KR101099614B1

KR101099614B1 - 식물형질전환용 운반체, 식물형질전환체, 식물형질전환 방법 및 이를 이용한 유전자형의 판별방법

Info

Publication number: KR101099614B1
Application number: KR1020090044305A
Authority: KR
Inventors: 임선형; 손성한; 원소윤; 김재광; 이시명; 신공식; 우희종; 김동헌; 권순종
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2009-05-21
Filing date: 2009-05-21
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2029-05-21
Also published as: KR20100125543A

Abstract

본 발명은 안토시아닌 색소합성에 관여하는 bHLH 전사인자와 MYB전사인자를 코딩하는 2종의 유전자를 식물형질전환용 운반체를 매개하여 선발마커로 식물세포에 도입하는 단계를 포함하는 식물형질전환방법을 제공한다.

안토시아닌 색소, 선발마커

Description

식물형질전환용 운반체, 식물형질전환체, 식물형질전환 방법 및 이를 이용한 유전자형의 판별방법{Vector for plant transformation, transgenic plant, method for plant transformation and determining method of genotype using the same}

본 발명은 식물형질전환용 운반체, 식물형질전환체, 식물형질전환 방법 및 이를 이용한 식물형질전환체의 유전자형의 판별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체와 환경에 대한 위해성이 없이 식물의 형질전환체를 조기에 판별하는 것이 가능하고, 동시에 이들 형질전환체를 자가수정하여 획득한 후대식물체의 유전자형을 조기에 판별할 수도 있어 조기에 목적하는 유전자만이 삽입된 형질전환 식물체를 선발할 수 있는 식물형질전환용 운반체, 식물형질전환체, 식물형질전환 방법 및 이를 이용한 식물형질전환체의 유전자형의 판별방법에 관한 것이다.

2006년 보고에 따르면 형질전환 작물은 22개국에서 재배되며, 재배면적은 1억 ha에 이르고 있고, 매년 그 면적이 증가되는 추세이다. 형질전환 작물의 재배면적과 상업화가 증가되는 반면 대중과 몇몇 시민단체에서는 형질전환 작물 개발시 사용되는 항생제 혹은 제초제 저항성유전자가 인체와 환경에 해를 미칠 것에 대하여 우려를 나타내고 있다.

현재 사용되고 있는 항생제 또는 제초제 저항성유전자를 제거 또는 다른 유전자로 대체할 경우 형질전환 작물의 구입 및 승인에 찬성하겠다는 대중인식 변화보고가 잇따르고 있다. 따라서 형질전환 작물을 개발하고 상업화하기 위해서는 이들 마커를 대체하기 위한 새로운 유전자의 개발이 요구된다.

최근에 이러한 요구에 부응하기 위하여 선발마커를 제거하는 다양한 방법이 많은 연구자들에 의해서 보고되고 있다. 첫째, 위치특이적 재조합반응(site-specific recombinase-based system)을 이용하여 선발마커를 제거하는 방법이다. 현재 사용되는 재조합효소는 박테리아파지로부터 유래한 Cre/loxP 방법, 효모로부터 유래한 FLP/FRT내염성 효모로부터 유래한 R/RS 방법 등이 있다. 이러한 방법은 현재 몇몇 모델 식물체에서만 개발되는 단점이 있고, 화학처리 또는 특정 부위에서만 발현이 조절되는 프로모터의 개발이 요구되고 있다. 둘째, 전이인자 (transposon-based marker)를 이용한 선발마커를 제거하는 방법이다. 옥수수에서 발견된 전이인자인 Ac/Ds를 바탕으로 하여 식물체 재분화 촉진 ipt유전자와 결합하여 MAT(Multi-Auto-Transformation) 벡터를 개발하여 선발마커가 제거된 식물체를 개발하였다. 전이인자의 경우 식물종에 따라 그 효과가 다르게 나타나고 있고, 선발마커가 제거된 개체를 얻기 위해서는 수세대에 걸친 교배가 이루어져야 하는 것과, 이들 전이인자가 게놈내에 다른 곳으로 다시 삽입될 수 있는 가능성이 있는 것으로 알려져 있다. 셋째로, 선발마커 유전자와 목표하는 유전자를 서로 다른 T-DNA 에 삽입하여 형질전환체를 개발한 후, 개발된 개체를 교배하여 선발마커 유전자를 제거하는 동시형질전환(co-transformation) 방법이다. 이 방법은 보편적이며, 기존에 사용되는 T-DNA 내에 새로운 유전자를 도입할 필요가 없고, 바로 적용가능한 방법이다. 하지만, 이 방법의 경우 유전자가 서로 근접하게 도입될 경우 후대에서 선발 마커와 원하는 유전자의 분리가 이루어지지 않는 단점이 있으며, 또한 목본과 같이 세대 진전이 느린 경우에는 이들을 조기에 판별하는 시스템의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같이 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 창안된 것으로, 그 목적은 인체와 환경에 대한 위해성이 없이 식물의 형질전환체를 조기에 판별하는 것이 가능하고, 동시에 이들 형질전환체를 자가수정하여 획득한 후대식물체의 유전자형을 조기에 판별할 수도 있어 조기에 목적하는 유전자만이 삽입된 형질전환 식물체를 선발할 수 있는 식물형질전환용 운반체, 식물형질전환체, 식물형질전환 방법 및 이를 이용한 식물형질전환체의 유전자형의 판별방법을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) 선발마커로 안토시아닌 색소합성에 관여하는 bHLH 전사인자와 MYB전사인자를 코딩하는 2종의 유전자를 함유하는 식물형질전환용 운반체.

(2) 제1항에 있어서,

전사인자를 코딩하는 유전자는 B-peru, TT8, JAF13, 및 DELILA 유전자 군에서 선택된 1종의 유전자와,

cPAP1D, ANT, AN2, 및 Rosea1 유전자 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 식물형질전환용 운반체.

(3) 제1항 또는 제2항의 식물형질전환용 운반체로 형질전환된 식물형질전환체.

(4) 안토시아닌 색소합성에 관여하는 bHLH 전사인자와 MYB전사인자를 코딩하는 2종의 유전자를 식물형질전환용 운반체를 매개하여 선발마커로 식물세포에 도입하는 단계를 포함하는 식물형질전환방법.

(5) 제1항에 있어서,

cPAP1D, ANT, AN2, 및 Rosea1 유전자 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 식물형질전환방법.

(6) 안토시아닌 색소합성에 관여하는 2종의 전사인자를 코딩하는 각 유전자를 식물형질전환용 운반체를 매개하여 선발마커로 식물세포에 함께 도입시켜 형질전환체를 얻는 단계; 및

상기 얻어진 형질전환체를 자가수분하여 얻은 후대 식물체에 상기 2종의 전사인자를 코딩하는 각 유전자를 주입하여 안토시아닌 색소의 합성여부를 확인하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 유전자형 판별방법.

(7) 제6항에 있어서,

cPAP1D, ANT, AN2, 및 Rosea1 유전자 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하 는 형질전환 식물체의 유전자형 판별방법.

본 발명에 의하면, 식물유래의 색소합성 전사인자를 선발마커로 이용하므로 인체와 환경에 대한 위해성이 없이 식물의 형질전환체를 조기에 판별하는 것이 가능하고, 동시에 이들 형질전환체를 자가수정하여 획득한 후대식물체의 유전자형을 조기에 판별할 수도 있어 조기에 목적하는 유전자만이 삽입된 형질전환 식물체를 선발할 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 안토시아닌 색소합성에 관여하는 bHLH 전사인자와 MYB전사인자를코딩하는 2종의 유전자를 선발마커로 함유하는 식물형질전환용 운반체, 식물형질전환체, 식물형질전환 방법 및 이를 이용한 식물형질전환체의 유전자형의 판별방법을 포함한다.

본 발명에 사용될 수 있는 안토시아닌 색소합성에 관여하는 전사인자는 식물체에 단독 또는 다른 전사인자와 함께 세포내에 발현시 안토니아닌 색소를 합성할 수 있는 어떠한 전사인자도 포함한다. 이들 전사인자를 코딩하는 유전자의 예로는, basic helix-loop-helix(bHLH) 인자인 옥수수의 B-peru 유전자, 애기장대의 TT8유전자, 페튜니아의 JAF13유전자, 금어초의 DELILA유전자와, myb 인자인 애기장대의 cPAP1-D 유전자, 토마토의 ANT유전자, 페튜니아의 AN2유전자, 금어초의 Rosea1 유전자 등을 들 수 있다. 바람직하게는 상기 본 발명에 사용되는 전사인자는 세포내에 함께 존재할 경우 안토니아닌 색소를 합성할 수 있는 2종의 것이 도입되어진다.

상기 식물형질전환용 운반체로는 식물체의 형질전환을 위해 사용될 수 있는 것으로 알려진 어떠한 운반체도 사용되어질 수 있다. 예를 들어, invitrogen사(미국)의 pK2GW7, pB7WG2D와 CAMBIA사(호주)의 pCAMBIA1300, pCAMBIA230 등을 들 수 있다. 이러한 운반체들에 당업계에 알려진 다양한 기능적 프로모터가 사용될 수 있으며, 예를 들어 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 슈가케인 바실리폼 바이러스 프로모터, 코메리나 옐로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제의 소단위(ssRUBISCO)로부터의 빛-유도성 프로모터, 쌀 사이토졸릭 트리오세포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 쌀 액틴 1 유전자 프로모터, 알파-아밀라제 3D 프로모터 (alpha-amylase, 3D promoter), 글로부린 프로모터, 글루테린 A 또는 B 프로모터, 만노핀 신타아제 및 옥토핀 신타아제 프로모터와 같은 다양한 프로모터가 사용될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 형질전환용 운반체를 식물에 도입하는 방법으로는 당분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리 (sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG (Polyethylenglyco l)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다 (Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985). 아그로박테리움-매개 형질전환법에 사용될 수 있는 아그로박테리움은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefacience) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등이 사용된다.

상기 본 발명에 따른 2종의 유전자가 세포내에서 함께 발현되어질 경우 안토니아닌 색소를 합성하여 식물체의 표현형을 변화시켜 형질전환체를 선별할 수 있게 된다. 앞에서 예시한 B-peru 유전자와 cPAP1-D 유전자를 식물체의 잎에 함께 도입시킨 경우에 안토니아닌 색소의 합성으로 인해 잎의 초록색은 보라색으로 그 표현형이 변화된다. 만일 이들 2종의 유전자 중에 어느 하나만이 잎의 세포에 도입되어지거나, 모두 도입되지 않은 경우에는 표현형의 변화는 없다. 즉 안토니아닌의 색소합성은 일어나지 않게 된다.

이러한 성질을 이용할 경우 서로 다른 2종의 유전자(이하, 이들 유전자를 각각 「제1유전자」와 「제2유전자」로 부르기로 한다)가 모두 도입된 형질전환체를 자가수분하여 얻은 후대 식물체의 유전자형을 결정하는 것도 가능하다.

2종의 유전자가 모두 도입된 형질전환체는 표현형의 차이로 육안으로도 쉽게 선별이 가능하고, 이와 같이 얻어진 형질전환체를 자가수분할 경우 후대 식물체는 ⅰ) 제1유전자와 제2유전자가 모두 포함되어 있는 종, ⅱ) 제1유전자만을 포함하고 있는 종, ⅲ) 제2유전자만을 포함하고 있는 종, ⅳ) 제1유전자와 제2유전자 모두를 포함하지 않는 종의 4가지 경우가 존재할 것이다.

후대 식물체가 상기 ⅱ)~ⅳ)에 해당할 경우 안토니아닌 색소를 합성하지 않게 되어 표현형으로는 구별되지 않게 된다. 본 발명에서는 이들 식물체의 유전자형을 구별하기 위한 방법으로 아그로인필트레이션(Agro-infiltration) 방법을 도입한다.

아그로인필트레이션 방법은 상기 제1유전자 또는 제2유전자가 삽입된 식물형질전환용 운반체를 아그로박테리움에 도입하고, 동 균주를 식물체의 잎 기공을 통해 주입하는 방법을 통해 이루어진다. 따라서, 후대식물체가 제1유전자만을 함유한 경우에는 제1유전자가 도입된 아그로박테리움을 주입하여도 그 표현형의 변화는 없다. 이와 달리 동 식물체에 제2유전자가 도입된 아그로박테리움을 주입할 경우에는 일시적으로 잎의 세포에서 안토니아닌 색소가 합성되어 잎의 색이 보라색으로 변하게 된다. 따라서, 표현형의 차이를 통해 당해 식물체의 유전자형을 결정하는 것이 가능하다.

마찬가지로 후대식물체가 제2유전자만을 함유한 경우에는 제2유전자가 도입된 아그로박테리움을 주입하여도 표현형의 변화는 없다. 이와 달리 동 식물체에 제1유전자가 도입된 아그로박테리움을 주입할 경우에는 일시적으로 잎의 세포에서 안토니아닌 색소가 합성되어 잎의 색이 보라색으로 변하게 된다. 따라서, 이 경우에도 표현형의 차이를 통해 당해 식물체의 유전자형을 결정하는 것이 가능하다.

후대식물체가 제1유전자와 제2유전자 모두를 포함하고 있지 아니한 경우에는 제1유전자 또는 제2유전자가 도입된 아그로박테리움을 투입하는 것만으로는 표현형의 차이를 발견할 수 없다. 이 경우에는 2종의 아그로박테리움을 모두 주입하여야 비로서 안토시안 색소가 합성될 수 있다.

상기한 방법을 통해 후대식물체의 유전자형을 모두 결정하는 것이 가능함을 알 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 안토시아닌 색소합성 전사인자의 클로닝

식물체의 유전자형 진단을 위해 안토시아닌 생합성 전사인자를 이용하였다. 본 실험에서는 옥수수의 basic helix-loop-helix(bHLH) 인자인 B-peru유전자와 애기장대의 myb 인자인 cPAP1-D유전자를 이용하였다. 옥수수와 애기장대의 잎에서 전체 RNA(total RNA)를 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 Superscriptase II (Life Technologies, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 각각의 전사인자를 PCR을 통하여 증폭하였다. 본 실험에 사용한 프라이머 염기서열은 아래와 같다.

B-peru-F: 5'-ATGGCGCTCTCAGCTTCCCCG-3' (서열번호 1)

B-peru-R: 5'-GCTTCACATGTAGCGCCCTTTCA-3' (서열번호 2)

cPAP1-D-F: 5'-ATACCTTTTACAATTTGTTTATAT-3' (서열번호 3)

cPAP1-D-R: 5'- GCAAACCTATACACAAACGCA-3' (서열번호 4)

PCR 증폭은 94 ℃에서 3분간 전변성(pre-denaturation), 94 ℃에서 45초, 57 ℃에서 45초, 72 ℃에서 1분 30초를 1 싸이클로 하여 30 싸이클 및 72 ℃에서 5분간 최종 연장반응 (final extension)에 의해 수행되었다. 증폭된 PCR 산물은 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, 미국)에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다.

염기서열분석 결과 클로닝된 B-peru유전자는 서열번호 5에 제시된 바와 같이 총 1709 bp로 구성되어 있고, ORF(open reading frame)는 562 a.a로 구성되었다. 데이터베이스(NCBI, BLAST)를 이용한 상동성 분석결과 클로닝된 유전자는 기존의 보고된 B-peru(X57276)과 핵산 염기서열에서 3개의 차이가 나타났고, 단백질 서열에도 3개의 아미노산 서열의 차이가 나타났으나, bHLH단백질의 보존된 활성부위의 변이는 발생하지 않았다.

염기서열분석 결과 클로닝된 cPAP1-D유전자는 서열번호 6에 제시된 바와 같이 총 833 bp로 구성되어 있고, ORF는 249 a.a로 구성되었다. 데이터베이스(NCBI, BLAST)를 이용한 상동성 분석결과 클로닝된 유전자는 기존의 보고된 cPAP1-D(NM104541)과 핵산 염기서열에서 2개의 차이가 나타났고, 단백질 서열에서는 1개의 아미노산 서열의 차이가 나타났으나 Myb 단백질의 보존된 활성부위의 변이는 발생하지 않았다.

<실시예 2> 안토시아닌 색소합성 전사인자의 식물체 과발현용 운반체 제작

상기 실시예 1에서 클로닝된 B-peru 유전자는 제초제(phosphinotricin)에 저항성을 지니는 Bar유전자를 가진 pB7WG2D의 식물발현 벡터(invitrogen, 미국)의 35S 프로모터와 35S 터미네이터 사이에 전체 ORF가 삽입된 벡터를 제작하였고, 이를 B-peru/pB7WG2D로 명명하였다 (도 1a). 실시예 1에서 클로닝된 cPAP1-D유전자를 식물체에서 과발현시키기 위해서 가나마이신 저항성을 지니는 pK2GW7의 식물발현 벡터(invitrogen, 미국)의 35S 프로모터와 35S 터미네이터 사이에 전체 ORF가 삽입된 벡터를 제작하였고, 이를 cPAP1-D/pK2GW7로 명명하였다 (도 1b).

<실시예 3> 안토시아닌 색소합성 전사인자의 동시형질전환(co-transformation)을 통한 작물형질전환

<3-1> 담배형질전환체 제조을 위한 코트랜스포메이션의 조건 확립

실시예 2에서 제작된 B-peru/pB7WG2D와 cPAP1-D/pK2GW7 식물발현벡터를 각각 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)(H, R. and Willmitzer L. (1988) Nucleic Acids Res 16:9877)에 freeze-thaw 방법을 이용하여 형질전환 후, 형질전환된 아그로박테리움액과 담배(Nicotiana tabaccum cv Xanthi) 잎 절편과 공동 배양하여 담배를 형질전환하였다.

공동배양에 사용된 배지는 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 20 g/L 수크로스(sucrose), 8 g/L 한천(agar)이 첨가된 MS배지를 이용하였다. 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위하여 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 300 mg/L 카르베니실 린(carbenicillin), 100 mg/l Km(가나마이신), 20 g/L 수크로스, 8 g/L 한천 첨가된 MS배지에서 배양한 다음, 3주마다 계대배양 하였다. 재분화된 신초는 300 mg/L 카르베니실린, 50mg/L Km, 20 g/L 수크로스, 8 g/L 한천이 첨가된 MS배지로 옮겨 발근을 유도하였다. 배양은 26 ℃, 16시간 광주기/8시간 암주기의 조건에서 배양하였고, 발근된 개체는 순화 후 화분으로 이식하여 온실에서 평균기온 26 ℃이상의 조건에서 생육시켰다.

안토시아닌 색소합성 전사인자를 이용한 효율적인 코트랜스포메이션 조건을 수립하기 위해서 B-peru/pB7WG2D와 cPAP1-D/pK2GW7 식물발현벡터의 농도(OD₆₀₀)를 0.5:1, 1:1, 0.5:2로, 공동배양기간을 2일, 3일, 5일간으로 실시하여 적정 배양조건을 확인하였고 결과는 표 1에 정리하였다.

<표 1>

공동배양기간	2			3			5
아그로박테리움의농도비 cPAP1-D/pK2GW7: B-peru/pB7WG2D	1:0.5	1:1	2:0.5	1:0.5	1:1	2:0.5	1:0.5	1:1	2:0.5
보라색 식물수/ 총이식식물수	92/99	185/101	128/104	77/73	91/101	48/54	121/100	95/90	78/117
코트랜스포메이션 (%)	93	183	123	105	90	88	121	106	67

그 결과, B-peru/pB7WG2D와 cPAP1-D/pK2GW7 식물발현 벡터의 공동배양 기간을 2일간, 아그로박테리움의 농도를 1:1의 비율로 배양했을 때 코트랜스포메이션 효율이 가장 높게 나타났다.

<3-2> 담배 형질전환체의 분자생물학적 분석

상기 실시예 <3-1>에서 선발된 형질전환 담배는 안토시아닌 색소가 전신에 축적되어 육안으로 검정이 가능하나, 담배식물체가 B-peru 유전자와 cPAP1-D 유전자를 안정적으로 발현하는지 확인하기 위하여 형질전환 담배개체와 대조구의 잎에서 총 RNA를 분리하였다. 분리된 총 RNA는 Superscriptase II (Life Technologies, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 RT(reverse-transcriptase)-PCR를 수행하였다. 본 실험에 사용된 프라이머의 염기서열은 아래와 같다.

B-peru RT-F2: 5'-CGTTGGTTCCCTCCATTCACAAGG-3' (서열번호 7)

B-peru 5R: 5'-CCCTTTCATCGCTTCCCTATAGCTTT-3' (서열번호 8)

seq-cPAP1-D-F: 5'-CGCCTTCATAGGCTTCTAGGGAAT-3' (서열번호 9)

cPAP1-D-R: 5'- GCAAACCTATACACAAACGCA-3' (서열번호 10)

PCR 증폭은 94 ℃에서 3분간 전변성(pre-denaturation), 94 ℃에서 45초, 57 ℃에서 45초, 72 ℃에서 1분 30초를 1 싸이클로 하여 30 싸이클 및 72 ℃에서 5분간 최종 연장반응 (final extension)에 의해 수행되었다. 증폭된 산물은 1.5 % 아가로오즈 겔에 전기영동하여 확인하였다.

그 결과, 도 2에서 보듯이, 선발된 형질전환 담배 식물체들을 도입된 안토시아닌 색소합성 전사인자인 B-peru 유전자와 cPAP1-D 유전자를 발현하고 있음을 확인하였고, 대조구의 담배식물체에는 색소합성 전사인자가 발현되지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 결과를 종합하면, B-peru 유전자와 cPAP1-D 유전자는 담배에 안정적으로 형질전환되어 발현함을 알 수 있었다.

<실시예 4> 형질전환 담배식물체의 안토시아닌 생합성 전사인자의 일시발현을 통한 후대 유전자형 확인

<4-1> 자가수정(Selfing)을 통한 후대 개체 생산

상기 실시예 3에서 개발된 안토시아닌 색소합성을 하는 형질전환 담배의 꽃을 자가수정하여 이들로부터 종자를 수확하였다. 수확된 종자는 온실 내에서 파종하여 후대개체에서의 유전자 분리양상을 확인하고자 하였다. 그 결과 파종된 종자는 안토시아닌 색소를 합성하는 개체와 합성하지 않는 개체로 나뉘어졌다. 안토시아닌 색소합성 전사인자 B-peru 유전자와 cPAP1-D유전자가 모두 후대로 유전된 경우에는 안토시아닌에 의해 보라색의 담배가 생산되었지만, 안토시아닌 색소합성 전사인자가 B-peru 유전자 또는 cPAP1-D유전자가 단독으로 후대로 유전되는 경우와 색소합성전사인자가 모두 유전되지 않는 경우에는 녹색의 담배가 생산되었다.

<4-2> 안토시아닌 생합성 전사인자의 일시발현을 위한 아그로박테리움 주입액 준비

상기 실시예 2에서 제작된 각각의 안토시아닌 전사인자를 과발현시킨 B-peru/pB7WG2D와 cPAP1-D/pK2GW7 식물발현벡터를 이용하여 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404를 이용하여 50 mg/L 스텍티노마이신(spectinomycin), 50 mg/L 리팜피신(rifampicin)이 포함된 YEP배지에서 28 ℃에서 진탕배양기(shaking incubator)로 배양한 다음, 상기 배양액을 원심분리(5000g×5min)하여 아그로박테 리움을 침전시킨 후, 펠렛을 10 mM MgCl₂, 0.1 mM 아세토시링곤(acetosyringone) 용액에 재현탁하여 농도를 조정하고(OD600 = 0.4), 얼음에 2시간 동안 방치하여 아그로박테리움을 준비하였다. 삽입된 유전자형을 확인하기 위한 아그로 인필트레이션은 파종 후 6주에서 10주가 지난 담배의 잎 뒷면에 1 mL 주사기(syringe)를 사용해 기공을 통해 아그로박테리움을 주입하는 방법으로 수행하였다.

<4-3> 일시발현을 통한 후대개체에서의 유전자형 확인

상기 실시예 <4-2>에서 제시된 방법으로 아그로박테리움을 준비한 후, 이들 현탁액을 단독 또는 혼합하여 안토시아닌 색소합성여부를 관찰하였다. 유전자의 기능을 보다 정확하게 확인하기 위해서 유전자침묵(gene silencing)을 억제하는 바이러스의 2b유전자를 이용하여 같이 침윤하였다. 담배의 잎 뒷면에 1 mL 주사기(syringe)를 사용해 기공을 통해 아그로박테리움액을 침윤하고 나서 5일 후의 결과와 본 실험에 사용된 현탁액의 종류, 유전자형에 따른 결과는 도 4에 나타내었다. 아그로박테리움액을 침윤한 결과, 후대유전자형이 B-peru경우 cPAP1-D/pK2GW7의 아그로박테리움용액을 침윤시켰을 때 안토시아닌 색소합성을 나타내었고, 후대 유전자형이 cPAP1-D의 경우 B-peru/pB7WG2D의 아그로박테리움 용액을 침윤시켰을 경우 안토시아닌 색소합성이 나타났다. 그러나, 안토시아닌 색소합성 전사인자를 지니지 않은 식물체의 경우에는 B-peru/pB7WG2D의 아그로박테리움 용액과 cPAP1-D/pB7WG2D의 아그로박테리움 용액을 혼합하여 침윤시켰을 경우에만 침윤된 잎조직 에서 안토시아닌 색소의 축적이 관찰되었다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

<실시예 5> PCR 분석과 아그로 인필트레이션을 통한 후대개체의 유전자형 확인

<5-1> 적정 PCR 프라이머의 개발 및 후대개체의 유전자형 확인

상기 실시예 <1>에서 개발된 B-peru 유전자와 cpap1-D 유전자의 염기서열을 바탕으로 각각을 선발하고자 적정 PCR 프라이머를 개발하였다. 개발된 프라이머의 염기서열은 아래와 같다.

B-peru RT-F2: 5'-CGTTGGTTCCCTCCATTCACAAGG-3' (서열번호 11)

T35S-R2: 5'-GGGAACTACTCACACATTATTCTGGAG-3' (서열번호 12)

P35S-2F: 5'-GGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG-3' (서열번호 13)

cPAP1-D-2R: 5'-CCCTAGAAGCCTATGAAGGCG-3' (서열번호 14)

개발된 프라이머를 이용하여 안토시아닌 색소합성 후대개체를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭은 94 ℃에서 3분간 전변성(pre-denaturation), 94 ℃에서 45초, 60 ℃에서 45초, 72 ℃에서 45초를 1 싸이클로 하여 35 싸이클 및 72 ℃에서 5분간 최종 연장반응 (final extension)에 의해 수행하였고, 증폭된 산물은 1 % 아가로오즈 겔에 전기영동하여 확인하였다. B-peru 유전자형 특이 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, B-peru 유전자를 지닌 개체와 B-peru 유전자와 cpap1-D 유전자가 중첩된 개체에서 밴드가 형성되었다. 반면, cpap1-D 유전자형 특이 프라이 머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, cpap1-D 유전자를 지닌 개체와 B-peru 유전자와 cpap1-D 유전자가 중첩된 개체에서 밴드가 형성되었다. 안토시아닌 색소합성전사인자가 삽입되지 않은 개체의 경우 B-peru 유전자형 특이 프라이머와 cpap1-D 유전자형 특이 프라이머를 이용하여 PCR을 수행할 경우 밴드를 형성하지 않았다. 이 결과는 도 4에 나타내었다.

<5-2> 후대개체의 유전자형확인을 위한 아그로 인필트레이션을 이용한 일시발현

상기 실시예 <5-2>에서 제시된 방법으로 아그로박테리움을 준비한 후, 이들 현탁액을 단독 또는 혼합하여 안토시아닌 색소합성여부를 관찰하였다. 유전자의 기능을 보다 정확하게 확인하기 위해서 유전자침묵(gene silencing)을 억제하는 바이러스의 2b유전자를 이용하여 같이 침윤하였다. 담배의 잎 뒷면에 1 mL 주사기(syringe)를 사용해 기공을 통해 아그로박테리움액을 침윤하고 나서 5일 후의 결과와 본 실험에 사용된 현탁액의 종류, 유전자형에 따른 결과는 표 2에 나타내었다. 아그로박테리움액을 침윤한 결과와 PCR을 통한 유전자형 분석결과를 비교해 본 결과, 후대개체의 유전자형 확인결과는 일치함을 확인하였다.

<표 2-1>

<표 2-2>

상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1a는 B-peru 전사인자의 식물발현용 운반체의 모식도.

LB: 좌측 경계, dual P35S: 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터 35, T35S: 콜리플라워 모자이크 바이러스 터미네이터, BAR: 제초제 저항성 유전자, rolD: 아그로박테리움 라이조게네스 RolD 프로모터, EgfpER: 소포체 적중 enhanced GFP (green-fluorescent protein), B-peru: basic helix-loop-helix 전사인자, RB: 우측 경계.

도 1b는 pap1-D 전사인자의 식물발현용 운반체의 모식도.

LB: 좌측 경계, dual P35S: 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터 35, T35S: 콜리플라워 모자이크 바이러스 터미네이터, Km: 항생제 유전자, cpap1-D: Myb 전사인자, RB: 우측 경계.

도 2는 안토시아닌 색소합성 전사인자의 코트랜스포메이션을 통하여 선발된 형질전환 담배식물체의 전사인자의 도입을 확인한 결과.

도 3은 아그로 인필트레이션에 의한 담배 유전자형 확인 및 결과.

도 4는 PCR 분석을 통한 후대 형질전환체의 안토시아닌 색소합성 전사인자를 확인한 결과.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Method for plant transformation and selection method of transformant using the same <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-peru-F <400> 1 atggcgctct cagcttcccc g 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-peru-R <400> 2 gcttcacatg tagcgccctt tca 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cPAP1-D-F <400> 3 atacctttta caatttgttt atat 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cPAP1-D-R <400> 4 gcaaacctat acacaaacgc a 21 <210> 5 <211> 1709 <212> DNA <213> Zea mays <220> <221> gene <222> (1)..(1709) <223> B-peru <400> 5 atggcgctct cagcttcccc ggctcaggaa gaactgctgc agcctgctgg gaggccgttg 60 aggaagcagc ttgctgcagc cgcgaggagc atcaactgga gctatgccct cttctggtcc 120 atttcaagca ctcaacgacc tcgggtgctg acgtggacgg acgggttcta caatggcgag 180 gtgaagacgc gtaagatctc ccactccgtg gagctgacag ccgaccagct gctcatgcag 240 aggagcgagc agctccggga gctctacgag gccctccggt ccggcgagtg cgaccgccgc 300 ggcgcgcggc cggtgggctc gctgtcgccg gaggacctcg gggacaccga gtggtactac 360 gtgatctgca tgacctacgc cttcctgccg ggccaaggct tgcccggcag gagttccgcg 420 agcaacgagc atgtctggct gtgcaacgcg cacctcgccg gcagcaagga cttcccccgc 480 gcgctcctgg ccaagagcgc gtccattcag acaatcgtct gcatcccgct catgggtggc 540 gtgcttgagc ttggtactac tgataaggtg ccggaggacc cggacttggt cagccgagca 600 accgtagcat tctgggagcc gcaatgtccg acatactcgc aacagccgag ctccaacccg 660 tcagcatacg aaaccgggga agccgcatac atagtcgtgt tggaggacct cgatcacaat 720 gccatggaca tggagacggt gactgccgcc gccgggagac acggaaccgg acaggagcta 780 ggagaagtcg agagcccgtc aaatgcaagc ctggagcaca tcaccaaggg gatcgacgag 840 ttctacagcc tctgcgagga aatggacgtg cagccgctag aggatgcctg gataatggac 900 gggtctaatt tcgaagtccc gtcgtcagcg ctcccggtgg atggctcaag cgcacccgct 960 gatggttctc gcgcgacaag tttcgtggtt tggacgaggt catcgcactc ctgctcgggt 1020 gaagcggcgg tgccggtcat cgaagagccg cagaaattgc tgaagaaagc gttggccggc 1080 ggcggtgctt gggcgaacac gaactgcggt ggcgggggca cgacggtaac agcccaggaa 1140 aacggcgcca agaaccacgt catgtcagag cgaaagcgcc gggagaagct caacgagatg 1200 ctcctcgttc tcaagtcgtt ggttccctcc attcacaagg tggacaaagc atccatcctc 1260 gccgaaacga tagcctatct aaaggagctt caacgaaggg tacaagaact ggaatccagg 1320 aggcaaggtg gcagtgggtg tgtcagcaag aaagtctgtg tgggctccaa ctccaagagg 1380 aagagcccag agttcgccgg tggcgcgaag gagcacccct gggtcctccc catggacggc 1440 accagcaacg tcaccgtcac cgtctcggac acgaacgtgc tcctggaggt gcaatgccgg 1500 tgggagaagc tcctgatgac acgggtgttc gacgccatca agagcctcca tttggacgct 1560 ctctcggttc aggcttcggc accagatggc ttcatgaggc tcaagatagg agctcagttt 1620 gcaggctccg gcgccgtcgt gcccggaatg atcagccaat ctcttcgtaa agctataggg 1680 aagcgatgaa agggcgctac atgtgaagc 1709 <210> 6 <211> 833 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana (L.) Heynh <220> <221> gene <222> (1)..(833) <223> Pap1-D <400> 6 atacctttta caatttgttt atatatttta cgtatctatc tttgttccat ggagggttcg 60 tccaaagggc tgcgaaaagg tgcttggact actgaggaag atagtctctt gagacagtgc 120 attaataagt atggagaagg caaatggcac caagttcctg taagagctgg gctaaaccgg 180 tgcaggaaaa gttgtagatt aagatggtcg aactatttga agccaagtat caagagagga 240 aaacttagct ctgatgaagt cgatcttctt cttcgccttc ataggcttct agggaatagg 300 tggtctttaa ttgctggaag attacctggt cggaccgcaa atgacgtcaa gaattactgg 360 aacactcatc tgagtaagaa acatgaaccg tgttgtaaga taaagatgaa aaagagagac 420 attacgccca ttcctacaac accggcacta aaaaacaatg tttataagcc tcgacctcga 480 tccttcacag ttaacaacga ctgcaaccat ctcaatgccc caccaaaagt tgacgttaat 540 cctccatgcc ttggacttaa catcaataat gtttgtgaca atagtatcat atacaacaaa 600 gataagaaga aagaccaact agtgaataat ttgattgatg gagataatat gtggttagag 660 aaattcctag aggaaagcca agaggtagat attttggttc ctgaagcgac gacaacagaa 720 aagggggaca ccttggcttt tgacgttgat caactttgga gtcttttcga tggagagact 780 gtgaaatttg attagtgttt cgaacatttg tttgcgtttg tgtataggtt tgc 833 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-peru RT-F2 <400> 7 cgttggttcc ctccattcac aagg 24 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-peru 5R <400> 8 ccctttcatc gcttccctat agcttt 26 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq-cPAP1-D-F <400> 9 cgccttcata ggcttctagg gaat 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cPAP1-D-R <400> 10 gcaaacctat acacaaacgc a 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-peru RT-F2 <400> 11 cgttggttcc ctccattcac aagg 24 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T35S-R2 <400> 12 gggaactact cacacattat tctggag 27 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35S-2F <400> 13 ggacccccac ccacgaggag catcg 25 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cPAP1-D-2R <400> 14 ccctagaagc ctatgaaggc g 21

Claims

선발마커로 안토시아닌 색소합성에 관여하는 bHLH 전사인자와 MYB전사인자를코딩하는 2종의 유전자를 함유하는 식물형질전환용 운반체.
제1항에 있어서,

전사인자를 코딩하는 유전자는 B-peru, TT8, JAF13, 및 DELILA 유전자 군에서 선택된 1종의 유전자와,

cPAP1D, ANT, AN2, 및 Rosea1 유전자 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 식물형질전환용 운반체.
제1항 또는 제2항의 식물형질전환용 운반체로 형질전환된 식물형질전환체.
안토시아닌 색소합성에 관여하는 bHLH 전사인자와 MYB전사인자를 2종의 유전자를 식물형질전환용 운반체를 매개하여 선발마커로 식물세포에 도입하는 단계를 포함하는 식물형질전환방법.
제4항에 있어서,

전사인자를 코딩하는 유전자는 B-peru, TT8, JAF13, 및 DELILA 유전자 군에서 선택된 1종의 유전자와,

cPAP1D, ANT, AN2, 및 Rosea1 유전자 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 식물형질전환방법.
안토시아닌 색소합성에 관여하는 2종의 전사인자를 코딩하는 각 유전자를 식물형질전환용 운반체를 매개하여 선발마커로 식물세포에 함께 도입시켜 형질전환체를 얻는 단계; 및

상기 얻어진 형질전환체를 자가수분하여 얻은 후대 식물체에 상기 2종의 전사인자를 코딩하는 각 유전자를 주입하여 안토시아닌 색소의 합성여부를 확인하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 유전자형 판별방법.
제6항에 있어서,

전사인자를 코딩하는 유전자는 B-peru, TT8, JAF13, 및 DELILA 유전자 군에서 선택된 1종의 유전자와,

cPAP1D, ANT, AN2, 및 Rosea1 유전자 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 유전자형 판별방법.