[go: up one dir, main page]

KR20130083433A - 식물 게놈 공학에서 통상적으로 사용되는 뉴클레오티드 서열에서 식물 게놈을 변경하는 방법 및 수단 - Google Patents

식물 게놈 공학에서 통상적으로 사용되는 뉴클레오티드 서열에서 식물 게놈을 변경하는 방법 및 수단 Download PDF

Info

Publication number
KR20130083433A
KR20130083433A KR1020137000586A KR20137000586A KR20130083433A KR 20130083433 A KR20130083433 A KR 20130083433A KR 1020137000586 A KR1020137000586 A KR 1020137000586A KR 20137000586 A KR20137000586 A KR 20137000586A KR 20130083433 A KR20130083433 A KR 20130083433A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plant
dna
seq
foreign dna
meganucleases
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020137000586A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101995698B1 (ko
Inventor
카틀린 달루인
Original Assignee
바이엘 크롭사이언스 엔.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이엘 크롭사이언스 엔.브이. filed Critical 바이엘 크롭사이언스 엔.브이.
Publication of KR20130083433A publication Critical patent/KR20130083433A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101995698B1 publication Critical patent/KR101995698B1/ko
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 키메라 유전자를 포함하는 형질전환 식물의 식물 게놈을 표적화된 방식으로 변경하는 방법 및 수단을 제공하고, 키메라 유전자는 식물 분자 생물학에서 통상적으로 사용되는 DNA 요소를 갖는다. 또한, 본 발명은 식물 분자 생물학에서 통상적으로 사용되는 요소를 절단하기 위해 재고안된 메가뉴클레아제를 제공한다.

Description

식물 게놈 공학에서 통상적으로 사용되는 뉴클레오티드 서열에서 식물 게놈을 변경하는 방법 및 수단{METHODS AND MEANS TO MODIFY A PLANT GENOME AT A NUCLEOTIDE SEQUENCE COMMONLY USED IN PLANT GENOME ENGINEERING}
본 발명은 농업 경제학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 형질전환 식물의 게놈에서 정확히 국한된 뉴클레오티드 서열에서 표적화된 변경, 예컨대 삽입, 결실 또는 치환을 도입하기 위한 방법 및 수단을 제공하고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 식물의 유전자 이식(transgenesis)에서 자주 사용되는 요소 또는 DNA 절편, 예를 들어 통상적으로 사용되는 선택가능한 표지 유전자 내에 포함된다. 변경은 제1 단계에서 인식 부위를 인식하고 그것을 단절시키도록 재고안된(re-designed), 자연적으로 존재하는 메가뉴클레아제(meganuclease)로부터 유래된 메가뉴클레아제를 사용하여 인식 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 단절을 도입하여 일어난다.
식물 게놈에 표적화된 변경을 도입, 예컨대 식물에서 외래 DNA의 통합 위치에 대한 제어의 필요성은 점점 더 중요해져 이러한 필요성을 충족시키기 위한 노력으로 몇가지 방법이 개발되었다(리뷰를 위해 문헌[Kumar and Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, pp155-159] 참조). 이들 방법은 주로 표적화된 위치에 이중 가닥 DNA 단절의 초기 도입을 필요로 한다.
래어 커팅(rare-cutting) 엔도뉴클레아제, 예를 들어 I-SceI를 통한 이중 가닥 DNA 단절의 도입을 통한 표적 유전자좌의 활성화 및/또는 공여자 DNA의 복구는 상동 재조합의 빈도를 몇 자릿수 만큼 증가시키는 것으로 나타났다(Puchta et ai, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, pp5055-5060; Chilton and Que, Plant Physiol, 2003; D'Halluin et al. 2008 Plant Biotechnol. J. 6, 93-102). 국제특허출원공개 제WO96/14408은 효소 I-SceI를 암호화하는 분리된 DNA를 기재한다. 이 DNA 서열은 클로닝 및 발현 벡터, 형질전환된 세포주 및 형질전환 동물에 혼입될 수 있다. 벡터는 유전자 지도 작성 및 유전자의 부위 지시된(site-directed) 삽입에 유용하다.
국제특허출원공개 제WO00/46386호는 I-SceI 도입된 이중 가닥 단절을 통해 세포 내의 유전자 또는 다른 염색체 DNA를 변경하고, 복구하고, 약화시키고 불활성화시키는 방법을 기재한다. 또한 필요로 하는 개체에서 유전적 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 개시한다. 추가로 키메라 제한 엔도뉴클레아제가 개시된다.
또한, 효소의 기질 또는 서열 특이성을 변경시키기 위해 래어 클리빙(rare cleaving) 엔도뉴클레아제를 고안하여 임의의 자연의 래어 클리빙 엔도뉴클레아제의 인식 부위의 존재에 상관없이 관심있는 유전자좌에 이중 가닥 단절을 도입할 수 있도록 하는 방법이 기재되었다. 간략히, 특이적인 뉴클레오티드 서열을 인식하도록 고안된 징크 핑거(zinc-finger) 도메인과 자연적인 제한 효소, 예를 들어 FokI으로부터 온 비특이적인 DNA 절단 도메인 사이에 하이브리드를 사용하여 키메라 제한 효소가 제조될 수 있다. 그러한 방법은 예를 들어 국제특허출원공개 제WO03/080809호, 제WO94/18313호 또는 제WO95/09233호 및 문헌[Isalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656- 660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530]에 기재되었다. 변이의 라이브러리로부터 선택에 의해 주문 제작한 메가뉴클레아제를 생산하는 또다른 방법이 국제특허출원공개 제WO2004/067736호에 기재되었다. 변경된 서열 특이성 및 DNA 결합 친화도를 갖는 주문 제작한 메가뉴클레아제 또는 재고안된 메가뉴클레아제가 또한 국제특허출원공개 제WO2007/047859호에 기재된 합리적인 고안을 통해 수득될 수 있다.
국제특허출원공개 제WO2007/049095호는 2개의 별개의 하위도메인에 돌연변이를 갖고 엔도뉴클레아제 변이가 각각의 하위도메인에 의해 결합된 뉴클레오티드를 포함하는 키메라 DNA 표적 서열을 절단할 수 있도록 각각이 변경된 DNA 표적 절반 부위의 별개의 부분에 결합하는 "LADGLIDADG" 호밍(homing) 엔도뉴클레아제 변이를 기재한다.
국제특허출원공개 제WO2007/049156호 및 제WO2007/093836호는 신규한 절단 특이성을 갖는 I-CreI 호밍 엔도뉴클레아제 변이 및 그 용도를 기재한다.
국제특허출원공개 제WO2007/047859호는 변경된 서열 특이성 및 DNA 결합 친화도를 갖는 합리적으로 고안된 메가뉴클레아제를 기재한다.
국제특허출원공개 제WO2006/105946호는 식물 세포 및 식물에서 상동 재조합을 통해 관심있는 DNA 서열을 표적 DNA 서열과 정확하게 교환하는 방법을 기재하는데, 이에 따라 유전자 교체 이벤트(event)의 일시적인 선택을 위한 상동 재조합 기 동안 사용되는 선택가능한 또는 스크리닝 가능한 표지는 이후에 풋 프린트(foot-print)를 남기지 않고 제거 단계 동안 시험관내 배양에 의존하지 않고 래어 클리빙 엔도뉴클레아제를 유도하는 이중 가닥 단절의 소포자 특이적인 발현에 의해 선택된 DNA의 제거를 위해 상기 문헌에 기재된 방법을 사용하여 제거될 수 있다.
미국가출원 제60/828,042호 및 유럽특허출원 제06020370.0호 및 국제특허출원공개 제WO2008/037436호는 국제특허출원공개 제WO2006/105946호(여기서 래어 클리빙 엔도뉴클레아제를 유도하는 이중 가닥 단절에 의해 유도되는 선택된 DNA 절편의 제거 단계는 생식세포 계열 특이적인 프로모터의 제어 하에 있다)의 방법 및 수단의 변이를 기재한다. 상기 방법의 다른 구현예는 복구 DNA의 한 말단에서 비상동 말단결합(non-homologous endjoining) 및 다른 말단에서의 상동 재조합에 의존한다.
문헌[Gao et al. 2009, The Plant Journal, pp 1-11]은 재고안된 엔도뉴클레아제를 사용하여 옥수수에서 유전적으로 표적화된(heritable targeted) 돌연변이를 기재한다.
재고안된 메가뉴클레아제가 자연적으로 존재하는 엔도뉴클레아제로부터 유래하기 때문에 이용가능한 잠재적인 인식 부위는 전적으로 랜덤한 것이 아니라 재고안된 메가뉴클레아제가 기초가 되는, 자연적으로 발생하는 엔도뉴클레아제에 의해 본래 인식되는 뉴클레오티드 서열과 어느 정도 유사한 것으로 나타난다. 상기 문헌[Gao et al, 2009]에 기술된 바와 같이 I-CreI의 DNA 결합 특성을 변경시키기 위한 구조를 기초로 한 단백질 고안 방법은 I-CreI-DNA 공결정 구조의 시각적 정밀 검사를 기초로 하여 그 인식 부위의 특정 위치에서 I-CreI 염기 선호도를 변화시키는 다수의 아미노산 치환을 예측하게 한다. 개별 아미노산 치환은 실험적으로 평가되고 염기 선호도에 원하는 변화를 부여하는 것들이 "혼합되고 매칭되어" 매우 다른 DNA 부위를 인식하는 I-CreI 유도체를 생성시킬 수 있는 돌연변이 데이터베이스에 첨가되었다. 이론상으로 현재의 돌연변이 데이터베이스를 사용하여 이용가능한 조합적 다양성은 랜덤 DNA 서열에서 대략 1000bp 마다 조작된 엔도뉴클레아제를 표적화하기에 충분하다.
따라서 여전히 형질전환 유전자(transgene)의 통상적으로 사용되는 부분으로서 형질전환 식물로 이전에 도입된 DNA 요소 또는 영역에서 인식 부위를 인식하고 충분한 효율로 그 영역 내에 이중 가닥 DNA 단절을 유도하여 예를 들어 이중 가닥 단절 부위에서 상동 재조합 또는 비상동 말단결합에 의해 외래 DNA의 삽입, 결실 또는 치환에 필요한 이벤트를 개시할 수 있는 기능적으로 재고안된 메가뉴클레아제에 대한 필요성이 남아있다. 그러한 한 쌍의 인식 부위 및 재고안된 메가뉴클레아제의 확인은 래어 클리빙 엔도뉴클레아제, 예를 들어 I-SceI(식물 세포에서 자연적으로 존재하지는 않음)을 위해 역사적으로 도입된 인식 부위의 존재에 의존할 필요 없이 이전에 도입된 형질전환 유전자의 위치에 유도된 이중 가닥 DNA 단절의 부근에서 DNA를 삽입, 결실 또는 치환하여 표적화된 방식으로 식물 게놈을 변경시키기 위해 이용가능한 수단을 증진시킨다.
이들 및 다른 문제는 청구항 뿐만 아니라 본 발명의 여러 가지 상세한 구현예에 이후 기재된 바와 같이 해결된다.
본 발명의 한 구현예에서
(a) 미리 정해진 부위에 이중 가닥 DNA 단절을 유도하는 단계;
(b) 식물 세포에 외래 DNA 분자를 도입하는 단계;
(c) 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물 세포를 선택하는 단계; 및
(d) 임의적으로 식물 세포를 식물로 재생시키는 단계
를 포함하는, 형질전환 식물의 게놈에서 미리 정해진 부위에 외래 DNA 분자를 도입하는 방법을 제공하고 상기 미리 정해진 부위는 자연적으로 존재하는 메가뉴클레아제에 대한 인식 부위와 상이한 뉴클레오티드 서열이되 형질전환 식물에 형질전환 유전자의 일부로 통상적으로 도입되는 뉴클레오티드 서열이고, 상기 이중 가닥 DNA 단절은 동시에 미리 정해진 부위를 인식하고 이중 가닥 단절을 유도하는 자연적으로 존재하지 않는 단일 쇄 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 자연적으로 존재하지 않는 메가뉴클레아제의 도입에 의해 유도되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서
(a) 미리 정해진 부위에 이중 가닥 DNA 단절을 유도하는 단계;
(b) 식물 세포에 외래 DNA 분자를 도입하는 단계;
(c) 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물 세포를 선택하는 단계; 및
(d) 임의적으로 식물 세포를 식물로 재생시키는 단계
를 포함하는, 식물 세포의 게놈에서 미리 정해진 부위에 외래 DNA 분자를 도입하는 방법을 제공하고 상기 미리 정해진 부위는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있는, 에스.히그로코피쿠스로부터(S. hygroscopicus)의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 암호화 영역(바(bar) 암호화 영역) 내에 포함되고, 상기 이중 가닥 DNA 단절은 동시에 미리 정해진 부위를 인식하고 이중 가닥 단절을 유도하는 단일 쇄 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제의 도입에 의해 유도되는 것을 특징으로 한다. 미리 정해진 부위는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서
(a) 미리 정해진 부위에 이중 가닥 DNA 단절을 유도하는 단계;
(b) 식물 세포에 외래 DNA 분자를 도입하는 단계;
(c) 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물 세포를 선택하는 단계; 및
(d) 임의적으로 식물 세포를 식물로 재생시키는 단계
를 포함하는, 식물 세포의 게놈에서 미리 정해진 부위에 외래 DNA 분자를 도입하는 방법을 제공하고 상기 미리 정해진 부위는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 이중 가닥 DNA 단절은 동시에 미리 정해진 부위를 인식하고 이중 가닥 단절을 유도하는 단일 쇄 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제의 도입에 의해 유도되는 것을 특징으로 한다. 예를 들어 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제는 I-CreI(서열번호 16으로 나타냄)로부터 유래되고 하기 아미노산이 서브유니트 중 하나에 존재한다: 위치 32에서 S; 위치 33에서 Y; 위치 38에서 E; 위치 40에서 R; 위치 66에서 K; 위치 80에서 Q; 위치 42에서 T; 위치 77에서 R; 위치 68에서 R; 위치 70에서 R; 위치 44에서 Q; 위치 24에서 I; 위치 26에서 S; 위치 28에서 S 및 위치 30에서 R 또는 위치 70에서 R; 위치 44에서 T; 위치 24에서 I; 위치 26에서 S; 위치 28에서 S; 위치 30에서 N; 위치 32에서 S; 위치 33에서 R; 위치 38에서 Q; 위치 80에서 Q; 위치 40에서 R; 위치 66에서 K; 위치 42에서 T; 위치 77에서 R 및 위치 68에서 R(위치는 I-CreI 아미노산 서열에 상응함). 그러한 메가뉴클레아제의 예는 서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 2004 내지 뉴클레오티드 위치 2525 또는 내지 2522의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 4885 내지 뉴클레오티드 위치 5405 또는 내지 5403의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 각각 암호화된 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 본 발명에 따른 단일 쇄 메가뉴클레아제는 서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 1267 내지 1605 및 1795 내지 2541의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 1267 내지 1605, 1795 내지 1956 및 2071 내지 2541의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 서열번호 18의 아미노산 위치 1 내지 167 및 208 내지 362의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
임의의 구현예에서 외래 DNA는 복구 DNA 내에 포함될 수 있고 복구 DNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 상류 또는 하류 서열과 상동인 하나 이상의 측면(flanking) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 외래 DNA는 선택가능한 표지 유전자 및/또는 관심있는, 예를 들어 제초제 내성 유전자, 곤충 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 무생물 스트레스 저항성 유전자, 오일 생합성 관련된 효소, 탄수화물 생합성, 섬유질 강도 또는 섬유질 길이와 관련된 효소, 2차 대사산물의 생합성과 관련된 효소의 식물 발현 유전자를 포함할 수 있다. 외래 DNA는 또한 예를 들어, 즉 비상동 말단결합에 의한 통합을 위해 (임의의 추가 DNA 없이) 미리 정해진 표적 부위 주위의 영역에 상동인 측면 서열 없이 통합될 수 있다.
메가뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제의 쌍은 키메라 유전자 또는 한 쌍의 키메라 유전자로부터 발현될 수 있고 각각은 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제 중 하나를 암호화하는 암호화 영역에 작동가능하게 연결되고 추가로 식물 세포에서 전사 종료 및 폴리아데닐화 기능에 관련된 DNA 영역에 작동가능하게 연결된, 식물에서 발현가능한 프로모터를 포함한다.
본 발명은 추가로 식물 세포 및 식물 및 종자 또는 증식 부분을 제공하고, 여기서 외래 DNA는 미리 정해진 부위에 도입되고 이는 본원에 제공되는 방법에 의해 수득된다.
본 발명은 또한 식물을 성장시키는 방법을 제공하고, 여기서 외래 DNA는 미리 정해진 부위에 도입되고 이는 식물과 함께 또는 식물이 성장하는 기질에 화학물질을 적용하는 단계를 포함하는, 본원에서 제공된 방법에 의해 수득된다.
본 발명의 또다른 구현예는 또다른 식물과 함께 또는 그 자체로 본원의 방법에 의해 수득된 식물 세포로 본질적으로 이루어진 식물을 교배시키는 단계 및 임의적으로 종자를 수확하는 단계를 포함하는, 바 암호화 영역에서 통합된 외래 DNA를 포함하는 식물 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 화학적 화합물을 본원에서 제공되는 방법에 의해 수득된, 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물 또는 식물의 종자에 적용하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 구현예는 식물 세포에서 바 암호화 영역으로 외래 DNA 를 도입하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 구현예는 식물 세포의 미리 정해진 부위에 관심있는 외래 DNA를 도입하기 위한 주문 제작한 메가뉴클레아제의 용도에 관한 것이다.
도 1은 상이한 메가뉴클레아제 단량체 단위체 BAY 39 및 BAY 40의 인식 부위 및 아미노산과의 상호작용의 개략도이다.
도 2는 BAY 39/40 단량체 단위체 2("40")의 아미노산 서열이다(상기 아미노산 서열은 SV40 핵 위치 신호(아미노산 1 내지 10)을 포함한다).
도 3은 BAY 39/40 단량체 단위체 1("39")의 아미노산 서열이다(상기 아미노산 서열은 SV40 핵 위치 신호(아미노산 1 내지 10)을 포함한다).
도 4는 단일 쇄 BAY 39/40 메가뉴클레아제의 아미노산 서열이다(상기 아미노산 서열은 SV40 핵 위치 신호(아미노산 1 내지 12) 및 링커 영역(아미노산 168 내지 205)를 포함한다).
도 5는 식물에서 발현가능한 바 유전자 및 BAY 39/40의 단량체 단위체에 대한 식물에서 발현가능한 유전자를 포함하는 형질전환 식물로부터 유래된 포스피노트리신 민감성 라인에서 바 암호화 영역의 인식 부위 주위의 PCR 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열의 정렬이다. 1. 대조 시료의 뉴클레오티드 서열; 2. 포스피노트리신 내성 라인의 뉴클레오티드 서열; 3 내지 9: 포스피노트리신 민감성 라인의 뉴클레오티드 서열.
본 발명은 뉴클레오티드 서열(서열번호 1 및 서열번호 2, 도 1)을 특이적으로 인식하고 절단하는 기능적으로 재고안된 메가뉴클레아제가 수득될 수 있다는 관찰에 기초를 두고, 상기 뉴클레오티드 서열은 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스로부터의 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자(바 유전자)의 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열에서 발견될 수 있고(Thompson, C, Mowa, R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J., Lauwereys, M. ans Botterman, J. (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal 6: 2519-2523 (Accession X05822)) 상기 뉴클레오티드 서열은 식물 형질전환에서 통상적으로 사용되는 선택가능한 표지 유전자에 존재한다.
서열번호 3은 바 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열번호 1(서열번호 2)의 인식 부위의 상보체는 서열번호 3의 뉴클레오티드 132 내지 153의 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 그러므로 본원에 기술된 메가뉴클레아제는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스로부터의 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자(바)를 암호화하는 DNA 영역에 작동가능하게 연결된 식물에서 발현가능한 작동가능한 프로모터를 갖고 3' 전사 종결 및 식물에서 기능을 갖는 폴리아데닐화 영역에 의해 이어지는, 식물에서 발현가능한 유전자를 포함하는 형질전환 식물에서 뉴클레오티드 서열을 인식하고 절단할 수 있고, 바 암호화 영역은 서열번호 1의 뉴클레오티드의 상보체, 예를 들어 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바 암호화 영역은 상업화되었거나 상업화되거나 상업화될 수많은 형질전환 식물, 예컨대 하기 이벤트를 포함하는 식물에 혼입되었다:
치커리(시코리움 인티부스(Cichorium intybus)):
-조절 파일 97-148-01p에 기재된 바와 같은 이벤트 RM3-3, RM3-4, RM3-6
유채꽃(브라시카 나푸스(Brassica napus)):
-조절 파일 DD95-04(CA) 또는 98-278-01p(US)에 기재된 바와 같은 이벤트 MS1
-조절 파일 DD96-17(CA) 또는 98-278-01p(US) 또는 국제특허출원공개 제WO2001/041558호에 기재된 바와 같은 이벤트 MS8
-조절 파일 DD95-04(CA) 또는 98-278-01p(US)에 기재된 바와 같은 이벤트 RF1
-조절 파일 DD95-04(CA) 또는 98-278-01p(US)에 기재된 바와 같은 이벤트 RF2
-조절 파일 DD96-17(CA) 또는 98-278-01p(US) 또는 국제특허출원공개 제WO2001/041558호에 기재된 바와 같은 이벤트 RF3
-일본 탈조절 파일에 기재된 바와 같은 이벤트 PHY14, PHY35, PHY36
면(고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum)):
-조절 파일 02-042-0lp(US) 또는 국제특허출원공개 제WO2003/013224호에 기재된 바와 같은 이벤트 LLcotton 25
-국제특허출원공개 제WO2008/122406호에 기재된 바와 같은 이벤트 T303-40
-조절 파일 08-340-01p(US) 또는 국제특허출원공개 제WO2008/151780호에 기재된 바와 같은 이벤트 GHB119
옥수수(제아 메이스(Zea mays)):
-조절 파일 03-181-01p(US)에 기재된 바와 같은 이벤트 TC-6275(=DAS-06275-8)
-조절 파일 94-319-01p(US)에 기재된 바와 같은 이벤트 Btl76
-미국의 탈조절 문서 95-145-01p 또는 국제특허출원공개 제WO9506128호에 기재된 바와 같은 이벤트 B16(=DLL25)
-미국의 탈조절 문서 96-291-01p(US)에 기재된 바와 같은 이벤트 DBT418
-이벤트 ZMA101
-미국의 탈조절 문서 97-265-0lp(US)에 기재된 바와 같은 이벤트 CBH351
-미국의 탈조절 파일 95-228-0lp(US)에 기재된 바와 같은 이벤트 MS3
-미국의 탈조절 파일 98-349-0lp(US)에 기재된 바와 같은 이벤트 MS6
쌀(오리자 사티바(Oryza sativa)):
-미국의 탈조절 문서 98-329-01p 또는 국제특허출원공개 제WO2001/083818호에 기재된 바와 같은 이벤트 LLRice62
-미국의 탈조절 문서 06-234-01p 또는 미국특허출원 제2008289060호에 기재된 바와 같은 이벤트 LLRice601
대두(글리신 맥스(Glycine max)):
-조절 파일 96-068-01p(US)에 기재된 바와 같은 이벤트 W62 및 W98
그러므로 이들 이벤트를 포함하는 형질전환 식물은 본원에 기재된 메가뉴클레아제에 대한 인식 서열을 포함하고 본 발명의 방법에 적합한 개체이다. 또한 식물에서 발현가능한 바 유전자는 일반적으로 선택가능한 표지로서 사용되어 또한 본 발명의 방법에 적합한 개체인 많은 형질전환 식물이 생성되었다.
따라서, 한 구현예에서 본 발명은
(a) 미리 정해진 부위에 이중 가닥 DNA 단절을 유도하는 단계;
(b) 식물 세포에 외래 DNA 분자를 도입하는 단계; 및
(c) 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물 세포를 선택하는 단계
를 포함하는, 형질전환 식물 세포의 (핵) 게놈에서 미리 정해진 또는 미리 선택된 부위에 외래 DNA 분자를 도입하는 방법에 관한 것이고, 상기 미리 정해진 부위는 자연적으로 존재하는 메가뉴클레아제에 대한 인식 부위와 상이한 뉴클레오티드 서열이고 형질전환 식물에 형질전환 유전자의 일부로 통상적으로 도입되는 뉴클레오티드 서열이고, 상기 이중 가닥 DNA 단절은 동시에 미리 정해진 부위를 인식하고 이중 가닥 단절을 유도하는 자연적으로 존재하지 않는 단일 쇄 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 자연적으로 존재하지 않는 메가뉴클레아제 단량체 단위체의 도입에 의해 유도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "식물에 형질전환 유전자의 일부로 통상적으로 도입되는 뉴클레오티드 서열"은 식물에 도입된 키메라 유전자의 요소로서 이전에 사용되고 그렇게 함으로써 형질전환 식물이 용이하게 이용가능하고 특히 그렇게 함으로써 형질전환 식물이 상업화되었거나 상업화되거나 상업화될 것이고 규제 승인이 인가되어 공개적으로 이용가능한 DNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 일컫는다. 규제 승인에 대한 적용 정보를 요약하고 제공하는 몇몇 데이터베이스, 예컨대 온라인상에서 협의될 수 있는, 환경 위험 평가 센터의 GM 작물 데이터베이스((http://www.cera-gmc.org/?action=gm_crop_database&) 또는 http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.htm의 온라인 상에서 이용가능한, APHIS에 의해 등록되거나 계류중인 비규제 상태의 청원 요약 목록이 이용가능하다.
식물에서 형질전환 유전자의 일부로 통상적으로 도입되는 DNA 영역은 프로모터 영역, 예를 들어 CaMV 35S 전사체의 35S 프로모터(Odell et al. (1985), Nature 313 : 810-812); FMV 35S 프로모터(Richins R.D., Scholthof H.B., Shepherd R.J. (1987) Sequence of the figwort mosaic virus (caulimovirus group). Nucleic Acids Research 15: 8451-8466); 아라비돕시스 탈리아나 루비스코 유전자의 소 서브유니트의 프로모터(Krebbers E., Seurinck J., Herdies L., Cashmore A. R., Timko M. P. (1988). Four genes in two diverged subfamilies encode the ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase small subunit polypeptides of Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, 11, 745-759); 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터(Verdaguer et al (1996) Plant Mol. Biol. 31 : 1129 또는 Verdaguer et al (1998) Plant Mol. Biol. 37: 1055); 아라비돕시스로부터의 액틴2 프로모터(An Y.Q., McDowell J.M., Huang S., McKinney E.C., Chambliss S., Meagher R.B. (1996) Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. The Plant Journal 10: 107-121) 또는 쌀로부터의 액틴2 프로모터(McElroy D., Zhang W., Cao J., Wu R. (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transfomation. The Plant Cell 2: 163-171); 히스톤 H3 프로모터 또는 히스톤 H4 프로모터(Chaboute M, Chaubet N, Philipps G, Ehling M and Gigot C (1987) Genomic organization and nucleotide sequences of two histone H3 and two histone H4 genes of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 8: 179-191); 옥수수(제아 메이즈) 유비퀴틴-1 유전자의 프로모터(Christensen et al (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675); 5' UTR 리더 서열, 예를 들어 cab22L 리더(Harpster M, Townsend J, Jones J, Bedbrook J and Dunsmuir P.(1988) Relative strengths of the 35S cauliflower mosaic virus, Γ, 2' and nopaline synthase promoters in transformed tobacco, sugarbeet and oilseed rape callus tissue. Mol Gen Genet. 212: 182-190); 5' 테브(Carrington J and Freed D (1990) Cap-independent enhancement of translation by a plant potyvirus 5' nontranslated region. J Virol 64(4): 1590-1597); 노팔린 신타제 유전자의 3' 말단(Depicker A., Stachel S., Dhaese P., Zambryski P., Goodman H.M. (1982). Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular and Applied Genetics 1, 561-573); 옥토핀 신타제 유전자의 3' 말단(De Greve H., Dhaese P., Seurinck J., Lemmers M., Van Montagu M., Schell J. (1982). Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene. Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 499-511); CaMV35S 터미네이터(Sanfacon et al (1991) Genes Dev. 5: 141); 옥토핀 유형 T-DNA 벡터의 유전자 7의 전사 종결 및 폴리아데닐화 영역(D'Haese et al, 1983, The EMBO Journal, 2, 419-426) 및 선택가능한 표지, 예를 들어 바(Thompson, C, Mowa, R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J., Lauwereys, M. ans Botterman, J. (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal 6: 2519-2523 (Accession X05822)); 패트(Wohlleben,W., Arnold, W., Broer,L, Hillemann,D., Strauch,E. and Puhler,A. Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tu494 and its expression in Nicotiana tabacum. Gene 70 (1), 25-37 (1988)); 2mepsps(미국특허 제US6566587호 또는 EMBL 번호 AR337832로부터의 서열 4); CP4(Padgette S.R., Re D., Barry G., Eichholtz D., Delannay X., Fuchs R.L., Kishore G.M., Fraley R.T. (1996). New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready gene. In Herbicide-Resistant Crops: Agricultural, Environmental, Econ...., neo Accession V00618; Beck et al (1982) Gene 19(3) p327-336); 또는 hpt(Kaster et al., (1983), NAR 11, 6895-6911)를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 바람직한 DNA 영역은 상기된 바와 같은 바 유전자의 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 기재된 재고안된 메가뉴클레아제는 스캐폴드로서의 사용을 위해 자연적으로 존재하는 메가뉴클레아제 I-CreI를 기초로 한다. I-CreI는 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas rheinhardti)의 엽록체에서 발견되는 호밍 엔도뉴클레아제이다(Thompson et al. 1992, Gene 119, 247-251). 이 엔도뉴클레아제는 23SrRNA에서 유사 회문식(pseudo-palindromic) 22bp DNA 부위를 인식하고 인트론의 도입에 사용되는 이중 가닥 DNA 단절을 생성하는 동형이량체이다. I-CreI는 단일 LAGLIDADG 모티프를 갖는 엔도뉴클레아제 군의 일원이다. LAGLIDADG 효소는 콘센서스 모티프의 1 또는 2개의 복사본을 포함한다. 단일 모티프 효소, 예를 들어 I-CreI는 동형이량체로서 작용하고 반면에 이중 모티프 효소는 2개의 별개의 도메인을 갖는 단량체이다. 따라서 관심있는 22bp 뉴클레오티드 서열을 인식하도록 I-CreI 스캐폴드로부터 유래된 메가뉴클레아제를 재고안할 때 2개의 단량체 단위체가 고안되고 각각은 22bp 인식 부위의 일부를 인식하고 이는 22bp 인식 부위에서 이중 가닥 단절을 동시에 유도하는데 필요하다(국제특허출원공개 제WO2007/047859호). 예를 들어 국제특허출원공개 제WO2007/047859호에 기재된 바와 같이 2개의 단량체 단위체를 하나의 단일 쇄 메가뉴클레아제로 연결시킴으로써 또한 이형이량체의 형성을 촉진시킴으로써 일치된 행동이 달성될 수 있다.
자연적으로 존재하는 I-CreI 단량체의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 제공된다. 그의 이형이량체가 서열번호 1 및/또는 2의 뉴클레오티드 서열을 인식하도록 I-CreI 단량체를 재고안하기 위해 하기 아미노산이 언급된 위치에 존재한다:
1. 메가뉴클레아제 단위체 1에서:
a. 위치 32에서 S;
b. 위치 33에서 Y;
c. 위치 38에서 E;
d. 위치 40에서 R;
e. 위치 66에서 K;
f. 위치 80에서 Q;
g. 위치 42에서 T;
h. 위치 77에서 R;
i. 위치 68에서 R;
j. 위치 70에서 R;
k. 위치 44에서 Q;
1. 위치 24에서 I;
m. 위치 26에서 S;
n. 위치 28에서 S;
o. 위치 30에서 R.
2. 메가뉴클레아제 단위체 2에서:
p. 위치 70에서 R;
q. 위치 44에서 T;
r. 위치 24에서 I;
s. 위치 26에서 S;
t. 위치 28에서 S;
u. 위치 30에서 N;
V. 위치 32에서 S;
w. 위치 33에서 R;
x. 위치 38에서 Q;
y. 위치 80에서 Q;
z. 위치 40에서 R;
aa. 위치 66에서 K;
bb. 위치 42에서 T;
cc. 위치 77에서 R;
dd. 위치 68에서 R.
그 개략도는 도 1에 제공된다.
재고안된 이중 가닥 단절 유도 효소는 핵 위치 신호(nuclear localization signal, NLS), 예를 들어 SV40 거대 T 항원의 NLS를 포함할 수 있지만 반드시 포함할 필요는 없다(Raikhel, Plant Physiol. 100: 1627-1632 (1992) 및 그의 참고문헌; Kalderon et al. Cell 39: 499-509 (1984)). 핵 위치 신호는 단백질 내의 어디든 위치할 수 있으나 적합하게는 단백질의 N-말단 끝에 위치한다. 핵 위치 신호는 이중 가닥 단절 유도 효소의 하나 이상의 아미노산을 대체할 수 있다. 재고안된 메가뉴클레아제에 단백질의 N-말단의 NLS, 예를 들어 SV40의 10 또는 12개의 아미노산 NLS가 제공되면 그에 따라 아미노산 위치가 이동(증가)할 것임이 주지되어야 한다. 이처럼 2개의 단량체 단위체가 단일 쇄 메가뉴클레아제로 연결되는 이벤트에서 제2 단위체의 위치 또한 이동할 것이다. I-CreI 아미노산 서열과 관련하여 상응하는 아미노산 위치는 또한 아래 기재된 바와 같이 최적 정렬을 측정하여 확인될 수 있다. 단일 쇄의 재고안된 메가뉴클레아제에서 단위체의 순서는 무관함이 분명할 것이다, 즉 상기 단위체 1 및 2가 단일 아미노산 쇄에서 실제로 그 순서로 존재하는지 또는 단일 아미노산 쇄에서 단위체 2가 단위체 1을 앞서는지는 2개의 단위체가 결합하여 표적 서열을 인식할 수 있게 하는데는 차이가 없다.
본 발명에 적합한 재고안된 메가뉴클레아제는 서열번호 5 및 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있거나(이형이량체로서 인식 부위를 절단할 수 있는 단량체 단위체) 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있거나(아미노산 168 내지 205에 의해 제시되는 링커 서열에 의해 연결된, 아미노산 1 내지 167 및 208 내지 362에 의해 각각 제시되는 2개의 단위체를 포함하는 단일 쇄 메가뉴클레아제) 서열번호 18의 1 내지 167 및 206 내지 362의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다(각각 링커 없는 단일 쇄 메가뉴클레아제의 단위체 1 및 2).
적합하게는 재고안된 메가뉴클레아제는 그러한 메가뉴클레아제를 암호화하는, 식물에서 발현가능한 재조합 유전자의 발현에 의해 제공될 수 있다. 이러한 목적을 위해 재고안된 메가뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제 단량체 단위체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 영역이 식물에서 발현가능한 프로모터 및 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관련된 DNA 영역에 작동가능하게 연결되어 식물 또는 식물 세포로 도입될 수 있다. 재고안된 메가뉴클레아제를 암호화하는 재조합 유전자는 일시적으로 또는 안정적으로 도입될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해 용어 "식물 작동 프로모터" 및 "식물에서 발현가능한 프로모터"는 식물, 식물 조직, 식물 기관, 식물 일부 또는 식물 세포에서 전사를 추진할 수 있는 프로모터를 의미한다. 이는 식물 유래의 임의의 프로모터를 포함하나 또한 식물 세포에서 전사를 지시할 수 있는 비식물 유래의 임의의 프로모터를 포함한다.
이 점에서 사용될 수 있는 프로모터는 항시 발현(constitutive) 프로모터, 예를 들어 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 전사체의 프로모터(Hapster et al.,1988, Mol. Gen. Genet. 212: 182-190), CaMV 19S 프로모터(미국특허 제5,352,605호; 국제특허출원공개 제WO84/02913호; Benfey et al., 1989, EMBO J. 8:2195-2202), 지하 클로버 바이러스 프로모터 4번 또는 7번(국제특허출원공개 제WO96/06932호), 루비스코 소 서브유니트 프로모터(미국특허 제4,962,028호), 유비퀴틴 프로모터(Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29:637-649), T-DNA 유전자 프로모터, 예를 들어 아그로박테리움으로부터의 옥토핀 신타제(octopine synthase, OCS) 및 노팔린 신타제(nopaline synthase, NOS) 프로모터 및 식물에서 항시 발현하는 것으로 당업자에게 알려진 유전자의 추가적인 프로모터이다.
이 점에서 사용될 수 있는 추가적인 프로모터는 조직 특이적 또는 기관 특이적 프로모터, 바람직하게는 종자 특이적 프로모터, 예를 들어 2S 알부민 프로모터(Joseffson et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 12196-12201), 파세올린 프로모터(미국특허 제5,504,200호; Bustos et al., 1989, Plant Cell l .(9):839-53), 레구민 프로모터(Shirsat et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 215(2):326-331), "무명의 종자 단백질(unknown seed protein, USP)" 프로모터(Baumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3):459-67), 나핀 프로모터(미국특허 제5,608,152호; Stalberg et al., 1996, Planta 199:515-519), 아라비돕시스 올레오신 프로모터(국제특허출원공개 제WO98/45461호), 브라시카 Bce4 프로모터(국제특허출원공개 제WO91/13980호) 및 식물에서 종자 특이적으로 발현하는 것으로 당업자에게 알려진 유전자의 추가적인 프로모터이다.
사용될 수 있는 다른 프로모터는 원시세포(primordia) 특이적인 프로모터(An et al., 1996, Plant Cell 8: 15-30), 줄기 특이적인 프로모터(Keller et al., 1988, EMBO J. 7(12): 3625-3633), 잎 특이적인 프로모터(Hudspeth et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 579-589), 엽육 특이적인 프로모터(예를 들어 광 유도성 루비스코 프로모터), 뿌리 특이적인 프로모터(Keller et al., 1989, Genes Dev. 3: 1639-1646), 괴경 특이적인 프로모터(Keil et al., 1989, EMBO J. 8(5): 1323-1330), 관다발 조직 특이적인 프로모터(Peleman et al., 1989, Gene 84: 359-369), 수술 선택성 프로모터(국제특허출원공개 제WO89/10396호, 제WO92/13956호), 열개 영역 특이적인 프로모터(국제특허출원공개 제WO97/13865호) 등과 같이 종자 특이적인 또는 기관 특이적인 프로모터이다.
본 발명에 적합한 재고안된 메가뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 2004 내지 뉴클레오티드 위치 2525 또는 2522의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 4885 내지 뉴클레오티드 위치 5404 또는 5403의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 클로닝 및 다른 재조합 DNA 기술을 용이하게 하기 위해 식물에서 작용하는 인트론을 메가뉴클레아제, 특히 단일 쇄 메가뉴클레아제를 암호화하는 영역에 포함시키는 것이 유리할 수 있다. 그러한 인트론은 예를 들어 서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 1606 내지 1794의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
재고안된 메가뉴클레아제를 암호화하는 DNA 영역은 GC 함량, 코돈 사용빈도, 원치않는 뉴클레오티드 서열의 제거를 도입함으로써 식물에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 암호화 영역은 식물에서의 발현을 위해 추가로 최적화될 수 있고 합성 암호화 영역은 다음 기준을 만족시키기 위해 고안된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다:
(a) 뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 바와 같이 기능적으로 재고안된 호밍 엔도뉴클레아제를 암호화하고;
(b) 뉴클레오티드 서열은 약 50% 내지 약 60%의 GC 함량을 갖고;
(c) 뉴클레오티드 서열은 GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA 및 CATAAA로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않고;
(d) 뉴클레오티드 서열은 CCAAT, ATTGG, GCAAT 및 ATTGC로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않고;
(e) 뉴클레오티드 서열은 ATTTA, AAGGT, AGGTA, GGTA 및 GCAGG로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하지 않고;
(f) 뉴클레오티드 서열은 G 및 C의 군으로부터 선택된 7개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 GC 스트레치(stretch)를 포함하지 않고;
(g) 뉴클레오티드 서열은 A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 5개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 AT 스트레치를 포함하지 않고;
(h) 뉴클레오티드 서열은 위치 2 및 3에 TA 또는 CG 듀플릿(duplet)을 포함하는, Leu, Ile, Val, Ser, Pro, Thr, Ala를 암호화하는 코돈을 포함하지 않는다(즉 뉴클레오티드 서열은 코돈 TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG 및 GCG를 포함하지 않는다).
그러한 최적화된 서열의 예는 서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 1267 내지 1605 및 뉴클레오티드 위치 1795 내지 2541에 의해 제시된다(여기서 2개의 메가뉴클레아제 단위체 사이에 존재하는 링커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 1957 내지 2070에 의해 제시된다).
또한 방법을 기재하는데 사용되는 용어, 예를 들어 "DNA 절편의 도입" 및 " 세포로부터의 식물의 재생"은 그러한 DNA 절편이 반드시 형질전환 기술에 의해 도입되어야 함을 의미하지 않음이 분명하다. 실제로 관심있는 DNA 분자가 또한 한 식물로부터 다른 식물로의 육종 또는 교배에 의해 도입될 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다.
그러나 관심있는 DNA 분자가 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 아그로박테리움 매개된 형절전환에 의해서 뿐만 아니라 직접적인 DNA 전달 방법에 의해 식물 세포에 도입될 수 있다는 것이 분명할 것이다. 형질전환 DNA 분자는 임의의 종래의 방법, 예컨대 직접적인 DNA 전달 방법(이에 한정되지 않음)을 사용하여 식물 세포에 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "직접적인 DNA 전달"은 자연의 아그로박테리움 종의 사용과 관련이 없이 식물 세포에 DNA를 도입하는, 식물 세포에 DNA를 도입할 수 있는 임의의 방법이다. 이는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 전기천공법에 의한 원형질체로의 DNA의 도입, 전기천공법에 의한 온전한 식물 세포 또는 부분적으로 절편된(partially degraded) 조직 또는 식물 세포로의 도입, 제제, 예를 들어 PEG 등의 작용을 통한 원형질체로의 DNA의 도입, 실리콘 위스커의 사용 및 DNA 코팅된 미세발사체를 사용한 충격을 포함한다.
미리 선택된 부위에 이중 가닥 단절을 유도하는 능력은 몇몇 잠재적인 적용을 가능하게 한다. 관심있는 외래 DNA는 상동 재조합에 의해 또는 비상동 말단결합의 방법에서 미리 선택된 부위에 도입될 수 있다. 이중 가닥 단절은 또한 미리 선택된 부위에 작은 결실 또는 삽입의 형성을 유도하여 미리 선택된 부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 유전자를 잠재적으로 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 국제특허출원공개 제WO06/105946호, 제WO08/037436호 또는 제WO08/148559호에 기재된 바와 같이 미리 선택된 부위에서의 이중 가닥 단절은 또한 관심있는 DNA 영역에 대한 부위 근처의 DNA 영역의 교체를 용이하게 할 것이다.
미리 선택된 부위에 상동 재조합에 의해 외래 DNA를 삽입하기 위해 외래 DNA는 복구 DNA 내에 포함될 수 있고, 여기서 외래 DNA는 미리 선택된 부위의 상류 또는 하류 DNA 영역의 뉴클레오티드 서열과 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 측면 DNA 영역에 의해 이웃하고 있다. 복구 DNA는 외래 DNA의 상류 및 하류에 2개의 측면 DNA 영역에 의해 이웃하여 삽입된 외래 DNA를 포함할 수 있고 2개의 측면 DNA 영역은 미리 선택된 부위의 상류 또는 하류의 DNA 영역의 뉴클레오티드 서열과 유사하다. 대안적으로 외래 DNA는 예를 들어, 즉 미리 정해진 표적 부위 주위의 영역과 상동인 측면 서열 없이(임의의 추가적인 DNA 없이) 비상동 말단결합에 의한 통합으로 통합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "측면 DNA 영역"은 표적 DNA 서열 또는 미리 선택된 부위의 상류 또는 하류 각각에 DNA 영역과 상동인 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA이다. 이는 관심있는 외래 DNA 또는 DNA 분자의 삽입을 더 잘 조절할 수 있게 한다. 실제로 상동 재조합에 의한 통합은 뉴클레오티드 수준까지 식물 핵 게놈으로 외래 DNA 절편의 정확한 결합을 가능하게 할 것이다.
측면 DNA 영역은 길이가 다양할 수 있고 길이가 약 10개 뉴클레오티드 이상이어야 한다. 그러나 측면 영역은 실질적으로 가능한 만큼 길 수 있다(예, 완전한 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome, BAC)와 같이 약 100 내지 150kb까지). 바람직하게는 측면 영역은 약 50bp 내지 약 2000bp일 것이다. 게다가 관심있는 외래 DNA에 이웃하는 영역은 미리 선택된 부위에 이웃하는 DNA 영역과 동일할 필요가 없고 미리 선택된 부위에 이웃하는 DNA 영역과 약 80% 내지 약 100% 서열 동일성, 바람직하게는 약 95% 내지 약 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 측면 영역이 더 길수록 상동성의 필요조건은 더 엄격하다. 또한 서열 동일성이 외래 DNA의 정확한 삽입 위치 부근에서 실질적으로 가능한 만큼 높은 것이 바람직하다. 또한 인접한 DNA 서열의 DNA 서열을 변경시키지 않고 표적 DNA 서열의 교환을 달성하기 위해 측면 DNA 서열이 바람직하게는 미리 선택된 부위에 이웃하는 DNA 영역과 동일해야 한다.
게다가 관심있는 외래 DNA와 이웃하는 영역은 미리 선택된 부위와 바로 이웃하는 영역과 상동일 필요가 없으나 미리 선택된 부위와 더 떨어진 핵 게놈의 DNA 영역과 상동일 수 있다. 그리고나서 외래 DNA의 삽입은 미리 선택된 삽입 부위와 상동인 DNA 영역 사이에서 표적 DNA의 제거를 초래할 것이다. 즉, 상동 영역 사이에 위치한 표적 DNA는 관심있는 외래 DNA로 치환될 것이다. 그러므로 이중 가닥 DNA 단절의 복구를 위해 외래 DNA의 적합한 배치를 선택하여 본 발명에 따라 외래 DNA 분자를 도입함으로써 삽입에 추가하여 또한 상동 영역 사이에 위치한 게놈 영역의 표적화된 교체 또는 표적화된 결실을 만들 수 있다.
삽입될 외래 DNA는 또한 삽입 후에 제거되거나 제거되지 않을 수 있는 선택가능한 또는 스크리닝가능한 표지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "선택가능한 또는 스크리닝가능한 표지"는 당업계 통상의 의미를 갖고 식물에서 발현가능한 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 글리포세이트 옥시다제, 글리포세이트 내성 EPSP 효소, 니트릴라제 유전자, 돌연변이 아세토락테이트 신타제 또는 아세토히드록시산 신타제 유전자, β-글루코로니다제(glucoronidase, GUS), R-유전자좌 유전자, 녹색 형광 단백질 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
선택가능한 또는 스크리닝 가능한 표지 및 나머지 외래 DNA 분자가 측면 DNA 영역을 통해 상동 재조합에 의해 도입된 식물 세포 또는 식물의 선택은 예를 들어 형질전환 DNA에 존재하지만 측면 DNA 영역의 밖에 위치한 서열의 부재를 스크리닝함으로써 달성될 수 있다. 실제로 측면 DNA 영역 밖의 형질전환 DNA로부터의 서열의 존재는 형질전환된 식물 세포의 유래가 랜덤 DNA 삽입에 의한 것임을 나타낼 것이다. 이 목적을 위해 선택가능한 또는 스크리닝가능한 표지가 측면 DNA 영역 밖의 형질전환 DNA 분자에 포함될 수 있고 그리고나서 이는 형질전환 DNA 밖에 위치한 선택가능한 또는 스크리닝가능한 표지를 갖지 않는 식물 세포를 확인하는데 사용될 수 있고 이는 측면 DNA 영역을 통한 상동 재조합에 의해 일어날 수 있다. 대안적으로 형질전환 DNA 분자는 그러한 유전자(음성적으로 선택가능한 표지 유전자)의 부재를 선택가능하게 하는 측면 DNA 영역 밖의 선택가능한 표지를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법이, 관심있는 임의의 DNA, 예컨대 예를 들어 후속 확인을 위한 특정 뉴클레오티드 서열 특징을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 포함하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 것이 분명하다. 관심있는 DNA는 또한 하나 이상의 식물에서 발현가능한 유전자, 예컨대 제초제 내성 유전자, 곤충 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 무생물 스트레스 저항성 유전자, 오일 생합성 또는 탄수화물 생합성에 관련된 효소, 섬유질 강도 및/또는 길이에 관련된 효소, 2차 대사산물의 생합성에 관련된 효소(이에 한정되지 않음)일 수 있다.
제초제 내성 유전자는 효소 5-엔올피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS)를 암호화하는 유전자를 포함한다. 그러한 EPSPS 유전자의 예는 박테리아 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 AroA 유전자(돌연변이 CT7)(Comai et al., 1983, Science 221, 370-371), 박테리아 아그로박테리움 종의 CP4 유전자(Barry et al., 1992, Curr. Topics Plant Physiol. 7, 139-145), 페튜니아 EPSPS를 암호화하는 유전자(Shah et al., 1986, Science 233, 478-481), 토마토 EPSPS(Gasser et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 4280-4289) 또는 엘루신 EPSPS(국제특허출원공개 제WO01/66704호)이다. 또한 예를 들어 유럽 특허 제0837944호, 국제특허출원공개 제WO00/66746호, 제WO00/66747호 또는 제WO02/26995호에 기재된 바와 같이 돌연변이된 EPSPS일 수 있다.
글리포세이트 내성 식물은 또한 미국특허 제5,776,760호 및 제5,463,175호에 기재된 바와 같이 글리포세이트 옥시도-리덕타제 효소를 암호화하는 유전자를 발현시켜 수득될 수 있다. 글리포세이트 내성 식물은 또한 예를 들어 국제특허출원공개 제WO02/36782호, 제WO03/092360호, 제WO05/012515호 및 제WO07/024782호에 기재된 바와 같이 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 유전자를 발현시켜 수득될 수 있다. 글리포세이트 내성 식물은 또한 예를 들어 국제특허출원공개 제WO01/024615호 또는 제WO03/013226호에 기재된 바와 같이 상기 유전자의 자연적으로 존재하는 돌연변이를 포함하는 식물을 선택하여 수득될 수 있다. 글리포세이트 내성을 부여하는 EPSPS 유전자는 예를 들어 미국특허출원 제11/517,991호, 제10/739,610호, 제12/139,408호, 제12/352,532호, 제11/312,866호, 제11/315,678호, 제12/421,292호, 제11/400,598호, 제11/651,752호, 제11/681,285호, 제11/605,824호, 제12/468,205호, 제11/760,570호, 제11/762,526호, 제11/769,327호, 제11/769,255호, 제11/943801호 또는 제12/362,774호에 기재되어 있다. 글리포세이트 내성을 부여하는 다른 유전자, 예를 들어 디카르복실라제 유전자는 예를 들어 미국특허출원 제11/588,811호, 제11/185,342호, 제12/364,724호, 제11/185,560호 또는 제12/423,926호에 기재되어 있다.
다른 제초제 내성 유전자는 예를 들어 미국특허출원 제11/760,602호에 기재된 제초제를 해독하는 효소 또는 억제에 저항성인 돌연변이 글루타민 신타제 효소를 암호화할 수 있다. 하나의 그러한 효과적인 해독 효소는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 효소(예를 들어 스트렙토마이세스 종으로부터의 바 또는 패트 단백질)이다. 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제는 예를 들어 미국특허 제5,561,236호, 제5,648,477호, 제5,646,024호, 제5,273,894호, 제5,637,489호, 제5,276,268호, 제5,739,082호, 제5,908,810호 및 제7,112,665호에 기재되어 있다.
제초제 내성 유전자는 또한 효소 히드록시페닐피루베이트디옥시게나제(hydroxyphenylpyruvatedioxygenase, HPPD)를 억제하는 제초제에 내성을 부여할 수 있다. 히드록시페닐피루베이트디옥시게나제는 파라-히드록시페닐피루베이트(hydroxyphenylpyruvate, HPP)가 호모겐티세이트로 변형되는 반응을 촉매화하는 효소이다. 국제특허출원공개 제WO96/38567호, 제WO99/24585호 및 제WO99/24586호, 제WO2009/144079호, 제WO2002/046387호 또는 미국특허 제6,768,044호에 기재된 바와 같이 HPPD 억제자에 대한 식물 내성은 자연적으로 존재하는 저항성 HPPD 효소를 암호화하는 유전자, 또는 돌연변이된 또는 키메라 HPPD 효소를 암호화하는 유전자로 형질전환될 수 있다. HPPD 억제자에 의한 본래의 HPPD 효소의 억제에도 불구하고 HPPD 억제자에 대한 내성은 또한 호모겐티세이트의 형성을 가능하게 하는 특정 효소를 암호화하는 유전자로 식물을 형질전환시켜 수득될 수 있다. 그러한 식물 및 유전자는 국제특허출원공개 제WO99/34008호 및 제WO02/36787호에 기재되어 있다. 국제특허출원공개 제2004/024928호에 기재된 바와 같이 HPPD 억제자에 대한 식물의 내성은 또한 HPPD 내성 효소를 암호화하는 유전자에 추가하여 프리페네이트 탈수소효소(prephenate dehydrogenase, PDH) 활성을 갖는 효소를 암호화하는 유전자로 식물을 형질전환시켜 향상될 수 있다. 나아가 식물은 식물의 게놈에 HPPD 억제자를 대사하거나 분해할 수 있는 효소, 예를 들어 국제특허출원공개 제WO2007/103567호 및 제WO2008/150473호에 나타낸 CYP450 효소를 암호화하는 유전자를 첨가함으로써 HPPD 억제자 제초제에 보다 내성있게 만들어질 수 있다.
더 나아가 제초제 내성 유전자는 예를 들어 문헌[Tranel and Wright (2002, Weed Science 50:700-712)] 뿐만 아니라 미국특허 제5,605,011호, 제5,378,824호, 제5,141,870호 및 제5,013,659호에 기재된 바와 같이 변이 ALS 효소(아세토히드록시산 신타제(acetohydroxyacid synthase), AHAS로도 공지됨)를 암호화한다. 설포닐우레아 내성 식물 및 이미다졸리논 내성 식물의 제조는 미국특허 제5,605,011호, 제5,013,659호, 제5,141,870호, 제5,767,361호, 제5,731,180호, 제5,304,732호, 제4,761,373호, 제5,331,107호, 제5,928,937호 및 제5,378,824호, 및 국제특허출원공개 제WO96/33270호에 기재되어 있다. 다른 이미다졸리논 내성 유전자는 또한 예를 들어 국제특허출원공개 제WO2004/040012호, 제WO2004/106529호, 제WO2005/020673호, 제WO2005/093093호, 제WO2006/007373호, 제WO2006/015376호, 제WO2006/024351호 및 제WO2006/060634호에 기재되어 있다. 추가적인 설포닐우레아 및 이미다졸리논 내성 유전자는 예를 들어 국제특허출원공개 제WO07/024782호 및 미국특허출원 제61/288958호에 기재되어 있다.
곤충 저항성 유전자는 다음을 암호화하는 암호화 서열을 포함할 수 있다:
(1) 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터의 살충 결정 단백질 또는 그의 살충 부분, 예를 들어 Crickmore 등(1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 807-813)에 의해 열거되고 Crickmore 등(2005)에 의해 온라인상의 http://www.lifesci.sussex.ac.uk Home/Neil_Crickmore/Bt/의 바실러스 투린지엔시스 독성 명명법에 업데이트되는 살충 결정 단백질 또는 그의 살충 부분, 예, Cry 단백질 클래스 Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1F, Cry2Ab, Cry3Aa 또는 Cry3Bb의 단백질 또는 그의 살충 부분(예, 유럽특허 제1999141호 및 국제특허출원공개 제WO2007/107302호) 또는 예를 들어 미국특허출원 제12/249,016호에 기재된 합성 유전자에 의해 암호화된 단백질; 또는
(2) 바실러스 투린지엔시스로부터의 제2의 다른 결정 단백질 또는 그 일부의 존재하에 살충성인 바실러스 투린지엔시스로부터의 결정 단백질 또는 그 일부, 예를 들어 Cry34 및 Cry35 결정 단백질로부터 제조된 2성분 독소(Moellenbeck et al. 2001, Nat. Biotechnol. 19: 668-72; Schnepf et al. 2006, Applied Environm. Microbiol. 71, 1765-1774), 또는 Cry1A 또는 Cry1F 단백질 및 Cry2Aa 또는 Cry2Ab 또는 Cry2Ae 단백질로부터 제조된 2성분 독소(미국특허출원 제12/214,022호 및 유럽특허 제08010791.5호); 또는
(3) 바실러스 투린지엔시스로부터의 상이한 살충 결정 단백질의 일부를 포함하는 하이브리드 살충 단백질, 예를 들어 상기 (1)의 단백질의 하이브리드 또는 상기 (2)의 단백질의 하이브리드, 예, 옥수수 이벤트 MON89034에 의해 생성된 Cry1A.105 단백질(국제특허출원공개 제WO2007/027777호); 또는
(4) 클로닝 또는 형질전환 동안 암호화 DNA에 도입된 변화로 인해 몇몇, 특히 1 내지 10개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교체되어 표적 곤충 종에 대해 더 높은 살충 활성을 수득하고/거나 영향받는 표적 곤충 종의 범위를 확대하는 상기 (1) 내지 (3) 중 임의의 하나의 단백질, 예를 들어 옥수수 이벤트 MON863 또는 MON88017에서 Cry3Bb1 단백질, 또는 옥수수 이벤트 MIR604에서 Cry3A 단백질; 또는
(5) 바실러스 투린지엔시스 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로부터 분비된 살충 단백질 또는 그의 살충 부분, 예를 들어 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html에 열거된 식물성 살충(vegetative insecticidal, VIP) 단백질, 예, VIP3Aa 단백질 클래스로부터의 단백질; 또는
(6) 바실러스 투린지엔시스 또는 바실러스 세레우스로부터 분비된 제2 단백질의 존재하에 살충성인 바실러스 투린지엔시스 또는 바실러스 세레우스로부터 분비된 단백질, 예를 들어 VIP1A 및 VIP2A 단백질로부터 제조된 2성분 독소(국제특허출원공개 제WO94/21795호); 또는
(7) 바실러스 투린지엔시스 또는 바실러스 세레우스로부터 분비된 상이한 단백질로부터의 일부를 포함하는 하이브리드 살충 단백질, 예를 들어 상기 (1)의 단백질의 하이브리드 또는 상기 (2)의 단백질의 하이브리드; 또는
(8) (여전히 살충 단백질을 암호화하는) 클로닝 또는 형질전환 동안 암호화 DNA에 도입된 변화로 인해 몇몇, 특히 1 내지 10개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교체되어 표적 곤충 종에 대해 더 높은 살충 활성을 수득하고/거나 영향받는 표적 곤충 종의 범위를 확대하는 상기 (5) 내지 (7) 중 임의의 하나의 단백질, 예를 들어 면 이벤트 COT102에서 VIP3Aa 단백질; 또는
(9) 바실러스 투린지엔시스로부터의 결정 단백질의 존재하에 살충성인 바실러스 투린지엔시스 또는 바실러스 세레우스로부터 분비된 단백질, 예를 들어 VIP3 및 Cry1A 또는 Cry1F로부터 제조된 2성분 독소(미국특허출원 제61/126083호 및 제61/195019호) 또는 VIP3 단백질 및 Cry2Aa 또는 Cry2Ab 또는 Cry2Ae 단백질로부터 제조된 2성분 독소(미국특허출원 제12/214,022호 및 유럽특허 제08010791.5호); 또는
(10) (여전히 살충 단백질을 암호화하는) 클로닝 또는 형질전환 동안 암호화 DNA에 도입된 변화로 인해 몇몇, 특히 1 내지 10개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교체되어 표적 곤충 종에 대해 더 높은 살충 활성을 수득하고/거나 영향받는 표적 곤충 종의 범위를 확대하는 상기 (9)의 단백질.
본원에서 사용되는 바와 같이 "곤충 저항성 유전자"는 예를 들어 국제특허출원공개 제WO2007/080126호, 제WO2006/129204호, 제WO2007/074405호, 제WO2007/080127호 및 제WO2007/035650호에 기재된 바와 같이 식물 해충에 의한 섭취 시 해충의 성장을 억제하는 이중 가닥 RNA를 발현 시 생산하는 서열을 포함하는 형질전환 유전자를 추가로 포함한다.
무생물 스트레스 내성 유전자는
(1) 국제특허출원공개 제WO00/04173호, 제WO2006/045633호, 유럽특허 제04077984.5호 또는 유럽특허 제06009836.5호에 기재된 바와 같이 식물 세포 또는 식물에서 폴리(ADP-리보스)폴리머라제(PARP) 유전자의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 형질전환 유전자.
(2) 예를 들어 국제특허출원공개 제WO2004/090140호에 기재된 바와 같이 식물 또는 식물 세포의 PARG 암호화 유전자의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 형질전환 유전자.
(3) 예를 들어 유럽특허 제04077624.7호, 국제특허출원공개 제WO2006/133827, PCT/EP07/002433, 유럽특허 제1999263호 또는 국제특허출원공개 제WO2007/107326호에 기재된 바와 같이 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 구조 합성 경로의 식물 작용성 효소, 예컨대 니코틴아미다제, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제, 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 트랜스퍼라제, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 신타제 또는 니코틴 아미드 포스포리보실트랜스퍼라제를 암호화하는 형질전환 유전자
를 포함한다.
탄수화물 생합성에 관련된 효소는 예를 들어 유럽특허 제0571427호, 국제특허출원공개 제WO95/04826호, 유럽특허 제0719338호, 국제특허출원공개 제WO96/15248호, 제WO96/19581호, 제WO96/27674호, 제WO97/11188호, 제WO97/26362호, 제WO97/32985호, 제WO97/42328호, 제WO97/44472호, 제WO97/45545호, 제WO98/27212호, 제WO98/40503호, 제W099/58688호, 제WO99/58690호, 제WO99/58654호, 제WO00/08184호, 제WO00/08185호, 제WO00/08175호, 제WO00/28052호, 제WO00/77229호, 제WO01/12782호, 제WO01/12826호, 제WO02/101059호, 제WO03/071860호, 제WO2004/056999호, 제WO2005/030942호, 제WO2005/030941호, 제WO2005/095632호, 제WO2005/095617호, 제WO2005/095619호, 제WO2005/095618호, 제WO2005/123927호, 제WO2006/018319호, 제WO2006/103107호, 제WO2006/108702호, 제WO2007/009823호, 제WO00/22140호, 제WO2006/063862호, 제WO2006/072603호, 제WO02/034923호, 유럽특허 제06090134.5호, 제06090228.5호, 제06090227.7호, 제07090007.1호, 제07090009.7호, 국제특허출원공개 제WO01/14569호, 제WO02/79410호, 제WO03/33540호, 제WO2004/078983호, 제WO01/19975호, 제WO95/26407호, 제WO96/34968호, 제WO98/20145호, 제WO99/12950, 제WO99/66050호, 제WO99/53072호, 미국특허 제6,734,341호, 국제특허출원공개 제WO00/11192호, 제WO98/22604호, 제WO98/32326호, 제WO01/98509호, 제WO2005/002359호, 미국특허 제5,824,790호, 제6,013,861호, 국제특허출원공개 제WO94/04693호, 제WO94/09144호, 제WO94/11520호, 제WO95/35026호 또는 제WO97/20936호에 기재된 것들 또는 유럽특허 제0663956호, 국제특허출원공개 제WO96/01904호, 제WO96/21023호, 제WO98/39460호 및 제WO99/24593호에 개시된 바와 같이 폴리프럭토스, 특히 이눌린 및 레반 유형의 생산에 관련된 효소, 국제특허출원공개 제WO95/31553호, 미국특허 제2002031826호, 제6,284,479호, 제5,712,107호, 국제특허출원공개 제WO97/47806호, 제WO97/47807호, 제WO97/47808호 및 제WO00/14249호에 개시된 바와 같이 알파-1,4-글루칸의 생산에 관련된 효소, 국제특허출원공개 제WO00/73422호에 개시된 바와 같이 알파-1,6 분지된 알파-1,4-글루칸의 생산에 관련된 효소, 예를 들어 국제특허출원 제WO00/47727호, 제WO00/73422호, 유럽특허 제06077301.7호, 미국특허 제5,908,975호 및 유럽특허 제0728213호에 개시된 알터난의 생산과 관련된 효소, 예를 들어 국제특허출원공개 제WO2006/032538호, 제WO2007/039314호, 제WO2007/039315호, 제WO2007/039316호, 일본특허 제2006304779호 및 국제특허출원공개 제WO2005/012529호에 개시된 히알루로난의 생산에 관련된 효소를 포함한다.
본 발명은 또한
(a) 미리 정해진 부위에 이중 가닥 DNA 단절을 유도하는 단계; 및
(b) 상기 미리 정해진 부위에 결실을 갖는 식물 세포를 선택하는 단계
를 포함하는 형질전환 식물 세포의 (핵) 게놈에서 미리 정해진 또는 미리 선택된 부위에 결실을 도입하는 방법을 제공하고, 상기 미리 정해진 부위는 자연적으로 존재하는 메가뉴클레아제에 대한 인식 부위와 상이한 뉴클레오티드 서열이고 형질전환 식물에 형질전환 유전자의 일부로 통상적으로 도입되는 뉴클레오티드 서열이고, 상기 이중 가닥 DNA 단절은 동시에 미리 정해진 부위를 인식하거나 이중 가닥 단절을 유도하는 자연적으로 존재하지 않는 단일 쇄 메가뉴클레아제 또는 한쌍의 자연적으로 존재하지 않는 메가뉴클레아제 단량체 단위체의 도입에 의해 유도된다.
본원에 기재된 바와 같이 재고안된 메가뉴클레아제를 암호화하는 키메라 유전자를 제공하는 것 또한 본 발명의 구현예이고, 여기서 키메라 유전자는 32 위치의 S; 33 위치의 Y; 38 위치의 E; 40 위치의 R; 66 위치의 K; 80 위치의 Q; 42 위치의 T; 77 위치의 R; 68 위치의 R; 70 위치의 R; 44 위치의 Q; 24 위치의 I; 26 위치의 S; 28 위치의 S 및 30 위치의 R 또는 70 위치의 R; 44 위치의 T; 24 위치의 I; 26 위치의 S; 28 위치의 S; 30 위치의 N; 32 위치의 S; 33 위치의 R; 38 위치의 Q; 80 위치의 Q; 40 위치의 R; 66 위치의 K; 42 위치의 T; 77 위치의 R 및 68 위치의 R(재고안된 메가뉴클레아제에서 아미노산 위치에 상응하는 I-CreI의 아미노산 서열에 대한 위치는 정렬에 의해 결정될 수 있다)을 포함하는, 스캐폴드로서 I-CreI의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 18의 위치 1 내지 167의 아미노산 서열 및 위치 206 내지 362의 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA 영역에 작동가능하게 연결된, 식물에서 발현가능한 프로모터를 포함한다.
본 발명의 수단 및 방법은 임의의 식물, 예컨대 옥수수, 담배, 시리얼 식물, 예컨대 밀, 귀리, 보리, 호밀, 쌀, 잔디, 수수, 기장 또는 사탕수수 식물에서 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 방법은 또한 임의의 식물(속씨식물 또는 겉씨식물), 예컨대 면, 카놀라, 유채꽃, 대두, 야채, 감자, 렘나 종(Lemna spp.), 니코티나 종, 아라비돕시스, 알팔파, 보리, 콩, 옥수수, 면, 아마, 완두콩, 유채꽃, 쌀, 호밀, 잇꽃, 수수, 대두, 해바라기, 담배, 밀, 아스파라거스, 비트 및 슈가비트, 브로콜리, 양배추, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 오이, 가지, 상추, 양파, 유채꽃, 후추, 감자, 호박, 무, 시금치, 애호박, 토마토, 긴 호박, 아몬드, 사과, 살구, 바나나, 블랙베리, 블루베리, 카카오, 체리, 코코넛, 크랜베리, 대추, 포도, 자몽, 구아바, 키위, 레몬, 라임, 망고, 멜론, 승도복숭아, 오렌지, 파파야, 패션 프루트, 복숭아, 땅콩, 배, 파인애플, 피스타치오, 자두, 라즈베리, 딸기, 감귤, 호두 및 수박(이에 한정되지 않음)에 적용될 수 있다.
본 발명의 목적은 또한 본 발명의 방법에 따라 생성된 식물 세포 및 식물을 제공하는 것이다. 전통적인 육종 방법에 의해 생산되는 DNA 삽입 이벤트를 포함하는 생식 세포, 종자, 배아, 접합자 또는 체세포, 자손 또는 하이브리드 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 그러한 식물은 표적 서열에 또는 표적 서열 대신에 삽입된 비상동 또는 외래 DNA 서열을 포함할 수 있고 교환 후 비상동 DNA 또는 DNA 서열의 존재에 의해 그들의 선조 식물과 상이할 것이다.
본원에 기재된 방법에 의해 수득된 식물은 추가로 다른 식물과의 전통적인 육종 기술에 의해 교배되어 본 발명에 따라 수득된 표적화된 DNA 삽입 이벤트를 포함하는 자손 식물을 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 식물 및 종자는 추가로 화학적 화합물, 예를 들어 하기 목록에서 선택된 화학적 화합물로 처리될 수 있다:
ㆍ과일/야채 제초제: 아트라진(Atrazine), 브로마실(Bromacil), 디우론(Diuron), 글리포세이트(Glyphosate), 리누론(Linuron), 메트리부진(Metribuzin), 시마진(Simazine), 트리플루랄린(Trifluralin), 플루아지폽(Fluazifop), 글루포시네이트(Glufosinate), 할로설푸론 고완(Halosulfuron Gowan), 파라?(Paraquat), 프로피자미드(Propyzamide), 세톡시딤(Sethoxydim), 부타페나실(Butafenacil), 할로설푸론(Halosulfuron), 인다지플람(Indaziflam)
ㆍ과일/야채 살충제: 알디카르브(Aldicarb), 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 카르바릴(Carbaryl), 카르보푸란(Carbofuran), 클로르피리포스(Chlorpyrifos), 시퍼메트린(Cypermethrin), 델타메트린(Deltamethrin), 아바멕틴(Abamectin), 시플루트린/베타-시플루트린(Cyfluthrin/beta-cyfluthrin), 에스펜발러레이트(Esfenvalerate), 람다-시할로트린(Lambda-cyhalothrin), 아세퀴노실(Acequinocyl), 비페나제이트(Bifenazate), 메톡시페노지드(Methoxyfenozide), 노발루론(Novaluron), 크로마페노지드(Chromafenozide), 티아클로프리드(Thiacloprid), 디노테푸란(Dinotefuran), 플루아크리피림(Fluacrypyrim), 스피로디클로펜(Spirodiclofen), 감마-시할로트린(Gamma-Cyhalothrin), 스피로메시펜(Spiromesifen), 스피노사드(Spinosad), 리낙시피르(Rynaxypyr), 시아지피르(Cyazypyr), 트리플루무론(Triflumuron), 스피로테트라맛(Spirotetramat), 이미다클로프리드(Imidacloprid), 플루벤디아미드(Flubendiamide), 티오디카르브(Thiodicarb), 메타플루미존(Metaflumizone), 설폭사플로르(Sulfoxaflor), 시플루메토펜(Cyflumetofen), 시아노피라펜(Cyanopyrafen), 클로티아니딘(Clothianidin), 티아메톡삼(Thiamethoxam), 스피노토람(Spinotoram), 티오디카르브(Thiodicarb), 플로니카미드(Flonicamid), 메티오카르브(Methiocarb), 에마멕틴-벤조에이트(Emamectin-benzoate), 인독사카르브(Indoxacarb), 펜아미포스(Fenamiphos), 피리프록시펜(Pyriproxifen), 펜부타틴-옥시드(Fenbutatin-oxid)
ㆍ과일/야채 살진균제: 아메톡트라딘(Ametoctradin), 아족시스트로빈(Azoxystrobin), 벤티아발리카르브(Benthiavalicarb), 보스칼리드(Boscalid), 캅탄(Captan), 카르벤다짐(Carbendazim), 클로로탈로닐(Chlorothalonil), 구리, 시아조파미드(Cyazofamid), 시플루펜아미드(Cyflufenamid), 시목사닐(Cymoxanil), 시프로코나졸(Cyproconazole), 시프로디닐(Cyprodinil), 디페노코나졸(Difenoconazole), 디메토모르프(Dimetomorph), 디티아논(Dithianon), 펜아미돈(Fenamidone), 펜헥사미드(Fenhexamid), 플루아지남(Fluazinam), 플루디옥소닐(Fludioxonil), 플루오피콜리드(Fluopicolide), 플루오피람(Fluopyram), 플루옥사스트로빈(Fluoxastrobin), 플럭사피록사드(Fluxapyroxad), 폴펫(Folpet), 포세틸(Fosetyl), 이프로디온(Iprodione), 이프로발리카르브(Iprovalicarb), 이소피라잠(Isopyrazam), 크레속심-메틸(Kresoxim-methyl), 만코제브(Mancozeb), 만디프로파미드(Mandipropamid), 메탈락실/메페녹삼((Metalaxyl/mefenoxam), 메티람(Metiram), 메트라페논(Metrafenone), 미클로부타닐(Myclobutanil), 펜코나졸(Penconazole), 펜티오피라드(Penthiopyrad), 피콕시스트로빈(Picoxystrobin), 프로파모카르브(Propamocarb), 프로피코나졸(Propiconazole), 프로피네브(Propineb), 프로퀴나지드(Proquinazid), 프로티오코나졸(Prothioconazole), 피라클로스트로빈(Pyraclostrobin), 피리메타닐(Pyrimethanil), 퀴녹시펜(Quinoxyfen), 스피록사민(Spiroxamine), 황, 테부코나졸(Tebuconazole), 티오파네이트-메틸(Thiophanate-methyl), 트리플록시스트로빈(Trifloxystrobin)
ㆍ시리얼 제초제: 2.4-D, 아미도설푸론(amidosulfuron), 브로목시닐(bromoxynil), 카르펜트라존-e(carfentrazone-e), 클로로톨루론(chlorotoluron), 클로로설푸론(chlorsulfuron), 클로디나폽-p(clodinafop-p), 클로피랄리드(clopyralid), 디캄바(dicamba), 디클로폽-m(diclofop-m), 디플루페니칸(diflufenican), 페녹사프롭(fenoxaprop), 플로라설람(florasulam), 플루카르바존-na(flucarbazone-na), 플루페나셋(flufenacet), 플루피르설푸론-m(flupyrsulfuron-m), 플루록시피르(fluroxypyr), 피우르타몬(fiurtamone), 글리포세이트(glyphosate), 요오도설푸론(iodosulfuron), 이옥시닐(ioxynil), 이소프로투론(isoproturon), mcpa, 메소설푸론(mesosulfuron), 메트설푸론(metsulfuron), 펜디메탈린(pendimethalin), 피녹사덴(pinoxaden), 프로폭시카르바존(propoxycarbazone), 프로설포카르브(prosulfocarb), 피록스설람(pyroxsulam), 설포설푸론(sulfosulfuron), 티펜설푸론(thifensulfuron), 트랄콕시딤(tralkoxydim), 트리아설푸론(triasulfuron), 트리베누론(tribenuron), 트리플루랄린(trifluralin), 트리토설푸론(tritosulfuron)
ㆍ시리얼 살진균제: 아족시스트로빈(Azoxystrobin), 비사펜(Bixafen), 보스칼리드(Boscalid), 카르벤다짐(Carbendazim), 클로로탈로닐(Chlorothalonil), 시플루펜아미드(Cyflufenamid), 시프로코나졸(Cyproconazole), 시프로디닐(Cyprodinil), 디목시스트로빈(Dimoxystrobin), 에폭시코나졸(Epoxiconazole), 펜프로피딘(Fenpropidin), 펜프로피모르프(Fenpropimorph), 플루오피람(Fluopyram), 플루옥사스트로빈(Fluoxastrobin), 플루퀸코나졸(Fluquinconazole), 플럭사피록사드(Fluxapyroxad), 이소피라잠(Isopyrazam), 크레속심-메틸(Kresoxim-methyl), 메트코나졸(Metconazole), 메트라페논(Metrafenone), 펜티오피라드(Penthiopyrad), 피콕시스트로빈(Picoxystrobin), 프로클로라즈(Prochloraz), 프로피코나졸(Propiconazole), 프로퀴나지드(Proquinazid), 프로티오코나졸(Prothioconazole), 피라클로스트로빈(Pyraclostrobin), 퀴녹시펜(Quinoxyfen), 스피록사민(Spiroxamine), 테부코나졸(Tebuconazole), 티오파네이트-메틸(Thiophanate-methyl), 트리플록시스트로빈(Trifloxystrobin)
ㆍ시리얼 살충제: 디메토에이트(Dimethoate), 람다-시할트린(Lambda-cyhalthrin), 델타메트린(Deltamethrin), 알파-시퍼메트린(alpha-Cypermethrin), 베타-시플루트린(β-cyfluthrin), 비펜트린(Bifenthrin), 이미다클로프리드(Imidacloprid), 클로티아니딘(Clothianidin), 티아메톡삼(Thiamethoxam), 티아클로프리드(Thiacloprid), 아세트아미프리드(Acetamiprid), 디네토푸란(Dinetofuran), 클로르피리포스(Clorphyriphos), 피리미카르브(Pirimicarb), 메티오카르브(Methiocarb), 설폭사플로르(Sulfoxaflor)
ㆍ옥수수 제초제: 아트라진(Atrazine), 알라클로르(Alachlor), 브로목시닐(Bromoxynil), 아세토클로르(Acetochlor), 디캄바(Dicamba), 클로피랄리드(Clopyralid), (S-)디메텐아미드(Dimethenamid), 글루포시네이트(Glufosinate), 글리포세이트(Glyphosate), 이속사플루톨(Isoxaflutole), (S-)메톨라클로르(Metolachlor), 메소트리온(Mesotrione), 니코설푸론(Nicosulfuron), 프리미설푸론(Primisulfuron), 림설푸론(Rimsulfuron), 설코트리온(Sulcotrione), 포람설푸론(Foramsulfuron), 토프라메존(Topramezone), 템보트리온(Tembotrione), 사플루페나실(Saflufenacil), 티엔카르바존(Thiencarbazone), 플루페나셋(Flufenacet), 피록사설폰(Pyroxasulfon)
ㆍ옥수수 살충제: 카르보푸란(Carbofuran), 클로르피리포스(Chlorpyrifos), 비펜트린(Bifenthrin), 피프로닐(Fipronil), 이미다클로프리드(Imidacloprid), 람다-시할로트린(Lambda-Cyhalothrin), 테플루트린(Tefluthrin), 테르부포스(Terbufos), 티아메톡삼(Thiamethoxam), 클로티아니딘(Clothianidin), 스피로메시펜(Spiromesifen), 플루벤디아미드(Flubendiamide), 트리플루무론(Triflumuron), 리낙시피르(Rynaxypyr), 델타메트린(Deltamethrin), 티오디카르브(Thiodicarb), 베타-시클루트린(β-Cyfluthrin), 시퍼메트린(Cypermethrin), 비펜트린(Bifenthrin), 루페누론(Lufenuron), 테부피림포스(Tebupirimphos), 에티프롤(Ethiprole), 시아지피르(Cyazypyr), 티아클로프리드(Thiacloprid), 아세트아미프리드(Acetamiprid), 디네토푸란(Dinetofuran), 아베르멕틴(Avermectin)
ㆍ옥수수 살진균제: 아족시스트로빈(Azoxystrobin), 비사펜(Bixafen), 보스칼리드(Boscalid), 시프로코나졸(Cyproconazole), 디목시스트로빈(Dimoxystrobin), 에폭시코나졸(Epoxiconazole), 페니트로판(Fenitropan), 플루오피람(Fluopyram), 플루옥사스트로빈(Fluoxastrobin), 플럭사피록사드(Fluxapyroxad), 이소피라잠(Isopyrazam), 메트코나졸(Metconazole), 펜티오피라드(Penthiopyrad), 피콕시스트로빈(Picoxystrobin), 프로피코나졸(Propiconazole), 프로티오코나졸(Prothioconazole), 피라클로스트로빈(Pyraclostrobin), 테부코나졸(Tebuconazole), 트리플록시스트로빈(Trifloxystrobin)
ㆍ쌀 제초제: 부타클로르(Butachlor), 프로파닐(Propanil), 아짐설푸론(Azimsulfuron), 벤설푸론(Bensulfuron), 시할로폽(Cyhalofop), 다이무론(Daimuron), 펜트라즈아미드(Fentrazamide), 이마조설푸론(Imazosulfuron), 메페나셋(Mefenacet), 옥사지클로메폰(Oxaziclomefone), 피라조설푸론(Pyrazosulfuron), 피리부티카르브(Pyributicarb), 퀸클로락(Quinclorac), 티오벤카르브(Thiobencarb), 인다노판(Indanofan), 플루페나셋(Flufenacet), 펜트라즈아미드(Fentrazamide), 할로설푸론(Halosulfuron), 옥사지클로메폰(Oxaziclomefone), 벤조비시클론(Benzobicyclon), 피리프탈리드(Pyriftalid), 페녹설람(Penoxsulam), 비스피리박(Bispyribac), 옥사디아르길(Oxadiargyl), 에톡시설푸론(Ethoxysulfuron), 프레틸라클로르(Pretilachlor), 메소트리온(Mesotrione), 테푸릴트리온(Tefuryltrione), 옥사디아존(Oxadiazone), 페녹사프롭(Fenoxaprop), 피리미설판(Pyrimisulfan)
ㆍ쌀 살충제: 디아지논(Diazinon), 페노부카르브(Fenobucarb), 벤푸라카르브(Benfuracarb), 부프로페진(Buprofezin), 디노테푸란(Dinotefuran), 피프로닐(Fipronil), 이미다클로프리드(Imidacloprid), 이소프로카르브(Isoprocarb), 티아클로프리드(Thiacloprid), 크로마페노지드(Chromafenozide), 클로티아니딘(Clothianidin), 에티프롤(Ethiprole), 플루벤디아미드(Flubendiamide), 리낙시피르(Rynaxypyr), 델타메트린(Deltamethrin), 아세트아미프리드(Acetamiprid), 티아메톡삼(Thiamethoxam), 시아지피르(Cyazypyr), 스피노사드(Spinosad), 스피노토람(Spinotoram), 에마멕틴-벤조에이트(Emamectin-Benzoate), 시퍼메트린(Cypermethrin), 클로르피리포스(Chlorpyriphos), 에토펜프록스(Etofenprox), 카르보푸란(Carbofuran), 벤푸라카르브(Benfuracarb), 설폭사플로르(Sulfoxaflor)
ㆍ쌀 살진균제: 아족시스트로빈(Azoxystrobin), 카르벤다짐(Carbendazim), 카르프로파미드(Carpropamid), 디클로시멧(Diclocymet), 디페노코나졸(Difenoconazole), 에디펜포스(Edifenphos), 페림존(Ferimzone), 젠타마이신(Gentamycin), 헥사코나졸(Hexaconazole), 히멕사졸(Hymexazol), 이프로벤포스(Iprobenfos, IBP), 이소프로티올란(Isoprothiolane), 이소티아닐(Isotianil), 카수가마이신(Kasugamycin), 만코제브(Mancozeb), 메토미노스트로빈(Metominostrobin), 오리사스트로빈(Orysastrobin), 펜시쿠론(Pencycuron), 프로베나졸(Probenazole), 프로피코나졸(Propiconazole), 프로피네브(Propineb), 피로퀼론(Pyroquilon), 테부코나졸(Tebuconazole), 티오파네이트-메틸(Thiophanate-methyl), 티아디닐(Tiadinil), 트리시클라졸(Tricyclazole), 트리플록시스트로빈(Trifloxystrobin), 발리다마이신(Validamycin)
ㆍ면 제초제: 디우론(Diuron), 플루오메투론(Fluometuron), MSMA, 옥시플루오르펜(Oxyfluorfen), 프로메트린(Prometryn), 트리플루랄린(Trifluralin), 카르펜트라존(Carfentrazone), 클레토딤(Clethodim), 플루아지폽-부틸(Fluazifop-butyl), 글리포세이트(Glyphosate), 노르플루라존(Norflurazon), 펜디메탈린(Pendimethalin), 피리티오박-나트륨(Pyrithiobac-sodium), 트리플록시설푸론(Trifloxysulfuron), 테프랄록시딤(Tepraloxydim), 글루포시네이트(Glufosinate), 플루미옥사진(Flumioxazin), 티디아주론(Thidiazuron)
ㆍ면 살충제: 아세페이트(Acephate), 알리카르브(Aldicarb), 클로르피리포스(Chlorpyrifos), 시퍼메트린(Cypermethrin), 델타메트린(Deltamethrin), 아바멕틴(Abamectin), 아세트아미프리드(Acetamiprid), 에마멕틴 벤조에이트(Emamectin Benzoate), 이미다클로프리드(Imidacloprid), 인독사카르브(Indoxacarb), 람다-시할로트린(Lambda-Cyhalothrin), 스피노사드(Spinosad), 티오디카르브(Thiodicarb), 감마-시할로트린(Gamma-Cyhalothrin), 스피로메시펜(Spiromesifen), 피리달릴(Pyridalyl), 플로니카미드(Flonicamid), 플루벤디아미드(Flubendiamide), 트리플루무론(Triflumuron), 리낙시피르(Rynaxypyr), 베타-시플루트린(Beta-Cyfluthrin), 스피로테트라맛(Spirotetramat), 클로티아니딘(Clothianidin), 티아메톡삼(Thiamethoxam), 티아클로프리드(Thiacloprid), 디네토푸란(Dinetofuran), 플루벤디아미드(Flubendiamide), 시아지피르(Cyazypyr), 스피노사드(Spinosad), 스피노토람(Spinotoram), 감마 시할로트린(gamma Cyhalothrin), 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-디플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 티오디카르브(Thiodicarb), 아베르멕틴(Avermectin), 플로니카미드(Flonicamid), 피리달릴(Pyridalyl), 스피로메시펜(Spiromesifen), 설폭사플로르(Sulfoxaflor)
ㆍ면 살진균제: 아족시스트로빈(Azoxystrobin), 비사펜(Bixafen), 보스칼리드(Boscalid), 카르베나짐(Carbendazim), 클로로탈로닐(Chlorothalonil), 구리, 시프로코나졸(Cyproconazole), 디페노코나졸(Difenoconazole), 디목시스트로빈(Dimoxystrobin), 에폭시코나졸(Epoxiconazole), 펜아미돈(Fenamidone), 플루아지남(Fluazinam), 플루오피람(Fluopyram), 플루옥사스트로빈(Fluoxastrobin), 플럭사피록사드(Fluxapyroxad), 이프로디온(Iprodione), 이소피라잠(Isopyrazam), 이소티아닐(Isotianil), 만코제브(Mancozeb), 마네브(Maneb), 메토미노스트로빈(Metominostrobin), 펜티오피라드(Penthiopyrad), 피콕시스트로빈(Picoxystrobin), 프로피네브(Propineb), 프로티오코나졸(Prothioconazole), 피라클로스트로빈(Pyraclostrobin), 퀸토젠(Quintozene), 테부코나졸(Tebuconazole), 테트라코나졸(Tetraconazole), 티오파네이트-메틸(Thiophanate-methy)l, 트리플록시스트로빈(Trifloxystrobin)
ㆍ대두 제초제: 알라클로르(Alachlor), 벤타존(Bentazone), 트리플루랄린(Trifluralin), 클로르이무론-에틸(Chlorimuron-Ethyl), 클로르안설람-메틸(Cloransulam-Methyl), 페녹사프롭(Fenoxaprop), 포메사펜(Fomesafen), 플루아지폽(Fluazifop), 글리포세이트(Glyphosate), 이마자목스(Imazamox), 이마자퀸(Imazaquin), 이마제타피르(Imazethapyr), (S-)메톨라클로르(Metolachlor), 메트리부진(Metribuzin), 펜디메탈린(Pendimethalin), 테프랄록시딤(Tepraloxydim), 글루포시네이트(Glufosinate)
ㆍ대두 살충제: 람다-시할로트린(Lambda-cyhalothrin), 메토밀(Methomyl), 이미다클로프리드(Imidacloprid), 클로티아니딘(Clothianidin), 티아메톡삼(Thiamethoxam), 티아클로프리드(Thiacloprid), 아세트아미프리드(Acetamiprid), 디네토푸란(Dinetofuran), 플루벤디아미드(Flubendiamide), 리낙시피르(Rynaxypyr), 시아지피르(Cyazypyr), 스피노사드(Spinosad), 스피노토람(Spinotoram), 에마멕틴-벤조에이트(Emamectin-Benzoate), 피프로닐(Fipronil), 에티프롤(Ethiprole), 델타메트린(Deltamethrin), 베타-시플루트린(β-Cyfluthrin), 감마 및 람다 시할로트린(gamma and lambda Cyhalothrin), 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-디플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 스피로테트라맛, 스피노디클로펜(Spinodiclofen), 트리플루무론(Triflumuron), 플로니카미드(Flonicamid), 티오디카르브(Thiodicarb), 베타-시플루트린(beta-Cyfluthrin)
ㆍ대두 살진균제: 아족시스트로빈(Azoxystrobin), 비사펜(Bixafen), 보스칼리드(Boscalid), 카르벤다짐(Carbendazim), 클로로탈로닐(Chlorothalonil), 구리, 시프로코나졸(Cyproconazole), 디페노코나졸(Difenoconazole), 디목시스트로빈(Dimoxystrobin), 에폭시코나졸(Epoxiconazole), 플루아지남(Fluazinam), 플루오피람(Fluopyram), 플루옥사스트로빈(Fluoxastrobin), 플루트리아폴(Flutriafol), 플럭사피록사드(Fluxapyroxad), 이소피라잠(Isopyrazam), 이프로디온(Iprodione), 이소티아닐(Isotianil), 만코제브(Mancozeb), 마네브(Maneb), 메트코나졸(Metconazole), 메토미노스트로빈(Metominostrobin), 미클로부타닐(Myclobutanil), 펜티오피라드(Penthiopyrad), 피콕시스트로빈(Picoxystrobin), 프로피코나졸(Propiconazole), 프로피네브(Propineb), 프로티오코나졸(Prothioconazole), 피라클로스트로빈(Pyraclostrobin), 테부코나졸(Tebuconazole), 테트라코나졸(Tetraconazole), 티오파네이트-메틸(Thiophanate-methyl), 트리플록시스트로빈(Trifloxystrobin)
ㆍ슈가비트 제초제: 클로리다존(Chloridazon), 데스메디팜(Desmedipham), 에토푸메세이트(Ethofumesate), 펜메디팜(Phenmedipham), 트리알레이트(Triallate), 클로피랄리드(Clopyralid), 플루아지폽(Fluazifop), 레나실(Lenacil), 메타미트론(Metamitron), 퀸메락(Quinmerac), 시클록시딤(Cycloxydim), 트리플루설푸론(Triflusulfuron), 테프랄록시딤(Tepraloxydim), 퀴잘로폽(Quizalofop)
ㆍ슈가비트 살충제: 이미다클로프리드(Imidacloprid), 클로티아니딘(Clothianidin), 티아메톡삼(Thiamethoxam), 티아클로프리드(Thiacloprid), 아세트아미프리드(Acetamiprid), 디네토푸란(Dinetofuran), 델타메트린(Deltamethrin), 베타-시플루트린(β-Cyfluthrin), 감마/람다 시할로트린(gamma/lambda Cyhalothrin), 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-디플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 테플루트린(Tefluthrin), 리낙시피르(Rynaxypyr), 시악시피르(Cyaxypyr), 피프로닐(Fipronil), 카르보푸란(Carbofuran)
ㆍ카놀라 제초제: 시클로피랄리드(Clopyralid), 디클로폽(Diclofop), 플루아지폽(Fluazifop), 글루포시네이트(Glufosinate), 글리포세이트(Glyphosate), 메타자클로르(Metazachlor), 트리플루랄린(Trifluralin) 에타메트설푸론(Ethametsulfuron), 퀸메락(Quinmerac), 퀴잘로폽(Quizalofop), 클레토딤(Clethodim), 테프랄록시딤(Tepraloxydim)
ㆍ카놀라 살진균제: 아족시스트로빈(Azoxystrobin), 비사펜(Bixafen), 보스칼리드(Boscalid), 카르벤다짐(Carbendazim), 시프로코나졸(Cyproconazole), 디페노코나졸(Difenoconazole), 디목시스트로빈(Dimoxystrobin), 에폭시코나졸(Epoxiconazole), 플루아지남(Fluazinam), 플루오피람(Fluopyram), 플루옥사스트로빈(Fluoxastrobin), 플루실라졸(Flusilazole), 플럭사피록사드(Fluxapyroxad), 이프로디온(Iprodione), 이소피라잠(Isopyrazam), 메피?-클로라이드(Mepiquat-chloride), 메트코나졸(Metconazole), 메토미노스트로빈(Metominostrobin), 파클로부트라졸(Paclobutrazole), 펜티오피라드(Penthiopyrad), 피콕시스트로빈(Picoxystrobin), 프로클로라즈(Prochloraz), 프로티오코나졸(Prothioconazole), 피라클로스트로빈(Pyraclostrobin), 테부코나졸(Tebuconazole), 티오파네이트-메틸(Thiophanate-methyl), 트리플록시스트로빈(Trifloxystrobin), 빈클로졸린(Vinclozolin)
ㆍ카놀라 살충제: 카르보푸란(Carbofuran), 티아클로프리드(Thiacloprid), 델타메트린(Deltamethrin), 이미다클로프리드(Imidacloprid), 클로티아니딘(Clothianidin), 티아메톡삼(Thiamethoxam), 아세트아미프리드(Acetamiprid), 이네토피란(Dinetofiiran), 베타-시플루트린(β-Cyfluthrin), 감마 및 람다 시할로트린, 타우-플루발러리에이트(tau-Fluvaleriate), 에티프롤(Ethiprole), 스피노사드(Spinosad), 스피노토람(Spinotoram), 플루벤디아미드(Flubendiamide), 리낙시피르(Rynaxypyr), 시아지피르(Cyazypyr), 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-디플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온.
본원에서 사용된 바와 같이 "포함하는"은 지칭되는 바와 같은 기술된 특징, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 특정하는 것으로 해석되지만 하나 이상의 특징, 정수, 단계 또는 성분, 또는 그의 군의 존재 또는 첨가를 불가능하게 하는 것은 아니다. 그러므로 예를 들어 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열을 포함하는 핵산 또는 단백질은 실제로 인용된 것들보다 더 많은 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 즉 더 큰 핵산 또는 단백질에 들어있을 수 있다. 기능적으로 또는 구조적으로 정의된 DNA 영역을 포함하는 키메라 유전자는 추가적인 DNA 영역 등을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "식물 일부"는 임의의 식물 기관 또는 식물 조직, 예컨대 열매, 종자, 배아, 분열(meristematic) 영역, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 싹, 꽃, 배우체, 포자체, 꽃가루 및 소포자(이에 한정되지 않음)를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해 %로 표현되는, 2개의 관련된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 서열에서 동일한 잔기를 갖는 위치의 수(x 100)를 비교된 위치의 수로 나눈 것을 지칭한다. 차이, 즉 정렬에서 잔기가 하나의 서열에는 존재하나 다른 서열에는 존재하지 않는 위치는 동일하지 않은 잔기를 갖는 위치로 여겨진다. 2개의 서열의 정렬은 니들만과 운슈 알고리즘에 의해 수행된다(Needleman and Wunsch 1970). 상기의 컴퓨터 보조의 서열 정렬은 표준 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 50의 캡 크리에이션 페널티(gap creation penalty) 및 3의 갭 익스텐션 페널티(gap extension penalty)를 갖는 표준 점수 행렬을 사용하는 위스콘신 패키지 버전 10.1(유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 일부인 GAP를 사용하여 편리하게 수행될 수 있다.
RNA 분자의 뉴클레오티드 서열이 상응하는 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 참조하여 정의될 때마다 뉴클레오티드 서열 중의 티민(T)이 우라실(U)에 의해 교체되어야 한다는 것은 분명할 것이다. RNA 분자에 대해 참조되는지 또는 DNA 분자에 대해 참조되는지는 적용의 맥락으로부터 분명할 것이다.
하기 비제한 예는 식물 게놈에 이미 존재하는 바 암호화 영역의 부위에서 식물을 변경시키기 위한 재고안된 메가뉴클레아제의 용도를 기재한다.
실시예에서 달리 기술되지 않으면 모든 재조합 DNA 기술은 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY and in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA]에 기재된 바와 같은 표준 프로토콜에 따라 수행된다. 식물 분자 작업을 위한 표준 물질 및 방법은 문헌[Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy, jointly published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UK]에 기재된다. 표준 분자 생물학 기술에 대한 다른 참조는 문헌[Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK)]을 포함한다. 폴리머라제 연쇄 반응을 위한 표준 물질 및 방법은 문헌[Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and in McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany]에서 발견될 수 있다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허출원 및 특허공개는 모든 목적을 위해 전체가 참조로 본원에 혼입된다.
상세한 설명 및 실시예에 걸쳐 하기 서열에 대해 참조가 이루어진다:
서열번호 1: 재고안된 메가뉴클레아제 BAY 39/BAY 40 인식 부위의 뉴클레오티드 서열
서열번호 2: 재고안된 메가뉴클레아제 BAY 39/BAY 40 인식 부위의 상보체의 뉴클레오티드 서열
서열번호 3: 바 유전자 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열
서열번호 4: 한 쌍의 이형이량체 메가뉴클레아제 BAY 39 및 BAY 40을 발현하는 벡터 pCV177의 뉴클레오티드 서열
서열번호 5: 메가뉴클레아제 BAY 39/40 단량체 단위체 2("40")의 아미노산 서열
서열번호 6: 메가뉴클레아제 BAY 39/40 단위체 1("39")의 아미노산 서열
서열번호 7: BAY 39/40 인식 부위 주위의 바 암호화 영역의 PCR 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열(대조군)
서열번호 8: BAY 39/40 인식 부위 주위의 바 암호화 영역의 PCR 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열(PPT 내성 라인)
서열번호 9: BAY 39/40 인식 부위 주위의 바 암호화 영역의 PCR 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열(PPT 민감성 라인 1)
서열번호 10: BAY 39/40 인식 부위 주위의 바 암호화 영역의 PCR 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열(PPT 민감성 라인 2)
서열번호 11: BAY 39/40 인식 부위 주위의 바 암호화 영역의 PCR 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열(PPT 민감성 라인 3)
서열번호 12: BAY 39/40 인식 부위 주위의 바 암호화 영역의 PCR 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열(PPT 민감성 라인 4)
서열번호 13: BAY 39/40 인식 부위 주위의 바 암호화 영역의 PCR 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열(PPT 민감성 라인 5)
서열번호 14: BAY 39/40 인식 부위 주위의 바 암호화 영역의 PCR 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열(PPT 민감성 라인 6)
서열번호 15: BAY 39/40 인식 부위 주위의 바 암호화 영역의 PCR 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열(PPT 민감성 라인 7)
서열번호 16: I-CreI의 자연적인 변이의 아미노산 서열(단량체)
서열번호 17: 단일 쇄 BAY 39/BAY 40 메가뉴클레아제를 발현하는 벡터 pCV170의 뉴클레오티드 서열
서열번호 18: 단일 쇄 BAY 39/BAY 40 메가뉴클레아제의 아미노산 서열
실시예
본원에 기재된 모든 재고안된 메가뉴클레아제는 프리시즌 바이오사이언시즈 인코포레이티드(Precision Biosciences Inc., 미국 노쓰캐롤라이나주 27713 리서치 트라이앵글 파크 티더블유 알렉산더 드라이브 104 소재)에 의해 고안되었다.
실시예 1: 본 발명에 따른 재고안된 메가뉴클레아제를 암호화하는 T- DNA 벡터의 기재
종래 재조합 DNA 기술을 사용하여 이형이량체로서 서열번호 1 또는 2의 뉴클레오티드 서열을 인식하는 한 쌍의 재고안된 메가뉴클레아제를 암호화하는 키메라 유전자(hd BAY 39/40)를 구축하였고 다음의 작동가능하게 연결된 DNA 절편을 포함한다:
ㆍCaMV35S 프로모터를 암호화하는 DNA 영역(서열번호 6의 뉴클레오티드 위치 1516 내지 뉴클레오티드 위치 1933, 예를 들어 서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 1516 내지 뉴클레오티드 위치 1997)
ㆍN-말단에서 SV40 NLS에 작동가능하게 연결된, BAY 39/40 단량체 단위체 2 암호화 영역을 포함하는 DNA 영역(서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 2004 내지 2525, 예컨대 종료 코돈 또는 종료 코돈을 제외한 2522)
ㆍ노팔린 신타제 유전자의 3' 말단 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관련된 DNA 영역(서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 2530 내지 2783)
ㆍCaMV35S 프로모터를 암호화하는 DNA 영역(서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 4397 내지 뉴클레오티드 위치 4814, 예를 들어 서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 4397 내지 뉴클레오티드 위치 4878)
ㆍN-말단에서 SV40 NLS에 작동가능하게 연결된, BAY 39/40 단량체 단위체 1을 포함하는 DNA 영역(서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 4885 내지 5405, 예컨대 종료 코돈 또는 종료 코돈을 제외한 5403)
ㆍ노팔린 신타제 유전자로부터의 3' 말단 전사 종료 및 폴리아데닐화에 관련된 DNA 영역(서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 5411 내지 5664)
생성된 플라스미드의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4로 제시된다.
종래 재조합 DNA 기술을 사용하여 서열번호 1 또는 2의 뉴클레오티드 서열을 인식하는 단일 쇄의 재고안된 메가뉴클레아제를 암호화하는 키메라 유전자(sc BAY 39/40)를 구축하였고 다음의 작동가능하게 연결된 DNA 절편을 포함한다:
ㆍCaMV35S 프로모터를 암호화하는 DNA 영역(서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 691 내지 뉴클레오티드 위치 1223)
ㆍ아라비돕시스 탈리아나 rbcS ATS1A 유전자로부터의 리더 서열; 서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 1224 내지 뉴클레오티드 위치 1266; Krebbers et al. 1988 Plant Molecular Biology 11:745-759
ㆍ담배에서의 발현에 최적화된, N-말단에서 SV40 NLS에 작동가능하게 연결된 단일 쇄 BAY 39/40 메가뉴클레아제의 N-말단 영역을 암호화하는 DNA 영역
ㆍ감자의 광 유도가능한 조직 특이적인 ST-LS1 유전자의 제2 인트론을 암호화하는 DNA 영역(서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 1606 내지 1794; X04753; Eckes et al. 1986 Mol. Gen. Genet. 205, 14-22)
ㆍ담배에서의 발현에 최적화된, 링커 서열을 암호화하는 DNA 영역(서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 1757 내지 2070)을 포함하는, 단일 쇄 BAY 39/40 메가뉴클레아제의 C-말단 영역을 암호화하는 DNA 영역(서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 1795 내지 1798, 예컨대 종료 코돈 또는 종료 코돈을 제외한 2541)
ㆍ35S 유전자로부터의 3' 말단 종료 및 폴리아데닐화에 관련된 DNA 영역(서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 2545 내지 2678)
생성된 플라스미드의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 17로 제시된다.
실시예 2: 표적 담배 라인의 기재 및 분석
이중 가닥 DNA 단절 도입을 위한 분석을 개발하기 위해 식물에서 발현가능한 프로모터의 제어 하에 바 암호화 영역을 포함하는, 포스피노트리신(phosphinotricin, PPT) 내성 담배 형질전환 식물 라인을 선택하였다.
hd BAY 39/40 메가뉴클레아제를 암호화하는 키메라 유전자가 안정적으로 또는 일시적으로 히그로마이신에 저항성을 부여하는 히그로마이신포스포트랜스퍼라제를 포함하는, 식물에서 발현가능한 키메라 유전자와 함께 도입된 형질전환에서 상기 형질전환 라인을 시작 물질로 사용하였다.
BAY 39/40 이형이량체를 암호화하는 식물에서 발현가능한 키메라 유전자의 발현을 통해 바 암호화 영역의 인식 부위에 이중 가닥 DNA 단절 유도 후, 단절은 복구 DNA 부재 하에 비상동 말단결합에 의해 복구될 수 있어 하나 이상의 염기 쌍의 결실 또는 삽입을 초래하여 바 암호화 영역을 파괴함으로써 포스피노트리신 민감성을 초래한다.
포스피노트리신 민감성 및 히그로마이신 저항성을 나타내는 몇몇 식물 라인을 선택하였다. 이들 식물 라인으로부터 DNA 절편을 바 암호화 영역의 인식 부위(서열번호 1 또는 2)의 양 옆에 위치한 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하여 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 상이한 뉴클레오티드 서열의 정렬은 도 5에 제시하였다.
PPT 민감성 식물 라인(3 내지 9)에서 BAY 39/40의 인식 부위는 결실(3 내지 8) 또는 삽입(9)에 의해 변경된 반면 PPT 저항성 식물 라인(2)에서는 변경이 발견되지 않았음이 분명하다.
그러므로 이들 실험으로부터 hd BAY 39/40이 미리 선택된 부위에서 절단 활성을 나타낸다고 결론지을 수 있다.
실시예 3: 비상동 말단결합에 의한 표적화된 삽입
선택가능한 표지, 예를 들어 2mepsp 암호화 영역을 포함하는 식물에서 발현가능한 키메라 유전자를 포함하는 복구 DNA와 함께 hd BAY 39/40 메가뉴클레아제를 암호화하는 키메라 유전자를 포함하는 pCV177 또는 sc BAY 39/40을 암호화하는 키메라 유전자를 포함하는 pCV170를 (표적 영역과의 추가적인 상동성 없이) 게놈에 통합된, 식물에서 발현가능한 키메라 바 유전자를 포함하는 식물 세포로 공동 전달하는 것 및 선택 화합물, 예를 들어 글리포세이트에 내성인 포스피노트리신 민감성 식물의 선택은 복구 DNA 서열이 바 암호화 영역에 통합된 식물 세포의 확인을 가능하게 한다.
실시예 4: 상동 말단결합에 의한 표적화된 삽입
선택가능한 표지, 예를 들어 서열번호 3의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 132의 바 암호화 영역과 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 측면 서열에 의해 상류에 이웃하고 서열번호 3의 뉴클레오티드 154 내지 뉴클레오티드 552의 바 암호화 영역에 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 측면 서열에 의해 하류에 이웃한 2mepsp 암호화 영역을 포함하는, 식물에서 발현가능한 키메라 유전자를 포함하는 복구 DNA와 함께 hd BAY 39/40 메가뉴클레아제를 암호화하는 키메라 유전자를 포함하는 pCV177 또는 sc BAY 39/40를 암호화하는 키메라 유전자를 포함하는 pCV170를 게놈에 통합된, 식물에서 발현가능한 키메라 바 유전자를 포함하는 식물 세포에 공동 전달하는 것 및 선택 화합물, 예를 들어 글리포세이트에 내성인 포스피노트리신 민감성 식물을 선택하는 것은 복구 DNA가 바 암호화 영역에 통합된 식물 세포의 확인을 가능하게 한다.
실시예 5: 면에서 BAY 39/40 단일 쇄 및 이형이량체 메가뉴클레아제를 사용한 표적화된 이중 가닥 DNA 단절 유도
CSVMV 프로모터 조절 하에 바 유전자를 포함하는 키메라 유전자를 포함하는 PPT 저항성 면 식물로부터의 배발생 캘러스를 2g/L 활성 탄소를 갖는 M100 기질(MS 염, B5 비타민, MES 0.5g/L, MgCl2.6H20 0.94g/L, 겔라이트 2g/L, 글루코스 30 g/L, pH 5.8)에서 성장시켰다. 이들 캘러스를 문헌[Sanford et al., 1992]에 기재된 바와 같이 본질적으로 바이오라드(BioRAD) PPS_1000/He 생물학적 입자(Biolistic Particle) 전달 시스템을 사용한 미세입자 충격을 가하였고 이에 따라 입자는 이형이량체 BAY 39/40 메가뉴클레아제를 암호화하는 pCV177 벡터 또는 단일 쇄 BAY 39/40 메가뉴클레아제를 암호화하는 pCV170 벡터로 코팅되었다. 선택가능한 표지 유전자로서 글리포세이트 내성을 부여하는 식물에서 발현가능한 프로모터의 제어 하에 2mepsps 유전자를 포함하는 벡터와 함께 메가뉴클레아제 벡터를 동시 전달하였다. 충격 후 캘러스를 1mM 글리포세이트를 포함하는 배지에 옮겨 약 3000개의 글리포세이트 저항성 배발생 캘러스를 초래하였다. 이들 중 PPT 민감성인 85 이벤트가 나타났고 이들 중 79 이벤트를 추가로 분자적으로 분석하였다. 이들 79 이벤트를 표적 부위에 이웃하는 프라이머를 사용한 PCR 및 PCR 산물의 후속 서열분석에 의해 유전자형에 대해 특징지었다. PCR 산물이 없는 것은 표적 부위 주위의 큰 결실의 표시이다(표 1).
PPT 민감성이고 글리포세이트 저항성인 형질전환 이벤트의 특성화
pCV170(sc)
수득가능한 PCR 산물		 이벤트 수 표적 부위에서의 변화 이벤트 수
없음 11 큰 결실 11
있음 8 돌연변이 없음 6
교체/삽입 1
결실 1
pCV177(hd)
수득가능한 PCR 산물		 이벤트 수 표적 부위에서의 변화 이벤트 수
없음 33 큰 결실 33
있음 27 돌연변이 없음 19
교체/삽입 4
결실 4
그러므로 이들 결과는 단일 쇄 및 이형이량체 BAY 39/40 메가뉴클레아제 둘 다 원하는 위치에서 표적화된 이중 가닥 DNA 단절을 유도할 수 있고 표적화된 결실, 교체 및 삽입 이벤트가 면에서 이들 메가뉴클레아제를 사용하여 수득될 수 있음을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer CropScience N.V. <120> Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering <130> BCS10-2010-KRw1 <140> PCT/EP2011/002895 <141> 2011-06-07 <150> EP10005941.9 <151> 2010-06-09 <150> US61/355,849 <151> 2010-06-17 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recognition site for BAY39/40 <400> 1 gacgaggtcg tccgtccact cc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Complement of the recognition site for BAY39/40 <400> 2 ggagtggacg gacgacctcg tc 22 <210> 3 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Coding region of the phosphinotricin actelyltransferase gene derived from S. hygroscopicus (bar) <400> 3 atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60 gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120 caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180 gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240 aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300 ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360 agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420 ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480 gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540 accgagatct ga 552 <210> 4 <211> 6234 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Plasmid pCV177 <220> <221> CDS <222> (2004)..(2522) <220> <221> CDS <222> (4885).. (5403) <400> 4 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60 cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180 aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240 ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300 ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360 tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420 tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480 actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540 gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600 acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660 gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720 acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780 gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840 ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900 gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960 cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020 agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080 catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140 tcctttttgc tagcgagagg cggtttgcgt attggctaga gcagcttgcc aacatggtgg 1200 agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg 1260 ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat cgggaaacct cctcggattc cattgcccag 1320 ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag aaaaggaagg tggcacctac aaatgccatc 1380 attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg 1440 gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc 1500 aagtggattg atgtgaacat ggtggagcac gacactctcg tctactccaa gaatatcaaa 1560 gatacagtct cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt aatatcggga 1620 aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcaaaaggac agtagaaaag 1680 gaaggtggca cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcgt tcaagatgcc 1740 tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 1800 gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg 1860 gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt 1920 catttggaga ggacacgctg aaatcaccag tctctctcta caaatctatc tctctcgagc 1980 tttcgcagat ctgtcgaacc acc atg gca ccg aag aag aag cgc aag gtg cat 2033 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His 1 5 10 atg aac acc aag tac aac aag aag ttc ctg ctc tac ctg gcg gyc ttc 2081 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Lys Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 15 20 25 gtg gac ggg gac ggc tcc atc atc gcc tcc atc tcc ccg aac cag tcc 2129 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Ser Ile Ser Pro Asn Gln Ser 30 35 40 cgc aag ttc aag cat cag ctg cgc ctc acc ttc acc gtc acc cag aag 2177 Arg Lys Phe Lys His Gln Leu Arg Leu Thr Phe Thr Val Thr Gln Lys 45 50 55 aca cag cgc cgt tgg ttc ctc gac aag ctg gtg gac aaq atc ggg gtg 2225 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Lys Ile Gly Val 60 65 70 ggc aag gtg cgc gac cgc ggc agc gtc tcc gac tac cgc ctg tcc cag 2273 Gly Lys Val Arg Asp Arg Gly ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Gln 75 80 85 90 atc aag cct ctg cac aac ttc ctg acc cag ctc cag ccc ttc ctg aag 2321 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 95 100 105 ctc aag cag aag cag gcc aac ctc gtg ctg aag atc atc gag cag ctg 2369 Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 110 115 120 ccc tcc gcc aag gaa tcc ccg gac aag ttc ctg gag gtg tgc acc tgg 2417 Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 125 130 135 gtg gac cag atc gcc gct ctg aac gac tcc aag acc cgc aag acc act 2465 Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 140 145 150 tcc gag acc gtc cgc gcc gtt cta gac agt ctc tcc gag aag aag aag 2513 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 155 160 165 170 tcg tcc ccc tagcatgccg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag 2562 Ser Ser Pro attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa 2622 gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag 2682 agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 2742 taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gcccgggaat aaaatatctt 2802 tattttcatt acatctgtgt gttggttttt tgtgtgaatc gatagtacta acatacgctc 2862 tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac tagcaaaata ggctgtcccc agtgcaagtg 2922 caggtgccag aacatttctc tgctagcctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 2982 ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 3042 ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 3102 ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 3162 ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 3222 ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 3282 tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 3342 tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 3402 tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 3462 tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 3522 gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 3582 tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 3642 ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 3702 gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 3762 gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc 3822 cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 3882 ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 3942 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 4002 ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cttgagaggc ggtttgcgta ttggctagag 4062 cagcttgcca acatggtgga gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat caaagataca 4122 gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc 4182 ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcaaaa ggacagtaga aaaggaaggt 4242 ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaqgcta tcgttcaaga tgcctctgcc 4302 gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt 4362 ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgaacatg gtggagcacg acactctcgt 4422 ctactccaag aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca 4482 acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat 4542 caaaaggaca gtagaaaagg aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa 4602 ggctatcgtt caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag 4662 gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga 4722 tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc 4782 tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctac 4842 aaatctatct ctctcgagct ttcgcagatc tgtcgaacca cc atg gca ccg aag 4896 Met Ala Pro Lys 175 aag aag cgc aag gtg cat atg aac acc aag tac aac gag gag ttc ctg 4944 Lys Lys Arg Lys Val His Met Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Glu Phe Leu 180 185 190 ctc tac ctg gcg ggc ttc gtg gac ggg gac ggc tcc atc atc gcc tcc 4992 Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Ser 195 200 205 atc tcc ccg cgc cag tcc tac aag ttc aag cat gag ctg cgc ctc acc 5040 Ile Ser Pro Arg Gln Ser Tyr Lys Phe Lys His Glu Leu Arg Leu Thr 210 215 220 225 ttc cag gtc acg cag aag aca cag cgc cgt tgg ttc ctc gac gag ctg 5088 Phe Gln Val Thr Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Glu Leu 230 235 240 gtg gac gag atc ggg gtg ggc aag gtg cgc gac cgc ggc agc gtc tcc 5136 Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Lys Val Arg Asp Arg G]y Ser Val Ser 245 250 255 gac tac cgc ctg tcc cag atc aag cct ctg cac aac ttc ctg acc cag 5184 Asp Tyr Arg Leu Ser Gln Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln 260 265 270 ctc cag ccc ttc ctg gag ctc aag cag aag cag gcc aac ctc gtg ctg 5232 Leu Gln Pro Phe Leu Glu Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu 275 280 285 aag atc atc gag cag ctg ccc tcc 9CC aag gaa tcc ccg gac aag ttc 5280 Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe 290 295 300 305 ctg gag gtg tgc acc tgg gtg gac cag atc gcc gct ctg aac gac tcc 5328 Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser 310 315 320 aag acc cgc aag acc act tcc gag acc gtc cgc gcc gtt cta gac agt 5376 Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser 325 330 335 ctc tcc gag aag aag aag tcg tcc ccc tagcatgccg ttcaaacatt 5423 Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser Ser Pro 340 345 tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 5483 tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 5543 agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 5603 atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg 5663 gcccgggaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt tgtgtgaatc 5723 gatagtacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac tagcaaaata 5783 ggctgtcccc agtgcaagtg caggtgccag aacatttcgg taccgagctc gaattcactg 5843 gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 5903 gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 5963 tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 6023 catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 6083 gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 6143 ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 6203 aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg a 6234 <210> 5 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His Met Asn Thr Lys Tyr Asn 1 5 10 15 Lys Lys Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser 20 25 30 Ile Ile Ala Ser Ile Ser Pro Asn Gln Ser Arg Lys Phe Lys His Gln 35 40 45 Leu Arg Leu Thr Phe Thr Val Thr Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe 50 55 60 Leu Asp Lys Leu Val Asp Lys Ile Gly Val Gly Lys Val Arg Asp Arg 65 70 75 80 Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Gln Ile Lys Pro Leu His Asn 85 90 95 Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala 100 105 110 Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser 115 120 125 Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala 130 135 140 Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala 145 150 155 160 Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser Ser Pro 165 170 <210> 6 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His Met Asn Thr Lys Tyr Asn 1 5 10 15 Glu Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser 20 25 30 Ile Ile Ala ser Ile Ser Pro Arg Gln ser Tyr Lys Phe Lys His Glu 35 40 45 Leu Arg Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe 50 55 60 Leu Asp Glu Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Lys Val Arg Asp Arg 65 70 75 80 Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Gln Ile Lys Pro Leu His Asn 85 90 95 Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Glu Leu Lys Gln Lys Gln Ala 100 105 110 Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser 115 120 125 Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala 130 135 140 Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala 145 150 155 160 Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser Ser Pro 165 170 <210> 7 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR amplicon of bar coding region around the BAY 39/40 recognition site (control) <400> 7 cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac cgcaggagtg gacggacgac ctcgtccgtc 60 tgcgggac 68 <210> 8 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR amplicon of bar coding region around the BAY 39/40 recognition site (PPT tolerant plant linel) <400> 8 cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac cgcaggagtg gacggacgac ctcgtccgtc 60 tgcgggac 68 <210> 9 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR amplicon of bar coding region around the BAY 39/40 recognition site (PPT sensitive plant linel 1) <400> 9 cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac cgcaggagtg gacgacgacc tcgtccgtct 60 gcgggac 67 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR amplicon of bar coding region around the BAY 39/40 recognition site (PPT sensitive plant linel 2) <400> 10 cggtcaactt ccgtccgtct gcgggac 27 <210> 11 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR amplicon of bar coding region around the BAY 39/40 recognition site (PPT sensitive plant linel 3) <400> 11 cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac cgcaggagtg gacctcgtcc gtctgcggga 60 c 61 <210> 12 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR amplicon of bar coding region around the BAY 39/40 recognition site (PPT sensitive plant linel 4) <400> 12 cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac cctcgtccgt ctgcgggac 49 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR amplicon of bar coding region around the BAY 39/40 recognition site (PPT sensitive plant linel 5) <400> 13 cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac ctcgtccgtc tgcgggac 48 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR amplicon of bar coding region around the BAY 39/40 recognition site (PPT sensitive plant linel 6) <400> 14 cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac cgcacgacct cgtccgtctg cgggac 56 <210> 15 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR amplicon of bar coding region around the BAY 39/40 recognition site (PPT sensitive plant linel 7) <400> 15 cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac cgcaggagtg gacggacgac ctcgtccgtc 60 tgcgggac 68 <210> 16 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> I-CreI <400> 16 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30 Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Glu Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60 Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110 Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125 Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160 Ser Ser Pro <210> 17 <211> 4925 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> vector <220> <221> CDS <222> (1267)..(1605) <220> <221> CDS <222> (1795)..(2541) <400> 17 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtacggc 660 cgtcaaggcc aagcttcccg tgggggatcc accatacatg gagtcaaaaa ttcagatcga 720 ggatctaaca gaactcgccg tgaagactgg cgaacagttc atacagagtc ttttacgact 780 caatgacaag aagaaaatct tcgtcaacat ggtggagcac gacactctcg tctactccaa 840 gaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt 900 aatatcggga aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcaaaaggac 960 agtagaaaag gaaggtggca cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcgt 1020 tcaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt 1080 ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac 1140 tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 1200 aagttcattt catttggaga ggactcgaga attaagcaaa agaagaagaa gaagaagtcc 1260 aaaacc atg gct aaa ccg cct aag aaa aag cgg aag gtt cat atg aat 1308 Met Ala Lys Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His Met Asn 1 5 10 acc aaa tac aac aaa gaa ttc ctt ctc tac cta gct ggt ttc gta gac 1356 Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp 15 20 25 30 gga gat gga tct att atc gca tca att agc cct cgg caa tcg tac aaa 1404 Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Ser Ile Ser Pro Arg Gln Ser Tyr Lys 35 40 45 ttc aag cat gaa ctg cga ctt act ttc caa gtg aca cag aaa acc caa 1452 Phe Lys His Glu Leu Arg Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys Thr Gln 50 55 60 agg aga tgg ttc ctt gat aaa ctc gtg gac gaa atc ggc gtt gga aag 1500 Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Lys 65 70 75 gtc aga gat aga ggg tcg gtg tcc gac tat agg ctc agt cag att aaa 1548 Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Gln Ile Lys 80 85 90 cct ttg cat aac ttc cta act caa ctt caa cca ttt ctg aaa ttg aag 1596 Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys 95 100 105 110 cag aag cag gtaagtttct gcttctacct ttgatatata tataataatt 1645 Gln Lys Gln atcattaatt agtagtaata taatatttca aatatttttt tcaaaataaa agaatgtagt 1705 atatagcaat tgcttttctg tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat aacttttcta 1765 atatatgacc aaaacatggt gatgtgcag gca aat ctg gtt ctc aag ata ata 1818 Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile 115 120 gag caa cta cca agc gca aag gaa tct cca gac aag ttt ttg gaa gtg 1866 Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val 125 130 135 tgt acc tgg gtt gac caa atc gca gct ttg aat gat tcc aag aca cga 1914 Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg 140 145 150 aag aca act tct gag act gtg aga gca gtc ctt gat tca tta ccc ggt 1962 Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Pro Gly 155 160 165 tcg gtt ggt ggc tta agc cct agt cag gct agt tct gcc gct agt tct 2010 Ser Val Gly Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser 170 175 180 185 gcc tca agc tct cca ggt tct ggg ata tcc gaa gcc ctt aga gct ggt 2058 Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly 190 195 200 gct act aag agc aag gag ttt ctc ctg tat tta gcc gga ttt gtt gat 2106 Ala Thr Lys Ser Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp 205 210 215 ggg gat gyt tca atc att 9CC tct atc tca cca aat cag agc cgt aag 2154 Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Ser Ile Ser Pro Asn Gln Ser Arg Lys 220 225 230 ttt aag cac caa ctg agg ttg aca ttc acc gtg aca cag aag act caa 2202 Phe Lys His Gln Leu Arg Leu Thr Phe Thr Val Thr Gln Lys Thr Gln 235 240 245 aga aga tgg ttt ctg gat aag ctt gtc gat gaa att ggc gtg gga aag 2250 Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Lys 250 255 260 265 gtt cgt gat aga gga tct gtt agt gac tat cgc cta tcc cag att aaa 2298 Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Gln Ile Lys 270 275 280 cct ctt cac aac ttc ctg acc cag ctt caa cct ttc ttg aaa tta aag 2346 Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys 285 290 295 cag aag cag gct aac ctg gtt ctc aaa atc att gag caa ctc cca tca 2394 Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser 300 305 310 gca aaa gaa tca ccg gat aaa ttt ctg gag gta tgc act tgg gta gac 2442 Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp 315 320 325 caa att gct gct ctg aac gat tca aag act cga aaa acc act agt gag 2490 Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu 330 335 340 345 aca gtt cgt gct gtc tta gat tcc ttg tcc gag aaa aag aaa agc tct 2538 Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser Ser 350 355 360 ccc tgattcccag ataagggaat tagggttcct atagggtttc gctcatgtgt 2591 Pro tgagcatata agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa 2651 tttctaattc ctaaaaccaa aatccagcct gcaggtctag ataagtggga tatcacgtga 2711 agcttgcaag ctccagcttt tgttcccttt agtgagggtt aattgcgcgc ttggcgtaat 2771 catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac 2831 gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa 2891 ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat 2951 gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc 3011 tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 3071 cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 3131 gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 3191 gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 3251 gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 3311 ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 3371 atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3431 tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 3491 ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 3551 gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3611 ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3671 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3731 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3791 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 3851 aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 3911 tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 3971 cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 4031 tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagat ccacgctcac 4091 cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 4151 ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 4211 gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 4271 gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 4331 gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 4391 gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 4451 tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 4511 aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 4571 cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 4631 caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 4691 cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 4751 ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 4811 aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 4871 tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccac 4925 <210> 18 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Met Ala Lys Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His Met Asn Thr Lys 1 5 10 15 Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Ile Ile Ala Ser Ile Ser Pro Arg Gln Ser Tyr Lys Phe Lys 35 40 45 His Glu Leu Arg Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys Thr Gln Arg Arg 50 55 60 Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Lys Val Arg 65 70 75 80 Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Gln Ile Lys Pro Leu 85 90 95 His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys Gln Lys 100 105 110 Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys 115 120 125 Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile 130 135 140 Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val 145 150 155 160 Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Pro Gly Ser Val Gly Gly Leu Ser Pro 165 170 175 Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser 180 185 190 Gly Ile ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Thr Lys Ser Lys Glu Phe 195 200 205 Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala 210 215 220 Ser Ile Ser Pro Asn Gln Ser Arg Lys Phe Lys His Gln Leu Arg Leu 225 230 235 240 Thr Phe Thr Val Thr Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys 245 250 255 Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Lys Val Arg Asp Arg Gly Ser Val 260 265 270 Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Gln Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr 275 280 285 Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val 290 295 300 Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys 305 310 315 320 Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp 325 330 335 Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp 340 345 350 Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser Ser Pro 355 360

Claims (30)

  1. (a) 미리 정해진 부위에 이중 가닥 DNA 단절을 유도하는 단계;
    (b) 식물 세포에 외래 DNA 분자를 도입하는 단계; 및
    (c) 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물 세포를 선택하는 단계
    를 포함하는, 식물 세포의 게놈에서 미리 정해진 부위에 외래 DNA 분자를 도입하는 방법으로서, 상기 미리 정해진 부위가 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 암호화되는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 영역(바(bar) 암호화 영역) 내에 포함되고, 상기 이중 가닥 DNA 단절이 동시에 미리 정해진 부위를 인식하고 이중 가닥 단절을 유도하는 단일 쇄 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제의 도입에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    미리 정해진 부위가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    바 암호화 영역이 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  4. (a) 미리 정해진 부위에 이중 가닥 DNA 단절을 유도하는 단계;
    (b) 식물 세포에 외래 DNA 분자를 도입하는 단계; 및
    (c) 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물 세포를 선택하는 단계
    를 포함하는, 식물 세포의 게놈에서 미리 정해진 부위에 외래 DNA 분자를 도입하는 방법으로서, 상기 미리 정해진 부위가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 이중 가닥 DNA 단절이 동시에 미리 정해진 부위를 인식하고 이중 가닥 단절을 유도하는 단일 쇄 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제의 도입에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제가 I-CreI로부터 유래되고 하기 아미노산이 메가뉴클레아제 단위체 1에 존재하고:
    (a) 위치 32에서 S;
    (b) 위치 33에서 Y;
    (c) 위치 38에서 E;
    (d) 위치 40에서 R;
    (e) 위치 66에서 K;
    (f) 위치 80에서 Q;
    (g) 위치 42에서 T;
    (h) 위치 77에서 R;
    (i) 위치 68에서 R;
    (j) 위치 70에서 R;
    (k) 위치 44에서 Q;
    (l) 위치 24에서 I;
    (m) 위치 26에서 S;
    (n) 위치 28에서 S;
    (o) 위치 30에서 R;
    하기 아미노산이 메가뉴클레아제 단위체 2에 존재하는 방법:
    (p) 위치 70에서 R;
    (q) 위치 44에서 T;
    (r) 위치 24에서 I;
    (s) 위치 26에서 S;
    (t) 위치 28에서 S;
    (u) 위치 30에서 N;
    (v) 위치 32에서 S;
    (w) 위치 33에서 R;
    (x) 위치 38에서 Q;
    (y) 위치 80에서 Q;
    (z) 위치 40에서 R;
    (aa) 위치 66에서 K;
    (bb) 위치 42에서 T;
    (cc) 위치 77에서 R;
    (dd) 위치 68에서 R.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    한 쌍의 메가뉴클레아제가 의무적으로 이형이량체를 형성하거나 메가뉴클레아제가 링커에 의해 공유결합으로 연결된, I-CreI로부터 유래된 2개의 도메인을 포함하는 단일 쇄 메가뉴클레아제인 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    한 쌍의 메가뉴클레아제가 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 각각 포함하거나 단일 쇄 메가뉴클레아제가 서열번호 18의 위치 1 내지 167 및 위치 206 내지 362의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    한 쌍의 메가뉴클레아제가 서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 2004 내지 뉴클레오티드 위치 2525 또는 내지 2522 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 위치 4885 내지 뉴클레오티드 위치 5405 또는 내지 5403의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되거나, 단일 쇄 메가뉴클레아제가 서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 1267 내지 1605 및 1795 내지 1956 및 2071 내지 2541의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되거나, 단일 쇄 메가뉴클레아제가 서열번호 17의 뉴클레오티드 위치 1267 내지 1605 및 1795 내지 2541의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제가 식물의 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된(codon-optimized) 핵산에 의해 암호화되는 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    외래 DNA가 직접적인 DNA 전달에 의해 도입되는 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    외래 DNA가 임의의 추가적인 DNA 없이 도입되는 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    외래 DNA가 복구 DNA 내에 포함되고, 복구 DNA가 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 상류 또는 하류 서열과 상동인 하나 이상의 측면(flanking) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제가 키메라 유전자 또는 한 쌍의 키메라 유전자로부터 발현되고, 각각 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제 중 하나를 암호화하는 암호화 영역에 작동가능하게 연결되고 식물 세포에서 작용하는 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관련된 DNA 영역에 추가로 작동가능하게 연결된, 식물에서 발현가능한 프로모터를 포함하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    키메라 유전자가 식물 세포에 일시적으로 도입되는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    키메라 유전자가 식물 세포에 안정적으로 도입되는 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    외래 DNA가 선택가능한 표지 유전자를 포함하는 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    외래 DNA가 관심있는, 식물에서 발현가능한 유전자를 포함하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    관심있는, 식물에서 발현가능한 유전자가 제초제 내성 유전자, 곤충 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 무생물 스트레스 저항성 유전자, 오일 생합성에 관련된 효소, 탄수화물 생합성에 관련된 효소, 섬유질 강도 또는 섬유질 길이에 관련된 효소 및 2차 대사산물의 생합성에 관련된 효소의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    식물 세포가 추가로 식물로 재생되는 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된, 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물 세포.
  21. 청구항 19에 따른 방법에 의해 수득된, 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물.
  22. 청구항 21에 따른 식물로부터 미리 정해진 부위에 통합된 외래 DNA를 포함하는 식물의 종자 또는 증식 부분.
  23. 식물 또는 식물이 성장하는 기질에 화학물질을 적용하는 단계를 포함하는, 청구항 21에 따른 식물을 성장시키는 방법.
  24. 또다른 식물과 함께 또는 그 자체로 청구항 20에 따른 식물 세포로 본질적으로 이루어진 식물을 교배시키는 단계 및 임의적으로 종자를 수확하는 단계를 포함하는, 바 암호화 영역에 통합된 외래 DNA를 포함하는 식물을 제조하는 방법.
  25. 청구항 21에 따른 식물에 화학적 화합물을 적용하는 단계를 포함하는, 들판(field)에서 식물을 성장시키는 방법.
  26. 청구항 22에 따른 식물의 종자에 화학적 화합물을 적용하는 단계를 포함하는, 처리된 종자를 제조하는 방법.
  27. 바 암호화 영역으로 외래 DNA를 도입하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 기재된 메가뉴클레아제 또는 한 쌍의 메가뉴클레아제의 용도.
  28. 식물 세포에서 미리 정해진 부위에 관심있는 외래 DNA를 도입하기 위해 주문 제작된 메가뉴클레아제의 용도.
  29. (a) 미리 정해진 부위에 이중 가닥 DNA 단절을 유도하는 단계;
    (b) 식물 세포에 외래 DNA 분자를 도입하는 단계; 및
    (c) 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물 세포를 선택하는 단계
    를 포함하는, 식물 세포의 게놈에서 미리 정해진 부위에 외래 DNA 분자를 도입하는 방법으로서, 상기 이중 가닥 DNA 단절이 동시에 미리 정해진 부위를 인식하고 이중 가닥 단절을 유도하는 자연적으로 존재하지 않는 단일 쇄 메가뉴클레아제 또는 자연적으로 존재하지 않는 한 쌍의 메가뉴클레아제의 도입에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. (a) 미리 정해진 부위에 이중 가닥 DNA 단절을 유도하는 단계;
    (b) 식물 세포에 외래 DNA 분자를 도입하는 단계; 및
    (c) 외래 DNA가 미리 정해진 부위에 도입된 식물 세포를 선택하는 단계
    를 포함하는, 형질전환 식물 세포의 게놈에서 미리 정해진 부위에 외래 DNA 분자를 도입하는 방법으로서, 상기 미리 정해진 부위가 자연적으로 존재하는 메가뉴클레아제에 대한 인식 부위와 상이한 뉴클레오티드 서열이되 형질전환 식물에 형질전환 유전자의 일부로 통상적으로 도입되는 뉴클레오티드 서열이고, 상기 이중 가닥 DNA 단절이 동시에 미리 정해진 부위를 인식하고 이중 가닥 단절을 유도하는 자연적으로 존재하지 않는 단일 쇄 메가뉴클레아제 또는 자연적으로 존재하지 않는 한 쌍의 메가뉴클레아제의 도입에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020137000586A 2010-06-09 2011-06-07 식물 게놈 공학에서 통상적으로 사용되는 뉴클레오티드 서열에서 식물 게놈을 변경하는 방법 및 수단 Expired - Fee Related KR101995698B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10005941.9 2010-06-09
EP10005941 2010-06-09
US35584910P 2010-06-17 2010-06-17
US61/355,849 2010-06-17
PCT/EP2011/002895 WO2011154159A1 (en) 2010-06-09 2011-06-07 Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130083433A true KR20130083433A (ko) 2013-07-22
KR101995698B1 KR101995698B1 (ko) 2019-07-03

Family

ID=44627458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137000586A Expired - Fee Related KR101995698B1 (ko) 2010-06-09 2011-06-07 식물 게놈 공학에서 통상적으로 사용되는 뉴클레오티드 서열에서 식물 게놈을 변경하는 방법 및 수단

Country Status (14)

Country Link
US (2) US9574201B2 (ko)
EP (1) EP2580335B1 (ko)
JP (1) JP6092100B2 (ko)
KR (1) KR101995698B1 (ko)
CN (2) CN109504700A (ko)
AR (1) AR081594A1 (ko)
AU (1) AU2011264075B2 (ko)
BR (1) BR112012031323A2 (ko)
CA (1) CA2801836A1 (ko)
MX (1) MX347575B (ko)
RU (1) RU2639512C2 (ko)
SG (1) SG185668A1 (ko)
UA (1) UA115961C2 (ko)
WO (1) WO2011154159A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287234A (zh) 2011-08-22 2017-10-24 拜尔作物科学公司 修饰植物基因组的方法和手段
AU2013348113A1 (en) 2012-11-20 2015-06-11 J.R. Simplot Company TAL-mediated transfer DNA insertion
ES2953523T3 (es) 2012-12-27 2023-11-14 Keygene Nv Método para inducir una translocación dirigida en una planta
WO2014144094A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 J.R. Simplot Company Tal-mediated transfer dna insertion
CN105121650A (zh) 2013-04-02 2015-12-02 拜尔作物科学公司 真核生物中的靶向基因组工程
CA2969151A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for identifying and enriching for cells comprising site specific genomic modifications
US10767190B2 (en) 2015-12-15 2020-09-08 Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc Brassicaceae plants resistant to Plasmodiophora brassicae (clubroot)
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
CN106508409A (zh) * 2016-11-29 2017-03-22 马健 玉米地晚秋套种豌豆的栽培方法
EP3550955B1 (en) 2016-12-09 2022-10-19 Newleaf Symbiotics, Inc. Methylobacterium compositions for fungal disease control
US20240368620A1 (en) 2021-07-23 2024-11-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Blackleg resistant plants and methods for the identification of blackleg resistant plants

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009511085A (ja) * 2005-10-18 2009-03-19 プレシジョン バイオサイエンシズ 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
WO2009114321A2 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Precision Biosciencs, Inc. Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering

Family Cites Families (219)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2031826A (en) 1934-09-22 1936-02-25 Homer J Lloyd Protecting means for mechanisms
DE3484215D1 (de) 1983-01-17 1991-04-11 Monsanto Co Chimaerische gene geeignet zur expression in pflanzenzellen.
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5331107A (en) 1984-03-06 1994-07-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US5304732A (en) 1984-03-06 1994-04-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
EP0242236B2 (en) 1986-03-11 1996-08-21 Plant Genetic Systems N.V. Plant cells resistant to glutamine synthetase inhibitors, made by genetic engineering
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5637489A (en) 1986-08-23 1997-06-10 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5276268A (en) 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5605011A (en) 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5378824A (en) 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
GB8810120D0 (en) 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
US6013861A (en) 1989-05-26 2000-01-11 Zeneca Limited Plants and processes for obtaining them
DE3922493A1 (de) 1989-07-08 1991-01-17 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von waessrigen dispersionen von polyurethanen und ihre verwendung als beschichtungsmittel fuer beliebige substrate
ES2110417T3 (es) * 1989-08-09 1998-02-16 Dekalb Genetics Corp Metodos y composiciones para la produccion de plantas de maiz fertiles, transformadas establemente y de sus celulas.
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5739082A (en) 1990-02-02 1998-04-14 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Method of improving the yield of herbicide-resistant crop plants
US5908810A (en) 1990-02-02 1999-06-01 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Method of improving the growth of crop plants which are resistant to glutamine synthetase inhibitors
EP0472712B1 (en) 1990-03-16 2001-09-12 Calgene LLC Novel sequences preferentially expressed in early seed development and methods related thereto
EP0536330B1 (en) 1990-06-25 2002-02-27 Monsanto Technology LLC Glyphosate tolerant plants
JP3462497B2 (ja) 1991-02-08 2003-11-05 バイエル・バイオサイエンス・エヌ・ヴェー コメ由来の雄ずい特異的プロモーター
DE4104782B4 (de) 1991-02-13 2006-05-11 Bayer Cropscience Gmbh Neue Plasmide, enthaltend DNA-Sequenzen, die Veränderungen der Karbohydratkonzentration und Karbohydratzusammensetzung in Pflanzen hervorrufen, sowie Pflanzen und Pflanzenzellen enthaltend dieses Plasmide
GB9104411D0 (en) 1991-03-01 1991-04-17 Elchrom Limited Improvement of gel composition in gels for submerged gel electrophoresis
US5731180A (en) 1991-07-31 1998-03-24 American Cyanamid Company Imidazolinone resistant AHAS mutants
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5305523A (en) 1992-12-24 1994-04-26 International Business Machines Corporation Method of direct transferring of electrically conductive elements into a substrate
DE4227061A1 (de) 1992-08-12 1994-02-17 Inst Genbiologische Forschung DNA-Sequenzen, die in der Pflanze die Bildung von Polyfructanen (Lävanen) hervorrufen, Plasmide enthaltend diese Sequenzen sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen
GB9218185D0 (en) 1992-08-26 1992-10-14 Ici Plc Novel plants and processes for obtaining them
DE69233352T2 (de) 1992-10-14 2004-10-07 Syngenta Ltd Pflanzen und verfahren zu ihrer herstellung
GB9223454D0 (en) 1992-11-09 1992-12-23 Ici Plc Novel plants and processes for obtaining them
SG71103A1 (en) 1993-01-21 2000-03-21 Matsushita Electric Ind Co Ltd Information recording medium and method of fabricating the same
EP0609022A3 (en) 1993-01-25 1995-08-23 Matsushita Electric Ind Co Ltd Image coding apparatus.
EP0682699B1 (en) 1993-02-12 2003-05-07 The Johns-Hopkins University FUNCTIONAL DOMAINS IN $i(FLAVOBACTERIUM OKEANOKOITES) (FOKI) RESTRICTION ENDONUCLEASE
BR9406484A (pt) 1993-03-25 1996-01-09 Ciba Geigy Ag Novas proteinas e cepas pesticidas
DE4323804A1 (de) 1993-07-15 1995-01-19 Siemens Ag Verfahren und Vorrichtung zur Steuerung einer m-pulsigen Wechselrichteranordnung, bestehend aus einem Master-Wechselrichter und wenigstens einem Slave-Wechselrichter
WO1995004826A1 (en) 1993-08-09 1995-02-16 Institut Für Genbiologische Forschung Berlin Gmbh Debranching enzymes and dna sequences coding them, suitable for changing the degree of branching of amylopectin starch in plants
DE4330960C2 (de) 1993-09-09 2002-06-20 Aventis Cropscience Gmbh Kombination von DNA-Sequenzen, die in Pflanzenzellen und Pflanzen die Bildung hochgradig amylosehaltiger Stärke ermöglichen, Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen und die daraus erhaltbare modifizierte Stärke
WO1995007355A1 (en) 1993-09-09 1995-03-16 Institut Für Genbiologische Forschung Berlin Gmbh Combination of dna sequences which enable the formation of modified starch in plant cells and plants, processes for the production of these plants and the modified starch obtainable therefrom
JPH09505467A (ja) 1993-11-09 1997-06-03 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー トランスジェニックフルクタン蓄積作物およびその生産法
WO1995026407A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Method for producing altered starch from potato plants
ATE368118T1 (de) 1994-05-18 2007-08-15 Bayer Bioscience Gmbh Für enzyme, die die fähigkeit besitzen lineare alpha 1,4-glucane in pflanzen, pilzen und mikroorganismen zu synthesieren, kodierende dna sequenzen
US5824790A (en) 1994-06-21 1998-10-20 Zeneca Limited Modification of starch synthesis in plants
AU706849B2 (en) 1994-06-21 1999-06-24 Cerestar Usa, Inc. Novel plants and processes for obtaining them
NL1000064C1 (nl) 1994-07-08 1996-01-08 Stichting Scheikundig Onderzoe Produktie van oligosacchariden in transgene planten.
US5616273A (en) 1994-08-11 1997-04-01 Dynax Corporation Synergistic surfactant compositions and fire fighting concentrates thereof
ATE266734T1 (de) 1994-08-30 2004-05-15 Commw Scient Ind Res Org Pflanzentraskriptionsregulator von circovirus
DE4441408A1 (de) 1994-11-10 1996-05-15 Inst Genbiologische Forschung DNA-Sequenzen aus Solanum tuberosum kodierend Enzyme, die an der Stärkesynthese beteiligt sind, Plasmide, Bakterien, Pflanzenzellen und transgene Pflanzen enhaltend diese Sequenzen
DE4447387A1 (de) 1994-12-22 1996-06-27 Inst Genbiologische Forschung Debranching-Enzyme aus Pflanzen und DNA-Sequenzen kodierend diese Enzyme
JP3840259B2 (ja) 1995-01-06 2006-11-01 プラント リサーチ インターナショナル ベスローテン フェンノートシャップ 炭水化物ポリマー合成酵素をコードするｄｎａ配列及びトランスジェニック植物を製造するための方法
DE19509695A1 (de) 1995-03-08 1996-09-12 Inst Genbiologische Forschung Verfahren zur Herstellung einer modifizieren Stärke in Pflanzen, sowie die aus den Pflanzen isolierbare modifizierte Stärke
ES2275275T3 (es) 1995-04-20 2007-06-01 Basf Aktiengesellschaft Productos resistentes a herbicidas diseñados sobre la base de la estructura.
US5853973A (en) 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
DK0826061T3 (da) 1995-05-05 2007-09-24 Nat Starch Chem Invest Forbedringer af eller relaterede til plantestivelsessammensætninger
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
US6284479B1 (en) 1995-06-07 2001-09-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Substitutes for modified starch and latexes in paper manufacture
US5712107A (en) 1995-06-07 1998-01-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Substitutes for modified starch and latexes in paper manufacture
FR2736926B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
DK0851934T3 (da) 1995-09-19 2006-07-31 Bayer Bioscience Gmbh Planter, som syntetiserer en modificeret stivelse, fremgangsmåder til deres fremstilling samt modificeret stivelse
DE69636288T2 (de) 1995-10-06 2007-07-26 Bayer Bioscience N.V. Samenstrenung resistenz
GB9524938D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Zeneca Ltd Modification of starch synthesis in plants
DE19601365A1 (de) 1996-01-16 1997-07-17 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle aus Pflanzen codierend Enzyme, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
DE19608918A1 (de) 1996-03-07 1997-09-11 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Mais codieren
DE19618125A1 (de) 1996-05-06 1997-11-13 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Kartoffel codieren
DE19619918A1 (de) 1996-05-17 1997-11-20 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend lösliche Stärkesynthasen aus Mais
DE69737448T2 (de) 1996-05-29 2007-11-15 Bayer Cropscience Ag Nukleinsäuremoleküle, die für enzyme aus weizen kodieren, welche an der stärkesynthese beteiligt sind
JP2000512349A (ja) 1996-06-12 2000-09-19 パイオニア ハイ―ブレッド インターナショナル，インコーポレイテッド 製紙における改変澱粉の代用品
EP0904454A1 (en) 1996-06-12 1999-03-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Substitutes for modified starch in paper manufacture
JP2001503607A (ja) 1996-06-12 2001-03-21 パイオニア ハイ―ブレッド インターナショナル，インコーポレイテッド 製紙における改変澱粉の代用品
GB9623095D0 (en) 1996-11-05 1997-01-08 Nat Starch Chem Invest Improvements in or relating to starch content of plants
US6232529B1 (en) 1996-11-20 2001-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of producing high-oil seed by modification of starch levels
DE19653176A1 (de) 1996-12-19 1998-06-25 Planttec Biotechnologie Gmbh Neue Nucleinsäuremoleküle aus Mais und ihre Verwendung zur Herstellung einer modifizierten Stärke
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
DE19708774A1 (de) 1997-03-04 1998-09-17 Max Planck Gesellschaft Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme die Fructosylpolymeraseaktivität besitzen
DE19709775A1 (de) 1997-03-10 1998-09-17 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Stärkephosphorylase aus Mais
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
JP2001512687A (ja) * 1997-08-05 2001-08-28 キメラジェン，インコーポレーテッド 植物に局在性遺伝子変化を生じさせるための混合二本鎖オリゴヌクレオチドの使用
GB9718863D0 (en) 1997-09-06 1997-11-12 Nat Starch Chem Invest Improvements in or relating to stability of plant starches
US5994624A (en) * 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
DE19749122A1 (de) 1997-11-06 1999-06-10 Max Planck Gesellschaft Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen
FR2770854B1 (fr) 1997-11-07 2001-11-30 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides
US6245968B1 (en) 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
FR2772789B1 (fr) 1997-12-24 2000-11-24 Rhone Poulenc Agrochimie Procede de preparation enzymatique d'homogentisate
EP1068333A1 (en) 1998-04-09 2001-01-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Starch r1 phosphorylation protein homologs
DE19820607A1 (de) 1998-05-08 1999-11-11 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme aus Weizen, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
DE19820608A1 (de) 1998-05-08 1999-11-11 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme aus Weizen, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
EP1078088B1 (de) 1998-05-13 2006-07-26 Bayer BioScience GmbH Transgene pflanzen mit veränderter aktivität eines plastidären adp/atp - translokators
US6635756B1 (en) 1998-06-15 2003-10-21 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Starch obtainable from modified plants
US6693185B2 (en) 1998-07-17 2004-02-17 Bayer Bioscience N.V. Methods and means to modulate programmed cell death in eukaryotic cells
DE19836098A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
DE19836097A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nukleinsäuremoleküle kodierend für eine alpha-Glukosidase, Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
DE19836099A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nukleinsäuremoleküle kodierend für eine ß-Amylase, Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
EP1108040A2 (en) 1998-08-25 2001-06-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase nucleic acids
EP1109916A1 (en) 1998-09-02 2001-06-27 Planttec Biotechnologie GmbH Nucleic acid molecules encoding an amylosucrase
BR9915026A (pt) 1998-10-09 2001-07-17 Planttec Biotechnologie Gmbh Móleculas de ácido nucléico codificando uma enzima ramificadora de bactérias do gênero neisseria bem como métodos para a produção de alfa-1,4 glicanos ramificados para alfa-1,6
DE19924342A1 (de) 1999-05-27 2000-11-30 Planttec Biotechnologie Gmbh Genetisch modifizierte Pflanzenzellen und Pflanzen mit erhöhter Aktivität eines Amylosucraseproteins und eines Verzweigungsenzyms
JP2002529094A (ja) 1998-11-09 2002-09-10 プランテック バイオテクノロジー ゲーエムベーハー コメ由来核酸分子および改変デンプンの生産のためのその使用
US6531648B1 (en) 1998-12-17 2003-03-11 Syngenta Participations Ag Grain processing method and transgenic plants useful therein
EP1141356A2 (en) * 1998-12-23 2001-10-10 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Plant transformation process
AU2982900A (en) 1999-02-03 2000-08-25 Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
DE19905069A1 (de) 1999-02-08 2000-08-10 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Alternansucrase
BR0010069A (pt) 1999-04-29 2002-01-22 Syngenta Ltd Polinucelotìdeo isolado, vetor, material vegetal, plantas ineiras, férteis, morfologicamente normais, plantas de milho, métodos para controlar seletivamente ervas daninhas em um campo, e para produzir vegetais que sejam substancialmente tolerantes resistentes ao herbicida glifosato, uso de polinucleotìdeo, e, métodos para selecionar material biológico transformado, e para regenerar uma planta transformada fértil para conter dna estranho
EP1173580A1 (en) 1999-04-29 2002-01-23 Syngenta Limited Herbicide resistant plants
DE19926771A1 (de) 1999-06-11 2000-12-14 Aventis Cropscience Gmbh Nukleinsäuremoleküle aus Weizen, transgene Pflanzenzellen und Pflanzen und deren Verwendung für die Herstellung modifizierter Stärke
DE19937348A1 (de) 1999-08-11 2001-02-22 Aventis Cropscience Gmbh Nukleinsäuremoleküle aus Pflanzen codierend Enzyme, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
DE19937643A1 (de) 1999-08-12 2001-02-22 Aventis Cropscience Gmbh Transgene Zellen und Pflanzen mit veränderter Aktivität des GBSSI- und des BE-Proteins
AU7647000A (en) 1999-08-20 2001-03-19 Basf Plant Science Gmbh Increasing the polysaccharide content in plants
US6423886B1 (en) 1999-09-02 2002-07-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Starch synthase polynucleotides and their use in the production of new starches
GB9921830D0 (en) 1999-09-15 1999-11-17 Nat Starch Chem Invest Plants having reduced activity in two or more starch-modifying enzymes
AR025996A1 (es) 1999-10-07 2002-12-26 Valigen Us Inc Plantas no transgenicas resistentes a los herbicidas.
US6506963B1 (en) 1999-12-08 2003-01-14 Plant Genetic Systems, N.V. Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same
US6585615B2 (en) 2000-02-17 2003-07-01 Koyo Seiko Co., Ltd. Power transmission ring and variable diameter pulley assembly using the same
US6803501B2 (en) 2000-03-09 2004-10-12 Monsanto Technology, Llc Methods for making plants tolerant to glyphosate and compositions thereof using a DNA encoding an EPSPS enzyme from Eleusine indica
WO2001083818A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Aventis Cropscience, N.V. Glufosinate tolerant rice
US6768044B1 (en) 2000-05-10 2004-07-27 Bayer Cropscience Sa Chimeric hydroxyl-phenyl pyruvate dioxygenase, DNA sequence and method for obtaining plants containing such a gene, with herbicide tolerance
US7169970B2 (en) 2000-09-29 2007-01-30 Syngenta Limited Herbicide resistant plants
US6734340B2 (en) 2000-10-23 2004-05-11 Bayer Cropscience Gmbh Monocotyledon plant cells and plants which synthesise modified starch
FR2815969B1 (fr) 2000-10-30 2004-12-10 Aventis Cropscience Sa Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique
CA2425956C (en) 2000-10-30 2014-12-23 Maxygen, Inc. Novel glyphosate n-acetyltransferase (gat) genes
BRPI0116018B1 (pt) 2000-12-07 2018-02-27 Syngenta Limited Polinucleotídeo, métodos para fornecer uma planta que seja tolerante aos herbicidas inibidores da hppd e para controlar seletivamente ervas daninhas em um local compreendendo plantas de safra e ervas daninhas
WO2002079410A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Basf Plant Science Gmbh Glucan chain length domains
DE60226508D1 (de) 2001-06-12 2008-06-19 Bayer Cropscience Gmbh Transgene pflanzen die stärke mit hohem amylosegehalt herstellen
US6818807B2 (en) 2001-08-06 2004-11-16 Bayer Bioscience N.V. Herbicide tolerant cotton plants having event EE-GH1
WO2003013226A2 (en) 2001-08-09 2003-02-20 Cibus Genetics Non-transgenic herbicide resistant plants
HUP0401861A2 (hu) 2001-10-17 2004-12-28 Basf Plant Science Gmbh Keményítő
DE10208132A1 (de) 2002-02-26 2003-09-11 Planttec Biotechnologie Gmbh Verfahren zur Herstellung von Maispflanzen mit erhöhtem Blattstärkegehalt und deren Verwendung zur Herstellung von Maissilage
AU2003218382B2 (en) 2002-03-21 2007-12-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
AR039501A1 (es) 2002-04-30 2005-02-23 Verdia Inc Genes de glifosato n-acetil transferasa (gat)
FR2844142B1 (fr) 2002-09-11 2007-08-17 Bayer Cropscience Sa Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree
WO2004040012A2 (en) 2002-10-29 2004-05-13 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods for identifying plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides
CN1745173B (zh) 2002-12-18 2012-11-28 阿则耐克斯公司 能赋予除草剂抗性的基因
DK1578973T3 (da) 2002-12-19 2008-11-24 Bayer Cropscience Ag Planteceller og planter, der syntetiserer en stivelse med foröget slutviskositet
WO2004067736A2 (en) 2003-01-28 2004-08-12 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
CA2517879A1 (en) 2003-03-07 2004-09-16 Basf Plant Science Gmbh Enhanced amylose production in plants
US7504561B2 (en) 2003-03-10 2009-03-17 Athenix Corporation GDC-1 genes conferring herbicide resistance
US7807881B2 (en) 2003-03-10 2010-10-05 Athenix Corp. Methods to confer herbicide resistance
EP1601774A2 (en) 2003-03-10 2005-12-07 Athenix Corporation Gdc-2 genes conferring herbicide resistance
CA2521729C (en) 2003-04-09 2013-12-03 Bayer Bioscience N.V. Methods and means for increasing the tolerance of plants to stress conditions
MXPA05011585A (es) 2003-04-29 2006-05-25 Pioneer Hi Bred Int Genes de glifosato-n-acetil transferasa (gat) novedosos.
CA2526480A1 (en) 2003-05-22 2005-01-13 Syngenta Participations Ag Modified starch, uses, methods for production thereof
EP1633875B1 (en) 2003-05-28 2012-05-02 Basf Se Wheat plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides
CN1833026A (zh) 2003-07-31 2006-09-13 东洋纺织株式会社 生产透明质酸的植物
ES2743420T3 (es) 2003-08-29 2020-02-19 Instituto Nac De Tecnologia Agropecuaria Plantas de arroz que tienen tolerancia incrementada frente a herbicidas de imidazolinona
EP1687416A1 (en) 2003-09-30 2006-08-09 Bayer CropScience GmbH Plants with increased activity of a class 3 branching enzyme
WO2005030942A1 (en) 2003-09-30 2005-04-07 Bayer Cropscience Gmbh Plants with reduced activity of a class 3 branching enzyme
PL1689870T3 (pl) * 2003-11-18 2009-06-30 Bayer Cropscience Nv Ulepszona docelowa insercja DNA w roślinach
AR048024A1 (es) 2004-03-05 2006-03-22 Bayer Cropscience Gmbh Plantas con actividad aumentada de distintas enzimas fosforilantes del almidon
AR048025A1 (es) 2004-03-05 2006-03-22 Bayer Cropscience Gmbh Plantas con actividad aumentada de una enzima fosforilante del almidon
ATE541042T1 (de) 2004-03-05 2012-01-15 Bayer Cropscience Ag Pflanzen mit reduzierter aktivität des stärkephosphorylierenden enzyms phosphoglucan- wasser-dikinase
AR048026A1 (es) 2004-03-05 2006-03-22 Bayer Cropscience Gmbh Procedimientos para la identificacion de proteinas con actividad enzimatica fosforiladora de almidon
US7432082B2 (en) 2004-03-22 2008-10-07 Basf Ag Methods and compositions for analyzing AHASL genes
NL1026276C2 (nl) 2004-05-26 2005-11-30 John De Groot Vaartuig uit inwendig verlicht lichtdoorlatend materiaal.
WO2006007373A2 (en) 2004-06-16 2006-01-19 Basf Plant Science Gmbh Polynucleotides encoding mature ahasl proteins for creating imidazolinone-tolerant plants
DE102004029763A1 (de) 2004-06-21 2006-01-05 Bayer Cropscience Gmbh Pflanzen, die Amylopektin-Stärke mit neuen Eigenschaften herstellen
BRPI0513981A (pt) 2004-07-30 2008-05-20 Basf Agrochemical Products Bv planta, semente, métodos para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta de girassol e de uma planta transformada, para aumentar a atividade de ahas em uma planta, para produzir uma planta resistente a herbicida, para intensificar a toleráncia a herbicida em uma planta tolerante a herbicida, para selecionar uma célula de planta trasnformada, para aumentar a resistência a herbicida de uma planta, e para combater vegetação indesejável, molécula de polinucleotìdeo isolada, cassete de expressão, célula hospedeira de não-humano, vetor de transformação, célula de planta transformada, e, polipeptìdeo isolado
BRPI0514047A (pt) 2004-08-04 2008-05-27 Basf Plant Science Gmbh polinucleotìdeo isolado, vetor de expressão de planta, polipeptìdeo isolado, célula de planta transgênica, métodos para realçar a atividade da ahas em uma planta, para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta, e para produzir uma planta transgênica tendo atividade da ahas aumentada, planta transgênica, e, polipeptìdeo de fusão
DK1786908T3 (da) 2004-08-18 2010-06-07 Bayer Cropscience Ag Planter med forøget plastidisk aktivitet af stivelsesphosphorylerende R3-enzym
EP1805312B9 (en) 2004-09-23 2009-12-09 Bayer CropScience AG Methods and means for producing hyaluronan
BRPI0518249A2 (pt) 2004-10-29 2008-11-11 Bayer Bioscience Nv plantas de algodço tolerantes À tensço
AR051690A1 (es) 2004-12-01 2007-01-31 Basf Agrochemical Products Bv Mutacion implicada en el aumento de la tolerancia a los herbicidas imidazolinona en las plantas
EP1672075A1 (en) 2004-12-17 2006-06-21 Bayer CropScience GmbH Transformed plant expressing a dextransucrase and synthesizing a modified starch
US7488866B2 (en) 2004-12-22 2009-02-10 Athenix Corporation gro-1 Herbicide resistance gene and methods for its use
ATE503841T1 (de) 2004-12-29 2011-04-15 Athenix Corp Herbizidresistenz verleihende gene
EP1679374A1 (en) 2005-01-10 2006-07-12 Bayer CropScience GmbH Transformed plant expressing a mutansucrase and synthesizing a modified starch
JP2006304779A (ja) 2005-03-30 2006-11-09 Toyobo Co Ltd ヘキソサミン高生産植物
EP1707632A1 (de) 2005-04-01 2006-10-04 Bayer CropScience GmbH Phosphorylierte waxy-Kartoffelstärke
ES2354109T3 (es) 2005-04-04 2011-03-10 Bayer Bioscience N.V. Métodos y medios para eliminar una secuencia de adn seleccionada.
EP1710315A1 (de) 2005-04-08 2006-10-11 Bayer CropScience GmbH Hoch Phosphat Stärke
AR053049A1 (es) 2005-04-08 2007-04-18 Athenix Corp Identificacaion de una nueva clase de epsp sintetasas
WO2006129204A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Devgen Nv Rnai for control of insects and arachnids
WO2006133827A2 (en) 2005-06-15 2006-12-21 Bayer Bioscience N.V. Methods for increasing the resistance of plants to hypoxic conditions
AR054174A1 (es) 2005-07-22 2007-06-06 Bayer Cropscience Gmbh Sobreexpresion de sintasa de almidon en vegetales
EA200800622A1 (ru) 2005-08-24 2008-08-29 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Композиции, обеспечивающие толерантность к нескольким гербицидам, и способы их применения
UA96421C2 (ru) 2005-08-31 2011-11-10 Монсанто Текнолоджи Ллс Нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок
PT2431473T (pt) 2005-09-16 2017-02-15 Monsanto Technology Llc Métodos para o controlo genético de infestações por insetos em plantas e suas composições
CA2622660C (en) 2005-09-16 2017-11-07 Devgen Nv Transgenic plant-based methods for plant pests using rnai
CA2624973C (en) 2005-10-05 2016-01-19 Bayer Cropscience Ag Production of hyaluronan from plants transgenic for hyaluronan synthase, gfat and udp-glucose dehydrogenase
CN101297041A (zh) 2005-10-05 2008-10-29 拜尔作物科学股份公司 具有增加的乙酰透明质酸ⅱ产量的植物
CA2624592C (en) 2005-10-05 2016-07-19 Bayer Cropscience Ag Gfat-expressing plants with increased hyaluronan production
WO2007060495A1 (en) 2005-10-25 2007-05-31 Cellectis I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof
WO2007049095A1 (en) 2005-10-25 2007-05-03 Cellectis Laglidadg homing endonuclease variants having mutations in two functional subdomains and use thereof
US7674958B2 (en) 2005-12-01 2010-03-09 Athenix Corporation GRG23 and GRG51 genes conferring herbicide resistance
JP5474356B2 (ja) 2006-01-12 2014-04-16 デブジェン エヌブイ ＲＮＡｉを使用する害虫を制御する方法
WO2007080126A2 (en) 2006-01-12 2007-07-19 Devgen N.V. Dsrna as insect control agent
US20080313769A9 (en) 2006-01-12 2008-12-18 Athenix Corporation EPSP synthase domains conferring glyphosate resistance
WO2007093836A1 (en) 2006-02-13 2007-08-23 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a xp gene and uses thereof
AR059724A1 (es) 2006-03-02 2008-04-23 Athenix Corp Metodos y composiciones para mejorar la actividad enzimatica en plantas transgenicas
US20070214515A1 (en) 2006-03-09 2007-09-13 E.I.Du Pont De Nemours And Company Polynucleotide encoding a maize herbicide resistance gene and methods for use
AU2007229005B2 (en) 2006-03-21 2012-05-31 Bayer Cropscience Nv Stress resistant plants
AU2007228981B2 (en) 2006-03-21 2012-10-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Novel genes encoding insecticidal proteins
EP2018431B1 (en) 2006-05-12 2011-08-10 Bayer BioScience N.V. Novel stress-related micro-RNA molecules and uses thereof
EP2018434B1 (en) * 2006-05-18 2011-03-02 Biogemma Method for performing homologous recombination in plants
US7910805B2 (en) 2006-06-08 2011-03-22 Athenix Corp. Bacterial glutamine synthetases and methods of use
US9045765B2 (en) 2006-06-09 2015-06-02 Athenix Corporation EPSP synthase genes conferring herbicide resistance
CA2659556A1 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Athenix Corporation Improved epsp synthases: compositions and methods of use
NZ573150A (en) 2006-06-27 2011-09-30 Athenix Corp Grg33, grg35, grg36, grg37, grg38, grg39, and grg50: novel epsp synthase genes conferring herbicide resistance
AR061661A1 (es) 2006-06-27 2008-09-10 Athenix Corp Gen de epsp sintetasa que confiere resistencia a herbicidas
EP1887079A1 (de) 2006-08-09 2008-02-13 Bayer CropScience AG Genetisch modifizierte Pflanzen, die eine Stärke mit erhöhtem Quellvermögen synthetisieren
US7928295B2 (en) 2006-08-24 2011-04-19 Bayer Bioscience N.V. Herbicide tolerant rice plants and methods for identifying same
US8367890B2 (en) * 2006-09-28 2013-02-05 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for removal of a selected DNA sequence
BRPI0719672A2 (pt) 2006-11-29 2013-12-24 Athenix Corp Molécula isolada de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, planta transgênica, semente transgênica, polipeptídeo isolado, método para produzir um polipeptídeo com atividade de resistência a herbicidas, método para conferir resistência a um herbicida em uma planta, planta, método para aumentar o vigor ou rendimento de uma planta, método para conferir resistência ao glifosato a uma planta
AR064558A1 (es) 2006-12-29 2009-04-08 Bayer Cropscience Sa Proceso para la modificacion de las propiedades termicas y de digestion de almidones de maiz y harinas de maiz
AR064557A1 (es) 2006-12-29 2009-04-08 Bayer Cropscience Ag Almidon de maiz y harinas y alimentos de maiz que comprenden este almidon de maiz
EP1950303A1 (de) 2007-01-26 2008-07-30 Bayer CropScience AG Genetisch modifizierte Pflanzen, die eine Stärke mit geringem Amylosegehalt und erhöhtem Quellvermögen synthetisieren
WO2008102199A1 (en) * 2007-02-20 2008-08-28 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from the beta-2-microglobulin gene and uses thereof
CN101679996A (zh) 2007-04-05 2010-03-24 拜尔生物科学公司 抗虫棉花植物及其鉴定方法
US8097774B2 (en) 2007-05-30 2012-01-17 Syngenta Participations Ag Cytochrome P450 genes conferring herbicide resistance
BRPI0812233B1 (pt) 2007-06-05 2022-10-04 Bayer Cropscience Ag Processos para troca de uma sequência de dna-alvo no genoma de uma célula de planta ou planta por uma sequência de dna de interesse, e vetor de dna
AP3195A (en) 2007-06-11 2015-03-31 Bayer Cropscience Nv Insect resistant cotton plants and methods for identifying same
US7960616B2 (en) 2008-02-01 2011-06-14 Athenix Corp. Directed evolution of GRG31 EPSP synthase enzyme
CA2724670C (en) 2008-04-14 2017-01-31 Bayer Bioscience N.V. New mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, dna sequence and isolation of plants which are tolerant to hppd inhibitor herbicides
BRPI0914615A2 (pt) 2008-06-13 2016-09-06 Bayer Bioscience Nv administração de resistência de inseto de lagarta em plantas transgênicas
CN101993876A (zh) * 2009-08-18 2011-03-30 中国农业科学院生物技术研究所 miR169d前体序列改造及其在基因沉默中的用途
AU2012266597B2 (en) * 2011-06-06 2016-09-22 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a preselected site

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009511085A (ja) * 2005-10-18 2009-03-19 プレシジョン バイオサイエンシズ 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
WO2009114321A2 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Precision Biosciencs, Inc. Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011154159A1 (en) 2011-12-15
EP2580335B1 (en) 2017-05-10
JP2013531489A (ja) 2013-08-08
US20130145490A1 (en) 2013-06-06
US9574201B2 (en) 2017-02-21
KR101995698B1 (ko) 2019-07-03
JP6092100B2 (ja) 2017-03-08
CN109504700A (zh) 2019-03-22
CN103119169B (zh) 2018-11-20
CN103119169A (zh) 2013-05-22
US20170096674A1 (en) 2017-04-06
AU2011264075B2 (en) 2015-01-29
AR081594A1 (es) 2012-10-03
MX347575B (es) 2017-05-03
CA2801836A1 (en) 2011-12-15
UA115961C2 (uk) 2018-01-25
SG185668A1 (en) 2012-12-28
EP2580335A1 (en) 2013-04-17
AU2011264075A1 (en) 2013-01-10
BR112012031323A2 (pt) 2015-09-08
RU2639512C2 (ru) 2017-12-21
MX2012014366A (es) 2013-01-29
RU2012157731A (ru) 2014-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101995698B1 (ko) 식물 게놈 공학에서 통상적으로 사용되는 뉴클레오티드 서열에서 식물 게놈을 변경하는 방법 및 수단
Mishra et al. A single transcript CRISPR/Cas9 mediated mutagenesis of CaERF28 confers anthracnose resistance in chilli pepper (Capsicum annuum L.)
KR101992494B1 (ko) 제초제 내성 대두 식물 및 그의 동정 방법
CN101155933B (zh) 原种事件a5547-127以及在生物样品中鉴定此类事件的方法和试剂盒
KR101981250B1 (ko) 대두 계통 ｓｙｈｔ0ｈ2 및 이의 조성물과 이를 검출하는 방법
CN107287234A (zh) 修饰植物基因组的方法和手段
WO1994000992A1 (en) Avidin and homologues as larvicides against insect pests
CN112746083B (zh) 一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法
EP2580336B1 (en) Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
CN110343698B (zh) 构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法
US6603062B1 (en) Method for producing transgenic plants with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis, method for identifying 5-aminolevulinic acid synthesis effectors
US9127290B2 (en) Rice gene capable of imparting wide-spectrum disease resistance
CN1886514B (zh) 用于增强植物胁迫耐受性的方法
EP4408860A1 (en) Wheat plants with an increased yield
WO2024258721A2 (en) Methods and compositions for icafolin herbicide tolerance
AU2022358470A1 (en) Plants with improved properties
WO1991008296A1 (en) Cdna of orsv gene

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20130109

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20160607

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20171117

Patent event code: PE09021S01D

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20180917

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20190327

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20190627

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20190627

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PC1903 Unpaid annual fee

Termination category: Default of registration fee

Termination date: 20230408