CN112322617A - 一种可鉴定大麦籽粒糯性的kasp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种可鉴定大麦籽粒糯性的KASP分子标记及其应用。具体技术方案为：一种引物组合物，包括正向引物AL1，其序列如SEQ ID NO.3所示；正向引物AL2，其序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物C，其序列如SEQ ID NO.5所示。本发明针对大麦Waxy基因第10个外显子的SNP位点G³⁹³⁵/T³⁹³⁵提供了一种功能性KASP分子标记，能对糯性基因进行准确分型，从而更加方便地在实验室条件下对糯性材料进行鉴定和筛选，实现大麦籽粒糯性的分子标记辅助选择育种，显著提高大麦品质育种的效率和准确性。

Description

一种可鉴定大麦籽粒糯性的KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及与大麦籽粒糯性相关的KASP分子标记及其应用。

背景技术

大麦胚乳的淀粉组成是影响籽粒制麦、食用和饲用品质的重要性状之一。大麦淀粉由直链淀粉(20～30％)和支链淀粉(70～80％)组成，糯大麦籽粒胚乳中直链淀粉含量很低或者为零，表现出独特的淀粉理化特性，在食品、化妆品和医药等领域具有特殊的应用价值。颗粒结合淀粉合酶(granule bound starch synthase，GBSS)是控制直链淀粉合成的关键酶，调控禾本科作物籽粒胚乳中直链淀粉的合成。大麦中存在着三种颗粒结合型淀粉合成酶：GBSS I、GBSS II和GBSS III。研究表明，GBSS I编码基因Waxy的序列变异与直链淀粉含量的变化密切相关。大麦Waxy基因由12个外显子和11个内含子组成，并存在高度变异序列，一些重要的核苷酸变化可以极大地影响直链淀粉的合成，并进一步改变淀粉特性。

单核苷酸的多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组内单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入所引起的DNA序列多态性。植物许多表型差异、对生物或非生物胁迫的易感性等等都可能与SNP有关。SNP已成为第三代遗传标记，主要有以下特点：(1)数量多，分布广泛；(2)适于快速、规模化筛查；(3)等位基因频率的容易估计；(4)易于基因分型。

KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型及检测InDels(Insertions and Deletions，插入和缺失)的技术。该项技术的主要优点有：(1)只需合成两个通用荧光探针、两个通用淬灭探针、多个针对具体位点的SNP PCR引物，即可检测许多位点；(2)准确率高，灵活性强，无需昂贵的双色标记探针，使用通用荧光探针来代替针对位点的荧光探针，大大节约成本；(3)该技术只要求很低的DNA样本需求，无需进行全基因组扩增，可快速高效地检测大量样本的少数几个标记，针对性强。KASP因其具有高通量准确检测的优点，成为国际上SNP鉴定的主流方法之一，在基因分型研究和分子标记辅助育种中发挥重要作用。

因此，如果能鉴定、选择对大麦糯性基因Waxy表达与功能有重要影响的SNP，并开发能准确鉴定其单倍型的KASP标记，将为进一步利用分子标记辅助选择育种培育具有低直链淀粉含量的糯大麦新品种(系)，提供精准的通量化鉴定技术手段，对大麦淀粉品质改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能鉴定大麦籽粒糯性的KASP分子标记及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种引物组合物，分别延长SNP G³⁹³⁵前后至少40bp碱基序列后获得。

相应的，一种引物组合物，正向引物AL1，其序列如SEQ ID NO.3所示；正向引物AL2，其序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物C，其序列如SEQ ID NO.5所示。

相应的，所述引物组合物在鉴定、检测、筛选大麦籽粒糯性及培育糯性大麦品种中的应用。

优选的，以待测样品的基因组DNA为模板，利用所述引物组合物对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型。

优选的，在各引物的5’端分别添加不同的标记基团，可识别出正向引物AL2标记的标记基团的待测样品为糯性大麦。

优选的，所述标记基团为荧光标记基团。

优选的，包括如下步骤：

(1)提取待测大麦样品DNA；

(2)取浓度为50～100ng/μL的模板DNA 1.0μL、引物混合液0.7μL、KASP MasterMix 5.0μL、超纯水加至总量为10μL，进行PCR扩增反应；所述引物混合液为正向引物AL1、正向引物AL2、反向引物C的混合溶液；

PCR扩增反应条件为：95℃预变性15分钟；第一步扩增反应：95℃变性20秒，65℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.7℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，30个循环；12℃保存。

(3)分析PCR扩增产物基因型；检测出等位位点T³⁹³⁵的样品为携有糯性等位类型植株。

优选的，引物混合液的制备方法为：将浓度均为10μM的正向引物AL1、正向引物AL2、反向引物C按体积比为3：3：8的比例混合。

相应的，一种含有所述引物组合物的产品，用于大麦籽粒糯性检测。

优选的，所述产品为试剂盒。

本发明具有以下有益效果：本发明通过I2-KI染色鉴定了120份大麦地方品种与育成品种的淀粉性状并筛选出4份糯大麦和116份非糯大麦材料，并发现：在控制颗粒结合淀粉合酶合成的Waxy基因外显子区域存在一个SNP位点G³⁹³⁵/T³⁹³⁵，该位点与大麦糯性高度相关。发明人基于此进一步提供了一种功能性KASP分子标记，能对糯性基因进行准确分型，预测大麦的直链淀粉含量，从而更加方便地在实验室条件下对糯性材料进行鉴定和筛选，实现大麦籽粒糯性的分子标记辅助选择育种，显著提高大麦品质育种的效率和准确性。

附图说明

图1为本发明SNP位点G³⁹³⁵/T³⁹³⁵的KASP分子标记在已知基因型的8个大麦品种中的鉴定结果示意图，其中，等位位点T³⁹³⁵为携有糯性优异等位类型材料；

图2为本发明SNP位点G³⁹³⁵/T³⁹³⁵的KASP分子标记在以TGN1作为供体材料,选育获得的8份BC3 F2代和8份BC4 F2代品系中的鉴定结果，其中，等位位点T³⁹³⁵为携有糯性优异等位类型品系。

具体实施方式

本发明提供了一种能鉴定大麦籽粒糯性的KASP分子标记。分子标记位点位于大麦Waxy基因中的第3935个碱基，其多态性为：G³⁹³⁵/T³⁹³⁵。扩增所述分子标记的引物包括：正向引物AL1，其序列如SEQ ID NO.3所示；正向引物AL2，其序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物C，其序列如SEQ ID NO.5所示。本申请提供的各序列中，左侧为5’端，右侧为3’端。

本发明还提供了一种将所述KASP分子标记用于大麦籽粒糯性鉴定的产品。本领域技术人员可以根据业内常规技术，在本发明提供的KASP分子标记的基础上，制备鉴定用试剂盒等产品。

本发明还提供了一种所述KASP分子标记在鉴定大麦籽粒糯性中的应用方法，具体包括如下步骤：

1、提取待测大麦样品的DNA。

2、取浓度为50～100ng/μL的模板DNA 1.0μL、引物混合液0.7μL、KASP Master Mix(2×PARMS)5.0μL、超纯水加至总量为10μL，进行PCR扩增。引物混合液的制备方法为：将浓度均为10μM的正向引物AL1、正向引物AL2、反向引物C按体积比为3：3：8的比例混合。

PCR反应条件为：95℃预变性15分钟。第一步扩增反应：95℃变性20秒，65℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.7℃。第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，30个循环。12℃保存。

3、采用荧光检测仪分析PCR扩增产物基因型；等位位点T³⁹³⁵为携有糯性优异等位类型材料。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：大麦中糯性SNP的鉴定及分子标记的获得

1、收集大麦地方品种和育成品种120份，2019年、2020年于四川什邡实验基地种植收获。

2、淀粉含量鉴定。对各品种分别选取150粒相互之间差异不显著的籽粒，对选取的各成熟籽粒横切面进行I2-KI染色鉴定。鉴定结果为：糯大麦胚乳由于不含或极少含有直链淀粉，染色后表现为棕红色，其中4份材料(TGN1、CD1021、CD2206、CD407)为糯大麦，而非糯大麦胚乳被染为蓝黑色，其余116份材料为非糯大麦。

3、选择上述4种糯大麦与4种非糯大麦(DM15、DM33、DM47和DM88，来自步骤2的116份非糯大麦)进行下一步实验。

4、SNP测序。为了鉴定上述8份大麦品种中SNP的分布情况，设计PCR引物扩增Waxy基因第10外显子区域600bp左右片段。以8种大麦基因组DNA为模板，利用设计的特异引物对模板进行PCR扩增。引物F如SEQ ID NO.1所示；引物R如SEQ ID NO.2所示。

PCR扩增体系如表1所示。

表1 PCR扩增体系

总体积	50μL
		2×Pfu	25μL
引物F	1μL，浓度为10μM
		引物R	1μL，浓度为10μM
100ng/μL DNA	2μL
		H<sub>2</sub>O	21μL

PCR反应程序如表2所示。

将反应获得的PCR产物进行测序：琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，确认目标条带后，送上海生工生物工程公司测序。

结果显示：扩增的600bp左右的片段在8份材料中十分保守，但在Waxy基因的第3935个碱基位置存在SNP位点，其中糯性品种TGN1,CD1021,CD2206和CD407含有碱基T³⁹³⁵，而非糯品种DM15、DM33、DM47和DM88含有碱基G³⁹³⁵，表明该SNP位点与大麦籽粒糯性密切相关。

5、KASP分子标记的开发和SNP鉴定。为方便对糯大麦材料进行SNP的鉴定和辅助选择，同时为了降低育种成本和工作量，增强育种工作中的可操作性，将SNP开发为基于常规分子生物学手段可用于鉴定和筛选的KASP标记。

开发KASP标记的关键是设计KASP引物，引物设计的好坏是KASP分型是否能成功的关键，因此对引物设计进行以下优化：

(1)通过对SNP位点前后序列进行分析发现：该位点附近序列GC含量较高，选择其中最合适的正向引物AL1(GC％＝63.64％),反向引物GC含量保证与正向引物相近，以保证引物在同一退火温度下能稳定结合DNA单链，进而扩增。

(2)引物特异性：引物在大麦基因组中唯一存在，保证扩增片段单一且特异。

(3)引物通用性：引物在各个品种的测序片段中保守，从而保证扩增成功。

(4)引物互补性：分别检测设计的各引物的自身互补性、两两配对后的引物互补性，确保所有互补后需解链的自由能＜±3Kcal/mol,保证正向引物AL1、正向引物AL2、反向引物C在扩增过程中不易形成引物二聚体。

(5)加上探针序列后，保证合适的GC含量，再一次检测引物互补性，确保所有互补后需解链的自由能＜±3Kcal/mol。

经上述优化设计后，将SNP开发为KASP分子标记的具体操作步骤如下：

分别延长SNP G³⁹³⁵前后至少40bp碱基序列，设计两条正向引物(AL1、AL2)和一条共用反向引物C。

以8种大麦基因组DNA为模板，以及添加糯大麦与非糯大麦DNA含量为1：1(ng/μL)的混合样共6个模板(TGN1:DM15＝1:1、TGN1:DM33＝1:1、TGN1:DM47＝1:1、TGN1:DM88＝1:1、CD1021:DM15＝1:1、CD1021:DM33＝1:1)，添加3个独立的以超纯水代替DNA模板的空白，利用正向引物AL1、AL2和反向引物C对各模板分别进行PCR扩增。

需要说明的是：PCR扩增体系及反应程序直接关系到结果的成败，且体系、程序中各参数并非常规调整、选择即可获得的，任意调整参数，很可能导致扩增失败。发明人在建立所述扩增体系时，使用定量PCR设备设定一个较多循环次数的PCR程序，实时检测FAM和VIC荧光，观察PCR扩增曲线，在确定大部分样本进入平台期后，得到最佳循环次数。循环数过多或过少均会导致分型变差或失败。

PCR扩增体系如表3所示。其中，DNA浓度为50～100ng/μL均可实现发明目的，本实施例使用浓度为100ng/μL。

表3 PCR扩增体系

总体积	10μL
		2×PARMS	5μL
引物AL1	0.15μL，浓度为10μM
		引物AL2	0.15μL，浓度为10μM
引物C	0.4μL
		50～100ng/μL DNA	1μL

PCR反应程序如表4所示。

表4 PCR反应程序

使用ABI实时荧光定量PCR仪在60℃对上述扩增产物进行荧光收集，利用生物信息学软件QuantStudio Design&Analysis Software v1.5.1对PCR产物进行分型，并与测序鉴定的基因型进行对比。

结果如图1所示：用KASP引物进行扩增时，4份非糯品种扩增出了等位位点G³⁹³⁵(AL1-Allele G)，4份糯性品种扩增出优异等位位点T³⁹³⁵(AL2-Allele T)，6个混合样显示出杂合性(Allele G/T)。以上大麦品种SNP分型情况与PCR产物测序结果一致。证明等位位点T³⁹³⁵(AL2-Allele T)与大麦低含量直链淀粉的糯性表型紧密连锁，本发明提供的KASP分子标记能成功分型并识别杂合后代。

结果证明：本发明提供的KASP分子标记可以准确鉴定大麦糯性情况。

实施例二：KASP分子标记在筛选大麦糯性后代中的应用

1、以TGN1糯性品种作为供体父本，不同大麦品种为母本，通过杂交和回交，获得BC3和BC4的F2群体，并在大麦蜡熟期收种。

选择以BC3 F2代材料8份(AN1、AN2、AN3、AN4、AN5、AN6、AN7、AN8)和BC4的F2代材料8份(BN1、BN2、BN3、CN1、CN2、CN3、DN1、DN2)共16个品种的大麦蜡熟期籽粒，分别用I2-KI染色法进行大麦籽粒糯性的鉴定，记录鉴定结果。

2、对上述16份大麦材料分别进行KASP标记检测，具体方法为：

于三叶期分别提取各品种叶片基因组总DNA。以16份材料以及4个已知的糯性品种和3个非糯性品种(对照)的基因组DNA分别为底物，添加3个独立的以超纯水代替DNA模板的空白，用开发的KASP分子标记引物(AL1、AL2、C)按实施例一的方法分别进行PCR扩增。

3、扩增完成后，使用ABI实时荧光定量PCR仪在60℃荧光收集产物，利用生物信息学软件QuantStudio Design&Analysis Software v1.5.1对PCR产物进行分型，并与已知基因型进行对照。

4、基因分型与表型鉴定结果。利用KASP分子标记对8份BC3的F2材料和8份BC4的F2代材料的糯性SNP位点进行分型，结果如图2所示。并采用I2-KI染色鉴定其籽粒糯性。

结果表明：从糯性供体品种回交后代的BC3和BC4的F2群体中同样能鉴定到糯性的SNP优异等位位点。其中，BN2基因型为AL1-Allele G，AN5、AN6、AN7、AN8基因型为Allele G/T，其他11个为AL2-Allele T(与供体亲本TGN1相同)；且籽粒淀粉染色与基因分型结果完全一致。

结果表明：本发明提供的籽粒糯性分子标记确实具有基因分型的作用，能准确鉴定具有低直链淀粉含量的糯大麦。经验证，本发明的KASP分子标记的序列、引物明确，结果高效、准确，经案例实施，可直接用于分子标记辅助选择育种中。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种可鉴定大麦籽粒糯性的KASP分子标记及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(F)

<400> 1

catgctcctg cacatttctg 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(R)

<400> 2

gagatcctgg atcatgcagt tct 23

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 正向引物(AL1)

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tacgatcgtg gagggcaaga ccg 43

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 正向引物(AL2)

<400> 4

gaaggtcgga gtcaacggat tacgatcgtg gagggcaaga cct 43

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 反向引物(C)

<400> 5

acgttgcact ggccaccaa 19

Claims (10)

1.一种引物组合物，其特征在于：分别延长SNP G³⁹³⁵前后至少40bp碱基序列后获得。

2.一种引物组合物，其特征在于：包括正向引物AL1，其序列如SEQ ID NO.3所示；正向引物AL2，其序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物C，其序列如SEQ ID NO.5所示。

3.权利要求1或2所述引物组合物在鉴定、检测、筛选大麦籽粒糯性及培育糯性大麦品种中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：以待测样品的基因组DNA为模板，利用所述引物组合物对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：在各引物的5’端分别添加不同的标记基团，可识别出正向引物AL2标记的标记基团的待测样品为糯性大麦。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述标记基团为荧光修饰基团。

7.根据权利要求4所述应用，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取待测大麦样品DNA；

(2)取浓度为50～100ng/μL的模板DNA 1.0μL、引物混合液0.7μL、KASP Master Mix5.0μL、超纯水加至总量为10μL，进行PCR扩增反应；所述引物混合液为正向引物AL1、正向引物AL2、反向引物C的混合溶液；

PCR扩增反应条件为：95℃预变性15分钟；第一步扩增反应：95℃变性20秒，65℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.7℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，30个循环；12℃保存。

(3)分析PCR扩增产物基因型；检测出等位位点T³⁹³⁵的样品为携有糯性等位类型植株。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：引物混合液的制备方法为：将浓度均为10μM的正向引物AL1、正向引物AL2、反向引物C按体积比为3：3：8的比例混合。

9.一种含有权利要求1或2所述引物组合物的产品，其特征在于：用于大麦籽粒糯性的鉴定、检测、筛选，或用于培育糯性大麦品种。

10.根据权利要求9所述产品，其特征在于：所述产品为试剂盒。

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