CN101490264B - 用于获得无标记转基因植物的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于鉴定转基因种子的方法和组合物，所述转基因种子包含目的转基因但缺乏标记基因。导致可检测表型的鉴定序列的使用增加筛选种子和植物的效率，在所述种子和植物中不与目的基因连接的转基因序列已与编码目的基因的序列分离。

Description

用于获得无标记转基因植物的方法和组合物

发明背景

本申请要求于2006年5月12日提交的美国临时申请系列号60/799,875的优先权，所述美国临时申请的完整公开内容引入本文作为参考。

1.发明领域

本发明总的来说涉及转基因植物。更具体而言，本发明涉及转基因植物中不需要或不必要的DNA的鉴定和去除。

2.相关领域的描述

转基因植物中不必要或不需要的转基因DNA的鉴定已成为众多研究的主题，并且在从此种植物中消除这些转基因序列的努力中已检查了许多不同方法(例如Hanson等人，1999；Dale等人，1991；Ebinuma等人，1997；Yoder等人，1994；Kononov等人，1997；Hare和Chua，2002；Scutt等人，2002；Puchta，2003；de Vetten等人，2003；Halpin，2005；美国公开申请20030110532；美国公开申请20040237142；美国专利6,458,594)。一般而言，鉴定不包括不有助于转基因植物中农业上有用性状的转基因DNA的植物是有利的。

通过土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化用于在植物中引入转基因的许多方法利用T-DNA(转化DNA)，所述T-DNA整合转基因和相关遗传元件，并且将这些转移到植物的基因组内。一般地，转基因以右边界DNA分子(RB)和左边界DNA分子(LB)为边界，并且被转移到植物基因组内，整合在一个或多个基因座上。已观察到当DNA构建体包含超过一种T-DNA时，这些T-DNAs和其中包含的转基因可以被整合到植物基因组内分开的基因座上(Framond等人，1986)。这称为共转化。

共转化过程可以通过用土壤杆菌属菌株的混合物递送T-DNAs来达到，所述土壤杆菌属菌株用携带分开的T-DNAs的质粒进行转化。共转化还可以通过用2种或更多DNA构建体转化一种土壤杆菌属菌株来达到，所述DNA构建体各自包含一种T-DNA。另外的方法利用在单个DNA载体上的2种T-DNAs且鉴定已在不同基因座上整合T-DNAs的转基因细胞或植物。在非土壤杆菌属介导的转化系统中，例如用于引入DNA的物理方法包括用微粒轰击，2种DNA分子可以独立整合到靶基因组内，并且随后在随后世代中独立分离。也已描述了允许序列的独立插入及其遗传分离的2种T-DNA构建体的使用(例如美国专利5,731,179；Zhou等人，2003；Breitler等人，2004；Sato等人，2004)。尽管前文已促进了本领域的理解，但仍需要改善的方法和组合物用于获得无标记植物以使得产品开发更有效。先前描述的筛选过程是高度劳动力密集的，例如需要DNA印迹或PCR^TM分析随后为R0和/或R1植物材料的生长。

美国公开20060041956描述了与土壤杆菌属介导的转化结合的视觉标记基因的使用。然而，该出版物未描述其中此种标记与选择或筛选标记基因连接且不与目的基因连接的任何方法。因此，本领域非常需要将改善容易和效率的方法和组合物，使用所述方法和组合物可以鉴定和消除缺乏标记序列和/或其他转基因DNA的植物，所述标记序列和/或其他转基因DNA不是农业上有用的。

发明概述

在一个方面，本发明提供了由转基因植物制备无标记种子的方法，其包括下述步骤：a)获得用第一种DNA区段和第二种DNA区段转化的转基因植物的种子，所述第一种DNA区段包含目的核酸，且所述第二种DNA区段包含与DNA盒物理和/或遗传连接的植物标记基因，所述DNA盒与在种子中有功能的启动子可操作地连接，其中所述DNA盒对包含DNA盒的种子赋予可检测表型；b)就可检测表型的不存在筛选种子；和c)选择缺乏可检测表型的至少第一个种子以获得无标记基因的种子。在一个实施方案中，步骤c)进一步包括就目的核酸的存在测定种子，并且选择包含目的核酸且缺乏选择标记基因的种子。在某些实施方案中，标记基因是选择或筛选标记基因。

在某些实施方案中，DNA盒可以与选择标记基因翻译或转录地融合；即，它可以编码与选择标记基因翻译或转录地融合的RNA。在进一步的实施方案中，DNA盒包含具有与内源基因同源的至少19或21bp的反义或有义DNA片段，例如其中反义或有义DNA片段与在种子中有功能的启动子可操作地连接。在另外一个实施方案中，DNA盒包含一对反向重复的DNA片段，其中每个片段大小为至少19或21bp，且其中DNA片段与内源基因同源，与在种子中有功能的启动子可操作地连接。与内源基因同源的反向DNA片段重复也可以包埋在选择标记基因内的内含子中。在某些实施方案中，DNA盒编码包含至少19或21个核苷酸的有义或反义RNA，其中DNA片段与内源基因同源。

在根据本发明制备无标记种子的方法中，所选择的种子可以缺乏筛选或筛选基因和DNA盒。获得转基因植物的种子可以包含用在分开的DNA构建体上的第一种和第二种DNA区段转化或共转化转基因植物或其任何前代的祖先。获得转基因植物的种子还可以包含用包含第一种和第二种DNA区段的单个DNA构建体转化转基因植物或其任何前代的祖先。第一种和第二种DNA区段由不同的T-DNA边界序列限制范围。在本发明的方法中，通过用DNA构建体转化植物或其任何前代的祖先来产生转基因植物，所述DNA构建体包含(i)侧面为左和右T-DNA边界的第一种DNA区段，和(ii)侧面为第二组左和右T-DNA边界的第二种DNA区段，其中所述第二种DNA区段进一步包含与在转基因植物中有功能的启动子可操作地连接的选择标记基因。第一种和第二种DNA区段在转基因植物中可以遗传连锁或不遗传连锁。

通过经由选自土壤杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、中生根瘤菌属(Mesorhizobium)或中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的细菌菌株介导的转化，通过将第一种和第二种DNA区段引入植物或其任何前代的祖先内可以生产根据本发明使用的转基因植物。还可以例如通过微粒轰击生产转基因植物。

与本发明一起使用的选择标记可以编码选自下述的产物：CP4EPSPS、bar、DMO、NptII、草甘膦乙酰转移酶、突变型乙酰乳酸合酶、氨甲蝶呤抗性DHFR、茅草枯脱卤素酶、PMI、Protox、潮霉素磷酸转移酶和5-甲基色氨酸抗性邻氨基苯甲酸合酶。用于与本发明一起使用的DNA盒序列可以选自例如crtB、gus、gfp、sacB、lux、花青苷合成基因、DefH9-iaaM、rolB、OsCDPK2、AP2、AFR2、ANT转录因子、LEC2、Snf-1、cobA、KAS4、splA、玉米醇溶蛋白反向重复、B-peru和酵母ATP-PFK。所述盒可以与在组织中有功能的启动子可操作地连接，所述组织选自胚、种子胚乳、子叶、糊粉和种皮。启动子可以例如选自油菜籽蛋白(napin)启动子、β-菜豆蛋白启动子、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)亚单位启动子、玉米醇溶蛋白启动子、Osgt-1启动子、油质蛋白启动子、淀粉合酶启动子、球蛋白1启动子、大麦LTP2启动子、α-淀粉酶启动子、壳多糖酶启动子、β-葡聚糖酶启动子、半胱氨酸蛋白酶启动子、谷氧还蛋白启动子、HVA1启动子、丝氨酸羧肽酶II启动子、过氧化氢酶启动子、α-葡糖苷酶启动子、β-淀粉酶启动子、VP1启动子、USP启动子、USP88启动子、USP99启动子、凝集素和bronze2启动子。可检测表型可以通过检测催化活性进行测定。可检测表型可以选自种子颜色、种子不透明度、种子发芽力、种子大小、种子生存力、种子形状、种子纹理、以及缺陷或败育种子。种子的筛选可以通过自动化种子分选机来完成。

在另一个方面，本发明提供了DNA构建体，其包含(a)包含在目的基因侧面的左和右T-DNA边界的第一种DNA区段，所述目的基因与在植物中有功能的启动子可操作地连接，和(b)包含在种子中有功能的启动子侧面的第二组左和右T-DNA边界的第二种DNA区段，所述启动子与在种子中赋予可检测表型的DNA盒可操作地连接，所述种子包含DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的选择标记基因。目的基因可以赋予选自下述的性状：除草剂耐受性、昆虫或害虫抗性、抗病性、增加的生物量、改良的脂肪酸代谢、改良的碳水化合物代谢和改良的营养质量。在所述构建体中，DNA盒和选择标记基因可以与相同启动子可操作地连接。在一个实施方案中，DNA盒和选择标记基因与不同启动子可操作地连接。在具体实施方案中，选择标记基因编码选自下述的产物：CP4EPSPS、膦丝菌素乙酰转移酶、DMO、NptII、草甘膦乙酰转移酶、突变型乙酰乳酸合酶、氨甲蝶呤抗性DHFR、茅草枯脱卤素酶、PMI、Protox、潮霉素磷酸转移酶和5-甲基色氨酸抗性邻氨基苯甲酸合酶。在另一个实施方案中，DNA盒选自crtB、gus、gfp、sacB、lux、花青苷合成基因、DefH9-iaaM、rolB、OsCDPK2、AP2、AFR2、ANT转录因子、LEC2、Snf-1、cobA、KAS4、splA、玉米醇溶蛋白反向重复、B-peru和酵母ATP-PFK。DNA盒可以与在组织中有功能的启动子可操作地连接，所述组织选自胚、种子胚乳、子叶、糊粉和种皮。在一个实施方案中，DNA盒与选自下述的启动子可操作地连接：油菜籽蛋白启动子、β-菜豆蛋白启动子、β-伴大豆球蛋白亚单位启动子、玉米醇溶蛋白启动子、Osgt-1启动子、油质蛋白启动子、淀粉合酶启动子、球蛋白1启动子、大麦LTP2启动子、α-淀粉酶启动子、壳多糖酶启动子、β-葡聚糖酶启动子、半胱氨酸蛋白酶启动子、谷氧还蛋白启动子、HVA1启动子、丝氨酸羧肽酶II启动子、过氧化氢酶启动子、α-葡糖苷酶启动子、β-淀粉酶启动子、VP1启动子、USP88或USP99启动子、和bronze2启动子。

在另外一个方面，本发明提供了用本文提供的构建体转化的转基因细胞和植物。在一个实施方案中，提供了用包含第一种DNA区段的DNA构建体和包含第二种DNA区段的第二种DNA构建体共转化的转基因植物，所述第一种DNA区段包含在目的基因侧面的左和右T-DNA边界，所述目的基因与在植物中有功能的启动子可操作地连接，且所述第二种DNA区段包含在种子中有功能的启动子侧面的第二组左和右T-DNA边界，所述启动子与在种子中赋予可检测表型的DNA盒可操作地连接，所述种子包含DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的选择标记基因。还提供了此种植物的细胞。

在另外一个方面，本发明提供了包含右和左T-DNA边界的DNA构建体，其中包含与在植物中有功能的启动子可操作地连接的目的基因的第一种DNA区段位于右边界后，且包含对植物种子赋予可检测表型的DNA盒的第二种DNA区段位于左边界后，所述植物种子包含DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的标记基因，例如选择标记基因。

在另外一个方面，本发明提供了包含右和左T-DNA边界的DNA构建体，其中包含对植物种子赋予可检测表型的DNA盒的第一种DNA区段位于右边界后，所述植物种子包含DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的选择标记基因，且包含与在植物中有功能的启动子可操作地连接的目的基因的第二种DNA区段位于左边界后。

在另外一个方面，本发明提供了包含2个右T-DNA边界的DNA构建体，其中包含与在植物中有功能的启动子可操作地连接的目的基因的第一种DNA区段位于一个右边界后，且包含对植物种子赋予可检测表型的DNA盒的第二种DNA区段位于另一个右边界后，所述植物种子包含DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的选择标记基因。

在另外一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，或与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少70％、75％、85％或95％同一性，且编码具有八氢番茄红素合酶活性的多肽的序列的分离的核酸序列。在一个实施方案中，本发明还提供了包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核酸序列的重组DNA构建体，或包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少71％、80％、90％、95％、98％或99％同一性，且编码具有八氢番茄红素合酶活性的多肽的序列的重组DNA构建体，其与在植物中有功能的异源启动子可操作地连接。包含此种序列的宿主细胞是本发明的另一个实施方案，其中所述细胞是细菌细胞或植物细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了转基因植物或种子，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，或与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少71％、80％、90％、95％、98％或99％同一性，且编码具有八氢番茄红素合酶活性的多肽的序列。

附图简述

下述附图是本说明书的部分且被包括以进一步证实本发明的某些方面。通过参考附图与本文呈现的具体实施方案的详细描述组合可以更好地理解本发明。

图1.(A)pMON10338；(B)pMON10339；和(C)pMON67465的示意图。

图2.用pMON67465转化的大豆组织中的CrtB表达。

图3.在来自事件A33908的种子中的CrtB表达。

图4.在未成熟的R1种子中的crtB、gus和CP4/EPSPS表达。

图5.在成熟的R1种子中的crtB表达。

图6.pMON67465种子的GUS染色。

图7.关于GUS阳性种子的CP4和CrtB PCR。

图8.用于筛选转基因事件的连锁-DNA印迹和筛选标记方法的比较。

图9.通过使用包含用于无标记种子的与CP4选择标记基因连接的筛选基因的构建体转移的DNA序列的示意概括。A)在用于土壤杆菌属介导的转化的一种构建体中，GOI位于一种T-DNA中，侧面为RB和LB且与第二种T-DNA物理连接，所述第二种T-DNA包含与CP4选择标记基因连接的筛选基因；B)包含2个边界的一种载体，将GOI置于RB后，而将筛选和选择标记基因连同主链一起置于第二个RB后或置于LB后；C)GOI和筛选基因-DNAs在2种载体中分开，且转化到一种土壤杆菌属细胞或分开的土壤杆菌属细胞中；D)来自GOI以及筛选和选择标记基因的2种DNA区段的可能连接。只有单独的GOI将显示正常的种子外观，而包含筛选基因的细胞显示可见表型；E)2种分开的DNA区段包含GOI或筛选和选择标记基因用于非细菌介导的转化。

图10.pMON67420表示用于共转化的GOI构建体。

图11.质粒pMON99575，包含经由种子特异性玉米醇溶蛋白启动子驱动的粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)ATP依赖性果糖磷酸激酶。

图12.表达种子特异性酵母ATP依赖性果糖磷酸激酶的玉米穗取消了正常的仁发育。

图13.用于证实置于标记基因的内含子内的反向重复导致可见表型的dsRNA编码构建体的示意图。

图14.包埋在内含子中的反向重复产生可见表型。

图15.玉米仁中的α-玉米醇溶蛋白的沉默导致可见表型。

图16.包含KAS4的pMON83530的示意图。

图17.用pMON83530转化的大豆种子的后代。左侧的种子由于表达KAS4而皱缩并且指出选择标记的存在，而右侧的种子是正常和无标记的。

图18.包含KAS4用作2T DNA构建体中的鉴定序列的pMON107314的示意图。

图19.包含splA基因用作鉴定基因的pMON68581的示意图。

图20.用pMON68581转化的后代大豆种子。右侧的种子由于表达splA而皱缩并且指出筛选或选择标记的存在，而左侧的种子是正常和无标记的。

图21.2T-DNA载体形式-示意图。

发明详述

下述是本发明的详细描述，提供用于帮助本领域技术人员实践本发明。本领域普通技术人员可以在不背离本发明的精神或范围的情况下，在本文描述的实施方案中进行修饰和变化。

本发明通过提供构建体和方法克服了现有技术中的缺陷，所述构建体和方法基于由种子表达的鉴定基因、序列或盒赋予的表型，允许有效区分缺乏鉴定序列和标记基因序列但包括一种或多种目的基因(GOI)的种子与包含鉴定基因序列和标记基因序列的种子。具体地，在一个实施方案中，本发明提供了用于转化植物细胞的转化构建体和方法，其包括：(i)目的基因；和(ii)在种子中表达且与选择或筛选标记基因物理连接的鉴定序列，所述选择或筛选标记基因可以在各种植物组织中表达，其中构建体和/或转化法这样设计，从而使得(i)和(ii)的遗传元件可以独立整合到植物基因组内，且因此在遗传上彼此分离。

鉴定序列在种子组织中的表达或其的缺乏允许直接鉴定种子和植物，所述种子和植物缺乏种子表达的鉴定序列和物理连接的选择或筛选标记基因，同时允许选择仍包含目的转基因的种子和植物。在种子水平上选择包括目的基因且缺乏标记基因序列的种子代表显著进步，因为它避免了先前使用的相对昂贵和劳动力密集的筛选法的需要。另外可以节省时间，因为筛选可以在发芽前或在发芽期间完成，而不需要使植物的下一代生长至允许组织收获的大小，如例如对于连锁-DNA印迹分析所需的。

在一个实施方案中，通过土壤杆菌属或其他根瘤菌介导的方法进行植物组织的转化(参见例如，于2006年5月16日提交，名称为“Use ofNon-Agrobacterium Bacterial Species for Plant Transformation”且指定代理受理号MONS：100USP1的美国临时专利申请系列号60/800,872，所述美国临时专利申请的完整公开内容特别引入本文作为参考)，并且包括在种子中表达的鉴定序列和物理连接的选择或筛选标记基因的DNA序列一起存在于转移到植物细胞内的T-DNA或其他序列(例如，载体主链)上(例如，侧面为T-DNA RB和/或LB序列或不含边界序列)。鉴定序列和标记基因可以物理连接地转移给植物，而目的基因存在于分开的T-DNA上，侧面为其自身的RB和LB序列或转移到植物细胞内的其他序列，并且可以整合到独立基因座上(例如图21)。选择和/或筛选标记允许鉴定转化的植物组织。可以获得能育的植物并且在育种方案中进行自交或杂交，以跟踪下一代中的表型分离。用于执行此种育种的策略是本领域众所周知的，并且在不同植物之间在细节方面可以有变化。鉴定序列的种子表达或缺乏表达允许就标记和鉴定序列的存在而言容易的鉴定种子。目的基因例如可以包含编码选自下述的性状的至少一个植物表达盒：除草剂耐受性、抗生素抗性、昆虫抗性、抗病性、抗应激性(例如干旱和寒冷)、增强的营养物使用效率、增强的营养含量(例如，氨基酸、蛋白质、糖、碳水化合物、脂肪酸和/或油)、不育系统、工业酶(例如，药物和用于生物燃料的加工酶)和增强的产量。

可以转移到植物细胞内的序列(例如T-DNAs)可以存在于用于转化的细菌菌株中的一个转化载体上。在另一个实施方案中，序列包括鉴定序列和植物选择标记以及包含目的基因的序列可以存在于细菌菌株中的分开的转化载体上。在另外一个实施方案中，可以在一起用于转化的分开的细菌细胞或菌株中发现，包括鉴定序列和植物选择标记的T-DNA以及包含目的基因的T-DNA。

在另外一个实施方案中，DNA序列包括(i)目的基因；和(ii)在种子中表达且与选择或筛选标记基因物理连接的鉴定序列可以通过物理方法例如微粒轰击引入植物细胞内。在此种实施方案中，(i)和(ii)的DNA序列可以位于分开的DNA片段上，所述分开的DNA片段可以在用DNA包被微粒之前或期间混合在一起。DNA序列可以存在于单个微粒上，或它们可以存在于分开的微粒上，所述分开的微粒在轰击前混合在一起。

由鉴定序列传递的表型可以通过下述来达到：与组成型或种子特异性启动子连接的异源或内源基因的异位超表达，或使用反义RNA、RNA干扰或共抑制技术下调内源基因。内源基因的例子可以包括但不限于，涉及糖/淀粉代谢、蛋白质代谢和脂肪酸代谢的基因。

在一个实施方案中，鉴定序列的种子表达导致在包含鉴定序列的转基因植物的种子中的可检测表型。在某些实施方案中，表型可以通过目测进行检测，且可以包括种子颜色、不透明度(或半透明度)、荧光、纹理、大小、形状、发芽力、生存力、或通常任何组分或性质中的变化，所述任何组分或性质可物理或生物化学测定且不同于非转基因受体基因型中发现的那种。在某些实施方案中，鉴定序列包括gusA、gfp(Pang等人，1996)、八氢番茄红素合酶、或八氢番茄红素去饱和酶编码基因、或花青苷基因(Pl、Lc、B-Peru、C1、R、Rc、mybA或myb1(例如Selinger等人，1998；Ludwig等人，1989；Himi等人，2005；Kobayashi等人，2002))。在具体实施方案中，鉴定基因包含编码八氢番茄红素合酶的crtB基因(美国专利号5,429,939；US 6,429,356；美国专利5,545,816)，包括包含对于在单子叶植物例如玉米植物中的表达进行了密码子最优化的crtB序列的基因。可以在这点上使用的基因的另一个例子是涉及种子色素生产的基因。

在其他实施方案中，表型可通过催化活性的检测进行测定。在另外一个实施方案中，表型是组织切除表型，例如花粉、卵或种子组织的形成中的阻断。还设想了包括标记基因、沉默配子生产或生存力所需的基因从而减少或阻止受精的组合物和方法。例如，可以使用导致花粉发育和生存力所需的基因沉默的序列。衍生自携带标记基因的减数分裂分离子的花粉将不发育或将是不能存活的，从而阻止标记基因通过花粉传递给后代。在异型杂交授粉中，所有后代将是无标记的。还设想了导致其他内源基因沉默(例如，RNAi技术包括miRNA)以导致种子表型的序列的使用。此种基因包括但不限于：编码或修饰种子贮藏蛋白例如玉米醇溶蛋白的表达的基因，Opaque2，Waxy，和编码涉及种子中的碳水化合物、蛋白质和/或脂质积聚的蛋白质的其他基因。

赋予不能存活的花粉表型的鉴定序列的表达也是希望的，因为当携带在花粉特异性启动子控制下的鉴定序列的转基因品系用作雄性传粉者时，仅不含鉴定序列的花粉粒将能够使卵受精，从而增加无鉴定序列和标记序列的种子得率。鉴定序列可以生产对于花粉致命或对于花粉萌发抑制性的蛋白质。可替代地，与基本内源的花粉基因同源的一对反向重复的表达可以用于沉默使得花粉不能存活的基因。花粉特异性基因和启动子的例子是本领域技术人员已知的，并且包括例如如描述的(Eyal等人，1995)LAT52和LAT59基因以及番茄启动子。

在另一个实施方案中，鉴定序列可以在种子和花粉中进行表达，用于进一步增强具有目的基因的种子的选择且消除具有鉴定序列和标记基因的种子。这可以通过使用包含2种转基因的鉴定序列来达到；所述转基因之一在种子中表达且另一种在花粉中表达。可替代地，可以在花粉和种子中表达相同鉴定序列的启动子还可以导致在花粉和种子中的可检测表型。在花粉和种子中表达的启动子的例子是来自玉蜀黍Waxy基因(zmGBS；Shure等人，1983)和稻小亚基ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(osAGP；Anderson等人，1991)的启动子。花粉和种子表达模式也在Russell和Fromm，1997中得到描述。

鉴定序列可以可替代地改变碳水化合物、蛋白质、脂质或者细胞或种子代谢的其他产物，以便产生可检测表型。在一个实施方案中，鉴定序列允许编码果聚糖蔗糖酶或酵母ATP依赖性果糖磷酸激酶(ATP-PFK)的sacB基因的胚乳特异性表达，这取消包含鉴定序列和标记基因的种子中的淀粉积聚(Caimi等人，1996；图12)。鉴定序列可以是基因。鉴定序列可以进一步编码转录或翻译融合物(例如U.S.6,307,123；美国专利公开20060064772)。

美国专利6,307,123涉及选择标记基因(nptII)和筛选标记基因(gfp)之间的翻译融合物的构建。可以应用该方法以产生本文描述的鉴定序列和本文描述的选择或筛选标记之间的融合物。

可以用于制备多肽融合物的另一种方法基于泛蛋白(Ub)加工途径。这种方法可以用于将包含2个蛋白质结构域的长多肽切割成2种分开的活性蛋白质。在这种方法中，单个基因盒可以编码2个ORFs，其中例如关于crtB和EPSPS-CP4的2个ORFs可以由Ub的14个C末端氨基酸分开，随后为全长Ub序列。在体内翻译后，内源性脱遍在蛋白酶(DUBs)将多蛋白切割成3个分开的单位：1)N末端蛋白质，其包含终止于Ub的14个C末端氨基酸的鉴定序列crtB；2)Ub单体；和3)C末端多肽，其编码选择标记EPSPS-CP4。此种方法是本领域技术人员已知的(例如Walker等人，2007)。

通过使用内部核糖体进入位点(IRES)可以制备鉴定序列和选择或筛选标记之间的转录融合物。例如，可以制备编码crtB的ORF随后为ESPSP-CP4的ORF的转录物，其中在它们之间放置功能IRES元件。几种IRES是本领域技术人员已知的(参见例如引入本文作为参考的Dinkova等人2005和其中的参考文献；和美国专利7,119,187)。

种子组织中的鉴定序列的表型还可以通过方法尤其包括视觉、生物化学、免疫学和基于核酸(例如基于PCR)的方法进行检测。鉴定序列可以在种子组织中赋予可检测表型，其可以与标记基因的表型区分开。由鉴定序列赋予的表型可以包括改变的种子发芽。鉴定序列可以在种子(仁)的一个或多个部分中表达，包括胚、胚乳、子叶和种皮(外种皮)，从而使得可以辨别表型。

鉴定序列还可以引起无种子表型。为了实现组织切除，在一个实施方案中，鉴定序列指导defH9-iaaM或rolB在植物中的胚珠特异性表达(例如Rotino等人1997，Carmi等人2003，GenBank AM422760，X64255，AE009418)，这取消了胚珠发育且导致在包含标记和鉴定序列的子房中的无种子表型。在另外一个实施方案中，鉴定序列指导OsCDPK2在谷类农作物中的超表达，从而破坏种子发育(Morello等人2000；例如，GenBank Y13658)。

遗传元件还可以设计为抑制内源基因的表达，从而导致产生允许区分包含标记基因的种子与不包含的那些的种子表型。这种鉴定序列的遗传元件与标记基因物理连接，例如包埋在标记DNA盒内，从而使得种子表型与标记的存在连锁，允许快速鉴定包含标记的种子。

RNAi可以用于沉默一种或多种基因，从而导致容易评分、优选可见的种子表型。RNAi介导的种子表型所需的DNA序列位于与标记基因相同的T-DNA上。包含标记基因的任何后代种子还将显示种子表型且将容易鉴定。此种种子将无需进行生长且就标记基因的存在进行筛选。因此，仅不含由鉴定序列赋予的表型的种子进行生长和/或就GOI的存在进行筛选。依赖于种子来自自花传粉还是异型杂交，这种方法减少了需要种植且对于自交植物物种通过至少3X或对于异型杂交植物物种通过1X筛选的种子数目。

可以用于使用RNAi相关途径沉默靶基因的广泛多样的组合物是本领域技术人员已知的。一个实施方案是装配DNA盒，所述DNA盒将转录序列的反向重复，以产生双链RNA(dsRNA)，一般长度是至少约19-21bp且对应于靶向用于沉默的一种或多种基因的部分。dsRNA长度可以是约19-21bp且对应于靶向用于沉默的一种或多种基因的部分。包括鉴定序列的这种DNA盒位于与选择标记基因相同的T-DNA内。本领域技术人员已知的沉默基因的其他方法包括但不限于：共抑制、反义、miRNAs(天然或改造的)的表达、反式作用siRNAs的表达和核酶的表达。如果基因沉默效应所需的序列位于与标记基因相同的T-DNA中，那么可以使用这些方法中的任何一种。

鉴定序列可以增加或减少种子大小。在一个实施方案中，鉴定序列可以通过反义RNA或RNA干扰或共抑制技术(Jofuku等人，2005)赋予AP2基因(例如，GenBank U12546)的下调，这导致包含鉴定序列和选择标记基因的较大种子。还可以通过AFR2基因(Schruff等人，2006；例如，GenBank登记NM_203251；NM_180913)或ANT转录因子(Mizukami和Fisher，2000；例如，GenBank NM_202701、NM_119937、NM_180024、NM_101474、NM_202110)的异位表达来达到较大的种子大小。在另一个实施方案中，鉴定序列通过反义或RNAi或共抑制技术来传递LEC2(例如，GenBank AF400123)或Snf-1(GenBank AB 101657、AB101656、AB101655)基因的下调，这导致减少的种子大小(Mendoza等人，2005；Radchuk等人，2006)。改变的种子大小可以通过人工和/或机械方法经由重量、形状或筛分容易地分选。

特别预期可以由本发明实现自动化筛选技术用于鉴定具有特定可检测表型的种子。用这种方式可以有效筛选大量种子，并且可以收集缺乏鉴定序列的种子。自动化技术可以比依赖人类技术员更快速、更廉价和更精确。已描述了可以以这种方式使用的此种种子分选机。例如，美国专利号4,946,046描述了用于根据颜色分选种子的装置。在这种机器中，通过将种子置于旋转鼓中一致的凹槽行中且使种子在数字成像相机和光源下经过根据颜色分选种子。通过相机阅读图像且输入计算机，所述计算机还接受来自鼓速度传感器的信息。计算机产生引起气流吹过包含有色种子的凹槽底部的开口的信号，以收集此种种子。将收集的种子注入收集漏斗内，并且将无色种子注入分开的漏斗内。

通过改变用于检测有色种子的光源的波长，以及置于有色种子和检测相机之间的屏障滤光片，可以用这种技术检测可能地任何鉴定标记。例如，为了检测表达GFP的种子，激发波长在蓝光UV谱中，一般在约395nm处。用于UV发射的合适的光源是本领域技术人员众所周知的并且包括氙和汞灯。合适的滤光片组也是本领域技术人员众所周知的，并且包括例如BP450-490激发器滤光片、FT510彩色分束器和BP515-565屏障滤光片(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)。此种滤光片组和发射波长在Heim和Tsien，1996中更详细讨论，其公开内容特别整体引入本文作为参考。

通过使用包括一种或多种鉴定序列的构建体，选择能力可以扩展至多种选择和/或筛选基因和目的基因。因此，可以有效筛选表示多种不同的转化事件的大量转基因种子，并且可以选择仅具有(或缺乏)所需鉴定序列组的那些种子。

重组DNA载体可以例如是线性DNA区段或闭合环状质粒。载体系统可以是单个载体或质粒或者一起包含待引入植物基因组内的总DNA的2个或更多载体或质粒。如本文所述的核酸分子可以例如适当地插入载体内在合适的启动子的控制下，所述启动子在植物细胞中起作用，以驱动连接的编码序列或其他DNA序列的表达。许多载体可用于这个目的，并且合适的载体的选择将主要依赖于待插入载体内的核酸的大小和待用载体转化的具体宿主细胞。依赖于其功能和与之一起使用或相容的具体载体和植物细胞，每个载体包含各种组分。

适合于稳定转化植物细胞或确立转基因植物的许多载体是众所周知的，例如Gelvin等人(1990)。一般地，植物表达载体包括但不限于，一个或多个目的基因转录单位，其中每个包括：5′非翻译区，其包括控制可操作地连接的蛋白质编码序列(“可读框”，ORF)的转录(例如，顺式作用启动子序列例如增强子、转录起始开始位点等)和翻译(例如，核糖体结合位点)的序列；3′非翻译区，其包括来自植物基因的3′末端的另外调节区(Thornburg等人，1987)；An等人，1989)，例如3′终止子区以增加mRNA稳定性。可替代地，植物表达载体可以设计用于表达mRNA分子，其例如可以通过RNAi介导的方法改变植物基因表达。此外，此种构建体通常包括选择和/或筛选标记转录单位和任选地复制起点或载体在细菌宿主细胞中复制所需的其他序列。

构建体还可以包含在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒主链DNA区段，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)复制起点例如ori322、广宿主范围复制起点例如oriV或oriRi、和关于选择标记的编码区，例如编码赋予对于壮观霉素或链霉素的抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酸转移酶(aadA)的Spec/Strp，或庆大霉素(Gm，Gent)选择标记基因。对于植物转化，宿主细菌菌株通常是携带具有用于表达单位的转移功能的质粒的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)ABI、C58、LBA4404、EHA101或EHA105。植物转化领域技术人员已知的其他菌株可以在本发明中起作用。

植物表达载体任选包括RNA加工信号，例如可以在转基因中置于多肽编码序列的上游或下游的内含子。此外，表达载体还可以包括来自植物基因的3′非翻译区的另外的调节序列。这些3′非翻译区包含mRNA转录终止信号。包含在植物表达载体中的其他可移动元件可以包括5′前导序列、转运信号序列和编码序列。

表达和克隆载体可以包含选择基因，也称为植物选择标记。这种基因编码在选择性培养方案中生长的转化植物细胞的存活或生长所需的蛋白质。一般的选择基因编码赋予对于选择剂的抗性的蛋白质，所述选择剂例如抗生素，包括除草剂或其他毒素，例如新霉素、氨甲蝶呤、麦草畏、草铵膦或草甘膦。用异源蛋白质或其片段成功转化的那些细胞产生赋予例如抗药性的蛋白质，且从而经受得住选择方案。各种选择/筛选/可评分标记的例子和编码其的基因公开于Miki和McHugh，2004中。

用于生产mRNA的表达载体还可以包含诱导型或组织特异性启动子，其在宿主植物细胞中被识别且与编码目的核酸分子或其片段的核酸可操作地连接。植物启动子在下文得到讨论。

在一个实施方案中，使用的植物转化载体包括分离和纯化的DNA分子，包括与本发明的一种或多种核酸序列可操作地连接的异源种子特异性启动子。在另一个实施方案中，启动子是种子表达的，但不是种子特异性的。植物转化载体可以包含来自一种或多种基因的序列，从而允许在植物细胞中生产超过一种mRNA。本领域技术人员将容易理解可以将DNA的区段组合到单个复合DNA区段内用于在转基因植物中表达。

认为用于与本发明一起使用的用于转化宿主细胞的合适方法包括通过其可以将DNA引入细胞内的事实上任何方法(参见，例如Miki等人，1993)，例如通过原生质体的转化(美国专利号5,508,184；Omirulleh等人，1993)、通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等人，1985)、通过电穿孔(美国专利号5,384,253)、通过用碳化硅纤维搅动(Kaeppler等人，1990；美国专利号5,302,523；和美国专利号5,464,765)、通过土壤杆菌属介导的转化(美国专利号5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；6,384,301)和通过DNA包被粒子的加速(美国专利号5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；6,403,865；Padgette等人1995)等。通过诸如这些的技术的应用，可以稳定转化事实上任何物种的细胞。在多细胞物种的情况下，转基因细胞可以再生成转基因生物。

用于将表达载体引入植物内的最广泛使用的方法基于土壤杆菌属的天然转化系统(例如，Horsch等人，1985)。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。土壤杆菌属载体系统和用于土壤杆菌属介导的基因转移的方法的描述由众多参考文献提供，包括Gruber等人，1993；Miki等人，1993，Moloney等人，1989，以及美国专利号：4,940,838和5,464,763。其他细菌例如与植物天然相互作用的中华根瘤菌属、根瘤菌属和中生根瘤菌属可以进行修饰以介导至众多不同植物的基因转移(Broothaerts等人，2005)。这些植物相关的共生细菌可以通过获得使得无效的Ti质粒和合适的二元载体制备成感受态的用于基因转移。待经由土壤杆菌属介导的转化法转移的DNA序列包括通常限定转移DNA(T-DNA)范围的一个或多个“边界”序列，例如右边界(RB)和左边界(LB)序列，所述转移DNA包含在植物细胞中待表达的一种或多种基因，且可以进一步包括增强子序列，例如如美国临时专利申请号60/831,814中公开的超驱动序列(Toro等人，1989)或多个超驱动序列，所述美国临时专利申请引入本文作为参考。

在棉花转化的背景中可以特别有用的技术公开于美国专利号5,846.797、5,159,135、5,004,863和6,624,344中。用于转化芸苔属(Brassica)植物的技术特别公开于例如美国专利5,750,871中；且用于转化大豆的技术公开于例如Zhang等人，1999，美国专利6,384,301和US 7,002,058中。用于转化玉米的技术公开于WO9506722中。可以在本发明中找到用途的植物的一些非限制性例子包括苜蓿、大麦、豆类、甜菜、嫩茎花椰菜、甘蓝、胡萝卜、低芥酸菜子、花椰菜、芹菜、大白菜、玉米、棉花、黄瓜、干菜豆、茄子、茴香、四季豆、瓠果、韭、莴苣、瓜、燕麦、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、南瓜、花生、马铃薯、南瓜、萝卜、稻、高粱、大豆、菠菜、西葫芦、甜玉米、甜菜、向日葵、番茄、西瓜和小麦。

载体或构建体还可以包括各种调节元件。5′非翻译前导序列可以衍生自选择用于表达本发明的DNA分子的异源基因序列的启动子，并且若需要则可以特别修饰以便增加mRNA的翻译。5′非翻译区还可以得自植物病毒RNAs(例如烟草花叶病毒、烟草蚀斑病毒、玉米矮花叶病毒、苜蓿花叶病毒)，来自合适的真核基因、植物基因(小麦和玉蜀黍叶绿素a/b结合蛋白质基因前导区)或来自合成基因序列。前导序列还可以衍生自无关启动子或编码序列。在本发明的背景中有用的前导序列包括玉蜀黍Hsp70前导区(整体引入本文作为参考的美国专利号5,362,865和美国专利号5,859,347)和TMVω元件(Gallie等人，1989)。翻译前导序列的例子尤其包括玉蜀黍和矮牵牛花热激蛋白前导区(美国专利号5,362,865)、植物病毒外壳蛋白质前导区、植物核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶前导区、GmHsp(美国专利5,659,122)、PhDnaK(美国专利5,362,865)、AtAnt1、TEV(Carrington和Freed，1990)、AGRtunos(GenBank登记V00087；Bevan等人，1983)、OsAct1(美国专利5641876)、OsTPI(美国专利号7,132,528)和OsAct15(美国公开号20060162010)。

内含子序列是本领域已知的以帮助转基因在单子叶植物细胞中的表达。内含子的例子包括玉米肌动蛋白内含子(美国专利5,641,876)、玉米HSP70内含子(ZmHSP70；美国专利5,859,347；美国专利5,424,412)、和稻TPI内含子(OsTPI；美国专利号7,132,528)，并且在实践本发明中具有利益。

载体还可以包括转运肽核酸序列。许多叶绿体定位蛋白质，包括涉及类胡萝卜素合成的那些，由核基因作为前体进行表达，并且通过在输入步骤后去除的叶绿体转运肽(CTP)靶向叶绿体。其他此种叶绿体蛋白质的例子包括核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)，以及集光复合体蛋白质I和蛋白质II。已在体内和体外证实非叶绿体蛋白质可以通过使用与CTP的蛋白质融合物靶向叶绿体，并且CTP序列足以使蛋白质靶向叶绿体。合适的叶绿体转运肽例如鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)(At)EPSPS CTP(Klee等人，1987)和碧冬茄(Petunia hybrida)(Ph.)EPSPS CTP(della-Cioppa等人，1986)的掺入已显示在转基因植物中使异源蛋白质序列靶向叶绿体。本领域技术人员将认识到，若需要则可以制备利用特定CTP的功能性将给定基因产物输入叶绿体内的各种嵌合构建体。在实践本发明中可能有用的其他CTPs包括PsRbcS衍生的CTPs(豌豆(Pisum sativum)核酮糖二磷酸羧化酶-氧化酶小亚基CTP；Coruzzi等人，1984)；AtRbcS CTP(鼠耳芥核酮糖二磷酸羧化酶-氧化酶小亚基1A CTP；CTP1；美国专利5,728,925)；AtShkG CTP(CTP2；Klee等人，1987)；AtShkGZm CTP(CTP2synthetic；对于单子叶植物表达最优化的密码子；WO04009761的SEQ ID NO：14)；PhShkG CTP(碧冬茄EPSPS；CTP4；对于单子叶植物表达最优化的密码子；Gasser等人，1988)；TaWaxy CTP(普通小麦(Triticum aestivum)颗粒结合淀粉合酶CTPsynthetic，对于玉米表达最优化的密码子：Clark等人，1991)：OsWaxy CTP(稻(Oryza sativa)淀粉合酶CTP；Okagaki，1992)；NtRbcS CTP(烟草(Nicotiana tabacum)核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶小亚基叶绿体转运肽；Mazur，等人，1985)；ZmAS CTP(玉蜀黍(Zea mays)邻氨基苯甲酸合酶α2亚单位基因CTP；Gardiner等人，2004)；和RgAS CTP(芸香(Ruta graveolens)邻氨基苯甲酸合酶CTP；Bohlmann，等人，1995)。可能有用的其他转运肽包括玉蜀黍cab-m7信号序列(PCT WO 97/41228)和豌豆(豌豆)谷胱甘肽还原酶信号序列(PCT WO 97/41228)。

转录的终止可以通过与重组转基因(例如目的基因、鉴定序列包括筛选基因、或植物选择标记基因)可操作地连接的3′非翻译DNA序列来完成。重组DNA分子的3′非翻译区包含在植物中起作用的多腺苷酸化信号以引起腺苷酸核苷酸添加至RNA的3′末端。3′非翻译区可以得自在植物细胞中表达的各种基因。胭脂氨酸合酶3′非翻译区(Fraley等人，1983)通常以这种能力使用。特别地来自豌豆RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等人，1984)、AGRtu.nos(Genbank登记E01312)、E6(登记#U30508)、稻谷蛋白(Okita等人，1989)和TaHsp17(小麦低分子量热激蛋白基因；登记#X13431)的多腺苷酸化分子可以具有与本发明一起使用的利益。

对于其中希望使用组成型启动子的本发明的实施方案，可以使用任何众所周知的组成型植物启动子。组成型植物启动子包括例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，其在大多数植物组织中赋予组成型、高水平表达(参见例如，Odell等人，1985)，包括单子叶植物(参见例如，Dekeyser等人，1990)；Terada等人，1990)；胭脂氨酸合酶启动子(An等人，1988)，章鱼氨酸合酶启动子(Fromm等人，1989)，花椰菜花叶病毒19S启动子，玄参花叶病毒35S启动子，稻肌动蛋白1启动子，甘露碱合酶启动子和组蛋白启动子。

对于本发明的其他实施方案，可以使用响应环境、激素、化学药品和/或发育信号得到调节的众所周知的植物基因启动子，包括由(1)热(Callis等人，1988)，(2)光(例如，豌豆rbcS-3A启动子，Kuhlemeier等人，1989；玉蜀黍rbcS启动子，Schaffner和Sheen，1991；或叶绿素a/b-结合蛋白质启动子，Simpson等人，1985)，(3)激素，例如脱落酸(Marcotte等人，1989)，(4)创伤(例如，wunl，Siebertz等人，1989)；或(5)化学药品例如茉莉酮酸甲酯、水杨酸等调节的启动子。采用(6)器官特异性启动子也是有利的(例如，Roshal等人，1987；Schernthaner等人，1988；Bustos等人，1989)。

存在可以用于驱动多核苷酸在转基因植物中的组织特异性表达的广泛多样的植物启动子序列。事实上，在本发明的具体实施方案中，使用的启动子是种子特异性启动子。关于β-伴大豆球蛋白的启动子(Chen等人，1989)或其他种子特异性启动子，例如在植物种子成熟期间得到调节的油菜籽蛋白启动子(Kridl等人，1991；Kohno-Murase等人，1994)，大麦Hv.Per1(Stacey等人，1996)，菜豆蛋白(Bustos等人，1989)，大豆胰蛋白酶抑制剂(Riggs等人，1989)，ACP(Baerson等人，1993)，硬脂酰-ACP去饱和酶(Slocombe等人，1994)，β-伴大豆球蛋白的大豆α′亚单位(P-Gm7S，参见例如，Chen等人，1986)，蚕豆(Vicia faba)USP(P-Vf.Usp，参见例如，SEQ ID NO：1、2和3，美国申请公开20030229918)，球蛋白启动子(参见例如Belanger和Kriz，1991)，β-伴大豆球蛋白的大豆α亚单位(7Sα；引入作为参考的美国专利6,825,398)和玉蜀黍L3油质蛋白启动子(P-Zm.L3，参见例如，Hong等人，1997；还参见美国专利号6,433,252，其公开内容特别引入本文作为参考)。

玉米醇溶蛋白是在玉蜀黍胚乳中发现的一组贮藏蛋白。已分离了用于玉米醇溶蛋白基因的基因组克隆(Pedersen等人，1982；美国专利6,326,527)，并且还可以使用来自这些克隆包括15kDa、16kDa、19kDa、22kD、27kDa和γ基因的启动子。已知例如在玉蜀黍中起作用的其他启动子包括用于下述基因的启动子：waxy(Russell和Fromm，1997；Shure等人，1983)、Brittle(Giroux等人，1994)、Shrunken 2、分支酶I和II、淀粉合酶、脱支酶、油质蛋白、谷蛋白和蔗糖合酶。用于玉蜀黍胚乳表达的另一种启动子是用于来自稻的谷蛋白基因的启动子，更特别地Osgt-1启动子(Zheng等人，1993)。在稻中的此种启动子的例子包括关于ADPGPP亚单位、结合颗粒和其他淀粉合酶、分支酶、脱支酶、蔗糖合酶(Yang等人，1990)、以及Betl1(基本胚乳转移层)和球蛋白1的那些启动子。

可以在本发明中有用的其他启动子的例子在下述专利中得到描述：美国专利6,437,217(玉蜀黍RS81启动子)，美国专利5,641,876(稻肌动蛋白启动子；OsAct1)，美国专利6,426,446(玉蜀黍RS324启动子)，美国专利6,429,362(玉蜀黍PR-1启动子)，美国专利6,232,526(玉蜀黍A3启动子)，美国专利6,177,611(组成型玉蜀黍启动子)，美国专利5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(35S启动子)，美国专利6,433,252(玉蜀黍L3油质蛋白启动子)，美国专利6,429,357(稻肌动蛋白2启动子以及稻肌动蛋白2内含子)，美国专利5,837,848(根特异性启动子)，美国专利6,294,714(光诱导型启动子)，美国专利6,140,078(盐诱导型启动子)，美国专利6,252,138(病原体诱导型启动子)，美国专利6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)，美国专利6,635,806(γ-薏苡辛启动子)和美国专利7,151,204(玉蜀黍叶绿体醛缩酶启动子)。可以找到用途的另外启动子是胭脂氨酸合酶(NOS)启动子(Ebert等人，1987)、章鱼氨酸合酶(OCS)启动子(其携带在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上)、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人，1987)、CaMV 35S启动子(Odell等人，1985)、玄参花叶病毒35S启动子(Walker等人，1987)、蔗糖合酶启动子(Yang等人，1990)、R基因复合物启动子(Chandler等人，1989)和叶绿素a/b结合蛋白质基因启动子等。在本发明中，具有增强子序列的CaMV35S(e35S；美国专利号5,322,938；5,352,605；5,359,142；和5,530,196)，FMV35S(美国专利6,051,753；5,378,619)，花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒(PClSV；美国专利5,850,019)，At.Act 7(登记#U27811)，At.ANT1(美国专利申请公开20060236420)，FMV.35S-EF1a(美国专利申请公开20050022261)，eIF4A10(登记#X79008)和AGRtu.nos(GenBank登记V00087；Depicker等人，1982；Bevan等人，1983)，稻胞质丙糖磷酸异构酶(OsTPI；美国专利号7,132,528)和稻肌动蛋白15基因(OsAct15；美国专利申请公开20060162010)启动子可以具有特别利益。在一些情况下，例如OsTPI和OsAct15，启动子可以包括5’UTR和/或第一个内含子。本发明还预期了本领域技术人员已知的在本发明的实践中有用的其他启动子。

植物表达载体还可以包括筛选或可评分标记基因盒，其可以在本发明中用于就表达(的丧失)监控分离细胞或后代。示例性标记是已知的且包括编码关于各种生色底物的酶的β-葡糖醛酸酶(GUS)(Jefferson等人，1987a；Jefferson等人，1987b)；编码调节植物组织中的花青苷色素(红色)产生的产物的R-基因座基因(Dellaporta等人，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等人，1978)；编码关于其的各种生色底物已知的酶的基因(例如，PADAC，生色头孢菌素)；萤光素酶基因(Ow等人，1986)；编码可以转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶的xy1E基因(Zukowsky等人，1983)；α-淀粉酶基因(Ikatu等人，1990)；编码能够使酪氨酸氧化成DOPA和依次缩合成黑色素的多巴醌(dopaquinone)的酶的酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)；绿色荧光蛋白(Elliot等人，1999)和α-半乳糖苷酶。筛选或可评分标记基因可以编码与鉴定序列相同的基因产物，包括筛选或可评分基因，或不同的基因产物。然而，鉴定序列表达于卵、花粉或种子组织中，而筛选或可评分标记基因在鉴定转化的植物细胞的过程中表达。鉴定序列还可以组成型表达，但仅传送在卵、花粉或种子组织中的表型。

可以通过植物细胞培养领域中众所周知的方法由转化的植物细胞再生转基因植物。使用土壤杆菌属转化法形成的转基因植物一般包含插入一个染色体内的单个简单重组DNA序列，且称为转基因事件。此种转基因植物对于插入的外源序列可以称为杂合的。可以通过使包含关于其自身的单个外源基因序列的独立的分离子转基因植物如F0植物有性交配(自交)以生产F1种子来获得就转基因而言纯合的转基因植物。产生的F1种子有四分之一就转基因而言将是纯合的。F1种子发芽导致可以就接合性进行测试的植物，一般使用允许区分杂合子和纯合子的SNP测定或热扩增测定(例如接合性测定)。

可以使用许多鉴定序列，例如其表达可以导致可见表型的基因，包括gus、gfp和luc的使用(参见例如，Ow等人，1986；WO 97/41228和美国专利6,583,338；例如M26194；M15077)。还可以采用导致“皱缩”种子表型的果聚糖蔗糖酶基因sacB(Caimi等人，1996；例如X02730)或导致发芽抑制的焦磷酸酶基因(Hajirezaei等人，1999)。编码八氢番茄红素合酶的基因(crtB)是本领域已知的，尤其包括来自噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)(例如Misawa等人，1990；Sandmann和Misawa，1992；美国专利5,429,939；6,429,356)，和成团泛菌(Pantoea)/成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)(例如GenBank M38423；M87280)的那些。导致橙色着色的crtB的种子特异性表达已得到描述(Shewmaker等人，1999；美国专利6,429,356)。

产生多效性种子表型的大多数转基因可以用作与选择标记连接的可见标记基因，以鉴定无标记目的基因阳性种子。可见表型可以通过转基因的异位超表达来产生，或起因于通过反义RNA、RNA干扰或共抑制技术下调内源代谢途径基因。

提供下述定义和方法以更好地定义本发明且在本发明的实践中指导本领域普通技术人员。除非另有说明，术语应根据相关领域普通技术人员的常规使用进行理解。在分子生物学中的常用术语的定义还可以在Rieger等人(1991)；和Lewin(1994)中找到。使用如在37CFR§1.822下阐述的关于DNA碱基的命名法。

“CP4”、“aroA：CP4”、“AGRTU.aroA：CP4”、“CP4EPSPS”和“EPSPSCP4”指由根癌土壤杆菌(AGRTU)菌株CP4纯化的EPSP合酶基因或蛋白质，当在植物中表达时，其赋予对于草甘膦和包含草甘膦的除草剂制剂的耐受性(整体引入本文作为参考的美国专利号5,633,435)。基因序列可以是天然的或对于在植物中增强的表达进行修饰。

DNA“区段”指DNA构建体的DNA序列的区域。DNA区段可以在用于土壤杆菌属介导的植物细胞转化的构建体中发现的T-DNA分子之内、之间或侧面。例如，DNA区段可以包含用于在细菌中的质粒复制的遗传元件，或设计用于在植物细胞转化中使用的DNA构建体的其他各种元件和表达盒。因此，“DNA盒”可以包含DNA区段，包括用于在细胞中表达DNA序列的一种或多种元件。

“融合蛋白”指作为单个单位表达，仍产生赋予由非融合起始基因序列编码的蛋白质表型的基因产物的翻译融合物。

“分离的”核酸通过常规核酸纯化法与其中核酸天然存在的生物细胞中的其他核酸序列基本上分开或纯化，即其他染色体和染色体外DNA和RNA。该术语还包含重组核酸和化学上合成的核酸。

术语“草甘膦抗性基因”指任何基因，当作为转基因在植物中表达时，其赋予耐受否则将损害或杀死植物的除草剂草甘膦水平的能力。技术人员已知的任何草甘膦耐受性基因都适合于用于实践本发明。草甘膦(包括任何除草剂活性形式的N-膦酰甲基甘氨酸及其任何盐)抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。多种天然和变体EPSPS酶已在转基因植物中进行表达以赋予草甘膦耐受性，其中任何一种都可以用于本发明中。这些EPSPS中的一些的例子包括依照下述专利描述和/或分离的那些：美国专利号4,940,835，美国专利号4,971,908，美国专利号5,145,783，美国专利号5,188,642，美国专利号5,310,667和美国专利号6,803,501。它们还可以衍生自结构上不同种类的非同源EPSPS基因，例如从土壤杆菌属物种菌株CP4中分离的II类EPSPS基因(AGRTU.aroA：CP4)。

术语“鉴定序列”指编码赋予可检测表型的产物或者细胞或种子代谢的其他产物的核酸，所述可检测表型例如种子或配子颜色、不透明度或半透明度、荧光、纹理、大小、形状、发芽力或生存力中的变化。鉴定序列可以包括可以经由下调另一种基因的表达，例如经由RNAi介导的过程赋予表型的核苷酸序列(例如基因片段)。在某些实施方案中，鉴定序列包括筛选基因例如gusA、gfp或crtB基因。在具体实施方案中，鉴定序列包括来自草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)编码八氢番茄红素合酶的crtB基因(成团泛菌(Pantoea agglomerans)；引入本文作为参考的GenBank M38423；和美国专利号5,429,939，6,429,356)。鉴定序列与植物选择、筛选和/或可评分标记基因物理连接，例如编码抗生素抗性或除草剂耐受性的标记基因。鉴定序列可以在种子中赋予可检测(例如，筛选或选择)表型。

当第一种核酸序列置于与第二种核酸序列的功能关系中时，第一种核酸序列与第二种核酸序列“可操作地”关连或“连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子与蛋白质编码序列可操作地连接。一般地，可操作地连接的DNA序列是邻接的，并且当必需连接2个蛋白质编码区时，在相同读框中。

术语“植物”包含任何高等植物及其后代，包括单子叶植物(例如，百合、玉米、稻、小麦、大麦等)，双子叶植物(例如，大豆、棉花、番茄、低芥酸菜子、马铃薯、鼠耳芥属、烟草等)，裸子植物(松、冷杉、雪松等)，且包括植物的部分，包括植物的繁殖单位(例如，种子、鳞茎、块茎、或植物可以由其繁殖的其他部分或组织)，果实，花等。

“重组”核酸通过2种否则分开的基因区段的人工组合进行制备，例如通过化学合成或通过经由基因工程技术操纵核酸的分离区段。

术语“DNA构建体”或“DNA载体”指任何质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体、或衍生自任何来源的其他环状单链或双链DNA或RNA，其包括一种或多种DNA序列，例如启动子、蛋白质编码序列、3′非翻译区等，其已通过重组DNA技术以功能操作方式进行连接。用于植物转化的重组DNA载体是能够在细菌细胞中复制的常用的双链环状质粒。用于制备和使用重组核酸构建体的常规组合物和方法是众所周知的，例如尤其是Sambrook等人，1989；和Ausubel等人，1992(含定期更新)和Clark等人(1997)。

术语“启动子”或“启动子区”指通常在编码序列的上游(5′)发现的核酸序列，其通过提供关于RNA聚合酶的识别位点和/或在正确位点上的转录起始所需的其他因子，通过控制信使RNA(mRNA)的生产来控制编码序列的表达。如本文所预期的，启动子或启动子区包括借助于与各种调节序列连接、随机或控制的诱变和增强子序列的添加或重复而获得的启动子变异。当作为合适的重组载体的部分引入宿主内时，启动子区负责驱动在其控制下的编码序列的转录，如通过其产生mRNA的能力证实的。

“再生”指由植物细胞(例如，植物原生质体或外植体)生长植物的过程。

“选择标记”指其表达赋予促进包含核酸序列的细胞鉴定的表型的核酸序列。选择标记包括赋予对于毒性化学药品的抗性(例如抗生素抗性)、或赋予视觉区别特征(例如颜色变化或荧光)的那些。

有用的显性植物选择标记基因尤其包括编码抗生素抗性基因(例如对于潮霉素、咪唑啉酮、卡那霉素、博来霉素、G418、链霉素或壮观霉素的抗性)；和除草剂抗性基因(例如膦丝菌素乙酰转移酶、改良的ALS、BAR、改良的I类EPSPSs、II类EPSPSs、DMOs)的基因。

术语“可评分标记基因”或“筛选标记基因”内包括的是编码可分泌标记的基因，所述可分泌标记的分泌可以作为鉴定或选择转化细胞的手段进行检测。例子包括编码可以通过抗体相互作用鉴定的可分泌抗原的标记，或甚至可以催化检测的可分泌的酶。可分泌蛋白质分成众多种类，包括可检测(例如，通过ELISA)的小型、可扩散蛋白质，在细胞外溶液中可检测的小型活性酶(例如α-淀粉酶、β-内酰胺酶、膦丝菌素乙酰转移酶)，或在细胞壁中插入或捕获的蛋白质(例如，包括前导序列的蛋白质，例如在延长的表达单位中发现的那种或烟草PR-S)。其他可能的选择和/或筛选标记基因对于本领域技术人员将是显而易见的。

“T-DNA”指经由土壤杆菌属或其他根瘤菌介导的转化法整合到植物基因组内的DNA分子。T-DNA分子的至少一个末端侧面为来自土壤杆菌属Ti或Ri质粒的T-DNA的至少一个边界区。这些边界区一般称为右边界(RB)和左边界(LB)区，并且依赖于其来源(例如土壤杆菌属的胭脂氨酸或章鱼氨酸生产菌株)作为核苷酸序列和长度中的变化而存在。在设计用于将转基因转移到植物内的DNA构建体中常用的边界区长度通常为几百个多核苷酸并且包括切口位点，其中衍生自Ti或Ri辅助质粒的virD2内切核酸酶消化DNA且在T链形成后与5′末端共价附着，以指导T链整合到植物的基因组内。T-DNA分子一般包含一个或多个植物表达盒。

术语“转基因”指转化到所述细胞或生物内的对于细胞或生物非天然的任何核酸序列。“转基因”还可以指通过修饰编码序列或调节序列异位表达的任何内源序列。“转基因”还包含通过经由定向重组插入非天然或天然核酸序列进行修饰的天然植物基因的构成部分。

实施例

本领域技术人员将理解由本发明提供的方法和组合物的许多优点。包括下述实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解下述实施例中公开的技术表示由本发明人发现在本发明的实践中良好起作用的技术，并且因此可以视为构成用于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解可以在不背离本发明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方案中进行许多变化且仍获得相同或相似结果。本文引用的所有参考文献都引入本文作为参考，其程度至它们补充本文采用的方法、技术或组合物，解释本文采用的方法、技术或组合物，提供关于本文采用的方法、技术或组合物的背景，或教导本文采用的方法、技术或组合物。

实施例1

具有鉴定序列和标记基因以及目的基因的2T-DNA载体的制备

根据标准分子克隆程序(Sambrook等人，1989)构建2种T-DNA植物表达载体，pMON67465，pMON101338和pMON101339(图1)。一种T-DNA包括与编码对于卡那霉素的抗性的nptII基因可操作地连接的CaMV 35S启动子，和与GUS报道基因可操作地连接的CaMV 35S启动子。另一种T-DNA包含赋予草甘膦抗性的油菜籽蛋白：ctp-crtB：油菜籽蛋白3’盒和35S：ctp：CP4EPSPS盒。具有oriV复制起点的pMON67465中的crtB由来自欧洲油菜(Brassica napus)的1.8kb种子特异性油菜籽蛋白启动子和1kb油菜籽蛋白终止子驱动。具有oriV复制子的pMON101338和具有pRi复制起点的pMON101339中的crtB由较短形式的油菜籽蛋白启动子(1kb)和终止子(0.3kb)驱动。编码来自欧文氏菌属物种(Erwinia sp.)的八氢番茄红素合酶的crtB基因对于大豆种子赋予橙色，而不影响转化频率(图3)。

实施例2

用pMON67465转化和再生大豆外植体

大豆(cv.A3244)组织经由土壤杆菌属介导的方法用pMON67465(图1)进行转化，基本上如先前所述(引入本文作为参考的美国专利6,384,301)。简言之，使手工切断的大豆分生组织外植体与土壤杆菌属于23℃共培养2-4天，转移到WPM固体培养基上，在PLANTCON中用75μM草甘膦选择，并且在16/8光/暗周期下于28℃进行培养。2周后，将外植体转移至新鲜WPM培养基且培养直至茎干收获。2个月后，切割具有真正三叶的茎干且在BRM生根培养基上培养2-4周。生根小植株在温室中生长用于种子成熟。在分析的40个事件中，72.5％显示出用2种T-DNAs的共转化。40个事件的45％包含nptII和gus基因。进一步分析包含来自pMON67465的T-DNAs的事件A33908。

通过将质粒再次转化到相同栽培种A3244内获得具有质粒pMON67465的另外事件，并且获得13个转基因品系，其转化频率为0.22％。在经由PCR就gus或CP4标记基因的存在或不存在分析正常外观种子后，13个品系中的7个是目的基因阳性和无标记的(图6)。来自R0植物的橙色种子也通过PCR就crtB基因和CP4标记基因的存在进行分析。发现除3种外的所有橙色种子对于crtB和CP4是阳性的(图7)，而正常外观种子(图7，白色细胞)无一包含CP4或crtB基因，这指出crtB表型与CP4选择标记基因紧密连锁。

因此，具有鉴定序列包括与选择标记基因连接的筛选基因的2T-DNA构建体的使用允许更有效筛选和选择转基因事件，其包含目的基因同时缺乏编码选择标记的序列。图8中发现用于鉴定后代种子的基于连锁-DNA印迹的方法(“标准2T”)和基于标记的(即，基于鉴定序列的)筛选之间的示例性比较，在所述后代种子中目的基因和选择标记已独立分离。鉴定序列法的使用允许筛选更多转基因事件和每个事件的更多后代，以鉴定对于进一步分析有用的后代。

实施例3

在大豆事件A33908和R1后代种子中的CrtB/GUS/CP4表达

来自事件A33908的组织的目测(图2)指出茎和幼年展开的叶显示出橙色脱落。叶和根组织在CrtB表达植物中则是表型正常的。来自R0植物的种子(即，R1代)的种皮显示出少量的CrtB表达，而A33908衍生种子的子叶显示出独特的橙色并且某些具有起皱表型(图3)。

使来自事件A33908的12粒未成熟的R1种子与种皮切开，且实施CP4-EPSPS ELISA以及CrtB和GUS视觉分析(图4)。CrtB、GUS和CP4-EPSPS表型的分离是明显的。9/12种子在所有3种测定中都是阳性的。1/12种子是CrtB和CP4-EPSPS阳性但GUS阴性的，显示出pMON67465的2种T-DNAs的分离，伴随gus基因的丧失。2/12种子是CP4-EPSPS ELISA阴性的。这些种子中的2粒是CrtB阴性和GUS阳性的，从而证实鉴定序列(crtB)和选择标记CP4-EPSPS基因之间的连锁，以及这些转基因基因座与gus基因座的分离。分离种子中的表型比率与2个显性基因座的孟德尔分离一致。

实施例4

R1种子视觉分析

来自A33908的成熟种子就颜色、大小和形状进行视觉分析(图5)。可见(i)无标记正常(例如黄色和光滑的)；(ii)橙色和光滑的；以及(iii)橙色和皱缩种子的混合物。

实施例5

GUS阳性种子的PCR分析

INVADER PCR(例如Mein等人，2000)用于跟踪由pMON67465递送的CP4-EPSPS、crtB和gus基因在转基因大豆植物的种子中的分离。确定事件A33908包含单拷贝的CP4-EPSPS标记基因和单拷贝的NPTII基因。橙色：正常种子的分离遵循事件A33908中预期的3∶1比(表1)。

表1：转基因植物的后代的表型和基因型

实施例6

ATP PFK作为鉴定序列的使用

对于富含淀粉的谷粒包括玉米，可以利用导致皱缩或取消的种子发育的表型的糖/淀粉代谢的处理。在玉米穗中sacB的种子特异性表达(Caimi等人1996)或酵母ATP依赖性果糖磷酸激酶(ATP PFK；例如GenBank登记NC 003423，碱基2297466..2300294)的种子特异性表达导致取消的仁发育(图12)。包含CP4选择标记和ATP-PFK的构建体pMON99575可以直接用于与包含目的基因的一种T-DNA构建体的共转化，其通过使各自包括这些构建体之一的2种土壤杆菌属菌株的细胞混合，且用混合的细菌培养物转化植物细胞来实现。可替代地，可以将种子特异性表达ATP-PFK盒亚克隆到2T-DNA构建体内作为鉴定序列，用于无标记种子的有效鉴定。包含这种基因的仁是极端皱缩的且不发芽。只有无鉴定序列和无标记基因的仁显示出正常外观。

实施例7

涉及卟啉合成的基因作为鉴定序列的使用

当在大肠杆菌(E.coli)、酵母和CHO细胞中超表达时，S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性尿卟啉原III(uro’gen)甲基转移酶(SUMT)产生鲜红色荧光卟啉样(porphyrinoid)化合物。这种性质已使得能够视觉选择转化的大肠杆菌菌落(Rossner&Scott 1995)，和自动化分选转化的酵母和CHO细胞(Wildt&Deuschle 1999)。这种荧光是二和三甲基化的uro’gen(dihydrosirohydrochlorin和trimethylpyrorocorphin)的细胞内积聚的结果，这2者都是在卟啉合成途径中发现的化合物(即，叶绿素和钴胺素)。

用来自费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)的编码SUMT的cobA(GenBank登记U13043；引入本文作为参考)转化的细胞产生荧光信号，其中吸光度峰值在384nm和500nm处，连同在605nm处的发射谱带。由cobA uro’gen甲基转移酶产生的荧光卟啉样具有用于制备植物材料的良好的光谱标记。在384或500nm处的激发避免强叶绿素吸收并且容易检测所得到的红色发射，因为它具有相当大的斯托克斯(Stokes)移动(从500nm吸收起源)，但不与在远红外(far red)中的叶绿素自身荧光重叠(Haseloff，1999)。

玉蜀黍SUMT(GenBank D83391)、鼠耳芥属Upml(GenBankL47479)和大肠杆菌CysG(GenBank X14202)蛋白质的羧基末端明显类似于由菲氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)(cobA)、脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)(cobA；GenBank M59236)和集胞蓝细菌属物种(Synechocystis sp.)(以前的巢状组囊蓝细菌(Anacystis nidulans)GenBank X70966)的基因编码的蛋白质，各自引入本文作为参考(Sakakibara等人1996)，并且可以类似使用。

包括具有仁表达的启动子和编码CobA或具有SUMT活性的类似蛋白质的基因的构建体，允许例如通过就玉米种子中的可见红色荧光(的缺乏)筛选使用此种基因作为鉴定序列。已报道植物赛罗血红素(siroheme)合酶位于叶绿体中(Leustek等人，1997)。因此，卟啉生物合成基因作为鉴定序列的使用可以包括叶绿体转运肽的使用，以使基因产物导向叶绿体。构建体可以直接用作鉴定序列，且包含此种鉴定序列和选择标记的T-DNA可以例如与包含含有目的基因的T-DNA的第二种构建体共转化，其通过使各自包括这些构建体之一的2种土壤杆菌属菌株混合，且用混合的细菌培养物转化植物细胞来实现。SUMT表达盒还可以由本领域技术人员容易地亚克隆到其他2T-DNA载体内，或设计用于在微粒介导的转化中使用的载体内，且作为鉴定序列使用。

实施例8

使用基因沉默以产生可检测种子表型

置于标记基因盒的内含子内的反向重复可以导致植物细胞中有效的基因沉默。这详细公开于美国申请公开号2006/0200878中(例如，图7、8、9，引入本文作为参考)。为了测试由置于内含子内的反向重复编码的dsRNA是否能够引发基因沉默，将～400bp的萤光素酶基因(SEQ ID NO：1)区段的反向重复置于EPSPS-CP4基因盒(pMON73874)中的稻肌动蛋白1启动子的内含子内，并且测试构建体在玉米叶原生质体的瞬时转化中抑制萤光素酶基因的能力。作为对照，测试相似的质粒，除了对照质粒具有GUS基因而不是萤光素酶基因区段的反向重复(pMON73875)。最后，作为另外的对照，还使用除了它没有反向重复外相同的pMON25492(图13)。

当这3种质粒在玉米叶原生质体瞬时基因沉默系统中进行测试，就萤火虫萤光素酶的抑制测试且对于RENILLA萤光素酶(Promega Corp.，Madison，WI)内部对照的表达标准化时，观察到相对于对照pMON73875和pMON25492，具有编码在内含子内的反向重复的dsRNA的质粒(pMON73874)能够抑制萤光素酶(图14)。使该实验重复第2次，得到类似结果。

为了测试经由基因沉默法是否能够产生玉米仁表型，制备设计为抑制Waxy基因的构建体。pMON81990包含Waxy基因的部分的反向重复。包含pMON81990的转基因玉米植物显示出在至少65％的独立R0植物中的Waxy基因的沉默，如通过用碘使花粉和仁染色就淀粉生产测定的。在比较中，包含表达Waxy的有义片段的pMON81993的植物不显示出Waxy基因的有效沉默。

还证实了编码玉米醇溶蛋白(种子贮藏蛋白)的基因的沉默，其导致可见表型。pMON73567包含编码在玉米仁中的α-玉米醇溶蛋白的基因序列的反向重复。反向重复的转录导致这些基因的沉默，从而减少在测试的29棵R0植物中的26棵中的19kD和22kDα-玉米醇溶蛋白水平。图15证实起因于用这种dsRNA编码序列转化的细胞的仁具有明显的可见表型，其中具有减少的玉米醇溶蛋白的仁比野生型仁更不透明。

因此，包埋在标记基因的内含子中的dsRNA编码序列可以用作根据本发明的鉴定序列。包含例如草甘膦抗性基因例如CP4EPSPS作为选择标记和在选择标记基因的内含子中的此种dsRNA编码序列的构建体，可以直接用于与包含目的基因的一种T-DNA构建体的共转化，其通过使各自包括这些构建体之一的2种土壤杆菌属菌株的细胞混合，且用混合的细菌培养物转化植物细胞来实现。可替代地，可以将dsRNA编码盒亚克隆到2T-DNA构建体内作为鉴定序列，用于无标记种子的有效鉴定。本领域技术人员还可以设计用于在微粒轰击介导的植物细胞转化中使用的类似构建体。

实施例9

KAS4作为鉴定序列的使用

二元载体pMON83530(图16)包含由大豆USP88启动子(例如美国专利7,078,588)驱动的KAS4(a-酮-乙酰基-ACT合酶；GenBank登记AF060518)，其中CP4植物表达盒在相同T-DNA上作为选择标记。KAS4基因的种子特异性表达导致皱缩的种子，其可与不包含该基因的正常种子容易地区分开(图17)。该构建体可以直接用作鉴定序列，并且包含此种鉴定序列和选择标记的T-DNA可以与包含含有目的基因的T-DNA的第二种构建体共转化，其通过使各自包括这些构建体之一的2种土壤杆菌属菌株混合，且用混合的细菌培养物转化植物细胞来实现。

如pMON107314中所示(图18)，KAS4表达盒还存在于2T-DNA质粒中，其中一种T-DNA包含splA基因(来自根癌土壤杆菌的蔗糖磷酸化酶；GenBank登记AE009432)作为鉴定序列和标记基因，并且另一种T-DNA可以包含目的基因，如通过本领域技术人员已知的常规克隆法构建的。2T-DNA质粒随后可以用于例如大豆转化。基于由鉴定基因提供的表型，鉴定基因用于选择无标记基因的种子。

实施例10

splA基因作为鉴定序列的使用

二元载体pMON68581(图19)包含由大豆7Sα启动子(例如GenBankM13759；Doyle等人，1986)驱动的splA(来自根癌土壤杆菌的蔗糖磷酸化酶；GenBank登记AE009432)，其中CP4植物表达盒在相同T-DNA上作为选择标记。splA基因的种子特异性表达导致皱缩的种子，其可与不包含该基因的正常种子容易地区分开(图20)。该构建体可以直接用作鉴定序列，并且包含此种鉴定序列和选择标记的T-DNA可以与包含含有目的基因的T-DNA的第二种构建体共转化，其通过使各自包括这些构建体之一的2种土壤杆菌属菌株混合，且用混合的细菌培养物转化植物细胞来实现。splA表达盒还可以通过本领域技术人员已知的常规克隆法容易地亚克隆到2T-DNA载体内，其中一种T-DNA包含splA基因作为鉴定序列和标记基因，并且另一种T-DNA包含目的基因。2T-DNA质粒随后可以用于例如大豆转化。基于由鉴定序列提供的表型表型，鉴定序列用于选择无选择或筛选标记基因的种子。

实施例11

几种鉴定序列在生产无标记玉米种子中的使用

构建多种2T-DNA植物表达载体。如下表中所示，在每种构建体中，第一种T-DNA区段包含植物可表达的uidA转基因作为目的核酸的例子，且第二种T-DNA区段包含植物可表达的CP4 EPSPS转基因作为选择标记和鉴定序列。设计用于在单子叶植物中表达的crtB的序列通过本领域已知的方法进行制备(例如通过如SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3中发现的密码子最优化)。pMON68412包含SEQ ID NO：3。第一种T-DNA侧面为右和左边界，而第二种T-DNA位于载体主链中，通常称为串联形式的2T-DNA形式(Huang等人，2005)。玉米组织通过本领域已知的方法用每一种构建体进行分开转化。下表2中指出了对于每一种鉴定基因的预期表型。用于在胚乳中表达鉴定序列的可替代启动子包括来自稻的谷蛋白1启动子、来自玉米的waxy启动子和来自玉米的brittle2启动子。

表2：对于给定鉴定序列预期的示例性表型。

根据本公开内容，无需过度实验即可制备和执行本文公开和要求保护的所有组合物和方法。尽管本发明的组合物和方法已就前述实施方案和举例说明性实施例而言进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，即可对本文描述的组合物、方法以及方法的步骤或步骤的顺序应用变更、变化、修饰和改变。更具体而言，显而易见的是化学和生理学相关的某些试剂可以替代本文描述的试剂，同时将达到相同或相似结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此种相似替代和修饰视为在如由附加权利要求定义的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

下述参考文献特别引入本文作为参考，其程度至它们提供补充本文所述那些的示例性程序或其他细节。

美国专利4,940,835；美国专利4,940,838；美国专利4,946,046；美国专利4,971,908；美国专利5,015,580；美国专利5,145,783；美国专利5,188,642；美国专利5,302,523；美国专利5,310,667；美国专利5,362,865；美国专利5,384,253；美国专利5,429,939；美国专利5,464,763；美国专利5,464,765；美国专利5,508,184；美国专利5,538,880；美国专利5,545,816；美国专利5,550,318；美国专利5,563,055；美国专利5,591,616；美国专利5,633,435；美国专利5,693,512；美国专利5,731,179；美国专利5,824,877；美国专利5,859,347；美国专利5,981,840；美国专利6,160,208；美国专利6,307,123；美国专利6,326,527；美国专利6,384,301；美国专利6,399,861；美国专利6,403,865；美国专利6,429,356；美国专利6,433,252；美国专利6,458,594；美国专利6,583,338；美国专利6,803,501；美国专利6,825,398；美国专利7,078,588；美国专利7,119,187；美国专利7,151,204。

U.S.Pub.20030110532；U.S.Pub.20030229918；U.S.Pub.20040237142；U.S.Pub.20060041956；U.S.Pub.20060064772；U.S.Pub.20060200878

PCT Appln.WO 00/018939

PCT Appln.WO 97/41228

An et al.，Plant Physiol.，88：547，1988.

An et al.，The Plant Cell，1：115，1989.

Anderson et al.，Gene 97：199-205，1991.

Ausubel et al.，In：Current Protocols in Molecular Biology，John，Wiley & Sons，Inc，New York，1992.

Baerson et al.，Plant Mol.Biol.，22(2)：255-267，1993.

Belanger and Kriz，Genet.，129：863-872，1991.

Bohlmann et al.，Plant J.，7(3)：491-501，1995.

Breitler et al.，Transgenic Res，.13：271-287，2004.

Broothaerts et al.，Nature 433：629-633，2005.

Bustos et al.，Plant Cell，1：839-853，1989.

Caimi et al.，Pl.Physiol.110：355-363，1996

Callis et al.，Plant Physiol.，88：965，1988.

Carmi et al.Planta，217：726-735，2003.

Chen et al.，Dev.Genet.，10：112-122，1989.

Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：8560-8564，1986.

Clark et al.，In：Plant Molecular Biology，A Laboratory Manual，Springer，NY，1997.

Clark et al.，Plant Mol.Biol.，16(6)：1099-1101，1991.

Coruzzi et al.，EMBO J.，3：1671-1679，1984.

Dale et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10558-10562，1991.

Daley et al.，Plant Cell Reports，17：489-496，1998.

De Neve et al.，Plant J.，11：15-29，1997.

de Vetten et al.，Nat.Biotechnol.21：439-442，2003.

DeBlock et al.，Theor.Appl.Genet.，82：257-263，1991.

Dekeyser et al.，Plant Cell，2(7)：591-602，1990.

della-Cioppa et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：6873-6877，1986.

Dellaporta et al.，Stadler Symposium，11：263-282，1988.

Depicker et al.，Mol.Gen.Genet.，201：477-484，1985.

Dinkova et al.Plant J.41：722-31，2005.

Doyle et al.，J.Biol.Chem.261：9228-9238，1986.

Ebinuma et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：2117-2121，1997.

Elliot et al.，Plant cell Rep.，18：707-714，1999.

Eyal et al.，Plant Cell，7：373-84，1995.

Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4803-4807，1983.

Framond et al.，Mol.Gen.Genet.202：125-131，1986.

Fromm et al.，Plant.Cell，1(10)：977-84，1989.

Gallie et al.，The Plant Cell，1：301-311，1989.

Gardiner et al.，Plant Physiol.，134：1317-1326，2004.

Gasser et al.，J.Biol.Chem.，263：4280-4287，1988.

Gelvin et al.，In：Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990.

Giroux et al.，Plant Physiol.，106：713-722，1994.

Gordon-Kamm，et al.，Plant Cell 2：603-618，1990.

Gruber et al.，In：Vectors for Plant.Transformation，Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，Glick and Thompson (Eds.)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，89-119，1993.

Hajirezaie et al.，Potato Res.42：353-372，1999.

Halpin，Pl.Biotechnol.J.3：141-155，2005.

Hanson et al.，Plant.J.19：727-734，1999.

Hare and Chua，Nature Biotechnol.20：575-580，2002.

Haseloff，Methods in Cell Biology，V58：139-151，1999，

Heim and Tsien，Curr.Biol.，6(2)：178-182，1996.

Himi et al.Genome 48：747-754，2005.

Hong et al.，Plant Mol.Biol.，34(3)：549-555，1997.

Horsch et al.，Science，227：1229，1985.

Huang et al.，Transgenic Research，13：451，2004.

Ikatu et al.，Bio/Technol.，8：241-242，1990.

Jefferson et al.，EMBO J.，6：3901-3907，1987b.

Jefferson et al.，Plant Mol.Biol，Rep.，5：387-405，1987a.

Jofuku et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA，102：3117-3122，2005

Kaeppler et al.，Plant Cell Reports，9：415-418，1990.

Katz et al.，J.Gen.Microbiol.，129：2703-2714，1983.

Klee et al.，Mol.Gen.Genet.，210：437-442，1987.

Kobayashi et al.Planta，215：924：933，2002

Kohno-Murase et al.，Plant Mol.Biol.，26：1115-1124，1994.

Komari et al.，Plant J.，10：165-174，1996.

Kononov et al.，Plant J.11：945-957，1997.

Kridl et al.，Seed Sci.Res.，1：209：219，1991

Kuhlemeier et al.，Plant Cell，1：471，1989.

Leustek et al.，J.Biol.Chem.，272：2744-2752，1997.

Lewin，In：Genes V，Oxford University Press，NY，1994.

Ludwig et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：7092，1989.

Marcotte et al.，Plant Cell，1：969，1989.

Mazur，et al.，Nucleic Acids Res.，13：2373-2386，1985.

McKnight et al.，Plant Mol Biol.，8：439-445，1987.

Mein et al.，.Genome Res，10：330-343，2000.

Mendoza et al.FEBS Letters，579：4666-4670，2005.

Miki et al.，In：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick andThompson(Eds.)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993.

Miki and McHugh，J.Biotechnol.，107：193，2004.

Misawa et al.，J.Bacteriol.，172：6704-6712，1990.

Mizukami and Fisher，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：942-947，2000.

Moloney et al.，Plant Cell Reports，8：238，1989.

Morello et al.Transgenic Res.9：453-462，2000.

Odell et al.，Nature，313：810-812，1985.

Okagaki，Plant Mol.Biol.，19：513-516，1992.

Okita et al.，J Biol Chem.264：12573 1989.

Omirulleh et al.，Plant Mol.Biol.，21：415-28，1993.

Ow et al.，Science，234：856-859，1986.

Pang et al.，Plant Physiol.，112：893-900，1996.

Padgette，et al.，Crop Sci.35：1451-1461，1995.

Pedersen et al.，Cell，29：1015-1026，1982.

Petit et al.，Mol.Gen.Genet.，202：388-393，1986.

Poirier et al.，Theor.Appl.Genet.，100：487-493，2000.

Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.，199：183-188，1985.

Puchta，Pl.Cell Tiss.Org.Cult.74：123-143，2003.

Radchuk et al.，Plant Physiol.，140：263-278，2006.

Rieger et al.，In：Glossary of Genetics：Classical and Molecular，5th Ed.，Springer-Verlag，NY，1991.

Riggs et al.，Plant Cell，1(6)：609-621，1989.

Roshal et al.，EMBO J.，6：1155，1987.

Rossner and Scott，Bio Techniques，V19(5)：760-764，1995.

Rotino et al.Nat.Biotechnol.15：1398-141，1997.

Russell and Fromm，Transgenic Res.，6：157-68，1997.

Sakakibara et al.，Plant J.，V10(5)：883-892，1996.

Sambrook et al.，In：Molecular cloning：a laboratory manual，2nd Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989.

Sandmann and Misawa，FEMS Microbiol Lett.，69(3)：253-257，1992.

Sato et al.，Crop Sci.44：646-652，2004.

Schaffner and Sheen，Plant Cell，3：997，1991.

Schellmann et al.，EMBO J.21，5036-5046，2002.

Schernthaner et al.，EMBO J.，7：1249，1988.

Schruff et al.Development，133：251：261，2006.

Scutt et al.，Biochimie 84：1119-1126，2002.

Selinger et al.Genetics，149：1125-1148，1998.

Shewmaker et al.，Plant J.，20(4)：401-412，1999.

Shure et al.，Cell 35：225-233，1983.

Siebertz et al.，Plant Cell，1：961，1989.

Simpson et al.，EMBO J.，4：2723，1985.

Slocombe et al.，Plant Physiol.，104(4)：167-176，1994.

Stacey et al.，Plant Mol.Biol.，31：1205-1216，1996

Sutcliffe et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：3737-3741，1978.

Terada et al.，Mol.Gen.Genet.，220：389-392，1990.

Thornburg et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，744-748，1987.

Toro et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8558-8562，1989.

Walker et al，Plant Biotechnol J.5：413-21，2007.

Wildt and Deuschle，Nature Biotechnology，V17：1175-1178，1999

Xing et al.，In Vitro Cell Devel.Biol.Plant 36：456-463，2000.

Yang et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：4144-4148，1990.

Yoder et al.，Bio/Technology 12：263-268，1994.

Zheng et al.，Mol.Cell Biol.，13：5829-5842，1993.

Zhou et al.，Acta Botanica Sinica 45：1103-1108，2003.

Zukowsky et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：1101-1105，1983.

序列表

<110>YE，XUDONG

     PETERSEN，MICHAEL W.

     HUANG，SHIHSHIEH

     CHOMET，PAUL S.

     WALTERS，DAVID

     JOHNSON，SUSAN

     GILBERTSON，LARRY

<120>用于获得无标记转基因植物的方法和组合物

<130>MONS：103WO

<140>UNKNOWN

<141>2007-05-11

<150>60/799,875

<151>2006-05-12

<160>3

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1048

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工引物

<400>1

ccacaccctt aggtaaccca gtagatccag aggaattcat tatcagtgca attgttttgt       60

cacgatcaaa ggactctggt acaaaatcgt attcattaaa accgggaggt agatgagatg      120

tgacgaacgt gtacatcgac tgaaatccct ggtaatccgt tttagaatcc atgataataa      180

ttttctggat tattggtaat tttttttgca cgttcaaaat tttttgcaac ccctttttgg      240

aaacaaacac tacggtaggc tgcgaaatgt tcatactgtt gagcaattca cgttcattat      300

aaatgtcgtt cgcgggcgca actgcaactc cgataaataa cgcgcccaac accggcataa      360

agaattgaag agagttttca ctgcatacga cgattctgtg atttgtattc agcccatatc      420

gacgcgtgaa gacgccaaaa acataaagaa aggcccggcg ccattctatc ctctagagga      480

tggaaccgct ggagagcaac tgcataaggc tatgaagaga tacgccctgg ttcctggaac      540

aattgctttt acagatgcac atatcgaggt gaacatcacg tacgcggaat acttcgaaat      600

gtccgttcgg ttggcagaag ctatgaaacg atatgggctg aatacaaatc acagaatcgt      660

cgtatgcagt gaaaactctc ttcaattctt tatgccggtg ttgggcgcgt tatttatcgg      720

agttgcagtt gcgcccgcga acgacattta taatgaacgt gaattgctca acagtatgaa      780

catttcgcag cctaccgtag tgtttgtttc caaaaagggg ttgcaaaaaa ttttgaacgt      840

gcaaaaaaaa ttaccaataa tccagaaaat tattatcatg gattctaaaa cggattacca      900

gggatttcag tcgatgtaca cgttcgtcac atctcatcta cctcccggtt ttaatgaata      960

cgattttgta ccagagtcct ttgatcgtga caaaacaatt gcactgataa tgaattcctc     1020

tggatctact gggttaccta agggtgtg                                        1048

<210>2

<211>930

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工引物

<400>2

atgtcccagc ctcctctcct ggatcatgct acccaaacta tggctaacgg tagcaagtcc       60

ttcgctaccg ccgctaagct cttcgatcct gctactaggc gttccgtcct catgctgtac      120

acctggtgta ggcattgcga cgatgtgatc gacgatcaaa cccacggttt cgcgtccgag      180

gctgcggccg aggaagaggc gacccaaagg ctcgctcgcc tccgtaccct caccctcgcc      240

gctttcgagg gcgctgagat gcaagatcct gcgttcgccg ctttccaaga ggtcgccctc      300

acccacggca tcactccaag gatggccctg gaccacctgg acggtttcgc tatggacgtc      360

gcccaaactc gctacgtgac tttcgaggac actctccggt actgctacca tgtcgccggt      420

gttgtcggcc tcatgatggc gcgcgtcatg ggtgtccgcg acgagcgcgt cctcgacagg      480

gcttgcgacc tcggcctcgc gtttcagctt accaacattg ctagggacat catcgacgac      540

gctgcgatag ataggtgtta cctgcctgct gagtggcttc aggacgctgg tcttacgccc      600

gagaactacg ctgccaggga gaacagggct gcccttgcta gagtcgctga gcgtttgatc      660

gacgcggctg aaccctatta cattagctcg caagcgggtt tgcatgactt gcctccacgt      720

tgtgcgtggg ccattgcgac ggcgcgtagt gtttatcgtg aaattgggat caaggttaag      780

gccgctggag gatcagcatg ggaccggaga cagcatacgt ctaagggaga gaagatcgca      840

atgctaatgg cagctcccgg ccaagtcatc cgcgcaaaga caacgcgggt tacacccaga      900

ccagcgggct tatggcagcg accagtatga                                       930

<210>3

<211>930

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工引物

<400>3

atgtcccagc ctcctctcct ggatcatgct acccaaacta tggctaacgg tagcaagtcc       60

ttcgctaccg ccgctaagct cttcgatcct gctactaggc gttccgtcct catgctgtac      120

acctggtgta ggcattgcga cgatgtgatc gacgatcaaa cccacggttt cgcgtccgag      180

gctgcggccg aggaagaggc gacccaaagg ctcgctcgcc tccgtaccct caccctcgcc      240

gctttcgagg gcgctgagat gcaagatcct gcgttcgccg ctttccaaga ggtcgccctc      300

acccacggca tcactccaag gatggccctg gaccacctgg acggtttcgc tatggacgtc      360

gcccaaactc gctacgtgac tttcgaggac actctccggt actgctacca tgtcgccggt      420

gttgtcggcc tcatgatggc gcgcgtcatg ggtgtccgcg acgagcgcgt cctcgacagg      480

gcttgcgacc tcggcctcgc gtttcagctt accaacattg ctagggacat catcgacgac      540

gctgcgatag ataggtgtta cctgcctgct gagtggcttc aggacgctgg tcttacgccc      600

gagaactacg ctgccaggga gaacagggcc gcccttgcta gagtcgctga gcgtttgatc      660

gacgcggctg aaccctatta cattagctcg caagcgggtt tgcatgactt gcctccacgt      720

tgtgcgtggg ccattgcgac ggcgcgtagt gtttatcgtg aaattgggat caaggttaag      780

gccgctggag gatcagcatg ggaccggaga cagcatacgt ctaagggaga gaagatcgca      840

atgctaatgg cagctcccgg ccaagtcatc cgcgcaaaga caacgcgggt tacacccaga      900

ccagcgggct tatggcagcg accagtatga                                       930

Claims (38)

1.一种由转基因植物制备无标记种子的方法，其包括下述步骤：

a)获得包含第一种DNA区段和第二种DNA区段的转基因植物的种子，所述第一种DNA区段包含目的核酸，且所述第二种DNA区段包含与DNA盒物理连接的标记基因，所述DNA盒与在所述种子中有功能的启动子可操作地连接，其中所述DNA盒赋予改变的种子大小的视觉可检测表型；

b)就所述视觉可检测表型的不存在筛选所述种子；和

c)选择缺乏所述视觉可检测表型的至少第一个种子以获得无所述标记基因的种子。

2.权利要求1的方法，其中所述步骤c)进一步包括就所述目的核酸的存在测试所述种子且选择包含所述目的核酸的种子。

3.权利要求1的方法，其中所述标记基因是选择标记基因。

4.权利要求1的方法，其中所述标记基因是筛选标记基因。

5.权利要求4的方法，其中所述DNA盒编码与所述选择标记基因翻译或转录地融合的RNA。

6.权利要求1的方法，其中所述DNA盒包含编码反义或有义RNA的DNA，其使内源基因沉默以导致所述可检测表型。

7.权利要求6的方法，其中所述DNA盒包含与所述内源基因同源的一对反向重复的DNA片段。

8.权利要求7的方法，其中所述反向DNA片段重复包埋在所述标记基因内的内含子中。

9.权利要求1的方法，其中所述第一种DNA区段和第二种DNA区段重叠。

10.权利要求1的方法，其中在步骤c)中选择的所述种子缺乏所述标记基因和DNA盒。

11.权利要求1的方法，其中用在分开的DNA构建体上的第一种和第二种DNA区段共转化所述转基因植物或其任何前代的祖先。

12.权利要求1的方法，其中所述第一种和第二种DNA区段由不同的T-DNA边界序列限制范围。

13.权利要求12的方法，其中步骤a)包括用包含所述第一种和第二种DNA区段的单个DNA构建体转化所述转基因植物或其任何前代的祖先。

14.权利要求1的方法，其中通过用DNA构建体转化植物或其任何前代的祖先来生产所述转基因植物，所述DNA构建体包含(i)包含目的核酸的侧面为左和右T-DNA边界的所述第一种DNA区段，和(ii)侧面为第二组左和右T-DNA边界的所述第二种DNA区段，其中所述第二种DNA区段进一步包含与在所述转基因植物中有功能的启动子可操作地连接的标记基因。

15.权利要求1的方法，其中所述第一种和第二种DNA区段在所述转基因植物中不遗传连锁。

16.权利要求1的方法，其中所述第一种和第二种DNA区段在所述转基因植物中遗传连锁。

17.权利要求1的方法，其中通过经由选自土壤杆菌属、根瘤菌属、中生根瘤菌属或中华根瘤菌属的细菌菌株介导的转化，通过将所述第一种和第二种DNA区段引入所述植物或其任何前代的祖先内来生产所述转基因植物。

18.权利要求1的方法，其中经由微粒轰击通过将所述第一种和第二种DNA区段引入所述植物或其任何前代的祖先来生产所述转基因植物。

19.权利要求3的方法，其中所述选择标记基因编码选自下述的产物：CP4EPSPS、膦丝菌素乙酰转移酶、DMO、NptII、草甘膦乙酰转移酶、突变型乙酰乳酸合酶、氨甲蝶呤抗性DHFR、茅草枯脱卤素酶、PMI、Protox、潮霉素磷酸转移酶和5-甲基色氨酸抗性邻氨基苯甲酸合酶。

20.权利要求1的方法，其中所述DNA盒序列选自sacB、DefH9-iaaM、rolB、OsCDPK2、AP2、AFR2、ANT转录因子、LEC2、Snf-1、cobA、KAS4、splA、玉米醇溶蛋白反向重复、B-peru和酵母ATP-PFK。

21.权利要求1的方法，其中所述DNA盒与在组织中有功能的启动子可操作地连接，所述组织选自胚、种子胚乳、子叶、糊粉和种皮。

22.权利要求1的方法，其中所述DNA盒包含与选自下述的启动子可操作地连接的核酸序列：油菜籽蛋白启动子、β-菜豆蛋白启动子、β-伴大豆球蛋白亚单位启动子、玉米醇溶蛋白启动子、Osgt-1启动子、油质蛋白启动子、淀粉合酶启动子、球蛋白1启动子、大麦LTP2启动子、α-淀粉酶启动子、壳多糖酶启动子、β-葡聚糖酶启动子、半胱氨酸蛋白酶启动子、谷氧还蛋白启动子、HVA1启动子、丝氨酸羧肽酶II启动子、过氧化氢酶启动子、α-葡糖苷酶启动子、β-淀粉酶启动子、VP 1启动子、USP、USP88、USP99、凝集素和bronze2启动子。

23.权利要求1的方法，其中步骤c)通过自动化种子分选机来进行。

24.权利要求1的方法，其中所述DNA盒包含编码蔗糖磷酸化酶(splA)的序列。

25.权利要求24的方法，其中所述编码splA的序列与选自大豆7Sα启动子和USP88启动子的种子特异性启动子可操作地连接。

26.一种DNA构建体，其包含(a)包含在目的基因侧面的左和右T-DNA边界的第一种DNA区段，所述目的基因与在植物中有功能的启动子可操作地连接，和(b)包含在种子中有功能的启动子侧面的第二组左和右T-DNA边界的第二种DNA区段，所述启动子与在种子中赋予改变的种子大小的视觉可检测表型的DNA盒可操作地连接，所述种子包含所述DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的标记基因。

27.权利要求26的DNA构建体，其中所述标记基因是选择标记基因。

28.权利要求26的构建体，其中所述目的基因赋予选自下述的性状：除草剂耐受性、昆虫或害虫抗性、抗病性、增加的生物量、改良的脂肪酸代谢、改良的碳水化合物代谢和改良的营养质量。

29.权利要求26的构建体，其中所述DNA盒和选择标记基因与相同启动子可操作地连接。

30.权利要求26的构建体，其中所述DNA盒和选择标记基因与不同启动子可操作地连接。

31.权利要求26的构建体，其中所述选择标记基因编码选自下述的产物：CP4EPSPS、膦丝菌素乙酰转移酶、DMO、NptII、草甘膦乙酰转移酶、突变型乙酰乳酸合酶、氨甲蝶呤抗性DHFR、茅草枯脱卤素酶、PMI、Protox、潮霉素磷酸转移酶和5-甲基色氨酸抗性邻氨基苯甲酸合酶。

32.权利要求26的构建体，其中所述DNA盒选自sacB、DefH9-iaaM、rolB、OsCDPK2、AP2、AFR2、ANT转录因子、LEC2、Snf-1、cobA、KAS4、splA、玉米醇溶蛋白反向重复、B-peru和酵母ATP-PFK。

33.权利要求26的构建体，其中所述DNA盒与在组织中有功能的启动子可操作地连接，所述组织选自胚、种子胚乳、子叶、糊粉和种皮。

34.权利要求22的构建体，其中所述DNA盒与选自下述的启动子可操作地连接：油菜籽蛋白启动子、β-菜豆蛋白启动子、β-伴大豆球蛋白亚单位启动子、玉米醇溶蛋白启动子、Osgt-1启动子、油质蛋白启动子、淀粉合酶启动子、球蛋白1启动子、大麦LTP2启动子、α-淀粉酶启动子、壳多糖酶启动子、β-葡聚糖酶启动子、半胱氨酸蛋白酶启动子、谷氧还蛋白启动子、HVA1启动子、丝氨酸羧肽酶II启动子、过氧化氢酶启动子、α-葡糖苷酶启动子、β-淀粉酶启动子、VP1启动子、USP、USP88或USP99、凝集素和bronze2启动子。

35.一种包含右和左T-DNA边界的DNA构建体，其中包含与在植物中有功能的启动子可操作地连接的目的基因的第一种DNA区段位于所述左边界后，且包含对植物种子赋予改变的种子大小的视觉可检测表型的DNA盒的第二种DNA区段位于所述右边界后，所述植物种子包含所述DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的标记基因。

36.一种包含右和左T-DNA边界的DNA构建体，其中包含对植物种子赋予改变的种子大小的视觉可检测表型的DNA盒的第一种DNA区段位于所述右边界后，所述植物种子包含所述DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的标记基因，且包含与在植物中有功能的启动子可操作地连接的目的基因的第二种DNA区段位于所述左边界后。

37.一种包含第一个和第二个右T-DNA边界的DNA构建体，其中包含与在植物中有功能的启动子可操作地连接的目的基因的第一种DNA区段位于所述第一个右边界后，且包含对植物种子赋予改变的种子大小的视觉可检测表型的DNA盒的第二种DNA区段位于所述第二个右边界后，所述植物种子包含所述DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的标记基因。

38.一种细菌细胞，其包含权利要求35-37中任一项的DNA构建体。

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