CN109593881A

CN109593881A - 检测水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP分子标记及方法

Info

Publication number: CN109593881A
Application number: CN201910121479.7A
Authority: CN
Inventors: 牛付安; 储黄伟; 曹黎明; 程灿; 周继华; 涂荣剑; 孙滨; 胡雪娇; 杨佳
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2019-04-09

Abstract

本发明公开了一种检测水稻低直链淀粉含量基因Wx^mq的KASP分子标记及其方法，所述分子标记是根据Wx^mq基因第4外显子497bp处发生由G→A的突变而设计的，命名为Wx^mq–KASP。所述KASP标记引物包括两条正向特异性引物和一条反向通用引物。根据本发明提供的KASP标记进行基因分型，在PCR扩增后不用酶切和电泳，可以高通量检测多个样品，快速检测Wx^mq等位基因在水稻分离群体中的分布情况，结果准确性好，与常规分子标记相比具有快捷、简便和成本较低等优点。本发明对水稻低直链含量基因Wx^mq的分子标记辅助选择育种具有重要意义。

Description

检测水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP分子标记及方法

技术领域

本发明涉及一种检测水稻低直链淀粉含量基因Wx^mq的KASP分子标记及方法，属水稻育种技术领域。

背景技术

水稻是中国主要的粮食作物，中国水稻常年种植面积保持在3000万公顷左右，稻谷总产居于世界第一。中国也是世界最大的稻米消费国，有百分之六十以上的人口以稻米为主食。长期以来，高产是稻育种的首要指标，随着人们生活水平的提高，对优质稻米的需求与日俱增，稻米品质尤其是食味品质已经成为消费者和育种家的首要考虑因素。稻米90％的组成成分是淀粉，而淀粉又由直链淀粉和支链淀粉组成，因此直链淀粉含量是影响稻米食味品质最重要的因素。软米，又称半糯米，直链淀粉含量为10％左右，用软米蒸煮的米饭具有软而不烂、富有弹性、回生程度小、冷后不易变硬等优点，近年来越来越受消费者欢迎。

水稻Wx基因编码颗粒淀粉合成酶(granule-bound starch synthase,GBSS)，是控制大米直链淀粉含量的主效基因。在非糯稻品种中，Wx基因分化为Wx^a和Wx^b两种等位基因，Wx^a主要存在于野生稻和籼稻中，对应直链淀粉含量约20％～28％；粳稻中为Wx^b，直链淀粉含量对应为15％～19％；而糯稻中Wx基因的功能缺失，导致糯稻中几乎不含直链淀粉。控制水稻低直链淀粉含量的基因目前已发现了14个，主要分布在第6、9、10和12染色体上。日本科学家于1996年利用N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)对水稻品种越光进行诱变处理后育成了一个软米品种‘Milky Queen’，用RT-PCR方法克隆‘Milky Queen’中的低直链淀粉含量基因后发现(Sato H,Suzuki Y,Sakai M,and Imbe T.2002.Molecular characterization ofWx-mq,a novel mutant gene for low-amylose content in endosperm of rice(Oryzasativa L.).Breeding Science,52(2):131-135)，与Wx^b基因序列相比，‘Milky Queen’中的Wx基因编码区有SNP1和SNP2两个突变位点，SNP1是第497位核苷酸由G突变为A，SNP2是第595位核苷酸由T突变为C,从而导致第4外显子编码的第158位氨基酸由精氨酸置换为组氨酸，以及第5外显子编码的第191位氨基酸由酪氨酸置换为组氨酸，进而影响到编码的颗粒淀粉合成酶的活性，最终造成直链淀粉含量下降。‘Milky Queen’中突变的Wx基因被命名为Wx^mq。Wx^mq基因的成功克隆为软米品种的分子标记辅助选择育种打下了基础。

利用基于表型选择的传统育种方法进行稻米直链淀粉含量的改良，选择准确性差，需要对每一代群体的植株均进行直链淀粉含量的测定，操作繁琐，不利于实验材料的高通量筛选。利用分子标记尤其是功能性分子标记进行直链淀粉含量的辅助选择，不受季节、环境限制，选择准确性更高；不存在基因是否表达的问题，在苗期即可对植株的直链淀粉含量进行基因型检测，大幅度提高了育种效率。单核苷酸多态性(SNP)是目前应用最为广泛的分子标记，关于SNP位点的检测方法有直接测序、分子信标、蝎状探针、等位基因特异性PCR(Allele specific PCR,AS-PCR)、CAPS(Cleaved amplified polymorphism sequences)、竞争性等位基因特异性PCR技术(Kompetitive allele specific PCR，KASP)等。Wang等(Wang C L,Zhang Y D,Zhu Z,Chen T,Zhao L,Lin J,Zhou L H.2009.Development of anew japonica rice variety Nan-jing 46with good eating quality by markerassisted selection.Molecular Plant Breeding,7(6):1070-1076)利用Wx^mq基因开发了一个CAPS标记，并成功应用于分子标记辅助选择育种，但是，利用CAPS标记需要对PCR扩增产物进行酶切和电泳，在水稻育种过程中育种家需要筛选大量的后代材料，因此成本较高且比较耗时。KASP是英国LGC(政府化学家实验室)公司提出的一种用于对基因组中SNPs和特定位点上InDels进行精准双等位基因判断的技术。由于具有简便、快速、准确等优点，KASP技术已经成为SNP分型的主流方法(Rasheed A,Wen W E,Gao F M,Zhai S N,Jin H,Liu J D,Guo Q,Zhang Y J,Dresigacker S,Xia X C,He Z H.2016.Development andvalidation of KASP assays for genes underpinning key economic traits in breadwheat.Theor.Appl.Genet,129(10):1843-1860)。水稻低直链淀粉含量基因Wx^mq的KASP分子标记开发可以为软米新品种的高效分子标记辅助选择育种打下基础。

发明内容

本发明的目的是开发一个检测水稻低直链淀粉基因Wx^mq的KASP分子标记并应用于分子标记辅助选择育种，降低对大量样本进行Wx^mq基因分子标记辅助选择的成本，提高育种效率。

为实现本发明目的，本发明提供了一种检测水稻低直链淀粉含量基因Wx^mq的KASP分子标记(Wx^mq–KASP)，其特征在于，所述Wx^mq–KASP分子标记的引物序列为：

正向引物1：5'-GATGAACACACGGTCGACTCCAT-3'；

正向引物2：5'-ATGAACACACGGTCGACTCCAC-3'；

反向通用引物：5'-GAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTA-3'。

进一步地，在合成Wx^mq–KASP分子标记对应的引物时，正向引物1的5'端需加上FAM荧光信号标签，FAM标签序列为5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'；正向引物2的5'端需加上HEX荧光信号标签，HEX标签序列为5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。

另一方面，基于所述的KASP分子标记，本发明提供了检测水稻低直链淀粉含量基因Wx^mq的方法，包括以下步骤：

1)提取水稻待测样本的DNA；

2)采用Wx^mq–KASP分子标记对待测样本的基因组DNA进行目标序列的PCR扩增；所述KASP分子标记的引物序列为：

正向引物1：5'-GATGAACACACGGTCGACTCCAT-3'；

正向引物2：5'-ATGAACACACGGTCGACTCCAC-3'；

反向通用引物：5'-GAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTA-3'；

3)对扩增后的样品进行基因分型检测，根据基因分型的结果判断样本材料中是否具有低直链淀粉含量等位基因Wx^mq。

所述正向引物1的5'端加有FAM荧光信号标签，FAM标签序列为：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'；所述正向引物2的5'端加有HEX荧光信号标签，HEX标签序列为：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。

优选地，步骤2中PCR扩增反应体系为10μL，包括2×KASP Master mix5μL，KASPPrimer mix 0.14μL，模板DNA 1.0μL，ddH2O 3.86μL。

优选地，步骤2中PCR扩增反应程序如下：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。

优选地，步骤3中基因分型的方法是PCR扩增反应结束后，采用PHERAstar PLUS酶标仪检测PCR产物，然后将数据导入KlusterCaller数据处理软件进行分析。根据颜色分类，聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型。左下角显示黑色的样本为空白对照。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的检测水稻低直链淀粉含量基因Wx^mq的KASP分子标记(Wx^mq–KASP)，是根据Wx^mq基因第4外显子497bp处发生由G→A的突变开发得到，根据该发明提供的Wx^mq–KASP标记进行基因分型，在PCR扩增后不用酶切和电泳，可以高通量检测多个样品，大大提高了检测效率，为育种家筛选携带Wx^mq等位基因的水稻育种材料提供了一种高通量、低成本快速检测的方法，加快了育种进程。

附图说明

图1是利用Wx^mq–KASP分子标记对‘南粳9108’、‘申01B’及其杂交F₂代群体Wx等位基因的分型示意图(样品板中添加了‘南粳9108’、‘申01B’以及两者的混合DNA样品各一份作为阳性对照)。

图2是用CAPS标记对‘南粳9108’、‘申01B’及其杂交F₂代群体部分植株Wx等位基因的检测电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例进一步阐述本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例

1、水稻材料

所用实验材料为‘南粳9108’、‘申01B’以及两者杂交衍生的F₂代群体。‘南粳9108’是由江苏省农业科学院选育的携带低直链淀粉含量基因Wx^mq的软米粳稻品种。‘申01B’是上海市农业科学院作物育种栽培研究所选育的早熟晚粳保持系，中等直链淀粉含量。F₂代群体包含83个植株。2017年正季将供试材料种植于上海市农业科学院庄行综合试验站，常规水肥管理。

2、水稻叶片DNA提取

水稻叶片在分蘖期采集，取100mg叶片加入液氮充分研磨，磨好的粉末利用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。采用赛默飞世尔科技公司的Nanodrop 2000分光光度计进行DNA浓度测定，调整DNA浓度到40ng/μL。

3、KASP分子标记设计

本发明提供的KASP标记(Wx^mq–KASP)是根据Wx^mq基因编码区第4外显子SNP1突变位点开发得到，Wx^mq–KASP标记引物根据互补链SNP1位点前后各50bp的碱基序列进行设计，包括两条正向特异性引物和一条反向通用引物，两条正向引物分别对应FAM和HEX两种荧光信号，具体引物序列信息如下：

(1)正向引物1：5'-GATGAACACACGGTCGACTCCAT-3'；

正向引物2：5'-ATGAACACACGGTCGACTCCAC-3'；

反向通用引物：5'-GAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTA-3'。

(2)FAM标签序列为5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，HEX标签序列为

5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。

4、KASP分子标记Wx^mq–KASP的实施

(1)PCR扩增反应

将提取的DNA分别加入全裙边96孔板，配制反应体系进行PCR扩增反应。

PCR反应体系：反应体系总体积为10μL，包括2×KASP Master mix 5μL，KASPPrimer mix 0.14μL，模板DNA 1μL，ddH2O 3.86μL。

PCR反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。

(2)KASP分子标记Wx^mq–KASP的基因分型

反应结束后，采用PHERAstar PLUS酶标仪检测PCR产物，然后将数据导入KlusterCaller软件进行聚类分析。根据检测的两种荧光的颜色分类，聚合在接近X轴的显示蓝色的样本基因型为‘南粳9108’基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本基因型为‘申01B’基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型。

基因分型结果显示(图1)，83个单株被分成3组，其中21个单株与‘南粳9108’基因型相同，42个单株为杂合基因型，20个单株与‘申01B’基因型相同(图1)，符合1:2:1(χ²＝0.055,p>0.05)的分离比。F₂群体中共筛选出63个携带低直链淀粉含量等位基因Wx^mq的单株(表1)。

5、Wx^mq–KASP标记检测结果的验证

为了进一步验证Wx^mq–KASP标记检测结果的准确性，利用CAPS标记对“南粳9108”、“申01B”及其杂交F₂代群体的Wx等位基因进行检测。实验用CAPS标记引物、PCR扩增、NIaⅢ酶切和电泳检测方法参照文献(Wang C L,Zhang Y D,Zhu Z,Chen T,Zhao L,Lin J,ZhouL H.2009.Development of a new japonica rice variety Nan-jing 46with goodeating quality by marker assisted selection.Molecular Plant Breeding,7(6):1070-1076)。结果显示在83个杂交F₂代单株中，有21个单株表现为和‘南粳9108’一样的基因型，有20个单株表现为与‘申01B’一样的基因型，其余42个单株表现杂合基因型，与Wx^mq–KASP标记检测的结果完全一致(图2，表1)。该结果再次验证Wx^mq–KASP标记能够准确的检测出Wx^mq等位基因。

表1Wx^mq–KASP与CAPS标记基因分型结果的比对

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 检测水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP分子标记及方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgaacaca cggtcgactc cat 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacacac ggtcgactcc ac 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagagggtga ggtttttcca ttgcta 26

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims

1.检测水稻低直链淀粉含量基因Wx^mq的KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记(Wx^mq–KASP)的引物序列为：

正向引物1：5'-GATGAACACACGGTCGACTCCAT-3'；

正向引物2：5'-ATGAACACACGGTCGACTCCAC-3'；

反向通用引物：5'-GAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTA-3'。

2.根据权利要求1所述的检测水稻低直链淀粉含量基因Wx^mq的KASP分子标记，其特征在于，在合成Wx^mq–KASP分子标记对应的引物时，所述正向引物1的5'端加上FAM荧光信号标签，FAM标签序列为：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'；所述正向引物2的5'端加上HEX荧光信号标签，HEX标签序列为：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。

3.检测水稻低直链淀粉含量基因Wx^mq的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取水稻待测样本的DNA；

正向引物1：5'-GATGAACACACGGTCGACTCCAT-3'；

正向引物2：5'-ATGAACACACGGTCGACTCCAC-3'；

反向通用引物：5'-GAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTA-3'；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述正向引物1的5'端加有FAM荧光信号标签，FAM标签序列为：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'；所述正向引物2的5'端加有HEX荧光信号标签，HEX标签序列为：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中PCR扩增反应体系为10μL，包括2×KASP Master mix 5μL，KASP Primer mix 0.14μL，模板DNA 1.0μL，ddH2O 3.86μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中PCR扩增反应程序如下：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3中基因分型的方法为：PCR扩增反应结束后，采用酶标仪检测PCR产物，将数据导入KlusterCaller数据处理软件进行分析，根据颜色分类，聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型。左下角显示黑色的样本为空白对照。