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KR20250031230A - 핵산 전달을 위한 지질 나노입자 및 이의 사용 방법 - Google Patents

핵산 전달을 위한 지질 나노입자 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20250031230A
KR20250031230A KR1020247042280A KR20247042280A KR20250031230A KR 20250031230 A KR20250031230 A KR 20250031230A KR 1020247042280 A KR1020247042280 A KR 1020247042280A KR 20247042280 A KR20247042280 A KR 20247042280A KR 20250031230 A KR20250031230 A KR 20250031230A
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KR
South Korea
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lnp
mol
composition
lipid
total
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Pending
Application number
KR1020247042280A
Other languages
English (en)
Inventor
대릴 씨. 드럼몬드
드미트리 비. 키르포틴
마크 이. 헤이즈
알렉산더 코시카리예프
로스 비. 풀턴
Original Assignee
아카제라 메디신즈, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 아카제라 메디신즈, 인크. filed Critical 아카제라 메디신즈, 인크.
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Abstract

본 발명은 치료 핵산을 세포로 전달하기 위한, 이온화 가능한 지질 나노입자의 개선된 조성물을 제공한다. 포스파티딜세린과 포스파티딜글리세롤을 포함한 음이온성 인지질이 지질 나노입자에 포함되어, 인간 수지상 세포의 형질 전환 효율을 증가시킨다. 디메틸아미노프로필-디옥솔란이나 헤테로고리 케탈 이온화 가능한 지질에 단일불포화 알킬 사슬 유사체를 추가로 포함시킨 제제는 동일 계열의 다른 이온화 가능한 지질과 비교했을 때 인간 수지상 세포에서 높은 수준의 형질 전환을 보였으며 산화적 손상에 대한 안정성이 우수한 것으로 나타났다. 마지막으로, 포스파티딜세린의 암모늄염을 사용하면 PS로 표적화된 LNP를 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

핵산 전달용 지질 나노입자 및 관련된 사용 방법
관련 출원
본 특허 출원은 2022년 5월 25일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/345,823호, 2022년 5월 26일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/346,197호, 2023년 5월 25일에 출원된 미국 실용특허 출원 제18/324,097호의 이익과 우선권을 주장하며, 각각의 전체 내용은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
서열 목록의 참조
본 명세서는 2023년 5월 24일에 생성된 17,585 바이트 크기의 191016-010503.xml 파일을 포함하는 함께 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 이온화 가능한 양이온 지질 및 지질 나노입자(LNP)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이온화 가능한 양이온 지질(들)을 포함하는 LNP는 핵산 화합물의 전달, 수지상 세포 표적화 또는 이러한 LNP 조성물을 백신으로서 사용하는 방법에 유용하다. 일부 실시형태에서, LNP는 생체환원성 이온화 가능한 양이온 지질 또는 비접합 폴리올레핀계 이온화 가능한 양이온 지질을 포함할 수 있다.
배경
지질 나노입자(LNP)는 치료용 핵산을 세포에 전달하는 데 사용된다. 예를 들어, LNP 약학 조성물은 mRNA 치료제를 전달하기 위해 백신에 사용된다. LNP 제형은 전형적으로 이온화 가능한 양이온 지질(ICL)을 포함한다. 그러나, 특정 ICL 화합물은 저장하는 동안 산화에 민감하여 바람직하지 않다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 핵산과 같은 치료제와 함께 LNP에 포함될 때 세포에서 원하는 형질 전환 활성 또는 효능을 제공하면서 저장 중에 산화적 분해에 대해 개선된 안정성을 갖는 개선된 ICL 화합물이 필요하다.
SNALP 조성물은 다양한 감염성 질병에 대한 핵산 요법의 전달에 유용하다. 결핵, HIV/AIDS, 말라리아 및 COVID-19와 같은 전염병은 인간 건강에 중대한 문제를 제기한다. 예를 들어, 마이코박테리아는 결핵(TB)을 일으키는 박테리아의 속이다. 세계 보건 기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 TB는 상위 10대 사망 원인 중 하나이며 단일 감염원으로 인한 주요 사망 원인이다. 현재 최선의 노력에도 불구하고 많은 전염병을 예방하는데 효과적인 백신 개발에 상당한 어려움이 있었다. 개개의 항원 펩티드 또는 이들의 조합을 식별하기 위한 새로운 노력은 백신의 효율성을 개선하는 데 도움이 되었다. 그럼에도 불구하고 이러한 항원 서열을 수지상 세포와 같은 전문 항원 제시 세포에 효율적으로 전달하여 제시하는 데 도움이 되는 보조제를 조작함에 있어서 여전히 중요한 기회가 남아 있다. 이온화 가능한 양이온 지질 나노입자와 조합된 항원 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 mRNA가 백신 개발에서 특히 유망한 전략을 나타낸다. 백신 조성물을 포함하여 다양한 질병을 치료 및 예방하기 위한, mRNA 전달용 LNP 약학 조성물을 포함하는 안전하고 효과적인 치료법이 필요하다.
요약
본 발명의 양상들은 다음을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물에 관한 것이다: (a) 핵산; (b) 핵산에 대해 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질(여기서 이온화 가능한 지질은 다음의 화학 구조를 가지고:
,
여기서 R1은 1개 또는 2개의 올레핀을 함유하는 C15-C19의 알킬기이고, 이온화 가능한 양이온 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량으로 LNP 백신 조성물에 존재하고, 이온화 가능한 양이온 지질은 선택적으로 DLin-KC3-DMA, KC3-01, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), KC3-C15(C8:1) 화합물 3(표 1A), 화합물 8(표 1A) 군에서 선택됨); (c) LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45mol% 총량의 스테롤; (d) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질인 하나 이상의 인지질; 및 (e) LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5mol% 총량의 접합 지질.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, PS-지질은 DSPS 또는 DPPS이다.
일부 실시형태에서, 제2 인지질은 DSPC, HSPC, DPPC 및 스핑고미엘린으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 단일불포화 알킬 사슬 또는 이중불포화 알킬 사슬을 포함하며, 여기서 올레핀은 적어도 두 개의 메틸렌기에 의해 분리된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: KC3-01, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), KC3-C15(C8:1) 및 화합물 8(표 1A).
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 핵산에 대해 5-6의 N/P 비율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 핵산은 RNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 화학적으로 변형된 RNA이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 N-메틸슈도우리딘으로 변형된다.
본 발명의 다른 양상들은 다음을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: (a) 핵산; (b) 핵산에 대해 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질(여기서 이온화 가능한 지질은 다음의 화학 구조를 가지고:
,
여기서 R1은 1개 또는 2개의 올레핀을 함유하는 C15-C19의 알킬기이고, 여기서 이온화 가능한 양이온 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량으로 LNP 조성물에 존재하고, 이온화 가능한 양이온 지질은 선택적으로 화합물 3(표 1A), 화합물 8(표 1A), DLin-KC3-DMA, KC3-01, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), 및 KC3-C15(C8:1)의 군에서 선택됨); (c) LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45mol%의 총량의 스테롤; (d) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25 mol% 총량의 인지질인 하나 이상의 인지질(및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS) 지질을 포함); 및 (e) LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량의 접합 지질.
일부 실시형태에서, 제2 인지질은 DSPC, HSPC 및 스핑고미엘린으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 핵산에 대한 N/P 비율이 5-6이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 두 개의 단일불포화 알킬 사슬 또는 두 개의 이중불포화 알킬 사슬을 포함하며, 여기서 올레핀은 적어도 두 개의 메틸렌기에 의해 분리된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-01, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), KC3-C15(C8:1) 및 화합물 8(표 1A)의 군에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민(KC3-OA)이다.
일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시형태에서, mRNA는 N-메틸슈도우리딘을 이용하여 화학적으로 변형된다.
본 발명의 양상들은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: (a) 핵산; (b) LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질; (c) LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45 mol% 총량의 스테롤; (d) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25 mol% 총량의 하나 이상의 인지질; 및 (e) LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5mol% 총량으로 존재하며 연결 모이어티에 말단이 부착된 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬 및 동일한 연결 모이어티에 말단이 부착된 두 개의 탄화수소 사슬을 갖는 PEG-지질을 포함하는 접합 지질(여기서 탄화수소 사슬은 n-도데실(라우릴) 기 및 n-도데카노일(라우로일) 기에서 독립적으로 선택된 포화된 C12-사슬임).
일부 실시형태에서, 연결 모이어티는 글리세릴 기, N-옥시카르보닐 글리세로포스포릴 에탄올아미노카르보닐 기, 옥시카르보닐아미드 기, 또는 옥시아세트아미드 기이다. 일부 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 평균 분자량이 2000인 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 mPEG-1,2-디라우로일글리세롤(PEG-DLG), mPEG-1,2-디라우릴글리세롤(PEG-DLG), PEG-1,2-디라우릴글리세롤, PEG-DLPE, PEG-옥시카르보닐-N,N-디도데실아미드, 또는 mPEG-N,N-디도데실아세트아미드이다.
일부 실시형태에서, LNP는 60-150 nm의 z-평균 입자 크기를 갖고 동결-융해 안정성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량으로 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하고, 여기서 LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함한다.
본 발명의 양상은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 인간 백신 조성물에 관한 것이다: (a) 핵산; (b) LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 40-65mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질; (c) LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 25-45mol% 총량의 스테롤; (d) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질 및, LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.0-10mol% 총량의 포스파티딜글리세롤(PG)을 포함하는, 하나 이상의 인지질; 및 (e) LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5mol% 총량의 접합 지질.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: KC3-01, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), KC3-C15(C8:1) 및 화합물 8(표 1A).
일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이고, 포스파티딜글리세롤(PG)은 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG) 및 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG)로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질이다.
일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이고 이온화 가능한 양이온 지질은 핵산에 대해 4 내지 7의 N/P 비율로 존재한다.
일부 실시형태에서, 접합 지질은 PEG-DMG, PEG-DLG 및 PEG-DLPE 중에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC)으로 구성된 군에서 선택된 인지질을 포함한다.
본 발명의 양상은 지질을 포함하는 핵산 전달 조성물을 만드는 방법에 관한 것으로, 여기서 지질은 포스파티딜세린을 포함하고, 이 방법은 포스파티딜세린을 에탄올에 용해하는 단계를 포함하며, 여기서 포스파티딜세린은 포스파티딜세린의 암모늄염 형태이다.
일부 실시형태에서, 포스파티딜세린은 DPPS이다. 일부 실시형태에서, 포스파티딜세린은 0.2 mM 이상의 농도로 에탄올에 용해된다. 일부 실시형태에서, 암모늄염은 암모늄, 알킬암모늄, 디알킬암모늄, 트리알킬암모늄 및 테트라알킬암모늄으로 구성된 군에서 선택된 암모늄을 포함하는 염이다. 일부 실시형태에서, 암모늄 형태는 다음으로 구성된 군에서 선택된다: 암모니아, 디메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 2-(디메틸아미노)에탄올, 디에탄올아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸-글루카민, 이미다졸, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 4-(2-하이드록시에틸)-모르폴린, 피페라진, 1-(2-하이드록시에틸)-피롤리딘, 트리에탄올아민 또는 트로메타민(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄).
본 발명의 양상들은 핵산을 세포에 전달하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 지질 나노입자(LNP)를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 인간 수지상 세포이고, LNP 조성물은 본 발명의 양상들의 공정을 통해 얻어졌다.
일부 실시형태에서, LNP는 본 발명의 이온화 가능한 양이온 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포는 인간 또는 동물 대상체에 존재한다. 일부 실시형태에서, LNP는 대상체에게 근육내, 피하, 진피내 또는 국소적으로 투여된다.
본 발명의 양상은 다음을 포함하는 LNP 조성물에 관한 것이다: (a) 핵산(여기서 핵산은 mRNA임); (b) LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤인 스테롤; (c) LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질; (d) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25 mol% 총량의 인지질인 하나 이상의 인지질(이러한 하나 이상의 인지질은 (i) LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS) 지질의 암모늄염; 및 (ii) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25 mol% 총량의 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 인지질로 구성된 군에서 선택됨); 및 (e) LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량의 PEG 함유 접합 지질.
본 발명의 양상은 필요로 하는 대상체에게 핵산을 투여하는 방법에 관한 것으로, 인간 대상체에게 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산 LNP 조성물은 다음을 포함한다: (a) 핵산; (b) LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질; (c) LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 25-45mol% 총량의 스테롤; (d) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.0-10mol% 총량의 포스파티딜글리세롤(PG)을 포함하는 하나 이상의 인지질; 및 (e) LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5mol% 총량의 접합 지질.
본 발명의 양상은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: (a) 핵산; (b) LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 40-65mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질; (c) LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 25-45mol% 총량의 스테롤; (d) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질; 및 (e) LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5mol% 총량의 접합 지질. 일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이고; 이온화 가능한 양이온 지질은 핵산에 대해 4 내지 7의 N/P 비율로 LNP 조성물에 존재하고; 스테롤은 콜레스테롤이고; 접합 지질은 PEG를 함유하는 접합 지질이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 일치하지 않는 아실 사슬 길이를 갖는 적어도 두 개의 인지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 포스파티딜세린(PS) 지질은 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS)이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC)으로 구성된 군에서 선택된 인지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS)으로 구성된다. 일부 실시형태에서, PEG 함유 접합 지질은 PEG(2000)-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)이다.
본 발명의 양상은 LNP 조성물에 관한 것으로서, 이온화 가능한 지질은 다음의 화학 구조를 가지며:
,
여기서 R1은
이고,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알킬이며;
n은 2, 3 또는 4와 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, R2 및 R3은 각각 메틸이고, n은 3 또는 4이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1) 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-PA이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-OA이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-C17(C8:1)이다.
본 발명의 양상들은 KC3-PA, KC3-C17(8:1) 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택된 이온화 가능한 양이온 지질에 관한 것이다.
본 발명의 양상은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: (a) 핵산; (b) LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 40-65mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질; (c) LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 25-45mol% 총량의 스테롤; (d) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는, 하나 이상의 인지질; 및 (e) LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5 mol% 총량의 접합 지질.
일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 일치하지 않는 아실 사슬 길이를 갖는 인지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, PS 지질은 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS)이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC)으로 구성된 군에서 선택된 인지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 포스파티딜세린(PS)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민(KC3-OA)이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민(KC3-OA)이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS)으로 구성되고, 포스파티딜세린(PS)은 (L-세린)DPPS이다.
일부 실시형태에서, 상기 접합 지질은 PEG를 함유하는 접합 지질이고, 여기서 PEG를 함유하는 접합 지질은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: PEG(2000)-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG-DLPE), 및 PEG(2000)-디라우로일글리세롤(PEG-DLG).
일부 실시형태에서, 상기 핵산은 mRNA이고; 하나 이상의 인지질은 포스파티딜세린(PS)과 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC) 및 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인지질을 포함하고; 접합 지질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합 지질은 PEG(2000)-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민(KC3-OA)이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS)으로 구성된다.
일부 실시형태에서, 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS)은 (L-세린)DPPS의 암모늄염이다.
일부 실시형태에서, (a) 핵산은 mRNA이고; (b) 스테롤은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45 mol% 총량의 콜레스테롤인 스테롤이고; (c) 이온화 가능한 양이온 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량의 핵산에 대한 N/P 비율이 3 내지 8이고; (d) 하나 이상의 인지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25 mol% 총량으로 존재하고, 하나 이상의 인지질은 다음으로 구성되며: (i) LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS) 지질; 및 (ii) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25 mol% 총량의 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 인지질; (e) 접합 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5 mol% 총량의 PEG 함유 접합 지질이다.
일부 실시형태에서, PEG 함유 접합 지질은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: PEG(2000)-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG-DLPE), 및 PEG(2000)-디라우로일글리세롤(PEG-DLG).
본 발명의 양상은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 인간 백신 조성물에 관한 것이다: (a) 핵산; (b) LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 40-65mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질; (c) LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 25-45mol% 총량의 스테롤; (d) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질 및, LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.0-10mol% 총량의 포스파티딜글리세롤(PG)을 포함하는, 하나 이상의 인지질; 및 (e) LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5mol% 총량의 접합 지질.
일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이고, 포스파티딜글리세롤(PG)은 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG) 및 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG)로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질이다.
일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이고 이온화 가능한 양이온 지질은 핵산에 대해 4 내지 7의 N/P 비율로 존재한다.
본 발명의 양상은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이며, 여기서 이온화 가능한 양이온 지질은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: KC3-PA, KC3-C17(8:1), 및 KC3-C15(C8:1), KC3-OA 및 KC3-01:
;
;
;
; 및
본 발명의 양상들은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: (a) 핵산; (b) LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질; (c) LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45 mol% 총량의 스테롤; (d) LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25 mol% 총량의 하나 이상의 인지질; 및 (e) LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5mol% 총량의 접합 지질(여기서 접합 지질은 연결 모이어티에 말단이 부착된 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬 및 동일한 연결 모이어티에 말단이 부착된 두 개의 탄화수소 사슬을 갖는 PEG-지질이며, 여기서 탄화수소 사슬은 n-도데실(라우릴) 기 및 n-도데카노일(라우로일) 기에서 독립적으로 선택된 포화된 C12-사슬임).
일부 실시형태에서, 연결 모이어티는 글리세릴 기, N-옥시카르보닐 글리세로포스포릴 에탄올아미노카르보닐 기, 옥시카르보닐아미드 기, 또는 옥시아세트아미드 기이다. 일부 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 평균 분자량이 2000인 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 mPEG-1,2-디라우로일글리세롤(PEG-DLG), mPEG-1,2-디라우릴글리세롤(PEG-DLG), PEG-1,2-디라우릴글리세롤, PEG-DLPE, PEG-옥시카르보닐-N,N-디도데실아미드, 또는 mPEG-N,N-디도데실아세트아미드이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 특히 산화에 민감한 접합된 다중 불포화를 함유하는 리놀레산의 지질 에스테르의 산화적 분해 메커니즘의 묘사이다.
도 2는 Fab' 항체 단편의 환원된 c-말단 시스테인과 말레이미드 말단-폴리(에틸렌 글리콜) 2000 유도체화 디스테아로일포스파티딜에탄올아민의 반응을 나타낸다. R1과 R2는 스테아르산이다. 최종 항체 리포폴리머 접합체는 지질 나노입자의 외부 지질층에 후속적으로 삽입되어 이 입자를 능동적으로 표적화되게 하는 중간체이다.
도 3A 이온화 가능한 양이온 지질로서 DLin-KC2-DMA를 사용하여 제형화된 mCherry mRNA LNP를 사용한 수지상 세포(MutuDC1940)의 형질 전환 효율에 대한 0-2.5mol%로 포함된 DSPS의 영향. ICL은 50mol%, 콜레스테롤은 38.5mol%, PEG-DMG는 1.5mol%로 유지되었고 DSPS 함량은 다양했다. DSPS는 추가된 DSPS의 mol%만큼 DSPC 함량을 줄임으로써 포함되었다. 세포를 24시간 동안 1ug mRNA/mL의 농도에서 각 제형과 함께 인큐베이션하였다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다. Lipofect는 리포펙타민 처리 샘플을 지칭한다.
도 3B 이온화 가능한 양이온 지질로서 DLin-KC2-DMA를 사용하여 제형화된 mCherry mRNA LNP를 사용한 수지상 세포(MutuDC1940)의 형질 전환 효율에 대한 0-7.5mol%로 포함된 DSPS의 영향. ICL은 50mol%, 콜레스테롤은 38.5mol%, PEG-DMG는 1.5mol%로 유지되었고 DSPS 함량은 다양했다. DSPS는 추가된 DSPS의 mol%만큼 DSPC 함량을 줄임으로써 포함되었다. 세포를 24시간 동안 1ug mRNA/mL의 농도에서 각 제형과 함께 인큐베이션하였다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다. Lipofect는 리포펙타민 처리 샘플을 지칭한다.
도 3C 이온화 가능한 양이온 지질로서 DLin-KC2-DMA를 사용하여 제형화된 mCherry mRNA LNP를 사용한 수지상 세포(MutuDC1940)의 형질 전환 효율에 대한 0-7.5mol%로 포함된 DSPS의 영향. ICL은 50mol%, 콜레스테롤은 38.5mol%, PEG-DMG는 1.5mol%로 유지되었고 DSPS 함량은 다양했다. DSPS는 추가된 DSPS의 mol%만큼 DSPC 함량을 줄임으로써 포함되었다. 세포를 24시간 동안 0.3ug mRNA/mL의 농도에서 각 제형과 함께 인큐베이션하였다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 3D 이온화 가능한 양이온 지질로서 DLin-KC2-DMA를 사용하여 제형화된 mCherry mRNA LNP를 사용한 수지상 세포(MutuDC1940)의 형질 전환 효율에 대한 0-7.5mol%로 포함된 DSPS의 영향. ICL은 50mol%, 콜레스테롤은 38.5mol%, PEG-DMG는 1.5mol%로 유지되었고 DSPS 함량은 다양했다. DSPS는 추가된 DSPS mol%만큼 DSPC 함량을 감소시킴으로써 포함되었다. 세포는 0.1ug mRNA/mL의 농도에서 24시간 동안 각 제형과 함께 인큐베이션되었다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 4 다양한 ICL(KC2, KC2-OA, KC3-OA 및 SM-102) 및 5 mol% DSPS를 포함하는 LNP를 사용한 뮤린 수지상 세포(MutuDC1940)의 형질 전환 및 DSPS 대신 Glu-DSPE 또는 Suc-DSPE를 사용한 LNP와의 비교. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 5 DSPS 또는 DPPS는 KC2, KC2-01, KC2-PA, KC3-01 및 KC3-OA 포함 ICL들을 이용한 mCherry LNP 형질 전환을 증가시킨다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 6A 뮤린 수지상 세포를 형질 전환함에 있어서 AKG-UO-1과 함께 다양한 화학적 형태의 포스파티딜세린을 함유하는 LNP의 비교. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다. Lipo는 제조업체의 지침에 따라 LNP와 동일한 용량 수준으로 사용되는 리포펙타민 메신저맥스(Lipofect아민 MessengerMax, ThermoFisher)를 지칭한다.
도 6B AKG-UO1 함유 LNP를 사용하여 뮤린 수지상 세포를 형질 전환시키는 데 있어 DSPS와 그 외 음전하를 띤 인지질의 비교. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다. Lipo는 제조업체의 지침에 따라 LNP와 동일한 용량 수준으로 사용되는 리포펙타민 메신저맥스(Lipofect아민 MessengerMax, ThermoFisher)를 지칭한다.
도 7 AUG-UO-1 함유 LNP 내 DSPS 농도가 수지상 세포의 형질 전환에 미치는 영향. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 8 5 mol% DSPS 유무에 따른, AUG-UO-1 함유 LNP들 내 PEG-DMG 농도가 수지상 세포의 형질 전환에 미치는 영향. Y축은 조성물에 사용된 PEG %를 세포에 추가된 mRNA의 농도(0.11, 0.33 또는 1μg/mL)에 따라 나타낸다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 9A 2개의 올레핀 사이에 하나의 메틸렌이 있는 ICL(KC2, KC3 및 O-11769) 및 2개의 올레핀 사이에 4개의 메틸렌이 있는 ICL(KC2-01, KC3-01 및 UO-1)의 지질 현탁액의 산화적 분해.
도 9B O-11769(2개의 올레핀 사이에 하나의 메틸렌이 있는 ICL)를 함유하는 리포솜 및 UO-1(2개의 올레핀 사이에 4개의 메틸렌이 있는 ICL)을 함유하는 리포솜의 산화적 분해.
도 10A 뮤린 수지상 세포에서 1 μg/ml에서 KC2-01을 함유하는 LNP의 mCherry 발현에 대한 N/P의 효과. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 10B 뮤린 수지상 세포에서 0.33 μg/ml에서 KC2-01을 함유하는 LNP의 mCherry 발현에 대한 N/P의 효과. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 11 DSPS(7.5 mol%) 유무에 따른, 다양한 이온화 가능한 양이온 지질을 함유하는 LNP의 형질 전환 효율. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 12 뮤린 수지상 세포에서 다양한 농도의 DOPS(총 지질의 %로서 0, 10 및 25mol%) 및 mCherry mRNA를 함유하는 LNP 제형의 형질 전환 효율.
도 13A SARS-COV2 스파이크 단백질 생성 서열인 VRN-029의 mRNA 서열.
도 13B LNP 백신 면역원성에 대한 PEG-DMG(C14) 농도(mol%)의 효과. PEG-DMG의 mol%를 증가시키면서 7.5% DSPS 및 이온화 가능한 지질 UO1을 사용한 mRNA-LNP로 면역화된 마우스로부터 얻은 총 항-스파이크 항체 역가 및 CD4 반응. 중간 그래프는 34일차 종점에서의 항체 역가를 보여준다. 오른쪽 그래프는 해당 CD4 T 세포 반응을 보여준다.
도 13C LNP 백신 면역원성에 대한 PEG-DPPE(C16) 농도(mol%)의 효과. PEG-DPPE의 mol%를 증가시키면서 7.5% DSPS 및 이온화 가능한 지질 UO1을 사용한 mRNA-LNP로 면역화된 마우스에서 얻은 총 항-스파이크 항체 역가. 중간 그래프는 34일차 종점에서의 항체 역가를 보여준다. PEG-DPPE의 mol%는 항체 수준에 역으로 영향을 미쳤다. 오른쪽 그래프는 해당 CD4 T 세포 반응을 보여준다.
도 13D 1.5 mol% PEG-DMG(14C) 또는 PEG-DSG(18C)와 함께 7.5% DSPS 및 이온화 가능한 지질 KC2OA를 사용한 mRNA-LNP로 면역화된 마우스에서 얻은 총 항-스파이크 항체 역가 및 CD4 반응. 왼쪽 그래프는 34일차 종점 항체 역가를 보여준다. 오른쪽 그래프는 해당 CD4 T 세포 반응을 보여준다.
도 13E 1.5 mol% PEG-DMG(14C) 또는 PEG-DSG(18C)와 함께 7.5% DSPS 및 이온화 가능한 지질 UO1을 사용한 mRNA-LNP로 면역화된 마우스로부터의 총 항-스파이크 항체 역가 및 CD4 반응. 왼쪽 그래프는 34일차 종점 항체 역가를 보여준다. 오른쪽 그래프는 해당 CD4 T 세포 반응을 보여준다.
도 13F mRNA-LNP 면역원성에서 포스파티딜세린 포함의 효과. 다양한 이온화 가능한 지질 및 PEG-지질 +/- 7.5 mol% DSPS를 사용하여 mRNA-LNP로 면역화된 마우스에서 얻은 총 항-스파이크 항체 역가(A) 및 스파이크 특이적 CD4 T 세포 반응. 항체 데이터를 로그 변환하고 Sidak의 다중 비교 검정과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 분석하였다. CD4 T 세포 데이터는 Sidak의 다중 비교 검정과 함께 REML 혼합 효과 모델을 사용하여 분석되었다.
도 13G B 세포(패널 A) 및 T 세포(패널 B) 반응의 mRNA-LNP 프라이밍에 대한 포스파티딜세린 지질 테일(DPPS 대 DSPS) 조성의 효과. 항체 데이터를 로그 변환한 다음 분석하였다. Tukey의 다중 비교 검정과 함께 일원 ANOVA를 사용하여 데이터를 분석했다.
도 14A 24시간 동안 1 μg/mL mRNA에서 KC2-01 LNP, 7.5 mol% DSPS(D 이성질체) 및 DSPS(L 이성질체)의 mCherry 발현 비교.
도 14B 24시간 동안 0.33 μg/mL mRNA에서 KC2-01 LNP, 7.5 mol% DSPS(D 이성질체) 및 DSPS(L 이성질체)의 mCherry 발현 비교.
도 15 24시간 동안 1 μg/mL mRNA에서 5 및 7.5 mol% DSPS(L-이성질체) 유무에 따른 KC2 LNP의 mCherry 발현을 SM-102 또는 ALC-0315를 사용하여 제조된 LNP와 비교. Y축은 평균 형광 강도(MFI)이다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 16 24시간 동안 1μg/mL mRNA에서 UO1, UO6 및 UO7 제형 단독 또는 7.5mol% D-이성질체 DSPS를 추가한 경우의 mCherry 발현을 비교. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 17 24시간 동안 1μg/mL mRNA에서 UO1, SM102, ALC-0315 제형 단독 또는 DSPS를 추가한 이들 제형의 mCherry 발현을 비교. Lipo는 제조업체의 지침에 따라 LNP와 동일한 용량 수준으로 사용되는 리포펙타민 메신저맥스(Lipofect아민 MessengerMax, ThermoFisher)를 지칭한다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 18 두 개의 올레핀 사이에 단일 메틸렌을 갖는 다중불포화 ICL인 KC3(DLin-KC3-DMA)를 함유한 리포솜이 단일불포화 알킬 사슬을 갖는 ICL(KC3-OA, KC3-PA 또는 KC3-C17(C8:1))과 완전히 포화된 ICL인 KC3-C17을 함유한 리포솜으로 산화 분해되는 모습. CAD-HPLC로 측정한 개별적인 이온화 가능한 양이온 지질의 안정성에 미치는 과산화수소의 영향.
도 19 인간 수지상 세포에서 24시간 동안 0.1 및 1 μg/mL mRNA에서 UO1, UO1A 및 KC3-OA LNP 제형 단독 또는 DSPS를 추가한 경우의 mCherry 발현을 비교. 비처리 DC 샘플은 LNP가 추가되지 않은 인간 수지상 세포에 해당한다.
도 20 뮤린 수지상 세포에서 24시간 동안 0.3 또는 1 μg/mL mRNA에서 다중불포화 KC3, 단일불포화 KC3-OA, KC3-PA 또는 KC3C17(C8:1) 및 완전히 포화된 KC3C17(모두 DPPS(NH4 + 염) 유무에 따라 구분)을 함유하는 LNP의 mCherry 발현 비교. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 21 인간 수지상 세포에서 24시간 동안 0.1 또는 1 μg/mL mRNA에서 두 개의 올레핀 사이에 단일 메틸렌을 갖는 다중불포화 KC2 또는 KC3, 두 개의 올레핀 사이에 네 개의 메틸렌을 갖는 다중불포화 KC3-01, 단일불포화 KC3-OA, KC3-PA 또는 KC3C17(C8:1) 및 ALC-0315(ALC-0315를 제외하고 모두 DPPS(NH4 + 염) 추가)를 함유하는 LNP의 mCherry 발현 비교. 비처리 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포에 해당한다.
도 22 인간 수지상 세포에서 24시간 동안 0.1 및 1 μg/mL mRNA에서 5 mol % DSPS와 46-54 mol % KC3-OA를 함유한 LNP 제형의 mCherry 발현을 ALC-0315 및 SM-102 LNP 대조군과 비교. 비처리 DC 샘플은 LNP가 추가되지 않은 인간 수지상 세포에 해당한다.
도 23 인간 수지상 세포에서 24시간 동안 0.1 μg/mL mRNA에서 N/P 비율 4-7로 0 또는 5 mol % DSPS와 50 mol % KC2-O1을 추가한 LNP 제형의 mCherry 발현을 비교. 이들을 또한 N/P 5로 KC3-OA와 5 mol% DSPS를 함유하는 LNP와 비교하였다. 비처리 DC 샘플은 LNP가 추가되지 않은 인간 수지상 세포에 해당한다.
도 24A 다중불포화 KC3를 함유하는 LNP 제형과 단일불포화 KC3-OA 및 KC3-PA를 함유하는 LNP 제형들의 백신 면역원성을 비교. KC3, KC3-OA 또는 KC3-PA를 함유한 5 mol % DSPS 또는 DPPS로 표적화된 LNP를 사용한 mRNA-LNP로 면역화된 마우스의 총 항-스파이크 항체 역가. KC3-OA 및 KC3-PA LNP의 경우, 각 제형은 C16 DPPC 또는 C18 DSPC 중성 포스파티딜콜린 성분을 사용하여 평가되었다. 모든 LNP에는 1.5 mol%의 PEG-DMG가 포함되어 있다. 그래프는 마우스 한 마리당 1 μg/mL mRNA의 초기 프라임 주입 후 21일차 종점 항체 역가를 보여준다.
도 24B 다중불포화 KC3을 함유하는 LNP 제형을 단일불포화 KC3-OA 및 KC3-PA를 함유하는 LNP 제형들의 백신 면역원성을 비교. KC3, KC3-OA 또는 KC3-PA를 함유한 5 mol % DSPS 또는 DPPS로 표적화된 LNP를 사용한 mRNA-LNP로 면역화된 마우스의 총 항-스파이크 항체 역가. KC3-OA 및 KC3-PA LNP의 경우, 각 제형은 C16 DPPC 또는 C18 DSPC 중성 포스파티딜콜린 성분을 사용하여 평가되었다. 모든 LNP에는 1.5 mol%의 PEG-DMG가 포함되어 있다. 그래프는 마우스 한 마리당 1 μg/mL mRNA를 프라임 투여 그리고 이후 21일차에 부스트 투여한 후 34일차 종점 항체 역가를 보여준다.
도 25A 인간 수지상 세포에서 24시간 동안 1μg/mL mRNA에서 5mol % DSPS 및 43-48mol % KC3-OA를 함유한 LNP 제형과 ALC-0315 및 SM-102 LNP 대조군의 mCherry 발현 비교. 총 지질의 45mol % KC3-OA 및 5mol % DSPS로 제조한 KC3-OA LNP도 5, 5.5, 6.0 및 6.5의 N/P 비율에서 비교했다. 마지막으로, N/P가 5 및 6인 45 mol% KC3-OA를 함유한 LNP는 1.5 mol% PEG-DMG 대신 1 또는 3 mol%의 PEG-SA를 사용하여 평가되었다. 비처리 DC 샘플은 LNP가 추가되지 않은 인간 수지상 세포에 해당한다.
도 25B 인간 수지상 세포에서 24시간 동안 0.1 μg/mL mRNA에서 5mol % DSPS 및 43-48mol % KC3-OA를 함유한 LNP 제형과 ALC-0315 및 SM-102 LNP 대조군의 의 mCherry 발현 비교. 총 지질의 45mol % KC3-OA 및 5mol % DSPS로 제조한 KC3-OA LNP도 5, 5.5, 6.0 및 6.5의 N/P 비율에서 비교했다. 마지막으로, N/P가 5 및 6인 45 mol% KC3-OA를 함유한 LNP는 1.5 mol% PEG-DMG 대신 1 또는 3 mol%의 PEG-SA를 사용하여 평가되었다. 비처리 DC 샘플은 LNP가 추가되지 않은 인간 수지상 세포에 해당한다.
도 26A 1 μg/mL mRNA에서 24시간 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서 7.5 mol%의 다양한 음이온성 인지질이 추가된 50 mol% UO-1을 함유하는 LNP 제형의 mCherry 발현 비교. 모든 LNP에는 2.5 mol%의 DSPC, 50 mol%의 UO-1, 1.5 mol%의 PEG-DMG가 포함되었다. 음이온성 인지질에는 포스파티딜세린, DOPS, DSPS, DPPS 및 DMPS, 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 및 N-글루타릴-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Glu-DSPE) 및 N-석시닐-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Suc-DSPE)이 포함되었으며 7.5 mol%로 포함되었지만, DSPG는 5와 7.5 mol%를 비교하였다.
도 26B 0.1 μg/mL mRNA에서 24시간 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서 7.5 mol%의 다양한 음이온성 인지질과 함께 50 mol% UO-1을 함유하는 LNP 제형의 mCherry 발현 비교. 모든 LNP에는 2.5 mol%의 DSPC, 50 mol%의 UO-1, 및 1.5 mol%의 PEG-DMG가 포함되었다. 음이온성 인지질에는 포스파티딜세린, DOPS, DSPS, DPPS 및 DMPS, 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 및 N-글루타릴-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Glu-DSPE) 및 N-석시닐-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Suc-DSPE)이 포함되었으며 7.5 mol%로 포함되었지만, DSPG는 5와 7.5 mol%를 비교하였다.
도 27A 1 μg/mL mRNA에서 24시간 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서 0-10 mol%의 DSPG와 함께 UO-1 또는 KC3-01을 함유하는 LNP 제형의 mCherry 발현을 비교. 1 μg/mL mRNA에서 ALC-0315 및 SM-102 LNP 대조군도 포함되었으며, 비처리 DC 샘플은 LNP가 추가되지 않은 인간 수지상 세포에 해당한다.
도 27B 0.1 μg/mL mRNA에서 24시간 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서 0-10 mol%의 DSPG와 함께 UO-1 또는 KC3-01을 함유하는 LNP 제형의 mCherry 발현 비교. 0.1 μg/mL mRNA에서 ALC-0315 및 SM-102 LNP 대조군도 포함되었으며, 비처리 DC 샘플은 LNP가 추가되지 않은 인간 수지상 세포에 해당한다.
도 28 뮤린 수지상 세포에서 1 μg/mL mRNA에서 24시간 인큐베이션 후 7.5 mol % DSPS와 함께 UO1, UO6 또는 UO7을 함유한 LNP의 mCherry 발현 비교. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 29 디리놀레일 KC2, 단일불포화 KC3-OA 및 4가지 메틸렌 중단형 다중불포화 ICL(KC3-01, AKG-UO1 및 AKG-UO9)을 함유하는 LNP 제형들이 백신 면역원성에 미치는 영향을 비교. ALC-0315 함유 LNP가 대조군으로 포함되었다. 모든 LNP에는 1.5 mol%의 PEG-DMG가 포함되어 있다. mRNA-LNP로 면역화된 마우스의 총 항-스파이크 항체 역가는 1일차에 마우스 한 마리당 1μg mRNA를 초기 프라임 주사 후 21일차에 측정되었다.
도 30A 1 μg/mL mRNA에서 24시간 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서 5 mol%의 다양한 음이온성 인지질이 포함된 48 mol% KC3-OA을 함유하는 LNP 제형들의 mCherry 발현 비교. 모든 LNP에는 2.5 mol%의 DSPC, 50 mol%의 UO-1, 및 1.5 mol%의 PEG-DMG가 포함되었다. 음이온성 인지질에는 포스파티딜글리세롤, DOPG, DSPG, DPPG, DMPG뿐만 아니라 DSPS도 포함된다. 일부 LNP에서, DSPG와 DSPS는 단독으로 또는 DSPC와 함께 조합되었다. 이 연구에서는 두 명의 공여체가 인간 수지상 세포를 생산하는 데 사용되었으며, 비처리 DC 샘플은 LNP가 추가되지 않은 인간 수지상 세포에 해당한다.
도 30B 0.1 μg/mL mRNA에서 24시간 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서 5 mol%의 다양한 음이온성 인지질과 함께 48 mol% KC3-OA을 함유하는 LNP 제형의 mCherry 발현 비교. 모든 LNP에는 2.5 mol%의 DSPC, 50 mol%의 UO-1, 및 1.5 mol%의 PEG-DMG가 포함되었다. 음이온성 인지질에는 포스파티딜글리세롤, DOPG, DSPG, DPPG, 및 DMPG 뿐만 아니라 DSPS도 포함된다. 일부 LNP에서, DSPG와 DSPS는 단독으로 또는 DSPC와 함께 조합되었다. 이 연구에서는 두 명의 공여체가 인간 수지상 세포를 생산하는 데 사용되었으며, 비처리 DC 샘플은 LNP가 추가되지 않은 인간 수지상 세포에 해당한다.
도 31 24시간 동안 1 μg/mL mRNA에서 인큐베이션 후 뮤린 수지상 세포에서 5 mol% DSPS(Na+ 염) 또는 5 mol% DPPS(NH4+ 염)와 함께 KC3-OA LNP를 함유하는 LNP들의 mCherry 발현 비교. 1 μg/mL mRNA에서 ALC-0315 및 SM-102 LNP 대조군도 포함되었다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 32. 형광 지질 라벨 DiIC18(5)-DS(DiI5-DS)로 라벨된 mCherry mRNA의 다양한 LNP 제형(0.2 μ과 함께 인큐베이션된 MutDC1940 세포에서 시간에 따른 LNP 흡수 그래프(실시예 47). 지정된 시간에 LNP 흡수량은 라벨(RL-1 형광 채널)의 유세포 분석법을 통해 정량화되고 세포 형광 강도 중앙값으로 플롯된다. 데이터는 3회 반복 실험의 평균이다. 오차 막대, 표준 편차. 제형: AKG + PS, KC3OA+PS; AKG - PS, KC3OA-PS; SM102; ALC-0315. 비처리는 LNP 처리를 하지 않은 세포를 지칭한다.
도 33. 형광 지질 라벨 DiIC18(5)-DS(DiI5-DS)로 라벨된 mCherry mRNA의 다양한 LNP 제형(0.2 μ과 함께 인큐베이션된 MutuDC1940 세포에서 시간에 따른 LNP mRNA 발현 그래프(실시예 47). 지정된 시간에 mCherry 단백질 발현은 단백질 형광(YL-2 형광 채널)을 통한 유세포 분석법으로 정량화되었고 세포 형광 강도의 중앙값으로 플롯되었다. 데이터는 3회 반복 실험의 평균이다. 오차 막대, 표준 편차. 제형: AKG + PS, KC3OA+PS; AKG - PS, KC3OA-PS; SM102; ALC-0315. 비처리는 LNP 처리를 하지 않은 세포를 지칭한다.
도 34. DiI5-DS 라벨된 LNP의 MutuDC1940 세포의 흡수에 대한 10x LNP 지질 농도에서 “차단 리포솜”으로 전처리한 세포의 효과(실시예 48). 리포솜은 LNP를 추가하기 15분 전에 추가되었다. LNP 노출 1시간 후 LNP 흡수는 유세포 분석기(RL1-A 채널)를 통해 DiI5-DS 형광으로 측정되었으며 세포 형광 강도의 중앙값으로 플롯되었다. 데이터는 4회 반복 실험의 평균이다. 오차 막대, 표준 편차. LNP 유형은 수평축에 표시된다. 범례는 “차단 리포솜”에서의 PS 성분의 양과 성질을 나타낸다. “%”는 총 지질에 대한 차단 리포솜 제형에서의 PS의 mol%를 나타낸다.
도 35. 다양한 ICL로 제조된 mCherry mRNA-LNP 구조체들(0.3 μg/mL mRNA)와 함께 3시간 인큐베이션한 후 MutuDC1940 세포에서의 mCherry 발현에 대한 PS 표적화제의 효과(실시예 49). 발현은 mCherry 단백질 형광(YL2-A 형광 채널)을 통한 유세포 분석법으로 정량화되었고 세포 형광 강도의 중앙값으로 플롯되었다. 데이터는 4회 반복 실험의 평균이다. 오차 막대, 표준 편차. ICL: UO1, KC2, KC3OA. 표적화 PS: DPPS, DSPS, D-DSPS, 표적화 없음(NT). UT는 LNP 처리를 하지 않은 세포를 지칭한다.
도 36. 다양한 ICL로 제조된 mCherry mRNA-LNP 구조체들(0.3 μg/mL mRNA)과 함께 24시간 인큐베이션한 후 MutuDC1940 세포에서의 mCherry 발현에 대한 PS 표적화제의 효과(실시예 49). 발현은 mCherry 단백질 형광(YL2-A 형광 채널)을 통한 유세포 분석법으로 정량화되었고 세포 형광 강도의 중앙값으로 플롯되었다. 데이터는 4회 반복 실험의 평균이다. 오차 막대, 표준 편차. ICL: UO1, KC2, KC3OA. 표적화 PS: DPPS, DSPS, D-DSPS, 표적화 없음(NT). UT는 LNP 처리를 하지 않은 세포를 지칭한다.
도 37. 다양한 ICL로 제조된 mCherry mRNA-LNP 구조체들(0.3 μg/mL mRNA)과 함께 3시간 인큐베이션한 후 MutuDC1940 세포에서의 LNP 흡수에 대한 PS 표적화제의 효과(실시예 49). 발현은 DiI5-DS (DiI) 지질 라벨 형광(RL1A 형광 채널)을 통한 유세포 분석법으로 정량화되었고 세포 형광 강도의 중앙값으로 플롯되었다. 데이터는 4회 반복 실험의 평균이다. 오차 막대, 표준 편차. ICL: UO1, KC2, KC3OA. 표적화 PS: DPPS, DSPS, D-DSPS, 표적화 없음(NT). UT는 LNP 처리를 하지 않은 세포를 지칭한다.
도 38. 다양한 ICL로 제조된 mCherry mRNA-LNP 구조체들(0.3 μg/mL mRNA)과 함께 24시간 인큐베이션한 후 MutuDC1940 세포에서의 LNP 흡수에 대한 PS 표적화제의 효과(실시예 49). 발현은 DiI5-DS (DiI) 지질 라벨 형광(RL1A 형광 채널)을 통한 유세포 분석법으로 정량화되었고 세포 형광 강도의 중앙값으로 플롯되었다. 데이터는 4회 반복 실험의 평균이다. 오차 막대, 표준 편차. ICL: UO1, KC2, KC3OA. 표적화 PS: DPPS, DSPS, D-DSPS, 표적화 없음(NT). UT는 LNP 처리를 하지 않은 세포를 지칭한다.
도 39. PEG-DMG 및 다양한 양의 PEG-DLG로 제조된 KC3OA/DPPS LNP에 제형화된 mCherry mRNA(0.3 μ의 LNP 제형에 의한, MutuDC1940 세포에 전달된 mCherry mRNA의 발현(실시예 50). 발현은, 1.0 및 0.1 μg/mL mRNA의 LNP로 형질 전환하고 24시간 후에 mCherry 형광의 유세포 분석법을 통해 정량화되었다. 두 명의 공여체로부터 PBMC를 채취하여 각각 3회 반복으로 실험하였다. 막대는 조합된 공여체 중복 데이터의 평균이다. LNP 조성은 X축에 표시된다. “%”는 총 LNP 지질에 대한 PEG-지질 성분의 mol%를 나타낸다.
도 40. PRG-DMG 또는 PEG-DLG를 함유하는 KC3-PA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-지질 LNP에 제형화된 VRN029 스파이크 mRNA로 면역화된 Balb/C 마우스(N=5) 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 51). 혈청은 1 μg mRNA/마우스의 부스트 투여 후 2주차(프라임 투여 후 35일차)에 수집되었다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. PEG-지질 표시에서 숫자는 LNP 총 지질에 대한 PEG-지질의 mol%이다. 점선은 적정 검정에서 검출 상한을 보여준다.
도 41A. PEG-DMG 또는 PEG-DLG를 함유하는 KC3-OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-지질 LNP에 제형화된 VRN029 스파이크 mRNA로 면역화된 Balb/C 마우스(N=5) 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 52). 혈청은 1 μg mRNA/마우스의 mRNA-LNP 프라임 투여 후 3주 후에 수집되었다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. 두 군들 간의 차이는 통계적으로 유의하다. 점선은 적정 검정에서 검출 하한을 보여준다.
도 41B. 다양한 양의 DPPS와, PEG-DMG 또는 PEG-DLG를 함유하는 KC3-OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-지질 LNP에 제형화된 VRN029 스파이크 mRNA로 면역화된 Balb/C 마우스(N=5) 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 52). 혈청은 프라임 투여 후 3주차에 1 μg mRNA/마우스의 부스트 mRNA-LNP를 투여한 후 2주 후에 채취하였다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. 점선은 적정 검정에서 검출 하한을 보여준다. “%”는 총 LNP 지질에 대한 지질 성분의 mol%를 나타낸다.
도 42. 다양한 양의 PEG-DMG 또는 PEG-DLPE로 제조된 KC3OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-지질 LNP에 의해 인간 PBMC 유래 수지상 세포에 전달된 mCherry mRNA의 발현(실시예 53). 발현은 0.3 μg/mL mRNA의 LNP로 형질 전환하고 24시간 후에 mCherry 형광의 유세포 분석법을 통해 정량화되었다. 막대는 중복 실험의 세포 형광 강도 평균 중앙값을 보여준다. 오차 구간은 표준 편차이다. Mol% PEG-지질은 총 LNP 지질에 대한 mol%를 지칭한다.
도 43A. 다양한 양의 DPPS를 함유하는 KC3-OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-DMG LNP에 제형화된 VRN029 스파이크 mRNA로 면역화된 Balb/C 마우스(N=5) 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 54). 혈청은 0.3μg mRNA/마우스의 프라임 mRNA 투여 후 20일차에 수집되었다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. 별표는 p=0.05에서 군들 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸다. p값이 0.059인 군도 표시된다. 점선은 적정 검정에서 검출 하한을 보여준다. LNP 지질 조성 라벨에서 숫자는 총 LNP 지질에 대한 각 성분의 mol%이다.
도 43B. 다양한 양의 PEG-DMG 또는 PEG-DLG를 함유하는 KC3-OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-지질 LNP에 제형화된 그리고 ALC-0315-기반 비표적화 LNP 제형의 VRN029 스파이크 mRNA로 면역화된 Balb/C 마우스(N=5) 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 54). 혈청은 0.3 μg mRNA/마우스의 프라임 mRNA-LNP 투여 후 3주차에 이루어진 부스트 주사 후 2주차에 채취하였다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. 점선은 적정 검정에서 검출 하한을 보여준다. LNP 지질 조성 라벨에서 숫자는 총 LNP 지질에 대한 각 성분의 mol%이다.
도 43C. PS 성분으로서 총 LNP 지질에 대해 5 mol%의 DSPS-Na 또는 DPPS-NH4를 함유하고, PEG-지질 성분으로서 총 LNP 지질에 대해 1.5 mol%의 PEG-DMG 또는 PEG-DLG를 함유하는 KC3-OA/DSPC/PS/Chol/PEG-지질 LNP에 제형화된 VRN029 스파이크 mRNA로 면역화된 Balb/C 마우스(N=5) 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 54). 혈청은 0.3 μg mRNA/마우스의 프라임 mRNA-LNP 투여 후 3주차에 이루어진 부스트 주사 후 2주차(프라임 투여 후 35일차)에 채취하였다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. 점선은 적정 검정에서 검출 하한을 보여준다. LNP 지질 조성 라벨에서 숫자는 총 LNP 지질에 대한 PEG-지질의 mol%이다.
도 44. KC3-OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-DMG LNP 또는 ALC-0315 LNP로 제형화된 다양한 SARS-COV-2 스파이크 mRNA(VRN029, VRN118, VRN119)로 면역화된 Balb/C 마우스(N=5) 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 55). 혈청은 0.3μg mRNA/마우스의 프라임 mRNA-LNP 투여 후 20일차에 수집되었다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. 점선은 적정 검정에서 검출 하한을 보여준다.
도 45A. ALC-0315-기반 LNP, SM-102-기반 LNP, 또는 KC3-OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-DMG LNP에 제형화된 VRN029 스파이크 mRNA로 면역화된 Balb/C 마우스(N=5) 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 56). 혈청은 0.1, 0.3, 또는 1.0 μg mRNA/마우스의 프라임 mRNA-LNP 투여 후 3주차에 이루어진 부스트 주사 후 2주차(프라임 투여 후 35일차)에 채취하였다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. 점선은 적정 검정에서 검출 하한을 보여준다. LNP 지질 조성 라벨에서 숫자는 총 LNP 지질에 대한 PEG-지질의 mol%이다.
도 45B. 다양한 양의 PEG-DMG가 추가된 KC3-OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-DMG LNP에 제형화되고 다양한 용량으로 투여된 VRN029 스파이크 mRNA로 면역화된 Balb/C 마우스(N=5) 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 56). 혈청은 0.1, 0.3, 또는 1.0 μg mRNA/마우스 용량의 프라임 mRNA-LNP 투여 후 3주차에 이루어진 부스트 주사 후 2주차(프라임 투여 후 35일차)에 채취하였다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. 점선은 적정 검정에서 검출 하한을 보여준다. LNP 지질 조성 라벨에서 숫자는 총 LNP 지질에 대한 상응하는 지질 성분의 mol%이다.
도 46A. KC3-OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-DMG(표적화된 KC3-OA) LNPs , KC3-OA/DSPC/Chol/PEG-DMG(비표적화된, KC3-OA) LNPs, 또는 ALC-0315 LNP에 제형화된 VRN029 스파이크 mRNA로 면역화된 Balb/C 마우스 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 57). 혈청은 0.1 μg mRNA/마우스 용량의 프라임 mRNA-LNP 투여 후 20일차에 수집되었다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. 점선은 적정 검정에서 검출 하한을 보여준다.
도 46B. KC3-OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-DMG(표적화된 KC3-OA) LNPs , KC3-OA/DSPC/Chol/PEG-DMG(비표적화된, KC3-OA) LNPs, 또는 ALC-0315 LNP에 제형화된 VRN029 스파이크 mRNA로 면역화된 Balb/C 마우스 혈청에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체 역가(실시예 57). 혈청은 0.1 μg mRNA/마우스 용량의 프라임 mRNA-LNP 투여 후 3주차에 이루어진 부스트 주사 후 2주차(프라임 투여 후 35일차)에 채취하였다. ELISA 검사의 평가변수로서 4x 배경을 사용하여 역가를 결정했다. 막대는 해당 군 전체의 기하평균 역가를 나타내고, 오차 구간은 로그 변환된 데이터의 표준 편차이며, 마커는 개별 동물의 역가를 보여준다. 점선은 적정 검정에서 검출 하한을 보여준다.
도 47A 및 도 47B. UO-1 계열의 이온화 가능한 양이온 지질에 대한 합성 반응식.
도 48 KC2-01 및 KC3-01 이온화 양이온 지질에 대한 합성 반응식.
도 49. 단일불포화 KC2-0A, KC2-PA 및 KC3-OA 이온화 가능 양이온 지질에 대한 합성 반응식.
도 50. 단일불포화 KC3-C17(C8:1) 및 완전 불포화 KC3-C17 이온화 가능 양이온 지질에 대한 합성 반응식.
도 51 디스테아로일포스파티딜-D-세린의 합성 반응식.
상세한 설명
전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명 모두는 단지 청구범위의 예시 및 설명을 위한 것이며 본 발명의 조성물 및 방법을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
리포좀 나노입자(LNP) 조성물은 이온화 가능한 지질, 스테롤 및 하나 이상의 인지질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 백신과 같은 약학 조성물에 투여하기 위한 mRNA와 같은 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 선택적으로 접합 지질을 추가로 포함한다.
mRNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물은 mRNA 또는 기타 핵산 치료제의 전신 전달을 위한 비히클로 사용되는 안정화된 핵산 지질 입자(SNALP)이다. SNALP 조성물은 단일 메틸렌 기(예: 리놀레산)에 의해 분리된 한 쌍의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 한 쌍의 선형 18 탄소 지방족 사슬에 결합된 양성자화 가능한 3차 아민 헤드 기를 포함하는, MC3 또는 KC2와 같은 양이온 지질을 포함한다. 그러나, 각각 단일 메틸렌 기에 의해 분리된 한 쌍의 이중 결합을 포함하는 이들 탄화수소 사슬의 구조가 SNALP 조성물에 바람직한 생물학적 특성을 부여하는 반면, 이러한 화학적 하위 구조는 또한 산화 분해에 대한 화합물의 민감도 증가라는 바람직하지 않은 문제를 가져온다. 에를 들어, 도 1은 특히 산화에 민감한, 접합된 다중 불포화를 함유하는 리놀레산의 지질 에스테르의 산화적 분해 메커니즘을 도시한다. 필요한 것은 SNALP 조성물에 사용하기에 적합하지만 산화적 분해에 대한 향상된 내성을 갖는 신규한 양이온 지질이다.
박테리아 감염의 치료와 관련된 화합물, 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “화합물”“약물”및 “활성제”는 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 일부 양상은 신규한 이온화 가능한 지질 또는 생체환원성 이온화 가능한 지질에 관한 것이다. 이들 지질은 세포에 의한 세포내이입 또는 식균작용 후에 세포내에서 발생하는 것과 같이 산성 pH에서 양이온성이다(즉, 양전하를 띤다). 동일한 지질 및 이를 함유하는 조성물은 pH 7.4에서 존재할 때 거의 중성에 가깝다. 이들 지질은 알킬기나 아실기에 단일 올레핀기를 가질 수도 있다.
본 발명의 일부 양상은 신규한 이온화 가능한 지질의 합성 방법에 관한 것이다.
다른 양상은 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 지질 나노입자는 핵산을 함유한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 지질 나노입자 내부에 캡슐화된다.
본 발명의 양상들은 치료 핵산을 세포로 전달하기 위한, 이온화 가능한 지질 나노입자의 개선된 조성물을 제공한다. 포스파티딜세린과 포스파티딜글리세롤을 포함한 음이온성 인지질이 지질 나노입자에 포함되어, 수지상 세포의 형질 전환 효율을 증가시킨다. 1,3-디옥솔란 또는 케탈의 2위치에 단일 불포화 알킬 사슬(단일 올레핀)을 젬 이치환(gem di-substitution)한 LNP 제형에 이온화 가능한 지질을 추가로 통합시킨 결과, 같은 계열의 다른 이온화 가능한 지질과 비교했을 때 인간 수지상 세포에서 높은 수준의 형질 전환이 나타났으며 산화적 손상에 대한 안정성이 우수한 것으로 나타났다.
정의
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 특정 용어들을 여기에 모아 설명한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에서 사용된 다음 용어 및 어구들은 다음과 같은 의미를 갖는다.
관사 "a" 및 "an"은 본 명세서에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 주어진 실시형태에 제공되는 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성요소(들)와 관련하여 사용되지만 불특정 요소를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "~으로 본질적으로 구성되는"은 주어진 실시형태에 필요한 요소들을 지칭한다. 이 용어는 본 발명의 실시형태들의 기본적이고 신규한 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
"~으로 구성된"이라는 용어는 본 명세서에 기재된 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성요소를 지칭하며, 실시형태의 설명에서 인용되지 않은 임의의 요소를 제외시킨다.
본 명세서에서 사용되는 "포함하는"이라는 용어는 "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는"을 포함한다.
상세한 설명에서 "위에서 언급한 바와 같이" 또는 "위에서 언급한", "상기"로 언급되는 경우, 이는 이전 페이지의 명세서에 개시된 임의의 내용을 지칭한다.
상세한 설명에서 "본 명세서에 언급된", "본 명세서에 설명된", "본 명세서에 제공된" 또는 "본 문단에서 언급된" 또는 "본 명세서에 설명된"으로 언급되는 경우, 이전 또는 이후 페이지의 명세서에 개시된 임의의 내용을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 명시된 값의 20% 이내, 10% 이내 및 5% 이내의 허용 가능한 변화를 의미한다. 특정 실시형태에서, "약"은 +/- 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 20%의 변화를 의미할 수 있다.
화합물 또는 조성물과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 살균 또는 정균 효과를 유발하기에 충분한 활성 화합물(또한 본 명세서에서 활성제 또는 약물로 지칭됨)의 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 유효량은 치료되는 세균 감염의 증상을 완화하기에 충분한 활성 화합물의 양을 의미하는 "치료적 유효량"이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"(또는 대안적으로 "환자")는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "투여" 또는 "투여하는 것"은 경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 경피, 흡입, 협측, 안구, 설하, 질, 직장 등을 비롯하여, 치료를 필요로 하는 대상체에 화합물 또는 약학 조성물을 투여하는 모든 수단을 포함한다. 화합물 또는 조성물의 투여는 적합하게는 비경구이다. 예를 들어, 화합물 또는 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여될 수 있지만, 마이코박테리움 아비움(mycobacterium avium)의 치료에서 리포솜 아미카신에 대해 임상에서 현재 사용되는 것과 같이 복강내 또는 흡입을 통해 투여될 수도 있다(Shirley 외, Amikacin Liposome Inhalation Suspension: A Review in Mycobacterium avium Complex Lung Disease. Drugs. 2019 Apr; 79(5):555-562 참조)
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는 것" 및 "치료"는 본 명세서에 기재된 것과 같은 치료적 또는 예방적 조치를 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 그 염이 원하는 약리 활성을 갖는 상대적으로 무독성인 본 발명의 화합물의 무기 또는 유기 산 부가염을 지칭한다.
용어 "알킬"은 탄소 사슬이 달리 정의되지 않는 한, 선형 또는 분지형 또는 이들의 조합일 수 있는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 포화된 탄소 사슬을 의미한다. 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec- 및 tert-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸 등을 포함한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬 기는 선택적으로 치환된다.
임의의 아실 사슬 조성을 갖는 "포스파티딜세린"이라는 용어는 특정 실시예에서 명시되지 않는 한 헤드 기에서 세린의 L-이성질체를 지칭한다.
용어 "지질 접합체"는 지질 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 지칭한다. 이러한 지질 접합체는 폴리사르코신(예를 들어 WO2021191265A1 참조, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), PEG-지질 접합체, 예컨대, 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG, 디아실글리세롤에 커플링된 PEG, 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG, 세라마이드에 커플링된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제 5,885,613 참조, 이의 개시 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨), 양이온성 PEG 지질 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. PEG는 지질에 직접 접합되거나 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. 예를 들어, 비-에스테르 함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티를 비롯하여 PEG를 지질에 커플링시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 비-에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다.
이온화 가능한 양이온 지질에 대한 약어는 표에 사용된 것으로부터 실시예에서 생략될 수 있는데, 예를 들어, AKG-UO-1 또는 AKG-KC2-01은 UO1 또는 KC2-01로 지칭될 수 있다.
다양한 연구에서 사용되는 약어 UT는 처리되지 않은 샘플을 지칭한다.
"지질 나노입자" 또는 "LNP"라는 용어는 직경이 약 5 내지 500nm인 입자를 의미한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 활성제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 나노입자의 내부에서 양이온 지질, 중합체 또는 다가 소분자 및 생물학적 환경과 상호작용하는 외부 지질 코트와 함께 응축된다. 인산기 사이의 반발력으로 인해 핵산은 본질적으로 딱딱한 중합체이며 길쭉한 구조를 선호한다. 세포에서, 부피 제약에 대처하기 위해 DNA는 이온 및 기타 분자의 도움을 받아 적절한 용액 조건에서 스스로를 패킹할 수 있다. 일반적으로 DNA 응축은 확장된 DNA 사슬이 하나 또는 몇 개의 분자만 포함하는 치밀하고 규칙적인 입자로 붕괴되는 것으로 정의된다. 인산염 기에 결합함으로써 양이온 지질은 인산염 전하를 중화하여 DNA를 응축시키고 밀집 패킹을 허용한다.
일부 실시형태에서, 활성제는 LNP로 캡슐화된다. 일부 실시형태에서, 활성제는 음이온성 화합물, 예를 들어, DNA, RNA, 천연 및 합성 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA 및 짧은 간섭 RNA 포함), 핵단백질, 펩티드, 핵산, 리보자임, DNA 함유 핵단백질, 예를 들어, 온전하거나 부분적으로 단백질이 제거된 바이러스 입자(비리온), DNA 이외의 올리고머 및 중합체 음이온 화합물(예: 산성 다당류 및 당단백질)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 활성제는 보조제와 혼합될 수 있다.
LNP 백신 제품에서, 활성제는 일반적으로 LNP 내부에 포함된다. 일부 실시형태에서, 활성제는 핵산을 포함한다. 전형적으로, 수용성 핵산은 입자의 내부에서 양이온 지질 또는 다가양이온성 중합체와 함께 축합되고 입자의 표면은 중성 지질 또는 PEG-지질 유도체가 풍부하다. 추가적인 이온화 가능한 양이온 지질 또한 표면에 있을 수 있으며 양전하를 띠고 엔도좀 탈출을 촉진함으로써 환경의 산성화에 반응할 수 있다.
이온화 가능한 지질은 LNP와 관련하여 상이한 특성 또는 기능을 가질 수 있다. 아미노 기의 pKa로 인해, 지질 분자는 산성 조건에서 양전하를 띨 수 있다. 이러한 조건 하에서, 지질 분자는 LNP의 형성 및 핵산의 포획을 허용하는 핵산의 인산염 기에 정전기적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, pKa는 생리학적 pH 값인 혈액과 같은 생물학적 유체에서 LNP의 표면 전하가 실질적으로 중성이 되도록 충분히 낮을 수 있다. 높은 LNP 표면 전하는 독성, 순환계로부터 고정 및 자유 대식세포에 의한 빠른 제거, 면역 활성화를 포함한 용혈성 독성과 관련이 있다(Filion et al Biochim Biophys Acta. 1997 Oct 23;1329(2):345-56).
일부 실시형태에서, pKa는 이온화 가능한 양이온 지질이 산성 엔도솜 pH 값에서 양전하 형태를 채택할 수 있을 정도로 충분히 높을 수 있다. 이러한 방식으로 양이온 지질은 내인성 엔도좀 음이온성 지질과 결합하여 육각형 HII 상과 같은 막 용해성 비이중층 구조를 촉진시켜 보다 효율적인 세포내 전달을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, pKa는 6.2-6.5 범위이다. 예를 들어, pKa는 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5일 수 있다. 불포화 테일은 또한 비이중층 구조를 채택하는 지질의 능력에 기여한다. (Jayaraman 외, Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Aug 20;51(34):8529-33).
리포좀 제거 및 순환 반감기와 같은 기타 특성들 중에서 LNP 제형으로부터 핵산의 방출은 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 또는 LNP의 다른 잠재적 추가제의 존재 및 상기 제형의 일부로서 포함된 이온화 가능한 양이온 지질의 pKa를 포함한 전체 화학 구조에 의해 변경될 수 있다.
용어 "생체환원성"은 환원성 환경에서 디설파이드 결합의 절단으로 인해 가속화된 분해를 거치는 화합물을 지칭한다. siRNA와 같은 다른 핵산 치료제와 달리, mRNA 기반 치료법의 성공은 mRNA를 캡슐화하는 안전하고 효율적인 전달 비히클의 이용가능성에 달려 있다. mRNA는 깨지기 쉽고 표적 부위에 도달할 때까지 활성 상태를 유지하려면 보호 코팅이 필요하다. LNP를 함유하는 mRNA는 Covid-19 면역을 위한 유망한 백신 옵션이다(Jackson 외, Preliminary Report. N Engl J Med. 2020 Nov 12;383(20):1920-1931). LNP의 효율성 및 내약성은 아미노 지질에 기인하며 몇 주 또는 몇 개월의 필요한 서비스 수명을 가질 수 있는 많은 생체 재료 응용 분야와 달리 mRNA의 기능적 LNP 매개 전달은 몇 시간 내에 발생하여 지속적인 지질의 필요성을 제거한다. 실제로 만성 투여가 필요한 응용 분야에서는 이것이 특히 중요할 것이다. LNP는 엔도사이토시스를 통해 세포에 들어가 엔도리소좀 구획에 축적된다는 것이 입증되었다. 이온화 가능한 양이온 지질(ICL)은 리파아제에 의한 후기 엔도좀/리소좀의 효소적 가수분해 또는 완전한 생분해를 가능하게 하는 리소좀의 환원 환경에 의해 촉발된 가수분해에 민감하면서 엔도사이토시스 후 세포질에 mRNA를 효과적으로 전달할 수 있다. 세포외 공간은 상대적으로 산화 환경인 반면, 세포내 공간은 환원성 환경으로, 디설파이드 연결된 분자로 하여금 세포외 공간에서는 온전하게 남아있지만 일단 내재화되면 급속히 감소되게 한다(Huang 외, Mol Ther. 2005 Mar;11(3):409-17, 2005). 일부 실시형태는 LNP 제형에서 안정하고 순환계에 있지만 리소좀의 환원성 환경에서 절단되는 생체환원성 디설파이드 연결된 ICL 분자(화합물 29-36, 표 2 참조)를 제공한다. 이러한 화합물 및 조성물은 지질의 신속한 생물학적 파괴를 촉진할 수 있고 ICL 지질의 잠재적 독성 축적을 방지할 수 있다(DLin-MC3-DMA를 보유한 래트에서 관찰됨(Sabins 외, Mol Ther. 2018 Jun 6;26(6): 1509-1519).
본 명세서에서 사용되는 용어 "캡슐화" 및 "포획된"은 지질 나노입자 내부에 또는 이를 이용한 mRNA, DNA, siRNA 또는 다른 핵산 약제의 포함 또는 회합을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "캡슐화된"이라는 용어는 완전한 캡슐화 또는 부분적인 캡슐화를 의미한다. siRNA는 관심 유전자의 발현을 선택적으로 녹다운 또는 하향조절할 수 있다. 예를 들어, siRNA는 siRNA를 포함하는 나노입자 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여시 특정 질병, 장애 또는 병태와 관련된 유전자를 침묵시키기 위해 선택될 수 있다. siRNA는 관심 유전자 또는 단백질을 인코딩하는 mRNA 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
콜레스테롤에 관한 용어 "mol%"는 콜레스테롤 및 비페길화된 인지질의 몰량의 합에 대한 콜레스테롤의 몰량을 백분율 포인트로 표현한 것을 의미한다. 예를 들어, 콜레스테롤 및 HSPC를 함유하는 리포솜에서 "55mol% 콜레스테롤"은 45몰 부의 HSPC 당 55몰 부의 콜레스테롤의 조성을 의미한다.
PEG-지질과 관련하여 용어 "mol%"는 PEG-지질 및 비페길화 인지질의 몰량의 비율을 백분율 포인트로 표현한 것을 의미한다. 예를 들어, HSPC 및 PEG-DSPE를 함유하는 LNP에서 "5 mol% PEG-DSPE"는 100몰 부의 HSPC 당 5 몰 부의 PEG-DSPE를 갖는 조성을 의미한다.
일부 실시형태에서, 콜레스테롤에 대한 "mol%"는 총 지질의 몰 양의 합에 대한 콜레스테롤의 몰 양을 백분율 포인트로 나타낸 것을 지칭한다. 예를 들어, 콜레스테롤, ICL, DSPC, PS, 콜레스테롤 및 PEG-DMG를 함유하는 LNP 조성물에서 "40.5 mol% 콜레스테롤"은 ICL, DSPC, PS 및 PEG-DMG 성분의 59.5 몰부당 콜레스테롤 40.5 몰부의 조성물을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 접합 지질에 대한 "mol%"는 백분율 포인트로 표현된 접합 지질의 몰 양의 비율을 지칭한다. 예를 들어, 콜레스테롤, ICL, DSPC, PS, 콜레스테롤 및 PEG-DMG를 함유하는 LNP에서 "1.5 mol% PEG-DMG"는 조합된 ICL, DSPC, PS 및 콜레스테롤 성분들 98.5 mol. 부 당 1.5 mol. 부의 PEG-DMG 조성을 나타낸다.
일부 실시형태에서, PS 지질에 대한 "mol%"는 백분율 포인트로 표현된 PS 지질의 몰 양의 비율을 지칭한다. 예를 들어, 콜레스테롤, ICL, DSPC, DPPS, 콜레스테롤 및 PEG-DMG를 함유하는 LNP에서 "5 mol% DPPS"는 조합된 ICL, DSPC, PEG-DMG 및 콜레스테롤 성분들 95 mol. 부 당 5 mol. 부의 PEG-DMG 조성을 지칭한다.
일부 실시형태에서, ICL에 대한 "mol%"는 백분율 포인트로 표현된 ICL의 몰 양의 비율을 지칭한다. 예를 들어, 콜레스테롤, KC3-OA(예: ICL의 예), DSPC, PS, 콜레스테롤 및 PEG-DMG를 함유하는 LNP의 "48 mol% PEG-DMG"는 조합된 PEG-DMG, DSPC, PS 및 콜레스테롤 성분 52 mol. 부 당 48 mol. 부의 ICL 조성을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"에는, 제한 없이, 인간 또는 가축에서의 사용에 대하여 허용되는 것으로 미국 식품의약국이 승인한, 임의의 보강제, 담체, 부형제, 유동화제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향 증진제, 계면활성제, 습윤화제, 분산제, 현탁화제, 안정화제, 등장화제, 용매, 또는 유화제가 포함된다.
다양한 양상 및 실시형태는 다음 하위 섹션에서 더 자세히 설명된다.
이온화 가능한 양이온 지질
본 명세서에는 지질 나노입자(LNP) 조성물을 제조하는 데 유용한 화합물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함한다:
(I),
여기서 R1은
,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알킬이며;
n은 2, 3 또는 4와 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식(I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 R1 탄화수소 사슬의 총 길이는 C15 - C18이다. 일부 실시형태에서, R1 탄화수소 사슬의 총 길이는 C16 - C18이다. 일부 실시형태에서, R1 탄화수소 사슬의 총 길이는 C16 또는 C18이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 0이고 b는 1, 2, 3 또는 4이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 0이고 b는 1 또는 3이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 0이고 b는 1이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 0이고 b는 3이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 1이고 b는 1, 2, 3 또는 4이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 1이고 b는 1 또는 3이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 1이고 b는 1이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 1이고 b는 3이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 R10 및 R12는 동일하다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 R10 및 R12는 각각 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 R10 및 R12는 각각 (C1-C4)알킬이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 R10 및 R12는 각각 메틸이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 R10 및 R12는 각각 에틸이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 R10 및 R12는 각각 메틸 또는 에틸에서 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 R10 및 R12는 각각 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH에서 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고; R2 및 R3은 각각 메틸이고; n은 2, 3 또는 4와 동일한 정수이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고; R2 및 R3은 각각 메틸이고; n은 2 또는 3과 동일한 정수이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고; R2 및 R3은 각각 메틸이고; n은 2와 동일한 정수이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고; R2 및 R3은 각각 메틸이고; n은 3과 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 화학식 (II)의 화학 구조:
(II),
또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 여기서
Y는, 이고,
n은 정수 2, 3 또는 4이고;
R22는 단일 올레핀이 있는 탄화수소 사슬이고 총 길이가 C15-C18이며; 그리고
R10및 R12 각각은 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다.
일부 양상에서, 화학식 (II)의 R22는 화학식 A의 폴리엔 탄화수소 사슬이다.
일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10 및 R12는 각각 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다. 일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10 및 R12는 각각 독립적으로 메틸이다. 일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10 및 R12는 각각 독립적으로 에틸이다. 일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10 및 R12 중 적어도 하나는 하이드록실로 선택적으로 치환된 n-프로필이다. 일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10은 메틸이고 R12는 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다. 일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10은 메틸이고 R12는 -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다. 일부 양상에서, 화학식 (II)의 화학 구조를 포함하는 화합물에서 R10은 메틸이고 R12는 -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다. 일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10 및 R12는 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환된 메틸 또는 에틸로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10 및 R12 중 하나 또는 둘 모두는 화학식 (II)에서 -(CH2)(CH2)OH, 또는 -(CH2)2(CH2)OH이다. 일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10은 메틸이고 R12는 하이드록실로 치환된 메틸 또는 에틸이다. 일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10 중 하나 또는 둘 모두는 메틸이고 화학식 (II)에서 R12는 -(CH2)(CH2)OH이다. 일부 양상에서, 화학식 (II)에서 R10 중 하나 또는 둘 모두는 메틸이고 화학식 (II)에서 R12는 -(CH2)2(CH2)OH이다.
일부 실시형태에서, 상기 화합물은 아래 표에 나열된 화합물의 구조를 갖는다. 표 1A 및 표 1B는 양이온 지질의 예를 보여준다. 표 2는 생체환원성 양이온 지질의 예를 보여준다.
표 1A. 양이온 지질의 예시
표 1A. 양이온 지질의 예시(계속)
표 1A. 양이온 지질의 예시(계속)
표 1A. 양이온 지질의 예시(계속)
표 1B 추가적인 양이온 지질의 예시
표 2. 생체환원성 양이온 지질의 예시
표 2. 생체환원성 양이온 지질의 예시(계속)
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 핵산을 캡슐화한다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP 제형에서 핵산을 캡슐화한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 siRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 DNA 분자이다.
일부 실시형태에서, 세포 표면 수용체에 대해 지시되는 리간드, 예를 들어, 항체 접합체를 추가로 포함하는 조성물은 지질 나노입자를 수지상 세포에 대해 매우 특이적인 방식으로 표적하도록 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 표적 리간드를 추가로 포함하며, 여기서 표적 리간드는 나노입자의 외부로 배향된다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 항체이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 수성 매질에 존재한다.
일부 실시형태에서, 핵산은 화학식 I, II, III, IV-B, V-A-1의 화합물 또는 이의 조합을 포함하는 본 명세서에 개시된 화합물과 함께 지질 나노입자에 포획되며, 여기서 핵산은 RNA 또는 DNA이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 본 명세서에 개시된 화합물 또는 이의 조합을 포함하는 본 명세서에 개시된 화합물과 함께 지질 나노입자에 포획되며, 여기서 핵산은 RNA 또는 DNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 siRNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 DNA이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 포스파티딜콜린 및 스테롤을 포함하는 막을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 포스파티딜콜린, 이온화 가능한 양이온 지질(ICL)을 포함하는 막을 포함한다. 일부 실시형태에서, ICL은 화학식 I, II, III, IV-B, VA-1 및 콜레스테롤의 구조를 가지며, 여기서 막은 지질 나노입자의 내부를 수성 매질로부터 분리한다. 일부 실시형태에서, ICL은 표 1A 및 표 2에 나타낸 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, ICL은 표 1B에 나타낸 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 포스파티딜콜린은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 또는 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC)이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질 대 콜레스테롤 몰비는 약 65:35 내지 40:60이다. 일부 실시형태에서, ICL 대 콜레스테롤 몰비는 약 60:40 내지 약 45:55이다.
일부 실시형태에서, 포스파티딜콜린 대 콜레스테롤 몰비는 약 1:5 내지 약 1:2이다.
일부 실시형태에서, 막은 중합체-접합 지질을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 ICL, DSPC, 콜레스테롤 및 중합체-접합 지질을 약 49.5:10.3:39.6:2.5 몰비로 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합체-접합 지질은 PEG(2000)-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG) 또는 PEG(분자량 2,000)-디미리스토일포스파티딜에탄올아민(PEG-DMPE)이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질에 대한 산화적 분해 생성물의 백분율은 DLin-KC2-DMA 또는 DLin-MC3-DMA 대조군 제형에 대한 것의 50% 미만이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 비경구 투여를 위한 액체 약학적 제형이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 피하, 근육내 또는 피내 투여를 위한 액체 약학적 제형이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 동결건조된 분말의 형태이며, 이는 후속적으로 투여 전에 수성 매질과 함께 재구성된다.
본 발명의 다른 양상은 박테리아 또는 바이러스 감염을 예방하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 면역 반응을 유도하기 위해 본 명세서에 제공된 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태는 필요로 하는 대상체를 백신접종하는 방법을 제공하며, 이 방법은 항원성 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 피하, 근육내 또는 피내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 박테리아 감염은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염이다. 일부 실시형태에서, 박테리아 감염은 비결핵 마이코박테리움의 한 형태이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 감염은 코로나바이러스이다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 감염은 HIV/AID이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 비경구적으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자 조성물은 단일 주사의 일부로서 투여된다.
본 발명은 핵산, 예를 들어, DNA, mRNA, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, CRISPR 성분, 예를 들어, 가이드 RNA(gRNA 또는 sgRNA) 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제(Cas 단백질) 및 지질을 포함하는 지질 나노입자를 특징으로 한다. 예시적인 지질은 이온화 가능한 양이온 지질(ICL), 인지질, 스테롤 지질, 알킬렌 글리콜 지질(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 지질), 스핑고지질, 글리세로지질, 글리세로인지질, 프레놀 지질, 사카로지질, 지방산 및 폴리케타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 단일 유형의 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 다수(예를 들어 2개 이상)의 지질을 포함한다. LNP는 이온화 가능한 양이온 지질, 인지질, 스테롤 또는 알킬렌 글리콜 지질(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 지질) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, LNP는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "이온화 가능한 양이온 지질", "이온화 가능한 지질" 및 "ICL"은 상호교환적으로 사용된다. ICL은 특정 조건 하에서(예를 들어, 특정 pH 범위에서, 예를 들어, 생리학적 조건 하에서) 전하(예를 들어, 양전하, 예를 들어, 양이온 지질)를 보유할 수 있는 이온화 가능한 모이어티를 포함하는 지질이다. 이온화 가능한 부분은 아민, 바람직하게는 치환된 아민을 포함할 수 있다. 이온화 가능한 지질은 양이온 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다. 이온화 가능한 모이어티에 더하여, 이온화 가능한 지질은, 예를 들어, 6개 초과 탄소 원자 길이(예를 들어, 약 8개 탄소, 10개 탄소, 12개 탄소, 14개 탄소, 16개 탄소, 18개 탄소, 20개 탄소 또는 그 이상의 길이)의 알킬 또는 알케닐 기를 함유할 수 있다. 본 명세서에 기술된 LNP에 포함될 수 있는 추가적인 이온화 가능한 지질은 Jayaraman 외, (Angew. Chem. Int. Ed. 51:8529-8533 (2012)), Semple 외, Nature Biotechnol. 28:172-176 (2010)), 및 미국 특허 제 8,710,200 및 8,754,062에 개시된 것들이며, 이들 문헌 각각은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, LNP는 화학식 (IV-A)의 구조 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 갖는 이온화 가능한 지질을 추가로 포함하며
(III)
여기서 R10 및 R12 각각은 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고; v는 0 또는 1이고; q1은 1 또는 2이고; Y는 , , , , 또는 이고; R22는 이고; a는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; c는 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 0이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 1이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 1이고 q1은 1이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 1이고 q1은 2이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 R22에서 a와 c의 합은 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 R22에서 a와 c의 합은 6이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 R22에서 a와 c의 합은 7이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 R22에서 a와 c의 합은 9이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22에서 a와 c의 합은 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22에서 a와 c의 합은 6이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22에서 a와 c의 합은 7이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22에서 a와 c의 합은 9이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 R10 및 R12는 각각 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 R10 및 R12는 각각 메틸이고 R22에서 a와 c의 합은 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 R10 및 R12는 각각 메틸이고, v는 0이고, R22에서 a와 c의 합은 6, 7, 8 또는 9이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a와 c의 합은 7 또는 9이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 4이고 c는 5이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 1이고 c는 8이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 2이고 c는 5이다.
LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 초과 농도의 이온화 가능한 지질을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 1mol%, 약 2mol%, 약 4mol%, 약 8mol%, 약 20mol%, 약 40mol%, 약 50mol%, 약 60mol%, 약 80mol% 초과 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 20mol%, 약 40mol%, 또는 약 50mol% 초과 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 1mol% 내지 약 95mol% 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 2mol% 내지 약 90mol%, 약 4mol% 내지 약 80mol%, 약 10mol% 내지 약 70mol%, 약 20mol% 내지 약 60mol%, 약 40mol% 내지 약 55mol% 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 20mol% 내지 약 60mol% 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 40mol% 내지 약 55mol% 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다.
한 실시형태에서, LNP는 인지질을 포함한다. 인지질은 인산염 기와 적어도 하나의 알킬, 알케닐 또는 헤테로알킬 사슬을 포함하는 지질이다. 인지질은 천연 발생 또는 비천연 발생(예: 합성 인지질)일 수 있다. 인지질은 아민, 아미드, 에스테르, 카르복실, 콜린, 하이드록실, 아세탈, 에테르, 탄수화물, 스테롤 또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인지질은 포스포콜린, 포스포스핑고지질, 또는 플라스마로겐을 포함할 수 있다. 예시적인 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1-미리스토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MOPC), 1, 2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 1-팔미토일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(PLPC), 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1-스테아로일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SMPC), 1-팔미토일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PMPC), 비스(모노아실글리세롤)포스페이트(BMP), L-α-포스파티딜콜린, 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린(DHDPC) 및 1-스테아로일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SAPC)을 포함한다 본 명세서에 기술된 LNP에 포함될 수 있는 추가적인 인지질은 Li, J. 외, (Asian J. Pharm. Sci. 10:81-98 (2015))에 개시된 것들이며, 이 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 일부 실시형태에서, 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)이다. 일부 실시형태에서, 인지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC)이다. 일부 실시형태에서, 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다.
포스파티딜세린의 포함
(예를 들어, 본 명세서에 기재된) LNP는 다음 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 약 1mol% 내지 약 95mol% 사이(또는 그 사이의 임의의 값, 예를 들어 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 C16 알킬 또는 C16 알케닐 기 또는 C18 알킬 또는 C18 알케닐 기를 함유하는 이온화 가능한 양이온 지질(ICL); (ii) 0.1mol% 내지 약 20mol%(또는 그 사이의 임의의 값, 예를 들어, 약 2.5mol% 내지 약 10mol%) 농도의 인지질(여기서 인지질은 또한 C16 또는 C18 알킬 또는 알케닐 기를 함유함); (iii) 약 1mol% 내지 약 95mol%(또는 그 사이의 임의의 값, 예를 들어 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 콜레스테롤; (iv) LNP의 총 지질 함량의 약 0.5 mol% 내지 약 20 mol%, 약 2.5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 4 mol% 내지 약 8 mol%, 또는 이들 사이의 임의의 값의 농도의, LNP 지질 제형에 추가된 포스파티딜세린(PS) 또는 포스파티딜글리세롤(PG), 및 (v) 약 0.1mol% 내지 약 5mol%(또는 그 사이의 임의의 값, 예를 들어 약 1mol% 내지 약 2.5mol%)의 농도의 폴리에틸렌글리콜(PEG)-2000-함유 지질(예: DPG-PEG2000, DPPE-PEG2000, DMPE-PEG2000, DMG-PEG2000). 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(v) 중 두 개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(v) 중 세 개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(v) 중 네 개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(v) 각각을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (ii)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii), (iv) 및 (v)를 포함한다. 실시예에서, LNP는 (i)-(v) 중 네 개로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 실시예에서, LNP는 각각의 (i)-(v)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (ii)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iii)으로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (v)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iii)으로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iii)으로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (v)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii), (iv) 및 (v)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다.
LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 보다 큰 농도의 인지질을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, LNP는 LNP의 총 지질 함량의 약 0.5mol%, 약 1mol%, 약 1.5mol%, 약 2mol%, 약 3mol%, 약 4mol%, 약 5mol%, 약 6mol%, 약 8mol%, 약 10mol%, 약 12mol%, 약 15mol%, 약 20mol%, 약 50mol% 보다 큰 농도의 인지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 1mol%, 약 5mol%, 또는 약 10mol% 보다 큰 농도의 인지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 내지 약 50mol% 농도의 인지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.5mol% 내지 약 40mol%, 약 1mol% 내지 약 30mol%, 약 5mol% 내지 약 25mol%, 약 10mol% 내지 약 20mol%, 약 10mol% 내지 약 15mol%, 또는 약 15mol% 내지 약 20mol% 농도의 인지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 5mol% 내지 약 25mol% 농도의 인지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 10mol% 내지 20mol% 농도의 인지질을 포함한다.
한 실시형태에서, LNP는 스테롤 또는 이온화 가능한 스테롤 분자를 포함한다. 스테롤은 다환식 구조 및 선택적으로 하이드록실 또는 에테르 치환기를 포함하는 지질이며, 천연 발생 또는 비천연 발생(예를 들어, 합성 스테롤)일 수 있다. 스테롤은 이중 결합을 포함하지 않거나 단일 이중 결합 또는 다중 이중 결합을 포함할 수 있다. 스테롤은 추가로 알킬, 알케닐, 할로, 에스테르, 케톤, 하이드록실, 아민, 폴리에테르, 탄수화물 또는 사이클릭 모이어티를 포함할 수 있다. 스테롤의 예시적인 목록은 콜레스테롤, 디하이드로에르고스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 디하이드로라노스테롤, 데스모스테롤, 브라시카스테롤, 라토스테롤, 자이모스테롤, 7-디하이드로데스모스테롤, 아베나스테롤, 캄페스타놀, 루페올 및 시클로아르테놀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스테롤은 콜레스테롤, 디하이드로에르고스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, β-시토스테롤 또는 스티그마스테롤을 포함한다. 본 명세서에 기술된 LNP에 포함될 수 있는 추가적인 스테롤은 Fahy, E. 외, (J. Lipid. Res. 46:839-862 (2005)에 개시된 것들이다.
이온화 가능한 스테롤
일부 실시형태에서, LNP는 스테롤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 디하이드로에르고스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 에르고스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 캄페스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 β-시토스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 스티그마스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 코르티코스테로이드(예: 코르티코스테론, 하이드로코르티손, 코르티손 또는 알도스테론)이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 ALC-0315 및 SM-102로부터 선택되는 다음과 같은 분지형의 이온화 가능한 지질일 수 있다:
.
LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 보다 큰 농도의 스테롤을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, LNP는 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.5mol%, 약 1mol%, 약 5mol%, 약 10mol%, 약 15mol%, 약 20mol%, 약 25mol%, 약 35mol%, 약 40mol%, 약 45mol%, 약 50mol%, 약 55mol%, 약 60mol%, 약 65mol%, 또는 약 70mol% 보다 큰 농도의 스테롤을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 10mol%, 약 15mol%, 약 20mol%, 또는 약 25mol%보다 큰 농도의 스테롤을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 1mol% 내지 약 95mol% 농도의 스테롤을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 LNP의 총 지질 함량의 약 5mol% 내지 약 90mol%, 약 10mol% 내지 약 85mol%, 약 20mol% 내지 약 80mol%, 약 20mol% 내지 약 60mol%, 약 20mol% 내지 약 50mol%, 또는 약 20mol% 내지 40mol% 농도의 스테롤을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 20mol% 내지 약 50mol% 농도의 스테롤을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 30mol% 내지 약 60mol% 농도의 스테롤을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 알킬렌 글리콜 함유 지질은 적어도 하나의 알킬렌 글리콜 모이어티, 예를 들어, 메틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 지질이다. 일부 실시형태에서, 알킬렌 글리콜 함유 지질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 알킬렌 글리콜 함유 지질은 PEG 함유 지질일 수 있다. 중합체-접합 지질은 폴리(에틸렌 글리콜)-접합 (페길화)인지질 (PEG-지질), 예를 들어, PEG(분자량 2,000) 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세롤(PEG-DSG), PEG(분자량 2,000) 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-1,2-팔미토일-sn-글리세롤(PEG-DPG), PEG(분자량 2,000) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG-DSPE) 또는 N-팔미토일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]} (PEG-세라마이드)를 포함할 수 있다. PEG-지질 성분에서 PEG 부분의 분자량은 또한 500-10,000g/mol, 1,500-6000g/mol로 다양할 수 있지만, 바람직하게는 약 2,000MW이다. 지질 앵커에 대한 접합에 사용되는 다른 중합체는 폴리(2-메틸-2-옥사졸린)(PMOZ), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOZ), 폴리-N-비닐피롤리돈(PVP), 폴리글리세롤, 폴리(하이드록시에틸 L-아스파라긴)(PHEA), 및 폴리(하이드록시에틸 L-글루타민)(PHEG)을 포함할 수 있다.
PEG 함유 지질은 아민, 아미드, 에스테르, 카르복실, 포스페이트, 콜린, 하이드록실, 아세탈, 에테르, 헤테로사이클 또는 탄수화물을 추가로 포함할 수 있다. PEG-함유 지질은, 예를 들어, PEG 모이어티에 더하여, 예를 들어, 6개 초과 탄소 원자 길이(예를 들어, 약 8개 초과, 10개 초과, 12개 초과, 14개 초과, 16개 초과, 18개 초과, 20개 초과 또는 그 이상의 길이)의 적어도 하나의 알킬 또는 알케닐기를 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, PEG 함유 지질은 적어도 20개의 PEG 단량체, 예를 들어, 적어도 30개의 PEG 단량체, 40개의 PEG 단량체, 45개의 PEG 단량체, 50개의 PEG 단량체, 100개의 PEG 단량체, 200개의 PEG 단량체, 300개의 PEG 단량체, 500개의 PEG 단량체, 1000개의 PEG 단량체, 또는 2000개의 PEG 단량체를 포함하는 PEG 모이어티를 포함한다. 예시적인 PEG-함유 지질은 PEG-DMG(예를 들어, DMG-PEG2k), PEG-c-DMG, PEG-DSG, PEG-DPG, PEG-DSPE, PEG-DMPE, PEG-DPPE, PEG-DOPE 및 PEG-DLPE를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG-지질은 PEG-DMG(예를 들어, DMG-PEG2k), PEG-c-DMG, PEG-DSG 및 PEG-DPG를 포함한다. 본 명세서에 기술된 LNP에 포함될 수 있는 추가적인 PEG-지질은 Fahy, E. 외, (J. Lipid. Res. 46:839-862 (2005))에 개시된 것들이며, 이 문헌은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-DMG(예를 들어, DMG-PEG2k)이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 α-(3’-{[1,2-디(미리스틸옥시)프로판옥시] 카르보닐아미노}프로필)-ω-메톡시, 폴리옥시에틸렌(PEG-c-DMG)이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-DSG이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-DPG이다.
LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 보다 큰 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, LNP는 LNP의 총 지질 함량의 약 0.5mol%, 약 1mol%, 약 1.5mol%, 약 2mol%, 약 3mol%, 약 4mol%, 약 5mol%, 약 6mol%, 약 8mol%, 약 10mol%, 약 12mol%, 약 15mol%, 약 20mol%, 약 50mol% 보다 큰 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 1mol%, 약 4mol%, 또는 약 6mol% 보다 큰 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 내지 약 50mol% 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.5mol% 내지 약 40mol%, 약 1mol% 내지 약 35mol%, 약 1.5mol% 내지 약 30mol%, 약 2mol% 내지 약 25mol%, 약 2.5mol% 내지 약 20%, 약 3mol% 내지 약 15mol%, 약 3.5mol% 내지 약 10mol%, 또는 약 4mol% 내지 9mol% 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 3.5mol% 내지 약 10mol% 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 4mol% 내지 약 9mol% 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 적어도 2가지 유형의 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질 중 2개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 적어도 3가지 유형의 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질 중 3개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 적어도 4가지 유형의 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질 각각을 포함한다.
(예를 들어, 본 명세서에 기재된) LNP는 다음 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 약 1mol% 내지 약 95mol%(예를 들어, 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 이온화 가능한 양이온 지질; (ii) 0.1mol% 내지 약 50mol%(예를 들어, 약 2.5mol% 내지 약 20mol%) 농도의 인지질; (iii) 약 1mol% 내지 약 95mol%(예를 들어, 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 스테롤; 및 (iv) 약 0.1mol% 내지 약 50mol%(예를 들어, 약 2.5mol% 내지 약 20mol%) 농도의 PEG 함유 지질. 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(iv) 중 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(iv) 중 두 개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(iv) 중 세 개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(iv) 각각을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (ii)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii) 및 (iv)를 포함한다.
(예를 들어, 본 명세서에 기재된) LNP는 다음 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 약 1mol% 내지 약 95mol%(예를 들어, 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 이온화 가능한 양이온 지질(ICL); (ii) 0.1mol% 내지 약 50mol%(예를 들어, 약 2.5mol% 내지 약 20mol%) 농도의 DSPC; (iii) 약 1mol% 내지 약 95mol%(예를 들어, 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 콜레스테롤; 및 (iv) 약 0.1mol% 내지 약 50mol%(예를 들어, 약 2.5mol% 내지 약 20mol%) 농도의 DMG-PEG2k. 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(iv) 중 두 개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(iv) 중 세 개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i)-(iv) 각각을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (ii)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii) 및 (iv)를 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 약 50:1 내지 약 1:1(예를 들어, 40:1, 32:3, 6:1, 7:1, 5:1, 24:5, 26:5, 10:3, 15:2, 16:7, 18:1, 3:1, 3:2 또는 1:1)의 이온화 가능한 지질 대 인지질의 비율을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 15:2의 이온화 가능한 지질 대 인지질의 비율을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 5:1의 이온화 가능한 지질 대 인지질의 비율을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 10:1 내지 약 1:10(예를 들어, 9:1, 8:1, 8:7, 7:1, 7:5, 7:3, 6:1, 6:5, 5:1, 5:3, 4:1, 4:3, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 3:4, 1:4, 3:5, 1:5, 4:5, 1:6, 5:6, 7:6, 7:8 또는 8:9)의 이온화 가능한 지질 대 스테롤의 비율을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 1:10 내지 약 10:1(예를 들어, 1:9, 1:8, 7:8, 7:1, 7:5, 7:3, 6:1, 6:5, 5:1, 5:3, 4:1, 4:3, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 3:4, 1:4, 3:5, 1:5, 4:5, 1:6, 5:6, 7:6, 7:8, 또는 8:9)의 이온화 가능한 지질 대 알킬렌 함유 지질의 비율을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 10:1 내지 약 1:10(예를 들어, 9:1, 8:1, 8:7, 7:1, 7:5, 7:3, 6:1, 6:5, 5:1, 5:3, 4:1, 4:3, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 3:4, 1:4, 3:5, 1:5, 4:5, 1:6, 5:6, 7:6, 7:8 또는 8:9)의 인지질 대 알킬렌 함유 지질의 비율을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 50:1 내지 약 1:1(예를 들어, 40:1, 32:3, 6:1, 7:1, 5:1, 24:1, 22:1, 20:1, 22:5, 24:5, 26:5, 10:3, 15:2, 16:7, 18:1, 3:1, 3:2 또는 1:1)의 스테롤 대 알킬렌 함유 지질의 비율을 포함한다.
일부 실시형태에서, (예를 들어, 본 명세서에 기재된) LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질(예를 들어, PEG-함유 지질) 중 2개를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, (예를 들어, 본 명세서에 기재된) LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질(예를 들어, PEG-함유 지질) 중 3개를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 본 명세서에 기재된) LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질(예를 들어, PEG-함유 지질) 각각을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 LNP는 5 내지 500 nm, 예를 들어 10 내지 400 nm, 20 내지 350 nm, 25 내지 325 nm, 30 내지 300 nm, 50 내지 250 nm, 60 내지 200 nm, 75 내지 190nm, 80 내지 180nm, 100 내지 200nm, 200 내지 300nm, 150 내지 250nm의 직경을 갖는다. LNP의 직경은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 동적 광 산란, 투과 전자 현미경(TEM) 또는 주사 전자 현미경(SEM)에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 50 내지 100nm, 70 내지 100nm, 및 80 내지 100nm의 직경을 갖는다. 한 실시형태에서, LNP는 약 90nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 LNP는 약 30nm 보다 큰 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 35nm, 약 40nm, 약 45nm, 약 50nm, 약 60nm, 약 70nm, 약 80nm, 약 90nm, 약 100nm, 약 120nm, 약 140 nm, 약 160 nm, 약 180 nm, 약 200 nm, 약 225 nm, 약 250 nm, 약 275 nm 또는 약 300 nm 보다 큰 직경을 갖는다. 한 실시형태에서, LNP는 약 70nm 보다 큰 직경을 갖는다. 한 실시형태에서, LNP는 약 90nm 보다 큰 직경을 갖는다. 한 실시형태에서, LNP는 약 180nm 보다 큰 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 복수의 LNP는 약 40 nm 내지 약 180 nm 범위의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 복수의 LNP는 약 50 nm 내지 약 150 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 복수의 LNP는 약 50 nm 내지 약 120 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 복수의 LNP는 약 60 nm 내지 약 120 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 약 40 nm, 약 45 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 100 nm, 약 120 nm, 약 140nm, 약 160nm, 약 180nm의 평균 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 나노입자 또는 복수의 나노입자는 -100 mv 미만, 예를 들어, -90 mv, -80 mv, -70 mv, -60 mv, -50 mv, -40mv, -30mv 및 -20mv 미만의 평균 중성 내지 음의 표면 전하를 갖는다. 일부 실시형태에서, 나노입자 또는 복수의 나노입자는 -100 mv 내지 100 mv, -75 mv 내지 0, 또는 -50 mv 내지 -10 mv의 중성 내지 음의 표면 전하를 갖는다.
일부 실시예에서, 다수의 나노입자 중 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%)의 나노입자는 -100mv 미만의 평균 중성 내지 음의 표면 전하를 갖는다. 일부 실시형태에서, 나노입자 또는 복수의 나노입자는 pH 7.4에서 -20 mv 내지 +20, -10 mv 내지 +10 mv, 또는 -5 mv 내지 +5 mv의 평균 표면 전하를 갖는다. 전하가 중성인 LNP는 양이온성 LNP에 비해 약동학 및 생물학적 성능이 개선되었다.
지질 나노입자(LNP) 제조
LNP의 제조 방법은 제1 용액을 제2 용액과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 혼합 단계는 표준 액체 혼합 기술, 예를 들어, 프로펠러 혼합, 소용돌이 용액을 사용하여, 또는 바람직하게는 미세유체 혼합 또는 고효율 T-혼합을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 용액은 지질 또는 복수의 지질 및 핵산을 포함하며, 여기서 모든 성분은 물/용매 시스템에서 용해된다. 용매는 임의의 수혼화성 용매(예를 들어, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 디옥산 또는 테트라하이드로푸란)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 용액은 적은 백분율의 물 또는 pH 완충수를 포함한다. 제1 용액은 부피로 최대 적어도 60%, 예를 들어, 부피로 최대 적어도 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60%의 물을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 제1 용액은 부피로 약 0.05% 내지 60%의 물, 예를 들어, 약 0.05% 내지 50%, 약 0.05% 내지 40%, 또는 약 5% 내지 20%의 물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 용액은 단일 유형의 지질, 예를 들어, 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 또는 PEG-함유 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 용액은 복수의 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 지질은 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 또는 PEG-함유 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 지질은 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC),1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌2000(DMG-PEG2k) 또는 α-(3’-{[1,2-디(미리스틸옥시)프로판옥시]카르보닐아미노}프로필)-ω-메톡시, 폴리옥시에틸렌 (PEG2000-C-DMG), 및 이온화 가능한 지질을 포함한다. 복수의 지질은 임의의 비율로 존재할 수 있다. 한 실시형태에서, 복수의 지질은 이온화 가능한 지질 또는 스테롤, 인지질, 스테롤, 상기 지질의 PEG-함유 지질 또는 이들의 조합을 특정 비율(예를 들어, 본 명세서에 기재된 비율)로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 용액은 물이다. 일부 실시형태에서, 제2 용액은 pH 3-6(예를 들어, 약 3, 약 4, 약 5, 또는 약 6의 pH)을 갖는 수성 완충액이다. 제2 용액은 로딩 성분, 예를 들어, 핵산(예를 들어, mRNA)을 포함할 수 있다. 제2 용액은 작은 백분율의 수혼화성 유기 용매를 포함할 수 있다. 제1 용액은 부피로 최대 적어도 60%의 적어도 하나의 수혼화성 유기 용매, 예를 들어, 부피로 최대 적어도 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%,10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 적어도 하나의 유기 용매(예를 들어, 수혼화성 유기 용매)를 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 제2 용액은 부피로 약 0.05% 내지 60%의 유기 용매, 예를 들어, 부피로 약 0.05% 내지 50%, 약 0.05% 내지 40%, 또는 약 5% 내지 20%의 유기 용매(예를 들어, 수혼화성 유기 용매)를 포함한다. 완충 수용액은 시트레이트 완충 수용액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 수성 완충액은 pH 4-6(예를 들어, 약 4, 약 5, 또는 약 6의 pH)을 갖는 시트레이트 완충액이다. 한 실시형태에서, 수성 완충 용액은 pH가 약 6인 시트레이트 완충 용액이다.
일부 실시형태에서, LNP 현탁액을 포함하는 제1 용액과 제2 용액의 혼합물을 포함하는 용액은 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액을 포함하는 제1 용액과 제2 용액의 혼합물을 포함하는 용액은 희석될 수 있다. 물, 산, 염기 또는 수성 완충액을 추가하여 LNP 현탁액의 pH를 희석 또는 조정할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액의 pH의 희석 또는 조정은 수행되지 않는다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액의 pH의 희석 및 조정 모두가 수행된다.
일부 실시형태에서, 과량의 시약, 용매, 캡슐화되지 않은 핵산은 접선 유동 여과(TFF)(예를 들어, 정용여과)에 의해 LNP 현탁액으로부터 제거될 수 있다. 유기 용매(예를 들어, 에탄올) 및 완충액은 또한 TFF를 사용하여 LNP 현탁액으로부터 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액은 TFF가 아니라 투석을 거친다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액은 투석이 아니라 TFF를 거친다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액은 투석 및 TFF 모두를 거친다.
한 양상에서, 본 발명은 지질층을 분해하여 캡슐화 및/또는 포획된 핵산(들)을 방출하기에 적합한 기간 동안 핵산을 포함하는 LNP의 샘플을 세제(예를 들어, Triton X-100, 또는 음이온성 세제(예를 들어, 소듐 도데실 설페이트(SDS)(그러나 이에 제한되는 것은 아님), 또는 비이온성 세제, 예를 들어, β-옥틸글루코사이드, 또는 쯔비터젠트(쯔비터젠트) 3-14(그러나 이에 제한되는 것은 아님))를 포함하는 유체로 처리하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 방출된 핵산(들)의 존재, 부재 및/또는 양에 대해 샘플을 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
리간드를 포함하는 LNP
본 발명의 일부 양상은 세포 표면 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 리간드(또한 본 명세서에서 표적화 리간드로 지칭됨)를 포함하는 LNP에 관한 것이며, 여기서 항원에 대한 리간드의 결합은 리간드의 내재화를 유도한다. 일부 실시형태는 본 명세서에 기술된 리간드를 포함하는 LNP를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
LNP 표적화는 상기 제형에 지질을 추가함으로써 달성될 수도 있다. 예를 들어, 포스파티딜세린은 아폽토시스 동안 원형질막의 외부 표면에 재분포되는 것으로 알려져 있으며 이는 식세포 유인을 위한 분자 자극이다(Fadok 외, Curr Biol. 2003 Aug 19;13(16):R655-7). 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티딜글리세롤(PG)은 수지상 세포에 의해 인식되며 수지상 세포의 흡수 및 활성화를 유도할 수 있다. LNP 표적화는 특정 음이온성 인지질을 상기 제형에 추가함으로써 달성될 수도 있다(표 3A). 예를 들어, 포스파티딜세린은 아폽토시스 동안 원형질막의 외부 표면에 재분포되는 것으로 알려져 있으며 이는 식세포 유인을 위한 분자 자극이다(Fadok 외, Curr Biol. 2003 Aug 19;13(16):R655-7). 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티딜글리세롤(PG)은 수지상 세포에 의해 인식되며 수지상 세포의 흡수 및 활성화를 유도할 수 있다(Caronni 외, Nat Comm. 2021 April 14; 12: 2237-2253; Ischihashi 외, PLOS One 2013). 음이온성 인지질이 이전에 리포솜과 관련하여 사용되었지만, 이온화 가능한 양이온 지질의 결합 부위에 대해 음이온성 헤드 기가 mRNA의 인산염 백본과 경쟁할 수 있기 때문에, 또는 표면 전하를 변경함으로써 세포내 탈출을 억제할 수 있기 때문에, 또는 형성 또는 저장 중에 LNP를 응집시킬 수 있기 때문에, 응축된 핵산을 포함하는 지질 나노입자에 이들을 포함시키는 것은 예상할 수 없는 것이다.
표 3A. 음이온성 인지질 표적화 모이어티
표 3B. 포스파티딜세린 표적화 모이어티
일부 실시형태에서, 음이온성 표적화 리간드는 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜글리세롤(PG), N-글루타릴-포스파티딜에탄올아민(N-glu-PE) 또는 N-숙시닐-포스파티딜에탄올아민(N-Suc-PE) 기로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 사용되는 음이온성 인지질은 포스파티딜세린이다. 또 다른 실시형태에서, 포스파티딜세린은 세린의 L-이성질체를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 디미리스토일포스파티딜-L-세린(DMPS), 디팔미토일포스파티딜-L-세린(DPPS) 또는 디스테아로일포스파티딜-L-세린(DSPS)의 경우와 같이 포스파티딜세린에 대해 아실 사슬은 완전히 포화된다. 바람직한 실시형태에서, 사용되는 PS는 DPPS 또는 DSPS의 L-이성질체이다. 포스파티딜세린은 또한, 예를 들어, 하나의 아실 사슬이 스테아르산이고 또 다른 하나가 팔미트산인 비대칭 아실 사슬 조성물을 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 음이온성 인지질은 포스파티딜세린 이외의 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 이러한 비 PS 음이온성 인지질에는 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티드산(PA), N-글루타릴-포스파티딜에탄올아민(N-Glu-PE), N-석시닐-포스파티딜에탄올아민(N-Suc-PE) 및 카르디오리핀이 포함된다. 한 실시형태에서, 이러한 음이온성 인지질에는 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), N-석시닐-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(N-Suc-DSPE), N-글루타릴-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(N-Glu-DSPE), 디스테아로일포스파티드산(DSPA) 및 카르디오리핀과 같은 16개 또는 18개 탄소의 포화 아실 사슬이 포함된다.
표 3C. 비포스파티딜세린 음이온성 인지질
일부 실시형태에서, 사용되는 음이온성 인지질은 포스파티딜글리세롤이다. 또 다른 실시형태에서, 포스파티딜글리세롤의 아실 사슬은, 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG) 또는 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG)의 경우와 같이 완전히 포화된다. 한 바람직한 실시형태에서, 사용되는 PG는 DPPS 또는 DSPS이다. 포스파티딜글리세롤은 또한, 예를 들어, 하나의 아실 사슬이 스테아르산이고 또 다른 하나가 팔미트산인 비대칭 아실 사슬 조성물을 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 포스파티딜글리세롤 또는 포스파티딜세린의 염 형태는 에탄올에 매우 잘 용해된다. 일부 실시형태에서, 포스파티딜세린의 염 형태는 에탄올에 매우 잘 용해된다. 일부 실시형태에서, 이는 0.5mg/ml 이상, 1mg/mL 이상, 5mg/mL 이상, 10mg/mL 이상, 또는 20mg/mL 이상으로 용해된다. 일부 실시형태에서, 포스파티딜글리세롤 또는 포스파티딜세린의 염 형태는 22℃ 이하의 온도에서 200 순도의 에탄올에서 진탕 플라스크 방법으로 측정 시 적어도 0.3 mM, 적어도 0.4 mM, 적어도 0.5 mM, 적어도 0.6 mM, 또는 적어도 0.8 mM로 용해된다. 일부 실시형태에서, 염은 암모늄염이다. 한 실시형태에서, 포스파티딜세린은 암모늄 또는 치환된 암모늄염의 형태로 LNP 지질에 추가된다. 치환된 암모늄염은 각각 1-6개, 1-4개, 1-3개, 1개, 2개 또는 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 보유하는 모노-, 디-, 트리-, 또는 테트라알킬암모늄일 수 있다. 하나 이상의 알킬기는 n-알킬 또는 분지형 알킬기(예를 들어, 이소프로필기)가 될 수 있고, 또는 고리(예를 들어, 시클로헥실기)를 형성할 수 있다. 알킬기와 질소 암모늄 원자는 헤테로고리를 형성할 수 있다. 치환된 암모늄염은 알킬렌디아민에 의해서도 형성될 수 있다. 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄과 트리에탄올아민도 PS 염을 형성하기 위한 아민 염기로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아민은 암모니아, 디메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 2-(디메틸아미노)에탄올, 디에탄올아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸-글루카민, 이미다졸, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 4-(2-하이드록시에틸)-모르폴린, 피페라진, 1-(2-하이드록시에틸)-피롤리딘, 트리에탄올아민 및 트로메타민(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄)에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 이러한 표적화 지질은 DPPS의 암모늄염이다.
표 3D. 디팔미토일 또는 디스테아로일 포스파티딜세린의 암모늄 및 나트륨 염 형태.
암모늄 또는 치환된 암모늄염의 형태로 포스파티딜세린을 얻기 위해서는 해당 기술 분야에 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다. 한 실시형태에서, 포스파티딜세린(PS)의 나트륨염을, 암모늄 또는 치환된 암모늄의 염화물 염을 포함하는 클로로포름, 메탄올 및 물의 단일상 시스템(블라이-다이어(Bligh-Dyer) 단일상)에 용해시키고, 암모늄 또는 치환된 암모늄 염화물을 함유하는 추가 메탄올 및/또는 물을 추가하여 시스템을 2상 상태로 만든다. PS를 함유하는, 클로로포름이 풍부한 상을 분리하고, 이 과정을 반복한다. 마지막으로, 클로로포름이 풍부한 상을 물로 세척하여 과도한 염화물을 제거하고, 클로로포름이 풍부한 상을 증발시켜 PS의 암모늄(치환된 암모늄)염을 얻는다. 선택적으로, 수득된 PS의 암모늄 또는 치환된 암모늄염을 진공 건조하거나, 시클로헥산에 용해하여 동결건조한다. 또 다른 실시형태에서, PS를 나트륨 또는 칼륨 염으로서 클로로포름이나 클로로포름-메탄올 혼합물과 같은 물에 섞이지 않는 유기 용매에 용해시키고, HCl과 같은 산의 희석된 수용액으로 세척하여 PS의 유리 산 형태를 얻은 다음, 이를 유리 염기 형태의 수산화 암모늄이나 치환된 아민으로 중화시킨다. 또 다른 실시형태에서, 나트륨이나 칼륨 염인 PS의 유기 용액을 치환된 암모늄 형태의 암모늄에서 양이온 교환 수지로 처리한다. 또 다른 실시형태에서, PS는 칼슘 또는 마그네슘 염의 형태로 제조되고, 유기 용매의 존재 하에 EDTA와 같은 킬레이트제의 암모늄 또는 치환된 암모늄 염으로, 또는 암모늄 또는 치환된 인산 암모늄으로 처리되어, 칼슘 또는 마그네슘 이온이 킬레이트 또는 덜 용해되는 인산의 형태로 치환되고, 이는 여과 등에 의해 분리되고, PS의 암모늄 또는 치환된 암모늄 염은 유기(예를 들어, 에탄올) 용액에 남겨진다.
한 실시형태에서, PS 또는 PG는 LNP의 총 지질 함량의 약 0.1 mol% 내지 약 20 mol%, 약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%, 약 0.1 mol% 내지 약 5 mol%, 약 0.5 mol% 내지 약 20 mol%, 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 0.5 mol% 내지 약 5 mol%, 약 1 mol% 내지 약 20 mol%, 약 1 mol% 내지 약 10 mol%, 또는 약 1 mol% 내지 약 5 mol%의 농도로 LNP 지질 제형에 추가된다. 한 실시형태에서, PS는 LNP의 총 지질 함량의 약 1 mol% 내지 약 20 mol%, 약 2.5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 3 mol% 내지 약 9 mol%, 또는 약 4 mol% 내지 약 8 mol%.의 농도로 LNP 지질 제형에 추가된다.
한 실시형태에서 PS 또는 PG 지질은 DODAP, AKG-OA-DM2, O-11769, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-KC3-DMA, ALC-0315, 및 SM-102를 비롯하여, 해당 분야에 공지된 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하는 LNP 조성물에 포함된다.
또 다른 실시형태에서 PS 지질은 화학식 I, II, III, IV-B, V-A-1의 ICL, 이의 조합 또는 이의 약학적 염을 포함하는 LNP 조성물에 포함된다. 다른 실시형태에서, PS 지질은 3 내지 8, 4 내지 7, 또는 5 내지 6의 N/P 비율을 사용하여 LNP 조성물에 포함된다.
일부 양상에서, 핵산을 세포로 전달하는 방법이 제공되며, 이 방법은 세포 표면 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 리간드(또한 본 명세서에서 표적화 리간드로 지칭됨)를 포함하는 LNP를 포함하는 조성물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 항원에 대한 리간드의 결합은 리간드의 내재화를 유도한다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 내재화 항체, 또는 이의 단편, 소분자 접합체 또는 당접합체일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 특정 세포 표면 항원에 대한 표적화 리간드의 결합은, 내재화 조건하에서 세포와 접촉하여 인큐베이션될 때 적어도 100,000개 또는 적어도 1,000,000개의 항원 분자를 발현하는 세포에 의해 부착된 표적화 리간드로 LNP의 내재화를 유도한다.
표 4A. 디알킬 및 분지형 이온화 가능한 양이온 지질의 예시
표 4B. 디알킬 및 분지형 이온화 가능한 양이온 지질의 예시(계속)
조성물
일부 실시형태에서, 지질 나노입자 조성물은 지질 및 핵산을 포함하고, 지질 나노입자는 화학식 I, II, III, IV-B, V-A-1의 화합물, 또는 이의 조합 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 감염성 질병 또는 암의 예방을 위한 백신에서 이러한 이온화 가능한 지질 또는 이온화가능 지질을 포함하는 지질 나노입자 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 감염성 질병은 박테리아 또는 바이러스 감염일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 결핵, HIV/AIDS, 말라리아, 또는 COVID-19와 같은 코로나바이러스 관련 감염과 관련된 감염을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 감염은 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 뎅기열, 인유두종바이러스(HPV), 노로바이러스, 볼거리, 홍역, 수막구균성 질병, 폐렴구균성 질병, 소아마비, 로토바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 풍진, 대상포진/대상 포진 바이러스, 파상풍 또는 백일해이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 화합물 및 조성물은 조직 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 표적 세포의 효율적인 흡수 및 형질 전환을 촉진할 수 있다. 감염성 바이러스 또는 박테리아에 특이적인 항원을 코딩하는 효율적인 전달 핵산 및 후속하여 해당 항원을 제시하여 원하는 면역 반응을 유도하고 해당 감염으로부터 보호하는 것이 그 결과이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스의 에피토프를 인코딩하는 합성 핵산(예를 들어, 조작된 코돈 최적화 mRNA)일 수 있다. 일부 실시형태에서 핵산은 S-단백질(스파이크 단백질) 또는 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스의 단편을 인코딩하는 합성 핵산(예: 조작된 코돈 최적화 mRNA)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 백신은 마이코박테리움 감염을 예방하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 백신은 결핵, 비결핵성 마이코박테리아(NTM), 비결핵성 폐질병, 나병, 마이코박테리움 아비움-인트라셀룰레어, 마이코박테리움 칸사시, 마이코박테리움 마리눔, 마이코박테리움 궤양, 마이코박테리움 켈로네, 마이코박테리움 포르투이툼, 마이코박테리움 압세수스 및 기타 감염성 질병, 예를 들어, 코로나바이러스(SARS-CoV-2, Covid-19; SARS-CoV, SARS; MERS-CoV; HCoV-229E; HCoV-NL63; HCoV-OC43; HCoV-HKU1), 치쿤구냐, 뎅기열, 디프테리아, 에볼라, EV-D68, 인플루엔자(독감), 간염 바이러스(HAV, HBV, HCV, HDV, HEV 및 GB 바이러스 C 포함), 헤모필루스 인플루엔자 B형(Hib), 헨드라 바이러스, HIV/AIDS, 인간 메타뉴모바이러스(hMPV), 인간 파필로마바이러스(HPV), 라사, 라임, 말라리아, 마르부르크, 홍역, 수막구균성 질병, 이하선염, 니파 바이러스, 노로바이러스, 파라인플루엔자 바이러스(PIV), 역병(plague), 폐렴구균성 질병, 소아마비, 호흡기세포융합바이러스(RSV), 로키산 홍반열, 로타바이러스, 풍진(독일 홍역), 수두대상포진바이러스(수두, 대상포진), 천연두, 파상풍(Lockjaw), 웨스트 나일(West Nile), 백일해(Pertussis) 및 지카에 의해 유발되는 질병의 예방에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약학적 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 수성 매질에 존재한다.
일부 실시형태에서, 핵산은 본 명세서에 제공된 이온화 가능한 양이온 지질 화합물 또는 이의 조합을 포함하는 지질 나노입자에 포획되며, 여기서 핵산은 RNA 또는 DNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 siRNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 DNA이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 포스파티딜콜린 및 스테롤을 포함하는 막을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 포스파티딜콜린, 이온화 가능한 양이온 지질(ICL)을 포함하는 막을 포함한다. 일부 실시형태에서, ICL은 화학식 I 및 콜레스테롤의 구조를 가지며, 여기서 막은 지질 나노입자의 내부를 수성 매질로부터 분리한다. 일부 실시형태에서, ICL은 표 1A 및 표 2에 나타낸 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, ICL은 표 1B에 나타낸 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 포스파티딜콜린은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 또는 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC)이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질 대 콜레스테롤 몰비는 약 65:35 내지 40:60이다. 일부 실시형태에서, ICL 대 콜레스테롤 몰비는 약 60:40 내지 약 45:55이다.
일부 실시형태에서, 포스파티딜콜린 대 콜레스테롤 몰비는 약 1:5 내지 약 1:2이다.
일부 실시형태에서, 막은 중합체-접합 지질을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 ICL, DSPC, 콜레스테롤 및 중합체-접합 지질을 약 49.5:10.3:39.6:2.5 몰비로 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합체-접합 지질은 PEG(2000)-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG) 또는 PEG(분자량 2,000)-디미리스토일포스파티딜에탄올아민(PEG-DMPE)이다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어, 정맥내, 비경구, 복강내 또는 국소 경로를 통해 전신 전달을 수행하기 위한 다양한 경로로 투여될 수 있다. 조성물은 대상체에게 정맥내, 피하 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 대상체에게 핵산을 생체내 전달하기 위한 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 비경구 투여를 위한 액체 약학적 제형이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 피하, 근육내 또는 피내 투여를 위한 액체 약학적 제형이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 동결건조된 분말의 형태이며, 이는 후속적으로 투여 전에 수성 매질과 함께 재구성된다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함한다:
(I),
여기서 R1은
이고,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알킬이며;
n은 2, 3 또는 4와 동일한 정수이다.
여기서 두 개의 R1 탄화수소 사슬의 a와 b는 동일하거나 다르거나, 두 R1 탄화수소 사슬 중 하나는 포화된 C12-C18 알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I-A)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하고:
(I-A),
여기서 R1은
이고,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알킬이며;
n은 2, 3 또는 4와 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, 두 R1 탄화수소 사슬의 a와 b는 동일하다.
일부 실시형태에서, 두 R1 탄화수소 사슬의 a와 b는 상이하다.
일부 실시형태에서, 두 R1 탄화수소 사슬 중 하나는 포화된 C12-C18 알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I-A)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하고:
(I-A),
여기서 R1은
이고,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 메틸이며;
n은 3과 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, 두 R1 탄화수소 사슬의 a와 b는 동일하다.
일부 실시형태에서, 두 R1 탄화수소 사슬의 a와 b는 상이하다.
일부 실시형태에서, 두 R1 탄화수소 사슬 중 하나는 포화된 C12-C18 알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I-A)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하고:
(I-A),
여기서
R1은 포화된 C15-C18 탄화수소 사슬이고,
R2 및 R3은 각각 메틸이며;
n은 3과 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, 두 R1 탄화수소 사슬의 a와 b는 동일하다.
일부 실시형태에서, 두 R1 탄화수소 사슬의 a와 b는 상이하다.
일부 실시형태에서, 두 R1 탄화수소 사슬 중 하나는 포화된 C12-C18 알킬이다.
사용 방법.
수지상 세포의 표적화
수지상 세포(DC)는 적응 면역을 개시하고 조절하는 데 중심적인 역할을 하는 특수화된 항원 제시 세포이다. 강력한 항원(Ag) 제시 능력과 뚜렷한 T 세포 반응을 생성하는 능력으로 인해, DC에 Ag를 효율적이고 특이적으로 전달하는 것은 종양이나 병원체에 대한 Ag 특이적 이펙터 및 기억 세포를 생성하기 위한 초석이다.
수지상 세포는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), IL-4 및 IFN-감마를 추가하여 시험관 내에서 단핵구 유래 DC를 분화시킴으로써 인간 혈액 단핵구로부터 생성될 수 있다. 배양 세포는 수지상 및 가려진 형태를 모두 나타내며, 전자는 부착형이고 후자는 현탁형이다. 표현형적으로는, 이들은 CD1a-/dim, CD11a+, CD11b++, CD11c+, CD14dim/-, CD16a-/dim, CD18+, CD32dim/-, CD33+, CD40+, CD45R0+, CD50+, CD54+, CD64-/dim, CD68+, CD71+, CD80dim, CD86+/++, MHC class I++/ , HLA-DR++/ , HLA-DP+, 및 HLA-DQ이다(Geiseler 외, Dev Immunol. 1998;6(1-2):25-39).
대안적으로, 인간 1차 혈액 수지상 세포주가 개발되었으며 Creative Biolabs사로부터 상업적으로 수득가능하다.
CD8+ T 세포는 IL2, IFN-γ 및 TNF를 생산할 수 있는데, 이들은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염 동안 중요한 기능을 하는 것으로 알려진 사이토카인이다. 중요하게는, CD8+ T 세포는 과립-매개 기능(퍼포린, 그랜자임 및 그래뉼리신을 통해) 또는 아폽토시스를 유도하는 Fas-Fas 리간드 상호작용을 통해 마이코박테리움 투베르쿨로시스에 감염된 세포를 사멸시키는 세포용해 기능을 가지고 있다. 인간에서 CD8+ T 세포는 마이코박테리움 투베르쿨로시스를 직접 사멸시킬 수 있는 그래뉼리신을 생산할 수 있다. 따라서 DC에 전달된 항원 생성 mRNA LNP는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염에 맞서 싸우기 위해 CD8+ T 세포 반응을 자극할 것으로 예상된다.
CD8+ T 세포는 고전적 및 비고전적 MHC 분자에 의해 제시된 M. 투베르쿨로시스 특이적 항원(펩티드)을 인식할 수 있다. 고전적으로 제한된 CD8+ T 세포는 고전적인 MHC Ia(HLA-A, -B, -C) 분자와 관련하여 항원 제시 세포에 의해 제시된 항원을 인식하는 것으로 확인되었다. 비고전적으로 제한되는 CD8+ T 세포에는 HLA-E 분자(비-MHC 1a), 군 1 CD1 분자와 관련된 당지질 및 MHC I 관련 분자(MR1)의 맥락에서 Mg 항원을 인식할 수 있는 CD8+ T 세포, 예를 들어, 점막 관련 불변 T 세포(MAIT)가 포함된다. 마지막으로, γδ T 세포는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염에 대한 반응으로 선천 기능과 적응 기능을 모두 가진 CD8(및 CD4) T 세포의 별도 집단을 나타낸다. CD8+ T 세포는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염에 반응하여 직접적인 기능을 수행하는 것으로 나타났지만 전체 숙주 면역 반응(예를 들어, 최적의 CD4 T 세포 기능을 제공하기 위한 상호 작용)에서 많은 상이한 기능들을 조율하는 데 중요한 역할을 한다.
한 실시형태에서, LNP는 배양된 인간 수지상 세포에 적절한 농도(예: 1-5μg/mL mRNA)로 추가될 수 있다. 세포를 흡수시키고 항원을 발현시킬 수 있게 하는 일정 시간 후, 인간 T 세포(HemaCare)를 추가할 수 있고 세포 배양 배지를 INF-γ에 대해 다양한 시간에 Elisa(R&D Systems, DIF50C)로 샘플링한다. 대안적으로, 세포는 CD8+ 마커 또는 세포내 INFγ 생성(PE 항-인간 IFN-γ 항체, Biolegend)에 대해 유세포 분석법에 의해 분석될 수 있다.
한 실시형태에서, LNP는 상기 약술된 임의의 투여 경로에 의해 0.01-5 mg/kg mRNA의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, LNP의 일부는 DC 세포에 흡수되는 반면, 대부분은 간 및 비장에 축적될 것이다. DC 세포는 항원성 펩티드를 발현할 수 있고, MHC I 제시를 위해 그것을 처리하고 나이브 T 세포에 제시하기 위해 림프절로 이동하여 항원에 대한 기억 T 세포의 교육을 유도할 수 있다.
한 실시형태에서, 항-DEC205-PEG-DSPE와 같은 표적화 리간드로 변형된 LNP는 0.01-5 mg/kg mRNA의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 더 높은 비율의 LNP가 DC 세포로 흡수될 수 있어, 비표적화 LNP에 비해 항원성 펩티드의 생산을 증가시키고 병원체에 대한 백신접종을 보다 효율적이게 할 수 있다. 수지상 세포에 대한 추가적인 표적화 리간드는 CLEC9A, CLEC4A, XCR1, CD141 및 HLD-DR을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, R&D Systems의 종 특이적 IFN-감마 Quantikine ELISA 키트로 INFγ 혈장 수준을 측정하여 생체 내 생산된 항원에 대한 CD8+ 반응성을 평가할 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 연장된 혈장 반감기 및 mRNA의 안정한 캡슐화와 같은 바람직한 약동학적 특성을 제공한다. 혈장 반감기는 면역적격 마우스에 정맥 주사한 후 6시간 또는 24시간 후에 혈액에 남아 있는 주사된 용량(ID)의 백분율로 측정될 수 있다. 혈장에서 24시간에 걸친 mRNA 캡슐화의 안정성은 마우스에서 iv 투여 후 mRNA-대-지질 비율(mRNA/L 비율)의 변화에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈액에 남아있는 캡슐화된 mRNA의 백분율은 6시간에 주입된 용량의 20% 초과, 바람직하게는 30% 초과, 가장 바람직하게는 40% 초과이다. 24시간 후 혈액에 남아 있는 퍼센트는 바람직하게는 주입된 용량의 10% 초과, 더 바람직하게는 20% 초과이다.
본 명세서에서는 마이코박테리움 투베르쿨로시스와 같은 마이코박테리아 감염, 또는 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA)와 같은 그람 양성 박테리아를 예방하는 방법을 개시한다. 추가적인 마이코박테리아 및 그람 양성 박테리아에는 마이코박테리움 아비움 콤플렉스, 마이코박테리움 레프라에, 마이코박테리움 고르도나에, 마이코박테리움 앱세서스, 마이코박테리움 앱세서스, 마이코박테리움 뮤코제니쿰, 스트렙토코키, 반코마이신 내성 엔테로코키(VRE), 스타필로코쿠스 뉴모니아에, 엔테로코쿠스 패시움, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 비리단스 그룹 스트렙토코키, 리스테리아 모노사이토게네스, 노카르디아, 및 코리네박테리움이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
제2 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 투여는 MHC 클래스 II 제시된 에피토프를 제공할 수 있는데, 이는 MHC 제시된 에피토프들을 유도한 항원을 발현하는 세포에 대해 CD4 + 헬퍼 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제2 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 투여는 MHC 클래스 I 제시된 에피토프를 제공할 수 있는데, 이는 MHC 제시된 에피토프들을 유도한 항원을 발현하는 세포에 대해 CD8 + T 세포 반응을 유도할 수 있다. 또한, 제2 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 투여는 하나 이상의 네오-에피토프(알려진 네오 에피토프 포함) 뿐만 아니라 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않지만 암세포에 의해 발현되고 바람직하게는 암 세포에 대한 면역 반응, 바람직하게는 암 특이적 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 에피토프를 제공할 수 있다. 한 실시형태에서, 제2 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 투여는 신생 에피토프를 제공하는데, 이는 MHC 클래스 II-제시된 에피토프인 및/또는 MHC 제시된 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대해 CD4 + 헬퍼 T 세포 반응을 유도할 수 있으며, 뿐만 아니라, 상기 투여는 암-특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않는 에피토프를 제공하는데, 이는 MHC 클래스 I-제시된 에피토프인 및/또는 MHC 제시된 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대해 CD8 + T 세포 반응을 유도할 수 있다. 한 실시형태에서, 에피토프는 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않는다.
"세포 면역 반응", "세포 반응", "항원에 대한 세포 반응" 또는 유사한 용어는 항원을 클래스 I 또는 클래스 II MHC로 제시하는 것을 특징으로 하는 세포에 대한 세포 반응을 포함하고자 한다. 세포 반응은 "헬퍼 세포" 또는 "살해 세포"로 작용하는 T 세포 또는 T 림프구라고 하는 세포와 관련이 있다. 헬퍼 T 세포(CD4+T 세포라고도 함)는 면역 반응을 조절하고 살해 세포(세포독성 T 세포, 세포용해 T 세포, CD8+T 세포 또는 CTLS라고도 함)는 암 세포와 같은 질병 세포를 사멸시켜, 더 많은 질병 세포의 생성을 방지하는 중심적인 역할을 한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 발현된 항원을 발현하고 바람직하게는 이러한 발현된 항원을 클래스 I MHC로 제시하는 마이코박테리움에 대한 항-마이코박테리움 투베르쿨로시스 CTL 반응의 자극을 포함한다.
본 발명에 따른 "항원"은 면역 반응을 유도할 임의의 물질을 포함한다. 특히, "항원"은 항체 또는 T-림프구(T 세포)와 특이적으로 반응하는 임의의 물질, 바람직하게는 펩티드 또는 단백질에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항원"은 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 항원은 선택적으로 가공 후, 바람직하게는 항원(항원을 발현하는 세포 포함)에 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. 본 발명에 따르면, 면역 반응의 후보인 임의의 적합한 항원이 사용될 수 있으며, 여기서 면역 반응은 바람직하게는 세포 면역 반응이다. 본 발명의 실시형태의 맥락에서, 항원은 바람직하게는 세포, 바람직하게는 MHC 분자의 맥락에서 질병 세포, 특히 암 세포를 포함하는 항원 제시 세포에 의해 제시되며, 이는 항원에 대한 면역 반응을 초래한다. 항원은 바람직하게는 자연 발생 항원에 해당하거나 이로부터 유래된 생성물이다. 이러한 자연 발생 항원은 종양 항원을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "항원 펩티드"는 면역 반응, 바람직하게는 항원의 발현 및 바람직하게는 이러한 항원의 제시를 특징으로 하는 항원 또는 세포들, 예를 들어, 질병 세포, 특히 암 세포에 대한 세포 반응을 자극할 수 있는 항원의 일부 또는 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, 항원 펩티드는 클래스 I MHC를 갖는 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포 반응을 자극할 수 있고 바람직하게는 항원 반응성 세포독성 T-림프구(CTL)를 자극할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항원 펩티드는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시된 펩티드이거나 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시된 펩티드를 생성하도록 가공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 펩티드는 항원 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 항원의 상기 단편은 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시된 펩티드이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항원 펩티드는 이러한 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하고 이러한 단편, 즉 항원으로부터 유도된 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩티드를 생성하도록 가공된다. 펩티드가 곧바로, 즉, 가공 없이, 특히, 절단 없이 제시되어야 한다면, MHC 분자, 특히, 클래스 I MHC 분자에 결합하기에 적합한 길이, 바람직하게는 7-20개 길이, 더 바람직하게는 7-12개 아미노산 길이, 더 바람직하게는 8-11개 아미노산 길이, 특히, 9 또는 10개 아미노산 길이를 가진다.
전문 항원 제시 세포의 주요 유형은 가장 넓은 범위의 항원을 제시하는 수지상 세포이며 그리고 아마도 가장 중요한 항원 제시 세포인, 대식세포, B 세포 및 특정 활성화된 상피 세포일 것이다. 수지상 세포(DC)는 말초 조직에서 포획된 항원을 MHC 클래스 II 및 I 항원 제시 경로 모두를 통해 T 세포에 제시하는 백혈구 집단이다. 수지상 세포가 면역 반응의 강력한 유도인자이며 이 세포의 활성화가 항종양 면역 유도를 위한 중요한 단계라는 것은 잘 알려져 있다. 수지상 세포는 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 편리하게 분류되며, 이는 2개의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법으로 사용될 수 있다.
그러나 이 명명법은 분화의 모든 가능한 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 미성숙 수지상 세포는 항원 흡수 및 처리 능력이 높은 항원 제시 세포로서 특징되며, Fcg 수용체 및 만노스 수용체의 높은 발현과 상관관계가 있다. 성숙 표현형은 전형적으로 이들 마커의 낮은 발현, 그러나 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자, 예를 들어, 클래스 I 및 클래스 II MHC, 접착 분자(예를 들어, CD54 및 CD11) 및 공동자극 분자(예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)의 높은 발현을 특징으로 한다. 수지상 세포 성숙은 수지상 세포 활성화 상태로 지칭되는데, 이 상태에서 이러한 항원 제시 수지상 세포는 T 세포 프라이밍을 유도하지만, 미성숙 수지상 세포에 의한 제시는 내성을 초래한다. 수지상 세포 성숙은 주로 선천적 수용체에 의해 검출되는 미생물 특성(박테리아 DNA, 바이러스 RNA, 내독소 등)을 가지는 생물분자, 전염증성 사이토카인(TNF, IL-1, IFNs), CD4OL에 의한 수지상 세포 표면의 CD40의 결찰 및 스트레스가 많은 세포 사멸을 거치는 세포에서 방출되는 물질에 의해 유발된다. 수지상 세포는 골수 세포를 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM CSF) 및 종양 괴사 인자 알파와 같은 사이토카인과 함께 시험관 내에서 배양함으로써 유도될 수 있다. 비전문적 항원 제시 세포는 순진 T 세포와 상호작용하는 데 필요한 MHC 클래스 II 단백질을 구성적으로 발현하지 않는다. 이러한 단백질은 IFNg와 같은 특정 사이토카인에 의해 비전문적 항원 제시 세포가 자극을 받았을 때만 발현된다. "항원 제시 세포"에는 펩티드 또는 제시될 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 바람직하게는 mRNA, 예를 들어, 항원을 인코딩하는 핵산을 세포에 형질도입함으로써 MHC 클래스 I 제시된 펩티드가 로딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포를 표적으로 하는 유전자 전달 비히클을 포함하는 약학 조성물은 환자에게 투여되어 생체내에서 일어나는 형질 전환을 야기할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 더욱 바람직하게는 RNA, 가장 바람직하게는 시험관내 전사 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA이다. 핵산은 본 발명에 따라 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합 생산 및 화학적 합성 분자를 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 선형 또는 공유적으로 원형으로 폐쇄된 분자로 존재할 수 있다. 핵산은 본 발명에 따라 단리될 수 있다. 용어 "단리된 핵산"은 본 발명에 따라, 핵산이 (i) 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 시험관 내에서 증폭되었고, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생성되었으며, (iii) 예를 들어, 겔 전기영동에 의한 절단 및 분리에 의해 정제되었고, 또는 (iv) 예를 들어, 화학적 합성에 의해 합성되었음을 의미한다. 핵산은 특히 DNA 템플릿으로부터 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA의 형태로, 세포 내부에 도입, 즉, 세포를 형질 전환시키기 위해 사용될 수 있다. 또한 RNA는 사용 전 서열 안정화, 캡핑 및 폴리아데닐화에 의해 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 바람직하게는 전체적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오티드"는 B-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 하이드록실기를 갖는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 용어 "RNA"는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA와 같은 단리된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 생성된 RNA, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 발생 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은, 예를 들어, RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비-뉴클레오티드 물질을 추가하는 것을 포함할 수 있다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비-표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체라고 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "RNA"는 "mRNA"를 포함하고 바람직하게는 이와 관련이 있다. "mRNA"라는 용어는 "메신저-RNA"를 의미하며, DNA 템플릿을 사용하여 생성되고 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 "전사체"에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역 및 3'-UTR을 포함한다. mRNA는 세포에서 그리고 시험관 내에서 제한된 반감기를 가지고 있다. 본 발명의 내용에서, mRNA는 DNA 템플릿으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에서 사용된 RNA와 관련하여 용어 "변형"은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 포함한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트는 RNA를 포스파타제로 처리함으로써 제거될 수 있다. 본 발명에 따른 RNA는 안정성을 증가시키고/시키거나 세포독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 한 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA에서 5-메틸시티딘은 시티딘을 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 치환한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 한 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA에서 수도우리딘은 우리딘을 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 치환한다.
한 실시형태에서, 용어 "변형"은 RNA에 5-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것과 관련된다. 용어 "5-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 말하며 일반적으로 특이한 5'-5 트리포르페이트 링키지를 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 한 실시형태에서, 이러한 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 "통상적인 5'-캡"은 천연 발생 RNA 5'-캡, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡(m'G)을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "5'-캡"은 RNA 캡 구조와 유사하고 바람직하게는 생체내에서 및/또는 세포에서 RNA에 부착시 RNA를 안정화하고/하거나 RNA의 번역을 향상시키는 능력을 갖도록 변형된 5'-캡 유사체를 포함한다.
본 발명에 따르면, RNA의 안정성 및 번역 효율은 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, RNA는 안정화될 수 있고 안정화 효과를 갖는 하나 이상의 변형 및/또는 RNA의 번역 효율 증가에 의해 이의 번역이 증가될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함된 PCT/EP2006/009448에 설명되어 있다. 본 발명에 따라 사용되는 RNA의 발현을 증가시키기 위해, 코딩 영역, 즉, 발현된 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 서열 내부에서, RNA는 바람직하게는 발현된 펩티드 또는 단백질의 서열을 변경시키지 않고, GC 함량을 증가시켜 mRNA 안정성을 증가시키고 코돈 최적화를 수행하여 세포에서 번역을 향상시키도록 변형될 수 있다.
본 발명의 양상은 박테리아 또는 바이러스 감염을 예방하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 면역 반응을 유도하기 위해 본 명세서에 제공된 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 양상은 대상체를 백신접종하는 방법을 제공하며 이 방법은 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)을 포함하는 본 명세서에 기술된 조성물의 단일 용량을 대상체를 백신접종하기 위한 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 양이온 지질 나노입자 내에 제형화된다. 일부 실시형태에서,지질 나노입자 조성물은 단일 주사로 투여된다.
일부 실시형태에서, 박테리아 감염은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 감염은 코로나바이러스이다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 감염은 HIV/AIDS이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 비경구적으로 투여된다.
일반적으로 환자에게 피내주사 투여가 가능하다. 그러나 주사는 림프절 내부에 림프절 내 투여될 수도 있다(Maloy 외, (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-3033). 생성된 세포는 관심 복합체를 제시하고 자가 세포독성 T 림프구에 의해 인식된 다음 증식한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 흡입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 비강 스프레이 및/또는 에어로졸로 제형화된다.
본 명세서에 개시된 약학 조성물에서 활성제의 실제 투여량 수준은 환자에 대한 독성 없이 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성제의 양을 얻기 위해 다양할 수 있다.
투여에 관한 내용에서 본 명세서에서 사용되는 "비경구"는 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식들, 통상적으로, 주사를 의미하며, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경결막, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 문구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"은 장관 (즉, 소화관을 통한) 및 국소 투여 이외의 투여 방식들, 통상적으로, 주사 또는 주입을 지칭하며, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경결막, 피하, 표피하, 관절내, 흡입, 피막하, 지주막하, 호흡기 점막, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다. 정맥 주사 및 주입은 리포솜 약물 투여에 종종(배타적이지는 않지만) 사용된다.
최적의 원하는 반응 (예: 치료 반응)을 제공하기 위해 용량 요법이 조정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 용량이 시간에 따라 투여될 수 있거나 이러한 용량은 치료 상황의 긴급성이 나타나는 바에 따라 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 5mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 5mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 3mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 3mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 1mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 1mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.5mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.5mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 1mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.1mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.05mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.1mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.05mg/kg의 mRNA를 포함한다.
화합물 및/또는 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 화합물 및/또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 LNP의 용량은 넓은 범위 내에서 달라질 수 있으며, 각 특정 사례에서 개별 조건 및 통제되는 병원체에 대해 자연적으로 조정될 것이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질(ICL)이 제공된다. 양이온 지질은 세포에서 높은 형질 전환 활성 또는 효능을 유지하면서도 보관 중에 산화적 분해에 대한 안정성이 개선되도록 설계되었다. 본 발명의 여러 양상은 mRNA와 특정 이온화 가능한 양이온 지질(ICL)을 포함하는 LNP 조성물이 인간 수지상 세포에서 mRNA의 발현을 향상시킨다는 발견에 부분적으로 기초하고 있다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 수지상 세포를 포함하여 매우 특이적인 방식으로 지질 나노입자를 표적화하기 위해 세포 표면 수용체에 대해 지시되는 표적 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 표적 리간드로서 디팔미토일포스파티딜-L-세린(DPPS) 또는 디스테아로일포스파티딜-L-세린(DSPS)과 같은 포스파티딜-L-세린 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 표적 리간드로서 포스파티딜-L-세린 화합물과 음이온성 인지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 인간 수지상 세포에서 발현을 향상시키기 위해 표적화 리간드로서 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG) 또는 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG)과 같은 포스파티딜글리세롤 함유 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 표적 리간드로서 포스파티딜-L-세린 화합물과, 제2 인지질로서 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)을 모두 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 표적화 리간드로서 포스파티딜-L-세린 화합물, 그리고 제2 인지질로서 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)을 모두 포함하며 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)은 포함하지 않는다.
본 발명의 여러 양상은 특정 이온화 가능한 양이온 지질을 선택하면 인간 수지상 세포의 형질 전환이 향상될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초하고 있다. 예를 들어, KC3 양이온 이온성 지질은 LNP 조성물에서 인간 수지상 세포를 형질 전환시키는 데 있어 KC2 또는 디아실 이온화 지질(UO 계열)보다 더 활성이었다. KC3 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하는 LNP 조성물 중에서, 단일불포화 알킬 사슬을 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하는 LNP 조성물은 놀랍게도 디리놀레일 알킬 사슬을 갖는 조성물을 함유하는 조성물보다 산화적 분해에 대해 활성이 더 높고 안정성이 더 높았다. 또한, 단일불포화 지질, 예를 들어, 디아실 이온화 가능한 지질(UO-계열)을 포함하는 LNP 조성물에서 인간 수지상 세포 활성에 있어서 감소된 형질 전환을 관찰했다.
일부 실시형태에서, 지질을 표적하는 포스파티딜세린의 특정 염이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 지질을 표적하는 포스파티딜세린은 LNP 제조에 바람직한 용매인 에탄올의 존재 하에서 향상된 생물학적 특성과 더 높은 용해도를 갖는 DPPS의 암모늄염으로 제공될 수 있다. DSPS 또는 DSPS의 나트륨염은 에탄올에 불용성이며, 이의 형성에 메탄올의 존재와 가열이 모두 필요했는데, 이는 DSPS의 암모늄염도 마찬가지였다. 포스파티딜세린의 다른 암모늄염도 용해도와 생물물리적 특성에 있어서 동일한 이점을 제공할 것으로 생각된다.
일부 실시형태에서, 리포좀 나노입자(LNP) 조성물을 제조하는 데 유용한 이온화 가능한 양이온 지질 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, (a) 디알킬 아미노 알킬기를 포함하는 헤드기에 공유 결합된 각 폴리엔 탄화수소 사슬 내에 단일 불포화 알케닐 이중 결합을 포함하는 한 쌍의 선형 C16 또는 C18 탄화수소 사슬을 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하는 리포좀 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질의 헤드기는 약 6.3-7.5의 pKa를 갖는 디알킬 아미노기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질의 헤드기는 디알킬 아미노기에 공유 결합된 헤테로사이클릴 또는 알킬 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질의 헤드기는 선택적으로 인산기를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질 화합물의 각 지질 테일은 동일하며, 각 지질 테일은 총 15, 16, 17 또는 18개의 탄소 길이를 갖는 총 하나의 올레핀을 갖는다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하고:
(I),
여기서 R1은
이고,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알킬이며;
n은 2, 3 또는 4와 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하며, 여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고; R2 및 R3은 각각 메틸이고; n은 3과 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 화학식 (I-A)의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하고:
(I-A),
여기서 R1은
이고,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 메틸이며;
n은 3과 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 총 15, 16, 17 또는 18개의 탄소를 갖고 단일 올레핀기 또는 한 쌍의 올레핀기를 포함하는 한 쌍의 동일한 지질 탄화수소 테일을 포함하는 이온화 가능한 양이온 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 다음으로 구성된 군에서 선택된 이온화 가능한 양이온 지질을 포함한다:
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-PA이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-C15(C8:1)이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-C16(C8:1)이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-C17(C8:1)이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-C18(C8:1)이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-15이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-16이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-17이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-18이다.
표적화 지질의 염 형태는 지질 나노입자 제조에 사용되는 알코올 함유 용매에서 이의 용해도에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 핵산; 본 명세서에 개시된 이온화 가능한 지질; 스테롤; 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질을 포함하고; 및 선택적으로 접합 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 mRNA 핵산; 본 명세서에 개시된 이온화 가능한 지질; 콜레스테롤; DSPC, DPPC 및 DOPC로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인지질; 및 DPPS, DSPS 및 DOPS로 구성된 군에서 선택된 PS 지질을 포함하고; 선택적으로 PEG를 포함하는 접합 지질을 추가로 포함한다.
. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-1A:
이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-1B:
이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-2
이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-4:
이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-4A:
이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-5:
이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-6, AKG-UO-7, AKG-UO-7, AKG-UO-8, AKG-UO-9, 또는 AKG-UO-10이다:
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 음이온성 인지질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 음이온성 인지질의 나트륨 또는 암모늄염을 사용하여 제조된다. 일부 실시형태에서, 음이온성 인지질 염은 다음 화학 구조를 갖는 화학식 (VA-1)의 화합물이고:
화학식 (V-A-1),
여기서
X+는 암모늄(NH4+) 또는 나트륨(Na+) 양이온이고;
a는 14, 15 또는 16이다.
일부 실시형태에서, 음이온성 인지질 염은 다음으로 구성된 군에서 선택된다:
.
일부 실시형태에서, 음이온성 인지질 염은 DSPS(L-이성질체) 나트륨 염이다. 일부 실시형태에서, 음이온성 인지질 염은 DSPS(L-이성질체) 암모늄 염이다. 일부 실시형태에서, 음이온성 인지질 염은 DPPS(L-이성질체) 나트륨 염이다. 일부 실시형태에서, 음이온성 인지질 염은 DPPS(L-이성질체) 암모늄 염이다. 일부 실시형태에서, 표적화 지질은 디팔미토일포스파티딜-L-세린(DPPS) 또는 디스테아로일포스파티딜-L-세린(DSPS)의 나트륨 또는 암모늄염이다. 일부 실시형태에서, 표적화 지질은 디팔미토일포스파티딜-L-세린(DPPS) 또는 디스테아로일포스파티딜-L-세린(DSPS)의 나트륨 또는 암모늄염이다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 다음으로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질:
,
또는 이의 암모늄 또는 나트륨 염을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 포스파티딜세린의 염 형태는 에탄올에 매우 잘 용해된다. 일부 실시형태에서, 이는 0.5mg/ml 이상, 1mg/mL 이상, 5mg/mL 이상, 10mg/mL 이상, 또는 20mg/mL 이상으로 용해된다. 일부 실시형태에서, 염은 암모늄염이다. 일부 실시형태에서, 염은 암모늄 그 자체, 알킬암모늄, 디알킬암모늄 또는 트리알킬암모늄 염이다. 일부 실시형태에서, 아민은 암모니아, 디메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 2-(디메틸아미노)에탄올, 디에탄올아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸-글루카민, 이미다졸, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 4-(2-하이드록시에틸)-모르폴린, 피페라진, 1-(2-하이드록시에틸)-피롤리딘, 트리에탄올아민 및 트로메타민(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄)에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 이러한 표적화 지질은 DPPS의 암모늄염이다.
포스파티딜-L-세린으로부터 분리된 음이온성 인지질 또한 LNP에 대한 표적화 지질로 간주되었다. 이들에는 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티드산(PA), N-글루타릴-포스파티딜에탄올아민(N-Glu-PE), N-석시닐-포스파티딜에탄올아민(N-Suc-PE) 및 카르디오리핀이 포함된다. 일부 실시형태에서, LNP는 LNP에 대한 표적화 지질로 유용한 포스파티딜-L-세린으로부터 분리된 음이온성 인지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 다음으로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질을 포함한다: 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티드산(PA), N-글루타릴-포스파티딜에탄올아민(N-Glu-PE), N-석시닐-포스파티딜에탄올아민(N-Suc-PE) 및 카디오리핀. 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디팔미토이포스파티딜글리세롤(DPPG), N-석시닐-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(N-Suc-DSPE), N-글루타릴-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(N-glu-DSPE), 디스테아로일포스파티드산(DSPA) 및 카디오리핀 또한 음이온성 인지질로서 제공된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질 조성물을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 mRNA 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 이러한 LNP 조성물의 총 지질의 2.5-10mol% 총량의 PS 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 DSPS(L-이성질체) 및 DPPS로 구성된 군에서 선택된 PS 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 접합 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.0 mol% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2 mol% 미만 총량으로 접합 지질을 포함하고, 접합 지질은 PEG-DMG이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 핵산; 본 명세서에 개시된 이온화 가능한 지질; 스테롤; 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질을 포함하고; 및 선택적으로 접합 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 조성물은 mRNA 핵산; 본 명세서에 개시된 이온화 가능한 지질; 콜레스테롤; SM, DSPC, HSPC, DPPC 및 DOPC로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인지질; 및 DPPS 및 DSPS로 구성된 군에서 선택된 PS 지질을 포함하고; 선택적으로 PEG를 포함하는 접합 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물은: 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 25-45mol% 총량의 스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질, LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질을 포함하고; 그리고 선택적으로 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5mol% 총량의 접합 지질을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은: DSPS(L-이성질체), DPPS(L-이성질체), DMPS(L-이성질체), DOPS(L-이성질체), 및 DSPS(D-이성질체)로 구성된 군에서 선택된 음이온성 지질을 추가로 포함한다.
본 발명의 양상은 다음의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이며:
,
여기서 R1은
이고,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알킬이며;
n은 2, 3 또는 4와 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, n은 2 또는 3이다. 일부 실시형태에서, a는 0이다. 일부 실시형태에서, b는 1, 2 또는 3이다. 일부 실시형태에서, a은 1이다. 일부 실시형태에서, b는 1, 2 또는 3이다. 일부 실시형태에서, R2 및 R3은 각각 메틸이다.
일부 실시형태에서, R1은
이고,
a는 0 또는 1이고 b는 1 또는 3이며; R2 및 R3은 각각 메틸이고; n은 2 또는 3이다. 일부 실시형태에서, n은 3이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 핵산; 본 명세서에 설명된 이온화 가능한 지질, 스테롤; 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질; 및 선택적으로 접합 지질을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 핵산은 mRNA이다.
일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 다음으로 구성된다: SM, DSPC, HSPC, DPPC 및 DOPC로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인지질; 및 DPPS 및 DSPS로 구성된 군에서 선택된 PS 지질.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 다음으로 구성된다: DSPC; 및 (L-세린) DPPS 및 (L-세린) DSPS로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 PS 지질.
일부 실시형태에서, 조성물은 PS 지질을 조성물의 총 지질의 2.5-10 mol% 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 접합 지질은 PEG를 포함한다.
본 발명의 양상은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 총 25-45mol% 총량의 스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질, 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질을 포함하고; 그리고 선택적으로 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5mol% 총량의 접합 지질.
일부 실시형태들에서, 핵산은 mRNA이다.
일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 DSPC 및 L-세린 PS로 구성된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 PS를 조성물의 총 지질의 2.5-7.5 mol% 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 접합 지질은 PEG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합 지질은 PEG-DMG를 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 접합 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.0 mol% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 접합 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2 mol% 미만의 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이고, 이온화 가능한 양이온 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 45-55 mol% 총량으로 존재하고; 스테롤은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 35-45 mol% 총량의 콜레스테롤이고; 인지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 7-15 mol%의 총량으로 존재하고; 하나 이상의 인지질은 DSPC로 구성되고, PS 지질은 DPPS 및 DSPS의 L-세린 구조로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 지질이고; PS 지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 약 5 mol%이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 PS 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.25 mol%, 2.5 mol%, 5 mol%, 7.5 mol% 및 10 mol%로부터 선택된 총량으로 포함한다.
본 발명의 양상들은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: 핵산(여기서 핵산은 mRNA임); 이온화 가능한 양이온 지질(여기서 이온화 가능한 양이온 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 45-55 mol% 총량임); 스테롤(여기서 스테롤은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 35-45 mol% 총량의 콜레스테롤임); 하나 이상의 인지질(여기서 하나 이상의 인지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 10 mol% 총량의 인지질임), 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 3-9 mol% 총량의 포스파티딜세린(PS); 및 접합 지질(여기서 접합 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.0 mol% 총량임).
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 DSPS(L-이성질체), DPPS(L-이성질체), DMPS(L-이성질체), DOPS(L-이성질체), 및 DSPS(D-이성질체)로 구성된 군에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 접합 지질은 PEG-DMG이고; PS 지질은 DSPS(L-이성질체) 및 DPPS로 구성된 군에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1) 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-PA이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-OA이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-C17(C8:1)이다.
일부 실시형태에서, LNP는 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 50 mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 38.5 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 7-15 mol% 총량의 하나 이상의 인지질, 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 3-9 mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.0 mol% 총량의 PEG 함유 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인지질은 DSPC, DOPC, DPPC, HSPC 및 SM으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인지질로 구성된다.
일부 실시형태에서, PS 지질은 DPPS 및 DSPS로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 L-세린 지질이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 일치하지 않는 아실 사슬 길이를 갖는 적어도 두 개의 (L-세린) PS 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인지질은 DSPC 및 DPPS이다. 일부 실시형태에서, DSPC와 DPPS는 각각 LNP 조성물의 총 지질 함량을 기준으로 각각 5 mol%의 총량으로 LNP에 존재한다.
본 발명의 양상은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: 핵산, LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질 KC3-PA 또는 KC3-OA, 및 (L-세린) PS 지질.
일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이고, PS 지질은 (L-세린)DPS, (L-세린)DPPS, 또는 이들의 혼합물이고, LNP 조성물은 콜레스테롤 및 DSPC, DPPC, HSPC, 및 SM으로 구성된 군에서 선택된 제2 인지질을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량을 기준으로 0.5-2.0 mol%의 PEG-DMG 또는 PEG-DSG를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-PA이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA이다.
본 발명의 양상은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: 핵산, LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 KC3-C17 (C8:1)이온화 가능한 양이온 지질, 및 (L-세린) PS 지질.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 N/P 비율이 4 내지 7이다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 N/P 비율이 5 내지 6이다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 N/P 비율이 5.3이다.
본 발명의 양상은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: 핵산, 이온화 가능한 양이온 지질 KC3-PA, 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린) PS 지질.
일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이고, PS 지질은 (L-세린)DPS, (L-세린)DPPS, 또는 이들의 혼합물이고, LNP 조성물은 콜레스테롤 및 DSPC, DOPC, DPPC, HSPC, 및 SM으로 구성된 군에서 선택된 제2 인지질을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량을 기준으로 0.5-2.0 mol%의 PEG-DMG 또는 PEG-DSG를 추가로 포함한다.
본 발명의 양상은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: 핵산, KC3-C17 (C8:1)에서 선택된 이온화 가능한 양이온 지질, 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린) PS 지질.
일부 실시형태에서, N/P 비율은 4 내지 7이다. 일부 실시형태에서, N/P 비율은 5 내지 6이다. 일부 실시형태에서, N/P 비율은 3이다. 일부 실시형태에서, N/P 비율은 7이다.
일부 실시형태에서, 핵산은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 인코딩하는 mRNA이다.
본 발명의 양상들은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물에 관한 것이다: N/P 비율이 4 내지 7인 mRNA 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-PA 이온화 가능한 양이온 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG.
본 발명의 양상들은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물에 관한 것이다: N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-C17(C8:1) 이온화 가능한 양이온 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG.
본 발명의 양상들은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물에 관한 것이다: N/P 비율이 4 내지 7인 mRNA 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-C15(C8:1) 이온화 가능한 양이온 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG.
본 발명의 양상들은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물에 관한 것이다: N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-C18 이온화 가능한 양이온 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG.
일부 실시형태에서, 핵산은 서열 번호 2의 mRNA이다.
본 발명의 양상들은 LNP를 수지상 세포로 표적화하기 위해 상기 LNP에서 (L-세린) PS 지질을 본 명세서에서 설명된 이온화 가능한 양이온 지질과 조합하여 사용하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, LNP는 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 콜레스테롤을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP의 (L-세린) PS 지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5~10 mol%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 DSPC를 포함하는 하나 이상의 추가 인지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 접합 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-PA 또는 KC3-C17 (C8:1) 이온화 가능한 양이온 지질(ICL); LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 접합 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, ICL은 KC3-PA이다. 일부 실시형태에서, ICL은 KC3-C17 (C8:1)이다.
본 발명의 일부 양상은 다음의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이며:
,
여기서 R1은
이고,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 메틸이며;
n은 2 또는 3과 동일한 정수이다.
일부 실시형태에서, a는 0이다. 일부 실시형태에서, b는 1이다. 일부 실시형태에서, b는 3이다.
일부 실시형태에서, a은 1이다. 일부 실시형태에서, b는 1이다. 일부 실시형태에서, b는 3이다.
일부 실시형태에서, n은 2이다. 일부 실시형태에서, n은 3이다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 다음으로 구성된 군에서 선택된 음이온성 지질을 포함한다: 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티드산(PA), N-글루타릴-포스파티딜에탄올아민(N-Glu-PE), N-석시닐-포스파티딜에탄올아민(N-Suc-PE) 및 카디오리핀. 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디팔미토이포스파티딜글리세롤(DPPG), N-석시닐-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(N-Suc-DSPE), N-글루타릴-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(N-glu-DSPE), 디스테아로일포스파티드산(DSPA) 및 카디오리핀.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 포스파티딜-L-세린 이외의 음이온성 표적화 인지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 DSPG 및 DPPG로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 N-Glu-DSPE 및 N-Suc-DSPE로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 DSPA 음이온성 인지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 카디오리핀 음이온성 인지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 다음 화학 구조를 가진다:
.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 다음 화학 구조를 가진다:
.
본 발명의 양상들은 화학식 (V-A-1)의 음이온성 인지질 조성물의 나트륨 또는 암모니아 염에 관한 것으로, 이는 다음 화학 구조를 가지며:
화학식 (V-A-1),
여기서 X+는 암모늄 양이온 또는 나트륨(Na+) 양이온이고; a는 14, 15 또는 16이다.
일부 실시형태에서, a는 14 또는 16이다. 일부 실시형태에서, X+는 암모늄 양이온(NH4 +)이다.
일부 실시형태에서, X+는 나트륨 양이온(Na+)이다.
일부 실시형태에서, X는 암모늄(NH4+), 알킬암모늄, 디알킬암모늄 및 트리알킬암모늄 염으로 구성된 군에서 선택된 암모늄 양이온이다. 일부 실시형태에서, X는 다음으로 구성된 군에서 선택된 암모늄 양이온이다: 암모늄, 디메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 2-(디메틸아미노)에탄올, 디에탄올아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸-글루카민, 이미다졸, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 4-(2-하이드록시에틸)-모르폴린, 피페라진, 1-(2-하이드록시에틸)-피롤리딘, 트리에탄올아민 및 트로메타민(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄).
일부 실시형태에서, 화학식 (V-A-1)의 음이온성 인지질은 디스테아로일포스파티딜-L-세린(DSPS L-이성질체)의 나트륨 염이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (V-A-1)의 음이온성 인지질은 디스테아로일포스파티딜-L-세린(DSPS L-이성질체)의 암모늄 염이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (V-A-1)의 음이온성 인지질은 DPPS(L-이성질체)의 나트륨 염이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (V-A-1)의 음이온성 인지질은 DPPS(L-이성질체)의 암모늄 염이다. 일부 실시형태는 리포좀 나노입자(LNP) 조성물을 제조하는 데 있어서 염 형태 조성물의 사용에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물을 제조하는 동안 다음 LNP 성분 중 하나 이상과 조합하여 사용된다: mRNA 핵산; 이온화 가능한 양이온 지질(ICL); 콜레스테롤; (L-세린) PS 지질; 하나 이상의 인지질; 및 접합 지질. 일부 실시형태에서, 상기 사용은 LNP 조성물을 제조하는 동안 화학식 (VA-1)의 화합물의 암모늄 또는 염 형태를 다음 LNP 성분 중 하나 이상과 조합하는 단계를 포함한다: mRNA 핵산; 이온화 가능한 양이온 지질(ICL); 콜레스테롤; (L-세린) PS 지질; 하나 이상의 인지질; 및 접합 지질.
일부 실시형태에서, LNP는 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자 백신 조성물이다: N/P 비율이 4 내지 7인 mRNA 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG.
일부 실시형태에서, 핵산은 서열 번호 2의 mRNA이다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 46-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 PS를 조성물의 총 지질의 약 5 mol% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 접합 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 약 1.5 mol% 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 접합 지질은 PEG-DMG이고; PS 지질은 DSPS(L-이성질체) 및 DPPS로 구성된 군에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(C8:1) 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-PA이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-OA이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 KC3-C17(C8:1)이다.
일부 실시형태는 LNP를 수지상 세포로 표적화하기 위해 상기 LNP에서 (L-세린) PS 지질을 본 명세서에서 설명된 이온화 가능한 양이온 지질과 조합하여 사용하는 것에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, LNP는 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 콜레스테롤을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP의 (L-세린) PS 지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5~10 mol%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 DSPC를 포함하는 하나 이상의 추가 인지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 접합 지질을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-PA 또는 KC3-C17 (C8:1) 이온화 가능한 양이온 지질(ICL); LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 접합 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, ICL은 KC3-PA이다. 일부 실시형태에서, ICL은 KC3-C17 (C8:1)이다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 DSPG 및 DPPG로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-7.5% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 DSPG 음이온성 인지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-7.5% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 DPPG 음이온성 인지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-7.5% 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 DSPC를 포함하는 하나 이상의 추가 인지질을 추가로 포함한다.
본 발명의 양상들은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물에 관한 것이다: 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 23.5 - 43.5 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 또는 HSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 mol%-2.5mol% 총량의 PEG 함유 접합 지질.
일부 실시형태들에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시형태에서, N/P 비율은 3 내지 8이다.
일부 실시형태에서, KC3 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1) 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, KC3 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA이다. 일부 실시형태에서, KC3 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-PA이다. 일부 실시형태에서, KC3 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-C17(C8:1)이다. 일부 실시형태에서, KC3 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-C15(C8:1)이다.
일부 실시형태에서, 접합 지질은 PEG-DMG 또는 PEG-DSG이다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 PEG 함유 접합 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.0 mol% 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 KC3 이온화 가능한 양이온 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 48 mol% 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 DSPC 및 DSPS를 LNP 조성물의 총 지질 함량의 10 mol% 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 5 % DSPC 또는 HSPC를 LNP 조성물의 총 지질 함량의 5 mol% 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 PEG-DMG를 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.5 mol% 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40.5 mol% 콜레스테롤 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 DSPC 인지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 10 mol% 총량으로 포함한다.
일부 실시형태에서, PEG 함유 접합 지질은 PEG2000-DMG이다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 23.5 mol% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 33.5 mol% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 38.5 mol% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40.5 mol% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 42.7 mol% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 43.5 mol% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 33.5-43.5 mol% 총량으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 KC3 이온화 가능한 양이온 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 45-55 mol% 총량으로 포함한다.
본 발명의 양상들은 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다: mRNA 핵산; LNP 조성물의 총 지질 함량의 45-55 mol%의 총량의, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택된 KC3 이온화 가능한 양이온 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 33.5-43.5 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5 mol% 총량의 (L-세린) DPPS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5 mol% 총량의 DSPC 또는 HSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.5 mol% 총량의 PEG-DMG 접합 지질.
본 발명의 양상들은 KC3 이온화 가능한 양이온 지질, (L-세린) PS 지질, 콜레스테롤, 하나 이상의 음이온성 인지질을 포함하는 하나 이상의 인지질 및 접합 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이며, 여기서 LNP는 음이온성 인지질의 나트륨 또는 암모늄 염을 용해하는 단계를 포함하는 공정에 의해 얻어진다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 핵산을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 mRNA이다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 백신이다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물 중 인지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25 mol%이고, 포스파티딜세린(PS)의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol%이고; 조성물 중 접합 지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량이다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 48 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질, 40.5 mol%의 콜레스테롤, 5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질을 포함하고, 여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 48 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질, 38.5 mol%의 콜레스테롤, 5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질을 포함하고, 여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 46-54 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질, 및 5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질을 포함하고, 여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 45 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질, 42.7 mol%의 콜레스테롤, 5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질을 포함하고, 여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 50 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질, 38.5 mol%의 콜레스테롤, 5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질, 및 총 10 mol% 농도의 인지질을 포함하고; 여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 48 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질, 40.5 mol%의 콜레스테롤, 5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질, 및 총 10 mol% 농도의 인지질을 포함하고; 여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 48 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질, 40.5 mol%의 콜레스테롤, 5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질, 5 mol% DSPC 또는 DPPC; 및 총 10 mol% 농도의 인지질을 포함하고; 여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 46.5 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질, 42 mol%의 콜레스테롤, 5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질을 포함하고, 여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 5 mol%의 DSPC 또는 HSPC를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.5 mol%의 PEG-DMG를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 DSPC/DPPC 인지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 10 mol% 총량으로 포함한다.
본 발명의 양상들은 DSPS 나트륨, DPPS 나트륨, DSPS 암모늄 및 DPPS 암모늄으로 구성된 군에서 선택된 포스파티딜세린 염에 관한 것이다.
본 발명의 양상들은, (L-세린) PS 지질, 스테롤, 접합 지질, 인지질을 포함하는, LNP를 수지상 세포에 표적화하기 위한 LNP를 제조하는 데 있어서 DSPS-Na 염 또는 DPPS-NH4 + 염의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 양상들은 에탄올과, DSPS 또는 DPPS를 포함하는 용액에 관한 것으로, 이 용액은 포스파티딜세린 염을 에탄올에 용해하는 단계를 포함하는 공정을 통해 얻어지며, 여기서 포스파티딜세린 염은 DSPS 나트륨, DPPS 나트륨, DSPS 암모늄 및 DPPS 암모늄으로 구성된 군에서 선택된다.
실시형태:
아래에는 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되는 비제한적인 실시형태가 설명되어 있다.
실시형태 1: 다음의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물:
,
여기서 R1은
이고,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알킬이며;
n은 2, 3 또는 4와 동일한 정수임.
실시형태 2: 실시형태 1에 있어서, n은 2 또는 3인, 조성물.
실시형태 3: 실시형태 1-2 중 어느 하나에 있어서, a는 0인, 조성물.
실시형태 4: 실시형태 1-3 중 어느 하나에 있어서, b는 1, 2 또는 3인, 조성물.
실시형태 5: 실시형태 1-2 중 어느 하나에 있어서, a는 1인, 조성물.
실시형태 6: 실시형태 1-3 중 어느 하나에 있어서, b는 1, 2 또는 3인, 조성물.
실시형태 7: 실시형태 1-6 중 어느 하나에 있어서, R2 및 R3가 각각 메틸인, 조성물.
실시형태 8: 실시형태 1에 있어서, R1은
이고,
a는 0 또는 1이고 b는 1 또는 3이고;
R2 및 R3은 각각 메틸이며;
n은 2 또는 3인, 조성물.
실시형태 9: 실시형태 1-8 중 어느 하나에 있어서, n은 3인, 조성물.
실시형태 10: 실시형태 1-9 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하고:
a. 핵산;
b. 실시형태 1-9 중 어느 하나의 이온화 가능한 지질;
c. 스테롤;
d. 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질; 그리고
e. 선택적으로 접합 지질을 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 11: 실시형태 10에 있어서, 핵산은 mRNA인, 조성물.
실시형태 12: 실시형태 11에 있어서, 스테롤은 콜레스테롤인, 조성물.
실시형태 13: 실시형태 12에 있어서, 하나 이상의 인지질은 다음으로 구성되는, 조성물:
a. SM, DSPC, HSPC, DPPC 및 DOPC로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인지질; 및
b. DPPS 및 DSPS로 구성된 군에서 선택된 PS 지질.
실시형태 14: 실시형태 13에 있어서, 하나 이상의 인지질은 다음으로 구성되는, 조성물:
a. DSPC; 및
b. (L-세린)DPPS 및 (L-세린)DPS로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 PS 지질.
실시형태 15: 실시형태 13에 있어서, 상기 조성물은 PS 지질을 조성물의 총 지질의 2.5-10 mol% 총량으로 포함하는, 조성물,
실시형태 16: 실시형태 10-15 중 어느 하나에 있어서, 접합 지질은 PEG를 포함하는, 조성물.
실시형태 17: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물:
a. 핵산;
b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질;
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45mol% 총량의 스테롤; 및
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 포스파티딜세린(PS)을 포함하는 하나 이상의 인지질; 및
e. 선택적으로 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량의 접합 지질을 추가로 포함함.
실시형태 18: 실시형태 17에 있어서, 핵산은 mRNA인, 조성물.
실시형태 19: 실시형태 18에 있어서, 스테롤은 콜레스테롤인, 조성물.
실시형태 20: 실시형태 19에 있어서, 하나 이상의 인지질은 DSPC 및 L-세린 PS로 구성되는, 조성물.
실시형태 21: 실시형태 20에 있어서, 상기 조성물은 PS 지질을 조성물의 총 지질의 2.5-7.5 mol% 총량으로 포함하는, 조성물,
실시형태 22: 실시형태 17-21 중 어느 하나에 있어서, 접합 지질은 PEG를 포함하는, 조성물.
실시형태 23: 실시형태 22에 있어서, 접합 지질은 PEG-DMG인, 조성물.
실시형태 24: 실시형태 23에 있어서, LNP는 접합 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.0 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 25: 실시형태 24에 있어서, LNP는 접합 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2 mol% 미만의 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 26: 실시형태 17에 있어서,
a. 핵산은 mRNA이고,
b. 이온화 가능한 양이온 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 45-55mol% 총량이고;
c. 스테롤은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 35-45mol% 총량의 콜레스테롤이고;
d. 인지질 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 7-15mol%이고;
e. 하나 이상의 인지질은 DSPC와, DPPS 및 DSPS의 L-세린 구조로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 지질인 PS 지질로 구성되고;
f. PS 지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 약 5 mol%인, 조성물.
실시형태 27: 실시형태 26에 있어서, 조성물은 PS 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.25 mol%, 2.5 mol%, 5 mol%, 7.5 mol% 및 10 mol%에서 선택된 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 28: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물:
a. 핵산(여기서 핵산은 mRNA임);
b. 이온화 가능한 양이온 지질(LNP 조성물의 총 지질 함량의 45-55 mol% 총량);
c. 스테롤(여기서 스테롤은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 35-45mol% 총량의 콜레스테롤임);
d. 하나 이상의 인지질(여기서 하나 이상의 인지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 10 mol% 총량의 인지질 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 3-9 mol% 총량의 포스파티딜세린(PS)을 포함함); 및
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.0 mol% 총량의 접합 지질.
실시형태 29: 실시형태 17-28 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 인지질은 DSPS(L-이성질체), DPPS(L-이성질체), DMPS(L-이성질체), DOPS(L-이성질체), 및 DSPS(D-이성질체)로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
실시형태 30: 실시형태 29에 있어서,
a. 접합 지질은 PEG-DMG이고; 그리고
b. PS 지질은 DSPS(L-이성질체) 및 DPPS로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
실시형태 31: 실시형태 17-28 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1) 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물인, 조성물.
실시형태 32: 실시형태 17-28 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-PA인, 조성물.
실시형태 33: 실시형태 17-28 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA인, 조성물.
실시형태 34: 실시형태 17-28 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-C17(C8:1)인, 조성물.
실시형태 35: 실시형태 17에 있어서, 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물:
a. 핵산;
b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 50mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질;
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 38.5mol% 총량의 콜레스테롤;
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 7-15mol% 총량의 인지질 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 3-9 mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질; 및
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.0mol% 총량의 PEG 함유 지질.
실시형태 36: 실시형태 34에 있어서, 인지질은 DSPC, DOPC, DPPC, HSPC 및 SM으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인지질로 구성되는, 조성물.
실시형태 37: 실시형태 36에 있어서, PS 지질은 DPPS 및 DSPS로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 L-세린 지질인, 조성물.
실시형태 38: 실시형태 17-28 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 인지질은 일치하지 않는 아실 사슬 길이를 갖는 적어도 두 개의 (L-세린) PS 지질을 포함하는, 조성물.
실시형태 39: 실시형태 38에 있어서, 인지질은 DSPC 및 DPPS인, 조성물.
실시형태 40: 실시형태 39에 있어서, DSPC와 DPPS는 각각 LNP 조성물의 총 지질 함량을 기준으로 각각 5 mol%의 총량으로 LNP에 존재하는, 조성물.
실시형태 41: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물: 핵산, LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질 KC3-PA 또는 KC3-OA, 및 (L-세린) PS 지질.
실시형태 42: 실시형태 41에 있어서, 핵산은 mRNA이고, PS 지질은 (L-세린)DPS, (L-세린)DPPS, 또는 이들의 혼합물이고, LNP 조성물은 콜레스테롤 및 DSPC, DPPC, HSPC, 및 SM으로 구성된 군에서 선택된 제2 인지질을 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 43: 실시형태 42에 있어서, LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량을 기준으로 0.5-2.0 mol%의 PEG-DMG 또는 PEG-DSG를 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 44: 실시형태 41-43 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-PA인, 조성물.
실시형태 45: 실시형태 41-43 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA인, 조성물.
실시형태 46: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물: 핵산, LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 KC3-C17 (C8:1) 이온화 가능한 양이온 지질, 및 (L-세린) PS 지질.
실시형태 47: 실시형태 41-46 중 어느 하나에 있어서, LNP 조성물은 N/P 비율이 4 내지 7인 조성물.
실시형태 48: 실시형태 47에 있어서, LNP 조성물은 N/P 비율이 5 내지 6인, 조성물.
실시형태 49: 실시형태 48에 있어서, LNP 조성물은 N/P 비율이 5.3인, 조성물.
실시형태 50: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물: 핵산, LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질 KC3-PA, 및 (L-세린) PS 지질.
실시형태 51: 실시형태 50에 있어서, 핵산은 mRNA이고, PS 지질은 (L-세린)DPS, (L-세린)DPPS, 또는 이들의 혼합물이고, LNP 조성물은 콜레스테롤 및DSPC, DOPC, DPPC, HSPC 및 SM으로 구성된 군에서 선택된 제2 인지질을 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 52: 실시형태 51에 있어서, LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량을 기준으로 0.5-2.0 mol%의 PEG-DMG 또는 PEG-DSG를 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 53: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물: 핵산, KC3-C17 (C8:1)에서 선택된 이온화 가능한 양이온 지질, 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린) PS 지질.
실시형태 54: 실시형태 17-21, 26-28, 35-44, 또는 53 중 어느 하나에 있어서, N/P 비율은 4 내지 7인, 조성물.
실시형태 55: 실시형태 54에 있어서, N/P 비율은 5 내지 6인, 조성물.
실시형태 56: 실시형태 55에 있어서, N/P 비율은 3인, 조성물.
실시형태 57: 실시형태 55에 있어서, N/P 비율은 7인, 조성물.
실시형태 58: 실시형태 17-21, 26-28, 35-47, 또는 53 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 인코딩하는 mRNA인, 조성물.
실시형태 59: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물:
a. N/P 비율이 4 내지 7인 mRNA 핵산;
b. KC3-PA 이온화 가능한 양이온 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량이고;
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG을 포함하는, 조성물.
실시형태 60: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물:
a. N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산;
b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-C17 (C8:1) 이온화 가능한 양이온 지질;
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG을 포함하는, 조성물.
실시형태 61: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물:
a. N/P 비율이 4 내지 7인 mRNA 핵산;
b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-C15 (C8:1) 이온화 가능한 양이온 지질;
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG을 포함하는, 조성물.
실시형태 62: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물:
a. N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산;
b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량의 KC3-C18 이온화 가능한 양이온 지질;
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG을 포함하는, 조성물.
실시형태 63: 실시형태 59-62 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호 2의 mRNA인, 조성물
실시형태 64: LNP를 수지상 세포로 표적화하기 위한, 상기 LNP에서 실시형태 1-9 중 어느 하나의 이온화 가능한 양이온 지질과 조합되는 (L-세린) PS 지질의 용도.
실시형태 65: 실시형태 64에 있어서, LNP가 mRNA를 포함하는, 용도.
실시형태 66: 실시형태 64-65 중 어느 하나에 있어서, LNP는 콜레스테롤을 추가로 포함하는, 용도.
실시형태 67: 실시형태 66에 있어서, LNP의 (L-세린) PS 지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol%인, 용도.
실시형태 68: 실시형태 67에 있어서, LNP는 DSPC를 포함하는 하나 이상의 추가 인지질을 추가로 포함하는, 용도.
실시형태 69: 실시형태 68에 있어서, LNP는 접합 지질을 추가로 포함하는, 용도.
실시형태 70: 실시형태 64에 있어서, LNP는 다음을 포함하는 용도:
a. N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산;
b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-PA 또는 KC3-C17 (C8:1) 이온화 가능한 양이온 지질(ICL);
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 접합 지질.
실시형태 71: 실시형태 70에 있어서, ICL은 KC3-PA인, 용도.
실시형태 72: 실시형태 70에 있어서, ICL은 KC3-C17 (C8:1)인, 용도.
실시형태 73: 다음의 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물:
,
여기서 R1은
이고,
여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 메틸이며;
n은 2 또는 3과 동일한 정수임.
실시형태 74: 실시형태 73에 있어서, a는 0인, 조성물.
실시형태 75: 실시형태 74에 있어서, b는 1인, 조성물.
실시형태 76: 실시형태 74에 있어서, b는 3인, 조성물.
실시형태 77: 실시형태 73에 있어서, a는 1인, 조성물.
실시형태 78: 실시형태 77에 있어서, b는 1인, 조성물.
실시형태 79: 실시형태 77에 있어서, b는 3인, 조성물.
실시형태 80: 실시형태 73-79 중 어느 하나에 있어서, n은 2인, 조성물.
실시형태 81: 실시형태 73-79 중 어느 하나에 있어서, n은 3인, 조성물.
실시형태 82: 실시형태 17-28 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티드산(PA), N-글루타릴-포스파티딜에탄올아민(N-Glu-PE), N-석시닐-포스파티딜에탄올아민(N-Suc-PE) 및 카디오리핀으로 구성된 군에서 선택된 음이온성 지질을 포함하는, 조성물. 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디팔미토이포스파티딜글리세롤(DPPG), N-석시닐-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(N-Suc-DSPE), N-글루타릴-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(N-glu-DSPE), 디스테아로일포스파티드산(DSPA) 및 카디오리핀.
실시형태 83: 실시형태 17-28 또는 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 포스파티딜-L-세린 이외의 음이온성 표적화 인지질을 포함하는, 조성물.
실시형태 84: 실시형태 17-28 또는 82-83 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 DSPG 및 DPPG로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질을 포함하는, 조성물.
실시형태 85: 실시형태 17-28 또는 82-83 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 N-Glu-DSPE 및 N-Suc-DSPE로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질을 포함하는, 조성물.
실시형태 86: 실시형태 17-28 또는 82-83 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 DSPA 음이온성 인지질을 포함하는, 조성물.
실시형태 87: 실시형태 17-28 또는 82-83 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 카디오리핀 음이온성 인지질을 포함하는, 조성물.
실시형태 88: 실시형태 1-63 또는 73-87 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 지질은 다음의 화학 구조를 가지는, 조성물:
.
실시형태 89: 실시형태 64-72 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 지질은 다음의 화학 구조를 가지는, 조성물:
.
실시형태 90: 화학식 (V-A-1)의 음이온성 인지질 조성물의 나트륨 또는 암모니아 염으로서, 이는 다음 화학 구조를 가지며:
화학식 (V-A-1),
여기서
X+는 암모늄 양이온 또는 나트륨(Na+) 양이온이고;
a는 14, 15 또는 16인, 음이온성 인지질 조성물의 나트륨 또는 암모니아 염.
실시형태 91: 실시형태 90에 있어서, a는 14 또는 16인, 조성물.
실시형태 92: 실시형태 90 또는 91에 있어서, X+는 암모늄 양이온(NH4 +)인, 조성물.
실시형태 93: 실시형태 90 또는 91에 있어서, X+는 나트륨 양이온(Na+)인, 조성물.
실시형태 94: 실시형태 90-93 중 어느 하나에 있어서, 화학식 (V-A-1)의 음이온성 인지질은 디스테아로일포스파티딜-L-세린(DSPS L-이성질체)의 나트륨 염인, 조성물.
실시형태 95: 실시형태 90-93 중 어느 하나에 있어서, 화학식 (V-A-1)의 음이온성 인지질은 디스테아로일포스파티딜-L-세린(DSPS L-이성질체)의 암모늄 염인, 조성물.
실시형태 96: 실시형태 90-93 중 어느 하나에 있어서, 화학식 (V-A-1)의 음이온성 인지질은 DPPS(L-이성질체)의 나트륨 염인, 조성물.
실시형태 97: 실시형태 90-93 중 어느 하나에 있어서, 화학식 (V-A-1)의 음이온성 인지질은 DPPS(L-이성질체)의 암모늄 염인, 조성물.
실시형태 98: 리포좀 나노입자(LNP) 조성물의 제조에 있어서 실시형태 90-97 중 어느 하나의 염 형태 조성물의 사용.
실시형태 99: 실시형태 98에 있어서, 상기 LNP 조성물을 제조하는 동안 다음 LNP 성분들 중 하나 이상과 조합되는, 사용:
mRNA 핵산;
이온화 가능한 양이온 지질(ICL);
콜레스테롤;
(L-세린) PS 지질;
하나 이상의 인지질; 및
접합 지질.
실시형태 100: 실시형태 98에 있어서, LNP 조성물을 제조하는 동안 화학식 (VA-1)의 화합물의 암모늄 또는 염 형태를 다음 LNP 성분 중 하나 이상과 조합하는 단계를 포함하는, 사용:
mRNA 핵산;
실시형태 1-9 또는 73-88 중 어느 하나의 이온화 가능한 양이온 지질(ICL);
콜레스테롤;
(L-세린) PS 지질;
하나 이상의 인지질; 및
접합 지질.
실시형태 101: 실시형태 98-100 중 어느 하나에 있어서, LNP는 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자 백신 조성물인, 사용:
a. N/P 비율이 4 내지 7인 mRNA 핵산;
b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의, 실시형태 1-9 또는 73-88 중 어느 하나의 이온화 가능한 양이온 지질;
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG.
실시형태 102: 실시형태 101에 있어서, 핵산은 서열 번호 2의 mRNA인, 사용.
실시형태 103: 실시형태 17-63 또는 73-89 중 어느 하나에 있어서, LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 46-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하는, 조성물.
실시형태 104: 실시형태 17-63, 73-89, 또는 103 중 어느 하나에 있어서, LNP 조성물은 PS를 조성물의 총 지질의 약 5 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 105: 실시형태 17-63, 73-89 또는 103-104 중 어느 하나에 있어서, LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 약 1.5mol% 총량의 접합 지질을 포함하는, 조성물.
실시형태 106: 실시형태 82-87 중 어느 하나에 있어서,
접합 지질은 PEG-DMG이고;
PS 지질은 DSPS(L-이성질체) 및 DPPS로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
실시형태 107: 실시형태 82-87 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(C8:1) 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물인, 조성물.
실시형태 108: 실시형태 82-87 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-PA인, 조성물.
실시형태 109: 실시형태 82-87 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA인, 조성물.
실시형태 110: 실시형태 82-87 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-C17(C8:1)인, 조성물.
실시형태 111: LNP를 수지상 세포로 표적화하기 위한, 상기 LNP에서 실시형태 73-87 중 어느 하나의 이온화 가능한 양이온 지질과 조합되는 (L-세린) PS 지질의 사용.
실시형태 112: 실시형태 111에 있어서, LNP가 mRNA를 포함하는, 사용.
실시형태 113: 실시형태 111-112 중 어느 하나에 있어서, LNP는 콜레스테롤을 추가로 포함하는, 사용.
실시형태 114: 실시형태 113에 있어서, LNP의 (L-세린) PS 지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol%인, 사용.
실시형태 115: 실시형태 114에 있어서, LNP는 DSPC를 포함하는 하나 이상의 추가 인지질을 추가로 포함하는, 사용.
실시형태 116: 실시형태 115에 있어서, LNP는 접합 지질을 추가로 포함하는, 사용.
실시형태 117: 실시형태 111에 있어서, LNP는 다음을 포함하는, 사용:
a. N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산;
b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-PA 또는 KC3-C17 (C8:1) 이온화 가능한 양이온 지질(ICL);
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 접합 지질.
실시형태 118: 실시형태 117에 있어서, ICL은 KC3-PA인, 사용.
실시형태 119: 실시형태 117에 있어서, ICL은 KC3-C17 (C8:1)인, 사용.
실시형태 120: 실시형태 90-97 중 어느 하나에 있어서, X는 암모늄(NH4+), 알킬암모늄, 디알킬암모늄 및 트리알킬암모늄 염으로 구성된 군에서 선택된 암모늄 양이온인, 조성물.
실시형태 121: 실시형태 120에 있어서, X는 다음으로 구성된 군에서 선택된 암모늄 양이온인, 조성물: 암모늄, 디메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 2-(디메틸아미노)에탄올, 디에탄올아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸-글루카민, 이미다졸, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 4-(2-하이드록시에틸)-모르폴린, 피페라진, 1-(2-하이드록시에틸)-피롤리딘, 트리에탄올아민 및 트로메타민(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄).
실시형태 122: 실시형태 17-28 또는 82-83 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 DSPG 및 DPPG로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-7.5% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 123: 실시형태 122에 있어서, 상기 조성물은 DSPG 음이온성 인지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-7.5% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 124: 실시형태 122에 있어서, 상기 조성물은 DPPG 음이온성 인지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-7.5% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 125: 실시형태 114에 있어서, LNP는 DSPC를 포함하는 하나 이상의 추가 인지질을 추가로 포함하는, 사용.
실시형태 126: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물:
a. 핵산;
b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질;
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 23.5 - 43.5mol% 총량의 콜레스테롤;
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 또는 HSPC 인지질; 및
f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 mol% 내지 2.5 mol% 총량의 PEG 함유 접합 지질.
실시형태 127: 실시형태 126에 있어서, 핵산은 mRNA인, 조성물.
실시형태 128: 실시형태 126-127 중 어느 하나에 있어서, N/P 비율은 3 내지 8인, 조성물.
실시형태 129: 실시형태 126-127 중 어느 하나에 있어서, KC3 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1) 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
실시형태 130: 실시형태 129에 있어서, KC3 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA인, 조성물.
실시형태 131: 실시형태 129에 있어서, KC3 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-PA인, 조성물.
실시형태 132: 실시형태 129에 있어서, KC3 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-C17(C8:1)인, 조성물.
실시형태 133: 실시형태 129에 있어서, KC3 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-C15(C8:1)인, 조성물.
실시형태 134: 실시형태 126-133 중 어느 하나에 있어서, 접합 지질은 PEG-DMG 또는 PEG-DSG인, 조성물.
실시형태 135: 실시형태 134에 있어서, 상기 조성물은 PEG 함유 접합 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.0 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 136: 실시형태 126-135 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 KC3 이온화 가능한 양이온 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 48 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 137: 실시형태 126-136 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 DSPC 및 DSPS를 LNP 조성물의 총 지질 함량의 10 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 138: 실시형태 126-137 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 5 % DSPC 또는 HSPC를 LNP 조성물의 총 지질 함량의 5 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 139: 실시형태 126-137 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 PEG-DMG를 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.5 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 140: 실시형태 126-137 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40.5 mol% 콜레스테롤 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 141: 실시형태 126-137 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 DSPC 인지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 10 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 142: 실시형태 126-141 중 어느 하나에 있어서, PEG 함유 접합 지질은 PEG2000-DMG인, 조성물.
실시형태 143: 실시형태 126-139 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 23.5 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 144: 실시형태 126-139 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 33.5 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 145: 실시형태 126-139 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 38.5 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 146: 실시형태 126-139 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40.5 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 147: 실시형태 126-139 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 42.7 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 148: 실시형태 126-139 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 43.5 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 149: 실시형태 126-139 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 콜레스테롤을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 33.5-43.5 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 150: 실시형태 126-149 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 KC3 이온화 가능한 양이온 지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 45-55 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 151: 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물:
a. mRNA 핵산;
b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 45-55mol% 총량의, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17 (8:1), 및 KC3-C15 (C8:1)로 구성된 군에서 선택된 KC3 이온화 가능한 양이온 지질;
c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 33.5-43.5mol% 총량의 콜레스테롤;
d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5mol% 총량의 (L-세린) DPPS 지질;
e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5mol% 총량의 DSPC 또는 HSPC 인지질; 및
f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.5mol% 총량의 PEG-DMG 접합 지질.
실시형태 152: KC3 이온화 가능한 양이온 지질, (L-세린) PS 지질, 콜레스테롤, 하나 이상의 음이온성 인지질을 포함하는 하나 이상의 인지질 및 접합 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물로서, 여기서 LNP는 음이온성 인지질의 나트륨 또는 암모늄 염을 용해하는 단계를 포함하는 공정에 의해 얻어지는, 조성물.
실시형태 153: 실시형태 152에 있어서, 음이온성 인지질은 청구항 90-97 중 어느 하나의 염인, 조성물.
실시형태 154: 실시형태 152-153 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 핵산을 포함하는, 조성물.
실시형태 155: 실시형태 154에 있어서, 핵산은 mRNA인, 조성물.
실시형태 156: 실시형태 155에 있어서, 조성물은 백신인, 조성물.
실시형태 157: 실시형태 152-156 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 중 인지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25 mol%이고, 포스파티딜세린(PS)의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol%이고; 조성물 중 접합 지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량인, 조성물.
실시형태 158: 실시형태 152-156 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하고:
48 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질,
40.5 mol%의 콜레스테롤, 및
5 mol% (L-세린) DPPS 지질,
여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭하는, 조성물.
실시형태 159: 실시형태 152-156 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하고:
48 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질,
38.5 mol%의 콜레스테롤, 및
5 mol% (L-세린) DPPS 지질,
여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭하는, 조성물.
실시형태 160: 실시형태 152-156 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하고:
46-54 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질, 및
5 mol% (L-세린) DPPS 지질,
여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭하는, 조성물.
실시형태 161: 실시형태 152-156 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하고:
45 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질,
42.7 mol%의 콜레스테롤, 및
5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질,
여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭하는, 조성물.
실시형태 162: 실시형태 152-156 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하고:
50 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질,
38.5 mol%의 콜레스테롤,
5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질, 및
총 10 mol% 농도의 인지질;
여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭하는, 조성물.
실시형태 163: 실시형태 152-156 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하고:
48 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질,
40.5 mol%의 콜레스테롤,
5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질, 및
총 10 mol% 농도의 인지질;
여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭하는, 조성물.
실시형태 164: 실시형태 152-156 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하고:
48 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질,
40.5 mol%의 콜레스테롤,
5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질,
5 mol% DSPC 또는 DPPC; 및
총 10 mol% 농도의 인지질;
여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭하는, 조성물.
실시형태 165: 실시형태 152-156 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하고:
46.5 mol%의 KC3 이온화 가능한 양이온 지질,
42 mol%의 콜레스테롤, 및
5 mol%의 (L-세린) DPPS 지질,
여기서 각 mol%는 LNP 조성물의 총 지질 함량의 mol%를 지칭하는, 조성물.
실시형태 166: 실시형태 158-165 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 5 mol%의 DSPC 또는 HSPC를 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 167: 실시형태 158-166 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.5 mol%의 PEG-DMG를 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 168: 실시형태 158-163 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 DSPC/DPPC 인지질을 LNP 조성물의 총 지질 함량의 10 mol% 총량으로 포함하는, 조성물.
실시형태 169: DSPS 나트륨, DPPS 나트륨, DSPS 암모늄 및 DPPS 암모늄으로 구성된 군에서 선택된 포스파티딜세린 염.
실시형태 170: (L-세린) PS 지질, 스테롤, 접합 지질, 인지질을 포함하는, LNP를 수지상 세포에 표적화하기 위한 LNP를 제조하는 데 있어서 DSPS-Na 염 또는 DPPS-NH4 + 염의 사용.
실시형태 171: 에탄올과, DSPS 또는 DPPS를 포함하는 용액에 관한 것으로, 이 용액은 포스파티딜세린 염을 에탄올에 용해하는 단계를 포함하는 공정을 통해 얻어지며, 여기서 포스파티딜세린 염은 DSPS 나트륨, DPPS 나트륨, DSPS 암모늄 및 DPPS 암모늄으로 구성된 군에서 선택된다.
실시예
본 발명을 특정 실시예와 관련하여 설명하였고 많은 세부사항이 설명을 위해 제시되었지만, 본 명세서는 추가적인 실시예를 포함하고 본 명세서에 기술된 세부사항 중 일부는 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 상당히 달라질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명는 이러한 추가적인 실시예, 변형 및 균등물을 포함한다. 특히, 본 발명은 다양한 예시적 구성요소 및 실시예의 특징, 용어 또는 요소들의 임의의 조합을 포함한다.
달리 명시적으로 나타내지 않는 한, 실시예에 사용된 포스파티딜세린 지질의 이성질체 형태는 포스파티딜-L-세린이다.
본 명세서에 개시된 실시형태들의 다양한 실시형태들을 설명하기 위해 특정한 실시예들이 아래에 제공된다. 당업자는 본 명세서에 개시된 다양한 실시예가 이들 특정한 예시적인 예에 제한되지 않는다는 것을 알고 있을 것이다.
실시예 1A: 이온화 가능한 지질의 합성
반응식 1 AKG-UO-1 내지 AKG-UO-3을 위한 산 중간체의 합성 도 47A-47B 참고.
중간체 (6Z,12Z)-6,12-옥타데카디엔산 및 (6Z,12Z)-6,12-헥사데카디엔산은 반응식 1에 도시된 바와 같은 일반 합성에 의해 제조되었으며, 이 합성은 i) 5-브로모 펜탄올로부터 제조된 트리페닐 포스포늄 일라이드 및 상응하는 알데히드의 초기 Witting 반응, ii) 메실화 및 치환에 의한 말단 알코올의 브롬화물로의 전환, iii) 일라이드 합성 및 Witting 반응의 순서 반복, 그리고 마지막으로 iv) 말단 알코올의 과요오드 산 산화를 포함한다. 생성된 산 중간체를 AKG-UO-1에서 AKG-UO-4로의 합성에 사용하였다(아래 참조).
반응식 2 AKG-UO-5의 산 중간체 합성
AKG-UO-5의 합성에 사용되는 산 중간체 (9Z,15Z)-9,15-옥타데카디엔산은 i) (5Z)-1-브로모-5-옥텐을 이용한 실릴 보호된 10-하이드록시-1-데신의 알킬화, ii) 알킨의 시스-알켄으로의 촉매적 수소화, iii) 알코올 상의 실릴 보호 제거, 및 마지막으로 iv) 말단 알코올의 원하는 산으로의 산화를 포함하는, 반응식 2에 도시된 일반 합성에 의해 제조되었다.
반응식 3 AKG-BDG-01 및 AKG-BDG-02를 위한 산 중간체의 합성
AKG-BDG-1 및 AKG-BDG-2의 합성에 사용되는 2개의 디설파이드산 중간체의 합성을 반응식 4에 도시한다.
AKG-BDG-1에 대한 산 중간체의 일반적인 합성은 i) 4-브로모 부티르산으로부터 4-머캅토 부티르산의 합성, ii) DPS와 4-머캅토 부티르산의 반응으로 4-(2-피리디닐디설파닐)부탄산을 생성, iii) 3-데신-1-올의 시스-알켄으로의 촉매적 수소화, iv) 1차 알코올의 토실화, v) 티오우레아를 사용한 토실 기 치환으로 말단 티올 생성, 및 마지막으로 vi) 말단 티올과 상기 단계 ii에서 제조된 4-(2-피리디닐디설파닐)부탄산을 커플링하여 디설파이드 함유 산 중간체 생성을 포함한다. 3-도데신-1-올에서 시작하는 유사한 합성 순서에 따라 AKG-BDG-2의 합성에 사용되는 제2의 산 중간체가 생성되었다.
반응식 4 AKG-UO-1, AKG-UO-4, AKG-UO-5, AKG-BDG-1 및 AKG-BDG-2의 합성
반응식 4에 나타낸 지질 AKG-UO-1, AKG-UO-4, AKG-UO-5, AKG-BDG-1 및 AKG-BDG-2의 일반적인 합성은 다음 단계를 포함한다: i) 시판되는 키랄 디옥솔란의 1차 알코올의 토실화, ii) 디메틸아민을 사용한 토실 기 치환으로 3차 아민을 생성, iii) 디올의 산 촉매 탈보호, 및 마지막으로 iv) 반응식 1-3에 따라 합성된 상응하는 산 중간체를 사용한 디올의 에스테르화. AKG-UO-2는 하기 반응식 5에 나타낸 바와 같이 상이한 디옥솔란 및 상응하는 산 중간체로부터 출발하여 유사한 합성 순서에 따라 제조된다.
반응식 5 AKG-UO-2의 합성
반응식 6에 나타낸 트리알킬 포스페이트 함유 지질 AKG-UO-3의 일반적인 합성은 하기 단계를 포함한다: i) 시판 키랄 디옥솔란의 1차 알코올과 메틸 디클로로포스파이트의 반응으로 상응하는 디알킬 클로로포스파이트 생성, ii) 디알킬 클로로포스파이트의 클로라이드를 3-브로모 프로판올로 처리하여 이의 염화물을 치환, iii) 디올의 산 촉매화된 탈보호, iv) 반응식 1에 따라 합성된 상응하는 산 중간체를 이용한 디올의 에스테르화, 및 마지막으로 v) 디메틸아민을 사용한 브로마이드 기의 치환으로 3차 아민을 생성.
반응식 6 AKG-UO-3의 합성
대안적으로, 탄화수소 사슬의 이중 결합 위치 사이에 2개의 메틸렌 기를 갖는 산 중간체가 Caballeira 외, Chem. Phys. Lipids, vol. 100, p. 33-40, 1999에 기재된 바와 같이, 또는 D’yakonov 외, (D’yakonov 외, Med. Chem. Res., 2016, vol. 25, p. 30-39; D’yakonov 외, Chem. Commun. 2013, vol. 49, p 8401-8403; D’yakonov 외, 2020, Phytochem. Rev.)에 기재된 바와 같이 합성된다.
실시예 1B: 이온화 가능한 지질의 합성 - 도 48 참고
1. 2-((S)-2,2-디((6Z,12Z)-옥타데카-6,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민 (AKG-KC2-01, O-12095)
2. 3-((S)-2,2-디((6Z,12Z)-옥타데카-6,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민 (AKG-KC3-01, O-12096)
3. 2-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민 (AKG-KC2-OA, O-11880)
4. 2-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민 (AKG-KC2-PA, O-11879)
5. 3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민 (AKG-KC3-OA, O-11957)
6. 3-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민 (AKG-KC3-PA, O-12418)
7. 3-((S)-2,2-디((Z)-헵타덱-8-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민 (AKG-KC3-C17(C8:1))
8. (S)-3-(2,2-디헵타데실-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민 (AKG-KC3-C17)
2-(( S )-2,2-디((6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민(AKG-KC2-01, O-12095)의 합성
3-(( S )-2,2-디((6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민 (AKG-KC3-01, O-12096)
도 48 참고.
실험 절차
(6Z,12Z)-1-브로모옥타데카-6,12-디엔, 2의 합성
0℃에서 디클로로메탄(50 mL) 중 (6Z,12Z)-옥타데카-6,12-디엔-1-올, 1(3.6 g, 13.7mmol)의 용액에 메탄 설포닐 클로라이드(1.26 mL, 16.4mmol) 및 트리에틸아민(3.6mL, 20.5mmol)를 첨가했다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 퀀칭하고 디클로로메탄(2X100mL)으로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 다음 마그네슘 설페이트로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 생성된 오일을 디에틸 에테르(50mL)에 용해시키고, 0℃에서 디에틸 에테르(50mL) 중 마그네슘 브로마이드 에틸 에테레이트(7g, 27.4mmol)의 교반 슬러리에 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 퀀칭하고 에틸 아세테이트(2X100 mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 다음 마그네슘 설페이트로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (6Z,12Z)-1-브로모옥타데카-6,12-디엔, 3(2.9 g, 8.89 mmol, 65%)을 황색 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.33 (m, 4H), 3.42-3.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.04-1.97 (m, 8H), 1.83-1.83 (m, 2H), 1.37-1.28 (m, 14H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
(6 Z ,12 Z ,25 Z ,31 Z )-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-올, 3 의 합성
에테르(10mL) 중 (6Z,12Z,)-1-브로모옥타데카-6,12-디엔, 2(2g, 6.08mmol)의 용액을 실온에서 아르곤하에 에테르(2mL) 중 요오드 및 마그네슘 조각(162mg, 6.69mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하고(마그네슘 조각 소모됨) 여기에 에틸 포르메이트(0.24mL, 3.04mmol)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 1N HCl 용액으로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2X100mL)로 추출하고 조합한 유기물을 물에 이어 염수로 세척하였다. 유기물을 마그네슘 술페이트 하에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 생성된 오일을 에탄올(10mL)에 용해시키고 물(3mL) 중의 포타슘 하이드록사이드(260mg) 용액에 첨가하였다. 12시간 동안 교반한 후, 혼합물의 pH를 2N HCl로 4로 조정하였다. 수용액을 디클로로메탄(2X)으로 추출하고 합하였다. 유기물을 염수로 세척한 후 마그네슘 술페이트 하에서 건조시키고 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 미정제 오일을 n-헥산 중 10-30% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 정제하여 (6Z,12Z,25Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-올, 3(0.29g, 0.55mmol, 18%)을 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 8H), 3.57 (bs, 1H), 3.33-3.32, (m, 2H), 2.13-1.97 (m, 16H), 1.36-1.29 (m, 34H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
(6 Z ,12 Z ,25 Z ,31 Z )-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-온, 4 의 합성
0℃에서 디클로로메탄 중 (6Z,12Z,25Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-올, 3(0.29g, 0.55mmol) 및 소듐 카보네이트(3mg, 0.03mmol)의 혼합물에 피리디늄 클로로크로메이트(236mg, 1.1mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하였다. 1시간 후, 실리카겔(1g)을 반응물에 첨가하고 혼합물을 여과하였다. 여과액을 농축시키고 생성된 오일을 n-헥산 중 10-20% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 정제하여 (6Z,12Z,25Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-온, 4(0.12g, 0.23mmol, 42%)를 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 8H), 3.36-3.32, (m, 1H), 2.40-2.35 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 2.14-2.00 (m, 16H), 1.58-1.54 (m, 4H), 1.34-1.29 (m, 28H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
2-(( S )-2,2-디((9 Z ,12 Z )-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 에탄-1-올, 7 의 합성
톨루엔(10mL) 중 (6Z,12Z,25Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-온, 4(0.12g, 0.23mmol), (4S)-(+)-4-(2-하이드록시에틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란 5(0.20g, 1.38mmol), 및 피리디늄 p-톨루엔 설포네이트(9mg))의 혼합물 질소 양압 하에 환류 가열하였다. 12시간 후, 혼합물을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 생성된 미정제 오일을 n-헥산 중 20-40% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-((S)-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 에탄-1-올, 7 (0.11 g, 0.17 mmol, 77%)을 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 8H), 4.25-4.20 (m, 1H), 4.10-4.06 (m, 1H), 3.82-3.77 (m, 1H), 3.54-3.49 (m, 1H), 2.23-2.19 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 2.14-2.00 (m, 16H), 1.84-1.78 (m, 2H), 1.62-1.51 (m, 6H), 1.34-1.29 (m, 28H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
3-(( S )-2,2-디((9 Z ,12 Z )-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올 , 8 의 합성
톨루엔(10mL) 중 (6Z,12Z,25Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-온, 4(0.50 g, 0.95 mmol), (S)-(3)-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)프로판올 6 (0.76 g, 4.75 mmol), 및 피리디늄 p-톨루엔 설포네이트(36mg))의 혼합물 질소 양압 하에 환류 가열하였다. 12시간 후, 혼합물을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 생성된 미정제 오일을 n-헥산 중 20-40% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 3-((S)-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올, 8 (0.48 g, 0.76 mmol, 80%)을 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.34-5.29 (m, 8H), 4.06-4.02 (m, 2H), 3.67-3.47 (m, 2H), 3.45-3.43 (m, 1H), 2.12-2.01 (m, 16H), 1.65-1.62 (m, 8H), 1.34-1.29 (m, 32H), 0.89-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
2-(( S )-2,2-디((9 Z ,12 Z )-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-01, O-12095)의 합성
0℃에서 디클로로메탄(10 mL) 중 2-((S)-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 에탄-1-올, 7(0.49 g, 0.79 mmol)의 용액에 메탄설포닐 클로라이드(73 mL, 0.95 mmol) 및 트리에틸아민(0.26 mL, 1.2 mmol)을 첨가하였다. 용액을 실온으로 가온하고 한 시간 더 교반하였다. 반응을 물로 퀀칭하고 디클로로메탄(2X100mL)으로 추출하였다. 유기물을 염수로 세척한 후 마그네슘 술페이트에서 건조시키고 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 2M 디메틸아민 용액(10mL)을 생성된 미정제 오일에 첨가하고 24시간 동안 교반하였다. 이후 혼합물을 물로 퀀칭하고 디클로로메탄(2X100mL)으로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 다음 마그네슘 설페이트로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-100% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-((S)-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-01, O-12095), (206 mg, 0.32 mmol, 41%)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.32 (m, 8H), 4.08-4.03 (m, 2H), 3.47 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.36-2.27 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 16H), 1.88-1.77 (m, 2H), 1.68-1.53 (m, 6H), 1.42-1.19 (m, 34H), 0.96-0.86 (t, J = 3.7 Hz, 6H).
MS(APCI) for C43H79NO2: 642.6
3-((S)-2,2-디((6Z, 12Z)-옥타데카-6-12-디엔-4-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, AKG-KC3-01, O-12096)의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일의 3-((S)-2,2-디((6Z, 12Z)-옥타데카-6-12-디엔-4-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-01, O-12096), (255 mg, 0.39 mmol, 51%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.32 (m, 8H), 4.06-4.02 (m, 2H), 3.48-3.44 (m, 1H), 2.35-2.30 (m, 2H), 2.25 (s, 6H), 2.01-1.98 (m, 16H), 1.70-1.51 (m, 12H), 1.35-1.25 (m, 32H), 0.90-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
MS(APCI) for C44H81NO2: 656.6
2-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민 (AKG-KC2-OA, O-11880)의 합성
2-(( S )-2,2-디(( Z )-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민 (AKG-KC2-PA, O-11879)
3-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민 (AKG-KC3-OA, O-11957)
3-(( S )-2,2-디(( Z )-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-PA, O-12418)
도 49 참고.
실험 절차(앞서 설명한 AKG-KC2-01의 합성 참조)
(Z)-1-브로모옥타덱-9-엔 3 의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일로서 (Z)-1-브로모옥타덱-9-엔(6.4g, 19.33mmol).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 2H), 3.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.01-1.99 (m, 4H), 1.87-1.82 (m, 2H), 1.44-1.26 (m, 22H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
( Z )-16-브로모헥사덱-7-엔 4
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 2H), 3.42 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.01-1.99 (m, 4H), 1.87-1.82 (m, 2H), 1.44-1.26 (m, 18H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
(9 Z ,28 Z )-헵타트리아콘타-9,28-디엔-19-올 5 의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
고체로서 (9Z,28Z)-헵타트리아콘타-9,28-디엔-19-올 (1.2 g, 2.25 mmol, 47%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 3.57 (bs, 1H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 53H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
(7 Z ,26 Z )-트리트리아콘타-7,26-디엔-17-올 6
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 3.57 (bs, 1H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 45H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
(9 Z ,28 Z )-헵타트리아콘타-9,28-디엔-19-온 7 의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일로서 (9Z,28Z)-헵타트리아콘타-9,28-디엔-19-온 (0.89 g, 1.67 mmol, 74%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 52H), 0.90-0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
(7 Z ,26 Z )-트리트리아콘타-7,26-디엔-17-온 8
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 44H), 0.90-0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
2-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 에탄-1-올 9 의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일로서 2-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 에탄-1-올 (0.39 g, 0.63 mmol, 74%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.28 (m, 4H), 4.22-4.10 (m, 1H), 4.08-4.05 (m, 1H), 3.82-3.79 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.24-2.21 (m, 1H), 2.01-1.99 (m, 8H), 1.81-1.80 (m, 2H), 1.59-1.54 (m, 6H), 1.34-1.26 (m, 45H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
2-(( S )-2,2-디(( Z )-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)에탄-1-올, 10 의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일로서 2-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)에탄-1-올 (1.02 g, 1.65 mmol, 51%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 4.23-4.10 (m, 1H), 4.07-4.05 (m, 1H), 3.82-3.79 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.24-2.12 (m, 1H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.84-1.78 (m, 2H), 1.57-1.55 (m, 8H), 1.34-1.29 (m, 35H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
3-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올, 11 의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일로서 3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 프로판-1-올 (0.41 g, 0.65 mmol, 76%)
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.32 (m, 4H), 4.06-4.03 (m, 2H), 3.71-3.67 (m, 2H), 3.47-3.46 (m, 1H), 2.01-1.99 (m, 10H), 1.66-1.59 (m, 4H), 1.56-1.54 (m, 6H), 1.34-1.26 (m, 44H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
3-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일로서 3-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올(0.9 g, 1.56 mmol, 80%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.28 (m, 4H), 4.06-4.01 (m, 2H), 3.71-3.67 (m, 2H), 3.47-3.46 (m, 1H), 2.01-1.99 (m, 10H), 1.66-1.59 (m, 4H), 1.56-1.54 (m, 6H), 1.34-1.26 (m, 37H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
2-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-OA, O-11880)의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일로서 2-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-OA, O-11880), (200 mg, 0.31 mmol, 49%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.38-5.28 (m, 4H), 4.08-4.01 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.39-2.24 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.82-1.77 (m, 2H), 1.68-1.52 (m, 6H), 1.34-1.26 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
C43H83NO2에 대한 MS(APCI): 646.7
2-(( S )-2,2-디(( Z )-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-PA, O-11879)의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일로서 2-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-PA, O-11879), (195 mg, 0.33 mmol, 18%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.28 (m, 4H), 4.08-4.02 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.38-2.27 (m, 2H), 2.20 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 8H), 1.97-1.80 (m, 2H), 1.77-1.52 (m, 6H), 1.34-1.29 (m, 38H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
C39H75NO2에 대한 MS(APCI): 590.6
3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-OA, O-11957)의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일로서 3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-OA, O-11957), (160 mg, 0.24 mmol, 37%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.28 (m, 4H), 4.06-4.01 (m, 2H), 3.44 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.26 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.20 (s, 6H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.82-1.77 (m, 2H), 1.60-1.43 (m, 8H), 1.34-1.26 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
C44H85NO2에 대한 MS(APCI): 660.6
3-(( S )-2,2-디(( Z )-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-PA, O-12418)의 합성
해당 절차는 앞서 설명하였다.
투명한 오일로서 3-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-PA, O-12418) (300 mg, 0.49 mmol, 32%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.28 (m, 4H), 4.06-4.01 (m, 2H), 3.47-3.42 (m, 1H), 2.43-2.41 (m, 2H), 2.31 (s, 6H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.70-1.52 (m, 6H), 1.27-1.18 (m, 42H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
C44H85NO2에 대한 MS(APCI): 604.6
3-(( S )-2,2-디(( Z )-헵타덱-8-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민 (AKG-KC3-C17(C8:1))의 합성
( S )-3-(2,2-디헵타데실-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민, AKG-KC3-C17의 합성
도 50 참고.
실험 절차
(9Z,26Z)-펜타트리아콘타-9,26-디엔-18-온, 2 의 합성
0℃에서 톨루엔(50mL) 중 올레오일 클로라이드(10g, 33.3mmol)의 교반 용액에 트리에틸아민(5.8mL, 33.3mmol)을 첨가했다. 무거운 침전물이 형성되었고, 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 2% 황산 용액으로 처리한 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기물을 염수로 세척한 후 마그네슘 설페이트에서 건조시키고 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 생성된 오일을 에탄올(20 mL)로 희석하고 [2N NaOH](30 mL)를 첨가했다. 혼합물을 100℃에서 12시간 동안 가열한 다음 냉각시켰다. 혼합물을 pH 4가 수득될 때까지 2N HCl 용액으로 희석했다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기물을 염수로 세척한 후 마그네슘 설페이트에서 건조시키고 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. n-헥산에 10-20% 에틸 아세테이트를 용출액으로 사용하여 실리카상에서 오일을 정제하여 (9Z,26Z)-펜타트리아콘타-9,26-디엔-18-온, 2(3.8g, 44%)가 황색 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 5.35-5.31 (m, 4H), 2.39-2.34 (m, 4H), 2.0-1.85 (m, 8H), 1.57-1.52 (m, 4H), 1.27-1.25 (m, 40H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
3-(( S )-2,2-디(( Z )-헵타덱-8-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올, 3의 합성
앞서 설명한 AKG-KC2-01의 합성 절차
투명한 오일로서 3-((S)-2,2-디((Z)-헵타덱-8-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 프로판-1-올, 3 (0.7 g, 1.15 mmol, 65%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 5.38-5.31 (m, 4H), 4.08-4.02 (m, 2H), 3.67-3.66 (m, 2H), 3.48-3.43 (m, 1H), 2.15-2.13 (m, 1H), 2.00-1.98 (m, 8H), 1.65-1.56 (m, 8H), 1.27-1.25 (m, 44H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
( S )-3-(2,2-디헵타데실-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올, 4 의 합성
메탄올/에틸 아세테이트(20 mL, 1:1/v:v)에 녹인 3-((S)-2,2-디((Z)-헵타덱-8-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 프로판-1-올(1.3 g, 2.15 mmol) 용액을 탄소 담지 10% 팔라듐(100 mg)을 이용하여 1 atm(수소 풍선)에서 2시간 동안 수소화시켰다. 혼합물에서 수소를 제거하고 질소를 유동시켰다. 혼합물을 셀라이트로 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축하여 (S)-3-(2,2-디헵타데실-1,3-디옥솔란-4-일) 프로판-1-올, 4 (1.3 g, 정량)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.10-4.01 (m, 2H), 3.71-3.64 (m, 1H), 3.47-3.43 (m, 2H), 2.05-2.01 (m, 1H), 1.63-1.51 (m, 8H), 1.42-1.22 (m, 58H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
3-(( S )-2,2-디(( Z )-헵타덱-8-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민, AKG-KC3-C17(C8:1)(O-12620)의 합성
앞서 설명한 AKG-KC2-01의 합성 절차
투명한 오일로서 3-((S)-2,2-디((Z)-헵타덱-8-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N, N-디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-C17 (C8:1), O-12620), (290 mg, 0.46 mmol, 40%)
C42H81 NO2에 대한 MS (APCI+): 632.6
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 5.38-5.28 (m, 4H), 4.09-3.99 (m, 2H), 3.48-3.41 (m, 1H), 2.77-2.71 (m, 1H), 2.55 (s, 6H), 2.01-1.95 (m, 8H), 1.88-1.78 (m, 2H), 1.62-1.50 (m, 6H), 1.27-1.24 (m, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
( S )-3-(2,2-디헵타데실-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민, AKG-KC3-C17 (O-12637)의 합성
앞서 설명한 AKG-KC2-01의 합성 절차
고체로서 (S)-3-(2,2-디헵타데실-1,3-디옥솔란-4-일)-N, N-디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-C17, O-12637), (275 mg, 0.43 mmol, 22%)
C42H85 NO2에 대한 MS (APCI+): 636.6
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.06-4.00 (m, 2H), 3.47-3.43 (m, 1H), 2.29-2.25 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 1.60-1.48 (m, 8H), 1.29-1.24 (m, 60H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
실시예 1C. 디라우로일-(S)-글리세롤-mPEG2000(PEG(2000)-DL)의 합성
실험 절차
mPEG2000 토실레이트 2의 합성
0℃에서 디클로로메탄(30mL)에 폴리(에틸렌 글리콜)메틸 에테르 1(7g, 3.5mmol)을 녹인 용액에 p-톨루엔설포닐 클로라이드(0.9g, 7mmol)와 트리에틸아민(1.8mL, 10.5mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기물을 염수로 세척한 다음, 마그네슘 설페이트로 건조한 후 여과했다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 디클로로메탄에 10% 메탄올을 용출액으로 사용하여 실리카 상의 오일을 정제하여 흰색 고체인 mPEG2000 토실레이트(5.2g, 70%)를 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.79-7.76 (d, 2H), 7.34-7.25 (d, 2H), 5.28 (s, 6H), 4.15-4.12 (, 2H), 3.87-3.81 (m, 1H), 3.71-3.43 (m, 188H). 3.47-3.36 (m, 5H).
(S)-(+)-1,2-이소프로필리덴 글리세롤 mPEG2000 4의 합성
소듐 하이드라이드(133mg, 3.33mmol)를 0℃에서 테트라하이드로푸란(20mL)에 녹인 (S)-(+)-1,2-이소프로필리덴 글리세롤(440mg, 3.33mmol) 용액에 첨가했다. 30분간 교반한 후, 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 토실레이트(5.2g, 2.41mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 70℃에서 18시간 동안 가열한 다음 냉각시켰다. 반응을 물로 퀀칭하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기물을 물로 세척한 다음 마그네슘 술페이트로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 디클로로메탄에 1% 메탄올을 용출액으로 사용하여 실리카 상에서 오일을 정제하여 (S)-(+)-1,2-이소프로필리덴 글리세롤 mPEG 2000(3.3 g, 56%)이 투명한 오일로 수득되었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.32 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 3.99 (dd, J = 8.2, 6.3 Hz, 1H), 3.85-3.74 (m, 1H), 3.68-3.51 (m, 190H), 3.39-3.36 (m, 5H), 1.35 (s, 3H), 1.28 (s, 3H).
(R)-3-(mPEG2000)-프로판-1,2-디올 5의 합성
(S)-(+)-1,2-이소프로필리덴 글리세롤 mPEG 2000(3.3 g, 1.56 mmol)과 THF(10 mL)에 녹인 [1N HCl] 15 mL의 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 1시간 후, 혼합물을 진공 하에 농축하여 (R)-3-(mPEG2000)-프로판-1,2-디올(3.4g, 정량)을 흰색 고체로 얻었다. 더 이상의 정제 과정 없이 진행되었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.1-4.12 (m, 1H), 3.68-3.51 (m, 180H), 3.39-3.36 (m, 4H).
디라우로일-(S)-글리세롤-mPEG2000의 합성
0℃에서 디클로로메탄(10 mL) 중 (R)-3-(mPEG2000)-프로판-1,2-디올(1.56 mmol)의 용액에 라우로일 클로라이드(0.75 g, 3.43 mmol), N, N-디이소프로필에틸아민(1.2 mL, 6.8 mmol), 4-디메틸아미노피리딘(0.42 g, 3.43 mmol)을 첨가했다. 생성된 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기물을 염수로 세척한 다음, 마그네슘 설페이트로 건조한 후 여과했다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 헥산에 5-100% 디에틸 에테르를 용출액으로 사용하여 실리카 상에서 오일을 정제하여 디라우로일-(S)-글리세롤-mPEG2000(0.66 g, 18%)이 흰색 고체로 생성된다.
MS (MALDI): CHCA 매트릭스: 2431.57
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 5.23-5.18 (m, 1H), 4.32 (dd, J = 11.8, 3.6 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 3.85-3.74 (m, 1H), 3.68-3.51 (m, 190H), 3.39-3.36 (m, 4H), 2.32-2.25 (m, 4H), 1.66-1.51 (m, 4H), 1.47-1.46 (m, 32H), 0.88-0.85 (m, 6H).
실시예 1D. mPEG2000-DLPE의 합성
4-니트로페닐-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68, 71,74,77,80,83,86,89,92,95,98,101,104,107,110,113,116,119,122,125,128,131-테트라테트라콘타옥사트리트리아콘타-헥탄-133-일) 카보네이트, 2
0℃에서 디클로로메탄(20 mL)에 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르(4 g, 2 mmol)를 녹인 용액에 4-니트로페닐 클로로포르메이트(603 mg, 3 mmol)와 피리딘(0.5 mL, 6 mmol)을 첨가했다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기물을 염수로 세척한 다음, 마그네슘 설페이트로 건조한 후 여과했다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 디클로로메탄 중 5-10% 메탄올을 용출액으로 사용하여 실리카 상에서 상기 오일을 정제하여 4-니트로페닐(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74, 77,80,83,86,89,92,95,98,101,104,107,110,113,116,119,122,125,128,131테트라테트라콘타옥사트리트리아콘타-헥탄-133-일) 카보네이트 (3.4 g, 82%)를 백색 고체로 수득하였다.
1H NMR(300MHz, CDCl3): δ ppm 8.28-8.25(d, 2H), 7.39-7.38(m, 2H), 4.43-4.41(m, 1H), 4.00-3.90(m, 2H), 4.00-3.80(m, 5H), 3.68-3.36(m, 188H), 2.03(s, 3H).
(2R)-3-((하이드록시((135-옥소-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59, 62,65,68,71,74,77,80,83,86,89,92,95,98,101,104,107,110,113,116,119,122,125,128,131,134-펜타테트라콘타옥사-136-타아자옥타트리아콘-헥탄-138-일)산소)포스포릴옥시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-디일 디도데카노에이트, mPEG2000-DLPE
디클로로메탄(30 mL) 중 4-니트로페닐(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59, 62,65,68,71,74,77,80,83,86,89,92,95,98,101,104,107,110,113,116,119,122,125,128,131-테트라테트라-콘타옥사트리트리아콘타헥탄-133-일) 카보네이트 2 (3.4 g, 1.65 mmol), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올 아민 (1 g, 1.72 mmol), 및 트리에틸아민(0.32 mL, 2.28 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 혼합물을 물로 퀀칭하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 조합된 유기물을 염수로 세척한 후 마그네슘 설페이트에서 건조시키고 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 디클로로메탄 중 1-5% 메탄올을 용출액으로 사용하여 실리카 상에서 상기 오일을 정제하여, (2R)-3-((하이드록시((135-옥소-2,5,8,11,14,17,20,23,26,
29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86,89,92,95,98,101,104,107,110,113,116,119,122,125,128,131,134-펜타테트라콘타옥사-136-타아자옥타트리아콘헥탄-138-일)옥시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-디일 디도데카노에이트 mPEG2000-DLPE (2 g, 46%)를 반 고체로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 5.17-5.15 (m, 1H), 4.35-4.31 (m, 1H), 4.16-4.10 (m, 3H), 4.00-3.80 (m, 5H), 3.65-3.37 (m, 188H), 3.34 (s, 3H), 3.05-3.01 (m, 1H), 2.26-2.23 (m, 6H), 1.54-1.52 (m, 4H), 1.32-1.17 (m, 33H), 0.86-0.82 (t, J = 1.3 Hz, 6H).
실시예 1E. 디스테아로일포스파티딜-D-세린(O-12153)의 합성 - 도 51 참고
벤질((벤질옥시)카르보닐)-D-세리네이트, 2
DMF(10mL)에 Z-(D)-세린-OH(2.4g, 10mmol)를 녹인 용액에 벤질 브로마이드(1.2mL, 10mmol)와 세슘 카보네이트(3.2g, 10mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기물을 염수로 세척한 다음, 마그네슘 설페이트로 건조한 후 여과했다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 헥산 중 20-40% 에틸 아세테이트를 용출액으로 사용하여 실리카 상에서 오일을 정제하여 벤질((벤질옥시)카르보닐)-D-세리네이트(2.5g, 76%)를 흰색 고체로 얻었다.
벤질 O-((벤질옥시)(디이소프로필아미노)포스파네일)-N-((벤질옥시)카르보닐)-D-세리네이트, 4
THF(20mL) 중 1-(벤질옥시)-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스판디아민, 3(2.8g, 8.4mmol), ((벤질옥시)카르보닐)-D-세리네이트 4(2.5g, 7.6mmol) 및 테트라졸(16.8mL, 8.4mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응을 진공하에 농축시키고 생성된 오일을 n-헥산 중 10% 에틸 아세테이트를 용출액으로 사용하여 실리카(0.1% Et3N/n-헥산 용액으로 전처리)에서 정제하여 벤질 O-((벤질옥시)(디이소프로필아미노)포스파닐)-N-((벤질옥시)카르보닐)-D-세리네이트 4(2.0 g, 47%)를 투명한 오일로 수득하였다.
MS (APCI+): 567.2 (M+1); 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.33-7.30 (m, 15H), 5.81-5.61 (dd, J = 11.8, 3.6 Hz, 1H), 5.12-5.09 (m, 3H), 4.61-4.58 (m, 2H), 4.13-4.11 (m, 2H), 3.58-3.55 (m, 2H), 1.16-1.12 (m, 12H).
(2R)-3-(((벤질옥시)((R)-3-(벤질옥시)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-3-옥소프로폭시) 포스포릴)옥시)프로판-1,2-디일 디스테아레이트, 6
THF(25mL) 중 1.2 디스테아로일-sn-글리세롤, 5(1.0 g, 1.6 mmol), 벤질 O-((벤질옥시)(디이소프로필아미노)포스파닐)-N-((벤질옥시)카르보닐)-D-세리네이트 4(0.94 g, 1.6 mmol) 및 테트라졸(4.3 mL, 1.9 mmol)의 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 6시간 후, THF(3mL)에 tert-부틸 하이드로퍼옥사이드 용액[물 중 70% 용액]을 첨가했다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 포화된 소듐 티오설페이트로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기물을 염수로 세척한 다음, 마그네슘 설페이트로 건조한 후 여과했다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 헥산 중 10-20% 에틸 아세테이트를 용출액으로 사용하여 실리카 상에서 오일을 정제하여 (2R)-3-(((벤질옥시)((R)-3-(벤질옥시)-2-(((벤질옥시)카르보닐) 아미노)-3-옥소프로폭시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-디일 디스테아레이트 6(1.4g, 80%)을 흰색 고체로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.33-7.25 (m, 15H), 5.91-5.79 (dd, J = 11.8, 3.6 Hz, 1H), 5.21-5.11 (m, 6H), 5.06-4.95 (m, 3H), 4.60-4.57 (m, 1H), 4.48-4.43 (m, 2H), 4.29-4.20 (m, 2H), 4.05-4.01 (m, 3H), 2.26-2.04 (m, 4H), 1.58-1.48 (m, 8H), 1.29-1.26 (m, 45H), 0.89-0.85 (t, J = 1.3 Hz, 6H).
O-(((R)-2,3-비스(스테아로일옥시)프로폭시)(하이드록시)포스포릴)-D-세린 비스 트리에틸아민 염,
메탄올, 아세트산, THF 혼합물(10:2 :4, v:v:v, 10mL)에 (2R)-3-(((벤질옥시)((R)-3-(벤질옥시)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-3-옥소프로폭시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-디일 디스테아레이트 6(800mg, 0.72mmol) 용액을 1기압, 실온에서 탄소 담지 10% 팔라듐(40mg)으로 수소화하였다. 3시간 후, 혼합물을 탈기시키고, 질소를 주입한 후, 셀라이트로 여과했다. 여과액에 트리에틸아민(0.5 mL)을 첨가한 후 진공 하에서 농축하여 오일을 얻었다. 이 오일을 메탄올(0.5% 트리에틸아민)을 용출액으로 사용하여 C18 컬럼에서 정제하여 O-(((R)-2,3-비스(스테아로일옥시)프로폭시)(하이드록시)포스포릴)-D-세린 비스 트리에틸아민 염(360mg, 50%)을 흰색 고체로 얻었다.
MS (APCI+): 567.2 (M+1); 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 5.30-5.20 (m, 1H), 4.38-4.17 (m, 4H), 3.94-3.84 (m, 4H), 3.12-3.07 (m, 4H), 2.32-2.02 (m, 14H), 1.58-1.57 (m, 4H), 1.24-0.89 (m, 66H), 0.87-0.85 (m, (dd, J = 0.6 Hz, 6H).
실시예 2. 인간 간세포 또는 암세포의 시험관내 세포독성 검정
LNP는 인간 간세포/간(HepG2; ATCC #HB8065) 세포에서 IC50을 결정하기 위해 일련의 10회 희석에 걸쳐 시험관 내에서 테스트될 수 있다. 이러한 제형은 일반적으로 무독성인 것으로 예상되므로, 모든 연구에 Lipofectamine™ 3000(ThermoFisher #L3000015)-복합체 mRNA(2μl 시약/1μg mRNA)의 양성 대조군이 포함된다. 사용된 mRNA는 CleanCap FLuc, EGFP 또는 MCherry 리포터 유전자 mRNA(5moU; Trilink #L-7202, #L-7201 또는 #L-7203)이다. 데이터는 전체 세포 생존율 곡선과 각 화합물에 대한 실제 IC50 값의 계산으로 보고된다.
부착 세포는 ~80% 컨플루언시까지 성장된다. 0.25% 트립신-EDTA(Gibco # 25200-072)를 첨가하여 세포를 트립신 처리한 다음, 세포를 스핀다운하고, 5ml의 성장 배지(MEM 배지; Corning # 10010 CM)를 첨가하여 세포를 분산시켰다. 세포 밀도는 혈구계산기를 사용하여 결정된다. 성장 배지(10% FBS를 포함하는 MEM 배지; Corning # 35015 CV)를 세포에 첨가하여 적절한 세포 농도로 조정한다. 그런 다음, 200 μl의 세포(5,000개 세포/웰)를 96-웰 투명 편평 바닥 플레이트(Costar #9804)에 첨가하고 37℃의 플레이트에서 5% CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
성장 배지를 용매로 사용하는 LNP 제형의 연속 희석물을 제조한다. 이들 화합물은 1 mg/ml mRNA 농도의 무균 수용액으로 제공된다. 희석을 위해, 각 LNP 스톡을 실온으로 가온시켰다. 이들은 250ug/ml의 최고 테스트 mRNA 농도로 성장 배지에서 4x로 추가로 희석되었다.
LNP는 각 LNP에 대한 초기 250 μg/ml 농도로부터, 기존 배지를 흡인하고 이를 LNP 함유 배지 200 μl로 대체함으로써 연속 1:3 희석하여 웰에 추가된다. 플레이트를 72시간 동안 5% CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션했다. LNP 인큐베이션 기간이 끝나면 각 웰의 배지를 1X PrestoBlue 세포 생존도 시약(ThermoFisher 카탈로그 # A13261) 100μl로 교체한다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 30분 내지 2시간 동안 인큐베이션한다. 30분, 60분, 120분에 판독값을 기록한다. SpectraMax M5 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 560nm 여기 및 590nm 방출로 형광을 판독한다. 모든 샘플 판독값에서 배양 배지(배경 대조 웰)만 포함하는 대조군의 RFU를 빼서 배경값을 수정한다. 아래 식을 사용하여 세포 독성 백분율을 계산하라:
세포독성 % = [(RFU.배지 - RFU 처리)/ RFU.배지] × 100%
IC50은 다음 식을 사용하여 GraphPad Prism을 사용하여 결정되었다:
Y=100/(1+10^((LogIC50-X)*힐슬로프)))
Lipofectamine™ 3000(ThermoFisher #L3000015)-복합체 mRNA(2μl 시약/1μg mRNA) 양성 대조군의 세포독성은 일부 실시예에서 본 명세서에 개시된 화합물보다 5-100배 더 독성일 수 있다. 이는 개시된 화합물이 시험관내 간세포독성 검정에서 시판되는 형질 전환 시약보다 독성이 적다는 것을 보여준다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 화합물은 시판되는 형질 전환 시약보다 생체내 독성이 더 적은 LNP를 형성한다.
실시예 3. 이온화 가능한 지질의 pKa 결정
이온화 가능한 양이온 지질의 pKa는 여러 가지 방법으로 계산할 수 있다. 지질의 경우 막 구조 그리고 막의 인접한 지질이 아미노 기의 해리 특성에 영향을 주어 잠재적으로 부정확한 값을 제공할 수 있기 때문에 계산이 때때로 어렵다. 이온화 가능한 지질의 겉보기 pKa가 지질이 의도한 환경 내에 있는 동안(이 경우 LNP의 일부로서) 측정되는 현장 측정이 이상적이다(Jayaraman 2012, Sabins 2018).
각각의 LNP 제형에 대해, 아미노 지질 pKa 값은 pH 3 내지 12로 적정하는 동안 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 측정하여 결정된다. TNS는 용액에서 형광을 발하지 않지만 양성 지질 막과 결합할 때 형광을 증가시키는 음이온 분자이며, 이 특성은 과거에 막 표면 전하를 조사하는 데 사용되어 왔다. 겉보기 pKa를 결정하기 위해 다양한 pH 값에서 완충액을 준비하는 데 사용되는 마스터 완충액 스톡(10mM 수산화칼륨, 10mM 붕산나트륨, 10mM 구연산나트륨, 150mM 염화나트륨)을 준비한다. 1M 수산화나트륨과 1M 염산을 사용하여 마스터 버퍼 스톡에서 약 20개의 고유 버퍼를 약 3~12 사이의 다양한 pH 값에서 준비한다. 300mM 6-(p-톨루이디노)-2-나프탈렌설폰산 나트륨 염(TNS) DMSO(디메틸 술폭사이드)에 용해된 시약)을 스톡으로 사용한다. LNP는 최종 mRNA 농도가 0.04 mg/mL인 원하는 pH 완충액으로 준비 및 정제된다. 원하는 완충액이 사전 부하된 96-웰 플레이트를 사용하여, mRNA의 최종 농도가 0.7μg/mL이 되도록 LNP를 포함하는 mRNA를 추가한다. 각각의 웰에, DMSO 농도가 1%(v/v)가 되도록 TNS를 첨가한다. 혼합 후, 각 웰에서 TNS의 형광을 측정하고(Ex/Em 331nm/445nm) S자형 최적 적합 분석을 형광 데이터에 적용한다. pKa는 절반 최대 형광 강도를 발생시키는 pH로 결정된다. 화합물 1-36에 대해 측정된 겉보기 pKa는 pH 범위 6.0-7.0에 속한다.
실시예 4. LNP의 세포 흡수 측정.
LNP 세포 흡수는 형광 이미징 및/또는 형광 정량화에 의해 측정된다. 이용가능한 많은 적합한 형광 추적자들, 예를 들어, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트(DiI), 3,3'-디리놀레일옥사카르보시아닌 퍼클로레이트(DiO), 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌 퍼클로레이트(DiD) 및 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도트리카르보시아닌 요오다이드(DiR)(Thermo)가 존재한다. 이러한 지질은 물에서 약하게 형광을 나타내지만 LNP에 존재하는 지질들과 같이 지질막에 통합될 때 높은 형광을 나타낸다. 선택된 지질은 광안정성이며 높은 흡광 계수를 갖는 것이 중요하다.
이러한 유형의 지질을 포함하는 LNP는 형광 현미경으로 시각화된다. 한 방법에서, LNP 지질 제형은 0.1-0.5mol% 총 지질의 형광 지질 추적자, 예를 들어, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌-5,5'-디설폰산 (DiI5-DS)을 함유한다. 관심 있는 세포들을 24-웰 플레이트(Corning사)와 같은 적합한 세포 배양 접시에서 성장시킨다. 세포들을 섭취 연구 전날 50% 컨플루언시로 시딩하고 적절한 조건, 예를 들어, 37℃, 5% CO2, 90-100% 습도에서 밤새 성장시킨다. LNP는 세포 배양 배지에 0.1-100 ug/mL mRNA로 첨가되고 일정 시간(4-24시간) 동안 세포와 상호작용시킨 다음, 세포는 배지로 세 번 세척하여 내재화되지 않은 LNP를 관찰하기 전에 제거한다. 형광 검출 기능이 있는 현미경으로 세포를 관찰한다. LNP 세포 흡수의 상대적 정도는 비처리 세포를 배경 대조군으로 사용하여 세포로부터의 형광 강도 신호로부터 결정된다. 대안적으로, 세포 형광 지질은 세포를 펠릿화하고 트리톤-X100과 같은 세제로 세포를 용해시키고 분광형광계로 형광을 정량화하거나 HPLC로 형광 지질 추적자를 정량화함으로써 정량적으로 측정될 수 있다.
유사한 방식으로, 형광 표지된 mRNA가 정량된다. 예를 들어, 1:3 비율의 시아닌 5-UTP:5-메톡시-UTP로 전사된 염료 표지 강화 녹색 형광 단백질(EGFP) 및 반딧불이 루시페라제(FLuc) mRNA는 현재 Trilink Biotechnologies사에서 수득가능하다. 시아닌 5는 여기 최대값이 650nm이고 방출 최대값이 670nm이다. 이 비율로 대체하면 쉽게 시각화되고 세포 배양물에서도 여전히 번역될 수 있는 mRNA가 생성된다. 형광 표지된 mRNA를 포획함으로써 위에서 설명한 방법으로 mRNA의 세포내 전달을 시각화할 수 있다.
세포에서 LNP 섭취는 ApoE 매개와 같은 내인성 방법 또는 활성 표적화와 같은 외인성 방법을 통해 달성될 수 있다. 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하는 LNP 시스템은 혈액에서 아포지단백 E(ApoE)를 흡착한 다음(Cullis et al 2017) ApoE 결합 리간드를 포함하는 여러 수용체에 의해 간세포에서 활발하게 흡수되는 "천연" 표적화 과정을 활용한다는 것이 밝혀졌다(Williams 외, 2010). 중복되지 않는 형광단을 사용하여 mRNA 및 LNP 세포내 분포 및 세포소기관 축적 동역학을 독립적으로 추적할 수 있다.
mRNA 세포 발현 수준은 Trilink Biotechnologies에서 수득할 수 있는 EGFP, FLuc 또는 mCherry와 같은 리포터 시스템을 사용하여 정량화될 수 있다. 한 실시형태에서, EGFP mRNA는 LNP에 캡슐화되고 관심 세포에 0.1-100ug/mL mRNA로 첨가된다. 세포는 4-24시간 후에 배지를 교체하여 내재화되지 않은 LNP가 없도록 세척될 수 있다. 24시간에, GFP 신호는 형광 현미경 또는 유세포 분석법으로 정량화된다. 이러한 방식으로 리포터 단백질 발현 수준에 따라 LNP 제형의 패널을 구별할 수 있다.
실시예 5 형질 전환 선택성 지수
형질 전환 선택성 지수(Transfection Selectivity Index, TSI)는 포유동물 세포의 상대적인 형질 전환 효율을 동일한 세포에서의 상대적인 독성과 비교하여 결정하기 위해 계산된다. 선택성 지수는 아래 식을 사용하여 계산되었다:
TSI = EF포유동물/ IC50,포유동물
여기서 EF포유동물은 백만개 세포 당 단백질의 ng으로 표현되는 형질 전환 효율이고 IC50,포유동물은 절반 최대 억제 농도로서 동일한 제제의 세포 생존율과 관련된다.
본 명세서에 기술된 화합물을 사용하는 LNP(1-36)는 ICL로서 대조군 분자 DLin-MC3-DMA로 만든 동일한 LNP를 사용하여 만든 LNP보다 TSI가 50% 더 높다.
실시예 6. 지질 과산화에 대한 분석.
산화 정도는 LNP 샘플을 25℃에서 3% H2O2로 처리하고 지질 산화 생성물에 대해 0일, 1일, 3일 및 5일차에 샘플링하는 강제 분해 분석을 사용하여 결정될 수 있다(Blessy 외, (2014) Journal of Pharmaceutical Analysis 4, 159-165). 산화 반응은 에탄올에 0.1M 부틸화 하이드록시톨루렌(BHT)을 첨가하여 퀀칭되고 측정할 때까지 -80℃에서 냉동 보관될 수 있다. 지질 산화 생성물은 지질 과산화의 최종 생성물인 말론디알데히드(MDA)를 검출하기 위한 2-티오바르비투르산(TBA) 반응성 분석(Gutteridge (1982) FEBS Letters 150, 454-458)을 사용하거나 증발 광 산란 검출(ELSD) 또는 하전 에어로졸 검출(CAD)을 이용한 HPLC 분석을 사용하여 검출하여 측정할 수 있다. 지질 산화 및 이성질체화 불순물 구조는 알려진 문헌 예시들에 기초하여 지정될 수 있으며 이성질체의 혼합물일 것으로 예상된다.
일반적으로, 아실 사슬에 다중 불포화를 갖는 지질이 산화에 더 민감하다는 것이 당업계에 공지되어 있다(Reis and Spickett (2012) Biochim Biophys Acta 1818, 2374-2387 참조).
본 명세서에 기재된 화합물 1-36은 DLin-KC2-DMA 지질을 함유하는 대조군 LNP와 비교할 때 또는 DLin-MC3-DMA를 함유하는 대조군 LNP와 비교할 때 산화적 손상 또는 분해에 덜 민감할 것으로 예상된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 화합물은 대조군 LNP와 비교할 때 산화 부산물의 감소가 30% 초과, 50% 초과, 75% 초과, 90% 초과 및 95% 초과이다.
실시예 7. 리간드 표적화된 LNP 준비
항체 Fab' 단편 또는 단일 사슬 Fv 단편 형태의 관심 세포, 예를 들어, 면역 세포 내부로 LNP의 특이적 흡수를 제공하는 항체 리간드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조되며(예를 들어, Drummond 외, 미국 특허 출원 20180271998; Zhou 외, 미국 특허 10,406,225; Marks 외, 미국 특허 8,974,792에 설명된 바와 같음), 이의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다). 리간드를 LNP에 접합시키기 위해, 리간드는 CAA 또는 GGSGGC와 같이 시스테인 잔기를 갖는 C 말단 서열로 구성되고, 이어서 도 2에 따라 말레이미드 말단 PEG-DSPE 앵커에 접합된다. 리간드는 박테리아 또는 진핵 세포에서 발현되며 단백질 친화성 크로마토그래피 또는 금속 킬레이트 크로마토그래피와 같은 표준 방법을 사용하여 세포 덩어리 또는 성장 배지에서 단리된다. 말단 시스테인 잔기의 티올 기를 활성화시키기 위해, 리간드는 140mm NaCl을 함유하는 pH 6.0-6.2의 10mM 시트레이트 완충액 중 15mM 시스테인의 존재하에서 1시간 동안 인큐베이션되고, 140mm NaCl을 함유하는 pH 6.0-6.2의 10mM 시트레이트 완충액인 용리액으로 SEPHADEX G-25 또는 유사한 컬럼 상에서 겔 크로마토그래피로 정제된다. 정제된 시스테인 활성화 리간드 용액의 단백질 농도는 280nm에서 UV 분광광도법을 사용하여 결정된다. 상기 명명된 완충액 중 1 내지 10 mg/ml의 항체 리간드를 말레이미드-종결 PEG-DSPE 유도체(mal-PEG(2000)-DSPE, 카탈로그 번호 880126, Avanti Polar Lipids, AL, USA, 또는 Sunbright®DSPE-020MA, NOF corporation, 일본) 수용액과 4:1의 단백질/지질 몰비로 혼합한다. 분자량이 3,400 (Sunbright®DSPE-034MA) 또는 5,000(NOF Corporation사로부터 수득가능(Sunbright®DSPE-050MA))인 PEG 스페이서를 갖는 Mal-PEG-지질은 LNP 표면과 리간드 모이어티 사이의 거리가 더 먼 것이 바람직한 경우에 사용될 수 있다. 용액을 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 미반응 말레이미드 기를 차단하기 위해 0.5mM 시스테인으로 조정하고, 미셀 리간드-PEG-DSPE 접합체를 용리액 - pH 7.0-7.4의 10mM HEPES로 완충된 144mM NaCl으로 Ultrogel AcA 34(리간드가 Fab인 경우) 또는 Ultrogel AcA 44(리간드가 scFv인 경우)에서 겔 크로마토그래피에 의해 정제한다. 접합된 단백질은 UV 분광광도법으로 정량하고 SDS 겔 전기영동으로 순도를 확인한다.
리간드는 다음 방법 중 하나를 사용하여 LNP의 표면에 추가된다.
방법 1. 예비형성된 LNP(본 명세서에 그 전문이 참조로 포함된 Hope 외, US 10,653,780에 기재된 바와 같이 수득됨)는 LNP 입자 당 5-100(전형적으로 15 -30)개 리간드 범위의 필요한 리간드/지질 비율에 도달하도록 HEPES-완충 식염수(10mM HEPES, 140mM NaCl, pH 7.0-7.2)에서 리간드-PEG-DSPE 접합체의 미셀 용액과 혼합된다. 혼합물을 37-40℃에서 2시간 동안 또는 2-8℃에서 밤새도록 천천히 교반하면서 인큐베이션하고, 이 시간 동안 접합체는 LNP의 외부 지질층에 포함된다. 리간드-접합된 LNP는 포함되지 않은 리간드-PEG-DSPE로부터 세파로스 CL-2B 또는 CL-4B(동일한 분자량 컷오프를 갖는 친수성 크기 배제 매질도 사용될 수 있음) 상의 겔 크로마토그래피에 의해 정제되며; 공극 부피 근방에서 보이는 LNP 부분들을 수집한다. 입자에 접합된 리간드의 양은 쿠마씨 블루 또는 형광 염색을 사용한 SDS 겔 전기영동 및 동시에 실행되는 리간드 표준에 의해 결정된다.
방법 2. LNP의 핵산 성분 또한 함유하는 pH 4.0의 10mM Na-시트레이트 완충액 중의 리간드-PEG-DSPE 접합체 용액을 Semple 외, 미국 특허 8,021,686(그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 LNP 지질의 에탄올 용액과 40 부피%의 최종 에탄올 농도까지 혼합하였다. 대안적으로, Hope 등의 미국 특허 10,653,780(그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)의 LNP 준비 프로토콜이 사용된다. 리간드-PEG-DSPE의 양은 지질의 0.1-1 mol%이다. 혼합물을 HEPES-완충 식염수(10mM HEPES, 140mM NaCl, pH 7.0)에 대해 투석하여 에탄올을 제거한다. 리간드-PEG-DSPE는 생성된 LNP에 통합된다. 잔여 리간드-PEG-DSPE는, 용리액 HEPES-완충 식염수, 세파로즈 CL-4B 또는 CL-2B를 사용하는 겔 크로마토그래피에 의해, 또는 500 KD 분자량 컷오프를 갖는 폴리설폰 막(평면 또는 중공 섬유 카트리지) 상에서 접선 유동 여과에 의한 HEPES-완충 식염수로의 완충액 교환에 의해 제거된다.
방법 3. Mal-PEG-DSPE는 방법 1의 리간드-PEG-DSPE와 동일한 방식으로 시트레이트 완충 식염수(10mM Na-시트레이트 완충액 pH 6.0-6.2, 140mM NaCl)에서 미리 형성된 LNP와 LNP 지질에 대해 0.1-1 mol%의 양으로 조합된다. mal-PE-DSPE가 포함된 LNP는 포함되지 않은 mal-PEG-DSPE로부터 동일한 완충액의 세파로즈 CL-4B 상의 겔 크로마토그래피에 의해 정제되고 티올-활성화 항체 리간드(LNP 입자 당 5-100개 리간드)와 함께 2-24시간 동안 인큐베이션된다. 이렇게 얻어진 리간드-접합된 LNP는 HEPES-완충 식염수 pH 7.0을 용리액으로 사용하는 세파로즈 CL-4B 겔 크로마토그래피에 의해 접합되지 않은 리간드로부터 정제된다.
방법 4. Mal-PEG-DSPE는 방법 2에 따라 리간드-PEG-DSPE와 동일한 방식으로 LNP 지질의 0.1-1 mol%로 LNP에 포함된다. 생성된 Mal-PEG-접합된 LNP는 티올-활성화된 리간드와 함께 인큐베이션되고 방법 3에 기재된 바와 같이 정제된다.
방법 5. 방법 4의 프로토콜이 수행되는데, 다른 점은 mal-PEG-DSPE 대신에 PEG 스페이서가 없는 말레이미드-접합 지질(mal-DSPE, Coatsome®FE-808MA3, NOF Corporation, 일본)을 지질 용액에 첨가하는 것이다. 생성된 말레이미드-LNP는 방법 3에 따라 티올 활성화 리간드에 접합된다.
방법 6. 저분자량 리간드(예를 들어, 만노스)는 방법 1 또는 2에 의해 LNP에 접합되는데, 이 때 만노스-PEG-DSPE(Biochempeg Scientific, MA, USA, 카탈로그 번호 12169)가 항체 리간드-PEG-DSPE를 치환한다.
실시예 8. 리간드 표적 LNP의 최적 리간드 밀도 결정
실시예 7의 방법들 중 하나를 사용하여 주어진 범위(LNP 입자당 2-200개 리간드, 또는 LNP 입자당 5-100개 리간드)에서 리간드 밀도를 증가시키면서 LNP 패널을 제조한다. LNP는 실시예 4에 기재된 바와 같이 형광 표지된 지질 또는 형광 표지된 핵산을 포함시켜 형광 표지된다. 표지된 리간드-접합된 LNP를 실시예 4에 따라 세포 흡수에 대해 테스트하고, LNP의 리간드-특이적 세포 흡수의 최대치에 상응하는 리간드 함량을 결정한다. 핵산 세포내 기능(예를 들어, mRNA 발현)이 분석 결과로 사용될 수 있으며(실시예 4), 이 경우 지질 또는 검출 가능한 핵산 표지가 필요하지 않다.
실시예 9. 지질 나노입자(LNP)의 준비.
5-메톡시우리딘(5moU)으로 변형되고 mCherry(카탈로그#L-7203)를 코딩하는 mRNA를 Trilink Biotechnologies(San Diego, CA)로부터 입수하였다. 모든 우리딘 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘으로 치환되었다. mRNA를 제조하기 위해, mRNA 서열을 인코딩하는 합성 유전자를 DNA 플라스미드에 클로닝했다. 합성 유전자는 RNA 프로모터, 5' 비번역 영역, mCherry 단백질 코딩 서열, 3' 비번역 영역 및 약 120A의 폴리(A) 테일 영역으로 구성되었다. TriLink(카탈로그#L-7203)의 mCherry mRNA에 대한 오픈 리딩 프레임 서열은 서열번호: 1에 해당한다.
AUGGUGAGCAAGGGCGAGGAGGACAACAUGGCCAUCAUCAAGGAGUUCAUGCGGUUCAAGGUGCACAUGGAGGGCAGCGUGAACGGCCACGAGUUCGAGAUCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGGCCCUACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCUGAAGGUGACCAAGGGCGGCCCCCUGCCCUUCGCCUGGGACAUCCUGAGCCCCCAGUUCAUGUACGGCAGCAAGGCCUACGUGAAGCACCCCGCCGACAUCCCCGACUACCUGAAGCUGAGCUUCCCCGAGGGCUUCAAGUGGGAGCGGGUGAUGAACUUCGAGGACGGCGGCGUGGUGACCGUGACCCAGGACAGCAGCCUGCAGGACGGCGAGUUCAUCUACAAGGUGAAGCUGCGGGGCACCAACUUCCCCAGCGACGGCCCCGUGAUGCAGAAGAAGACCAUGGGCUGGGAGGCCAGCAGCGAGCGGAUGUACCCCGAGGACGGCGCCCUGAAGGGCGAGAUCAAGCAGCGGCUGAAGCUGAAGGACGGCGGCCACUACGACGCCGAGGUGAAGACCACCUACAAGGCCAAGAAGCCCGUGCAGCUGCCCGGCGCCUACAACGUGAACAUCAAGCUGGACAUCACCAGCCACAACGAGGACUACACCAUCGUGGAGCAGUACGAGCGGGCCGAGGGCCGGCACAGCACCGGCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGAGCGGCAACUGA
각각의 지질의 스톡 용액을 준비했다. 이온화 가능한 지질을 4mL 유리 바이알(Thermo B7999-2)에서 계량하고 최종 농도 10mM이 되도록 에탄올(Sigma-Aldrich 200 proof, RNase 없음)에 용해시켰다. DSPC, DPPC-NH4, 콜레스테롤 및 PEG-DMG와 같은 다른 지질을 계량하고 에탄올에 1mM의 농도로 용해시켰다. DSPS-Na는 1mM의 농도로 메탄올(Sulpelco, Omnisolve)에 용해되었고 잠시 70℃로 가열하여 용해를 완료하였다.
각각의 개별 LNP에 대한 지질 혼합물은 원하는 부피의 각 지질 스톡 용액을 새로운 바이알에 첨가하고, 필요에 따라 1.2mL의 최종 부피를 달성하도록 에탄올을 첨가하여 준비되었다. 예를 들어, N/P가 5인 AKG-UO-1/DSPC/DSPS/Chol/PEG-DMG(50/2.5/7.5/38.5/1.5 mol%)의 LNP 제형은 사용된 mRNA 100 μ당 1500 nmol AKG-UO-1, 75 nmol DSPC, 225 nmol DSPS, 1155 nmol Chol 및 45 nmol PEG-DMG를 함유했다.
동결된 mRNA(mCherry mRNA, Trilink) 바이알을 해동시키고 mRNA를 6.25mM 아세트산나트륨(pH 5.0)에서 최종 농도 0.033mg/mL로 희석하여 mRNA 용액을 준비했다.
LNP를 준비하기 위해, NanoAssemblr Benchtop 미세유체 장치(Precision Nanosystems)를 사용했다. LNP에 DSPS의 나트륨이나 암모늄염, DPPS의 나트륨염이 포함되어 있는 경우 70℃로 설정된 가열 블록 액세서리를 사용했고, 그렇지 않은 경우 LNP를 실온에서 혼합했다. mRNA 용액 3mL를 3mL 일회용 주사기(BD 309656)에 넣고 지질 혼합물 1ml를 1ml 주사기(BD309659)에 넣고 혼합하기 전에 4분 동안 NanoAssemblr 가열 블록에 두었다. LNP는 6 mL/분의 혼합 속도에서 3:1 수성:알코올 부피 비율로 액체 스트림을 일회용 마이크로유체 카세트를 통해 펌핑하여 형성되었다. 혼합 후, 3.6mL의 LNP 혼합물을 수집하고 초기 혼합 부피 0.35mL와 마지막 0.05mL의 혼합물을 버렸다. 에탄올은 PBS(Cytivia, SH30256.01)에서 SpectraPor 투석 튜브(12-14k MWCO)를 사용하여 완충액 교환에 의해 또는 Amicon Ultra-4 원심 농축기(10k MWCO, 500g)를 사용하여 순차적인 농축 및 희석에 의해 제거되었다.
LNP는 일반적으로 pH 7.4의 PBS로 교환된 다음 15mM Tris, pH 7.4, 20% 수크로스로 교환되고, Amicon-Ultra 4 (100,000 MWCO) 스핀 컬럼을 사용하여 20-50ug/mL mRNA로 농축되고, 멸균 여과(Thermo Nalgene 0.2um #720-1320)한 후 액체 질소에 5분 동안 담가 동결시키고 -80℃에서 장기간 보관했다.
실시예 10. LNP 특성화
A. 형광 결합 염료에 의한 mRNA 농도 및 상대적 캡슐화 효율 결정
재료: Ribogreen 시약(Thermo #11491), 뚜껑이 있는 3 x 96웰 플레이트, PBS, 해리 완충액(10% DMSO 및 1%(wt/wt) 쯔비터젠트 3-14(Sigma-Aldrich #693017)가 포함된 PBS, mRNA, 일반 피펫 팁 및 반복 피펫 팁.
1. 5mL의 2μg/mL mRNA 스톡을 DPBS 또는 PBS에서 준비했다.
2. 희석된 표준은 96-웰 플레이트(플레이트 A)의 하나의 웰에서 다음과 같이 준비되었다.
3. 플레이트 A의 다른 웰을 사용하여 샘플 mRNA 농도를 추정하고 표준 곡선 내에 들어오도록 희석했다. 예를 들어, 대략적인 mRNA 농도가 샘플에서 ~ 30ug/mL이어야 하는 경우, 20X 희석을 수행했다(희석 계수). (웰의 380 μL PBS에 20 uL 샘플 추가). 플레이트 A에는 뚜껑을 사용하지 않았다. 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 샘플을 혼합했다.
플레이트 A의 실시예
4. 2개의 추가 플레이트인, 플레이트 B 및 C를 사용하였다. 다중 채널 피펫터를 사용하여, 60 μL의 각 표준을 2번 각 웰에 피펫팅하고(중복) 샘플들을 각각 3개 웰에 피펫팅하였다(3회 반복실험)
플레이트 B 및 C의 예
5. 각 플레이트에 사용된 웰의 수를 세고 이 수에 4를 더했다. 플레이트 B의 경우, Ribogreen을 1:100으로 희석시켜 PBS를 준비했다. 예를 들어, 40웰의 경우 44를 상기 수치로 사용했다. 44 X 60 μL = 2.64 mL Ribogreen 용액이 필요하므로, 26.4 μL Ribogreen을 사용하여 PBS는 2.61 mL가 된다.
6. 플레이트 C의 경우, 2.61mL 해리 완충액 및 26.4uL Ribogreen을 피펫팅했다.
7. 60 μL로 설정된 리피터 피펫(repeater pipette)을 사용하여 PBS+RiboGreen을 플레이트 B의 각 웰에 추가하고 60 μL 해리 완충액+Ribogreen을 플레이트 C에 추가했다. 두 플레이트 B와 C를 오비탈 믹서(120rpm)에서 1분 동안 혼합했다. 플레이트 B를 15분 동안 암실에 두었다. 플레이트 C를 37℃의 암실에서 10분 동안 인큐베이션한 후 RT에서 5분 동안 인큐베이션했다.
8. 여기 465, 방출 530nm을 사용하여 두 플레이트를 차례로 판독하였다.
9. 표준 곡선을 사용하여, 기울기와 절편을 계산하고 외삽을 통해 플레이트 B 및 C 샘플들의 mRNA 농도를 계산했다(평균 및 표준 편차).
10. [mRNA] 플레이트 B/ [mRNA] 플레이트 CX 100에 의한 캡슐화 효율 퍼센트(% EE)를 계산했다.
11. [mRNA] 플레이트 C X 희석 계수를 취하여 총 [mRNA]를 계산하였다.
B. LNP 입자 크기
1. LNP 30 μL를 폴리스티렌 큐벳(Sarstedt, #67.754)에서 1.5mL PBS와 혼합하고 ZS Xplorer 소프트웨어(버전 번호 1.4.0.105)를 사용하는 ZetaSizer Pro(Malvern)를 사용하여 크기를 분석했다. Z-평균 크기 및 다분산 지수 값을 기록했다. 전형적으로, LNP의 크기를 LNP 혼합 후, 완충액 교환 후 그리고 멸균 여과 후 측정하였다.
C. LNP 제타 전위
1. 30 μL의 LNP를 1.5mL PBS와 혼합하고 일회용의 폴딩된 모세관 셀(Malvern Nanoseries DTS1070)에 주입하고 ZetaSizer Pro에서 25℃에서 제타 전위를 측정했다.
실시예 11. mCherry mRNA를 사용하여 LNP의 뮤린 수지상 세포에서 형질 전환 효율의 측정.
A. 세포 증식, 형질 전환, 수확 및 염색 프로토콜
1. MutuDC1940 세포(Applied Biological Materials, T0528)는 공급업체의 지침에 따라 T75 플라스크에서 성장시켰다. 이 세포들을 형질 전환 하루 전에 24-웰 플레이트에 180,000개의 세포/웰로 도말하였다.
2. 원하는 mRNA 농도(예: 1 μg/mL로 각 웰에 LNP를 1 mL 배지에서 3회 반복으로 첨가하고 24시간 후 세포를 DPBS(VWR 02-0119-1000)로 한 번 세척했다.
3. 분리를 용이하게 하기 위해 0.2 mL의 DPBS(+ 5 mM EDTA, pH 7.4)를 첨가하였다.
4. 세포들을 분리될 때까지 3분 동안 37℃에 두었다.
5. 0.5ml DPBS를 각 웰에 첨가하고 액체를 유세포 분석법 튜브(Falcon 5mL #352054)로 옮겼다.
6. 튜브를 1100rpm에서 3-5분 동안 원심분리하고 액체를 따라 냈다.
7. Zombie Violet 100μL(Biolegend)(PBS에 1:500으로 희석)를 각 튜브에 첨가했다.
8. 튜브를 부드럽게 탭핑하여 세포를 재현탁시키고 RT에서 15분 동안 암실에 두었다.
9. 세포에 0.5 mL(PBS:DPBS 1:1중 파라포름알데히드 4%)를 첨가하고 세포를 부드럽게 흔들어 재현탁시키고 얼음에 30분 동안 두었다. 또 다른 2ml PBS가 추가되었다.
10. 세포들을 상기와 같이 펠릿화하고 5% BSA를 함유하는 0.5 mL DPBS에 재현탁시키고 필요할 때까지 냉장고에 두었다.
B. 세포 분석
세포 현탁액은 생존/사멸 신호 및 mCherry 형광 신호에 대해 각각 VL1 및 YL2를 사용하는 Attune NxT 유동 세포 분석기로 분석했다. 게이팅 분석은 FloJo 소프트웨어에서 수행되었다.
실시예 12. 이온화 가능한 양이온 지질로서 KC2를 갖는 LNP를 사용하는 수지상 세포의 형질 전환 효율에 대한 DSPS의 영향.
이 연구의 목적은 뮤린 수지상 세포에서 형질 전환 효율에 대한 DSPS를 사용한 포스파티딜세린 표적화의 효과를 탐구하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는 모두 총 지질의 5 및 50mol%의 N/P 비율의 DLin-KC2-DMA 상수를 갖고, PS 지질은 초기에 0 - 2.5mol%로 다양하고 DSPC 인지질은 0 - 7.5mol%로 다양하며(DSPC 및 DSPS의 총 mol%는 10mol%로 일정함), 콜레스테롤 상수는 38.5mol%(총 지질의 모든 mol%)이다. 모든 제형에 대한 입자 크기, 다분산도 지수(PDI) 및 포획 효율은 아래 표 5 및 6에 제시되어 있다.
표 5. 실시예 12에서 사용된 KC2-함유 LNP의 물리화학적 특성은 실시예 12 및 도 3A에서 사용된 0-2.5 mol%로 다양하다.
표 6. 실시예 12 및 도 3B, 도 3C, 및 도 3D에서 사용된 0-7.5mol%로 변화하는 KC2-함유 LNP의 물리화학적 특성.
DLin-KC2-DMA 및 0-2.5mol% DSPS 형태의 다양한 포스파티딜세린을 함유하는 LNP의 초기 세트는 0 또는 0.5mol% DSPS에서 거의 형질 전환을 나타내지 않았지만, DSPS는 2.5mol%로 포함되었을 때 18배 증가하였다(도 3A). 0-7.5mol%의 DSPS로 제조된 두 번째 시리즈의 LNP들은 0.1, 0.3 및 1μg/mL mRNA 농도에서 평가되었다(도 3B, 도 3C 및 도 3D). 형질 전환 효율은 DSPS의 mol%가 2.5mol% 이상 증가함에 따라 증가했으며, 최대값은 1μg/mL mRNA에서 7.5mol%, 0.1 및 0.3μg/mL mRNA 모두에서 5mol%였다. 이들 데이터는 포스파티딜-L-세린의 포함이 mRNA-함유 LNP의 형질 전환 효율을 극적으로 증가시킬 수 있고, 최대 흡수가 DSPS의 5-7.5mol%(총 지질의 %로서)에서 발생한다는 것을 입증한다.
실시예 13. 수지상 세포의 mRNA 형질 전환에 대한 ICL 및 음이온성 인지질 표적화 리간드의 영향.
이 연구의 목적은 다른 음이온성 인지질이 LNP의 형질 전환 효율을 향상시킬 수 있는지, 다양한 ICL 및 PS 표적화로 준비된 LNP가 수지상 세포를 형질 전환시키는 방법을 확인하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는 다양한 ICL(DLin-KC2-DMA, KC2-OA, KC3-OA 또는 SM-102)이 N/P 비율이 총 지질의 5 및 50mol%로 일정하고, PS 지질은 5mol%로, DSPC는 5mol%로 일정하게 유지되고, 콜레스테롤은 38.5mol%(총 지질의 모든 mol%)로 일정하게 유지되었다. 모든 제형에 대한 입자 크기, PDI 및 포획 효율은 아래 표 7에 제시되어 있다.
표 7. 사용되는 ICL를 변화시키면서 그리고 5 mol%에서 음이온성 인지질을 갖는 LNP의 물리화학적 특성.
형질 전환 결과는 도 4에 도시되어 있으며, 도 4는 3개의 상이한 KC-시리즈의 ICL(KC2, KC2-OA 및 KC3-OA) 그리고 또한 분지형 ICL인, SM-102와 함께 제조된 LNP에서 높은 형질 전환률을 보여준다. 다른 음이온성 인지질(Suc-DSPE 또는 Glu-DSPE)과 함께 제조된 제형들을 비롯하여, 모든 제형에 대해 캡슐화 효율이 높았고 입자 크기가 100nm 미만이었다. 데이터는 DSPS(L-세린)는 N-글루타릴-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Glu-DSPE) 또는 N-숙시닐-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Suc-DSPE)으로 치환될 수 없고 그리고 두 가지 인지질 모두 또한 2개의 음전하를 함유하고 두 가지 모두 동일한 디스테아로일(C18:0) 완전 포화 아실 사슬을 함유함에도 불구하고 동일한 높은 수준의 mRNA 형질 전환을 제공함을 입증한다. 이러한 연구는 또한 DSPS의 추가가, 단일 불포화 아실 증가(KC2-OA 또는 KC3-OA)을 포함하는 것들 그리고 SM-102와 같은 분지형 ICL을 포함하는 것들을 비롯하여, 다른 이온화 가능한 양이온 지질에 대해 높은 형질 전환 효율을 유발할 수 있음을 분명히 보여준다. 예를 들어, SM-102 함유 LNP에 DSPS를 추가하면 mCherry 발현이 22배 증가한다.
실시예 14. ICL 및 PS 구조에 대한 PS 표적화의 의존성.
이 연구의 목적은 다양한 아실 사슬 조성의 KC2 및 KC3 시리즈의 이온화 가능한 양이온 지질과 PS로 표적화된 LNP를 비교하는 것이었다. 디메틸아미노에틸 헤드기 구조의 구조를 갖는 KC2 시리즈 지질을 디메틸아미노프로필-유도체화된 헤드기를 포함하는 KC3 시리즈와 비교하였다. LNP는 ICL로서 다양한 ICL(KC2, KC2-01, KC2-OA, KC2-PA, KC3-OA 및 KC3-01)을 5 및 50mol% ICL의 N/P 비율 및 일정한 1.5mol% PEG-DMG로 함유하였다. 콜레스테롤 함량은 38.5mol%로 일정하게 유지되었고 DSPC 함량은 0 또는 5mol%의 DSPS의 mol%에 따라 역으로 변화하였다(모든 지질 농도는 총 지질의 mol%로 사용되었다). 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질 전환 효율을 평가하였다.
표 8. 사용되는 ICL를 변화시키면서 그리고 5 mol%에서 음이온성 인지질을 갖는 LNP의 물리화학적 특성.
형질 전환 결과를 도 5에 나타내며 이는 여러 KC 시리즈의 ICL에 대한 PS 표적화의 긍정적인 영향을 명확하게 보여준다. 여기서 데이터는 불포화 C16 및 C18 ICL을 모두 포함하는 ICL이 포스파티딜-L-세린으로 표적화될 수 있고 수지상 세포에 대한 높은 형질 전환률을 생성할 수 있음을 보여준다. PS와 PC가 미스매치된 아실 사슬 조성을 포함하고 5 mol% DPPC 및 5 mol% DSPS를 가지며 C16 ICL(KC2-PA)과 조합될 때 가장 높은 형질 전환률이 나타났다.
실시예 15. LNP의 형질 전환 효율에 대한 포스파티딜세린 구조의 영향
이 연구의 목적은 수지상 세포에서 형질 전환 효율에 대한 다양한 음이온성 인지질 구조의 효과를 탐구하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는 모두 총 지질의 5 및 50mol%의 N/P 비율에서 일정한 AKG-UO-1을 가졌으며, 음이온성 지질은 제형에 따라 DSPC 인지질과 역으로 변화하엿으며, 20mol% DSPS LNP를 제외하고는 38.5mol%로 일정한 콜레스테롤을 갖는다(모두 총 지질 중의 mol%). 최대 10%의 포스파티딜세린 성분을 함유하는 샘플의 경우, 포스파티딜콜린 조성은 그에 따라 10mol%로부터 감소했다. 예를 들어, 5mol% DSPS를 포함하는 LNP는 5mol% DSPS 및 5mol% DSPC를 포함하고 10mol% DSPS를 포함하는 LNP에는 DSPC가 없었다. 그러나, 20mol% DSPS를 함유한 샘플의 경우, 제형에 DSPC가 없었고 mol% 콜레스테롤은 28.5mol%로 10mol% 만큼 감소하였다.
모든 제형에서 포획 효율은 84 내지 90%였으며, 이는 LNP에서 높은 효율의 mRNA 포획을 나타낸다.
표 9. AKG-UO-1을 ICL로 사용하고 다양한 음이온성 인지질로 제조한 LNP의 물리화학적 특성 및 캡슐화.
상이한 포스파티딜세린 화학적 형태의 효과를 도 6A에서 평가하였으며, 이는 뮤린 수지상 세포에서 LNP 형질 전환 활성에 대한 포화, 아실 사슬 길이 및 세린 입체화학의 중요성을 보여준다. 올레산 아실 사슬을 갖는 또는 입체화학이 L-세린이 아닌 (D-세린)과 같은 PS 유사체(DOPS)는 어떠한 포스파티딜세린도 없이 제조된 LNP와 유사한 형질 전환 활성을 갖는 LNP를 발생시킨다. 그러나 세린의 L-이성질체와 포화 아실 사슬을 포함하는 PS로 제조된 LNP는 PS가 없는 LNP에 비해 수지상 세포를 형질 전환시킴에 있어 훨씬 더 우수하다. 포화 시리즈 중에서 C16(DPPS) 또는 C18(DSPS)을 가진 세포는 가장 높은 활성을 보인 반면, C14(DMPS)를 가진 세포는, PS가 없는 LNP로 처리된 수지상 세포에 비해 활성이 여전히 개선되었지만 낮았다. 도 6B에서 다른 음이온성 인지질의 영향은 배경과 유사한 활성을 보여주는 DSPG-함유 제형들(5 또는 7.5mol%) 및 N-글루타릴- 또는 N-숙시닐-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Glu-DSPE 또는 Suc-DSPE)으로 평가되었으며, 이러한 AKG-UO1 함유 LNP들에 포함될 때 활성은 보다 온건하게 3-5배 향상되었다. 이 실시예는 포화 포스파티딜-L-세린과 함께 LNP가 불포화 디올레오일포스파티딜-L-세린(DOPS) 또는 DSPS의 D-이성질체를 함유하는 것보다 훨씬 더 우수하게 수지상 세포를 형질 전환시킨다는 것을 보여준다. DSPS 및 DPPS의 L-이성질체를 포함하는 LNP는 5 또는 7.5mol%의, 다른 형태의 PS, 음이온성 N-글루타릴 또는 N-숙시닐 DSPE 유사체 또는 디스테아로일포스파티디글리세롤(DSPG)에 비해 가장 높은 수준의 형질 전환을 나타냈다.
실시예 16. LNP를 함유하는 AKG-UO-1에서 DSPS 밀도 최적화
이 연구의 목적은 DSPS 밀도가 LNP의 형질 전환 효율에 미치는 영향을 조사하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하였다. LNP는 0 내지 20mol% DSPS 및 일정한 1.5mol% PEG-DMG와 함께 ICL로서 5의 N/P 비율의 AKG-UO-1을 함유하였다. 콜레스테롤 함량은 38.5mol%로 일정하게 유지되었고 DSPC 함량은 0-10 mol% 사이의 DSPS의 mol%에 따라 역으로 변화하였다(모든 지질 농도는 총 지질의 mol%로 사용되었다). 20 mol% DSPS 제형에서는 DSPC가 없었고 콜레스테롤 함량은 (38.5로부터 28.5 mol%로) 총 10 mol% 감소하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질 전환 효율을 평가하였다.
표 10. AKG-UO-1을 ICL로 사용하고 다양한 음이온성 인지질로 제조한 LNP의 물리화학적 특성 및 캡슐화.
AKG-UO1 함유 LNP에 있어 DSPS 농도에 대한 LNP 조성의 의존성을 도 7에 나타낸다. 이 연구는 AKG-UO-1 함유 LNP에서 제형 내 DSPS의 존재가 2.5 내지 10mol% DSPS의 높은 수준의 수지상 세포 형질 전환 및 약 5-7.5mol% DSPS의 겉보기 피크를 가능하게 함을 시사한다.
실시예 17. AKG-UO-1 함유 LNP의 형질 전환 효율에 대한 PEG의 영향.
이 연구의 목적은 비표적화된 그리고 포스파티딜-L-세린 표적화된 LNP의 형질 전환 효율에 대한 PEG-지질 밀도의 영향을 조사하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하였다. LNP는 0 또는 5mol% DSPS 및 0.5-4.5 mol% PEG-DMG와 함께 ICL로서 5의 N/P 비율의 AKG-UO-1을 함유하였다. 콜레스테롤 함량은 38.5mol%로 일정하게 유지되었고 DSPC 함량은 DSPS가 없는 제형의 경우 10mol%, 5mol% DSPS가 있는 제형의 경우 5mol%였다. 1.5 mol% 이상의 PEG-DMG 함량에서, 총 콜레스테롤 함량을 추가된 PEG-DMG의 양만큼 감소시켰는데, 예를 들면, PEG-DMG 함량이 3.5 mol%인 경우, 콜레스테롤 함량을 38.5 mol%에서 36.5 mol%로 감소시켰다. 0.5% PEG-DMG를 포함하는 입자는 pH 7.4에서 음의 제타 전위를, 그리고 pH 5에서 양의 제타 전위로 상당한 이동을 나타냈다. 1.5-3.5mol% PEG-DMG를 포함하는 LNP는 pH 7에서 본질적으로 중성이었다.
표 11. 실시예 17에서 사용되고 AKG-UO-1, 0 또는 5mol%의 DSPS를 함유하는 LNP의 물리화학적 특성
AKG-UO-1 ICL을 포함하는 DSPS로 표적화된 LNP에 의한 수지상 세포의 형질 전환에 대한 PEG-DMG의 영향을 도 8에 나타낸다. 0.5% PEG-DMG를 포함하는 제형은 5% DSPS의 존재시 1.5-2.5% PEG-DMG에서 관찰된 것보다 6-7배 더 높은 형질 전환 효율을 나타냈다. 1.5 및 2.5% PEG-DMG에서의 형질 전환은 유사했지만, 3.5 및 4.5mol% PEG-DMG에서는 두드러지게 감소하였다. 각각의 PEG 밀도에서 표적화 대 비표적화 형질 전환의 비율은 다양했고, 0.5% PEG에서 12배, 1.5% PEG에서 7배, 2.5% PEG에서 37배, 3.5 및 4.5% PEG에서 5배 미만이었는데, 이는 아마도 PS 표적화 모이어티의 높은 PEG-차폐 때문일 것이다. 이러한 데이터의 조합은 PEG-밀도의 최적 범위가 0.5-2.5% PEG-DMG이며 전체 형질 전환 효율에 있어서 해당 범위의 하한이 최적인 반면, 표적 특이성에 있어서는 2.5%가 최적임을 보여준다.
실시예 18. ICL의 산화 안정성
이 연구의 목적은 접합된 올레핀이 있는 양이온 지질(예: KC2, KC3 및 O-11769)과 가속화된 산화하에 있는 접합된 올레핀이 있는 양이온 지질(예: KC2-01, KC3-01 및 UO-1)의 안정성을 비교하는 것이다.
개별 지질 스톡(10mM)을 에탄올에서 준비하고 -20℃에서 보관했다. 실험에 앞서, 에탄올(Sigma-Aldrich, 카탈로그# 459836)에 45μl의 10mM 지질 스톡을 초순수(Rx Biosciences, 카탈로그# P01-UPW02-1000) 45μl와 혼합하여 5mM 현탁액(KC2, KC2-01, KC3, KC3-01, O-11769 및 UO-1)을 준비했다. AKG-UO-1 및 O-11769 이온화 가능한 양이온 지질에 기초한 리포좀 제형(표 12)은 NanoAssemblr(Precision Nanosystems) 상에서 6 mL/분으로 1mL 에탄올 중 원하는 조성의 지질 혼합물을 pH 5.0의 3mL 6.25mM 아세트산나트륨과 조합함으로써 제조되었다. 3.6mL의 혼합물을 유지하고 초기 0.35mL 및 최종 0.05mL의 혼합물을 버렸다. 에탄올은 4℃에서 10분 동안 500g에서 Aminon-Ultra 4 원심 농축기를 사용하여 각각의 리포솜 제제들을 농축하고 PBS로 원래 부피로 다시 희석함으로써 pH 7.4의 PBS로 완충액 교환하여 제거되었다. 에탄올 농도가 1% 미만이 될 때까지 이 주기를 여러 번 반복했다. 마지막으로, 리포솜을 0.2μm PES(Nalgene) 주사기 필터를 통해 멸균 여과하고 ZetaSizer(Malvern)로 크기를 측정했다. AKG-UO-1 함유 제형(Lot#102021-6)은 평균 크기가 81.8 nm이고 PDI가 0.09인 반면, O-11769 함유 제형은 평균 크기가 86.6 nm이고 PDI가 0.10이었다.
표 12. 가속화 산화 연구에 사용된 LNP 제형.
리포좀 제형의 분취물들을 -80℃ 에서 보관하고 실험 전에 해동시켰다. 물에서 조합된, 10% H202(Sigma-Aldrich, cat# H1009) 및 1mM Fe(III)Cl(Sigma-Aldrich, cat# 372870)의 스톡을 처리 전에 새로 준비했다. H202 및 100μM Fe(III)Cl의 1% 최종 농도를 만들기 위해, 10% H202/1mM Fe(III)Cl 스톡 10μl를 90μl의 리포좀 제형 및 개별 지질에 첨가했다. 리포솜과 개별 지질들을 37℃에서 H202/Fe(III)Cl과 함께 인큐베이션한 다음 각 샘플 5μl를 상이한 시점들(0, 3, 24, 48 및 72시간)에서 취하고 HPLC 분석을 위해 90μl의 MeOH에 용해시켰다. 주요 지질 피크의 분해는 하전 에어로졸 검출기(Charged Aerosol Detector, CAD) 및 Thermo Scientific Accucore™ C18+ UHPLC 컬럼(L= 50mm, D= 2.1mm, 입자 크기 = 1.5μm)이 장착된 Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC 을 사용하여 분석했다. UHPLC 가동 조건은 표 13에 나열되어 있다.
표 13. 크로마토그래피 조건
데이터는 시간 0에서 측정된 지질 피크에 대한, 서로 다른 시점에서 측정된 주요 지질 피크의 백분율로 표시된다.
표 14. 하나(KC2, KC3 또는 O-11769) 또는 그 이상(KC2-01, KC3-01, UO-1, UO-6 및 UO-7)의 메틸렌에 의해 분리된 두 개의 올레핀이 있는 ICL의 분해.
도 9A 및 도 9B에서 보는 바와 같이, 2개의 올레핀 사이에 4개의 메틸렌을 갖는 올레핀(KC2-01, KC3-01 및 UO-1)을 갖는 모든 ICL은 2개의 올레핀을 분리하는 단일 메틸렌을 갖는 대응물(각각 KC2, KC3 및 O-11769)과 비교하여 과산화수소를 사용한 가속화된 산화 하에서 극적으로 우수한 안정성을 나타낸다. 과산화수소로 72시간 처리한 후에도 KC2-01, KC3-01 및 UO-1의 주요 피크는 처리 시작시에 비해 70% 이상 유지되는 반면, KC2, KC3 및 O-11769는 과산화수소로 48시간 인큐베이션 후 완전히 분해된다. 2개의 다른 다중불포화 ICL(UO-6 및 UO-7)은 유사하게 산화에 대해 양호한 안정성을 나타내었지만, 헤드 기에 하이드록시에틸 치환기를 갖는 UO-7은 디메틸아미노 ICL보다 더 빠르게 분해되었다(표 14).
하나 이상의 메틸렌에 의해 분리된 올레핀이 있는 ICL의 안정성을, 구조적으로 관련된 UO-1 및 O-11769 ICL을 사용하여 mRNA가 없는 리포솜 제형의 일부로서 연구하였다. 다른 이온화 양이온 지질(KC2, KC2-01, KC3 및 KC3-01)은 크로마토그래피 피크가 DSPC 피크와 겹치고 이는 데이터 해석을 손상시키기 때문에 이 연구에서 제외되었다. UO-1 및 O-11769 기반 리포좀 제형의 안정성 데이터는 도 9A에 도시되어 있다. 리포솜에 제형화된 UO-1은 1% 과산화수소 존재 하에 72시간 인큐베이션 후 주요 UO-1 피크의 73 ±0.05%를 가진다. 대조적으로, O-11769 기반 리포솜은 처리 72시간 후 O-11769 피크의 3.9 ±0.06%만을 나타낸다.
이 데이터 전체는 실시예 14 및 20 또는 그 올레핀들 사이에 1개 초과의 메틸렌이 있는 ICL에서 입증된 개선된 형질 전환 효율 이외에도, 이들 지질이 산화 분해에 대해 상당히 개선된 안정성을 나타낸다는 것을 시사한다.
실시예 19. mCherry mRNA 함유 LNP의 형질 전환 효율에 대한 N/P 비율의 영향.
이 연구의 목적은 수지상 세포에서 형질 전환 효율에 대한 다양한 N/P 비율의 효과를 탐구하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는 모두 ICL로 KC2-01을 사용했지만 양이온 지질-대-mRNA 인산염(N/P) 비율을 4-7로 변화시켰고 PS 지질은 5mol%로 일정했고 DSPC 인지질은 5mol%로 일정했으며 콜레스테롤은 38.5mol%로 일정했다. 모든 제형에서 포획 효율은 84 내지 90%였으며, 이는 LNP에서 높은 효율의 mRNA 포획을 나타낸다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질 전환 효율을 평가하였다.
표 15. 실시예 19에서 사용된 LNP의 물리화학적 특성
DSPS로 표적화된 및 비표적화된 KC-01 LNP 제형 모두에 대한 형질 전환 활성을 1 ug/ml(도 10A) 및 0.33 ug/ml(도 10B) 모두에서 평가하였다. 이 데이터는 광범위한 N/P 비율에 걸쳐 LNP를 함유하는 KC2-01에 대한 높은 DSPS-매개 형질 전환 효율을 나타내며, 최대 형질 전환 효율은 N/P 7에서 관찰되었다.
실시예 20. 이온화 가능한 지질 구조가 LNP를 포함하는 형질 전환 효율에 미치는 영향.
이 연구의 목적은 수지상 세포에서 형질 전환 효율에 대한 다양한 ICL의 효과를 탐구하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는, N/P 비율이 5로 일정하고 PS 지질이 0 또는 7.5 mol%이고 DSPC 인지질 이 10 또는 2.5 mol%로 일정하고(DSPC 및 DSPC의 총합이 10 mol%임), 콜레스테롤이 38.5 mol%로 일정한 ICL에서 표 16의 이온화 가능한 지질을 사용했다.
표 16. 실시예 20에서 사용된 LNP의 물리화학적 특성.
형질 전환 활성에 대한 표적화 및 ICL 선택의 효과는 비표적화된 그리고 7.5mol% DSPS로 표적화된 LNP 모두를 사용하여 평가하였다(도 11). 이 연구에 사용된 모든 ICL은 아실 사슬의 불포화 정도와 위치 또는 사용된 특정 이온화 가능한 아민이 변화하는 관련 디아실 구조를 가지고 있었으므로 겉보기 pKa이다. 이 데이터는 2개의 올레핀이 4개의 메틸렌(C18 총 길이)에 의해 분리되어 있는 AKG-UO1 지질이 LNP에 통합되었을 때 가장 높은 활성을 나타냄을 보여준다. O-11769 지질(디리놀레산)은 LNP를 함유하는 AKG-UO-1의 대략 절반인 활성을 나타냈고, 후자는 C16 아실 사슬을 갖는 AKG-UO4 지질 및 동일한 헤드 기를 갖지만 두 아실 사슬 모두에서 올레산(단일 올레핀)을 갖는 ICL(AKG-OA-DM2)과 유사한 활성을 갖는다. 그러나 활성의 가장 큰 감소는 AKG-UO-1의 디메틸 아민 치환기를 UO-1A의 디에틸아미노로 변경하거나 두 에스테르와 디메틸아미노기(DODAP) 사이의 메틸렌 수를 줄이는 데서 발생했다. 이 두 가지 변화는 형질 전환 활성을 크게 감소시켰고, 후자는 DSPS 표적화가 있는 경우에도 마찬가지였다.
이 시리즈 중에서, 7.5 mol% DSPS를 포함하는 LNP는 DSPS를 포함하지 않았던 LNP보다 동결-해동 과정을 거친 후 입자 크기의 불리한 변화에 덜 민감하다는 점도 주목할 가치가 있다. 평균적으로 DSPS를 포함하지 않았던 LNP는 직경이 28.4nm로 변경된 반면 DSPS를 포함하는 LNP는 3.9nm로 변경되었다. 저장 안정성은 mRNA 백신의 주요 관심사이기 때문에 DSPS의 추가는 이러한 LNP에 중요한 안정화 효과를 제공한다.
실시예 21. MutuDC1940 수지상 세포주에서 LNP 입자 형성 및 활성에 대한 10 및 25mol% DOPS 추가 효과 측정.
이 연구의 목적은 mRNA LNP 제형에 DOPS를 이전에 문헌(Gaitonde 외, (2011) Clin Immunol 138, 135-145; Rodriquez-Fernandez (2018) Front Immunol 9, 253)에 나타난 mol% 이하의 조성으로 포함시켜 리포솜의 수지상 세포로의 흡수를 향상시키는 영향을 조사하는 것이었다. 25℃에서 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고 실시예 10에서와 같이 분석하였다. LNP는 0, 10 및 25mol% DOPS 및 일정한 1.5mol% PEG-DMG와 함께 ICL로서 5의 N/P 비율의 KC2를 함유하였다. 콜레스테롤 함량은 0% 및 10% DOPS 제형에서 38.5 mol%로 일정하게 유지되었고 DSPC 함량은 0-10 mol% 사이에서 DOPS의 mol%에 따라 역으로 변화하였다(모든 지질 농도는 총 지질의 mol%로서 사용됨). 25 mol% DOPS 제형에서는 DSPC가 없었고 콜레스테롤 함량은 총 15 mol% 감소하였다(38.5로부터 23.5 mol%로). 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질 전환 효율을 평가하였다.
표 17. DOPS 함유 LNP 제형의 물리화학적 특성
수지상 세포에 대한 LNP의 표적화에 대한 10-25 mol% DOPS의 영향을 도 12에서 평가하였다. 이 연구는 KC2 기반 LNP 제형에 10 mol% DOPS를 포함시키는 것이 MutuDC1940 세포의 mCherry 발현 수준에 긍정적인 영향을 줌과 동시에 입자 크기 또는 mRNA의 캡슐화에 부정적인 영향을 미치지 않음을 보여준다. 그러나, DOPS 함량이 25mol%로 증가했을 때 mCherry의 발현은 DOPS가 없는 제형보다 낮았고 PDI의 증가에 의해 입증된 바와 같이 크기 분포는 넓어졌으며 > 400nm의 입자를 포함하는 분포를 유발하였다. 종합하면, 25mol%는 문헌에서 수지상 세포로의 리포솜 흡수를 향상시키는 것으로 나타났을 수 있으나, mRNA를 갖는 LNP 제형에서는 입자 크기 및 형질 전환 활성 모두에 해로운 영향을 미쳤다. 중요한 것은 본 명세서와 문헌에 사용된 DOPS에 불포화 아실 사슬(이 경우에는 올레산)이 포함되어 있다는 것이다. 이것은 포스파티딜세린 아실 사슬이 종종 sn-2 위치에서 그리고 많은 경우에 다중 올레핀(2-4)으로 불포화되는 많은 세포에서 전형적인 것과 유사하다. 낮은 농도의 DOPS에서 약간 향상되지만, 이러한 향상은 실시예 15에서 PS가 포화 아실 사슬, 가장 바람직하게는 디팔미토일(C16) 또는 디스테아로일(C18)로 구성될 때 상당히 더 높은 것으로 나타났다.
실시예 22. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 mRNA 백신 구조체들의 면역원성에 대한 페길화 및 포스파티딜세린 표적화의 영향.
마우스 및 연구 설계. 생체 내 연구가 수행되었다. 암컷 BALB/c 마우스를 Jackson Labs에서 구입하여 적어도 7일 동안 동식물 사육장에서 적응시켰으며 연구 시작 시 6-8주차였다. 연구일 0일에 생쥐의 오른쪽 대퇴사두근에 50mL 용량의 백신 후보물질 1ug(양은 mRNA를 나타냄)을 근육 내 주사했다. 연구 군은 5마리의 마우스로 구성되었으며, 대조군, 비교 백신, 실험 백신 후보가 포함되었다. 21일 후에 마우스에 동일한 백신 후보를 두 번째 주사했다. 연구 시작 시 무작위로 선택된 5마리의 대조군 마우스와 연구 21일 및 34일차에 모든 마우스로부터 혈액을 수집하고 혈청을 단리했다. 항체 역가를 분석할 때까지 혈청을 -80℃에 보관했다. 연구 34일차에 마우스를 안락사시키고 비장을 적출하였다.
mRNA의 설계 및 준비. SARS-CoV-2 전장 스파이크 단백질을 인코딩하고 BNT162b2(Comirnaty) 백신에 사용된 것과 동일한 UTR이 측접한 mRNA를 Vernal Biosciences에서 구입했다. 모든 우리딘 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘으로 치환되었다. mRNA를 생성하기 위해, mRNA 서열(VRN029; 서열번호 2, 도 13A)을 인코딩하는 합성 유전자를 DNA 플라스미드에 클로닝하였다. 합성 유전자는 RNA 프로모터, 5' 비번역 영역, SARS-COV2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인, 3' 비번역 영역 및 약 120A의 폴리(A) 테일 영역으로 구성되었다. 플라스미드는 대장균의 배양물에서 증식 및 확장된 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정화된 대장균 용해물로부터 단리되었다. 정제된 플라스미드는 폴리(A) 테일 인코딩 영역의 말단의 부위에서 절단하는 유형 IIs 제한 효소를 사용하여 선형화되었다. 그런 다음 그 플라스미드를 뉴클레오티드 트리포스페이트, RNA 중합효소 및 RNase 억제제가 있는 완충액에서 인큐베이션했다. 반응을 중단시키기 위해, 선형 플라스미드 템플릿을 절단하는 DNase I을 첨가했다. 이어서 캡핑되지 않은 RNA를 크로마토그래피를 사용하여 정제한 다음 GTP, S-아데노실메티오닌, 구아날릴트랜스퍼라제, 2'-O-메틸트랜스퍼라제 및 RNase 억제제와 함께 또 다른 완충액에서 인큐베이션하였다. 이어서, 캡핑된 mRNA를 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 완충액을 물로 교환하고, 바이알에 채웠다.
mRNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)의 생성. 각각의 지질의 스톡 용액을 준비했다. 이온화 가능한 지질을 4mL 유리 바이알(Thermo B7999-2)에서 계량하고 최종 농도 10mM이 되도록 에탄올(Sigma-Aldrich 200 proof, RNase 없음)에 용해시켰다. DSPC(Avanti Polar Lipids), 콜레스테롤(Dishman) 및 PEG-DMG(NOF)와 같은 다른 지질을 계량하고 에탄올에 1mM의 농도로 용해시켰다. DSPS-Na (NOF)는 1mM의 농도로 메탄올(Sulpelco, Omnisolve)에 용해되었고 잠시 70℃로 가열하여 용해를 완료하였다.
각각의 개별 LNP에 대한 지질 혼합물은 원하는 부피의 각 지질 스톡 용액을 새로운 바이알에 첨가하고, 필요에 따라 1.2mL의 최종 부피를 달성하도록 에탄올을 첨가하여 준비되었다. 예를 들어, N/P가 5인 AKG-UO-1/DSPC/DSPS/Chol/PEG-DMG(50/2.5/7.5/38.5/1.5 mol%)의 LNP 제형은 사용된 mRNA 100 μ당 1500 nmol AKG-UO-1, 75 nmol DSPC, 225 nmol DSPS, 1155 nmol Chol 및 45 nmol PEG-DMG를 함유했다. 동결된 mRNA(SARS-CoV-2 스파이크 mRNA, Vernal) 바이알을 해동시키고 mRNA를 6.25mM 아세트산나트륨(pH 5.0)에서 최종 농도 0.033mg/mL로 희석하여 mRNA 용액을 준비했으며, 여기서 농도는 Nanodrop에서 흡광도로 확인된다.
LNP를 준비하기 위해, NanoAssemblr Benchtop 미세유체 장치(Precision Nanosystems)를 사용했다. LNP에 DSPS가 포함된 경우, 70℃로 설정된 가열 블록 액세서리를 사용하고 그렇지 않은 경우 LNP를 실온에서 혼합했다. mRNA 용액 3mL를 3mL 일회용 주사기(BD 309656)에 넣고 지질 혼합물 1ml를 1ml 주사기(BD309659)에 넣고 혼합하기 전에 4분 동안 NanoAssemblr 가열 블록에 두었다. LNP는 6 mL/분의 혼합 속도에서 3:1 수성:알코올 부피 비율로 액체 스트림을 일회용 마이크로유체 카세트를 통해 펌핑하여 형성되었다. 혼합 후, 3.6mL의 LNP 혼합물을 수집하고 초기 혼합 부피 0.35mL와 마지막 0.05mL의 혼합물을 버렸다. 에탄올은 PBS(Cytivia, SH30256.01)에서 SpectraPor 투석 튜브(12-14k MWCO)를 사용하여 완충액 교환에 의해 제거되었다. LNP는 일반적으로 pH 7.4의 PBS로 교환된 다음 15mM Tris, pH 7.4, 20% 수크로스로 교환되고, 20-50ug/mL mRNA로 농축되고, 멸균 여과(Thermo Nalgene 0.2um #720-1320)한 후 액체 질소에 5분 동안 담가 동결시키고 -20℃에서 장기간 보관했다. 이 연구를 위해 샘플을 >40 μg/mL mRNA로 농축하고 다양한 부피의 15 mM Tris, 20% Sucrose, pH 7.4로 희석하여 목표 농도 40 μg mRNA로 만든 다음 LN2에서 동결시켰다. LNP의 분취물을 해동시키고 pH 7.4의 15mM Tris로 1:1(부피:부피)로 희석하여 최종 농도가 15mM 트리스, 10% 수크로스, pH 7.4 중에서 20μg/mL mRNA가 되도록 한 후에, LNP의 특성화에 착수했다. 이는 뒷다리에 IM 주입을 통해 50 μL 부피의 1 μg mRNA를 동물에게 투여하기 전에 수행되었던 샘플 준비 조건들을 시뮬레이션한 것이다.
LNP 특성화. LNP 내 mRNA 캡슐화 및 mRNA 농도는 Ribogreen 분석을 사용하여 측정되었다. 나노 입자 크기와 제타 전위는 제타사이저(Malvern)로 측정했다.
SARS-CoV-2 항스파이크 항체 역가. SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 총 IgG 결합 항체에 대한 혈청 샘플을 분석하기 위해 표준 간접 ELISA를 수행했다. 이 분석을 위해 Nunc MaxiSorp 96-웰 플레이트를 1x PBS, pH 7.4에서 2μg/mL로 희석된 100μL의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(Sino Biological, 카탈로그 번호 40589-V08B1)로 코팅하였다. 플레이트를 37℃에서 12시간 동안 정적으로 인큐베이션했다. 100 μL PBS + 0.05% Tween-20으로 플레이트를 3회 세척하여 결합되지 않은 코팅 항원을 제거했다. 그런 다음 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 PBS + 5% 탈지유에서 블로킹하였다. 테스트 및 양성 대조군 샘플을 분석 희석액(PBS, Tween-20, 1% 탈지유)에서 시작점 희석 1:20으로 희석한 다음 U-바닥 희석 플레이트를 사용하여 4배 연속 희석했다. 블로킹이 완료되면 뒤집어 블로킹 완충액을 제거하고 각 샘플을 이중으로 도말했다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 정적으로 인큐베이션한 다음 100 μL의 PBS + 0.05% Tween-20으로 3회 세척하여 결합되지 않은 혈청을 제거했다. 100mL의 2차 검출 항체(염소 항-마우스-HRP IgG, Abcam)를 1:10,000의 희석으로 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 정적으로 인큐베이션하고, 이어서 결합되지 않은 항체를 제거하고 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 현상을 위해 100μL의 1단계 Ultra TMB 기질을 각 웰에 추가하고 50μL의 TMB 정지 용액(SeraCare, 카탈로그 번호 5150-0019)으로 약 10분 후에 반응을 정지시켰다. Thermo LabSystems Multiskan 분광광도계를 사용하여 450nm에서 30분 이내에 플레이트를 판독했다. 역가는 적정 곡선의 선형 부분에서 OD 450에 대한 특정 컷오프 값을 생성하는 희석의 역수로 정의되었다.
생체외 T 세포 반응. 연구 34일차에, 비장을 단일 세포 현탁액에 기계적으로 분리시켰다. 세포를 세포 자극 배지(L-글루타민 및 HEPES 완충액을 함유한 RPMI, 열-불활성화 소 태아 혈청 및 Pen/Strep)에 재현탁시키고 2x106개 세포를 100 mL부피로 96-웰 플레이트에 분취하였다. 각 마우스의 비장 세포는 PMA 및 이오노마이신 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(JPT, 카탈로그 # PM-WCPV-S-2)을 포함하는 1mg/mL의 펩티드 풀을 포함하는 양성 대조군 세포 자극 칵테일(ThermoFisher, 카탈로그 # 00-4970-93)로 처리된 100mL 배지만으로 37℃에서 약 18시간 동안 자극되었다. 자극 1시간 후, Golgi Stop(BD Biosciences, 카탈로그 # 554724)을 각 웰에 첨가하였다.
유세포 분석법. 자극 후, 세포를 PBS로 세척하고 96-웰 딥웰 플레이트로 옮겼다. 세포를 4℃에서 20분 동안 PBS에 희석된 LIVE/DEAD 근적외선 생존도 염료(ThermoFisher, cat. # L10119)로 염색했다. 세포를 FBS 염색 완충액(BD Biosciences, cat. # 554656)으로 세척하고 Fc Block(BD Biosciences, cat. 553142)과 함께 4℃에서 10분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 CD3 BV605(BD, 카탈로그 번호 564009), CD4 BV421(BD, 카탈로그 번호 562891) 및 CD8 APC(BD, 카탈로그 번호 553035)로 구성된 세포 표면 항체 칵테일로 4℃에서 40분 동안 염색했다. BD Brilliant 염색 완충액(카탈로그 번호 563794)이 염색 완충액에 포함되었다. 세포를 FBS 염색 완충액으로 세척한 후 Fix/Perm 완충액(ThermoFisher, cat. # 00-5523-00)으로 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 세포를 1x Perm 완충액으로 세척하고, Fc Block과 함께 인큐베이션한 다음, IFN-g PE/Cy7(BD, cat. # 557649), IL-2 PE(BioLegend, cat. # 503808) 및 TNF-a FITC(BD, cat. # 554418)로 구성된 세포내 사이토카인 항체 칵테일로 4℃에서 40분 동안 염색했다. 그런 다음 세포를 세척하고 FBS 염색 완충액에 재현탁하고 MACSQuant 16 유동 세포 측정기(Miltenyi Biotec)에서 수집했다. 유동 데이터는 FlowJo v10.8.1(BD Biosciences)을 사용하여 분석했다.
표 18. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 mRNA 백신 구조체의 면역원성을 평가하는 데 사용되는 LNP의 물리화학적 특성
백신 면역원성에 대한 PEG-지질 농도의 영향을 평가하기 위해, BALB/c 마우스를 증가하는 양의 PEG-지질(PEG-DMG 또는 PEG-DPPE)을 함유하는 mRNA-LNP로 면역화하였다. 항체 분석을 위해 프라임 후 21일차 및 부스트 후 13일차(연구 34일차)에 혈청을 수집하였다. 비장 세포를 스파이크 펩티드 풀로 자극하고 IL-2를 생산하는 CD4 T 세포의 백분율을 유세포 분석법을 사용하여 정량화했다(도 13B 및 도 13C). 두 가지 형태의 PEG, PEG-DMG (도 13B) 또는 PEG-DPPE (도 13C) 모두 mRNA-LNPA 백신 면역원성에 역으로 영향을 주었고, 더 낮은 농도의 PEG-지질은 더 높은 수준의 B-세포 및 T-세포 반응 모두를 나타냈다.
mRNA-LNP 면역원성에 대한 PEG-지질 아실 사슬 조성의 영향을 평가하기 위해, BALB/c 마우스를 상이한 PEG 형식(PEG-DMG 또는 PEG-DSG)을 포함하는 mRNA-LNP로 면역화하였다. 프라임 후 21일차 및 부스트 후 13일차(연구 34일차)에 혈청을 수집하였다. 비장 세포를 스파이크 펩티드 풀로 자극하고 IL-2를 생산하는 CD4 T 세포의 백분율을 유세포 분석법을 사용하여 정량화했다. 항체 역가 데이터는 통계 분석 전에 로그 변환되었다. 독립표본 t 검정을 사용하여 군들을 비교했다. 이온화 가능한 지질 KC2OA로 제조된 LNP의 경우, 어느 PEG 형식도 유사하게 거동하였다(도 13D). 대조적으로, 이온화 가능한 지질 UO1 및 PEG-DMG를 사용하는 LNP는 PEG-DSG를 함유하는 LNP보다 우수한 항체 반응을 유도하였다(도 13E).
포스파티딜세린의 포함이 mRNA-LNP 면역원성에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위해, BALB/c 마우스를 DSPS가 있거나 없는 다양한 이온화 가능한 지질을 함유하는 mRNA-LNP로 면역화했다. 34일(부스팅 후 13일)차에, ELISA로 총 IgG 항-스파이크 항체를 정량화하기 위해 혈청을 수집하였다. 비장 세포를 펩티드로 자극하고 IL-2를 생산하는 CD4 T 세포의 백분율을 유세포 분석법을 사용하여 정량화했다.
비교 이온화 가능한 지질 ALC-0315를 갖는 DSPS의 포함은 전체 IgG 항-스파이크 항체 수준에 부정적인 영향을 미쳤다(도 13F). DSPS는 이온화 가능한 지질 UO1 및 KC2OA를 포함하는 LNP에 대해 반대의 효과를 보였고 기하 평균 항체 수준을 각각 36배 및 46배 크게 증가시켰다. DSPS는 또한 CD4 T 세포 반응에 영향을 미쳤는데, 반응은 UO1 및 KC2OA를 포함하는 LNP에서 더 높은 경향이 있었고 SM-102에서 상당히 더 높았다. 종합하면, 지질 나노입자에 DSPS를 포함시키는 것은 mRNA 백신의 면역원성에 실질적으로 영향을 미칠 수 있으며, DSPS의 영향은 이온화 가능한 양이온 지질의 유형에 의해 영향을 받는다.
상이한 포스파티딜세린 아실 사슬 조성의 혈청 항체 역가에 대한 효과(도 13G, 패널 A) 및 비장에서 스파이크 특이적 CD4 T 세포 반응의 크기(도 13G, 패널 B)를 평가하였다. 생쥐는 이온화 가능한 지질 UO1과 DSPS 또는 DPPS 형태의 포스파티딜 세린을 사용한 LNP로 면역화되었다. 34일(부스팅 후 13일)차에, ELISA로 총 IgG 항-스파이크 항체를 정량화하기 위해 혈청을 수집하였다. 비장 세포를 펩티드로 자극하고 IL-2를 생산하는 CD4 T 세포의 퍼센트를 유세포 분석법을 사용하여 정량화했다.
PS 아실 사슬 조성의 영향과 관련하여, 두 형태의 PS 모두 PS가 결여된 기본 제형에 비해 항체 수준을 비교적 증가시켰다(도 13G, 패널 A). DPPS를 포함하는 제형만이 PS가 없는 기본 제형보다 상당히 더 높았지만, 두 형태의 PS 모두 CD4 T 세포 반응에 긍정적인 영향을 미쳤다(도 13G, 패널 B). 종합하면, 우리의 LNP, DPPS 또는 DSPS에 포함된 두 형태의 PS 모두는 mRNA-LNP 백신의 면역원성을 증가시키는 데 유사한 긍정적 효과를 나타냈다.
실시예 23. KC2-01 기반 LNP에서 DSPS D-이성질체 또는 L-이성질체를 7.5mol%로 추가하는 것의 효과를 MutuDC1940 수지상 세포주에서 입자 특성 및 활성으로 측정.
본 연구의 목적은 DSPS의 D 및 L-이성질체를 7.5mol%로 mRNA LNP 제형에 포함시키는 것의 영향을 비교하는 것이었다. 25℃에서 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고 실시예 10에서와 같이 분석하였다. LNP는 2.5mol% DSPC, 7.5mol% DSPS(D 또는 L) 및 일정한 1.5mol% PEG-DMG와 함께 ICL로서 KC2-01을 5의 N/P 비율로 함유하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질 전환 효율을 평가하였다.
표 19. mCherry mRNA 및 디스테아로일포스파티딜-L-세린 또는 디스테아로일포스파티딜-D-세린이 있는 KC2-01 LNP의 물리화학적 특성.
이 연구는 KC2-01 기반 LNP 제형에 7.5 mol% DSPS(둘 중 하나의 이성질체)를 포함시키는 것이 입자 크기 또는 mRNA 캡슐화에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 제타 전위 값은 pH 5에서 유사하지만, DSPS 함유 제형은 비-DSPS 함유 제형보다 pH 7에서 더 많은 음의 값을 가지는데, 이는 아마도 DSPS에 의해 추가된 추가 음전하로 인한 결과일 것이다. 형질 전환에 대한 입체화학의 영향을 도 14A 및 도 14B에서 평가하였다. DSPS의 D-이성질체가 사용되었을 때 1μg/mL mRNA(0.33μg/mL mRNA에서 4.7배)에서 L 이성질체와 비교하여 mCherry 발현의 8배 증가가 관찰되었으며, 이는 DSPS 함유 LNP의 흡수 또는 발현 메커니즘(들)이 입체특이적일 가능성이 있음을 나타낸다.
실시예 24. MutuDC1940 수지상 세포주에서 25℃ 및 65℃에서 KC2 기반 LNP에 DSPS를 포함시키는 것의 입자 특성 및 활성에 대한 효과를 측정.
이 연구의 목적은 두 가지 다른 온도에서 생산된 KC2 기반 LNP에서 DSPS의 D-이성질체를 포함시키는 것의 영향을 비교하는 것이었다. 실시예 9에 기술된 바와 같이(여기서 DSPS를 포함하는 것들은 65℃에서 제조되었고 DSPS를 포함하지 않는 것들은 25℃에서 제조되었음) LNP를 제조하고 모든 LNP를 실시예 10에서와 같이 분석하였다.
모든 LNP는 일정한 1.5mol% PEG-DMG와 함께 ICL을 N/P 비율 5로 포함하였다. 콜레스테롤 함량은 38.5mol%로 일정하게 유지되었고 DSPC 함량은 5 및 7.5 mol%의 DSPS mol%에 따라 역으로 변화하였다(모든 지질 농도는 총 지질의 mol%로 사용되었다). 이들 mRNA LNP는 모두 mCherry mRNA를 함유하였으며 mRNA-1273에서 사용된 것과 동일한 지질 조성의 SM-102 기반 지질 제형 및 BNT162b2에서 사용된 것과 유사한 ALC-0315를 사용한 지질 제형을 사용한 비교 제형들의 조성은 각각의 처방 정보로부터 얻었다. ALC-0315를 사용하는 BNT162b2 비교제형은 본 연구의 다른 제형에 따라 5.0의 N/P로 만들어졌는데, 이는 승인된 Covid 백신 Comirnaty와 상이하다.
표 20. SM102 또는 ALC-0315 이온화 가능한 양이온 지질로 제조된 유사한 LNP에 대해 5 또는 7.5% DSPS를 갖는 KC2 함유 LNP의 물리화학적 특성.
이 연구는 65℃로 설정된 가열 블록에서 지질 용액 및 mRNA 용액을 가열하는 것이 5 또는 7.5mol% DSPS 함량에서 입자 직경 또는 제타 전위 또는 mRNA 캡슐화 판독값에 유해한 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. DSPS로 표적화된 KC2 LNP의 형질 전환에 대한 온도의 영향, 및 SM102 및 ALC-0315 함유 LNP와의 비교가 도 15에 도시되어 있다. 5 mol% DSPS 제형은 25℃에서 만든 완전히 동일한 제형보다 mCherry 발현이 2배 더 높았다(p < 0.05, T-검정). 두 온도에서 제조된 7.5 mol% DSPS를 사용한 제형의 비교는 유의한 차이를 나타내지 않았다. 65℃에서 만들어진 5mol% DSPS 함유 LNP는 SM102 제형에 비해 mCherry 발현을 6.5배 증가시켰다. 더 높은 온도는 알코올에서 DSPS의 용해도를 증가시키고 입자에 지질을 더 잘 포함시킬 수 있게 하여, 본 시험관내 연구에서 향상된 흡수를 허용하는 동시에, 크기, 캡슐화 또는 mRNA 발현과 같은 많은 중요한 LNP 입자 특성에 악영향을 미치지 않는다.
실시예 25. DSPS 유무에 따른 LNP에서 UO1, UO6& 7 비교
이 연구의 목적은 7.5mol% DSPS가 있는 그리고 없는 LNP에서 AKG-UO-6("UO-6") 및 AKG-UO-7("UO-7")을 평가하는 것이었다. 이전에는 7.5 mol% DSPS가 UO-1 시리즈에서 가장 최적의 LNP를 생성하는 것으로 나타났다. 본 실시예에서 7.5 mol% DSPS는 구조적으로 유사한 UO-6을 비교하기 위해 포함시킬 초기 DSPS의 양으로 선택되었고 7개의 LNP를 실시예 9에 기술된 바와 같이 제조하였고 실시예 10에서와 같이 분석하였다.
LNP는 ICL로서 UO-1, UO-6 또는 UO-7을 50mol% 함유하였다. 이들 제형은 또한 38.5mol% 콜레스테롤 및 1.5mol% PEG-DMG를 함유하였다. 비 DSPS 함유 샘플은 10mol% DSPC를 갖고, 7.5mol% DSPS 함유 LNP에 DSPS를 7.5mol%로 첨가하였고 DSPC는 2.5mol%로 포함시켰다. 모든 제형의 N/P는 5였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질 전환 효율을 평가하였다.
표 21. DSPS-표적화 유무에 따른 UO-1, UO-6 및 UO-7 LNP의 물리화학적 특성 및 캡슐화 효율.
이 연구는 UO1, UO6 및 UO7을 기반으로 하는 LNP에 DSPS를 포함시키면 입자 크기 또는 mRNA 포획의 불리한 변화 없이 mCherry의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다. 3가지 상이한 ICL(UO-1, UO-6 및 UO-7)로 제조된 제형에 있어서, LNP에 7.5% DSPS를 포함시킨 것의 수지상 세포 형질 전환 활성에 대한 영향이 나타났다(도 16). 7.5mol% DSPS를 포함하는 UO-1의 경우, mCherry 발현은 7.5mol% DSPS를 포함하는 UO6보다 11배, 7.5mol% DSPS를 포함하는 UO7보다 7배 더 높았다. DSPS가 있는 UO-7은 DSPS가 있는 UO6보다 mCherry 표현이 1.5배 더 많았다. DSPS를 함유하지 않은 제형들 중에서 UO7은 UO1보다 2.2배 더 활성이었고 UO6보다 1.9배 더 활성이었다. 그러나 3가지 ICL 모두로 제조된 LNP는 우수한 캡슐화 효율, 입자 크기 및 제타 전위를 유지하면서도 해당 제형에 DSPS를 포함시켜 표적화하는 이점을 얻었다.
실시예 26. UO1, SM102 및 ALC-0315 기반 LNP에 DSPS를 첨가한 효과를 MutuDC1940 수지상 세포주에서 입자 특성 및 활성을 비교하여 평가.
본 연구의 목적은 DSPC의 L-이성질체를 0, 5% 및 7.5mol%로 mRNA LNP 제형에 포함시킨 효과를 평가하는 것이었다. 25℃에서 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고 실시예 10에서와 같이 분석하였다.
LNP는 ICL로서 AKG-UO-1("UO-1") 또는 SM102를 50mol%로 포함하였다. UO1 및 SM102의 경우 제형들은 38.5mol% 콜레스테롤 및 1.5mol% PEG-DMG를 함유했다. 비 DSPS 함유 샘플들은 10 mol% DSPC를 가지며, DSPS 함유 LNP에, DSPS가 5 또는 7.5 mol%로 첨가되었고 동시에 DSPC는 이와 동일한 mol%만큼 감소되었다. ALC-0315 제형의 경우, ICL은 46.3mol%, DSPC 9.4mol%, 콜레스테롤 42.7mol% 및 PEG-DMG 1.5mol%이었다. DSPS는 상기와 같이 DSPC mol%를 동시에 감소시키면서 첨가되었다. 모든 제형의 N/P는 5였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질 전환 효율을 평가하였다.
표 22. UO1, SM102 및 ALC-0315 함유 LNP의 PS로 표적화된 제형들의 물리화학적 특성 및 캡슐화 효율
이 연구는 UO1, SM102 및 ALC-0315을 기반으로 하는 LNP에 DSPS를 포함시키면 입자 크기 또는 mRNA 포획의 불리한 변화 없이 mCherry의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다(도 17). UO-1 및 SM102의 경우 5mol% DSPS가 최대인 반면 ALC-0315 제형의 경우 7.5mol% DSPS가 최대였다. UO-1 및 SM102의 경우, 5mol% DSPS 샘플에서 발현 증가는 각각 18.1배 및 58.7배였다. 이러한 증가는 7.5 mol% DSPS에 대한 ALC-0315 기반 샘플의 경우 80.9배였다.
실시예 27. 추가적인 예시적 포스파티딜-L-세린 표적화된 LNP 제형.
하기 제시된 추가 제형들 또한 상기 실시예에 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 모든 지질 농도는 LNP에서 총 지질의 백분율로서 mol%로 표시된다. 하기 조성물은 접합된 지질 함량이 0.5 내지 2.5mol%, 스테롤 함량이 25 내지 45mol%, ICL 함량이 40 내지 65mol%, 포화 포스파티딜-L-세린 함량이 2 내지 10mol%, 그리고 총 비양이온성 인지질 함량이 5 내지 20mol%로 다양하다. 대부분의 조성물은 2개의 인지질, 전형적으로 포스파티딜-L-세린(DSPS 또는 DPPS가 바람직함) 및 포스파티딜콜린을 함유할 것이지만, 일부 예시적인 제형은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)과 같은 포스파티딜에탄올아민을 비롯한 2개 이상의 인지질을 함유할 수 있다.
표 23. 예시적인 포스파티딜-L-세린 함유 LNP 제형
표 23. 예시적인 포스파티딜-L-세린 함유 LNP 제형(계속)
실시예 28. mCherry mRNA를 사용하여 LNP의 인간 수지상 세포에서 형질 전환 효율의 측정.
형질 전환 4일 전에 건강한 공여체의 PBMC에서 CD14 단리 키트(StemCell)를 사용하여 단핵구를 단리했다. 순도 CD14 = 90.3%, 생존율 = 93.2%. 단핵구는 6웰 디쉬에서 IL-4(R&D 1000 IU/mL) 및 GM-CSF(R&D, 800 IU/mL)와 함께 1x106개의 세포/mL의 농도로 37℃, 5% CO2에서 배양되었다. 4일 후 미성숙 DC를 수확하여 96웰 둥근 바닥 플레이트에 50,000개 세포/웰로 씨딩하였다. 바이알을 37℃ 수조에 30초간 담가두거나 샘플이 거의 완전히 녹을 때까지 기다려서 LNP를 해동시켰다. 곧바로 바이알들을 사용하기 전까지 얼음 위에 두었다. LNP는 1 μg/ml 및 0.1 μg/mL mRNA의 최종 농도까지 첨가되었다. 1 μg/mL 처리의 경우, LNP를 각 웰에 직접 첨가한 다음 피펫으로 웰을 혼합했다. 0.1 μg/mL 처리의 경우, LNP를 완전 배지에서 1:10으로 희석한 다음 각 웰에 첨가하고 피펫으로 혼합했다. 4시간 후, TNF-a(R&D, 10 ng/mL), IL-1b(R&D, 2 ng/mL), IL-6(R&D, 1000 IU/mL), PGE1(R&D, 1 μg/mL)로 구성된 성숙 사이토카인 칵테일을 각 웰에 직접 첨가했다. 24시간 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 세척한 후 유세포 분석법을 통해 mCherry 형광을 분석했다. 게이팅 분석은 CytExpert 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
실시예 29 가속 산화 조건에서 이온화 가능한 양이온 지질의 안정성
본 연구의 목적은 가속 산화 하에서 이온화 가능한 양이온 지질의 안정성을 비교하는 것이다.
1 mM 양이온 지질(KC3, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17 및 KC3-C17(C8:1))의 에탄올(Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 459836) 스톡을 제조하여 -20℃에서 보관했다. 실험 전에, 지질 스톡 75 μl를 초순수 75 μl Biosciences, 카탈로그 번호 P01-UPW02-1000)와 혼합하여 각각 양이온 지질 0.5 mM 및 리놀레산 5 mM을 만들었다. 물에서 조합된, 10% H202(Sigma-Aldrich, cat# H1009) 및 1mM Fe(III)Cl(Sigma-Aldrich, cat# 372870)의 스톡을 실험 전에 새로 준비했다. H202 및 100μM Fe(III)Cl의 1% 최종 농도를 만들기 위해, 10% H202/1mM Fe(III)Cl 스톡 15μl를 135μl의 개별 지질에 첨가했다. 리포솜과 개별 지질들을 37℃에서 H202/Fe(III)Cl과 함께 인큐베이션한 다음 각 샘플 5μl를 상이한 시점들(0, 24, 48, 72 및 96시간)에서 취하고 HPLC 분석을 위해 90μl의 MeOH에 용해시켰다. 주요 지질 피크의 분해는 하전 에어로졸 검출기(Charged Aerosol Detector, CAD) 및 PhenomenexTM Kinetex C8 컬럼(L= 150mm, D= 2.1mm, 입자 크기 = 1.7μm, 100A)이 장착된 Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC 을 사용하여 분석했다. UHPLC 가동 조건은 표 24에 나열되어 있다.
표 24. 크로마토그래피 조건
데이터는 시간 0에서 측정된 지질 피크에 대한, 서로 다른 시점에서 측정된 주요 지질 피크의 백분율로 표시된다.
도 18과 표 25에서 보는 바와 같이, KC3는 H202에 의한 강제 산화에서 다른 양이온 지질에 비해 가장 빠른 분해를 보였다.
표 25. 개별적인 이온화 가능한 양이온 지질의 안정성에 미치는 과산화수소의 영향.
실시예 30. KC3-OA, UO-1 또는 UO-1A 지질을 사용하여 제조된 LNP의 인간 수지상 세포에서의 형질 전환 효율 비교
이 연구의 목적은 인간 수지상 세포에서 형질 전환 효율에 대한 다양한 ICL의 효과를 탐구하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 28에 기재된 바와 같이 인간 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는 표 26-28에 있는 이온화 가능한 지질을 사용하였고 ICL은 N/P 비율을 5로 일정하게 유지하였으며, PS 지질은 0 또는 7.5 mol%, DSPC 인지질은 10 또는 2.5 mol%(DSPS와 DSPC의 합계는 10 mol%)였고, 콜레스테롤은 38.5 mol%로 일정하게 유지하였다.
표 26. 실시예 30에서 사용된 LNP의 물리화학적 특성.
표 27. 1ug/mL에서 표적화된 UO-1 또는 KC3-OA LNP에 대한 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
표 28. 0.1ug/mL에서 표적화된 UO-1 또는 KC3-OA LNP에 대한 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
형질 전환 활성에 대한 표적화 및 ICL 선택의 효과는 비표적화된 그리고 7.5mol% DSPS로 표적화된 LNP 모두를 사용하여 평가하였다(도 19). 이 연구에서 사용된 세 가지 ICL은 사용된 특정 이온화 가능한 아민(디메틸아미노에틸 또는 디에틸아미노에틸)에 따라 달라지는 디아실 구조(UO-1 또는 UO-1A)를 가지고 있었으며, 따라서 겉보기 pKa도 달랐다. 최종 ICL은 디옥살란 구조와 단일 올레핀을 갖는 KC3-OA와 함께 사용되었다. LNP를 함유한 UO-1 또는 UO-1A의 경우, 음이온성 인지질 DSPS를 제형에 포함시켰을 때 인간 수지상 세포의 형질 전환 활성이 유의하게 향상되었는데, mRNA 1μg/mL에서는 33.8-107.5배, 0.1μg/mL에서는 5.6-10.6배 향상되었다. 이는 포스파티딜세린이 형질 전환 활성에 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 능력을 보여준다. 또한, DSPS로 표적화된 KC3-OA LNP를 DSPS로 표적화된 UO-1 또는 UO-1A LNP와 비교했을 때, KC3-OA가 함유된 제형이 10배 이상 활성이 더 높았다. 1 ug/mL에서 이러한 차이는 16.4-22.8배였고, 0.1 μg/mL에서는 형질 전환 활성의 증가가 25.3-66.4배였는데, 이는 KC3-OA가 함유된 제형의 활성이 인간 수지상 세포를 형질 전환 시킴에 있어서 상당히 더 높다는 것을 시사한다.
실시예 31. PS로 표적화된 LNP를 발현하는 뮤린 수지상 세포에서 KC2 및 KC3 계열 지질의 비교
이 연구의 목적은 뮤린 수지상 세포에서 형질 전환 효율에 대한 다양한 KC2 및 KC3 ICL의 효과를 탐구하는 것이었다. KC2(DLin-KC2-DMA)와 KC3(DLin-KC3-DMA) 지질은 둘 다 올레핀 2개를 갖는 리놀레산 사슬을 가지고 있지만, 디옥솔란 고리에서 떨어져 나온 이온화 가능한 아민기가 다른데, KC2는 이 위치에 디메틸아미노에틸기를 가지고 있고 KC3는 이 위치에 디메틸아미노프로필기를 가지고 있다. 평가된 다른 두 가지 변형체는 길이가 18개의 탄소인 KC3-OA와 길이가 17개의 탄소인 KC3C17(8:1)을 갖는 단일불포화 알킬 사슬을 가지고 있다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는 ICL에서 표 29-30에 있는 이온화 가능한 지질을 사용하였고 N/P 비율은 5.25로 일정하였고, DPPS(NH4+ 염) 지질은 0 또는 5 mol%였으며, DSPC 인지질 상수는 10 또는 5 mol%(DPPS와 DSPC의 합계는 10 mol%)였고, 콜레스테롤 상수는 38.5 mol%였다.
표 29. 실시예 31에서 사용된 LNP의 물리화학적 특성.
표 30. 뮤린 수지상 세포에서의 mCherry 발현
형질 전환 활성에 대한 표적화 및 ICL 선택의 효과는 비표적화된 그리고 5mol% DSPS로 표적화된 LNP 모두를 사용하여 평가하였다(도 20). 이 연구에서 사용된 다섯 가지 ICL은 사용된 특정 이온화 가능한 아민에 따라 달라지는 디아실 구조를 가지고 있었으며, 따라서 겉보기 pKa도 달랐다. 이 데이터는 단일 올레핀을 함유하는 두 개의 KC3 지질인 KC3OA와 KC3C17(8:1)이 LNP에 통합되었을 때 가장 높은 활성을 보였다는 것을 보여준다. 5 mol% DPPS로 표적화된 LNP에 통합된 이들 두 지질은 KC3 지질을 함유하는 LNP 제형의 경우 185-282% 활성 내지 KC2 지질을 함유하는 LNP의 경우 1,087-1,227% 형질 전환 활성을 나타냈다. 이전에 Semple과 동료 연구진(Semple 외, (2010) Nature Biotech. 28 (2) 172-176)은 KC2가 KC3에 비해 활성이 6배 더 높다는 것을 보여주었고, 모든 지질은 DLinDMA에 대한 이전의 연구(Heyes 외, (2005) J Control Release 107, 276-287)를 기반으로 두 개의 cis 이중 결합을 갖는 리놀레일 지질이 상당히 덜 활성이 있을 것이라는 이해를 바탕으로 설계되었으며, 따라서 단일불포화 지질은 평가되지 않았다. 여기에서 데이터는 두 가지 다른 단일불포화 ICL인 KC3-OA와 KC3C17(8:1)을 사용하여 단일불포화 지질이 디리놀레일 사슬을 함유한 지질보다 명백히 더 우수하고, DPPS를 표적으로 하는 지질이 존재하더라도 완전히 불활성인 완전 포화 알킬 사슬(KC3C17)을 함유한 지질과 비교했을 때 우수하다는 것을 명확히 보여준다. 또한 상기 데이터는 이러한 새로운 지질들은 이러한 초기 연구에서 나온 주요 지질이자 가장 활성인 지질인 KC2(DLin-KC2-DMA)보다 훨씬 더 활성이었다. 마지막으로, DPPS와 이 두 단일불포화 ICL 중 하나로 구성된 LNP는 DPPS가 없는 유사한 LNP와 비교했을 때 6-10배의 표적화 효과를 보였다.
실시예 32. PS로 표적화된 LNP를 발현하는 인간 수지상 세포에서 KC2 및 KC3 계열 지질의 비교
이 연구의 목적은 인간 수지상 세포에서 형질 전환 효율에 대한 다양한 KC2 및 KC3 ICL의 효과를 탐구하는 것이었다. KC2(DLin-KC2-DMA)와 KC3(DLin-KC3-DMA) 지질은 둘 다 올레핀 2개를 갖는 리놀레산 사슬을 가지고 있지만, 디옥솔란 고리에서 떨어져 나온 이온화 가능한 아민기가 다른데, KC2는 이 위치에 디메틸아미노에틸기를 가지고 있고 KC3는 이 위치에 디메틸아미노프로필기를 가지고 있다. 평가된 다른 세 가지 변형체는, KC3-OA는 탄소 길이가 18개, KC3-PA는 탄소 길이가 16개, KC3C17(8:1)은 탄소 길이가 17개인 단일불포화 알킬 사슬을 가지고 있다. 본 연구의 목적은 KC3-OA와 KC3C17(8:1)을 함유하는 LNP들 모두를 사용하여 완전히 포화된 C16 DPPC와 완전히 포화된 DSPC를 비교하여 PC 성분이 형질 전환에 미치는 영향을 평가하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는 표 31-33에 있는 이온화 가능한 지질을 사용하였고 ICL은 N/P 비율이 5.25 및 48 mol%로 일정하게 유지하였으며, DPPS(NH4+ 염) 지질은 5 mol%로 포함되었고 DSPC 인지질은 5 mol%로 일정하게 유지되었으며(DPPS와 DSPC/DPPC의 합계는 10 mol%임), 콜레스테롤은 38.5 mol%로 일정하게 유지되었다. 최종 ALC-0315/DSPC 제형은 46.3 mol% ALC-0315, 9.4 mol% DSPC, 42.7 mol% 콜레스테롤 및 1.56 mol% PEG-DMG로 구성되었으며 N/P는 6.2였다. 최종 SM-102/DSPC 제형은 50 mol% SM-102, 10 mol% DSPC, 38.5 mol% 콜레스테롤 및 1.5 mol% PEG-DMG로 구성되었으며 N/P는 5였다.
표 31. 실시예 32에서 사용된 LNP의 물리화학적 특성.
표 32. 1 μg/ml에서 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
표 33. 0.1 μg/ml에서 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
형질 전환 활성에 대한 표적화 및 ICL 선택의 효과는 비표적화된 그리고 5mol% DPPS로 표적화된 LNP 모두를 사용하여 평가하였다(도 21). 이 연구에서 사용된 다섯 가지 ICL은 사용된 특정 이온화 가능한 아민에 따라 달라지는 디아실 구조를 가지고 있었다. 이 데이터는 단일 올레핀을 갖는 세 가지 KC3 지질, KC3OA, KC3-PA 및 KC3C17(8:1) 또는 두 올레핀 사이에 네 개의 메틸렌을 갖는 다중불포화 KC3-01 지질이 LNP에 통합되었을 때 가장 높은 활성을 보였다는 것을 보여준다(표 32 및 33). 이들 네 가지 지질은 인간 수지상 세포에서 1 μg/ml에서 KC3를 함유한 LNP와 비교했을 때 형질 전환 활성이 4.7-10.8배 증가하고, 0.1 μg/ml에서 3.8-7.5배 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 증가는 KC2를 함유하는 표적화된 LNP와 비교했을 때 10-12배 더 높았다. KC2와 KC3는 모두 리놀레오일 알킬 사슬(하나의 메틸렌에 의해 분리된 두 개의 올레핀)을 함유하고 있다. 이전에 Semple과 동료 연구진(Semple 외, (2010) Nature Biotech. 28 (2) 172-176)은 KC2가 KC3에 비해 활성이 6배 더 높다는 것을 보여주었고, 모든 지질은 DLinDMA에 대한 이전의 연구(Heyes 외, (2005) J Control Release 107, 276-287)를 기반으로 두 개의 cis 이중 결합을 갖는 리놀레일 지질이 상당히 덜 활성이 있을 것이라는 이해를 바탕으로 설계되었으며, 따라서 단일불포화 지질은 평가되지 않았다. 여기서 데이터는 세 가지 다른 단일불포화 ICL인 KC3-OA, KC3-PA 및 KC3C17(8:1)을 사용하였을 경우 단일불포화 지질이 디리놀레일 사슬을 함유한 지질보다 명백히 우수하다는 것을 명확히 보여준다. 그러나 두 농도 모두에서 가장 큰 개선은 두 올레핀 사이에 4개의 메틸렌을 포함하는 KC3-01 ICL을 사용했을 때 나타났다. 또한 이들 데이터는 이러한 새로운 지질은 이 초기 작업에서 나온 주요 지질이자 가장 활성이 높은 지질인 KC2(DLin-KC2-DMA)보다 훨씬 활성이 높았고, ALC-0315나 SM-102를 함유한 LNP와 비교되었다. 마지막으로, DPPS와 KC3-OA 또는 KC3-C17(8:1) ICL로 구성된 DPPS로 표적화된 LNP 두 개가 포스파티딜콜린 성분으로 C16 DPPC 또는 C18 DSPC를 사용하여 평가되었다. 두 가지 제형 모두에서 DSPC를 함유하는 제형은 DPPC 제형에 비해 인간 수지상 세포에서 더 높은 형질 전환 활성을 보였는데, 0.1 μg/mL에서는 2.61-2.82배, 1 μg/mL에서는 2.35-3.60배 더 높았다. 이는 LNP를 함유한 DSPC가 DPPC와 같은 낮은 상전이 지질에 비해 더 강력한 형질 전환 활성을 제공한다는 것을 의미한다.
실시예 33. PS로 표적화된 LNP의 ICL 농도가 인간 수지상 세포에서의 발현에 미치는 영향
본 연구의 목적은 DSPS로 표적화된 LNP의 KC3-OA 농도가 인간 수지상 세포의 형질 전환 효율에 미치는 영향을 조사하는 것이다. KC3-OA의 농도는 46-54 mol%로 다양하게 조절하였고, DSPS와 DSPC 농도는 각각 5 mol%로, PEG-DMG는 1.5 mol%로 일정하게 유지하였다. KC3OA의 % 증가는 콜레스테롤 %의 비례적 감소와 상응했다. ALC-0315와 SM-102 비교 제형들 또한 평가되었다. 최종 ALC-0315/DSPC 제형은 46.3 mol% ALC-0315, 9.4 mol% DSPC, 42.7 mol% 콜레스테롤 및 1.56 mol% PEG-DMG로 구성되었으며 N/P는 6.2였다. 최종 SM-102/DSPC 제형은 50 mol% SM-102, 10 mol% DSPC, 38.5 mol% 콜레스테롤 및 1.5 mol% PEG-DMG로 구성되었으며 N/P는 5였다.
실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 28에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다.
표 34. 다양한 농도의 KC3-OA를 함유한 DSPS 표적 KC3-OA LNP의 물리화학적 특성 및 특성화
모든 DSPS로 표적화된 KC3-OA 제형은 약 100-120nm의 입자 크기와 90% 이상의 캡슐화 효율을 보였다. 모든 입자는 -80℃에서 동결 및 해동에 안정적이었다. 46-54 mol % 범위에서 사용된 KC3-OA 농도가 이러한 특성에 미치는 명백한 영향은 없었다.
표 35. 1μg/ml에서 인큐베이션 후 다양한 농도의 KC3-OA를 함유한 DSPS로 표적화된 KC3-OA LNP에 대한 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
표 36. 0.1μg/ml에서 인큐베이션 후 다양한 농도의 KC3-OA를 함유한 DSPS로 표적화된 KC3-OA LNP에 대한 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
46-54 mol% 농도 범위의 KC3-OA로 구성된 5 mol% DSPS로 표적화된 LNP를 사용하여 표적화 및 ICL 선택이 형질 전환 활성에 미치는 영향을 평가했다(도 22). 이 표적화 조성물은 0.1 및 1 ug/mL 모두의 모든 KC3-OA 농도에서 높은 활성을 나타냈으며 48-50 mol % KC3-OA에서만 약간의 피크를 나타냈다. 그러나 이러한 DSPS로 표적화된 KC3-OA LNP 제형의 모든 변형체들은 SM-102/DSPC 또는 ALC-0315/DSPC 대조군보다 훨씬 더 활성이 높았다(표 34-36).
실시예 34. PS로 표적화된 LNP의 N/P 비율이 인간 수지상 세포의 발현에 미치는 영향
본 연구의 목적은 DSPS로 표적화된 KC2-01 LNP의 N/P 비율 변화가 인간 수지상 세포의 형질 전환 효율에 미치는 영향을 조사하는 것이었다. DSPS와 DSPC 농도를 각각 5 mol%로, KC2-01 농도를 50 mol%로, PEG-DMG 농도를 1.5 mol%로 일정하게 유지하면서 N/P 비율을 4-7까지 변화시켰다. ALC-0315와 SM-102 비교 제형들 또한 평가되었다. 최종 ALC-0315/DSPC 제형은 46.3 mol% ALC-0315, 9.4 mol% DSPC, 42.7 mol% 콜레스테롤 및 1.56 mol% PEG-DMG로 구성되었으며 N/P는 6.2였다. 최종 SM-102/DSPC 제형은 50 mol% SM-102, 10 mol% DSPC, 38.5 mol% 콜레스테롤 및 1.5 mol% PEG-DMG로 구성되었으며 N/P는 5였다.
실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 28에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다.
표 37. 다양한 N/P 비율의 KC2-O1을 함유하는 DSPS로 표적화된 KC2-O1 LNP의 물리화학적 특성 및 특성화
모든 DSPS로 표적화된 KC2-O1 제형은 약 76-85nm의 입자 크기와 80% 이상의 캡슐화 효율을 보였다. 모든 입자는 -80℃에서 동결 및 해동에 안정적이었다. 4-7 범위로 사용된 N/P가 이러한 특성에 미치는 명백한 영향은 없었다.
표 38. 0.1μg/ml에서 인큐베이션 후 다양한 N/P 비율의 KC2-O1을 함유하는 DSPS로 표적화된 KC2-O1 LNP에 대한 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
4-7의 비율로 KC2-O1을 포함하는 5 mol % DSPS로 표적화된 LNP를 사용하여 표적화 및 N/P 비율이 형질 전환 활성에 미치는 영향을 평가했다(도 23). 이러한 표적화된 조성물은 모든 N/P 비율에서 높은 활성을 보였지만, N/P가 5에서 N/P가 4로 감소하면서 약 3배의 감소를 보였다. 표적화 대 비표적화(T/NT) 비율은 N/P = 5에서 명확한 피크를 나타냈다(표 38).
실시예 35. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 mRNA 백신 구조체들의 면역원성에 대한 이온화 가능한 지질의 영향.
마우스 및 연구 설계. 암컷 BALB/c 마우스를 Charles River Laboratories에서 구입하여 적어도 4일 동안 동식물 사육장에서 적응시켰으며 연구 시작 시 6-8주령이었다. 0 연구일(SD)에 마우스들에게 50mL 용량의 백신 후보물질 1mg(수량은 mRNA를 나타냄)을 왼쪽 뒤쪽 허벅지 근육 내 주사했다. 연구 군은 5마리의 마우스로 구성되었으며, 대조군, 비교 백신, 실험 백신 후보가 포함되었다. 21일 후에 마우스에 동일한 백신 후보를 두 번째 주사했다. 혈액은 턱밑 천자를 통해 수집하거나 마지막에는 심장 천자를 통해 수집하였고, 혈청이나 혈장은 SD 21과 34(부스트 투여 후 +13일차)에 마우스에서 단리했다. 항체 역가를 분석하기 전까지 샘플은 -80℃에서 보관되었다.
mRNA의 설계 및 준비. SARS-CoV-2 전장 스파이크 단백질을 인코딩하고 BNT162b2(Comirnaty) 백신에 사용된 것과 동일한 UTR이 측접한 mRNA를 Vernal Biosciences에서 구입했다. 모든 우리딘 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘으로 치환되었다. mRNA를 생성하기 위해, mRNA 서열(VRN029; 서열번호 2, 도 13A)을 인코딩하는 합성 유전자를 DNA 플라스미드에 클로닝하였다. 합성 유전자는 RNA 프로모터, 5' 비번역 영역, SARS-COV2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인, 3' 비번역 영역 및 약 120A의 폴리(A) 테일 영역으로 구성되었다. 플라스미드는 대장균의 배양물에서 증식 및 확장된 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정화된 대장균 용해물로부터 단리되었다. 정제된 플라스미드는 폴리(A) 테일 인코딩 영역의 말단의 부위에서 절단하는 유형 IIs 제한 효소를 사용하여 선형화되었다. 그런 다음 그 플라스미드를 뉴클레오티드 트리포스페이트, RNA 중합효소 및 RNase 억제제가 있는 완충액에서 인큐베이션했다. 반응을 중단시키기 위해, 선형 플라스미드 템플릿을 절단하는 DNase I을 첨가했다. 이어서 캡핑되지 않은 RNA를 크로마토그래피를 사용하여 정제한 다음 GTP, S-아데노실메티오닌, 구아날릴트랜스퍼라제, 2'-O-메틸트랜스퍼라제 및 RNase 억제제와 함께 또 다른 완충액에서 인큐베이션하였다. 이어서, 캡핑된 mRNA를 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 완충액을 물로 교환하고, 바이알에 채웠다.
mRNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)의 생성. 각각의 지질의 스톡 용액을 준비했다. 이온화 가능한 지질을 4mL 유리 바이알(Thermo B7999-2)에서 계량하고 최종 농도 10mM이 되도록 에탄올(Sigma-Aldrich 200 proof, RNase 없음)에 용해시켰다. DSPC(Avanti Polar Lipids), 콜레스테롤(Dishman) 및 PEG-DMG(NOF)와 같은 다른 지질을 계량하고 에탄올에 1mM의 농도로 용해시켰다. DSPS-Na (NOF)는 1mM의 농도로 메탄올(Sulpelco, Omnisolve)에 용해되었고 잠시 70℃로 가열하여 용해를 완료하였다. DPPS-NH4(Avanti Polar Lipids)를 에탄올에 직접 용해한 후 다른 지질 성분들과 함께 실온에서 혼합했다.
각각의 개별 LNP에 대한 지질 혼합물은 원하는 부피의 각 지질 스톡 용액을 새로운 바이알에 첨가하고, 필요에 따라 1.2mL의 최종 부피를 달성하도록 에탄올을 첨가하여 준비되었다. 모든 제형에는 PC 및 PS 성분이 5 mol%, 콜레스테롤이 40.5 mol%, PEG-DMG가 1.5 mol%, ICL이 48 mol%로 함유되어 있었으며, N/P 비율은 5.25로 일정했다. 예를 들어, N/P가 5.25인 KC3-PA/DPPC/DPPS/Chol/PEG-DMG(48/5/5/40.5/1.5 mol%)의 LNP 제형은 사용된 mRNA 100μg당 1575 nmol KC3-PA, 164.1 nmol DPPC, 164.1 nmol DPPS, 1296.1 nmol Chol 및 82 nmol PEG-DMG를 함유하였다. 동결된 mRNA(SARS-CoV-2 스파이크 mRNA, Vernal) 바이알을 해동시키고 mRNA를 6.25mM 아세트산나트륨(pH 5.0)에서 최종 농도 0.033mg/mL로 희석하여 mRNA 용액을 준비했으며, 여기서 농도는 Nanodrop에서 흡광도로 확인된다.
LNP를 준비하기 위해, NanoAssemblr Benchtop 미세유체 장치(Precision Nanosystems)를 사용했다. LNP에 DSPS가 포함된 경우, 70℃로 설정된 가열 블록 액세서리를 사용하고 그렇지 않은 경우 LNP를 실온에서 혼합했다. mRNA 용액 3mL를 3mL 일회용 주사기(BD 309656)에 넣고 지질 혼합물 1ml를 1ml 주사기(BD309659)에 넣고 혼합하기 전에 4분 동안 NanoAssemblr 가열 블록에 두었다. LNP는 6 mL/분의 혼합 속도에서 3:1 수성:알코올 부피 비율로 액체 스트림을 일회용 마이크로유체 카세트를 통해 펌핑하여 형성되었다. 혼합 후, 3.6mL의 LNP 혼합물을 수집하고 초기 혼합 부피 0.35mL와 마지막 0.05mL의 혼합물을 버렸다. 에탄올은 PBS(Cytivia, SH30256.01)에서 SpectraPor 투석 튜브(12-14k MWCO)를 사용하여 완충액 교환에 의해 제거되었다. LNP는 일반적으로 pH 7.4의 PBS로 교환된 다음 15mM Tris, pH 7.4, 20% 수크로스로 교환되고, 20-50ug/mL mRNA로 농축되고, 멸균 여과(Thermo Nalgene 0.2um #720-1320)한 후 액체 질소에 5분 동안 담가 동결시키고 -20℃에서 장기간 보관했다. 이 연구를 위해 샘플을 >40 μg/mL mRNA로 농축하고 다양한 부피의 15 mM Tris, 20% Sucrose, pH 7.4로 희석하여 목표 농도 40 μg mRNA로 만든 다음 LN2에서 동결시켰다. LNP의 분취물을 해동시키고 pH 7.4의 15mM Tris로 1:1(부피:부피)로 희석하여 최종 농도가 15mM 트리스, 10% 수크로스, pH 7.4 중에서 20μg/mL mRNA가 되도록 한 후에, LNP의 특성화에 착수했다. 이는 뒷다리에 IM 주입을 통해 50 μL 부피의 1 μg mRNA를 동물에게 투여하기 전에 수행되었던 샘플 준비 조건들을 시뮬레이션한 것이다.
LNP 특성화. LNP 내 mRNA 캡슐화 및 mRNA 농도는 Ribogreen 분석을 사용하여 측정되었다. 나노 입자 크기와 제타 전위는 제타사이저(Malvern)로 측정했다.
SARS-CoV-2 항스파이크 항체 역가. SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 총 IgG 결합 항체에 대한 혈청 샘플을 분석하기 위해 표준 간접 ELISA를 수행했다. Nunc MaxiSorp 96웰 플레이트에 1x PBS(pH 7.4)에 5 nM로 희석한 SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1) 스파이크 단백질(Sino Biological, 카탈로그 번호 40589-V08B1) 75 μL를 코팅하고, 덮은 후 4℃에서 16-18시간 동안 정적으로 인큐베이션했다. 결합되지 않은 코팅 항원은 BioTek 405 TS 플레이트 세척기를 사용하여 300 μL PBS + 0.05% Tween-20으로 플레이트를 3번 세척하여 제거했다. 그런 다음 플레이트를 PBS + 5% w/v 무지방 탈지유(Research Products International, 카탈로그 번호 M17200-1000.0)에 1시간 동안 37℃에서 차단시켰다. 테스트 및 양성 대조 샘플은 검정 희석액(PBS, 0.05% Tween-20, 1% 무지방 탈지유)에 1:20 또는 1:40의 초기 희석비로 희석한 다음 U형 바닥 희석 플레이트를 사용하여 4배 연속 희석했다. 차단이 완료되면, 차단 완충액을 역전법으로 제거하고, 플레이트를 종이 타월로 닦아내고, 각 샘플을 2회씩 도말했다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 정적 인큐베이션 후 300 μL로 3번 세척했다. 검정 희석액에 2차 검출 항체(염소 항-마우스-HRP IgG, Abcam, 카탈로그 번호 ab6789) 100mL를 1:10,000(1.33 nM 농도)의 희석률로 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 정적으로 인큐베이션 후, 결합되지 않은 항체는 플레이트 역전법으로 제거한 후 300 uL로 3번 세척했다. 현상을 위해 100μL의 실온의 1단계 Ultra TMB 기질(ThermoFisher, 카탈로그 번호 34028)을 각 웰에 추가하고 50μL의 TMB 정지 용액(ThermoFisher 카탈로그 번호SS04)으로 약 10분 후에 반응을 정지시켰다. BioTek Synergy Neo 2 분광광도계를 사용하여 450nm에서 30분 이내에 플레이트를 판독했다. 역가는 적정 곡선의 선형 부분에서 흡광도 신호를 생성하는 희석의 역수로 정의되었다.
표 39. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 mRNA 백신 구조체의 면역원성을 평가하는 데 사용되는 LNP의 물리화학적 특성
mRNA-LNP 면역원성에 대한 이온화 가능한 지질 조성의 영향을 평가하기 위해, BALB/c 마우스를 상이한 이온화 가능한 지질(KC3, KC3-OA, 및 KC3-PA)을 포함하는 mRNA-LNP로 면역화하였다. 프라임 후 21일차 및 부스트 후 13일차(연구 34일차)에 혈장을 수집하였다. 총 항-스파이크 결합 IgG 항체 역가는 ELISA를 통해 결정되었다. 통계 분석에 앞서 역수 항체 역가 데이터(Reciprocal antibody titer data)를 로그 변환했다. 각 군을 Dunnett의 다중 비교 사후 검정과 함께 일원 ANOVA를 사용하여 비교하였다. 이온화 가능한 지질인 KC3-OA 또는 KC3-PA를 사용하여 제조한 LNP는 투여 후 21일차(도 24A) 및 부스트 후 13일차(연구 34일차)(도 24B) 모두 디리놀레오일 KC3(DLin-KC3-DMA 또는 KC3만 해당)를 함유한 LNP보다 우수한 항체 반응을 유도했다.
실시예 36. DPPS 및 DSPS의 암모늄염 제조
500ml의 CHCl3에 1.5g의 PS 나트륨염(DPPS-Na 또는 DSPS-Na)을 용해시킨다. 메탄올: 물(CMW)을 1:3:1(부피 기준)로 혼합하고, 물에 1M NH4Cl을 첨가하여 분별깔때기에서 단일상 용액을 만든다. 3-5분간 저어주고, PS가 완전히 용해되지 않았다면 최소한의 열을 가한다. CHCl3와 증류수(각각 약 200mL)를 넣고, 두 개의 상이 깨끗하게 분리될 때까지 2-3분간 깔때기를 흔든다. 바닥층을 수집하여 물 중의 1M NH4Cl과 CMW 1:1:1(부피 기준)로 재분획시킨다. 바닥층을 모아 두 개의 상이 깨끗하게 분리될 때까지 깨끗한 메탄올-물로 2번 세척한다(메탄올의 부피는 CHCl3 부피의 50%이고 물의 부피는 클로로포름과 메탄올 총 부피의 20%임). 진공 상태에서 용매를 제거하고 시클로헥산에서 동결 건조시킨다. 수율 1.2 g.
실시예 37. 에탄올에 대한 포스파티딜세린 염의 겉보기 용해도
에탄올에서 포스파티딜세린염의 겉보기 용해도는 진탕 플라스크 기술을 통해 결정되었다. 분말 형태의 포스파티딜세린의 나트륨과 암모늄염은 Avanti Polar Lipids(Alabama, 미국)에서 구입했다. 포스파티딜세린 염 분말의 일부를 12x75 붕규산 유리관에 3회 반복으로 넣었다. 200 순도의 에탄올(카탈로그 번호 E-7023, MilliporeSigma, 미국) 3 mL을 첨가하고, 튜브를 폴리에틸렌 스냅 캡으로 닫은 다음, 볼텍스 믹서를 사용하여 10-15초 동안 교반하여 균일한 현탁액을 얻고, 실온(20-22℃)에서 흔들림이 있는 플랫폼 위에 수평으로 놓아 하룻밤 두었다. 인큐베이션 종료시 주변 온도는 20.4-20.9℃였다. 24시간 인큐베이션 후, 현탁액을 고체상이 있는지 육안으로 확인한 다음 중력에 의해 침전시키고 상층액을 0.2-μm PTFE 주사기 멤브레인 필터로 통과시켰다. 여과액의 처음 0.5ml를 버리고, 다음 1ml를 수집한 후 여과액의 포스파티딜세린을 다음과 같이 인지질 인산염 분석법을 통해 정량화했다: 여과액 20 μL를 유리관에 3회 반복으로 넣고, 에탄올을 아르곤 흐름에서 70℃에서 증발시키고, 잔류물을 농축 황산 60 μL와 30% 과산화수소 20 μL의 혼합물에 넣고 180-190℃에서 10분간 분해하였다. 분해된 샘플을 1 mL의 탈이온수로 희석한 다음, 10% 소듐 설페이트 20 μL를 첨가하여 잔류 과산화물을 파괴하고, 샘플을 끓는 물에서 15분 동안 인큐베이션하여 응축된 인산염 종을 가수분해했다. 샘플들을 실온까지 냉각시킨 다음, 2% (w/w) 몰리브덴산 암모늄 용액 0.2 mL와 10% (w/w) 아스코르브산 용액 20 μL와 혼합하고, 끓는 수조에서 10분간 인큐베이션 후 실온의 수조에서 냉각시켰다. 인산염 농도는 NIST 추적 가능한 상업용 인산염 표준 용액을 희석하여 0 - 2 mM 범위의 인산염을 포함하도록 준비한 동시 실행 표준으로부터 5점 표준 곡선을 사용하여 825 nm에서 형성된 청색 인산몰리브덴산의 광학 밀도로부터 결정되었다(결정 계수 R2 >0.9999). 포스파티딜세린 염의 용해도는 포스파티딜세린의 몰 농도 단위로 표현되었다(표 40). 데이터는 평균 ±SD(N=3)이다.
표 40. 실온의 100% 에탄올에서 포스파티딜세린염의 용해도.
디팔미토일포스파티딜세린(DPPS)의 암모늄염은 예상치 못하게도 디스테아로일포스파티딜세린(DSPS)의 암모늄염이나 이들 화합물의 나트륨염보다 몇 배나 더 높은 에탄올 용해도를 보였다.
실시예 38. PEG-스테아르산, N/P 및 ICL이 인간 수지상 세포의 형질 전환 효율에 미치는 영향
본 연구의 목적은 DSPS로 표적화된 LNP의 KC3-OA 농도와 N/P 비율의 변화가 인간 수지상 세포의 형질 전환 효율에 미치는 영향을 조사하는 것이었다. 또한, PEG-DMG를 PEG-스테아르산(PEG-SA)(BroadPharm, BP-26262)으로 총 지질의 1 및 3 mol%로 대체한 효과를 비교하였다.
KC3-OA의 농도는 45-48 mol%로 다양하게 조절하였고, DSPS와 DSPC 농도는 각각 5 mol%로, PEG-DMG는 1.5 mol%로 일정하게 유지하였다. KC3OA의 % 증가는 콜레스테롤 %의 비례적 감소와 상응했다. 45 mol% KC3OA를 일정하게 유지하면서 N/P를 0.5 단위로 5-6.5까지 변화시켰다. 어떤 경우에는 PEG-DMG가 PEG-스테아르산으로 대체되었다. ALC-0315와 SM-102 비교 제형들 또한 평가되었다. 최종 ALC-0315/DSPC 제형은 46.3 mol% ALC-0315, 9.4 mol% DSPC, 42.7 mol% 콜레스테롤 및 1.56 mol% PEG-DMG로 구성되었으며 N/P는 6.2였다. 최종 SM-102/DSPC 제형은 50 mol% SM-102, 10 mol% DSPC, 38.5 mol% 콜레스테롤 및 1.5 mol% PEG-DMG로 구성되었으며 N/P는 5였다.
실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 28에 기재된 바와 같이 인간 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다.
표 41. 실시예 38에서 사용된 다양한 N/P 비율, 다양한 ICL 농도 및 PEG-SA 농도에서 DSPS로 표적화된 KC3-OA LNP의 물리화학적 특성 및 특성화
모든 DSPS로 표적화된 KC3-OA 제형은 1.5 mol % PEG-DMG로 제형화되었을 때 약 90 nm의 입자 크기와 90% 이상의 캡슐화 효율을 보였다. 그러나 PEG200-스테아르산(PEG-SA) 1 또는 3 mol%를 PEG-DMG 1.5 mol%로 대체했을 때 크기가 약 140nm로 유의하게 증가했다. 모든 입자는 pH 7.4에서 약간의 음 제타 전위를 보였고, pH 5에서는 12.5-23 mV 사이의 제타 전위를 보였다.
표 42. 1 μg/ml에서 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
표 43. 0.1 μg/ml에서 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
43-48 mol% 농도 범위의 KC3-OA(도 25A-25B) 및 5-6.5의 N/P를 포함하는 5 mol% DSPS로 표적화된 LNP를 사용하여 표적화 및 ICL 선택이 형질 전환 활성에 미치는 영향을 평가했다. N/P 5 및 6의 LNP 제형과 45 mol% KC3-OA도 1 및 3 mol%의 PEG-SA로 제조되었고 1.5 mol% PEG-DMG를 사용한 유사 제형과 비교했다. 모든 제형이 높은 활성을 보였지만, PEG-DMG가 함유된 제형은 PEG-SA가 함유된 제형보다 약 30-40% 더 높은 형질 전환률을 보였다. 해당 제형은 43 내지 48 mol% KC3-OA로 갈수록 형질 전환률이 더 높아지는 경향을 보였다. 이 DSPS로 표적화된 KC3-OA LNP 제형의 모든 LNP 변형은 평가된 두 농도 모두에서 SM-102/DSPC 또는 ALC-0315/DSPC 대조군보다 유의하게 활성이 더 높았다(표 42 및 43).
실시예 39. 음이온성 인지질을 이용한 인간 수지상세포 표적화
본 연구의 목적은 DSPS 양을 증가시키면서 AKG-UO-1 기반 LNP를 표적하는 효과를 조사하여 최적의 조성을 정의할 수 있는지 확인하는 것이었다. 또한, 포스파티딜세린 조성을 일정하게 유지하면서 L-DSPS, L-DPPS, L-DOPS, L-DMPG의 나트륨염과 DSPS의 D 이성질체를 비교하였다. 또한, DSPG(Avanti Polar Lipids #840465), DSPE-글루라르산(BroadPharm, BP-26158) 및 DSPE-숙시닐(Avanti Polar Lipids)의 나트륨염을 함유하는 AKG-UO-1 LNP를 제조하고 인간 수지상 세포에서의 형질 감염 효율을 결정함으로써 포스파티딜세린의 표적화 효과를 다른 음이온성 지질의 잠재적인 표적화 효과와 비교했다.
KC3-OA의 농도는 50 mol%로 일정하게 유지하였고, 총 인지질 농도는 10 mol%로 일정하게 유지하였으며, 콜레스테롤 조성은 38.5 mol%로 일정하게 유지하였고, PEG-DMG 농도는 1.5 mol%로 일정하게 유지하였다. 모든 샘플의 N/P 비율은 5였다. DSPS 함량의 증가는 DSPS 비율의 비례적 감소에 상응하였고, 음이온성 지질은 DSPC가 비례적으로 감소함과 동시에 포함되었다.
실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 28에 기재된 바와 같이 인간 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다.
표 44. 실시예 39에서 사용된 LNP의 물리화학적 특성 및 특성화.
인간 수지상 세포에서 다양한 음이온성 인지질로 표적화된 이러한 UO-1 함유 LNP에 대한 발현 데이터는 1μg/mL mRNA 농도의 경우 도 26A에, 0.1μg/mL 농도의 경우 도 26B에 도시되어 있다. 이 연구들은 DPPS나 DSPS를 통합한 LNP가 포스파티딜세린을 전혀 포함하지 않은 LNP에 비해 현저히 더 높은 발현을 보였으며, 이들 두 가지 포화 PS 유사체가 C14 포화 DMPS와 C18 단일 불포화 DOPS를 포함한 LNP보다 우수하다는 것을 보여준다. 놀랍게도 LNP에 DSPG를 포함시키면 DSPS나 DPPS와 마찬가지로 0.1 및 1 ug/mL에서 모두 발현이 동일하게 증가했지만 Glu-DSPE나 Suc-DSPE는 발현이 개선되지 않았다. 놀랍게도, 뮤린 수지상 세포를 포함하는 LNP에서 인지질글리세롤(PG)을 사용하는 것이 이점이 없다는 사실이 밝혀진 반면(실시예 15), 본 실시예에서 제공하는 결과는 PG를 LNP에 포함시키면 인간 수지상 세포의 형질 전환을 획기적으로 개선할 수 있고 그에 따라 인간 LNP 백신의 유용한 성분이 될 수 있음을 보여준다.
실시예 40. 포스파티딜글리세롤을 이용한 인간 수지상세포 표적화
본 연구의 목적은 다양한 밀도의 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG)과 함께 UO-1 또는 KC3-01 ICL을 함유하는 표적화 LNP가 인간 수지상 세포의 형질 전환 효율에 미치는 영향을 조사하는 것이었다. DSPG는 총 지질 함량의 0-10 mol% 범위의 밀도로 LNP에 통합되었다. 대조 LNP에는 표적 지질로 이전에 확립된 5 mol %의 DSPS를 포함하는 KC3-OA LNP와 LNP를 함유한 비표적 SM-102 또는 ALC-0315가 포함되었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 28에 기재된 바와 같이 인간 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는 ICL에서 표 45에 있는 이온화 가능한 지질을 사용하였고 N/P 비율은 5.25, 48 mol%로 유지되었으며, DSPG(Na+ 염) 지질은 0-10 mol%로 포함되었으며, DSPC 인지질은 10 mol% - 포함되는 DSPG mol%(DSPG와 DSPC의 합계는 10 mol%)로 유지되었고, 콜레스테롤은 40.5 mol%로 유지되었다. PEG-DMG는 모든 제형에서 1.5 mol%로 일정하게 유지되었다. 최종 ALC-0315/DSPC 제형은 46.3 mol% ALC-0315, 10 mol% DSPC, 42.7 mol% 콜레스테롤 및 1.5 mol% PEG-DMG로 구성되었다. SM-102/DSPC 제형은 50 mol% SM102, 10 mol% DSPC, 38.5 mol% 콜레스테롤 및 1.5 mol% PEG-DMG로 구성되었다.
표 45. 실시예 40에서 사용된 LNP의 물리화학적 특성 및 특성화.
표 46. 1 μg/ml에서 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
표 47. 0.1 μg/ml에서 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
두 개의 서로 다른 LNP를 DSPG로 표적화하는 것이 형질 전환 활성에 미치는 영향을 0-10 mol% DSPG 표적화 LNP를 사용하여 평가했다(도 27A-27B). LNP를 포함하는 UO-1의 경우 최적 DSPG 농도는 1 및 0.1 ug/ml 모두에서 5 mol%였으며, 1 ug/ml에서 34.8 배의 표적화 효과를 보였고 0.1 ug/ml에서 표적화되지 않은 LNP보다 81배 개선되었다. LNP를 함유한 KC3-01의 경우, 최적 DSPG 농도는 0.1 ug/mL의 경우 5 mol%였지만, 1 ug/mL의 더 높은 농도에서는 1.25-5 mol%의 더 넓은 피크를 보였으며, 1 ug/mL에서 2.4배, 0.1 ug/mL의 더 낮은 농도에서 12.5배의 표적화 효과를 보였다. 피크 표적화 LNP들 모두 비표적화 ALC-0315 및 SM-102 LNP에 비해 증가된 형질 전환 활성을 보였으며(표 46 및 47), 1 ug/mL에서 DSPG 표적화 KC3-01 LNP의 경우 ALC-0315와 비교해 최대 102.6% 증가하고, 0.1 ug/mL에서 최대 247.6배 증가했다. SM-102 LNP에 비해 개선된 정도는 5 mol% DSPG 표적화 KC3-01 LNP의 경우 최대 38.50배, DSPS 표적화 KC3-OA LNP 대조군의 경우 최대 48배였다. 이 데이터는 DSPG가 인간 수지상 세포의 형질 전환 효율을 높이는 강력한 표적화 음이온성 지질이 될 수 있으며, 따라서 인간 지질 나노입자 기반 백신에 포함될 수 있음을 보여준다. 데이터에 따르면 LNP의 PG 표적화는 ICL의 KC3 계열과 조합 시 매우 효과적이다. 이러한 결과는 매우 음전하를 띤 음이온성 인지질을 이와 경쟁하는 음전하를 띠는 핵산을 또한 포함하고 있는 LNP에서 사용한 점을 감안하면 예상치 못한 것이었다. 이러한 결과는 LNP에 DSPG를 포함시키는 것이 뮤린 수지상 세포의 흡수에 영향을 미치지 않는다는 점에 비추어 볼 때 놀랍기도 했다(실시예 15).
실시예 41. KC3-PA 기반 LNP 제형에서 헬퍼 지질로서 DSPC와 DPPC의 비교
본 연구의 목적은 KC3-PA DPPS로 표적화된 그리고 비표적화된 LNP에서 DSPC와 DPPC를 비교하여 조사하는 것이다. KC3-OA의 농도는 48 mol%, 콜레스테롤은 40.5 mol%, PEG-DMG는 1.5 mol%이었다. 인지질 조성은 10 mol%로 일정하게 유지했지만, DPPS로 표적화된 경우 DPPS 농도는 5 mol%이고 DSPC 또는 DPPC는 5 mol%였다. 모든 제형의 N/P는 5.25였다.
LNP는 실시예 9에 설명된 대로 제조되었고, 실시예 10에 설명된 대로 투석으로 에탄올을 제거한 후와 멸균 여과 후 입자 크기, mRNA 농도, %mRNA 포집률을 특성화했다.
표 48. KC3-PA 표적화된 및 비표적화된 LNP의 물리화학적 특성 및 특성화
LNP가 준비되고 투석을 통해 에탄올이 제거되면, 상기 제형들을 평가하는 또 다른 지표를 제공하기 위해 여과 전후의 mRNA 농도를 측정하였다. LNP의 멸균 여과 효율이 높으면 mRNA 손실이 최소화되고 막 오염과 생성물 수율 저하가 없어져 유리하다. 비표적화된 군에서, DSPC 샘플에서의 mRNA 복구가 DPPC에 비해 2.8배 향상되었고, 표적화된 군에서는 mRNA 복구가 2.4배 증가한 것을 발견했다. 이는 DSPC가 5 mol% DPPS가 있거나 없는 DPPC보다 KC3-PA가 포함된 제형에서 더욱 적합한 헬퍼 지질임을 시사한다.
실시예 42. PS 표적화된 LNP의 UO-1, UO-6, UO-7의 뮤린 수지상 세포에서의 발현 비교
본 연구의 목적은 DSPS로 표적화된 그리고 비표적화된 LNP로 제형화했을 때, 뮤린 수지상 세포에서 일련의 이온화 가능한 지질 유사체의 형질 전환 활성을 비교하는 것이었다. AKG-UO-1, AKG-UO-6 및 AKG-UO-7은 mCherry 인코딩 mRNA를 사용하여 5의 N/P 이내에서 10% 인지질, 38.5 mol% 콜레스테롤, 1.5 mol% PEG-DMG를 함유하는 50 mol%의 LNP로 제형화되었다. DSPS를 추가하면 제형에 포함된 DSPC의 mol%가 이에 비례하여 감소한다.
실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다.
표 49. UO-1, UO-6 또는 UO-7을 포함하는 DSPS 표적화된 LNP의 물리화학적 특성 및 특성화
7.5% DSPS와 세 가지 다른 ICL, UO-1, UO-6, UO-7을 첨가하거나 첨가하지 않고 제조한 LNP는 모두 72-95nm의 작은 크기와 약 90% 이상의 캡슐화 효율을 나타냈다. 모든 LNP는 pH 5에서 양의 제타 전위를 가지는 반면, DSPS가 포함된 제형은 중성 pH에서 약간의 음이온성 제타 전위를 나타냈다.
표 50. UO-1, UO-6 또는 UO-7을 포함하는 DSPS 표적화된 LNP에서 1μg/ml에서 인큐베이션 후 뮤린 수지상 세포에서의 mCherry 발현
3개의 다른 ICL 각각으로 구성된 LNP의 발현 데이터는 7.5 mol% DSPS를 포함하지 않는 LNP와 비교하여 13.3-15.4배의 표적화 효과(T/NT)를 보였다(도 28). 그러나 UO-1을 포함한 LNP는 UO-6 및 UO-7 모두에 비해 뮤린 수지상 세포에 대한 형질 전환 능력이 명백히 우수했다. 이는 우리가 이전에 디옥솔란 계열 지질에서 디메틸아미노프로필 헤드 그룹(예: KC3-01)이 KC2-01로 제조된 LNP보다 명백히 우수하다는 것을 보여준 점을 고려하면 놀라운 일이었는데, 이 때 KC2-01의 헤드 그룹은 디메틸아미노에틸이었고, 따라서 적정 가능한 아민기와 디옥솔란 백본 사이에 에틸기(두 개의 탄소)를 포함했다. 그러나 UO 계열 지질의 경우 KC3에서 사용된 것과 동일한 디메틸아미노프로필기를 함유한 UO-7 지질은 아민과 글리세롤 백본 사이에 두 개의 탄소 에틸기를 함유한 디메틸아미노에틸기를 갖는 UO-1 지질보다 명백히 열등하다. 실제로, UO-7을 함유한 LNP는 UO-1을 함유한 LNP에서 관찰된 활성의 13%만을 나타냈다.
실시예 43 이온화 가능한 지질과 ICL 밀도가 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 mRNA LNP의 면역원성에 미치는 영향
실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 28에 기재된 바와 같이 인간 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는 ICL에서 표 51의 이온화 가능한 지질을 사용하였고 N/P 비율은 5.25로 일정했다. 특정 제형에 사용된 ICL 농도가 그래프에 표시된다. 예를 들어, 46.5% KC3-OA%/5% DSPC/5% DSPS 제형은 100μg mRNA 당 46.5mol% KC3-OA, 5mol% DSPC, 5mol% DSPS, 42mol% 콜레스테롤 및 1.5mol% PEG-DMG, 또는 1575nmol KC3-OA, 169.4nmol DSPC, 169.4nmol DSPS, 1422.6nmol 콜레스테롤 및 50.8nmol PEG-DMG를 함유한다. 모든 샘플에서 PEG-DMG 농도는 1.5 mol%로 일정하게 유지되었다. ICL 농도가 증가하면 콜레스테롤 농도는 비례적으로 감소한다. KC 유사 ICL을 함유한 제형의 경우, 5 mol% DSPS로 표적화 되었고, UO 유사 ICL의 경우, 7.5 mol% DSPS로 표적화 되었다.
ALC-0315 제형은 46.3 mol% ALC-0315, 10 mol% DSPC, 42.7 mol% 콜레스테롤 및 1.56 mol% PEG-DMG로 구성되었다.
표 51. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 mRNA를 포함하는 ALC-0315, KC2, KC3-OA, UO-1 및 UO-9를 포함하는 LNP의 물리화학적 특성 및 특성화
그러나 이온화 가능한 지질의 mol%를 낮추는 것이 생체 내 면역원성에 부정적인 영향을 미치는지 여부는 불분명했다. 실시예 35에 설명된 동일한 방법을 사용하여 BALB/c 마우스에게 1mg의 백신 후보물질을 근육 내 주사하여 면역화하고 21일 후에 혈액을 채취했다.
혈청에서 총 항-스파이크 IgG 항체에 대해 ELISA를 이용하여 분석했다. 46.5 또는 48 mol% KC3-OA를 함유한 LNP로 면역화된 마우스들 사이에서 기하 평균 역가는 유사했다. 이온화 가능한 지질 KC3-01을 46.5 mol% 함유하는 LNP는 유사하게 면역원성을 나타냈다(도 29). 모든 KC3-01 또는 KC3-OA LNP는 ALC-0315 또는 KC2 LNP 대조군과 비교했을 때 상당히 높은 역가를 나타냈다.
마우스는 또한 이온화 가능한 지질인 AKG-UO1과 AKG-UO9를 함유한 백신 후보로 면역화되었다. AKG-UO1은 KC3-OA와 유사한 항체 역가를 유도했지만 AKG-UO9를 함유한 LNP는 면역원성이 낮았다.
실시예 44. LNP를 함유한 KC3-OA의 PG 및 PS 표적화가 인간 수지상 세포의 mRNA 발현에 미치는 영향.
본 연구의 목적은 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG)을 비롯한 다양한 형태의 포스파티딜글리세롤(PG)로 KC3-OA ICL을 함유한 LNP를 표적화하는 것이 인간 수지상 세포의 형질 전환 효율에 미치는 영향을 조사하는 것이었다. 두 번째 목표는 표적화 LNP를 DSPS가 포함된 LNP와 비교하고, 마지막으로 두 가지 음이온성 인지질(DSPG와 DSPS)을 포함시킨 제형을 비교하는 것이었다.
PG는 다양한 형태로 LNP에 총 지질 함량의 0-5 mol% 범위의 밀도로 포함되었다. 대조 LNP에는 표적 지질로 이전에 확립된 5 mol %의 DSPS를 포함하는 KC3-OA LNP가 포함되었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 28에 기재된 바와 같이 인간 수지상 세포에서의 형질 전환 효율에 대해 평가하였다. LNP는 ICL에서 표 52에 있는 이온화 가능한 지질을 사용하였고 N/P 비율은 5.25, 48 mol%로 유지되었으며, DSPG(Na+ 염) 지질은 0-10 mol%로 포함되었으며, DSPC 인지질 또한 0-10 mol%로 달라졌으며, 콜레스테롤은 40.5 mol%로 유지되었다. 일부 제형에는 DSPS와 DSPG가 포함되었으며 DSPC가 있거나 없었다. PEG-DMG는 모든 제형에서 1.5 mol%로 일정하게 유지되었다.
표 52. 실시예 44에서 사용된 LNP의 물리화학적 특성 및 특성화.
모든 제형은 pH 7.4에서 약간의 음전하를 띠고 pH 5에서 10-25 mV의 뚜렷한 양전하 제타 전위를 나타내며 입자 크기는 65-100 nm 사이였다. mRNA의 음전하 인산과 결합을 놓고 경쟁할 수 있는 음이온성 인지질이 존재함에도 불구하고 모든 입자는 90% 이상의 캡슐화 효율을 보였다.
표 53. 1 μg/ml에서 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
표 54. 0.1 μg/ml에서 인큐베이션 후 인간 수지상 세포에서의 mCherry 발현
두 개의 서로 다른 LNP를 DSPG로 표적화하는 것이 형질 전환 활성에 미치는 영향을 다양한 조성의 PG로 표적화된 LNP를 사용하여 평가했다(도 30A-30B). LNP를 함유한 KC3-OA의 경우, 모든 형태의 PG는 10% DSPC 대조군에 비해 상대적으로 어느 정도 증가된 발현을 보였으며, 하나의 공여체에서는 포화된 DPPG 또는 DSPG 형태의 PG에 대한 선호도가 약간 있었지만, 별도의 공여체에서는 DOPG와 DMPG가 유사한 활성을 보였다. DSPC 대조군에 비해 가장 큰 증가는 5% DSPS로 표적화된 LNP에서 나타났으며, DSPS와 DSPG를 조합해도 형질 전환 활성은 더 이상 향상되지 않았으며 대부분의 경우 DSPS를 유일한 음이온성 인지질로 함유한 제형과 비교했을 때 길항적이었다. 실제로 모든 인지질이 DSPG이거나 DSPS(예: DSPC 없음)인 LNP 제형은 표적화된 LNP 제형 중 가장 낮은 형질 전환 활성을 보였다. 이 데이터는 PG와 DSPS 모두가 인간 수지상 세포에서 형질 전환 효율을 높이기 위해 음이온성 지질을 강력하게 표적화할 수 있으나, 두 가지를 조합하면 활성이 더욱 향상되지 않는 것으로 보임을 보여준다.
실시예 45. 용해성이 더 적은 DSPS-Na와는 대조적으로 에탄올 용해성 DPPS-NH4를 사용하면 포스파티딜세린-표적화된 KC3OA 기반 LNP를 실온에서 제조할 수 있다
본 연구의 목적은 마우스 DC 세포에서의 형질 전환 효율을 측정하여 LNP의 표적화 리간드인 DSPS-Na와 DPPS-NH4를 비교하는 것이었다. LNP는 실시예 10에서와 같이 제조되었다. LNP를 제조하기 전에, 각 지질의 스톡 용액은 사용 전 에탄올에서 만들었지만, DSPS-Na는 에탄올에 대한 용해도가 낮기 때문에(실시예 37 참고) 완전히 용해되도록 고온(70℃)에서 메탄올에 용해시켰다. 메탄올 용액을 실온으로 냉각시키면, 짧은 시기(< 1시간) 동안 DSPS-Na 용해도가 유지될 것이다. 따라서 각각의 지질 스톡에서 KC3OA, DSPC, Chol 및 PEG-DMG와 DSPS-Na를 첨가한 후 생성된 혼합물은 에탄올 중 부피 기준으로 약 16%의 메탄올을 함유하게 된다. DSPS로 표적화된 LNP를 만들고 DSPS-Na의 완전한 용해성을 보장하기 위해 에탄올/메탄올 용액을 예열된 mRNA와 혼합하기 전에 주사기 홀더 가열 블록에서 70℃에서 인큐베이션한다. LNP가 형성되기 전에 높은 온도 제어를 유지하기 위해 주의해야 하며, 그렇지 않으면 DSPS 응집이나 LNP 응집이 발생할 수 있다. LNP가 형성되면, 현탁액을 자연적으로 실온으로 냉각시킨 후, 투석을 통해 용매를 제거하였다. KC3OA는 48 mol%로 일정하게 유지하였고, DSPC 농도는 5 mol%였으며, 5 mol% DSPS-Na 또는 DPPS-NH4, 38.5 mol% 콜레스테롤 및 1.5 mol% PEG-DMG가 포함되었다. N/P는 5.25였다. KC3OA/DSPS 샘플에는 100 μg mRNA 당 1575 nmol KC3OA, 164.1 nmol DSPC, 164.1 nmol DSPS-Na, 1328.9 nmol 콜레스테롤 및 49.2 nmol PEG-DMG가 포함되어 있다. 반면, DPPS-NH4의 용해도가 더 높기 때문에 모든 에탄올 스톡 용액에서 LNP를 제조할 수 있어 혼합 전 고온 배양이 필요 없고 공정에서 메탄올이 필요하지 않아 스케일 확대와 잔류 용매 측면에서 모두 유리하다. KC3OA/DPPS 샘플은 100 μg mRNA 당 1575 nmol KC3OA, 164.1 nmol DSPC, 164.1 nmol DPPS-NH4, 1328.9 nmol 콜레스테롤 및 49.2 nmol PEG-DMG를 함유하였고 실온에서 혼합하였다. 최종 ALC-0315/DSPC 제형은 46.3 mol% ALC-0315, 10 mol% DSPC, 42.7 mol% 콜레스테롤 및 1.5 mol% PEG-DMG로 구성되었다. SM-102/DSPC 제형은 50 mol% SM102, 10 mol% DSPC, 38.5 mol% 콜레스테롤 및 1.5 mol% PEG-DMG로 구성되었으며, 이들 두 대조군 모두 실온에서 준비되었다.
LNP는 pH 7.4의 PBS로 교환된 다음 15mM Tris, pH 7.4, 20% 수크로스로 교환되고, Amicon-Ultra 4 (100,000 MWCO) 스핀 컬럼을 사용하여 20-50ug/mL mRNA로 농축되고, 멸균 여과(Thermo Nalgene 0.2um #720-1320)한 후 액체 질소에 5분 동안 담가 동결시키고 -80℃에서 장기간 보관했다. LNP는 실시예 10에 설명된 바와 같이 분석되었으며, 실시예 11에 설명된 바와 같이 뮤린 DC 세포에서 테스트되었다.
표 55A
표 55B
KC3-OA/DPPS-NH4 LNP는 생물물리학적 관점에서 볼 때 DSPS로 표적화된 LNP와 유사했으며, 모든 측정 특성이 매우 유사했다. 또한 DPPS를 포함시키면 mCherry 발현이 약 2배 증가하는 것으로 나타났다(도 31). 비슷한 생물물리적 LNP 특성 및 비슷하고 약간 향상된 mRNA 발현을 조합하는 것은 DPPS-NH4가 KC3-OA LNP를 표적화하는 매력적인 PS 표적화 리간드임을 시사한다.
실시예 46: 비대칭 사슬을 가지며, 또한 한 사슬이 포화 알킬이고 다른 사슬이 단일 불포화, C15 또는 C17인 양이온 지질의 합성
(7Z, 24Z)-트리트리아콘타-7,24-디엔-16-온(비대칭 C 15 (8:1)-C 17 (8:1) 케톤)의 합성.
올레오일 클로라이드와 팔미톨레오일 클로라이드의 등몰 혼합물을 (9Z,26Z)-펜타트리아콘타-9,26-디엔-18-온(2)을 합성하기 위해 본질적으로 위에서 설명한 바와 같이 처리한다. 생성물(C15(8:1)-C15(8:1), C17(8:1)-C17(8:1), 및 C15(8:1)-C17(8:1) 케톤)을 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리하여 비대칭 C15(8:1)-C17(8:1) 케톤을 단리한다. 구조를 NMR로 확인하였다.
Synthesis of 3-(S)-2-(8Z)-펜타덱-8-엔-1-일-2'-(8Z)-헵타덱-8-엔-1-일-1,3-디옥솔란-4-일)-N.N-디메틸프로판-1-아민의 합성본질적으로 (7Z, 24Z)-트리트리아콘타-7,24-디엔-16-온을 출발 물질로 사용하여 위에 기술한 3-((S)-2,2-디((Z)-헵타덱-8-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, AKG-KC3-C17(C8:1))의 합성 절차를 따랐다. 하나의 C17 단일불포화 사슬과 하나의 C15 단일불포화 R1 탄화수소 사슬을 갖는 일반 구조 I-A를 갖는 양이온 지질이 수득된다.
(9Z)-펜타트리아콘트-9-엔-18-온(비대칭 C 17 (8:1)-C 17 케톤)의 합성올레오일 클로라이드와 스테아로일 클로라이드의 등몰 혼합물을 (9Z,26Z)-펜타트리아콘타-9,26-디엔-18-온(2)을 합성하기 위해 본질적으로 위에서 설명한 바와 같이 처리한다. 생성물(C17(8:1)-C17(8:1), C17(8:1)-C17, 및 C17-C17케톤)을 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리하여 비대칭 C17(8:1)-C17 케톤을 단리한다. 구조를 NMR로 확인하였다.
3-(S)-2-(8Z)-헵타덱-8-엔-1-일-2'-헵타덱-1-일-1,3-디옥솔란-4-일)-N.N-디메틸프로판-1-아민의 합성
본질적으로 (9Z)-펜타트리아콘트-9-엔-18-온을 출발 물질로 사용하여 위에 기술한 3-((S)-2,2-디((Z)-헵타덱-8-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, AKG-KC3-C17(C8:1))의 합성 절차를 따랐다. 하나의 C17 단일불포화 사슬과 하나의 C17 포화(알킬) R1 탄화수소 사슬을 갖는 일반 구조 I-A를 갖는 양이온 지질이 수득된다.
(24Z)-트리트리아콘트-24-엔-16-온 (비대칭 C 15 - C 17 (8:1) 케톤)의 합성올레오일 클로라이드와 팔미토일 클로라이드의 등몰 혼합물을 (9Z,26Z)-펜타트리아콘타-9,26-디엔-18-온(2)을 합성하기 위해 본질적으로 위에서 설명한 바와 같이 처리한다. 생성물 (C17(8:1)-C17(8:1), C15-C15 , 및 C15-C17(8:1) 케톤)을 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리하여 비대칭 C15-C17(8:1) 케톤을 단리한다. 구조를 NMR로 확인하였다.
3-(S)-2-(8Z)-펜타덱-8-엔-1-일-2'-헵타덱-1-일-1,3-디옥솔란-4-일)-N.N-디메틸프로판-1-아민의 합성
본질적으로 (24Z)-트리트리아콘트-24-엔-16-온을 출발 물질로 사용하여 위에 기술한 3-((S)-2,2-디((Z)-헵타덱-8-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, AKG-KC3-C17(C8:1))의 합성 절차를 따랐다. 하나의 C17 단일불포화 사슬과 하나의 C15 포화(알킬) R1 탄화수소 사슬을 갖는 일반 구조 I-A를 갖는 양이온 지질이 수득된다.
실시예 47. 포스파티딜세린을 사용하여 KC3OA 기반 LNP를 표적화하는 것이 시험관내에서 뮤린 DC 세포에 미치는 영향 및 ALC-0315 및 SM-102 LNP 제형과 비교
리포터 mRNA mCherry(Trilink Biotechnologies, San Diego, CA, #7203)를 함유하는 Comirnaty®(“ALC-0315”) 및 Spikevax®(“SM102”)에 상응하는 LNP 지질 제형은 실시예 9 및 10에 설명된 대로 제조 및 특성화되었으며 KC3OA(KC3OA-PS) 및 KC3OA/5mol% DPPS(KC3OA+PS) 제형과 비교되었다. 구체적으로, 상기 제형들은 ALC-0315/DSPC/Chol/ALC-0159(46.3/9.4/42.7/1.56 mol%, "ALC-0315"); SM102/DSPC/Chol/PEG-DMG(50/10/38.5/1.5 mol%, "SM102"); KC3OA/DSPC/Chol/PEG-DMG(48/10/40.5/1.5 mol%, "KC3OA-PS"); 및 KC3OA/DSPC/DPPS/Chol/PEG-DMG(48/5/5/40.5/1.5 mol%, "KC3OA+PS")로 구성되었다. 형광 지질 마커인 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸린도디카보시아닌-5,5'-디설폰산(DiIC18(5)-DS, ATT Bioquest, 카탈로그 번호 22054)를 각각 0.025 mol%로 첨가했다. SM-102는 Organix, Inc(O-11182)에서 구입했고 ALC-0315(BP-25498)와 ALC-0159(BP-25711)는 BroadPharm, Inc.에서 구입했다. 이러한 제형들에 대한 분석 결과를 표 56에 나타낸다. (약어: F/T, 동결/해동 주기. %EE, mRNA 캡슐화 효율. %. Stdev - EE 표준 편차. Zeta, 제타 전위(mV). C/F, 농축 및 0.2-μm 멸균 여과 단계. Z-Ave, DLS에 의한 Z-평균 입자 크기(nm). PDI, DLS에 의한 다분산 지수)
표 56. 실시예 47에 기술된 LNP 제형들의 분석. F/T, 동결/해동 주기. EE, 캡슐화 효율.
LNP는 동결 및 해동 시 mRNA 캡슐화에 거의 변화가 없었고(<1% 미만), 크기 변화도 2% 미만이었다. LNP는 pH 5.0 또는 pH 7.0 완충액에 현탁되었을 때 예상했던 제타 전위 변화를 나타냈다(이들은 양이온 표면 전하에서 중성 표면 전하로 변화했다). 해당 제형을 MutuDC1940 세포에 0.2 μg mRNA/ml 농도로 첨가하고 37℃에서 인큐베이션했다. 다양한 인큐베이션 시간에서 세포를 세척하고 수확하여 생존/사멸 염료로 염색하고 고정한 후 실시예 11에 설명된 바와 같이 유세포 분석법을 통해 DiIC18(5)-DS 함량 또는 mCherry 단백질 함량을 분석했다. 결과를 도 32 및 도 33과 표 57에 나타낸다.
시간 경과에 따른 DiIC18(5)-DS 신호의 증가를 통해 관찰된 바와 같이 우리는 기본 제형 KC3OA-PS와 비교하여 PS 표적화된 KC3OA LNP의 빠른 세포 축적을 관찰했으며, 이러한 증가는 약 24시간에서 정점을 이루고 72시간 후 감소했다. KC3OA+PS의 DiIC18(5)-DS 신호는 24시간에서 KC3OA-PS에 비해 15.1배 더 높았다. DiIC18(5)-DS 신호는 24시간에서 표적화된 제형이 ALC-0135 또는 SM102 제형에 비해 더 높았다(각각 4.1배 및 9.7배 더 높음). 실제로 세포 축적이 증가하면서 mCherry 발현도 향상되었다; PS 표적화된 KC3OA 제형은 비표적화된 KC3OA 제형에 비해 mCherry 신호가 22배 더 높았고, ALC-0315와 SM102 LNP보다 각각 38.5배와 6.8배 더 높았다. DiIC18(5)-DS와 mCherry 모두에서 72시간 후 세포 신호가 감소한 것은 MutuDC1940 세포 분열로 인한 신호 희석 때문일 수 있다.
표 57. mCherry mRNA-LNP 제형의 존재하에 다양한 인큐베이션 시간에서 MutuDC1940 세포에서 DiIC18(5)-DS 지질 라벨과 mCherry 단백질의 형광 강도 중앙값(MedFI).
실시예 48. 포스파티딜세린을 함유한 리포솜과 LNP의 공동 인큐베이션이 mRNA-LNP의 DC 흡수에 미치는 영향
이 실험의 목적은 PS 변형체를 함유한 포스파티딜콜린/콜레스테롤/PEG-DMG 리포솜이 시험관 내에서 서로 다른 LNP 제형의 세포 흡수에 대해 경쟁하는지 여부를 확인하는 것이었다. PS를 함유하는 리포솜과 LNP가 Tim4/Tim1 및 기타 PS 특이적 수지상 세포 표면 수용체를 통해 내재화된다면, 크기가 비슷하고 LNP가 없는 PS를 함유하는 중성 리포솜("차단 리포솜")은 PS 표적화된 LNP의 흡수를 특이적으로 차단하고 PS가 없는 리포솜은 차단 효율이 떨어질 것이므로, PS를 함유하는 LNP의 향상된 흡수 메커니즘은 PS 특이적임을 입증한다는 가설을 세웠다. 본 연구에서 사용된 LNP들은 ALC-0315/DSPC/Chol/ALC-0159(46.3/9.4/42.7/1.56 mol%, "ALC-0315"); SM102/DSPC/Chol/PEG-DMG(50/10/38.5/1.5 mol%, "SM102"); KC3OA/DSPC/Chol/PEG-DMG(48/10/40.5/1.5 mol%, "KC3OA-PS"); 및 KC3OA/DSPC/DPPS/Chol/PEG-DMG(48/5/5/40.5/1.5 mol%, "KC3OA+PS")로 구성되었다. 형광 마커 DiIC18(5)-DS를 각각 0.025 mol%로 첨가했다. LNP는 실시예 9와 10에 설명된 바와 같이 만들어지고 특성화되었다.
리포솜 준비. 차단 리포솜을 준비하는 데에는 여러 가지 설계 요소가 고려되었다. 첫째, 대부분의 지질은 이중층을 형성하는 특성상 KC3OA와 유사해야 한다. 따라서 우리는 KC3OA와 동일한 알킬 사슬을 가지고 있는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)을 선택했으며, 이를 48 mol%의 KC3OA-LNP와 동일한 비율로 사용했다. 두 번째로, 콜레스테롤과 PEG-DMG 함량은 일반적인 KC3OA 기반 LNP와 일치하게 40.5와 1.5 mol%로 유지되었다. PS가 함유되지 않은 리포솜의 경우 10 mol% DSPC를 사용했다. PS가 함유된 리포솜의 경우 DSPC를 PS 변형체인 L-DPPS, L-DOPS, L-DSPC(Avanti Polar Lipids) 또는 D-DSPC로 (실시예 1E에 설명된 바와 같이) 대체했다.
리포솜은 다음과 같이 제조되었다:
1. 지질 스톡 용액은 에탄올(DNAse, RNAse free, Sigma E7023) 중에서 준비하였고(DPPS는 에탄올-메탄올 혼합물 중에서 준비) 25ml 유리 배 모양 플라스크(72umol DOPC 기준)에 넣었다.
2. 지질 용액을 육안으로 관찰하여 건조될 때까지 50℃에서 회전증발시키고 65℃에서 0.5ml 에탄올에 재용해시켰다.
3. 지질 에탄올 용액에 25 mM Tris, 145 mM NaCl, pH 7.5(TBS-25-7.5) 4.5 ml를 첨가하고 65℃에서 2분간 교반하여 다중층 소포(MLV)를 형성시켰다.
4. MLV는 65℃, 34-350psi에서 10ml 열통 압출기(Lipex, Northern Lipids)를 사용하여 기공 크기가(위에서 아래로) 200nm(1), 100nm(1), 및 50nm(1)인 폴리카보네이트 트랙 에칭 멤브레인 스택(PCTE, Whatman Nuclepore) 을 5회 통과시킨 후 냉장고에서 밤새 냉각시켰다.
5. 리포솜을 실온에서 2시간 동안 각각 150ml TBS-25-7.5를 2번 바꾸어 SpectraPor 12-14 MWCO 25mm 튜브를 사용하여 투석했다.
6. 리포솜은 0.2-μm 13-mm 멸균 PES 필터(Nalgene)를 통해 무균 여과한 후 인지질 함량과 DLS를 사용하여 입자 크기에 따라 특성화했다(희석된 리포솜 또는 표준 물질의 분취액이 5ul이고, 표준 물질이 인산염 2.5-10mM 범위의 인산염이었던 것을 제외하고 실시예 37에 설명된 바에 따름). 결과를 아래 표 58에 나타낸다.
표 58. LNP 공동 인큐베이션 연구를 위한 리포솜 로트의 특성
MutuDC1940 세포는, 96웰 플레이트를 사용하고 세포 수를 웰당 35,000개 세포로 도말한 것을 제외하고는 실시예 11에 설명된 대로 도말하였다. LNP를 첨가하기 15분 전(n=4), ~32 μM의 총 지질 농도에서 리포솜을 첨가했다. LNP는 0.1 μg/ml mRNA 또는 3.2 μM의 총 지질에서 첨가되었고 37C에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 세포를 세척하고 유세포 분석법으로 DiIC18(5)-DS 신호를 분석했다. 결과를 도 34 및 표 59에 나타낸다. "세포 단독" 샘플의 MedFI는 319 ±56.6 형광 단위였다.
표 59. LNP와 리포좀 차단제로 처리한 세포의 DiIC18(5)-DS 형광 강도 중앙값(medFI, 평균 ±표준 편차(SD)).
우리는 리포솜 중 어느 것도 ALC-0315나 SM102 제형의 흡수에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 확인했다. 그러나 특정 리포솜으로 전처리하면 PS로 표적화된 KC3OA LNP의 흡수에 두드러진 효과가 나타났다. 예를 들어, L-DPPS, L-DOPS 또는 L-DSPS를 함유한 리포솜은 표적화된 KC3OA+PS LNP 흡수를 광범위하게 차단하여 이를 비표적화된 제형인 KC3OA-PS와 유사한 수준으로 감소시켰다. 이와 대조적으로, PS가 없는 리포솜은 LNP 흡수에 영향을 미치지 않았다. 중요한 점은, D-DSPS를 함유한 리포솜은 효과가 없었는데, 이는 PS의 L-이성질체와 관련된 흡수의 특이성을 보여주는 것이다. 이러한 데이터는 PS로 표적화된 LNP가 L-이성질체 특이적인 PS-의존적 메커니즘을 통해 DC에 내재화된다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 49. 시험관 내 뮤린 DC 세포에서 D- 또는 L-이성질체가 포스파티딜세린을 함유한 LNP 제형의 표적화 능력에 미치는 영향.
본 연구의 목적은 세린기의 키랄성이 포스파티딜세린을 함유하는 LNP 흡수 및 기능적 mRNA 전달에 미치는 영향을 평가하는 것이었다. mCherry mRNA(Trilink, Cat#L-7203)를 함유한 LNP가 N/P = 5.25로 UO-1, KC2 또는 KC3OA ICL을 사용하여 제조되었으며 -80℃에서 보관하기 위해 15 mM Tris, 20% 수크로스, pH 7.4 완충액 중에서 제형화되었다. 포스파티딜세린(PS) 지질인 L-DSPS-Na, D-DSPS-Na 또는 L-DPPS-NH4는 UO-1 함유 LNP의 경우 7.5 mol%, KC-계열 ICL의 경우 5.0 mol%로 상기 제제에 포함되었으며, 이는 이전 실험에서 각 ICL에 대한 최적의 mol%라는 것을 발견했다. PS가 없는 LNP도 준비되었다. PS 지질은 해당 제형에서 DSPC의 mol%를 비례적으로 감소시키면서 적정되었다. 모든 제형에서 PS + DSPC 조성은 10 mol%였고, PS가 없는 제형의 경우 DSPC는 10 mol%였다. 총 LNP 지질에 대하여 ICL 함량은 48 mol%, 콜레스테롤 함량은 38.5 mol%, PEG-DMG 함량은 1.5 mol%였다. DSPS-Na와 DPPS-NH4는 Avanti Polar Lipids사로부터 얻었고 D-DSPS는 실시예 9와 10에 설명된 바와 같이 합성 및 정제되었다. 또한 총 지질의 0.025 mol%로 비교환성 형광 지질 마커 DiIC18(5)-DS가 포함되었다. 이러한 제형들은 실시예 51에 설명된 바와 같이 형질 전환 전에 수행된 샘플 준비 조건을 시뮬레이션하기 위해 동결-해동되었다. LNP 특성화 데이터는 아래 표 60에 나와 있다(약어는 실시예 47, 표 56 참고).
표 60. 실시예 47에 기술된 LNP 제형의 분석.
우리는 F/T에 따라 LNP 크기가 2.8% 미만으로 변하는 것을 발견했는데, UO-1(PS 없음)의 경우 LNP가 97nm에서 125nm로 증가했다. LNP는 동결 및 해동 시 mRNA 캡슐화에 거의 변화를 보이지 않았으나(3.5% 미만), 단, UO-1(PS 없음)은 88%에서 82%로 감소했다(6% 감소). LNP는 pH 5.0 또는 pH 7.0 완충액에 현탁되었을 때 예상했던 제타 전위 변화를 나타냈다(이들은 양이온 표면 전하에서 중성 표면 전하로 변화했다). LNP는 실시예 11에 설명된 대로 MutuDC1940 세포에 0.3μg mRNA/ml(n=4)로 첨가되었고 3시간 및 24시간 시에 세포를 세척하고 생존/사멸 염색을 실시하고 고정시킨 후 AttuneNxT 세포분석기를 사용하여 유세포 분석법으로 mCherry 및 DiIC18(5)-DS 신호를 분석했다. DSPS의 L-이성질체로 표적화하면 MutuDC1940 세포의 흡수가 비표적화된 샘플 및 DSPS의 비자연적 D-이성질체 형태를 함유한 샘플보다 향상된다. LNP 흡수와 mCherry 발현은 시간에 따라 달라졌으며(도 35-38) 데이터는 표 61A에 나타내었다.
표 61A. 실시예 49의 LNP를 3시간 또는 24시간 동안 처리한 후 MutuDC1940 세포에서의 mCherry 형광 강도 중앙값.
표 61B. LNP(0.3μg mRNA 용량)로 3시간 또는 24시간 동안 처리한 MutuDC1940 세포의 DiIC18(5)-DS 형광 강도 중앙값
표 62. MutuDC1940 세포에서 3시간 및 24시간 차에 L-DPPS, L-DSPS 또는 D-DSPS 표적화된 LNP의 mCherry 발현 또는 DiIC18(5)-DS 흡수의 비교 비율. 비율은 L-DPPS를 함유한 LNP로 처리한 세포와 비표적화된 LNP(DPPS/NT), L-DSPS를 함유한 LNP(DPPS/DSPS) 또는 DSPS의 D 이성질체(DPPS/D-DSPS)로 처리한 세포의 medFI mCherry 또는 DiIC18(5)-DS 신호의 배수 차이로 표현된다.
우리는 L-DPPS로 표적화된 LNP 사용시 24시간 후에 mutuDC1940 mCherry 발현이 6.2-9.8배 증가하는 것을 관찰했는데, 표 62에 나타난 UO-1 ICL을 함유한 LNP 제형에서 가장 큰 배수로 증가하였다. 우리는 24시간 후 LNP 흡수(DiIC18(5)-DS 신호)가 비표적화된 LNP에 비해 DPPS를 포함시킴으로써 11.9-17.7배 증가하는 것을 관찰했다. 전반적으로 DPPS는 표적화 능력 측면에서 DSPS보다 약간 더 우수했지만, DSPS의 L-이성질체는 D-이성질체 지질보다 7.2-9배 더 우수했으며, 이는 PS의 L-이성질체 형태가 DC에 대한 최적의 LNP 표적화에 중요하다는 것을 보여준다. 이 실시예에서 우리는 PS로 표적화된 LNP가 자연적인 PS/수용체 내재화와 세포 흡수 메커니즘을 활용하여 mRNA의 세포 내 전달과 번역을 개선한다고 제안한다.
실시예 50. PEG-DLG가 LNP 생물학적 특성과 인간 단핵구에서 유래한 수지상 세포의 형질 전환 효율에 미치는 영향.
지질 이중층으로부터의 해리가 증가하기 때문에, 탄소 원자 수가 14개 미만인 이중 탄화수소 사슬을 갖는 결합 지질은 일반적으로 핵산 페이로드의 효과적인 세포 전달을 통해 크기가 안정적인 LNP를 생성하는 데 고려되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 우리는 LNP 제형이 LNP 안정화제로서 디-C12-PEG-접합 지질(PEG-디라우로일글리세롤, PEG-PLG)을 사용할 수 있는지, LNP에서 PEG-DLG의 mol%를 증가시키는 것이 생물물리적 특성과 형질 전환 효율에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. 이를 위해 다양한 양의 PEG-DLG가 KC3OA+PS LNP에 통합되었다. 또한, 비교를 위해 1.5 mol%의 디-C14-PEG-접합 지질 PEG DMG를 함유하는 KC3OA+PS LNP를 제조하였다. 실시예 9 및 10의 프로토콜이 LNP 제조 및 특성화에 사용되었으며, 이러한 LNP의 기본 지질 조성은 KC3OA/DSPC/DPPS-NH4/Chol/PEG-지질이었고 몰비는 48/5/5/(42-X)/X였으며, 여기서 X = 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 또는 2.5였고 mRNA의 N/P는 5.25였다. LNP 입자 크기와 mRNA 캡슐화 효율을 표 63에 나타낸다.
표 63. 실시예 50에서 사용된 KC3OA+PS LNP의 물리화학적 특성
PEG-DLG 양이 증가하는 LNP 계열 내에서 LNP 크기와 PEG-DLG 함량 사이에 반비례 관계가 존재하였으며(로트 # 032922-2 내지 032922-6), 반면에 캡슐화 효율은 1.5 mol% PEG-DMG 샘플(92%)과도 유사하게 ~92%로 비슷하게 유지되었음을 관찰하였다. 032922-1과 032922-4의 유사한 크기 및 mRNA 포집 특성은 PEG-DLG를 함유한 LNP가 PEG-DMG를 함유한 LNP와 매우 유사함을 시사한다.
실시예 28에 설명된 바와 같이 형질 전환 4일 전에 건강한 공여체의 PBMC에서 CD14 단리 키트(StemCell)를 사용하여 단핵구를 단리했다. 공여체 1과 공여체 2 단핵구의 CD14 순도는 각각 95%와 98%였고, 전체 생존율은 > 92% 였다. 단핵구는 6웰 디쉬에서 IL-4(R&D 1000 IU/mL) 및 GM-CSF(R&D, 800 IU/mL)와 함께 1x106개의 세포/mL의 농도로 37℃, 5% CO2에서 배양되었다. 4일 후 미성숙 DC를 수확하여 96웰 둥근 바닥 플레이트에 50,000개 세포/웰로 씨딩하였다. 바이알을 37℃ 수조에 30초간 담가두거나 샘플이 거의 완전히 녹을 때까지 기다려서 LNP를 해동시켰다. 곧바로 바이알들을 사용하기 전까지 얼음 위에 두었다. LNP는 1 μg/mL 및 0.1 μg/mL mRNA의 최종 농도까지 첨가되었다. 1 μg/mL 처리의 경우, LNP를 각 웰에 직접 첨가한 다음 피펫으로 웰을 혼합했다. 0.1 μg/mL 처리의 경우, LNP를 완전 배지에서 1:10으로 희석한 다음 각 웰에 첨가하고 피펫으로 혼합했다. 4시간 후, TNF-a(R&D, 10 ng/mL), IL-1b(R&D, 2 ng/mL), IL-6(R&D, 1000 IU/mL), PGE1(R&D, 1 μg/mL)로 구성된 성숙 사이토카인 칵테일을 각 웰에 직접 첨가했다. 24시간 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 세척한 후 유세포 분석법을 통해 mCherry 형광을 분석했다. 게이팅 분석은 CytExpert 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
mCherry 발현(도 39)은 mCherry 발현과 PEG-DLG 함량 사이에 역의 관계를 보였다. LNP 032911-1 내지 6에는 0.5-2.5 mol% 범위의 PEG-DLG가 0.5 mol% 증분으로 다양하게 포함되어 있다. 이 계열 내에서 PEG-DLG 함량이 증가할수록 mCherry 발현이 감소하는 것으로 나타났다. PEG-DMG 또는 PEG-DLG(로트 032922-1 대 032922-4)를 각각 1.5 mol%로 사용하여 만든 LNP를 직접 비교하면 PEG-DMG LNP의 mCherry 발현은 PEG-DLG LNP보다 약 5.2배(1 μg/ml) 또는 4.5배(0.1 μg/ml) 더 높았고, 두 LNP의 LNP 크기와 mRNA 캡슐화 효율은 비슷했다.
실시예 51. Covid 스파이크 mRNA의 KC3-PA 기반 LNP 제형에서 생체 내에서 항-스파이크 항체를 생성하는 능력에 관한 PEG-DMG와 PEG-DLG의 비교.
본 연구의 목적은 SARS-COV2 스파이크 단백질을 인코딩하는 mRNA를 함유한 LNP 제형에서 PEG-DMG와 PEG-DLG를 비교하여 마우스에서 SARS-COV2 스파이크 단백질에 대한 항체 역가를 유도하는 능력을 비교하는 것이었다.
mRNA의 설계 및 준비. SARS-CoV-2 전장 스파이크 단백질을 인코딩하고 BNT162b2(Comirnaty®백신에 사용된 것과 동일한 UTR이 측접한 mRNA가 Vernal Biosciences에 의해 실시예 35에 설명된 바와 같이 준비되었다.
LNP 준비
LNP는 실시예 9에 설명된 바와 같이 이온화 가능한 지질인 KC3-PA를 48 mol%, 인지질인 DPPC를 5 mol%, DPPS-NH4를 5 mol% 사용하고, N/P 비율이 5.25인 mRNA VRN029를 사용하여 PEG-DLG의 양을 1.5 mol%에서 2.5 mol%까지 변화시켜 준비되었다. 실시예 50과 유사하게 PEG-지질 함량은 콜레스테롤 함량을 감소시켜 증가되었다. 실시예 35의 KC3-PA/DSPC/DPPS/Chol/PEG-DMG(48/5/5/40.5/1.5 mol%)로 구성된 비교 제형 031822-9도 사용되었다.
동결/해동 프로토콜
LNP 동결은 샘플 바이알을 액체 질소(LN2)에 5분간 부분적으로 담근 다음 -80℃에서 보관하여 수행된다. 투여하기 전에 각 LNP 바이알을 플로터에 넣고 37℃ 수조에 ~30초 동안 담가 바이알 내부의 얼음이 거의 완전히 녹을 때까지 기다린다.
이 연구를 위해 샘플을 >40 μg/mL mRNA로 농축하고 다양한 부피의 15 mM Tris, 20% Sucrose, pH 7.4로 희석하여 목표 농도 40 μg mRNA로 만든 다음 LN2에서 동결시켰다. LNP의 분취물을 해동시키고 pH 7.4의 15mM Tris로 1:1(부피:부피)로 희석하여 최종 농도가 15mM 트리스, 10% 수크로스, pH 7.4 중에서 20μg/mL mRNA가 되도록 한 후에, LNP의 특성화에 착수했다. 이는 50 μL 용적의, 1 μg LNP로 제형화된 mRNA를 동물의 뒷다리 허벅지 부위에 근육 주사하기 전에 사용된 샘플 준비 조건을 시뮬레이션한 것이다. LNP들을 입자 크기와 mRNA 캡슐화 효율에 따라 특성화하였다(표 64).
표 64. 실시예 51의 Covid 스파이크 mRNA 면역원성 연구에 사용된 LNP의 조성 및 특성화.
면역화 및 SARS-CoV-2 항스파이크 항체 역가. 마우스를 LNP로 면역화하고, 실시예 35에 설명된 대로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 총 IgG 결합 항체에 대한 혈청 샘플을 분석하기 위해 표준 간접 ELISA를 수행했다.
도 40은 KC3-PA 기반 LNP(SD35)를 부스트 투여한 후 2주차에 마우스의 혈액 내 항-스파이크 항체의 역가를 보여준다. 놀랍게도 시험관 내 mRNA 발현의 차이에도 불구하고(실시예 50 참고), PEG-DMG와 PEG-DLG를 함유한 LNP는 생체 내에서 매우 유사한 성능을 보였다. PEG-DLG의 mol%가 총 지질의 1.5 mol% 내지 2.0 mol% 및 2.5 mol%로 증가함에 따라 해당 LNP로 얻은 평균 항체 역가는 Dunnett의 다중 비교 사후 검정을 적용한 일원 ANOVA를 사용하였을 때 통계적으로 차이가 없었다. 이는 PEG-DLG가 PEG-DMG의 대안으로 사용될 수 있음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, PEG-DLG 농도의 범위는 약 0.5-2.5mol%이다.
실시예 52. DPPS 함량(3.5-6.5 mol%)의 KC3-OA 효과에 대한 PEG-DMG와 PEG-DLG 함유 SARS-COV-2 스파이크 mRNA 제형들의 면역원성 비교.
본 연구의 목적은 SARS-COV2 스파이크 단백질을 인코딩하는 mRNA를 함유하는, PEG-DMG 및 PEG-DLG 함유 KC3-OA 기반 LNP 제형들을 SARS-COV2 스파이크 단백질에 대한 항체를 유도하는 능력에 관하여 비교하는 것이었다. LNP는 이온화 가능한 지질로 KC3-OA, 표적화 리간드로 5mol% DPPS를 사용하고 LNP를 안정화하는 데 사용된 PEG-지질 유형을 다르게 하여 SARS-CoV-2 전장 스파이크 단백질을 인코딩하는 mRNA를 사용하여 준비되었다. 몰비가 48/(10-X)/X/40.5/1.5, X=3.5, 5.0 또는 6.5인 KC3OA, DSPC, DPPS-NH4, 콜레스테롤 및 PEG-지질을 갖는 LNP들을 실시예 9에 설명된 대로 제조하였다. 그 조성과 특성을 표 65에 나타낸다.
표 65. 실시예 52에서 사용된 KC3-OA-함유 LNP의 조성 및 특성화. ZP, 제타 전위(mV). %EE, 캡슐화 효율, % (평균 ±표준 편차).
Balb/C 마우스(n=5)에게 1 μg LNP로 제형화된 mRNA를 50 μL 용적으로 뒷다리 근육 주사를 통해 투여했다. 투여 3주 후에 혈청을 수집하여 실시예 35에 설명된 대로 ELISA를 통해 항-스파이크 항체를 분석하였고, 그 결과를 도 41A에 나타낸다.
또 다시, 시험관 내 결과와는 반대로, PEG-DMG 대신 PEG-DLG를 포함시킨 경우 다른 입자 특성은 유사했지만 면역원성이 약간 향상되었다. 이는 PEG-DLG가 유사한 생물물리적 특성을 나타내고 생체 내에서 유사하거나 더 나은 활성을 가질 수 있는 LNP 제형에 사용될 수 있는 잠재력이 있음을 나타낸다. 부스트 투여 후 2주차에 역가를 측정했을 때, PEG-DLG 또는 PEG-DMG를 함유한 5 mol% DPPS로 표적화된 KC3-OA LNP들 간에 유사한 역가를 관찰했는데(도 41B), 이는 프라임 투여 후 3주차보다 최소한 두 자릿수 이상 높은 역가이다(도 41A). 또한 도 41B에는 3.5-6.5 mol%의 DPPS와 1.5 mol%의 PEG-DMG를 함유하는 제형들이 도시되어 있다. 3.5-6.5 mol % DPPS 범위에 걸친 1.5 mol % PEG-DMG LNP 제형 3개는 생체 내 mRNA 인코딩 항원에 대한 면역 반응을 유발하는 능력에 있어서 서로 유사했으며 1.5 mol % PEG-DLG를 포함한 5 mol % DPPS 제형과도 유사했다(도 41B). 이들 제형의 제형 크기와 mRNA 캡슐화 효율은 유사했는데, 이는 생물학적 특성 및/또는 면역원성에 큰 변화 없이 LNP에 포함될 수 있는 DPPS 농도 범위를 나타내는 것이다.
실시예 53. 다양한 mol%에서 PEG-DMG와 PEG-DLPE를 함유한 LNP의 생물물리학적 특성화 및 시험관 내 비교.
본 연구의 목적은 다양한 농도(0.5-2.5 mol%)에서 PEG-DMG를 다른 디-C12-PEG 지질, 즉 포스파티딜에탄올아민 지질 유도체인 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG-DLPE)로 대체하는 것이 LNP 입자 크기, mRNA 캡슐화% 및 동결-해동 안정성의 생물물리학적 특성에 미치는 영향을 비교하는 것이다. KC3OA/DSPC/DPPS-NH4/콜레스테롤//PEG-지질을 48/5/5/(42-X)/X(여기서 X=0.5, 1.0, 1.5, 2.0 또는 2.5임)의 몰비로 함유하고 N/P = 5.25로 mRNA를 함유하는 LNP들을 위의 실시예 9 및 10에서 설명한 대로 제조, 분석 및 동결하였다. LNP의 분석 데이터를 표 66과 67에 나타낸다(약어: %EE, mRNA 캡슐화 효율, %; stdev, %EE 표준 편차; 혼합 후, 지질과 mRNA 용액을 혼합한 후; 회전+필터 후, 원심 농축기와 0.2μm 여과를 통한 완충액 교환 후; F/T 후, 동결-해동 사이클 후; Z-Ave, DLS에 의한 z-평균 입자 크기, nm; PDI, 크기 다분산 지수).
표 66. 실시예 10에서 설명한 형광 측정 Ribogreen®분석법으로 측정한 KC3-OA 함유 LNP의 mRNA 농도 및 캡슐화 효율.
전반적으로, 동결/해동 전후 mRNA 캡슐화 효율 사이에 편차가 거의 없는 것으로 관찰되었다(PEG-지질이 1 mol% 이상인 LNP의 경우 1.2% 미만). 그러나 0.5mol% PEG-DLPE의 경우 해동 후 캡슐화가 각각 11.7% 감소하여 이 PEG-지질 변형체의 동결/해동 안정성에 PEG-지질 농도가 중요함을 나타냈다.
표 67. 실시예 53의 KC3-OA를 함유한 LNP의 다양한 제조 공정 단계에서의 입자 크기 특성.
PEG-DMG와 PEG-DLPE 모두에서 제형 내 PEG-지질 농도가 낮을수록 LNP 크기가 커지는 것으로 관찰되었다. 이는 LNP 제형에서 PEG-지질의 잘 알려진 농도 의존적 안정화 효과의 결과일 가능성이 가장 높다(Mui BL, 외, Mol Ther Nucleic Acids. 2013 Dec 17;2(12):e139. doi: 10.1038/mtna.2013.66. PMID: 24345865; PMCID: PMC3894582). 일반적으로 PEG-DMG를 포함한 LNP의 크기는 상응하는 함량의 PEG-DLPE를 포함한 LNP보다 작았으며 직경이 19.8-27.0% 범위로 더 작았다. 그러나 원래 샘플과 비교했을 때 동결 및 해동에 따른 크기의 변화는 모든 경우에서 1.5% 미만이었다.
실시예 53의 LNP에서 mCherry 단백질 mRNA의 시험관 내 발현은 0.3 μg/mL LNP로 제형화된 mCherry mRNA로 24시간 인큐베이션 후 뮤린 DC 세포주 MutuDC1940에서 연구되었으며 유세포 분석법으로 측정되었고, 실험 세부 사항 및 세포 샘플 준비는 실시예 11에 설명되어 있다(표 68, 도 42).
표 68. 실시예 53의 LNP로 처리한 MutuDC1940 세포의 mCherry 형광 강도 중앙값(MedFI).
각 군 내에서 PEG-지질 농도가 낮을수록 형질 전환률이 높은 것으로 나타났다. PEG-DMG를 함유한 LNP는 PEG-지질 함량이 낮을 때(1.5mol% 이하) 가장 좋은 성능을 보였고, PEG-DLPE는 PEG-지질 함량이 2mol%를 넘을 때 PEG-DMG보다 성능이 더 좋았다. 선택된 범위에서, PEG-DMG(0.5-2mol%)를 함유한 LNP와 PEG-DLPE(r2=0.99)를 0.5-1.5mol% 함유한 LNP의 경우 mCherry 발현이 선형적으로 감소했다(r2=0.99). 데이터에 따르면 또 다른 디-C12-PEG-지질 접합체인 PEG-DLPE는 LNP 제형에서 PEG-DMG만큼 효과적이었다. 이 기술은 LNP에 높은 mRNA 포집 효율을 제공하고, LNP 크기에 농도 의존적 효과를 미치며, 동결 및 해동 시 LNP의 구조적 불안정성을 방지하고, PEG-DMG와 유사한 mRNA 형질 전환 활성을 가진 LNP를 제공하며, 더 높은 PEG 밀도에서는 PEG-DMG보다 더 효율적일 수 있다.
실시예 54. 다양한 PS 농도에 따른 LNP의 생체 내 면역원성 비교, 단일 PS 농도에서 PEG-DMG와 PEG-DLG의 비교, 및 표적화 리간드로서 DSPS와 DPPS의 비교.
이 연구의 첫 번째 목적은 마우스에서 가장 높은 항체 역가를 달성할 수 있는 KC3OA 기반 LNP에 통합될 수 있는 특정 양의 PS 표적화 지질이 있는지 확인하는 것이었다. 이는, 0, 2, 3.5, 5, 6.5 또는 9 mol% DPPS(잔부는 DPPS+DSPC의 합이 전체 지질의 10 mol%가 되게 하는 DSPC임)를 첨가한, mRNA VRN029(N/P=5.25)를 캡슐화하는 PEG-DMG 함유 LNP를 생산하고, 0.3 μg LNP로 제형화된 mRNA(n=5)를 마우스에 투여하고, 20일차에 혈청을 수집하여 항-스파이크 항체 역가를 분석함으로써 테스트되었다. LNP는 실시예 9에 설명된 대로 만들어지고 특성화되었으며, 마우스들을 면역화시키고 항-스파이크 항체 역가를 실시예 35에서와 같이 결정했다. 20일차 역가 데이터는 도 43A에 도시되어 있다. DPPS-NH4 함량에 대한 현저한 의존성이 관찰되었으며, 활성에 최적인 범위는 2.0-5.0 mol%인 것으로 나타났다. DPPS가 없는(비표적화된) LNP에 대한 각 제형들의 기하평균 역가의 비율을 표 69에 나타낸다. 실시예 54에서 사용된 LNP의 지질 조성과 생물물리학적 특성을 각각 표 70과 71에 기재한다.
표 69. 20일차 혈청 항스파이크 항체 역가에서 주어진 제형과 비표적화된 변형체(DPPS 표적화 지질이 포함되지 않은 KC3OA) 간의 배수 차이.
위의 데이터로부터, 최적의 DPPS mol%는 2-5mol% 범위에 있는 것으로 나타났다. 3.5mol%의 DPPS를 함유하고 PEG-DLG 또는 PEG-DMG의 양이 다른 일련의 LNP들을 제조하여 특성화하고, 마우스를 0.3μg LNP로 제형화된 mRNA로 면역화했다. ALC-0315 LNP를 대조군으로 준비했다. Chol 함량의 mol%를 비례적으로 감소시켜 KC3-OA LNP에 다양한 양의 PEG-DMG 또는 PEG-DLG를 포함시켰다(KC3OA/DSPC/DPPS/Chol/PEG 지질 48/6.5/3.5/42-X/X 몰부, X=0.5, 1.0, 1.5, 2.0). 항스파이크 역가는 초기 프라임 투여 후 2주 후인 35일차에 측정되었다(도 43B). PEG-DMG(제형 16, 15 및 5는 각각 0.5, 1.0 및 1.5 mol% PEG-DMG 함유, 표 70)의 경우 항체 역가에 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 평균 LNP 크기는 각각 145, 125 및 103nm였으며 크기는 PEG-지질 함량에 반비례하는 것으로 나타났다(표 71). 또한, 1.0, 1.5 또는 2.0 mol% PEG-DLG를 함유한 제형의 경우 역가에 있어서 유의미한 변화가 관찰되지 않았고, 이들 제형들을 면역원성 판독으로 구별할 수 없었다. 이들 제형의 LNP Z-평균 입자 크기는 1.0, 1.5 및 2.0 mol% 각각에서 113, 94 및 88 nm로 PEG-DLG 함량과 반비례 관계를 나타냈다. 3.5 mol% DPPS로 표적화된 KC3-OA LNP에서 얻은 데이터는 다양한 PEG-DMG와 PEG-DLG 농도에서 유사했으며, 이는 PEG-DLG가 LNP 제형에서 PEG-DMG의 대체제로 사용될 수 있음을 보여주었다. PEG-지질 정체성이나 농도에 관계없이 DPPS로 표적화된 모든 KC3-OA 제형들은 ALC-0315 대조 제형이나 비표적화된 KC3-OA LNP보다 훨씬 더 활성이 높았다.
또한, 표적화 성분(5 mol%)으로 DSPS-Na를 사용하는 KC3-OA 기반 LNP 제형과 1.5 mol% PEG-DMG 또는 PEG-DLG를 사용한 KC3-OA 기반 LNP 제형의 비교를 완료하였으며 SD35 역가 데이터를 도 43C에 도시하였다. 5mol% DPPS, 1.5mol% PEG-DMG를 첨가한 KC3OA 비교 제형도 테스트하였다. 데이터에 따르면 이러한 제형은 유사한 면역원성을 가지고 있어 DSPS와 DPPS가 수지상 세포를 표적화하는 데 있어 동등하며, PEG-DLG는 바람직하지 않은 항-PEG 항체 반응을 유발할 가능성이 낮은 LNP 제형에서 PEG-DMG의 효과적인 대안으로 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 54에서 사용된 제형의 모든 지질 조성이 표 70에 제시되어 있으며, 크기, 제타 전위, mRNA 포집률과 같은 생물물리학적 특성은 표 71에 나타나 있다. 모든 LNP의 총 인지질은 10 mol%이며, 다양한 양의 포스파티딜세린을 포함시킨 후 그 차이는 DSPC로 채운다.
표 70. 실시예 54에서 사용된 LNP 제형 세부 정보.
표 71. %EE는 mRNA 캡슐화 효율을 나타낸다. F/T는 동결/해동을 의미한다.
LNP 제형과 특성화 데이터는 각각 표 69와 70에 나타낸다. LNP의 %EE는 제형에 따라 79.2 내지 91.6% 범위였으며 동결-해동 시 2.5% 미만으로 변화하였다. 완충액 교환과 멸균 여과 후 LNP 입자 크기는 제형에 따라 80.9 내지 145.3nm 범위였으며, 동결 및 해동 시 크기가 5% 미만으로 변화하였다.
표 72. LNP에서 0.3μg mRNA로 처리한 마우스에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체의 로그 변환된 역수 혈청 역가를 0일차와 21일차에 측정: 채혈 시간 35일차(부스트). 로그 역가는 평균 ±표준 편차(중앙값)로 표시된다.
이 연구는 디라우로일 알킬 사슬을 함유한 면역원성이 낮은 접합 지질이 근육 내 투여되는 LNP 백신과 마찬가지로 국소 투여용으로 개발된 LNP 조성물에 성공적으로 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 55. 다양한 SARS-CoV-2 전장 스파이크 단백질을 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 LNP의 비교.
본 연구의 목적은 BNT162b2(Comeirnaty) 백신(VRN029)에 사용된 것과 동일한 UTR들이 측접한 SARS-CoV-2 전장 스파이크 단백질을 인코딩하는 mRNA를 동일한 내인성 5' 신호 서열과 폴리 A 테일을 함유하지만 ORF 코돈 최적화 및 UTR 최적화 및 서열이 다른 두 개의 다른 mRNA와 비교하는 것이었다. 두 가지 mRNA 변형체는 VRN118(Akagera (AKG) 최적화, HBB UTRs, 서열 번호 3) 및 VRN119 (AKG 최적화, Vernal UTRs, 서열 번호 4). 우리의 가설은 Comirnaty®백신 의약품에 포함된 mRNA의 서열 최적화를 통해 면역원성이 향상될 수 있다는 것이다.
VRN 118의 서열(서열 번호 3)은 아래와 같다.
ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGCCACCATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGACCACCAGGACCCAGCTGCCCCCCGCCTACACCAACAGCTTCACCAGGGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGGAGCAGCGTGCTGCACAGCACCCAGGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGGTTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCCAGCACCGAGAAGAGCAACATCATCAGGGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTGTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGAGTTCAGGGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAGCCCTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGAGGGACCTGCCCCAGGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACATCACCAGGTTCCAGACCCTGCTGGCCCTGCACAGGAGCTACCTGACCCCCGGCGACAGCAGCAGCGGCTGGACCGCCGGCGCCGCCGCCTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCCAGGACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGACTGCGCCCTGGACCCCCTGAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCAGGGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCAGCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTCCAGCAGTTCGGCAGGGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGGGACCCCCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACCCCCTGCAGCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCCACGCCGACCAGCTGACCCCCACCTGGAGGGTGTACAGCACCGGCAGCAACGTGTTCCAGACCAGGGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGCACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGCGCCAGCTACCAGACCCAGACCAACAGCCCCAGGAGGGCCAGGAGCGTGGCCAGCCAGAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACCGAGATCCTGCCCGTGAGCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAACAGGGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAGGACAAGAACACCCAGGAGGTGTTCGCCCAGGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAACTTCAGCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGAGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGACTGCCTGGGCGACATCGCCGCCAGGGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTCAACGGCCTGACCGTGCTGCCCCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCCCAGTACACCAGCGCCCTGCTGGCCGGCACCATCACCAGCGGCTGGACCTTCGGCGCCGGCGCCGCCCTGCAGATCCCCTTCGCCATGCAGATGGCCTACAGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGAGCAGCACCGCCAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGGACGTGGTGAACCAGAACGCCCAGGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCAGCAGCGTGCTGAACGACATCCTGAGCAGGCTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGACAGGCTGATCACCGGCAGGCTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACCCAGCAGCTGATCAGGGCCGCCGAGATCAGGGCCAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGCCAGAGCAAGAGGGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCCCAGAGCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAGGAGAAGAACTTCACCACCGCCCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCAGGGAGGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACCCAGAGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAACACCGTGTACGACCCCCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGGAGCTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGACATCAGCGGCATCAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAGGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTGACCATCATGCTGTGCTGCATGACCAGCTGCTGCAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAGCTGCACTACACCTGATAATAGGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA
VRN 119의 서열(서열 번호 4)은 아래와 같다.
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCACCATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGACCACCAGGACCCAGCTGCCCCCCGCCTACACCAACAGCTTCACCAGGGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGGAGCAGCGTGCTGCACAGCACCCAGGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGGTTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCCAGCACCGAGAAGAGCAACATCATCAGGGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTGTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGAGTTCAGGGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAGCCCTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGAGGGACCTGCCCCAGGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACATCACCAGGTTCCAGACCCTGCTGGCCCTGCACAGGAGCTACCTGACCCCCGGCGACAGCAGCAGCGGCTGGACCGCCGGCGCCGCCGCCTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCCAGGACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGACTGCGCCCTGGACCCCCTGAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCAGGGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCAGCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTCCAGCAGTTCGGCAGGGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGGGACCCCCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACCCCCTGCAGCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCCACGCCGACCAGCTGACCCCCACCTGGAGGGTGTACAGCACCGGCAGCAACGTGTTCCAGACCAGGGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGCACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGCGCCAGCTACCAGACCCAGACCAACAGCCCCAGGAGGGCCAGGAGCGTGGCCAGCCAGAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACCGAGATCCTGCCCGTGAGCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAACAGGGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAGGACAAGAACACCCAGGAGGTGTTCGCCCAGGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAACTTCAGCCAGATCCTGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGAGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGACTGCCTGGGCGACATCGCCGCCAGGGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTCAACGGCCTGACCGTGCTGCCCCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCCCAGTACACCAGCGCCCTGCTGGCCGGCACCATCACCAGCGGCTGGACCTTCGGCGCCGGCGCCGCCCTGCAGATCCCCTTCGCCATGCAGATGGCCTACAGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGAGCAGCACCGCCAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGGACGTGGTGAACCAGAACGCCCAGGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCAGCAGCGTGCTGAACGACATCCTGAGCAGGCTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGACAGGCTGATCACCGGCAGGCTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACCCAGCAGCTGATCAGGGCCGCCGAGATCAGGGCCAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGCCAGAGCAAGAGGGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCCCAGAGCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAGGAGAAGAACTTCACCACCGCCCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCAGGGAGGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACCCAGAGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAACACCGTGTACGACCCCCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGGAGCTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGACATCAGCGGCATCAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAGGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTGACCATCATGCTGTGCTGCATGACCAGCTGCTGCAGCTGCCTGAAGGGCTGCTGCAGCTGCGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAGCTGCACTACACCTGATAATAGCTAGTGACTGACTAGGATCTGGTTACCACTAAACCAGCCTCAAGAACACCCGAATGGAGTCTCTAAGCTACATAATACCAACTTACACTTACAAAATGTTGTCCCCCAAAATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAAAAGAAAGTTTCTTCACAT
LNP는 실시예 9 및 10의 절차에 따라 제조 및 분석되었으며, 이때 지질 조성은 KC3OA/DSPC/DPPS/Chol/PEG-DMG이고 몰비는 48/6.5/3.5/40.5/1.5, mRNA N/P =5.25(KC3OA)이고, ALC-0315/DSPC/Chol/ALC-0159의 경우 몰비는 46.3/9.4/42.7/1.5, mRNA N/P =6.2(ALC-0315)였다. 분석 데이터를 표 73에 나타낸다(약어는 실시예 47, 표 56 참고).
표 73. 실시예 55의 LNP 제형 KC3OA 제형 분석
이 연구에 사용된 LNP는 직경이 <100nm이고 80-91%의 양호한 mRNA 포집률을 보였으며 동결-해동 주기를 거친 후에도 이러한 특성에 거의 변화가 없었다. 이들 LNP의 면역원성을 실시예 35와 마찬가지로 Balb/C 마우스에서 연구하였는데, 단 투여량은 0.3 μg mRNA였다. 주사 후 20일차(프라임)와 35일차(부스트)에 혈청을 채취하여 항스파이크 역가를 평가하였으며, 그 결과를 도 44에 제시했다.
표 74. 다양한 스파이크-코딩 mRNA를 함유한 LNP로 처리한 마우스에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체의 로그 변환된 역수 혈청 역가. 로그 역가는 평균 ±표준 편차(중앙값)로 표시된다.
동일한 N/P = 5.25 비율에서 동일한 LNP 제형(KC3OA/DSPC/DPPS/Chol/PEG-DMG 48.5/5/5/40.5/1.5 mol%)으로 제형화된 mRNA는 VRN118과 VRN119 모두에서 VRN029보다 우수한 역가를 나타냈고(평균 ~1.5배 더 높음), VRN029의 KC3OA/5% PS 제형은 ALC-0315 제형보다 ~35배 더 높았다.
실시예 32는 KC3-OA PS로 표적화된 LNP가 시험관 내 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 ALC-0315 제형보다 mCherry 신호가 더 크다는 것을 보여주는데, 여기서 두 제형 모두 동일한 mRNA를 포함하고 있다. 실시예 45에서는 동일한 mRNA를 사용하는 ALC-0315 제형보다 MutuDC1940 뮤린 DC 세포에서 시험관 내에서 유사하게 더 우수한 mCherry 신호가 관찰되었다. 실시예 54와 55는 PS로 표적화된 LNP가 ALC-0315 기반 LNP보다 유리하다는 것을 보여주는데, 둘 다 마우스에서 항스파이크 역가를 생성하기 위해 SARS-CoV2 mRNA 서열(VRN029)을 사용하였다. 이 실시예에서, DPPS로 표적화된 KC3-OA LNP가 추가적인 서로 다른 두 가지 SARS-CoV2 mRNA 서열들(VRN118 및 VRN119)을 사용하여 SD20(초기 면역화 후 3주)에서 ALC-0315 기반 제형들 보다 우수한 면역원성을 가지는 것으로 확인되었다. 이러한 데이터를 종합해 보면, ALC-0315 기반 제형보다 KC3-OA/PS 기반 LNP에서 관찰된 향상된 면역원성은 mRNA가 아닌 지질 운반체 때문이라는 것을 알 수 있다.
실시예 56. LNP 제형 및 용량이 마우스의 SARS-COV-2 스파이크 mRNA의 면역원성에 미치는 영향
이 연구의 목표는 Comirnaty®및 Spikevax®의 공지된 mRNA-LNP 백신에 존재하는 LNP 지질 제형의 면역원성을 마우스에서 1, 0.3 및 0.1μg mRNA VRN029 용량에서 KC3OA/5% DPPS와 비교하는 것이었다. Comirnaty®Spikevax®에 대해 발표된 정보에 해당하는 제형들의 조성물이 준비되었으며, 이들의 지질 조성을 아래 표 75에 나타내었다. 또한 KC3OA/5% DPPS의 조성도 나타낸다. 모든 제형은 이전에 설명한 대로(실시예 35) NanoAssemblr을 사용하여 N/P = 각각 N/P = 6.25, 5.0 및 5.25로 제조되었으며 -80℃에서 보관하기 위해 15 mM Tris, 20% 수크로스, pH 7.4로 정제되었다.
표 75. 실시예 56 및 도 45A에서 사용된 제형들의 지질 조성
상기 제형의 생물학적 특성을 아래 표 76에 나타낸다. 약어에 대해서는 실시예 47, 표 56을 참고한다.
표 76. 실시예 56 및 도 45A에서 사용된 ALC-0315, SM102 및 KC3OA/5% DPPS LNP 제형의 특성화.
동물에게 투여하기 전에 수행된 샘플 준비 조건을 시뮬레이션하기 위해 제형을 동결-해동했다. 동결 및 해동 후 %EE 크기는 1% 미만으로 변화하였고, 크기는 2.5% 미만으로 변화하였다. LNP는 pH 5.0(10 mM MES, 15 mM NaCl) 또는 pH 7.0(10 mM HEPES, 15 mM NaCl) 완충액에 현탁되었을 때 예상했던 대로 제타 전위가 변화했다(양이온 표면 전하에서 중성 표면 전하로 변화하였음). Balb/C 마우스에 50 μL 용량의 LNP로 제형화된 mRNA 1 μg, 0.3 μg 또는 0.1 μg을 뒷다리 근육 주사를 통해 투여하고 3주 후에 다시 투여했으며, 20일차 및 35일차에 실시예 35에 설명된 바와 같이 혈청 항체 역가를 측정했다(도 45A, 표 77).
모든 제형에서 항체 역가의 용량 의존성이 관찰되었다. ALC-0315와 SM-102는 고용량에서 비슷한 역가를 보였지만, ALC-0315 제형의 경우 비선형적 의존성이 발견되었으며, SM-102에 비해 0.1μg 용량에서는 생산성이 떨어졌다. 대조적으로, 우리는 KC3OA/5% DPPS 제형이 모든 테스트 용량에서 비교 제형인 ALC-0135 및 SM-102보다 더 높은 역가를 생성하며(각각 1μg에서 2.7배 및 3.7배, 0.3μg 용량에서 4.1배 및 3.1배) 그 차이는 저용량에서 크게 증가하였음을 발견하였다(0.1μg, 각각 80배 및 6.1배 더 높음, Mann-Whitney U 검정, P=0.009). 이론에 얽매이지 않고, 우리는 이러한 면역원성의 강력한 증가가 DPPS를 포함시킴으로써, 이 제형에 제공되는 수지상 세포로의 LNP 흡수의 특이성이 증가했기 때문일 가능성이 높다고 가정한다.
표 77. ALC-0315, SM-102 및 KC3OA/5% DPPS LNP를 세 가지 스파이크 mRNA 용량 수준에서 0일차(프라임) 및 21일차(부스트)에 처리한 마우스에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체의 로그 변환된 역수 혈청 역가; 채혈 시간 20일차(프라임) 및 35일차(프라임-부스트). 로그 역가는 평균 ±표준 편차(중앙값)로 표시된다.
또한, 다양한 양의 PEG-DMG를 함유하는 KC3-OA LNP에 제형화된 SARS-COV-2 스파이크 mRNA에 의해 유발된 항-스파이크 항체 반응의 용량 의존성을 결정했다. 몰비 48/5/5/(42-X)/X, X=0.5, 1.0, 1.5의 KC3-OA/DPPS/DSPC/Chol/PEG-DMG를 함유하는 제형을 실시예 9에 따라 제조하였다. LNP 분석 데이터는 표 78이며, 면역원성 결과는 표 79 및 도 45B에 있다.
표 78. 실시예 56 및 도 45B에서 사용된 KC3-OA 제형의 생물물리학적 특성.
표 79. 서로 다른 양의 PEG-DMG를 첨가한 KC3OA/5% DPPS LNP를 세 가지 스파이크 mRNA 용량 수준에서 0일차(프라임) 및 21일차(부스트)에 처리한 마우스에서 항-SARS-COV-2 스파이크 단백질 항체의 로그 변환된 역수 혈청 역가; 채혈 시간 20일차(프라임) 및 35일차(프라임-부스트). 로그 역가는 평균 ±표준 편차(중앙값)로 표시된다.
0.5-1.5 mol% PEG-DMG 범위에서는 각 용량 군의 항체 역가가 유사했다.
실시예 57. 저용량에서 마우스의 SARS-CoV2 스파이크 mRNA의 LNP 제형 면역원성에 대한 PS-표적화의 영향.
실시예 56(도 45A)의 데이터는 KC3-OA 제형의 면역원성 이점이 보다 낮은 투여량의 LNP-제형화 mRNA에서 더욱 두드러진다는 것을 시사했다. 우리는 PS를 포함시켜 DC를 능동적으로 표적화하는 것이 저용량에서 더 특이적일 수 있는지 조사하였는데, 왜냐하면 생체 내에서 LNP 흡수를 담당하는 표적 수용체들의 양이 제한적이고, 고용량에서는 이러한 표적 수용체들이 포화될 수 있기 때문이다. 이로 인해 더 많은 양의 약물이 비표적 조직에 투여되어 효과가 없게 된다. 표적화제로서 5 mol% DPPS를 포함하는 ALS-0135 ICL, KC3-OA ICL 및 KC3-OA ICL을 사용하여 제조된 LNP에 대해, 다음의 지질 조성을 가지는 캡슐화 SARS-COV-2 스파이크 mRNA VRN029를 실시예 9에 따라 제조하였다. ALC-0315/DSPC/Chol/ALC-0159 몰비 46.3/9.4/42.7/1.5(ALC-0315); KC3-OA/DPPS-NH4/DSPC/Chol/PEG-DMG 몰비 48/5/5/40.5/1.5(표적화된 KC3-OA) 및 KC3-OA/DSPC/Chol/PEG-DMG 몰비 48/10 /40.5/1.5(KC3-OA). mRNA는 N/P 5.25로 추가되었다. 상기 제형들을 입자 크기와 캡슐화 효율성(표 80)에 따라 특성화하였고, 실시예 56에 설명된 바와 같이 0일차와 21일차에 0.1μg의 mRNA 용량으로 마우스에 투여하였다. 20일차와 35일차에 혈액 샘플을 채취하여 실시예 35와 동일한 방법으로 항스파이크 항체 역가를 측정했다. 결과(도 46A, 46B)는 0.1μg mRNA의 저용량에서 PS 표적화 효과가 가장 높았으며, PS 표적화 되지 않은 동일한 제형에 비해 항체 역가가 12.7배(20일차, Mann-Whitney U 검정으로 P=0.028) 및 7배(35일차, Mann-Whitney U 검정으로 P=0.009) 증가한 것으로 나타났다. 공개된 비교 LNP 제형(ALC-0315)은 해당 군의 5마리 마우스 중 단 1마리에서만 검출 가능한 역가 신호를 생성했다.
표 80. 실시예 57에서 사용된 ALC-0315, KC3OA/5% DPPS 및 비표적화된 LNP 제형의 특성화
실시예 58. 이온화 가능한 지질인 ALC-0315, SM-102 및 AKG UO-1로 구성된 LNP 제형에서 보다 짧은 알킬 사슬 PEG-DLG 및 PEG-DLPE의 비교.
실시예 52 및 53은 디-C12-PEG-지질 PEG-DLG와 PEG-DLPE가 KC3-OA 기반 LNP 제형들에서 PEG-지질 PEG-DMG를 안정화하는 데 실행 가능한 옵션임을 보여주었다. 본 연구의 목적은 다른 이온화 가능한 양이온 지질을 기반으로 한 PEG-DLG 또는 PEG-DLPE를 함유한 일련의 LNP를 제조하고 특성화하는 것이었다. ICL 계열(ALC-0315 및 SM-102)을 함유한 분지형 에스테르와 지질 테일에 두 개의 메틸렌기에 의해 분리된 올레핀을 함유한 디알킬 이온화 가능한 양이온 지질(AKG-UO-1)이 사용되었다. ALC-0315, SM-102 및 KC3-OA/PS LNP는 실시예 9에 설명된 바와 같이 최종 완충액을 PBS(pH 7.4)로 교환하고 mCherry 인코딩된 mRNA를 사용하여 각각 6.2, 5.0 및 5.25의 N/P 비율로 제조되었다. LNP는 실시예 10에 설명된 바와 같이 입자 크기, mRNA 캡슐화 및 표면 전하에 따라 특성화되었다. LNP 지질 제형화 및 특성화 데이터는 표 81에 나와 있다. (약어에 대해서는 실시예 47, 표 56을 참고한다.)
표 81. PEG-DLG 또는 PEG-DLPE를 활용한 LNP의 지질 조성 및 특성화.
표 81에 나타낸 LNP 제형들은 작은 크기와 양호한 크기 균질성(PDI < 0.2) 및 mRNA 포집 효율성을 나타냈다. 표 81에 기재된 ALC-0315, SM-102 및 AKG UO-1 제형은 다른 실시예에서 표시된 것과 동일한 mol%로 PEG-DMG를 대신 사용한 유사한 제형과 유사한 생물물리학적 특성을 가지고 있다(ALC-0315 및 SM-102 비교는 실시예 24, 표 20 참고, UO-1 비교의 경우 실시예 15, 표 9 참고). 따라서 PEG-DLG와 PEG-DLPE는 다양한 ICL 구조를 기반으로 하는 LNP 제형에 사용하기 위한 안정화 PEG-지질로서 PEG-DMG의 실행 가능한 대체물이다.
본 발명의 다양한 양상들은 단독으로, 조합되어, 또는 전술한 실시예에서 구체적으로 논의되지 않은 다양한 배열로 사용될 수 있으며, 따라서 그 적용이 전술한 설명에서 설명되거나 도면에 예시된 구성 요소들의 세부 사항 및 배열에 제한되지 않는다. 예를 들어, 한 실시형태에서 설명된 양상들은 다른 실시형태에서 설명된 양상들과 임의의 방식으로 조합될 수 있다.
본 발명의 특정한 실시형태들이 논의되었지만, 상기 설명은 예시적인 것이며 제한적이지 않다. 본 명세서를 읽으면 본 발명의 많은 변형이 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 전체 범위는 균등물의 전체 범위와 함께 청구항을 참조하고, 그러한 변형과 함께 명세서를 참조하여 결정되어야 한다.
본 명세서에 참조된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적으로 명시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
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Claims (55)

  1. 다음을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물:
    a. 핵산;
    b. 핵산에 대한 N/P 비율이 3 내지 8이고 다음의 화학 구조를 가지는 이온화 가능한 양이온 지질:(여기서 R1은 1개 또는 2개의 올레핀을 함유하는 C15-C19의 알킬기이고,
    여기서 이온화 가능한 양이온 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량으로 LNP 백신 조성물에 존재하고, 이온화 가능한 양이온 지질은 선택적으로 DLin-KC3-DMA, KC3-01, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), KC3-C15(C8:1) 화합물 3(표 1A), 화합물 8(표 1A) 군에서 선택됨);
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45mol% 총량의 스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질인 하나 이상의 인지질; 및
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량의 접합 지질.
  2. 청구항 1에 있어서, 하나 이상의 인지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는, 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, PS-지질은 DSPS 또는 DPPS인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 제2 인지질은 DSPC, HSPC, DPPC 및 스핑고미엘린으로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 단일불포화 알킬 사슬 또는 이중불포화 알킬 사슬을 포함하며, 여기서 올레핀은 적어도 두 개의 메틸렌기에 의해 분리되는, 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-01, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), KC3-C15(C8:1) 및 화합물 8(표 1A)로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
  7. 청구항 1-6 중 어느 한 항에 있어서, 핵산에 대해 5-6의 N/P 비율을 갖는, 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 핵산은 RNA인, 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 핵산은 mRNA이고, 선택적으로 화학적으로 변형된 RNA이며, 추가로 선택적으로 N-메틸슈도우리딘으로 변형되는, 조성물.
  10. 다음을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물:
    a. 핵산;
    b. 핵산에 대해 N/P 비율이 3 내지 8인 이온화 가능한 양이온 지질(여기서 이온화 가능한 지질은 다음의 화학 구조를 가지고:
    , 여기서 R1은 1개 또는 2개의 올레핀을 함유하는 C15-C19의 알킬기이고,
    여기서 이온화 가능한 양이온 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량으로 LNP 백신 조성물에 존재하고, 이온화 가능한 양이온 지질은 선택적으로 화합물 3(표 1A), 화합물 8(표 1A), DLin-KC3-DMA, KC3-01, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), KC3-C15(C8:1) 군에서 선택됨);
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45mol% 총량의 스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질; 및
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량의 접합 지질.
  11. 청구항 10에 있어서, 제2 인지질은 DSPC, HSPC, 및 스핑고미엘린으로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
  12. 청구항 10-11 중 어느 한 항에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 핵산에 대한 N/P 비율이 5-6인, 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 두 개의 단일불포화 알킬 사슬 또는 두 개의 이중불포화 알킬 사슬을 포함하며, 여기서 올레핀은 적어도 두 개의 메틸렌기에 의해 분리되는, 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-01, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), KC3-C15(C8:1) 및 화합물 8(표 1A)로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민(KC3-OA)인, 조성물.
  16. 청구항 10-15 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 mRNA인, 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, mRNA는 N-메틸슈도우리딘을 이용하여 화학적으로 변형된, 조성물.
  18. 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물:
    a. 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 대 8인 이온화 가능한 양이온 지질;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45mol% 총량의 스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질인 하나 이상의 인지질; 및
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-2.5mol% 총량으로 존재하며 연결 모이어티에 말단이 부착된 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬 및 동일한 연결 모이어티에 말단이 부착된 두 개의 탄화수소 사슬을 갖는 PEG-지질을 포함하는 접합 지질(여기서 탄화수소 사슬은 n-도데실(라우릴) 기 및 n-도데카노일(라우로일) 기에서 독립적으로 선택된 포화된 C12-사슬임).
  19. 청구항 18에 있어서, 연결 모이어티는 글리세릴 기, N-옥시카르보닐 글리세로포스포릴 에탄올아미노카르보닐 기, 옥시카르보닐아미드 기, 또는 옥시아세트아미드 기인, 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 평균 분자량이 2000인 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)인, 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, PEG-지질은 mPEG-1,2-디라우로일글리세롤(PEG-DLG), mPEG-1,2-디라우릴글리세롤(PEG-DLG), PEG-1,2-디라우릴글리세롤, PEG-DLPE, PEG-옥시카르보닐-N,N-디도데실아미드, 또는 mPEG-N,N-디도데실아세트아미드인, 조성물.
  22. 청구항 18-21 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 60-150 nm의 z-평균 입자 크기를 갖고 동결-해동 안정성을 갖는, 조성물.
  23. 청구항 18-22 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 인지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량으로 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하고, 여기서 LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는, 조성물.
  24. 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 인간 백신 조성물:
    a. 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 대 8인 이온화 가능한 양이온 지질;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45mol% 총량의 스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.0 - 10mol% 총량의 포스파티딜글리세롤(PG)을 포함하는 하나 이상의 인지질; 및
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량의 접합 지질.
  25. 청구항 24에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-01, KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1), KC3-C15(C8:1) 및 화합물 8(표 1A)로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
  26. 청구항 24에 있어서,
    a. 스테롤은 콜레스테롤이고,
    b. 포스파티딜글리세롤(PG)은 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG) 및 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG)로 구성된 군에서 선택된 음이온성 인지질인, 조성물.
  27. 청구항 24에 있어서, 핵산은 mRNA이고 이온화 가능한 양이온 지질은 핵산에 대해 4 내지 7의 N/P 비율로 존재하는, 조성물.
  28. 청구항 24에 있어서, 접합 지질은 PEG-DMG, PEG-DLG 및 PEG-DLPE 중에서 선택되는, 조성물.
  29. 청구항 26에 있어서, 하나 이상의 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC)으로 구성된 군에서 선택된 인지질을 포함하는, 조성물.
  30. 지질을 포함하는 핵산 전달 조성물을 만드는 방법으로서, 여기서 지질은 포스파티딜세린을 포함하고, 이 방법은 포스파티딜세린을 에탄올에 용해하는 단계를 포함하며, 여기서 포스파티딜세린은 포스파티딜세린의 암모늄염 형태인, 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 포스파티딜세린은 DPPS인, 방법.
  32. 청구항 30-31 중 어느 한 항에 있어서, 포스파티딜세린은 0.2 mM 이상의 농도로 에탄올에 용해되는, 방법.
  33. 청구항 30-32 중 어느 한 항에 있어서, 암모늄염은 암모늄, 알킬암모늄, 디알킬암모늄, 트리알킬암모늄 및 테트라알킬암모늄으로 구성된 군에서 선택된 암모늄을 포함하는 염인, 방법.
  34. 청구항 30-32 중 어느 한 항에 있어서, 암모늄은 암모니아, 디메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 2-(디메틸아미노)에탄올, 디에탄올아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸-글루카민, 이미다졸, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 4-(2-하이드록시에틸)-모르폴린, 피페라진, 1-(2-하이드록시에틸)-피롤리딘, 트리에탄올아민 또는 트로메타민(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄)으로 구성된 군에서 선택된 암모늄 형태에서 선택되는, 방법.
  35. 청구항 30-32 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 전달 조성물은 청구항 1-29 중 어느 한 항의 조성물인, 방법.
  36. 세포로 핵산을 전달하는 방법으로서, 지질 나노입자(LNP)를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 인간 수지상 세포이고, LNP 조성물은 청구항 30-34 중 어느 한 항의 하나 이상의 단계를 포함하는 공정을 통해 얻어지는, 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, LNP는 청구항 1-29 중 어느 한 항의 이온화 가능한 양이온 지질을 포함하는, 방법.
  38. 청구항 36 또는 37에 있어서, 세포는 인간 또는 동물 대상체 내에 존재하는, 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, LNP는 대상체에게 근육내, 피하, 진피내 또는 국소적으로 투여되는, 방법.
  40. 다음을 포함하는 LNP 조성물:
    a. 핵산(여기서 핵산은 mRNA임);
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤 스테롤;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 대 8인 이온화 가능한 양이온 지질;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25 mol% 총량의 인지질인 하나 이상의 인지질, 여기서 하나 이상의 인지질은 다음으로 구성된 군에서 선택됨:
    i. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS) 지질의 암모늄 염; 및
    ii. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 인지질; 및
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량의 PEG-함유 접합 지질.
  41. 필요로 하는 대상체에게 핵산을 투여하는 방법으로서, 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 핵산 LNP 조성물은 다음을 포함하는, 방법:
    a. 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 대 8인 이온화 가능한 양이온 지질;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45mol% 총량의 스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.0 - 10mol% 총량의 포스파티딜글리세롤(PG)을 포함하는 하나 이상의 인지질; 및
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량의 접합 지질.
  42. 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물:
    a. 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량이고 핵산에 대한 N/P 비율이 3 대 8인 이온화 가능한 양이온 지질;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45mol% 총량의 스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 인지질 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질; 및
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량의 접합 지질.
  43. 청구항 42에 있어서,
    a. 핵산은 mRNA이고;
    b. 이온화 가능한 양이온 지질은 핵산에 대해 4 내지 7의 N/P 비율로 LNP 조성물에 존재하고;
    c. 스테롤은 콜레스테롤이고; 그리고
    d. 접합 지질은 PEG-함유 접합 지질인, 조성물.
  44. 청구항 43에 있어서, 하나 이상의 인지질은 일치하지 않는 아실 사슬 길이를 갖는 적어도 두 개의 인지질을 포함하는, 조성물.
  45. 청구항 44에 있어서, 포스파티딜세린(PS) 지질은 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS)인, 조성물.
  46. 청구항 45에 있어서, 하나 이상의 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC)으로 구성된 군에서 선택된 인지질을 포함하는, 조성물.
  47. 청구항 46에 있어서, 하나 이상의 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디팔미토일포스파티딜-L-세린((L-세린)DPPS)으로 구성되는, 조성물.
  48. 청구항 47에 있어서, PEG-함유 접합 지질은 PEG(2000)-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)인, 조성물.
  49. LNP 조성물로서, 이온화 가능한 지질은 다음의 화학 구조를 가지며:
    ,
    여기서 R1은
    이고,
    여기서 a는 0 또는 1이고; b는 1, 2, 3 또는 4이며, 단 a+b의 합은 1, 2, 3 또는 4이고;
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알킬이며;
    n은 2, 3 또는 4와 동일한 정수인, 조성물.
  50. 청구항 49에 있어서,
    a. R2 및 R3은 각각 메틸이며;
    b. n은 3 또는 4인, 조성물.
  51. 청구항 49에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA, KC3-PA, KC3-C17(8:1) 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물인, 조성물.
  52. 청구항 49-51 중 어느 한 항에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-PA인, 조성물.
  53. 청구항 49-51 중 어느 한 항에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-OA인, 조성물.
  54. 청구항 49-51 중 어느 한 항에 있어서, 이온화 가능한 양이온 지질은 KC3-C17 (C8:1)인, 조성물.
  55. KC3-PA, KC3-C17(8:1) 및 KC3-C15(C8:1)로 구성된 군에서 선택된 이온화 가능한 양이온 지질.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102447831B1 (ko) * 2018-12-27 2022-09-27 코오롱인더스트리 주식회사 멀티 채널 중공사막을 포함하는 연료전지용 막가습기
MX2023006056A (es) 2020-11-25 2023-06-06 Akagera Medicines Inc Nanoparticulas lipidicas para suministro de acidos nucleicos y metodos de uso de las mismas.
WO2025117732A1 (en) * 2023-11-29 2025-06-05 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids and methods of use thereof
CN118206664A (zh) * 2024-02-04 2024-06-18 中国科学院杭州医学研究所 原位生成多功能嵌合抗原受体巨噬细胞的方法及其在免疫治疗中的应用
WO2025180874A1 (en) * 2024-02-27 2025-09-04 Basf Se Substituted 1,3-dioxolane sulfates and their use
WO2025240355A1 (en) * 2024-05-14 2025-11-20 Recode Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticles for extrahepatic delivery

Family Cites Families (285)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
DE3068743D1 (en) 1980-01-16 1984-08-30 Weder Hans G Process and dialysis-installation for the preparation of bilayer-vesicles and their use
US4598051A (en) 1980-03-12 1986-07-01 The Regents Of The University Of California Liposome conjugates and diagnostic methods therewith
US4515736A (en) 1983-05-12 1985-05-07 The Regents Of The University Of California Method for encapsulating materials into liposomes
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5550289A (en) 1985-01-07 1996-08-27 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(1,(1-1)-dialkyloxy)-and N-(1,(1-1)-dialkenyloxy alk-1-yl-N-N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5320906A (en) 1986-12-15 1994-06-14 Vestar, Inc. Delivery vehicles with amphiphile-associated active ingredient
JPH085107B2 (ja) 1988-08-04 1996-01-24 ファナック株式会社 電動式射出成形機における位置決め方式
IL91664A (en) 1988-09-28 1993-05-13 Yissum Res Dev Co Ammonium transmembrane gradient system for efficient loading of liposomes with amphipathic drugs and their controlled release
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
JPH03126211A (ja) 1989-10-12 1991-05-29 Nippon Chemicon Corp 電解コンデンサ用電解液
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
EP0625207A1 (en) 1991-12-17 1994-11-23 The Regents Of The University Of California Gene therapy for cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activity (cftr)
US5858784A (en) 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
EP0672178A4 (en) 1992-02-19 1996-03-20 Baylor College Medicine CELL GROWTH MODULATION WITH OLIGONUCLEOTIDS.
WO1993025673A1 (en) 1992-06-04 1993-12-23 The Regents Of The University Of California In vivo gene therapy with intron-free sequence of interest
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5578475A (en) 1993-07-12 1996-11-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
US5674908A (en) 1993-12-20 1997-10-07 Life Technologies, Inc. Highly packed polycationic ammonium, sulfonium and phosphonium lipids
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
US6075012A (en) 1994-02-11 2000-06-13 Life Technologies, Inc. Reagents for intracellular delivery of macromolecules
US6989434B1 (en) 1994-02-11 2006-01-24 Invitrogen Corporation Reagents for intracellular delivery of macromolecules
EP0807116A4 (en) 1994-06-22 1998-01-07 Megabios Corp CATIONIC AMPHIPHILE
FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
US5627159A (en) 1994-10-27 1997-05-06 Life Technologies, Inc. Enhancement of lipid cationic transfections in the presence of serum
US5800833A (en) 1995-02-27 1998-09-01 University Of British Columbia Method for loading lipid vesicles
AU5979296A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US5811406A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Regents Of The University Of California Dry powder formulations of polynucleotide complexes
US6051429A (en) 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
EP0830368A1 (en) 1995-06-07 1998-03-25 Genta Incorporated Novel carbamate-based cationic lipids
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
JPH11507815A (ja) 1995-06-07 1999-07-13 ジンタ・インコーポレイテッド ホスホン酸基本カチオン性脂質
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US20030069173A1 (en) 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
JP4335310B2 (ja) 1995-06-07 2009-09-30 ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 疎水性脂質−核酸複合中間体を通して調製される脂質−核酸粒子、及び遺伝子移送のための使用
US6339173B1 (en) 1996-07-22 2002-01-15 Promega Biosciences, Inc. Amide-based cationic lipids
WO1997003939A1 (en) 1995-07-21 1997-02-06 Genta Incorporated Novel amide-based cationic lipids
US6330349B1 (en) 1995-11-30 2001-12-11 Chromavision Medical Systems, Inc. Automated method for image analysis of residual protein
US5817856A (en) 1995-12-11 1998-10-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Radiation-protective phospholipid and method
US6284267B1 (en) 1996-08-14 2001-09-04 Nutrimed Biotech Amphiphilic materials and liposome formulations thereof
WO1998017256A1 (en) 1996-10-22 1998-04-30 Dmitri Kirpotin Compound-loaded liposomes and methods for their preparation
US6210707B1 (en) 1996-11-12 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Methods of forming protein-linked lipidic microparticles, and compositions thereof
US5877220A (en) 1997-03-06 1999-03-02 Genta, Incorporated Amide-based oligomeric cationic lipids
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
AU733310C (en) 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
AU7490098A (en) 1997-05-15 1998-12-08 Genzyme Corporation Cationic amphiphile formulations
ATE355826T1 (de) 1997-10-10 2007-03-15 Inex Pharmaceuticals Corp Verfahren zur verkapselung von nukleinsäuren in lipiddoppelschichten
US6410328B1 (en) 1998-02-03 2002-06-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Sensitizing cells to compounds using lipid-mediated gene and compound delivery
CA2271582A1 (en) 1998-05-14 1999-11-14 Sean C. Semple Method for administration of therapeutic agents, including antisense, with repeat dosing
EP1096921B1 (en) 1998-07-20 2003-04-16 Protiva Biotherapeutics Inc. Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
US6900049B2 (en) 1998-09-10 2005-05-31 Cell Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing cell status-specific response elements and methods of use thereof
AU772847B2 (en) 1998-11-12 2004-05-06 Invitrogen Corporation Transfection reagents
US6649780B1 (en) 1998-12-22 2003-11-18 Valentis, Inc. Cationic lipids
EP1173600A2 (en) 1999-04-20 2002-01-23 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
US6696424B1 (en) 1999-05-28 2004-02-24 Vical Incorporated Cytofectin dimers and methods of use thereof
US20010048940A1 (en) 1999-06-18 2001-12-06 Jennifer D. Tousignant Cationic amphiphile micellar complexes
KR100758158B1 (ko) 1999-07-14 2007-09-12 알자 코포레이션 중성 지질중합체 및 그를 함유하는 리포솜 조성물
CA2378430A1 (en) 1999-07-15 2001-01-25 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods and apparatus for preparation of lipid vesicles
JP4782966B2 (ja) 2000-01-10 2011-09-28 イッサム・リサーチ・ディベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム・リミテッド 疾患の治療における脂質コンジュゲートの使用
US6622305B1 (en) 2000-02-25 2003-09-16 Opentv, Inc. System and method for displaying near video on demand
NZ522045A (en) 2000-03-30 2007-05-31 Whitehead Biomedical Inst RNA sequence-specific mediators of RNA interference
MXPA02012045A (es) 2000-06-05 2003-10-15 Dong A Pharm Co Ltd Nuevos derivados de oxazolidinona y proceso para su preparacion.
AU2001275423B2 (en) 2000-06-09 2007-01-11 Regulon, Inc. Encapsulation of polynucleotides and drugs into targeted liposomes
US20030072794A1 (en) 2000-06-09 2003-04-17 Teni Boulikas Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes™) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes
JP2004508359A (ja) 2000-09-06 2004-03-18 ニューロゲン　コーポレイション アリール置換テトラヒドロインダゾール、及び、ｇａｂａ−ａ受容体に対するリガンドとしてのそれらの使用
AU2002214854A1 (en) 2000-10-25 2002-05-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid formulations for target delivery
JP2004521614A (ja) 2000-10-27 2004-07-22 インヴィトロジェン コーポレーション アンチセンスオリゴヌクレオチドを真核細胞に導入する方法
JP5355838B2 (ja) 2000-11-20 2013-11-27 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング キラルな光異性化可能な化合物
IL155991A0 (en) 2000-12-01 2003-12-23 Max Planck Gesellschaft Rna interference mediating small rna molecules
EP1386004A4 (en) 2001-04-05 2005-02-16 Ribozyme Pharm Inc MODULATION OF GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY PROLIFERATION AND GROWTH OF NEURITIES BY METHODS INVOLVING NUCLEIC ACID
US20040142892A1 (en) 2001-04-30 2004-07-22 The University Of British Columbia Autogene nucleic acids encoding a secretable RNA polymerase
WO2002087541A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
US7238367B2 (en) 2001-10-03 2007-07-03 Celator Pharmaceuticals, Inc. Liposome loading with metal ions
US20040063654A1 (en) 2001-11-02 2004-04-01 Davis Mark E. Methods and compositions for therapeutic use of RNA interference
WO2003075889A1 (en) 2002-03-05 2003-09-18 Transave, Inc. An inhalation system for prevention and treatment of intracellular infections
US7074596B2 (en) 2002-03-25 2006-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues
CA2752143C (en) 2002-05-15 2014-09-23 Sutter West Bay Hospitals Delivery of nucleic acid-like compounds
EP2338478B1 (en) 2002-06-28 2014-07-23 Protiva Biotherapeutics Inc. Method for producing liposomes
DE10250870A1 (de) 2002-10-31 2004-05-13 Switch Biotech Ag Zusammensetzung enthaltend Aktivatoren von IK-Kaliumkanälen und Calcineurin-Antagonisten und deren Verwendung
US20040146941A1 (en) 2002-11-04 2004-07-29 Biliang Zhang Chemical encoding technology for combinatorial synthesis
EP2251434B1 (en) 2003-01-16 2014-07-30 The Trustees of The University of Pennsylvania Compositions and methods for siRNA inhibition of ICAM-1
ES2337254T3 (es) 2003-02-14 2010-04-22 Glaxo Group Limited Derivados de carboxamida.
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
DE10314976A1 (de) 2003-04-02 2004-10-14 Bayer Healthcare Ag Verbesserte Penetration von Wirkstoffen in Zellen und Organe
DE50303835D1 (de) 2003-06-18 2006-07-27 Goldschmidt Gmbh Haarbehandlungsmittel und Haarnachbehandlungsmittel zum Schutz vor Schäden durch chemische Behandlung und zur Reparatur bereits geschädigter Haare enthaltend als Wirksubstanz Alkylguanidin-Verbindungen
DE10327871A1 (de) 2003-06-18 2005-01-05 Goldschmidt Ag Verwendung von Alkylguanidin-Verbindungen zur Behandlung und Nachbehandlung von Haaren
AU2004246905B2 (en) 2003-06-18 2010-01-21 Biolab Ltd. Sphingoid polyalkylamine conjugates for vaccination
US20050000030A1 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Dupont Jeffrey Scott Fabric care compositions for lipophilic fluid systems
CN101291653B (zh) 2003-07-16 2012-06-27 普洛体维生物治疗公司 脂质包封的干扰rna
US7803397B2 (en) 2003-09-15 2010-09-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
KR100854211B1 (ko) 2003-12-18 2008-08-26 동아제약주식회사 신규한 옥사졸리디논 유도체, 그의 제조방법 및 이를유효성분으로 하는 항생제용 약학 조성물
EP1547581A1 (en) 2003-12-23 2005-06-29 Vectron Therapeutics AG Liposomal vaccine for the treatment of human hematological malignancies
JP4483300B2 (ja) 2004-01-15 2010-06-16 セイコーエプソン株式会社 光走査装置および画像形成装置
US7470713B2 (en) 2004-02-23 2008-12-30 Bristol-Myers Squibb Company Imidazole based kinase inhibitors
KR101223366B1 (ko) 2004-05-03 2013-01-16 헤르메스 바이오사이언스, 인코포레이티드 약물 전달에 유용한 리포좀
JP2008514547A (ja) 2004-05-23 2008-05-08 ハウシー・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド セラミューテイン・モジュレーター
AU2005247670A1 (en) 2004-05-25 2005-12-08 Astrazeneca Ab 3- {4- (pyridin-3-yl) phenyl} -5- (1H-1, 2, 3-triazol-1-ylmethyl) -1, 3-oxazolidin-2-ones as antibacterial agents
EP1766035B1 (en) 2004-06-07 2011-12-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
WO2005120152A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
EP1773857A4 (en) 2004-07-02 2009-05-13 Protiva Biotherapeutics Inc THE IMMUNE SYSTEM STIMULATING SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
US7749520B2 (en) 2004-07-07 2010-07-06 Statens Serum Institut Compositions and methods for stabilizing lipid based adjuvant formulations using glycolipids
JP4638500B2 (ja) 2004-10-06 2011-02-23 ビーシー キャンサー エージェンシー 治療剤を封入するためのリポソームからなる組成物及び治療剤のリポソーム内での保持性を高めるための方法
CA2587411A1 (en) 2004-11-17 2006-05-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of apolipoprotein b
WO2006102163A2 (en) 2005-03-17 2006-09-28 Invitrogen Corporation Transfection reagents for non-adherent suspension cells
US8188128B2 (en) 2005-05-12 2012-05-29 The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Opioid receptor subtype-selective agents
WO2007015877A2 (en) 2005-07-20 2007-02-08 Kalypsys, Inc. Inhibitors of p38 kinase and methods of treating inflammatory disorders
US9005654B2 (en) 2005-07-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
EP4174179B1 (en) 2005-08-23 2025-05-07 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
US7838658B2 (en) 2005-10-20 2010-11-23 Ian Maclachlan siRNA silencing of filovirus gene expression
JP2006080560A (ja) 2005-10-31 2006-03-23 Kansai Electric Power Co Inc:The 光結合パワー半導体素子
CN101346393B (zh) 2005-11-02 2015-07-22 普洛体维生物治疗公司 修饰的siRNA分子及其应用
US20070218122A1 (en) 2005-11-18 2007-09-20 Protiva Biotherapeutics, Inc. siRNA silencing of influenza virus gene expression
HUE029994T2 (en) 2005-12-08 2017-04-28 Insmed Inc Lipid-based compositions of antiinfectives for treating pulmonary infections
MX2008007195A (es) 2005-12-08 2008-09-10 Hybrigenics Sa Inhibidores de proteasas de cisteina, composiciones farmaceuticas de las mismas y sus aplicaciones terapeuticas.
US7462615B2 (en) 2005-12-08 2008-12-09 Hybrigenics Sa Inhibitors of cysteine proteases, the pharmaceutical compositions thereof and their therapeutic applications
UY30118A1 (es) 2006-01-31 2007-06-29 Tanabe Seiyaku Co Compueto amina trisustituido
TW200808731A (en) 2006-03-30 2008-02-16 Tanabe Seiyaku Co A process for preparing tetrahydroquinoline derivatives
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
EP2104671A2 (en) 2006-09-25 2009-09-30 Mutabilis SA Substituted heterocyclylcarbonylamino-acetic-acid-derivatives as inhibitors of bacterial heptose synthesis, methods for their preparation and biological applications of said inhibitors
WO2008064317A1 (en) 2006-11-22 2008-05-29 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Lipophilic opioid receptor active compounds
WO2008064318A2 (en) 2006-11-22 2008-05-29 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Peripheral opioid receptor active compounds
WO2008091681A2 (en) 2007-01-23 2008-07-31 Housey Gerard M Theramutein modulators
WO2008101029A2 (en) 2007-02-13 2008-08-21 Xenon Pharmaceuticals Inc. Use of thiazole, oxazole and imidazole compounds for the treatment of sodium channel-mediated diseases or conditions
AR065369A1 (es) 2007-02-19 2009-06-03 Novartis Ag Derivados de ciclohexil - amida del acido aril- carboxilico
EP2139476A1 (en) 2007-04-13 2010-01-06 PTC Therapeutics, Inc. Administration of carboline derivatives useful in the treatment of cancer and other diseases
JP4834699B2 (ja) 2007-07-30 2011-12-14 田辺三菱製薬株式会社 医薬組成物
JP4846769B2 (ja) 2007-07-30 2011-12-28 田辺三菱製薬株式会社 医薬組成物
DE102007038957A1 (de) 2007-08-17 2009-02-19 Merck Patent Gmbh 6-Thioxo-pyridazinderivate
TWI461411B (zh) 2007-08-17 2014-11-21 Du Pont 製備５－鹵烷基－４，５－二氫異唑衍生物之方法
EP2238251B1 (en) 2007-12-27 2015-02-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
EP3100718B1 (en) 2008-01-02 2019-11-27 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
JP2011512536A (ja) 2008-02-15 2011-04-21 シグマ−アルドリッチ・カンパニー ジカチオン液体塩およびその使用方法
US8673970B2 (en) 2008-02-21 2014-03-18 Sequoia Pharmaceuticals, Inc. HIV protease inhibitor and cytochrome p450 inhibitor combinations
CN102014932B (zh) 2008-03-05 2015-11-25 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因表达的组合物和方法
CA2718276A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Perkinelmer Las, Inc. Enzymatic substrates for multiple detection systems
AU2009238175C1 (en) 2008-04-15 2023-11-30 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
EP2770057A1 (en) 2008-04-15 2014-08-27 Protiva Biotherapeutics Inc. Silencing of CSN5 gene expression using interfering RNA
WO2009132131A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
ES2331282B1 (es) 2008-06-25 2010-10-21 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) (45%) Hidrazidas de sistemas heterociclicos y su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
EP2313091A4 (en) 2008-07-14 2012-04-04 Univ Kingston PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS WITH RET-HEMMERN AND METHOD FOR THE TREATMENT OF CANCER
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
CA3222620A1 (en) 2008-10-20 2010-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
WO2010048536A2 (en) 2008-10-23 2010-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Processes for preparing lipids
CN111909020A (zh) 2008-11-10 2020-11-10 阿布特斯生物制药公司 用于递送治疗剂的脂质和组合物
JP5212350B2 (ja) 2008-12-24 2013-06-19 住友化学株式会社 含ハロゲン有機硫黄化合物およびその用途
US20120101148A1 (en) 2009-01-29 2012-04-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. lipid formulation
DE102009000641A1 (de) 2009-02-05 2010-08-12 Evonik Goldschmidt Gmbh Verfahren zur Herstellung von antistatisch angerüsteten Kunststeinen für Flächengebilde
CA2754043A1 (en) 2009-03-12 2010-09-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
KR20240015723A (ko) 2009-05-05 2024-02-05 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 조성물
US20120202801A1 (en) 2009-05-27 2012-08-09 Liangxian Cao Methods for treating breast cancer
WO2010138652A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating kaposi sarcoma
US20120157401A1 (en) 2009-05-27 2012-06-21 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating neurofibromatosis
CA3184380A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating cancer and non-neoplastic conditions
US8703726B2 (en) 2009-05-27 2014-04-22 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating prostate conditions
US20120157402A1 (en) 2009-05-27 2012-06-21 Liangxian Cao Methods for treating brain tumors
RU2732574C2 (ru) 2009-06-05 2020-09-21 Инфекшес Дизиз Рисерч Инститьют Синтетические глюкопиранозиллипидные адъюванты
WO2010148422A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Compounds and methods for treating parasitic infestations
EP2449106B1 (en) 2009-07-01 2015-04-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein b
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
EP2449114B9 (en) 2009-07-01 2017-04-19 Protiva Biotherapeutics Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
US8716464B2 (en) 2009-07-20 2014-05-06 Thomas W. Geisbert Compositions and methods for silencing Ebola virus gene expression
WO2011017548A1 (en) 2009-08-05 2011-02-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
WO2011021218A2 (en) 2009-08-12 2011-02-24 Msn Laboratories Limited Process for the preparation of 4-[3,5-bis(2-hydroxyphenyl)-1h-1,2,4-triazol-1-yl]-benzoic acid and its amine salts
ES2620177T3 (es) 2009-10-15 2017-06-27 Guerbet Agentes de formación de imágenes y su uso para el diagnóstico in vivo de enfermedades neurodegenerativas, particularmente la enfermedad de Alzheimer y enfermedades derivadas
CN102712935B (zh) * 2009-11-04 2017-04-26 不列颠哥伦比亚大学 含有核酸的脂质粒子及相关的方法
EP2506879A4 (en) 2009-12-01 2014-03-19 Protiva Biotherapeutics Inc PREPARATIONS OF SNALP CONTAINING ANTIOXIDANTS
WO2011075656A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 The University Of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
CA2785410A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Carlos F. Barbas, Iii Tyrosine bioconjugation through aqueous ene-like reactions
CN102883602B (zh) 2010-02-16 2017-07-18 Uwm研究基金会有限公司 降低细菌的毒力的方法
US8455455B1 (en) 2010-03-31 2013-06-04 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing genes involved in hemorrhagic fever
WO2011141705A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
US9006417B2 (en) 2010-06-30 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
EP2590625B1 (en) 2010-07-06 2017-09-20 GlaxoSmithKline Biologicals SA Cationic oil-in-water emulsions
CN104531812A (zh) 2010-10-01 2015-04-22 现代治疗公司 设计核酸及其使用方法
WO2012068176A1 (en) 2010-11-15 2012-05-24 Life Technologies Corporation Amine-containing transfection reagents and methods for making and using same
ES2921724T1 (es) 2011-12-07 2022-08-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lípidos biodegradables para la administración de agentes activos
BR112014024131A2 (pt) 2012-03-29 2017-07-25 Shire Human Genetic Therapies lipídios catiônicos ionizáveis
EP2925348B1 (en) 2012-11-28 2019-03-06 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Individualized vaccines for cancer
WO2014089239A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved nucleic acid lipid particle formulations
US10821175B2 (en) 2014-02-25 2020-11-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
EP3461904A1 (en) 2014-11-10 2019-04-03 ModernaTX, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
WO2016118697A1 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Phaserx, Inc. Methods, compositions, and systems for delivering therapeutic and diagnostic agents into cells
WO2016176330A1 (en) 2015-04-27 2016-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleoside-modified rna for inducing an adaptive immune response
AU2016285852B2 (en) 2015-06-29 2020-12-17 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2017066964A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxazolidinone compounds and methods of use thereof as antibacterial agents
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
LT3386484T (lt) 2015-12-10 2022-06-10 Modernatx, Inc. Gydomųjų medžiagų sudėtis ir pristatymo metodai
AU2016369977A1 (en) 2015-12-15 2018-06-21 British Columbia Cancer Agency Branch Metal complexed therapeutic agents and lipid-based nanoparticulate formulations thereof
US10799463B2 (en) 2015-12-22 2020-10-13 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
CA3018978A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components
CA3024624A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding porphobilinogen deaminase for the treatment of acute intermittent porphyria
EP3468537A1 (en) 2016-06-14 2019-04-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
US20210284998A1 (en) 2016-10-03 2021-09-16 Precision Nanosystems Inc. Compositions for Transfecting Resistant Cell Types
WO2018119514A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 Precision Nanosystems Inc. Compositions for transfecting resistant cell types
WO2018075592A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Influenza hemagglutinin protein vaccines
KR20190093816A (ko) 2016-10-26 2019-08-26 큐어백 아게 지질 나노입자 mRNA 백신
EP3532103B1 (en) 2016-10-26 2025-12-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
WO2018081638A1 (en) 2016-10-27 2018-05-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleoside-modified rna for inducing an adaptive immune response
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
US10526284B2 (en) 2016-12-21 2020-01-07 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
WO2018126084A1 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Phaserx, Inc. Branched peg molecules and related compositions and methods
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
MX2019011004A (es) 2017-03-15 2020-08-10 Modernatx Inc Compuestos y composiciones para la administracion intracelular de agentes terapeuticos.
EP3615060A4 (en) 2017-04-26 2021-06-09 Merck Sharp & Dohme Corp. HSV ANTIGEN PEPTIDS AND HSV PROTEIN VACCINES
IL315224A (en) 2017-05-08 2024-10-01 Gritstone Bio Inc Neoantigen alphavirus vectors
WO2018213789A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 Modernatx, Inc. Modified messenger rna comprising functional rna elements
US12077501B2 (en) 2017-06-14 2024-09-03 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
EP3668522B1 (en) 2017-08-18 2024-09-11 ModernaTX, Inc. Efficacious mrna vaccines
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
SG11202000765PA (en) 2017-09-08 2020-03-30 Generation Bio Co Lipid nanoparticle formulations of non-viral, capsid-free dna vectors
LT3688162T (lt) 2017-09-29 2024-05-27 Intellia Therapeutics, Inc. Preparatai
WO2019089828A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lamellar lipid nanoparticles
US11167043B2 (en) 2017-12-20 2021-11-09 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
EP3740241A1 (en) 2018-01-18 2020-11-25 eTheRNA Immunotherapies NV Lipid nanoparticles
CA3088546A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Merck Sharp & Dohme Corp. Stabilized rsv f proteins and uses thereof
US20210163928A1 (en) 2018-04-11 2021-06-03 Modernatx, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements
WO2019202035A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Curevac Ag Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination
US11679159B2 (en) 2018-04-29 2023-06-20 Precision NanoSystems ULC Compositions for transfecting resistant cell types
US20210315820A1 (en) 2018-07-30 2021-10-14 Trucode Gene Repair, Inc. Lipid nanoparticle formulations comprising nucleic acid mimics
US20230081530A1 (en) 2018-09-14 2023-03-16 Modernatx, Inc. Methods and compositions for treating cancer using mrna therapeutics
EP3853202A1 (en) 2018-09-19 2021-07-28 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
JP2022501348A (ja) 2018-09-19 2022-01-06 モデルナティエックス インコーポレイテッドModernaTX, Inc. ステロール類似体及びその使用
CA3113651A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
US20220152225A1 (en) 2018-09-27 2022-05-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
WO2020069718A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Rna particles comprising polysarcosine
US12419965B2 (en) 2018-10-01 2025-09-23 BioNTech SE RNA particles comprising polysarcosine
KR20210093232A (ko) 2018-10-09 2021-07-27 더 유니버시티 오브 브리티시 콜롬비아 유기용매와 세제가 없는 형질감염 적격 소포를 포함하는 조성물과 시스템 및 관련 방법
TW202039534A (zh) 2018-12-14 2020-11-01 美商美國禮來大藥廠 KRAS變體mRNA分子
MX2021009245A (es) 2019-01-31 2021-11-12 Modernatx Inc Metodos de preparacion de nanoparticulas lipidicas.
BR112021018526A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Arcturus Therapeutics Inc Método de fabricação de nanopartículas de rna encapsuladas em lipídio
JP7636338B2 (ja) 2019-03-28 2025-02-26 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド コルチコステロイドを含む、ｔｔｒ遺伝子編集およびａｔｔｒアミロイドーシスを治療するための組成物および方法、またはその使用
PH12021552301A1 (en) 2019-03-28 2022-07-04 Intellia Therapeutics Inc Compositions and methods comprising a ttr guide rna and a polynucleotide encoding an rna-guided dna binding agent
EP3947741A4 (en) 2019-03-29 2023-04-12 BioNTech US Inc. CANCER BIOMARKERS FOR LASTING CLINICAL BENEFITS
WO2020200472A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Preparation and storage of liposomal rna formulations suitable for therapy
CN113710811B (zh) 2019-04-15 2024-05-14 精密纳米系统无限责任公司 T细胞基因表达的非病毒修饰
WO2020219941A1 (en) 2019-04-26 2020-10-29 Genevant Sciences Gmbh Lipid nanoparticles
EP3966333A1 (en) 2019-05-07 2022-03-16 ModernaTX, Inc. Polynucleotides for disrupting immune cell activity and methods of use thereof
CA3143577C (en) 2019-06-20 2024-02-20 Precision Nanosystems Inc. Ionizable lipids for nucleic acid delivery
MA56517A (fr) 2019-06-24 2022-04-27 Modernatx Inc Arn messager comprenant des éléments d'arn fonctionnels et leurs utilisations
CN115279743B (zh) 2019-06-29 2024-05-14 精密纳米系统无限责任公司 用于核酸递送的可离子化脂质
MX2022000934A (es) 2019-07-23 2022-02-14 Translate Bio Inc Composiciones estables de nanoparticulas lipidicas cargadas de arnm y procesos de fabricacion.
JP2022543773A (ja) 2019-07-31 2022-10-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 免疫細胞へのｒｎａ干渉剤の送達のための組成物及び方法
EP4009955A1 (en) 2019-08-07 2022-06-15 ModernaTX, Inc. Compositions and methods for enhanced delivery of agents
GEP20257820B (en) 2019-08-14 2025-11-10 Acuitas Therapeutics Inc Improved lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
US20220280427A1 (en) 2019-09-06 2022-09-08 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions comprising closed-ended dna and cleavable lipids and methods of use thereof
WO2021050986A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 Modernatx, Inc. Lnp-formulated mrna therapeutics and use thereof for treating human subjects
EP4031521B1 (en) 2019-09-19 2025-12-24 ModernaTX, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
US20230000773A1 (en) 2019-09-19 2023-01-05 Modernatx, Inc. Novel headgroup lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
JP7638972B2 (ja) 2019-09-19 2025-03-04 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療薬の細胞内送達のための分岐状尾部脂質化合物及び組成物
US20240158458A1 (en) 2019-10-15 2024-05-16 Moderna TX, Inc. Mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
WO2021077066A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Lipid and lipid nanoparticle formulation for drug delivery
CA3155075A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Michael Mitchell Lipid nanoparticles and formulations thereof for car mrna delivery
CN114787127B (zh) 2019-11-22 2024-04-26 世代生物公司 可电离脂质及其纳米颗粒组合物
EP4076647A1 (en) 2019-12-20 2022-10-26 CureVac AG Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
US20230157955A1 (en) 2020-01-08 2023-05-25 Puretech Lyt, Inc. Vesicle compositions for oral delivery
BR112022013837A2 (pt) 2020-01-21 2022-09-13 Etherna Immunotherapies Nv Nanopartículas lipídicas
TW202139976A (zh) 2020-01-31 2021-11-01 美商現代公司 製備脂質奈米顆粒之方法
AU2021216658A1 (en) 2020-02-04 2022-06-23 CureVac SE Coronavirus vaccine
CA3169889A1 (en) 2020-03-03 2021-09-10 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
WO2021178725A1 (en) 2020-03-04 2021-09-10 Verve Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeted rna delivery
EP4117725A4 (en) 2020-03-09 2024-05-29 Arcturus Therapeutics, Inc. CORONAVIRUS VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS
WO2021191265A1 (en) 2020-03-25 2021-09-30 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna particles comprising polysarcosine
CN115916163A (zh) 2020-03-27 2023-04-04 世代生物公司 新型脂质及其纳米颗粒组合物
EP4126947A1 (en) 2020-03-30 2023-02-08 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2021207020A1 (en) 2020-04-06 2021-10-14 Tiba Biotech Llc Carriers for efficient nucleic acid delivery
JP7457833B2 (ja) 2020-04-09 2024-03-28 ヴァーヴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ａｎｇｐｔｌ３の塩基編集および疾患の処置のためにこれを使用する方法
IL297419B2 (en) 2020-04-22 2025-02-01 BioNTech SE Coronavirus vaccine
JP2023524666A (ja) 2020-04-28 2023-06-13 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド インビトロ細胞送達の方法
JP2023524071A (ja) 2020-05-01 2023-06-08 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッド 嚢胞性線維症を治療するための核酸及び方法
WO2021159130A2 (en) 2020-05-15 2021-08-12 Modernatx, Inc. Coronavirus rna vaccines and methods of use
JP2023526284A (ja) 2020-05-15 2023-06-21 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子製剤
MX2023006056A (es) 2020-11-25 2023-06-06 Akagera Medicines Inc Nanoparticulas lipidicas para suministro de acidos nucleicos y metodos de uso de las mismas.
CN113719307B (zh) 2021-07-28 2022-05-03 中国矿业大学 一种液压支架智能供液系统及工作方法

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