MX2008014506A

MX2008014506A - Metodos y composiciones para obtener plantas transgenicas libres de marcadores.

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Publication number: MX2008014506A
Application number: MX2008014506A
Authority: MX
Inventors: Larry Gilbertson; Xudong Ye; Shihshieh Huang; Michael W Petersen; Paul S Chomet; David Walters; Susan Johnson
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2006-05-12
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2008-11-27
Also published as: WO2007134234A2; CN101490264B; EP2316957A3; EP2316957A2; US20070266456A1; US20190345507A1; BR122016030514B1; CA2917552C; JP5330231B2; US11629357B2; JP2020171330A; CA2917552A1; AU2007249224A1; EP2316958B1; EP2316957B1; US20120131699A1; WO2007134234A8; US10240165B2; JP2017063797A; EP2811025A3

Abstract

La invención provee métodos y composiciones para identificar semilla transgénica que contiene un transgén de interés, pero carece de un gen marcador; el uso de una secuencia de identificación que da por resultado un fenotipo detectable incrementa la eficiencia de determinación selectiva para semilla y plantas en las cuales las secuencias de transgén no enlazadas a un gene de interés se han segregado de la secuencia que codifica un gen de interés.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA OBTENER PLANTAS TRANSGENICAS LIBRES DE MARCADORES ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos Serie No. 60/799,875, presentada el 12 de mayo de 2006, cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad. 1. CAMPO DE LA INVENCION La invención generalmente se refiere a plantas transgénicas. De manera más especifica, la invención se refiere a la identificación y remoción de ADN no deseado o innecesario en plantas transformadas. 2. DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA La identificación de ADN transgénico innecesario o no deseado en plantas transformadas ha sido el tema de numerosas investigaciones y muchos métodos diferentes han sido examinados en esfuerzos para eliminar estas secuencias transgénicas de dichas plantas (v.gr., Hanson et al. , 1999; Dale et al., 1991 ; Ebinuma et al. , 1997; Yoder et al. , 1994; Kononov et. al., 1997; Haré y Chua, 2002; Scutt et al., 2002; Puchta, 2003; de Vetten et al., 2003; Halpin, 2005; solicitud publicada de E.U.A. 200301 10532; solicitud publicada de E.U.A.. 20040237142; patente de E.U.A. 6,458,594). En general, es benéfico identificar plantas que no incluyen ADN transgénico que no contribuyen a un rasgo agronómicamente útil de la planta transgénica. Muchos métodos para introducir transgenes en plantas por transformación mediada por Agrobacterium utilizan un ADN-T (ADN transferido) que incorpora un transgén y elementos genéticos asociados, y transfiere éstos al genoma de una planta. Generalmente, el transgén(es) es delimitado por una molécula de ADN de borde derecho (BD) y una molécula de ADN de borde izquierdo (Bl), y es transferido al genoma de la planta, integrándose en uno o más loci. Se ha observado que cuando una construcción de ADN contiene más de un ADN-T, estos ADN-T y los transgenes contenidos en el interior pueden ser integrados en el genoma de la planta en loci separados (Framond et al., 1986). Esto se refiere como co-transformación. El proceso de co-transformación se puede lograr mediante el suministro de los ADN-T con una mezcla de cepas de Agrobacterium transformadas con plásmidos que portan los ADN-T separados. La co-transformación se puede lograr mediante la transformación de una cepa de Agrobacterium con dos o más construcciones de ADN, cada una conteniendo un ADN-T. Un método adicional utiliza dos ADN-T en un solo vector de ADN e identifica células o plantas transgénicas que han integrado los ADN-T en diferentes loci. En un sistema de transformación no mediada por Agrobacterium, tal como un método físico para introducir ADN incluyendo bombardeo con microproyectiles, dos moléculas de ADN se podrían integrar independientemente en el genoma objetivo, y después segregar independientemente en una generación subsecuente. El uso de 2 construcciones de ADN-T que permiten la inserción independiente de secuencias y su segregación genética, también se ha descrito (v.gr., patente de E.U.A. 5,731 , 179; Zhou et al., 2003; Breitler et al., 2004; Sato et al., 2004). Aunque lo anterior ha fomentado el entendimiento en la técnica, persiste la necesidad de métodos y composiciones mejorados para obtener plantas libres de marcador para hacer el desarrollo de productos más eficientes. Los procedimientos de determinación selectiva anteriormente descritos han sido de mano de obra altamente intensiva, por ejemplo requiriendo análisis de Southern blot o PCR™ después del crecimiento de material vegetal R0 y/o R1 . La publicación de E.U.A. 20060041956 describe el uso de un gen marcador visual junto con transformación mediada por Agrobacterium. Sin embargo, la publicación no describe método alguno en donde dichos marcadores son enlazados a un gen marcador seleccionable o selectivamente determinable y no enlazados a un gene de interés. Por lo tanto, persiste la gran necesidad en la técnica de métodos y composiciones que mejoren la facilidad y eficiencia con la cual las plantas que carecen de secuencias de marcador y/o otro ADN transgénico que no sea agronómicamente útil puedan ser identificadas y eliminadas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención provee un método para preparar semillas libres de marcador de una planta transgénica que comprende los pasos de: a) obtener semillas de una planta transgénica transformada con un primer segmento de ADN que comprende un ácido nucleico de interés y un segundo segmento de ADN que comprende un gen marcador de planta físicamente y/o genéticamente enlazado a un cásete de ADN que es operablemente enlazado a un promotor funcional en la semilla, en donde el cásete de ADN confiere un fenotipo detectable a semillas que comprenden el cásete de ADN; b) determinar selectivamente las semillas para ausencia del fenotipo detectable; y c) seleccionar por lo menos una primera semilla que carece del fenotipo detectable para obtener una semilla que es libre del gen marcador. En una modalidad, el paso c) además comprende probar la semilla para la presencia del ácido nucleico de interés y seleccionar una semilla que comprende el ácido nucleico de interés y que carece del gen marcador seleccionable. En ciertas modalidades, el gen marcador es un gen marcador seleccionable o selectivamente determinable. En ciertas modalidades, el cásete de ADN puede ser traduccionalmente o transcripcionalmente fusionado al gen marcador seleccionable; es decir, puede codificar un ARN que sea traduccionalmente o transcripcionalmente fusionado al gen marcador seleccionable. En una modalidad adicional, el cásete de ADN comprende un fragmento de ADN de antisentido o sentido con por lo menos 19 ó 21 pb de homología a un gen endógeno, por ejemplo, en donde el fragmento de ADN de antisentido o sentido es operablemente enlazado a un promotor funcional en una semilla. En otra modalidad adicional, el cásete de ADN comprende un par de repeticiones invertidas de un fragmento de ADN, en donde cada fragmento es por lo menos de 19 ó 21 pb en tamaño, y en donde el fragmento de ADN es homólogo a un gen endógeno, operablemente enlazado a un promotor funcional en la semilla. La repetición de fragmento de ADN invertida homóloga a un gen endógeno también puede ser incrustada en un intrón dentro del gen marcador seleccionable. En ciertas modalidades, el cásete de ADN codifica un ARN de sentido o antisentido que comprende por lo menos 19 ó 21 nucleótidos en donde el fragmento de ADN es homólogo a un gen endógeno. En un método para preparar semillas libres de marcador de conformidad con la invención, la semilla seleccionada puede carecer de un gen y cásete de ADN seleccionable o selectivamente determinable. La obtención de semillas de una planta transgénica puede comprender transformar o co-transformar la planta transgénica o un progenitor de la misma de cualquier generación anterior con primer y segundo segmentos de ADN cobre construcciones de ADN separadas. La obtención de semillas de una planta transgénica también puede comprender transformar la planta transgénica o un progenitor de la misma de cualquier generación anterior con una sola construcción de ADN que comprende el primer y segundo segmentos de ADN. El primer y segundo segmentos de ADN pueden ser unidos por diferentes secuencias de borde de ADN-T. En un método de la invención, una planta transgénica puede ser producida al transformar la planta o un progenitor de la misma de cualquier generación anterior con una construcción de ADN que comprende (i) el primer segmento de ADN flanqueado por bordes de ADN-T derecho e izquierdo, y (¡i) el segundo segmento de ADN flanqueado por un segundo conjunto de bordes de ADN-T izquierdo y derecho, en donde el segundo segmento de ADN además comprende un gen marcador seleccionable operablemente enlazado a un promotor funcional en la planta transgénica. El primer y segundo segmentos de ADN pueden o no estar genéticamente enlazados en la planta transgénica. Las plantas transgénicas usadas de conformidad con la invención pueden ser producidas al introducir el primer y segundo segmentos de ADN en la planta o un progenitor de la misma de cualquier generación anterior por transformación mediada por una cepa bacteriana seleccionada del género Agrobacterium, Rhizobium, Mesorhizobium o Sinorhizobium. Las plantas transgénicas también pueden ser producidas, por ejemplo, por bombardeo de microproyectiles. Un marcador seleccionable usado con la invención puede codificar un producto seleccionado del grupo que consiste de CP4 EPSPS, bar, DMO, Nptll, glifosato acetil transferasa, acetolactato sintasa muíante, DHFR resistente a metotrexato, dalapon deshalogenasa, PMI, Protox, higromicina fosfotransferasa y antranilato sintasa resistente a 5-metil triptofano. Una secuencia de cásete de ADN para usarse con la invención se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste de crtB, gus, gfp, sacB, lux, un gen de síntesis de antocianina, DefH9-iaaM, rolB, OsCDPK2, AP2, AFR2, factor de transcripción de ANT, LEC2, Snf-1, cobA, KAS4, spIA, repeticiones invertidas de zeína, B-peru, y ATP-PFK de levadura. El cásete puede ser operablemente enlazado a un promotor funcional en un tejido seleccionado de un embrión, endospermo de semilla, cotiledón, aleurona y revestimiento de semilla. El promotor puede ser, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de un promotor de napin, un promotor de beta-faseolina, un promotor de subunidad de beta-conglicinina, un promotor de zeína, un promotor de Osgt-1 , un promotor de oleosina, un promotor de almidón sintasa, un promotor de globulina 1 , un promotor de LTP2 de cebada, un promotor de alfa-amilasa, un promotor de quitinasa, un promotor de beta-glucanasa, un promotor de cisteína, un promotor de glutaredoxin, un promotor de HVA1 , un promotor de serina carboxípeptidasa II, un promotor de catalasa, un promotor de alfa-glucosidasa, un promotor de beta-amilasa, un promotor de VP1 , un promotor de USP, un promotor de USP88, un promotor de USP99, Lectina, y un promotor de bronze2. El fenotipo detectable puede ser probado mediante detección de una actividad catalítica. El fenotipo detectable puede ser seleccionado del grupo que consiste de color de la semilla, opacidad de la semilla, capacidad de germinación de la semilla, tamaño de la semilla, viabilidad de la semilla, forma de la semilla, textura de la semilla y una semilla defectuosa o abortada. La determinación selectiva de semillas se puede hacer mediante una máquina de clasificación de semillas automatizada.

En otro aspecto, la invención provee una construcción de ADN que comprende (a) un primer segmento de ADN que comprende bordes de ADN-T izquierdo y derecho que flanquean un gen de interés operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas, y (b) un segundo segmento de ADN que comprende un segundo conjunto de borde de ADN izquierdo y derecho que flanquean un promotor funcional en una semilla operablemente enlazado a un cásete de ADN que confiere un fenotipo detectable en semillas que comprende el cásete de ADN y un gen marcador seleccionable operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas. El gene de interés puede conferir un rasgo seleccionado del grupo que consiste de tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos o plagas, resistencia a enfermedad, biomasa incrementada, metabolismo de ácidos grasos modificado, metabolismo de carbohidratos modificado y calidad nutricional modificada. En la construcción, el cásete de ADN y gen marcador seleccionable pueden ser operablemente enlazados al mismo promotor. En una modalidad, el cásete de ADN y el gen marcador seleccionable son operablemente enlazados a diferentes promotores. En modalidades especificas, el gen marcador seleccionable codifica un producto seleccionado del grupo que consiste de CP4 EPSPS, fosfinotricina acetiltransferasa, DMO, Nptll, glifosato acetil transferasa, acetolactato sintasa mutante, DHFR resistente a metotrexato, dalapon deshalogenasa, PMI, Protox, higromicina fosfotransferasa y antranilato sintasa resistente a 5-metil triptofano. En otras modalidades, el cásete de ADN se selecciona del grupo que consiste de crtB, gus, gfp, sacB, lux, un gen de síntesis de antocianina, DefH9-iaaM, rolB, OsCDPK2, AP2, AFR2, factor de transcripción de ANT, LEC2, Snf-1, cobA, KAS4, spIA, repeticiones invertidas de zeína, B-peru, y ATP-PFK de levadura. El cásete de ADN puede ser operablemente enlazado a un promotor funcional en un tejido seleccionado del grupo que consiste de un embrión, endospermo de semilla, cotiledón, aleurona y revestimiento de semilla. En una modalidad, el cásete de ADN es operablemente enlazado a un promotor seleccionado del grupo que consiste de un promotor de napin, un promotor de beta-faseolina, un promotor de subunidad de beta-conglicinina, un promotor de zeína, un promotor de Osgt-1 , un promotor de oleosina, un promotor de almidón sintasa, un promotor de globulina 1 , un promotor de LTP2 de cebada, un promotor de alfa-amilasa, un promotor de quitinasa, un promotor de beta-glucanasa, un promotor de cisteína, un promotor de glutaredoxin, un promotor de HVA1 , un promotor de serina carboxipeptidasa II, un promotor de catalasa, un promotor de alfa-glucosidasa, un promotor de beta-amilasa, un promotor de VP1 , un promotor de USP88 o USP99 promotor, y un promotor de bronze2. En otro aspecto adicional, la invención provee células y plantas transgénicas transformadas con una construcción provista en las mismas. En una modalidad, se provee una planta transgénica que es co-transformada con una construcción de ADN que contiene un primer segmento de ADN que comprende borde de ADN izquierdo y derecho que flanquean un gen de interés operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas y una segunda construcción de ADN que contiene un segundo segmento de ADN que comprende un segundo conjunto de borde de ADN izquierdo y derecho que flanquean un promotor funcional en una semilla operablemente enlazado a un cásete de ADN que confiere un fenotipo detectable en semillas que comprende el cásete de ADN y un gen marcador seleccionable operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas. También se proveen células de dicha planta. En otro aspecto adicional, la invención provee una construcción de ADN que comprende bordes de ADN-T derecho e izquierdo, en donde un primer segmento de ADN que comprende a gene de interés operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después del borde derecho y un segundo segmento de ADN que comprende un cásete de ADN que confiere un fenotipo detectable a semillas de una planta que comprenden el cásete de ADN y un gen marcador, tal como un gen marcador seleccionable, operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después del borde izquierdo. En otro aspecto adicional, la invención provee una construcción de ADN que comprende bordes de ADN-T derecho e izquierdo, en donde un primer segmento de ADN que comprende un cásete de ADN que confiere un fenotipo detectable a semillas de una planta que comprenden el cásete de ADN y un gen marcador seleccionable operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después del borde derecho y un segundo segmento de ADN que comprende un gen de interés operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después del borde izquierdo.

En otro aspecto adicional, la invención provee una construcción de ADN que contiene dos bordes de ADN-T derechos, en donde un primer segmento de ADN que comprende un gen de interés operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después de un borde derecho y un segundo segmento de ADN que comprende un cásete de ADN que confiere un fenotipo detectable a semillas de una planta que comprenden el cásete de ADN y un gen marcador seleccionable operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas ubicado después del otro borde derecho. En otro aspecto adicional, la invención provee una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, o una secuencia con por lo menos 70%, 75%, 85% o 95% de identidad a SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO.3, y que codifica un polipéptido con actividad de fitoeno sintasa. En una modalidad, la invención también provee una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3, o una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia con por lo menos 71 %, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad a SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3, y que codifica un polipéptido con actividad de fitoeno sintasa, operablemente enlazado a un promotor funcional heterólogo en una planta. Una célula hospedero que comprende dicha secuencia, en donde la célula es una célula bacteriana o una célula de una planta es otra modalidad de la invención. En otra modalidad, la invención provee una planta o semilla transgénica que comprende SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 SEQ ID NO.2, SEQ ID NO:3, o una secuencia con por lo menos 71 %, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad a SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3, y que codifica un polipéptido con actividad de fitoeno sintasa.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos son parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor por referencia a los dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas aquí. Figura 1 A-figura 1 C. Diagramas esquemáticos de: (A) pMON10338; (B) pMON10339; y (C) pMON67465. Figura 2A-figura 2D. Expresión de CrtB en tejidos de soya transformados con pMON67465. Figura 3. Expresión de CrtB en semilla del evento A33908. Figura 4. Expresión de crtB, gus, y CP4/EPSPS en semillas de R1 inmaduras. Figura 5. Expresión de crtB en semillas de R1 maduras. Figura 6A-figura 6E. Reumático de secuencias de ADN transferidas mediante el uso de una construcción que comprende un gen selectivamente determinable enlazado a un gen marcador seleccionable de CP4 para semillas libres de marcador. A) GOI localizado en un ADN-T flanqueado con un BD y Bl y físicamente enlazado a un segundo ADN-T que contiene un gen selectivamente determinable enlazado a un gen marcador seleccionable de CP4 en una construcción usada para transformación mediada por Agrobacterium; B) Un vector que contiene dos bordes, el GOI se coloca después de un BD mientras que los genes marcadores selectivamente determinables y seleccionabas se colocan después de un BD o después de un Bl junto con la estructura de base; C) El GOI y genes selectivamente determinables -DNAs son separados en dos vectores y transformados ya sea en una célula de Agrobacterium o células de Agrobacterium separadas; D) Posible enlace de dos segmentos de ADN del GOI y genes marcadores selectivamente determinables y seleccionabas. Sólo el GOI por sí solo mostrará apariencia de velocidad normal, mientras que las células que contienen el gen selectivamente determinable muestra un fenotipo visible; E) Dos segmentos de ADN separados contienen ya sea el GOI o genes marcadores selectivamente determinables y seleccionares usados para transformación no mediada por bacterias. Figura 7. pMON67420 representa una construcción de GOI para co-transformación. Figura 8. Plásmido pMON99575 que contiene fosfofructocinasa dependiente de ATP de Schizosaccharomyces pombe impulsado por el promotor de zeína especifico de semilla. Figura 9. Mazorca de maíz que expresa fosfofructocinasa dependiente de ATP de Schizosaccharomyces pombe anuló el desarrollo normal del grano. Figura 10. Diagrama esquemático de construcciones que codifican ARNdc usadas para demostrar que las repeticiones invertidas colocadas dentro de un intrón de un gen marcador dan por resultado un fenotipo visible. Figura 1 1. Repeticiones invertidas incrustadas en un intrón dan origen a un fenotipo visible. Figura 12. El silenciamiento de a-zeinas en granos de maíz conduce a un fenotipo visible. Figura 13. Diagrama esquemático de pMON83530 que contiene KAS4. Figura 14. La progenie de semillas de soya transformadas con pMON83530. Las semillas de la izquierda se encogen debido a expresión de KAS4 e indican la presencia de marcador seleccionable, mientras que las semillas de la derecha son normales y libres de marcador. Figura 15. El diagrama esquemático de pMON107314 que contiene KAS4 útil como una secuencia de identificación en una construcción de ADN-2T. Figura 16. El diagrama esquemático de pMON68581 que contiene un gen spIA útil como un gen de identificación. Figura 17. Progenie de semillas de soya transformadas con pMON68581 . Las semillas de la derecha se encogen debido a expresión de spIA e indican la presencia del marcador selectivamente determinable o seleccionable, mientras que las semillas de la izquierda son normales y libres de marcador. Figura 18. Formatos de vector de ADN-2T - diagrama esquemático.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La siguiente es una descripción detallada de la invención provista para ayudar a los expertos en la técnica a poner en práctica la presente invención. Los expertos en la técnica pueden hacer modificaciones y variaciones en las modalidades descritas aquí sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención. La invención supera las deficiencias en la técnica anterior al proveer construcciones y métodos que permiten distinguir eficientemente semillas que carecen de una secuencia de identificación y secuencia de gen marcador, pero que incluyen un gene o genes de interés (GOl), de semillas que contienen una secuencia de gen de identificación y secuencia de gen marcador, basada en un fenotipo conferido por un gen, secuencia o cásete de identificación expresado en la semilla. En particular, la presente invención provee, en una modalidad, construcciones y métodos de transformación para transformación de células vegetales que incluyen: (i) un gene de interés; y (ii) una secuencia de identificación expresada en semilla y físicamente enlazada a un gen marcador seleccionable o selectivamente determinable que se puede expresar en varios tejidos vegetales, en donde la construcción y/o método de transformación se designa de modo que los elementos genéticos de (i) y (ii) puedan integrarse independientemente en el genoma de la planta, y por lo tanto genéticamente segregar uno de otro. La expresión o falta de la misma de la secuencia de identificación en tejidos de semilla permite la identificación directa de semillas y plantas que carecen de la secuencia de identificación expresada en la semilla y el gen marcador seleccionable o selectivamente determinable físicamente enlazado, mientras permite la elección de semillas y plantas que aún contienen el transgén de interés. La elección de la semilla que incluye el gene de interés y que carece de la secuencia de genes marcadores al nivel de semilla representa un avance significativo ya que evita la necesidad de métodos de determinación selectiva previamente utilizados que son comparativamente intensivos en costo y mano de obra. Además, se puede ahorrar tiempo ya que la determinación selectiva se puede hacer antes de o durante la germinación sin requerir el crecimiento de la siguiente generación de plantas a un tamaño que permita la cosecha de tejido, según sea necesario para, por ejemplo, análisis de enlace-Southern. En una modalidad, la transformación de tejido vegetal es realizada por Agrobacterium u otro método mediado por Rhizobía (véase, v.gr., solicitud de patente provisional de E.U.A. Serie No. 60/800,872, presentada el 16 de mayo de 2006, titulada "Use of Non-Agrobacterium Bacterial Species for Plant Transformaron" y caso de apoderado cedido No.

MONS:100USP1 , cuya descripción se incorpora específicamente aquí por referencia en su totalidad), y las secuencias de ADN incluyendo la secuencia de identificación expresada en semilla y el gen marcador físicamente enlazado seleccionable o selectivamente determinable están presentes juntos en una secuencia de ADN-T u otra secuencia (v.gr., estructura de base de vector) que es transferida a una célula vegetal (v.gr., flanqueado por secuencias de BD y/o Bl de ADN-T o sin una secuencia de borde). La secuencia de identificación y gen marcador puede ser transferida a la planta físicamente enlazada, mientras que el gen de interés está presente en un ADN-T flanqueado separado por sus propias secuencias de BD y Bl, u otra secuencia transferida a la célula vegetal, y puede ser integrada en un locus independiente (v.gr., figura 18). El marcador seleccionable y/o selectivamente determinable permite la identificación de tejidos vegetales transformados. Las plantas fértiles pueden ser obtenidas y autocruzadas o cruzadas en un esquema de reproducción para seguir la segregación de fenotipos en la siguiente generación. Las estrategias para realizar dicha reproducción son bien conocidas en la técnica, y pueden variar en detalles entre diferentes plantas. La expresión, o falta de expresión, de las semillas, de la secuencia de identificación permite la identificación fácil de semilla con respecto a la presencia de secuencias de marcador e identificación. El gene de interés, por ejemplo, puede contener por lo menos un cásete de expresión de la planta que codifica un rasgo seleccionado del grupo que consiste de tolerancia a herbicidas, resistencia a antibióticos, resistencia a insectos, resistencia a enfermedad, resistencia a estrés (v.gr., sequía y frío), eficiencia de uso de nutrientes incrementada, contenido nutritivo incrementado (v.gr., aminoácido, proteína, azúcares, carbohidratos, ácidos grasos, y/o aceite), sistemas de esterilidad, enzimas industriales (v.gr., enzimas farmacéuticas y de procesamiento para bio-combustibles) y campo incrementado. Las secuencias que pueden ser transferidas a una célula vegetal (v.gr., ADN-T) pueden estar presentes en un vector de transformación en una cepa bacteriana que es utilizada para transformación. En otra modalidad, las secuencias que incluyen la secuencia de identificación y marcador vegetal seleccionable, y la(s) secuencia(s) que comprende(n) el gene(s) de interés pueden estar presentes en vectores de transformación separados en la cepa bacteriana. En otra modalidad adicional, el ADN-T que incluye la secuencia de identificación y el marcador vegetal seleccionable y el ADN-T que comprende el gen de interés se pueden encontrar en células o cepas bacterianas separadas usadas juntas para transformación. En otra modalidad adicional, las secuencias de ADN que incluyen el (i) gen de interés; y (ii) secuencia de identificación expresada en semilla y físicamente enlazada a gen marcador seleccionable o selectivamente determinable se pueden introducir en una célula vegetal por un método físico tal como bombardeo de microproyectiles. En dicha modalidad, las secuencias de ADN de (i) y (i¡) se pueden localizar en fragmentos separados de ADN que se pueden mezclar juntos antes de o durante el revestimiento de microproyectiles con ADN. Las secuencias de ADN pueden estar presentes en un solo microproyectil, o pueden estar presentes en microproyectiles separados que se mezclan juntos antes del bombardeo. El fenotipo transportado por la secuencia de identificación se puede lograr por sobreexpresión ectópica de un gen heterógeno o endógeno enlazado a un promotor constitutivo o específico de semilla, o por regulación descendente de un gen endógeno usando ARN de antisentido, interferencia de ARN o tecnología de co-supresión. Ejemplos del gen endógeno pueden incluir, pero no se limitan a, genes implicados en el metabolismo de azúcar/almidón, metabolismo de proteína y metabolismo de ácidos grasos. En una modalidad, la expresión de semilla de la secuencia de identificación da por resultado un fenotipo detectable en semilla de una planta transgénica que contiene una secuencia de identificación. En algunas modalidades, el fenotipo puede ser detectado por inspección visual, y puede incluir un cambio en color, opacidad (o translucidez), fluorescencia, textura, tamaño, forma, capacidad de germinación y viabilidad de la semilla o generalmente cualquier componente o propiedad que puede ser físicamente o bioquímicamente sometida a prueba y diferente de aquella encontrada en el genotipo del receptor no transgénico. En ciertas modalidades, la secuencia de identificación incluye un gen que codifica gusA, gfp (Pang ef al. , 1996), fitoeno sintasa, o fitoeno desaturase, o un gen de antocianina (Pl, Le, B-Peru, C1 , R, Re, mybA o mybl (v.gr. , Selinger eí al., 1998; Ludwig eí al. , 1989; Himi ef al., 2005; Kobayashi ef al., 2002)). En una modalidad particular, el gen de identificación comprende un gen crtB que codifica una fitoeno sintasa (patentes de E.U.A. Nos. 5,429,939; US 6,429,356; patente de E.U.A. 5,545,816), incluyendo un gen que comprende una secuencia de crtB optimizada en cuanto a codón para expresión en una planta monocotiledónea, tal como una planta de maíz. Otro ejemplo de gen que se podría usar a este respecto es un gen implicado en la producción de pigmento de semilla. En otras modalidades, el fenotipo se puede probar por detección de actividad catalítica. En otras modalidades adicionales, el fenotipo es un fenotipo de ablación de tejido, por ejemplo, un bloqueo en la formación de polen, óvulo o tejido de semilla. También se contemplan composiciones y métodos que silencian los genes requeridos para la producción o viabilidad de gametos, reduciendo o previniendo fertilizaciones que incluyen el gen marcador. Por ejemplo, se podrían usar secuencias que den por resultado el sílenciamiento de genes requeridos para el desarrollo y viabilidad del polen. Los granos de polen que se derivan de segregantes meióticos que portan el gen marcador no se desarrollarían o serían ¡nvíables, evitando así la transmisión del gen marcador a la progenie a través del polen. En polinizaciones cruzadas, toda la progenie sería libre de marcador. También se contempla el uso de secuencias que dan por resultado el sílenciamiento de otro gen endógeno (v.gr., las tecnología de iARN incluyendo ARNmi) para producir un fenotipo de semilla. Dichos genes incluyen, pero no se limitan a: genes que codifican o modifican la expresión de proteínas de almacenamiento de semilla tales como zeínas, Opaque2, Waxy (ceroso), y otros genes que codifican proteínas implicadas en la acumulación de carbohidratos, proteína, y/o lipidos en las semillas. La expresión de una secuencia de identificación que confiere un fenotipo de polen no viable también es deseable debido a que sólo los granos de polen sin la secuencia de identificación serían capaces de fertilizar óvulos incrementando así la producción de semillas libres de la secuencia de identificación y la secuencia de marcador cuando la linea transgénica que porta la secuencia de identificación bajo el control de un promotor específico de polen se usa como un polinizador masculino. La secuencia de identificación puede producir una proteína que sea letal para el polen o inhibidora para la germinación del polen. Alternativamente, la expresión de un par de repeticiones invertidas homologas a un gen de polen endógeno esencial se puede usar para silenciar el gen que hace al polen no viable. Ejemplos de genes específicos de polen y promotores son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen por ejemplo genes LAT52 y LAT59 y promotores de tomate como se describe (Eyal et al., 1995). En otra modalidad, la secuencia de identificación se puede expresar tanto en la semilla como el polen para incrementar adicíonalmente la selección de semillas con el gen de interés y eliminar las semillas con la secuencia de identificación y el gen marcador. Esto se puede lograr usando una secuencia de identificación compuesta de dos transgenes; uno que se expresa en la semilla y el otro se expresa en el polen. Alternativamente, un promotor que puede expresar la misma secuencia de identificación en el polen y semilla también puede dar por resultado un fenotipo detectable tanto en el polen como en la semilla. Ejemplos de promotores que se expresan en polen y semilla son los promotores del gen ceroso del maíz (zmGBS; Shure et al., 1983), y el gen de ADP-glucosa pirofosforilasa de subunidad pequeña de arroz (osAGP; Anderson et al. , 1991 ). Los patrones de expresión de polen y semilla también se describen en Russell y Fromm, 1997. La secuencia de identificación alternativamente puede alterar carbohidratos, proteínas, lípidos u otros productos del metabolismo celular o de la semilla para producir un fenotipo detectable. En una modalidad, la secuencia de identificación permite la expresión específica de endospermo de un gen sacB que codifica una levansucrasa o una fosfofructocinasa dependiente de ATP de levadura (ATP-PFK) que anula la acumulación de almidón en semillas que contienen la secuencia de identificación y gen marcador (Caimi ef al., 1996; figura 9). La secuencia de identificación también puede ser un gen. La secuencia de identificación además puede codificar una fusión transcripcional o traduccional (v.gr. , U.S. 6,307, 123; publicación de patente de E.U.A. 20060064772). La patente de E.U.A. 6,307,123 se refiere a la construcción de una fusión traduccional entre un gen marcador seleccionable (npfll) y un gen marcador selectivamente determinable (gfp). El método se puede aplicar para producir una fusión entre una secuencia de identificación descrita aquí y un marcador seleccionable o uno selectivamente determinable descrito aquí. Otro método que se puede usar para hacer una fusión de polipéptido se basa en la vía de procesamiento de ubiquitina (Ub). Este método se puede usar para digerir un polipéptido largo que comprende dos dominios de proteína en dos proteínas activas separadas. En este método, un cásete de un solo gen puede codificar dos ORFs, en donde los dos ORFs, v.gr., para crtB y EPSPS-CP4 son separados por los aminoácidos 14 C-terminales de Ub, seguido por una secuencia de Ub de longitud completa. Después de la traducción in vivo, las enzimas de des-ubiquitinación endógenas (DUBs) digieren la poliproteína en tres unidades separadas: 1 ) la proteína N-terminal, que comprende la secuencia de identificación crtB que termina en los aminoácidos 14 C-terminales de Ub; 2) un monómero de Ub; y 3) el polipéptido C-terminal, que codifica un marcador seleccionable EPSPS-CP4. Dichos métodos son conocidos por los expertos en la técnica (v.gr. Walker et al, 2007). Una fusión transcripcional entre una secuencia de identificación y un marcador seleccionable o selectivamente determinable se puede hacer usando sitios de entrada a ribosomas internos (IRES). Por ejemplo, se podría hacer una transcripción que codifique el ORF de crtB seguido por el ORF de ESPSP-CP4 con un elemento de IRES funcional ubicado entre ellos. Varios IRES son conocidos por los expertos en la técnica (véase, v.gr., Dinkova et al. 2005 y referencias en la misma; y patente de E.U.A. 7, 1 19,187, incorporada aquí por referencia). El fenotipo de la secuencia de identificación en tejido de la semilla también puede ser detectado por métodos que incluyen métodos visual, bioquímico, inmunológico y basado en aminoácido (v.gr. basado en PCR), entre otros. La secuencia de identificación puede conferir un fenotipo detectable en tejido de semilla que se puede distinguir del fenotipo del gen marcador. El fenotipo conferido por la secuencia de identificación puede incluir germinación de semilla alterada. La secuencia de identificación se puede expresar en una o más porciones de una semilla (grano), incluyendo el embrión, endospermo, cotiledón(es), y revestimiento de semilla (testa), de tal manera que un fenotipo puede ser discernido. La secuencia de identificación también puede causar un fenotipo sin semilla. Para lograr ablación de tejido, en una modalidad, la secuencia de identificación dirige expresión especifica de óvulo de defH9-iaaM o rolB en plantas (v.gr. Rotino et al. 1997, Carmi et al. , 2003, GenBank AM422760, X64255, AE009418), que anula el desarrollo del óvulo y produce un fenotipo sin semilla en marcador y secuencia de ovarios que contienen identificación. En otra modalidad adicional, la secuencia de identificación dirige sobreexpresion de OsCDPK2 en cultivos de cereales alterando el desarrollo de semilla (Morello et al. 2000; v.gr., GenBank Y 3658). También se pueden diseñar elementos genéticos para suprimir la expresión de un gen endógeno, dando por resultado la producción de un fenotipo de semilla que permite distinguir semillas que contienen el gen marcador de los que no lo contienen. Los elementos genéticos de esta secuencia de identificación están físicamente enlazados al gen marcador, v.gr. incrustados dentro del cásete marcador de ADN, de tal manera que el fenotipo de semilla está enlazado a la presencia del marcador, permitiendo la rápida identificación de semillas que contienen marcador. Se puede usar ¡ARN para silenciar uno o más genes produciendo un fenotipo de semilla fácilmente calificable, preferiblemente visible. Las secuencias de ADN requeridas para un fenotipo de semilla mediada por ¡ARN están ubicadas en el mismo ADN-T que el gen marcador. Cualquier semilla de progenie que contiene el gen marcador también desplegaría el fenotipo de semilla y sería fácilmente identificado. Dichas semillas no necesitarían crecer y determinarse selectivamente para la presencia del gen marcador. Por lo tanto, sólo semillas sin el fenotipo conferido por la secuencia de identificación se hacen crecer y/o se determinan selectivamente para la presencia del GOl. Dependiendo de si las semillas son de auto-polinización o cruza externa, este método reduce el número de semillas que necesitan ser plantadas y determinadas selectivamente por lo menos por 3X para la autocruza de especies vegetales o 1X para cruza externa de especies vegetales. Una amplia variedad de composiciones son conocidas por los expertos en la técnica que se pueden usar para silenciar un gen objetivo usando vías relacionadas con ¡ARN. Una modalidad es ensamblar un cásete de ADN que transcriba una repetición invertida de secuencias, para producir un ARN de doble cadena (ARNdc), típicamente por lo menos de aproximadamente 19-21 pb de longitud y correspondiendo a una porción de uno o más genes dirigidos para silenciamiento. El ARNdc puede ser de aproximadamente 19-21 pb de longitud y correspondiendo a una porción de uno o más genes dirigidos para silenciamiento. Este cásete de ADN que incluye una secuencia de identificación está ubicado dentro del mismo ADN-T que el gen marcador seleccionable. Otros métodos para silenciar un gen conocido por los expertos en la técnica incluyen, pero no se limitan a: la co-supresión, antisentido, expresión de RNAmi (naturales o genéticamente manipulados), expresión de RNAsc de acción trans, y expresión de ribozimas. Cualquiera de estos métodos se puede usar si las secuencias requeridas para el efecto de silenciamiento de gen están ubicadas en el mismo ADN-T que el gen marcador. La secuencia de identificación puede incrementar o disminuir el tamaño de la semilla. En una modalidad, la secuencia de identificación confiere regulación descendente del gen AP2 (v.gr., GenBank U12546) por tecnología de ARN de antisentido o interferencia o co-supresión de de ARN (Jofuku et al., 2005), que da por resultado semillas más grandes que contienen la secuencia de identificación y gen marcador seleccionabas. El tamaño de semilla más grande también se puede lograr por expresión ectópica de un gen AFR2 (Schruff et al. , 2006; v.gr., accesos a GenBank NM_203251 ; NM_1809 3), o factor de transcripción de ANT (Mizukami y Fisher, 2000; v.gr., GenBank NM_202701 , NM_119937, NM_180024, NM_101474, NM_2021 10). En otra modalidad, la secuencia de identificación transporta regulación descendente de un gen LEC2 (v.gr., GenBank AF400123) o un gen Snf-1 (GenBank AB101657, AB101656, AB101655) por ARN de antisentído o ¡ARN o tecnología de co-supresión, que conduce a tamaño de semilla disminuido (Mendoza et al., 2005; Radchuk et al., 2006). El tamaño de semilla cambiado puede ser fácilmente clasificado por peso, forma o tamizarse por medios manuales y/o mecánicos. Se contempla específicamente que las técnicas de determinación selectiva automatizadas se pueden implementar con la presente invención para la identificación de semillas que tienen un fenotipo detectable particular. De esta manera, grandes números de semillas pueden ser eficientemente determinadas selectivamente y semillas que carecen de una secuencia de identificación pueden ser recolectadas. Las técnicas automatizadas pueden ser más rápidas, menos costosas y más exactas que las que se basan en técnicas humanas. Se han descrito las máquinas de clasificación de semillas que se podrían usar de esta manera. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,946,046 describe un aparato para clasificar semillas de conformidad con el color. En esta máquina, las semillas se clasifican de conformidad con el color colocando las semillas en hileras de hendiduras uniformes en un tambor giratorio y haciendo pasar las semillas por debajo de una cámara de imagen digital y una fuente de luz. Las imágenes son leídas por la cámara y son alimentadas a una computadora, que también recibe información de un sensor de velocidad de tambor. La computadora genera una señal que hace que un estallido de aire sople a través de una abertura en el fondo de una hendidura que contiene una semilla de color para recolectar dicha semilla. Las semillas recolectadas son alimentadas a una tolva de recolección, y las semillas no coloreadas a una tolva separada.

Al variar la longitud de onda de la fuente de luz usada para detección de semillas coloreadas, así como filtros de barrera colocados entre las semillas coloreadas y la cámara de detección, potencialmente cualquier marcador de identificación se podría detectar con esta técnica. Por ejemplo, para detectar semillas que expresen GFP, la longitud de onda de excitación está en el espectro de UV de luz azul, típicamente a aproximadamente 395 nm. Las fuentes de luz adecuadas para emisión de UV son bien conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen lámparas de xenón o mercurio. Conjuntos de filtro adecuados también son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, un filtro excitador de BP450-490, un divisor de haz cromático FT510, y un filtro de barrera BP515-565 (Cari Zeiss, Inc., Thornwood, NY). Dichos conjuntos de filtro y longitudes de onda emisoras se describen con más detalle en Heim y Tsien, 1996, cuya descripción es específicamente incorporada aquí por referencia en su totalidad. Con el uso de construcciones que incluyen una o más secuencias de identificación(es), el poder selectivo se puede extender a múltiple genes y genes de interés seleccionable y/o selectivamente determinables. Por lo tanto, grandes números de semillas transgénicas, que representan una variedad de diferentes eventos de transformación, pueden ser eficientemente determinados selectivamente y sólo aquellas semillas que tienen (o que carecen) de un conjunto deseado de secuencias de identificación se pueden seleccionar. Un vector de ADN recombinante, por ejemplo, puede ser un segmento lineal de ADN o un plásmido circular cerrado. El sistema de vector puede ser un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que ha de ser introducido en el genoma de la planta. Moléculas de ácido nucleico como se expone aquí, por ejemplo, pueden ser adecuadamente insertadas en un vector bajo el control de un promotor adecuado que funciona en una célula vegetal para impulsar la expresión de una secuencia codificadora enlazada u otra secuencia de ADN. Muchos vectores están disponibles para este propósito, y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico que ha de ser insertado en el vector y la célula hospedero particular que ha de ser transformada con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función y el vector y célula vegetal particulares con los cuales se usa o es compatible. Un número de vectores adecuados para transformación estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas son bien conocidos, v.gr. , Gelvin et al. (1990). Típicamente, los vectores de expresión de la planta incluyen, pero no se limitan a, una o más unidades de transcripción de genes de interés, cada una de las cuales incluye: una región no traducida 5', que incluye secuencias que controlan la transcripción (v.gr., secuencias promotoras de acción cis tales como incrementadores, el sitio de inicio de transcripción, etc.) y traducción (v.gr. , un sitio de unión a ribosoma) de una secuencia codificadora de proteína operablemente ligada ("marco de lectura abierta", ORF); una región no traducida 3' que incluye regiones reguladoras adicionales del extremo 3' de los genes de la planta (Thornburg et al. , 1987); An et al. , 1989), v.gr., una región terminadora 3' para incrementar la estabilidad de ARNm. Alternativamente, un vector de expresión de una planta se puede diseñar para la expresión de una molécula de ARNm que, por ejemplo, puede alterar expresión de genes de la planta por un enfoque mediado por iARN. Además, dichas construcciones comúnmente incluyen una unidad de transcripción de marcador seleccionable y/o selectivamente determinable y opcionalmente un origen de replicación u otras secuencias requeridas para replicación del vector en una célula hospedero bacteriana. Las construcciones también pueden contener los segmentos de estructura de base de ADN de plásmido que proveen función de replicación y selección de antibióticos en células bacterianas, por ejemplo, un origen de replicación de Escherichia co//' tal como or/322, origen de replicación de amplio rango de hospederos tal como or/V o oriRi, y una región de codificación para un marcador seleccionable tal como Spec/Strp que codifica para Tn7 aminoglucósido adeniltransferasa (aadA) confiriendo resistencia a espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Para transformación de una planta, la cepa bacteriana hospedera con frecuencia es Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, LBA4404, EHA101 o EHA105 que porta un plásmido que tiene una función de transferencia para la unidad de expresión. Otras cepas conocidas por los expertos en la técnica de transformación de plantas pueden funcionar en la presente invención.

Vectores de expresión de la planta opcionalmente incluyen señales de procesamiento de ARN, v.gr., intrones, que pueden ser colocados hacia el extremo 5' o hacia el extremo 3' de una secuencia codificadora de polipéptido en el transgén. Además, los vectores de expresión también pueden incluir secuencias reguladoras adicionales de la región no traducida 3' de genes de la planta. Estas regiones no traducidas 3' contienen señales de terminación de transcripción de ARNm. Otros elementos movibles contenidos en los vectores de expresión de una planta pueden incluir secuencias líderes 5', secuencias de señal de tránsito, y secuencias codificadoras. Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también referido como un marcador seleccionable de planta. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células vegetales transformadas que crecen en un régimen de cultivo selectivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a agentes selectivos tales como antibióticos incluyendo herbicidas, u otras toxinas, v.gr., neomicina, metotrexato, dicamba, glufosinato o glifosato. Aquellas células que son exitosamente transformadas con una proteína heteróloga o fragmento de la misma producen una proteína que confiere, v.gr. resistencia a fármacos y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de varios marcadores seleccionables/selectivamente determinables/calificables y genes que los codifican se describen en Miki y McHugh, 2004. Un vector de expresión para producir un ARNm también puede contener un promotor ¡nducible o especifico de tejido que es reconocido en la célula vegetal y es operablemente enlazado al ácido nucleico, que codifica la molécula de ácido nucleico, o fragmento del mismo, de interés. Los promotores de plantas se describen a continuación. En una modalidad, el vector de transformación de la planta que se utiliza incluye una molécula de ADN aislada y purificada que incluye un promotor específico de semilla heterólogo operativamente enlazado a una o más secuencias de nucleótidos de la presente invención. En otra modalidad, el promotor es expresado por la semilla, pero no especifico de la semilla. Un vector de transformación de la planta puede contener secuencias de uno o más genes, permitiendo así la producción de más de un ARNm en una célula vegetal. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que segmentos de ADN se pueden combinar en un solo segmento mixto de ADN para expresarse en una planta transgénica. Métodos adecuados para la transformación de células hospedero para usarse con la presente invención se cree que incluyen virtualmente cualquier método por el cual el ADN puede ser introducido en una célula (véase, por ejemplo, Miki et al., 1993), tal como por transformación de protoplastos (patente de E.U.A. No. 5,508, 184; Omirulleh et al., 1993), por absorción de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al., 1985), por electroporación (patente de E.U.A. No. 5,384,253), por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; patente de E.U.A. No. 5,302,523; y patente de E.U.A. No. 5,464,765), por transformación mediada por Agrobacterium (patentes de E.U.A. Nos. 5,563,055; 5,591 ,616; 5,693,512; 5,824,877; 5,981 ,840; 6,384,301 ) y por aceleración de partículas revestidas de ADN (patentes de E.U.A. Nos. 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6, 160,208; 6,399,861 ; 6,403,865; Padgette et al. 1995), etc. A través de la aplicación de técnicas tales como éstas, las células de casi cualquier especie pueden ser establemente transformadas. En el caso de especies multicelulares, las células transgénicas pueden ser regeneradas en organismos transgénicos. El método más ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium (por ejemplo, Horsch et al. , 1985). Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, portan genes responsables de transformación genética de la planta. Descripciones de sistemas de vector de Agrobacterium y métodos para transferencia de gen mediada por Agrobacterium son provistos por numerosas referencias, incluyendo Gruber et al. , 1993; Miki et al., 1993, Moloney et al. , 1989, y patentes de E.U.A. Nos: 4,940,838 y 5,464,763. Otras bacterias tales como Sinorhizobium: Rhizobium, y Mesorhizobium que interactúan con plantas naturalmente pueden ser modificadas para mediar la transferencia de gen a un número de diversas plantas (Broothaerts et al., 2005). Estas bacterias simbióticas asociadas con plantas se pueden hacer competentes para transferencia de genes por la adquisición tanto de plásmido Ti desarmado como un vector binario adecuado. Las secuencias de ADN que han de ser transferidas mediante un método de transformación mediado por Agrobacterium incluyen una o más secuencias de "borde", tales como secuencias borde derecho (BD) y borde izquierdo (Bl) que usualmente definen el grado del ADN transferido (ADN-T) que contiene uno o más genes que han de ser expresados en una célula vegetal, y además pueden incluir una secuencia incrementadora tal como una secuencia abrumadora (Toro et al., 1989) o una pluralidad de secuencias abrumadoras como se describe en la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 60/831 ,814, incorporada aquí por referencia. Las técnicas que pueden ser particularmente útiles en el contexto de transformación de algodón se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,846.797, 5, 159, 1 35, 5,004,863 y 6,624,344. Las técnicas para transformar plantas de Brassica en particular se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. 5,750,871 ; y las técnicas para transformar soya se describen, por ejemplo, en Zhang et al. , 1999, patente de E.U .A. 6,384 ,301 , y E.U.A. 7,002,058. Las técnicas para transformar maíz se describen en WO9506722. algunos ejemplos no limitantes de plantas que pueden encontrar uso para la invención incluyen alfalfa, cebada, frijol, remolacha, brócoli, col, zanahoria, cañóla, coliflor, apio, col china, maíz, algodón, pepino, frijol seco, berenjena, hinojo, frijol de jardín, calabacín, puerro, lechuga, melón, avena, quimbombó, cebolla, guisante, pimiento, calabaza, cacahuate, papa, calabaza, rábano, arroz, sorgo, soya, espinaca, calabaza amarilla, maíz dulce, remolacha azucarera, girasol, tomate, sandía y trigo. Un vector o construcción también puede incluir varios elementos reguladores. La secuencia líder no traducida 5' se puede derivar del promotor seleccionado para expresar la secuencia de gen heteróloga de la molécula de ADN de la presente invención, y puede ser específicamente modificada si se desea para incrementar la traducción de ARNm. Las regiones no traducidas 5' también se pueden obtener ARNs virales de la planta (v.gr., virus del mosaico del tabaco, virus de grabado del tabaco, virus del mosaico enano del maíz, virus del mosaico de la alfalfa) de genes eucarioticos adecuados, genes de plantas (líder de gen de proteína de unión a clorofila a/b de trigo y maíz), o de una secuencia de gen sintética. La secuencia líder también se podría derivar de un promotor no relacionado o secuencia codificadora. Las secuencias líderes útiles en el contexto de la presente invención incluyen el líder Hsp70 del maíz (patente de E.U.A. No. 5,362,865 y patente de E.U.A. No. 5,859,347, incorporada aquí por referencia en su totalidad), y el elemento omega de TMV (Gallie et al. , 1989). Ejemplos de secuencias líderes de traducción incluyen líderes de impacto de calor de maíz y petunia (patente de E.U.A. No. 5,362,865), líderes de proteína de revestimiento de virus de plantas, líderes de rubisco de planta, GmHsp (patente de E.U.A. 5,659, 122), PhDnaK (patente de E. U.A. 5,362,865), AtAntl , TEV (Carrington y Freed, 1990), AGRtunos (acceso a GenBank V00087; Bevan et al. , 1983), OsActl (patente de E.U.A. 5641876), OsTPI (patente de E.U.A. No. 7, 132,528), y OsAct15 (publicación de E.U.A. No. 20060162010), entre otros. Secuencias de intrón son conocidas en la técnica para ayudar en la expresión de transgenes en células de plantas monocotiledóneas. Ejemplos de intrones incluyen el intrón de actína de maíz (patente de E.U.A. 5,641 ,876), el intrón de maíz HSP70 (ZmHSP70; patente de E.U.A. 5,859,347; patente de E.U.A. 5,424,412), y el intrón TPI de arroz (OsTPI; patente de E.U.A. No. 7, 132,528), y son de beneficio en la práctica de esta invención. Un vector también puede incluir una secuencia de ácido nucleico de péptido de tránsito. Muchas proteínas localizadas en cloroplastos, incluyendo aquellas implicadas en síntesis de carotenoides, se expresan a partir de genes nucleares como precursores y son dirigidas al cloroplasto por un péptido de tránsito de cloroplasto (CTP) que es removido después de los pasos de importación. Ejemplos de otras de esas proteínas de cloroplastos incluyen la subunidad pequeña (SSU) de ribulosa-1 ,5,-bisfosfato carboxilasa, y el complejo proteina I y proteína II de luz-cosecha. Se ha demostrado in vivo e in vitro que las proteínas que no son cloroplastos pueden ser dirigidas al cloroplasto mediante el uso de fusiones de proteína con un CTP y que una secuencia de CTP es suficiente para dirigir una proteína al cloroplasto. La incorporación de un péptido de tránsito de cloroplasto adecuado, tal como EPSPS CTP de Arabidopsis thaliana (At) (Klee et al., 1987), y EPSPS CTP de Petunia hybrida (Ph.) (della-Cioppa et al., 1986) se ha mostrado que dirige secuencias de proteína heterólogas a cloroplastos en plantas transgénicas. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden hacer varias construcciones quiméricas, si es necesario, utilizando la funcionalidad de un CTP particular para importar un producto de gen dado en un cloroplasto. Otros CTPs que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen CTPs derivados de PsRbcS (CTP de subunidad pequeña de Rubisco de Pisum sativum; Coruzzi et al. , 1984); CTP de AtRbcS (CTP de subunidad pequeña de Rubisco de 1A de Arabidopsis thaliana; CTP1 ; patente de E.U.A. 5,728,925); CTP de AtShkG (CTP2; Klee et al. , 1987); CTP de AtShkGZm (CTP2sintética; codón optimizado para expresión de monocotiledóneas; SEQ ID NO: 14 de WO04009761 ); CTP de PhShkG (EPSPS; CTP4 de Petunia hybrida; codón optimizado para expresión de monocotiledóneas; Gasser et al. , 1988); TaWaxy CTP (CTPsintético de almidón sintasa unido a granulo de Triticum aestivum, codón optimizado para expresión de maíz: Clark et al., 1991): OsWaxy CTP (almidón sintasa CTP de Oryza sativa; Okagaki, 1992); NtRbcS CTP (péptido de transito de cloroplasto de subunidad pequeña de ribulosa ,5-bisfosfato carboxilasa de Nicotiana tabacum; Mazur, et al., 1985); ZmAS CTP (CTP de gen de subunidad alfa 2 de antranilato sintasa de Zea mays; Gardiner et al., 2004); y RgAS CTP (CTP de antranilato sintasa de Ruta graveolens; Bohlmann, et al., 1995). Otros péptidos de tránsito que pueden ser útiles incluyen secuencia de señal cab-m7 de maíz (PCT WO 97/41228) y la secuencia de señal de glutatión reductasa de guisante (Pisum sativum) (PCT WO 97/41228). La terminación de la transcripción se puede lograr por una secuencia de ADN no traducida 3' operablemente enlazada a un transgén recombinante (v.gr., el gen de interés, la secuencia de identificación incluyendo un gen selectivamente determinable, o gen marcador de la planta seleccionable). La región no traducida 3' de una molécula de ADN recombinante contiene una señal de poliadenilación que funciona en plantas para causar la adición de nucleótidos de adenilato al extremo 3' del ARN. La región no traducida 3' se puede obtener de varios genes que se expresan en células vegetales. La región no traducida 3' de nopalina sintasa (Fraley et al., 1983), se usa comúnmente en esta capacidad. Las moléculas de poliadenilación de un gen RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al., 1984), AGRtu.nos (acceso a Genbank E01312), E6 (Acceso # U30508), glutelina de arroz (Okita et al., 1989), y TaHsp17 (gen de proteína de choque térmico de peso molecular bajo de trigo; Acceso # X 3431 ) en particular puede ser de beneficio para usarse con la invención. Para modalidades de la invención en las cuales el uso de un promotor constitutivo es deseable, se puede usar cualquier promotor de planta constitutivo bien conocido. Los promotores de planta constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que confiere expresión de alto nivel constitutiva en la mayoría de los tejidos de la planta (véase, v.gr., Odell et al. , 1985), incluyendo monocotiledóneas (véase, v.gr., Dekeyser et a/. , 1990); Terada et ai , 1990); el promotor de nopalina sintasa (An eí al., 1988), el promotor de octopina sintasa (Fromm et al. , 1989), el promotor q9S del virus del mosaico de la coliflor, promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia, promotor de actina 1 del arroz, promotor de manopina sintasa y un promotor de histona. Para otras modalidades de la invención, se pueden usar promotores de genes de plantas bien conocidos que son regulados en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas y/o de desarrollo, incluyendo promotores regulados por (1 ) calor (Callis et al., 1988), (2) luz (v.gr., promotor rbcS-3A de guisante, Kuhlemeier et al., 1989; promotor rbcS de maíz, Schaffner y Sheen, 1991 ; o promotor de unión a/b de clorofila, Simpson et al., 1985), (3) hormonas, tales como ácido abscísico (Marcotte et al. , 1989), (4) heridas (v.gr. , wunl, Siebertz et al., 1989); o (5) sustancias químicas tales como metil jasmonato, ácido salicílico, etc. También puede ser ventajoso utilizar (6) promotores específicos de órganos (v.gr., Roshal et al. , 1987; Schernthaner et al , 1988; Bustos et al., 1989). Existe una variedad de secuencias promotoras de plantas que se pueden usar para impulsar la expresión específica de tejido de polinucleótidos en plantas transgénicas. De hecho, en modalidades particulares es de la invención, el promotor usado es un promotor específico de semilla. El promotor para ß-conglicinina (Chen et al. , 1989) u otros promotores específicos de semilla tales como el promotor de napin, que son regulados durante la maduración de semillas de plantas (Kridl et al., 1991 ; Kohno-Murase et al., 1994), Hv.PeM de cebada (Stacey et al., 1996), faseolina (Bustos et al., 1989), inhibidor de tripsina de soya (Riggs et al., 1989), ACP (Baerson et al., 1993), estearoil-ACP desaturasa (Slocombe et al., 1994), subunidad a' de ß-conglicinina de soya (P-Gm7S, véase, por ejemplo, Chen et al., 1986), Vicia faba USP (P-Vf.Usp, véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 , 2 y 3, publicación de solicitud de E.U.A. 20030229918), el promotor de globulina (véase, por ejemplo, Belanger y Kriz, 1991 ), subunidad alfa de ß-conglicinina de soya (7S alfa; patente de E.U.A. 6,825,398, incorporada por referencia) y promotor de L3 oleosina de Zea mays (P-Zm.L3, véase, por ejemplo, Hong et al., 1997; véase también patente de E.U.A. No. 6,433,252, la descripción de las cuales se incorpora específicamente aquí por referencia). Las zeínas son un grupo de proteínas de almacenamiento encontradas en endospermo de Zea mays. Se han aislado clones genómicos para gtenes de zeína (Pedersen et al., 1982; patente de E.U.A. 6,326,527), y los promotores de estos clones, incluyendo los genes de 15 kDa, 16 kDa, 19 kDa, 22 kD, 27 kDa, y genes gamma, también se podrían usar. Otros promotores que se sabe que funcionan, por ejemplo, en Zea mays incluyen los promotores para los siguientes genes: ceroso (Russell y Fromm, 1997; Shure et al., 1983), frágil (Giroux et al., 1994), encogido 2, enzimas ramificadoras I y II, almidón sintasas, enzimas desramificadoras, oleosinas, glutelinas y sacarosa sintasas. Otro promotor para expresión de endospermo de Zea mays es el promotor para el gen de glutelina de arroz, muy particularlmente el promotor Osgt-1 (Zheng et al., 1993). Ejemplos de dichos promotores en arroz incluyen aquellos promotores para las subunidades ADPGPP, la almidón sintasa unida a gránulos y otra almidón sintasa, las enzimas ramificadoras, las enzimas desramificadoras, sacarosa sintasas (Yang et ai, 1990) y BetU (capa de transferencia de endospermo) y globulinal . Ejemplos de otros promotores que pueden ser útiles con la presente invención se describen en la patente de E.U.A. 6,437,217 (promotor RS81 de maíz), patente de E.U.A. 5,641 ,876 (promotor de actina de arroz; OsActl ), patente de E.U.A. 6,426,446 (promotor de RS324 de maíz), patente de E.U.A. 6,429,362 (promotor de PR-1 de maíz), patente de E.U.A. 6,232,526 (promotor de A3 de maíz), patente de E.U.A. 6, 177,6 (promotores de maíz constitutivos), patentes de E.U .A. 5,322,938, 5,352,605, 5,359, 142 y 5,530, 196 (promotor de 35S), patente de E.U.A. 6,433,252 (promotor de L3 oleosina de maíz), patente de E. U.A. 6,429,357 (promotor de actina 2 de arroz así como un intrón de actina 2 de arroz), patente de E.U.A. 5,837,848 (promotor específico de raíz), patente de E.U.A. 6,294,714 (promotores inducibles por la luz), patente de E.U.A. 6, 140,078 (promotores inducibles por sal), patente de E.U.A. 6,252, 138 (promotores inducibles por patógenos), patente de E.U.A. 6, 175,060 (promotores inducibles por deficiencia de fósforo), patente de E.U.A. 6,635,806 (promotor de gamma-coixina) y patente de E.U.A. 7, 151 ,204 (promotor de cloroplasto aldolasa de maíz). Promotores adicionales que pueden encontrar uso son un promotor de nopalina sintasa (NOS) (Ebert et al. , 1987), el promotor de octopina sintasa (OCS) (que es portado en plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), los promotores de virus de la coliflor tales como el promotor de 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Lawton et al. , 1987), el promotor de 35S de CaMV (Odell et al. , 1985), el promotor de 35S de virus del mosaico de la escrofularia (Walker et al. , 1987), el promotor de sacarosa sintasa (Yang et al. , 1990), el promotor de complejo de gen R (Chandler et al., 1989), y el promotor de gen de proteina de unión a/b de clorofila, etc. En la presente invención, los promotores de CaMV35S con secuencias incrementadoras (e35S; patentes de E.U.A. Nos. 5,322,938; 5,352,605; 5,359, 142; y 5,530, 196), FMV35S (patentes de E.U.A. 6,051 ,753; 5,378,619), caulimovirus de veteado clorótico del cacahuate (PCISV; patente de E.U.A. 5,850,019), At.Act 7 (Acceso # U27811 ), At.ANTI (publicación de solicitud de patente de E.U.A. 20060236420), FMV.35S-EF1 a (publicación de solicitud de patente de E.U.A. 20050022261 ), elF4A10 (Acceso # X79008) y AGRtu.nos (GenBank Acceso V00087; Depicker et al, 1982; Bevan et al., 1983), triosa fosfato isomerasa citosólica del arroz (OsTPI; patente de E.U.A. No. 7,132,528), y gen de actina 15 del arroz (OsAct15; publicación de solicitud de patente de E.U.A. 20060162010) pueden ser de beneficio particular. En algunos casos, v.gr., OsTPI y OsAct 15, un promotor puede incluir un 5'UTR y/o un primer intrón. Otros promotores útiles en la práctica de la invención que son conocidos por un experto en la técnica también son contemplados por la invención. Un vector de expresión de una planta también puede incluir un cásete de gen marcador selectivamente determinable o calificable que se puede usar en la presente invención para monitorear células segregadoras o progenie para (pérdida de) expresión. Los marcadores ilustrativos son conocidos e incluyen ß-glucuronidasa (GUS) que codifica una enzima para varios sustratos cromogénicos (Jefferson et al. , 1987a; Jefferson et al. , 1987b); un gen de R-locus, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta et al., 1988); un gen de ß-lactamasa (Sutcliffe et al., 1978); un gene que codifica una enzima para varios sustratos cromogénicos, son conocidos (v.gr., PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen de luciferasa (Ow et al. , 1986); un gen xy1E (Zukowsky et al. , 1983) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen de -amilasa (Ikatu et al., 1990); un gen de tirosinasa (Katz et al., 1983) que codifica una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa a melanina; proteina de fluorescencia verde (Elliot et al. , 1999) y una a-galactosidasa. Un gen marcador selectivamente determinable o calificable puede codificar el mismo producto de gen que una secuencia de identificación incluyendo un gen selectivamente determinable o calificable, o un producto de gen diferente. Sin embargo, la secuencia de identificación se expresa en óvulo, polen o tejidos de semilla, mientras que el gen marcador selectivamente determinable o calificable se expresa durante el procedimiento de identificación de células vegetales transformadas. La secuencia de identificación también se puede expresar constitutivamente, pero sólo transporta un fenotipo en óvulo, polen o tejidos de semilla. Las plantas transgénicas pueden ser regeneradas a partir de una célula vegetal transformada por métodos bien conocidos en el campo de cultivo de células vegetales. Una planta transgénica formada usando métodos de transformación de Agrobacterium típicamente contiene una sola secuencia de ADN recombinante simple insertada en un cromosoma y se refiere como un evento transgénico. Dichas plantas transgénicas se pueden referir como que son heterocigóticas para la secuencia exógena insertada. Una planta transgénica homocigótica con respecto a un transgén se puede obtener mediante reproducción sexual (autocruza) de una planta transgénica segregadora independiente que contiene una sola secuencia de gen exógeno consigo misma, por ejemplo una planta FO, para producir semilla F1. Una cuarta parte de la semilla F1 producida será homocigótica con respecto al transgén. La germinación de la semilla F1 produce plantas que pueden ser probadas para cigosidad, usando típicamente una prueba de SNP o una prueba de amplificación térmica que permite la distinción entre heterocigotos y homocigotos (es decir, una prueba de cigosidad). Un número de secuencias de identificación se pueden usar, por ejemplo, genes cuya expresión puede dar por resultado un fenotipo visible, incluyendo el uso de gus, gfp, y luc (véase, v.gr., Ow et al., 1986; WO 97/41228 y patente de E.U.A. 6,583,338; v.gr., M26194; M15077). Un gen de levansucrasa, sacS (Caimi et al., 1996; v.gr., X02730) que conduce a un fenotipo de semilla "encogido", o un gen de pirofosfatasa (Hajirezaei et al., 1999) que conduce a inhibición de germinación, también se puede utilizar. Genes que codifican fitoene sintasa (crtB) se conocen en la técnica, incluyendo aquellos de Erwinia uredovora (v.gr., Misawa et al., 1990; Sandmann y Misawa, 1992; patentes de E.U.A. 5,429,939; 6,429,356), y Pantoea/Enterobacter agglomerans (v.gr. GenBank M38423; M87280), entre otros. Se ha descrito la expresión específica de semilla de crtB que da por resultado coloración anaranjada (Shewmaker et al., 1999; patente de E.U.A. 6,429,356). La mayoría de los transgenes que producen fenotipos de semilla pleiotrópicos se pueden usar como un gen de etiqueta visible enlazado a un marcador seleccionable para identificar semillas con gene de interés positivas libres de marcador semillas. El fenotipo visible puede ser producido por sobreexpresión ectópica de un transgén o resulta de regulación descendente de genes de vía metabólica endógenos por ARN de antisentido, interferencia de ARN o tecnología de co-supresión. Las siguientes definiciones y métodos se proveen para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique otra cosa, los términos se han de entender de conformidad con el uso convencional por los expertos en la técnica. Las definiciones de términos comunes en biología molecular también se pueden encontrar en Rieger ef al. (1991 ); y Lewin (1994). Se usa nomenclatura para bases de ADN como se expone en 37 CFR § 1 .822. "CP4", "aro \:CP4", "AGRTU.aroA:CP4", "CP4 EPSPS" y "EPSPS CP4" se refieren al gen de EPSP sintasa o proteína purificada de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens (AGRTU) que cuando es expresada en plantas confiere tolerancia a glifosato y formulaciones de herbicida que contienen glifosato (patente de E.U.A. No. 5,633,435, incorporada aquí por referencia en su totalidad). La secuencia de gen puede ser nativa o modificada para expresión incrementada en plantas. Un "segmento" de ADN se refiere a una región de secuencia ADN de una construcción de ADN. Un segmento de ADN puede estar dentro, entre, o flanqueando las moléculas de ADN-T encontradas en una construcción usada para transformación de células vegetales mediada por Agrobacterium. Por ejemplo, un segmento de ADN puede contener elementos genéticos para la replicación de plásmidos en bacterias u otros varios elementos y casetes de expresión de la construcción de ADN diseñada para usarse en transformación de células vegetales. Por lo tanto, un "cásete de ADN" puede comprender un segmento de ADN, incluyendo elemento(s) para expresión de la secuencia de ADN en una célula. Una "proteína de fusión" se refiere a una fusión traduccional expresada como una unidad individual, pero que produce un producto de gen que confiere los fenotipos de la proteína codificada por las secuencias de gen de inicio no fusionadas. Un ácido nucleico "aislado" es sustancialmente separado o purificado de otras secuencias de ácido nucleico en la célula del organismo en la cual el ácido nucleico ocurre naturalmente, es decir, otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, por métodos de purificación de ácido nucleico convencionales. El término también abarca ácidos nucleicos recombinantes y ácidos nucleicos que químicamente sintetizados. El término "gen de resistencia a glifosato" se refiere a cualquier gen que, cuando se expresa como un transgén en una planta, confiere la capacidad para tolerar niveles del herbicida glifosato que de otra manera dañarían o matarían a la planta. Cualquier gen de tolerancia a glifosato conocido por un experto en la técnica es adecuado para usarse en la práctica de la presente invención. El glifosato (incluyendo cualquier forma herbicidamente activa de N-fosfonometilglicina y cualquier sal de la misma) inhibe la enzima 5-enolpiruvilshikimatao-3-fosfato sintasa (EPSPS). Una variedad de enzimas EPSPS nativas y variantes han sido expresadas en plantas transgénicas a fin de conferir tolerancia a glifosato, cualquiera de las cuales se puede usar en la invención. Ejemplos de algunas de estas EPSPSs incluyen aquellas descritas y/o aisladas de conformidad con la patente de E.U.A. No. 4,940,835, patente de E.U.A. No. 4,971 ,908, patente de E.U .A. No. 5,145,783, patente de E.U.A. No. 5,188,642, patente de E.U.A. No. 5,310,667, y patente de E.U.A. No. 6,803,501. También se pueden derivar de una clase estructuralmente distinta de genes de EPSPS no homólogos, tales como genes de EPSPS de clase II aislados de la cepa CP4 de Agrobacterium sp. (AGRTU.aroACP4). El término "secuencia de identificación" se refiere a un ácido nucleico que codifica un producto que confiere un fenotipo detectable tal como un cambio en el color de la semilla o gametos, opacidad o translucidez, fluorescencia, textura, tamaño, forma, capacidad de germinación o viabilidad u otro producto de metabolismo de las células o semillas. La secuencia de identificación puede incluir una secuencia de nucleótidos (v.gr., un fragmento de genes) que puede conferir un fenotipo mediante regulación descendente de la expresión de otro gen, tal como un proceso mediado por ¡ARN. En ciertas modalidades, la secuencia de identificación incluye un gen selectivamente determinable tal como un gen gusA, gfp, o crtB. En una modalidad particular, la secuencia de identificación incluye un gen crtB que codifica una fitoeno sintasa de Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans GenBank M38423, incorporada aquí por referencia; y patentes de E.U.A. Nos. 5,429,939, 6,429,356). La secuencia de identificación es físicamente enlazada a un gen marcador vegetal seleccionable, selectivamente determinable y/o calificable, tal como uno que codifica resistencia a antibióticos o tolerancia a herbicida. La secuencia de identificación puede conferir un fenotipo detectable (v.gr., selectivamente determinable o seleccionable) en la semilla. Una primera secuencia de ácido nucleico es "operablemente" conectada o "enlazada" con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico es colocada en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor es operablemente enlazado a una secuencia que codifica proteína si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificadora. Generalmente, secuencias de ADN operablemente enlazadas son contiguas y, en donde es necesario unir dos regiones codificadoras de proteína, están en el mismo marco de lectura. El término "planta" abarca cualquier planta superior y progenie de la misma, incluyendo monocotiledóneas (v.gr., lirio, maíz, arroz, trigo, cebada, etc.), dicotiledóneas (v.gr., soya, algodón, tomate, cañóla, papa, Arabidopsis, tabaco, ere), gimnospermas (pinos, abetos, cedros etc.) e incluye partes de plantas, incluyendo unidades reproductivas de una planta (v.gr., semillas, bulbos, tubérculos u otras partes o tejidos de la planta que se pueden reproducir), frutos, flores, etc. Un ácido nucleico "recombinante" se hace por cualquier combinación artificial de dos segmentos de secuencia de otra manera separados, v.gr. , por síntesis química o por manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos o técnicas de ingeniería genética. Los términos "construcción de ADN" o "vector de ADN" se refiere a cualquier plásmido, cósmido, virus, secuencia autónomamente replicadora, fago u otro ADN o ARN de una sola cadena o de doble cadena circular derivado de cualquier fuente que incluye una o más secuencias de ADN , tales como promotores, secuencias codificadoras de proteína, regiones no traducidas 3', etc., que han sido enlazadas de una manera funcionalmente operativas por técnicas de ADN recombinante. Los vectores de ADN recombinante para transformación de plantas son comúnmente plásmidos circulares de doble cadena capaces de replicarse en una célula bacteriana. Las composiciones y métodos convencionales para hacer y usar construcciones de ácido nucleico recombinante son bien conocidas, v.ar. , Sambrook et al., 1989; y Ausubel ef al. , 1992 (con actualizaciones periódicas), y Clark et al. ( 1997), entre otros. El término "promotor" o "región promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico, usualmente encontrada hacia el extremo 5' (5') a una secuencia codificadora que controla la expresión de la secuencia codificadora al controlar la producción de ARN mensajero (ARNm) al proveer el sitio de reconocimiento para ARN polimerasa y/u otros factores necesarios para el inicio de transcripción en el sitio correcto. Como se contempla aquí, un promotor o región promotora incluye variaciones de promotores derivados por medio de ligación a varias secuencias reguladoras, mutagénesis aleatoria o controlada, y adición o duplicación de secuencias incrementadoras. Una región promotora es responsable de impulsar la transcripción de secuencias codificadoras bajo su control cuando se introduce en un hospedero como parte de un vector recombinante adecuado, como se demuestra por su capacidad para producir ARNm. "Regeneración" se refiere a un proceso de hacer crecer una planta a partir de una célula vegetal (v.gr., protoplasto o explante vegetal). "Marcador seleccionable" se refiere a una secuencia de ácido nucleico cuya expresión confiere un fenotipo que identifica la identificación de células que contienen la secuencia de ácido nucleico. Los marcadores seleccionables incluyen aquellos que confieren resistencia a compuestos químicos tóxicos (v.gr., resistencia a antibióticos), o imparten una característica visualmente distinguible (v.gr., cambios de color o fluorescencia). Los genes marcadores seleccionables de plantas dominantes útiles incluyen genes que codifican genes de resistencia a antibióticos (v.gr., resistencia a higromicina, imidazolinona, canamicina, bleomicina, G418, estreptomicina o espectinomicina); y genes de resistencia a herbicidas (v.gr., fosfinotricina acetiltransferasa, ALS modificada, BAR, EPSPSs de clase I modificada, EPSPSs de clase II, DMOs), entre otras.

Incluidos dentro de los términos "genes marcadores calificables" o "genes marcadores selectivamente determinables" están los genes que codifican un marcador secretable cuya secreción puede ser detectada como un medio de identificación o selección de células transformadas. Ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno secretable que puede ser identificado por interacción de anticuerpo o incluso enzimas secretables que pueden ser detectadas catalíticamente. Las proteínas secretables caen en un número de clases, incluyendo proteínas difundibles pequeñas que son detectables (v.gr., por ELISA), enzimas activas pequeñas que son detectables en solución extracelular (v.gr., a-amilasa, ß-lactamasa, fosfinotricina acetiltransferasa), o proteínas que son insertadas o atrapadas en la pared celular (tales como proteínas que incluyen una secuencia líder tal como aquella encontrada en la unidad de expresión de extensión o tabaco PR-S). Otros genes marcadores seleccionabas y/o selectivamente determinables serán evidentes para los expertos en la técnica. "ADN-T" se refiere a una molécula de ADN que se integra en un genoma de la planta mediante Agrobacterium u otro método de transformación mediado por Rhizobia. Por lo menos un extremo de la molécula de ADN-T es flanqueada por lo menos por una región de borde del ADN-T de un plásmido Ti o Ri de Agrobacterium. Estas regiones de borde generalmente se refieren como las regiones de borde derecho (RB) y borde izquierdo (LB) y existen como variaciones en la secuencia y longitud de nucleótidos dependiendo de su fuente (v.gr., cepas de Agrobacterium que producen nopalina u octopina). Las regiones de borde comúnmente usadas en construcciones de ADN diseñadas para transferir transgenes en plantas a menudo son varios cientos de polinucleótidos de longitud e incluyen un sitio de ruptura en donde la eridonucleasa de virD2 derivada de plásmido auxiliar Ti o R¡ digiere el ADN y covalentemente se une al extremo 5' después de la formación de la cadena T para guiar la integración de la cadena T en el genoma de una planta. Las moléculas de ADN-T generalmente contienen uno o más casetes de expresión de la planta. El término "transgén" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico no nativa a una célula u organismo transformado en dicha célula u organismo. "Transgén" también se refiere a cualquier secuencia endógeno que es ectópicamente expresada al modificar la secuencias codificadoras o secuencias reguladoras. "Transgén" también abarca las partes de componente de un gen de planta nativa modificado por inserción de una secuencia de ácido nucleico no nativa o nativa por recombinación directa.

EJEMPLOS Los expertos en la técnica apreciarán las muchas ventajas de los métodos y composiciones provistos por la presente invención. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descritas por los inventores para funcionar bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción, deberán apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y sin embargo obtener un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan aquí por referencia al grado de que pueden complementar, explicar, proveer un antecedente para, o enseñar metodologías, técnicas o composiciones utilizadas aquí.

EJEMPLO 1 Preparación de vectores ADN-2T con una secuencia de identificación y gen marcador, y un gen de interés Los vectores de expresión de planta de ADN-T, pMON67465, pMON101338 y pMON101339 (figura 1 ), se construyeron de conformidad con el procedimiento de clonación molecular estándar (Sambrook et al., 1989). Un ADN-T incluye un promotor CaMV 35S operablemente enlazado a un gen npfll que codifica resistencia a canamicina y un promotor CaMV 35S operablemente enlazado a un gen reportero GUS. El otro ADN-T comprende un cásete de nap¡n:ctp-c/ 6: napin 3' y un cásete de 35S:ctp:CP4 EPSPS, que confiere resistencia a glifosato. El crtB en pMON67465 con origen de replicación de oriV fue impulsado por un promotor de napin específico de semilla de 1 .8 kb y un terminador de napin de 1 kb de Brassica napus. El crtB en pMON101338 con un replicón de oriV y en pMON101339 con origen de replicación de pRi fue impulsado por una versión más corta de promotor de napin (1 kb) y terminador (0.3 kb). El gen crtB, que codifica una fitoeno sintasa de Erwinia sp. confiere color anaranjado a la semilla de soya sin afectar la frecuencia de transformación (figura 3).

EJEMPLO 2 Transformación y regeneración de explantes de soya con pMON67465 Tejidos de soya (cv. A3244) fueron transformados con pMON67465 (figura 1 a-figura 1 c) por un método mediado por Agrobacterium, esencialmente como se describió antes (patente de E.U.A. 6,384,301 , incorporada aquí por referencia). En breve, explantes de meristema de soya cortados manualmente se co-cultivaron con Agrobacterium durante 2-4 días a 23°C, se transfirieron a un medio sólido de WPM con una selección de glifosato de 75 µ? en un PLANTCON y se cultivaron a 28°C bajo un periodo de luz/oscuridad de 16/8. Después de dos semanas, los explantes fueron transferidos a un medio WPM fresco y se cultivaron hasta cosechar vástagos. Después de 2 meses, los vástagos con trifolios verdaderos se cortaron y se cultivaron en un medio de raíz BRM durante 2-4 semanas. Las plántulas enraizadas se hicieron crecer en invernadero para maduración de semilla. Entre 40 eventos analizados, 72.5% desplegaron co-transformación con ambos ADNs-T. 45% de los 40 eventos contenían ambos genes nptll y gus. El evento A33908, que contenía ADNs-T de pMON67465, se analizó posteriormente. Eventos adicionales con plásmido pMON67465 se obtuvieron por retransformación del plásmido en el mismo cultivar A3244 y 13 líneas transgénicas se obtuvieron con frecuencia de transformación de 0.22%. Siete de 13 líneas son gen de interés positivo y libre de marcador después de analizar semillas con apariencia normal mediante PCR para presencia o ausencia de un gen gus o gen marcador CP4 (cuadro A). Las semillas anaranjadas de plantas R0 también se analizaron por PCR para la presencia del gen crtB y el gen marcador CP4. Se encontró que todas las semillas anaranjadas excepto tres eran positivas tanto para crtB como para CP4 (cuadro B), mientras que ninguna de las semillas de apariencia normal (cuadro B, células blancas) contenían genes CP4 o crtB, lo que indicó que el fenotipo crtB está estrechamente ligado al gen marcador seleccionable CP4.

CUADRO A Relación 1 : GUS positivo de semillas encogidas Muy débil Relación 2: GUS positivo de semillas normales Relación 3: GUS positivo de un total de 16 semillas picadas Enlazadas Plantas negativas Ya sea totalmente enlazadas o líneas negativas Líneas segregantes, podrían ser de una sola copia o múltiples copias para GUS Tres líneas (46614, 46868 y 47267) de semillas normales con tinción con GUS son muy débiles gen de interés positivo, libre de marcador CUADRO B ¿¿¿¿¿¿¿j Todas las semillas de color anaranjado son gus y CP4 PCR positivas, tinción con gus positiva Semillas normales, tinción con gus positiva La posible truncacion de crtB conduce a crtB PCR negativa Por lo tanto, el uso de una construcción ADN-2T con una secuencia de identificación que incluye un gen selectivamente determinable enlazado a un gen marcador seleccionare permite la determinación selectiva y selección más eficientes de un evento transgénico que contiene un gen de interés mientras que carece de secuencias que codifican un gen seleccionable. Una comparación ilustrativa entre un enfoque basado en enlace-Southern ("Estándar 2T") y una determinación selectiva basada en marcador (es decir, basado en secuencia de identificación) para identificar semilla de progenie en la cual un gen de interés y un marcador seleccionable se han segregado independientemente se encuentra en el cuadro C. El uso del enfoque de identificación permite para determinación selectiva más eventos transgénicos y más progenie de cada evento a fin de identificar la progenie útil para análisis posterior.

CUADRO C 2T estándar 2T con marcador enlazado a etiqueta de crtB 100 eventos 100 eventos 69 (después de determinación selectiva de GOl) 69 (después de determinación selectiva de GOl) 45 (después de copia baja) 45 (después de copia baja) 4 (después de enlace Southern) 45 (sin enlace Southern) 14 (sin determinación de línea germinal) 38 (después de determinación de línea germinal a partir de crtB) 14 eventos para R1 38 eventos para R1 1050 progenie plantada (75/evento) 722 progenie plantada (19 semilla amarilla/evento) 1050 para aspersión de glifosato Sin aspersión de glifosato 263 para prueba de cigosídad 722 para prueba de cigosidad EJEMPLO 3 Expresión de CrtB/GUS/CP4 en evento A33908 de soya y semilla de progenie R1 La inspección visual de tejidos del evento A33908 (figura 2A-figura 2D) indicó que los tallos y hojas no dobladas jóvenes desplega ron un aspecto anaranjado. El tejido foliar y radical fueron fenotípicamente de otra manera normales en plantas que expresaban CrtB. Los revestimientos de semilla de la semilla de la planta RO (es decir, la generación R1 ) desplegaron expresión de CrtB ligera, mientras que los cotiledones de semilla derivada de A33908 desplegaron un color anaranjado distinto y algunos con un fenotipo rugoso (figura. 3). Doce semilla R1 inmaduras del evento A33908 se disecaron del revestimiento de semilla y se sometieron a CP4-EPSPS ELISA, y análisis de CrtB y visual de GUS (figura 4). La segregación de los fenotipos de CrtB, GUS, y CP4-EPSPS fue evidente. 9/12 semillas fueron positivas en las tres pruebas. 1/12 semilla fue CrtB y CP4-EPSPS positivo, pero GUS negativo, mostrando segregación de los dos ADNs-T de pMON67465, con pérdida del gen gus. 2/12 semillas fueron CP4-EPSPS ELISA negativas. Ambas de estas semillas fueron CrtB negativas y GUS positivas, demostrando así el enlace entre la de secuencia de identificación (crtB) y el gen CP4-EPSPS marcador seleccionable, y la segregación de estos loci transgénicos del locus gus. La relación fenotípica en la segregación de semilla fue consistente con la segregación Mendeliana de dos loci dominantes.

EJEMPLO 4 Análisis visual de semilla R1 Semillas maduras de A33908 se analizaron visualmente para color, tamaño y forma (figura 5). Se vio una mezcla de semillas de (i) normales libres de marcador (v.gr., amarillas y lisas); (i¡) anaranjadas y lisas; y (iii) anaranjadas y encogidas.

EJEMPLO 5 Análisis de PCR sobre semilla GUS positivas Se usó INVADER PCR (v.gr., Mein et al., 2000) para seguir la segregación de los genes CP4-EPSPS, crtB, y gus suministrados por pMON67465 en semillas de plantas de soya transgénicas. Se determinó que el evento A33908 contenía una sola copia del gen marcador CP4-EPSPS y una sola copia del gen NPTII. La segregación de semillas anaranjadas:normales siguió una relación esperada de 3: 1 en el evento A33908 (cuadro 1 ).

CUADRO 1 Fenotipo y genotipo de progenie de plantas transgénicas EJEMPLO 6 Uso de ATP PFK como una secuencia de identificación Para granos de cereal ricos en almidón incluyendo maíz, se puede utilizar la manipulación del metabolismo de azúcar/almidón que da por resultado un fenotipo de desarrollo de semillas encogidas o nulo. La expresión específica de semillas de sacB (Caimi et al. 1996), o la expresión específica de semillas de fosfofructocinasa dependiente de ATP de levadura (ATP PFK; v.gr., acceso de GenBank NCJD03423, bases 2297466..2300294) en mazorcas de maíz da por resultado desarrollo de grano nulo (figura 9). La construcción pMON99575 que contenía el marcador seleccionable CP4 y ATP-PFK se puede usar directamente para co-transformación con una construcción de ADN-T que contiene un gen de interés al mezclar células de dos cepas de Agrobacterium cada una incluyendo una de estas construcciones y transformando una célula vegetal con el cultivo bacteriano mixto. Alternativamente, el cásete de A TP-PFK de expresión específica de semilla puede ser subclonado en una construcción de ADN-2T como una secuencia de identificación, para la identificación eficiente de semillas libres de marcador. Los granos que contienen este gen son extremadamente encogidos y no germinan. Sólo los granos libres de secuencia de identificación y libres de gen marcador muestran apariencia normal.

EJEMPLO 7 Uso de genes implicados en síntesis de porfirina como secuencias de identificación Uroporfirinogeno III (uro'gen) metil transferasas (SUMT) dependientes de S-adenosil-L-metionina producen compuestos de porfirinoide fluorescentes rojo brillante cuando se sobreexpresan en E. coli, levadura y células de CHO. Esta propiedad tiene selección visual habilitada de colonias de E. coli transformadas (Rossner y Scott, 1995) y distribución automatizada de levadura y células de CHO transformadas (Wildt y Deuschle, 1999). Esta fluorescencia es el resultado de acumulación ¡ntracelular de uro'gen di- y tri-metilado (dihidrosirohidroclorina y trimetilpirorocorfina), ambos de los cuales son compuestos encontrados en las vías de síntesis de porfirina (es decir, clorofila y cobalamina). Las células transformadas con cobA que codifica SUMT de Propionibacterium freudenreichii (acceso a GenBank U 13043; incorporada aquí por referencia) da una señal fluorescente con picos de absorbancia a 384 nm y 500 nm junto con una banda de emisión a 605 nm. Los porfirinoides fluorescentes generados por la cobA uro'gen metil transferasa tienen buena firma espectral para hacer material vegetal. La excitación ya sea a 384 ó 500 nm evita la absorbancia de clorofila fuerte y la emisión roja resultante que es fácilmente detectada ya que tiene un desplazamiento de Stokes sustancial (a partir del origen de absorbancia de 500 nm), pero no se traslapa con la autofluorescencia de la clorofila en el rojo lejano (Haseloff, 999). El carboxi terminal de la proteína SUMT de maíz (GenBank D83391), Upm1 de Arabidopsis (GenBank L47479), y CysG de E. coli (GenBank X14202) son significativamente similares a proteínas codificadas por genes de P. freudenreichii (cobA), Pseudomonas denitrificans (cobA; GenBank M59236), y de Synechocystis sp. (anteriormente Anacystis nidulans, GenBank X70966), cada una incorporada aquí por referencia (Sakakibara et al. 1996), y se pueden usar de manera similar. Una construcción que incluye un promotor con expresión de grano y un gen que codifica CobA, o una proteína similar con actividad de SUMT, permite el uso de dicho gen como una secuencia de identificación al determinar selectivamente (falta de) fluorescencia de rojo visible en semilla de maíz, por ejemplo. Se ha reportado que las siroheme sintasas vegetales se localizan en el cloroplasto (Leustek ef al., 1997). Por lo tanto, el uso de un gen de biosíntesis de porfirina como una secuencia de identificación puede incluir el uso de un péptido de tránsito de cloroplasto para dirigir el producto de gen al cloroplasto. La construcción se puede usar directamente como una secuencia de identificación, y un ADN-T que comprende dicha secuencia de identificación y un marcador seleccionable, por ejemplo, puede ser co-transformada con una segunda construcción que comprende un ADN-T que contiene un gen de interés mezclando dos cepas de Agrobacteríum cada una conteniendo una de estas construcciones, y transformando una célula vegetal con el cultivo bacteriano mixto. Un cásete de expresión de SUMT también puede ser fácilmente subclonado en otros vectores ADN-2T, o en un vector diseñado para usarse en transformación mediada por microproyectiles y usarse como una secuencia de identificación por un experto en la técnica.

EJEMPLO 8 Uso de silenciamiento de genes para producir un fenotipo de semilla detectable Una repetición invertida ubicada dentro de un intrón del cásete de gen marcador puede conducir a un silenciamiento de gen eficiente en células vegetales. Este se describe con detalle en la publicación de solicitud de E.U.A. No. 2006/0200878 (v.gr., figuras 7, 8, 9, incorporadas aquí por referencia). Para probar si un ARNdc codificado por repeticiones invertidas clonadas dentro de un intrón fue capaz de inducir silenciamiento de gen, repeticiones invertidas de un segmento de ~400 pb del gen de luciferasa (SEQ ID NO:1 ) se colocaron en el intrón en el promotor Actinl de arroz en un cásete de gen EPSPS-CP4 (pMON73874) y la capacidad de la construcción para suprimir el gen de luciferasa en una transformación transitoria de protoplastos de hojas de maíz se probaron. Como un control, se probó un plásmido similar, excepto que el plásmido de control tuvo repeticiones invertidas de un segmento del gen GUS en lugar del gen de luciferasa (pMON73875). Finalmente, como un control adicional, pMON25492, que fue idéntico excepto que no tuvo repeticiones invertidas, también se utilizó (figura 13). Cuando estos tres plásmidos se probaron en una prueba del sistema de silenciamiento del gen transitorio de protoplasto de hoja de maiz para la supresión de luciferasa de luciérnaga y normalización a la expresión de un control interno de luciferasa de RENILLA (Promega Corp., Madison, Wl) se observó que el plásmido con ARNdc que codifica repeticiones invertidas dentro del intrón (pMON73874) fue capaz de suprimir la luciferasa en relación con los controles pMON73875 y pMON25492 (figura 1 1 ). El experimento se repitió una segunda vez con resultados similares. Para probar si un fenotipo de grano de maíz se puede generar mediante un enfoque de silenciamiento de gen, construcciones diseñadas para suprimir el gen ceroso se hicieron. pMON81990 contiene repeticiones invertidas de parte del gen ceroso. Plantas de maíz transgénícas que contenían pMON8 990 desplegaron silenciamiento el gen ceroso en por lo menos 65% de las plantas RO independientes, como se determina por tinción de polen y granos con yodo para producción de almidón. En comparación, las plantas que contienen pMON81993, que expresa un fragmento de sentido de ceroso, no despliega silenciamiento eficiente del gen ceroso. También se demostró el silenciamiento de genes que codifican zeínas (proteínas de almacenamiento de semilla), que conduce a un fenotipo visible. pMON73567 contiene repeticiones invertidas de secuencia de genes que codifican a-zeínas en granos de maíz. La transcripción de las repeticiones invertidas da por resultado el silenciamiento de estos genes, reduciendo los niveles de las a-zeínas de 19kD y 22kD en 26 de 29 plantas RO probadas. La figura 12 demuestra que los granos que resultan de células transformadas con la secuencia codificadora de ARNdc tienen un fenotipo visual obvio, en donde los granos con zeínas reducidas con menos conocidos que los granos de tipo silvestre. Por lo tanto, una secuencia codificadora de ARNdc incrustada en el intrón de un gen marcador se puede usar como una secuencia de identificación de conformidad con la presente invención. Las construcciones que contienen, por ejemplo, un gen de resistencia a glifosato tal como CP4 EPSPS como un marcador seleccionable y dicha secuencia codificadora de ARNdc en un intrón del gen marcador seleccionable se puede usar directamente para co-transformación con una construcción de ADN-T que contiene un gen de interés al mezclar células de dos cepas de Agrobacterium cada una comprendiendo una de estas construcciones y transformando una célula vegetal con el cultivo bacteriano mixto. Alternativamente, el cásete codificador de ARNdc se puede subclonar en una construcción de ADN-2T como una secuencia de identificación, para identificación eficiente de semillas libres de marcador. Un experto en la técnica también podría diseñar construcciones análogas para usarse en la transformación de células vegetales mediadas por bombardeo de microproyectiles.

EJEMPLO 9 Uso de KAS4 como una secuencia de identificación El vector binario pMON83530 (figura 13) contiene una KAS4 (a-ceto-acetil-ACT sintasa; acceso a GenBank AF0605 8) impulsada por un promotor USP88 de soya (v.gr., patente de E.U.A. 7,078,588) con un cásete expresable de planta CP4 como un marcador seleccionable en el mismo ADN-T. La expresión específica de semilla del gen KAS4 da por resultado semillas encogidas que son fácilmente distinguibles de las semillas normales que no contienen el gen (figura 14). La construcción se puede usar directamente como una secuencia de identificación, y un ADN-T que comprende dicha secuencia de identificación y un marcador seleccionable puede ser co-transformado con una segunda construcción que comprende un ADN-T que contiene un gen de interés al mezclar dos cepas de Agrobacteríum cada una conteniendo una de esas construcciones y transformando una célula vegetal con el cultivo bacteriano mixto.

El cásete de expresión de KAS4 también está presente en un plásmido de ADN-2T como se muestra en pMON107314 (figura 15) en donde un ADN-T comprende un gen spIA (sacarosa fosforilasa de Agrobacterium tumefaciens; acceso a GenBank AE009432) como una secuencia de identificación y un gen marcador y el otro ADN-T puede comprender un gen de interés como construido por métodos de clonación de rutina conocidos por los expertos en la técnica. El plásmido ADN-2T entonces se puede usar, por ejemplo, para transformación de soya. El gen de identificación se usa para la selección de semillas sin gen marcador basada en el fenotipo provisto por el gen de identificación.

EJEMPLO 10 Uso de un gen spIA como una secuencia de identificación El vector binario pMON68581 (figura 16) contiene el spIA (Sacarosa fosforilasa de Agrobacterium tumefaciens; acceso a GenBank AE009432) impulsado por un promotor 7S alfa de soya (v.gr., GenBank M13759; Doyle et al., 1986) con un cásete expresable de planta CP4 como un marcador seleccionable en el mismo ADN-T. La expresión específica de semilla del gen spIA da por resultado semillas encogidas que son fácilmente distinguibles de las semillas normales que no contienen el gen (figura 17). La construcción puede ser usada directamente como una secuencia de identificación, y un ADN-T que comprende dicha secuencia de identificación y un marcador selecciónatele puede ser co-transformado con una segunda construcción que comprende un ADN-T que contiene un gen de interés al mezclar dos cepas de Agrobacterium cada una conteniendo una de esas construcciones y transformando una célula vegetal con el cultivo bacteriano mixto. El cásete de expresión de spIA también puede ser fácilmente subclonado en vectores ADN-2T en donde un ADN-T comprende el gen spIA como una secuencia de identificación y un gen marcador y el otro ADN-T comprende un gen de interés por métodos de clonación de rutina conocidos por los expertos en la técnica. El plásmido ADN-2T entonces se puede usar, por ejemplo, para transformación de soya. La secuencia de identificación se usa para seleccionar semillas sin un gen marcador seleccionable o selectivamente determinable basado en el fenotipo provisto por la secuencia de identificación.

EJEMPL0 11 Uso de varias secuencias de identificación en la producción de semilla de maíz libre de marcador Se construyeron múltiples vectores de expresión ADN-2T de plantas. En cada construcción, el primer segmento de ADN-T comprendía un transgén uidA expresable en planta como un ejemplo de un ácido nucleico de interés y el segundo segmento de ADN-T comprendía un transgén CP4 EPSPS expresable de planta como un marcador seleccionable y una secuencia de identificación como se muestra en el cuadro siguiente. Las secuencias de crtB diseñadas para expresión en monocotiledóneas se prepararon por métodos conocidos en la técnica (v.gr., por optimización en cuanto a codones como se encuentra en SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3). pMON68412 comprende SEQ ID NO:3. El primer ADN-T es flanqueado por bordes derecho e izquierdo mientras que el segundo ADN-T está localizado en la estructura e base del vector, un formato de ADN-2T comúnmente conocido como formato en tándem (Huang et al., 2005). Los tejidos de maíz se transformaron por separado con cada una de las construcciones por métodos conocidos en la técnica. El fenotipo esperado con cada gen de identificación se indica en el cuadro 2 siguiente. Promotores alternativos para expresión de las secuencias de identificación en endospermo incluyen promotor de glutelinal de arroz, el promotor ceroso de maíz y el promotor frágil2 de maíz.

CUADRO 2 Fenotipos ilustrativos esperados con secuencias de identificación dadas Cásete de secuencia de identil icación Promotor Secuencia de Terminador Construcción Fenotipo de identificación semillas que portan el gen de identificación y el gen marcador seleccionable Zeína de 27 crtB Glutelinal de pMON68412 Pigmento de kD de maíz arroz carotenoide en endospermo; desarrollo de grano defectuoso Todas las composiciones y métodos descritos y reclamados aquí se pueden hacer y ejecutar sin experimentación extraordinaria a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de las modalidades anteriores y ejemplos ilustrativos, será evidente para los expertos en la técnica que variaciones, cambios, modificaciones y alteraciones se pueden aplicar a la composición, métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos aquí, sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes que están tanto químicamente como fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los agentes descritos aquí mientras se logran los mismos resultados o resultados similares. Todos los sustitutos similares y modificaciones evidentes para los expertos en la técnica se considera que están dentro del espíritu, alcance y objeto de la invención como lo definen las reivindicaciones anexas.

Referencias Las siguientes referencias, al grado que pueden proveer detalles de procedimiento ilustrativos u otros detalles complementarios a los expuestos aquí, se incorporan específicamente aquí por referencia. Patente de E.U.A. 4,940,835; patente de E.U.A. 4,940,838; patente de E.U.A. 4,946,046; patente de E.U.A. 4,971 ,908; patente de E.U.A. 5,015,580; patente de E.U.A. 5,145,783; patente de E.U.A. 5, 188,642; patente de E.U.A. 5,302,523; patente de E.U.A. 5,310,667; patente de E.U.A. 5,362,865; patente de E.U.A. 5,384,253; patente de E.U.A. 5,429,939; patente de E.U.A. 5,464,763; patente de E.U.A. 5,464,765; patente de E.U.A. 5,508, 184; patente de E.U.A. 5,538,880; patente de E.U.A. 5,545,816; patente de E.U.A. 5,550,318; patente de E.U.A. 5,563,055; patente de E.U.A. 5,591 ,616; patente de E.U.A. 5,633,435; patente de E.U.A. 5,693,512; patente de E.U.A. 5,731 ,179; patente de E.U.A. 5,824,877; patente de E.U.A. 5,859,347; patente de E.U.A. 5,981 ,840; patente de E.U.A. 6, 160,208; patente de E.U.A. 6,307,123; patente de E.U.A. 6,326,527; patente de E.U.A. 6,384,301 ; patente de E.U.A. 6,399,861 ; patente de E.U.A. 6,403,865; patente de E.U.A. 6,429,356; patente de E.U.A. 6,433,252; patente de E.U.A. 6,458,594; patente de E.U.A. 6,583,338; patente de E.U.A. 6,803,501 ; patente de E.U.A. 6,825,398; patente de E.U.A. 7,078,588; patente de E.U.A. 7, 1 19, 187; patente de E.U.A. 7, 151 ,204. Publicación de E.U.A. 200301 10532; publicación de E.U.A. 20030229918; publicación de E.U.A. 20040237142; publicación de E.U.A. 20060041956; publicación de E.U.A. 20060064772; publicación de E.U.A. 20060200878 Solicitud del PCT WO 00/018939 Solicitud del PCT WO 97/41228 An et al., Plant Physiol., 88:547, 1988. An etal., The Plant Cell, 1: 5, 1989. Anderson etal., Gene 97:199-205, 1991. Ausubel et al., En: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, New York, 1992. Baerson etal., Plant Mol. Biol., 22(2):255-267, 1993. Belanger y Kriz, Genet., 129:863-872, 1991. Bohlmann etal., Plant J., 7 (3): 491-501, 1995. Breitleref a/., Transgenic Res,.13:271-287, 2004. Broothaerts etal., Nature 433:629-633, 2005. Bustos etal., Plant Cell, 1:839-853, 1989. Caimi etal., Pl. Physiol.110:355-363, 1996 Callis etal., Plant Physiol., 88:965, 1988. Carmi ef al. Planta, 217:726-735, 2003. Chen etal., Dev. Genet., 10:112-122, 1989. Chen etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8560-8564, 1986. Clark ef al., En: Plant Molecular Biology, A Laboratory Manual, Springer, NY, 1997. Clark etal., Plant Mol. Biol., 16 (6): 1099-1101, 1991.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 - Un método para preparar semillas libres de marcador de una planta transgénica que comprende los pasos de: a) obtener semillas de una planta transgénica que comprende un primer segmento de ADN que comprende un ácido nucleico de interés y un segundo segmento de ADN que comprende un gen marcador físicamente enlazado a un cásete de ADN que es operablemente enlazado a un promotor funcional en la semilla, en donde el cásete de ADN confiere un fenotipo detectable; b) determinar selectivamente las semillas para ausencia del fenotipo detectable; y c) seleccionar por lo menos una primera semilla que carece del fenotipo detectable para obtener una semilla que es libre del gen marcador. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el paso c) además comprende probar la semilla para la presencia del ácido nucleico de interés y seleccionar una semilla que comprende el ácido nucleico de interés. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el gen marcador es un gen marcador seleccionable. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el gen marcador es un gen marcador selectivamente determinable. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el cásete de ADN codifica un ARN que es traduccionalmente o transcripcionalmente fusionado al gen marcador selecciónatele. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el cásete de ADN comprende ADN que codifica un ARN de antisentido o sentido que silencia un gen endógeno para dar por resultado el fenotipo detectable. 7 - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el cásete de ADN comprende un par de repeticiones invertidas de un fragmento de ADN homólogo al gen endógeno. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la repetición de fragmento de ADN invertido es incrustada en un intrón dentro del gen marcador. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer segmento de ADN y segundo segmento de ADN se traslapan. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la semilla seleccionada en el paso c) carece del gen marcador y cásete de ADN. 1 . - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la planta transgénica o un progenitor del mismo de cualquier generación anterior fue co-transformada con el primer y segundo segmentos de ADN en construcciones de ADN separadas. 1

2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer y segundo segmentos de ADN son unidos por diferentes secuencias de borde de ADN-T. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el paso a) comprende transformar la planta transgénica o un progenitor del mismo de cualquier generación anterior con una construcción de ADN individual que comprende el primer y segundo segmentos de ADN. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la planta transgénica se produjo transformando la planta o un progenitor del mismo de cualquier generación anterior con una construcción de ADN que comprende (i) el primer segmento de ADN flanqueado por borde de ADN izquierdo y derecho que comprende un ácido nucleico de interés, y (ii) el segundo segmento de ADN flanqueado por un segundo conjunto de bordes de ADN izquierdo y derecho, en donde el segundo segmento de ADN además comprende un gen marcador operablemente enlazado a un promotor funcional en la planta transgénica. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer y segundo segmentos de ADN no son genéticamente enlazados en dicha planta transgénica. 16 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer y segundo segmentos de ADN son genéticamente enlazados en dicha planta transgénica. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la planta transgénica se produjo introduciendo el primer y segundo segmentos de ADN en dicha planta o un progenitor del mismo de cualquier generación anterior por transformación mediada por una cepa bacteriana seleccionada del género Agrobacterium, Rhizobium, Mesorhizobium o Sinorhizobium. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la planta transgénica se produjo introduciendo el primer y segundo segmentos de ADN en dicha planta o un progenitor del mismo de cualquier generación anterior por bombardeo de microproyectiles. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el gen marcador seleccionable codifica un producto seleccionado del grupo que consiste de CP4 EPSPS, fosfinotricina acetiltransferasa, DMO, Nptll, glifosato acetil transferasa, acetolactato sintasa muíante, DHFR resistente a metotrexato, dalapon deshalogenasa, PMI, Protox, higromicina fosfotransferasa y antranilato sintasa resistente a 5-metil triptofano. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la secuencia de cásete de ADN se selecciona del grupo que consiste de crtB, gus, gfp, sacB, lux, un gen de síntesis de antocianina, DefH9-iaaM, rolB, OsCDPK2, AP2, AFR2, ANT factor de transcripción, LEC2, Snf-1, cobA, KAS4, spIA, repeticiones invertidas de zeína, B-peru, y ATP-PFK de levadura. 21 . - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el cásete de ADN es operablemente enlazado a un promotor funcional en un tejido seleccionado de un embrión, endospermo de semilla, cotiledón, aleurona y revestimiento de semilla. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el cásete de ADN comprende una secuencia de ácido nucleico operablemente enlazado a un promotor seleccionado del grupo que consiste de un promotor de napin, un promotor de beta-faseolina, un promotor de subunidad de beta-conglicinina, un promotor de zeína, un promotor de Osgt-1 , un promotor de oleosina, un promotor de almidón sintasa, un promotor de globulina 1 , un promotor de LTP2 de cebada, un promotor de alfa-amilasa, un promotor de quitinasa, un promotor de beta-glucanasa, un promotor de cisteína, un promotor de glutaredoxin, un promotor de HVA1 , un promotor de serina carboxipeptidasa II, un promotor de catalasa, un promotor de alfa-glucosidasa, un promotor de beta-amilasa, un promotor de VP1 , USP, USP88, USP99, Lectina, y un promotor de bronze2. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el fenotipo detectable se selecciona del grupo que consiste de color de la semilla, opacidad de la semilla, capacidad de germinación de la semilla, tamaño de la semilla, viabilidad de la semilla, forma de la semilla y textura de la semilla. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el fenotipo detectable se prueba por detección de una actividad catalítica. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el fenotipo detectable es un fenotipo de ablación de tejido. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el fenotipo detectable da por resultado una semilla defectuosa o abortada. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el paso c) se lleva a cabo por una máquina de clasificación de semillas automatizada. 28. - Una construcción de ADN que comprende (a) un primer segmento de ADN que comprende bordes de ADN izquierdo y derecho que flanquean un gen de interés operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas, y (b) un segundo segmento de ADN que comprende un segundo conjunto de borde de ADN izquierdo y derecho que flanquea un promotor funcional en una semilla operablemente enlazado a un cásete de ADN que confiere un fenotipo detectable en semillas que comprende el cásete de ADN y un gen marcador operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas. 29. - La construcción de ADN de la reivindicación 28, caracterizada además porque el gen marcador es un gen marcador seleccionable. 30. - La construcción de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el gen de interés confiere un rasgo seleccionado del grupo que consiste de tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos o plagas, resistencia a enfermedad, biomasa incrementada, metabolismo de ácidos grasos modificado, metabolismo de carbohidratos modificado y calidad nutricional modificada. 31. - La construcción de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el cásete de ADN y gen marcador seleccionable son operablemente enlazados al mismo promotor. 32. - La construcción de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el cásete de ADN y el gen marcador seleccionable son operablemente enlazados a diferentes promotores. 33. - La construcción de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el gen marcador seleccionable codifica un producto seleccionado del grupo que consiste de CP4 EPSPS, fosfinotricina acetiltransferasa, DMO, Nptll, glifosato acetil transferasa, acetolactato sintasa muíante, DHFR resistente a metotrexato, dalapon deshalogenasa, PMI, Protox, higromicina fosfotransferasa y antranilato sintasa resistente a 5-metil triptofano. 34. - La construcción de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el cásete de ADN se selecciona del grupo que consiste de crtB, gus, gfp, sacB, lux, un gen de síntesis de antocianina, DefH9-iaaM, rolB, OsCDPK2, AP2, AFR2, factor de transcripción de ANT, LEC2, Snf-1, cobA, KAS4, spIA, repeticiones invertidas de zeína, B-peru, y levadura ATP-PFK. 35. - La construcción de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el cásete de ADN es operablemente enlazado a un promotor funcional en un tejido seleccionado del grupo que consiste de un embrión, endospermo de semilla, cotiledón, aleurona, y revestimiento de semilla. 36. - La construcción de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el cásete de ADN es operablemente enlazado a un promotor seleccionado del grupo que consiste de un promotor de napin, un promotor de beta-faseolina, un promotor de subunidad de beta-conglicinina, un promotor de zeína, un promotor de Osgt-1 , un promotor de oleosina, un promotor de almidón sintasa, un promotor de globulina 1 , un promotor de LTP2 de cebada, un promotor de alfa-amilasa, un promotor de quitinasa, un promotor de beta-glucanasa, un promotor de cisteína, un promotor de glutaredoxin, un promotor de HVA1 , un promotor de serina carboxipeptidasa II, un promotor de catalasa, un promotor de alfa-glucosidasa, un promotor de beta-amilasa, un promotor de VP1 , un promotor de USP, USP88 o USP99, y un promotor de bronze2. 37. - Una célula transgénica transformada con la construcción de la reivindicación 28. 38. - Una planta transgénica transformada con la construcción de la reivindicación 28. 39.- Una planta transgénica co-transformada con una construcción de ADN que comprende un primer segmento de ADN que comprende bordes de ADN izquierdo y derecho que flanquean un gen de interés operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas y una segunda construcción de ADN que contiene un segundo segmento de ADN que comprende un segundo conjunto de borde de ADN izquierdo y derecho que flanquea un promotor funcional en una semilla operablemente enlazado a un cásete de ADN que confiere un fenotipo detectable en semillas que comprende el cásete de ADN y un gen marcador operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas. 40 - Una célula de de la planta de la reivindicación 39. 41 - Una construcción de ADN que comprende bordes de ADN-T derecho e izquierdo, en donde un primer segmento de ADN que comprende un gene de interés operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después del borde izquierdo y un segundo segmento de ADN que comprende un cásete de ADN que confiere un fenotipo detectable a semillas de una planta que comprenden el cásete de ADN y un gen marcador operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después del borde derecho. 42.- Una construcción de ADN que comprende bordes de ADN-T derecho e izquierdo, en donde un primer segmento de ADN que comprende un cásete de ADN que confiere un fenotipo detectable a semillas de una planta que comprenden el cásete de ADN y un gen marcador operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después del borde derecho, y un segundo segmento de ADN que comprende un gene de interés operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después del borde izquierdo. 43. - Una construcción de ADN que comprende primer y segundo bordes de ADN-T derechos, en donde un primer segmento de ADN que comprende un gene de interés operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después del primer borde derecho y un segundo segmento de ADN que comprende un cásete de ADN que confiere un fenotipo detectable a semillas de una planta que comprende el cásete de ADN y un gen marcador operablemente enlazado a un promotor funcional en plantas está ubicado después del segundo borde derecho. 44. - Una secuencia aislada de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, o una secuencia con por lo menos 71 % de identidad a SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3, y que codifica un polipéptido con actividad de fitoeno sintasa. 45. - Una construcción de ADN recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 44, operablemente enlazado a un promotor heterólogo funcional en una planta. 46. - Una célula hospedero que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 44. 47. - La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada además porque la célula hospedero es una célula bacteriana o una célula vegetal. 48.- Una planta transgénica o semilla que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 44.