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CN105525021A - 鉴定大麦糯性性状的特异性引物及方法 - Google Patents

鉴定大麦糯性性状的特异性引物及方法 Download PDF

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CN105525021A
CN105525021A CN201610074062.6A CN201610074062A CN105525021A CN 105525021 A CN105525021 A CN 105525021A CN 201610074062 A CN201610074062 A CN 201610074062A CN 105525021 A CN105525021 A CN 105525021A
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barley
waxy
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CN201610074062.6A
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马建
兰秀锦
孙敏
郑有良
魏育明
江千涛
刘亚西
祁鹏飞
陈国跃
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Sichuan Agricultural University
Original Assignee
Sichuan Agricultural University
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Abstract

本发明提供了鉴定大麦糯性性状的特异性引物及其应用，以及鉴定大麦糯性性状的方法，本发明所开发的特异性引物的靶序列为共显性标记，可以用于鉴定大麦是否为糯大麦，检测方便、扩增稳定、简单易行。可以直接对杂交后代材料进行目的基因的扩增检测，不但能从基因分子水平上对杂交后代的真假做出判断，而且在连续的自交与回交育种过程中能够追踪检测基因的转移与存在，并且本发明所提供的鉴定方法简单，结果可靠，弥补了形态学鉴定的粗放，利用该方法，将使后续研究更具目的性与针对性，对选育兼具其他优良品质的糯大麦具有重要作用。

Description

鉴定大麦糯性性状的特异性引物及方法
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及鉴定大麦糯性性状的特异性引物及方法。
背景技术
作为世界上第四大粮食作物，大麦(HordeumvulgareL.,2n＝14,HH)主要用于麦芽制作、啤酒酿造及动物饲料，少部分被人类用来直接食用。近些年，大麦作为一种由人类直接食用的粮食作物而受到人们的广泛关注。大麦淀粉由20-30％的直链和70-80％的支链淀粉组成。糯淀粉含有很少甚至不含直链淀粉(1-13％)。大麦胚乳中的直链淀粉和支链淀粉比例决定着淀粉的糊化和凝胶化等特性，这些特性进一步决定诸如麦芽、食品和饲料等质量品质。高直链淀粉不仅可以用作具有应用价值的‘抗性淀粉’，还可用作胶黏剂、波纹纸板及纸张的生产。直链淀粉的合成仅由60KDa的颗粒结合淀粉合成酶I(granule-boundstarchsynthaseI,GBSSI，又叫waxy蛋白)控制，而编码该蛋白的单拷贝基因叫waxy基因。
Waxy突变体(又叫糯大麦)具有少量或者无直链淀粉含量，而造成这种表型的原因可能是waxy基因表达或者GBSSI蛋白功能出现了紊乱。糯大麦相比一般大麦口感显著改善了糯的特性从而使加工的食品口感更脆，有利于开发休闲食品。糯性也对大麦生产高麦芽糖糖浆有利。糯大麦淀粉胶凝温度低，因此烹调中可以减少养分的流失。糯性淀粉持水能力强，凝沉和老化速度慢，具有天然的抗老化性能和较强的冻融稳定性，因此大大增加了大麦制品的保鲜能力，适宜制作冷藏及速冻食品，在商业销售过程中延长食品的货架寿命。糯大麦所表现出的独特加工特性，在食品开发上显示出巨大利用潜力，正日渐成为研究重点。传统方法上，选育具有特异性状的品种，都是基于表型而进行的，鉴定结果可靠性不高，且费时费力。因此有必要对大麦糯性性状的分子机制进行深入研究，提供一种快速准确的糯性性状大麦的鉴定检测方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供鉴定大麦糯性性状的特异性引物。
本发明的第二个目的在于提供糯性性状大麦的鉴定检测方法。
为达到本发明的第一个目的，发明人对糯大麦的分子机制进行了深入的研究，研究发现，大麦waxy基因启动子区部分片段的缺失可能引起大麦糯性性状的改变，因此发明人从NCBI数据库中获得糯大麦和野生型大麦waxy基因序列，并对基因序列结构进行分析。本发明通过对糯大麦和野生型大麦waxy基因序列(三个糯大麦waxy基因登录号分别为:GU599883、JQ768365、JQ768364；两个野生型大麦waxy基因登录号分别为:GU599884、JQ768363)进行序列比对分析，在糯大麦基因起始密码子ATG上游44bp和1011bp处，设计了一对鉴定大麦糯性性状的特异性引物waxy-p，所述特异性引物的核苷酸序列为：
正向引物：5’-AGGCATGCAGCAGCGTGAGT-3’(SEQIDNO.1)；
反向引物：5’-CACTGATCGTCAGTGTGAGT-3’(SEQIDNO.2)。
利用本发明所提供的特异性引物可以通过PCR方法对大麦waxy基因的特定区段进行PCR扩增获得扩增片段，若待测大麦具有糯性性状，那么扩增片段的长度为760bp左右，若待测大麦具有非糯性性状，那么扩增片段的长度为970bp左右。
本发明进一步的提供了所述的特异性引物在大麦种质资源改良中的应用。
本发明还提供了所述的特异性引物在大麦育种中的应用。
将利用本发明所提供的方法鉴定得到的糯大麦与其他各方面表现优异的本地大麦杂交，可以选育兼具糯性和优良性状的大麦
本发明所述的特异性引物还可应用于大麦特异材料创制。
含有上述特异性引物的试剂盒也属于本发明的保护范围。所述试剂盒中还可以包括本领域常用的PCR反应试剂。
本发明还提供了一种鉴定大麦糯性性状的方法，所述方法包括，以待测大麦基因组DNA为模板，利用上述特异性引物进行PCR扩增获得扩增片段，检测扩增片段的长度，当扩增片段的长度为760bp时鉴定待测大麦具有糯性性状，当扩增片段的长度为970bp时鉴定待测大麦不具有糯性性状。
其中，所述PCR扩增的反应程序为：94～95℃预变性5～8min；94～95℃变性45～60s，60～63℃退火40～50s，71～73℃延伸40～50s，共30～35个循环；71～74℃终延伸4～6min。
优选的，所述PCR方法的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸5min。
其中，所述PCR扩增的反应体系为：5μL10×PCRbuffer、1.5UExTaqTMDNA聚合酶、2mmol/lMgCl2、0.2mmol/LdNTP、上下游引物各150ng，100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μL。
在所述方法中，当扩增片段的长度为970bp时，鉴定待测大麦为非糯性大麦。
本发明中对于检测扩增片段长度的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规的方法进行，例如可以利用核酸电泳方法或测序方法鉴定扩增片段的长度。
本发明的一个方面还提供了所述的引物在大麦waxy基因型鉴定中的应用，包括利用所述的特异性引物进行PCR扩增获得扩增片段，检测扩增片段的长度，当扩增片段的长度为760bp时鉴定待测大麦的waxy基因为糯性基因型，当扩增片段的长度为970bp时鉴定待测大麦的waxy基因为非糯性基因型或者不具有糯性基因型。
本发明所开发的特异性引物的靶序列为共显性标记，可以用于鉴定大麦是否为糯大麦，检测方便、扩增稳定、简单易行。可以直接对杂交后代材料进行目的基因的扩增检测，不但能从基因分子水平上对杂交后代的真假做出判断，而且在连续的自交与回交育种过程中能够追踪检测基因的转移与存在，并且鉴定方法简单，结果可靠，弥补了形态学鉴定的粗放，利用本发明的鉴定方法，将使后续研究更具目的性与针对性，对选育兼具其他优良品质的糯大麦具有重要作用。
附图说明
图1为三种糯大麦和两种野生型大麦检测的电泳图谱；其中1、2、4为糯大麦、3、5为非糯大麦。
图2为糯大麦×野生型大麦杂交F2株系植株检测的电泳图谱；其中1、2、4、8和10别为糯大麦株系，即扩增出760bp左右的条带，而3、5、6、7、9和11为非糯大麦野生型株系，即能扩增出970bp左右的条带。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
设计特异性引物waxy-p，其核苷酸序列如下：
上游引物序列，5-AGGCATGCAGCAGCGTGAGT-3’(SEQIDNO.1)
下游引物序列，5-CACTGATCGTCAGTGTGAGT-3’(SEQIDNO.2)。
将以上设计的引物对三个糯大麦和两个野生型大麦进行PCR扩增，PCR扩增体系：5μL10×PCRbuffer、1.5UExTaqTMDNA聚合酶、2mmol/lMgCl2、0.2mmol/LdNTP、上下游引物各150ng，100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μL；PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，总共35个循环；72℃延伸5min；将得到的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TAE，恒定电压150V，电流180A。电泳结果(见图1)发现该引物对能很好得区分非糯性野生型大麦和糯大麦。
实施例2
(1)利用糯大麦JM-1为母本，非糯性野生型大麦JM-10为父本进行杂交，获得F1后，自交获得F2，在F2后代株系中随机选择11个株系。
(2)对所获得的11个株系进行waxy-p标记检测，具体方法为：在苗期提取11个株系的DNA；以其为底物，以特异性引物对为引物进行PCR扩增，所述引物为：
上游引物序列，5-AGGCATGCAGCAGCGTGAGT-3’(SEQIDNO.1)
下游引物序列，5-CACTGATCGTCAGTGTGAGT-3’(SEQIDNO.2)。
PCR扩增体系：5μL10×PCRbuffer、1.5UExTaqTMDNA聚合酶、2mmol/lMgCl2、0.2mmol/LdNTP、上下游引物各150ng，100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μL；PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，总共35个循环；72℃延伸5min；将得到的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TAE，恒定电压150V，电流180A。电泳结果(见图2)发现其中5个植株具有糯大麦的等位位点，6个植株具有非糯性大麦的等位位点，即1、2、4、8、10扩增出了一条与糯大麦一致的760bp左右的条带为糯大麦株系，3、5、6、7、9、11同非糯性大麦一样未能扩增出760bp而是970bp左右的条带，为非糯性野生型大麦株系。
表1糯大麦JM-1x非糯性野生型大麦JM-10F2代部分株系的
电泳结果统计
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.鉴定大麦糯性性状的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列为：
正向引物：5’-AGGCATGCAGCAGCGTGAGT-3’；
反向引物：5’-CACTGATCGTCAGTGTGAGT-3’。
2.一种鉴定大麦糯性性状的方法，其特征在于，所述方法包括，以待测大麦基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增获得扩增片段，检测扩增片段的长度，当扩增片段的长度为760bp时鉴定待测大麦具有糯性性状。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在，所述PCR扩增的反应程序为：94～95℃预变性5～8min；94～95℃变性45～60s，60～63℃退火40～50s，71～73℃延伸40～50s，共30～35个循环；71～74℃终延伸4～6min。
4.根据权利要求2或3所述所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：5μL10×PCR缓冲液、1.5UExTaqTMDNA聚合酶、2mmol/lMgCl2、0.2mmol/LdNTP、上下游引物各150ng，100ng模板DNA、双蒸水加至反应体系总量为50μL。
5.一种大麦糯性性状检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的特异性引物。
6.权利要求1所述的引物在大麦waxy基因型鉴定中的应用，其特征在于，所述应用包括利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增获得扩增片段，检测扩增片段的长度，当扩增片段的长度为760bp时鉴定待测大麦的waxy基因为糯性基因型，当扩增片段的长度为970bp时鉴定待测大麦的waxy基因为非糯性基因型。
7.权利要求1所述的特异性引物在大麦种质资源改良中的应用。
8.权利要求1所述的特异性引物在大麦育种中的应用。
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