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KR20220144416A - 코로나바이러스 백신 - Google Patents

코로나바이러스 백신 Download PDF

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KR20220144416A
KR20220144416A KR1020227028435A KR20227028435A KR20220144416A KR 20220144416 A KR20220144416 A KR 20220144416A KR 1020227028435 A KR1020227028435 A KR 1020227028435A KR 20227028435 A KR20227028435 A KR 20227028435A KR 20220144416 A KR20220144416 A KR 20220144416A
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KR
South Korea
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nucleic acid
composition
rna
isl
epi
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020227028435A
Other languages
English (en)
Inventor
수잔 라우치
한스 볼프강 그로쎄
벤자민 페취
Original Assignee
큐어백 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=74586987&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20220144416(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 큐어백 아게 filed Critical 큐어백 아게
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Abstract

본 발명은 코로나바이러스, 바람직하게는 코로나바이러스 SARS-CoV-2 감염, 또는 이러한 감염, 바람직하게는 COVID-19와 관련된 장애의 치료 또는 예방을 위해 적합한 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조성물들, 폴리펩타이드들 및 백신들에 관한 것이다. 상기 조성물 및 백신은 바람직하게는 적어도 하나의 상기 핵산 서열, 바람직하게는 지질 나노입자(LNP)와 회합된 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 핵산, 조성물, 폴리펩티드, 조합물, 백신, 및 키트의 제1 및 제2 의학적 용도, 및 코로나바이러스 감염, 바람직하게는 Coronavirus 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

코로나바이러스 백신
본 발명은 특히 코로나바이러스, 바람직하게는 코로나바이러스 SARS-CoV-2에 의한 감염, 또는 이러한 감염, 바람직하게는 COVID-19에 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용하기에 적합한 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조성물, 폴리펩타이드 및 백신에 관한 것이다. 조성물 및 백신은 바람직하게는 적어도 하나의 상기 핵산 서열, 바람직하게는 중합체 담체, 다중양이온성 단백질 또는 펩티드, 또는 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP)와 회합된 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 핵산, 상기 조성물, 상기 폴리펩티드, 상기 백신, 및 상기 키트의 제1 및 제2 의학적 용도, 및 코로나바이러스 감염, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
코로나바이러스는 코로나바이러스과(Coronaviridae family)의 외피가 있는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스이다.
그들은 대표적으로 포유류, 조류 및 물고기와 같은 다양한 척추 동물에서 매우 다양한 질병을 유발한다.
코로나바이러스는 유전적으로 매우 가변적이며 개별 바이러스 종(species)은 종 장벽을 극복하여 여러 숙주 종을 감염시킬 수도 있다. 이러한 이동으로 인해 SARS 관련 코로나바이러스(SARS-CoV) 및 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 사람이 감염되었다. 2019/2020년의 전환기에 중국 우한에서 시작된 코로나바이러스 전염병은 nCoV-2019 또는 우한 인간 코로나바이러스(WHCV)라는 예비 이름이 부여된 이전에 알려지지 않은 코로나바이러스에 기인한다. 나중에 이 바이러스는 SARS-CoV-2라는 공식 이름을 갖게 되었다.
COVID-19 질병(Coronavirus disease 2019)으로도 명명되는, SARS-CoV-2로 인한 바이러스 감염의 전형적인 증상에는 발열, 기침, 숨가쁨, 폐렴 및 위장 증상(예: 설사)이 포함된다. 심각한 질병은 중환자실에서 기계적 환기와 지원이 필요한 호흡 부전으로 이어질 수 있다. 2020년 1월 30일 세계보건기구(WHO)는 신종 코로나바이러스 감염증에 대해 세계보건 비상사태를 선포했다. 3월 11일 WHO는 전 세계 110개 이상의 국가와 영토에서 118,000건 이상의 코로나바이러스 질병 사례와 추가적인 글로벌 확산의 지속적인 위험을 지적하면서 COVID-19를 팬데믹(pandemic)으로 선언했다. 2020년 3월 말까지 SARS-CoV-2 감염 사례가 800,000건 이상 확인되었으며, 전 세계 거의 모든 국가에 확산되었고 40,000명 이상의 COVID-19 관련 사망자가 발생했다.
현재 SARS-CoV-2 감염 및/또는 COVID-19 질병에 사용할 수 있는 백신이나 특정 치료법은 없다.
SARS-CoV-2 감염으로 진단된 환자는 개인의 증상과 임상 상태에 따라 보조 치료를 받을 뿐이다. 심각한 세계적 대유행의 상당한 위험 때문에, SARS-CoV-2 감염의 안전하고 효과적인 치료 또는 예방이 시급히 필요하다. 특히 사망률이 높은 고령층을 보호하기 위해서는 백신이 필요하다.
DNA 또는 RNA를 포함한 핵산 기반 백신 접종은 신종 바이러스에 대한 새로운 백신에 대한 유망한 기술을 나타낸다. 핵산은 유전적으로 조작되어 인간 피험자에게 투여될 수 있다. 형질감염된 세포는 암호화된 항원(예: DNA 또는 RNA, 특히 mRNA에 의해 제공됨)을 직접 생산하여 보호 면역학적 반응을 유발한다.
SARS-CoV 감염에 대한 광범위하고 장기적인 보호에서 바이러스 특이적 기억 T 세포의 중추적인 역할이 밝혀졌다(예: Channappanavar, Rudragouda, et al. "Virus-specific memory CD8 T cells provide substantial protection from lethal severe acute respiratory syndrome coronavirus infection." Journal of virology 88.19 (2014): 11034-11044 참조). 바이러스 특이적 CD8 T 세포는 예를 들어 병원체 제거 및 바이러스 감염 후 보호 매개에 필요하다. 따라서 효과적인 SARS-CoV-2 백신은 강력한 기능적 체액성 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라, SARS-CoV-2 특이적 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 반응을 유도한다.
따라서, 본 발명의 목적은 코로나바이러스 감염, 특히 SARS-CoV-2 감염을 위한 핵산 기반 백신을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 콜드체인 없이 보관 및 운송이 가능하고, 신속하고 대량생산가능한(scalable) 코로나바이러스 백신 생산을 가능하게 하는 효과적인 코로나바이러스 백신을 제공하는 것이다.
특허청구범위 및 본 설명에서 추가로 정의된 바와 같이, 이러한 목적은 특히 코로나바이러스 SARS-CoV-2로부터 유래된 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 코딩 서열을 포함하는 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA를 제공함으로써 해결된다.
또한, 그러한 핵산, 또는 예를 들어, 상기 핵산을 포함하는 조성물/백신은 하기 유리한 특징 중 적어도 일부를 갖는 것이 바람직하다:
ㆍ 주사/백신 접종 부위(예: 근육)의 핵산 번역;
ㆍ 매우 낮은 투여량 및 투여 요법에서, 암호화된 SARS-CoV-2 단백질에 대한 항원 특이적 면역 반응의 매우 효율적인 유도;
ㆍ 유아 및/또는 신생아 또는 노인, 특히 노인의 백신접종에 대한 적합성;
ㆍ 근육내 투여를 위한 조성물/백신의 적합성;
ㆍ 코로나바이러스, 예를 들어, SARS-CoV-2에 대한 특이적이고 기능적인 체액성 면역 반응 유도;
ㆍ 코로나바이러스, 예를 들어, SARS-CoV-2에 대한 광범위하고 기능적인 세포 T 세포 반응의 유도;
ㆍ 코로나바이러스, 예를 들어, SARS-CoV-2에 대한 특정 B 세포 기억 유도;
ㆍ 바이러스, 예를 들어, SARS-CoV-2를 효과적으로 중화할 수 있는 기능적 항체의 유도;
ㆍ SARS-CoV-2의 새로운 변이체를 효과적으로 중화할 수 있는 기능적 항체의 유도;
ㆍ 점막 IgA 항체를 유도하여 점막 IgA 면역 유발;
ㆍ 균형 잡힌 B 세포 및 T 세포 반응의 유도;
ㆍ 코로나바이러스 감염, 예를 들어, SARS-CoV-2 또는 이의 새로운 변이체에 대한 방어 면역 유도;
ㆍ 코로나바이러스, 예를 들어, SARS-CoV-2에 대한 면역 보호의 빠른 개시;
ㆍ 코로나바이러스, 예를 들어, SARS-CoV-2에 대한 유도된 면역 반응의 지속성;
ㆍ 백신 접종 또는 면역병리학적 효과로 인한 SARS-CoV-2 감염의 증가 없음;
ㆍ 핵산 기반 SARS-CoV-2 백신으로 인한 항체 의존성 강화(ADE) 없음;
ㆍ 백신 접종 시 원치 않는 높은 반응성을 유발하는, 백신 적용 후 전신 사이토카인 또는 케모카인 반응이 과도하게 유도되지 않음;
ㆍ 백신의 내약성(Well tolerability), 부작용 없음, 무독성;
ㆍ 핵산 기반 백신의 유리한 안정성 특성;
ㆍ 코로나바이러스 백신 생산의 속도, 적응성(adaptability), 단순성 및 확장성(scalability );
ㆍ 충분한 보호를 위해 한 번 또는 두 번의 백신접종만 필요한 유리한 백신 접종 요법;
ㆍ 충분한 보호를 위해 저용량의 조성물/백신만 요구하는 유리한 백신 접종 요법.
정의들
명확성과 가독성을 위해 다음 정의가 제공된다. 이러한 정의에 대해 언급된 모든 기술적 특징은 본 발명의 각각의 및 모든 구현예에서 나타날 수 있다. 추가적인 정의 및 설명은 본 발명 구현예의 맥락에서 구체적으로 제공될 수도 있다.
숫자의 맥락에서 백분율은 각 항목의 총 수에 대한 상대적인 것으로 이해해야 한다. 다른 경우에, 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 백분율은 중량 백분율(wt.-%)로 이해되어야 한다.
약: "약"이라는 용어는 결정인자(determinant) 또는 값이 동일, 즉 100% 동일할 필요가 없는 경우 사용된다. 따라서, "약"은 결정인자 또는 값들이 0.1% 내지 20%, 바람직하게는 0.1% 내지 10% 차이가 날 수 있음을 의미하고; 특히, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 차이 날 수 있다. 당업자는 예를 들어 특정 파라미터 또는 결정인자는 파라미터가 결정된 방법에 따라 약간 다를 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 특정 결정인자 또는 값이 예를 들어 "약 1000개 뉴클레오티드"의 길이를 가진다고 본 명세서에서 정의된다면, 길이는 0.1% 내지 20%, 바람직하게는 0.1% 내지 10%로 차이가 날 수 있고; 특히, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 차이가 날 수 있다. 따라서, 당업자는 그 특정 예에서 길이가 1 내지 200개 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 200개 뉴클레오티드로 다양할 수 있음을, 특히 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200개의 뉴클레오티드일 수 있음을 알 것이다.
적응 면역 반응(Adaptive immune response): 본 명세서에 사용된 용어 "적응 면역 반응"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 면역 체계(적응 면역 체계)의 항원 특이적 반응을 의미하는 것으로 의도된다. 항원 특이성은 특정 병원체 또는 병원체에 감염된 세포에 맞춤화된 반응 생성을 허용한다. 이러한 맞춤형 반응을 수행하는 능력은 일반적으로 "기억 세포"(B-세포)에 의해 신체에서 유지된다. 본 발명의 맥락에서, 항원은 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 (nCoV-2019)로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산(예를 들어, RNA 또는 DNA)에 의해 제공된다.
항원: 본 명세서에 사용된 용어 "항원"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 면역 체계, 바람직하게는 적응 면역 체계에 의해 인식될 수 있고 항원 특이적 면역 반응, 예를 들어, 적응 면역 반응의 일부로서 항체 및/또는 항원 특이적 T 세포의 형성에 의한 항원 특이적 면역 반응을 유발할 수 있는 물질을 지칭하기 위한 것이다. 전형적으로, 항원은 MHC에 의해 T-세포에 제시될 수 있는 펩티드 또는 단백질이거나 이를 포함할 수 있다. 또한 예를 들어, 적어도 하나의 에피토프를 포함하는, 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 (nCoV-2019)로부터의 스파이크 단백질(S)로부터 유래한 펩타이드 또는 단백질의 단편, 변이체 및 유도체는 본 발명의 맥락에서 항원으로 이해된다. 본 발명의 맥락에서, 항원은 본 명세서에 명시된 제공된 핵산의 번역 산물일 수 있다.
항원성 펩티드 또는 단백질: 용어 "항원성 펩티드 또는 단백질" 또는 "면역원성 펩티드 또는 단백질"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 적응 면역 반응을 제공하기 위해 신체의 적응 면역 시스템을 자극하는 (항원 또는 면역원) 단백질에서 유래한 펩타이드 또는 단백질을 의미하는 것으로 의도된다. 따라서 항원/면역원성 펩타이드 또는 단백질은 그것이 유래된 단백질(예를 들어, 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2(nCoV-2019)의 스파이크 단백질(S))의 적어도 하나의 에피토프(본 명세서에 정의된 바와 같음) 또는 항원(본 명세서에 정의된 바와 같음)을 포함한다.
양이온성: 특정 맥락에서 다른 의미가 명확하지 않은 한, "양이온성"이라는 용어는 각 구조가 영구적으로 또는 영구적이지 않지만 pH와 같은 특정 조건에 반응하여 양전하를 띠는 것을 의미한다. 따라서 "양이온성"이라는 용어는 "영구적으로 양이온성" 및 "양이온화가능한(cationisable)"을 모두 포함한다.
양이온화가능한(cationisable): 본 명세서에 사용된 용어 "양이온화가능한"은 화합물, 그룹 또는 원자가 더 낮은 pH에서 양전하를 띠고 환경의 더 높은 pH에서 하전되지 않음을 의미한다. 또한 pH 값을 결정할 수 없는 비수성 환경에서 양이온화가능한 화합물, 그룹 또는 원자는 높은 수소 이온 농도에서 양전하를 띠고 수소 이온의 낮은 농도 또는 활성에서는 전하를 띠지 않는다. 이는 양이온화 또는 다중양이온화 가능한 화합물의 개별 특성, 특히 특정 pH 또는 수소 이온 농도에서 하전되거나 하전되지 않은 각각의 양이온화 가능한 그룹 또는 원자의 pKa에 따라 다르다. 희석된 수성 환경에서, 양전하를 갖는 양이온화가능한 화합물, 그룹 또는 원자의 분율(fraction)은 당업자에게 잘 알려진 소위 Henderson-Hasselbalch 방정식을 사용하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 화합물 또는 모이어티가 양이온화될 수 있는 경우, pH가 약 1 내지 9, 바람직하게는 4 내지 9, 5 내지 8 또는 심지어 6 내지 8, 보다 바람직하게는 9 이하, 8 이하, 7 이하의 pH 값, 가장 바람직하게는 생리학적 pH 값, 예를 들어 약 7.3 내지 7.4, 즉 생리학적 조건하, 특히 생체내 세포의 생리학적 염 조건하의 pH 값에서 양으로 하전되는 것이 바람직하다. 다른 구체예에서, 양이온화가능한 화합물 또는 모이어티는 생리학적 pH 값, 예를 들어, 약 7.0-7.4에서 주로 중성이지만, 더 낮은 pH 값에서 양전하를 띠게 되는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 양이온화성 화합물 또는 모이어티에 대한 pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다.
코딩 서열/코딩 영역: 용어 "코팅(암호화) 서열" 또는 "코딩 영역" 및 본 명세서에 사용된 상응하는 약어 "cds"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 펩티드나 단백질로 번역될 수 있는 여러 뉴클레오티드 트리플렛(triplet)의 서열을 의미하도록 의도된다. 본 발명의 맥락에서 코딩 서열은 시작 코돈으로 시작하고 바람직하게는 정지 코돈으로 끝나는 3으로 나눌 수 있는 다수의 뉴클레오티드로 구성된 DNA 서열, 바람직하게는 RNA 서열일 수 있다.
유래: 핵산의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "유래된", 즉 (다른) 핵산으로부터 "유래"한 핵산은 (다른) 핵산으로부터 유래된 핵산이 예를 들어, 그것이 유래한 핵산과 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가지는 것을 의미한다. 당업자는 서열 동일성이 일반적으로 동일한 유형의 핵산, 즉 DNA 서열 또는 RNA 서열에 대해 계산된다는 것을 알고 있다. 따라서 DNA가 RNA에서 "유래"되거나 RNA가 DNA에서 "유래"되는 경우 첫 번째 단계에서 RNA 서열이 상응하는 DNA 서열로 전환(특히 서열 전체에 걸쳐 우라실(U)을 티미딘(T)으로 대체)되거나 또는 그 반대로 DNA 서열은 상응하는 RNA 서열로 전환(특히 서열 전체에 걸쳐 T를 U로 대체)되는 것으로 이해된다. 그 후, DNA 서열의 서열 동일성 또는 RNA 서열의 서열 동일성이 결정된다. 바람직하게는, 핵산 "유래된" 핵산은 또한 핵산이 유래된 핵산과 비교하여, RNA 안정성을 더욱 증가시키기 위해 및/또는 단백질 생산을 연장 및/또는 증가시키기 위해 변형된 핵산을 의미한다. 아미노산 서열(예: 항원성 펩티드 또는 단백질)과 관련하여 "~로부터 유래된"이라는 용어는 (또 다른) 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열이 그것이 유래한 아미노산 서열과 예를 들어 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성(identity)을 가지는 것을 의미한다.
에피토프: 본 명세서에 사용된 용어 "에피토프"(당업계에서 "항원 결정자(antigen determinant)"라고도 함)는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 T 세포 에피토프 및 B 세포 에피토프를 언급하기 위한 것으로 의도된다. T 세포 에피토프 또는 항원성 펩티드 또는 단백질의 일부는 바람직하게는 약 6 내지 약 20개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는 단편, 예를 들어 MHC 클래스 I 분자에 의해 처리되고 제시되는 단편, 바람직하게는 약 8 내지 약 10개 아미노산 길이, 예를 들어 8, 9 또는 10개(또는 심지어 11개 또는 12개 아미노산), 또는 바람직하게는 약 13 내지 약 20개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는 MHC 클래스 II 분자에 의해 처리되고 제시되는 단편을 포함한다. 이러한 단편은 일반적으로 펩티드 단편과 MHC 분자로 구성된 복합체 형태로 T 세포에 의해 인식됩니다. 즉, 단편은 일반적으로 그 자체의 형태로 인식되지 않는다. B 세포 에피토프는 일반적으로 (천연) 단백질 또는 펩티드 항원의 외부 표면에 위치한 단편이며, 바람직하게는 5 내지 15개의 아미노산, 보다 바람직하게는 5 내지 12개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 6 내지 9개의 아미노산을 가지며, 이는 원래의 형태로 항체에 의해 인식된다. 단백질 또는 펩티드의 이러한 에피토프는 또한 본 명세서에서 언급된 이러한 단백질 또는 펩티드의 임의의 변이체로부터 선택될 수 있다. 이러한 맥락에서 에피토프는 본 명세서에 정의된 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열에서 불연속적이지만 3차원 구조로 함께 결합된 본 명세서에 정의된 단백질 또는 펩티드의 분절(segment)들로 구성된 입체구조(conformational) 또는 불연속 에피토프이거나 단일 폴리펩타이드 사슬로 구성된 연속 또는 선형 에피토프이다.
단편(Fragment): 핵산 서열(예를 들어, RNA 또는 DNA) 또는 아미노산 서열의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "단편"은 일반적으로 예를 들어 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 전장(full-length) 서열의 더 짧은 부분일 수 있다. 따라서, 단편은 일반적으로 전장 서열 내 대응하는 스트레치와 동일한 서열로 구성된다. 본 발명의 맥락에서 서열의 바람직한 단편은 단편이 유래된 분자에서 엔티티의 연속 스트레치에 해당하는 뉴클레오티드 또는 아미노산과 같은 엔티티의 연속 스트레치로 구성되며, 이는 단편이 유래된 전체(즉, 전장) 분자(예: 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 (nCoV-2019)의 스파이크 단백질(S))의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%이다. 단백질 또는 펩티드와 관련하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "단편"은 전형적으로 본 명세서에 정의된 바와 같은 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있으며, 이는 그의 아미노산 서열과 관련하여, 원래 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 N-말단 및/또는 C-말단이 절단된다. 따라서 이러한 절단(truncation)은 아미노산 수준에서 또는 상응하는 핵산 수준에서 발생할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 정의된 이러한 단편에 대한 서열 동일성은 바람직하게 본 명세서에 정의된 전체 단백질 또는 펩티드 또는 이러한 단백질 또는 펩티드의 전체 (코딩) 핵산 분자에 대한 것이다. 단백질 또는 펩티드의 단편은 그러한 단백질 또는 펩티드의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 수 있다.
이종성: 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "이종성" 또는 "이종성 서열"은 다른 유전자, 다른 대립유전자, 또는 예를 들어 다른 종 또는 바이러스로부터 유래된 서열인 서열(예: RNA, DNA, 아미노산)을 지칭하는 것으로서 이해되어야 한다. 2개의 서열이 동일한 유전자 또는 동일한 대립유전자로부터 유도될 수 없는 경우 일반적으로 "이종성"인 것으로 이해된다. 즉, 이종 서열이 동일한 유기체 또는 바이러스에서 유래할 수 있지만 자연 상태로 동일한 핵산 또는 단백질에서 발생하지 않는다.
체액성 면역 반응: 용어 "체액성 면역" 또는 "체액성 면역 반응"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 B 세포 매개 항체 생산 및 선택적으로 항체 생산을 수반하는 보조 과정을 의미한다. 체액성 면역 반응은 일반적으로 Th2 활성화 및 사이토카인 생산, 배 중심 형성(germinal center formation) 및 이소타입 전환, 친화성 성숙 및 기억 세포 생성에 의해 특징지어질 수 있다. 체액성 면역은 또한 병원체 및 독소 중화, 클래식한(classical) 보체 활성화, 식균 작용 및 병원체 제거의 옵소닌 촉진을 포함하는 항체의 이펙터 기능을 나타낼 수 있다.
(서열의) 동일성: 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "동일성"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 두 시퀀스가 동일한 퍼센트를 나타낸다. 두 시퀀스가 동일한 비율을 결정하려면, 예를 들어 본 명세서에 정의된 핵산 서열 또는 아미노산(aa) 서열, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 핵산 서열에 의해 코딩되는 aa 서열 또는 aa 서열 자체가 있는 경우, 서열은 연속적으로 서로 비교하기 위해 정렬될 수 있다. 따라서 예를 들어 제1 서열의 위치는 제2 서열의 대응하는 위치와 비교될 수 있다. 첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 위치에서와 같이 동일한 잔기에 의해 점유된다면, 두 서열은 이 위치에서 동일하다. 그렇지 않은 경우 이 위치에서 다르다. 첫 번째 시퀀스와 비교하여 두 번째 시퀀스에서 삽입이 발생하면 첫 번째 시퀀스에 간격을 삽입하여 추가 정렬을 허용할 수 있다. 첫 번째 시퀀스와 비교하여 두 번째 시퀀스에서 삭제가 발생하면 두 번째 시퀀스에 간격을 삽입하여 추가 정렬을 허용할 수 있다. 2개의 서열이 동일한 비율은 동일한 위치의 수를 하나의 서열에서만 차지하는 위치를 포함하는 위치의 총수로 나눈 함수이다. 두 시퀀스가 동일한 비율은 알고리즘, 예를 들어, BLAST 프로그램에 통합된 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.
면역원(immunogen), 면역원성: 용어 "면역원" 또는 "면역원성"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 면역 반응을 자극/유도할 수 있는 화합물을 의미하도록 의도된다. 바람직하게는, 면역원은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다. 본 발명의 의미에서 면역원은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 SARS-CoV-2 (nCoV-2019)의 스파이크 단백질(S) 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드, 단백질을 코딩하는 하나 이상의 코딩 서열을 포함하는 제공된 핵산의 번역 산물이다. 일반적으로 면역원은 적응 면역 반응을 유발한다.
면역 반응: 용어 "면역 반응"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 특정 항원에 대한 적응 면역계의 특이적 반응(소위 특이적 또는 적응 면역 반응) 또는 선천성 면역계의 비특이적 반응(소위 비특이적 또는 선천성 면역 반응), 또는 이들의 조합을 지칭하는 것으로 의도된다.
면역계: 용어 "면역계"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 유기체를 감염으로부터 보호할 수 있는 유기체 시스템을 의미하는 것으로 의도된다. 병원체가 유기체의 물리적 장벽을 통과하는데 성공하여 이 유기체에 들어가면 선천 면역계는 즉각적이지만 비특이적인 반응을 제공한다. 병원체가 이 선천적 반응을 회피하면 척추동물은 두 번째 보호층인 적응 면역 체계를 갖게 된다. 여기에서 면역 체계는 감염 중 병원체에 대한 인식을 개선하기 위해 반응을 조정한다. 이 개선된 반응은 병원체가 제거된 후에도 면역학적 기억의 형태로 유지되며 적응 면역 체계가 이 병원체와 마주칠 때마다 더 빠르고 더 강력한 공격을 가할 수 있도록 한다. 이에 따르면 면역계는 선천 및 적응 면역계로 나뉜다. 이 두 부분 각각은 일반적으로 소위 체액 및 세포성(cellular) 요소를 포함한다.
선천 면역계: 용어 "선천 면역계(면역 시스템)"(비특이적 또는 특이적이지 않은 면역계로도 알려짐)는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 일반적으로 비특이적 방식으로 다른 유기체에 의한 감염으로부터 숙주를 방어하는 기전과 세포를 포함하는 시스템을 의미하도록 의도된다. 이것은 선천적 시스템의 세포가 일반적인 방식으로 병원체를 인식하고 반응할 수 있지만 적응 면역 시스템과 달리 숙주에 오래 지속되거나 보호 면역을 부여하지 않는다는 것을 의미한다. 선천 면역계는 패턴 인식 수용체, 예를 들어, 톨 유사 수용체, NOD 유사 수용체 또는 RIG-I 유사 수용체 등의 리간드에 의해 활성화될 수 있다.
리피도이드 화합물: 단순히 리피도이드라고도 하는 리피도이드 화합물은 지질 유사 화합물, 즉 지질 유사 물리적 특성을 갖는 양친매성 화합물이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 지질은 리피도이드 화합물을 포함하는 것으로 간주된다.
영구 양이온성: 본 명세서에 사용된 용어 "영구적으로 양이온성"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 각각의 화합물, 또는 그룹 또는 원자가 임의의 pH 값 또는 그 환경의 수소 이온 활성에서 양으로 하전됨을 의미한다. 일반적으로 양전하는 4차 질소 원자의 존재로 인해 발생한다. 화합물이 이러한 양전하를 복수로 운반하는 경우 영구적인 다중양이온성이라고 할 수 있다.
안정화된 RNA: "안정화된 RNA"라는 용어는 그러한 조정이 없는 RNA와 비교하여 환경 요인 또는 효소 분해(예: 엑소- 또는 엔도뉴클레아제 분해)에 의한 해체(disintegration) 또는 분해에 더 안정하도록 변형된 RNA를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 안정화된 RNA는 원핵 또는 진핵 세포와 같은 세포, 바람직하게는 인간 세포와 같은 포유동물 세포에서 안정화된다. 안정화 효과는 예를 들어, 안정화된 RNA를 포함하는 조성물의 보관을 위한 완충 용액 등에서와 같이, 세포 외부에서도 발휘될 수 있다.
T-세포 반응: 본 명세서에 사용된 용어 "세포 면역" 또는 "세포(성) 면역 반응" 또는 "세포(성) T-세포 반응"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 대식세포, 자연 킬러 세포(NK), 항원 특이적 세포독성 T-림프구의 활성화 및 항원에 대한 반응으로 다양한 사이토카인의 방출을 지칭하도록 의도된다. 보다 일반적인 용어로, 세포 면역은 항체에 기초한 것이 아니라 면역계의 세포 활성화에 기초한다. 전형적으로, 세포 면역 반응은 예를 들어, 표면에 외래 항원의 에피토프를 표시하는 세포, 예를 들어, 수지상 세포 또는 다른 세포와 같은 특정 면역 세포에서 아폽토시스을 유도할 수 있는 항원 특이적 세포독성 T-림프구를 활성화하는 것으로 특징지워질 수 있다.
(서열의) 변이체: 핵산 서열의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "변이체"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 다른 핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열의 변이체를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 핵산 서열의 변이체는 변이체가 유래된 핵산 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 삽입, 추가 및/또는 치환을 나타낼 수 있다. 핵산 서열의 변이체는 변이체가 유래된 핵산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일할 수 있다. 변이체는 변이체가 유래된 서열의 기능의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상을 보유했다는 점에서 기능적 변이체이다. 핵산 서열의 "변이체"는 핵산 서열의 적어도 10, 20, 30, 50, 75 또는 100개의 뉴클레오티드의 스트레치에 있어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 뉴클레오티드 동일성을 가질 수 있다.
단백질 또는 펩티드와 관련하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "변이체"는 예를 들어 하나 이상의 치환, 삽입 및/또는 결실된 아미노산(들)과 같이 하나 이상의 변이(들)/치환(들)에서 원래 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드 변이체를 지칭하도록 의도된다. 바람직하게는, 이들 단편 및/또는 변이체는 동일하거나 필적하는 특이적 항원 특성(면역원성 변이체, 항원성 변이체)을 갖는다. 삽입 및 치환은 특히 3차원 구조에 변형을 일으키지 않거나 결합 영역에 영향을 미치지 않는 서열 위치에서 가능하다. 삽입 또는 삭제에 의한 3차원 구조의 수정은 예를 들어, CD 스펙트럼(원형 이색성 스펙트럼(circular dichroism spectra))을 사용하여 쉽게 결정할 수 있습니다. 단백질 또는 펩티드의 "변이체"는 단백질 또는 펩티드의 적어도 10, 20, 30, 50, 75 또는 100 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 단백질의 변이체는 단백질의 기능적 변이체를 포함하며, 이는 본 발명의 맥락에서 변이체가 그것이 유래한 단백질과 비교하여 본질적으로 동일하거나 그것이 유래한 단백질의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%의 면역원성을 나타냄을 의미한다.
본 발명에 대한 간략한 설명
본 발명은 코로나바이러스 SARS-CoV-2(이전에는 nCoV-2019로 불림)에서 유래된, 핵산, 예를 들어 RNA의 코딩 서열에 의해 제공되는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질이 인간 세포에서 효율적으로 발현될 수 있다(실시예 2a, 2b 및 2c)는 발명자들의 놀라운 발견에 기초한다. 훨씬 더 놀랍고 예상치 못하게, 상기 핵산, 예를 들어, 상기 RNA를 포함하는 조성물의 투여는 코로나바이러스, 특히 코로나바이러스 SARS-CoV-2에 대한 항원 특이적 면역 반응을 유도한다(실시예 섹션 참조).
훨씬 더 예기치 않게, 본 발명자들은 본 발명의 코딩 RNA가 높은 바이러스 중화 역가(VNT) 및 T-세포 반응(백신은 이중 양성 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 유도함)에 의해 나타난 바와 같이 높은 수준의 기능성 항체를 유도한다는 것을 보여주었고(예를 들어 실시예 7 및 실시예 10 참조), SARS-CoV-2 챌린지 감염으로부터 햄스터 및 NHP를 보호하기까지 하여(실시예 9 및 실시예 15 참조), 이는 본 발명의 코딩 RNA 또는 조성물/백신이 따라서 백신, 예를 들어, 인간 개체를 위한 백신으로 사용하기에 적합함을 나타낸다.
이러한 발견은 핵산 기반 코로나 바이러스 백신 제공의 기초이다.
제1 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스 백신, 바람직하게는 코로나바이러스 SARS-CoV-2 백신을 위한 핵산을 제공하며, 여기서 상기 핵산은 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체을 코딩하는 하나 이상의 코딩 서열을 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은 조성물, 바람직하게는 첫 번째 측면의 하나 이상의 핵산을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 적합하게는, 조성물은 적어도 하나의 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하거나, 하나 이상의 지질 내에 캡슐화되거나, 하나 이상의 지질과 회합되어 지질 나노입자를 형성하는 적어도 하나의 코딩 RNA를 포함할 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스 백신, 바람직하게는 SARS-CoV-2 조성물 또는 백신을 위한 항원성 폴리펩타이드를 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스 백신, 바람직하게는 SARS-CoV-2 백신을 제공하며, 여기서 백신은 제1 측면의 하나 이상의 핵산, 또는 제2 측면의 조성물, 또는 세 번째 측면의 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다.
제5 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 하나 이상의 핵산, 및/또는 제2 측면의 하나 이상의 조성물, 및/또는 제3 측면의 하나 이상의 폴리펩티드, 및/또는 네 번째 측면의 적어도 하나의 백신을 포함하는 키트 또는 부품 키트(kit of parts)를 제공한다.
제6 측면에서, 본 발명은 2개 이상의 개별 성분을 포함하는 조합을 제공하고, 여기서 2개 이상의 개별 성분은 제1 측면의 2개의 핵산, 및/또는 제2 측면의 2개 이상의 조성물, 및/또는 제3 측면의 2개 이상의 폴리펩티드, 및/또는 제4 측면의 2개 이상의 백신으로부터 선택된다.
본 발명의 추가 측면은 코로나바이러스 감염, 바람직하게는 대상체에서 SARS-CoV-2 감염을 치료 또는 예방하는 방법, 및 핵산, 조성물 및 백신의 제1 및 제2 의학적 용도에 관한 것이다. 또한 상기 핵산, 조성물 또는 백신을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 상세한 설명
본 출원은 본 출원의 설명의 일부인 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다(WIPO 표준 ST.25). 서열 목록에 포함된 정보는 그 전체가 참조로 여기에 포함된다. 본 명세서에서 "서열 번호"가 언급되는 경우, 각각의 식별자를 갖는 서열 목록의 상응하는 핵산 서열 또는 아미노산(aa) 서열이 지칭된다. 많은 서열들의 경우 서열 목록은 추가 세부 정보, 예를 들어, 특정 구조적 특징, 서열 최적화, GenBank(NCBI) 또는 GISAID(epi) 식별자 또는 코딩 능력에 관한 추가 세부 정보와 관련하여 추가 세포 정보를 제공한다. 특히, 이러한 정보는 WIPO 표준 ST.25 시퀀스 목록의 숫자 식별자 <223>에서 제공된다. 따라서, 상기 숫자 식별자 <223> 아래에 제공된 정보는 여기에 그 전체가 명시적으로 포함되며 기본 발명의 설명의 필수적인 부분으로 이해되어야 한다.
코로나바이러스 백신을 위한 핵산 :
제1 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스 백신에 적합한 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면, 즉 본 발명의 핵산과 관련하여 설명된 특정 특징 및 구현예는 마찬가지로 두 번째 측면(본 발명의 조성물), 세 번째 측면(본 발명의 폴리펩티드), 네 번째 측면 (본 발명의 백신), 다섯 번째 측면 (본 발명의 부품의 키트 또는 키트), 또는 의학적 용도 및 치료 방법을 포함하는 추가 측면에 적용 가능하다는 점에 유의해야 한다.
코로나바이러스는 알파코로나바이러스, 베타코로나바이러스, 델타코로나바이러스, 감마코로나바이러스 및 분류되지 않은 코로나바이러스로 분류할 수 있다. 코로나바이러스는 유전적으로 매우 가변적이며 개별 바이러스 종은 종 장벽을 극복하여 여러 숙주 종을 감염시킬 수도 있다. 인간 코로나바이러스에는 SARS 관련 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 및 코로나바이러스 SARS-CoV-2(이전 명칭은 "우한 인간 코로나바이러스" 또는 nCoV-2019)가 포함된다. 따라서 핵산은 코로나바이러스, 바람직하게는 인간 병원체인 코로나바이러스, 가장 바람직하게는 신종 코로나바이러스 SARS-CoV-2(nCoV-2019)에 대한 백신에 적합할 수 있다.
용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이다. 본 명세서에서 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 바람직하게는 DNA(분자) 또는 RNA(분자)를 의미한다. 이는 바람직하게는 용어 폴리뉴클레오티드와 동의어로 사용된다. 바람직하게는, 핵산 또는 핵산 분자는 당/포스페이트-백본의 포스포디에스테르-결합에 의해 서로 공유 연결된 뉴클레오티드 단량체를 포함하거나 이로 구성된 중합체이다. 용어 "핵산 분자"는 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 염기-변형, 당-변형 또는 골격-변형된 DNA 또는 RNA 분자와 같은 변형된 핵산 분자를 포함한다.
제1 측면의 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA는 핵산 기반 조성물 또는 백신의 기초를 형성할 수 있다. 일반적으로 단백질 기반 백신 또는 약독화 생백신은 높은 생산 비용으로 인해 개발 도상국에서 사용하기에 최적이 아니다. 또한, 단백질 기반 백신 또는 약독화 생백신은 개발 시간이 오래 걸리고 2019/2020년 코로나바이러스 SARS-CoV-2 발생과 같은 대유행 바이러스 발생의 신속한 대응에 적합하지 않다. 대조적으로, 본 발명에 따른 핵산 기반 백신은 매우 빠르고 비용 효율적인 생산을 가능하게 한다. 따라서, 기존의 백신에 비해 본 발명의 핵산을 기반으로 하는 백신을 훨씬 저렴하고 빠르게 생산할 수 있어 특히 개발도상국에서 사용하기에 매우 유리하다. 본 발명의 핵산을 기반으로 하는 백신의 또 다른 이점은 단백질 또는 펩티드 기반 백신과 비교하여 온도 안정성일 수 있다. 그러나, 폴리펩타이드에 기초한 백신도 기본 발명의 범위에 속한다(예를 들어, 세 번째 측면 참조).
용어 "핵산 서열", "DNA 서열", "RNA 서열"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어, 뉴클레오타이드의 연속에 대한 특정, 개별적인 순서를 나타낸다.
제1 측면의 바람직한 실시양태에서, 핵산은 SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 코로나바이러스, 또는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체로부터의 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 코딩 서열을 포함한다.
"SARS-CoV-2 코로나바이러스의 항원성 펩타이드 또는 단백질"이라는 용어는 (i) SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터의 항원으로, 이는 항원성 펩타이드 또는 단백질(또는 이의 단편)의 아미노산 서열이 SARS-CoV-2 코로나바이러스 단백질(또는 이의 단편)과 동일하거나, 또는 (ii) SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 유래된 항원으로, 이는 항원성 펩티드 또는 단백질(또는 이의 단편)의 아미노산 서열이 해당 SARS-CoV-2 코로나바이러스 단백질(또는 이의 단편)과 동일하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 제1 측면의 바람직한 실시양태에서, 핵산은 SARS-CoV-2(nCoV-2019) 코로나바이러스로부터 유래된 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질, 또는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코팅하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다.
"SARS-CoV-2(nCoV-2019) 코로나바이러스이거나 이로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질"이라는 용어는 (i) "SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터의(is from a SARS-CoV-2 coronavirus)" 항원으로, 이는 항원성 펩타이드 또는 단백질(또는 이의 단편)의 아미노산 서열이 SARS-CoV-2 코로나바이러스 단백질(또는 이의 단편)과 서열이 동일한 것을 의미하거나, 또는 (ii) "SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 항원(is derived from a SARS-CoV-2 coronavirus)"으로, 이는 항원성 펩타이드 또는 단백질(또는 이의 단편)의 아미노산 서열이 상응하는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 단백질(또는 이의 단편)의 서열과 동일하지 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 적어도 하나의, SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 코로나바이러스이거나 이로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질, 또는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 상기 핵산은 적어도 하나의 이종성 비번역 영역(UTR)을 포함한다.
용어 "번역되지 않은 영역" 또는 "UTR" 또는 "UTR 요소"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 일반적으로 코딩 서열의 5' 또는 3'에 위치한 핵산 분자의 일부를 의미하는 것으로 의도된다. UTR은 단백질로 번역되지 않는다. UTR은 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA의 일부일 수 있다. UTR은 조절 요소라고도 하는 유전자 발현을 제어하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소(regulatory element)는 예를 들어 리보솜 결합 부위, miRNA 결합 부위 등일 수 있다.
여기에 사용된 용어 "인간 코로나바이러스 2019", "우한 인간 코로나바이러스"(WHCV), "nCoV-2019 코로나바이러스", "nCoV-2019", "우한 해산물 시장 폐렴 바이러스", "우한 코로나바이러스", "WHCV 코로나바이러스", "HCoV-19", "SARS2", "COVID-19 바이러스", "hCoV-19", "SARS-CoV-2" 또는 "coronavirus SARS-CoV-2"는 본 발명 전반에 걸쳐 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며, 2019/2020 전환기에 중국 도시 우한에서 출현한 새로운 유행성 코로나바이러스와 관련하여 COVID-19라는 질병을 유발했다. WHO (2020년 2월)에 따르면 이 바이러스는 공식적으로 "SARS-CoV-2"로 명명되고 관련 질병은 공식적으로 "COVID-19"로 명명된다.
바이러스 SARS-CoV-2는 Coronaviridae, 특히 Orthocoronaviruses, 더 구체적으로 Betacoronavirus 속에 속한다. 예시적인 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 아래 목록 A 및 B에 제공된 것을 포함하지만 이에 국한되지 않는 분리주(isolate)이다.
목록 A : 예시적인 SARS-CoV-2 코로나바이러스 분리주(EPI/GISAID):
EPI_ISL_402119, EPI_ISL_402120, EPI_ISL_402121, EPI_ISL_402123, EPI_ISL_402124 (hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019), EPI_ISL_402125, EPI_ISL_402127, EPI_ISL_402128 (hCoV-19/Wuhan/WIV05/2019; WIV05; SARS-CoV-2/Wuhan/WIV05/2019__EPI_ISL_402128), EPI_ISL_402129, EPI_ISL_402130, EPI_ISL_402131, EPI_ISL_402132, EPI_ISL_403928, EPI_ISL_403929, EPI_ISL_403930, EPI_ISL_403931, EPI_ISL_403932, EPI_ISL_403933, EPI_ISL_403934, EPI_ISL_403935, EPI_ISL_403936, EPI_ISL_403937, EPI_ISL_403962, EPI_ISL_403963, EPI_ISL_404227, EPI_ISL_404228, EPI_ISL_404253, EPI_ISL_404895, EPI_ISL_405839, EPI_ISL_406030, EPI_ISL_406031, EPI_ISL_406034, EPI_ISL_406036, EPI_ISL_406223, EPI_ISL_406531, EPI_ISL_406533, EPI_ISL_406534, EPI_ISL_406535, EPI_ISL_406536, EPI_ISL_406538, EPI_ISL_406592, EPI_ISL_406593, EPI_ISL_406594, EPI_ISL_406595, EPI_ISL_406596, EPI_ISL_406597, EPI_ISL_406798, EPI_ISL_406800, EPI_ISL_406801, EPI_ISL_406844, EPI_ISL_406862, EPI_ISL_406716, EPI_ISL_406717, EPI_ISL_406970, EPI_ISL_406973, EPI_ISL_407071, EPI_ISL_407073, EPI_ISL_407079, EPI_ISL_407084, EPI_ISL_407193, EPI_ISL_407214, EPI_ISL_407215, EPI_ISL_407313, EPI_ISL_407893, EPI_ISL_407894, EPI_ISL_407896, EPI_ISL_407976, EPI_ISL_407987, EPI_ISL_407988, EPI_ISL_408008, EPI_ISL_408009, EPI_ISL_408010, EPI_ISL_408430, EPI_ISL_408431, EPI_ISL_408478, EPI_ISL_408479, EPI_ISL_408480, EPI_ISL_408481, EPI_ISL_408482, EPI_ISL_408484, EPI_ISL_408486, EPI_ISL_408488, EPI_ISL_408489, EPI_ISL_408514, EPI_ISL_408515, EPI_ISL_408665, EPI_ISL_408666, EPI_ISL_408667, EPI_ISL_408668, EPI_ISL_408669, EPI_ISL_408670, EPI_ISL_408976, EPI_ISL_408977, EPI_ISL_409067, EPI_ISL_410044, EPI_ISL_410045, EPI_ISL_410218, EPI_ISL_410301, EPI_ISL_410486, EPI_ISL_410531, EPI_ISL_410532, EPI_ISL_410535, EPI_ISL_410536, EPI_ISL_410537, EPI_ISL_410538, EPI_ISL_410539, EPI_ISL_410540, EPI_ISL_410541, EPI_ISL_410542, EPI_ISL_410713, EPI_ISL_410714, EPI_ISL_410715, EPI_ISL_410716, EPI_ISL_410717, EPI_ISL_410718, EPI_ISL_410719, EPI_ISL_410720, EPI_ISL_410984, EPI_ISL_411060, EPI_ISL_411066, EPI_ISL_411218, EPI_ISL_411219, EPI_ISL_411220, EPI_ISL_411902, EPI_ISL_411915, EPI_ISL_411926, EPI_ISL_411927, EPI_ISL_411929, EPI_ISL_411950, EPI_ISL_411951, EPI_ISL_411952, EPI_ISL_411953, EPI_ISL_411954, EPI_ISL_411955, EPI_ISL_411956, EPI_ISL_411957, EPI_ISL_412026, EPI_ISL_412028, EPI_ISL_412029, EPI_ISL_412030, EPI_ISL_412459, EPI_ISL_412862, EPI_ISL_412869, EPI_ISL_412870, EPI_ISL_412871, EPI_ISL_412872, EPI_ISL_412873, EPI_ISL_412898, EPI_ISL_412899, EPI_ISL_412912, EPI_ISL_412966, EPI_ISL_412967, EPI_ISL_412968, EPI_ISL_412969, EPI_ISL_412970, EPI_ISL_412972, EPI_ISL_412973, EPI_ISL_412974, EPI_ISL_412975, EPI_ISL_412978, EPI_ISL_412979, EPI_ISL_412980, EPI_ISL_412981, EPI_ISL_412982, EPI_ISL_412983, EPI_ISL_413014, EPI_ISL_413015, EPI_ISL_413016, EPI_ISL_413017, EPI_ISL_413018, EPI_ISL_413021, EPI_ISL_413022, EPI_ISL_413023, EPI_ISL_413024, EPI_ISL_413213, EPI_ISL_413214, EPI_ISL_413455, EPI_ISL_413456, EPI_ISL_413457, EPI_ISL_413458, EPI_ISL_413459, EPI_ISL_413485, EPI_ISL_413486, EPI_ISL_413488, EPI_ISL_413489, EPI_ISL_413490, EPI_ISL_413513, EPI_ISL_413514, EPI_ISL_413515, EPI_ISL_413516, EPI_ISL_413518, EPI_ISL_413519, EPI_ISL_413520, EPI_ISL_413521, EPI_ISL_413522, EPI_ISL_413523, EPI_ISL_413555, EPI_ISL_413557, EPI_ISL_413558, EPI_ISL_413559, EPI_ISL_413560, EPI_ISL_413562, EPI_ISL_413563, EPI_ISL_413566, EPI_ISL_413572, EPI_ISL_413573, EPI_ISL_413577, EPI_ISL_413579, EPI_ISL_413580, EPI_ISL_413581, EPI_ISL_413582, EPI_ISL_413583, EPI_ISL_413584, EPI_ISL_413587, EPI_ISL_413589, EPI_ISL_413590, EPI_ISL_413591, EPI_ISL_413592, EPI_ISL_413593, EPI_ISL_413594, EPI_ISL_413595, EPI_ISL_413596, EPI_ISL_413597, EPI_ISL_413598, EPI_ISL_413599, EPI_ISL_413600, EPI_ISL_413602, EPI_ISL_413603, EPI_ISL_413604, EPI_ISL_413606, EPI_ISL_413607, EPI_ISL_413608, EPI_ISL_413609, EPI_ISL_413610, EPI_ISL_413611, EPI_ISL_413612, EPI_ISL_413613, EPI_ISL_413614, EPI_ISL_413615, EPI_ISL_413616, EPI_ISL_413617, 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예시적인 SARS-CoV-2 코로나바이러스는 또한 아래 목록 B에 제공된 GenBank Accession 번호에 의해 제공된 유전 정보에 의해 정의되거나 식별될 수 있다.
목록 B : 다양한 SARS-CoV-2 분리주의 GenBank 접근 번호:
NC_045512, LC528232, LC528233, LC529905, MN908947, MN938384, MN938385, MN938386, MN938387, MN938388, MN938389, MN938390, MN970003, MN970004, MN975262, MN975263, MN975264, MN975265, MN975266, MN975267, MN975268, MN985325, MN988668, MN988669, MN994467, MN994468, MN996527, MN996528, MN996529, MN996530, MN996531, MN997409, MT007544, MT012098, MT019529, MT019530, MT019531, MT019532, MT019533, MT020880, MT020881, MT027062, MT027063, MT027064, MT039873, MT039887, MT039888, MT039890, MT044257, MT044258, MT049951, MT050493, MT066156, MT066175, MT066176, MT072688, MT093571, MT093631, MT106052, MT106053, MT106054, MT118835, MT121215, MT123290, MT123291, MT123292, MT123293, MT126808, MT135041, MT135042, MT135043, MT135044, MT152824, MT159705, MT159706, MT159707, MT159708, MT159709, MT159710, MT159711, MT159712, MT159713, MT159714, MT159715, MT159716, MT159717, MT159718, MT159719, MT159720, MT159721, MT159722, MT163716, MT163717, MT163718, MT163719, MT163720, MT163721, MT184907, MT184908, MT184909, MT184910, MT184911, MT184912, MT184913, MT188339, MT188340, MT188341, MT192759, MT192765, MT192772 or MT192773.
SARS-CoV-2 코로나바이러스는 NCBI 분류 ID (NCBI:txid 또는 taxID): 2697049에 따른다.
"nCoV-2019 코로나바이러스의 항원성 펩타이드 또는 단백질" 또는 "SARS-CoV-2 코로나바이러스의 항원성 펩타이드 또는 단백질"이라는 용어는 위에서 설명한 바와 같이 SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 코로나바이러스로부터이거나 이에서 유래한 어떠한 펩타이드 또는 단백질에 관한 것이거나, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체, 바람직하게는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체에 관한 것이다.
"면역원성 단편" 또는 "면역원성 변이체"라는 용어는 대상체에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 해당 SARS-CoV-2(nCoV-2019) 코로나바이러스 항원의 임의의 단편/변이체로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 제1 측면의 핵산의 근육내 또는 피내 투여는 대상체에서 코딩된 SARS-CoV-2 항원(펩티드 또는 단백질)의 발현을 초래한다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현"은 SARS-CoV-2 코로나바이러스 펩티드 또는 단백질의 생산을 지칭하며, 여기서 상기 SARS-CoV-2 코로나바이러스 펩티드 또는 단백질은 제1 측면의 핵산의 코딩 서열에 의해 제공된다. 예를 들어, RNA의 "발현"은 RNA의 폴리펩티드으로의 번역, 예를 들어, SARS-CoV-2 코로나바이러스이거나 이로부터 유래한 펩타이드 또는 단백질으로의 번역을 통한 (예를 들어, 상기 RNA를 세포 또는 대상체에 투여한 후) 단백질의 생산을 지칭한다. DNA의 "발현"은 DNA의 RNA로의 전사 및 후속적인 폴리펩타이드의 번역, 예를 들어, SARS-CoV-2 코로나바이러스이러가 이로부터 유래된 펩타이드 또는 단백질로의 번역을 통한 단백질의 생산(예를 들어, 상기 DNA를 세포 또는 대상체에 투여한 후)을 지칭한다. 용어 "발현" 및 용어 "생산"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 또한, "발현"이라는 용어는 바람직하게는 핵산을 세포 또는 유기체에 투여할 때 특정 펩티드 또는 단백질의 생산에 관한 것이다.
실시양태에서, 핵산은 백신, 바람직하게는 코로나바이러스 백신에 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 SARS-CoV-2 코로나바이러스 백신에 적합하다.
본 발명의 맥락에서, SARS-CoV-2 코로나바이러스이거나 그로부터 유래된 임의의 단백질이 사용될 수 있고 제1 측면의 핵산 또는 코딩 서열에 의해 적합하게 코딩될 수 있다. 적어도 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질이 합성 조작된(synthetically engineered) 또는 인공 코로나바이러스 펩타이드 또는 단백질을 포함하거나 구성될 수 있다는 것은 본 발명의 범위에 추가로 속한다. "합성적으로 조작된" 코로나바이러스 펩타이드 또는 단백질이라는 용어 또는 "인공 코로나바이러스 펩타이드 또는 단백질"이라는 용어는 자연에서 발생하지 않는 단백질에 관한 것이다. 따라서, "인공 코로나바이러스 펩티드 또는 단백질" 또는 "합성적으로 조작된 코로나바이러스 펩티드 또는 단백질"은 예를 들어 천연 코로나바이러스 펩티드 또는 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산이 상이할 수 있고/있거나 추가적인 이종 펩티드 또는 단백질 요소(element)를 포함할 수 있고/있거나, N-말단 또는 C-말단으로 확장되거나 잘릴 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질, 또는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 하나 이상의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질은 구조 단백질, 부속 단백질, 또는 레플리카제 단백질 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체이거나 그로부터 유래된 하나의 펩티드 또는 단백질을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 구조 단백질이거나 구조 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 포함하며, 여기서 구조 단백질은 스파이크 단백질(S), 외피 단백질(E), 막 단백질(M) 또는 뉴클레오캡시드 단백질(N), 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 변이체 중에서 선택된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 상기 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 스파이크 단백질(S), 또는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다.
스파이크 단백질은 헤드(S1)와 스템(S2)으로 구성된 각 단량체와 함께 바이러스 표면에 트리머(trimer)로 존재하는 전형적인 유형 I 바이러스 융합 단백질이다. 개별 전구체 S 폴리펩타이드는 동종트리머를 형성하고 골지체 내에서 글리코실화를 겪을 뿐만 아니라 신호 펩타이드를 제거하기 위한 처리를 하고, 세포 프로테아제에 의해 절단되어 별도의 S1 및 S2 폴리펩타이드 사슬을 생성하며, 이는 동종트리머 내에서 S1/S2 프로토머로 결합된 채로 남아 있으므로 이종다이머의 트리머이다. 스파이크 당단백질의 S1 도메인은 안지오텐신 전환 효소 2 수용체와 (아마도) 결합하고 숙주 세포로의 바이러스 융합을 매개하는 수용체 결합 도메인(RBD), 표적 세포와 초기 접촉할 수 있는 N-말단 도메인, 및 중화 항체에 민감한 2개의 하위 도메인을 포함한다. S2 도메인은 숙주 엔도솜 막과의 막 융합에 관여하는 6개의 헤릭스 번들 융합 코어로 구성되며 중화의 표적이기도 하다. S2 서브유닛은 2개의 헵타드 반복 서열(HR1 및 HR2)과 융합 당단백질의 전형적인 중심 헤릭스, 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명의 핵산에 의해 제공되는 적합한 항원성 펩티드 또는 단백질 서열은 표 1의 1행 내지 41행, A 및 B열에 개시되어 있다. 또한, 상기 적합한 항원성 펩티드 또는 단백질 서열에 관한 추가 정보는 ST25 서열 목록의 <223> 식별자에서 제공된다.
하기에서, 본 발명의 핵산에 의해 제공되는 바람직한 항원성 펩티드 또는 단백질 서열이 상세히 기술된다.
바람직한 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 1-111, 274-11663, 13176-13510, 13521-14123, 22732-22758, 22917, 22923, 22929-22964, 26938, 26939 또는 이들의 어느 하나의 면역원성 단편 또는 면역원성의 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한, 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 행 1 내지 41 참조) 및 각 서열 번호의 ST25 서열 목록의 <223> 식별자에서 제공된다.
아미노산(aa) 잔기 및 스파이크 단백질(S)에서의 그들의 위치에 대한 언급이 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 임의의 번호는, 서열 번호: 1에 따른, SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 코로나바이러스 분리주 EPI_ISL_402128 (BetaCoV_Wuhan_WIV05_2019_EPI_ISL_402128)의 대응 스파이크 단백질(S) 내 각 아미노산 잔기의 위치에 관한 것이다. 개시 내용 전체에 걸쳐 스파이크 단백질(S)에 대한 각 아미노산 위치는 SARS-CoV-2 coronavirus isolate EPI_ISL_402128 (서열 번호: 1)의 스파이크 단백질 (S)에 대해 예시적으로 표시된다. 당업자는 물론 SARS-CoV-2 EPI_ISL_402128 (서열 번호: 1)에 대해 예시적으로 본 명세서에서 제공된 가르침을 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스 분리주, 예를 들어, EPI_ISL_404227, EPI_ISL_403963, EPI_ISL_403962, EPI_ISL_403931, EPI_ISL_403930, EPI_ISL_403929, EPI_ISL_402130, EPI_ISL_402129, EPI_ISL_402128, EPI_ISL_402126, EPI_ISL_402125, EPI_ISL_402124, EPI_ISL_402123, EPI_ISL_402120, EPI_ISL_402119 (추가적인 SARS-CoV-2 isolate들은 표 25의 목록 A 및/또는 목록 B에 제공됨)를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는 분리주들 내 다른 항원성 펩티드 또는 단백질에 물론 응용할 수 있다.
참조 단백질로서 서열 번호: 1을 사용하여 단백질 주석을 수행하였다. SARS-CoV-2 코로나바이러스 참조 단백질의 전장 스파이크 단백질(S)은 1273개의 아미노산 잔기를 가지며 다음 요소로 구성된다:
- secretory signal peptide: 아미노산 위치 aa 1 내지 aa 15 (서열 번호: 28 참조)
- spike protein fragment S1: 아미노산 위치 aa 1 내지 aa 681 (서열 번호: 27 참조)
- receptor binding domain (RBD): 아미노산 위치 aa 319 내지 aa 541 (서열 번호: 13243 참조)
- critical neutralisation domain (CND): 아미노산 위치 aa 329 내지 aa 529 (서열 번호: 13310 참조)
- spike protein fragment S2: 아미노산 위치 aa 682 내지 aa 1273 (서열 번호: 30 참조)
- transmembrane domain (TM) 아미노산 위치 aa 1212 내지 aa 1273 (서열 번호: 49 참조)
- transmembrane domain (TMflex) 아미노산 위치 aa 1148 내지 aa 1273 (서열 번호: 13176 참조)
아미노산 수준의 변화는 서로 다른 SARS-CoV-2 분리주 (예시적인 SARS-CoV-2 분리주가 목록 A 및 목록 B에 제공됨)에서 유래된 스파이크 단백질 사이에서 자연적으로 발생한다는 점에 유의해야 한다. 본 발명의 맥락에서, 이러한 아미노산 변이는 본 명세서에 기재된 스파이크 단백질로부터 유래된 각각의 항원성 펩티드 또는 단백질에 적용될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 제공되고 본 발명의 맥락에서 적합한 항원으로 고려되는 각각의 스파이크 단백질은 하기 아미노산 변이(레퍼런스 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치) 중 하나 이상을 가질 수 있다:
· D614G 또는 G614D
· H49Y 또는 Y49H
· V367F 또는 F367V
· P1263L 또는 L1263P
· V483A 또는 A483V
· S939F 또는 F939S
· S943P 또는 P943S
· L5F 또는 F5L
· L8V 또는 V8L
· S940F 또는 F940S
· C1254F 또는 F1254C
· Q239K 또는 K239Q
· M153T 또는 T153M
· V1040F 또는 F1040V
· A845S 또는 S845A
· Y145H 또는 H145Y
· A831V 또는 V831A
· M1229I 또는 I1229M
· H69 또는 H69del/aa 결손(deleted)
· V70 또는 H70del/aa 결손
· H69_V70 또는 H69del 및 H70del/aa 결손
· A222V 또는 V222A
· Y453F 또는 F453Y
· S477N 또는 N477S
· I692V 또는 V692I
· R403K 또는 K403R
· K417N 또는 N417K
· N437S 또는 S437N
· N439K 또는 K439N
· V445A 또는 A445V
· V445I 또는 I445V
· V445F 또는 F445V
· G446V 또는 V446G
· G446S 또는 S446G
· G446A 또는 A446G
· L455F 또는 F455L
· F456L 또는 L456F
· K458N 또는 N458K
· A475V 또는 V475A
· G476S 또는 S476G
· G476A 또는 A476G
· S477I 또는 I477S
· S477R 또는 R477S
· S477G 또는 G477S
· S477T 또는 T477S
· T478I 또는 I478T
· T478K 또는 K478T
· T478R 또는 R478T
· T478A 또는 A478T
· E484Q 또는 Q484E
· E484K 또는 K484E
· E484A 또는 A484E
· E484D 또는 D484E
· G485R 또는 R485G
· G485S 또는 S485G
· F486L 또는 L486F
· N487I 또는 I487N
· Y489H 또는 H489Y
· F490S 또는 S490F
· F490L 또는 L490F
· Q493L 또는 L493Q
· Q493K 또는 K493Q
· S494P 또는 P494S
· S494L 또는 L494S
· P499L 또는 L499P
· T500I 또는 I500T
· N501Y 또는 Y501N
· N501T 또는 T501N
· N501S 또는 S501N
· V503F 또는 F503V
· V503I 또는 I503V
· G504D 또는 D504G
· Y505W 또는 W505Y
· Q506K 또는 K506Q
· Q506H 또는 H506Q
· Y144 또는 Y144del/aa 결손
· A570D 또는 D570A
· P681H 또는 H681P
· T716I 또는 I716T
· S982A 또는 A982S
· D1118H 또는 H1118D
· L18F 또는 F18L
· D80A 또는 A80D
· D215G 또는 G215D
· L242 또는 L242del/aa 결손
· A243 또는 A243del/aa 결손
· L244 또는 L244del/aa 결손
· L242_A243_L244 또는 L242del 및 A243del 및 L244del/aa 결손
· R246I 또는 I246R
· A701V 또는 V701A
· T20N 또는 N20T
· P26S 또는 S26P
· D138Y 또는 Y138D
· R190S 또는 S190R
· H655Y 또는 Y655H
· T1027I 또는 I1027T
· S13I 또는 I13S
· W152C 또는 C152W
· L452R 또는 R452L
· R346T 또는 T346R
· P384L 또는 L384P
· L452M 또는 M452L
· F456A 또는 A456F
· F456K 또는 K456F
· F456V 또는 V456F
· E484P 또는 P484E
· K417T 또는 T417K
· G447V 또는 V447G
· L452Q 또는 Q452L
· A475S 또는 S475A
· F486I 또는 I486F
· F490Y 또는 Y490F
· Q493R 또는 R493Q
· S494A 또는 A494S
· P499H 또는 H499P
· P499S 또는 S499P
· G502V 또는 V502G
· T748K 또는 K748T
· A522S 또는 S522A
· V1176F 또는 F1176V
하기 아미노산 변이(레퍼런스 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)가 특히 바람직하다:
· H69del, V70del, Y144del, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, 및 D1118H
· L18F, D80A, D215G, L242del, A243del, L244del, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G, 및 A701V
· K417N, E484K, N501Y, 및 D614G
· E484K 및 D614G
· L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, 및 T1027I
· S13I, W152C, L452R, 및 D614G
· delH69, delV70, Y453F, D614G, I692V, 및 M1229I
· E484K, E484P, 또는 E484Q
· G446V
· G485R
일부 실시양태에서, 스파이크 단백질(S)의 단편은 본 발명의 핵산에 의해 코딩될 수 있으며, 여기서 상기 단편은 N-말단이 절단될 수 있고, 전체 길이의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 참조 단백질(서열 번호: 1)의 N-말단 아미노산 1 내지 최대 100개가 결여될 수 있고/있거나 여기에서 상기 단편은 C-말단이 절단될 수 있고, 전체 길이의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 참조 단백질(서열 번호: 1)의 C-말단 아미노산 (aa) 531 내지 최대 aa 1273이 결여될 수 있다. 이러한 "스파이크 단백질(S)의 단편"은 아미노산 치환(하기 기재된 바와 같음)을 추가로 포함할 수 있고, 적어도 하나의 이종 펩티드 또는 단백질 요소(하기 기재된 바와 같음)를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 스파이크 단백질(S)의 단편은 C-말단이 절단될 수 있으며, 이것에 의해 C-말단 막횡단 도메인이 결여될 수 있다(즉, aa 1212 내지 aa 1273 또는 aa 1148 내지 aa 1273 결핍).
다른 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 스파이크 단백질(S)을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 스파이크 단백질(S)은 막횡단 도메인 (TM) (아미노산 위치 aa 1212 내지 aa 1273)이 결여된다. 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 스파이크 단백질(S)을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 스파이크 단백질(S)은 막횡단 도메인의 확장된 부분(TMflex)(아미노산 위치 aa 1148 내지 aa 1273)이 결여된다. 어떠한 이론에 얽매이지 않고, 본 명세서에 정의된 막횡단 도메인(TM 또는 TMflex)이 결여된 스파이크 단백질(S)은 코로나바이러스 백신에 적합할 수 있는데, 그 이유는 이러한 단백질이 가용성이고 세포막에 고정되지 않기 때문이다. 따라서 가용성 단백질은 피험자에게 투여 시 더 높은 농도로 생산(즉, 번역)되어 면역 반응이 개선될 수 있다.
어떠한 이론에 얽매이지 않고, RBD (aa 319 내지 aa 541) 및 CND (aa 29 내지 aa 529) 도메인은 면역원성에 중요할 수 있다. 두 영역 모두 스파이크 단백질의 S1 단편에 위치한다. 따라서, 항원성 펩티드 또는 단백질이 스파이크 단백질의 S1 단편 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 것이 본 발명의 맥락에서 적합할 수 있다. 적합하게는, 이러한 S1 단편은 상기 정의된 바와 같은 적어도 RBD 및/또는 CND 도메인을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 수용체-결합 도메인(RBD; aa 319 내지 aa 541)을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 RBD는 스파이크 단백질 단편, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 절단된 수용체-결합 도메인(truncRBD; aa 334 내지 aa 528)을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 RBD는 스파이크 단백질 단편, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다.
이러한 "스파이크 단백질(S)의 단편"(RBD; aa 319 내지 aa 541 또는 truncRBD, aa 334 내지 aa 528)은 추가로 아미노산 치환(아래에 설명됨)을 포함할 수 있고, 적어도 하나의 이종 펩티드 또는 단백질 요소(아래 설명 참조)를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 스파이크 단백질(S)을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 스파이크 단백질(S)은 스파이크 단백질 단편 S1, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질(스파이크 단백질 단편 S1을 포함하거나 이로 구성됨)은 서열 번호: 1-27, 29, 31-48, 58-111, 274-1345, 1480-1546, 1614-11663, 13377-13510, 13521-14123, 22732, 22737-22758, 22929-22964 중 어느 하나 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 행 1 내지 6, 9, 11-41 참조) 및 각 서열 서열 번호의 ST25 서열 목록의 <223> 식별자 하에 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 스파이크 단백질 단편 S1을 포함하고, 스파이크 단백질 단편 S2 (aa 682 내지 aa 1273)가 적어도 70%, 80%, 90%, 바람직하게는 100% 결여되어 있다. 이러한 실시양태는 S1 단편이 S1 및 S2를 포함하는 전장 단백질의 잠재적인 문제 없이 중화 에피토프를 포함하기 때문에 유리할 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질(본질적으로 스파이크 단백질 단편 S1으로 이루어짐)은 서열 번호: 27, 1279-1345, 29, 1480-1546, 13243-13309, 22733-22736, 26938, 26939 중 어느 하나 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(컬럼 A 및 B의 6행 및 9행 참조) 및 각 서열 서열 번호의 ST25 서열 목록의 <223> 식별자 하에 제공된다.
어떠한 이론에 얽매이지 않고, 항원성 펩티드 또는 단백질은 스파이크 단백질 단편 S1 및 (적어도 단편인) 스파이크 단백질 단편 S2를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 적합할 수 있는데, 그 이유는 면역원성 스파이크 단백질의 형성이 촉진될 수 있기 때문이다.
따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 스파이크 단백질(S)을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 스파이크 단백질(S)은 스파이크 단백질 단편 S1 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체, 및 스파이크 단백질 단편 S2 또는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 실시양태에서, 스파이크 단백질 단편 S1 및 스파이크 단백질 단편 S2를 포함하거나 이로 구성된 적어도 하나의 코딩된 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 1-26, 31-48, 58-111, 274-1278, 1614-11663, 13377-13510, 13521-14177, 22732, 22737-22758, 22929-22964 중 어느 하나 또는 이들 중 어느 하나의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 행 1 내지 5, 11-35, 38 참조) 및 각 서열 서열 번호의 ST25 서열 목록의 <223> 식별자 하에 제공된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 코딩된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 전장 스파이크 단백질 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다.
"전장(full length) 스파이크 단백질"이라는 용어는 본질적으로 전체 스파이크 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 스파이크 단백질, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 스파이크 단백질인 것으로 이해되어야 한다. 따라서, "전장 스파이크 단백질"은 aa 1 내지 aa 1273(참조 단백질: 서열 번호: 1)을 포함할 수 있다. 따라서, 전장 스파이크 단백질은 전형적으로 분비 신호 펩티드, 스파이크 단백질 단편 S1, 스파이크 단백질 단편 S2, 수용체 결합 도메인(RBD), 및 임계 중화 도메인 CND, 및 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 특히, 특정 아미노산 치환(예를 들어, S 단백질의 융합전(pre-fusion) 안정화를 허용하기 위한) 또는 천연 발생 아미노산 결실을 포함하는 변이체도 "전장 스파이크 단백질"이라는 용어에 포함된다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 코딩된 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 1-9, 274-340, 22737, 22739, 22741, 22743, 22745, 22747, 22749, 22751, 22753, 22755, 22757, 22929-22946 중 어느 하나 또는 이들 중 어느 하나의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열들 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어진 전장 S 단백질이다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 1행 참조) 및 각 서열 서열 번호의 ST25 서열 목록의 <223> 식별자 아래에 제공된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산에 의해 제공되는 스파이크 단백질(S)은 융합전(pre-fusion) 형태로 항원을 안정화시키도록 설계되거나 적합화된다. 항체를 중화하기 위한 몇 가지 잠재적인 에피토프가 상기 융합전(pre-fusion) 단백질 형태에서만 접근할 수 있기 때문에 융합전 형태는 효율적인 코로나바이러스 백신의 맥락에서 특히 유리하다. 또한, 사전 융합 형태에서 단백질의 나머지는 예를 들어, 강화된 질병 및/또는 항체 의존성 강화(ADE)와 같은 면역병리학적 효과를 피하기 위한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 코딩하는 핵산(또는 조성물 또는 백신)을 대상체에 투여하면 스파이크 단백질 중화 항체를 유도하고 질병-증진 항체를 유도하지 않는다. 특히, 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 암호화하는 핵산(또는 조성물 또는 백신)을 대상체에 투여하는 것은 예를 들어, 강화된 질병 및/또는 항체 의존성 강화(ADE)와 같은 면역병리학적 효과를 유도하지 않는다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 SARS-CoV-2 코로나바이러스이거나 그로부터 유래된 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질은 스파이크 단백질(S)이거나 또는 이로부터 유래되며, 여기서 스파이크 단백질(S)은 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)이다. 적합하게는, 상기 융합전 안정화된 스파이크 단백질은 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "융합전 형태(pre-fusion conformation)"는 분비 시스템에서 성숙한 코로나바이러스 S 단백질 내로 처리된 후, 그리고 코로나바이러스 S의 융합 후 형태로의 전이를 유도하는 융합생성(fusogenic) 이벤트를 촉발하기 전에 코로나바이러스 S 단백질의 엑토도메인에 의해 채택된 구조적 형태에 관한 것이다.
본 명세서에 기재된 "융합전(pre-fusion) 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)"은 대응하는 천연 코로나바이러스 S 서열로부터 형성된 코로나바이러스 S 엑토도메인 트리머와 비교하여 융합전 형태의 증가된 보유를 제공하는, 천연 코로나바이러스 S 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의한 융합전 입체형태의 "안정화"는 예를 들어 에너지 안정화(예를 들어, 융합후 개방 입체형태에 비해 융합전 입체형태의 에너지 감소) 및 /또는 동역학적 안정화(예를 들어, 융합전 형태에서 융합후 형태로의 전이 속도 감소)일 수 있다. 추가로, 융합전 형태에서 코로나바이러스 S 엑토도메인 트리머의 안정화는 상응하는 천연 코로나바이러스 S 서열과 비교하여 변성에 대한 내성의 증가를 포함할 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 스파이크 단백질은 융합전 형태에서 S 단백질을 안정화시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 사전 융합 형태에서 S 단백질의 막 원위 부분(N-말단 영역 포함)을 안정화시키는 치환을 포함한다.
SARS-CoV-2 코로나바이러스 스파이크 단백질의 안정화는 위치 K986 및/또는 V987에서 적어도 하나의 아미노산을 융합전 형태(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치들)에서 스파이크 단백질을 안정화시키는 아미노산으로 치환함으로써 수득될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 융합전(pre-fusion) 안정화 돌연변이는 위치 K986에서 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 K986은 A, I, L, M, F, V, G, 또는 P (참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치들)로부터 선택된 하나로 치환되고, 바람직하게는 아미노산 K986이 P로 치환된다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 융합전 안정화 돌연변이는 위치 K986에서의 아미노산 치환을 포함하고(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치), 여기서 아미노산 V987은 A, I, L, M, F, V, G 또는 P 로부터 선택되는 하나로 치환되고, 바람직하게는 아미노산 V987은 P로 치환된다.
적합하게는, SARS-CoV-2 코로나바이러스 스파이크 단백질의 안정화는 위치 K986 및 V987(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치들)에서 2개의 연속적인 아미노산을 융합전 형태에서 스파이크 단백질을 안정화시키는 아미노산으로 치환함으로써 수득될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 융합전 안정화 돌연변이는 위치 K986 및 V987에서 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 K986 및/또는 V987(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치들)은 A, I, L, M, F, V, G, 또는 P로부터 선택된 하나로 치환된다.
바람직하게는, 융합전 형태의 안정화는 스파이크 단백질의 잔기 K986 및 V987(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치들)에서 2개의 연속적인 프롤린 치환을 도입함으로써 얻어진다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)은 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이는 다음의 아미노산 치환: K986P 및 V987P (아미노산 위치 참조 서열 번호: 1)을 포함한다.
따라서, 상기 제공된 임의의 NCBI 단백질 접근 번호, 또는 서열 번호: 1-9, 274-340, 22737, 22739, 22741, 22743, 22745, 22747, 22749, 22751, 22753, 22755, 22757, 22929-22946로부터 선택된 임의의 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체는 이러한 아미노산 변화, 바람직하게는 아미노산 치환: K986P 및 V987P(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)를 도입하기 위해 당업자에 의해 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 융합전 안정화 돌연변이는 융합전 상태를 추가로 안정화시키는 공동 충전(cavity filling) 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 돌연변이/아미노산 치환은 T887WN; A1020W; T887WN 및 A1020W; 또는 P1069F(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)를 포함하는 리스트로부터 선택된다.
"공동 충전 돌연변이" 또는 "공동 충전 아미노산 치환"이라는 용어는 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인과 같은 단백질의 단백질 코어 내의 공동(cavity)을 채우는 아미노산 치환에 관한 것이다. 공동은 본질적으로 아미노산 또는 아미노산 체인이 존재하지 않는 접힌 단백질 내의 공극(void)이다. 몇몇 실시양태에서, 공동-충전 아미노산 치환은 융합후 형태로의 전이 후에 붕괴되는 (예를 들어, 감소된 부피를 갖는) 코로나바이러스 S 엑토도메인 코어의 융합전 형태에 존재하는 공동을 채우기 위해 도입된다.
일부 실시양태에서, 다음의 아미노산 치환 F817P, A892P, A899P 및 A942P (참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치) 중 적어도 하나는 (K986P 및 V987P) 치환과 조합될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, SARS-CoV-2 코로나바이러스 스파이크 단백질은 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치):
ㆍ F817P; K986P 및 V987P
ㆍ A892P; K986P 및 V987P
ㆍ A899P; K986P 및 V987P
ㆍ A942P; K986P 및 V987P
특히 바람직한 실시양태에서, SARS-CoV-2 코로나바이러스 스파이크 단백질은 다음의 아미노산 치환(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)을 포함한다:
ㆍ F817P, A892P, A899P, A942P, K986P 및 V987P (S_stab_PP_hex)
따라서, 상기 제공된 임의의 NCBI 단백질 접근 번호, 또는 서열 번호: 1-9, 274-340, 22737, 22739, 22741, 22743, 22745, 22747, 22749, 22751, 22753, 22755, 22757, 22929-22946로부터 선택된 임의의 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체는 이러한 아미노산 변화, 적합하게는 F817P, A892P, A899P, A942P로부터 선택된 아미노산 치환; 또는 (F817P; K986P 및 V987P); (A892P; K986P 및 V987P); (A899P; K986P 및 V987P); (A942P; K986P 및 V987P); (F817P, A892P, A899P, A942P, K986P 및 V987P)로부터 선택된 아미노산 치환을 도입하기 위해 당업자에게 선택될 수 있다 (참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치).
특히 바람직한 실시양태에서, 다음의 아미노산 치환 T887W; A1020W; T887W 및 A1020W; 또는 P1069F 중 적어도 하나는 (K986P 및 V987P) (참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치) 치환과 조합될 수 있다.
다른 특히 바람직한 실시양태에서, SARS-CoV-2 코로나바이러스 스파이크 단백질은 하기 아미노산 치환(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치) 중 적어도 하나를 포함한다:
ㆍ T887W; K986P 및 V987P
ㆍ A1020W; K986P 및 V987P
ㆍ T887W 및 A1020W; K986P 및 V987P
ㆍ P1069F; K986P 및 V987P
따라서, 상기 제공된 임의의 NCBI 단백질 접근 번호, 또는 서열 번호: 1-9, 274-340, 22737, 22739, 22741, 22743, 22745, 22747, 22749, 22751, 22753, 22755, 22757, 22929-22946로부터 선택된 임의의 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체는 이러한 아미노산 변화, 적합하게는 T887W; A1020W; T887W 및 A1020W로부터 선택된 아미노산 치환, 또는 P1069F; 또는 (T887W; K986P 및 V987P); (A1020W; K986P 및 V987P); (T887W 및 A1020W; K986P 및 V987P); (P1069F; K986P 및 V987P)로부터 선택된 아미노산 치환 (참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)을 도입하기 위해 당업자가 선택할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이는 융합전 상태를 추가로 안정화시키는 돌연변이된 양성자화 부위를 포함하며, 여기서 상기 돌연변이/아미노산 치환은 H1048Q 및 H1064N; H1083N 및 H1101N; 또는 H1048Q 및 H1064N 및 H1083N 및 H1101N(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 하기 아미노산 치환 H1048Q 및 H1064N; H1083N 및 H1101N; 또는 H1048Q 및 H1064N 및 H1083N 및 H1101N 중 적어도 하나는 (K986P 및 V987P) 치환과 조합될 수 있다(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치).
특히 바람직한 실시양태에서, SARS-CoV-2 코로나바이러스 스파이크 단백질은 하기 아미노산 치환(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치) 중 적어도 하나를 포함한다:
ㆍ H1048Q 및 H1064N; K986P 및 V987P
ㆍ H1083N 및 H1101N; K986P 및 V987P
ㆍ H1048Q 및 H1064N 및 H1083N 및 H1101N; K986P 및 V987P
따라서, 상기 제공된 임의의 NCBI 단백질 접근 번호, 또는 서열 번호: 1-9, 274-340, 22737, 22739, 22741, 22743, 22745, 22747, 22749, 22751, 22753, 22755, 22757, 22929-22946로부터 선택된 임의의 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체는 이러한 아미노산 변화, 적합하게는 H1048Q 및 H1064N; H1083N 및 H1101N; 또는 H1048Q 및 H1064N 및 H1083N 및 H1101N로부터 선택된 아미노산 치환; 또는 (H1048Q 및 H1064N; K986P 및 V987P); (H1083N 및 H1101N; K986P 및 V987P); (H1048Q 및 H1064N 및 H1083N 및 H1101N; K986P 및 V987P)로부터 선택된 아미노산 치환 (참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)을 도입하기 위해 당업자가 선택할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이는 인공 분자내 이황화 결합을 포함한다. 이러한 인공 분자내 이황화 결합은 융합전 형태에서 S 단백질의 막 원위 부분(N-말단 영역 포함)을 추가로 안정화시키기 위해 도입될 수 있으며; 즉, 하나 이상의 융합전 특이(specification) 항체에 특이적으로 결합하고/하거나 융합전 형태에 존재하지만 S 단백질의 융합 후 형태에는 존재하지 않는 적합한 항원 부위를 제시하는 형태이다.
바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 융합전 안정화 돌연변이는 인공 분자내 이황화 결합을 생성하며, 여기서 하나 이상의 인공 분자내 이황화 결합은 I712C, I714C, P715C, T874C, G889C, A890C, I909C, N914C, Q965C, F970C, A972C, R995C, G999C, S1003C, L1034C, V1040C, Y1047C, S1055C, P1069C, T1077C, 또는 Y1110C, S1123C (참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)를 포함하는 리스트로부터 선택된 적어도 2개의 아미노산 치환에 의해 생성된다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이는 인공 분자내 이황화 결합을 생성하며, 여기서 적어도 하나의 인공 분자내 이황화 결합은 하기 아미노산 치환: I712C 및 T1077C; I714C 및 Y1110C; P715C 및 P1069C; G889C 및 L1034C; I909C 및 Y1047C; Q965C 및 S1003C; F970C 및 G999C; A972C 및 R995C; A890C 및 V1040C; T874C 및 S1055C, 또는 N914C 및 S1123C(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)의 적어도 하나에 의해 생성된다.
추가 실시양태에서, 하나 이상의 융합전 안정화 돌연변이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 상이한 인공 분자내 이황화 결합을 포함하고, 여기서 각각은 다음의 아미노산 치환: I712C 및 T1077C; I714C 및 Y1110C; P715C 및 P1069C; G889C 및 L1034C; I909C 및 Y1047C; Q965C 및 S1003C; F970C 및 G999C; A972C 및 R995C; A890C 및 V1040C; T874C 및 S1055C, 또는 N914C 및 S1123C(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)으로 부터 선택된다.
추가 실시양태에서, 다음의 아미노산 치환 I712C 및 T1077C; I714C 및 Y1110C; P715C 및 P1069C; G889C 및 L1034C; I909C 및 Y1047C; Q965C 및 S1003C; F970C 및 G999C; A972C 및 R995C; A890C 및 V1040C; T874C 및 S1055C, 또는 N914C 및 S1123C 중 적어도 하나, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 그 이상은 (K986P 및 V987P) 치환과 결합될 수 있다. 예를 들어, 융합전 안정화된 S 단백질은 2개의 상이한 인공 분자내 이황화 결합, 예를 들어, I712C 및 T1077C; P715C 및 P1069C; 및 추가로 K986P 및 V987P 치환 등(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, SARS-CoV-2 코로나바이러스 스파이크 단백질은 하기 아미노산 치환(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치) 중 적어도 하나를 포함한다:
ㆍ I712C 및 T1077C; K986P 및 V987P
ㆍ I714C 및 Y1110C; K986P 및 V987P
ㆍ P715C 및 P1069C; K986P 및 V987P
ㆍ G889C 및 L1034C; K986P 및 V987P
ㆍ I909C 및 Y1047C; K986P 및 V987P
ㆍ Q965C 및 S1003C; K986P 및 V987P
ㆍ F970C 및 G999C; K986P 및 V987P
ㆍ A972C 및 R995C; K986P 및 V987P
ㆍ A890C 및 V1040C; K986P 및 V987P
ㆍ T874C 및 S1055C; K986P 및 V987P
ㆍ N914C 및 S1123C; K986P 및 V987P
따라서, 상기 제공된 임의의 NCBI 단백질 접근 번호, 또는 서열 번호: 1-9, 274-340, 22737, 22739, 22741, 22743, 22745, 22747, 22749, 22751, 22753, 22755, 22757, 22929-22946로부터 선택된 임의의 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체는 이러한 아미노산 변화, 적합하게는 I712C 및 T1077C; I714C 및 Y1110C; P715C 및 P1069C; G889C 및 L1034C; I909C 및 Y1047C; Q965C 및 S1003C; F970C 및 G999C; A972C 및 R995C; A890C 및 V1040C; T874C 및 S1055C, 또는 N914C 및 S1123C로부터 선택된 아미노산 치환; 또는 (I712C; T1077C; K986P; V987P) 또는 (I714C; Y1110C; K986P; V987P) 또는 (P715C; P1069C; K986P; V987P) 또는 (G889C; L1034C; K986P; V987P) 또는 (I909C; Y1047C; K986P; V987P) 또는 (Q965C; S1003C; K986P; V987P) 또는 (F970C; G999C; K986P; V987P) 또는 (A972C; R995C; K986P; V987P) 또는 (A890C 및 V1040C; K986P 및 V987P) 또는 (T874C 및 S1055C; K986P 및 V987P) 또는 (N914C 및 S1123C; K986P 및 V987P)로부터 선택되는 아미노산 치환 (참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)을 도입하기 위해 당업자가 선택할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 임의의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 스파이크 단백질은 융합전 형태에서 스파이크 단백질을 안정화시키기 위해 상기 기재된 바와 같이 (참조 단백질 서열 번호: 1에 대해 예시됨)돌연변이될 수 있음이 강조되어야 한다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)은 서열 번호: 10-26, 40-48, 85-111, 341-1278, 1681-2618, 2686-3623, 3691-4628, 4696-5633, 5701-6638, 6706-7643, 7711-8648, 8716-9653, 9721-10658, 10726-11663, 13377-13510, 13521-14123, 22732, 22738, 22740, 22742, 22744, 22746, 22748, 22750, 22752, 22754, 22756, 22758, 22947-22964 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 행 2 내지 5, 12-15, 17-20, 22-25, 27-30, 32-35, 38 참조) 및 ST25 서열 목록의 각 서열 서열 번호들의 식별자 <223> 아래에 제공된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)은 서열 번호: 10-26, 341-407, 609-1278, 13521-13587, 22738, 22740, 22742, 22744, 22746, 22748, 22750, 22752, 22754, 22756, 22758, 22947-22964 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 2행 및 5행 참조) 및 ST25 서열 목록의 각 서열 서열 번호들의 식별자 <223> 아래에 제공된다.
더 바람직한 실시양태에서, 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)은 서열 번호: 10-18, 341-407, 22947-22964 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 2행 참조) 및 ST25 서열 목록의 각 서열 서열 번호들의 식별자 <223> 아래에 제공된다.
추가적인, 더 바람직한 실시양태에서, 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)은 서열 번호: 22960, 22961, 22963 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
더욱 더 바람직한 실시양태에서, 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)은 서열 번호: 10 또는 341 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
다양한 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 본 명세서에 정의된 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터의 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질, 및 추가로 하나 이상의 이종성 펩티드 또는 단백질 요소를 코딩한다.
적합하게는, 상기 적어도 하나의 이종 펩티드 또는 단백질 요소는 본 발명의 코딩된 항원성 펩티드 또는 단백질의 분비를 촉진하거나 개선할 수 있거나 (예를 들어, 분비 신호 서열을 통해), 원형질막에서 본 발명의 코딩된 항원성 펩티드 또는 단백질의 고정(anchoring)을 촉진하거나 개선하거나 (예를 들어, 막횡단 요소를 통해), 항원 복합체의 형성을 촉진 또는 개선하거나 (예를 들어, 다량체화 도메인 또는 항원 클러스터링 요소를 통해), 또는 바이러스-유사 입자 형성(VLP 형성 서열)을 촉진 또는 개선한다. 또한, 제1 측면의 핵산은 펩티드 링커 요소, 자가-절단 펩티드, 면역학적 애주번트 서열 또는 수지상 세포 표적화 서열을 추가로 코딩할 수 있다.
적합한 다량체화 도메인은 WO2017/081082의 서열 번호: 1116-1167에 따른 아미노산 서열의 목록, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다. 적합한 막관통 요소는 WO2017/081082의 서열 번호: 1228-1343, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체에 따른 아미노산 서열의 목록으로부터 선택될 수 있다. 적합한 VLP 형성 서열은 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1168-1227에 따른 아미노산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록으로부터 선택될 수 있다. 적합한 펩티드 링커는 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1509-1565에 따른 아미노산 서열 목록, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다. 적합한 자가 절단 펩티드는 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1434-1508에 따른 아미노산 서열 목록, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다. 적합한 면역학적 애주반트 서열은 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1360-1421에 따른 아미노산 서열 목록, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다. 적합한 수지상 세포(DC) 표적화 서열은 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1344-1359에 따른 아미노산 서열 목록, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다. 적합한 분비 신호 펩티드는 공개된 PCT 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1-1115 및 서열 번호: 1728에 따른 아미노산 서열의 목록, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 코딩 서열은 신호 펩티드, 링커 펩티드, 헬퍼 에피토프, 항원 클러스터링 요소, 삼량체화 또는 다량체화 요소, 막횡단 요소, 또는 VLP 형성 서열로부터 선택된 하나 이상의 이종성 펩티드 또는 단백질 요소를 코팅한다.
바람직한 실시양태에서, SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 하나 이상의 항원성 단백질을 코딩하는 본 발명의 핵산은 추가로 하나 이상의 이종 삼량체화 요소, 항원 클러스터링 요소, 또는 VLP 형성 서열을 코딩한다.
항원 클러스터링 요소 또는 다량체화 요소(multimerization element)
바람직한 양태에서, 항원 클러스터링 요소는 페리틴 요소, 또는 루마진 신타제 요소, B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg), 또는 캡슐린으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 융합전 형태로, 안정적으로 클러스터된 스파이크 단백질을 발현하면 SARS-CoV-2에 대한 중화 활성의 크기와 폭이 증가할 수 있다.
Lumazine 합성 효소(Lumazine, LS, LumSynth)는 입자 형성 특성을 가진 효소로 다양한 유기체에 존재하며 리보플라빈 생합성에 관여한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 루마진 신타제는 항원 클러스터링을 촉진하기 위해 사용되며, 따라서 본 발명의 코딩된 코로나바이러스 항원의 면역 반응을 촉진하거나 향상시킬 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 항원 클러스터링 요소(다량체화 요소)는 루마진 합성효소이거나 이로부터 유래되며, 여기서 상기 항원 클러스터링 도메인의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열 번호: 112, 이의 단편 또는 이의 변이체 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
페리틴은 주요 기능이 세포 내 철 저장인 단백질이다. 거의 모든 살아있는 유기체는 24개의 서브유닛으로 구성된 페리틴을 생성한다. 각 서브유닛은 4개의 알파나선 다발로 구성되며, 이 서브유닛은 팔면체 대칭을 갖는 4차 구조로 자가 조립된다. 나노 입자로 자기 조립하는 이러한 특성은 항원을 운반하고 노출시키는 데 적합하다.
특히 바람직한 실시양태에서, 페리틴은 항원 클러스터링을 촉진하기 위해 사용되며, 따라서 코딩된 코로나바이러스 항원, 바람직하게는 스파이크 단백질의 면역 반응을 촉진할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 상기 항원 클러스터링 요소(다량체화 요소)는 페리틴이거나 페리틴으로부터 유래되며, 여기서 상기 항원 클러스터링 도메인의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열 번호: 113, 이의 단편 또는 이의 변이체 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 실시양태에서, 항원-클러스터링 도메인은 B형 간염 표면 항원(HBsAg)이다. HBsAg는 구형 입자를 형성한다. B형 간염 바이러스(HBsAg) 서열의 표면 항원 단편의 추가는 코로나바이러스에 대한 핵산 기반 백신의 면역 반응을 향상시키는 데 특히 효과적일 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, HBsAg는 항원 클러스터링을 촉진하기 위해 사용되며, 따라서 코딩된 코로나바이러스 항원, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 스파이크 단백질의 면역 반응을 촉진할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원-클러스터링 요소는 엔캡슐린(encapsulin) 요소이다. 엔캡슐린 서열의 추가는 코로나바이러스에 대한 핵산 기반 백신의 면역 반응을 향상시키는 데 특히 효과적일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 엔캡슐린은 항원 클러스터링을 촉진하기 위해 사용되며, 따라서 코딩된 코로나바이러스 항원, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 스파이크 단백질의 면역 반응을 촉진할 수 있다.
엔캡슐린은 호열성 Thermotoga maritima에서 분리한 단백질로 항원이 자기조립하여 항원 (나노)입자를 형성할 수 있도록 하는 요소로 사용될 수 있다. 엔캡슐린은 내부 및 외부 직경이 각각 20 및 24 nm인 얇은 정이십면체 T = 1 대칭 케이지 구조를 갖는 동일한 31 kDa 단량체의 60개 카피로부터 조립된다.
핵산의 코딩 서열이 이종 항원 클러스터링 요소를 추가로 코딩하는 일부 실시양태에서, 항원-클러스터링 요소 및 SARS-CoV-2로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생성하는 것이 특히 바람직하고 적합하다. 적합하게는, 상기 항원성 펩티드 또는 단백질, 바람직하게는 스파이크 단백질은 C-말단 막횡단 도메인(TM)이 결여되어 있거나(aa 1212 내지 aa 1273이 없음) C-말단 막횡단 도메인(TMflex)의 일부가 결여, 예를 들어, aa 1148에서 aa 1273 결여되어 있다.
따라서, 서열 번호: 1-26, 274-1278, 13521-13587, 22732, 22737-22758, 22929-22964의 어느 것과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 임의의 아미노산 서열은 위치 aa 1212 내지 aa 1273에서 내인성 막횡단 도메인(TM)을 제거하도록 변형되고 따라서 본 발명의 맥락에서 "C-말단 절단된" 단백질로서 사용될 수 있다(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치). 또한, 서열 번호: 1-26, 274-1278, 13521-13587, 22732, 22737-22758, 22929-22964의 어느 것과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 임의의 아미노산 서열은 위치 aa 1148 내지 aa 1273에서 내인성 막횡단 도메인의 일부(TMflex)를 제거하도록 변형되고 따라서 본 발명의 맥락에서 "C-말단 절단된" 단백질로서 사용될 수 있다(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치). C-말단 막횡단 도메인(TM 또는 TMflex)이 결여된 적합한 스파이크 단백질은 서열 번호: 31-39, 1614-3623, 13377-13510으로부터 선택될 수 있다.
핵산의 코딩 서열이 상기 정의된 바와 같은 이종 항원 클러스터링 요소를 추가로 코딩하는 다른 실시양태에서, 항원 클러스터링 요소 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 단편 S1(S2 및/또는 TM 및/또는 TMflex 결여)로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생성하는 것이 특히 바람직하고 적합하다. 추가로, 항원성 펩티드 또는 단백질로부터 이종 항원-클러스터링 요소를 분리하기 위한 링커 요소(예를 들어, 서열 번호: 115, 13148, 13152에 따른 링커)를 사용하는 것이 적합할 수 있다.
바람직한 양태에서, 이종 항원 클러스터링 요소를 포함하는 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 58-75, 85-102, 3624-5633, 7644-9653, 13588-13721, 13856-13989, 22733, 22735, 22736, 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체의 어느 것과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 16행 및 25행 참조) 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자 하에 제공된다.
추가의 적합한 다량체화 요소는 WO2017/081082의 서열 번호: 1116-1167에 따른 아미노산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록으로부터 선택될 수 있다. WO2017/081082의 서열 번호: 1116-1167은 인용을 통하여 본 명세서에 포함된다.
삼량체화(트리머화) 요소
바람직한 실시양태에서, 삼량체화 요소는 폴돈(foldon) 요소로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 폴돈 요소는 피브리틴 폴돈 요소이다. 안정한 삼량체 스파이크 단백질을 바람직하게는 융합전 형태로 발현하면 SARS-CoV-2에 대한 중화 활성의 크기와 폭이 증가할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 피브리틴 폴돈 요소는 항원 삼량체화를 촉진하기 위해 사용되며, 따라서 코딩된 코로나바이러스 항원, 바람직하게는 스파이크 단백질의 면역 반응을 촉진할 수 있다. 바람직하게는, 폴돈 요소는 박테리오파지, 바람직하게는 박테리오파지 T4, 가장 바람직하게는 박테리오파지 T4의 피브리틴이거나 또는 이로부터 유래된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 삼량체화 요소는 폴돈이거나 또는 폴돈으로부터 유래되며, 여기서 상기 삼량체화 요소의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열 번호: 114, 이의 단편 또는 변이체의 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
핵산의 코딩 서열이 이종 삼량체화 요소를 추가로 코딩하는 다른 실시양태에서, 삼량체화 요소 및 SARS-CoV-2로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생성하는 것이 특히 바람직하고 적합하다. 적합하게는, 상기 항원성 펩티드 또는 단백질, 바람직하게는 SARS-CoV-2로부터 유래한 스파이크 단백질은 C-말단 막횡단 도메인(TM)이 결여되어 있거나(aa 1212 내지 aa 1273이 없음) C-말단 막횡단 도메인(TMflex)의 일부가 결여, 예를 들어, aa 1148에서 aa 1273 결여되어 있다.
따라서, 서열 번호: 1-26, 274-1278, 13521-13587, 22732, 22737-22758, 22947-22964의 어느 것과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 임의의 아미노산 서열은 위치 aa 1212 내지 aa 1273에서 내인성 막횡단 도메인(TM)을 제거하도록 변형되고 따라서 본 발명의 맥락에서 "C-말단 절단된" 단백질로서 사용될 수 있다. 또한, 서열 번호: 1-26, 274-1278, 13521-13587, 22732, 22737-22758, 22947-22964의 어느 것과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 임의의 아미노산 서열은 위치 aa 1148 내지 aa 1273에서 내인성 막횡단 도메인의 일부(TMflex)를 제거하도록 변형되고 따라서 본 발명의 맥락에서 "C-말단 절단된" 단백질로서 사용될 수 있다(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치). C-말단 막횡단 도메인(TM 또는 TMflex)이 결여된 적합한 스파이크 단백질은 서열 번호: 31-39, 1614-3623, 13377-13510으로부터 선택될 수 있다.
핵산의 코딩 서열이 상기 정의된 바와 같은 이종 삼량체화 요소를 추가로 코딩하는 다른 실시양태에서, 삼량체화 요소 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 단편 S1(S2 및/또는 TM 및/또는 TMflex 결여)로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생성하는 것이 특히 바람직하고 적합하다. 추가로, 항원성 펩티드 또는 단백질로부터 이종 항원-클러스터링 요소를 분리하기 위한 링커 요소(예를 들어, 서열 번호: 115, 13148, 13152에 따른 링커)를 사용하는 것이 적합할 수 있다.
바람직한 양태에서, 이종 삼량체화 요소를 포함하는 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 76-84, 103-111, 5634-6638, 9654-10658, 13722-13788, 13990-14056, 22734, 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체의 어느 것과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 26, 30, 및 41행 참조) 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자 하에 제공된다.
추가의 적합한 삼량체화 요소는 WO2017/081082의 서열 번호: 1116-1167, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체에 따른 아미노산 서열의 목록으로부터 선택될 수 있다. WO2017/081082의 서열 번호: 1116-1167은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
VLP 형성 요소
바람직한 실시양태에서, VLP 형성 서열은 본 명세서에 정의된 바와 같은 코로나바이러스 항원에 선택되고 융합될 수 있다. VLP 형태로 안정적으로 클러스터된 스파이크 단백질을 발현하면 SARS-CoV-2에 대한 중화 활성의 크기와 폭이 증가할 수 있다. VLP는 구조적으로 감염성 바이러스를 모방하고 강력한 세포 및 체액 면역 반응을 유도할 수 있다.
적합한 VLP 형성 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원, HIV-1 Gag 단백질, 또는 우드척 간염 코어 항원 요소(WhcAg)로부터 유래된 요소로부터 선택될 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 적어도 하나의 VLP-형성 서열은 우드척 간염 코어 항원 요소(WhcAg)이다. WhcAg 요소는 VLP 형성을 촉진하는 데 사용되므로 코딩된 코로나바이러스 항원, 바람직하게는 스파이크 단백질의 면역 반응을 촉진할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, VLP 형성 서열은 폴돈이거나 폴돈으로부터 유래되며, 여기서 상기 VLP 형성 서열의 아미노산 서열은 바람직하게는 아미노산 서열 서열 번호: 13171, 이의 단편 또는 변이체 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
핵산의 코딩 서열이 이종 VLP 형성 서열을 추가로 코딩하는 다른 실시양태에서, VLP 형성 서열 및 SARS-CoV-2로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생성하는 것이 특히 바람직하고 적합하다. 적합하게는, 상기 항원성 펩티드 또는 단백질, 바람직하게는 SARS-CoV-2로부터 유래한 스파이크 단백질은 C-말단 막횡단 도메인(TM)이 결여되어 있거나(aa 1212 내지 aa 1273이 없음) C-말단 막횡단 도메인(TMflex)의 일부가 결여, 예를 들어, aa 1148에서 aa 1273 결여되어 있다.
따라서, 서열 번호: 1-26, 274-1278, 13521-13587, 22732, 22737-22758, 22947-22964의 어느 것과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 임의의 아미노산 서열은 위치 aa 1212 내지 aa 1273에서 내인성 막횡단 도메인(TM)을 제거하도록 변형되고 따라서 본 발명의 맥락에서 "C-말단 절단된" 단백질로서 사용될 수 있다. 또한, 서열 번호: 1-26, 274-1278, 13521-13587, 22732, 22737-22758, 22947-22964의 어느 것과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 임의의 아미노산 서열은 위치 aa 1148 내지 aa 1273에서 내인성 막횡단 도메인의 일부(TMflex)를 제거하도록 변형되고 따라서 본 발명의 맥락에서 "C-말단 절단된" 단백질로서 사용될 수 있다(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치). C-말단 막횡단 도메인(TM 또는 TMflex)이 결여된 적합한 스파이크 단백질은 서열 번호: 31-39, 1614-3623, 13377-13510으로부터 선택될 수 있다.
핵산의 코딩 서열이 상기 정의된 바와 같은 이종 VLP 형성 서열을 추가로 코딩하는 다른 실시양태에서, VLP 형성 서열 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 단편 S1(S2 및/또는 TM 및/또는 TMflex 결여)로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생성하는 것이 특히 바람직하고 적합하다. 추가로, 항원성 펩티드 또는 단백질로부터 이종 항원-클러스터링 요소를 분리하기 위한 링커 요소(예를 들어, 서열 번호: 115, 13148, 13152에 따른 링커)를 사용하는 것이 적합할 수 있다.
바람직한 양태에서, 이종 VLP 형성 서열을 포함하는 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 6639-7643, 10659-11663, 13789-13855, 14057-14123, 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체의 어느 것과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 31 및 35행 참조) 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자 하에 제공된다.
본 발명의 맥락에서 추가의 적합한 VLP 형성 서열을 WO2017/081082의 서열 번호: 1168-1227, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체에 따른 아미노산 서열의 목록으로부터 선택될 수 있다. WO2017/081082의 서열 번호: 1168-1227은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
이종 분비 신호 펩티드
일부 실시양태에서, 항원성 펩티드 또는 단백질은 이종 신호 펩티드를 포함한다. 코딩된 코로나바이러스 항원의 분비를 개선하기 위해 이종 신호 펩티드가 사용될 수 있다.
적합한 분비 신호 펩티드는 공개된 PCT 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1-1115 및 서열 번호: 1728에 따른 아미노산 서열 목록, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다. WO2017/081082의 서열 번호: 1-1115 및 서열 번호: 1728은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
핵산의 코딩 서열이 이종 분비 신호 펩티드를 추가로 코딩하는 실시양태에서, 이종 분비 신호 펩티드 및 SARS-CoV-2로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생성하는 것이 특히 바람직하고 적합하다. 적합하게는, 상기 항원성 펩티드 또는 단백질, 바람직하게는 SARS-CoV-2로부터 유래된 스파이크 단백질은 N-말단 내인성 분비 신호 펩티드가 결여되어 있다(aa 1 내지 aa 15 결여). 따라서, 서열 번호: 1-26, 274-1278, 13521-13587, 22732, 22737-22758, 22929-22964의 어느 것과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열은 위치 aa 1 내지 aa 15에서 내인성 분비 신호 펩티드가 결여되도록 변형되어 본 발명의 맥락에서 "N-말단 절단된" 단백질로서 사용될 수 있다.
다음 목록 1에는 위에서 정의한 적절한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 항원성 펩티드 및 단백질이 더 자세히 지정되어 있습니다(예: 명명법, 단백질 요소 등).
목록 1 : 본 발명의 예시적인 적합한 단백질 디자인:
ㆍ aa 1 내지 aa 1273을 포함하는 전장 스파이크 단백질(S);
o 예를 들어 서열 번호: 1, 274를 참조.
ㆍ aa1-aa1273 및 K986P, V987P 치환을 포함하는 안정화된 S 단백질(S_stab_PP);
o 예를 들어 서열 번호: 10, 341 참조.
ㆍ aa1-aa1273 및 K986P, V987P 치환을 포함하는 안정화된 S 단백질(S_stab_PP);
o 예를 들어 서열 번호: 22961 참조.
ㆍ aa1-aa1273 및 K986P, V987P 치환을 포함하는 안정화된 S 단백질(S_stab_PP);
o 예를 들어 서열 번호: 22960 참조.
ㆍ aa1-aa1273 및 K986P, V987P, F817P, A892P, A899P, A942P 프롤린 치환을 포함하는 안정화된 S 단백질; S_stab_PP_hex
o 예를 들어 서열 번호: 22732 참조.
ㆍ aa1-aa1273 및 K986P, V987P 치환 및 공동 충전 돌연변이(T887W, A1020W)를 포함하는 안정화된 S 단백질; S_stab_PP_cav
o 예를 들어 서열 번호: 408을 참조.
ㆍ aa1-aa1273 및 K986P, V987P 치환 및 공동 충전 돌연변이(P1069F)를 포함하는 안정화된 S 단백질; S_stab_PP_cav
o 예를 들어 서열 번호: 475를 참조.
ㆍ aa1-aa1273 및 K986P, V987P 치환 및 공동 충전 돌연변이(H1048Q, H1064N, H1083N, H1101N)를 포함하는 안정화된 S 단백질; S_stab_PP_prot
o 예를 들어 서열 번호: 542를 참조.
ㆍ aa1-aa1273 및 인공 이황화 결합(S_stab_disul) I712C, T1077C를 포함하는 안정화된 S 단백질;
o 예를 들어 서열 번호: 19, 609 참조.
ㆍ aa1-aa1211을 포함하는 막횡단 도메인이 없는 S (S_woTM);
o 예를 들어 서열 번호: 31, 1614 참조.
ㆍ aa1-aa1147을 포함하는 막횡단 도메인 플렉스가 없는 S (S_woTMflex);
o 예를 들어 서열 번호: 2619를 참조.
ㆍ K986P, V987P 치환을 포함하는 S_woTM (S_stab_PP_woTM)
o 예를 들어 서열 번호: 40, 1681 참조.
ㆍ K986P, V987P 치환을 포함하는 S_woTMflex (S_stab_PP_woTMflex)
o 예를 들어 서열 번호: 2686을 참조.
ㆍ aa 1 내지 aa 681을 포함하는 스파이크 단백질 단편 S1 (S1);
o 예를 들어 서열 번호: 27, 1279 참조.
ㆍ 루마진 합성효소를 포함하는 S_woTM;
o 예를 들어 서열 번호: 58, 3624를 참조.
ㆍ 루마진 합성효소를 포함하는 S_woTMflex;
o 예를 들어 서열 번호: 7644를 참조.
ㆍ 루마진 합성효소를 포함하는 S_stab_PP_woTM;
o 예를 들어 서열 번호: 85, 3691 참조.
ㆍ 루마진 합성효소를 포함하는 S_stab_PP_woTMflex;
o 예를 들어 서열 번호: 7711 참조.
ㆍ 페리틴 요소를 포함하는 S_woTM;
o 예를 들어 서열 번호: 67, 4629 참조.
ㆍ 페리틴 요소를 포함하는 S_woTMflex;
o 예를 들어 서열 번호: 8649를 참조.
ㆍ 페리틴 요소를 포함하는 S_stab_PP_woTM;
o 예를 들어 서열 번호: 94, 4696 참조.
ㆍ 페리틴 요소를 포함하는 S_stab_PP_woTMflex;
o 예를 들어 서열 번호: 8716을 참조.
ㆍ 폴돈(foldon) 요소를 포함하는 S_woTM;
o 예를 들어 서열 번호: 76, 5634 참조.
ㆍ 폴돈 요소를 포함하는 S_woTMflex;
o 예를 들어 서열 번호: 9654를 참조.
ㆍ 폴돈 요소를 포함하는 S_stab_PP_woTM;
o 예를 들어 서열 번호: 103, 5701 참조.
ㆍ 폴돈 요소를 포함하는 S_stab_PP_woTMflex;
o 예를 들어 서열 번호: 9721 참조.
ㆍ VLP 서열(WhcAg)를 포함하는 S_woTM;
o 예를 들어 서열 번호: 6639를 참조.
ㆍ VLP 시퀀스(WhcAg)를 포함하는 S_woTMflex;
o 예를 들어 서열 번호 10659를 참조.
ㆍ VLP 시퀀스(WhcAg)를 포함하는 S_stab_PP_woTM;
o 예를 들어 서열 번호: 6706을 참조.
ㆍ VLP 시퀀스(WhcAg)를 포함하는 S_stab_PP_woTMflex;
o 예를 들어 서열 번호: 10726을 참조.
ㆍ 폴돈 요소를 포함하는 truncRBD:
o 예를 들어 서열 번호: 22734를 참조.
ㆍ 루마진 합성효소(C-말단)를 포함하는 truncRBD
o 예를 들어 서열 번호: 22735를 참조.
ㆍ 루마진 합성효소(N-말단)를 포함하는 truncRBD
o 예를 들어 서열 번호: 22736 참조
ㆍ 페리틴 요소를 포함하는 truncRBD:
o 예를 들어 서열 번호: 22733 참조.
목록 1에 제공된 아미노산 위치는 참조 서열 번호 1에 따른 것이다.
제1 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 10, 21, 22, 25, 27, 274, 341, 408, 475, 542, 743, 810, 1011, 1145, 1212, 1279, 8716, 10726, 22732-22758, 22929-22942, 22947-22964, 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체들 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
상기 정의된 바와 같은 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 바람직한 항원성 펩티드 또는 단백질은 표 1(1 내지 41행)에 제공된다. 여기에서 각 행 1 내지 41은 적절한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 구조에 해당한다. 표 1의 A열은 적합한 항원 구조(construct)에 대한 간략한 설명을 제공한다. 표 1의 B열은 각각의 항원 구조의 단백질(아미노산) 서열 번호를 제공한다. 표 1의 열 C는 상응하는 야생형 핵산 코딩 서열의 서열 번호를 제공한다. 표 1의 열 D는 상응하는 G/C 최적화 핵산 코딩 서열(opt1, gc)의 서열 번호를 제공한다. 표 1의 열 E는 상응하는 인간 코돈 사용(usage)에 적합한 핵산 코딩 서열(opt 3, 인간)의 서열 번호를 제공한다. 표 1의 열 F는 상응하는 G/C 함량 변형 핵산 코딩 서열(opt10, gc mod)의 서열 번호를 제공한다("코딩 서열"에 대한 자세한 설명은 "적절한 코딩 서열" 단락 참조).
특히, 본 발명의 설명은 본 출원의 ST25 서열 목록의 <223> 식별자 아래에 제공된 정보를 명시적으로 포함한다. 표 1의 코딩 서열을 포함하는 바람직한 핵산 구조(construct), 예를 들어, 표 1의 코딩 서열을 포함하는 mRNA 서열은 표 3a 및 표 3b에 제공되어 있다.
바람직한 코로나바이러스 구조 (아미노산 서열 및 핵산 코딩 서열):
행 A B C D E F
1 전장 스파이크 단백질; S 1-9, 274-340, 22737, 22739, 22741, 22743, 22745, 22747, 22749, 22751, 22753, 22755, 22757; 22929-22946 116-131, 11664-11730 136, 11731-11797, 22764, 22766, 22768, 22770, 22772, 22774, 22776, 22778, 22780, 22782, 22784; 22969-23040 11967-12033 12034; 23041-23076
2 안정화된 스파이크 단백질; S_stab_PP 10-18, 341-407, 22738, 22740, 22742, 22744, 22746, 22748, 22750, 22752, 22754, 22756, 22758; 22947-22964 　 137, 11798, 22765, 22767, 22769, 22771, 22773, 22775, 22777, 22779, 22781, 22783, 22785; 23077-23148 142 146, 12035; 23149-23184
3 안정화된 스파이크 단백질; S_stab_PP_cav 408-541 　 11799, 11800 　 12036, 12037
4 안정화된 스파이크 단백질; S_stab_PP_prot 542-608 　 11801 　 12038
5 안정화된 스파이크 단백질; S_stab_disul 19-26, 609-1278, 13521-13587 　 11802-11811, 14124 　 12039-12048, 14133
6 스파이크 단백질 단편 S1 27, 1279-1345 132 138, 11812 143 147, 12049
7 스파이크 단백질 단편 S2 30, 1346-1412 135 141, 11813 　 12050
8 스파이크 단백질의 신호 펩티드; SP 28, 1413-1479 133 139, 11814 144 12051
9 신호 펩티드 결여 S1; S1_woSP 29, 1480-1546 134 140, 11815 145 12052
10 스파이크 단백질의 막횡단 도메인; TM/ TMflex 49-57, 1547-1613, 13176-13242 　 11816, 13511 　 12053, 13516
11 막횡단 도메인 결여 S; S_woTM/ woTMflex 31-39, 1614-1680, 2619-2685 　 11817, 11832 　 12054, 12069
12 막횡단 도메인 결여 안정화된 S; S_stab_PP_woTM/ woTMflex 40-48, 1681-1747, 2686-2752 　 11818, 11833 　 12055, 12070
13 막횡단 도메인 결여 안정화된 S; S_stab_PP_cav_woTM/ woTMflex 1748-1881, 2753-2886 　 11819, 11820, 11834, 11835 　 12056, 12057, 12071, 12072
14 막횡단 도메인 결여 안정화된 S; S_stab_PP_prot_woTM/ woTMflex 1882-1948, 2887-2953 　 11821, 11836 　 12058, 12073
15 막횡단 도메인 결여 안정화된 S; S_stab_disul_woTM/ woTMflex 1949-2618, 2954-3623, 13377-13510 　 11822-11831, 11837-11846, 13514, 13515 　 12059-12068, 12074-12083, 13519, 13520
16 루마진 신타제를 포함하는 S_woTM/ woTMflex 58-66, 3624-3690, 7644-7710 　 11847, 11907 　 12084, 12144
17 루만진 신타제를 포함하는 S_stab_PP_woTM/ woTMflex 85-93, 3691-3757, 7711-7777 　 11848, 11908 　 12085, 12145
18 루만진 신타제를 포함하는
S_stab_PP_cav_woTM/ woTMflex		 3758-3891, 7778-7911 　 11849, 11850, 11909, 11910 　 12086, 12087, 12146, 12147
19 루만진 신타제를 포함하는
S_stab_PP_prot_woTM/ woTMflex 		3892-3958, 7912-7978 　 11851, 11911 　 12088, 12148
20 루만진 신타제를 포함하는
S_stab_disul_woTM/ woTMflex		 3959-4628, 7979-8648, 13588-13654, 13856-13922 　 11852-11861, 11912-11921, 14125, 14129 　 12089-12098, 12149-12158, 14134, 14138
21 페리틴 포함 S_woTM/ woTMflex 67-75, 4629-4695, 8649-8715 　 11862, 11922 　 12099, 12159
22 페리틴 포함 S_stab_PP_woTM/ woTMflex 94-102, 4696-4762, 8716-8782 　 11863, 11923 　 12100, 12160
23 페리틴 포함 S_stab_PP_cav_woTM/ woTMflex 4763-4896, 8783-8916 　 11864, 11865, 11924, 11925 　 12101, 12102, 12161, 12162
24 페리틴 포함 S_stab_PP_prot_woTM/ woTMflex 4897-4963, 8917-8983 　 11866, 11926 　 12103, 12163
25 페리틴 포함 S_stab_disul_woTM/ woTMflex 4964-5633, 8984-9653, 13655-13721, 13923-13989 　 11867-11876, 11927-11936, 14126, 14130 　 12104-12113, 12164-12173, 14135, 14139
26 폴돈 포함 S_woTM/ woTMflex 76-84, 5634-5700, 9654-9720 　 11877, 11937 　 12114, 12174
27 폴돈 포함 S_stab_ PP_woTM/ woTMflex 103-111, 5701-5767, 9721-9787 　 11878, 11938 　 12115, 12175
28 폴돈 포함 S_stab_PP_cav_woTM/ woTMflex 5768-5901, 9788-9921 　 11879, 11880, 11939, 11940 　 12116, 12117, 12176, 12177
29 폴돈 포함 S_stab_PP_prot_woTM/ woTMflex 5902-5968, 9922-9988 　 11881, 11941 　 12118, 12178
30 폴돈 포함 S_stab_disul_woTM/ woTMflex 5969-6638, 9989-10658, 13722-13788, 13990-14056 　 11882-11891, 11942-11951, 14127, 14131 　 12119-12128, 12179-12188, 14136, 14140
31 WhcAg (VLP) 포함 S_woTM/ woTMflex 6639-6705, 10659-10725 　 11892, 11952 　 12129, 12189
32 WhcAg (VLP) 포함 S_stab_PP_woTM/ woTMflex 6706-6772, 10726-10792 　 11893, 11953 　 12130, 12190
33 WhcAg (VLP) 포함 S_stab_PP_cav_woTM/ woTMflex 6773-6906, 10793-10926 　 11894, 11895, 11954, 11955 　 12131, 12132, 12191, 12192
34 WhcAg (VLP) 포함 S_stab_PP_prot_woTM/ woTMflex 6907-6973, 10927-10993 　 11896, 11956 　 12133, 12193
35 WhcAg (VLP) 포함 S_stab_disul_woTM/ woTMflex 6974-7643, 10994-11663, 13789-13855, 14057-14123 　 11897-11906, 11957-11966, 14128, 14132 　 12134-12143, 12194-12203, 14137, 14141
36 수용체 결합 도메인; RBD 13243-13309, 22917, 22923 　 13512, 22914, 22918, 22919, 22924, 22925 13517, 22915, 22916, 22920-22922, 22926-22928
37 중요 중화 도메인(Critical neutralisation domain); CND 13310-13376 　 13513 13518
38 안정화된 스파이크 단백질; S_stab_PP_hex 22732 22759
39 루마진 신타제 포함 RBD 22735, 22736 22762, 22763, 22967, 22968
40 페리틴 포함 RBD 22733 22760, 22965
41 폴돈 포함 RBD 22734, 26938, 26939 22761, 22966, 26940, 26941
적합한 코딩 서열:
바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 코로나바이러스, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 그의 단편 및 변이체로부터 유래된 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 코딩 서열을 포함한다. 이러한 맥락에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 항원성 단백질, 또는 그의 단편 및 변이체를 코딩하는 임의의 코딩 서열은 적합한 코딩 서열로서 이해될 수 있고 따라서 본 발명의 핵산에 포함될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 본 명세서에 정의된 바와 같은 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터의 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는, 바람직하게는 서열 번호: 1-111, 274-11663, 13176-13510, 13521-14123, 22732-22758, 22917, 22923, 22929-22964, 26938, 26939 또는 이의 단편 또는 변이체 중 어느 것을 코팅하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 핵산 수준에서 서열 번호: 1-111, 274-11663, 13176-13510, 13521-14123, 22732-22758, 22917, 22923, 22929-22964, 26938, 26939 또는 이의 단편 또는 변이체 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 서열(DNA 또는 RNA 서열)은 선택될 수 있는 것으로 이해되어야 하고 따라서 본 발명의 적합한 코딩 서열로서 이해될 수 있다. 상기 아미노산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(열 A 및 B의 행 1 내지 41 참조), 표 3a 및 3b, 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자 하에 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-13147, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14177, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23184, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937에 따른 서열 또는 이들 서열의 어느 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 코팅 서열을 포함한다. 상기 핵산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(C-F열의 행 1 내지 7, 9, 11-41 참조), 표 3a 및 3b, 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자 하에 제공된다.
대안적으로, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-13147, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14177, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23184, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937에 따드되, 여기서 각 서열의 모든 우라실(U)은 티미딘(T) 치환된 서열, 또는 이들 서열의 어느 것의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함한다. 상기 핵산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(C-F열의 행 1 내지 7, 9, 11-41 참조), 표 3a 및 3b, 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자 하에 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184에 따른 서열 또는 이들 서열의 어느 것의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한, 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 코팅 서열을 포함한다. 상기 핵산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(C-F열의 행 1 내지 7, 9, 11-41 참조), 표 3a 및 3b, 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자 하에 제공된다.
대안적으로, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184에 따르되, 여기서 각 서열의 모든 우라실(U)은 티미딘(T) 치환된 서열 또는 이들 서열의 어느 것의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한, 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 코팅 서열을 포함한다. 상기 핵산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(C-F열의 행 1 내지 7, 9, 11-41 참조), 표 3a 및 3b, 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자 하에 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 인공 핵산, 예를 들어, 인공 DNA 또는 인공 RNA이다.
본 명세서에 사용된 용어 "인공 핵산"은 자연적으로 발생하지 않는 핵산을 지칭하는 것으로 의도된다. 즉, 인공 핵산은 비천연 핵산 분자로 이해될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 개별 서열(예: G/C 함량 변형된 코딩 서열, UTR)로 인해 및/또는 다른 변형, 예를 들어, 뉴클레오타이드의 구조적 변형으로 인해 비천연일 수 있다. 전형적으로, 인공 핵산은 원하는 인공 뉴클레오티드 서열에 상응하도록 유전 공학에 의해 설계 및/또는 생성될 수 있다. 이러한 맥락에서, 인공 핵산은 자연적으로 발생하지 않을 수 있는 서열, 즉 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 야생형 서열/자연 발생 서열과 상이한 서열이다. "인공 핵산"이라는 용어는 "하나의 단일 분자"를 의미하는 것으로 제한되지 않고 본질적으로 동일한 핵산 분자의 앙상블(ensemble)을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 이는 본질적으로 동일한 복수의 핵산 분자와 관련될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "인공 핵산"은 인공 DNA 또는 바람직하게는 인공 RNA에 관한 것일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 핵산, 바람직하게는 제1 측면의 DNA 또는 RNA는 변형 및/또는 안정화된 핵산, 바람직하게는 변형 및/또는 안정화된 인공 핵산이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 따라서 "안정화된 인공 핵산" 또는 "안정화된 코딩 핵산"으로 제공될 수 있고, 즉 생체내 분해에 개선되는 저항성을 나타내는 핵산 및/또는 생체내에서 개선된 안정성을 나타내는 핵산, 및/또는 생체내에서 개선된 번역성을 나타내는 핵산으로 제공될 수 있다. 다음에서, 이러한 맥락에서 핵산을 "안정화"하기에 적합하게 특정한 적합한 변형/적응이 설명된다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산은 "안정화된 RNA", "안정화된 코딩 RNA", "안정화된 DNA" 또는 "안정화된 코딩 DNA"로서 제공될 수 있다.
이러한 안정화는 본 명세서에 명시된 "건조된 핵산"(예: 건조된 DNA 또는 RNA) 및/또는 "정제된 핵산"(예: 정제된 DNA 또는 RNA)을 제공함으로써 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 그에 추가하여, 이러한 안정화는 예를 들어 본 발명의 핵산의 변형된 포스페이트 백본에 의해 수행될 수 있다. 본 발명과 관련된 백본 변형은 핵산에 포함된 뉴클레오타이드의 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형이다. 이와 관련하여 바람직하게 사용될 수 있는 뉴클레오티드는 예를 들어 포스포로티오에이트-개질된 포스페이트 백본, 바람직하게는 포스페이트 백본에 함유된 적어도 하나의 포스페이트 산소가 황 원자로 대체된 것이다. 안정화된 핵산, 바람직하게는 안정화된 RNA는 예를 들어 비이온성 포스페이트 유사체, 예를 들어, 하전된 포스포네이트 산소가 알킬 또는 아릴 기로 대체된 알킬 및 아릴 포스포네이트, 또는 하전된 산소 잔기가 알킬화된 형태로 존재하는 포스포디에스테르 및 알킬포스포트리에스테르를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 골격 변형은 일반적으로 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트(예: 시티딘-5'-O-(1-티오포스페이트))로 이루어진 군으로부터의 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
하기에서, 본 발명의 핵산을 "안정화"할 수 있는 적합한 변형이 기술된다.
바람직한 구체예에서, 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA는 적어도 하나의 코돈 변형된 코딩 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 핵산의 적어도 하나의 코딩 서열은 코돈 변형된 코딩 서열이고, 여기서 적어도 하나의 코돈 변형된 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 바람직하게는 상응하는 야생형 또는 참조 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다.
용어 "코돈 변형된 코딩 서열"은 상응하는 야생형 또는 참조 코딩 서열과 비교하여 적어도 하나의 코돈(하나의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드의 트리플렛)이 상이한 코딩 서열에 관한 것이다. 적합하게는, 본 발명의 맥락에서 코돈 변형된 코딩 서열은 생체내 분해에 대한 개선된 저항성 및/또는 생체내 개선된 안정성, 및/또는 생체내 개선된 번역성을 나타낼 수 있다. 가장 넓은 의미의 코돈 변형은 다중 코돈이 동일한 아미노산을 코딩할 수 있고 상호교환적으로 사용될 수 있는 유전 코드의 축퇴성(degeneracy)을 이용하여(표 2 참조), 위에서 약술한 바와 같이 생체내 적용을 위한 코딩 서열을 최적화/수정하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "참조 코딩 서열"은 변형 및/또는 최적화될 기원 서열인 코딩 서열에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 핵산의 적어도 하나의 코딩 서열은 코돈 변형된 코딩 서열이고, 여기서 코돈 변형된 코딩 서열은 C 최대화된 코딩 서열, CAI 최대화된 코딩 서열, 인간 코돈 사용(usage)에 적합한 코딩 서열, G/C 콘텐츠 변형된 코딩 서열, 및 G/C 최적화된 코딩 서열, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
포유동물 숙주 세포 내로 형질감염될 때, 코돈 변형된 코딩 서열을 포함하는 핵산은 12-18시간, 또는 18시간 초과, 예를 들어, 24, 36, 48, 60, 72, 또는 72시간 초과의 안정성을 갖고, 포유동물 숙주 세포(예: 근육 세포)에 의해 발현될 수 있다.
포유동물 숙주 세포 내로 형질감염될 때, 코돈 변형된 코딩 서열을 포함하는 핵산은 단백질로 번역되고, 여기서 단백질의 양은 자연 발생 또는 야생형 또는 포유동물 숙주 세포 내로 형질감염된 참조 코딩 서열에 의해 얻은 단백질의 양과 필적하거나 이들 양보다 바람직하게는 적어도 10% 초과, 또는 적어도 20% 초과, 또는 적어도 30% 초과, 또는 적어도 40% 초과, 또는 적어도 50% 초과, 또는 적어도 100% 초과, 또는 적어도 200% 초과이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 변형될 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 코딩 서열의 C 함량은 상응하는 야생형 또는 참조 코딩 서열의 C 함량과 비교하여 증가, 바람직하게는 최대화될 수 있다 (본 명세서에서 "C 최대화된 코딩 서열"로 명명함). 핵산의 C 최대화 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 바람직하게는 각각의 야생형 또는 참조 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다. C 최대화 핵산 서열의 생성은 WO2015/062738에 따른 변형 방법을 사용하여 적절하게 수행될 수 있다. 이러한 맥락에서, WO2015/062738의 개시 내용은 인용을 통하여 본 명세서에 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 핵산이 변형될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 코딩 서열의 G/C 함량은 상응하는 야생형 또는 참조 코딩 서열의 G/C 함량과 비교하여 최적화될 수 있다(본 명세서에서 "G /C 콘텐츠 최적화 코딩 서열"로 명명함). 그 맥락에서 "최적화된"은 G/C 함량이 바람직하게는 본질적으로 가능한 가장 높은 G/C 함량으로 증가되는 코딩 서열을 지칭한다. 핵산의 G/C 함량 최적화된 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 바람직하게는 각각의 야생형 또는 참조 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다. G/C 함량 최적화된 핵산 서열(RNA 또는 DNA)의 생성은 WO2002/098443에 따른 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 맥락에서, WO2002/098443의 개시는 그 전체 내용이 본 발명 내에 포함된다. 서열 목록의 <223> 식별자를 포함하여, 설명 전반에 걸쳐 G/C 최적화된 코딩 서열은 약어 "opt1" 또는 "gc"로 표시된다.
바람직한 양태에서, 핵산은 변형될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 코딩 서열의 코돈은 인간 코돈 사용(usage)에 맞게 적응될 수 있다(본 명세서에서 "인간 코돈 사용(usage)에 적응된 코딩 서열"로 지칭됨). 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈은 인간에서 다른 빈도로 발생한다. 따라서, 핵산의 코딩 서열은 바람직하게는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈의 빈도가 인간 코돈 사용에 따른 그 코돈의 자연 발생 빈도에 상응하도록 변형된다. 예를 들어, 아미노산 Ala의 경우, 야생형 또는 참조 코딩 서열은 바람직하게는 코돈 "GCC"가 0.40의 빈도로 사용되고, 코돈 "GCT"는 0.28의 빈도로 사용되고, "GCA" 코돈은 0.22의 빈도로 사용되며, "GCG" 코돈은 0.10의 빈도로 사용되는 등의 방식으로 적응된다 (표 2 참조). 따라서, 이러한 절차(Ala에 대해 예시됨)는 인간 코돈 사용에 적합한 서열을 얻기 위해 핵산의 코딩 서열에 의해 코딩된 각 아미노산에 적용된다. 서열 목록의 <223> 식별자를 포함하여, 명세서 설명 전반에 걸쳐, 인간 코돈 사용 적응 코딩 서열은 약어 "opt3" 또는 "인간"으로 표시된다.
각 아미노산에 대한 빈도가 표시된 인간 코돈 사용빈도(usage) 표
아미노산 코돈 빈도 아미노산 코돈 빈도
Ala GCG 0.10 Pro CCG 0.11
Ala GCA 0.22 Pro CCA 0.27
Ala GCT 0.28 Pro CCT 0.29
Ala GCC* 0.40 Pro CCC* 0.33
Cys TGT 0.42 Gln CAG* 0.73
Cys TGC* 0.58 Gln CAA 0.27
Asp GAT 0.44 Arg AGG 0.22
Asp GAC* 0.56 Arg AGA* 0.21
Glu GAG* 0.59 Arg CGG 0.19
Glu GAA 0.41 Arg CGA 0.10
Phe TTT 0.43 Arg CGT 0.09
Phe TTC* 0.57 Arg CGC 0.19
Gly GGG 0.23 Ser AGT 0.14
Gly GGA 0.26 Ser AGC* 0.25
Gly GGT 0.18 Ser TCG 0.06
Gly GGC* 0.33 Ser TCA 0.15
His CAT 0.41 Ser TCT 0.18
His CAC* 0.59 Ser TCC 0.23
Ile ATA 0.14 Thr ACG 0.12
Ile ATT 0.35 Thr ACA 0.27
Ile ATC* 0.52 Thr ACT 0.23
Lys AAG* 0.60 Thr ACC* 0.38
Lys AAA 0.40 Val GTG* 0.48
Leu TTG 0.12 Val GTA 0.10
Leu TTA 0.06 Val GTT 0.17
Leu CTG* 0.43 Val GTC 0.25
Leu CTA 0.07 Trp TGG* 1
Leu CTT 0.12 Tyr TAT 0.42
Leu CTC 0.20 Tyr TAC* 0.58
Met ATG* 1 Stop TGA* 0.61
Asn AAT 0.44 Stop TAG 0.17
Asn AAC* 0.56 Stop TAA 0.22
*: 가장 흔한 인간 코돈
양태들에서, 본 발명의 핵산이 변형될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 코딩 서열의 G/C 함량은 상응하는 야생형 또는 참조 코딩 서열의 G/C 함량과 비교하여 변형될 수 있다(본 명세서에서는 "G/C 함량 변형된 코딩 서열"로 명명됨). 이러한 맥락에서, 용어 "G/C 최적화" 또는 "G/C 함량 변형"은 상응하는 야생형 또는 참조코딩 서열에 비해 변형된, 바람직하게는 증가된 수의 구아노신 및/또는 시토신 뉴클레오티드를 포함하는 핵산에 관한 것이다. 이러한 증가된 수는 아데노신 또는 티미딘 뉴클레오티드를 함유하는 코돈을 구아노신 또는 시토신 뉴클레오티드를 함유하는 코돈으로 치환함으로써 생성될 수 있다. 유리하게는, 증가된 G/C 함량을 갖는 핵산 서열은 증가된 A/U를 갖는 서열보다 더 안정하거나 더 나은 발현을 나타낸다. 핵산의 G/C 함량 변형된 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 바람직하게는 각각의 야생형 또는 참조 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다. 바람직하게는, 핵산의 코딩 서열의 G/C 함량은 상응하는 야생형 또는 참조 핵산 서열의 코딩 서열의 G/C 함량과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 바람직하게는 적어도 40% 증가된다 (본 명세서에서 "opt 10" 또는 "gc mod"로 지칭됨).
양태들에서, 핵산이 변형될 수 있고, 여기서 코돈 적응 지수(codon adaptation index, CAI)는 적어도 하나의 코딩 서열에서 증가되거나 바람직하게는 최대화될 수 있다 (본 명세서에서 "CAI 최대화된 코딩 서열"로 지칭됨). 예를 들어, 인간에서 비교적 희귀한 야생형 또는 참조 핵산 서열의 모든 코돈이 예를 들어, 인간 내에서 빈도가 높은 각가의 코돈으로 교환되는 것이 바람직하며, 여기에서 빈도 높은 코돈은 비교적 희귀한 코돈과 동일한 아미노산을 코딩한다. 적합하게는, 가장 빈도 높은 코돈이 코딩된 단백질의 각 아미노산에 사용된다 (표 2 참조, 가장 빈도 높은 인간 코돈은 별표로 표시됨). 적합하게는, 핵산은 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 코딩 서열의 코돈 적응 지수(CAI)는 적어도 0.5, 적어도 0.8, 적어도 0.9 또는 적어도 0.95이다. 가장 바람직하게는, 적어도 하나의 코딩 서열의 코돈 적응 지수(CAI)는 1(CAI=1)이다. 예를 들어, 아미노산 Ala의 경우, 야생형 또는 참조 코딩 서열은 가장 빈번한 인간 코돈 "GCC"가 항상 상기 아미노산에 사용되는 방식으로 적응될 수 있다. 따라서, 이러한 절차(Ala에 대해 예시됨)는 CAI 최대화된 코딩 서열을 얻기 위해 핵산의 코딩 서열에 의해 코딩되는 각각의 아미노산에 적용될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 핵산의 적어도 하나의 코딩 서열은 코돈 변형된 코딩 서열이고, 여기서 코돈 변형된 코딩 서열은 G/C 최적화된 코딩 서열, 인간 코돈 사용빈도에 적합한 코딩 서열, 또는 G/C 변형 코딩 서열에서 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 136-138, 140-143, 145-175, 11731-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-13147, 14142-14177, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23184, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937 또는 이러한 서열들의 어느 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 코돈 변형 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코돈 변형 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 인코딩하는 이러한 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 또한 서열 목록, 특히 식별자 <223> 하에 제공된 세부사항에서 얻을 수 있다. 제1 측면의 적합한 코딩 서열은 표 1에 제공된다. 상기 핵산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(D-F열의 행 1 내지 7, 9, 11-41 참조), 표 3a 및 3b 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자에서 제공된다.
대안적으로, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 136-138, 140-143, 145-175, 11731-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-13147, 14142-14177, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23184, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937에 따른 서열이되, 각각의 서열에서 모든 우라실(U)은 티미딘(T)으로 치환된 서열, 또는 이러한 서열들의 어느 것의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코돈 변형 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 상기 핵산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(D-F열의 행 1 내지 7, 9, 11-41 참조), 표 3a 및 3b 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자에서 제공된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 136-138, 140, 141, 148, 149, 152, 155, 156, 159, 162, 163, 166, 169, 170, 173, 11731-11813, 11815, 11817-11966, 12271-12472, 12743-12944, 13514, 13515, 14124-14132, 14142-14150, 14160-14168, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23040, 23077-23148, 23189-23260, 23297-23368, 23409-23480, 23517-23588, 23629-23700, 23737-23808, 23849-23920, 23957-24028, 24069-24140, 24177-24248, 24289-24360, 24397-24468, 24509-24580, 24617-24688, 24729-24800, 24837-24908, 24949-25020, 25057-25128, 25169-25240, 25277-25348, 25389-25460, 25497-25568, 25609-25680, 25717-25788, 25829-25900, 25937-26008, 26049-26120, 26157-26228, 26269-26340, 26377-26448, 26489-26560, 26597-26668, 26709-26780, 26817-26888, 26925-26937 또는 이러한 서열들의 어느 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 코돈 변형 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 G/C 최적화된 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 인코딩하는 이러한 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 또한 서열 목록, 특히 식별자 <223> 하에 제공된 세부사항에서 얻을 수 있다. 제1 측면의 적합한 코딩 서열은 표 1에 제공된다. 상기 핵산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(D열의 1 내지 7, 9, 11-41행 참조), 표 3a 및 3b 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자에서 제공된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 142, 143, 145, 150, 153, 157, 160, 164, 167, 171, 174, 11967-12033, 12473-12539, 12945-13011 또는 이러한 서열들의 어느 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 코돈 변형 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 인간 코돈 사용 적합화 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 인코딩하는 이러한 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 또한 서열 목록, 특히 식별자 <223> 하에 제공된 세부사항에서 얻을 수 있다. 제1 측면의 적합한 코딩 서열은 표 1에 제공된다. 상기 핵산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(E열의 1 내지 7, 9, 11-41행 참조), 표 3a, 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자에서 제공된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 146, 147, 151, 154, 158, 161, 165, 168, 172, 175, 12034-12050, 12052, 12054-12203, 12540-12675, 13012-13147, 13519, 13520, 14133-14141, 14151-14159, 14169-14177, 23041-23076, 23149-23184, 23261-23296, 23369-23404, 23481-23516, 23589-23624, 23701-23736, 23809-23844, 23921-23956, 24029-24064, 24141-24176, 24249-24284, 24361-24396, 24469-24504, 24581-24616, 24689-24724, 24801-24836, 24909-24944, 25021-25056, 25129-25164, 25241-25276, 25349-25384, 25461-25496, 25569-25604, 25681-25716, 25789-25824, 25901-25936, 26009-26044, 26121-26156, 26229-26264, 26341-26376, 26449-26484, 26561-26596, 26669-26704, 26781-26816, 26889-26924 또는 이러한 서열들의 어느 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 코돈 변형 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 G/C 변형 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 인코딩하는 이러한 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 또한 서열 목록, 특히 식별자 <223> 하에 제공된 세부사항에서 얻을 수 있다. 제1 측면의 적합한 코딩 서열은 표 1에 제공된다. 상기 핵산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(F열의 1 내지 7, 9, 11-41행 참조), 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자에서 제공된다.
더욱 더 바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 136-138, 142, 143, 146, 147, 11731, 11798-11801, 11804, 11805, 11808, 11810-11812, 11923, 11953, 12035, 12049, 22759-22785, 22965-22982, 23077-23094, 23149 또는 이러한 서열들의 어느 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 코돈 변형 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 G/C 변형 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 인코딩하는 이러한 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 또한 서열 목록, 특히 식별자 <223> 하에 제공된 세부사항에서 얻을 수 있다. 제1 측면의 적합한 코딩 서열은 표 1에 제공된다. 상기 핵산 서열에 관한 추가 정보는 또한 표 1(F열의 1 내지 7, 9, 11-41행 참조), 및 ST25 서열 목록의 각각의 서열 서열 번호의 <223> 식별자에서 제공된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 137 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코돈 변형 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 G/C 변형 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다.
특히 더욱 바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 23090,23091, 23093, 23094 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코돈 변형 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 G/C 변형 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 서열 번호: 23113, 23167 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코돈 변형 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 G/C 변형 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다.
UTR(들):
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산은 단백질-코딩 영역("코딩 서열" 또는 "cds"), 및 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 특히, UTR은 핵산을 결정하는 조절 서열 요소, 예를 들어, RNA 턴오버, 안정성 및 국소화(localization) 요소를 보유할 수 있다. 또한 UTR에는 번역을 향상시키는 서열 요소가 포함될 수 있다. 핵산 서열(DNA 및 RNA 포함)의 의학적 적용에서, 핵산의 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질로의 번역은 치료 효능에 가장 중요하다. 3'-UTR 및/또는 5'-UTR의 특정 조합은 본 발명의 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 향상시킬 수 있다. 상기 UTR 조합을 보유하는 핵산 분자는 유리하게는 대상체에 투여 후, 바람직하게는 근육내 투여 후에 항원성 펩티드 또는 단백질의 신속하고 일시적인 발현을 가능하게 한다. 따라서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 3'-UTR 및/또는 5'-UTR의 특정 조합을 포함하는 핵산은 백신으로서 투여하기에 특히 적합하고, 특히 개체의 근육, 진피 또는 표피로 투여하기에 적합하다.
적합하게는, 본 발명의 핵산은 적어도 하나의 이종 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함한다. 상기 이종 5'-UTR 또는 3'-UTR은 자연 발생 유전자로부터 유래되거나 합성 조작될 수 있다. 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 적어도 하나의 (이종성) 3'-UTR 및/또는 적어도 하나의 (이종성) 5'-UTR에 작동가능하게 연결된, 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함한다.
"3'-비번역 영역" 또는 "3'-UTR" 또는 "3'-UTR 요소"라는 용어는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 코딩 서열의 3'(즉, 다운스트림)에 위치하고 단백질로 번역되지 않는 핵산 분자의 일부를 지칭하기 위한 것이다. 3'-UTR은 코딩 서열과 (선택적) 말단 폴리(A) 서열 사이에 위치한, 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA의 일부일 수 있다. 3'-UTR은 조절 요소(regulatory element)라고도 하는 유전자 발현을 제어하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 예를 들어 리보솜 결합 부위, miRNA 결합 부위 등일 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 반감기가 향상된(즉, 안정한 RNA를 제공하는) RNA와 관련된 유전자로부터 유도될 수 있는 3'-UTR을 포함한다.
일부 양태에서, 3'-UTR은 하나 이상의 폴리아데닐화 신호, 세포 내 위치의 핵산 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 부위, 또는 하나 이상의 miRNA 또는 miRNA에 대한 결합 부위를 포함한다.
MicroRNA(또는 miRNA)는 핵산 분자의 3'-UTR에 결합하고 핵산 분자 안정성을 감소시키거나 번역을 억제함으로써 유전자 발현을 하향 조절하는 19-25 뉴클레오티드 길이의 비암호화 RNA이다. 예를 들어, microRNA는 RNA를 조절하여 단백질 발현을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 예를 들어, 간(miR-122), 심장(miR-ld, miR-149), 내피 세포(miR-17-92, miR-126), 지방 조직(let-7, miR-30c), 신장(miR-192, miR-194, miR-204), 골수 세포(miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), 근육(miR-133, miR-206, miR-208) 및 폐 상피 세포(let-7, miR-133, miR-126)이 있다. RNA는 하나 이상의 마이크로RNA 표적 서열, 마이크로RNA 서열, 또는 마이크로RNA 시드를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 예를 들어 US2005/0261218 및 US2005/0059005에 교시된 것과 같은 알려진 microRNA에 해당한다.
따라서, 위에서 정의한 miRNA 또는 miRNA의 결합 부위는 원하는 세포 유형 또는 조직(예: 근육 세포)에서 핵산, 예를 들어, RNA의 발현을 조정하기 위해 3'-UTR에서 제거되거나 3'-UTR로 도입될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 이종 3'-UTR을 포함하고, 여기서 하나 이상의 이종 3'-UTR은 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈("muag"로 지칭됨), CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9, 또는 이러한 유전자들 중 어느 것의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 3'-UTR로부터 유래한 핵산 서열, 바람직하게는 서열 번호: 253-268, 22902-22905, 22892-22895 또는 이들 중 어느 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 또는 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열에 따른 서열을 포함한다. 이러한 맥락에서 특히 바람직한 핵산 서열은 공개된 PCT 출원 WO2019/077001A1, 특히 WO2019/077001A1의 청구항 9로부터 유래될 수 있다. WO2019/077001A1의 제9항의 상응하는 3'-UTR 서열은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다 (예를 들어, WO2019/077001A1의 서열 번호: 23-34, 또는 이의 단편 또는 변이체).
특히 바람직한 양태에서, 핵산은 알파-글로빈 유전자로부터 유래된 3'-UTR을 포함한다. 알파-글로빈 유전자("muag")로부터 유래된 상기 3'-UTR은 서열 번호: 267, 268, 22896-22901, 22906-22911 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가적인 양태에서, 핵산은 RPS9 유전자로부터 유래된 3'-UTR을 포함한다. RPS9 유전자로부터 유래된 상기 3'-UTR은 서열 번호: 263 또는 264, 22894, 22895, 22904, 22905 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 양태에서, 핵산은 PSMB3 유전자로부터 유래된 3'-UTR을 포함한다. PSMB3 유전자로부터 유래된 상기 3'-UTR은 서열 번호: 253 또는 254, 22892, 22893, 22902, 22903 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 양태에서, 핵산은 서열 번호: 22876-22891 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진3'-UTR을 포함한다.
다른 양태에서, 핵산은 WO2016/107877에 기술된 바와 같은 3'-UTR을 포함할 수 있으며, 3'-UTR 서열과 관련된 WO2016/107877의 개시는 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 적합한 3'-UTR은 WO2016/107877의 서열 번호: 1-24 및 서열 번호: 49-318, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 다른 양태에서, 핵산은 WO2017/036580에 개시된 3'-UTR을 포함할 수 있으며, 3'-UTR 서열과 관련된 WO2017/036580의 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 적합한 3'-UTR은 WO2017/036580의 서열 번호: 152-204, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 다른 실시양태에서, 핵산은 WO2016/022914에 기재된 바와 같은 3'-UTR을 포함하고, 3'-UTR 서열과 관련된 WO2016/022914의 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특히 바람직한 3'-UTR은 WO2016/022914의 서열 번호: 20-36에 따른 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다.
바람직한 양태에서, 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR을 포함한다.
용어 "5'-비번역 영역" 또는 "5'-UTR" 또는 "5'-UTR 요소"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 코딩 서열의 5'(즉, "업스트림")에 위치하며 단백질로 번역되지 않는 핵산 분자의 일부를 지칭하기 위한 것이다. 5'-UTR은 코딩 서열의 5'에 위치한 핵산의 일부일 수 있다. 일반적으로 5'-UTR은 전사 시작 부위에서 시작하여 코딩 서열의 시작 코돈 앞에서 끝난다. 5'-UTR은 조절 요소라고도 하는 유전자 발현을 제어하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 예를 들어 리보솜 결합 부위, miRNA 결합 부위 등일 수 있다. 5'-UTR은 전사 후 변형될 수 있으며, 예를 들어, 5'-캡 구조의 효소적 또는 전사 후 추가(예: 아래 정의된 mRNA의 경우)에 의해 변형된다.
바람직하게는, 핵산은 반감기가 향상된(즉, 안정한 RNA를 제공하는) RNA와 관련된 유전자로부터 유도될 수 있는 5'-UTR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 5'-UTR은 세포 내의 RNA 안정성 또는 RNA 위치에 영향을 미치는 단백질에 대한 하나 이상의 결합 부위, 또는 (상기 정의된 바와 같은) 하나 이상의 miRNA 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.
따라서, 원하는 세포 유형 또는 조직(예: 근육 세포)에 대한 핵산 발현을 조정하기 위해 위에서 정의한 miRNA 또는 miRNA에 대한 결합 부위를 5'-UTR에서 제거하거나 5'-UTR에 도입할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 핵산은 적어도 하나의 이종 5'-UTR을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 이종 5'-UTR은 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B, 및 UBQLN2로부터 선택된 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 핵산 서열, 또는 서열 번호: 231-252, 22870-22875 또는 이들 중 어느 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열에 따른 유전자, 또는 이의 상동체(homolog), 단편 또는 변이체를 포함한다. 이러한 맥락에서 특히 바람직한 핵산 서열은 공개된 PCT 출원 WO2019/077001A1, 특히 WO2019/077001A1의 청구항 9로부터 선택될 수 있다. WO2019/077001A1의 제9항의 상응하는 5'-UTR 서열은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다(예를 들어, WO2019/077001A1의 서열 번호: 1-20, 또는 이의 단편 또는 변이체).
바람직한 실시양태에서, 핵산은 RPL31 유전자로부터 유래된 5'-UTR을 포함하고, 여기서 RPL31 유전자로부터 유래된 상기 5'-UTR은 서열 번호: 243, 244, 22872, 22873 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 실시양태에서, 핵산은 SLC7A3 유전자로부터 유래된 5'-UTR을 포함하고, 여기서 SLC7A3 유전자로부터 유래된 상기 5'-UTR은 서열 번호: 245, 246, 22874, 22875 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특히 바람직한 실시양태에서, 핵산은 HSD17B4 유전자로부터 유래된 5'-UTR을 포함하고, 여기서 HSD17B4 유전자로부터 유래된 상기 5'-UTR은 서열 번호: 231, 232, 22870, 22871 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 양태에서, 핵산은 서열 번호: 22848-22869 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5'-UTR을 포함한다.
다른 양태에서, 핵산은 WO2013/143700에 개시된 5'-UTR을 포함하며, WO2013/143700의 개시내용은 5'-UTR 서열과 관련하여 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특히 바람직한 5'-UTR은 WO2013/143700의 서열 번호: 1-1363, 서열 번호: 1395, 서열 번호: 1421 및 서열 번호: 1422로부터 유래된 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 다른 양태에서, 핵산은 WO2016/107877에 기재된 바와 같은 5'-UTR을 포함하고, WO2016/107877의 개시내용은 5'-UTR 서열과 관련하여 인용에 의해 본 명세서에 참조로 포함된다. 특히 바람직한 5'-UTR은 WO2016/107877의 서열 번호: 25-30 및 서열 번호: 319-382에 따른 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 다른 양태에서, 핵산은 WO2017/036580에 기재된 바와 같은 5'-UTR을 포함하고, 5'-UTR 서열에 관한 WO2017/036580의 개시는 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특히 바람직한 5'-UTR은 WO2017/036580의 서열 번호: 1-151에 따른 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 다른 실시양태에서, 핵산은 WO2016/022914에 기재된 바와 같은 5'-UTR을 포함하고, WO2016/022914의 개시내용은 5'-UTR 서열과 관련하여 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특히 바람직한 5'-UTR은 WO2016/022914의 서열 번호: 3-19에 따른 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다.
적합하게는, 바람직한 실시양태에서, 핵산은 다음의 5'UTR/3'UTR 조합 ("또한 UTR 디자인으로 명명됨")으로부터 선택된, 3'-UTR 및/또는 5'-UTR에 작동가능하게 연결된, 본 명세서에서 정의된 적어도 하나의 항원성 단백질, 바람직하게는 SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 코로나바이러스로부터 유래된 하나의 항원성 단백질을 코딩하는 본 명세서에서 규정된 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다:
a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-2 (NDUFA4/PSMB3), a-3 (SLC7A3/PSMB3), a-4 (NOSIP/PSMB3), a-5 (MP68/PSMB3), b-1 (UBQLN2/RPS9), b-2 (ASAH1/RPS9), b-3 (HSD17B4/RPS9), b-4 (HSD17B4/CASP1), b-5 (NOSIP/COX6B1), c-1 (NDUFA4/RPS9), c-2 (NOSIP/NDUFA1), c-3 (NDUFA4/COX6B1), c-4 (NDUFA4 /NDUFA1), c-5 (ATP5A1/PSMB3), d-1 (Rpl31/PSMB3), d-2 (ATP5A1/CASP1), d-3 (SLC7A3/GNAS), d-4 (HSD17B4/NDUFA1), d-5 (Slc7a3/Ndufa1), e-1 (TUBB4B/RPS9), e-2 (RPL31/RPS9), e-3 (MP68/RPS9), e-4 (NOSIP/RPS9), e-5 (ATP5A1/RPS9), e-6 (ATP5A1/COX6B1), f-1 (ATP5A1/GNAS), f-2 (ATP5A1/NDUFA1), f-3 (HSD17B4/COX6B1), f-4 (HSD17B4/GNAS), f-5 (MP68/COX6B1), g-1 (MP68/NDUFA1), g-2 (NDUFA4/CASP1), g-3 (NDUFA4/GNAS), g-4 (NOSIP/CASP1), g-5 (RPL31/CASP1), h-1 (RPL31/COX6B1), h-2 (RPL31/GNAS), h-3 (RPL31/NDUFA1), h-4 (Slc7a3/CASP1), h-5 (SLC7A3/COX6B1), i-1 (SLC7A3/RPS9), i-2 (RPL32/ALB7), i-2 (RPL32/ALB7), 또는 i-3 (알파-글로빈 유전자).
특히 바람직한 실시양태에서, 핵산은 바람직하게는 SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 코로나바이러스로부터 유래된, 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 항원성 단백질을 코딩하는 본 명세서에 명시된 바와 같은 하나 이상의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 상기 코딩 서열은 HSD17B4 5'-UTR 및 PSMB3 3'-UTR (HSD17B4/PSMB3 (UTR design a-1))에 작동가능하게 연결된다.
본 발명자들은 이 실시양태가 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하는데 특히 유익하다는 것을 보여주었다. 이러한 맥락에서, 이미 한 번의 백신 접종으로 바이러스를 중화시키는 항체 역가가 발생하기에 충분하다는 것을 보여줄 수 있다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 핵산은 바람직하게는 SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 코로나바이러스로부터 유래된, 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 항원성 단백질을 코딩하는 본 명세서에 명시된 바와 같은 하나 이상의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 상기 코딩 서열은 SLC7A3 5'-UTR 및 PSMB3 3'-UTR (SLC7A3/PSMB3 (UTR design a-3))에 작동가능하게 연결된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 핵산은 바람직하게는 SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 코로나바이러스로부터 유래된, 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 항원성 단백질을 코딩하는 본 명세서에 명시된 바와 같은 하나 이상의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 상기 코딩 서열은 RPL31 5'-UTR 및 RPS9 3'-UTR (RPL31/ RPS9 (UTR design e-2))에 작동가능하게 연결된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 핵산은 바람직하게는 SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 코로나바이러스로부터 유래된, 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 항원성 단백질을 코딩하는 본 명세서에 명시된 바와 같은 하나 이상의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 상기 코딩 서열은 알파-글로빈 ("muag") 3'-UTR (-/muag)(UTR design i-3))에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA는 모노시스트론, 바이시스트론 또는 멀티시스트론일 수 있습니다.
용어 "모노시스트론(monocistronic)"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 하나의 코딩 서열만을 포함하는 핵산을 지칭하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용된 용어 "바이시스트로닉" 또는 "멀티시스트로닉"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 2개(바이시스트론) 또는 그 이상(멀티시스트론) 코딩 서열을 포함할 수 있는 핵산을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 모노시스트론이다.
다른 실시양태에서, 핵산은 모노시스트론성이고 상기 핵산의 코딩 서열은 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 적어도 2개의 상이한 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 따라서, 상기 코딩 서열은 아미노산 링커 서열이 있거나 없이 연결된, SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 그 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있으며, 여기서 상기 링커 서열은 강성 링커, 유연성 링커, 절단 가능한 링커, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 구조(construct)는 본 명세서에서 "다중-항원-구조(multi-antigen-construct)"로 지칭된다.
추가 실시양태에서, 핵산은 바이시스트론성 또는 멀티시스트론성일 수 있고 2개 이상의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 코딩 서열은 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 2개 이상의 상이한 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 따라서, 바이시스트론 또는 멀티시스트론 핵산 내의 코딩 서열은 본 명세서에 정의된 바와 같은 별개의 항원성 단백질 또는 펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 적합하게 코딩한다. 바람직하게는, 상기 바이시스트론 또는 멀티시스트론 구조의 코딩 서열은 적어도 하나의 IRES(내부 리보솜 진입 부위) 서열에 의해 분리될 수 있다. 따라서, 용어 "2개 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는"은 비시스트론성 또는 멀티시스트론성 핵산이 상이한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 분리주의, 예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상(바람직하게는 상이한) 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 것을 의미할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 바이시스트론 또는 멀티시스트론 핵산은 예를 들어, 동일한 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상(바람직하게는 상이한) 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 이러한 맥락에서, 적합한 IRES 서열은 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1566-1662에 따른 핵산 서열의 목록, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다. 이러한 맥락에서, IRES 서열에 관한 WO2017/081082의 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 맥락에서, 코딩 서열의 특정 조합은, 본 명세서에 정의된 다중 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 세트를 얻기 위하여, 모노시스트론, 바이시스트론 및 멀티시스트론 DNA 및/또는 RNA 구조 및/또는 다중-항원 구조의 임의의 조합에 의해 생성될 수 있음이 이해되어야 한다.
바람직한 실시양태에서, 핵산의 리보솜 결합 부위의 환경에서 A/U(A/T) 함량은 각각의 야생형 또는 참조 핵산의 리보솜 결합 부위 환경에서의 A/U(A/T) 함량에 비해 증가될 수 있다. 이 변형(리보솜 결합 부위 주변의 증가된 A/U(A/T) 함량)은 핵산, 예를 들어, RNA에 대한 리보솜 결합의 효율성을 증가시킨다. 리보솜 결합 부위에 대한 리보솜의 효과적인 결합은 차례로 핵산의 효율적인 번역 효과를 갖는다.
따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, 핵산은 서열 번호: 180, 181, 22845-22847 또는 이의 단편 또는 변이체의 어느 하나와 동일하거나 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 동일한, "Kozak(코작) 서열"이라고도 하는 리보솜 결합 부위를 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산은 적어도 하나의 폴리(N) 서열, 예를 들어, 하나 이상의 폴리(A) 서열, 하나 이상의 폴리(U) 서열, 하나 이상의 폴리(C) 서열, 또는 이들의 조합을 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산, 바람직하게는 RNA는 적어도 하나의 폴리(A) 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리(A) 서열", "폴리(A) 테일" 또는 "3'-폴리(A) 테일"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 일반적으로 선형 RNA(또는 원형 RNA)의 3'-말단에 위치하며 최대 약 1000개의 아데노신 뉴클레오티드인 아데노신 뉴클레오티드의 서열로 의도된다. 바람직하게는, 상기 폴리(A) 서열은 본질적으로 단독중합체이며, 예를 들어, 예를 들어 100개의 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 시퀀스는 본질적으로 100개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 다른 양태에서, 폴리(A) 서열은 아데노신 뉴클레오티드와 상이한 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 끊어질 수 있으며, 예를 들어, 100개의 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 서열은 100개 보다 큰 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다(100개의 아데노신 뉴클레오티드 및 추가로 상기 아데노신 뉴클레오티드와 상이한 적어도 하나의 뉴클레오티드 - 또는 뉴클레오티드의 스트레치를 포함). 본 명세서에 정의된 "폴리(A) 서열"은 일반적으로 RNA에 관한 것이지만, 본 발명의 맥락에서, 용어는 마찬가지로 DNA 분자의 상응하는 서열(예를 들어, "폴리(T) 서열")에 관한 것으로 이해되어야 한다.
폴리(A) 서열은 약 10 내지 약 500개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 200개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 40 내지 약 200개의 아데노신 뉴클레오티드, 또는 약 40 내지 약 150개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 적합하게는, 폴리(A) 서열의 길이는 적어도 약 10, 50, 64, 75, 100, 200, 300, 400, 또는 500개의 아데노신 뉴클레오티드이거나 이것보다 많을 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 핵산은 약 30 내지 약 200개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 폴리(A) 서열을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리(A) 서열은 약 64개의 아데노신 뉴클레오티드(A64)를 포함한다. 다른 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리(A) 서열은 약 100개의 아데노신 뉴클레오티드(A100)를 포함한다. 다른 구체예에서, 폴리(A) 서열은 약 150개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다.
추가 실시양태에서, 핵산은 약 100개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 폴리(A) 서열을 포함하며, 여기서 폴리(A) 서열은 비-아데노신 뉴클레오티드, 바람직하게는 10개의 비-아데노신 뉴클레오티드(A30-N10-A70)에 의해 끊어진다.
본 명세서에 정의된 폴리(A) 서열은 핵산의 3' 말단, 바람직하게는 RNA의 3' 말단에 직접 위치할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 3'-말단 뉴클레오티드(즉, 폴리뉴클레오티드 사슬의 마지막 3'-말단 뉴클레오티드)는 적어도 하나의 폴리(A) 서열의 3'-말단 A 뉴클레오티드이다. "3' 말단에 직접 위치"라는 용어는 정확히 3' 말단에 위치하는 것으로 이해되어야 한다 - 즉, 핵산의 3' 말단은 A 뉴클레오티드로 종결되는 폴리(A) 서열로 구성된다.
본 발명자들은 이 실시양태가 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하는데 특히 유익하다는 것을 보여주었다. 이러한 맥락에서, 이미 한 번의 백신 접종으로 바이러스를 중화시키는 항체 역가가 발생하기에 충분하다는 것을 보여줄 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 핵산 서열, 바람직하게는 RNA는 70개 이상의 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 서열을 포함하고, 여기서 3'-말단 뉴클레오티드는 아데노신 뉴클레오티드이다.
이러한 맥락에서, 아데노신 뉴클레오티드로 끝나는 것은 RNA 백신에 의한 IFN알파의 유도를 감소시키는 것으로 나타났다. 이것은 IFN알파의 유도가 예방접종을 받은 피험자에서 열을 유발하는 주요 요인으로 생각되기 때문에 특히 중요하며, 이는 당연히 피해야 한다.
핵산이 RNA인 실시양태에서, 핵산의 폴리(A) 서열은 바람직하게는 RNA 시험관내 전사 동안 DNA 주형으로부터 수득된다. 다른 양태에서, 폴리(A) 서열은 반드시 DNA 주형으로부터 전사될 필요 없이 화학적 합성의 일반적인 방법에 의해 시험관내에서 수득된다. 다른 실시양태에서, 폴리(A) 서열은 상업적으로 입수가능한 폴리아데닐화 키트 및 당업계에 공지된 상응하는 프로토콜을 사용하여 RNA의 효소적 폴리아데닐화(RNA 시험관내 전사 후)에 의해 생성되거나, 또는 대안적으로, 고정화된 폴리(A) 중합효소를 사용함으로써, 예를 들어, WO2016/174271에 기술된 방법 및 수단을 사용하여 생성된다.
핵산은 효소적 폴리아데닐화에 의해 수득된 폴리(A) 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 대부분의 핵산 분자는 약 100(+/-20) 내지 약 500(+/-50), 바람직하게는 약 250(+/-20) 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산은 주형 DNA로부터 유래된 폴리(A) 서열을 포함할 수 있고, 효소적 폴리아데닐화, 예를 들어, WO2016/091391에 기술된 바와 같은 폴리아데닐화에 의해 생성된 적어도 하나의 추가 폴리(A) 서열을 추가로 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 핵산은 적어도 하나의 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
다른 양태에서, 핵산은 적어도 하나의 폴리(C) 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리(C) 서열"은 약 200개 이하의 시토신 뉴클레오티드의 시토신 뉴클레오티드의 서열인 것으로 의도된다. 바람직한 실시양태에서, 폴리(C) 서열은 약 10 내지 약 200개의 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 100개의 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 70개의 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 60개의 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 약 40개의 시토신 뉴클레오티드을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리(C) 서열은 약 30개의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산은 적어도 하나의 히스톤 스템-루프(hSL)를 포함한다.
용어 "히스톤 스템-루프"(예를 들어, 서열 목록에서 "hSL"로 약칭됨)는 히스톤 mRNA에서 주로 발견되는 스템-루프 2차 구조를 형성하는 핵산 서열을 지칭하도록 의도된다.
히스톤 스템-루프 서열/구조는 WO2012/019780에 개시된 바와 같은 히스톤 스템-루프 서열로부터 적합하게 선택될 수 있으며, WO2012/019780의 개시 중 히스톤 스템-루프 서열/히스톤 스템-루프 구조에 관한 개시는 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 히스톤 스템-루프 서열은 바람직하게는 WO2012/019780의 화학식 (I) 또는 (II)로부터 유래될 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 핵산은 특허 출원 WO2012/019780의 특정 화학식 (Ia) 또는 (IIa) 중 적어도 하나로부터 유래된 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산은 적어도 하나의 히스톤 스템-루프를 포함하고, 여기서 상기 히스톤 스템-루프(hSL)는 서열 번호: 178 또는 179 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 실시양태에서, 제1 측면의 RNA는 본 명세서에 정의된 바와 같은 히스톤 스템-루프를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 특히 RNA와 관련된 실시양태에서, 핵산은 3'-말단 서열 요소를 포함한다. 상기 3'-말단 서열 요소는 폴리(A) 서열 및 선택적으로 히스톤-스템-루프 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 핵산은 서열 번호: 182-230, 22912, 22913 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 적어도 하나의 3'-말단 서열 요소를 포함한다.
바람직한 양태에서, 특히 RNA와 관련된 양태에서, 핵산은 3'-말단 서열 요소를 포함한다. 상기 3'-말단 서열 요소는 폴리(A) 서열 및 선택적으로 히스톤-스템-루프 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 핵산은 서열 번호: 182, 187, 189, 192, 199, 207 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 적어도 하나의 3'-말단 서열 요소를 포함한다.
다양한 실시양태, 특히 RNA와 관련된 실시양태에서, 핵산은 서열 번호: 176 또는 177, 22840-22844, 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 5'-말단 서열 요소를 포함한다. 이러한 5'-말단 서열 요소는 예를 들어 T7 RNA 중합효소의 결합 부위와같은 결합 부위를 포함한다. 또한, 상기 5'-말단 시작 서열의 첫 번째 뉴클레오티드는 바람직하게는 2'O 메틸화, 예를 들어, 2'O 메틸화 구아노신 또는 2'O 메틸화 아데노신을 포함할 수 있습니다.
바람직하게는, 제1 측면의 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA는 일반적으로 약 50 내지 약 20000개의 뉴클레오티드, 또는 약 500 내지 약 10000개의 뉴클레오티드, 또는 약 1000 내지 약 10000개의 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 약 1000 내지 약 5000개의 뉴클레오티드, 또는 훨씬 더 바람직하게는 약 2000 내지 약 5000개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 DNA 또는 RNA이다.
다양한 실시양태에서, DNA는 플라스미드 DNA 또는 선형 코딩 DNA 구조이고, 여기서 DNA는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 요소(예를 들어 코딩 서열, UTR, 폴리(A/T), 폴리아데닐화 신호, 프로모터)를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 양태에서, 핵산은 DNA 발현 벡터이다. 이러한 DNA 발현 벡터는 박테리아 플라스미드, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 파라폭시바이러스(orf 바이러스), 백시니아 바이러스, 계두 바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 알파바이러스, 렌티바이러스, 람다 파지, 림프구성 맥락수막염 바이러스 및 리스테리아 종, 살모넬라 종로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, DNA는 또한 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 항원 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 예를 들어 원숭이 바이러스 40(SV40)의 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 예를 들어 소 면역결핍 바이러스(BIV) 장말단 반복(LTR) 프로모터, 몰로니(Moloney) 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스(ALV) 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 예를 들어 CMV 즉시 초기 프로모터, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스(EBV) 프로모터, 또는 Rous 육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 천연 또는 합성의 근육 또는 피부 특이적 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 미국 특허 출원 공개 번호 US20040175727에 개시된다. 바람직한 실시양태에서, 벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 코로나바이러스 항원을 코딩하는 DNA를 발현할 수 있고 세포가 서열을 면역계에 의해 인식되는 항원으로 번역할 수 있게 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
추가로 적합한 플라스미드 DNA가 생성되어 세포주, 예를 들어, 곤충 세포주에서 암호화된 SARS-CoV-2 항원의 효율적인 생산을 허용할 수 있다. 예를 들어, WO2009150222A2에 기술되고 PCT 청구항 1 내지 33에 정의된 벡터를 사용할 수 있으며, WO2009150222A2의 청구항 1 내지 33에 관한 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 아데노바이러스 기반 벡터이다. 이러한 아데노바이러스 기반 벡터는 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, WO2005/071093 또는 WO2006/048215에 기재된 것과 같은 임의의 적합한 아데노바이러스 기반 벡터가 사용될 수 있다. 적절하게는, 사용된 아데노바이러스 기반 벡터는 원숭이 아데노바이러스이므로 AdHu5와 같은 일반적인 인간 개체에 대한 기존 항체에 의한 백신 접종 후 면역 반응의 약화를 방지한다. 적합한 유인원 아데노바이러스 벡터는 AdCh63 (특허 번호 WO/2005/071093) 또는 AdCh68 (Cohen et al J. Gen Virol 2002 83:151)을 포함하지만 다른 것도 사용될 수 있다. 적절하게는 아데노바이러스 벡터는 E1 영역이 삭제되어 인간 세포에서 복제가 결핍되게 만든다. E3 및 E4와 같은 아데노바이러스의 다른 영역도 삭제될 수 있다.
추가 실시양태에서, 제1 측면의 핵산은 orf 바이러스 기반 벡터이다. 이러한 아데노바이러스 기반 벡터는 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 RNA이다.
바람직하게는, RNA는 전형적으로 약 50 내지 약 20000개의 뉴클레오티드, 또는 약 500 내지 약 10000개의 뉴클레오티드, 또는 약 1000 내지 약 10000개의 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 약 1000 내지 약 5000개의 뉴클레오티드, 또는 훨씬 더 바람직하게는 약 2000 내지 약 5000개의 뉴클레오티드를 포함한다.
바람직한 양태에 따르면, 핵산은 RNA, 바람직하게는 코딩 RNA이다.
바람직한 양태에서, 코딩 RNA는 mRNA, (코딩) 자가-복제 RNA, (코딩) 원형 RNA, (코딩) 바이러스 RNA, 또는 (코딩) 레플리콘 RNA로부터 선택될 수 있다.
다른 양태에서, 코딩 RNA는 원형 RNA이다. 본 명세서에 사용된 "원형 RNA" 또는 "circRNA"는 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 원형 폴리뉴클레오티드 구조로서 이해되어야 한다. 바람직하게는, 이러한 circRNA는 단일 가닥 RNA 분자이다. 바람직한 구현예에서, 상기 circRNA는 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체로부터의 적어도 하나의 항원성 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다.
추가 실시양태에서, 코딩 RNA는 레플리콘 RNA이다. 용어 "레플리콘 RNA"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 최적화된 자가 복제 RNA가 되도록 의도된다. 이러한 구조는 예를 들어, 알파바이러스(예: SFV, SIN, VEE 또는 RRV) 및 구조적 바이러스 단백질의 관심 핵산(즉, SARS-CoV-2 코로나바이러스의 항원성 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 코딩 서열)으로의 치환으로부터 유래한 레플리카제 요소를 포함한다. 대안적으로, 레플리카제는 독립적인 코딩 RNA 구조 또는 코딩 DNA 구조에 제공될 수 있다. 레플리카제의 다운스트림은 레플리콘 RNA의 복제를 제어하는 서브-게놈 프로모터일 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 적어도 하나의 핵산은 레플리콘 RNA 또는 자가-복제 RNA가 아니다.
특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산은 mRNA이다.
바람직하게는, mRNA는 레플리카제 요소(예를 들어, 레플리카제를 인코딩하는 핵산)를 포함하지 않는다.
용어 "RNA" 및 "mRNA"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 리보핵산 분자, 즉 뉴클레오티드로 구성된 중합체로 의도된다. 이러한 뉴클레오티드는 일반적으로 소위 백본을 따라 서로 연결된 아데노신-일인산, 우리딘-일인산, 구아노신-일인산 및 시티딘-일인산 단량체이다. 백본은 첫 번째의 당, 즉 리보오스와 두 번째 인접한 단량체의 인산염 모이어티 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해 형성된다. 단량체의 특정 연속을 RNA-서열이라고 한다. mRNA(메신저 RNA)는 특정 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오티드 코딩 서열을 제공한다.
본 발명의 맥락에서, 코딩 RNA, 바람직하게는 mRNA는 투여 후 (예를 들어, 개체, 예를 들어, 인간에 투여 후) (기능적) 항원으로 번역되는, SARS-CoV-2으로부터의 항원성 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 제공한다.
따라서, 코딩 RNA, 바람직하게는 mRNA는 백신, 바람직하게는 SARS-CoV-2 백신에 적합하다.
적합하게는, 코딩 RNA는 5'-캡 구조의 추가에 의해 변형될 수 있으며, 이는 바람직하게는 (개체 투여 후에) 코딩 RNA를 안정화하고/하거나 코딩된 항원의 발현을 향상시키고/시키거나 선천성 면역계의 자극을 감소시킨다. 5'-캡 구조는 핵산이 RNA, 특히 선형 코딩 RNA인 실시양태, 예를 들어, 선형 mRNA 또는 선형 코딩 레플리콘 RNA에서 특히 중요하다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, RNA, 특히 코딩 RNA는 5'-캡 구조, 바람직하게는 cap0, cap1, cap2, 변형된 cap0, 또는 변형된 cap1 구조를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "5'-캡 구조"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 RNA, 예를 들어, mRNA의 5'-말단에 위치한 5' 변형된 뉴클레오티드, 특히 구아닌 뉴클레오티드를 의미하도록 의도된다. 바람직하게는, 5'-캡 구조는 5'-5'-트리포스페이트 연결을 통해 RNA에 연결된다.
본 발명의 맥락에서 적합할 수 있는 5'-캡 구조는 cap0 (첫 번째 핵염기의 메틸화, 예를 들어 m7GpppN), cap1 (m7GpppN의 인접 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화), cap2 (m7GpppN의 2번째 뉴클레오티드 다운스트림의 리보스의 추가 메틸화), cap3 (m7GpppN의 다운스트림 3번째 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화), cap4 (m7GpppN의 다운스트림 4번째 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화), ARCA(안티-리버스 cap 유사체), 변형된 ARCA(예: 포스포티오에이트 변형된 ARCA), 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'-플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 및 2-아지도-구아노신이다.
5'-cap (cap0 또는 cap1) 구조는 cap 유사체를 사용하여 화학적 RNA 합성 또는 RNA in vitro 전사(공-전사(co-transcriptional) 캡핑)에서 형성될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "캡 유사체(cap analogue)"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 번역 또는 국소화를 촉진하고/하거나 핵산 분자의 5'-말단에 통합될 때 핵산 분자, 특히 RNA 분자의 분해를 방지한다는 점에서 캡 기능을 갖는 비-중합성 디-뉴클레오티드 또는 트리-뉴클레오티드를 지칭하는 것으로 의도된다. 비-중합성(non-polymerizable)은 캡 유사체가 단지 5'-말단에 포함되는 것을 의미하며, 이는 그것이 5' 트리포스페이트가 없기 때문에 템플레이트-의존성 폴리머라제, 특히 템플레이트-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 3'-방향으로 확장될 수 없기 때문이다. 캡 유사체의 예는 m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; 메틸화되지 않은 캡 유사체(예: GpppG); 디메틸화된 캡 유사체(예: m2,7GpppG), 트리메틸화된 캡 유사체(예: m2,2,7GpppG), 디메틸화된 대칭 캡 유사체(예: m7Gpppm7G), 또는 안티-리버스 캡 유사체(예: ARCA; m7,2'OmeGpppG, m7,2'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'dGpppG 및 이들의 테트라포스페이트 유도체들)로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 구조를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가 캡 유사체는 이전에 설명되었졌다 (WO2008/016473, WO2008/157688, WO2009/149253, WO2011/015347, 및 WO2013/059475). 이러한 맥락에서 추가의 적합한 캡 유사체는 WO2017/066793, WO2017/066781, WO2017/066791, WO2017/066789, WO2017/053297, WO2017/066782, WO2018/075827 및 WO2017/066797에 설명되어 있으며, 이들에 개시된 캡 유사체에 대한 개시들은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 실시양태에서, 변형된 cap1 구조는 WO2017/053297, WO2017/066793, WO2017/066781, WO2017/066791, WO2017/066789, WO2017/066782, WO2018/075827 및 WO2017/066797에 개시된 바와 같은 트리-뉴클레오티드 캡 유사체를 사용하여 생성된다. 특히, WO2017/053297의 청구항 1 내지 5에 개시된 구조로부터 유도될 수 있는 임의의 캡 구조는 변형된 cap1 구조를 공동-전사적으로 생성하는 데 적합하게 사용될 수 있다. 또한, WO2018/075827의 청구항 1 또는 청구항 21에 정의된 구조로부터 유도가능한 임의의 캡 구조는 변형된 cap1 구조를 공동-전사적으로 생성하는데 적합하게 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, (코딩) RNA, 특히 mRNA는 cap1 구조를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 5'-캡 구조는 본 명세서에 정의된 바와 같은 RNA 시험관내 전사 반응에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 트리-뉴클레오티드 캡 유사체를 사용하여 공동-전사적으로 추가될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 코딩 RNA의 cap1 구조는 트리-뉴클레오티드 캡 유사체 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG를 사용하여 공동 전사 캡핑을 사용하여 형성된다. 이러한 맥락에서 바람직한 cap1 유사체는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA의 cap1 구조는 트리-뉴클레오티드 캡 유사체 3'OMe-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG를 사용하는 공동-전사 캡핑을 사용하여 형성된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 RNA의 cap0 구조는 cap 유사체 3'OMe-m7G(5')ppp(5')G를 사용하는 공동-전사 캡핑을 사용하여 형성된다.
다른 구체예에서, 5'-캡 구조는 cap0 또는 cap1 또는 cap2 구조를 생성하기 위해 캡핑 효소(예를 들어, 백시니아 바이러스 캡핑 효소 및/또는 캡 의존적 2'-O 메틸트랜스퍼라제)를 사용하는 효소적 캡핑을 통해 형성된다. 5'-캡 구조(cap0 또는 cap1)는 WO2016/193226에 개시된 방법 및 수단을 사용하여 고정된 캡핑 효소 및/또는 캡-의존성 2'-O 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 추가할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, RNA (종)의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%는 캡핑 분석을 사용하여 결정된 바와 같이 cap1 구조를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, RNA(종)의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만은 캡핑 분석을 사용하여 결정된 바와 같이 cap1 구조를 포함하지 않는다. 다른 바람직한 실시양태에서, RNA(종)의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%는 캡핑 분석을 사용하여 결정된 바와 같은 cap0 구조를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, RNA(종)의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만은 캡핑 분석을 사용하여 결정된 바와 같이 cap0 구조를 포함하지 않는다.
용어 "RNA 종"은 "하나의 단일 분자"를 의미하는 것으로 제한되지 않고, 본질적으로 동일한 RNA 분자의 앙상블을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 이는 복수의 본질적으로 동일한 (코딩) RNA 분자의 복수와 관련될 수 있다.
cap0 또는 cap1 구조의 존재/부재를 결정하기 위해, 공개된 PCT 출원 WO2015/101416, 특히 공개된 PCT 출원 WO2015/101416의 청구항 27 내지 46에 기재된 바와 같은 캡핑 분석이 사용될 수 있다. RNA의 cap0 또는 cap1 구조의 존재/부재를 결정하기 위해 사용될 수 있는 다른 캡핑 분석은 PCT/EP2018/08667 또는 공개된 PCT 출원 WO2014/152673 및 WO2014/152659에 설명되어 있다.
바람직한 구현예에서, RNA는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA) 캡 구조를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 코딩 RNA는 5'-말단 m7G 캡, 및 m7GpppN의 인접한 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화, 일정 경우에는 2'O 메틸화된 아데노신을 포함한다. 바람직하게는, RNA(종)의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%가 캡핑 분석을 사용하여 결정된 바와 같은 cap1 구조를 포함한다.
다른 바람직한 양태에서, RNA는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG) 캡 구조를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 코딩 RNA는 5'-말단 m7G 캡, 및 인접한 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화, 이 경우에 2'O 메틸화된 구아노신를 포함한다. 바람직하게는, 코딩 RNA(종)의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%가 캡핑 분석을 사용하여 결정된 바와 같은 cap1 구조를 포함한다.
따라서, 상기 RNA 또는 mRNA 서열의 첫 번째 염기, 즉 m7G(5')ppp 구조의 뉴클레오티드 다운스트림은 2'O 메틸화 구아노신 또는 2'O 메틸화 아데노신일 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, RNA는 변형된 RNA이고, 여기서 변형은 백본 변형 뿐만 아니라 당 변형 또는 염기 변형을 포함하는 화학적 변형을 지칭한다.
변형된 RNA는 뉴클레오티드 유사체/변형, 예를 들어, 백본 변형, 당 변형 또는 염기 변형을 포함할 수 있습니다. 본 발명의 맥락에서 백본 변형은 RNA의 뉴클레오티드 골격의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형이다. 본 발명의 맥락에서 당 변형은 RNA의 뉴클레오티드 당의 화학적 변형이다. 또한, 본 발명의 맥락에서 염기 변형은 RNA의 뉴클레오티드의 염기 모이어티의 화학적 변형이다. 이러한 맥락에서, 뉴클레오티드 유사체 또는 변형은 바람직하게는 전사 및/또는 번역에 적용 가능한 뉴클레오티드 유사체로부터 선택된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된 RNA에 혼입될 수 있는 뉴클레오티드 유사체/변형물은 바람직하게는 2-아미노-6-클로로퓨린리보시드-5'-트리포스페이트, 2-아미노퓨린-리보시드-5'-트리포스페이트; 2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘-트리포스페이트, 2-티오시티딘-5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로티미딘-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸-이노신-5'-트리포스페이트 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도시티딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도- 2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-데옥시우리딘 -5'-트리포스페이트, 6-아자시티딘-5'-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5'-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보사이드-5'-트리포스페이트, 7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5'-트리포스페이트, 8-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 벤즈이미다졸-리보사이드-5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 또는 퓨로마이신-5'-트리포스페이트, 크산토신-5'-트리포스페이트(xanthosine-5'-triphosphate)로부터 선택된다. 특히 바람직한 것들은 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 및 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 피리딘-4-원 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 파이롤로-시티딘, 파이롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린(zebularine), 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-트레오닐(threonyl)카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신(wyosine), 와이부토신(wybutosine), 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-시티딘, 5'-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-우리딘, 5'-O-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘, 6-아자-시티딘, 2-티오-시티딘, 알파-티오-시티딘, 슈도-이소-시티딘, 5-아미노알릴(allyl)-우리딘, 5-요오도-우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 알파-티오-우리딘, 4-티오-우리딘, 6-아자-우리딘, 5-하이드록시-우리딘, 데옥시-티미딘, 5-메틸-우리딘, 파이롤로-시티딘, 이노신, 알파-티오-구아노신, 6-메틸-구아노신, 5-메틸-시티딘, 8-옥소-구아노신, 7-데아자-구아노신, N1-메틸-아데노신, 2-아미노-6-클로로-퓨린, N6-메틸-2-아미노-퓨린, 슈도-이소-시티딘, 6-클로로-퓨린, N6-메틸-아데노신, 알파-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데노신로 이루어진 염기-변형 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 변형을 위한 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 5-메틸우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디히드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 및 2'-O-메틸 우리딘로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 정의된 코딩 서열 내 우라실의 100%는 화학적 변형을 가지며, 바람직하게는 화학적 변형은 우라실의 5-위치에 있다.
본 발명의 맥락에서 특히 바람직한 것은 슈도우리딘(ψ), N1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸시토신, 및 5-메톡시우리딘이다.
그러나, 일부 양태에서, 실시양태의 폴리뉴클레오타이드 분자는 임의의 N1-메틸슈도우리딘(m1Ψ) 치환된 위치를 포함하지 않는다. 추가 측면에서, 실시양태의 폴리뉴클레오티드 분자는 임의의 슈도우리딘(ψ), N1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸시토신, 및 5-메톡시우리딘 치환된 위치를 포함하지 않는다. 또 다른 측면에서, 실시양태의 폴리뉴클레오티드 분자는 G, C, A 및 U 뉴클레오티드로만 구성된 코딩 서열을 포함한다.
슈도우리딘(ψ), N1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸시토신 및/또는 5-메톡시우리딘과 같은 변형된 뉴클레오티드를 RNA의 코딩 서열에 통합하는 것은 원치 않는 선천성 면역 반응(코딩 RNA 또는 백신의 투여 시)을 (필요하다면) 조정하거나 줄일 수 있다.
일부 실시양태에서, RNA는 본 명세서에 정의된 바와 같은 SARS-CoV-2 항원성 단백질을 코딩하는 하나 이상의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 상기 코딩 서열은 슈도우리딘(ψ) 및 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ)으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드는 슈도우리딘(ψ) 뉴클레오티드 및/또는 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
바람직한 양태에서, RNA는 N1-메틸슈도우리딘(m1Ψ) 치환된 위치를 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, RNA는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸시토신, 및 5-메톡시우리딘 치환된 위치를 포함하지 않는다.
바람직한 실시양태에서, RNA는 G, C, A 및 U 뉴클레오티드로만 구성된 코딩 서열을 포함하므로 (Cap 유사체 제외하고) 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
핵산, 바람직하게는 코로나바이러스 백신에 적합한 mRNA 구조:
다양한 실시양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 바람직하게는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함한다:
A) 5'-캡 구조, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 바와 같은 5'-캡 구조;
B) 5'-말단 시작 요소, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 바와 같은 5'-말단 시작 요소;
C) 임의로, 5'-UTR, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 바와 같은 5'-UTR;
D) 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 바와 같은 리보솜 결합 부위;
E) 적어도 하나의 코딩 서열, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 바와 같은 적어도 하나의 코딩 서열;
F) 3'-UTR, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 바와 같은 3'-UTR;
G) 임의로, 폴리(A) 서열, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 바와 같은 폴리(A) 서열;
H) 임의로, 폴리(C) 서열, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 바와 같은 폴리(C) 서열;
I) 임의로(optionally), 히스톤 스템-루프, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 바와 같은 히스톤 스템-루프;
J) 임의로, 3'-말단 서열 요소, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 바와 같은 3'-말단 서열 요소.
바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 바람직하게는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함한다:
A) m7G(5'), m7G(5')ppp(5')(2'OMeA) 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)에서 선택된 5'-캡 구조;
B) 서열 번호: 176 또는 177 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 5'-말단 시작 요소;
C) 임의로, HSD17B4 유전자로부터 유래된 5'-UTR;
D) 서열 번호: 180, 181, 22845-22847 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 리보솜 결합 부위;
E) 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184, 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 코딩 서열;
F) PSMB3 유전자 또는 알파-글로빈 유전자("muag")로부터 유래한 3'-UTR;
G) 임의로, 약 30 내지 약 500개의 아데노신을 포함하는 폴리(A) 서열;
H) 임의로, 약 10 내지 약 100개의 시토신을 포함하는 폴리(C) 서열;
I) 임의로, 서열 번호: 178 또는 179로부터 선택된 히스톤 스템-루프;
J) 임의로, 서열 번호: 182-230에서 선택된 3'-말단 서열 요소.
특히 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 바람직하게는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함한다:
A) 본 명세서에서 정의된 바와 같은 cap1 구조;
B) 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 코딩 서열;
C) 본 명세서에 정의된 muag 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 267 또는 268, 22896-22901, 22906-22911에 따른 3'-UTR;
D) 약 64개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열;
E) 약 10 내지 약 100개의 시토신을 포함하는 폴리(C) 서열;
F) 서열 번호: 178 또는 179로부터 선택된 히스톤 스템-루프.
바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함한다:
A) 본 명세서에서 정의된 바와 같은 cap1 구조;
B) 본 명세서에 정의된 HSD17B4 유전자로부터 유래한 5'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 231 또는 232에 따른 5'-UTR;
C) 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184 또는 이의 단편 또는 변이체으로부터 선택된 코딩 서열;
D) 본 명세서에 정의된 PSMB3 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 253 또는 254에 따른 3'-UTR;
E) 약 64개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열;
F) 임의로 약 10 내지 약 100개의 시토신을 포함하는 폴리(C) 서열;
G) 서열 번호: 178 또는 179로부터 선택된 히스톤 스템-루프;
H) 임의로, 서열 번호: 182-230의 3'-말단 서열 요소.
특히 바람직한 실시양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함한다:
A) 본 명세서에서 정의된 바와 같은 cap1 구조;
B) 본 명세서에 정의된 HSD17B4 유전자로부터 유래한 5'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 231 또는 232에 따른 5'-UTR;
C) 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184 또는 이의 단편 또는 변이체으로부터 선택된 코딩 서열;
D) 본 명세서에 정의된 PSMB3 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 253 또는 254에 따른 3'-UTR;
E) 서열 번호: 178 또는 179로부터 선택된 히스톤 스템-루프;
F) 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열, 바람직하게는 3' 말단을 나타내는 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열.
더욱 바람직한 실시양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함한다:
A) 본 명세서에서 정의된 바와 같은 cap1 구조;
B) 본 명세서에 정의된 HSD17B4 유전자로부터 유래한 5'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 231 또는 232에 따른 5'-UTR;
C) 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184 또는 이의 단편 또는 변이체으로부터 선택된 코딩 서열;
D) 본 명세서에 정의된 PSMB3 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 253 또는 254에 따른 3'-UTR;
F) 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열, 바람직하게는 3' 말단을 나타내는 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열.
특히 바람직한 실시양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함한다:
A) 본 명세서에서 정의된 바와 같은 cap1 구조;
B) 본 명세서에 정의된 SLC7A3 유전자로부터 유래한 5'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 245 또는 246에 따른 5'-UTR;
C) 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184 또는 이의 단편 또는 변이체으로부터 선택된 코딩 서열;
D) 본 명세서에 정의된 PSMB3 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 253 또는 254에 따른 3'-UTR;
E) 임의로, 서열 번호: 178 또는 179로부터 선택된 히스톤 스템-루프;
F) 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열, 바람직하게는 3' 말단을 나타내는 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열.
특히 바람직한 실시양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함한다:
A) 본 명세서에서 정의된 바와 같은 cap1 구조;
B) 본 명세서에 정의된 RPL31 유전자로부터 유래한 5'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 243 또는 243에 따른 5'-UTR;
C) 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184 또는 이의 단편 또는 변이체으로부터 선택된 코딩 서열;
D) 본 명세서에 정의된 RPS9 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 263 또는 264에 따른 3'-UTR;
E) 임의로, 서열 번호: 178 또는 179로부터 선택된 히스톤 스템-루프;
F) 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열, 바람직하게는 3' 말단을 나타내는 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열.
본 발명의 바람직한 핵산 서열, 바람직하게는 mRNA 서열은 표 3a에 제공된다. 거기에서, 각 행은 본 발명의 특정한 적합한 SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 구조(construct)(표 1과 비교)을 나타내며, 여기서 SARS-CoV-2 구조에 대한 설명은 표 3a의 열 A에 표시되어 있고 각각의 SARS-CoV-2 구조의 아미노산 서열의 서열 번호는 열 B에 제공된다. 각각의 SARS-CoV-2 구조를 코딩하는 코딩 서열의 상응하는 서열 번호는 표 1에 제공된다. 추가 정보는 서열 목록에서 각 서열 번호의 <223> 식별자 아래에 제공된다.
상응하는 핵산, 바람직하게 코딩 RNA 서열, 특히 바람직한 코딩 서열을 포함하는 mRNA 서열은 열 C 및 D에 제공되며, 여기에서 열 C는 본 명세서에 정의된 바와 같은 UTR 조합 "HSD17B4/PSMB3"을 갖는 핵산 서열을 제공하고, 여기서 열 D는 본 명세서에 정의된 "알파-글로빈" 3' UTR을 갖는 핵산 서열을 제공한다.
핵산, 바람직하게는 코로나바이러스 백신에 적합한 mRNA 구조(컨스트럭트)
[표 3a]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
추가의 바람직한 핵산 서열, 바람직하게는 본 발명의 mRNA 서열은 표 3b에 제공된다. 여기에서, 각 열은 본 발명의 특정한 적합한 SARS-CoV-2(nCoV-2019) 구조를을 나타내고(표 1 및 표 3a와 비교), 여기서 열 B는 표 1 및 표 3a의 1행과 비교하여 "전장 스파이크 단백질; S"를 나타내고, 및 열 C는 표 1 및 표 3a의 행 2와 비교하여 "안정화된 스파이크 단백질; S_stab_PP”을 나타낸다.
각각의 SARS-CoV-2 구조의 아미노산 서열의 서열 번호는 1행에 제공된다. 각각의 SARS-CoV-2 구조를 암호화하는 코딩 서열의 상응하는 서열 번호는 표 1에 제공된다. 정보는 서열 목록의 각 서열 번호의 <223> 식별자 아래에 제공된다.
상응하는 핵산, 바람직하게 코딩 RNA 서열, 특히 바람직한 코딩 서열을 포함하는 mRNA 서열이 행 2-16에 제공되며, 여기서 각 행은 UTR 조합 및 적합한 3' 말단을 갖는 핵산 서열을 제공한다.
핵산, 바람직하게는 코로나바이러스 백신에 적합한 mRNA 구조
[표 3b]
Figure pct00004
바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937 또는 이들 서열 중 임의의 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 각각의 핵산 서열에 관한 추가 정보는 서열 목록 내 각 서열 번호의 식별자 <223>, 표 3a (특히 열 C 및 D 참조) 및 표 3b (특히 행 2-16 참조)에서 제공된다.
특히 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 162-175, 12676-13147, 14160-14177, 22786-22839, 23189-23404 또는 이들 서열 중 임의의 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 각각의 핵산 서열에 관한 추가 정보는 서열 목록 내 각 서열 번호의 식별자 <223>, 표 3a (특히 열 D 참조), 표 3b (2행)에서 제공된다.
특히 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 148-161, 12204-12675, 14142-14159, 22786-22812, 23409-23624, 24729-24944 또는 이들 서열 중 임의의 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 각각의 핵산 서열에 관한 추가 정보는 서열 목록 내 각 서열 번호의 식별자 <223>, 표 3a (특히 열 C 참조) 및 표 3b (행 3, 7 참조)에서 제공된다.
특히 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 149-154, 156-161, 163-168, 170-175, 12338, 12352, 12541, 12555, 12810, 12824, 13013, 13027, 22786, 22792, 22794, 22796, 22798, 22800, 22802, 22804, 22806, 22808, 22810, 22812, 22813, 22819, 22821, 22823, 22825, 22827, 22829, 22831, 22833, 22835, 22837, 22839, 23517-23624, 23297-23404, 24837-24944 또는 이들 서열 중 임의의 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 각각의 핵산 서열에 관한 추가 정보는 서열 목록 내 각 서열 번호의 식별자 <223>, 표 3a (열 C 및 D, 행 2 및 6 참조) 및 표 3b (열 C 참조)에서 제공된다.
더욱 더 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 149, 156, 12338, 150, 157, 151, 158, 12541, 163, 170, 12810, 164, 171, 165, 172, 13013, 12342-12351, 12545-12554, 12814-12823, 13017-13026, 14133 또는 이들 서열 중 임의의 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 각각의 핵산 서열에 관한 추가 정보는 서열 목록 내 각 서열 번호의 식별자 <223>, 표 3a 및 3b에서 제공된다.
더욱 더 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 149, 150, 151, 163, 164, 165 또는 이들 서열 중 임의의 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 각각의 핵산 서열에 관한 추가 정보는 서열 목록 내 각 서열 번호의 식별자 <223> 및 표 3a (열 C 및 D, 행 2 참조)에서 제공된다.
특히 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 163의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
더욱 특히 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 149의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
더욱 특히 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 24837의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
더욱 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 23311, 23531, 24851의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
더욱 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 23310, 23530, 24850의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
더욱 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 23313, 23533, 24853, 23314, 23534, 24854의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
더욱 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 26633의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
더욱 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 26907의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937이고, 여기에서 상기 RNA 서열은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 cap1 구조를 포함하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 각각의 핵산 서열에 관한 추가 정보는 서열 목록의 각 서열 번호의 식별자 <223> 및 표 3a 및 3b에 제공된다.
추가의 실시양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937이고, 여기에서 상기 RNA 서열 내 적어도 하나, 바람직하게는 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘(ψ) 뉴클레오티드 및/또는 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ) 뉴클레오티드로 치환된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 각각의 핵산 서열에 관한 추가 정보는 서열 목록의 각 서열 번호의 식별자 <223> 및 표 3a 및 3b에 제공된다.
추가의 실시양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937이고, 여기에서 상기 RNA 서열이 본 명세서에서 정의된 바와 같은 cap1 구조를 포함하고, 여기에서 상기 RNA 서열 내 적어도 하나, 바람직하게는 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘(ψ) 뉴클레오티드 및/또는 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ) 뉴클레오티드로 치환된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 각각의 핵산 서열에 관한 추가 정보는 서열 목록의 각 서열 번호의 식별자 <223> 및 표 3a 및 3b에 제공된다.
명세서 전반에 걸쳐 개괄된 바와 같이, 적합한 아미노산 서열 또는 핵산 서열(코딩 서열, DNA 서열, RNA 서열)에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 설명된 바와 같이 식별자 <223> 하에 제공된 세부사항에서 유래할 수도 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 RNA이고, 여기서 RNA는 예를 들어, 고상 RNA 합성과 같은 화학 합성뿐만 아니라, RNA 시험관내 전사 반응과 같은 시험관내(in vitro) 방법을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, RNA는 RNA 시험관내 전사에 의해 얻어진다.
따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산은 바람직하게는 시험관내 전사된 RNA이다.
"RNA 시험관내(in vitro) 전사" 또는 "시험관내 전사"라는 용어는 RNA가 무세포 시스템(시험관내)에서 합성되는 과정에 관한 것이다. RNA는 본 발명에 따른 선형화된 플라스미드 DNA 주형(template) 또는 PCR 증폭된 DNA 주형인 적절한 DNA 주형의 DNA 의존적 시험관내 전사에 의해 얻어질 수 있다. RNA 시험관내 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. DNA 의존성 RNA 폴리머라제의 특정 예는 T7, T3, SP6 또는 Syn5 RNA 폴리머라제이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, DNA 주형은 RNA 시험관내 전사에 적용되기 전에 적합한 제한 효소로 선형화된다.
RNA 시험관내 전사에 사용되는 시약은 일반적으로 박테리오파지 인코딩된 RNA 중합효소(T7, T3, SP6, 또는 Syn5)와 같은 그것의 각각의 RNA 중합효소에 대해 높은 결합 친화도를 가진 프로모터 서열을 함유한 DNA 주형 (선형 플라스미드 DNA 또는 PCT 산물); 4개의 염기(아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실)에 대한 리보뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP); 임의로, 본 명세서에 정의된 캡 유사체; 임의로, 본 명세서에 정의된 추가 변형된 뉴클레오티드; DNA 주형 내의 프로모터 서열에 결합할 수 있는 DNA-의존성 RNA 중합효소(예: T7, T3, SP6, 또는 Syn5 RNA 중합효소); 임의로, 임의의 잠재적으로 오염된 RNase를 비활성화하기 위한 리보뉴클레아제(RNase) 억제제; 임의로, RNA 시험관내 전사를 억제할 수 있는 피로포스페이트를 분해하기 위한 피로포스파타제; 중합효소의 보조인자로 Mg2+ 이온을 공급하기 위한 MgCl2; 적절한 pH 값을 유지하기 위한 완충액(TRIS 또는 HEPES), 이는 항산화제(예: DTT) 및/또는 최적 농도의 스페르미딘과 같은 폴리아민, 예를 들어, WO2017/109161에 개시된 TRIS-시트레이트를 포함하는 완충 시스템을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA의 cap1 구조는 트리-뉴클레오티드 캡 유사체 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG를 사용하는 공-전사 캡핑(using co-transcriptional capping)을 사용하여 형성된다. 본 발명의 코딩 RNA를 제조하는데 적합하게 사용될 수 있는 바람직한 cap1 유사체는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA의 cap1 구조는 트리-뉴클레오티드 캡 유사체 3'OMe-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG를 사용하는 공동-전사 캡핑을 사용하여 형성된다.
다른 양태에서, 본 발명의 RNA의 capO 구조는 캡 유사체 3'OMe-m7G(5')ppp(5')G를 사용하는 공동-전사 캡핑을 사용하여 형성된다.
추가 실시양태에서, RNA 시험관내 전사에 사용되는 뉴클레오티드 혼합물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, 바람직한 변형된 뉴클레오티드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸시토신 및 5-메톡시우리딘으로부터 선택될 수 있다. 특정 양태에서, 뉴클레오타이드 혼합물 내의 우라실 뉴클레오타이드는 변형된 RNA를 얻기 위해 슈도우리딘(ψ) 및/또는 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ)에 의해 (부분적으로 또는 완전히) 대체된다.
바람직한 실시양태에서, RNA 시험관내 전사에 사용되는 뉴클레오티드 혼합물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, RNA 시험관내 전사에 사용되는 뉴클레오티드 혼합물은 G, C, A 및 U 뉴클레오티드, 및 임의로 본 명세서에 정의된 캡 유사체만을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, RNA 시험관내 전사 반응에 사용되는 뉴클레오티드 혼합물(즉, 혼합물 중 각 뉴클레오티드의 분획)은 바람직하게는 WO2015/188933에 기재된 바와 같이 주어진 RNA 서열에 대해 최적화될 수 있다.
이러한 맥락에서, 시험관내 전사는 서열 최적화된 뉴클레오티드 혼합물 및 임의로 캡 유사체의 존재 하에 수행되었으며, 바람직하게는 여기서 서열 최적화된 뉴클레오티드 혼합물은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
이와 관련하여, 서열 최적화된 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물은 4개의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) GTP, ATP, CTP 및 UTP을 포함하는, 주어진 서열의 RNA 분자의 생체내 전사 반응에서의 사용을 위한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs)의 혼합물이며, 여기서 서열-최적화된 뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTP) 혼합물 내 4개의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 각각의 분획은 상기 RNA 분자에서 각 뉴클레오티드의 분획에 대응한다. 리보뉴클레오티드가 RNA 분자에 존재하지 않는 경우, 상응하는 뉴클레오시드 트리포스페이트도 서열 최적화된 뉴클레오시드 트리포스페이트(NTP) 혼합물에 존재하지 않는다.
본 명세서에 정의된 하나보다 많은 상이한 RNA가 생성되어야 하는 실시양태에서, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 RNA가 생성되어야 하는 경우(두 번째 측면 참조), WO2017/109134에 설명된 절차가 적합하게 사용될 수 있다.
핵산 기반 백신 생산과 관련하여 GMP 등급 핵산, 예를 들어, GMP 등급 RNA 또는 DNA을 제공해야 할 수도 있다. GMP 등급 RNA 또는 DNA는 규제 당국에서 승인한 제조 공정을 사용하여 생산할 수 있다. 따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, RNA 생산은 바람직하게는 WO2016/180430에 따라 DNA 및 RNA 수준에 대한 다양한 품질 관리 단계를 구현하는, 현행 GMP(우수 제조 관리) 하에 수행된다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 RNA는 GMP-등급 RNA, 특히 GMP-등급 mRNA이다. 따라서, 백신용 RNA는 바람직하게는 GMP 등급 RNA이다.
수득된 RNA 생성물은 바람직하게는 PureMessenger® (CureVac, T
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bingen, Germany; WO2008/077592에 따른 RP-HPLC) 및/또는 접선 유동 여과 (WO2016/193206에 기술됨) 및/또는 올리고 d(T) 정제(WO2016/180430 참조)를 사용하여 정제된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 RNA는 RP-HPLC를 사용하여, 바람직하게는 거대다공성 스티렌/디비닐벤젠 컬럼(예를 들어, 입자 크기 30 ㎛, 기공 크기 4000 Å)을 사용하는 역상 고압 액체 크로마토그래피 (Reversed-Phase High pressure liquid chromatography) (RP-HPLC)를 사용하고, 추가로 약 100kDa의 분자량 컷오프를 갖는 셀룰로오스 기반 멤브레인이 있는 필터 카세트를 사용하여 정제한다.
이러한 맥락에서, 정제된 RNA가 RP-HPLC 및/또는 TFF에 의해 정제되어 RP-HPLC 및/또는 TFF로 정제되지 않은 RNA와 비교하여 이중 가닥 RNA 부산물이 약 5%, 10% 또는 20% 감소하는 것이 특히 바람직하다.
대안적으로, RP-HPLC 및/또는 TFF에 의해 정제된 정제된 RNA는 Oligo dT 정제, 침전, 여과 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피로 정제된 RNA와 비교하여 이중 가닥 RNA 부산물이 약 5%, 10%, 또는 20% 적게 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 핵산, 바람직하게는 RNA는 동결건조되어 (예를 들어 WO2016/165831 또는 WO2011/069586에 따라) 본 명세서에 정의된 바와 같은 온도 안정한 건조된 핵산 (분말) (예를 들어 RNA 또는 DNA)을 생성한다. 본 발명의 핵산, 특히 RNA는 또한 분무-건조 또는 분무-동결 건조(예를 들어, WO2016/184575 또는 WO2016/184576에 따라)를 사용하여 건조되어 본 명세서에 정의된 바와 같은 온도 안정한 RNA(분말)를 생성할 수 있다. 따라서, 핵산, 특히 RNA의 제조 및 정제의 맥락에서, WO2017/109161, WO2015/188933, WO2016/180430, WO2008/077592, WO2016/193206, WO2016/165831, WO2011/069586, WO2016/184575, 및 WO2016/184576의 개시는 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
따라서, 바람직한 양태에서, 핵산은 건조된 핵산, 특히 건조된 RNA이다.
본 명세서에 사용된 용어 "건조된 RNA"는 온도 안정한 건조된 RNA(분말)를 얻기 위해 상기 정의된 바와 같이 동결건조되거나, 분무-건조되거나, 분무-동결 건조된 RNA로 이해되어야 한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산은 정제된 핵산, 특히 정제된 RNA이다.
본 명세서에 사용된 용어 "정제된 핵산"은 특정 정제 단계 후에 출발 물질보다 더 높은 순도를 갖는 핵산으로 이해되어야 한다. 정제된 핵산에 본질적으로 존재하지 않는 전형적인 불순물은 펩티드 또는 단백질, 스페르미딘, BSA, 중단(abortive) 핵산 서열, 핵산 단편, 유리 뉴클레오티드, 박테리아 불순물, 또는 정제 절차로부터 유래된 불순물을 포함한다. 따라서, 이와 관련하여 "핵산 순도"가 가능한 100%에 가까운 것이 바람직하다. 또한 전체 길이의 핵산의 양이 100%에 가까운 것이 핵산 순도를 위해 바람직하다. 따라서, 본 명세서에 사용된 "정제된 핵산"은 75%, 80%, 85%, 매우 특히 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 더욱 바람직하게는 99% 또는 그 이상의 순도를 가진다. 순도는 예를 들어 분석용 HPLC에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 상기 제공된 백분율은 표적 핵산에 대한 피크 면적과 부산물을 나타내는 모든 피크의 총 면적 사이의 비율에 해당한다. 대안적으로, 순도는 예를 들어 분석용 아가로스 겔 전기영동 또는 모세관 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산은 정제된 RNA이다.
본 명세서에 사용된 용어 "정제된 RNA" 또는 "정제된 mRNA"는 특정 정제 단계(예: HPLC, TFF, Oligo d(T) 정제, 침전 단계) 후에 출발 물질 (예를 들어 시험관 내 전사된 RNA)보다 더 높은 순도를 가진 RNA로 이해되어야 한다. 정제된 RNA에 본질적으로 존재하지 않는 일반적인 불순물은 펩티드 또는 단백질(예: DNA 의존성 RNA 시험관내 전사에서 유래된 효소, 예: RNA 폴리머라제, RNase, 피로포스파타제, 제한 엔도뉴클레아제, DNase), 스페르미딘, BSA, 중단 RNA 서열, RNA 단편 (짧은 이중 가닥 RNA 단편, 중단 서열 등), 유리 뉴클레오티드(변형된 뉴클레오티드, 기존 NTP, 캡 유사체), 주형 DNA 단편, 완충 성분(HEPES, TRIS, MgCl2) 등을 포함한다. 다른 잠재적인 불순물들은 예를 들어, 발효 절차로부터 유래될 수 있는 세균 불순물(바이오버든, 세균 DNA) 또는 정제 절차에서 파생된 불순물(유기 용매 등)이 포함된다. 따라서, 이와 관련하여 "RNA 순도"가 가능한 100%에 가까운 것이 바람직하다. 또한 전체 길이의 RNA 전사체의 양이 가능한 100%에 가까운 것이 RNA 순도의 정도에 대해 바람직하다. 따라서, 본 명세서에 사용된 "정제된 RNA"는 75%, 80%, 85%, 매우 특히 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 가장 바람직하게는 99% 또는 그 이상의 순도를 가진다. 순도는 예를 들어 분석용 HPLC에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 상기 제공된 백분율은 표적 RNA에 대한 피크 면적과 부산물을 나타내는 모든 피크의 총 면적 사이의 비율에 해당한다. 대안적으로, 순도는 예를 들어 분석용 아가로스 겔 전기영동 또는 모세관 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다.
핵산이 RNA인 특히 바람직한 실시양태에서, RNA는 이중 가닥 RNA, 캡핑되지 않은 RNA 및/또는 RNA 단편을 제거하기 위해 RP-HPLC 및/또는 TFF에 의해 정제되었다.
예를 들어, RNA 시험관내 전사 동안의 부산물로서 이중 가닥 RNA의 형성은 선천성 면역 반응의 유도, 특히 백신 접종 대상에서 발열을 유발하는 주요 인자인 IFN알파를 유도할 수 있으며, 이는 물론 원치 않는 부작용이다. dsRNA의 면역블롯팅을 위한 현재 기술(예를 들어, 도트 블롯, 혈청 특이적 전자 현미경(SSEM) 또는 ELISA를 통해)은 핵산 혼합물로부터 dsRNA 종을 검출하고 크기를 결정하는 데 사용된다.
적합하게는, 본 발명의 RNA는 dsRNA의 양을 감소시키기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같이 RP-HPLC 및/또는 TFF에 의해 정제되었다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA는 RP-HPLC 및/또는 TFF로 정제되지 않은 RNA 대비 약 5%, 10%, 또는 20% 더 적은 이중 가닥 RNA 부산물을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RP-HPLC 및/또는 TFF 정제된 RNA는 올리고 dT 정제, 침전, 여과 및 /또는 AEX로 정제된 RNA 대비 약 5%, 10%, 또는 20% 더 적은 이중 가닥 RNA 부산물을 포함한다.
본 명세서에 정의된 "건조된 RNA" 및 본 명세서에 정의된 "정제된 RNA" 또는 본 명세서에 정의된 "GMP-등급 RNA"가 우수한 안정성 특성(시험관내, 생체내) 및 개선된 효율성(예: mRNA의 생체 내 더 나은 번역 가능성)을 가지며, 따라서 예를 들어, 백신과 같은 의학적 목적에 특히 적합함이 이해되어야 한다.
본 명세서에 정의된 공동-전사 캡핑 및 본 명세서에 정의된 정제 후, 수득된 RNA의 캡핑 정도는 공개된 PCT 출원 WO2015/101416, 특히 공개된 PCT 출원 WO2015/101416의 청구항 27 내지 46에 기재된 바와 같은 캡핑 검정을 사용하여 결정할 수 있다. 대안적으로, PCT/EP2018/08667에 설명된 캡핑 분석을 사용할 수 있다.
실시양태들에서, RNA 시험관내 전사를 수행하기 위한 자동화 장치를 사용하여 본 발명의 핵산을 생산하고 정제할 수 있다. 이러한 장치는 또한 조성물 또는 백신을 생산하는 데 사용될 수 있다(2 및 3 측면 참조). 바람직하게는, WO2020002598에 기술된 장치, 특히 WO2020002598 (및 도 1-18)의 청구항 1 내지 59 및/또는 68 내지 76에 기술된 장치가 적합하게 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법은 바람직하게는 하기에 추가로 상세히 기술되는 바와 같이 RNA 조성물 또는 백신을 생산하는 방법에 적용될 수 있다.
조성물, 약학적 조성물:
두 번째 측면은 첫 번째 측면의 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특히, 제2 측면의 조성물과 관련된 양태들은 마찬가지로 제4 측면의 백신의 적합한 양태로서 읽고 이해될 수 있다. 또한, 제4 측면의 백신과 관련된 실시양태는 마찬가지로 제2 측면의 조성물(제1 측면의 핵산을 포함함)의 적합한 실시양태로 읽고 이해될 수 있다. 또한, 제1 측면(본 발명의 핵산)의 맥락에서 설명된 특징 및 양태는 제2 측면의 조성물의 적합한 양태로서 읽히고 이해되어야 한다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 SARS-CoV-2 (이전의 nCoV-2019) 코로나바이러스, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체이거나 이로부터 유도된 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 제1 측면에 따른 하나 이상의 핵산을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 제1 측면에 따른 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체이거나 이로부터 유래된 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하며, 여기서 상기 조성물은 바람직하게는 근육내 또는 피내 투여된다.
바람직하게는, 상기 조성물의 근육내 또는 피내 투여는 대상체에서 암호화된 SARS-CoV-2 항원 구조의 발현을 초래한다. 핵산이 RNA인 실시양태에서, 상기 조성물의 투여는 대상체에서 RNA의 번역 및 코딩된 SARS-CoV-2 항원의 생산을 초래한다. 핵산이 DNA(예를 들어, 플라스미드 DNA, 아데노바이러스 DNA)인 양태에서, 상기 조성물의 투여는 대상체 내에서 DNA의 RNA로의 전사, 및 RNA의 코딩된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 항원으로의 후속 번역을 초래한다.
바람직하게는, 제2 측면의 조성물은 백신, 특히 코로나바이러스 백신, 바람직하게는 SARS-CoV-2 (nCoV-2019) 백신에 적합하다.
본 발명의 맥락에서, "조성물"은 특정 성분(예를 들어, SARS-CoV-2 코로나바이러스, 예를 들어 SARS-CoV-2 코로나바이러스이거나 유래된 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA, 예를 들어 중합체 담체 또는 LNP와 함께), 선택적으로 임의의 추가 성분과 함께 일반적으로 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제와 함께 혼입된 어떠한 형태의 조성물이 될 수 있다. 상기 조성물은 분말 또는 과립과 같은 건조 조성물 또는 동결건조 형태와 같은 고체 단위일 수 있다. 대안적으로, 조성물은 액체 형태일 수 있고, 각 성분은 독립적으로 용해되거나 분산된(예를 들어, 현탁되거나 유화된) 형태로 혼입될 수 있다.
제2 측면의 바람직한 실시양태에서, 조성물은 제1 측면의 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA, 및 임의로, 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함한다.
제2 측면의 실시양태에서, 조성물은 제1 측면의 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 아데노바이러스 DNA, 및 임의로, 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함한다.
두 번째 측면의 바람직한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 및 임의로 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함하고, 여기서 핵산은 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-13147, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14177, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23184, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열 포함하거나 이로 이루어진다.
두 번째 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 및 임의로 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함하고, 여기서 핵산은 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
더욱 바람직하게, 조성물은 적어도 하나의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA를 포함하고, 여기서 핵산은 서열 번호: 163의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
더욱 바람직하게, 조성물은 적어도 하나의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA를 포함하고, 여기서 핵산은 서열 번호: 149의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가적으로 특히 바람직한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA를 포함하고, 여기서 핵산은 서열 번호: 24837, 23311, 23531, 23310, 23530, 23313, 23533의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가적인 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA를 포함하고, 여기서 핵산은 서열 번호: 26633, 26907의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
두 번째 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 및 임의로 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함하고, 여기서 핵산은 서열 번호: 149-151, 163-165, 24837, 23311, 23531, 24851, 23310, 23530, 23313, 23533로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 담체" 또는 "약학적으로 허용되는 첨가제"는 바람직하게는 투여용 조성물의 액체 또는 비-액체 기반(basis)을 포함한다. 조성물이 액체 형태로 제공되는 경우, 담체는 물, 예를 들어, 파이로젠 없는 물; 등장 식염수 또는 완충 (수용성) 용액, 예를 들어, 인산염, 구연산염 등 완충 용액일 수 있다. 물 또는 바람직하게 완충액, 더욱 바람직하게 수용성 완충액은 나트륨 염, 바람직하게는 50mM 이상의 나트륨 염, 칼슘 염, 바람직하게는 0.01mM 이상의 칼슘 염, 및 임의로 칼륨 염, 바람직하게는 적어도 3mM의 칼륨 염을 포함하는 형태로 사용된다. 바람직한 양태예에 따르면, 나트륨, 칼슘 및 선택적으로 칼륨 염은 예를 들어 염화물, 요오드화물 또는 브롬화물와 같은 이들의 할로겐화물, 그들의 수산화물, 탄산염, 탄산수소염 또는 황산염 등의 형태로 이용된다. 나트륨 염의 예들은 NaCl, NaI, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4을 포함하며, 임의의 칼륨 염의 예들은 KCl, KI, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4을 포함하고, 칼슘 염의 예들은 CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2을 포함한다.
게다가, 상기 양이온의 유기 음이온은 완충액에 존재할 수 있다. 따라서, 양태들에서, 핵산 조성물은 예를 들어, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 사용하여 예를 들어, 안정성 증가, 세포 형질감염 증가, 지속 또는 지연 허용, 생체내 암호화된 코로나바이러스 단백질 번역 증가 및/또는 생체내 암호화된 코로나바이러스 단백질의 방출 프로파일 변경을 위하여 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 기타 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 계면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제와 같은 전통적인 첨가제에 추가하여, 본 발명의 첨가제는, 어떠한 제한 없이, 리피도이드, 리포솜, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스, 코어-쉘 나노입자, 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 세포, 히알루로니다제, 나노입자 모방체 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 양태들에서, 하나 이상의 상용성(compatible) 고체 또는 액체 충전제 또는 희석제 또는 캡슐화 화합물도 사용될 수 있으며, 이는 대상체에 투여하기에 적합하다. 본 명세서에 사용된 용어 "상용성"은 조성물의 구성성분이 상호작용이 발생하지 않는 방식으로 조성물의 하나 이상의 핵산 및 임의로 복수의 핵산과 혼합될 수 있음을 의미하며, 상호작용은 전형적인 사용 조건(예를 들어, 근육내 또는 피내 투여)하에서 조성물의 생물학적 활성 또는 약학적 유효성을 실질적으로 감소시킬 것이다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제는 치료 대상에 투여하기에 적합하도록 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제로서 사용될 수 있는 화합물은 예를 들어, 락토스, 글루코스, 트레할로스, 만노스 및 수크로스와 같은 당; 예를 들어 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 전분; 덱스트로스; 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 수지(tallow); 예를 들어, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트와 같은 고체 활택제; 황산칼슘; 예를 들어, 땅콩 오일, 면실유, 참기름, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 테오브로마 오일과 같은 식물성 오일; 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 알긴산이다.
조성물의 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제는 바람직하게는 상기 조성물의 근육내 또는 피내 전달/투여에 적합하도록 선택될 수 있다. 따라서, 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물, 적합하게는 근육내 투여용 조성물이다.
조성물, 바람직하게는 약학적 조성물의 투여가 고려되는 대상은 인간 및/또는 다른 영장류; 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 생쥐 및/또는 쥐와 같은 상업적으로 관련된 포유동물을 포함하는 포유동물; 및/또는 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조와 같은 상업적으로 관련된 조류를 포함하는 조류이다.
본 발명의 약학적 조성물은 적합하게는 멸균 및/또는 파이로젠-프리이다.
본 발명의 다가 조성물:
양태들에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 조성물(예를 들어, 다가 조성물)은 핵산 종, 예를 들어, 본 발명의 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 RNA 종 중 적어도 하나 이상 또는 복수를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 정의된 조성물은 제1 측면의 맥락에서 각각 정의된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 핵산을 포함할 수 있다.
양태들에서, 조성물(예를 들어, 다가 조성물)은 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 핵산 종을 포함할 수 있으며, 각각은 동일한 코로나바이러스로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질, 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩한다. 특히, 상기 (유전적으로) 동일한 코로나바이러스는 (본질적으로) 동일한 레퍼토리의 단백질 또는 펩티드를 발현하며, 여기서 모든 단백질 또는 펩티드는 (본질적으로) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 상기 (유전적으로) 동일한 코로나바이러스는 본질적으로 동일한 단백질, 펩티드 또는 폴리단백질을 발현하며, 여기서 이들 단백질, 펩티드 또는 폴리단백질은 바람직하게는 아미노산 서열(들)이 상이하지 않다.
양태들에서, 조성물(예를 들어, 다가 조성물)은 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 핵산 종을 포함하며, 각각은 유전적으로 상이한 코로나바이러스(예를 들어, 상이한 코로나바이러스 분리주)로부터 유래한 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩한다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 "상이한" 또는 "상이한 코로나바이러스"라는 용어는 적어도 2개의 개별 코로나바이러스(예를 들어, 상이한 코로나바이러스 분리주) 사이의 차이로 이해되어야 하며, 여기서 차이는 각각의 상이한 코로나바이러스의 게놈에 나타난다. 특히, 상기 (유전적으로) 상이한 코로나바이러스는 적어도 하나의 상이한 단백질, 펩티드 또는 폴리단백질을 발현할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 상이한 단백질, 펩티드 또는 폴리단백질은 적어도 하나의 아미노산이 상이하다.
바람직한 실시양태에서, 다가 조성물의 핵산 서열의 복수 또는 하나 이상은 각각 상이한 스파이크 단백질, 바람직하게는 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 코딩한다.
이러한 맥락에서, 상이한 스파이크 단백질 또는 융합전 안정화된 스파이크 단백질이 상이한 SARS-CoV-2 바이러스 변이체/분리주로부터 유래되는 것이 특히 바람직하고, 여기서 스파이크 단백질이 B.1.1.7, B.1.351, P.1, 또는 CAL.20C로부터 유래하는 것이 특히 바람직하다.
이러한 맥락에서, 상이한 스파이크 단백질 또는 융합전 안정화된 스파이크 단백질이 다음을 포함하는 스파이크 단백질에서 아미노산 변화를 갖는 것이 추가로 바람직하다:
(i) delH69, delV70, Y453F, D614G, I692V 및 M1229I;
(ii) delH69, delV70, delY144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A 및 D1118H;
(iii) L18F, D80A, D215G, delL242, delA243, delL244, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G 및 A701V;
(iv) L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y 및 T1027I; 및/또는
(v) S13I, W152C, L452R, 및 D614G.
양태들에서, 조성물(예: 다가 조성물)은 2, 3, 4 또는 5개의 핵산 종(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 종, 및 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하며, 여기서 상기 핵산 종은 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-13147, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14177, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23184, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 2, 3, 4 또는 5개의 핵산 종의 각각은 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 상이한 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다.
따라서, 양태들에서, 조성물(예: 다가 조성물)은 2개의 핵산 종(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 종, 및 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하며, 여기서 상기 핵산 종은 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 상기 2개의 핵산 종의 각각은 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 상이한 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다.
양태들에서, 조성물(예: 다가 조성물)은 3개의 핵산 종(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 종, 및 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하며, 여기서 상기 핵산 종은 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 상기 2, 3, 4 또는 5개의 핵산 종의 각각은 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 상이한 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다.
하기에서, 다가 조성물의 특히 바람직한 실시양태가 제공된다.
바람직하게는, 다가 조성물의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 핵산 종은 각각 상이한 융합전 안정화된 스파이크 단백질(제1 측면에서 정의됨)을 코딩한다. 바람직하게는, 융합전 형태의 안정화는 스파이크 단백질의 잔기 K986 및 V987(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)에서 2개의 연속적인 프롤린 치환을 도입함으로써 얻어진다. 따라서, 바람직한 양태에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab) 각각은 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이는 다음의 아미노산 치환들: K986P 및 V987P(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)을 포함한다.
따라서, 다가 조성물의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 핵산 종은 각각 상이한 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 코딩하며, 여기서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 안정화된 스파이크 단백질은 서열 번호: 10-26, 341-407, 609-1278, 13521-13587, 22738, 22740, 22742, 22744, 22746, 22748, 22750, 22752, 22754, 22756, 22758, 22947-22964, 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 다가 조성물은 서열 번호: 10과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 종을 포함하며, 여기에서 상기 다가 조성물은 추가적으로 다음으로부터 선택되는 적어도 2, 3, 4개의 추가 RNA 종을 포함한다:
i) 서열 번호: 22961과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
ii) 서열 번호: 22960과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
iii) 서열 번호: 22963과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
iv) 서열 번호: 22941과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
v) 서열 번호: 22964과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종.
바람직한 실시형태에서, 다가 조성물은 서열 번호: 10, 22961; 22960, 22963, 22941, 22964의 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 적어도 2개의 핵산 종을 포함한다.
바람직하게는, 다가 조성물의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 핵산 종은 상이한 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 각각 코딩하는 핵산 코딩 서열을 포함하고,
여기서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 핵산 코딩 서열은 서열 번호: 136-138, 140-143, 145-175, 11731-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184, 또는 이들 중 어느 것의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 다가 조성물은 서열 번호: 137과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종을 포함하며, 여기에서 다가 조성물은 추가적으로 적어도 2, 3, 4의 추가 RNA 종을 포함하며, RNA 종은 다음에서 선택된다:
i) 서열 번호: 23091과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
ii) 서열 번호: 23090과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
iii) 서열 번호: 23093과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
iv) 서열 번호: 22999과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
v) 서열 번호: 23094과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종.
바람직하게는, 다가 조성물의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 핵산 종은 상이한 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 각각 코딩하는 핵산 코딩 서열을 포함하고,
여기서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 핵산 코딩 서열은 서열 번호: 149-151, 163-165, 12338, 12541, 12810-12813, 12901, 12931, 13013, 22792, 22794, 22796, 22798, 22802, 22804, 22806, 22810, 22813, 22819, 22821, 22823, 22825, 22827, 22829, 22831, 22833, 22835, 22837, 22839, 23297-23314, 23369, 23517-23520, 23523-23525, 23527, 23529, 23530, 23589, 23737, 23957, 24397, 24837, 25057, 25277, 25717, 26925-26937, 또는 이들 중 어느 것의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 다가 조성물은 서열 번호: 163과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 하나의 RNA 종을 포함하며, 여기에서 다가 조성물은 추가적으로 적어도 2, 3, 4의 추가 RNA 종을 포함하며, RNA 종은
i) 서열 번호: 23311과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 하나의 RNA 종; 및/또는
ii) 서열 번호: 23310과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
iii) 서열 번호: 23313과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
iv) 서열 번호: 23219과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
v) 서열 번호: 23314과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종으로부터 선택되며,
여기에서, 바람직하게는, 각각의 mRNA 종은 Cap1 구조를 포함하고, 선택적으로 각각의 mRNA 종은 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 다가 조성물은 서열 번호: 149 또는 24837과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 하나의 RNA 종을 포함하며, 여기에서 다가 조성물은 추가적으로 적어도 2, 3, 4의 추가 RNA 종을 포함하며, RNA 종은
i) 서열 번호: 23531 또는 24851 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 하나의 RNA 종; 및/또는
ii) 서열 번호: 23530 또는 24850 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
iii) 서열 번호: 23533 또는 24853 중 어느 것과과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
iv) 서열 번호: 23439 또는 24759 중 어느 것과과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
v) 서열 번호: 23534 또는 24854 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종으로부터 선택되며,
여기에서, 바람직하게는, 각각의 mRNA 종은 Cap1 구조를 포함하고, 선택적으로 각각의 mRNA 종은 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 다가 조성물은 서열 번호: 149 또는 24837, 23531 또는 24851, 23530 또는 24850, 23533 또는 24853, 23439 또는 24759 또는 23534 또는 24854 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 2개의 RNA 종을 포함한다.
양태들에서, 다가 조성물의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 종은 분리되어 제형화될 수 있다(아래에 명시된 제형). 바람직한 실시양태에서, 다가 조성물의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 종(species)은 분리되어 공동-제형화될 수 있다(아래에 명시된 바와 같은 제형).
복합체화(Complexation) :
제2 측면의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 하나 이상의 RNA가 추가 화합물과 복합체화되거나 회합되어 제형화된 조성물을 수득한다. 이러한 맥락에서 제형은 형질감염제(transfection agent)의 기능을 가질 수 있다. 이러한 맥락에서 제형은 또한 핵산을 분해로부터 보호하는 기능을 가질 수 있다.
제2 측면의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 적어도 하나의 RNA, 및 임의로 적어도 하나의 추가 핵산은 하나 이상의 양이온성 또는 다가양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 또는 다가양이온성 중합체, 양이온성 또는 다가양이온성 다당류, 양이온성 또는 다가양이온성 지질, 양이온성 또는 다가양이온성 단백질, 양이온성 또는 다가양이온성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합과 복합체를 형성하거나, 회합되거나, 또는 적어도 부분적으로 복합체를 형성하거나 회합된다.
본 명세서에 사용된 용어 "양이온성 또는 다가양이온성 화합물"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 약 1 내지 9 범위의 pH 값에서, 약 3 내지 8 범위의 pH 값에서, 약 4 내지 8 범위의 pH 값에서, 약 5 내지 8 범위의 pH 값에서, 더욱 바람직하게 약 6 내지 8 범위의 pH 값에서, 더욱 더 바람직하게는 약 7 내지 8 범위의 pH 값에서, 가장 바람직하게는 생리학적 pH, 예를 들어, 약 7.2 내지 약 7.5 범위에서 양으로 하전된, 하전된 분자를 지칭하도록 의도된다. 따라서 양이온 성분, 예를 들어 양이온성 펩티드, 양이온성 단백질, 양이온성 폴리머, 양이온성 다당류, 양이온성 지질은 생리학적 조건 하에서 양으로 하전된 임의의 양으로 하전된 화합물 또는 중합체일 수 있다. "양이온성 또는 다가양이온성 펩티드 또는 단백질"은 적어도 하나의 양으로 하전된 아미노산, 또는 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산, 예를 들어, Arg, His, Lys 또는 Orn에서 선택된 것을 포함한다. 따라서, "다양이온성" 성분은 또한 주어진 조건에서 하나 이상의 양전하를 나타내는 범위 내에 있다.
양이온성 또는 다가양이온성 화합물, 본 발명의 맥락에서 특히 바람직한 양이온성 또는 다가양이온성 화합물은 다음의 양이온성 또는 다가양이온성 펩타이드 또는 단백질 또는 이의 단편의 목록으로부터 선택될 수 있다: 프로타민, 뉴클레오린, 스페르민 또는 스페르미딘, 또는 폴리-L-라이신(PLL)과 같은 다른 양이온성 펩타이드 또는 단백질, 폴리-아르기닌, 염기성 폴리펩타이드, HIV-결합 펩타이드를 포함한 세포 투과 펩타이드(CPP), HIV-1 Tat(HIV), Tat 유래 펩타이드, 페네트라틴(Penetratin), VP22 유래 또는 유사 펩타이드, HSV VP22(Herpes simplex), MAP, KALA 또는 단백질 전달 도메인(protein transduction domain, PTD), PpT620, 프롤린-풍부 펩티드, 아르기닌-풍부 펩티드, 리신-풍부 펩티드, MPG-펩티드, Pep-1, L-올리고머, 칼시토닌 펩티드(들), Antennapedia 유래 펩타이드, pAntp, pIsl, FGF, 락토페린(Lactoferrin), Transportan, 부포린(Buforin)-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, hCT 유래 펩타이드, SAP 또는 히스톤. 보다 바람직하게는, 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 예를 들어, 코딩 RNA, 바람직하게는 mRNA는 하나 이상의 다가양이온, 바람직하게는 프로타민 또는 올리고펙타민, 가장 바람직하게는 프로타민과 복합체를 형성한다.
바람직한 양태에서, 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 적어도 하나의 RNA는 프로타민과 복합체를 형성한다.
형질감염 또는 착화 성분으로서 사용될 수 있는 추가의 바람직한 양이온성 또는 다가양이온성 화합물은 양이온성 다당류, 예를 들어, 키토산, 폴리브렌 등; 양이온성 지질, 예를 들어 DOTMA, DMRIE, 디-C14-아미딘, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: 디올레일 포스파티딜에탄올-아민, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS, DIMRI, DOTAP, DC-6-14, CLIP1, CLIP6, CLIP9, 올리고펙타민; 또는 양이온성 또는 다가양이온성 중합체, 예를 들어, 베타-아미노산-폴리머 또는 역(reversed) 폴리아미드 등과 같은 변형된 폴리아미노산, PVP 등과 같은 변형된 폴리에틸렌, pDMAEMA 등과 같은 변형된 아크릴레이트, pAMAM 등과 같은 변형된 아미도아민, 디아민 말단 개질된 1,4 부탄디올 디아크릴레이트-co-5-아미노-1-펜탄올 중합체 등과 같은 변형된 폴리베타아미노에스테르(PBAE), 폴리프로필아민 덴드리머 또는 pAMAM 기반 덴드리머 등과 같은 덴드리머, PEI, 폴리(프로필렌이민) 등과 같은 폴리이민(들), 폴리알릴아민, 예를 들어 시클로덱스트린계 중합체, 덱스트란계 중합체 등과 같은 당(sugar) 백본 기반 중합체, PMOXA-PDMS 공중합체 등과 같은 실란 백본 중합체, 하나 이상의 양이온성 블럭(예를 들어, 상기 언급된 양이온성 중합체로부터 선택됨) 및 하나 이상의 친수성 또는 소수성 블록(예: 폴리에틸렌글리콜)의 조합으로 이루어진 블록 공중합체; 등을 포함한다.
이러한 맥락에서, 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 적어도 하나의 RNA가 양이온성 또는 다가양이온성 화합물 및/또는 중합체 담체, 바람직하게는 양이온성 단백질 또는 펩티드와 복합체화되거나 적어도 부분적으로 복합체화되는 것이 특히 바람직하다. 또는 펩티드. 이러한 맥락에서, WO2010/037539 및 WO2012/113513의 개시 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 부분적으로는 핵산의 일부만 양이온성 화합물과 복합체화되고 나머지 핵산은 복합체화되지 않은 형태("유리")임을 의미한다.
양태들에서, 조성물은 하나 이상의 양이온성 또는 다가양이온성 화합물, 바람직하게는 프로타민과 복합체화된, 하나 이상의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 하나 이상의 RNA, 및 하나 이상의 유리(비복합체) 핵산을 포함한다.
이러한 맥락에서, 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 적어도 하나의 RNA가 프로타민과 복합체를 형성하거나 적어도 부분적으로 복합체를 형성하는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 핵산, 특히 프로타민-복합체 RNA의 RNA 대 유리 RNA의 몰비는 약 1:1의 비를 포함하여 약 0.001:1 내지 약 1:0.001의 몰비로부터 선택될 수 있다. 적합하게는, 복합체화된 RNA는 2:1의 RNA:프로타민 중량 대 중량비(w/w)로 RNA 샘플에 프로타민-트레할로스 용액을 첨가함으로써 프로타민과 복합체화된다.
복합체화에 사용될 수 있는 추가의 바람직한 양이온성 또는 다가양이온성 단백질 또는 펩티드는 특허 출원 WO2009/030481 또는 WO2011/026641의 화학식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x로부터 유도될 수 있다. 이에 관한 WO2009/030481 또는 WO2011/026641의 개시 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 적어도 하나의 RNA는 바람직하게는 서열 번호: 269 내지 273로부터 선택되는 적어도 하나의 양이온성 또는 다가양이온성 단백질 또는 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합과 복합체를 형성하거나 적어도 부분적으로 복합체를 형성한다.
다양한 양태들에 따르면, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 RNA, 및 중합체 담체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "중합체 담체"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 다른 화합물(예: 화물 핵산)의 수송 및/또는 복합화를 촉진하는 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 중합체 담체는 전형적으로 중합체로 형성된 담체이다. 고분자 담체는 공유 또는 비공유 상호작용에 의해 화물(예: DNA 또는 RNA)에 결합될 수 있다. 중합체는 공중합체와 같은 상이한 서브유닛을 기반으로 할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 적합한 중합체 담체는, 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락타이드, 폴리락타이드-폴리글리콜리드 공중합체, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 시클로덱스트린, 프로타민, PEG화 프로타민, PEG화 PLL 및 폴리에틸렌이민(PEI), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 폴리(에틸렌 이민) 비스카르바메이트(PEIC), 폴리(L-리신)(PLL), 히스티딘 변형 PLL, 폴리(N-비닐피롤리돈)(PVP), 폴리(프로필렌이민(PPI) , 폴리(아미도아민)(PAMAM), 폴리(아미도 에틸렌이민)(SS-PAEI), 트리에틸렌테트라민(TETA), 폴리(β-아미노에스테르), 폴리(4-하이드록시-L-프로인 에스테르)(PHP), 폴리(알릴아민), 폴리(α-[4-아미노부틸]-L-글리콜산(PAGA), 폴리(D,L-락트산-코-글리콜리드산(PLGA), 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드), 폴리(포스파젠)(PPZ), 폴리(포스포에스테르)(PPE), 폴리(포스포르아미데이트)(PPA), 폴리(N-2-히드록시프로필메타크릴아미드)(pHPMA), 폴리(2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트)(pDMAEMA), 폴리(2-아미노에틸 프로필렌 포스페이트) PPE_EA), 갈락토실화 키토산, N-도데실화 키토산, 히스톤, 콜라겐 및 덱스트란-스페민을 포함한다. 한 실시양태에서, 중합체는 PEG와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 불활성 중합체일 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체는 PEI, PLL, TETA, 폴리(알릴아민), 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드), pHPMA 및 pDMAEMA와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 양이온성 중합체일 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체는 DSP, DTBP 및 PEIC와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 생분해성 PEI일 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체는 히스틴 변형 PLL, SS-PAEI, 폴리(β-아미노에스테르), PHP, PAGA, PLGA, PPZ, PPE, PPA 및 PPE-EA와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 생분해성일 수 있다.
적합한 중합체 담체는 이황화물-가교된 양이온성 화합물에 의해 형성된 중합체 담체일 수 있다. 이황화 가교결합된 양이온성 화합물은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 중합체 담체는 또한 추가 성분을 함유할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 중합체 담체는 (-SH 기를 통해) 이황화 결합에 의해 가교된, 양이온성 펩티드, 단백질 또는 중합체 및 임의로 본 명세서에 정의된 추가 성분의 혼합물을 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 특허 출원 WO2012/013326의 화학식 {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x(Cys)y} 및 화학식 Cys,{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}Cys2에 따른 중합체 담체가 바람직하며, 이에 관한 WO2012/013326의 개시 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
양태들에서, 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 적어도 하나의 RNA를 복합체화하는데 사용되는 중합체성 담체는 특허 출원 WO2011/026641의 화학식 (L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L)에 따른 중합체 담체 분자로부터 유래되며, 이에 관한 WO2011/026641의 개시 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
양태들에서, 중합체 담체 화합물은 펩티드 요소 CysArg12Cys (서열 번호: 269) 또는 CysArg12(서열 번호: 270) 또는 TrpArg12Cys(서열 번호: 271)에 의해 형성되거나 이를 포함하거나 이로 이루어진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 중합체성 담체 화합물은 (R12C)-(R12C) 이량체, (WR12C)-(WR12C) 이량체, 또는 (CR12)-(CR12C)-(CR12) 삼량체로 이루어지며, 여기서 이량체 (예를 들어 (WR12C)), 또는 삼량체 (예를 들어, (CR12)) 내 개별 펩티드 요소는 -SH 그룹을 통해 연결된다.
두 번째 측면의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 하나 이상의 RNA는 HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH (펩티드 모노머로서 서열 번호: 272), HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)4-S-PEG5000-OH (펩티드 모노머로서 서열 번호: 272), HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)7-S-PEG5000-OH (펩티드 모노머로서 서열 번호: 273)를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체 및/또는 HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH (펩티드 모노머의 서열 번호: 273)을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체와 복합체화되거나 회합(associated)된다.
다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 적어도 하나의 RNA는 중합체성 담체 및 선택적으로 적어도 WO2017/212008A1, WO2017/212006A1, WO2017/212007A1, 및 WO2017/212009A1에 개시된 것과 같은 적어도 하나의 지질 성분과 복합체화되거나 회합된다. 이러한 맥락에서, WO2017/212008A1, WO2017/212006A1, WO2017/212007A1, 및 WO2017/212009A1의 개시내용은 인용에 의해 본 발명에 포함된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 중합체성 담체(제1 및/또는 제2 성분의)는 펩티드 중합체, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체, 및 지질 성분, 바람직하게는 리피도이드 성분이다.
리피도이드(lipidoid)(또는 리피도이트(lipidoit))는 지질 유사 화합물, 즉 지질 유사 물리적 특성을 갖는 양친매성 화합물이다. 리피도이드는 바람직하게는 2개 이상의 양이온성 질소 원자 및 2개 이상의 친유성 꼬리를 포함하는 화합물이다. 많은 통상적인 양이온성 지질과 대조적으로, 리피도이드는 가수분해성 연결기, 특히 가수분해성 에스테르, 아미드 또는 카바메이트기를 포함하는 연결기가 없을 수 있다. 리피도이드의 양이온성 질소 원자는 양이온화 가능하거나 영구적으로 양이온성일 수 있거나, 두 유형의 양이온성 질소가 화합물에 존재할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 지질은 또한 리피도이드를 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명의 일부 양태에서, 리피도이드는 PEG 모이어티를 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 하나 이상의 RNA는 중합체 담체, 바람직하게는 상기 정의된 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체 및 리피도이드 성분과 복합체를 형성하거나 회합된다.
적합하게는, 리피도이드는 양이온성이며, 이는 이것이 양이온화가능하거나 영구적으로 양이온성임을 의미한다. 한 실시양태에서, 리피도이드는 양이온화가능하고, 즉 이는 하나 이상의 양이온화가능한 질소 원자를 포함하지만 영구적인 양이온성 질소 원자는 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 리피도이드의 양이온성 질소 원자 중 적어도 하나는 영구적으로 양이온성이다. 선택적으로, 리피도이드는 2개의 영구적인 양이온성 질소 원자, 3개의 영구적인 양이온성 질소 원자, 또는 심지어 4개 이상의 영구적인 양이온성 질소 원자를 포함한다.
바람직한 양태에서, 리피도이드 성분은 공개된 PCT 특허 출원 WO2017/212009A1의 50-54페이지의 표에 제공된 리피도이드의 리피도이드부터 선택되며, 상기 표에 제공된 특정 리피도이드, 및 이와 관련된 구체적 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직한 양태에서, 리피도이드 성분은 3-C12-OH, 3-C12-OH-cat, 3-C12-아미드, 3-C12-아미드 모노메틸, 3-C12-아미드 디메틸, RevPEG(10)-3-C12-OH, RevPEG(10)-DLin-pAbenzoic, 3C12amide-TMA cat., 3C12amide-DMA, 3C12amide-NH2, 3C12amide-OH, 3C12Ester-OH, 3C12 Ester-amin, 3C12Ester-DMA, 2C12Amid-DMA, 3C12-lin-amid-DMA, 2C12-sperm-amid-DMA, 또는 3C12-sperm-amid-DMA (공개된 PCT 특허 출원 WO2017/212009A1 (페이지 50-54)의 표 참조)로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 특히 바람직한 것은 3-C12-OH 또는 3-C12-OH-cat이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 명시된 바와 같은 리피도이드(예: 3-C12-OH 또는 3-C12-OH-cat)를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체는 N/P 비가 약 0.1 내지 약 20, 또는 약 0.2 내지 약 15, 또는 약 2 내지 약 15, 또는 약 2 내지 약 12인 복합체를 형성하기 위해 적어도 하나의 핵산과 복합체화되기 위해 사용되고, 여기서 N/P 비는 상기 핵산의 포스페이트 그룹에 대한 양이온성 펩타이드 또는 중합체의 염기성 그룹의 질소 원자의 몰비로서 정의된다. 이러한 맥락에서, 공개된 PCT 특허 출원 WO2017/212009A1, 특히 WO2017/212009A1의 청구항 1 내지 10의 개시, 및 이와 관련된 특정 개시내용들은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
추가의 적합한 리피도이드는 공개된 PCT 특허 출원 WO2010/053572로부터 유래될 수 있다. 특히, 공개된 PCT 특허 출원 WO2010/053572의 청구항 1 내지 297로부터 유래할 수 있는 리피도이드가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 바와 같은 펩티드 중합체 내로 통합되거나, 또는 예를 들어, 지질 나노입자(아래에 설명됨)에 통합된다. 따라서, 공개된 PCT 특허 출원 WO2010/053572의 청구항 1 내지 297, 및 이와 관련된 특정 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
LNP 내 캡슐화/복합체화:
제2 측면의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 적어도 하나의 RNA, 및 임의로는 적어도 하나의 추가 핵산이 하나 이상의 지질 (예: 양이온성 지질 및/또는 중성 지질)과 복합체화되거나, 캡슐화되거나, 부분적으로 캡슐화되거나, 회합되며, 이것에 의해 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜과 같은 지질 기반 담체를 형성한다.
리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜 - 혼입 핵산(예: DNA 또는 RNA)은 완전히 또는 부분적으로 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포좀의 내부 공간에, 지질층/막 내, 또는 지질층/막의 외부 표면과 결합되어 위치한다. 리포솜/LNP로의 핵산의 혼입은 또한 본 명세서에서 "캡슐화"로 지칭되며, 여기서 핵산, 예를 들어, RNA는 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜의 내부 공간 내에 완전히 포함되어 있다. 핵산을 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜에 통합하는 목적은 핵산을 분해하는 효소 또는 화학물질 또는 조건 및/또는 핵산의 빠른 배설을 일으키는 시스템 또는 수용체를 포함할 수 있는 환경으로부터 핵산, 바람직하게는 RNA를 보호하는 것이다. 더욱이, 핵산, 바람직하게는 RNA를 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜에 혼입하면 핵산의 흡수를 촉진할 수 있고, 따라서 핵산, 예를 들어, 항원성 SARS-CoV-2(nCoV-2019) 단백질을 암호화하는 RNA의 치료 효과를 향상시킬 수 있다. 따라서, 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA를 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜으로 봉입하는 것은 코로나바이러스 백신(예: SARS-CoV-2 백신), 예를 들어, 근육내 및/또는 피내 투여용 백신에 특히 적합할 수 있다.
이러한 맥락에서, 용어 "복합체화된" 또는 "회합된(associated)"은 공유 결합 없이 더 큰 복합체 또는 어셈블리로의 핵산과 하나 이상의 지질의 본질적으로 안정한 조합을 지칭한다.
"LNP"로도 지칭되는 용어 "지질 나노입자"는 임의의 특정 형태로 제한되지 않으며, 양이온성 지질 및 임의로 하나 이상의 추가 지질이 조합될 때, 예를 들어 수성 환경 및/또는 핵산, 예를 들어, RNA의 존재 하에 조합될 때 생성되는 임의의 형태를 포함한다. 예를 들어, 리포솜, 지질 복합체, 리포플렉스 등은 지질 나노 입자(LNP)의 범위 내에 있다.
리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜은 직경이 수백 나노미터일 수 있고, 좁은 수성 구획(aqueous compartment), 직경이 50nm보다 작을 수 있는 작은 단세포 소포(small unicellular vesicle, SUV) 및 직경이 50nm에서 500nm 사이일 수 있는 큰 단층 소포(large unilamellar vesicle, LUV)에 의해 분리된 일련의 동심 이중층을 함유할 수 있는 다중층 소포(multilamellar vesicle, MLV)와 같은 다양한 크기일 수 있지만 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 LNP는 하나 이상의 이중층의 막에 의해 외부 매질로부터 격리된 내부 물 공간을 갖는 미세한 소포로서 적합하게 특징지어진다. LNP의 이중층 막은 일반적으로 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 합성 또는 천연 기원의 지질과 같은 양친매성 분자에 의해 형성된다. 리포솜의 이중층 막은 또한 양쪽성 폴리머 및 계면활성제(예: 폴리머로솜, 니오솜 등)에 의해 형성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, LNP는 전형적으로 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 적어도 하나의 RNA를 표적 조직으로 수송하는 역할을 한다.
따라서, 제2 측면의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산, 바람직하게는 하나 이상의 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 지질 나노입자(LNP)를 형성한다. 바람직하게는, 상기 LNP는 근육내 및/또는 피내 투여에 특히 적합하다. LNP는 일반적으로 양이온성 지질, 및 중성 지질, 하전 지질, 스테로이드 및 폴리머 접합 지질(예: PEG화 지질)에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 핵산(예: RNA, DNA)은 LNP의 지질 부분 또는 LNP의 일부 또는 전체 지질 부분에 의해 둘러싸인 수성 공간에 캡슐화될 수 있다. 핵산(예: RNA, DNA) 또는 이의 일부는 또한 LNP와 회합 및 복합화될 수 있다. LNP는 핵산이 부착되거나 하나 이상의 핵산이 캡슐화된 입자를 형성할 수 있는 임의의 지질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 핵산을 포함하는 LNP는 하나 이상의 양이온성 지질, 및 하나 이상의 안정화 지질을 포함한다. 안정화 지질에는 중성 지질 및 PEG화 지질이 포함된다.
바람직하게는, LNP는
(i) 하나 이상의 양이온성 지질;
(ii) 하나 이상의 중성 지질;
(iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 콜레스테롤; 및
(iv) 하나 이상의 중합체 접합 지질, 바람직하게는 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% 폴리머 접합 지질의 몰비로 존재한다.
LNP의 양이온성 지질은 양이온화될 수 있다. 즉, pH가 지질의 이온화 가능한 기의 pK 미만으로 낮아짐에 따라 양성자화되지만 더 높은 pH 값에서 점진적으로 더 중성이 된다. pK 미만의 pH 값에서 지질은 음전하를 띤 핵산과 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 양이온성 지질은 pH 감소에 대해 양전하를 띠는 쯔비터이온성 지질을 포함한다.
이러한 지질에는 DSDMA, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), 1,2-디올레오일트리메틸 암모늄 염화프로판(DOTAP)(N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 및 1,2-디올레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염으로도 알려짐), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민(DODMA), ckk-E12, ckk, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-y-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 98N12-5, 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레오일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), ICE(이미다졸 기반), HGT5000, HGT5001, DMDMA, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, XTC (2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란) HGT4003, 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA) 또는 이의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC3), ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d] [1 ,3]디옥솔-5-아민)), 1,1'-(2-(4-(2-((2)-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸아잔디일)디도데칸-2-올 (C12-200), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), NC98-5 (4,7, 13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-N1 ,N 16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-M-C3-DMA), 3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타- 6,9,28,31-테트라엔-19-일옥시)-N,N-디메틸프로판-1-아민(MC3 에테르), 4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일옥시)-N,N-디메틸부탄-1-아민(MC4 에테르), LIPOFECTIN® (GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.로부터 상업적으로 이용 가능한, DOTMA 및 1,2-디올레오일-sn-3포스포에탄올아민(DOPE)을 포함하는 양이온성 리포솜); LIPOFECTAMINE® (GIBCO/BRL로부터 상업적으로 이용 가능한, N-(1-(2,3디올레일옥시)프로필)-N-(2-(스페르민카르복스아미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA) 및 (DOPE)를 포함하는 양이온성 리포솜); 및 TRANSFECTAM® (Promega Corp., Madison, Wis.로부터 상업적으로 이용 가능한, 에탄올 중 디옥타데실아미도글리실 카르복시스페민(DOGS)을 포함하는 양이온성 지질) 또는 상기 중 임의의 것의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 추가의 적합한 양이온성 지질은 국제 특허 공개 WO2010/053572 (및 특히, 단락 [00225]에 기재된 CI 2-200) 및 WO2012/170930에 기재된 것들을 포함하며, 이들 둘 모두는 인용에 의해 본 명세서에 포함되며, HGT4003, HGT5000, HGTS001, HGT5001, HGT5002 (US20150140070A1 참조)을 포함한다. 양태들에서, 양이온성 지질은 아미노 지질일 수 있다.
대표적인 아미노 지질은 1,2-디리놀레옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레옥시-3모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 염화물 염 (DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N,디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디올(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 및 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[ 1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA); 디리놀레일-메틸-4-디메틸아미노부티레이트(DLin-MC3-DMA); MC3(US20100324120)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 양태들에서, 양이온성 지질은 아미노알코올 리피도이드일 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 아미노알코올 리피도이드는 미국 특허 제8,450,298호에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이는 전문이 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 적합한 (이온화 가능한) 지질은 또한 표 1, 2 및 3에 개시되고 본 명세서에 인용에 의해 포함되는 WO2017/075531A1의 청구항 1-24에 정의된 바와 같은 화합물일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 적합한 지질은 또한 WO2015/074085A1 (즉, ATX-001 내지 ATX-032 또는 청구범위 1-26에 명시된 화합물), 미국 출원 제61/905,724호 및 15/614,499호 또는 미국 특허 제9,593,077호 및 9,567,296호에 개시된 화합물일 수 있으며, 이들 문헌들은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 실시양태에서, 적합한 양이온성 지질은 또한 WO2017/117530A1에 개시된 바와 같은 화합물(즉, 지질 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 청구범위에 명시된 바와 같은 화합물)일 수 있으며, 이는 인용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 이온성 또는 양이온성 지질은 또한 WO2018/078053A1에 개시된 지질(즉, WO2018/078053A1의 화학식 I, II 및 III로부터 유래된 지질, 또는 WO2018/078053A1의 청구항 1 내지 12에 명시된 바와 같은 지질)로부터 선택될 수 있으며, WO2018/078053A1의 개시 내용은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이러한 맥락에서, WO2018/078053A1의 표 7에 개시된 지질(예를 들어, 화학식 I-1 내지 I-41로부터 유래된 지질) 및 WO2018/078053A1의 표 8에 개시된 지질(예를 들어, 화학식 II-1 내지 II-36에서 유래된 지질 )는 본 발명의 맥락에서 적절하게 사용될 수 있다. 따라서, WO2018/078053A1의 화학식 I-1 내지 화학식 I-41 및 화학식 II-1 내지 화학식 II-36, 및 이와 관련된 특정 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 양이온성 지질은 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 화학식 III으로부터 유래될 수 있다. 따라서, WO2018/078053A1의 화학식 III, 및 이와 관련된 특정 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 조성물의 하나 이상의 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 LNP를 형성하고, 여기서 LNP의 양이온성 지질은 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 표 9의 구조 III-1 내지 III-36으로부터 선택된다. 따라서, WO2018/078053A1의 화학식 III-1 내지 III-36, 및 이와 관련된 구체적인 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
제2 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 하나 이상의 RNA가 하나 이상의 지질과 복합체를 형성함으로써 LNP를 형성하고, 여기서 LNP는 화학식 III-3에 따른 양이온성 지질을 포함한다:
Figure pct00006
(III-3)
본 명세서에 적합하게 사용된 화학식 III-3의 지질은 화학 용어 ((4-히드록시부틸)아잔디일)비스(헥산-6,1-디일)비스(2-헥실데카노에이트)이며, 이는 ALC-0315로도 지칭된다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 정의된 양이온성 지질, 더욱 바람직하게는 양이온성 지질 화합물 III-3은 LNP의 총 지질 함량에 대해 약 30 내지 약 95몰%의 양으로 LNP에 존재한다. LNP 내에 하나 이상의 양이온성 지질이 포함된 경우, 이러한 비율은 합쳐진 양이온성 지질에 적용된다.
양태들에서, 양이온성 지질은 약 30 내지 약 70몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 실시양태에서, 양이온성 지질은 약 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60몰%과 같은 약 40 내지 약 60몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 양태들에서, 양이온성 지질은 약 47 내지 약 48몰%, 예를 들어 약 47.0, 47.1, 47.2, 47.3, 47.4, 47.5, 47.6, 47.7, 47.8, 47.09, 50몰%의 양으로 LNP에 존재하며, 여기에서 47.7몰%가 특히 바람직하다.
일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 LNP에 존재하는 총 지질의 약 20mol% 내지 약 70 또는 75mol% 또는 약 45 내지 약 65mol% 또는 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 약 70mol%의 비율로 존재한다. 추가 실시양태에서, LNP는 양이온성 지질의 몰 기준으로 약 25% 내지 약 75%, 예를 들어 약 20 내지 약 70%, 약 35 내지 약 65%, 약 45 내지 약 65%, 몰 기준으로 60%, 약 57.5%, 약 57.1%, 약 50% 또는 약 40%(지질 나노입자 내 지질의 100% 총 몰을 기준으로 함) 포함한다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질 대 핵산(예를 들어, 코딩 RNA 또는 DNA)의 비는 약 3 내지 약 15, 예컨대 약 5 내지 약 13 또는 약 7 내지 약 11이다.
다른 적합한(양이온성 또는 이온화 가능한) 지질은 WO2009/086558, WO2009/127060, WO2010/048536, WO2010/054406, WO2010/088537, WO2010/129709, WO2011/153493, WO2013/063468, US2011/0256175, US2012/0128760, US2012/0027803, US8158601, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2017/070613, WO2017/070620, WO2017/099823, WO2012/040184, WO2011/153120, WO2011/149733, WO2011/090965, WO2011/043913, WO2011/022460, WO2012/061259, WO2012/054365, WO2012/044638, WO2010/080724, WO2010/21865, WO2008/103276, WO2013/086373, WO2013/086354, 미국 특허 제7,893,302호, 제7,404,969호, 제8,283,333호, 제8,466,122호 및 제8,569,256호 및 미국 특허출원 US2010/0036115, US2012/0202871, US2013/0064894, US2013/0129785, US2013/0150625, US2013/0178541, US2013/0225836, US2014/0039032 및 WO2017/112865에 개시되어 있다. 이러한 맥락에서, LNP에 사용하기에 적합한 (양이온성) 지질들과 관련된 WO2009/086558, WO2009/127060, WO2010/048536, WO2010/054406, WO2010/088537, WO2010/129709, WO2011/153493, WO 2013/063468, US2011/0256175, US2012/0128760, US2012/0027803, US8158601, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2017/070613, WO2017/070620, WO2017/099823, WO2012/040184, WO2011/153120, WO2011/149733, WO2011/090965, WO2011/043913, WO2011/022460, WO2012/061259, WO2012/054365, WO2012/044638, WO2010/080724, WO2010/21865, WO2008/103276, WO2013/086373, WO2013/086354, 미국 특허 제7,893,302호, 제7,404,969호, 제8,283,333호, 제8,466,122호 및 제8,569,256호 및 미국 특허출원 US2010/0036115, US2012/0202871, US2013/0064894, US2013/0129785, US2013/0150625, US2013/0178541, US2013/0225836 및 US2014/0039032 및 WO2017/112865의 개시내용들은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
양태들에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 아미노 또는 양이온성 지질은 지질이 생리학적 pH(예를 들어, pH 7.4) 이하의 pH에서 양전하를 띠고 제2 pH, 바람직하게는 생리적 pH 이상에서 중성이 되도록 적어도 하나의 양성자화 가능한 또는 탈양성자화 가능한 기를 갖는다. 물론 pH의 함수로서 양성자의 추가 또는 제거는 평형 과정이며, 하전 또는 중성 지질에 대한 언급은 우세한 종의 성질을 의미하며, 모든 지질이 하전된 형태 또는 중성 형태로 존재해야 함을 필요로 하는 것은 아니다. 하나 이상의 양성자화 가능 또는 탈양성자화 가능한 기를 가지거나 쯔비터이온성인 지질은 배제되지 않고 마찬가지로 본 발명의 맥락에서 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양성자화가능한 지질은 약 4 내지 약 11 범위의 양성자화가능한 기의 pKa, 예를 들어, 약 5 내지 약 7의 pKa를 갖는다.
LNP는 본 명세서에 정의된 2개 이상의 (상이한) 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 양이온성 지질은 상이한 유리한 특성에 기여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 아민 pKa, 화학적 안정성, 순환 반감기, 조직 내 반감기, 조직 내 순 축적 또는 독성과 같은 특성이 다른 양이온성 지질을 LNP에 사용할 수 있다. 특히, 양이온성 지질은 혼합-LNP의 특성이 개별 지질의 단일-LNP의 특성보다 더 바람직하도록 선택될 수 있다.
영구적인 양이온성 지질 또는 리피도이드의 양은 핵산 화물(cargo)의 양을 고려하여 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 양은 나노입자(들) 또는 조성물의 N/P 비가 약 0.1 내지 약 20 범위가 되도록 선택된다. 이와 관련하여, N/P 비는 화물로 사용되는 핵산의 인산기("P")에 대한 지질 또는 리피도이드의 염기성 질소 함유 기의 질소 원자("N")의 몰비로 정의된다. N/P 비율은, RNA가 염기의 통계적 분포를 나타내는 경우, 예를 들어, 1ug RNA가 일반적으로 약 3nmol 포스페이트 잔기를 함유한다는 것을 기준으로 계산할 수 있다. 지질 또는 리피도이드의 "N"-값은 분자량 및 영구적인 양이온성 및 - 존재하는 경우 - 양이온성 기의 상대적 함량을 기준으로 계산할 수 있다.
LNP의 생체 내 특성 및 거동은 입체 안정화 부여를 위해 LNP 표면에 친수성 고분자 코팅, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 추가하여 수정할 수 있다. 또한, LNP는 리간드(예: 항체, 펩티드 및 탄수화물)를 부착된 PEG 사슬의 말단 또는 표면에 부착함으로써(예: PEG화된 지질 또는 PEG화된 콜레스테롤을 통해) 특정 표적화에 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, LNP는 중합체 접합 지질을 포함한다. 용어 "고분자 접합 지질"은 지질 부분과 고분자 부분을 모두 포함하는 분자를 의미한다. 중합체 접합 지질의 예는 PEG화 지질이다. 용어 "PEG화된 지질"은 지질 부분 및 폴리에틸렌 글리콜 부분 둘 다를 포함하는 분자를 지칭한다. PEG화된 지질은 당업계에 공지되어 있으며, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-s-DMG) 및 이와 유사한 것을 포함한다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 중합체 접합 지질, 예를 들어. PEG-지질은 응집 감소 지질의 역할을 할 수 있다.
특정 실시양태에서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜-지질(PEG화된 지질)인 안정화-지질을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 글리콜-지질에는 PEG-변형 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형 포스파티드산, PEG-변형 세라마이드(예: PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형 디알킬아민, PEG-변형 디아실글리세롤, PEG-변형 디알킬글리세롤이 포함된다. 대표적인 폴리에틸렌 글리콜-지질에는 PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA 및 PEG-s-DMG가 포함된다. 한 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바밀]-1,2-디미리스틸옥실프로필-3-아민 (PEG-c-DMA)이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-2000-DMG이다. 한 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG)이다. 다른 실시양태에서, LNP는 PEG화 디아실글리세롤(PEG-DAG), 예를 들어 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), PEG화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEG-S-DAG), 예를 들어 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG), PEG화 세라마이드 (PEG-cer), 또는 PEG 디알콕시프로필카바메이트, 예를 들어, ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-디(테트라데카녹시)프로필)카바메이트 또는 2,3-디(테트라데카녹시)프로필-N-(ω-메톡시( 폴리에톡시)에틸)카바메이트를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, PEG화된 지질은 바람직하게는 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 화학식 IV로부터 유래된다. 따라서, 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 화학식 IV로부터 유도된 PEG화된 지질, 및 이와 관련된 각각의 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 조성물의 적어도 하나의 핵산(예: RNA 또는 DNA)은 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 LNP를 형성하고, 여기서 LNP는 PEG화된 지질을 포함하고, 여기서 PEG 지질은 바람직하게는 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 화학식 (IVa)에서 유래한다. 따라서, 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 화학식 (IVa)로부터 유래된 PEG화된 지질, 및 이에 관련된 각각의 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산, 바람직하게는 하나 이상의 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성함으로써 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP는 PEG화 지질/PEG 지질을 포함한다. 바람직하게는, 상기 PEG 지질은 하기 화학식 IVa이다:
Figure pct00007
(IVa)
여기서 n은 약 30±2, 32±2, 34±2, 36±2, 38±2, 40±2, 42±2, 44±2, 46±2, 48±2, 50±2, 52±2, 54±2, 56±2, 58±2, 또는 60±2와 같은 30 내지 60 범위의 평균값을 갖는다. 가장 바람직한 실시양태에서 n은 약 49이다. 추가의 바람직한 측면에서, 상기 PEG 지질은 화학식 IVa의 것이고, 여기서 n은 PEG 지질의 평균 분자량이 약 2000g/mol 내지 약 3000g/mol 또는 약 2300g/mol 내지 약 2700g/mol, 훨씬 더 바람직하게는 약 2500g/mol이 되도록 선택된 정수이다.
본 명세서에 적합하게 사용된 화학식 IVa의 지질은 ALC-0159로도 지칭되는 화학 용어 2[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드를 갖는다.
이러한 맥락에서 적합한 PEG-지질의 추가 예는 US2015/0376115A1 및 WO2015/199952에 제공되며, 이들 각각은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 실시양태에서, LNP는 LNP 내의 지질의 총 몰을 기준으로 약 3, 2, 또는 1 몰% 미만의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다. 추가 실시양태에서, LNP는 몰 기준으로 약 0.1% 내지 약 20%의 PEG-변형된 지질, 예를 들어, 몰 기준으로 약 0.5 내지 약 10%, 약 0.5 내지 약 5%, 약 10%, 약 5%, 3.5%, 약 3%, 약 2.5%, 약 2%, 약 1.5%, 약 1%, 약 0.5%, 또는 약 0.3%(LNP에서 지질의 100% 총 몰을 기준으로 함) 포함한다. 바람직한 실시양태에서, LNP는 몰 기준으로 약 1.0% 내지 약 2.0%의 PEG-변형된 지질, 예를 들어, 약 1.2 내지 약 1.9%, 약 1.2 내지 약 1.8%, 약 1.3 내지 약 1.8%, 약 1.4% 내지 약 1.8%, 약 1.5 내지 약 1.8%, 약 1.6 내지 약 1.8%, 특히 약 1.4%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 가장 바람직하게는 1.7% 를 포함한다 (LNP에서 지질의 100% 총 몰을 기준으로 함). 다양한 양태에서, 양이온성 지질 대 PEG화된 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 25:1의 범위이다.
바람직한 실시양태에서, LNP는 입자의 형성 동안 또는 제조 공정 동안 입자의 형성을 안정화시키는 하나 이상의 추가 지질(예를 들어, 중성 지질 및/또는 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체)을 포함한다.
두 번째 측면의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산, 바람직하게는 하나 이상의 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP는 하나 이상의 중성 지질 및/또는 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 포함한다.
적합한 안정화 지질은 중성 지질 및 음이온성 지질을 포함한다. 용어 "중성 지질"은 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않거나 중성 쯔비터이온 형태로 존재하는 다수의 지질 종 중 임의의 하나를 지칭한다. 대표적인 중성 지질은 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 디히드로 스핑고미엘린, 세팔린 및 세레브로사이드를 포함한다.
두 번째 측면의 실시양태에서, LNP는 하나 이상의 중성 지질을 포함하며, 여기서 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE) 및 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일포스파티디에탄올 아민(SOPE), 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포포에탄올아민(transDOPE), 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, LNP는 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택된 중성 지질을 포함한다. 다양한 양태에서, 양이온성 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1의 범위이다.
바람직한 양태에서, 중성 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 양이온성 지질 대 DSPC의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1 범위일 수 있다.
바람직한 양태들에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 양이온성 지질 대 콜레스테롤의 몰비는 약 2:1 내지 약 1:1 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤은 PEG화될 수 있다.
스테롤은 지질 입자의 약 10mol% 내지 약 60mol% 또는 약 25mol% 내지 약 40mol%일 수 있다. 한 실시양태에서, 스테롤은 지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 약 60mol%이다. 또 다른 실시양태에서, LNP는 스테롤의 몰 기준으로 약 5% 내지 약 50%, 예를 들어, 약 15% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 몰 기준으로 약 48%, 약 40%, 약 38.5%, 약 35%, 약 34.4%, 약 31.5% 또는 약 31%(지질 나노입자 내 지질의 100% 총 몰을 기준으로 함)의 스테롤을 포함한다.
바람직하게는, 지질 나노입자(LNP)는 (a) 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 제1 측면의 적어도 하나의 RNA, (b) 양이온성 지질, (c) 응집 감소제(예: 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 지질 또는 PEG-변형된 지질), (d) 선택적으로 비-양이온성 지질(예: 중성 지질), 및 (e) 선택적으로, 스테롤을 포함한다.
일부 실시양태에서, 양이온성 지질(상기 정의된 바와 같음), 비-양이온성 지질(상기 정의된 바와 같음), 콜레스테롤(상기 정의된 바와 같음), 및/또는 PEG-변형된 지질(상기 정의된 바와 같음)은 다양한 상대 몰비로 조합될 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질 대 비-양이온성 지질 대 콜레스테롤-기반 지질 대 PEG화된 지질의 비는 약 30-60:20-35:20-30:1-15, 또는 약 40:30:25:5, 50:25:20:5, 50:27:20:3, 40:30:20:10, 40:32:20:8, 40:32:25:3 또는 40:33:25:2의 비율일 수 있으며, 또는 각각 약 50:25:20:5, 50:20:25:5, 50:27:20:3 40:30:20: 10,40:30:25:5 또는 40:32:20:8, 40:32:25:3 또는 40:33:25:2의 비율일 수 있다.
일부 실시양태에서, LNP는 화학식 III의 지질, 하나 이상의 핵산, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 RNA, 중성 지질, 스테로이드 및 PEG화된 지질을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 화학식 III의 지질은 지질 화합물 III-3 (ALC-0315)이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스테로이드는 콜레스테롤이고, PEG화된 지질은 화학식 IVa의 화합물(ALC-0159)이다.
제2 측면의 바람직한 실시양태에서, LNP는 (i) 하나 이상의 양이온성 지질; (ii) 중성 지질; (iii) 스테롤, 예를 들어 , 콜레스테롤; 및 (iv) PEG-지질, 예를 들어 PEG-DMG 또는 PEG-cDMA를, 약 20-60% 양이온성 지질: 5-25% 중성 지질: 25-55% 스테롤; 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 본질적으로(essentially) 이루어진다.
특히 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산, 바람직하게는 하나 이상의 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP는 다음을 포함한다:
(i) 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 양이온성 지질, 바람직하게는 화학식 III의 지질, 더욱 바람직하게는 지질 III-3(ALC-0315);
(ii) 본 명세서에 정의된 하나 이상의 중성 지질, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
(iii) 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 콜레스테롤; 및
(iv) 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 PEG-지질, 예를 들어, PEG-DMG 또는 PEG-cDMA, 바람직하게는 화학식 IVa(ALC-0159)이거나 그로부터 유래된 PEG화된 지질.
특히 바람직한 양태에서, 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 적어도 하나의 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP는 약 20-60% 양이온성 지질: 5-25% 중성 지질: 25-55% 스테롤; 0.5-15% PEG-지질의 몰 비율로 상기 (i) 내지 (iv)를 포함한다.
한 바람직한 실시양태에서, 지질 나노입자는 화학식 III의 양이온성 지질 및/또는 화학식 IV의 PEG 지질, 임의로 중성 지질, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 및 임의로 스테로이드, 바람직하게는 콜레스테롤을 포함하고, 여기서 양이온성 지질 대 DSPC의 몰비는 임의로 약 2:1 내지 8:1 범위이고, 여기서 양이온성 지질 대 콜레스테롤의 몰비는 임의로 약 2:1 내지 1:1이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산, 바람직하게는 하나 이상의 RNA를 포함하는 제2 측면의 조성물은 약 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 약 47.5:10:40.8:1.7 또는 보다 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7 (즉, 양이온성 지질(바람직하게는 지질 III-3 (ALC-0315)), DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질 (바람직하게는 n = 49인 화학식 IVa의 PEG-지질, 훨씬 더 바람직하게는 n = 45인 화학식 IVa의 PEG-지질 (ALC-0159)); 에탄올에 용해됨)의 몰비를 갖는 지질 나노입자(LNP)를 포함한다.
가장 바람직하게는, 제2 측면의 조성물은 지질 나노입자(LNP)로 제형화된 서열 번호: 163의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 RNA를 포함하며, LNP는 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 더 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7 비율(몰%)의 몰비의 양이온성 지질 III-3 (ALC-0315), DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa의 PEG-지질 (n=49 또는 n=45 (ALC-0159))을 가진다. 이 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 화학적으로 변형되지 않는다.
다른 가장 바람직한 양태에서, 제2 측면의 조성물은 지질 나노입자(LNP)로 제형화된 서열 번호: 149의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 RNA를 포함하며, LNP는 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 더 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7 비율(몰%)의 몰비의 양이온성 지질 III-3 (ALC-0315), DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa의 PEG-지질 (n=49 또는 n=45 (ALC-0159))을 가진다. 이 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 화학적으로 변형되지 않는다.
다른 가장 바람직한 양태에서, 제2 측면의 조성물은 지질 나노입자(LNP)로 제형화된 서열 번호: 24837의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 RNA를 포함하며, LNP는 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 더 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7 비율(몰%)의 몰비의 양이온성 지질 III-3 (ALC-0315), DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa의 PEG-지질 (n=49 또는 n=45 (ALC-0159))을 가진다. 이 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 화학적으로 변형되지 않는다.
추가적인 바람직한 양태에서, 제2 측면의 조성물은 지질 나노입자(LNP)로 제형화된 서열 번호: 23311, 23531, 또는 24851의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 RNA를 포함하며, LNP는 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 더 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7 비율(몰%)의 몰비의 양이온성 지질 III-3 (ALC-0315), DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa의 PEG-지질 (n=49 또는 n=45 (ALC-0159))을 가진다. 이 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 화학적으로 변형되지 않는다.
추가적인 바람직한 양태에서, 제2 측면의 조성물은 지질 나노입자(LNP)로 제형화된 서열 번호: 23310, 23530, 23313, 또는 23533의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 RNA를 포함하며, LNP는 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 더 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7 비율(몰%)의 몰비의 양이온성 지질 III-3 (ALC-0315), DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa의 PEG-지질 (n=49 또는 n=45 (ALC-0159))을 가진다. 이 바람직한 양태에서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 화학적으로 변형되지 않는다.
조성물이 상기 정의된 바와 같은 다가 조성물인 실시양태에서, 핵산 종(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 다가 조성물의 RNA 종은 별도로 제제화될 수 있고, 바람직하게는 리포솜 또는 LNP에서 별도로 제제화될 수 있다. 적합하게는, 다가 조성물의 RNA 종은 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 더욱 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7 비율(mol%)의 몰비를 갖는 양이온성 지질 III-3 (ALC-0315), DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa의 PEG-지질 (n=49 또는 n=45)의 LNP로 별도로 제형화된다. 다가 조성물에 대한 핵산 종은 바람직하게는 상기 정의된 바와 같이 선택된다(섹션 "본 발명의 다가 조성물" 참조).
조성물이 상기 정의된 바와 같은 다가 조성물인 실시양태에서, 다가 조성물의 핵산 종(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 종은 공동-제형화될 수 있고, 바람직하게는 리포솜 또는 LNP에서 공동-제형화될 수 있다. 적합하게는, 다가 조성물의 RNA 종은 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 더욱 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7 비율(mol%)의 몰비를 갖는 양이온성 지질 III-3 (ALC-0315), DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa의 PEG-지질 (n=49 또는 n=45)의 LNP에서 공동-제형화(co-formulated)된다.
다가 조성물에 대한 핵산 종은 바람직하게는 상기 정의된 바와 같이 선택된다(섹션 "본 발명의 다가 조성물" 참조).
지질 나노입자 내 핵산의 총량은 다양할 수 있으며 예를 들어 핵산 대 총 지질 w/w 비율에 따라 정의된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 핵산, 특히 RNA 대 총 지질 비는 0.06 w/w 미만, 바람직하게는 0.03 w/w 내지 0.04 w/w이다.
일부 실시양태에서, 지질 나노입자(LNP)는 단지 3개의 지질 성분, 즉 이미다졸 콜레스테롤 에스테르(ICE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG-2K)로 구성된다.
한 실시양태에서, 조성물의 지질 나노입자는 양이온성 지질, 스테로이드; 중성 지질; 및 중합체 접합 지질, 바람직하게는 페길화 지질을 포함한다. 바람직하게는, 중합체 접합 지질은 페길화된 지질 또는 PEG-지질이다. 특정 실시양태에서, 지질 나노입자는 하기 화학식에 따른 양이온성 지질 COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15; NOF Corporation, Tokyo, Japan)와 유사한 양이온성 지질을 포함한다:
Figure pct00008
.
하기에 추가로 설명되는 바와 같이, 이러한 지질 나노입자는 "GN01"로 지칭된다.
또한, 특정 실시양태에서, GN01 지질 나노입자는 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhyPE) 구조와 유사한 중성 지질을 포함한다:
Figure pct00009
또한, 특정 실시양태에서, GN01 지질 나노입자는 하기 구조를 갖는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000(DMG-PEG 2000)인 중합체 접합 지질, 바람직하게는 페길화된 지질을 포함한다:
Figure pct00010
.
당업계에 사용된 "DMG-PEG 2000"은 ~ 97:3 비율의 1,2-DMG PEG2000 및 1,3-DMG PEG2000의 혼합물로 간주된다.
따라서, 바람직한 실시양태 중 하나에 따른 GN01 지질 나노입자(GN01-LNP)는 SS-EC 양이온성 지질, 중성 지질 DPhyPE, 콜레스테롤, 및 중합체 접합 지질(페길화된 지질) 1,2-디미리스토일-rac-글리세로- 3-메톡시폴리에틸렌 글리콜(PEG-DMG)를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, GN01 LNP는 다음을 포함한다:
(a) 45-65 mol%의 양이온성 지질 SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15; NOF Corporation, Tokyo, Japan);
(b) 25-45 mol%의 콜레스테롤;
(c) 8-12 mol%의 DPhyPE; 및
(d) 1-3 mol%의 PEG-DMG 2000;
각 양은 GN01 지질 나노입자의 모든 지질 첨가제의 총 몰량에 대한 값임.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 GN01 지질 나노입자는 59mol% 양이온성 지질, 10mol% 중성 지질, 29.3mol% 스테로이드 및 1.7mol% 중합체 접합 지질, 바람직하게는 페길화된 지질을 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 GN01 지질 나노입자는 59mol% 양이온성 지질 SS-EC, 10mol% DPhyPE, 29.3mol% 콜레스테롤 및 1.7mol% DMG-PEG 2000을 포함한다.
GN01 지질 나노입자 내 핵산의 양에 대한 양이온성 지질의 양은 또한 중량비(즉, "m/m"로 축약됨)로 표현될 수 있다. 예를 들어, GN01 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 적어도 하나의 RNA를 약 20 내지 약 60, 또는 약 10 내지 약 50 범위의 지질 대 RNA 중량비를 달성하기 위한 양으로 포함한다. 다른 실시양태에서, 양이온성 지질 대 핵산 또는 RNA의 비는 약 3 내지 약 15, 예컨대 약 5 내지 약 13, 약 4 내지 약 8 또는 약 7 내지 약 11이다. 본 발명의 매우 바람직한 양태에서, 총 지질/RNA 질량비는 RNA 캡슐화를 보장하기 위해 약 40 또는 40, 즉 약 40 또는 40배 질량 초과이다. 또 다른 바람직한 RNA/지질 비는 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4, 또는 바람직하게는 약 3이다.
또한, 양이온성 지질의 양은 RNA 화합물과 같은 핵산 카고의 양을 고려하여 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, N/P 비는 약 1 내지 약 50의 범위일 수 있다. 다른 실시양태에서, 범위는 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5이다. 바람직한 일 실시양태에서, 이들 양은 GN01 지질 나노입자 또는 조성물의 N/P 비율이 약 10 내지 약 20 범위가 되도록 선택된다. 추가의 매우 바람직한 실시양태에서, N/P는 14(즉, 핵산 캡슐화를 보장하기 위해 양전하의 14배 몰 과량)이다.
바람직한 실시양태에서, GN01 지질 나노입자는 59mol% 양이온성 지질 COATSOME® SS-EC (실시예 섹션에서 명백한 바와 같이 이전 명칭: SS-33/4PE-15; NOF Corporation, Tokyo, Japan), 스테로이드로서 29.3mol% 콜레스테롤, 중성 지질/인지질로서 10mol% DPhyPE 및 중합체 접합 지질로서 1.7mol% DMG-PEG 2000을 포함한다. DPhyPE의 사용과 관련된 추가의 독창적인 이점은 부피가 큰 꼬리로 인한 융합 생성(fusogenicity)에 대한 높은 용량이며, 이것에 의해 엔도솜 지질과 높은 수준에서 융합할 수 있다. "GN01"의 경우, N/P (지질 대 핵산, 예를 들어 RNA mol 비)는 바람직하게는 14이고, 총 지질/RNA 질량비는 바람직하게는 40 (m/m)이다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 하나 이상의 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP는 다음을 포함한다:
I 적어도 하나의 양이온성 지질;
Ii 적어도 하나의 중성 지질;
Iii 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체; 및
Iiii 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 PEG-지질,
여기서 양이온성 지질은 DLin-KC2-DMA (50mol%) 또는 DLin-MC3-DMA (50mol%)이고, 중성 지질은 DSPC (10mol%)이고, PEG 지질은 PEG-DOMG (1.5mol%)이고, 구조적 지질은 콜레스테롤 (38.5mol%)임.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 하나 이상의 RNA가 하나 이상의 지질과 복합체를 형성함으로써 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP는 SS15 / Chol / DOPE (또는 DOPC) / DSG-5000을 50/38.5/10/1.5 mol%로 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 핵산은 리포솜, 예를 들어, WO2019/222424, WO2019/226925, WO2019/232095, WO2019/232097, 또는 WO2019/2322208에 개시된 리포솜으로 제형화될 수 있으며, 리포솜 또는 지질-기반 담체 분자와 관련된 WO2019/222424, WO2019/226925, WO2019/232095, WO2019/232097, 또는 WO2019/232208의 개시는 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 핵산을 적합하게 캡슐화하는 LNP는 평균 직경이 약 50nm 내지 약 200nm, 약 60nm 내지 약 200nm, 약 70nm 내지 약 200nm, 약 80nm 내지 약 200nm, 약 90nm 내지 약 200nm, 약 90nm 내지 약 190nm, 약 90nm 내지 약 180nm, 약 90nm 내지 약 170nm, 약 90nm 내지 약 160nm, 약 90nm 내지 약 150nm, 약 90nm 내지 약 140nm 약 90nm 내지 약 130nm, 약 90nm 내지 약 120nm, 약 90nm 내지 약 100nm, 약 70nm 내지 약 90nm, 약 80nm 내지 약 90nm, 약 70nm 내지 약 80nm, 또는 약 30nm, 35nm, 40nm, 45nm, 50nm, 55nm, 60nm, 65nm, 70nm, 75nm, 80nm, 85nm, 90nm, 95nm, 100nm, 105nm, 110nm, 115nm, 120nm, 125nm, 130nm, 135nm, 140nm, 145nm, 150nm, 160nm, 170nm, 180nm, 190nm, 또는 200nm이며 실질적으로 무독성입니다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 평균 직경은 당업계에 일반적으로 공지된 동적 광산란에 의해 결정된 z-평균으로 나타낼 수 있다.
나노입자의 다분산 지수(polydispersity index, PDI)는 전형적으로 0.1 내지 0.5의 범위이다. 특정 실시양태에서, PDI는 0.2 미만이다. 일반적으로 PDI는 동적 광산란에 의해 결정된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 지질 나노입자는 각각 약 50nm 내지 약 300nm, 또는 약 60nm 내지 약 250nm, 약 60nm 내지 약 150nm, 또는 약 60nm 내지 약 120nm 범위의 유체역학적(hydrodynamic) 직경을 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 지질 나노입자는 각각 약 50nm 내지 약 300nm, 또는 약 60nm 내지 약 250nm, 약 60nm 내지 약 150nm, 또는 약 60nm 내지 약 120nm 범위의 유체역학적 직경을 갖는다.
하나 초과 또는 복수, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 본 발명의 핵산 종이 조성물에 포함되는 양태들에서, 상기 하나 초과 또는 복수, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 본 발명의 핵산 종은 하나 이상의 지질 내에서 복합화되어 하나 초과 또는 복수, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 다른 핵산 종을 포함하는 LNP를 형성한다.
바람직한 양태에 따르면, 바람직하게 RNA를 캡슐화하거나 포함하는 지질-기반 담체는 적어도 하나의 정제 단계, 바람직하게는 적어도 하나의 TFF 단계 및/또는 적어도 하나의 정화(clarification) 단계 및/또는 적어도 하나의 여과 단계인 정제 단계를 포함한다. 이러한 정제는 특히 지질 제형에 사용된 조성물 내 에탄올의 양을 감소시킨다.
이러한 맥락에서, 조성물은 정제 후 약 500ppM 미만의 에탄올, 바람직하게는 약 50ppM 미만의 에탄올, 더욱 바람직하게는 약 5ppM 미만의 에탄올을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
양태들에서, 본 명세서에 기재된 LNP는 제형 및/또는 핵산, 바람직하게는 RNA의 저장 안정성을 개선하기 위해 동결건조될 수 있다. 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 LNP는 제제 및/또는 핵산의 저장 안정성을 개선하기 위해 분무 건조될 수 있다. 동결건조 및/또는 분무 건조를 위한 동결보호제는 트레할로스, 수크로스, 만노스, 덱스트란 및 이눌린으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 동결보호제는 수크로스이며, 임의로 추가 동결보호제(lyoprotectant)를 포함한다. 추가로 바람직한 동결보호제는 트레할로스이며, 임의로 추가 동결보호제를 포함한다.
따라서, 상기 조성물, 예를 들어, LNP를 포함하는 조성물은 동결건조되어(예를 들어, WO2016/165831 또는 WO2011/069586에 따라) 본 명세서에 정의된 바와 같은 온도 안정한 건조된 핵산 (예를 들어, RNA 또는 DNA) (분말) 조성물을 생성한다. 조성물, 예를 들어, LNP를 포함하는 조성물은 또한 분무-건조 또는 분무-동결 건조(예를 들어, WO2016/184575 또는 WO2016/184576에 따름)를 사용하여 건조되어 본 명세서에 정의된 바와 같은 온도 안정한 조성물(분말)을 생성할 수 있다.
따라서, 바람직한 양태에서, 조성물은 건조된 조성물이다.
본 명세서에 사용된 용어 "건조된 조성물"은 온도 안정한 건조된 조성물(분말), 예를 들어, LNP 복합 RNA (상기 정의된 바와 같음)를 포함하는 안정한 건조된 조성물을 얻기 위하여 상기 정의된 바와 같이 동결건조되거나, 분무-건조되거나, 분무-동결 건조된 조성물로서 이해되어야 한다.
추가 실시양태에 따르면, 제2 측면의 조성물은 하나 이상의 애주번트를 포함할 수 있다.
적합하게는, 애주번트는 바람직하게는 조성물의 면역자극 특성을 향상시키기 위해 첨가된다.
본 명세서에 사용된 용어 "애주번트"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 다른 성분의 효과를 변형, 예를 들어, 향상시키거나 조성물의 투여 및 전달을 지원하는 데 적합할 수 있는 약리학적 및/또는 면역학적 성분을 지칭하도록 의도된다. 용어 "애주번트"라는 광범위한 물질을 의미한다. 일반적으로 이러한 물질은 항원의 면역원성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 애주번트는 선천 면역계에 의해 인식될 수 있고, 예를 들어 선천 면역 반응(즉, 비특이적 면역 반응)을 유발할 수 있다. "애주번트"는 일반적으로 적응 면역 반응을 이끌어내지 않는다. 본 발명의 맥락에서, 애주번트는 핵산에 의해 제공되는 항원성 펩티드 또는 단백질의 효과를 향상시킬 수 있다. 이러한 맥락에서, 적어도 하나의 애주번트는 당업자에게 공지되어 있고, 본 경우에 적합한, 즉 대상체, 예를 들어, 인간에게서 면역 반응의 유도를 지원하는 임의의 애쥬번트로부터 선택될 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 하나 이상의 애주번트를 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 애주번트는 WO2016/203025에 제공된 임의의 애주번트로부터 적합하게 선택될 수 있다. WO2016/203025의 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 개시된 애주번트, 바람직하게는 WO2016/203025의 제17항에 개시된 애주번트가 특히 적합하며, 이에 관한 특정 내용은 인용에 의해 여기에 포함된다. 애주번트는 예를 들어, 제2 측면의 조성물 또는 제4 측면의 백신에서 암호화된 단백질에 대한 충분한 면역 반응에 필요한 핵산의 양을 감소시키고/시키거나 노인의 치료/백신 접종을 위한 조성물/백신의 효능을 개선하기 위하여 적합하게 사용 및 포함될 수 있다. 코로나바이러스 조성물 또는 백신(특히 제3 측면의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 경우)과 관련하여 적합한 애주번트는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 작용제 애주번트, CpG 1018TM일 수 있다.
제2 측면의 조성물은 본 명세서에 명시된 성분 외에, 추가 항원(예를 들어, 펩티드 또는 단백질의 형태, 바람직하게는 코로나바이러스로부터 유래된 펩티드 또는 단백질의 형태) 또는 추가의 항원-암호화 핵산 (바람직하게는 펩티드 또는 단백질을 코딩, 바람직하게는 코로나바이러스 유래); 추가 면역치료제; 하나 이상의 보조 물질 (사이토카인, 예를 들어 모노카인, 림포카인, 인터루킨 또는 케모카인); 또는 인간 Toll-유사 수용체에 대한 결합 친화성(리간드로서)으로 인해 면역 자극하는 것으로 알려진 임의의 추가 화합물; 및/또는 애주반트 핵산, 바람직하게는 면역자극 RNA (isRNA), 예를 들어, CpG-RNA 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 적어도 하나의 추가 성분을 포함할 수 있다.
양태들에서, RNA를 캡슐화하는 지질 기반 담체를 포함하는 조성물은 액체로서 저장 후 안정하며, 예를 들어 약 5℃의 온도에서 액체로서 저장 후 적어도 2주 동안 안정하다.
일부 측면에서, 본 명세서에 사용된 "안정한"은 다양한 물리화학적 파라미터에 대한 측정값이 저장 후 정의된 범위 내에 있는 RNA를 캡슐화하는 지질 기반 담체를 포함하는 액체 조성물을 지칭한다. 한 실시양태에서, RNA를 캡슐화하는 지질-기반 담체를 포함하는 액체 조성물을 분석하여 다양한 파라미터에 따른 안정성을 평가한다. 적합한 안정성 파라미터에는 RNA 무결성(integrity), Z-평균 입자 크기, 다분산 지수(PDI), 액체 조성물 내 유리 RNA의 양, RNA의 캡슐화 효율(지질 기반 담체에 혼입된 퍼센트로 나타낸 RNA의 비율), RNA를 캡슐화하는 지질 기반 담체의 모양 및 형태, pH, 삼투질 농도 또는 탁도를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 추가로, "안정한"은 다양한 기능적 파라미터에 대한 측정값이 저장 후 정의된 범위 내에 있는 RNA를 캡슐화하는 지질 기반 담체를 포함하는 액체 조성물을 지칭한다. 한 실시양태에서, RNA를 캡슐화하는 지질-기반 담체를 포함하는 액체 조성물은 예를 들어 코딩된 펩티드 또는 단백질의 발현, 특이적 항체 역가의 유도, 중화 항체 역가의 유도, T-세포의 유도, 예를 들어 선천성 면역 반응의 유도를 포함하는 액체 조성물의 반응성(reactogenicity) 등을 포함하는, 액체 조성물의 효능을 평가하기 위해 분석된다.
바람직한 실시양태에서, 용어 "안정한"은 RNA 무결성(integrity)을 지칭한다.
다양한 실시양태에서, 실시양태의 조성물은 온도 안정한 액체 약학 조성물로서 정의되고, 액체 조성물의 온도 안정성을 달성하기 위한 적합한 특징일 수 있는 RNA를 캡슐화하는 특정 농도의 지질-기반 담체를 포함한다. 어떠한 이론에 얽매이지 않고, RNA의 특정 농도는 액체로 저장될 때 조성물의 온도 안정성에 유리한 효과를 가질 수 있다.
양태들에서, 조성물 중 RNA의 농도는 약 10㎍/ml 내지 약 10mg/ml의 범위이다. 양태들에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 약 100㎍/ml 내지 약 5mg/ml의 범위이다. 양태들에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 약 100㎍/ml 내지 약 2mg/ml의 범위이다. 양태들에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 약 100㎍/ml 내지 약 1mg/ml의 범위이다. 양태들에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 약 200㎍/ml 내지 약 1mg/ml의 범위이다. 양태들에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 약 100㎍/ml 내지 약 500㎍/ml의 범위이다. 바람직한 실시양태에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 약 200㎍/ml 내지 약 500㎍/ml의 범위이다. 바람직한 실시양태에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 약 200㎍/ml 내지 약 600㎍/ml의 범위이다. 바람직한 실시양태에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 약 200㎍/ml 내지 약 700㎍/ml의 범위이다. 바람직한 실시양태에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 약 200㎍/ml 내지 약 800㎍/ml의 범위이다. 바람직한 실시양태에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 약 200㎍/ml 내지 약 900㎍/ml의 범위이다.
양태들에서, 조성물 중 RNA의 농도는 예를 들어 약 100μg/ml, 약 200μg/ml, 약 300μg/ml, 약 400μg/ml, 약 500μg/ml, 약 600μg/ml, 약 700μg/ml, 약 800μg/ml, 약 900㎍/ml, 약 1mg/ml이다. 바람직한 양태들에서, 액체 조성물 중 RNA의 농도는 적어도 100㎍/ml, 바람직하게는 적어도 200㎍/ml, 보다 바람직하게는 적어도 500㎍/ml이다.
다양한 실시양태에서, 약학 조성물의 RNA는 액체 조성물의 온도 안정성을 달성하기 위한 적합한 특징일 수 있는 특정 RNA 무결성(intergrity)을 갖는다.
"RNA 무결성"이라는 용어는 일반적으로 완전한 RNA 서열이 액체 조성물에 존재하는지 여부를 설명한다. 낮은 RNA 무결성은 무엇보다도 RNA 분해, RNA 절단, RNA의 부정확하거나 불완전한 화학적 합성, 부정확한 염기 쌍, 변형된 뉴클레오티드의 통합 또는 이미 통합된 뉴클레오티드의 변형, 캡핑 부족 또는 불완전한 캡핑, 폴리아데닐화의 부족 또는 불완전 폴리아데닐화, 또는 불완전한 RNA 시험관내 전사로 인해 발생할 수 있다. RNA는 쉽게 분해될 수 있는 깨지기 쉬운 분자이며, 이것은 온도, 리보뉴클레아제, pH 또는 기타 요인(예: 친핵성 공격, 가수분해 등)에 의해 야기될 수 있으며, 이는 RNA 무결성 및 결과적으로 RNA의 기능을 감소시킬 수 있다.
당업자는 RNA 무결성을 결정하기 위한 다양한 상이한 크로마토그래피 또는 전기영동 방법으로부터 선택할 수 있다. 크로마토그래피 및 전기영동 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 크로마토그래피가 사용되는 경우(예: RP-HPLC), RNA 무결성 분석은 해당 크로마토그램에서 전체 길이 RNA의 피크 면적(또는 "피크 아래 면적")을 결정하는 것을 기반으로 할 수 있다. 피크 면적은 검출기 시스템의 신호를 평가하는 적절한 소프트웨어에 의해 결정될 수 있다. 피크 면적을 결정하는 과정을 적분이라고도 한다. 전장 RNA를 나타내는 피크 면적은 일반적으로 각 샘플에서 전체 RNA의 피크 면적과 관련하여 설정된다. RNA 무결성은 % RNA 무결성으로 표현될 수 있다.
본 발명의 측면과 관련하여, RNA 무결성은 분석 (RP)HPLC를 사용하여 결정될 수 있다. 전형적으로, RNA를 캡슐화한 지질 기반 담체를 포함하는 액체 조성물의 시험 샘플은 지질 기반 담체를 해리하고 캡슐화된 RNA를 방출하기 위해 세제(예를 들어, 약 2% Triton X100)로 처리될 수 있다. 방출된 RNA는 적절한 결합 화합물, 예를 들어, Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 제조업체의 지시서에 따라 사용하여 포획될 수 있다. RNA 샘플을 준비한 후 분석 (RP)HPLC를 수행하여 RNA의 무결성을 결정할 수 있다. 일반적으로 RNA 무결성을 결정하기 위해, RNA 샘플은 예를 들어 주사용수(WFI)를 사용하여 0.1g/l의 농도로 희석될 수 있다. 희석된 RNA 샘플의 약 10μl를 HPLC 컬럼(예: 모놀리식 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스)에 주입할 수 있다. 분석 (RP)HPLC는 표준 조건, 예를 들어, 구배 1: 완충액 A (0.1M TEAA (pH 7.0)); 완충액 B (25% 아세토니트릴을 함유하는 0.1M TEAA(pH 7.0))을 사용하여 수행할 수 있다. 30% 완충액 B에서 시작하여 구배는 2분 내에 32% 완충액 B로 확장된 다음, 1ml/min의 유속으로 15분에 걸쳐 55% 완충액 B로 확장된다. HPLC 크로마토그램은 일반적으로 260nm의 파장에서 기록된다. 수득된 크로마토그램은 소프트웨어를 사용하여 평가할 수 있고, 상대적 피크 면적은 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 백분율(%)로 결정할 수 있다. 상대 피크 면적은 100% RNA 무결성을 갖는 RNA의 양을 나타낸다. HPLC에 주입된 RNA의 양이 일반적으로 알려져 있기 때문에 상대 피크 면적의 분석은 RNA의 무결성에 대한 정보를 제공한다. 따라서 예를 들어 총 100ng RNA가 주입되었으며 100ng가 상대 피크 면적으로 결정되면, RNA 무결성은 100%가 된다. 예를 들어 상대 피크 면적이 80ng에 해당한다면 RNA 무결성은 80%가 된다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 RNA 무결성은 분석용 HPLC, 바람직하게는 분석용 RP-HPLC를 사용하여 결정된다.
특정 실시양태에서, 실시양태의 약학 조성물은 약 5℃의 온도에서 액체로서 저장 후 약 2주 내지 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년 동안 안정하다. 예를 들어, RNA의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%는 약 2주, 3주, 1개월, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년 동안 약 5 ℃의 온도에서 액체로 저장한 후 온전한 상태로 남아 있습니다. 일부 측면에서, 양태들의 온도 안정한 액체 약제는 약 5 ℃의 온도에서 액체로 저장한 후 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 온전한 RNA를 포함한다. 추가 측면에서, 양태들의 온도 안정한 액체 제약은 약 5 ℃의 온도에서 액체로 저장한 후 적어도 1개월 후에 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 온전한 RNA를 포함한다. 일정 측면에서, 양태들의 온도 안정한 액체 약제는 약 5 ℃의 온도에서 액체로 저장한 후 적어도 약 2주 내지 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년 저정 후 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 온전한 RNA를 포함한다. 일부 특정 측면에서, 양태들의 온도 안정한 액체 약제는 약 5℃의 온도에서 액체로서 약 2주 저장 후 온전한 RNA의 적어도 약 80%를 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물의 RNA는 약 40% 내지 약 100% 범위의 RNA 무결성을 갖는다. 양태들에서, RNA는 약 50% 내지 약 100% 범위의 RNA 무결성을 갖는다. 양태들에서, RNA는 약 60% 내지 약 100% 범위의 RNA 무결성을 갖는다. 양태들에서, RNA는 약 70% 내지 약 100% 범위의 RNA 무결성을 갖는다. 양태들에서, RNA 무결성은 예를 들어 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%이다. RNA는 분석용 HPLC, 바람직하게는 분석용 RP-HPLC를 사용하여 적절하게 결정된다.
바람직한 실시양태에서, 조성물의 RNA는 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 가장 바람직하게는 약 80% 이상 또는 약 90%의 RNA 무결성을 갖는다. RNA는 분석용 HPLC, 바람직하게는 분석용 RP-HPLC를 사용하여 적절하게 결정된다.
다양한 실시양태에서, 핵산, 예를 들어 약학 조성물의 RNA는 액체 조성물의 온도 안정성을 달성하기 위한 적합한 특징일 수 있는 유리 RNA의 특정 비율을 초과하지 않는다. 어떠한 이론에 얽매이지 않고, 액체 조성물의 유리 RNA는 지질 기반 담체에 캡슐화되는 RNA로서 분해에 더 취약할 수 있다.
특정 측면에서, 양태들의 조성물은 RNA를 포함한다. 이러한 맥락에서, 용어 "유리 RNA" 또는 "비복합체 RNA" 또는 "비캡슐화 RNA"는 본 명세서에 정의된 지질 기반 담체에 캡슐화되지 않은 RNA 분자를 포함한다. 액체 조성물을 제형화하는 동안(예: RNA를 지질 기반 담체로 캡슐화하는 동안) 유리 RNA는 오염 또는 불순물을 나타낼 수 있다. 캡슐화되지 않은 또는 유리 RNA의 많은 부분은 또한 조성물의 지질 기반 담체의 불안정화에 대한 지표(예를 들어, 조성물의 저장 시)일 수 있다. 예를 들어, 액체 조성물에서 검출 가능한 유리 RNA는 보관 동안 증가할 수 있으며, 이는 조성물의 온도 안정성을 결정하기 위한 특징으로 사용될 수 있다.
당업자는 액체 조성물에서 유리 RNA의 유리 핵산의 양 및/또는 비율을 결정하기 위한 다양한 상이한 방법으로부터 선택할 수 있다. 액체 조성물의 유리 RNA는 크로마토그래피 방법(예: AEX, SEC) 또는 조성물의 유리 RNA에 결합하는 프로브(예: 염료)를 사용하여 결정할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 유리 RNA 또는 캡슐화되지 않은 RNA의 양은 염료 기반 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 유리 RNA의 양 및/또는 비율을 결정하는 데 사용할 수 있는 적합한 염료에는 RiboGreen®, PicoGreen® 염료, OliGreen® 염료, QuantiFluor® RNA 염료, Qubit® RNA 염료, Quant-iT™ RNA 염료, TOTO®-1 염료, YOYO®-1 염료를 포함한다. 이러한 염료는 유리 RNA와 캡슐화된 RNA를 구별하는 데 적합하다. 정의된 양의 유리 RNA 또는 캡슐화된 RNA로 구성된 참조 표준품을 공급업체 지침에서 권장하는 대로 각 시약(예: RiboGreen® 시약 (Excitation 500nm/Emission 525nm))과 혼합하여 사용할 수 있다. 일반적으로 액체 조성의 유리 RNA는 제조업체의 지침에 따라 Quant-iT RiboGreen RNA Reagent를 사용하여 정량화된다. 본 발명의 맥락에서 유리 RNA의 비율은 일반적으로 RiboGreen 분석을 사용하여 결정된다.
양태들에서, 조성물은 약 30% 내지 약 0% 범위의 유리 RNA와 같은 유리 핵산을 포함한다. 양태에서, 액체 조성물은 약 20% 유리 RNA (및 약 80% 캡슐화 RNA), 약 15% 유리 RNA (및 약 85% 캡슐화 RNA), 약 10% 유리 RNA (및 약 90% 캡슐화 RNA), 또는 약 5% 유리 RNA (및 약 95% 캡슐화된 RNA)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 액체 조성물은 약 20% 미만의 유리 RNA, 바람직하게는 약 15% 미만의 유리 RNA, 보다 바람직하게는 약 10% 미만의 유리 RNA, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 유리 RNA를 포함한다.
RNA 핵산을 포함하는 측면에서, 용어 "캡슐화된 RNA"는 본 명세서에 정의된 지질 기반 담체에 캡슐화된 RNA 분자를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 캡슐화된 RNA의 비율은 일반적으로 RiboGreen 분석을 사용하여 결정된다.
따라서, 양태들에서, 액체 조성물 중 RNA의 약 70% 내지 약 100%가 지질 기반 담체에 캡슐화된다. 양태들에서, 액체 조성물은 약 80%의 캡슐화된 RNA (및 약 20%의 유리 RNA), 약 85%의 캡슐화된 RNA (및 약 15%의 유리 RNA), 약 90%의 캡슐화된 RNA (및 약 10%의 유리 RNA), 또는 약 95% 캡슐화된 RNA (및 유리 RNA에 대한 5%)를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 액체 조성물에 포함된 핵산(예를 들어, RNA)의 80%가 캡슐화되고, 바람직하게는 조성물에 포함된 RNA의 85%가 캡슐화되고, 보다 바람직하게는 조성물에 포함된 RNA의 90%가 캡슐화되고, 가장 바람직하게는 조성물에 포함된 RNA의 95%가 캡슐화된다.
다양한 실시양태에서, 약학 조성물 (특히 조성물의 RNA)은 액체 조성물의 온도 안정성을 달성하기 위한 적합한 특징일 수 있는 특정 양의 2가 양이온을 초과하지 않는다. 2가 양이온, 예를 들어, 2가 금속 이온(예: Mg2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+, Ni2+, Fe2+, Co2+, Pb2+)은 액체로 보관하는 동안 지질 기반 담체에 캡슐화된 RNA의 가수분해를 유발할 수 있다.
일부 측면에서, 조성물의 RNA는 전형적으로 (선형) DNA 주형의 RNA 시험관내 전사(IVT)에 의해 생성될 수 있다. 일반적인 RNA 시험관 내 전사 완충액은 RNA 중합효소의 보조 인자인 다량의 MgCl2 (예: 5mM, 15mM 또는 그 이상)를 포함한다. 따라서, 얻어진 시험관내 전사된 RNA는 오염물로서 Mg2+ 이온을 포함할 수 있다. RNA 시험관내 전사 후, DNA 주형은 일반적으로 DNAses에 의해 제거된다. DNAse 분해를 위한 일반적인 완충액은 DNAse의 보조 인자인 다량의 CaCl2 (예: 1mM, 5mM 또는 그 이상)로 구성된다. 따라서, 얻어진 시험관내 전사된 RNA는 오염물로서 Ca2+를 포함할 수 있다.
일반적으로 다양한 RNA 정제 단계(예: RP-HPLC, 접선 흐름 여과(tangential flow filtration))를 사용하여 2가 금속 이온을 포함한 다양한 오염을 제거할 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 지질 기반 담체에 캡슐화하기 위해 사용된 RNA는 2가 금속 이온을 제거하기 위해 정제되었다.
양태들에서, 양태들의 조성물은 g RNA당 약 100nM 미만의 2가 양이온, 바람직하게는 g RNA당 약 50nM 미만의 2가 양이온, 보다 바람직하게는 g RNA당 약 10nM 미만의 2가 양이온을 포함한다. 양태들에서, 2가 양이온은 Mg2+ 및/또는 Ca2+로부터 선택된다. 양태들에서, 액체 조성물은 RNA g당 약 100nM 미만의 Mg2+를 포함한다. 양태들에서, 액체 조성물은 RNA g당 약 100nM 미만의 Ca2를 포함합니다. 일반적으로 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(IC-ICP-MS)과 결합된 이온 크로마토그래피(IC)를 2가 양이온 측정에 사용할 수 있다.
양태들예에서, 조성물의 RNA를 캡슐화하는 지질 기반 담체는 g RNA당 약 100nM 미만의 2가 양이온, 바람직하게는 g RNA당 약 50nM 미만의 2가 양이온, 보다 바람직하게는 g RNA당 약 10nM 미만의 2가 양이온을 포함한다. 양태들에서, 2가 양이온은 Mg2+ 및/또는 Ca2+로부터 선택된다. 양태들에서, RNA를 캡슐화하는 지질 기반 담체는 RNA g당 약 100nM 미만의 Mg2+를 포함한다. 양태들에서, RNA를 캡슐화하는 지질 기반 담체는 g RNA당 약 100nM 미만의 Ca2를 포함한다. 일반적으로 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(IC-ICP-MS)과 결합된 이온 크로마토그래피(IC)를 Mg2+ 및/또는 Ca2+ 측정에 사용할 수 있다.
양태들에서, 조성물의 RNA는 반대 이온으로서 Na+를 포함한다. 양태들에서, RNA는 RNA g당 약 10㎍ Na+ 내지 RNA g당 약 1mg Na+ 범위의 양으로 Na+를 포함한다. 양태들에서, RNA는 반대 이온으로서 Na+를 RNA g당 적어도 약 100㎍ Na+, 바람직하게는 RNA g당 적어도 약 200㎍ Na+의 양으로 포함한다. 일반적으로 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(IC-ICP-MS)과 결합된 이온 크로마토그래피(IC)를 Na+ 측정에 사용할 수 있다.
양태들에서, 조성물은 하나 이상의 RNA 감지 패턴 인식 수용체(RNA sensing pattern recognition receptor)의 하나 이상의 길항제를 포함한다. 이러한 길항제는 바람직하게는 본원에 정의된 지질 기반 담체로 공동-제형화될 수 있다.
적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적합한 길항제는 PCT 특허 출원 PCT/EP2020/072516에 개시되어 있으며, 전체 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특히, PCT/EP2020/072516의 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적합한 길항제에 관한 개시내용이 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 Toll-유사 수용체, 바람직하게는 TLR7 및/또는 TLR8로부터 선택되는 하나 이상의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 하나 이상의 길항제를 포함한다.
양태들에서, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 핵산, 펩티드, 단백질, 소분자, 지질, 또는 이들 중 어느 하나의 단편, 변이체 또는 유도체로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드이다.
양태들에서, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 길항제는 PCT/EP2020/072516의 서열 번호: 85-212 또는 이들 서열의 어느 것의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다.
바람직한 양태들에서, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 길항제는 PCT/EP2020/072516의 서열 번호: 85-87, 149-212 또는 이들 서열의 어느 것의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 맥락에서 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 특히 바람직한 길항제는 5'-GAG CGmG CCA-3' (PCT/EP2020/072516의 서열 번호: 85), 또는 이의 단편이다.
양태들에서, 본 명세서에 정의된 하나 이상의 핵산, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 SRAS-CoV-2 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 RNA에 대한 본 명세서에 정의된 하나 이상의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 하나 이상의 길항제의 몰비는 적절하게 약 1:1 내지 약 100:1, 또는 약 20:1 내지 약 80:1의 범위이다.
양태들에서, 여기서 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 SRAS-CoV-2 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 RNA에 대한 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제의 중량 대 중량비는 적절하게는 약 1:1 내지 약 1:30의 범위, 또는 약 1:2 내지 약 1:10의 범위이다.
코로나바이러스 백신용 폴리펩티드
제3 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스 백신, 특히 SARS-CoV-2 (이전의 nCoV-2019) 코로나바이러스 백신에 적합한 항원성 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 제1 측면의 핵산이 코딩하는 임의의 단백질 또는 그의 단편으로부터 유래된다. 바람직한 폴리펩티드 디자인은 목록 1에 개시되어 있습니다.
바람직한 실시양태에서, 제3 측면의 항원성 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 1-111, 274-11663, 13176-13510, 13521-14123, 22732-22758, 22917, 22923, 22929-22964, 26938, 26939, 또는 이들 중 어느 것의 단편 또는 변이체의 아미노산 서열 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
제3 측면의 폴리펩타이드는 또한 약학적으로 허용되는 담체, 또는 특히 제2 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 본 명세서에 정의된 바와 같은 애주번트를 포함하는 (약학) 조성물에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 항원성 폴리펩타이드를 포함하는 (약학) 조성물에 관한 것이다.
제3 측면의 폴리펩타이드는 또한 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 특히 제4 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 본 명세서에 정의된 바와 같은 애주번트를 포함하는 백신에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 항원성 폴리펩타이드를 포함하는 백신에 관한 것이다(제4 측면 참조). 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리펩티드와 조합하여 사용될 수 있는 적합한 애주번트는 사포닌계 애주번트 (스테로이드 또는 트리테르페노이드 글리코시드), 예를 들어 매트릭스-M 애주번트이다.
백신 :
네 번째 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스, 바람직하게는 COVID-19 질병을 유발하는 SARS-CoV-2 (이전의 nCoV-2019) 코로나바이러스에 대한 백신을 제공한다.
제4 측면의 바람직한 실시양태에서, 백신은 적어도 하나의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게는 제1 측면의 적어도 하나의 RNA, 또는 제2 측면의 조성물을 포함한다.
다른 실시양태에서, 백신은 제3 측면에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 백신은 제1 측면에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 플라스미드 DNA 또는 아데노바이러스 DNA를 포함한다.
특히, 제2 측면의 조성물과 관련된 양태는 마찬가지로 제4 측면의 백신의 적합한 양태로서 읽고 이해될 수 있다. 또한, 제4 측면의 백신과 관련된 양태들은 마찬가지로 제2 측면의 조성물의 적합한 양태로서 읽고 이해될 수 있다. 또한, 제1 측면(본 발명의 핵산)의 맥락에서 설명된 특징 및 양태들은 제4 측면의 조성물의 적합한 양태로서 읽히고 이해되어야 한다.
용어 "백신"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 적어도 하나의 에피토프 또는 항원, 바람직하게는 면역원(immunogen)을 제공하는 예방 또는 치료 물질로 의도된다. 본 발명의 맥락에서 항원 또는 항원 기능은 제1 측면의 본 발명의 핵산(상기 핵산은 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함함) 또는 제2 측면의 조성물(적어도 하나의 제1 측면의 핵산을 포함함)에 의해 적합하게 제공된다. 다른 실시양태에서, 항원 또는 항원 기능은 제3 측면의 본 발명의 폴리펩티드에 의해 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 백신 또는 제2 측면의 조성물은 적응 면역 반응, 바람직하게는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 적응 면역 반응을 유도한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 백신 또는 제2 측면의 조성물은 바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 효과적으로 중화할 수 있는 기능적 항체를 유도한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 백신 또는 제2 측면의 조성물은 점막 IgA 항체를 유도함으로써 점막 IgA 면역을 유도한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 백신 또는 제2 측면의 조성물은 바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 효과적으로 중화할 수 있는 기능적 항체를 유도한다.
추가의 특히 바람직한 실시양태에서, 백신 또는 제2 측면의 조성물은 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 광범위하고 기능적인 세포 T-세포 반응을 유도한다.
추가의 특히 바람직한 실시양태에서, 백신 또는 제2 측면의 조성물은 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 균형 잡힌 B 세포 및 T 세포 반응을 유도한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 바와 같은 백신은 약학상 허용되는 담체 및 임의로 제2 측면의 맥락에서 특정된 바와 같은 적어도 하나의 애주번트를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 맥락에서 적합한 애주번트는 WO2016/203025의 청구항 17에 개시된 애주번트로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 백신은 1가 백신이다.
용어 "1가 백신", "1가 조성물" "1가 백신" 또는 "1가 조성물"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 하나의 항원 또는 병원체로부터의 항원 컨스트럭트만을 포함하는 조성물 또는 백신을 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 백신 또는 조성물은 단일 유기체의 단일 항원 또는 항원 컨스트럭트를 코딩하는 단 하나의 핵산 종을 포함한다. "1가 백신"이라는 용어에는 단일 원자가에 대한 면역이 포함된다. 본 발명의 맥락에서, 1가 SARS-CoV-2 코로나바이러스 백신 또는 조성물은 하나의 특정 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터 유래된 하나의 단일 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함할 것이다.
양태들에서, 백신은 제1 측면의 맥락에서 정의된 핵산 종의 복수 또는 적어도 하나 초과를 포함하는 다가 백신이다. 제2 측면의 맥락에서 개시된 바와 같은 다가 조성물에 관한 양태들은 마찬가지로 다가 백신의 적합한 양태로서 읽고 이해될 수 있다.
용어 "폴리발런트(polyvalent) 백신", "폴리발런트 조성물" "다가(multivalent) 백신" 또는 "다가 조성물"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어, 하나 초과의 바이러스(예: 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스 분리주)의 항원을 포함하거나 동일한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 또는 이들의 조합의 다른 항원 또는 항원 컨스트럭트를 포함하는 조성물 또는 백신을 의미합니다. 용어는 상기 백신 또는 조성물이 하나 이상의 가(valence)를 갖는다는 것을 설명한다. 본 발명의 맥락에서, 다가 SARS-CoV-2 코로나바이러스 백신은 여러 상이한 SARS-CoV-2 코로나바이러스(예를 들어, 상이한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 분리주들)로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또는 동일한 SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터의 상이한 항원 또는 항원 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 다가 또는 다가 백신은 제2 측면에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 다가 조성물을 포함한다. " 본 발명의 다가 조성물 " 섹션에 정의된 바와 같은 다가 조성물이 특히 바람직하다.
양태들에서, 백신은 제2 측면에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 하나 이상의 길항제를 포함한다.
코로나바이러스 백신은 일반적으로 안전하고 유효한 양의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 제1 측면의 RNA 또는 제2 측면의 조성물 (또는 제3 측면의 폴리펩티드)을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "안전하고 유효한 양"은 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염과 관련된 질병 또는 장애의 양성 변형을 유의하게 유도하기에 충분한 핵산 또는 조성물의 양을 의미한다. 동시에, "안전하고 효과적인 양"은 심각한 부작용을 피할 만큼 충분히 적다. 본 발명의 핵산, 조성물 또는 백신과 관련하여, "안전하고 유효한 양"이라는 표현은 바람직하게는 과도하거나 손상을 주는 면역 반응(예: 선천성 면역 반응)이 달성되지 않는 방식으로 코로나바이러스에 대한 적응 면역계를 자극하기에 적합한 핵산, 조성물 또는 백신의 양을 의미한다.
위에 정의된 핵산, 조성물 또는 백신의 "안전하고 유효한 양"은 치료할 특정 상태 및 치료할 환자의 연령 및 신체 상태, 상태의 중증도, 치료 기간, 수반되는 치료요법의 특성, 사용된 특정 약학적으로 허용되는 담체, 및 유사한 인자들에 따라 당업자의 지식 및 경험 내에서 달라질 것이다. 또한, 핵산, 조성물 또는 백신의 "안전하고 효과적인 양"은 적용/전달 경로(피내, 근육내, 비강내), 적용 장치(제트 주사, 바늘 주사, 미세바늘 패치, 전기천공 장치) 및 /또는 복합체화/제형(프로타민 복합체화 또는 LNP 캡슐화, DNA 또는 RNA)에 의존한다. 더욱이, 핵산, 조성물 또는 백신의 "안전하고 효과적인 양"은 치료 대상(유아, 임산부, 면역 저하 인간 대상 등)의 신체 상태에 따라 달라질 수 있다.
코로나바이러스 백신은 인간 의학적 목적 및 또한 수의학적 의학적 목적(포유류, 척추동물 또는 조류 종)을 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 약학적으로 허용되는 담체는 바람직하게는 본 발명의 코로나바이러스 백신의 액체 또는 비액체 기반을 포함한다. 본 발명의 백신이 액체 형태로 제공되는 경우, 담체는 물, 일반적으로 발열원이 없는 물; 등장 식염수 또는 완충(수용성) 용액, 예를 들어, 인산염, 구연산염 등 완충 용액일 것이다. 바람직하게는, 링거-락테이트 용액은 WO2006/122828에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 백신 또는 조성물을 위한 액체 기반으로서 사용되며, 적합한 완충 용액에 관한 그것의 개시내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 백신 또는 조성물, 특히 LNP를 포함하는 조성물/백신에 대한 액체 기반으로서 사용되는 다른 바람직한 용액은 수크로스 및/또는 트레할로스를 포함한다.
본 명세서에 정의된 약학적으로 허용되는 담체의 선택은 원칙적으로 본 발명에 따른 약학 조성물(들) 또는 백신이 투여되는 방식에 의해 결정된다. 코로나바이러스 백신은 바람직하게는 국소적으로(locally) 투여된다. 일반적으로 국소 투여를 위한 경로는 예를 들어 토피칼(topical) 투여 경로 뿐만 아니라 피내, 경피, 피하 또는 근육내 주사 또는 병변내, 두개내, 폐내, 심장내, 관절내 및 설하 주사를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물 또는 백신은 피내, 피하 또는 근육내 경로, 바람직하게는 주사에 의해 투여될 수 있으며, 이는 무바늘 및/또는 주사바늘 주사일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 근육내 주사가 바람직하다. 따라서, 조성물/백신은 바람직하게는 액체 또는 고체 형태로 제형화된다. 투여될 본 발명에 따른 백신 또는 조성물의 적합한 양은 일상적인 실험, 예를 들어 동물 모델을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 모델에는 토끼, 양, 마우스, 쥐, 개 및 인간이 아닌 영장류 모델이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 주사용으로 바람직한 단위 투여 형태는 물, 생리 식염수 또는 이들의 혼합물의 멸균 용액을 포함한다. 이러한 용액의 pH는 약 7.4로 조정되어야 한다.
본 명세서에 정의된 본 발명의 코로나바이러스 백신 또는 조성물은 면역원성을 추가로 증가시키기 위해 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 보조 물질 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물/백신에 함유된 핵산 및 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 백신 또는 조성물과 임의로 공동 제제화(또는 별도로 제제화)될 수 있는 보조 물질의 상승(synergistic) 작용은 바람직하게는 이에 의해 달성된다. 이러한 면역원성 증가제 또는 화합물은 별도로 제공될 수 있고 (본 발명의 백신 또는 조성물과 함께 제형화되지 않음) 개별적으로 투여될 수 있다.
코로나바이러스 백신은 바람직하게는 동결건조 또는 분무-건조 형태로 제공된다 (제2 측면의 맥락에서 설명됨). 이러한 동결건조 또는 분무-건조 백신은 전형적으로 트레할로스 및/또는 수크로스를 포함하고, 대상체에 투여하기 전에 적합한 액체 완충액에서 재구성된다. 일부 측면에서, 양태들의 동결건조 백신은 LNP와 복합된 양태들의 mRNA를 포함한다. 일부 측면에서, 동결건조된 조성물은 약 10% 미만의 수분 함량을 갖는다. 예를 들어, 동결건조된 조성물은 약 0.1% 내지 10%, 0.1% 내지 7.5%, 또는 0.5% 내지 7.5%의 수분 함량을 가질 수 있고, 바람직하게는 동결건조된 조성물은 약 0.5% 내지 약 5.0%의 수분 함량을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 치료 유효량의 핵산, 조성물, 폴리펩티드, 백신을 대상체에 투여하면 대상체에서 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 중화 항체 역가가 유도된다.
일부 실시양태에서, 중화 항체 역가는 밀리리터당 적어도 100 중화 단위(NU/mL), 적어도 500NU/mL, 또는 적어도 1000NU/mL이다.
일부 실시양태에서, 검출가능한 수준의 코로나바이러스 항원은 핵산, 조성물, 폴리펩티드 또는 백신의 투여 후 약 1 내지 약 72시간에 대상체에서 생성된다.
일부 실시양태에서, 적어도 100NU/ml, 적어도 500NU/ml, 또는 적어도 1000NU/ml의 중화 항체 역가(코로나바이러스에 대한)가 핵산, 조성물, 폴리펩티드 또는 백신의 투여 후 약 1일 내지 약 72일에 대상체의 혈청에서 생성된다.
일부 실시양태에서, 중화 항체 역가는 백신 접종되지 않은 대조군 대상체의 중화 항체 역가에 비해 또는 약독화 생백신, 불활성화 바이러스 백신 또는 단백질 하위 단위 바이러스 백신(protein sub unit viral vaccine)으로 백신 접종된 대상체의 중화 항체 역가에 비해 적어도 50%만큼 코로나바이러스 감염을 더 감소시키기에 충분하다.
일부 실시양태에서, 중화 항체 역가 및/또는 T 세포 면역 반응은 백신접종되지 않은 대조군 대상체의 중화 항체 역가에 비해 무증상 바이러스 감염의 비율을 감소시키기에 충분하다.
일부 실시양태에서, 중화 항체 역가 및/또는 T 세포 면역 반응은 대상체에서 바이러스 잠복기를 예방하기에 충분하다.
일부 실시양태에서, 중화 항체 역가는 대상체의 상피 세포와 바이러스의 융합을 차단하기에 충분하다.
일부 실시양태에서, 중화 항체 역가는 핵산, 조성물, 폴리펩티드 또는 백신의 단일 1ug-100ug 용량 후 20일 이내에, 또는 핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 또는 백신의 두 번째 1ug-100ug 용량 후 40일 이내에 유도된다.
바람직한 실시양태에서, 치료 유효량의 핵산, 조성물, 폴리펩티드 또는 백신을 대상체에 투여하면 대상체에서 코로나바이러스에 대한 T 세포 면역 반응이 유도된다. 바람직한 실시양태에서, T 세포 면역 반응은 CD4+ T 세포 면역 반응 및/또는 CD8+ T 세포 면역 반응을 포함한다.
키트 또는 부품 키트(kit of parts), 적용, 의료 용도, 치료 방법:
제5 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하는데 적합한 키트 또는 부품 키트(kit of parts)를 제공한다. 바람직하게는, 상기 키트 또는 부품 키트는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 (이전의 nCoV-2019) 코로나바이러스 감염을 치료하거나 예방하는데 적합하다.
특히, 제1 측면의 핵산, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 및 제4 측면의 백신에 관한 실시양태는 마찬가지로 본 발명의 다섯 번째 측면의 키트 또는 부품 키트의 적합한 실시양태로서 읽고 이해될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 적어도 하나의 핵산(예: RNA 또는 DNA), 바람직하게는 제1 측면의 적어도 하나의 RNA, 제2 측면의 적어도 하나의 조성물, 및/또는 제3 측면, 및/또는 제4 측면의 적어도 하나의 백신을 포함한다.
양태들에서, 키트 또는 부품 키트는 첫 번째 측면에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 DNA, 예를 들어, 적어도 하나의 플라스미드 DNA 및/또는 적어도 하나의 아데노바이러스 DNA를 포함한다.
실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 제3 측면에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 키트 또는 부품 키트는 가용화를 위한 액체 비히클 및/또는 구성요소의 투여 및 투여량에 대한 정보를 제공하는 기술 지침서(instructions)를 포함할 수 있다.
키트는 제2 측면의 조성물 및/또는 제4 측면의 백신과 관련하여 기재된 바와 같은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트의 기술 지침서에는 투여 및 투여량 및 환자 그룹에 대한 정보가 포함될 수 있다. 이러한 키트, 바람직하게는 부품 키트가 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스, 또는 이와 관련된 장애로 인한 감염 또는 질병의 치료 또는 예방을 위해, 본 명세서에 언급된 임의의 적용 또는 용도, 바람직하게는 제1 측면의 핵산, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 또는 제4 측면의 백신의 용도를 위해 적용될 수 있다.
바람직하게는, 핵산, 조성물, 폴리펩티드, 또는 백신은 키트의 별도 부분에 제공되며, 여기서 핵산, 조성물, 폴리펩티드, 또는 백신은 바람직하게는 동결건조된다.
키트는 핵산, 조성물, 폴리펩타이드 또는 백신을 가용화하기 위한 비히클(예: 완충액)을 일부로서 추가로 함유할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 정의된 키트 또는 부품 키트는 링거 락테이트 용액을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 정의된 키트 또는 부품 키트는 조성물/백신의 투여를 위한 다중 용량(multidose) 용기를 포함한다.
임의의 상기 키트는 본원에 정의된 바와 같은 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 키트 중 임의의 것이 백신, 바람직하게는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 의해 유발되는 감염에 대한 백신으로 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 하기 구성요소를 포함한다:
a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 조성물 또는 SARS-CoV-2 백신을 포함하는 하나 이상의 용기 또는 바이알, 여기서 조성물 또는 SARS-CoV-2 백신은 약 100㎍/ml 내지 약 1mg/ml, 바람직하게는 약 100μg/ml 내지 약 500μg/ml 범위, 예를 들어 약 270μg/ml의 핵산 농도, 바람직하게는 RNA 농도를 가짐;
b) 멸균 희석 완충액, 적합하게는 NaCl을 포함하고 선택적으로 방부제를 포함하는 완충액을 포함하는 하나 이상의 희석 용기 또는 바이알;
c) 조성물 또는 백신을 저장 용기에서 희석 용기로 옮기기 위한 하나 이상의 수단; 및
d) 최종 희석된 조성물 또는 백신을 대상체에게 투여하기 위한 적어도 하나의 주사기, 바람직하게는 인간 대상체에 대한 근육내 투여용으로 구성되며, 여기서 최종 희석된 조성물 또는 백신은 약 10㎍/ml 내지 약 100㎍/ml, 바람직하게는 약 10㎍/ml 내지 약 50㎍/ml 범위, 예를 들어 약 24μg/ml의 핵산 농도, 바람직하게는 RNA 농도임.
한 실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 하나 초과의 mRNA-기반 SARS-CoV-2 조성물/백신을 포함하며, 바람직하게는
- 제1 바이알 또는 용기에 제공된 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 백신, 여기서 백신은 서열 번호: 163 , 149 또는 24837의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 RNA를 포함하고, 바람직하게는 지질 나노입자(LNP) 내로 제형화되며, 이것은 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 보다 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7 비율의 몰비(mol%)의 양이온성 지질 III-3 (ALC-0315), DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa의 PEG-지질 (n=49 또는 n=45(ALC-0159))을 포함한다. 바람직하게는, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 화학적으로 변형되지 않는다.
- 제1 바이알 또는 용기에 제공된 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 백신, 여기서 백신은 서열 번호: 23311, 23531, 24851, 23310, 23530, 24850, 23313, 23533, 24853, 23314, 23534, 또는 24854의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 RNA를 포함하고, 바람직하게는 지질 나노입자(LNP) 내로 제형화되며, 이것은 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 보다 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7 비율의 몰비(mol%)의 양이온성 지질 III-3 (ALC-0315), DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa의 PEG-지질 (n=49 또는 n=45(ALC-0159))을 포함한다. 바람직하게는, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 화학적으로 변형되지 않는다.
한 실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 프라임 백신접종 및 부스트 백신접종을 위한 2개의 상이한 SARS-CoV-2 백신을 포함한다:
- 제1 바이알 또는 용기에 제공되는 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 프라임 백신, 여기서 백신은 본 명세서에 정의된 바와 같은 mRNA-기반 SARS-CoV-2 백신임; 및
- 제1 바이알 또는 용기에 제공된 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 부스트 백신, 여기서 조성물/백신은 본 명세서에 정의된 바와 같은 아데노바이러스 기반 SARS-CoV-2 백신임.
한 실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 프라임 백신접종 및 부스트 백신접종을 위한 2개의 상이한 SARS-CoV-2 백신을 포함한다:
- 제1 바이알 또는 용기에 제공되는 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 부스트 백신, 여기서 백신은 본 명세서에 정의된 바와 같은 mRNA-기반 SARS-CoV-2 백신임; 및
- 제1 바이알 또는 용기에 제공된 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 프라임 백신, 여기서 조성물/백신은 본 명세서에 정의된 바와 같은 아데노바이러스 기반 SARS-CoV-2 백신임.
조합(Combination):
제6 측면은 제1 측면에서 정의된 바와 같은 2개 이상의 핵산 서열, 제2 측면의 맥락에서 정의된 2개 이상의 조성물, 제3 측면에서 정의된 2개 이상의 폴리펩티드, 제4 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 2개 이상의 백신, 또는 제5 측면에서 정의된 바와 같은 2개 이상의 키트의 조합에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "조합"은 바람직하게는 적어도 2개의 성분, 바람직하게는 제1 측면에서 정의된 바와 같은 적어도 2개의 핵산 서열, 제2 측면에서 정의된 바와 같은 적어도 2개의 조성물, 제3 측면에서 정의된 바와 같은 적어도 2개의 폴리펩타이드, 제4 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 2개 이상의 백신, 또는 제5 측면에서 정의된 바와 같은 2개 이상의 키트의 조합된 발생(combined occurrence)을 의미한다. 이러한 조합의 구성요소는 별도의 개체(entity)로 발생할 수 있다. 따라서, 조합 성분들의 투여는 동일한 투여 부위 또는 상이한 투여 부위에서 동시에 또는 시차를 두고 발생할 수 있다.
특히, 제1 측면의 핵산, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 및 제4 측면의 백신, 또는 제5 측면의 키트 또는 부품 키트에 관한 실시양태들도 마찬가지로 제6 측면의 조합의 구성요소의 적합한 양태들로 읽히고 이해될 수 있다.
양태들에서, 조합은 복수 또는 적어도 하나 초과의 핵산 종, 예를 들어, 본 발명의 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 RNA 종을 포함하며, 여기에서 핵산 종은 별도의 성분으로서 제공된다.
바람직하게는, 본 명세서에 정의된 조합은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 핵산, 예를 들어 본 발명의 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 RNA 종; 본 발명의 제2 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 조성물; 본 발명의 제3 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 폴리펩티드; 본 발명의 제3 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 백신을 포함할 수 있으며, 여기서 핵산 종, 조성물, 폴리펩티드, 백신은 별개의 성분으로서 제공된다.
양태들에서, 조합은 별개의 구성요소들 내에 포함된 2, 3, 4 또는 5개의 핵산 종(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 종 및 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하며, 여기서 상기 핵산 종은 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-13147, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14177, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23184, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기에서 2, 3, 4 또는 5개의 핵산 종 각각은 상이한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다.
따라서, 양태들에서, 조합은 별개의 구성요소들 내에 포함된 2개의 핵산 종(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 종 및 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하며, 여기서 상기 핵산 종은 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937148으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기에서 2개의 핵산 종 각각은 상이한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다.
양태들에서, 조합은 별개의 구성요소들 내에 포함된 3개의 핵산 종(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA 종 및 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하며, 여기서 상기 핵산 종은 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기에서 2, 3, 4 또는 5개의 핵산 종 각각은 상이한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩한다.
하기에서, 조합의 특히 바람직한 실시양태가 제공되며, 여기서 조합의 각 구성요소는 개별 엔티티로서 제공된다.
바람직하게는, 조합의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 핵산 종, 조성물, 백신은 각각 상이한 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 코딩한다(제1 측면에 정의된 바와 같음). 바람직하게는, 융합 전 형태의 안정화는 스파이크 단백질의 잔기 K986 및 V987(참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치)에서 2개의 연속적인 프롤린 치환을 도입함으로써 얻어진다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)은 각각 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이는 하기 아미노산 치환을 포함한다: K986P 및 V987P (참조 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치).
따라서, 조합의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 핵산 종, 조성물, 백신은 각각 상이한 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 코딩하고, 여기서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 안정화된 스파이크 단백질은 서열 번호: 10-26, 341-407, 609-1278, 13521-13587, 22738, 22740, 22742, 22744, 22746, 22748, 22750, 22752, 22754, 22756, 22758, 22947-2296410 또는 이것들의 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열들로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 조합은 서열 번호: 10과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종, 조성물, 백신을 포함하고, 여기서 다가 조성물은 다음에서 선택된 적어도 2, 3, 4의 추가 RNA 종을 추가로 포함한다:
i) 서열 번호: 22961와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
ii) 서열 번호: 22960와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
iii) 서열 번호: 22963와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
iv) 서열 번호: 22941와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
v) 서열 번호: 22964와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종.
따라서, 조합의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 핵산 종, 조성물, 백신은 각각 상이한 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 코딩하는 핵산 코딩 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 핵산 코딩 서열은 서열 번호: 136-138, 140-143, 145-175, 11731-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-12203, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14141, 22759, 22764-22785, 22969-23184 또는 이것들의 어느 것의 단편 또는 변이체 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 조합은 서열 번호: 137과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 핵산 종, 조성물, 백신을 포함하고, 여기서 다가 조성물은 다음에서 선택된 적어도 2, 3, 4의 추가 RNA 종을 추가로 포함한다:
i) 서열 번호: 23091와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
ii) 서열 번호: 23090와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
iii) 서열 번호: 23093와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
iv) 서열 번호: 22999와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종; 및/또는
v) 서열 번호: 23094와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 핵산 종.
바람직하게, 조합의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 훨씬 더 많은 상이한 핵산 종, 조성물, 백신은 각각 상이한 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 코딩하는 핵산 코딩 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 핵산 코딩 서열은 서열 번호: 149-151, 163-165, 12338, 12541, 12810-12813, 12901, 12931, 13013, 22792, 22794, 22796, 22798, 22802, 22804, 22806, 22810, 22813, 22819, 22821, 22823, 22825, 22827, 22829, 22831, 22833, 22835, 22837, 22839, 23297-23314, 23369, 23517-23520, 23523-23525, 23527, 23529, 23530, 23589, 23737, 23957, 24397, 24837, 25057, 25277, 25717, 26925-26937149 또는 이것들의 어느 것의 단편 또는 변이체 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 조합은 서열 번호: 163과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 하나의 RNA 종, 조성물, 백신을 포함하고, 여기서 상기 조합은 다음에서 선택된 적어도 2, 3, 4의 추가 RNA 종을 추가로 포함하고:
i) 서열 번호: 23311와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 하나의 RNA 종; 및/또는
ii) 서열 번호: 23310와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
iii) 서열 번호: 23313와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
iv) 서열 번호: 23219와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
v) 서열 번호: 23314와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종,
여기에서, 바람직하게는, 각각의 mRNA 종은 Cap1 구조를 포함하고, 선택적으로 각각의 mRNA 종은 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 조합은 서열 번호: 149 또는 24837과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 하나의 RNA 종, 조성물, 백신을 포함하고, 여기서 상기 조합은 다음에서 선택된 적어도 2, 3, 4의 추가 RNA 종을 추가로 포함하고:
i) 서열 번호: 23531 또는 24851와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 하나의 RNA 종; 및/또는
ii) 서열 번호: 23530 또는 24850와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
iii) 서열 번호: 23533 또는 24853B와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
iv) 서열 번호: 23439 또는 24759와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종; 및/또는
v) 서열 번호: 23534 또는 24854와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 하나의 RNA 종,
여기에서, 바람직하게는, 각각의 mRNA 종은 Cap1 구조를 포함하고, 선택적으로 각각의 mRNA 종은 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 조합의 제1 성분은 아데노바이러스 벡터 기반 백신, 예를 들어 ADZ1222 또는 Ad26.COV-2.S와 같은 바이러스 벡터 백신/조성물을 포함하고, 제2 성분은 핵산 기반 백신/조성물, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 mRNA 기반 백신을 포함한다.
1차 및 2차/추가 의학적 용도 :
추가 측면은 제공된 핵산, 조성물, 폴리펩티드, 백신, 키트, 또는 조합의 제1 의학적 용도에 관한 것이다.
특히, 제1 측면의 핵산, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 및 제4 측면의 백신, 또는 제5 측면의 키트 또는 부품 키트, 또는 조합에 관한 실시양태들은 마찬가지로, 본 발명의 의학적 용도의 적절한 실시양태로 읽고 이해될 수 있다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 의약으로 사용하기 위한 제1 측면에서 정의된 바와 같은 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 RNA, 의약으로 사용하기 위한 제2 측면에서 정의된 바와 같은 조성물, 의약으로 사용하기 위한 제3 측면에서 정의된 바와 같은 폴리펩티드, 의약으로 사용하기 위한 제4 측면에서 정의된 바와 같은 백신, 및 의약으로 사용하기 위한 제5 측면에서 정의된 바와 같은 키트 또는 부품 키트, 및 그 조합을 제공한다.
본 발명은 또한 핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트, 또는 조합의 여러 적용 및 용도를 제공한다.
특히, 핵산 (바람직하게는 RNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트, 또는 조합은 인간 의학적 목적 및 또한 수의학적 의학적 목적, 바람직하게는 인간 의학적 목적을 위해 사용될 수 있다.
특히, 핵산 (바람직하게는 RNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트, 또는 조합은 인간 의료 목적을 위한 약제로서 사용하기 위한 것이며, 여기서 상기 핵산(바람직하게는 RNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트는 어린 유아, 신생아, 면역 저하 환자, 임산부 및 모유 수유 여성 및 노인에게 적합할 수 있습니다. 특히, 핵산(바람직하게는 RNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트는 인간 의학적 목적을 위한 약제로서 사용하기 위한 것이며, 여기서 상기 핵산(바람직하게는 RNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신 또는 키트 또는 부품 키트는 노인 인간 대상에게 특히 적합하다.
상기 핵산(바람직하게는 RNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 조합은 인간 의학적 목적을 위한 의약으로서 사용하기 위한 것이며, 여기서 상기 RNA, 조성물, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트는 특히 근육 주사 또는 피내 주사에 적합하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제공된 핵산, 조성물, 폴리펩티드, 백신, 또는 키트 또는 조합의 제2 의학적 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염, 또는 COVID-19와 같은 이러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 제1 측면에서 정의된 바와 같은 핵산, 바람직하게는 RNA; 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염, 또는 COVID-19와 같은 이러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 제2 측면에서 정의된 바와 같은 조성물; 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염, 또는 COVID-19와 같은 이러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 제3 측면에서 정의된 바와 같은 폴리펩티드; 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염, 또는 COVID-19와 같은 이러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 제4 측면에서 정의된 바와 같은 백신; 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염, 또는 COVID-19와 같은 이러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 제5 측면에서 정의된 바와 같은 키트 또는 부품 키트; 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염, 또는 COVID-19와 같은 이러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 제6 측면에서 정의된 바와 같은 조합을 제공한다.
양태들에서, 제1 측면의 핵산, 바람직하게는 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 백신, 또는 제5 측면의 키트 또는 부품 키트, 또는 제6 측면의 조합은 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
특히, 제1 측면의 핵산, 바람직하게는 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 백신, 또는 제5 측면의 키트 또는 부품 키트, 또는 제6 측면의 이들의 조합은 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 의해 유발된 감염의 예방적(노출전 예방 또는 노출후 예방) 및/또는 치료 방법에 사용될 수 있다.
특히, 제1 측면의 핵산, 바람직하게는 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 백신, 또는 제5 측면의 키트 또는 부품 키트, 또는 제6 측면의 이들의 조합은 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염으로 인한 COVID-19 질병의 예방(노출 전 예방 또는 노출 후 예방) 및/또는 치료 방법에 사용될 수 있다.
핵산, 조성물, 폴리펩티드, 또는 백신, 또는 조합은 바람직하게는 국소적으로 투여될 수 있다. 특히, 조성물 또는 폴리펩티드 또는 백신 또는 조합물은 피내, 피하, 비강내 또는 근육내 경로에 의해 투여될 수 있다. 양태들에서, 본 발명의 핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 백신은 통상적인 바늘 주사 또는 바늘 없는 제트 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명 맥락에서 근육내 주사가 바람직하다.
플라스미드 DNA가 사용되고 조성물 또는 백신 또는 조합물에 포함되는 실시양태에서, 조성물/백신/조합물은 전기천공 장치, 예를 들어, 피내 또는 근육내 전달을 위한 전기천공 장치를 사용하는 전기천공법에 의해 투여될 수 있다. 적합하게는, US7245963B2에 설명된 장치, 특히 US7245963B2의 청구항 1 내지 68에 정의된 장치가 사용될 수 있다.
아데노바이러스 DNA가 사용되고 조성물 또는 백신 또는 조합물에 포함되는 실시양태에서, 조성물/백신/조합물은 비강내 투여에 의해 투여될 수 있다.
양태들에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 조성물 또는 백신 또는 조합물에 포함된 핵산은 약 100ng 내지 약 500ug의 양, 약 1ug 내지 약 200ug의 양, 약 1ug 내지 약 100ug의 양으로, 약 5ug 내지 약 100ug의 양, 바람직하게는 약 10ug 내지 약 50ug의 양, 구체적으로, 약 1ug, 2ug, 3ug, 4ug, 5ug, 8ug, 9ug, 10ug, 11ug, 12ug, 13ug, 14ug, 15ug, 16ug 20ug, 25ug, 30ug, 35ug, 40ug, 45ug, 50ug, 55ug, 60ug, 65ug, 70ug, 75ug, 80ug, 85ug, 90ug, 95ug 또는 100ug의 양으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 핵산을 포함하는 백신, 또는 핵산을 포함하는 조성물은 대상체에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하기 위한 유효량으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 핵산의 유효량은 1ug 내지 200ug, 1ug 내지 100ug, 또는 5ug 내지 100ug의 총 용량이다.
핵산이 지질 기반 담체, 예를 들어, LNP에서, 내에서 제공되는 실시양태에서, 1회 용량에 포함된 본 명세서에 정의된 PEG-지질의 양은 약 50㎍ PEG 지질 미만, 바람직하게는 약 45㎍ PEG 지질 미만, 더욱 바람직하게는 약 40㎍ PEG 지질 미만이다.
1회 용량에 적은 양의 PEG 지질이 있으면 부작용(예: 알레르기)의 위험을 줄일 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 1회 용량에 포함된 PEG-지질의 양은 약 3.5㎍ 내지 약 35㎍ PEG 지질의 범위이다.
핵산이 지질 기반 담체, 예를 들어, LNP 내에서 제공되는 실시양태에서, 1회 용량에 포함된 본 명세서에 정의된 양이온성 지질의 양은 약 400㎍ 양이온성 지질 미만, 바람직하게는 약 350㎍ 양이온성 지질 미만, 더욱 바람직하게는 약 300㎍ 양이온성 지질 미만이다.
1회 용량에 낮은 양의 양이온성 지질이 있으면 부작용의 위험(예: 더 적음)을 줄일 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 1회 용량에 포함된 양이온성 지질의 양은 약 30㎍ PEG 지질 내지 약 300㎍ PEG 지질 범위이다.
한 실시양태에서, 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 대상체의 치료 또는 예방을 위한 면역화 프로토콜은 1회 용량의 조성물 또는 백신을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 1ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 2ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 3ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 4ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 5ug의 용량이다. 1회 백신 접종으로 대상체에 투여되는 6ug. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 7ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 8ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 9ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 10ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 11ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 12ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 13ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 14ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 16ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 20ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 25ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 30ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 40ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 50ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 100ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 1회의 백신 접종으로 대상체에게 투여되는 200ug의 용량이다. 그 맥락에서 "용량"은 본 명세서에 정의된, 유효량의 핵산, 바람직하게는 mRNA에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 면역화 프로토콜은 조성물 또는 백신의 일련의 단일 용량들(doses) 또는 투여량들(dosages)을 포함한다. 본 명세서에 사용된 단일 용량은 각각 초기/제1 용량, 제2 용량 또는 임의의 추가 용량을 나타내며, 이는 바람직하게는 면역 반응을 "부스트(boost)"하기 위해 투여된다.
일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 1ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 2ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 3ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 4ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 5ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 6ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 7ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 8ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 9ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 10ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 11ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 12ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 13ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 14ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 16ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 20ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 25ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 30ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 40ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 50ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 100ug의 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에게 총 2회 투여되는 200ug의 용량이다. 그 맥락에서 "용량"은 유효량의 본 명세서에 정의된 핵산, 바람직하게는 mRNA에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 백신/조성물/조합은 적어도 1년, 바람직하게는 적어도 2년 동안 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염(본 명세서에 정의된 투여 시)에 대해 대상체를 면역화시킨다. 바람직한 양태들에서, 백신/조성물/조합은 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대해 2년 초과, 더욱 바람직하게는 3년 초과, 훨씬 더 바람직하게는 4년 초과, 심지어 보다 바람직하게는 5-10년 이상 동안 대상체를 면역화시킨다.
치료 방법 및 용도, 진단 방법 및 용도:
또 다른 측면에서, 본 발명은 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
특히, 제1 측면의 핵산, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 및 제4 측면의 백신, 제5 측면의 키트 또는 부품 키트, 제6 측면의 조합, 또는 의학적 용도에 관한 양태들은 마찬가지로 본 명세서에 제공된 바와 같은 치료 방법의 적합한 실시양태로 읽고 이해될 수 있다. 또한, 본 명세서에 제공된 바와 같은 치료 방법과 관련된 특정 특징 및 양태들은 또한 본 발명의 의학적 용도에 적용될 수 있다.
질병, 특히 코로나바이러스 감염을 예방(억제)하거나 치료하는 것은 질병 또는 상태, 예를 들어 코로나바이러스 감염과 같은 질병에 대한 위험이 있는 대상체에서 질병 또는 상태의 완전한 발달을 억제하는 것에 관한 것이다. "치료"는 발병하기 시작한 질병 또는 병리학적 상태의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 개입을 의미한다. 질병 또는 병리학적 상태와 관련하여 용어 "개선(ameliorating)"은 치료의 관찰 가능한 유익한 효과를 의미한다. 질병을 억제하는 것은 바이러스 감염의 위험을 예방하거나 줄이는 것과 같이 질병의 위험을 예방하거나 줄이는 것을 포함할 수 있다. 유익한 효과는 예를 들어 감수성 대상체에서 질병의 임상 증상의 지연된 발병, 질병의 일부 또는 모든 임상 증상의 중증도 감소, 질병의 더 느린 진행, 바이러스 부하(load)의 감소, 대상체의 전반적인 건강 또는 웰빙의 개선, 또는 특정 질병에 특정한 다른 파라미터에 의해 증명될 수 있다. "예방적" 치료는 병리 발생 위험을 감소시킬 목적으로, 질병의 징후를 나타내지 않거나 초기 징후만 나타내는 대상체에게 투여되는 치료이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 적어도 하나의 제1 측면의 핵산, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 백신, 또는 제5 측면의 키트 또는 부품 키트, 또는 제6 측면의 조합을 이를 필요로 하는 대상체에게 적용 또는 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 장애는 코로나바이러스 감염, 또는 이러한 감염과 관련된 장애, 특히 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 의한 감염, 또는 이러한 감염, 예를 들어, COVID-19과 관련된 장애이다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 적어도 하나의 제1 측면의 핵산, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 백신, 또는 제5 측면의 키트 또는 부품 키트, 또는 제6 측면의 조합을 이를 필요로 하는 대상에게 적용하거나 투여하는 것을 포함하며, 여기서 필요한 대상은 바람직하게는 포유동물 대상체이다.
특정 실시양태에서, 질병의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 적어도 하나의 제1 측면의 핵산, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 백신, 또는 제5 측면의 키트 또는 부품 키트, 또는 제6 측면의 조합을 적용하거나 투여함으로써 질병을 치료하거나 예방하는 방법은 대상체에서 질병 부담을 감소시키는 방법으로서 추가로 정의된다. 예를 들어, 방법은 바람직하게는 COVID-19 질병의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 지속기간을 감소시킨다. 일부 측면에서, 방법은 대상이 입원, 중환자실 입원, 보충 산소 치료 및/또는 인공 호흡기 치료를 필요로 할 확률을 감소시킨다. 추가 측면에서, 방법은 대상체가 열, 호흡 곤란; 후각 상실 및/또는 미각 상실을 겪을 확률을 감소시킨다. 바람직한 측면에서, 방법은 대상체가 중증 또는 중등도의 COVID-19 질병에 걸릴 확률을 감소시킨다. 특정 측면에서, 방법의 양태들은 대상체가 양태들의 조성물을 투여받은 후 약 2주 내지 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년 또는 2년 사이에 대상체에서 중증 또는 중등도의 COVID-19 질병을 예방한다. 바람직한 측면에서, 방법의 양태들은 증상이 있는 COVID-19 질병을 예방한다. 추가 측면에서, 양태의 방법은 대상체가 양태들의 조성물을 투여받은 후 약 2주 내지 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년 또는 2년 사이에 대상체에서 SARS CoV-2 핵산의 검출가능한 수준을 예방한다. 추가 측면에서, 실시양태의 방법은 대상체에서 코로나바이러스 감염(예를 들어, SARS CoV-2 감염)에 대한 보호 면역을 제공하기 위한 방법으로 정의된다. 또 다른 측면에서, 양태의 방법은 치료 대상의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방한다. 또 다른 측면에서, 실시양태의 방법은 제2 또는 후속 면역원성 조성물 (예를 들어, 부스터 투여) 투여 후 약 2주 내지 약 1년에 치료 대상의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방한다. 또 다른 측면에서, 양태의 방법은 제2 또는 후속 조성물 투여 후 약 2주 내지 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 동안 치료 대상의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방한다.
추가 측면에서, 양태의 방법은 (i) 양태들의 조성물(예를 들어, 백신 조성물)을 얻는 단계, 여기서, 조성물은 동결건조됨; (ii) 약학상 허용되는 액체 담체에 동결건조된 조성물을 가용화하여 액체 조성물을 생성하는 단계; 및 (iii) 유효량의 액체 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 동결건조된 조성물은 약 10% 미만의 수분 함량을 포함한다. 예를 들어, 동결건조된 조성물은 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 10%, 0.5% 내지 7.5% 또는 0.5% 내지 5.0%의 물을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 양태의 방법은 서열 번호: 163과 적어도 약 95% 동일한 mRNA를 포함하는 백신 조성물(예를 들어, LNP와 복합체로)을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
추가 측면에서, 양태의 방법은 서열 번호: 149, 24837, 23311, 23531, 23310, 23530, 23313, 또는 23533과 적어도 약 95% 동일한 mRNA를 포함하는 백신 조성물(예를 들어, LNP와의 복합체 내로)을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 이러한 방법은 적어도 약 6개월 동안 중증 COVID-19 질병으로부터 대상체를 보호하기에 충분한 면역 반응을 대상체에서 제공한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 대상체는 약 6개월 내지 약 1년, 1.5년, 2년, 2.5년, 3년, 4년 또는 5년 동안 중증 COVID-19 질병으로부터 보호된다. 따라서, 일부 측면에서, 실시양태의 방법은 대상체에게 중증 질환으로부터 장기간(예를 들어, 6개월 초과) 보호를 제공할 수 있는 단일 용량 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 중증 COVID-19 질병은 다음 중 하나 이상을 경험하는 대상으로 정의된다:
ㆍ 휴식 시 심각한 전신 질환을 나타내는 임상 징후 (호흡수 ≥ 분당 30회, 심박수 ≥ 125/분, 해수면에서 실내 공기에서 SpO2 ≤ 93% 또는 PaO2/FIO2 < 300mm Hg (고도에 따라 조정))
ㆍ 호흡 부전 (고유량 산소, 비침습적 환기, 기계적 환기 또는 ECMO가 필요한 것으로 정의됨)
ㆍ 쇼크의 증거 (SBP < 90mmHg, DBP < 60mmHg, 또는 승압제가 필요한 경우)
ㆍ 심각한 신장, 간 또는 신경학적 기능 장애
ㆍ ICU 입원
ㆍ 사망
본 명세서에서 사용된 중등도 COVID-19 질병은 다음 중 하나 이상을 경험하는 대상으로 정의된다:
ㆍ 숨가쁨 또는 호흡 곤란
ㆍ 호흡수 ≥ 분당 20회 호흡
ㆍ SpO2가 비정상적이지만 여전히 해수면의 실내 공기에서 > 93% (고도에 따라 조정됨)
ㆍ 하기도 질환의 임상적 또는 방사선학적 증거
ㆍ 심부 정맥 혈전증(DVT)의 방사선학적 증거
본 명세서에서 사용된 경증 COVID-19 질병은 다음을 모두 경험하는 대상으로 정의된다:
ㆍ 증상이 있고, 및
ㆍ 숨가쁨이나 호흡 곤란이 없고, 및
ㆍ 저산소혈증 없고 (고도에 따라 조정), 및
ㆍ 중등도 또는 중증 COVID-19 질병의 사례 정의를 충족하지 않음
특히 바람직한 실시양태에서, 필요한 대상은 포유동물 대상, 바람직하게는 인간 대상, 예를 들어 신생아, 임산부, 면역 저하 및/또는 노인이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 6개월 내지 100세, 6개월 내지 80세, 1세 내지 80세, 1세 내지 70세, 2세 내지 80세 또는 2세 60세이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 3세 이하, 2세 이하, 1.5세 이하, 1세(12개월) 이하, 9개월, 6개월 또는 3개월 이하의 신생아 또는 유아이다. 일부 다른 실시양태에서 대상체는 50, 60, 65, 또는 70세 이상의 노인 대상체이다. 추가 측면에서, 실시양태에 따른 치료 대상은 61세 이상이다. 또 다른 측면에서, 대상체는 18세 내지 60세이다.
특정 실시양태에서, 실시양태에 따른 치료를 위한 대상체는 임신한 대상체, 예를 들어 임신한 인간이다. 일부 측면에서, 대상체는 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월 또는 8개월 초과 동안 임신했다.
특히 바람직한 실시양태에서, 인간 대상체는 노인 인간 대상체이다.
특정 측면에서, 양태들에 따른 치료 대상은 아메리카 원주민, 아프리카인, 아시아인 또는 유럽인 혈통을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75 %, 80%, 85% 또는 90% 아메리카 원주민, 아프리카, 아시아 또는 유럽 혈통(heritage)이다. 특정 측면에서, 대상체는 적어도 약 10%, 25% 또는 50% 아메리카 원주민 혈통과 같은 아메리카 원주민 혈통을 가지고 있습니다. 추가 측면에서, 대상체는 아메리카 원주민 혈통을 갖는 노인 대상체, 예를 들어 55세, 60세, 65세 또는 70세 이상인 대상체이다.
추가 측면에서, 양태들에 따른 치료를 위한 대상체는 질병을 갖거나 면역이 손상된다. 일부 측면에서, 대상체는 간 질환, 신장 질환 당뇨병, 고혈압, 심장 질환 또는 폐 질환이 있다. 추가 측면에서, 양태들에 따른 치료를 위한 대상체는 알레르기 반응의 병력이 있는 대상체, 예를 들어 음식 알레르기가 있는 대상체이다. 일부 측면에서, 대상체는 아나필락시스 반응과 같은 백신에 대한 이전의 알레르기 반응이 있었다. 또 다른 측면에서, 방법에 따른 치료를 위한 대상은 혈청에서 검출가능한 항-PEG IgE와 같은 검출가능한 항-PEG 항체를 갖는 대상이다.
추가 측면에서, 양태들에 따른 치료를 위한 대상은 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 동반질병(co-morbidity)을 갖는다:
(i) 만성 신장 질환: 신장 기능은 CKD-EPI(Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration) 방정식을 사용하여 추정 사구체 여과율(eGFR)로 변환된, 지난 3-6개월 이내에 혈청 크레아티닌 측정에서 확인될 것이며, 손상된 신장 기능(impaired kidney function)은 eGFR <60 mL/min/1.73 m2로 정의됨.
- 경증 만성 신장 질환은 60-89 mL/min/1.73 m2 사이의 eGFR로 정의됨.
- 중등도의 만성 신장 질환은 31-59 mL/min/1.73 m2 사이의 eGFR로 정의되며, 최소 6개월 이상의 안정적인 치료와 양호한 유지 관리가 동반됨 (Clinical Practice Clinical Guidelines for Chronic Kidney Disease: Am J Kidney Dis, 2002에서 수정됨).
(ii) COPD (폐기종 및 만성 기관지염 포함).
- 기침 또는 가래 생성이 있거나 없는 경증 COPD는 1초 동안 강제 호기량/강제 폐활량 (FEV1/FVC) <0.7 및 FEV1 ≥80% 예측으로 정의됨.
- 기침 또는 가래 생성이 있거나 없는 중등도 COPD는 FEV1/FVC <0.7 및 FEV1 ≥50%이지만, 안정적인 치료로 예측되기는 <80%로 정의됨 (COPD 중증도에 대한 GOLD 기준).
(iii) 체질량 지수 (BMI)가 >32 kg/m2인 비만 - 모든 극도의 병적 비만도 포함됨.
(iv) 다음을 포함한 만성 심혈관 질환 (심부전, 관상동맥 질환, 심근병증, 동맥 고혈압):
- 기능적 또는 구조적 심장 장애가 없는 미래에 심부전으로 발전할 가능성이 높은 클래스 I 심부전.
- 2급 심부전: 신체활동에 약간의 제한이 있는 심장질환이 있는 자. 휴식 상태에서는 편안함.
- 일상적인 신체 활동은 피로, 심계항진, 호흡곤란 또는 협심증을 유발함.
- 신체활동에 현저한 제한이 있는 3급 심부전이지만, 안정 시에는 편안하지만 약한 일상 활동은 증상을 초래함.
- 어떤 단계에서도 증상이 없는 구조적 심장 장애.
- 경미한 좌심실 수축기 또는 이완기 기능장애, 일반적으로 임상 징후가 많지 않음.
- 뉴욕심장협회(NYHA)에 따른 운동성 호흡곤란 또는 기립성 또는 발작성 야간 호흡곤란을 동반한 중등도 좌심실 부전, 약물 치료로 안정됨(Class II-III).
- 대사등가역치(MET)가 2 이상인 관상동맥질환이 중등도까지, 약물로 안정화됨. (MET는 휴식을 취하는 앉아 있는 동안 소비되는 산소의 양으로 정의되며 체중 1 kg 당 3.5ml O2 × 분(min)과 같음. 4 정상, 계단을 오르거나 언덕을 오를 수 있으며 다른 격렬한 활동에 참여할 수 있음. 1 자신을 돌볼 수 있고 스스로를 유지하지 못하고 활동에 제약을 받음.)
- 약물 투여 시 2-3 MET인 비감염성 및 대사성 기원의 심근병증.
- 약물로 안정적이고 조절된 1기 고혈압 또는 2기 고혈압
(v) 등록 전 12개월 이내에 채취한 혈액 샘플에 의해 문서화된 안정 바이러스혈증(<50 카피/mL) 및 CD4 수 >350/mL를 갖는 만성 HIV 감염. (50-350 카피/mL의 일시적인 변화와 함께 <50 카피/mL의 바이러스 부하가 허용됨.)
(vi) 약물 [헤모글로빈 A1c (HbA1c) <58 mmol/mol (7.45%)]으로 조절되거나 최근 HbA1c >58 mmol/mol (7.45%)로 조절되지 않는 제2형 당뇨병; [(HbA1c (% - 2.15) x 10.929 = HbA1c (mmol/mol)]; 조절되지 않는 DM에서 HbA1c는 변동이 10% 미만이어야 하며 이전 3개월 이내에 당뇨병성 케톤산증의 병력이나 심각한 증상이 있는 저혈당증의 에피소드가 없어야 함.
(vii) 낮은 거부 위험으로 분류된 약물을 사용하여 적어도 1년 전에 안정적인 조건에서 적어도 6개월 동안 신장 이식을 받은 대상체.
또 다른 측면에서, 양태들에 따른 치료를 위한 대상체는 지난 6개월 동안 14일 초과 동안 면역억제제로 치료되지 않았다. 일부 측면에서, 실시양태에 따른 치료를 위한 대상체는 투여 전 적어도 28일 동안 생백신을 받지 않았거나 및/또는 투여 전 적어도 14일 동안 불활성화 백신을 받지 않았다. 추가 측면에서 실시양태에 따른 치료 대상은 다음을 갖지 않는다:
- 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 질병이 있는 경우;
- 여성의 경우: 실시양태의 조성물 투여 전 1개월 이내에 임신 또는 수유를 경험한 자;
- 실시양태의 조성물을 투여하기 전 28일 이내에 연구 또는 미등록 제품(예: 백신 또는 약물)으로 치료를 받은 자;
- 양태의 조성물의 투여 전 28일(생백신의 경우) 또는 14일(불활화 백신의 경우) 이내에 허가된 백신을 받음;
- 연구용 SARS-CoV-2 백신 또는 다른 코로나바이러스(SARS-CoV, MERS-CoV) 백신으로 이전에 또는 동시에 치료를 받은 적이 있는 경우;
- 양태의 조성물을 투여하기 전 6개월 이내에 총 14일 이상 동안 면역억제제 또는 다른 면역-조절 약물(예를 들어, 코르티코스테로이드, 생물학적 제제 및 메토트렉세이트)으로 치료받은 자;
- 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), B 형 간염 바이러스 (HBV) 또는 C 형 간염 바이러스 (HCV) 감염을 포함하여 병력 및 신체 검사를 기반으로 의학적으로 진단되거나 의심되는 면역 억제 또는 면역 결핍 상태; 백혈병, 림프종, 호지킨병, 다발성 골수종 또는 전신 악성종양을 포함한 암의 현재 진단 또는 치료; 만성 신부전 또는 신증후군; 및 장기 또는 골수 이식의 수령.
- 혈관부종(유전성 또는 특발성)의 병력이 있거나 아나필락시스 반응 또는 pIMD의 병력이 있는 경우.
- CVnCoV 백신의 임의의 성분에 대한 알레르기 병력.
- 양태의 조성물을 투여하기 전 3개월 이내에 면역글로불린 또는 임의의 혈액 제제를 투여받은 자;
- 심각한 급성 또는 만성 의학적 또는 정신과적 질병을 경험한 자; 및/또는
- 중증 및/또는 조절되지 않는 심혈관 질환, 위장 질환, 간 질환, 신장 질환, 호흡기 질환, 내분비 장애, 신경 및 정신 질환을 경험한 자.
특정 측면에서, 양태들의 방법에 따른 치료를 위한 대상체는 임의의 잠재적인 면역 매개 질환(pIMD)을 갖지 않는다. 추가 측면에서, 실시양태의 치료 방법은 치료 대상에서 임의의 pIMD를 유도하지 않는다. 본 명세서에 사용된 pIMD는 복강병(Celiac disease); 크론병; 궤양성 대장염; 궤양성 직장염; 자가면역 담관염; 자가면역 간염; 원발성 담즙성 간경변증; 원발성 경화성 담관염; 애디슨병; 자가면역 갑상선염 (하시모토 갑상선염 포함); 당뇨병 1형; 그레이브스 또는 베도우병; 항합성효소 증후군; 피부근염; 청소년 만성 관절염 (스틸병 포함); 혼합 결합 조직 장애; 류마티스성 다발성 근육통; 다발성 근염; 건선 관절염; 재발성 다발성 관절염; 경피증(예: 미만성 전신 형태 및 CREST 증후군 포함); 척추관절염(예: 강직성 척추염, 반응성 관절염 (라이터 증후군) 및 미분화 척추관절염 포함); 전신성 홍반성 루푸스; 전신성 경화증; 급성 부위 척수염 (부위 특이적 변이형태 (예: 비감염성 뇌염, 뇌척수염, 척수염, 골수척수염) 포함); 뇌신경(Cranial nerve) 장애(예: paralyses/paresis (예: 벨 마비) 포함); 길랭-바레 증후군(예: 밀러 피셔 증후군 및 기타 변이 포함); 면역 매개 말초 신경병증, Parsonage-Turner 신드롬 및 신경총병증, (예를 들어, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 다초점 운동 신경병증, 및 단일클론 감마병증과 관련된 다발신경병증 포함); 다발성 경화증; 기면증; 시신경염; 횡단 척수염; 원형 탈모증; pemphigus, pemphigoid 및 포진 피부염을 포함한 자가면역 수포성 피부 질환; 피부 홍반성 루푸스; 결절 홍반; 형태소(Morphoea); 편평 태선; 건선; 스위트 증후군; 백반증; 대혈관 혈관염(예: 거대 세포 동맥염, 예를 들어 Takayasu 동맥염 및 측두 동맥염 포함); 중형 및/또는 소형 혈관 혈관염(예: 결절성 다발동맥염, 가와사키병, 현미경적 다발혈관염, 베게너 육아종증, 처그-스트라우스 증후군(알레르기성 육아종성 혈관염), 버거병 항혈전성 항혈전성 항혈관염, 괴사성 혈관염 및 항호중구 세포질 항체 (ANCA) 양성 혈관염(유형 미상), Henoch-Schonlein 자반병, Behcet 신드롬, 백혈구모세포혈관염); 항인지질 증후군; 자가면역 용혈성 빈혈; 자가면역 사구체신염 (IgA 신병증, 급속 진행성 사구체신염, 막성 사구체신염, 막증식성 사구체신염 및 간질증식성 사구체신염 포함); 자가면역 심근염/심근병증; 자가면역 혈소판감소증; 굿파스처(Goodpasture) 증후군; 특발성 폐섬유증; 악성 빈혈; 레이노 현상; 사르코이드증; 쇼그렌 증후군; 스티븐스-존슨 증후군, 포도막염)으로 정의된다.
특정 측면에서, 양태들의 백신 접종 방법은 대상체가 특별한 관심의 임의의 유해 사례(AESI)를 경험하게 하지 않는다. 본 명세서에 사용된 AESI는 위에 나열된 pIMD; 아나필락시스; 혈관염; 예방접종 후 촉진된 질병; 어린이의 다기관 염증 증후군; 급성 호흡기 장애 증후군; COVID-19 질병; 급성 심장 손상; 미세혈관병증; 심부전 및 심인성 쇼크; 스트레스성 심근병증; 관상동맥 질환; 부정맥; 심근염, 심낭염; 혈소판 감소증; 심부 정맥 혈전증; 폐색전증; 뇌혈관 뇌졸중; 사지 허혈; 출혈성 질환; 급성 신장 손상; 간 손상; 전신 경련; 길랭-바레 증후군; 급성 파종성 뇌척수염; 후각 상실, 미각 소실; 수막뇌염; Chilblain-유사 병변; 단일 기관 피부 혈관염; 다형홍반; 예방접종 후 심각한 국소/전신 AR로 정의된다.
특히, 이러한 치료 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
a) 제1 측면의 하나 이상의 핵산(예: DNA 또는 RNA), 바람직하게는 하나 이상의 RNA, 제2 측면의 하나 이상의 조성물, 제3 측면의 하나 이상의 폴리펩티드, 제4 측면의 하나 이상의 백신, 또는 다섯 번째 측면의 키트 또는 부품 키트를 제공하는 단계;
b) 상기 핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트를 대상체에게 제1 용량으로 적용 또는 투여하는 단계
c) 선택적으로, 상기 핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트를 대상체에게 제2 용량 또는 추가 용량으로, 바람직하게는 첫 번째 접종 후 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 후 적용하거나 투여하는 단계.
본 명세서에 사용된 제1 용량은 각각 초기/제1 용량, 제2 용량 또는 임의의 추가 용량을 나타내며, 이는 바람직하게는 면역 반응을 "부스트"하기 위해 투여된다. 특정 측면에서, 백신/조성물은 1회, 2회 3회, 4회 또는 그 이상 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 백신/조성물은 적어도 1회 및 2회(예를 들어, 프라임 및 부스트) 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 2차 투여는 제1 투여 후 적어도 10일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일 또는 56일이다. 일부 측면에서, 제1 투여와 제2 투여 사이의 시간은 약 7일 내지 약 56일이고; 약 14일 내지 약 56일; 약 21일 내지 약 56일; 또는 약 28일 내지 약 56일이다. 추가 측면에서, 백신/조성물은 대상체에게 3회 이상 투여된다. 특정 측면에서, 백신/조성물의 각각의 투여 사이에는 적어도 10일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일 또는 56일이 있다.
일부 측면에서, 실시양태에 따른 치료를 위한 대상체는 이전에 SARS CoV-2에 감염되었거나 이전에 적어도 제1 SARS CoV-2 백신 조성물로 치료받은 적이 있다. 일부 측면에서, 대상체는 1회, 2회, 3회 또는 그 이상의 용량의 제1 SARS CoV-2 백신 조성물로 치료되었다. 일부 측면에서, 대상체를 치료하기 위해 사용된 실시양태의 조성물은 대상체를 치료하기 위해 이전에 사용된 조성물과 상이한 유형의 백신 조성물이다. 일부 측면에서, 대상체는 이전에 BNT162 또는 mRNA-1273과 같은 mRNA 백신으로 치료받았다. 추가 측면에서, 대상체는 이전에 단백질 서브유닛 백신, 예를 들어 스파이크 단백질 기반 백신, 예를 들어 NVX-CoV2373 또는 COVAX로 치료받았다. 특정 바람직한 측면에서, 단백질 서브유닛 백신 조성물은 애쥬번트를 포함한다. 추가 측면에서, 대상체는 이전에 아데노바이러스 벡터 기반 백신, 예를 들어 ADZ1222 또는 Ad26.COV-2.S와 같은 바이러스 벡터 백신으로 치료받았다. 또 다른 측면에서, 대상체는 이전에 CoronaVac, BBIBP-CorV 또는 BBV152와 같은 SARS CoV-2에 대한 불활성화된 바이러스 백신으로 치료받았다. 추가 측면에서, 백신 조성물로 이전에 치료된 대상체는 SARS CoV-2 S 단백질-결합 항체 또는 SARS CoV-2 N 단백질-결합 항체와 같은 검출가능한 SARS CoV-2 결합 항체를 갖는다. 추가 측면에서, 실시양태에 따른 치료를 위한 대상체는 적어도 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 전에 제1 SARS CoV-2 백신 조성물로 치료되었다. 또 다른 측면에서, 실시양태에 따른 치료를 위한 대상체는 약 3개월 내지 2년 전 또는 약 6개월 내지 2년 전에 제1 SARS CoV-2 백신 조성물로 치료되었다. 일부 측면에서, 실시양태의 추가 백신 조성물로 치료된 대상체는 치료된 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%의 치료 받은 대상체에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병이 보호된다. 예를 들어, 치료 대상은 추가 조성물의 투여 후 약 2주 내지 약 1년에 치료 대상의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병으로부터 보호될 수 있다. 또 다른 측면에서, 실시양태의 추가 백신 조성물을 투여하면 치료된 대상의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병이 상기 투여 후 약 2주 내지 약 3개월, 6개월, 상기 투여 후 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 동안 보호된다. 이러한 조합 백신 접종 전략의 예는 다음과 같습니다.
1회 mRNA 백신 - T1 - 2회 mRNA 백신 - T2 - 3회 mRNA 백신
1회 mRNA 백신 - T1 - 2회 mRNA 백신 - T2 - 3회 단백질 서브유닛 백신
1회 mRNA 백신 - T1 - 2회 mRNA 백신 - T2 - 3회 바이러스 벡터 백신
1회 mRNA 백신 - T1 - 2회 mRNA 백신 - T2 - 3회 불활화 바이러스 백신
1회 단백질 서브유닛 백신 - T1 - 2회 단백질 서브유닛 백신 - T2 - 3회 mRNA 백신
1회 불활화 바이러스 백신 - T1 - 2회 불활화 바이러스 백신 - T2 - 3회 mRNA 백신
1회 바이러스 벡터 백신 - T1 - 2회 바이러스 벡터 백신 - T2 - 3회 mRNA 백신
1회 바이러스 벡터 백신 - T2 - 2회 mRNA 백신
1회 단백질 서브유닛 백신 - T2 - 2회 mRNA 백신
1회 불활화 바이러스 백신 - T2 - 2회 mRNA 백신
1회 mRNA 백신 - T2 - 2회 mRNA 백신
실시예에서, 상기 기간 1(T1)은 전형적으로 2 내지 6주, 바람직하게는 3 내지 4주이다. 기간 2(T2)는 일부 경우에 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년이다.
일부 측면에서, 실시양태의 방법은 다중 용량의 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 추가 측면에서, SARS CoV-2 부스터 백신 조성물의 반응성(reactogenicity)을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 초기 백신 접종 후, 높은 수준의 반응성을 나타내는 대상체는 초기 백신 조성물과 상이한 부스터 백신을 투여받는다. 예를 들어, 일부 측면에서, 초기 백신은 BNT162 또는 mRNA-1273이고 부스터 백신은 실시양태의 mRNA 백신 조성물이다. 일부 측면에서, 높은 반응성을 갖는 대상체를 위한 부스터 백신 조성물은 이전에 투여된 백신 조성물과 비교하여 더 낮은 농도의 PEG 또는 PEG-접합체를 갖는 것에 기초하여 선택된다. 일부 측면에서, 높은 반응성을 갖는 대상체에 대한 부스터 백신 조성물은 이전에 투여된 백신 조성물과 비교하여 mRNA 또는 LNP의 더 낮은 농도에 기초하여 선택된다.
특정 측면에서, 실시양태에 따른 치료를 위한 대상체는 부스터 백신으로서 백신 조성물이 투여되고, 이전에 코로나바이러스 백신 조성물의 1회 이상의 투여로 치료된 적이 있다. 특정 측면에서, 부스터 백신으로 치료되는 대상체는 이전에 스파이크 단백질 항원 또는 스파이크 단백질 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신 조성물로 치료되었다. 일부 측면에서, 부스터 백신을 사용한 치료를 위해 선택된 대상체는 부스터 백신의 스파이크 단백질과 상이한 아미노산 서열을 갖는 스파이크 단백질을 포함하거나 코딩하는 백신 조성물을 이전에 투여받았다. 특정 측면에서, 이전에 투여된 백신 조성물은 부스터 백신 조성에 대한 아미노산 차이가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 차이를 갖는 스파이크(예를 들어, SARS CoV-2 스파이크) 단백질을 포함하거나 암호화한다. 특정 측면에서, 부스터 백신 조성물은 이전에 투여된 백신 조성물과 비교하여 약 1 내지 50; 약 3 내지 30; 약 5 내지 30개 또는 약 10 내지 25개의 아미노산 차이를 갖는 스파이크 단백질을 코딩하는 RNA를 포함한다. 또 다른 측면에서, 부스터 백신 조성물은 상이한 아미노산 서열을 갖는 2, 3, 4 또는 그 이상의 별개의 스파이크 단백질을 코딩하는 RNA를 포함한다.
추가 측면에서, 실시양태의 방법은 2개 이상의 부스터 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 각각의 부스터 백신 조성물은 상이한 아미노산 서열을 갖는 별개의 스파이크 단백질을 코딩하는 RNA를 포함한다. 일부 측면에서, 이러한 별개의 부스터 백신 조성물은 본질적으로 동시에 또는 약 10분, 20분, 30분, 1시간 또는 2시간 간격 미만으로 투여된다. 일부 측면에서, 별개의 부스터 백신 조성물은 대상체의 동일한 팔에 근육내 주사와 같이 동일한 부위에 투여된다. 추가 측면에서, 별개의 부스터 백신 조성물은 상이한 부위에, 예컨대 상이한 팔 또는 한쪽 또는 양쪽 팔 및 하나 이상의 다리 근육에 대한 근육내 주사에 투여된다.
특정 측면에서, 실시양태의 방법은 대상체에서 항체 또는 CD8+ T-세포 반응을 자극하는 방법으로 추가로 정의된다. 일부 측면에서, 방법은 대상체에서 중화 항체 반응을 자극하는 방법으로 정의된다. 추가 측면에서, 방법은 대상체에서 보호 면역 반응을 자극하는 방법으로 정의된다. 또 다른 측면에서, 방법은 대상체에서 TH2 유도 면역 반응을 자극하는 방법으로 정의된다.
추가 측면에서, 실시양태의 백신/조성물/조합의 투여는 대상체에서 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 10 내지 약 500개의 코로나바이러스 스파이크 단백질-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극한다. 예를 들어, 투여는 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 200개 이하의 스파이크 단백질 결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극할 수 있다. 추가 측면에서, 투여는 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 10 내지 약 300; 약 20 내지 약 300; 약 20 내지 약 200; 약 30 내지 약 100; 또는 약 30개 내지 약 80개 코로나바이러스 스파이크 단백질-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극한다. 또 다른 측면에서, 실시양태의 조성물의 투여는 평균 회복기 환자 혈청(코로나바이러스 감염에서 회복된 피험자로부터)에서 발견되는 코로나바이러스 중화 항체에 대한 스파이크 단백질 결합 항체의 비율이 20%, 15%, 10% 또는 5%의 비율인 코로나바이러스 중화 항체에 대한 스파이크 단백질-결합 항체의 비율을 포함하는 대상체에서 항체 반응을 자극한다.
또 다른 측면에서, 실시양태의 백신/조성물/조합물의 투여는 대상체의 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 1 내지 약 500개의 코로나바이러스 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극한다. 추가 측면에서, 투여는 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 50개 이하의 스파이크 단백질 RBD-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극한다. 또 다른 측면에서, 투여는 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 1 내지 약 200; 약 2 내지 약 100; 약 3 내지 약 200; 약 5 내지 약 100; 약 5 내지 약 50; 또는 약 5 내지 약 20개의 스파이크 단백질 RBD-결합 항체을 생성하는 항체 반응을 자극한다. 또 다른 측면에서, 실시양태의 조성물의 투여는 평균 회복기 환자 혈청에서 발견되는 (코로나바이러스 감염에서 회복된 대상체로부터) 코로나바이러스 중화 항체에 대한 스파이크 단백질 RBD 결합 항체의 비율이 20%, 15%, 10% 또는 5%인 스파이크 단백질 RBD-결합 항체 대 코로나바이러스 중화 항체의 비율을 포함하는 대상체에서 항체 반응을 자극한다.
또 다른 측면에서, 실시양태의 백신/조성물/조합물의 투여는 대상체에서 IL-4, IL-13, TNF 및/또는 IL-1β의 증가를 본질적으로 유도하지 않는다. 추가 측면에서, 실시양태의 백신/조성물의 투여는 대상체에서 혈청 IL-4, IL-13, TNF 및/또는 IL-1β의 증가를 본질적으로 유도하지 않는다. 일부 측면에서, 실시양태의 백신/조성물의 투여는 대상체의 주사 부위(예를 들어, 근육내 주사 부위)에서 IL-4, IL-13, TNF 및/또는 IL-1β의 증가를 본질적으로 유도하지 않는다.
또 다른 측면에서, 실시양태의 방법은 질병이 있는 인간 대상체에게 양태들의 백신/조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 대상체는 심혈관 질환, 신장 질환, 폐 질환 또는 자가면역 질환이 있다. 일부 측면에서, 실시양태의 백신/조성물은 항응고 요법을 받고 있는 대상체에게 투여된다.
또 다른 측면에서, 실시양태의 백신/조성물/조합물을 인간 대상체에게 투여하면 3등급 국소 유해 사례(Grade 3 local adverse event)를 경험하는 대상체는 20%, 15%, 10%, 7.5% 또는 5% 이하이다(아래 표 A 참조). 예를 들어, 일부 측면에서, 대상체의 10% 이하가 조성물의 제1 또는 제2 접종 후에 3등급 국소 유해 사례를 경험한다. 바람직한 측면에서, 실시양태의 조성물을 인간 대상체에게 투여하면 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 7.5% 또는 5% 이하의 대상체가 2등급 이상의 국소 유해 사례를 경험한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 대상체의 30% 이하가 조성물의 제1 또는 제2 접종 후 등급 2 이상의 국소 유해 사례를 경험한다. 일부 측면에서, 실시양태의 조성물을 인간 대상체에게 투여하면 대상체의 10% 이하가 주사 부위에서 3등급 통증, 발적, 부종 및/또는 가려움증을 경험하게 된다.
추가 측면에서, 실시양태의 백신/조성물/조합물을 인간 대상체에게 투여하면 대상체의 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하가 3등급 전신 유해 사례(Grade 3 systemic adverse event)(아래 표 B 참조) 경험한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 대상체의 25% 이하가 조성물의 제1 접종 후에 3등급 전신 유해 사례를 경험한다. 일부 측면에서, 대상체의 40% 이하가 조성물의 2차 투여 후 3등급 전신 유해 사례를 경험한다. 일부 측면에서, 실시양태의 조성물을 인간 대상체에게 투여하면 3등급 발열, 두통, 피로, 오한, 근육통, 관절통, 메스꺼움 및/또는 설사을 경험하는 대상체는 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하이다.
요청된(solicited) 국소 이상 반응에 대한 강도 등급*
[표 A]
Figure pct00011
요청된 전신 유해 사례에 대한 강도 등급*
[표 B]
Figure pct00012
*FDA 독성 등급 척도(toxicity grading scale)(미국 Department of Health and Human Services, 식품의약국(FDA). 산업 지침. 예방 백신 임상 시험에 등록한 건강한 성인 및 청소년 자원자를 위한 독성 등급 척도(Guidance for Industry. Toxicity Grading Scale for Healthy Adult and Adolescent Volunteers Enrolled in Preventive Vaccine Clinical Trials_. 2007. 월드 와이드 웹(world wide web): fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Vaccines/ucm091977.pdf, 액세스: 2019년 3월, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨); IV = 정맥 주사(Intravenous).
추가 측면에 따르면, 본 발명은 또한 코로나바이러스로부터 유래된 하나 이상의 펩티드 또는 단백질, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 바람직하게는 하기 단계를 포함한다:
a) 제1 측면의 하나 이상의 핵산 또는 제2 측면의 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계; 및
b) 상기 핵산 또는 조성물을 발현 시스템(세포), 조직, 유기체에 적용하거나 투여하는 단계. 폴리펩티드(본 발명의 핵산에 의해 제공됨)를 발현하기에 적합한 세포는 초파리(Drosophila) S2 곤충 세포주일 수 있다.
발현 방법은 실험실, 연구, 진단, 펩티드 또는 단백질의 상업적 생산 및/또는 치료 목적에 적용될 수 있다. 방법은 또한 특정 질병의 치료, 특히 감염성 질병, 특히 코로나바이러스 감염, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염 및 질병 COVID-19의 치료와 관련하여 수행될 수 있다.
마찬가지로, 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 바람직하게는 진단 또는 치료 목적, 예를 들어, 암호화된 코로나바이러스 항원성 펩티드 또는 단백질의 발현을 위한 핵산, 조성물, 폴리펩티드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트의 용도를 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기 핵산, 폴리펩티드, 조성물, 백신, 조합을 조직 또는 유기체에 적용 또는 투여한 후에는 예를 들어 유도된 코로나바이러스 항체를 얻는 단계, 예를 들어 SARS-CoV-2 코로나바이러스 특이적 (단일클론) 항체 또는 생성된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 단백질 컨스트럭트 (S 단백질)을 얻는 단계가 따라온다.
용도는 (진단) 실험실, 연구, 진단, 펩티드, 단백질 또는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 항체의 상업적 생산 및/또는 치료 목적으로 적용될 수 있다. 용도는 시험관내, 생체내(in vivo) 또는 생체외(ex vivo)에서 수행될 수 있다. 용도는 또한 특정 질병의 치료, 특히 코로나바이러스 감염(예를 들어, COVID-19) 또는 관련 장애의 치료와 관련하여 수행될 수 있다.
추가 측면에 따르면, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 조성물 또는 백신의 제조 방법을 제공한다:
a) 바람직하게는 표 3a 및 3b에 제공된 바와 같은 핵산 서열을 갖는, 캡핑된 mRNA를 수득하기 위해 캡 유사체의 존재 하에 DNA 주형을 사용하는 RNA 시험관내 전사 단계;
b) RP-HPLC, 및/또는 TFF, 및/또는 올리고(dT) 정제 및/또는 AEX, 바람직하게는 RP-HPLC를 사용하여 단계 a)의 획득된 캡핑된 RNA를 정제하는 단계;
c) 단계 b)의 정제된 캡핑된 RNA를 포함하는 제1 액체 조성물을 제공하는 단계;
d) 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 양이온성 지질, 본 명세서에에 정의된 바와 같은 중성 지질, 본 명세서에 정의된 바와 같은 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 및 본 명세서에 정의된 바와 같은 PEG-지질을 포함하는 제2 액체 조성물을 제공하는 단계;
e) 캡핑된 RNA를 포함하는 LNP의 형성을 허용하기 위해 제1 액체 조성물 및 제2 액체 조성물을 하나 이상의 혼합 수단에 도입하는 단계;
f) 캡핑된 RNA를 포함하는 수득된 LNP를 정제하는 단계;
g) 선택적으로, 캡핑된 RNA를 포함하는 정제된 LNP를 동결건조하는 단계.
바람직하게는, 단계 e)의 혼합 수단은 T-피스 커넥터 또는 미세유체 혼합 장치이다. 바람직하게는, 정제 단계 f)는 침전 단계, 투석 단계, 여과 단계, TFF 단계로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 포함한다. 선택적으로, 효소적 폴리아데닐화 단계는 단계 a) 또는 b) 후에 수행될 수 있다. 선택적으로, 추가 정제 단계는 예를 들어 잔류 DNA, 완충액, 작은 RNA 부산물 등을 제거한다. 선택적으로, RNA 시험관내 전사는 cap 유사체 없이 수행되고, 효소적 캡핑 단계는 RNA 시험관 전사 후에 수행된다. 임의로, RNA 시험관내 전사는 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드의 존재 하에 수행된다.
양태들에서, 단계 a, 바람직하게는 단계 a-c, 더욱 바람직하게는 위에서 요약된 모든 단계(a-g)는 RNA 시험관내 전사를 위한 자동화 장치에서 수행된다. 이러한 장치는 또한 조성물 또는 백신을 생산하는 데 사용될 수 있다(2 및 3 측면 참조). 바람직하게는, WO2020/002598에 기재된 장치, 특히 WO2020/002598 (및 도 1-18)의 청구항 1 내지 59 및/또는 68 내지 76에 기재된 장치가 적합하게 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태들/항목들
하기에서, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태(항목 1-275)가 제공된다.
항목 목록:
항목 1. SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터인 또는 이로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 핵산으로서, 여기서 핵산은 적어도 하나의 이종 비번역 영역(UTR)을 포함함.
항목 2. 항목 1에 있어서, 핵산이 백신에 적합한 것인 핵산.
항목 3. 항목 1 또는 2에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 구조 단백질, 부속 단백질 또는 레플리카제 단백질이거나 그로부터 유래된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 4. 항목 3에 있어서, 구조 단백질이 스파이크 단백질(S), 외피 단백질(E), 막 단백질(M) 또는 뉴클레오캡시드 단백질(N), 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체이거나 이로부터 유래된 핵산.
항목 5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 스파이크 단백질(S), 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체이거나 이로부터 유래된 핵산.
항목 6. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 1-111, 274-11663, 13176-13510, 13521-14123, 22732-22758, 22917, 22923, 22929-22964, 26938, 26939 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
항목 7. 항목 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 스파이크 단백질(S)이 스파이크 단백질 단편 S1, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
항목 8. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 1-27, 29, 31-48, 58-111, 274-1345, 1480-1546, 1614-11663, 13377-13510, 13521-14123, 22732, 22737-22758, 22929-22964 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
항목 9. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 27, 1279-1345, 29, 1480-1546, 13243-13309, 22733-22736, 26938, 26939 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
항목 10. 항목 4 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 스파이크 단백질(S)이 스파이크 단백질 단편 S1 또는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체, 및 스파이크 단백질 단편 S2 또는 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
항목 11. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 1-26, 31-48, 58-111, 274-1278, 1614-11663, 13377-13510, 13521-14177, 22732, 22737-22758, 22929-22964 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
항목 12. 항목 4 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 스파이크 단백질(S)이 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이를 포함하는 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)인 핵산.
항목 13. 항목 12에 있어서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이는 K986P 및 V987P의 아미노산 치환을 포함하는 것인 핵산.
항목 14. 항목 12 또는 13에 있어서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이가 공동 충전(cavity filling) 돌연변이를 포함하는 핵산.
항목 15. 항목 14에 있어서, 적어도 하나의 공동 충전 돌연변이가 T887W; A1020W; T887W 및 A1020W; 또는 P1069F을 포함하는 리스트로부터 선택되는 핵산.
항목 16. 항목 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이가 돌연변이된 양성자화 부위를 포함하는 핵산.
항목 17. 항목 16에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이된 양성자화 부위가 H1048Q 및 H1064N; H1083N 및 H1101N; 또는 H1048Q 및 H1064N 및 H1083N 및 H1101N을 포함하는 리스트로부터 선택되는 핵산.
항목 18. 항목 12 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이가 하나 이상의 인공 분자내 이황화 결합을 생성하는 핵산.
항목 19. 항목 18에 있어서, 적어도 하나의 인공 분자내 이황화 결합이 I712C 및 T1077C; I714C 및 Y1110C; P715C 및 P1069C; G889C 및 L1034C; I909C 및 Y1047C; Q965C 및 S1003C; F970C 및 G999C; A972C 및 R995C; A890C 및 V1040C; T874C 및 S1055C, 또는 N914C 및 S1123C인 아미노산 치환에 의해 생성되는 것인 핵산.
항목 20. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 10-26, 40-48, 85-111, 341-1278, 1681-2618, 2686-3623, 3691-4628, 4696-5633, 5701-6638, 6706-7643, 7711-8648, 8716-9653, 9721-10658, 10726-11663, 13377-13510, 13521-14123, 22732, 22738, 22740, 22742, 22744, 22746, 22748, 22750, 22752, 22754, 22756, 22758, 22947-22964 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 21. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 10-26, 341-407, 609-1278, 13521-13587, 22738, 22740, 22742, 22744, 22746, 22748, 22750, 22752, 22754, 22756, 22758, 22947-22964 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 22. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 신호 펩티드, 링커, 헬퍼 에피토프, 항원 클러스터링 요소, 삼량체화 요소, 막횡단 요소, 및/또는 VLP-형성 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 이종성 펩티드 또는 단백질 요소를 추가로 코딩하는 것인 핵산.
항목 23. 항목 22에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종성 펩티드 또는 단백질 요소가 이종 항원-클러스터링 요소, 이종 삼량체화 요소, 및/또는 VLP-형성 서열인 핵산.
항목 24. 항목 22 또는 23에 있어서, 적어도 하나의 이종 항원 클러스터링 요소가 페리틴 요소, 루마진 신타제 요소, B형 간염 바이러스(HBsAg)의 표면 항원, 또는 캡슐린으로부터 선택되는 핵산.
항목 25. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 58-75, 85-102, 3624-5633, 7644-9653, 13588-13721, 13856-13989, 22733, 22735, 22736 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 26. 항목 22 또는 23에 있어서, 적어도 하나의 이종 삼량체화 요소가 폴돈 요소, 바람직하게는 피브리틴 폴돈 요소인 핵산.
항목 27. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 76-84, 103-111, 5634-6638, 9654-10658, 13722-13788, 13990-14056, 22734, 26938, 26939 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 28. 항목 22 또는 23에 있어서, 적어도 하나의 VLP-형성 서열이 우드척 간염 코어 항원 요소(WhcAg)인 핵산.
항목 29. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 6639-7643, 10659-11663, 13789-13855, 14057-14123 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 30. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 1, 10, 21, 22, 25, 27, 274, 341, 408, 475, 542, 743, 810, 1011, 1145, 1212, 1279, 8716, 10726, 22732-22758, 22929-22942, 22947-22964 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 31. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 10, 22960, 22961 또는 22963 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 32. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-13147, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14177, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23184, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937 또는 이들 중 임의의 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 33. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 10, 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 융합전 안정화 K986P 및 V987P 돌연변이를 포함하는 S 단백질인 핵산.
항목 34. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 코돈 변형된 코딩 서열이고, 여기서 적어도 하나의 코돈 변형된 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 바람직하게는 상응하는 야생형 또는 참조 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는 것인 핵산.
항목 5. 항목 34에 있어서, 적어도 하나의 코돈 변형된 코딩 서열이 C 최대화된 코딩 서열, CAI 최대화된 코딩 서열, 인간 코돈 사용(usage)에 적합한 코딩 서열, G/C 함량 변형된 코딩 서열, 및 G/C 최적화된 코딩 서열, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 핵산.
항목 36. 항목 34 또는 35에 있어서, 적어도 하나의 코돈 변형된 코딩 서열이 G/C 최적화된 코딩 서열, 인간 코돈 사용에 적합한 코딩 서열, 또는 G/C 함량 변형된 코딩 서열인 핵산.
항목 37. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 136-138, 140, 141, 148, 149, 152, 155, 156, 159, 162, 163, 166, 169, 170, 173, 11731-11813, 11815, 11817-11966, 12271-12472, 12743-12944, 13514, 13515, 14124-14132, 14142-14150, 14160-14168, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23040, 23077-23148, 23189-23260, 23297-23368, 23409-23480, 23517-23588, 23629-23700, 23737-23808, 23849-23920, 23957-24028, 24069-24140, 24177-24248, 24289-24360, 24397-24468, 24509-24580, 24617-24688, 24729-24800, 24837-24908, 24949-25020, 25057-25128, 25169-25240, 25277-25348, 25389-25460, 25497-25568, 25609-25680, 25717-25788, 25829-25900, 25937-26008, 26049-26120, 26157-26228, 26269-26340, 26377-26448, 26489-26560, 26597-26668, 26709-26780, 26817-26888, 26925-26937 또는 이들 서열의 임의의 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 G/C 최적화된 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 38. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 142, 143, 145, 150, 153, 157, 160, 164, 167, 171, 174, 11967-12033, 12473-12539, 12945-13011 또는 이들 서열의 임의의 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 인간 코돈 사용에 적합한 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 39. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 146, 147, 151, 154, 158, 161, 165, 168, 172, 175, 12034-12050, 12052, 12054-12203, 12540-12675, 13012-13147, 13519, 13520, 14133-14141, 14151-14159, 14169-14177, 23041-23076, 23149-23184, 23261-23296, 23369-23404, 23481-23516, 23589-23624, 23701-23736, 23809-23844, 23921-23956, 24029-24064, 24141-24176, 24249-24284, 24361-24396, 24469-24504, 24581-24616, 24689-24724, 24801-24836, 24909-24944, 25021-25056, 25129-25164, 25241-25276, 25349-25384, 25461-25496, 25569-25604, 25681-25716, 25789-25824, 25901-25936, 26009-26044, 26121-26156, 26229-26264, 26341-26376, 26449-26484, 26561-26596, 26669-26704, 26781-26816, 26889-26924 또는 이들 서열의 임의의 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 G/C 함량 변형된 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 40. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 적어도 약 50%, 55%, 또는 60%, 바람직하게는 약 63.9%의 G/C 함량을 갖는 핵산.
항목 41. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 융합전 안정화 K986P 및 V987P 돌연변이를 포함하는 S 단백질을 코딩하고, 여기서 코딩 서열은 서열 번호 137, 23090, 23091, 23093, 23094 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일한 핵산 서열을 포함하는 G/C 최적화된 코딩 서열을 포함하거나 이로 구성된 것인 핵산.
항목 42. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 이종성 비번역 영역은 적어도 하나의 이종성 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종성 3'-UTR로부터 선택되는 핵산.
항목 43. 항목 42에 있어서, 적어도 하나의 이종성 3'-UTR이 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9, 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 것인 핵산.
항목 44. 항목 42에 있어서, 적어도 하나의 이종성 5'-UTR이 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B 및 UBQLN2, 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 것인 핵산.
항목 45. 항목 42에 있어서, 적어도 하나의 이종성 5'-UTR 및 적어도 하나의 이종성 3' UTR이 UTR 디자인 a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-3 (SLC7A3/PSMB3), e-2 (RPL31/RPS9), 및 i-3 (-/muag)으로부터 선택되고, 여기서 UTR 디자인 a-1 (HSD17B4/PSMB3) 및 i-3 (-/muag)이 특히 바람직한 것인, 핵산.
항목 46. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 적어도 하나의 폴리(A) 서열, 바람직하게는 30 내지 200개의 아데노신 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 폴리(C) 서열, 바람직하게는 10 내지 40개의 시토신 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
항목 47. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 적어도 하나의 히스톤 스템-루프를 포함하는 핵산.
항목 48. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 DNA 또는 RNA인 핵산.
항목 49. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 코딩 RNA인 핵산.
항목 50. 항목 49에 있어서, 코딩 RNA가 mRNA, 자가-복제 RNA, 원형 RNA, 또는 레플리콘 RNA인 핵산.
항목 51. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 바람직하게는 코딩 RNA가 mRNA인 핵산.
항목 52. 항목 51에 있어서, mRNA가 레플리콘 RNA 또는 자가-복제 RNA가 아닌 핵산.
항목 53. 항목 51에 있어서, mRNA가 30 내지 200개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 폴리(A) 서열을 포함하고 3' 말단 뉴클레오티드가 아데노신인 핵산.
항목 54. 항목 48 내지 51 중 어느 하나에 있어서, RNA, 바람직하게는 코딩 RNA가 5'-캡 구조, 바람직하게는 m7G, cap0, cap1, cap2, 변형된 cap0 또는 변형된 cap1 구조, 바람직하게는 5'-cap1 구조를 포함하는 핵산.
항목 55. 항목 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 바람직하게는 mRNA가 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함하는 핵산:
A) 5'-cap1 구조;
B) 서열 번호: 137, 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코딩 서열;
C) 알파-글로빈 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 267 또는 268에 따른 3'-UTR;
D) 약 64개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열;
E) 약 30개의 C 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(C) 서열;
F) 서열 번호: 178 또는 179에 따른 히스톤 스템-루프.
항목 56. 항목 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함하는 핵산:
A) 5'-cap1 구조;
B) HSD17B4 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 5'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 231 또는 232에 따른 5'-UTR;
C) 서열 번호: 137, 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코딩 서열;
D) PSMB3 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 253 또는 254에 따른 3'-UTR;
E) 서열 번호: 178 또는 179로부터 선택된 히스톤 스템-루프;
F) 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열.
항목 57. 항목 56에 있어서, 3' 말단 뉴클레오티드가 아데노신인 핵산.
항목 58. 항목 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 바람직하게는 mRNA가 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함하는 핵산:
A) 5'-cap1 구조;
B) 서열 번호: 23090 또는 23091, 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코딩 서열;
C) 알파-글로빈 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 267 또는 268에 따른 3'-UTR;
D) 약 64개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열;
E) 약 30개의 C 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(C) 서열;
F) 서열 번호: 178 또는 179에 따른 히스톤 스템-루프.
항목 59. 항목 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 바람직하게는 mRNA가 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함하는 핵산:
A) 5'-cap1 구조;
B) HSD17B4 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 5'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 231 또는 232에 따른 5'-UTR;
C) 서열 번호: 23090 또는 23091, 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코딩 서열;
D) PSMB3 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 253 또는 254에 따른 3'-UTR;
E) 서열 번호: 178 또는 179로부터 선택된 히스톤 스템-루프;
F) 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열.
항목 60. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937148 또는 이들 서열 중 어느 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 61. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 149, 156, 12338, 150, 157, 151, 158, 12541, 163, 170, 12810, 164, 171, 165, 172, 13013, 12342-12351, 12545-12554, 12814-12823, 13017-13026, 14133 또는 이들 서열 중 어느 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 서열 번호: 149, 150, 151, 163, 164, 165 또는 이들 서열 중 어느 것의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 62. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 163 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 63. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 149 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 64. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 24837 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 65. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 23311, 23531, 24851 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 66. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 23310, 23530, 24850 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 67. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 23313, 23533, 24853, 23314, 23534, 24854 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
항목 68. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 1-메틸슈도우리딘 치환을 포함하지 않는 RNA인 핵산.
항목 69. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는 RNA인 핵산.
항목 70. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 시험관내 전사된 RNA이고, 여기서 RNA 시험관내 전사는 서열 최적화된 뉴클레오티드 혼합물 및 캡 유사체의 존재 하에 수행되며, 바람직하게는 여기서 서열 최적화된 뉴클레오티드 혼합물은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는 핵산.
항목 71. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 정제된 RNA, 바람직하게는 RP-HPLC 및/또는 TFF에 의해 정제된 RNA인 핵산.
항목 72. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RP-HPLC 및/또는 TFF에 의해 정제되고, RP-HPLC 및/또는 TFF로 정제되지 않은 RNA 대비 약 5%, 10% 또는 20% 미만의 이중 가닥 RNA 부산물을 포함하는 핵산.
항목 73. 앞선 항목들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RP-HPLC 및/또는 TFF에 의해 정제되고, Oligo dT 정제, 침전, 여과 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피로 정제된 RNA 대비 약 5%, 10% 또는 20% 미만의 이중 가닥 RNA 부산물을 포함하는 핵산.
항목 74. 항목 1 내지 73 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 조성물.
항목 75. 항목 74에 있어서, 조성물이 서열 번호: 149,163, 24837, 23311, 23531, 23310, 23530, 23313 또는 23533, 또는 이들 서열의 어느 것의 단편 또는 변이체에 따른 mRNA를 포함하는 조성물.
항목 76. 항목 74에 있어서, 조성물은 항목 1 내지 73 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 핵산을 복수 또는 적어도 하나 초과 포함하는 다가 조성물인 조성물.
항목 77. 항목 76에 있어서, 다가 조성물의 복수 또는 적어도 하나 초과 핵산 서열은 각각 상이한 스파이크 단백질, 바람직하게는 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 코딩하는 것인 조성물.
항목 78. 항목 77에 있어서, 상이한 스파이크 단백질 또는 융합전 안정화된 스파이크 단백질이 상이한 SARS-CoV-2 바이러스 변이체/분리주로부터 유래된 것인, 조성물.
항목 79. 항목 78의 조성물에 있어서, 상이한 스파이크 단백질 또는 융합전 안정화된 스파이크 단백질은 적어도 B.1.1.7, B.1.351, P.1, 또는 CAL.20C로부터 유래된 것인 조성물.
항목 80. 항목 78에 있어서, 상이한 스파이크 단백질 또는 융합전 안정화된 스파이크 단백질이 다음을 포함하는 S 단백질의 아미노산 변화를 가지는 것인 조성물:
(i) delH69, delV70, Y453F, D614G, I692V 및 M1229I;
(ii) delH69, delV70, delY144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A 및 D1118H;
(iii) L18F, D80A, D215G, delL242, delA243, delL244, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G 및 A701V;
(iv) L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y and T1027I; 및/또는
(v) S13I, W152C, L452R, 및 D614G.
항목 81. 항목 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 다가 조성물은 서열 번호: 10, 22961; 22960, 22963, 22941, 22964 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 적어도 두 개의 핵산 종을 포함하는 것인 조성물.
항목 82. 항목 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 다가 조성물은 서열 번호: 149 또는 24837, 23531 또는 24851, 23530 또는 24850, 23533 또는 24853, 23439 또는 24759 또는 23534 또는 24854 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 적어도 두 개의 핵산 종을 포함하는 것인 조성물.
항목 83. 항목 74 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 70% 이상의 RNA 완전성(integrity)을 갖는 mRNA를 포함하는 조성물.
항목 84. 항목 74 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 캡핑 정도가 70% 이상인 mRNA를 포함하고, 바람직하게는 mRNA 종의 적어도 70%, 80%, 또는 90%가 Cap1 구조를 포함하는 조성물.
항목 85. 항목 74 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 핵산은 하나 이상의 양이온성 또는 다가양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 또는 다가양이온성 중합체, 양이온성 또는 다중양이온성 다당, 양이온성 또는 다중양이온성 지질, 양이온성 또는 다중양이온성 단백질, 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합과 복합체화 또는 회합(associated)되거나 또는 적어도 부분적으로 복합체화 또는 회합되는 것인 조성물.
항목 86. 항목 85에 있어서, 적어도 하나의 핵산이 하나 이상의 지질 또는 지질계 담체와 복합체를 형성하거나 회합되어, 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜을 형성하고, 바람직하게는 적어도 하나의 핵산을 캡슐화하는 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜을 형성하는 조성물.
항목 87. 항목 85 또는 86에 있어서, 적어도 하나의 핵산이 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자를 형성하는 것인 조성물.
항목 88. 항목 86 또는 87에 있어서, LNP가 화학식 III-3에 따른 양이온성 지질을 포함하는, 조성물:
Figure pct00013
(III-3).
항목 89. 항목 86 내지 88 중 어느 한 항목에 있어서, LNP가 하기 화학식 (IVa)의 PEG 지질을 포함하는 조성물:
Figure pct00014
(IVa),
여기서 n은 30 내지 60 범위의 평균값을 갖고, 바람직하게는 n은 약 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54의 평균값을 가지며, 가장 바람직하게는 n은 49 또는 45의 평균값을 가짐.
항목 90. 항목 86 내지 88 중 어느 하나에 있어서, LNP가 하기 화학식 IVa의 PEG 지질을 포함하는 조성물:
Figure pct00015
(IVa),
여기서 n은 PEG 지질의 평균 분자량이 약 2500g/mol이 되도록 선택된 정수임.
항목 91. 항목 86 내지 90 중 어느 하나에 있어서, LNP가 하나 이상의 중성 지질 및/또는 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 포함하는 조성물.
항목 92. 항목 91에 있어서, 중성 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이고, 바람직하게는 양이온성 지질 대 DSPC의 몰비가 약 2:1 내지 약 8:1인, 조성물.
항목 93. 항목 91에 있어서, 스테로이드가 콜레스테롤이고, 바람직하게는 양이온성 지질 대 콜레스테롤의 몰비가 약 2:1 내지 약 1:1 범위인 조성물.
항목 94. 항목 86 내지 93 중 어느 하나에 있어서, LNP는
(i) 적어도 하나의 양이온성 지질, 바람직하게는 화학식 III의 지질, 더욱 바람직하게는 지질 III-3;
(ii) 적어도 하나의 중성 지질, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
(iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 콜레스테롤; 및
(iv) 적어도 하나의 중합체 접합 지질, 바람직하게는 화학식 IVa로부터 유도된 PEG-지질(n = 49)를 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는 것인, 조성물.
항목 95. 항목 86 내지 93 중 어느 하나에 있어서, LNP는
(i) 하나 이상의 양이온성 지질, 바람직하게는 화학식 III의 지질, 더욱 바람직하게는 지질 III-3;
(ii) 적어도 하나의 중성 지질, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
(iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 콜레스테롤; 및
(iv) 적어도 하나의 중합체 접합 지질, 바람직하게는 화학식 IVa로부터 유도된 PEG-지질 (n = 45)을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는 것인, 조성물.
항목 96. 항목 94 또는 95에 있어서, (i) 대 (iv)는 약 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 더욱 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비로 존재하는 조성물.
항목 97. 항목 87 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 RNA이고 조성물은 약 20% 미만의 유리(복합화되지 않은 또는 캡슐화되지 않은) RNA, 바람직하게는 약 15% 미만의 유리 RNA, 더 바람직하게는 약 10% 미만의 유리 RNA를 포함하는 것인 조성물.
항목 98. 항목 87 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 지질 대 핵산의 중량/중량 비는 약 10:1 내지 약 60:1, 바람직하게는 약 20:1 내지 약 30:1, 예를 들어, 약 25:1인 조성물.
항목 99. 항목 87 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 핵산을 캡슐화하는 LNP의 n/p 비율은 약 1 내지 약 10의 범위, 바람직하게는 약 5 내지 약 7의 범위, 보다 바람직하게는 약 6인 조성물.
항목 100. 항목 87 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 약 0.4 미만, 바람직하게는 약 0.3 미만, 보다 바람직하게는 약 0.2 미만, 가장 바람직하게는 약 0.1 미만의 다분산 지수(polydispersity index (PDI)) 값을 갖는 것인 조성물.
항목 101. 항목 86 내지 100 중 어느 하나에 있어서, LNP는 약 60nm 내지 약 120nm, 바람직하게는 약 120nm 미만, 보다 바람직하게는 약 100nm 미만, 가장 바람직하게는 약 80nm 미만 범위의 Z-평균 크기를 갖는 조성물.
항목 102. 항목 86 내지 101 중 어느 하나에 있어서, LNP는 입자 크기가 약 500nm를 초과하는 LNP가 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만인 것인 조성물.
항목 103. 항목 86 내지 102 중 어느 하나에 있어서, LNP는 입자 크기가 약 20nm보다 작은 LNP가 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만 포함되는 것인 조성물.
항목 104. 항목 86 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 지질계 담체의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%가 구형 형태를 갖고, 바람직하게는 고체 코어 또는 부분적 고체 코어를 포함하는 조성물.
항목 105. 항목 86 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 약 150 FNU 내지 약 0.0 FNU, 바람직하게는 약 50 FNU 이하, 보다 바람직하게는 약 25 FNU 이하 범위의 탁도를 갖는 조성물.
항목 106. 항목 74 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 약 50 내지 약 300mM 농도의 당, 바람직하게는 약 150mM 농도의 수크로스를 추가로 포함하는, 조성물.
항목 107. 항목 74 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 약 10mM 내지 약 200mM 농도의 염, 바람직하게는 약 75mM 농도의 NaCl을 추가로 포함하는, 조성물.
항목 108. 항목 74 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 1mM 내지 약 100mM 농도의 완충제, 바람직하게는 약 10mM 농도의 Na3PO4를 추가로 포함하는, 조성물.
항목 109. 항목 74 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0, 바람직하게는 약 pH 7.4의 pH를 갖는 조성물.
항목 110. 항목 86 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 융합전 안정화 K986P 및 V987P 돌연변이를 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질을 코딩하는 RNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하며,
여기에서 LNP는
(i) 화학식 III-3의 양이온성 지질;
(ii) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa의 PEG-지질(n=49))을 포함하고,
여기에서 (i) 대 (iv)는 약 47.4% 양이온성 지질, 10% DSPC, 40.9 콜레스테롤, 1.7% PEG-지질의 몰비이고;
여기서 RNA는 서열 번호: 163 또는 149의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하며;
여기서 RNA는 화학적으로 변형되지 않고;
여기서 RNA는 5'-Cap1 구조를 포함하고;
여기서 RNA의 완전성(integrity)은 적어도 약 70%이고;
여기서 RNA를 캡슐화하는 LNP의 n/p 비는 약 6이고;
여기서 RNA를 캡슐화하는 LNP는 약 60nm 내지 약 120nm의 Z-평균 크기를 가지며;
상기 조성물은 약 20% 미만의 유리(비복합체; 비캡슐화) RNA를 포함하고;
임의로, 여기서 조성물은 약 150mM 농도의 수크로스, 약 75mM 농도의 NaCl, 약 10mM 농도의 Na3PO4를 추가로 포함하고;
임의로, 여기서 조성물은 약 pH 7.4의 pH를 갖는, 조성물.
항목 111. 항목 86 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 융합전 안정화 K986P 및 V987P 돌연변이를 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질을 코딩하는 RNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하며,
여기서 LNP는
(i) 화학식 III-3의 양이온성 지질;
(ii) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa의 PEG-지질(n=45))을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 47.4% 양이온성 지질, 10% DSPC, 40.9 콜레스테롤, 1.7% PEG-지질의 몰비이고;
여기서 RNA는 서열 번호: 163 또는 149와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하고;
여기서 RNA는 화학적으로 변형되지 않고;
여기서 RNA는 5'-Cap1 구조를 포함하고;
여기서 RNA의 완전성은 적어도 약 70%이고;
여기서 RNA를 캡슐화하는 LNP의 n/p 비는 약 6이고;
여기서 RNA를 캡슐화하는 LNP는 약 60nm 내지 약 120nm의 Z-평균 크기를 가지며;
여기서 조성물은 약 20% 미만의 유리(비복합체) RNA를 포함하고;
임의로, 여기서 조성물은 약 150mM 농도의 수크로스, 약 75mM 농도의 NaCl, 약 10mM 농도의 Na3PO4를 추가로 포함하고;
임의로, 여기서 조성물은 약 pH 7.4의 pH를 갖는, 조성물.
항목 112. 항목 86 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 지질 나노입자(LNP)로 제형화된, 화학적으로 변형되지 않은 RNA를 포함하고, RNA는 서열 번호: 163의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하며, LNP는 약 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 보다 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7의 비율(몰%)의 양이온성 지질 III-3, DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 (IVa) PEG-지질의 몰 비율을 갖는, 조성물.
항목 113. 항목 86 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 지질 나노입자(LNP)로 제형화된, 화학적으로 변형되지 않은 RNA를 포함하고, RNA는 서열 번호: 149의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하며, LNP는 약 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 보다 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7의 비율(몰%)의 양이온성 지질 III-3, DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 (IVa) PEG-지질의 몰 비율을 갖는, 조성물.
항목 114. 항목 74 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 하나 이상의 융합전 안정화 돌연변이를 포함하는 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)인 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(S)을 코딩하는 mRNA를 포함하는 조성물.
항목 115. 항목 114에 있어서, mRNA가 서열 번호: 163과 적어도 95% 동일한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 코딩하거나 서열 번호: 163과 동일한 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는, 조성물.
항목 116. 항목 114에 있어서, LNP가
(i) 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) 적어도 하나의 중성 지질;
(iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체; 및
(iv) 적어도 하나의 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는, 조성물.
항목 117. 항목 114에 있어서, LNP가
(i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) DSPC;
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는, 조성물.
항목 118. 항목 114에 있어서, LNP가
(i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) DSPC;
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 47.5:10:40.8:1.7의 몰비인, 조성물.
항목 119. 항목 114에 있어서, LNP가
(i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) DSPC;
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비인, 조성물.
항목 120. 항목 107 내지 118 중 어느 하나에 있어서, mRNA 대 총 지질의 비율이 약 0.03 내지 0.04 w/w인, 조성물.
항목 121. 항목 120에 있어서, mRNA가 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP가
(i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) DSPC;
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 47.5:10:40.8:1.7의 몰비이고,
여기서 mRNA 대 총 지질(mRNA to total lipid)의 비율은 약 0.03 내지 0.04 w/w인, 조성물.
항목 122. 항목 120에 있어서, mRNA가 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP가
(i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) DSPC;
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비이고,
여기서 mRNA 대 총 지질의 비율은 약 0.03 내지 0.04 w/w인 조성물.
항목 123. 항목 74-99 또는 110-122 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 동결건조된 조성물인, 조성물.
항목 124. 항목 123에 있어서, 동결건조된 조성물이 약 10% 미만의 수분 함량을 갖는, 조성물.
항목 125. 항목 124에 있어서, 동결건조된 조성물이 약 0.5% 내지 5%의 수분 함량을 갖는, 조성물.
항목 126. 항목 86 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고 조성물이, 조성물이 약 5℃의 온도에서 액체로서 저장 후 적어도 약 2주 동안 안정한 조성물.
항목 127. 항목 126에 있어서, 핵산이 RNA이고, 조성물이 약 5℃의 온도에서 액체로서 저장 후 적어도 1개월 동안 안정한 조성물.
항목 128. 항목 126에 있어서, 핵산은 RNA이고, 조성물이 약 5℃의 온도에서 액체로서 저장 후 약 2주 내지 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년 동안 안정한 조성물.
항목 129. 항목 126에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 약 5℃의 온도에서 액체로서 적어도 약 2주 동안 저장 후 온전한(intact) 것인 조성물.
항목 130. 항목 129에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 약 5℃의 온도에서 액체로 적어도 1개월 저장 후에 온전한 조성물.
항목 131. 항목 126에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 약 5℃의 온도에서 액체로 약 2주 내지 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년 저장 후 온전한 조성물.
항목 132. 항목 126에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 적어도 80%가 약 5℃의 온도에서 액체로서 약 2주 저장 후에 온전한 조성물.
항목 133. 항목 86 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 응집 감소 지질을 포함하는 조성물.
항목 134. 항목 86 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 농도가 약 10㎍/ml 내지 약 10mg/ml 범위, 바람직하게는 약 100㎍/ml 내지 약 1 mg/ml 범위인 조성물.
항목 135. 항목 86 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 농도가 적어도 100㎍/ml, 보다 바람직하게는 적어도 200㎍/ml, 가장 바람직하게는 적어도 500㎍/ml인 조성물.
항목 136. 항목 86 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA가 적어도 약 50% 이상, 바람직하게는 적어도 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 약 80% 이상의 RNA 완전성을 갖는 조성물.
항목 137. 항목 86 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 조성물이 약 20% 미만의 유리 RNA, 바람직하게는 약 15% 미만의 유리 RNA, 더 바람직하게는 약 10% 미만의 유리 RNA를 포함하는 조성물.
항목 138. 항목 86 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 조성물이 g RNA당 약 100nM 미만의 2가 양이온, 바람직하게는 g RNA당 약 50nM 미만의 2가 양이온, 더 바람직하게는 g RNA당 약 10nM 미만의 2가 양이온을 포함하는 조성물.
항목 139. 항목 138에 있어서, 2가 양이온이 Mg2+ 및/또는 Ca2+로부터 선택되는 조성물.
항목 140. 항목 86 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 지질의 농도가 약 250㎍/ml 내지 약 250mg/ml 범위, 바람직하게는 약 2.5mg/ml 내지 약 25mg/ml 범위인, 조성물.
항목 141. 항목 86 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 지질의 농도는 적어도 약 2.5mg/ml, 바람직하게는 적어도 5mg/ml, 더 바람직하게는 적어도 12.5mg/ml인 조성물.
항목 142. 항목 133 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 응집 감소 지질의 농도가 약 17.5㎍/ml 내지 약 17.5mg/ml 범위, 바람직하게는 약 175㎍/ml 내지 약 1.75 mg/ml 범위인 조성물.
항목 143. 항목 133 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 응집 감소 지질의 농도가 적어도 약 175㎍/ml, 바람직하게는 적어도 약 350㎍/ml, 보다 바람직하게는 적어도 875㎍/ml인, 조성물.
항목 144. 항목 86 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 지질 대 RNA의 wt/wt 비가 약 10:1 내지 약 60:1, 바람직하게는 약 20:1 내지 약 30:1, 보다 바람직하게는 약 25:1인 조성물.
항목 145. 항목 86 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 지질계 담체 대 RNA(the lipid-based carriers to the RNA)의 N/P 비율이 약 1 내지 약 10 범위, 바람직하게는 약 5 내지 약 7 범위, 보다 바람직하게는 약 6인 조성물.
항목 146. 항목 86 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA를 캡슐화하는 지질계 담체가 응집 감소 지질을 약 0.5%-15%의 몰비, 바람직하게는 약 1.0% 내지 약 2.5% 몰비, 보다 바람직하게는 약 1.7%의 몰비로 포함하는 조성물.
항목 147. 항목 133 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 응집 감소 지질은 폴리머 접합 지질, 예를 들어, PEG-결합 지질인 것인 조성물.
항목 148. 항목 86 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA 및 RNA를 캡슐화하는 지질계 담체가 적어도 하나의 정제 단계, 바람직하게는 적어도 하나의 단계의 TFF 및/또는 적어도 하나의 단계의 정화(clarification) 단계 및/또는 적어도 하나의 여과 단계로 정제된 것인 조성물.
항목 149. 항목 86 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 약 500ppM 미만의 에탄올, 바람직하게는 약 50ppM 미만의 에탄올, 더 바람직하게는 약 5ppM 미만의 에탄올을 포함하는 조성물.
항목 150. 항목 86 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 조성물의 삼투압 농도가 약 250 mOsmol/kg 내지 약 450 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 335 mOsmol/kg인 조성물.
항목 151. 항목 86 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 약 25 ℃의 액체로 저장 시 적어도 1주, 바람직하게는 적어도 2주, 보다 바람직하게는 적어도 3주, 가장 바람직하게는 적어도 4주 동안 안정한 조성물.
항목 152. 항목 86 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 약 40 ℃의 액체로 저장 시 적어도 1일, 바람직하게는 적어도 2일, 더욱 바람직하게는 적어도 3일, 가장 바람직하게는 적어도 4일 동안 안정한 조성물.
항목 153. 항목 86 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 액체로서 저장 시, RNA의 완전성은 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만으로 감소하는 것인 조성물.
항목 154. 항목 86 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 액체로서 저장 시, 유리 RNA의 양이 10% 초과, 바람직하게는 5% 초과만큼 증가하지 않는 것인 조성물.
항목 155. 항목 86 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 액체로서 저장 시 RNA를 캡슐화하는 지질계 담체의 PDI 값이 약 0.2의 값보다 증가하지 않는, 바람직하게는 약 0.1 이하의 값인 조성물.
항목 156. 항목 86 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 액체로서 저장 시 RNA를 캡슐화하는 지질계 담체의 Z-평균 크기가 20% 이상 증가하지 않는, 바람직하게는 10% 이하인 조성물.
항목 157. 항목 86 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 액체로서 저장 시 조성물의 탁도가 20% 이상 증가하지 않는, 바람직하게는 10% 이하인 조성물.
항목 158. 항목 86 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 액체로서 저장 시, pH 및/또는 삼투압 농도는 20% 이상 증가하거나 감소하지 않는, 바람직하게는 10% 이하만큼 증가하거나 감소하지 않는 것인 조성물.
항목 159. 항목 86 내지 158 중 어느 하나에 있어서, 액체로서 저장시, 조성물의 효능은 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만으로 감소하는 조성물.
항목 160. 항목 86 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA가 정제된 RNA, 바람직하게는 RP-HPLC 정제된 RNA 및/또는 접선 유동 여과(TFF) 정제된 RNA인 조성물.
항목 161. 항목 74 내지 160 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게는 TLR7 수용체 및/또는 TLR8 수용체의 적어도 하나의 길항제를 추가로 포함하는, 조성물.
항목 162. 항목 161에 있어서, TLR7 수용체 및/또는 TLR8 수용체의 적어도 하나의 길항제가 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 p5'-GAG CGmG CCA-3'인 조성물.
항목 163. 코로나바이러스 SARS-CoV-2, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체이거나 이로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 포함하는 백신용 폴리펩티드로서, 바람직하게는 상기 항원성 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 1-111, 274-11663, 13176-13510, 13521-14123, 22732-22758, 22917, 22923, 22929-22964, 26938, 26939, 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것인, 펠리펩티드.
항목 164. 항목 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 및/또는 항목 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 및/또는 항목 163의 폴리펩티드를 포함하는 백신.
항목 165. 항목 164에 있어서, 백신이 적응 면역 반응, 바람직하게는 코로나바이러스, 바람직하게는 코로나바이러스 SARS-CoV-2에 대한 보호 적응 면역 반응을 유도하는 백신.
항목 166. 항목 164 또는 165에 있어서, 백신이 항목 1 내지 73 중 어느 하나에 정의된 핵산 중 복수 또는 적어도 하나 초과, 또는 항목 74 내지 162 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 조성물 중 복수 또는 적어도 하나 초과를 포함하는 다가 백신인 백신.
항목 167. 항목 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 및/또는 항목 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 및/또는 항목 163의 폴리펩티드, 및/또는 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클을 포함하는 항목 164 내지 166의 백신, 및 선택적으로 성분의 투여 및 투여량에 대한 정보를 제공하는 기술 설명서를 포함하는 키트 또는 부품 키트(kit of parts).
항목 168. 의약품으로 용도를 위한, 항목 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 항목 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 항목 163의 폴리펩티드, 항목 164 내지 166의 백신, 항목 167의 키트 또는 부품 키트.
항목 169. 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 의한 감염, 또는 이러한 감염, 바람직하게는 COVID-19와 관련된 장애의 치료 또는 예방용 항목 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 항목 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 항목 163의 폴리펩티드, 항목 164 내지 166의 백신, 항목 167의 키트 또는 부품 키트.
항목 170. 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 항목 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 항목 163의 폴리펩티드, 항목 164 내지 166의 백신 및/또는 항목 167의 키트 또는 부품 키트를 이를 필요로 하는 대상체에게 적용 또는 투여하는 것을 포함하는 방법.
항목 171. 항목 170에 있어서, 장애가 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염이거나, 또는 이러한 감염과 관련된 장애, 바람직하게는 COVID-19인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
항목 172. 항목 170 또는 171에 있어서, 필요로 하는 대상체는 포유동물 대상체, 바람직하게는 인간 대상체인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
항목 173. 항목 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체는 노인 인간 대상체, 바람직하게는 적어도 50, 60, 65, 또는 70세의 연령인 인간 대상체인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
항목 174. 항목 173에 있어서, 인간 대상체가 61세 이상인 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
항목 175. 항목 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체가 18 내지 60세인 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
항목 176. 항목 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 임신 중인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
항목 177. 항목 170 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 조성물의 첫 번째 용량 후 등급 3 전신 유해 사례를 경험하는 대상체가 25% 이하이거나, 조성물의 첫 번째 용량 후 등급 2 또는 더 높은 등급의 국소 유해 사례를 경험하는 대상체가 30% 이하인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
항목 178. 항목 170 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 조성물의 두 번째 용량 후 등급 3 전신 유해 사례를 경험하는 대상체가 40% 이하인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
항목 179. 항목 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체는 신생아 또는 유아, 바람직하게는 3세 이하, 2세 이하, 1.5세 이하, 1세(12개월) 이하, 9개월, 6개월 또는 3개월 이하, 또는 6개월에서 2세 사이의 연령인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
항목 180. 항목 170에 있어서, 대상체의 질병 부담을 줄이는 방법으로 추가로 정의되는 방법.
항목 181. 항목 180에 있어서, 방법이 COVID-19 질병의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 방법.
항목 182. 항목 181에 있어서, 방법은 대상체가 병원 입원, 중환자실 입원, 보충 산소 치료 및/또는 인공호흡기를 사용한 치료를 필요로 할 확률을 감소시키는 방법.
항목 183. 항목 181에 있어서, 방법은 대상체가 중증 또는 중등도의 COVID-19 질병에 걸릴 확률을 감소시키는 방법.
항목 184. 항목 181에 있어서, 방법이 대상체에서 적어도 약 6개월 동안 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
항목 185. 항목 184에 있어서, 대상체가 서열 번호: 1과 비교하여 S 단백질에서 적어도 첫 번째 아미노산 변화를 갖는 SARS CoV-2 변이체에 노출될 때 대상체에서 심각한 COVID-19 질병을 예방하는 것인 방법.
항목 186. 항목 185에 있어서, SARS CoV-2 변이체가 다음을 포함하는 S 단백질에서 아미노산 변화를 갖는 방법:
(i) delH69, delV70, Y453F, D614G, I692V 및 M1229I;
(ii) delH69, delV70, delY144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A 및 D1118H;
(iii) L18F, D80A, D215G, delL242, delA243, delL244, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G 및 A701V;
(iv) L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y and T1027I; 및/또는
(v) S13I, W152C, L452R, 및 D614G.
항목 187. 항목 181에 있어서, 방법은 대상체가 열, 호흡 곤란; 후각 상실 및/또는 미각 상실을 겪을 확률을 감소시키는 것인 방법.
항목 188. 항목 181에 있어서, 방법은 대상체가 열, 호흡 곤란; 후각 상실 및/또는 미각 상실을 겪을 확률을 감소시키는 것인 방법.
항목 189. 항목 170에 있어서, 대상체는 질병이 있거나 면역이 손상된 것인 방법.
항목 190. 항목 189에 있어서, 대상체가 간 질환, 신장 질환 당뇨병, 고혈압, 심장 질환, 폐 질환, 암을 갖거나 HIV 양성인 방법.
항목 191. 항목 170에 있어서, 대상체가 지난 6개월 동안 14일 초과 동안 면역억제제로 치료되지 않은 방법.
항목 192. 항목 170에 있어서, 대상체가 투여 전 적어도 28일 동안 생백신을 받지 않았거나 및/또는 투여 전 적어도 14일 동안 불활성화 백신을 받지 않은 것인 방법.
항목 193. 항목 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 바람직하게는 mRNA를 포함하는 적어도 제1 조성물, 항목 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 항목 163의 폴리펩티드, 항목 164 내지 166의 백신, 및/또는 항목 167의 키트 또는 부품 키트를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
항목 194. 항목 193에 있어서, 대상체는 이전에 SARS CoV-2에 감염되었던 것인 방법.
항목 195. 항목 193에 있어서, 대상체가 적어도 제1 SARS CoV-2 백신 조성물로 이전에 치료된 것인 방법.
항목 196. 항목 195에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 mRNA 백신인 방법.
항목 197. 항목 196에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 BNT162 또는 mRNA-1273인 방법.
항목 198. 항목 195에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 단백질 서브유닛 백신인 방법.
항목 199. 항목 198에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 NVX-CoV2373 또는 COVAX인 방법.
항목 200. 항목 195에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 아데노바이러스 벡터 백신인 방법.
항목 201. 항목 200에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 ADZ1222 또는 Ad26.COV-2.S인 방법.
항목 202. 항목 193 내지 201 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 검출가능한 SARS CoV-2 결합 항체를 갖는 것인 방법.
항목 203. 항목 202에 있어서, 대상체가 검출가능한 SARS CoV-2 S 단백질-결합 항체를 갖는 것인 방법.
항목 204. 항목 202에 있어서, 대상체가 검출가능한 SARS CoV-2 N 단백질-결합 항체를 갖는 것인 방법.
항목 205. 항목 195 내지 201 중 어느 하나에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 환자에게 적어도 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 전에 투여된 방법.
항목 206. 항목 195 내지 201 중 어느 하나에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 약 3개월 내지 2년 전 또는 약 6개월 내지 2년 전에 환자에게 투여된 것인 방법.
항목 207. 항목 193 내지 206 중 어느 하나에 있어서, 방법이 치료 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
항목 208. 항목 207에 있어서, 방법은 상기 투여 후 약 2주 내지 약 1년에서 치료 대상의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
항목 209. 항목 207에 있어서, 방법은 치료 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 투여 후 약 2주 내지 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 동안 예방하는 방법.
항목 210. 항목 193 내지 209 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체의 SARS CoV-2 감염 및/또는 대상체로부터의 SARS CoV-2 전파를 치료 대상체의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 예방하는 방법.
항목 211. 항목 210에 있어서, 대상체의 SARS CoV-2 감염 및/또는 대상체로부터의 SARS CoV-2 전파를 투여 후 약 2주 내지 약 1년 사이에 치료 대상체에서 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 예방하는 방법.
항목 212. 항목 211에 있어서, 방법은 대상체의 SARS CoV-2 감염 및/또는 대상체로부터의 SARS CoV-2 전파를 투여 후 약 2주 내지 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 사이에 치료 대상체의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 예방하는 방법.
항목 213. 항목 193 내지 212 중 어느 하나에 있어서, 적어도 제2 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 제2 조성물은 항목 1 내지 61 중 어느 하나의 핵산, 바람직하게는 mRNA, 항목 74 내지 128 중 어느 하나의 조성물, 항목 163의 폴리펩티드, 항목 164 내지 166의 백신, 및/또는 항목 167의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 것인, 방법.
항목 214. 항목 213에 있어서, 제2 조성물이 상기 제1 조성물 후 적어도 약 7일에 투여되는 방법.
항목 215. 항목 214에 있어서, 제2 조성물이 상기 제1 조성물 후 적어도 약 10일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일 또는 56일 후에 투여되는 방법.
항목 216. 항목 213에 있어서, 제2 조성물이 상기 제1 조성물 후 약 7일 내지 약 56일 사이에 투여되는 방법.
항목 217. 항목 216에 있어서, 제2 조성물이 상기 제1 조성물 후 약 14일 내지 약 56일; 약 21일 내지 약 56일; 또는 약 28일 내지 약 56일 사이에 투여되는 것인 방법.
항목 218. 항목 193 내지 212 중 어느 한 항목에 있어서, 적어도 제3 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 제3 조성물은 항목 1 내지 61 중 어느 하나의 핵산, 항목 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 항목 163의 폴리펩티드, 항목 164 내지 166의 백신, 및/또는 항목 167의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 것인 방법.
항목 219. 항목 213 내지 218 중 어느 하나에 있어서, 방법이 치료 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
항목 220. 항목 219에 있어서, 방법은 제2 또는 후속 조성물을 투여한 후 약 2주 내지 약 1년 사이에 치료 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
항목 221. 항목 219에 있어서, 방법은 후속 조성물을 투여한 후 약 2주 내지 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 동안 치료 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
항목 222. 항목 193 내지 221 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 항체, CD4+ T 세포 반응 또는 CD8+ T 세포 반응을 자극하는 방법으로 추가로 정의되는 방법.
항목 223. 항목 193 내지 221 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 중화 항체 반응을 자극하는 방법으로 추가로 정의되는 방법.
항목 224. 항목 193 내지 221 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체의 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 10 내지 약 500개의 코로나바이러스 스파이크 단백질-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
항목 225. 항목 224에 있어서, 방법은 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 200개 이하의 스파이크 단백질 결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
항목 226. 항목 224에 있어서, 방법은 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 10 내지 약 300; 약 20 내지 약 300; 약 20 내지 약 200; 또는 약 30개 내지 약 100개 코로나바이러스 스파이크 단백질-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
항목 227. 항목 226에 있어서, 방법은 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 30 내지 약 80개의 코로나바이러스 스파이크 단백질 결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
항목 228. 항목 223에 있어서, 방법은 대상체의 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 1 내지 약 500개의 코로나바이러스 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
항목 229. 항목 228에 있어서, 방법이 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 50개 이하의 스파이크 단백질 RBD-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
항목 230. 항목 228에 있어서, 방법이 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 1 내지 약 200; 약 2 내지 약 100; 약 3 내지 약 200; 약 5 내지 약 100; 또는 약 5 내지 약 50개의 스파이크 단백질 RBD-결합 항체을 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
항목 231. 항목 230에 있어서, 방법은 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 5 내지 약 20개의 코로나바이러스 스파이크 단백질 RBD-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
항목 232. 항목 222에 있어서, 대상체가 SARS-CoV-2에 이전에 감염된 적이 있는 방법.
항목 233. 항목 222에 있어서, 대상체에서 보호 면역 반응을 자극하는 방법으로 추가로 정의되는 방법.
항목 234. 항목 193 내지 233 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
항목 235. 항목 234에 있어서, 대상체가 6개월 내지 100세, 6개월 내지 80세, 1세 내지 80세, 1세 내지 70세, 2세 내지 80세 또는 2세 내지 60세인 방법.
항목 236. 항목 234에 있어서, 대상체가 3세 이하, 2세 이하, 1.5세 이하, 1세(12개월) 이하, 9개월, 6개월 또는 3개월 이하 또는 6개월 내지 2년 사이의 신생아 또는 유아인 방법.
항목 237. 항목 234에 있어서, 대상체가 50, 60, 65, 또는 70세 이상의 고령 대상체인 방법.
항목 238. 항목 237에 있어서, 대상체가 60세 이상의 고령 대상체인 방법.
항목 239. 항목 234 내지 238 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 아메리카 원주민, 아프리카인, 아시아인 또는 유럽인 혈통(heritage)을 갖는 방법.
항목 240. 항목 238에 있어서, 대상체가 적어도 약 10%, 25%, 또는 50%의 아메리카 원주민, 아프리카인, 아시아인 또는 유럽인 혈통을 갖는 방법.
항목 241. 항목 238에 있어서, 대상체가 아메리카 원주민 혈통을 갖는 방법.
항목 242. 항목 238에 있어서, 대상체가 적어도 약 10%, 25% 또는 50%의 아메리카 원주민 혈통을 갖는 방법.
항목 243. 항목 193 내지 242 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체에서 Th2 사이토카인, 바람직하게는 IL-4, IL-13, TNF 및/또는 IL-1β의 증가를 본질적으로 유도하지 않는 방법.
항목 244. 항목 193 내지 242 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 Th1 지정(directed) 면역 반응을 유도하는 방법으로 추가로 정의되는 방법.
항목 245. 항목 193 내지 244 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 항응고 치료를 받고 있는 방법.
항목 246. 항목 193 내지 245 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 근육내 주사에 의해 투여되는 방법.
항목 247. 항목 193 내지 246 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 적어도 하나의 예비전 안정화 돌연변이를 포함하는 융합전 안정화 스파이크 단백질(S_stab)인 코로나바이러스 스파이크 단백질(S)을 코딩하는 mRNA를 포함하는 방법.
항목 248. 항목 247에 있어서, mRNA가 서열 번호: 163과 적어도 95% 동일한 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 것인 방법.
항목 249. 항목 248에 있어서, mRNA가 서열 163과 동일한 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 것인 방법.
항목 250. 항목 247에 있어서, mRNA가 서열 번호: 149와 적어도 95% 동일한 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 것인 방법.
항목 251. 항목 248에 있어서, mRNA가 서열 번호: 149와 동일한 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 것인 방법.
항목 252. 항목 250 또는 251에 있어서, 조성물의 단일 용량이 적어도 약 6개월 동안 중증 COVID-19 질병으로부터 대상체를 보호하기에 충분한 면역 반응을 제공하는 방법.
항목 253. 항목 252에 있어서, 조성물의 단일 용량은 약 6개월 내지 약 1년, 1.5년, 2년, 2.5년, 3년, 4년 또는 5년 동안 중증 COVID-19 질병으로부터 대상체를 보호하기에 충분한 면역 반응을 제공하는 것인 방법.
항목 254. 항목 247 내지 249 중 어느 하나에 있어서, mRNA가 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 LNP를 형성하는 것인 방법.
항목 255. 항목 254에 있어서, LNP가
(i) 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) 적어도 하나의 중성 지질;
(iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체; 및
(iv) 적어도 하나의 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는 것인 방법.
항목 256. 항목 255에 있어서, LNP가
(i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) DSPC;
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는 것인 방법.
항목 257. 항목 256에 있어서, LNP가
(i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) DSPC;
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 47.5:10:40.8:1.7의 몰비인, 방법.
항목 258. 항목 256에 있어서, LNP가
(i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) DSPC;
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비인, 방법.
항목 259. 항목 254 내지 258 중 어느 하나에 있어서, mRNA 대 총 지질의 비율은 약 0.03-0.04 w/w인, 방법.
항목 260. 항목 249에 있어서, mRNA는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP는
(i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) DSPC;
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 약 47.5:10:40.8:1.7의 몰비이고,
여기서 mRNA 대 총 지질의 비율은 약 0.03-0.04 w/w인, 방법.
항목 261. 항목 249에 있어서, mRNA는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP는
(i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
(ii) DSPC;
(iii) 콜레스테롤; 및
(iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
여기서 (i) 대 (iv)는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비이고,
여기서 mRNA 대 총 지질의 비율은 약 0.03-0.04 w/w인, 방법.
항목 262. 항목 247 내지 261 중 어느 하나에 있어서, 대상체에게 약 2 ㎍ 내지 약 50 ㎍의 mRNA를 포함하는 조성물이 투여되는 방법.
항목 263. 항목 262에 있어서, 대상체에게 약 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍의 mRNA인 조성물이 투여되는 방법.
항목 264. 항목 263에 있어서, 대상체에게 약 10 ㎍ 내지 약 30 ㎍의 mRNA인 조성물이 투여되는 방법.
항목 265. 항목 264에 있어서, 대상체에게 약 12 ㎍의 mRNA를 포함하는 조성물이 투여되는 방법.
항목 266. 항목 264 내지 265 중 어느 하나에 있어서, 투여는 조성물이 투여되는 대상체의 100%에서 혈청전환(seroconversion)을 제공하는 방법.
항목 267. 항목 193 내지 266 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체가 61세 이상인 방법.
항목 268. 항목 193 내지 266 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체가 18세 내지 60세인 방법.
항목 269. 항목 193 내지 268 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체는 이전에 백신 알레르기가 있었던 것인 방법.
항목 270. 항목 193 내지 269 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 검출가능한 항-PEG 항체를 갖는 것인 방법.
항목 271. 항목 193 내지 270 중 어느 하나에 있어서, 방법은
(i) 항목 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물을 얻는 단계로서, 여기서 조성물은 동결건조되는 단계;
(ii) 약학상 허용되는 액체 담체에 동결건조된 조성물을 가용화하여 액체 조성물을 생성하는 단계; 및
(iii) 유효량의 액체 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
항목 272. 조성물을 동결건조하여 안정화된 조성물을 생성하는 것을 포함하는, 항목 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물을 안정화시키는 방법.
항목 273. 항목 272에 있어서, 안정화된 조성물이 약 10% 미만의 수분 함량을 갖는 방법.
항목 274. 항목 273에 있어서, 안정화된 조성물이 약 0.5% 내지 5.0%의 수분 함량을 갖는 방법.
항목 275. 항목 272-274 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 안정화되고 동결건조된 조성물.
목록 및 표에 대한 간략한 설명
목록 A: 예시적인 SARS-CoV-2 코로나바이러스 분리주들
목록 B: 다양한 SARS-CoV-2 분리주의 GenBank 접근 번호
목록 1: 본 발명의 예시적인 적합한 단백질 디자인
표 A: 요청된(solicited) 국소 유해 사례(adverse event)에 대한 강도 등급
표 B: 요청된 전신 유해 사례에 대한 강도 등급
표 1: 바람직한 코로나바이러스 컨스트럭트 (아미노산 서열 및 핵산 코딩 서열)
표 2: 각 아미노산에 대해 표시된 빈도가 있는 인간 코돈 사용 표
표 3a: 코로나바이러스 백신에 적합한 핵산, 바람직하게는 mRNA 컨스트럭트
표 3b: 코로나바이러스 백신에 적합한 핵산, 바람직하게는 mRNA 컨스트럭트
표 4: 상이한 SARS-CoV-2 S 항원 디자인을 코딩하는 RNA 컨스트럭트 (실시예에서 사용됨)
표 A: 실시예의 지질계 담체 조성물
표 5: 실시예 2a에서 사용된 mRNA 컨스트럭트의 개요
표 6: 실시예 2b에서 사용된 mRNA 컨스트럭트의 개요
표 7: 실시예 2c에서 사용된 mRNA 컨스트럭트의 개요
표 8: 백신 접종 요법 (실시예 3)
표 9: 백신 접종 요법 (실시예 4)
표 10: 백신 접종 요법 (실시예 5)
표 11: 백신 접종 요법 (실시예 6)
표 12: 백신 접종 요법 (실시예 7)
표 13: 백신 접종 요법 (실시예 8)
표 14: 백신 접종 요법 (실시예 9)
표 15: 도 12F에 표시된 조직병리학적 분석 목록:
표 16: 백신 접종 요법 (실시예 11)
표 17: 백신 접종 요법 (실시예 12)
표 18: 각 종점(endpoint)의 분석을 위한 1차 및 지원 모집단
표 19: 56 및 111 케이스에서 중간 분석 및 185 케이스에서 최종 분석을 사용한 2단계 그룹 순차 설계
표 20: 백신 접종 요법 (실시예 14)
표 21: 백신 접종 요법 (실시예 15)
표 22: 백신 접종 요법 (실시예 16)
표 23: 백신 접종 요법 (실시예 17)
표 24: 백신 접종 요법 (실시예 18)
표 25: 새로운 SARS-CoV-2 분리주/변이체 목록 (실시예 19)
도 1은 상이한 SARS-CoV-2 S 단백질 디자인을 코딩하는 mRNA 컨스트럭트가 시험관 내 번역 시스템을 사용하여 검출 가능한 단백질 발현을 유도한다는 것을 보여준다. 구체적 사항은 실시예 2a 및 표 5에 제공됨.
도 2는 상이한 SARS-CoV-2 S 단백질 디자인을 코딩하는 mRNA 컨스트럭트가 포유동물 세포의 세포 표면에서 발현된다는 것을 FACS 분석을 사용하여 보여준다. 구체적 사항은 실시예 2b 및 표 6에 제공됨.
도 3은 상이한 SARS-CoV-2 S 단백질을 코딩하는 mRNA 컨스트럭트가 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 포유동물 세포에서 발현된다는 것을 보여준다. 구체적 사항은 실시예 2c 및 표 7에 제공됨.
도 4는 전장 안정화 S 단백질을 코딩하는 mRNA 백신으로 백신접종된 그룹에 대한 유의적인 IgG1 및 IgG2a 반응을 보여준다. 도 4는 mRNA 백신과 rec. SARS-CoV-S 단백질에 대한 비교 가능한 IgG1 반응 및 rec. SARS-CoV-S 단백질 대비 mRNA 백신에 대한 더 높은 IgG2a 역가를 보여준다. IgG1 및 IgG2a 항체 역가는 코팅 시약으로 rec. SARS-CoV-S 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 평가됨. 실험은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭스 세부사항은 표 10에 제공된다.
도 5는 전장 안정화 S 단백질 및 전장 야생형 S 단백질을 코딩하는 mRNA 백신으로 백신접종된 그룹에 대한 유의적인 IgG1 및 IgG2a 반응을 보여준다. 도 5A는 전장 S 단백질 디자인 둘 다에 대해 비교 가능한 IgG1 반응을 나타내고 도 5B는 전장 S 단백질 디자인 둘 다에 대해 비교 가능한 IgG2a 역가를 보여준다. 도 5C는 42일째에 전장 S 단백질 디자인 둘 다에 대한 높고 비교 가능한 바이러스 중화 역가를 나타낸다. 실험은 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 11에 제공된다.
도 6은 세포내 사이토카인 염색 분석을 사용하여, 전장 안정화된 S 단백질 및 전장 S 단백질을 코딩하는 LNP 제형화된 mRNA가 마우스에서 세포 면역 반응(CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포 반응)을 유도함을 보여준다. 그룹 A-C LNP는 상이한 전장 S 단백질 디자인을 코딩하는 mRNA를 제제화했다. 그룹 D 음성 대조군. 백신 접종 계획은 표 11을 참조. 추가 세부사항은 실시예 6에 제공됨.
도 7은 전장 S 단백질(S_stab)(그룹 A)을 코딩하는 LNP 제형화된 mRNA로 백신 접종 후 선천성 면역 반응을 나타낸다. 점선은 검출의 하한을 나타낸다. 실험은 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 12에 제공된다.
도 8A는 전장 안정화된 S 단백질을 코딩하는 mRNA 백신으로 백신접종된 그룹에 대한 유의적인 IgG1 및 IgG2a 반응을 보여준다. 도 8A는 첫 번째 백신 접종 후 높은 IgG1 반응 및 높은 IgG2a 반응을 보여준다. 그룹 A-D: 전장 S 단백질(S_stab)을 코딩하는 LNP 제형화된 mRNA를 사용한 1회 백신접종; 그룹 I: 애주번트가 첨가된 재조합 스파이크 단백질 및 그룹 J: 음성 대조군. 실험은 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 12에 제공된다.
도 8B는 전장 안정화 S 단백질(s_stab)을 코딩하는 mRNA 백신으로 백신접종된 모든 그룹에 대한 유의적인 IgG1 및 IgG2a 반응을 보여준다. 도 8B(A)는 28일(1차 백신접종 후) 및 35일(2차 백신접종 후)에 IgG1 반응을 나타내고 도 8B(B)는 28일(1차 백신접종 후) 및 35일(2차 백신 접종 후)에 IgG2a 반응을 나타낸다. 그룹 A-H: 다른 백신 접종 간격으로 LNP 제형화된 전장 S 단백질 mRNA; 그룹 I: 애주번트가 첨가된 재조합 스파이크 단백질 및 그룹 J: 음성 대조군. 실험은 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 12에 제공된다.
도 9는 전장 안정화 S 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA 백신으로 백신접종된 모든 그룹에 대한 바이러스 중화 역가(VNT)의 유의한 유도를 나타낸다. 도 9A는 28일(첫 번째 백신 접종 후)과 35일 및 49일(도 9B)(두 번째 백신 접종 후)의 VNT를 보여준다. 그룹 A-H: 다른 백신 접종 간격으로 LNP 제형화된 전장 S 단백질 mRNA; 그룹 I: 애주번트가 첨가된 재조합 스파이크 단백질 및 그룹 J: 음성 대조군. 실험은 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 12에 제공된다.
도 10은 세포내 사이토카인 염색 분석을 사용하여 평가된, 전장 안정화된 S 단백질(S_stab)을 코딩하는 LNP 제형화된 mRNA가 프라임 백신과 부스터 백신 사이의 다른 시간 간격으로 두 번째 백신 접종 후 마우스에서 세포 면역 반응(CD8+ 및/또는 CD4+ T-세포 반응)을 유도한다는 것을 보여준다. 그룹 A-H: 다른 백신 접종 간격으로 LNP 제형화된 전장 S 단백질 mRNA; 그룹 I: 애주번트가 첨가된 재조합 스파이크 단백질 및 그룹 J: 음성 대조군. 실험은 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 12에 제공된다.
도 11은 전장 안정화 S 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA 백신의 상이한 용량으로 백신접종된 그룹에 대한 래트에서의 유의한 항체 반응을 나타낸다. 도 11A는 그룹 C-F에 대한 높은 IgG1 반응을 보여주고, 도 11B는 그룹 D-F에 대한 높은 IgG2a 반응을 보여주고, 도 11C는 그룹 C-E에 대한 높은 총 IgG 반응을 보여준다. 그룹 B-F: LNP 제형화된 전장 S 단백질 mRNA의 상이한 용량 및 그룹 A: 음성 대조군. 도 11D는 추가로 증가된 IgG1 항체 반응을 나타내고 도 11E는 42일째에 2차 백신 접종 후 모든 그룹에 대해 추가로 증가된 IgG2a 항체 역가를 나타낸다. 도 11F 및 G는 LNP에서 제형화된 mRNA 전장 S 안정화 단백질을 사용한 백신 접종이 랫트에서 용량 의존적 수준의 VNT를 유도함을 보여준다. 실험은 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 13에 제공된다.
도 12는 전장 안정화된 S 단백질(S_stab)을 코딩하는 본 발명의 상이한 mRNA 백신으로 백신접종된 SARS-CoV-2 공격으로부터 햄스터의 보호를 보여준다. 도 12A는 백신접종된 그룹 E 및 F에 대한 높은 총 IgG 항체의 유도를 나타내고 도 12B는 1회(28일) 또는 2회의 백신접종(42일 및 56일) 시 VNT의 용량 의존적 유도를 나타낸다. 도 12C-E는 56일부터 60일까지(도 12C) 인후 면봉, 60일에 비갑개(도 12D) 및 60일에 폐 조직(도 12F)에서 검출 가능한 수준의 복제 가능 바이러스를 보여준다. 각 점은 개별 동물을 나타내고 막대는 중앙값을 나타낸다. 통계 분석은 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 수행되었다. 도 12F는 백신 강화 질병의 징후가 없는 경우 공격 감염으로부터 백신 접종된 햄스터의 호흡기를 보호하는 것을 보여준다. 조직병리학적 분석은 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직 절편에서 감염 후 4일 후인 60일째에 수행되었다. 조직병리학적 평가 점수는 검사된 파라미터의 중증도에 따라 수행되었다. 각 점은 개별 동물을 나타내고 막대는 중앙값을 나타낸다. 통계 분석은 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 수행되었다. 실험은 실시예 9에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 세부사항은 표 14 및 표 15에 제공된다.
도 13은 건강한 인간 대상을 대상으로 한 1상 임상 시험의 결과를 보여준다. 도 13A에서 전신 유해 사례는 1차 투여 후 및 2차 투여 후 상이한 용량 코호트에서 제시된다. 도 13B에서 국소 유해 사례는 1차 투여 후 및 2차 투여 후 상이한 용량 코호트에서 제시된다. 도 13C에는 피로, 두통, 근육통, 오한, 관절통, 발열, 메스꺼움 및 설사와 같은 특정 전신 유해 사례가 제시되어 있다. 도 13D에는 통증, 가려움증, 부기 및 발적과 같은 특정 국소 유해 사례가 나와 있다. 도 13E에서 1일, 29일, 36일, 43일 및 57일에 스파이크 단백질 특이적 IgG 항체의 유도가 상이한 용량 코호트에 대해 제시된다. 도 13E의 표에는 백신접종된 대상체의 혈청전환율의 퍼센트가 제시되어 있다. 도 13F에서는 1일, 36일 및 43일에 RBD-특이적 IgG 항체의 유도가 상이한 용량 코호트에 대해 제시되어 있다. 도 13F의 표에는 백신접종된 대상체의 혈청전환율의 퍼센트가 제시되어 있다. 도 13G에는 바이러스 중화 항체의 유도가 나타나 있다. 도 13G의 표에는 백신접종된 대상체의 혈청전환율의 퍼센트가 제시되어 있다. 도 13H에서 중화 항체의 수준에 대한 스파이크 단백질 또는 RBD 결합 항체의 수준의 비율이 제시된다. 도 13I는 첫 번째 용량(29일) 및 두 번째 용량(36일) 후 스파이크 단백질 S1에 대한 CD4+ T 세포의 유도를 보여준다. 도 13J는 제1 용량(29일) 및 제2 용량(36일) 후 스파이크 단백질 S2에 대한 CD4+ T 세포의 유도를 나타낸다. 도 13K에는 2μg 및 4μg CvnCoV 백신접종 후 SARS-CoV-2 혈청 양성 대상체에서 바이러스 중화 역가 및 RBD 특이적 항체의 유도가 제시된다.
도 14는 전장 S 안정화 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA로 백신접종 후 단일 백신접종(d21) 후 상당한 IgG1 및 IgG2a 반응을, 및 두 번째 백신접종(d42) 후 더 증가된 유의적인 IgG1 및 IgG2a 반응을 보여준다(도 14A). hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)(그룹 C)을 포함하는 SARS-CoV-2 S_stab을 코딩하는 mRNA를 포함하는 백신 조성물은 개선되고 더 강력한 결합 항체 유도를 나타낸다(IgG1 및 IgG2a 종점 역가로 나타냄). VNT의 유도는 도 14B에 제시되어 있다. 그룹 C의 마우스는 그룹 B와 비교하여 첫 번째 백신접종 후 d21에 이미 VNT의 조기 증가된 수준을 나타냈다. T-세포 면역의 유도는 도 14C에 제시된다. hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)(그룹 C)을 포함하는 SARS-CoV-2 S_stab을 코딩하는 mRNA를 포함하는 백신 조성물은 놀랍게도 CD8+ IFNγ/TNF 이중 양성 T 세포의 현저하게 더 강력한 유도를 나타낸다.
도 15는 LNP로 제형화된, 3'말단 hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)을 갖는 대체 비코딩 영역을 포함하는 전장 안정화 S 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA 백신의 상이한 용량으로 백신접종된 그룹에 대한 랫트에서의 유의한 항체 반응을 나타낸다. 도 15A는 IgG1 및 IgG2a 결합 항체의 강력한 유도를 나타내고, 도 15B는 용량 의존적 방식으로 VNT의 유도를 나타낸다. 실험은 실시예 12에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 17에 제공된다.
도 16은 LNP에 제형화된, 상이한 비-코딩 영역을 포함하는 전장 안정화 S 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA 백신의 상이한 용량으로 백신접종된 그룹에 대한 래트에서의 유의한 항체 반응을 나타낸다. 도 16A는 IgG1 및 IgG2a 결합 항체의 강력하고 용량 의존적 유도를 나타내고, 도 16B는 LNP로 제형화된, 3' 말단 hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)을 갖는 비-코딩 영역을 포함하는 전장 안정화된 S 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA 백신에 대한 용량-의존적 방식으로의 1회 접종 후 VNT의 조기 유도를 나타낸다. 도 16C는 42일째에 2회 백신 접종 후 VNT의 유도를 나타낸다. 실험은 실시예 14에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 20에 제공된다.
도 17은 CVnCoV (LNP로 제형화된 전장 안정화 S 단백질(S_stab)를 코딩하는 mRNA 백신)가 비인간 영장류에서 체액성 반응을 유도함을 보여준다. (도 17A) 연구 설정의 개략도. 붉은털 원숭이(n=6; 수컷 3마리, 암컷 3마리/그룹)는 0일 및 28일에 0.5μg 또는 8μg의 CVnCoV로 IM 백신을 접종하거나 백신을 접종하지 않은 상태로 유지했다. 모든 동물은 d56에 5.0 × 106 PFU의 SARS-CoV-2로 공격받았다. 각 그룹의 2마리의 동물은 각각 d62, d63 및 d64에 종결되었다(도 17B) 표시된 바와 같이 다른 시점에서 종점 역가로 나타내진 삼량체 스파이크 단백질 또는 (도 17C) RBD 특이적 결합 IgG 항체 (C) 표시된 바와 같이 다른 시점에서 초점 감소 중화 테스트를 통해 결정된 바이러스 중화 항체. 모든 값은 범위가 있는 중앙값으로 표시된다. 점선은 각각 백신접종과 도전 감염을 나타낸다. RBD 수용체 결합 도메인; VNT 바이러스 중화 역가. 실험은 실시예 15에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 21에 제공된다.
도 18은 CVnCoV (LNP로 제형화된 전장 안정화 S 단백질(S_stab)를 코딩하는 mRNA 백신)가 비인간 영장류에서 세포 반응을 유도함을 보여준다. 0.5μg 또는 8μg CVnCoV 백신접종한 또는 치료되지 않은 동물들로부터 다른 시점에서 분리된 PBMC를 생체외에서 S 특이적 펩티드 풀(pool)로 재자극한 후 IFNγ ELISpot 분석을 수행했다. (도 18A) d56에 챌린지 감염 전 IFNγ ELISpot. 패널 1은 전체 S 단백질을 커버하는 단일 펩타이드 풀을 사용한 자극 결과를 나타내고, 패널 2-4는 각 그룹의 전체 S 단백질을 커버하는 10개의 개별 풀의 자극 결과를 나타낸다. (도 18B) d62-d64에서 종료될 때까지 IFNγ ELISpot. 패널 1은 3개의 메가풀을 사용한 자극의 결과를 나타내고 전체 S 단백질을 커버하는 미라(mummed) 반응을 보여주며, 패널 2-4는 각 그룹의 전체 S 단백질을 커버하는 10개의 개별 풀의 자극 결과를 나타낸다. SFU 스폿 형성 유닛; PP 펩타이드 풀. 실험은 실시예 15에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 21에 제공된다.
도 19는 CVnCoV (LNP로 제형화된 전장 안정화 S 단백질(S_stab)를 코딩하는 mRNA 백신)가 챌린지 감염으로부터 비인간 영장류를 보호한다는 것을 보여준다 (도 19A) 챌린지 후 상이한 시점에서 채취한 비강 면봉(도 19B) d59 및 d62-64의 종료 시점에 취한 생활 BAL 샘플 및 (도 19C) d62-64로부터의 폐 조직 균질물을 RT-qPCR을 통해 전체 바이러스 RNA의 카피에 대해 분석하였다. (도 19D) 챌린지 후 상이한 시점에서 채취한 비강 면봉 (도 19E) d59 및 d62-64의 종료 시점에서 채취한 생활 BAL 샘플 및 (도 19F) d62-64로부터의 폐 조직 균질물을 RT-qPCR을 통해 서브게놈 바이러스 RNA의 카피에 대해 분석하였다. 값은 범위가 있는 중앙값으로 표시된다. 하단 및 상단 점선은 각각 LLOD 및 LLOQ를 나타낸다. Kruskall-Wallis ANOVA에 이어 Dunn의 테스트를 사용하여 그룹을 비교하고 P 값이 표시된다. LLOD 검출 하한, LLOQ 정량 하한, RT-qPCR 역전사-정량적 중합효소 연쇄 반응. 실험은 실시예 15에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 21에 제공된다.
도 20은 CVnCoV (LNP로 제형화된 전장 안정화 S 단백질(S_stab)를 코딩하는 mRNA 백신)가 챌린지 감염으로부터 비인간 영장류를 보호한다는 것을 보여준다 (도 20A) 챌린지 후 상이한 시점에서 채취한 인후 면봉은 RT-qPCR을 통해 총 바이러스 카피에 대해 분석되었다 (도 20B) 챌린지 후 상이한 시점에서 채취한 인후 면봉은 RT-qPCR을 통해 서브게놈 바이러스 카피에 대해 분석되었다. (도 20C) 편도선(도 20D) 기관(trachea) (도 20E) 비장 (도 20F) 십이지장 (G) 결장 (H) 간 (I) 신장에서 유래된 균질화된 조직은 RT-qPCR를 통해 총 바이러스 RNA 카피에 대해 분석되었다. (RT-qPCR 역전사-정량적 중합효소 연쇄 반응, sg 서브게놈). 실험은 실시예 15에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 21에 제공된다.
도 21 조직병리학(H&E) 및 SARS-CoV-2 in situ 하이브리드화(hybridisation)(ISH)을 보여주는 예시적인 섹션. 도 21A: 폐포 공간의 폐포 네크로시스 및 염증성 삼출물(*) 및 II형 폐세포 증식증(pneumocyte hyperplasia)(화살표). 도 21B: 약한 혈관주위 커프(화살표). 도 21C: 폐포 공간 및 폐포 사이 격막(*)에서의 염증 세포 침윤 및 II형 폐세포 증식증(화살표). 도 21D: 염증 병소 내 풍부한 세포에서의 SARS-CoV-2 ISH 염색(화살표). 도 21E: 폐포간 중격 내의 단일 세포에서의 SARS-CoV-2 ISH 염색(화살표). 도 21F: 폐포 내벽 및 폐포간 격막 내 SARS-CoV-2 ISH 염색 세포의 풍부한 병소(화살표)(바 = 100μm. ISH in situ 하이브리드화). 실험은 실시예 15에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 21에 제공된다.
도 22는 8㎍의 CVnCoV (LNP로 제형화된 전장 안정화 S 단백질(S_stab)를 코딩하는 mRNA 백신)를 사용한 백신 접종이 바이러스 챌린지 시 병리학적 변화로부터 폐를 보호한다는 것을 보여준다 (도 22A) 각 폐 병리 파라미터에 대한 점수를 보여주는 히트 맵 및 표시된 대로 모든 그룹의 각 동물에 대한 평균 점수. 심각도 범위는 0에서 4까지임: 0=없음; 1=최소; 2=약함; 3=중등도 및 4=표시/심각함. (도 22B) 각 동물로부터의 모든 폐 조직병리학 파라미터에 대한 누적 점수를 나타내는 그래프. (도 22C) 모든 동물의 폐 조직 절편에서 바이러스 RNA의 존재는 폐 절편의 ISH (RNAScope, in situ 하이브리드화) 양성 염색 영역의 백분율로 표시된다. (도 22D) CT 방사선을 통해 검출된 폐 병리의 누적 점수. 상자와 위스커(whisker)는 범위가 있는 중앙값을 나타낸다. Kruskall-Wallis ANOVA에 이어 Dunn의 테스트를 사용하여 그룹을 비교하고 P 값이 표시된다. 실험은 실시예 15에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추가 컨스트럭트 세부사항은 표 21에 제공된다.
도 23은 mRNA 백신 조성물로 자극된 인간 PBMC(도 23A)에서 INFα의 유도를 보여준다. 1회 백신 접종 후(21일째) 및 2회 백신 접종 후(42일째) VNT의 유도가 도 23B 및 C에 나타나 있다. 3' 말단 "hSL-A100" 또는 "A100"을 포함하는 mRNA를 갖는 모든 mRNA 백신 조성물 (그룹 C-G, I-M)은 VNT의 개선된, 빠른 및 강력한 유도를 보여주었다. 이러한 컨스트럭트에서, 폴리(A) 서열은 RNA의 3' 말단에 직접 위치한다.
도 24 도 24A는 단 1회의 백신접종 후 VNT의 유도를 나타낸다. 3' 말단 "hSL-A100" 또는 "A-100"을 포함하는 mRNA를 갖는 mRNA 백신 조성물은 VNT의 개선된, 빠른 및 강력한 유도를 나타내었다. 이러한 컨스트럭트에서, 폴리(A) 서열은 RNA의 3' 말단에 직접 위치한다. 도 24B는 42일째의 나중 시점에서 1회의 백신접종(그룹 A-E) 또는 2회의 백신 접종 후(그룹 F-J) VNT의 유도를 입증한다. R9709 (그룹 B)를 포함하는 mRNA 백신 조성물은 1회 예방접종만 받은 그룹 사이에서 VNT의 가장 두드러진 역가를 유도하였다.
하기에서, 본 발명의 다양한 실시양태 및 측면을 예시하는 특정 실시예가 제시된다. 그러나, 본 발명은 여기에 설명된 특정 실시양태들에 의해 범위가 제한되어서는 안 된다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 보다 명확하게 이해하고 실시할 수 있도록 하기의 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나, 본 발명은 단지 본 발명의 단일 측면의 예시로서 의도된 예시된 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본 명세서에 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명, 첨부 도면 및 하기 실시예로부터 통상의 기술자에게 용이하게 명백해질 것이다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구항의 범위에 속한다.
실시예 1 : DNA 및 RNA 컨스트럭트, 조성물 및 백신의 제조
본 실시예는 본 발명의 RNA를 수득하는 방법 뿐만 아니라 본 발명의 조성물 또는 백신을 생성하는 방법을 제공한다.
1.1. DNA 및 RNA 컨스트럭트의 제조:
다양한 SARS-CoV-2 S 단백질 디자인을 코딩하는 DNA 서열을 준비하고 후속 RNA 시험관 내 전사 반응에 사용했다. 상기 DNA 서열은 안정화 및 발현 최적화를 위해 G/C 최적화 또는 변형된 코딩 서열(예를 들어, "cds opt1")을 도입함으로써 DNA 서열을 암호화하는 참조 또는 야생형을 변형함으로써 제조되었다. 서열은 안정화 3'-UTR 서열 및 5'-UTR 서열을 포함하도록 pUC 유래 DNA 벡터 내로 도입되었으며, 추가로 아데노신의 스트레치(예: A64 또는 A100), 및 임의로 히스톤-스템-루프(hSL) 구조를 포함하고, 및 선택적으로 30개의 시토신의 스트레치(예: C30)를 포함한다 (표 4 참조, 코로나바이러스 항원 디자인의 개요는 목록 1 또는 표 1 참조).
수득된 플라스미드 DNA 컨스트럭트는 당업계에 공지된 통상적인 프로토콜을 사용하여 박테리아에서 형질전환 및 증식시켰다. 결국, 플라스미드 DNA 컨스트럭트를 추출, 정제하고 후속 RNA 시험관 내 전사에 사용했다(섹션 1.2 참조).
대안적으로, DNA 플라스미드를 PCR 증폭을 위한 템플릿으로 사용할 수 있다(섹션 1.3 참조).
1.2. 플라스미드 DNA 주형으로부터의 RNA 시험관내 전사:
섹션 1.1에 따라 제조된 DNA 플라스미드를 제한 효소를 사용하여 효소적으로 선형화하고, 적당한 완충제 조건하 뉴클레오티드 혼합물(ATP/GTP/CTP/UTP) 및 캡 유사체(예: m7GpppG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG,m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG), 또는 3'OMe-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG.)의 존재 하에서 T7 RNA 중합효소를 사용한 DNA 의존성 RNA 시험관내 전사에 사용되었다. 얻어진 RNA 컨스트럭트를 RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac AG, T
Figure pct00016
bingen, Germany; WO2008/077592)를 사용하여 정제하고, 시험관내 및 생체내 실험에 사용하였다. DNA 주형은 또한 PCR을 사용하여 생성할 수도 있다. 이러한 PCR 주형은 본 명세서에 약술된 바와 같은 RNA 폴리머라제를 사용하여 DNA 의존성 RNA 시험관내 전사에 사용될 수 있다.
화학적으로 변형된 mRNA를 얻기 위해, 우라실 대신 슈도우리딘 N(1)-메틸슈도우리딘(m1Ψ)을 포함하는 변형된 뉴클레오티드 혼합물의 존재 하에 RNA 시험관내 전사를 수행하였다. 수득된 m1Ψ 화학적으로 변형된 RNA를 RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac AG, T
Figure pct00017
bingen, Germany; WO2008/077592)를 사용하여 정제하고, 추가 실험에 사용하였다(예: 실시예 16 또는 17 참조).
효소적 캡핑을 사용한 캡핑된 RNA의 생성 (예시적):
일부 RNA 컨스트럭트는 cap 유사체가 없이 시험관 내에서 전사된다. 그 다음, 캡-구조(cap0 또는 cap1)는 당업계에 일반적으로 공지된 캡핑 효소를 사용하여 효소적으로 첨가된다. 간단히 말해서, 시험관 내 전사된 RNA는 cap0-RNA를 얻기 위해 캡핑 키트를 사용하여 캡핑된다. cap0-RNA는 cap 특이적 2'-O-메틸트랜스퍼라제를 사용하여 추가로 변형되어 cap1-RNA를 얻는다. cap1-RNA는 정제되며, 예를 들어위에서 설명한 대로 정제되며, 추가 실험에 사용된다.
임상 개발을 위한 RNA는 현재의 good manufacturing practice, 예를 들어, WO2016/180430에 따라 생산되며, DNA 및 RNA 레벨에 대한 다양한 품질 관리 단계를 구현한다.
실시예의 RNA 컨스트럭트들:
생성된 RNA 서열/컨스트럭트는 암호화된 항원성 단백질 및 여기에서 표시된 각각의 UTR 요소를 나타낸 표 4에 제공된다. 달리 표시되지 않은 경우, 표 4의 RNA 서열/컨스트럭트는 m7GpppG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG의 존재하에서 RNA 시험관내 전사를 사용하여 생성되었고; 따라서 RNA 서열/컨스트럭트는 5' Cap1 구조를 포함한다. 달리 표시되지 않은 경우, 표 4의 RNA 서열/컨스트럭트는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(예: 슈도우리딘(Ψ) 또는 N(1)-메틸슈도우리딘(m1Ψ)) 없이 생성되었다.
1.3. PCR 증폭된 DNA 주형으로부터의 RNA 시험관내 전사 (예시적):
단락 1.1에 따라 제조된 정제된 PCR 증폭된 DNA 주형은 뉴클레오티드 혼합물(ATP/GTP/CTP/UTP) 및 캡 유사체(m7GpppG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G))의 존재 하에 적당한 완충액 조건에서 DNA 의존성 T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관 내에서 전사된다. 대안적으로, PCR 증폭된 DNA는 변형된 뉴클레오티드 혼합물(ATP, GTP, CTP, N1-메틸슈도우리딘(m1Ψ) 또는 슈도우리딘(Ψ) 및 캡 유사체(m7GpppG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG)의 존재하에 적절한 완충액 조건 하에서 DNA 의존성 T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관 내에서 전사된다. 일부 RNA 컨스트럭트는 cap 유사체가 없이 시험관 내에서 전사되고, 캡-구조(cap0 또는 cap1)는 당업계에 일반적으로 알려진 캡핑 효소를 사용하여 효소적으로 추가된다. 얻은 RNA는 예를 들어 위에서 설명한 대로 정제하고 추가 실험에 사용된다. 얻은 mRNA는 예를 들어 RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac AG, T
Figure pct00018
bingen, Germany; WO2008/077592)를 사용하여 정제되고, 시험관내 및 생체내 실험에 사용된다.
다양한 SARS-CoV-2 S 항원 디자인을 코딩하는 RNA 컨스트럭트들
RNA ID 명칭 약어 CDS
opt. 		5'-UTR/
3'-UTR;
UTR 디자인 		3'-말단 서열 번호: 단백질 서열 번호: CDS 서열 번호: RNA
R9488, R9492, R10161* 스파이크 단백질 S opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 1 136 148
R9514 스파이크 단백질 S opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 1 136 162
R9487, R9491, R9709, R10159**, R10160* 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 10 137 149
R9515, R10157** 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 10 137 163
R9486, R9490 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt3
(human)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 10 142 150
R9517 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt3
(human)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 10 142 164
R9519 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt10
(gc mod)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 10 146 165
R9489, R9493 S 단편(1-681) 스파이크 단백질 S1 opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 27 138 152
R9506, R9513 S 단편 (1-681) 스파이크 단백질 S1 opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 27 138 166
R9516 S 단편 (1-681) 스파이크 단백질 S1 opt3
(human)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 27 143 167
R9518 S 단편 (1-681) 스파이크 단백질 S1 opt10
(gc mod)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 27 147 168
R9561 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_disul (P715C_P1069C) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 21 11804 12816
R9564 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_disul (G889C_L1034C) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22 11805 12817
R9562 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_disul (F970C_G999C) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 25 11808 12820
R9560 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_disul (A890C_V1040C) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 1145 11810 12822
R9563 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_disul (T874C_S1055C) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 1212 11811 12823
R9641 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP_cav (K986P_V987P_ T887W_A1020W) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 408 11799 12811
R9660 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP_cav (K986P_V987P_ P1069F) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 475 11800 12812
R9661 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP_prot (K986P_V987P_ H1048Q_H1064N_ H1083N_H1101N) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 542 11801 12813
R9663 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP_ delTMflex_WhcAg (K986P_V987P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 10726 11953 12931
R9664 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP_ delTMflex_Ferritin (K986P_V987P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 8716 11923 12901
R9848 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP_hex (K986P_V987P _F817P_A892P _A899P_A942P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22732 22759 22813
R9926 RBD 단편 (334-528) 스파이크 단백질 RBD_Foldon opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22734 22761 22815
R9927 RBD 단편 (334-528) 스파이크 단백질 RBD_Foldon opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22734 22761 22788
R10335 RBD 단편 (334-528) 스파이크 단백질 RBD_LumSynth opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22735 22762 22816
R10338 RBD 단편 (334-528) 스파이크 단백질 RBD_LumSynth opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22735 22762 22789
R10336 RBD 단편 (334-528) 스파이크 단백질 LumSynth_RBD opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22736 22763 22817
R10339 RBD 단편 (334-528) 스파이크 단백질 LumSynth_RBD opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22736 22763 22790
R10337 RBD 단편 (334-528) 스파이크 단백질 RBD_Ferritin opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22733 22760 22814
R10340 RBD 단편 (334-528) 스파이크 단백질 RBD_Ferritin opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22733 22760 22787
R10182 S(D614G) S (D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22737 22764 22791
R10165 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22738 22765 22819
R10166 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22738 22765 22792
R10276 스파이크 단백질 S (A222V_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22739 22766 22820
R10278 스파이크 단백질 S (A222V_D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22739 22766 22793
R10277 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _A222V_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22740 22767 22821
R10279 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _A222V_D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22740 22767 22794
R10296 스파이크 단백질 S (N439K_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22741 22768 22822
R10298 스파이크 단백질 S (N439K_D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22741 22768 22795
R10297 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _N439K_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22742 22769 22823
R10299 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _N439K_D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22742 22769 22796
R10284 스파이크 단백질 S (S477N_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22743 22770 22824
R10287 스파이크 단백질 S (S477N_D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22743 22770 22797
R10285 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _S477N_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22744 22771 22825
R10286 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _S477N_D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22744 22771 22798
R10350 스파이크 단백질 S (N501Y_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22745 22772 22826
R10351 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _N501Y_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22746 22773 22827
R10272 스파이크 단백질 S (H69del_V70del _D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22747 22774 22828
R10274 스파이크 단백질 S (H69del_V70del _D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22747 22774 22801
R10273 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _H69del_V70del _D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22748 22775 22829
R10275 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _H69del_V70del _D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22748 22775 22802
R10280 스파이크 단백질 S (Y453F_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22749 22776 22830
R10282 스파이크 단백질 S (Y453F_D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22749 22776 22803
R10281 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _Y453F_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22750 22777 22831
R10283 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _Y453F_D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22750 22777 22804
R10288 스파이크 단백질 S (D614G_I692V) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22751 22778 22832
R10290 스파이크 단백질 S (D614G_I692V) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22751 22778 22805
R10289 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _D614G_I692V) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22752 22779 22833
R10291 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _D614G_I692V) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22752 22779 22806
R10344 스파이크 단백질 S (D614G_M1229I) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22753 22780 22834
R10345 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _D614G_M1229I) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22754 22781 22835
R10292 스파이크 단백질 S (H69del_V70del _A222V_Y453F _S477N_D614G _I692V) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22755 22782 22836
R10294 스파이크 단백질 S (H69del_V70del _A222V_Y453F _S477N_D614G _I692V) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22755 22782 22809
R10293 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _H69del_V70del _A222V_Y453F _S477N_D614G _I692V) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22756 22783 22837
R10295 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _H69del_V70del _A222V_Y453F _S477N_D614G _I692V) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22756 22783 22810
R10346 스파이크 단백질 S (H69del_V70del _Y453F_D614G _I692V_M1229I) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22757 22784 22838
R10347 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P _H69del_V70del _Y453F_D614G _I692V_M1229I) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22758 22785 22839
R10136, R10158** 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 hSL-A100 10 137 24397
R10154 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A100 10 137 25717
R10153 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 A100 10 137 24837
R10155 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 Rpl31/ RPS9; e-2 hSL-A100 10 137 23957
R10156 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 Rpl31/ RPS9; e-2 A100 10 137 25277
R10183 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 Slc7a3/ PSMB3; a-3 hSL-A100 10 137 23737
R10184 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 Slc7a3/ PSMB3; a-3 A100 10 137 25057
R10300 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A25 10 137 26925
R10301 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A60 10 137 26926
R10302 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A80 10 137 26927
R10303 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A90 10 137 26928
R10304 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A110 10 137 26929
R10305 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A120 10 137 26930
R10306 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A140 10 137 26931
R10307 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL 10 137 26932
R10308 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A50-N5-C30-hSL-N5 10 137 26933
R10309 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A35-N5-C30-hSL-N5 10 137 26934
R10310 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A25-N5-C30-hSL-N5 10 137 26935
R10311 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A73-N5-C30-hSL-N5 10 137 26936
R10312 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 hSL-N5 10 137 26937
R10162** 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P) opt10
(gc mod)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 10 146 151
R10352 스파이크 단백질 S (H69del_V70del_Y144del_N501Y_A570D_D614G_P681H_T716I_S982A_D1118H) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22941 22981 23201
R10356 스파이크 단백질 S (H69del_V70del_Y144del_N501Y_A570D_D614G_P681H_T716I_S982A_D1118H) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22941 22981 23421
R10353 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P_H69del_V70del_Y144del_N501Y_A570D_D614G_P681H_T716I_S982A_D1118H) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22959 23089 23309
R10357 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P_H69del_V70del_Y144del_N501Y_A570D_D614G_P681H_T716I_S982A_D1118H) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22959 23089 23529
R10358 스파이크 단백질 S (K417N_E484K_N501Y_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22942 22982 23202
R10359 스파이크 단백질 S (K417N_E484K_N501Y_D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22942 22982 23422
R10360 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P_K417N_E484K_N501Y_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22960 23090 23310
R10361 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P_K417N_E484K_N501Y_D614G) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22960 23090 23530
R10379 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P_L18F_D80A_D215G_L242del_A243del_L244del_R246I_K417N_E484K_N501Y_D614G_A701V) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22961 23091 23311
R10384 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P_L18F_D80A_D215G_L242del_A243del_L244del_R246I_K417N_E484K_N501Y_D614G_A701V) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22961 23091 23531
R10378 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P_E484K_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22962 23092 23312
R10380 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P_L18F_T20N_P26S_D138Y_R190S_K417T_E484K_N501Y_D614G_H655Y_T1027I) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22963 23093 23313
R10385 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P_L18F_T20N_P26S_D138Y_R190S_K417T_E484K_N501Y_D614G_H655Y_T1027I) opt1
(gc)		 HSD17B4/ PSMB3;
a-1		 hSL-A100 22963 23093 23533
R10381 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab_PP (K986P_V987P_S13I_W152C_L452R_D614G) opt1
(gc)		 -/muag;
i-3		 A64-N5-C30-hSL-N5 22964 23094 23314
*mRNA R10160 및 R10161은 3'OME Clean Cap으로 생산되었다.
**mRNA R10157, R10158, R10159, R10162는 N(1)-메틸슈도우리딘(m1ψ)으로 생성되었다.
1.4. LNP 제형화된 mRNA 조성물의 제조:
LNP는 양이온성 지질, 구조 지질, PEG-지질 및 콜레스테롤을 사용하여 제조되었다. 지질 용액(에탄올 중)을 미세유체 혼합 장치를 사용하여 RNA 용액(수성 완충액)과 혼합하였다. 얻은 LNP를 투석을 통해 탄수화물 완충액에서 재완충하고, 초원심분리 튜브를 사용하여 목표 농도로 상향 농축하였다. LNP 제제화 mRNA는 시험관내 또는 생체내 실험에서 사용하기 전에 -80 ℃에서 저장되었다.
바람직하게는, 지질 나노입자는 PCT 공개 WO 2015/199952, WO 2017/004143 및 WO 2017/075531에 기술되어 있는 일반적인 절차에 따라 제조되고 시험되었으며, 이들 문헌들의 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이온화 가능한 아미노 지질(양이온성 지질), 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 사용하여 지질 나노입자(LNP)로 제형화된 mRNA를 제조하였다. LNP는 다음과 같이 준비되었다. 화학식 III-3에 따른 양이온성 지질(ALC-0315), DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa에 따른 PEG-지질 (ALC-0159)을 약 47.5:10:40.8:1.7의 몰비로 에탄올에 용해시켰다(표 A 참조). 화합물 III-3을 포함하는 지질 나노입자(LNP)는 0.03-0.04 w/w의 mRNA (서열은 표 4 참조) 대 총 지질의 비율의 비율로 제조하였다. 간단히 말해서, mRNA는 10 내지 50mM 시트레이트 완충액, pH 4에서 0.05 내지 0.2mg/mL이 되도록 희석되었다. 주사기 펌프를 사용하여 총 유속이 15ml/min 이상으로, 에탄올성 지질 용액을 mRNA 수용액과 약 1:5 내지 1:3의 비율(vol/vol)로 혼합하였다. 그런 다음 에탄올을 제거하고 외부 완충액을 투석에 의해 PBS로 교체했다. 마지막으로 지질 나노입자를 0.2μm 공극 멸균 필터를 통해 여과하였다. Malvern Zetasizer Nano(Malvern, UK)를 사용한 준탄성 광 산란(quasi-elastic light scattering)에 의해 결정된 지질 나노입자 입자 직경 크기는 60-90nm였다.
실시예의 지질계 담체 조성
[표 A]
Figure pct00019
Figure pct00020
1.5. 프로타민 복합체화된 mRNA 조성물의 제조 (예시적):
RNA 컨스트럭트는 생체내 면역화 실험에서 사용하기 전에 프로타민과 복합체를 형성한다. RNA 제형은 50% 유리 RNA와 2:1의 중량비로 프로타민과 복합체화된 RNA 50%의 혼합물로 구성된다. 첫째, mRNA는 mRNA에 프로타민-Ringer의 락테이트 용액을 첨가하여 프로타민과 복합체를 형성한다. 10분간 배양 후, 복합체가 안정적으로 생성되면 유리 mRNA를 첨가하고 Ringer 락테이트 용액으로 최종 농도를 조절한다.
1.6. 설계된 mRNA 컨스트럭트의 발현 분석:
표 4에 나타낸 mRNA 컨스트럭트는 세포 배양에서 뿐만 아니라 토끼 망상체 용해물 시스템(Rabbit Reticulocte Lysate System)을 사용한 시험관내 번역을 통해 그들의 발현이 시험되었으며, 이후 웨스턴 블롯 또는 당업계에 일반적으로 알려진 FACS 분석을 통한 검출을 수행했다 (자세한 내용 및 예시적인 결과는 실시예 2 참조).
실시예 2a: SARS-CoV-2 단백질(S, S_stab, S1)을 코딩하는 mRNA 컨스트럭트의 발현 분석
mRNA 컨스트럭트의 시험관 내 단백질 발현을 결정하기 위해, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 단편(S, S_stab, S1)을 코딩하는 컨스트럭트를 제조업체의 프로토콜에 따라 Promega Rabbit Reticulocyte Lysate System의 구성 요소와 혼합했다. 용해물에는 단백질 합성에 필요한 세포 성분(tRNA, 리보솜, 아미노산, 개시, 연장 및 종결 인자들)이 포함되어 있다. 양성 대조군으로는 Lysate System Kit의 루시페라제 RNA를 사용하였다. 번역 결과는 SDS-Page 및 Western Blot 분석(IRDye 800CW 스트렙타비딘(streptavidin) 항체(1:2000))으로 분석하였다. 표 5는 시험된 RNA 컨스트럭트를 요약한다.
실시예 2a에서 사용된 mRNA 컨스트럭트의 개요
레인 명칭 약어 CDS opt. mRNA ID 서열 번호: RNA
1 스파이크 단백질 S opt1 R9514 162, 12743
2 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab opt10 R9519 165, 13013
3 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab opt1 R9515 163, 12810
4 S 단편 (1-681) 스파이크 단백질 S1 opt10 R9518 168, 13027
5 S 단편 (1-681) 스파이크 단백질 S1 opt1 R9513 166, 12824
6 RNAse 유리 수(water)
7 양성 대조군, Lysate System Kit에서 유래한 대조군 RNA
결과:
도 1에서 볼 수 있듯이, 사용된 mRNA 컨스트럭트는 mRNA 기반 SARS-CoV-2 백신의 전제 조건인, 예상 크기(S 또는 S_stab: 140kDa, S1: 75kDa)의 검출 가능한 단백질 발현을 유도했다.
실시예 2b : HeLa 세포에서 SARS-CoV-2 단백질(S, S_stab, S1)의 발현 및 FACS에 의한 분석
mRNA 컨스트럭트의 시험관 내 단백질 발현을 결정하기 위해, HeLa 세포를 SARS-CoV-2 단백질(S, S_stab, S1)을 코딩하는 mRNA로 일시적으로 형질감염시키고 적절한 항-스파이크 단백질 항체(마우스에서 발생)를 사용하여 염색하고, FITC 결합 이차 항체로 카운터염색하였다. HeLa 세포를 형질감염 24시간 전에 세포 배양 배지(RPMI, 10% FCS, 1% L-글루타민, 1% Pen/Strep)에서 400,000개 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 시딩했다. HeLa 세포는 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 2μg 비제제화 mRNA로 형질감염되었다. 실시예 1에 따라 제조되고 표 6에 열거된 mRNA 컨스트럭트를 실험에서 사용하였고, 음성 대조군(주사용수)이 포함되었다. 형질감염 24시간 후, HeLa 세포는 적절한 항스파이크 단백질(SARS S에 대해 발생된 S 특이적 항체, SARS-Cov-2 S에 대해 교차 반응성) 항체(마우스에서 발생, 1:250) 및 항-마우스 FITC 표지된 이차 항체(1:500)로 염색되었고, 후속적으로 FACS Diva 소프트웨어를 사용하여 BD FACS Canto II에서 유세포 분석(FACS)에 의해 분석되었다. 형광 FITC 신호의 정량적 분석은 FlowJo 소프트웨어 패키지(Tree Star, Inc.)를 사용하여 수행되었다.
실시예 2b에서 사용된 mRNA 컨스트럭트의 개요
레인 명칭 약어 CDS opt. mRNA ID 서열 번호: RNA
1 스파이크 단백질 S opt1 R9514 162, 12743
2 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab opt1 R9515 163, 12810
3 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab opt10 R9519 165, 13013
4 S 단편 (1-681) 스파이크 단백질 S1 opt1 R9513 166, 12824
5 S 단편 (1-681) 스파이크 단백질 S1 opt10 R9518 168, 13027
6 RNAse 유리 수(water)
결과:
도 2에 도시된 바와 같이, 사용된 mRNA 컨스트럭트는 전장 S(S 및 S_stab)에 대해 검출가능한 세포 표면 발현을 유도하였다. S1 단편에는 막횡단 도메인이 없기 때문에 세포 표면에서 발현이 감지되지 않았다(도 2).
실시예 2c : 웨스턴 블롯을 이용한 SARS-CoV-2 단백질(S, S_stab, S1)의 발현 분석
SARS-CoV-2 S 발현의 분석을 위해, HeLa 세포를 형질감염제로 Lipofectamine을 사용하여 비제제화 mRNA로 형질감염시켰다. HeLa 세포를 6웰 플레이트에 300,000개 세포/웰의 밀도로 시딩했다. HeLa 세포는 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 2μg 비제제화 mRNA로 형질감염되었다. 실시예 1에 따라 제조되고 표 7에 열거된 mRNA 컨스트럭트가 실험에 사용되었고, 음성 대조군(주사용수)이 포함되었다. 형질감염 24시간 후, HeLa 세포는 트립신이 없는/EDTA 완충액에 의해 분리되고, 수확되고, 세포 용해물이 준비되었다. 세포 용해물에 SDS-PAGE를 수행한 후 웨스턴 블롯 검출을 수행했다. 웨스턴 블롯 분석은 적절한 2차 항체와 함께 사용된 항스파이크 단백질(SARS S, SARS-CoV-2 S에 대한 교차 반응성) 항체를 사용하여 수행되었다.
실시예 2c에서 사용된 mRNA 컨스트럭트의 개요
레인 명칭 약어 CDS opt. mRNA ID 서열 번호: RNA
1 S 단편 (1-681) 스파이크 단백질 S1 opt1 R9513 166, 12824
2 스파이크 단백질 S opt1 R9514 162, 12743
3 S 단편 (1-681) 스파이크 단백질 S1 opt10 R9518 168, 13027
4 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab opt10 R9519 165, 13013
5 스파이크 융합전 안정화 단백질 S_stab opt1 R9515 163, 12810
6 RNAse 유리 수
결과:
발현은 세포 용해물(도 3) 내 모든 mRNA에 대해 검출 가능했고, 전체 길이 S: 예상 크기 140kDa, 2개의 주요 밴드 약 90kDA 및 180kDa이었고, 2개의 주요 밴드는 처리되지 않은 S 단백질(S0)의 글리코실화된 형태 및 절단된 S2 서브유닛, S1: 70kDa, 글리코실화된 가능성 있음)이었다.
실시예 3 : SARS-CoV-2 단백질 디자인 항원(S, S_stab)을 코딩하는 mRNA로 마우스의 백신접종
LNP 제제화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조되었다. HPLC 정제된 mRNA는 생체내 백신접종 실험에서 사용하기 전에 실시예 1.4에 따라 LNP와 함께 제제화된다.
면역(Immunization):
암컷 BALB/c 마우스(6-8주령)에 표 5에 나타낸 mRNA 백신 조성물 및 용량을 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 한 그룹의 마우스에 완충액을 백신 접종하였다. 모든 동물은 0일 및 21일에 백신을 접종하였다. 항체 역가를 결정하기 위해 21일(프라임 후) 및 42일(부스트 후)에 혈액 샘플을 수집하였다.
백신 접종 요법(실시예 3):
그룹 SARS-CoV-2 스파이크 단백질
서열 번호: 		CDS 최적화 제제 용량
1 S서열 번호: 148, 155, 162, 또는 169 opt1 LNP 5㎍
2 S서열 번호: 148, 155, 162, 또는 169 opt1 LNP 2.5㎍
3 S서열 번호: 148, 155, 162, 또는 169 opt1 LNP 1.25㎍
4 S 안정화 (S_stab)서열 번호: 149, 156, 163, 또는 170 opt1 LNP 5㎍
5 S 안정화 (S_stab)서열 번호: 149, 156, 163, 또는 170 opt1 LNP 2.5㎍
6 S 안정화 (S_stab)서열 번호: 149, 156, 163, 또는 170 opt1 LNP 1.25㎍
7 S 안정화 (S_stab)서열 번호: 150, 157, 164, 또는 171 opt3 LNP 5㎍
8 S 안정화 (S_stab)서열 번호: 150, 157, 164, 또는 171 opt3 LNP 2.5㎍
9 S 안정화 (S_stab)서열 번호: 150, 157, 164, 또는 171 opt3 LNP 1.25㎍
7 S 안정화 (S_stab)서열 번호: 151, 158, 165, 또는 172 opt10 LNP 5㎍
8 S 안정화 (S_stab)서열 번호: 151, 158, 165, 또는 172 opt10 LNP 2.5㎍
9 S 안정화 (S_stab)서열 번호: 151, 158, 165, 또는 172 opt10 LNP 1.25㎍
10 완충액
ELISA를 사용한 IgG1 및 IgG2 항체 역가 측정:
ELISA는 코팅을 위해 재조합 SARS-CoV-2 S(세포외 도메인) 단백질을 사용하여 수행된다. 코팅된 플레이트는 각각의 혈청 희석액을 사용하여 인큐베이션되고 SARS-CoV-2 S에 대한 특이적 항체의 결합은 기질로 Amplex와 함께 스트렙타비딘-HRP(horse radish peroxidase)가 뒤따르는 비오틴화된 이소타입 특이적 항-마우스 항체를 사용하여 검출된다. 항체(IgG1, IgG2a)의 종점 역가는 백신 접종 후 21일 및 42일에 ELISA에 의해 측정된다.
스파이크 단백질 특이적 면역 반응의 검출:
Hela 세포는 리포펙타민을 사용하여 스파이크 단백질을 코딩하는 2μg의 mRNA로 형질감염된다. 세포를 형질감염 20시간 후에 수확하고 96웰 플레이트에 웰당 1×105로 시딩한다. 세포를 백신 접종된 마우스의 혈청 샘플(1:50로 희석)과 함께 인큐베이션한 다음 FITC-접합된 항-마우스 IgG 항체와 함께 인큐베이션한다. DIVA 소프트웨어를 사용한 BD FACS Canto II에서 세포를 획득하고 FlowJo로 분석했다.
세포내 사이토카인 염색:
백신접종된 마우스로부터의 비장세포는 당업계에 공지된 표준 프로토콜에 따라 단리된다. 간단히 말해서, 분리된 비장은 세포 스트레이너(strainer)를 통해 갈고 PBS/1%FBS로 세척한 다음 적혈구 용해를 수행한다. PBS/1%FBS로 광범위한 세척 단계 후, 비장세포를 96웰 플레이트에 접종한다(웰당 2 × 106세포). 세포는 단백질 수송 억제제의 존재 하에서 37 ℃에서 6시간 동안 2.5μg/ml의 항-CD28 항체(BD Biosciences)의 존재 하에 SARS-CoV-2 S 단백질 특이적 펩티드 에피토프(각 펩티드의 5μg/ml)의 혼합물로 자극된다. 자극 후, 세포는 제조업체의 지침에 따라 Cytofix/Cytoperm 시약(BD Biosciences)을 사용하여 세포내 사이토카인에 대해 세척되고 염색된다. 항체 Thy1.2-FITC (1:200), CD8-APC-H7 (1:100), TNF-PE (1:100), IFNγ-APC (1:100) (eBioscience), CD4-BD Horizon V450 (1:200) (BD Biosciences)가 염색에 사용되고, 1:100으로 희석된 Fcγ-블록과 함께 인큐베이션된다. Aqua Dye(Invitrogen)는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는데 사용된다. 세포는 Canto II 유세포 분석기(Beckton Dickinson)를 사용하여 획득된다. FlowJo 소프트웨어 패키지(Tree Star, Inc.)를 사용하여 유세포 분석 데이터를 분석한다.
바이러스 중화 역가의 결정:
CPE(cytopathic effect, 세포변성 효과) 또는 유사형 입자 기반 분석을 통해 검출된 SARS-CoV-2 중화 역가(VNT)의 결정을 위해 혈청을 수집한다.
실시예 4 : SARS-CoV-2 항원 S1을 코딩하는 mRNA로 마우스의 백신접종
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 생체내 백신접종 실험에서 사용하기 전에 실시예 1.4에 따라 LNP로 제제화된다.
면역:
암컷 BALB/c 마우스(6-8주령)에 표 6에 나타낸 mRNA 백신 조성물 및 용량을 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 한 그룹의 마우스에 완충액으로 백신접종하였다. 모든 동물은 0일 및 21일에 백신을 접종하였다. 항체 역가를 결정하기 위해 21일(프라임 후) 및 42일(부스트 후)에 혈액 샘플을 수집하였다.
백신접종 요법 (실시예 4)
그룹 SARS-CoV-2 스파이크 단백질
서열 번호: 		CDS 최적화 제제 용량
1 스파이크 S1
서열 번호: 152, 159, 166, 또는 173		 opt1 LNP 5㎍
2 스파이크 S1
서열 번호: 152, 159, 166, 또는 173		 opt1 LNP 2.5㎍
3 스파이크 S1
서열 번호: 152, 159, 166, 또는 173		 opt1 LNP 1.25㎍
1 스파이크 S1
서열 번호: 153, 160, 167, 또는 161		 opt3 LNP 5㎍
2 스파이크 S1
서열 번호: 153, 160, 167, 또는 161		 opt3 LNP 2.5㎍
3 스파이크 S1
서열 번호: 153, 160, 167, 또는 161		 opt3 LNP 1.25㎍
1 스파이크 S1
서열 번호: 154, 161, 168, 또는 175		 opt10 LNP 5㎍
2 스파이크 S1
서열 번호: 154, 161, 168, 또는 175		 opt10 LNP 2.5㎍
3 스파이크 S1
서열 번호: 154, 161, 168, 또는 175		 opt10 LNP 1.25㎍
4 완충액
ELISA, ICS 및 VNT를 통한 특이적 면역 반응의 유도는 앞서 기술된 바와 같이 결정된다(실시예 3 참조).
실시예 5 : SARS-CoV-2 항원 디자인(S_stab)을 코딩하는 mRNA로 마우스의 백신접종
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
면역:
암컷 BALB/c 마우스(6-8주령)에 표 10에 나타낸 바와 같이 mRNA 백신 조성물 및 용량을 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 한 그룹의 마우스에 완충액으로 백신접종하였다. 모든 동물은 0일에 백신 접종을 받았습니다. 항체 역가를 결정하기 위해 21일에 혈액 샘플을 수집했다.
백신접종 요법 (실시예 5):
그룹 백신 조성물 mRNA ID CDS opt. 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA 용량
A LNP에 제제화된, S_stab 코딩 mRNA R9519 opt10 10, 341 165, 13013 2㎍
B Rec. 단백질 SARS-CoV-2 S ECD (세포외 도메인) + alum -- -- 1.5㎍
C 완충액 -- -- --
ELISA를 사용한 IgG1 및 IgG2 항체 역가 측정:
코팅을 위해 재조합 SARS-CoV-2 S 단백질을 사용하여 ELISA가 수행되었다. 코팅된 플레이트를 각각의 혈청 희석액을 사용하여 인큐베이션하고, SARS-CoV-2 S에 대한 특이적 항체의 결합을 바이오티닐화된 이소타입 특이적 항-마우스 항체에 이어 Amplex를 기질로 하는 스트렙타비딘-HRP(horse radish peroxidase)를 사용하여 검출했다. 항체(IgG1, IgG2a)의 종말점 역가는 단일 프라임 백신접종 후 21일째에 ELISA에 의해 측정되었다.
결과:
도 4에 나타낸 바와 같이, 전장 S 안정화 단백질을 코딩하는 mRNA를 사용한 백신접종은 단일 백신접종 후 (d21) 높은 역가의 S 특이적 결합 항체를 유도하였다. 애쥬번트가 첨가된 재조합 S 단백질과 비교하여, mRNA 백신은 유사한 IgG1 역가 및 더 높은 IgG2a 역가를 유도하였다.
실시예 6 : SARS-CoV-2 항원 디자인을 코딩하는 mRNA로 마우스의 백신접종
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
면역:
암컷 BALB/c 마우스(6-8주령)에 표 11에 나타낸 mRNA 백신 조성물 및 용량을 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 한 그룹의 마우스에 완충액으로 백신접종하였다. 모든 동물은 0일 및 21일에 백신 접종을 받았다. 항체 역가를 결정하기 위해 21일(프라임 후) 및 42일(부스트 후)에 혈액 샘플을 수집했다.
백신접종 요법 (실시예 6):
그룹 백신 조성물 mRNA ID CDS opt. 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA 용량
A LNP로 제제화된, S_full length을 코딩하는 mRNA R9514 opt1 1 162 2㎍
B LNP로 제제화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 10 163 2㎍
C LNP로 제제화된, S_stab 코딩 mRNA R9519 opt10 10 165 2㎍
D 완충액 -- -- --
ELISA를 사용한 IgG1 및 IgG2 항체 역가 측정:
코팅을 위해 재조합 SARS-CoV-2 S(세포외 도메인) 단백질을 사용하여 ELISAr가 수행되었다. 코팅된 플레이트를 각각의 혈청 희석액을 사용하여 인큐베이션하고, SARS-CoV-2 S에 대한 특이적 항체의 결합을 바이오티닐화된 이소타입 특이적 항-마우스 항체에 이어 Amplex를 기질로 하는 스트렙타비딘-HRP(horse radish peroxidase)를 사용하여 검출했다. 항체(IgG1, IgG2a)의 종점 역가를 프라임 백신접종 후 21일 및 42일에 ELISA에 의해 측정하였다.
바이러스 중화 역가의 결정:
CPE(세포변성 효과)를 통해 검출된 SARS-CoV-2 중화 역가(VNT)의 결정을 위해 혈청을 수집했다. 1:10의 시작 희석액에 이어 1:2의 연속 희석으로 이중으로 테스트된 열-비활성화 혈청(30분 동안 56 ℃)의 연속 희석물을 야생형 SARS-CoV-2(strain 2019-nCov/Italy-INMI1)와 함께 1시간 동안 37 ℃에서 배양했다. 모든 플레이트에는 세포와 배지만 포함하는 세포 제어 전용 열(8개 웰)과 세포와 바이러스만 포함하는 바이러스 제어 전용 열이 포함되었다. 감염성 바이러스는 Vero E6 세포(ATCC, Cat.1586)의 합류층(confluent layer)과 함께 100μl의 바이러스-혈청 혼합물의 배양 후 정량화되었으며, 이어서 37 ℃에서 3일 동안 배양되고, CPE 형성에 대한 현미경적 점수가 매겨졌다. 작동하는 바이러스 용액의 TCID50의 정확한 범위를 확인하기 위해 각 실행에 대해 역적정(back titration)을 수행했다. VN 역가는 Reed & Muench에 의해 기술된 방법에 따라 계산되었다. 중화가 관찰되지 않은 경우(MNt <10), 임의의 값 5가 보고되었다. VisMederi srl(Siena, Italy)에서 분석을 수행했다.
세포내 사이토카인 염색:
백신접종된 마우스로부터의 비장세포를 당업계에 공지된 표준 프로토콜에 따라 단리하였다. 간단히 말해서, 분리된 비장을 세포 스트레이너를 통해 분쇄하고 PBS/1% FBS로 세척한 후 적혈구 용해를 수행했다. PBS/1%FBS를 사용한 광범위한 세척 단계 후, 비장세포를 96웰 플레이트에 접종했다(웰당 2 × 106개 세포). 세포는 단백질 수송 억제제의 존재 하에서 37 ℃에서 6시간 동안 2.5㎍/ml의 항-CD28 항체(BD Biosciences)의 존재 하에 SARS-CoV-2 S 단백질 특이적 펩티드 에피토프의 혼합물(각 펩티드의 5㎍/ml)로 자극되었다. 자극 후 세포를 세척하고 제조업체의 지침에 따라 Cytofix/Cytoperm 시약(BD Biosciences)을 사용하여 세포 내 사이토카인을 염색했다. 항체 Thy1.2-FITC (1:200), CD8-APC-H7 (1:100), TNF-PE (1:100), IFNγ-APC (1:100) (eBioscience), CD4-BD Horizon V450 (1:200) (BD Biosciences) 를 염색에 사용했고, 1:100으로 희석된 Fcγ-블록과 함께 인큐베이션했다. Aqua Dye(Invitrogen)는 살아있는/죽은 세포를 구별하기 위해 사용되었다. 세포는 Canto II 유세포 분석기(Beckton Dickinson)를 사용하여 획득했다. FlowJo 소프트웨어 패키지(Tree Star, Inc.)를 사용하여 유세포 분석 데이터를 분석했다.
결과:
도 5A 및 B에 도시된 바와 같이, 전장 S 단백질 및 전장 S 안정화 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA를 사용한 백신접종은 단일 백신접종(d21) 후 높은 역가의 S 특이적 결합 항체를 유도하였다(도 5A: IgG1, 도 5B: IgG2a). 역가는 두 번째 백신접종 후 증가했다(d42). 모든 mRNA 디자인은 어느 정도 유사한 항체 역가를 유도한 반면, 그룹 C의 마우스는 다른 그룹과 비교하여 d21에 감소된 수준의 IgG2a 항체를 나타냈다. 도 5C에 나타낸 바와 같이 전장 S 단백질 및 전장 S 안정화 단백질을 코딩하는 mRNA를 사용한 백신접종은 2회의 백신접종 후 강력한 수준의 바이러스 중화 항체를 유도하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 전장 S 단백질 및 전장 S 안정화된(S_stab) 단백질을 코딩하는 mRNA를 사용한 백신접종은 CD4+ 및 CD8+ IFNγ/TNF 이중 양성 T 세포 둘 모두를 유도하였다.
실시예 7 : 상이한 백신접종 스케줄에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물의 생체내 면역원성
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
면역:
암컷 BALB/c 마우스(6-8주령)에 표 12에 표시된 mRNA 백신 조성물 및 용량을 근육내(i.m.) 주사했다. 그룹 I은 Alum 애주번트 추가된 SARS-CoV2 스파이크 단백질(S 세포외 도메인)(1.5μg, 인산염 완충 생리식염수[PBS]에 완충된 5.6μl Alhydrogel 내). 음성 대조군으로서, 한 그룹의 마우스에 완충액(0.9% NaCl)으로 백신접종하였다.
동물은 0일, 7일, 14일 또는 21일에 첫 번째 백신접종을 받았다. 모든 동물은 28일에 두 번째 백신접종을 받았다. SARS-CoV-2 S 결합 항체의 존재는 28일 및 35일에 분석되었으며, 바이러스 중화 역가(VNT)를 28, 35 및 49일에 분석했다. 백신 접종 후 T 세포 반응의 유도를 실험 49일에 평가했다. 이 실험 설정은 특정 면역 반응의 시작을 결정하고 첫 번째 면역화에서 두 번째 면역화까지의 백신접종 간격이 마우스에서 가장 높은 면역 반응을 생성하는지 확인하기 위해 선택되었다.
백신접종 요법 (실시예 7):
그룹 백신 조성물 mRNA ID 백신 접종 CDS opt. 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA 용량
A LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA (CVnCoV) R9515 d21, d28 opt1 10 163 2㎍
B LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA (CVnCoV) R9515 d14, d28 opt1 10 163 2㎍
C LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA (CVnCoV) R9515 d7, d28 opt1 10 163 2㎍
D LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA (CVnCoV) R9515 d0, d28 opt1 10 163 2㎍
E LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9519 d21, d28 opt10 10 165 2㎍
F LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9519 d14, d28 opt10 10 165 2㎍
G LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9519 d7, d28 opt10 10 165 2㎍
H LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9519 d0, d28 opt10 10 165 2㎍
I 양성 대조군 (alum 애주번트 첨가 S 단백질) -- d0, d28 -- -- -- --
J 완충액 -- d0, d28 -- -- -- --
RNA 유도 선천 면역 반응의 특성화:
혈액 샘플은 LNP으로 제형화된 S_stab을 코딩하는 mRNA(그룹 A에 대해 예시적으로 표시됨), 양성 대조군 또는 완충액를 투여한 후 14시간 후에 안와후 출혈을 통해 채취되었다. 혈청 사이토카인(IFN-γ, IL-1β TNF, IL-6, IL-4, IL-5 및 IL-13)은 BD FACS CANTO II를 사용하여 세포측정 비드 어레이(CBA)를 사용하여 평가되었다. 혈청을 1:4로 희석하고 제조업체의 프로토콜에 따라 BD Bioscience 마우스 사이토카인 플렉스 세트를 사용하여 혈청 사이토카인 수준을 결정했다.
다음 플렉스 세트가 사용되었다: 마우스 IFN-γ Flex Set RUO (A4) (BD Bioscience, Cat. 558296); 마우스 Il-13 Flex Set RUO (B8) (BD Bioscience, Cat. 558349); Mouse IL-1β Flex Set RUO (E5) (BD Bioscience, Cat. 560232); 마우스 Il-4 Flex Set RUO (A7) (BD Bioscience, Cat. 558298); 마우스 Il-5 Flex Set RUO (A6) (BD Bioscience, Cat. 558302); 마우스 IL-6 Flex Set RUO (B4) (BD Bioscience, Cat. 558301); 마우스 TNF Flex Set RUO (C8) (BD Bioscience, Cat. 558299).
IFN-α는 제조업체의 지침에 따라 VeriKine-HS 마우스 IFN-α 혈청 ELISA 키트(pbl, Cat. 42115-1)를 사용하여 정량화되었다. 혈청을 1:100으로 희석하고 희석액 50μl를 테스트했다.
ELISA를 사용한 IgG1 및 IgG2 항체 역가 측정:
코팅을 위해 재조합 SARS-CoV-2 S(세포외 도메인) 단백질을 사용하여 ELISA가 수행되었다. 코팅된 플레이트를 각각의 혈청 희석액을 사용하여 인큐베이션하고, SARS-CoV-2 S에 대한 특이적 항체의 결합을 바이오티닐화된 이소타입 특이적 항-마우스 항체에 이어 Amplex를 기질로 하는 스트렙타비딘-HRP(horse radish peroxidase)를 사용하여 검출했다.
바이러스 중화 역가의 결정:
야생형 SARS-CoV-2 바이러스를 사용하는 CPE(cytopathic effect)를 통해 검출된 SARS-CoV-2 중화 역가(VNT)의 결정을 위해 혈청을 수집했다. 마우스 혈청의 바이러스 중화 역가를 분석하기 위해, 1:10의 시작 희석액에 이어 1:2 연속 희석액으로 이중으로 테스트된 열 비활성화된(30분 동안 56℃) 혈청의 연속 희석액을 100 TCID50의 야생형 SARS-CoV-2(strain 2019-nCov/Italy-INMI1)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 모든 플레이트에는 세포와 배지만 포함하는 세포 제어 전용 열(8개 웰)과 세포와 바이러스만 포함하는 바이러스 제어 전용 열이 포함되었다. 감염성 바이러스는 Vero E6 세포(ATCC, Cat.1586)의 합류층과 함께 100μl의 바이러스-혈청 혼합물의 배양 후 정량화되었으며, 이어서 37 ℃에서 3일 동안 배양되고 CPE 형성에 대한 현미경적 점수가 매겨졌다. 작동하는 바이러스 용액의 TCID50의 정확한 범위를 확인하기 위해 각 실행에 대해 역적정을 수행했다. VN 역가는 Reed & Muench에 의해 기술된 방법에 따라 계산되었다. 중화가 관찰되지 않은 경우(MNt <10), 임의의 값 5가 보고되었다. VisMederi srl(Siena, Italy)에서 분석을 수행했다.
세포내 사이토카인 염색:
비장세포를 분리하고 SARS-CoV-2 스파이크 특이적 펩티드 라이브러리로 24시간 동안 자극했다. 후속적으로 세포를 분화 클러스터 8(CD8) 및 CD4 T 세포(표면)에 대해 염색하고 INF-γ 및 TNF(세포내)에 대해 염색하여 백신 특이적 펩티드에 의해 특이적으로 활성화된 다기능 T 세포의 유도를 평가하였다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 함께 배양된 세포는 음성 대조군으로 사용되었다. 세포는 Canto II flow cytometer (Beckton Dickinson)를 사용하여 획득했다. FlowJo 소프트웨어 패키지(Tree Star, Inc.)를 사용하여 Flow cytometry 분석 데이터를 분석했다.
결과
도 7에 나타난 바와 같이 사이토카인 분석은 각각 TH1 및 TH2 반응을 나타내는, IFNγ 또는 IL4, IL-5 및 IL-13에 대한 편향을 나타내지 않는 LNP로 제형화된 S_stab을 코딩하는 mRNA (CVnCoV) 주사에 대한 균형 잡힌 면역 반응의 유도를 입증했다. 낮은 수준의 전-염증성 사이토카인 IL-6, IFNγ은 혈청에서 검출 가능했지만, TNF와 IL1β은 검출되지 않았다.
도 8A에 나타낸 바와 같이 전장 S 안정화 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA R9515를 사용한 백신접종은 첫 번째 백신접종 시 면역 반응의 빠른 개시를 유도하였다. 단일 i.m. 투여한 백신 조성물은 주사 후 7일에 결합 항체를 유도하기에 충분하였다.
도 8B에 도시된 바와 같이 전장 S 안정화 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA를 사용한 백신접종은 CDS 최적화와 무관하게 필적할만한 항체 역가를 유도하였다. 결합 항체의 수준은 백신접종과 혈청 샘플링 사이의 간격이 길어질수록 증가했다(도 8A+B). 두 번째 백신접종는 주사 후 1주(35일)에 결합 항체의 전체 역가를 증가시킬 수 있었다. 1차 백신접종과 2차 백신접종 사이의 더 긴 간격을 특징으로 하는 그룹에서 더 높은 수준의 결합 항체 역가가 35일째에 관찰되었다. 애주번트를 첨가한 재조합 스파이크 단백질 백신(그룹 I)은 유사한 수준의 결합 IgG1 항체를 유도했지만, IgG2a 역가는 모든 mRNA 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 낮았다.
도 9A+B에 도시된 바와 같이, 낮지만 검출 가능한 수준의 VNT가 첫 번째 백신접종 후 28일에 존재했다(그룹 D 및 H). VNT 수준은 연구 35일 및 49일에 분석된 모든 그룹에 걸쳐 2차 백신접종 후에 증가했다. 증가된 결합 항체와 함께, VNT는 시간이 지남에 따라 그리고 첫 번째와 두 번째 백신접종 사이의 간격이 더 긴 그룹에서 증가했다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 다기능성 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 강한 증가가 백신접종된 동물에서 관찰되었다.
다기능 T 세포의 강력한 유도와 결합, 더 중요하게는 기능적 항체의 유도는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 코딩하는 mRNA 백신이 마우스에서 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 시사한다.
백신은 동등한 수준의 IgG1 및 IgG2a 항체의 유도뿐만 아니라 TH2 편향, 즉 IL4, IL5 및 IL13의 유도를 나타내지 않는 사이토카인 프로필에 의해 표시되는 균형 잡힌 Th1/Th2 프로필을 유도했다.
실시예 8 : SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 mRNA로 래트의 백신접종
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 생체내 백신접종 실험에서 사용하기 전에 실시예 1.4에 따라 LNP와 함께 제형화되었다.
면역:
표 13에 나타낸 바와 같이 mRNA 백신 조성물 및 용량을 래트에 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 래트의 한 그룹을 완충제으로 백신접종하였다(그룹 A). 모든 동물을 0일 및 21일에 백신접종하였다. 항체 역가의 측정을 위해 21일(프라임 후) 및 42일(부스트 후)에 혈액 샘플을 수집하였다.
백신접종 요법 (실시예 8):
그룹 백신 조성물 mRNA ID CDS opt. 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA 용량
A 완충액 -- -- -- --
B LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 10 163 0.5㎍
C LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 10 163 2㎍
D LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 10 163 10㎍
E LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 10 163 40㎍
F LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 10 163 80㎍
ELISA를 사용한 IgG1 및 IgG2 항체 역가 측정:
코팅을 위해 재조합 SARS-CoV-2 S(세포외 도메인) 단백질을 사용하여 ELISAr가 수행되었다. 코팅된 플레이트를 각각의 혈청 희석액을 사용하여 인큐베이션하고 SARS-CoV-2 S에 대한 특이적 항체의 결합을 마우스 ELISA에 사용된 2차 HRP 항체 대신 표지된 HRP 항체로 직접 검출했다. 랫트 ELISA에서 신호 증폭의 부족은 더 낮은 역가의 이유가 될 수 있으므로, 랫트와 마우스 연구 간의 ELISA 역가는 현재 비교할 수 없다.
바이러스 중화 항체 역가(VNT)의 측정
랫트 혈청 샘플의 바이러스 중화 항체 역가(VNT)를 마우스 혈청을 사용하여 이전 실시예 6에 기재된 바와 같이 분석하였다.
결과:
도 11A-C에 나타낸 바와 같이, LNP에서 제형화된 전장 S 안정화 단백질 mRNA 을 사용한 0.5㎍, 2㎍ 및 10㎍ 용량 백신접종은 21일째에 결합 항체 역가의 용량 의존적 레벨을 유도하였고, 40㎍ 및 80㎍으로 백신접종된 그룹에서 포화에 도달했다. 도 11D 및 E는 제1 백신접종 후 42일째에 결합 항체 역가의 레벨을 나타낸다. 두 번째 백신접종은 항체 역가를 추가로 증가시켰다.
도 11F 및 G에 나타낸 바와 같이, LNP에서 제형화된 전장 S 안정화 단백질 mRNA을 사용한 백신접종은 랫트에서 용량 의존적 수준의 VNT를 유도하였다.
실시예 9 : SARS-CoV-2에 감염된 햄스터에 대한 챌린지 연구
LNP로 제형화된 S_stab을 코딩하는 mRNA (CVnCoV)의 보호 효능은 시리아 햄스터에서 다루어졌다. 이 모델은 경증 내지 중등도의 인간 폐 질환 병리를 나타내며 인간 관련 면역원성 및 병인을 조사하기 위해 인정되고 수용되는 모델 중 하나이다 (Mu
Figure pct00021
oz-Fontela et al, PMID 32967005). 햄스터는 야생형 SARS-CoV-2 감염에 취약하여, 바이러스 표적 기관에서 높은 수준의 바이러스 복제 및 조직병리학적 변화를 초래한다.
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조하였다. HPLC 정제된 mRNA는 생체내 백신접종 실험에서 사용하기 전에 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
예방접종 및 챌린지:
시리아 골든 햄스터(n=5/그룹, 11 내지 13주령)에 표 14(예를 들어, 그룹 E 및 F 참조)에 나타낸 mRNA 백신 조성물 및 용량을 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 한 그룹의 햄스터는 처리되지 않고 모의 감염(완충제로)(그룹 A)되었고, 다른 그룹은 완충제 대조군으로서 NaCl을 주사하였다. 양성 대조군으로서 C군은 0일째에 0.1ml의 102 TCID50/용량의 SARS CoV-2 분리주 BetaCoV/Munich/BavPat1/2020 (D614G　치환 포함)를 비강내로 감염시켰다. 추가 양성 대조군으로서 D군은 Alhydrogel (Brennetag) 2%로 애주번트 첨가된 5μg의 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (S1+S2 ECD, His tag; Sino Biological, Cat. 40589-V08B1)을 근육 주사했다. 항체 역가의 결정을 위해 혈액 샘플을 28일(프라임 후) 및 42일 및 56일(부스트 후)에 수집했다. 동물은 56일째에 0.1ml의 총 용량 부피의 102 TCID50/용량의 SARS CoV-2로 비강 내로 챌린지되었다. 동물은 챌린지 후 4일 동안(p.c.) 추적되었고 실험 60일째에 안락사되었다.
백신접종 요법 (실시예 9):
그룹 백신 조성물 mRNA ID 용량 백신 접종 CDS opt. 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA
A 처리되지 않음/모의 감염(Untreated/mock infected)
B NaCl d0, d28 -- -- --
C SARS-CoV-2 감염 102 TCID50 d0 -- -- --
D 양성 대조군 (alum 애주번트 추가 S 단백질) 1.5㎍ d0, d28 -- -- --
E LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA (CVnCoV) R9515 2㎍ d0, d28 opt1 10 163
F LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA (CVnCoV) R9515 10㎍ d0, d28 opt1 10 163
항체 분석
ELISA를 통한 총 IgG 항체 측정을 위해 28일, 42일 및 56일에 혈액 샘플을 채취했다. 플레이트를 37℃에서 4-5시간 동안 1μg/ml의 SARS-CoV-2 스파이크 S(세포외 도메인) 단백질로 코팅했다. 플레이트를 10% 우유에서 밤새 차단하고, 세척하고, 실온에서 2시간 동안 혈청과 함께 인큐베이션했다. 검출을 위해 햄스터 혈청을 비오틴 염소 항-햄스터(Syrian) IgG 항체(BioLegend, Cat: 405601)와 함께 인큐베이션한 후, HRP-Streptavidin(BD, Cat: 554066)과 인큐베이션했다. 특정 신호의 검출은 excitation 530/25, emission detection 590/35 및 45의 감도로 BioTek SynergyHTX 플레이트 판독기에서 수행되었다. 감염된 동물(그룹 C)에 대한 ELISA를 통한 IgG 항체 역가는 분석되지 않았다.
햄스터 혈청 샘플의 바이러스 중화 항체 역가(VNT)는 56℃에서 30분 동안 샘플의 열 불활성화 시 분석되었다. 3중, 연속 2배 희석물을 102 TCID50/웰 SARS-CoV-2 바이러스(돌연변이 D614G를 특징으로 함)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 1:10의 샘플 시작 희석을 유도했다. 바이러스-혈청 혼합물을 Vero E6 세포 배양 단층이 있는 96웰 플레이트로 옮기고 37℃에서 5일 동안 인큐베이션했다. 그 다음 플레이트는 활력 마커(vitality marker) WST8을 사용하여 점수를 매겼고 (100% 종말점) VN 역가는 Reed & Muench에 의해 기술된 방법에 따라 계산되었다.
호흡기의 바이러스 로드
챌린지 후 인후 면봉, 폐 및 비갑개 조직에서 복제 가능한 바이러스의 검출 가능한 수준을 분석했다. 4중의 10배 연속 희석액을 Vero E6 세포 배양 단층이 있는 96웰 플레이트로 옮기고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 세포 단층을 37℃에서 5일 동안 배양하기 전에 세척하였다. 이어서, 활력 마커 WST8을 사용하여 플레이트의 점수를 매기고, Spearman-Karber 방법을 사용하여 바이러스 역가(Log10 TCID50/ml 또는 /g)를 계산하였다.
햄스터에 챌린지 시 조직병리
챌린지 후 4일째에 샘플링된 조직에 대해 조직병리학적 분석을 수행하였다. 10% 포르말린으로 고정한 후, 절편을 파라핀에 포매하고 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 조직학적 검사를 하였다. 조직병리학적 평가 점수는 다음과 같다: 폐포염 중증도, 기관지염/세기관지염 중증도: 0 = 염증 세포 없음, 1 = 염증 세포 적음, 2 = 중간 정도 수의 염증 세포, 3 = 많은 염증 세포. 폐포염 정도, 0 = 0%, 1 = <25%, 2 = 25-50%, 3 = >50%. 폐포 부종 존재, 폐포 출혈 존재, II형 폐세포 증식 존재, 0 = 아니오, 1 = 예. 기관지주위/혈관주위 커프(peribronchial/perivascular cuffing)의 정도, 0 = 없음, 1 = 1-2 세포 두께, 2 = 3-10 세포 두께, 3 = >10 세포 두께.
결과
도 12A에서 볼 수 있듯이 4주 간격으로 2μg 또는 10μg의 CVnCoV 용량을 2회 백신접종한 햄스터는 첫 번째 백신접종 후 및 두 번째 백신접종 후 증가된 용량 의존적 S 결합 IgG 항체가 발생했다. 10μg의 CVnCoV 백신접종한 동물의 중앙값 종말점 역가는 1회 투여 후 1.6 × 105이었고 42일째에 7.8 × 105에서 최고조에 달했다. 감염된 동물(그룹 C)에 대해서는 ELISA를 통한 IgG 항체 역가는 분석되지 않았다.
도 12B에 나타낸 바와 같이, VNT의 검출가능한 레벨은 최초 백신접종 후 28일째에 존재하였다. VNT 레벨은 연구 42일 및 56일에 분석된 두 용량 그룹(그룹 E 및 F)에 걸쳐 두 번째 백신접종 후에 증가했다. 이 분석에 사용된 바이러스는 D614D 돌연변이를 특징으로 하지만 CVnCoV로 인코딩된 S_stab에는 이 돌연변이가 포함되지 않는다. 참고로 Alum-애주번트 추가 SECD 단백질을 투여받은 대조군은 검출 가능한 수준의 VNT를 유도하지 않고 IgG 항체를 나타내었다.
두 번째 백신 접종 4주 후인 56일째에, 모든 동물에 D614G를 특징으로 하는 SARS-CoV-2 (102 TCID50/용량)로 챌린지하였다. 완충제 대조군 동물에서, 56일째부터 60일째 종료까지 매일 채취한 인후 스왑에서 복제 가능한 바이러스의 레벨은 챌린지 후 2일째에 대략 103 TCID50/ml의 피크 바이러스 역가를 나타내었고 60일째에 거의 검출할 수 없는 수준으로 복귀했다. 이전에 SARS-CoV-2에 감염된 동물은 실험 내내 음성을 유지했다. 두 CVnCoV 백신접종 그룹의 인후 면봉에서의 바이러스 레벨은 유의하게 감소했다. 10μg의 CVnCoV를 사용한 백신접종은 챌린지 3일 후 101.5 TCID50/ml에서 바이러스 피크가 상당히 감소하고 지연되었다. 이 그룹의 동물 5마리 중 적어도 2마리는 테스트 기간 내내 음성으로 남아 있었다(도 12C 참조).
비갑개에서 바이러스 레벨은 덜 뚜렷하지만, 바이러스 복제의 검출 가능한 용량 의존적 감소를 나타냈다(도 12D). 중요하게도, 10μg의 CVnCoV로 백신접종된 동물은 폐에서 검출 가능한 바이러스 수준을 나타내지 않았으며, 이는 하기도에서 바이러스 복제로부터 동물을 보호하는 CVnCoV의 능력을 입증했다(도 12E).
조직병리학적 분석은 SARS-CoV-2 감염 시 완충액 대조군에서 폐포 손상 및 폐포, 기관지 및 기관(trachea) 염증의 발생을 보여주었다. 폐에서 바이러스 복제로부터 보호하는 것과 일치하게, CVnCoV는 10μg으로 2회 백신접종 시 조직병리학적 변화를 유의하게 감소시켰다. 중요하게도, 결합 항체를 유도하지만 낮은 수준의 VNT만 유도하는 2μg의 용량은 조직병리학 점수의 증가를 유도하지 않았다. 폐 균질액에서 차등적 유전자 발현에 대한 그룹 비교는 완충액 또는 모의 감염 그룹과 비교하여 mRNA 그룹에서 IL-4 또는 IL-5의 유도에서 유의한 변화를 나타내지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 따라서, 본 발명자들은 CVnCoV가 돌발성(breakthrough) 바이러스 복제가 발생하는 조건하에서도 (예를 들어, 항체 의존적 강화를 통해) 햄스터에서 강화된 질병을 유도하지 않는다는 결론을 내렸다. 제시된 데이터는 검출 가능한 수준의 VNT를 유도하지 않지만 높은 수준의 결합 항체를 유도하는 Alum-애주번트 첨가된 단백질 백신을 사용한 백신접종이 햄스터에서 증가된 조직병리학 점수를 유발함을 나타낸다(도 12F, 표 14).
도 12F에 표시된 조직병리학적 분석 목록:
조직병리학적 분석
1 폐포염/폐포 손상의 확장
2 폐포염의 중증도
3 확장 + 중증도 폐포염의 합
4 폐포 부종의 존재
5 폐포 출혈 존재
6 유형 II 폐구 증식증 존재(Type II pneumocytehyperplasia presence)
7 기관지염의 중증도
8 세기관지염의 중증도
9 기관지주위/혈관주위 커프의 정도
10 기관염의 중증도
11 비염의 중증도
강력한 면역 반응과 일관되게, CVnCoV는 S의 D614G 돌연변이를 특징으로 하는 SARS-CoV-2 바이러스 공격으로부터 햄스터를 보호하여 가장 널리 퍼진 형태의 바이러스로부터 보호하는 CVnCoV의 능력을 입증했다. 이 실험은 10μg의 CVnCoV로 2회 백신접종했을 때 상기도에서 복제 바이러스 수준의 현저한 감소와 동물의 폐에서 검출 가능한 살아있는 바이러스의 부재를 보여주었다.
실시예 10 : SARS-CoV-2 mRNA 백신 조성물의 임상 개발
mRNA 백신 조성물(들)의 안전성 및 면역원성을 입증하기 위해, 임상 시험(1상, 2a상)이 시작되었다. 1상 임상 시험에서 인간 자원자(18-60세)의 코호트에 최소 2회 근육 주사되었다 (예를 들어, 본 발명에 따라, LNP로 제형화된 (실시예 1.4에 개시된 바와 같이) SARS-CoV-2 스파이크 단백질(R9515, 서열 번호: 163)을 코딩하는 mRNA (CVnCoV)을 1일 및 29일에 2μg, 4μg, 8μg, 12μg, 16μg 또는 20μg 용량으로). 본 발명에 따른 백신 조성물의 안전성 프로파일을 평가하기 위해, 투여 후 대상체를 모니터링한다 (활력 징후, 백신접종 부위 및 전신 반응원성(reactogenicity) 평가, 혈액학적 분석). 면역화의 면역원성은 백신접종 대상의 혈청에서 SARS-CoV-2에 대한 항체, 바이러스 중화 역가(VNT) 및 SARS-CoV-2 특이적 T 세포를 평가하여 분석된다. 혈액 샘플은 기준선으로 1일째에, 각 백신접종 후 및 장기 추적기간 동안 수집된다.
코호트:
Figure pct00022
8일, 15일, 29일, 36일, 43일, 57일, 120일, 211일 및 393일에 다음이 결정되었다.
a.) ELISA에 의해 측정된, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 항체에 대해 혈청전환된 대상체의 비율.
SARS-CoV-2 N-항원을 ELISA로 측정했을 때 시험 전 또는 시험 중 적용가능한 샘플이 수집되기 전에 SARS-CoV-2에 노출되지 않은 대상체에서, 혈청전환은 기준선 대비 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 항체 역가의 증가로 정의된다.
기준선에서 SARS-CoV-2에 대해 혈청양성인 대상체에서, 혈청전환은 기준선에 비해 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 항체 역가의 2배 증가로 정의된다.
b.) ELISA로 측정한 혈청 내 개별 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 특이적 항체 레벨.
c.) 시험 전 또는 해당 샘플이 수집되기 전 시험 중에 SARS-CoV-2 N-항원에 대한 ELISA에 의해 측정된 SARS-CoV-2에 노출되지 않은 대상체에서 ELISA로 측정한 혈청 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 항체의 기하 평균 역가(GMT).
d.) 활성 분석에 의해 측정된, SARS-CoV-2 중화 항체에 대해 혈청전환된 대상체의 비율.
SARS-CoV-2 N-항원에 대한 ELISA로 측정한 시험 전 또는 시험 중 적용가능한 샘플이 수집되기 전에 SARS-CoV-2에 노출되지 않은 대상체에서, 혈청 전환은 기준선 대비 SARS-CoV-2 중화 항체 역가의 증가로 정의된다.
기준선에서 SARS-CoV-2에 대해 혈청양성인 대상체에서, 혈청전환은 기준선에 비해 SARS-CoV-2 중화 항체 역가의 2배 증가로 정의된다.
e.) 혈청 내 개별 SARS-CoV-2 중화 항체 레벨.
f.) SARS-CoV-2 N-항원에 대한 ELISA로 측정한 시험 전 또는 시험 중에 해당 샘플을 수집하기 전에 SARS-CoV-2에 노출되지 않은 대상체에서, 활성 분석에 의해 측정된 혈청 SARS-CoV-2 중화 항체의 GMT.
세포 매개 면역 반응
29일, 36일 및 211일에 모든 대상체로부터의 지정된 부위(들)의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 다음이 결정되었다:
a.) 항원 자극 후 SARS-CoV-2 스파이크 특이적 T 세포 반응의 빈도 및 기능.
b.) Th1 반응 및 Th2 마커의 생산을 조사하기 위한 세포내 사이토카인 염색 (ICS)
c.) SARS-CoV-2 스파이크 특이적 T 세포 반응에서 검출 가능한 증가가 있는 대상체의 비율.
선천적 면역 반응
2일, 8일, 29일, 30일 및 36일에 모든 오픈-라벨 센티넬 대상체에서 다음이 결정되었다.
a.) 인터페론(IFN)-α, IFN-γ, 인터루킨(IL)-6, 케모카인 리간드(CCL) 2 및 IFN-γ-유도 단백질 10(IP 10)을 포함하나 이에 제한되지 않는 혈청 사이토카인 농도.
b.) 유전자 발현 프로파일링.
감염 평가
a.) 임상적으로 역전사(RT)-PCR에 의해 측정된 바이러스학적으로 확인된 SARS-CoV-2 감염이 있는 대상체의 수는 시험 전체를 통해 결정된 시점에서 평가되었다.
b.) 사전 정해진 시점에서 후향적(retrospective) 혈청학에 의해 측정된 무증상 SARS-CoV-2 감염이 있는 대상체의 수를 결정했다.
바이러스 중화:
유도된 항체의 중화 활성은 VERO E6 세포주 상의 야생형 바이러스 균주(SARS-CoV-2 2019 nCOV ITALY/INMI1)를 사용하여, 바이러스 감염 용량 25 (MN 25 TCID50/웰)에 의한 50% CPE 관찰하는 세포변성 효과(CPE) 기반 미세-중화 분석을 사용하여 결정되었다. 분석은 96-웰 플레이트 형식으로 수행되었으며, 인간 혈청은 1:2 연속 희석으로 희석되었다. 미세-중화 역가는 CPE로부터 세포의 최소 50%를 보호하는 최고 샘플 희석의 역수이며 중복의 기하 평균으로 보고된다.
엘리사(Elisa):
항체 역가는 Spike의 세포외 도메인(ECD) 또는 수용체 결합 도메인(RBD)을 표적 항원으로 사용하여 Elisa 분석으로 측정되었다. 코팅에 사용된 항원 재조합 단백질은 진핵 세포에서 발현되었다. 인간 혈청은 연속 희석액으로 1:2로 희석되었으며, 역가는 블랭크 플러스 매트릭스 효과로 정의된 컷 포인트(cut-point)에 대한 최고 샘플 희석액의 역수이다. 역가는 중복(duplicate)의 기하 평균으로 보고된다.
T 세포 반응:
이 임상 시험의 탐색적 종점으로, 항원 자극 후 SARS-CoV-2 스파이크 특이적 CD4+ Th1 및 세포독성 CD8+ T 세포 반응의 빈도와 기능을 평가하여 세포 매개 면역 반응을 평가했다. 또한 백신접종 후 SARS-CoV-2 스파이크 특이적 T 세포 반응이 감지 가능한 증가를 보이는 대상자의 비율이 결정되었다.
기능적 T 세포 반응은, 스파이크 펩티드 풀이 겹치는 SARS-CoV-2 스파이크 특이적 CD4+ Th1 및 세포독성 CD8+ T 세포의 자극 후, T 세포 활성화 마커 및 이펙터 사이토카인(CD40L, IFN-감마, IL-2 및 TNF-알파)의 유세포 분석 기반 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의해 생체 외에서 결정 및 정량화되었다.
결과:
도 13A에서, 전신 유해 사례는 1차 투여 후 및 2차 투여 후 상이한 용량 코호트에서 나타난다.
도 13B에서, 국소 유해 사례는 1차 투여 후 및 2차 투여 후 상이한 용량 코호트에서 나타난다.
도 13C에서, 피로, 두통, 근육통, 오한, 관절통, 발열, 메스꺼움 및 설사와 같은 특정 전신 유해 사례가 나타난다.
도 13D에서, 통증, 가려움증, 부기 및 발적과 같은 특정 국소 유해 사례가 나타난다.
요약하면 CvnCoV 백신은 우수한 안전성 특성과 수용 가능한 반응성(reactogenicity)을 보여주었다.
도 13E에서, 1일, 29일, 36일, 43일 및 57일에 스파이크 단백질 특이적 IgG 항체의 유도가 상이한 용량 코호트에서 보여진다. 백신을 접종한 모든 대상은 스파이크 특이적 항체의 우수한 유도를 보여주었으며, 여기서 12μg 코호트는 혈청전환된 환자(HCS)와 동일한 수준의 항체를 나타냈다. 도 13E의 표에는 백신접종된 대상체의 혈청전환율이 제시되어 있다. 대부분의 경우 백신접종 대상의 90% 이상이 43일째에 기준선과 비교하여 스파이크 단백질 특이적 항체의 2배 이상 증가를 나타냈다. 모든 용량 그룹에서 백신접종 대상의 70% 이상이 기준선과 비교하여 스파이크 단백질 특이적 항체의 4배 이상 증가를 보였다. 12μg에서는 90% 이상의 대상들이 항체가 4배 이상 증가한 것으로 나타났다.
도 13F에서, 1일, 36일 및 43일에 RBD-특이적 IgG 항체의 유도가 상이한 용량 코호트에서 나타났다. 모든 백신접종 대상자는 RBD 특이적 항체의 우수한 유도를 보여주었으며, 여기서 12μg 코호트는 혈청전환된 환자(HCS)와 동일한 수준의 항체를 나타냈다. 도 13F의 표에는 백신접종된 대상체의 혈청전환율이 제시되어 있다. 대부분의 경우 백신접종한 대상의 80% 이상이 43일째에 기준선과 비교하여 RBD 특이적 항체가 2배 이상 증가한 것으로 나타났다. 8㎍ 및 12㎍ 그룹에서 대상의 80% 이상이 4배 이상 증가 항체의 증가를 보였다.
도 13G에서, 바이러스 중화 항체의 유도가 나타나 있다. 모든 용량 그룹은 바이러스 중화 역가의 좋은 유도를 나타내었고, 12㎍의 최고 용량이 혈청전환된 환자(HCS)에 존재하는 것과 동일한 수준의 중화 항체를 유도하였다. 도 13G의 표에는 백신접종된 대상체의 혈청전환율이 제시되어 있다. 모든 용량 그룹에서 백신접종 대상자의 70% 이상이 43일째에 기준선과 비교하여 바이러스 중화 항체의 2배 이상 증가를 나타냈다. 8μg 및 12μg 용량 그룹에서 백신접종 대상의 적어도 70%가 기준선과 비교하여 바이러스 중화 항체에서 4배 이상 증가를 보였다. 12μg에서는 100%의 대상체가 바이러스 중화 항체가 4배 이상 증가한 것으로 나타났다.
도 13H에서, 중화 항체의 레벨에 대한 스파이크 단백질 또는 RBD 결합 항체의 레벨의 비율이 제시된다. 중요하게도, CVnCoV 유도 비율은 회복기 대상체의 비율과 거의 동일하며, 이는 유도된 항체 수준이 SARS-CoV-2를 중화하기에 충분하다는 것을 의미한다.
도 13I는 첫 번째 용량(29일) 및 두 번째 용량(36일) 후 스파이크 단백질 S1에 대한 CD4+ T 세포의 유도를 보여준다. 두 용량 그룹(4μg 및 8μg) 모두 스파이크 단백질 S1에 대한 CD4+ T 세포의 우수한 유도를 보여준다.
도 13J는 제1 용량(29일) 및 제2 용량(36일) 후 스파이크 단백질 S2에 대한 CD4+ T 세포의 유도를 나타낸다. 두 용량 그룹(4μg 및 8μg)은 회복기 환자와 비교하여 스파이크 단백질 S에 대한 CD4+ T 세포의 우수한 유도를 보여준다.
도 13K에서, 2㎍(좌측) 및 4㎍(우측) CvnCoV로 백신접종한 후 SARS-CoV-2 혈청양성 대상체(상부)에서 바이러스 중화 역가의 유도가 표시된다. 놀랍게도, 바이러스 중화 항체는 이미 바이러스 중화 항체를 발현하는 혈청양성 환자의 두 용량 그룹 모두에서 부스팅될 수 있다.
하부에는 2μg(좌측) 및 4μg(우측) CvnCoV로 백신접종한 후 SARS-CoV-2 혈청양성 대상체에서 RBD 특이적 항체의 유도가 표시된다. 놀랍게도, RBD 특이적 항체는 이미 RBD 특이적 항체를 발현하는 혈청양성 환자의 두 용량 그룹 모두에서 부스팅될 수 있다.
실시예 11 : LNP에서 제형화된, SARS-CoV-2 항원 S_stab을 코딩하는 mRNA로 마우스의 백신접종
본 실시예는 3' 말단(A64-N5-C30-hSL-N5 또는 hSL-A100) 및 UTR 조합 (i-3 (-/muag) 또는 a-1 (HSD17B4/PSMB3))의 대안적 형태를 포함하는 mRNA를 가진 SARS-CoV-2 S mRNA 백신이 마우스에서 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는 것을 보여준다. hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)을 포함하는 SARS-CoV-2 S_stab을 코딩하는 mRNA는 더 강력한 결합 및 중화 항체의 유도 및 더 강력한 CD8+ T 세포 유도에 의해 입증된, 더 강력한 면역 반응 유도를 나타낸다.
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
면역:
암컷 BALB/c 마우스(6-8주령, n = 8)에 표 16에 표시된 투여량으로 mRNA 백신 조성물을 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 한 그룹의 마우스에 완충액으로 백신접종하였다. 모든 동물을 0일 및 21일에 백신접종하였다. 항체 역가의 결정을 위해 21일(프라임 후) 및 42일(부스트 후)에 혈액 샘플을 수집하고, T-세포 분석을 위해 42일에 비장세포를 단리하였다.
백신접종 요법 (실시예 11):
그룹 백신 조성물 mRNA ID CDS opt. 5'-UTR/
3'-UTR;
UTR 디자인 		3'-말단 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA 용량
A 완충액 - - - - -
B LNP로 제형화된, S_stab 코팅 mRNA R9515 opt1 -/muag; A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 1㎍
C LNP로 제형화된, S_stab 코팅 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 1㎍
ELISA를 사용한 IgG1 및 IgG2 항체 역가의 결정, CPE(세포변성 효과)를 통한 바이러스 중화 역가의 결정 및 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의한 T-세포 분석을 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과:
도 14A에 나타낸 바와 같이, 전장 S 안정화 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA를 사용한 백신접종은 단일 백신접종(d21) 후 높은 역가의 S 특이적 결합 항체(IgG1 및 IgG2a)를 유도하였다. 역가는 두 번째 백신접종(d42) 후 증가했다. hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)(그룹 C)을 포함하는 SARS-CoV-2 S_stab을 코딩하는 mRNA를 포함하는 백신 조성물은 결합 항체의 개선되고 더 강력한 유도를 나타내었다(IgG1 및 IgG2a 종점 역가로 나타냄).
두 mRNA 디자인 모두 2차 백신접종(42일차) 후 다소 유사한 바이러스 중화 항체 역가를 유도한 반면, 그룹 C의 마우스는 그룹 B와 비교하여 1차 백신접종 후 d21에 이미 증가된 레벨의 VNT을 나타냈다(도 14B에 나타냄).
도 14C에 나타낸 바와 같이, 3' 말단 (A64-N5-C30-hSL-N5 또는 hSL-A100) 및 UTR 조합 (i-3(-/muag) 또는 a-1(HSD17B4/PSMB3))의 두 가지 대안적 형태를 갖는 전장 S 안정화 단백질을 코딩하는 mRNA를 사용한 백신접종은 2회의 백신접종 후 항원 특이적 CD4+ 및 CD8+ IFNγ/TNF 이중 양성 T 세포의 강력한 수준을 유도하였다. hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)(그룹 C)을 포함하는 SARS-CoV-2 S_stab을 코딩하는 mRNA를 포함하는 백신 조성물은 놀랍게도 CD8+ IFNγ/TNF 이중 양성 T 세포의 현저하게 더 강력한 유도를 나타내었다.
실시예 12 : LNP에서 제형화된 SARS-CoV-2 항원 S_stab을 코딩하는 mRNA로 래트의 백신접종
본 실시예는 3' 말단(hSL-A100) 및 UTR 조합 (a-1 (HSD17B4/PSMB3))의 본 발명의 대안적 형태를 포함하는 mRNA를 포함하는 SARS-CoV-2 S mRNA 백신이 랫트에서 강한 체액성 면역 반응을 유도함을 보여준다.
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 생체내 백신접종 실험에서 사용하기 전에 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
면역:
표 17에 나타낸 바와 같이, mRNA 백신 조성물 및 용량을 래트에 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 래트의 한 그룹을 완충제로 백신접종하였다(그룹 A). 모든 동물을 0일 및 21일에 백신접종하였다. 항체 역가의 측정을 위해 21일(프라임 후) 및 42일(부스트 후)에 혈액 샘플을 수집하였다.
백신접종 요법 (실시예 12):
그룹 백신 조성물 mRNA ID CDS opt. 5'-UTR/
3'-UTR;
UTR 디자인 		3'-말단 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA 용량
A 완충액 - - - - -
B LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 0,5㎍
C LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 2㎍
C LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 8㎍
ELISA를 사용한 IgG1 및 IgG2 항체 역가의 측정:
코팅을 위해 재조합 SARS-CoV-2 S (수용체 결합 도메인 RBD) 단백질을 사용하여 ELISA이 수행되었다. 코팅된 플레이트를 각각의 혈청 희석액을 사용하여 인큐베이션하고, SARS-CoV-2 S에 대한 특이적 항체의 결합을 마우스 ELISA에 사용된 2차 HRP 항체 대신 표지된 HRP 항체로 직접 검출했다. 랫트 ELISA에서 신호 증폭의 부족은 더 낮은 역가에 대한 이유가 될 수 있으므로 랫트와 마우스 연구 간의 ELISA 역가는 현재 비교할 수 없다.
바이러스 중화 항체 역가(VNT)의 측정
랫트 혈청 샘플의 바이러스 중화 항체 역가(VNT)를 마우스 혈청을 사용한 이전 실시예 6에 기재된 바와 같이 분석하였다.
결과:
도 15A에 나타낸 바와 같이, LNP로 제형화되며, 3' 말단 hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)을 포함하는 대안적인 비-코딩 영역을 포함하는 전장 S 안정화된 단백질 mRNA을 이용한 백신접종은 0.5μg, 2μg 및 8μg의 용량을 사용하여 첫 번째 백신접종 후 21일째와 두 번째 백신접종 후 42일째에 강력하고 용량 의존적인 레벨의 결합 항체 역가를 랫트에서 유도했다. 두 번째 백신접종은 항체 역가를 추가로 증가시켰다.
도 15B에 나타낸 바와 같이, LNP로 제형화되며, 전장 S 안정화된 단백질을 코딩하고, 3' 말단 hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)을 갖는 대안적이고 독창적인 비-코딩 영역을 포함하는 mRNA를 사용한 백신접종은 랫트에서 용량 의존적이고 매우 높은 수준의 VNT를 유도하였다. ELISA (결합 항체 IgG1 및 IgG2a) 및 VNTS에 의해 나타난 체액성 면역 반응은 3' 말단 A64-N5-C30-hSL-N5 및 UTR 조합 i-3 (-/muag)를 갖는 비-코딩 영역을 포함하는 mRNA로 유도된 면역 반응에 비해 현저하게 증가하였다. (비교 실시예 8 도 11A-F 참조).
실시예 13 : SARS-CoV-2 (CVnCoV) 백신의 임상 개발
1 인간 백신접종을 위한 시험 프로토콜
2 요약
이 시험은 18세 이상의 성인을 대상으로 한 2b/3상 중추적(pivotal) 효능 및 안전성 시험으로 설계되었다. 이 시험은 무작위, 관찰자-맹검(observer-blinded), 위약-조절(placebo-controlled) 설계이다. 대상체는 전 세계적으로 여러 위치에 등록되며, 12μg mRNA의 용량 수준에서 CVnCoV 또는 대조군으로 위약 {정상 식염수(0.9% NaCl)}의 2-투여 일정을 받기 위해 1:1 비율로 무작위화된다.
3 확장
393일째에 시험 CV-NCOV-004를 완료한 후, 대상체는 시험의 1년 연장에 계속 참여할 것이다. 시험 CV-NCOV-004에 대한 동의 시, 대상체도 1년 연장 참여에 동의할 것이다. 연장 연구(Extension Study)는 백신 유효성(VE)의 지속 기간을 평가하기 위하여 장기 안전성{심각한 유해 사례 (SAE)}, SARS-CoV-2에 대한 항체 지속성, 및 코로나19 사례의 발생을 평가하기 위한 추가 데이터를 수집할 것이다.
4 시험 목적, 종점 및 추정치(ESTIMANDS)
4.1 목표
4.1.1 주요 목적
공동 1차(Co-Primary) 효능 목표
ㆍSARS CoV 2 이력이 없는 대상체에서 임의의 중증도의 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드를 예방하는데 있어 CVnCoV 2회 투여 일정의 효능을 입증하기 위해.
ㆍSARS CoV-2 이력이 없는 대상체에서 바이러스학적으로 확인된 중등도 내지 중증의 COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드를 예방하는데 있어 CVnCoV 2회 투여 일정의 효능을 입증하기 위해.
주요 안전 목표
ㆍ18세 이상의 대상체에게 2회 투여 일정으로 투여된 CVnCoV의 안전성을 평가하기 위해.
4.1.2 2차 목표
주요 2차 효능 목표
ㆍSARS-CoV-2 이력이 없는 대상체서에서 바이러스학적으로 확인된 중증 COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드를 예방하는데 있어 CVnCoV 2회 투여 일정의 효능을 입증하기 위해.
ㆍ바이러스의 N 단백질로의 혈청전환에 의해 측정된, 혈청음성 피험자에서 SARS-CoV-2에 의한 무증상 감염의 예방 또는 감소에서 CVnCoV의 2회 투여 일정의 효능을 입증하기 위해.
기타 2차 효능 목표
SARS-CoV-2 이력이 없는 대상체에서 하기를 평가하기 위해:
ㆍ61세 이상의 대상체에서 모든 중증도의 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드를 예방하는데 있어 CVnCoV 2회 투여 일정의 효능.
ㆍ증상이 있든 없든, 바이러스학적으로 확인된 SARS-CoV-2 감염 사례의 첫 번째 에피소드를 예방하는데 있어 CVnCoV 2회 투여 일정의 효능.
ㆍCOVID-19로 인한 질병 부담(BoD)을 줄이는데 있어 COVnCoV의 2회 접종 일정의 효능.
ㆍ모든 중증도의 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드를 예방하는데 있어 첫 번째 투여 후 CVnCoV의 효능.
2차 면역원성 목표
ㆍ임상 2b상 시험에 참여하는 일부 대상체에서 CVnCoV 1회 및 2회 투여 후 SARS-CoV-2의 S 단백질 RBD에 대한 항체 반응을 평가하기 위해.
ㆍ임상 2b상 시험에 참여하는 일부 대상체에서 CVnCoV 1회 및 2회 투여 후 SARS-CoV-2 바이러스 중화 항체 반응을 평가하기 위해.
2차 안전 목표
ㆍ임상 2b상 시험에 참여하는 18세 이상의 대상체에게 2회 투여 일정으로 투여된 CVnCoV의 반응성(reactogenicity) 및 내약성을 평가하기 위해.
4.1.3 탐색 목표
탐색적 효능 목표
SARS-CoV-2 이력이 없는 대상체에서 하기를 평가하기 위해:
ㆍCOVnCoV의 2회 투여 일정을 받은 대상체에서 위약을 투여한 대상체에 비해 COVID-19 사례의 중증도가 경미한지 여부.
ㆍCOVnCoV의 2회 투여 일정을 받는 대상체에서 위약을 투여받은 대상과 비교하여 COVID-19로 인한 추가 산소 공급의 필요성이 감소한지 여부.
ㆍCOVnCoV의 2회 투여 일정을 받는 대상체에서 위약을 투여받은 대상과 비교하여 COVID-19로 인한 기계적 환기의 필요성이 감소한지 여부.
ㆍCOVnCoV의 2회 투여 일정을 받는 대상체에서 위약을 투여받은 대상과 비교하여 COVID-19로 인한 입원이 감소한지 여부.
ㆍCOVnCoV의 2회 투여 일정을 받는 대상체에서 위약을 투여받은 대상과 비교하여 COVID-19로 인한 사망률이 감소한지 여부.
ㆍCOVnCoV의 2회 투여 일정을 받는 대상체에서 위약을 투여받은 대상과 비교하여 모든 원인에 의한 사망률이 감소한지 여부.
ㆍ선택된 부위(들)에서 최대 400명의 대상체로부터 CVnCoV의 2회 투여 일정의 세포 매개 면역(CMI) 반응을 조사하기 위해.
SARS-CoV-2 이력이 없는 및 있는 대상체에서 하기를 조사하기 위해:
ㆍ기준선에서 SARS-CoV-2 혈청학적 상태에 관계없이, 모든 대상체에서 모든 중증도의 COVID-19 바이러스학적으로 확인된 사례의 첫 번째 에피소드를 예방하는데 있어 CVnCoV 2회 투여 일정의 효능.
ㆍ기준선에서 SARS-CoV-2 혈청학적 상태에 관계없이, 모든 대상체에서 모든 중증도의 COVID-19 바이러스학적으로 확인된 사례의 첫 번째 에피소드를 예방하는 데 있어 첫 번째 투여 후 CVnCoV의 효능.
시험 기간 동안 바이러스학적으로 확인된 COVID-19의 첫 번째 에피소드가 있는 대상체를 조사하기 위해:
ㆍ위약을 투여받은 사람들과 비교하여, CVnCoV의 2회 투여 일정을 받은 대상체들에서 COVID-19의 두 번째 에피소드의 발생.
4.2 종점(Endpoint)
4.2.1 기본 종점
공동 1차 효능 종점
ㆍ1차 효능 분석에 대한 사례 정의를 충족하는, 모든 중증도의 바이러스학적으로 확인된 {역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 양성} COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드의 발생.
ㆍ1차 효능 분석에 대한 사례 정의를 충족하는, 중등도 내지 중증 COVID-19의 바이러스학적으로 확인된 (RT-PCR 양성) 사례의 첫 번째 에피소드 발생 (본 명세서에 정의된 중등도 및 중증 COVID-19 질병).
1차 안전 종점
ㆍ모든 피험자에서 2차 시험 백신접종 후 6개월 동안 수집된 의료 참여 AE의 발생, 강도 및 상관성.
ㆍ모든 피험자에서 2차 시험 백신접종 후 1년 동안 수집된 SAE 및 AESI의 발생, 강도 및 상관성.
ㆍ모든 피험자에서 2차 시험 백신접종 후 1년 동안 치명적인 SAE 발생.
4.2.2 2차 종점
주요 2차 효능 종점
ㆍ1차 효능 분석의 사례 정의를 충족하는, 바이러스학적으로 확인된 (RT-PCR 양성) 중증 COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드의 발생 (본 명세서에 정의된 중증 COVID-19 질병).
ㆍ무증상 혈청음성 대상체에서 2차 시험 백신접종 후 15일 이상 SARS-CoV-2의 N 단백질로의 혈청전환 발생.
혈청전환은 시험 211일 및/또는 393일에 대상체의 혈청에서 검출가능한 SARS-CoV-2 N 단백질 항체로 정의되며, 이들은 1일(기준선) 및 43일(즉, 2차 시험 백신접종 후 15일 이전의 2개의 시험 시점)에 혈청음성으로 테스트됨.
기타 2차 효능 종점
ㆍ61세 이상의 대상체에서, 1차 효능 분석에 대한 사례 정의를 충족하는, 모든 중증도의 바이러스학적으로 확인된 (RT-PCR 양성) COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드 발생.
ㆍ증상이 있거나 없는 바이러스학적으로 확인된 (RT-PCR 양성) SARS-CoV-2 감염의 발생.
피험자가 증상이 있는 경우, 증상의 발병은 두 번째 시험 백신접종 후 15일 이후에 발생했어야 함; 피험자가 무증상인 경우, 양성 RT PCR 검사는 두 번째 시험 백신접종 후 15일 이상에서 이루어졌어야 함.
ㆍ1차 효능 분석에 대한 사례 정의를 충족하는, 모든 중증도의 바이러스학적으로 확인된 (RT-PCR 양성) COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드에 기초하여 계산된 BoD 점수.
o BoD #1 - 질병 없음 (감염되지 않았거나 무증상 감염) = 0; 경증 또는 중등도 질병 = 1; 심각한 질병 = 2.
o BoD #2 - 질병 없음 (감염되지 않았거나 무증상 감염) = 0; 입원하지 않은 질병 = 1; 입원한 질병 = 2; 사망 = 3.
ㆍ첫 번째 시험 백신접종 후 언제든지 증상이 시작되는, 모든 중증도의 바이러스학적으로 확인된 (RT-PCR 양성) COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드 발생.
2차 면역원성 종점 (2b상 면역원성 서브셋)
S 단백질의 SARS-CoV-2 RBD 항체 반응
1일, 29일, 43일, 57일, 120일, 211일 및 393일:
ㆍS 단백질의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 혈청 항체.
ㆍS 단백질의 SARS-CoV-2 RBD로의 혈청전환 발생.
혈청전환은 기준선에서 혈청음성으로 테스트된 대상체의 혈청에서 S 단백질의 SARS-CoV-2 RBD의 검출가능한 항체로 정의된다.
SARS-CoV-2 바이러스 중화 항체 반응
1일, 29일, 43일, 57일, 120일, 211일, 393일:
ㆍ바이러스 중화 항체 분석으로 측정한, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 혈청 바이러스 중화 항체.
ㆍ바이러스 중화 항체 분석으로 측정한, SARS-CoV-2 바이러스로의 혈청전환 발생.
혈청전환은 기준선에서 혈청음성으로 테스트된 대상체의 혈청에서 검출가능한 SARS-CoV-2 바이러스 중화 항체로 정의된다.
2차 안전 종점
ㆍ2b상 대상체에서 각 시험 백신접종 후 7일 이내에 각 요청된(solicited) 국소 AE의 발생, 강도 및 기간.
ㆍ2b상 대상체에서 각 시험 백신접종 후 7일 이내에 각 요청된 전신 AE의 발생, 강도, 기간.
ㆍ2b상 대상체에서 각 시험 백신접종 후 28일 이내에 발생하는 요청되지 않은 AE의 발생, 강도 및 상관성.
ㆍ모든 피험자에서 2차 시험 백신접종 후 1년 동안 백신 중단 또는 시험 중단으로 이어지는 AE의 발생.
4.2.3 탐색적 종점
탐색적 효능 종점
ㆍ일차 효능 분석에 대한 사례 정의를 충족하는, 바이러스학적으로 확인된 (RT-PCR 양성) COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드의 심각도 평가.
다음 종점(endpoint)들이 2차 시험 백신접종 (완전 VE) 15일 이후에 및 1차 시험 백신접종 후 언제든지 발생하는 것으로 분석될 것이다.
SARS-CoV-2 이력이 없는 대상체에서:
ㆍCOVID-19 질병으로 인한 산소 보충 발생.
ㆍCOVID-19 질병으로 인한 기계적 환기 발생.
ㆍCOVID-19 질병으로 인한 입원 발생.
ㆍCOVID-19 질병으로 인한 사망 발생.
ㆍ어떠한 원인에 의하든 사망의 발생.
SARS-CoV-2 경헙이 없거나 있는 대상체에서:
ㆍ기준선 혈청상태에 관계없이 모든 피험자에서, 모든 중등도의 바이러스학적으로 확인된 (RT-PCR 양성) COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드의 발생.
다음 종점들이 1차 효능 분석에 대한 사례 정의를 충족하는 모든 중증도의 바이러스학적으로 확인된 (RT-PCR 양성) COVID-19 사례의 첫 번째 에피소드가 있었던 대상에서 분석될 것이다.
ㆍ모든 중증도의 COVID-19 바이러스학적으로 확인된 (RT-PCR 양성) 사례의 두 번째 에피소드 발생.
탐색적 면역원성 종점 (2b상 면역원성 서브셋)
1일, 29일, 43일, 120일** 및 211일**에, 선정된 부위(들)에서 최대 400명의 대상체로부터 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서:
ㆍTh1 반응과 Th2 마커의 발현을 조사하기 위해, 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의한 항원 자극 후 S-특이적 T-세포 반응의 SARS-CoV-2 RBD의 빈도 및 기능.
ㆍS 특이적 T 세포 반응의 SARS-CoV-2 RBD에서 감지가능한 증가가 있는 대상체의 비율.
** 120일 및 211일에 수집된 샘플의 테스트는 29일 및/또는 43일에 T 세포 반응자로 분류된 대상에서만 수행될 것이다.
4.3 에스티맨드(Estimands)
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
5 시험 설계
5.1 전체 디자인
시험 CV-NCOV-004는 초기 2b상 시험과 대규모 3상 효능 시험으로의 전환이라는 두 부분으로 진행된다. 2b상과 3상 모두 무작위, 관찰자-맹검, 위약 대조 시험으로 수행된다. 18세 이상의 대상체는 전 세계적으로 여러 사이트에 등록되며 1:1 비율로 12μg mRNA 용량 수준의 CVnCoV 또는 위약 {정상 식염수(0.9% NaCl)} 중 하나의 2-용량 일정을 받는다. 임상 2b상 및 3상 부분 모두 디자인이 일관적이므로(예: COVID-19 사례 확인 및 사례 정의를 위해) 2b상에서 발생하는 COVID-19 사례를 VE의 1차 분석을 위해 3상에서 발생하는 사례와 통합할 수 있다.
대상체들은 또한 시험의 2b상 및 3상 부분의 1년 연장에 참여할 것이다.
2b상 디자인 및 목표
2b상의 목적은 3상을 시작하기 전에 CVnCoV의 안전성, 반응성 및 면역원성을 추가로 특성화하는 것이다. CVnCoV는 초기 1상 및 2a 시험으로부터의 안전성 및 면역원성 데이터에 근거하여 3상 조사를 위해 선택된 12μg 용량 수준으로 투여될 것이다. 2b상은 의도된 3상 시험 모집단의 연령 범위를 나타내는 18 내지 60세 및 61세 이상의 성인 2개 연령 그룹에서 수행된다.
약 4,000명의 대상이 등록되고 1:1 비율로 무작위 배정되어 28일 간격으로 투여되는 12μg mRNA 용량 수준의 CVnCoV 또는 위약의 2회 용량을 받게 된다. 등록된 4,000명의 대상 중 약 800 내지 1,000명(20% 내지 25%)이 61세 이상이다. 2b상은 안전 평가의 잠재적 편향을 줄이기 위해 관찰자 맹검 방식으로 수행된다. 4,000명의 대상의 표본 크기는 3상에 진입하기 전에 CVnCoV의 안전성, 반응성 및 면역원성을 특성화하는 강력하고 상세한 데이터 세트를 생성하는 것을 기반으로 한다. 또한, 2b상에서 생성된 데이터는 CVnCoV의 조기 조건부 승인을 지원하기 위해 제출되는 주요 데이터 세트가 될 것이다.
2b상에서, CVnCoV의 2회 투여 일정의 안전성 및 반응성은 다음의 AE의 빈도 및 중증도를 측정함으로써 상세하게 평가될 것이다: 각 백신접종 후 7일 동안 요청된 국소 및 전신 반응; 각 백신접종 후 28일 동안 요청되지 않은 AE; 두 번째 시험 백신접종 후 6개월까지 의료 참여 AE; 및 2차 시험 백신접종 후 1년까지의 AESI 및 SAE. CVnCoV의 면역원성은 S 단백질의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 결합 항체 및 바이러스 중화 항체를 측정하여 대상체들의 하위집합(2개 연령 그룹 각각에 등록된 처음 600명의 대상; 면역원성 하위집합의 총 1,200명의 대상)에서 1회 및 2회 투여 후 평가된다. 항체 지속성은 이 시험과 연장 연구에서 평가될 것이다.
2b상 대상에서 발생하는 COVID-19 사례는 수집되어 3상에서 발생하는 사례와 통합되며, 총 사례 수는 효능의 1차 분석에 사용된다. 또한 DSMB는 VDE의 신호에 대해 COVID-19 사례를 주기적으로 모니터링한다.
2b상에 참여하는 대상들은, 또한 SARS-CoV-2의 N 단백질에 대한 항체의 발달(즉, 혈청전환)에 의해 측정된 바와 같이, 시험 동안 무증상 SARS-CoV-2 감염에 대해 평가된다. 이 데이터는 CVnCoV 백신 접종이 SARS-CoV-2(주요 2차 효능 목표 중 하나)에 의한 무증상 감염 비율을 예방하거나 감소시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해 3상 데이터와 결합될 것이다.
2b상 내 2개의 타깃 연령 그룹의 대상체 등록 시작은 유연하다. 1상 및 2a상 시험의 데이터 시기에 따라 2개 연령 그룹을 2b상으로 등록하는 것은 시차를 둘 수 있으며, 처음에는 18세에서 60세 사이의 대상으로부터 시작하여 61세 이상의 대상도 뒤따른다. 고령층이 2b상에서 전체 대상체의 20% 내지 25%를 구성할 것이기 때문에 이 시차를 둔 시작은 2b상 코호트의 전체 등록에 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다.
2b상 데이터의 조기 안전성 검토는 DSMB에서 수행합니다(섹션 9.3.9.1 참조). 안전성 검토는 약 1,000명의 피험자(대상체)가 2b상(등록 피험자의 25%; CVnCoV 접종 500명, 위약 접종 500명)에 등록되고 첫 번째 시험 백신접종 후 최소 1주일의 안전성 추적 관찰이 있을 때 수행된다. 안전성 프로파일이 수용 가능한 것으로 판단되고 안전성 또는 내약성 문제가 없는 경우, 3상으로의 대상체(피험자) 등록은 2b상으로부터 중단 없이 시작할 수 있을 것으로 예상된다. DSMB에 의한 또 다른 안전성 검토는 약 1,000명의 2b상 피험자가 2차 시험 백신접종을 받았고 최소 1주일의 안전성 후속 조치가 있을 때 수행될 것이다. 2b상 피험자로부터 입수 가능한 모든 1차 용량 안전성 데이터도 이때 검토된다.
3상 디자인 및 목표
결합된 2b/3상 시험의 공동 주요 목표는 모든 중증도의 COVID-19 사례의 예방에 있어 또는 중등도 또는 더 심각한 COVID-19 사례 예방에 있어 CVnCoV의 2회 투여 일정의 효능을 입증하는 것이다. 2b상과 유사하게 3상은 무작위, 관찰자-맹검, 위약 대조 시험으로 수행된다. 18세 이상인 약 32,500명의 피험자가 3상에서 전 세계적으로 여러 장소에 등록되고 1:1 비율로 12μg 용량 수준의 CVnCoV 또는 위약 중 하나의 2-용량 일정을 받게 된다(도 2 참조). 2b상과 유사하게, 등록은 61세 이상의 피험자가 3상 시험 모집단(6,500-8,125명의 피험자)의 약 20% 내지 25%를 차지하는 것을 목표로 한다. 임상 2b상 및 3상 부분을 결합한 총 등록 인원은 36,500명이다.
대상은 COVID-19에 대한 적극적인 감시를 받게 된다. 모든 현장 방문 및 전화 통화 중에 피험자는 COVID-19와 임상적으로 일치하는 증상이 있는 급성 질환이 있는 경우 현장에 연락하도록 상기시킨다. 또한 피험자들은 일주일에 최대 두 번 메시지를 받고 COVID-19 증상이 있는 경우 예 또는 아니오로 응답하게 된다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 인터뷰 및 평가를 위해 시험 직원이 연락할 것이다. 피험자가 COVID-19 질병이 의심되는 경우 현장 또는 가정 방문에서 수집된 샘플로 SARS-CoV-2 감염 검사를 받게 된다. 대상자가 COVID-19에 감염된 것으로 확인되면 모든 대상자는 질병이 해결될 때까지 추적된다. 피험자가 입원하는 경우, 피험자의 진행 상황은 조사자가 계속 추적하고 입원이 끝날 때 얻은 퇴원 요약서는 얻어진다. 임상 증상 및 징후, 기간 및 중증도, COVID-19 에피소드의 치료 및 결과에 대한 정보는 시험 직원이 문서화하고 전자 사례 보고서 양식(eCRF)에 기록한. 해결되면 피험자는 COVID-19를 제출하지 않은 사람들과 동일한 방식으로 시험 종료까지 계속 추적될 것이다. 이전 질병이 있는 대상체에서 COVID-19의 두 번째 에피소드는 1차 효능 사례로 계산되지 않지만 백신 접종 대상체에서 COVID-19의 재발을 평가하는 탐색적 목표에는 계산된다.
팬데믹 환경에서 COVID-19 사례의 발병률이 불확실하기 때문에 임상시험은 모든 중증도의 COVID-19 종점에 기초한 사례 중심 임상시험으로 진행되며, 여기에는 각 분석에 대해 미리 정의된 수의 사례를 달성함으로써 촉발되는 두 가지 중간 분석과 최종 분석이 모두 포함된다. 위에서 설명한 대로 2b상에서 발생하는 COVID-19 사례는 VE의 1차 분석을 위해 3상의 사례와 통합된다. 따라서 2b상에 참여하는 피험자는 VE의 1차 분석(N=36,500)을 위한 전체 샘플 크기에 기여할 것이다.
효능의 1차 분석을 위해, 사례는 다음 기준을 충족해야 한다(중등도 및 중증 COVID-19 질병이 여기에 정의됨):
ㆍ임상적으로 증상이 있는 COVID-19가 있는 사람에서 양성 SARS CoV 2 특정 RT-PCR 검사로 정의된 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 사례여야 함(섹션 9.2 참조).
ㆍ증상 발병은 두 번째 시험 백신접종 후 15일 이상에서 발생해야 함.
ㆍ대상자는 등록 시 바이러스 확인된 COVID-19의 병력(제외 기준 1에 따름)이 없거나 2차 시험 백신접종 후 15일 이전에 바이러스로 확인된 COVID-19 사례가 발생하지 않아야 함.
ㆍ피험자는 기준선과 43일에 SARS-CoV-2 이력이 없는 것으로 입증되어야 함(N 단백질에 대한 혈청음성).
1차 유효성 사례는 심사위원회(Adjudication Committee)의 확인을 받아야 한다.
이 시험은, 모든 심각도의 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 사례의 공동 1차 종료점에 대해 오브라이언 및 플레밍 오류 지출 함수(O'Brien and Fleming error spending function)를 사용하여 높은 효능 또는 무익(futility)에 대한 2개의 중간 분석이 있는 그룹 순차 디자인을 활용한다. 최종 분석에서 1차 효능 사례 정의를 충족하는 모든 심각도의 총 양면 알파 2.5%와 총 185개의 COVID-19 사례를 통해, 시험은 VE를 60%로 고려할 때 30%{VE에 대한 97.5% 신뢰 구간(CI)의 하한에 대해 30%의 여유를 기준으로 함}보다 큰 VE를 입증하는 90%의 전체 검정력(overall power)를 가진다. 1차 사례 정의를 충족하는 56/111 사례가 발생하면(최종 사례 수의 30%/60%) 높은 효율성 또는 무익에 대한 두 가지 중간 분석이 수행된다. 이 점은 2가지 기준에 따라 선택되었다. i) 높은 효능 또는 무익한 결정을 뒷받침하는 56/111 사례의 견고성 및 ii) 높은 효능이면 시험 기간을 단축하고 백신의 잠재적으로 조기 사용가능하게 할 것임.
바이러스학적으로 확인된 중등도 내지 중증 COVID-19 사례의 공동 1차 종점의 경우, 전체 양면 알파는 2.5%이고 최종 분석에서 1차 효능 사례 정의를 충족하는 총 60건의 중증 내지 중등도 COVID-19 사례를 가진, 시험은 VE를 70%로 고려할 때 20%{VE에 대한 97.5% 신뢰 구간(CI)의 하한에 대한 20% 마진을 기준으로} 보다 큰 VE를 입증하기 위해 90%의 전체 검정력을 갖는다. COVID-19 사례의 1/3이 중등도 내지 중증이라고 가정하면, COVID-19 사례의 총 수가 180일 때 중등도에서 중증 사례 60건이 획득될 것이다. 이 공동 1차 종점에 대한 중간 분석은 없을 것이다.
위약 피험자에서 COVID-19의 발병률을 월 0.15%(1.5건/1000/월)로; VE를 60%로; 그리고 시험 중 기준선에서 등록자의 ~5% 혈청양성(즉, 경험 대상자)을 포함하는 평가불가능한 비율을 20%로 가정할 때, 3개월에 걸쳐 등록된 36,500명의 대상자(백신 그룹당 18,250명)의 추적 조사는 첫 번째 백신접종 후 약 9개월 후에 모든 중증도의 목표 185명의 COVID-19 사례를 누적하게 된다.
등록이 완료되거나 거의 완료되면, DSMB에서 사례 발생률에 대한 맹검 검토를 수행한다. 사례 발생률이 예상보다 낮은 경우 DSMB는 샘플 크기의 증가를 권장할 수 있다. 필요한 경우, 표본 크기를 추가로 조정하기 위해 나중에 DSMB에 의한 또 다른 맹검 검토가 수행될 수 있다. 시험 이벤트는 아래 타임라인에 나와 있다(1년 연장 연구는 아래에서 논의됨).
두 그룹의 평가가능한 대상에 대한 동일한 추적 시간으로, 총 185건의 사례 중 60건 이하가 CVnCoV 그룹에 있는 경우 (추정 VE ≥ 52.0%) 최종 분석에서 효능이 입증된다. 1차 사례 정의를 충족하는 56/111 사례가 발생한 경우(시험 시작 후 약 5/6.5개월) 높은 효능 또는 무익에 대한 두 가지 중간 분석이 수행된다. 평가 가능한 피험자의 추적관찰 시간이 두 그룹에서 동일하다면, 56/111 사례 중 7/29 사례 이하가 CVnCoV 그룹에 있는 경우 (중간 시점에서 추정 VE ≥ 85.7% / 64.6% )조기 높은 효능이 입증될 것이고; 반대로, 26/41 사례 이상이 CVnCoV 그룹에 있는 경우 (중간 시점에서 추정 VE ≤ 13.3%/41.4%) 무익에 도달할 것이다. 중간 분석의 평가는 DSMB에 의해 수행될 것이며, 결과는 시험 팀이나 후원자의 맹검해제 없이 전달될 것이다.
2b상과 유사하게, 3상에 참여하는 피험자들은, 혈청음성 피험자에서 SARS-CoV-2의 N 단백질에 대한 항체의 발달에 의해 측정된 바와 같이, 시험 동안 SARS-CoV-2 감염에 대해 평가될 것이다.
3상의 안전성 목표는 CVnCoV의 안전성을 입증할 대규모 안전 데이터베이스를 생성하는 것이다. 임상시험의 2b상 및 3상 부분에 참여하는 모든 피험자는 두 번째 백신접종 후 6개월 동안 의료 참여 AE를 수집하게 되며, 두 번째 백신접종 후 1년 동안 AESI 및 SAE를 수집하게 된다.
중간 분석 또는 최종 분석에서 CVnCoV 효능의 입증과 무관하게, HERALD 시험 CV-NCOV-004는 계속되고 시험이 끝날 때까지 {393일째 마지막 피험자가 당일 마지막 방문을 완료했을 때 (섹션 5.4 참조)} 관찰자 맹검 상태로 유지될 것이다. 이 기간 동안 위약 대조 안전 데이터 수집 및 COVID-19 사례 발생의 수집은 계속된다.
확장 연구(Extension Study)
393일째 시험 완료 후, 대상체는 HERALD 시험 CV-NCOV-004의 1년(12개월) 연장에 계속 참여할 것이다. 연장 연구 동안, 안전성(SAE), SARS-CoV-2에 대한 항체의 지속성 및 유효성 지속 기간을 평가하기 위한 COVID-19 사례의 발생에 대한 추가 위약 대조 데이터 수집에 대해 사이트 수준에서 맹검이 유지된다. 연장 연구는 CVnCoV의 승인 시 종료될 수 있으며, 이때 대조군 대상체는 가능한 한 빨리 CVnCoV 백신 접종을 제공받을 수 있다. 연장 연구는 효과적인 백신을 지역적으로 배포하는 경우에도 종료될 수 있다. 연장 연구를 종료하기 전에 이는 관련 규제 기관뿐만 아니라 DSMB 및 조사자와 논의될 것이다.
5.2 시험 디자인에 대한 과학적 근거
헤랄드 시험 CV-NCOV-004는 초기 2b상 시험과 대규모 3상 효능 시험으로의 전환이라는 두 부분으로 진행된다. 임상시험의 2상과 3상 부분은 모두 디자인이 일관적이므로, VE의 1차 분석을 위해 2상에서 발생하는 COVID-19 사례를 3상과 통합할 수 있다. 2상 및 3상에서 COVID-19 사례를 결합하여 효능 결과를 촉진하는 것은 전염병 상황에서 정당한 것으로 간주되었다.
2b상과 3상 모두 무작위, 관찰자-맹검 및 위약 대조가 될 것이다. 시험용 CVnCoV 백신과 위약의 모양과 외관의 차이로 인해 시험을 관찰자-맹검 방식으로 수행해야 하며, 이는 일반적으로 시험 맹검에 사용되며 잘 받아들여지는 방법이다. 무작위, 관찰자-맹검 및 위약 대조 디자인은 시험의 안전성 및 효능 결과에서 편향 위험을 감소시킬 것이다 (섹션 7.3 참조).
고령자는 SARS CoV 2의 영향을 가장 많이 받고 심각한 질병 및 사망 위험이 높기 때문에, 이 모집단에서 CVnCoV를 조사하는 것이 중요하므로 61세 이상의 피험자가 포함된다.
2b상 대상 4,000명의 표본 크기는 3상에 진입하기 전에 CVnCoV의 안전성, 반응성 및 면역원성을 특징짓는 강력하고 상세한 데이터 세트를 생성하는 것을 기반으로 한다. 또한, 2b상에서 생성된 데이터가 CVnCoV의 조기 조건부 승인을 지원하는데 제출될 주요 데이터 세트가 될 것이다.
결합된 2b/3상 시험에 대한 36,500명의 피험자의 총 표본 크기는 VE를 60%로 고려할 때 30% (VE에 대한 97.5% CI의 하한에 대한 30% 마진 기준) 이상의 VE를 입증하는 것을 기반으로 한다. 2.5%의 양면 알파와 총 185건의 COVID-19 사례를 가지고, 시험은 30% 이상의 VE를 입증하는 90%의 검정력을 갖게 된다. 대조 피험자군에서 월 0.15%의 COVID-19 발병률; 및 기준선에서 등록자의 5% 혈청양성을 포함하는 시험 중 20%의 평가할 수 없는 비율(즉, 이력이 없는 피험자가 아닌 피험자)을 가정할 때, 3개월 동안 등록된 36,500명의 피험자(백신 그룹당 18,250명)의 추적 조사는 첫 번째 백신접종 후 약 9개월 후에 목표 185 COVID-19 사례를 누적할 것이다.
효능에 대한 공동 1차 분석의 경우, COVID-19 사례 확인은 CVnCoV 2차 백신접종 후 15일 이상에 시작된다. 이 시점은 면역 반응이 성숙하고 두 번째 투여 후 최대 높이에 도달하도록 한다. 이처럼, 이 시점에서 시작되는 사례 확인은 COVID 19에 대한 CVnCoV의 완전한 VE 평가를 의미한다.
3상의 안전 목표는 CVnCoV의 안전성을 입증할 대규모 안전 데이터베이스를 생성하는 것이다. 임상시험의 2b상 및 3상 부분에 참여하는 모든 피험자는 두 번째 백신접종 후 6개월 동안 의료 참여 AE가 수집되고; 및 두 번째 백신접종 후 1년 동안 AESI 및 SAE가 수집된다. 이와 같이 각 피험자는 약 13.5개월 동안 안전성 추적조사에 참여하게 된다.
바이러스학적으로 확인된 COVID-19 질병의 이력이 있는 개인은 이 시험에 참여할 수 없다. 그러나 이 시험은 과거 SARS-CoV-2 감염의 병력 또는 실험실 증거가 있는 참가자를 선별하거나 배제하지 않으며, 이들 중 상당수는 무증상이었을 수 있다. 사전 감염에 대한 백신접종-전 스크리닝은 실제로 발생할 가능성이 낮기 때문에, SARS-CoV-2 바이러스에 이전에 감염된 개인의 백신 안전성과 COVID-19 결과를 이해하는 것이 중요하다.
5.3 용량에 대한 정당성
시험 CV-NCOV-004에 대한 CVnCOV의 12μg mRNA 용량 수준의 선택은 시험 CV-NCOV-001 및 CV NCOV-002의 안전성, 내약성 및 면역원성 결과를 기반으로 했다.
5.4 시험 종료 정의
피험자는 무작위 배정된 그룹에 적용가능한 모든 방문, 절차 및 테스트를 완료했을 때 시험을 완료한 것으로 간주된다.
시험 CV-NCOV-004의 종료는 마지막 피험자가 393일째에 마지막 방문을 완료했거나 시험을 조기에 중단한 때로 정의된다.
모든 피험자는 마지막 피험자가 757일째에 마지막 방문을 완료한 때로 시험 종료가 정의되는 1년 연장 연구에서 계속될 것으로 예상된다.
5.5 안전을 위한 정지/일시정지 규칙
5.5.1 개별 피험자 중지 규칙
첫 번째 시험 백신접종 후 다음과 같은 사건이 발생할 경우 개별 피험자 중단 규칙이 충족된다:
ㆍ 시험 백신과 관련된 것으로 간주되는 알레르기/아나필락시스 반응
ㆍ 시험 백신과 관련된 것으로 간주되는 모든 SAE
이러한 규칙 중 하나라도 충족되면, 대상은 두 번째 백신접종을 받지 않아야 한다. 피험자는 안전을 위해 시험이 끝날 때까지 계속 참여하도록 권장된다.
5.5.2 시험의 일시중지
안전성 신호로 인해 시험을 일시중지하기로 한 결정(즉, 등록 및 백신접종의 일시적인 중단)은 후원사와 협의하여 DSMB의 권장 사항을 기반으로 한다(섹션 9.3.9.1 참조). DSMB는 정기적으로 예정된 DSMB 회의에서 제공되는 축적된 안전성 데이터를 검토한 후 또는 의심되는 예기치 않은 심각한 부작용(suspected unexpected serious adverse reaction, SUSAR); 시험 백신과 관련된 것으로 판단되는 모든 SAE; SAE(예: AESI) 관련; 생명을 위협하는 모든 AE 및 사망을 포함하되 이에 국한되지 않는 AE에 대한 지속적인 검토를 통해 안전성 문제로 시험을 일시 중지할 것을 권장할 수 있다. 이러한 이벤트는 평가 기간 동안 DSMB에서 정기적으로 모니터링한다. 안전성 검토를 위해 선택된 AE 및 절차는 DSMB 헌장에 자세히 설명되어 있다.
지속적으로 피험자의 안전을 보장하기 위해, 위에 설명된 AE의 블라인드(blinded) 목록은 DSMB 의장(또는 피지명인)이 정규의 간격으로 정기적으로 모니터링한다. 각 검토에 대해 의장{또는 피지명인}은 단일 이벤트 또는 이벤트 그룹이 새로운 안전 신호를 구성하는지 여부를 결정한다. 그렇지 않은 경우 의장은 연구 팀에 안전 문제가 없음을 알린다. 반대로, 안전 문제가 있는 경우, 의장은 AE 또는 AE들의 블라인드를 해제하고, 필요한 경우 이벤트(들)에 대한 추가 평가를 위해 임시 DSMB 회의를 소집할 수 있다.
시험 백신에 대한 AE(들)의 대략적 상관성의 유익성-위험 비율 및 생물학적 타당성의 평가를 기반으로, DSMB는 후원자에게 계획대로 시험을 계속하거나 수행을 수정하거나 또는 AE의 추가 평가를 허용하기 위해 시험을 일시중지할 것을 추천할 수 있다. 후자의 경우, 후원자는 DSMB와 협의하여 연구를 일시중지하기로 결정한다.
DSMB의 역할과 책임에 대한 추가 논의는 DSMB 헌장을 참조하라.
6 시험 모집단(population)
등록 기준은 명시적으로 따라야 한다. 포함 기준 중 하나 이상을 충족하지 않고/하거나 제외 기준 중 하나 이상을 충족하지 않는 피험자가 부주의하게 등록 및 투여된 것으로 기록된 경우, 후원자에게 즉시 연락해야 한다.
이 시험에서 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 질병의 이력이 있는 개인은 시험에서 제외된다. 그러나 이 시험은 이전 SARS-CoV-2 감염의 병력 또는 실험실 증거가 있는 개인을 선별하거나 배제하지 않는다. 또한, 등록 당시 SARS CoV 2 감염이 있는 개인을 제외하기 위해 스크리닝 시 일상적인 RT PCR 검사를 수행하지 않는다. 국가별 규정이 추가로 준수된다.
6.1 모든 대상들에 대한 포함 기준
피험자는 다음 기준을 모두 충족하는 경우에만 이 시험에 등록된다:
1. 18세 이상의 남성 또는 여성 피험자.
2. 시험 절차를 시작하기 전에 서면 동의서를 제공.
3. 프로토콜 절차에 대한 예상 준수 및 마지막 계획된 방문을 통한 임상 후속 조치의 가용성.
4. 다음과 같이 정의된 비-가임 가능성의 여성: 수술로 불임(양쪽 난관 결찰, 양측 난소 절제술 또는 자궁 절제술의 병력) 또는 폐경 후 {대체 의학적 원인 없이 선별 검사(1일차) 전 연속 12개월 동안 무월경으로 정의}. 난포 자극 호르몬(FSH) 수준은 폐경 후 상태를 확인하기 위해 조사자의 재량에 따라 측정될 수 있다.
5. 가임 여성: 1일 및 29일에 각 시험 백신접종 전 24시간 이내에 소변 임신 테스트 음성 {인간 융모막 성선 자극 호르몬(hCG)}.
6. 가임 여성은 시험 백신접종 2주 전부터 마지막 백신접종 후 3개월까지 매우 효과적인 피임법을 사용해야 한다. 다음과 같은 피임 방법은 일관되고 올바르게 사용하면 매우 효과적인 것으로 간주된다:
ㆍ 조합된 배란 억제와 관련된 (에스트로겐 및 프로게스토겐 포함) 호르몬 피임법 (경구, 질내 또는 경피);
ㆍ 배란 억제와 관련된 프로게스테론 단독 호르몬 피임법 (경구, 주사 또는 이식);
ㆍ 자궁 내 장치(IUD);
ㆍ 자궁 내 호르몬 방출 시스템(IUS);
ㆍ 양측 난관 폐쇄;
ㆍ 정관을 절제한 파트너 또는 불임 파트너;
ㆍ 성적인 금욕 {주기적인 금욕(예: 달력, 배란, 증상 온열 및 배란 후 방법) 및 금단은 허용되지 않음}.
6.2 제외 기준
피험자는 다음 기준 중 하나라도 충족하는 경우 이 시험에 등록하지 않는다:
1. 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 질병의 이력.
2. 여성의 경우: 임신 또는 수유.
3. 첫 번째 시험 백신 투여 전 28일 이내에 시험 중이거나 등록되지 않은 제품(백신 또는 약물)의 사용 또는 시험 중 사용 계획.
4. 1차 시험 백신 접종 전 28일(생백신의 경우) 또는 14일(비활성화 백신의 경우) 이내에 허가된 백신의 접종.
5. 연구용 SARS-CoV-2 백신 또는 다른 코로나바이러스(SARS-CoV, MERS-CoV) 백신의 사전 투여 또는 시험 중 사용 계획.
6. 시험 백신 투여 전 6개월 이내에 총 14일 이상 동안 면역억제제 또는 기타 면역 조절 약물(코르티코스테로이드, 생물학적 제제 및 메토트렉세이트를 포함하지만 이에 국한되지 않음)을 사용한 모든 치료 또는 시험 중 사용 계획. 코르티코스테로이드 사용의 경우 이는 14일 이상 동안 프레드니손 또는 이에 균등물 0.5mg/kg/일을 의미한다. 코르티코스테로이드의 흡입, 국소 또는 국소 주사(예: 관절 통증/염증)의 사용은 허용된다.
7. 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV) 또는 C형 간염 바이러스(HCV) 감염을 포함하여 병력 및 신체 검사에 기초하여 의학적으로 진단되거나 의심되는 면역억제 또는 면역결핍 상태; 백혈병, 림프종, 호지킨병, 다발성 골수종 또는 전신 악성종양을 포함한 암의 현재 진단 또는 치료; 만성 신부전 또는 신증후군; 및 장기 또는 골수 이식의 수령.
8. 혈관부종의 병력(유전성 또는 특발성), 또는 임의의 아나필락시스 반응 또는 pIMD의 병력.
9. CVnCoV 백신의 성분에 대한 알레르기 병력.
10. 시험 백신 투여 전 3개월 이내에 면역글로불린 또는 혈액 제제 투여 또는 시험 기간 동안 예정된 수령.
11. 연구자의 의견에 따라 임상시험 참여를 배제할 수 있는 심각한 급성 또는 만성 의학적 또는 정신과적 질환이 있는 피험자 (예를 들어, 시험 참여의 위험을 증가시키거나, 피험자가 시험의 요구 사항을 충족할 수 없도록 하거나, 피험자의 시험 평가를 방해할 수 있음). 여기에는 중증 및/또는 조절되지 않는 심혈관 질환, 위장 질환, 간 질환, 신장 질환, 호흡기 질환, 내분비 장애, 신경 및 정신 질환이 포함된다. 그러나 통제되고 안정적인 사례가 있는 사람들은 시험에 포함될 수 있다.
12. 근육주사 또는 채혈이 금기인 응고장애 또는 출혈 장애가 있는 피험자.
13. 조사관이 판단한 시험 절차의 예측가능한 불이행.
6.3 백신 지연 권장사항
등록 후, 피험자는 아래에 설명된 바와 같이 시험 백신 투여의 지연을 정당화할 수 있는 임상 상황에 직면할 수 있다:
ㆍ1일 또는 29일에 예정된 시험 백신접종 후 3일 이내에, 임상적으로 유의한(≥ 등급 2) 활성 감염 또는 기타 급성 질환(조사자가 평가한 대로) 또는 체온 ≥ 38.0 ℃(≥ 100.4 °F) 대상자. 이는 COVID-19 질병을 나타낼 수 있는 증상이 포함된다.
o 활성 감염 또는 기타 급성 질환이 ≤ 1등급으로 회복되거나 대상체의 체온이 < 38.0 ℃(< 100.4°F)로 감소할 때까지 시험 백신접종을 연기해야 한다. 질병의 해결에 따라, 피험자는 조사자의 판단에 기초하여 시험 백신접종을 위해 다시 일정이 잡힐 수 있다.
o 경미한 질병이 있는 열이 있는 대상체는 조사자의 재량에 따라 백신접종을 받을 수 있다.
ㆍ시험용 백신의 예정된 투여 전후 28일(생백신의 경우) 또는 14일(불활화 백신의 경우) 이내에 허가된 백신의 수령. 이 기간은 권장 기간이므로 이러한 기간을 준수하도록 시험 백신접종 일정을 변경하는 것은 가능한 경우에만 수행해야 한다.
6.4 자격 기준 미달(Failure to Meet Eligibility Criteria)
조사자는 사전 동의서에 서명한 모든 피험자에 대해 설명해야 한다. 대상이 적격하지 않은 것으로 밝혀지면(즉, 모든 포함 기준을 충족하지 않거나 하나 이상의 제외 기준을 충족함), 연구자는 이를 대상의 원본 문서에 문서화해야 한다.
7 시험 백신
7.1 시험 백신 투여
7.1.1 시험 백신에 대한 설명
CVnCoV는 연구용 LNP 제제화된 RNActive® SARS-CoV-2 백신이다. IMP는 활성 약학적 성분, Wsmpv-SP를 코딩하는 mRNA, 및 4가지 지질 성분: 콜레스테롤, 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), PEG화 지질 및 양이온성 지질로 구성된다. 그것은 1mg/mL의 mRNA 약물 물질의 농축물로 공급된다.
위약 백신은 주사용 멸균 생리식염수(0.9% NaCl)이다.
7.1.2 용량 및 투여
7.1.2.1 CVnCoV
CVnCoV에 무작위 배정된 피험자는 28일 간격으로 투여되는 12μg mRNA의 용량 수준으로 CVnCoV를 2회 주사할 것이다.
CVnCoV의 투여는 삼각근 부위, 바람직하게는 비주력 팔에 근육내(IM) 주사로 수행해야 한다. CVnCoV는 엄격하게 IM 주사용이며, 피하, 피내 또는 정맥 주사해서는 안된다. 약국 매뉴얼에 설명된 주사 지침을 따라야 한다.
7.1.2.2 위약 대조군 (정상 식염수)
시험의 대조군에 무작위 배정된 피험자는 28일 간격으로 식염수 위약(주사용 생리 식염수(0.9% NaCl))의 2회 용량을 받는다.
식염수 위약의 투여는 삼각근 부위, 바람직하게는 비주력 팔에 IM 주사로 수행해야 한다. 약국 매뉴얼에 설명된 주사 지침을 따라야 한다.
7.1.2.3 백신접종에 대한 과민 반응
CVnCoV는 백신 성분에 과민증이 있는 것으로 알려진 피험자에게 투여해서는 안된다.
아나필락시 반응의 이론적 위험이 있으므로, 시험용 백신은 아나필락시 반응 치료를 위한 응급 장비(정맥 수액, 코르티코스테로이드, H1 및 H2 차단제, 에피네프린, 심폐 소생술 장비)가 있는 경우에만 투여해야 한다. 모든 피험자는 시험 백신 투여 후 최소 30분 동안 이러한 반응의 치료에 대해 훈련을 받은 직원의 직접적인 감독 하에 있어야 한다.
시험 백신 투여 후 아나필락시스 또는 심각한 과민 반응이 발생하면 더 이상 투여하지 않아야 한다(섹션 5.5.1 및 8.1 참조).
7.2 준비/취급/보관/책임
CVnCoV 및 식염수 위약의 준비, 취급, 보관 및 맹검에 대한 자세한 정보는 약국 매뉴얼을 참조하라.
7.2.1 CVnCoV 제조
농축된 CVnCoV는 IM 주사용 용량 용액을 생성하기 위해 제공된, 방부제가 포함된 멸균 생리식염수(0.9% NaCl) 희석제에 희석되어야 한다. 이것은 CureVac AG에서 제공한 IMP에 대한 취급 매뉴얼에 따라 맹검, 자격을 갖춘 약사가 준비한다. 약사는 백신접종 후 다른 시험 기능을 수행하지 않으며 엄격한 기밀로 치료 할당을 유지한다.
7.2.2 CVnCoV 제품 보관 및 안정성
농축된 CVnCoV는 -60 ℃ 이하에서 동결되어 현장으로 배송된다.
일단 현장에 도착하면 농축된 CVnCoV는 -60 ℃ 미만에서 냉동 보관해야 한다.
7.2.3 위약 대조군 (정상 식염수)
생리식염수 위약 대조 백신은 제품 특성 요약에 따라 보관해야 한다.
7.2.4 책임(Accountability)
해당 규정 및 지침에 따라 적절한 양식을 사용하여 현장에서 접수, 저장 및 분배된 시험 용품의 현재 및 정확한 기록이 유지되도록 하는 것은 조사자의 책임이다. 시험 용품은 접근이 제한된 권장 보관 조건에서 보관해야 한다 (약국 설명서 참조). 승인된 직원은 프로토콜과 해당 규정 및 지침에 따라 시험 장소에서 백신을 조제해야 한다.
IMP 책임 및 인벤토리 로그는 다음 정보와 함께 평가판 사이트에서 최신 상태로 유지되어야 한다:
ㆍ CureVac에서 받은 CVnCoV의 날짜 및 수량.
ㆍ 고유한 피험자 식별자.
ㆍ 각 피험자에게 분배된 시험 백신의 날짜 및 양.
ㆍ 투여를 준비하는 사람의 이니셜.
ㆍ 백신을 투여한 사람의 이니셜.
이러한 로그는 검사를 위해 즉시 사용할 수 있어야 하며 언제든지 규제 검사에 공개된다.
7.3 무작위화 및 맹검(Blinding)
2b상과 3상 모두 무작위, 관찰자-맹검 및 위약 대조로 수행된다. 연구용 CVnCoV 백신과 위약의 외관이 다르기 때문에 시험을 관찰자 맹검 방식으로 수행해야 했으며, 이는 널리 인정되는 맹검 방법이다.
7.3.1 무작위화
18세 이상의 피험자는 전 세계적으로 여러 사이트에 등록되고 CVnCoV 또는 위약을 받기 위해 1:1 비율로 무작위화됩니다. 무작위 배정은 중앙에서 수행되며 국가 및 연령 그룹(18 내지 60세 및 61세 이상)별로 계층화된다. 무작위화 계획은 계약 연구 기관(CRO), PRA의 독립 통계 그룹에 의해 생성되고 유지된다. 피험자는 온라인으로 시험에 등록되고 IWRS(Interactive Web Response System)를 사용하여 무작위로 지정된다. 인구통계학적 및 적격성 기준이 시스템에 입력된 후 시험에 등록된 각 피험자에게 치료 할당이 할당된다.
7.3.2 맹검
피험자는 무작위로 선정되고 (시험용 CVnCoV 백신과 위약의 모양과 외관의 차이로 인해) 관찰자 맹검 방식으로 CVnCoV 또는 위약 백신을 접종할 것이다. 현장의 약사는 피험자에게 투여되는 시험 백신의 정체가 가려지지 않을 것이다. 그러나 백신접종자, 조사자 및 시험 수행(안전 추적 및 COVID-19 사례 확인 포함)에 관련된 모든 현장 직원은 시험 백신 및 대상자 치료 할당에 대해 정보가 가려진다. 백신접종자의 맹검을 유지하기 위해, 약사는 액체 내용물이 보이지 않도록 라벨이 부착된 주사기에 미리 채워진 투여용량의 시험 백신을 백신접종자에게 제공한다. 임상시험 수행에 직접 관여하는 CRO 및 후원자의 모든 직원도 맹검 상태가 된다. CRO 및 후원자(Sponsor)에는 시험 기간 동안 맹검 해제가 필요한 기능을 담당하는 특정 개인이 있을 것이다(예: 약국에서 시험 백신 책임에 대한 맹검 해제 모니터링; DSMB를 지원하는 맹검해제된 독립 통계학자; 면역원성 데이터 검토(다음 단락 참조)}. 이러한 맹인해제 개인을 식별되고 그들의 책임을 문서화한다.
면역원성 결과는 피험자의 치료 할당을 맹검해제할 것이기 때문에, 분석을 수행하는 독립적인 실험실은 결과를 엄격하게 기밀로 유지할 것이다. 시험 시작 시 이름이 지정되고 시험 수행과 독립적인 맹검해제 담당자는 생성되는 면역원성 데이터의 품질을 검토할 책임이 있다. 이 사람은 결과를 철저히 비밀로 유지한다. 맹검을 유지하기 위해, 면역원성 데이터는 시험의 맹검해제 후에만 임상 데이터베이스와 병합된다.
DSMB 회의에서 검토된 안전 데이터를 맹검 해제할지 여부는 DSMB 회원의 재량에 따른다. 안전 문제가 있는 경우, DSMB는 언제든지 개별 대상 또는 특정 데이터세트의 맹검해제를 요청할 수 있다. 또한 DSMB는 VDE의 신호에 대해 백신 그룹별 COVID-19 사례를 주기적으로 모니터링한다. 중간 분석에서, DSMB는 백신 그룹별 COVID-19 사례를 검토하여 유효한지 또는 무익한지 여부를 검토하고, 그 결과를 후원자에게 맹검 방식으로 전달할 것이다.
시험 CV-NCOV-004를 진행하는 동안 규제 승인을 위한 문서 제출을 위해(예: 중간 분석 중 하나에서 효능이 입증된 경우) 시험 수행 팀과 완전히 독립적인 맹검해제 제출 팀(Submisstion Team)이 구성된다. 제출 팀은 스폰서 및 CRO의 개인으로 구성되며, 비맹검 팀에서의 그들의 역할과 책임이 명확하게 정의된다.
7.3.3 비상 맹검해제
개별 맹검해제는 시험 백신에 대한 지식이 피험자의 임상 관리 또는 복지에 필수적인 경우 피험자의 안전을 위해 긴급 상황에서만 발생해야 한다. 이 상황에서 맹검해제는 이상적으로는 후원자와의 논의에서 조사자의 판단에 기초할 것이다.
일반적으로 시험 백신의 정체는 SAE/AE의 임상 관리에 영향을 미치지 않아야 한다. 가능한 모든 경우, 조사자는 맹검을 해제하기 전에 긴급 맹검해제의 필요성에 대해 논의하기 전에 후원자에게 연락을 시도해야 한다. 합의되면 IWRS를 통해 코드 해독이 수행된다.
맹검이 깨졌을 때, 날짜, 정확한 시기, 및 이유는 원본 문서에 충분히 문서화되어야 한다. 조사자는 다른 맹검 시험 직원에게 IMP의 신원을 알리지 않아야 한다.
코드가 손상되었고 중단에 대한 의학적 이유가 없는 경우, 피험자는 시험을 계속할 수 있다. 피험자가 시험 백신을 1회 이상 받은 경우, 후원자와 협의하여 피험자가 두 번째 접종으로 백신을 접종할지 여부는 조사자가 판단할 것이다. 피험자가 시험에서 중단된 경우, 시험이 끝날 때까지 피험자의 안전 추적을 계속하기 위해 모든 노력을 기울여야 한다.
7.4 백신 준수(Compliance)
조사자는 피험자의 eCRF 페이지에 투여된 모든 시험 백신접종을 기록해야 한다.
7.5 오용 및 과다복용
오용의 정의: 시험용 백신이 프로토콜 투여 지침 또는 승인된 제품 정보에 따르지 않고 의도적으로 부적절하게 사용되는 상황.
과량투여의 정의: 프로토콜 투여 지침 또는 승인된 제품 정보에 따라 최대 권장 용량을 초과하는 투여당 또는 누적적으로 주어진 시험 백신 양의 투여.
현재 임상 및 비임상 경험에서 독성 영향이 예상되지 않는다. 가능한 국소 반응 (통증) 또는 전신 AE (발열, 두통, 피로, 오한, 근육통, 관절통, 메스꺼움/구토 및 설사)는 물리적 조치, 파라세타몰 또는 비스테로이드성 항염증제로 증상에 따라 치료할 수 있다.
7.6 병용 요법 및 백신
투여 이유를 포함한 병용 약물 및 백신은 피험자의 eCRF에 기록되어야 한다.
7.6.1 시험 기간 동안 허용된 약물/백신
피험자는 피험자가 가질 수 있는 진행 중인 상태(들)를 치료하기 위해 해열제 및 기타 진통제를 사용할 수 있다. 해열제(예: 파라세타몰) 또는 기타 진통제를 사용하여 시험 백신 접종과 관련된 국소 및/또는 전신 반응을 치료할 수 있다. 잠재적인 백신 관련 반응에 대해 예방적으로 복용하는 파라세타몰도 이 시험에서 허용된다. 예를 들어, 피험자가 첫 번째 시험 백신접종 후 이상 반응을 경험하면, 두 번째 시험 백신접종을 위해 이러한 반응에 대해 예방적으로 파라세타몰을 복용 할 수 있다. 이 경우, 파라세타몰(최대 1g 용량)은 시험 접종 후 및 취침 시간에 복용하고, 다음날 아침 및 취침 시간에 복용할 수 있다. 또는 500mg 용량의 파라세타몰을 최대 36시간 동안 시험 백신접종 후 6시간마다 복용할 수 있다. 파라세타몰의 투여량 및 투여 일정은 조사자와 논의해야 한다.
백신 관련 반응의 치료 또는 예방을 위해 투여된 파라세타몰은 시험 백신접종과 관련된 투여 시기에 따라 eCRF에 문서화되어야 한다.
섹션 6.2에 설명되어 있고 아래 섹션 7.6.2에 나열된 금지 약물 및 백신 외에, 대상자의 기존 의학적 상태의 치료에 필요한 약물은 허용된다.
7.6.2 시험 중 금지된 약물/백신
ㆍ 임상시험 기간 중에는 임상시험 또는 미등록 제품(백신 또는 의약품)의 사용을 금지한다.
ㆍ 허가된 백신은 시험 중 시험 백신 투여 후 28일(생백신의 경우) 또는 14일(불활화 백신의 경우) 이내에 투여해서는 안 된다.
ㆍ 시험 중에는 다른 조사용 SARS-CoV-2 백신 또는 기타 코로나바이러스 백신을 받는 것이 금지된다.
ㆍ 시험 중에는 면역억제제 또는 기타 면역 조절 약물(코르티코스테로이드, 생물학적 제제 및 메토트렉세이트를 포함하되 이에 국한되지 않음)을 사용한 치료가 금지된다. 코르티코스테로이드 사용의 경우, 이는 14일 이상 동안 프레드니손 또는 이에 상응하는 약물 0.5mg/kg/일을 의미한다. 코르티코스테로이드의 흡입, 국소 또는 국소 주사(예: 관절 통증/염증)의 사용은 허용된다.
ㆍ 시험 중에는 면역글로불린 또는 혈액 제제의 투여가 금지된다.
7.7 중단으로 이어지는 치료
피험자가 섹션 6.2의 제외 기준으로 나열된 요법이 필요하고 이러한 요법이 지연될 수 없는 경우, 개별 사례 검토 후 시험 데이터의 완전성을 보장하기 위해 중단이 고려될 것이다. 시험이 끝날 때까지 피험자의 안전 추적을 계속하기 위해 모든 노력을 기울여야 한다.
7.8 시험 종료 후 치료
임상시험 후 케어는 제공되지 않는다.
8 중단 / 철회 기준
시험 참여는 전적으로 자발적이다. 피험자는 언제든지 어떤 이유로든 시험 참여를 철회할 권리가 있다. 연구자는, 피험자에게 최선의 이익이 되는 것으로 간주되거나 프로토콜 일탈의 결과로 추가 시험 백신 투여 및/또는 시험에서 피험자를 제외할 권리가 있다.
AE로 인한 중단의 경우, 이벤트 결과를 문서화하기 위해 모든 노력을 기울여야 한다.
시험 백신을 1회 이상 받은 피험자는 안전성 평가를 위해 시험이 끝날 때까지 계속 참여하도록 권장된다.
8.1 시험 백신 투여 중단
시험 백신의 추가 투여를 중단하는 주된 이유는 다음 범주에 따라 피험자의 eCRF에 기록된다:
ㆍ 피험자의 동의 철회.
철회 사유가 있는 경우, 제공된다면, eCRF에 기록해야 한다.
참고: 철회의 근본적인 이유를 파악하기 위한 모든 시도가 이루어져야 하며, 가능한 경우 근본적인 주요 이유를 기록해야 한다(즉, AE로 인한 철회는 "자발적 철회" 범주에 기록되어서는 안 됨).
ㆍ AE(시험 백신의 알려진 부작용 포함).
중단이 시험 백신 또는 시험 절차와 관련될 수 있는 AE로 인한 경우, 상태가 해결되거나 또는 조사자가 더 이상 의학적으로 지시되지 않는 추가 관찰 또는 검사라고 판단할 때까지 시험자의 의학적 판단에 따라 대상체에 대한 추가 검사를 실시해야 한다.
ㆍ 추가 참여를 금지하는 피험자의 전반적인 의학적 상태의 변경.
ㆍ 임신(섹션 9.3.5 참조).
적절한 피임이 필요함에도 불구하고, 시험 기간 동안 임신한 피험자는 추가 시험 백신접종을 받지 않을 것이다. 사이트는 임신한 피험자와의 접촉을 유지하고 가능한 한 빨리 "임상 시험 임신 양식(Clinical Trial Pregnancy Form)"을 작성해야 한다. 또한, 피험자는 아이가 태어날 때까지 또는 자발적 또는 자발적인 종료까지 추적 관찰해야 합니다. 임신 결과 정보를 사용할 수 있게 되면 동일한 형식을 사용하여 정보를 캡처해야 한다. 피험자는 IMP 중단으로 보고되어야 하고 이유(즉, 임신)가 제공되어야 한다.
ㆍ 후원자에 의한 종료된 시험(이 경우 393일째 시험 방문 종료 시 수행된 최소 안전 추적조사가 수행됨).
ㆍ 주요 프로토콜 편차.
ㆍ 기타.
참고: 구체적인 이유는 eCRF의 "specify" 필드에 기록되어야 한다.
8.2 시험으로부터의 철회
다음 상황 중 하나가 발생하는 경우 피험자를 시험에서 철회해야 한.
ㆍ 지속적인 참여가 피험자의 건강, 안전 또는 권리를 위태롭게 한다.
ㆍ 지속적인 참여가 피험자의 건강에 허용할 수 없는 위험을 초래하거나 피험자가 AE 때문에 계속할 의사가 없기 때문에, 피험자가 조기 종료가 필요한 AE를 경험했다. 추가 안전성 또는 면역원성 평가를 수행하지 않는 이유를 문서화해야 한다.
ㆍ 피험자는 사이트로 돌아오지 않았고 피험자에게 연락하기 위한 여러 번의 시도(최소 3회 시도)가 실패했다(추적 조사에 실패).
ㆍ 피험자는 시험으로부터 철회하기를 원한다. 철회 사유는, 제공된다면, 기록해야 한다.
철회의 근본적인 이유를 결정하기 위한 모든 시도가 이루어져야 하며, 가능한 경우 근본적인 주요 이유를 기록해야 한다(즉, AE로 인한 철회는 "자발적 철회" 범주에 기록되어서는 안 됨).
참여를 조기에 종료하고 최소한 1회의 시험 백신접종을 받은 모든 대상은 시험 방문 종료와 동일한 절차를, 그러한 절차가 피험자에게 허용할 수 없는 위험을 초래하는 것으로 간주되지 않는 한, 거치게 된다. 중단되거나 철회된 대상은 대체되지 않는다.
8.3 시험 종료
후원사는 언제든지 시험을 종료할 수 있는 권리를 보유한다. 시험 종료의 가능한 이유는 다음과 같다.
ㆍ 중간 분석의 결과가 높은 VE 또는 무익함을 나타낼 수 있다.
ㆍ 안전상의 이유: 관련 백신을 사용하는 이 시험이나 다른 시험에서 AE의 발생률은 피험자의 잠재적인 건강 위험성을 나타낸다.
ㆍ 실험의 목적을 더 이상 실현 가능/유효하지 않게 만드는 새로운 과학적 지식이 알려졌다.
ㆍ 사이트는 합의된 기간 내에 충분한 대상체를 모집할 수 없을 것이다.
ㆍ 사이트가 시험 관리 요청에 응답하지 않는다.
ㆍ 반복되는 프로토콜 편차.
ㆍ 안전하지 않거나 비윤리적인 관행.
ㆍ 행정 결정.
시험 종료 결정에 따라, 연구자는 후원자가 설정한 기간 내에 모든 피험자에게 연락해야 한다. 모든 시험 자료를 수집하고 관련 문서를 최대한 완성해야 한다.
시험은 또한 어떤 이유로든 또는 DSMB가 권장하는 경우 규제 당국에 의해 종료될 수 있으며, 독립 윤리 위원회 또는 기관 검토 위원회(IEC/IRB)가 현장 수준에서 종료할 수도 있다. 후원사는 불량한 프로토콜 준수 또는 불만족스러운 피험자 모집과 같은 이유로 개별 사이트를 조기에 폐쇄할 수 있다.
8.4 후속 조치 실패
예정된 시험 방문을 위해 돌아오지 않았거나 예정된 전화 통화에 연락할 수 없는 피험자에게 연락하기 위해 모든 노력을 기울여야 한다. 최소 3번의 시도를 하고 문서화해야 한다. 관련 SAE 또는 AE가 해결되기 전에 피험자가 후속 조치를 취하지 못한 경우, 후원사는 후속 안전 정보를 수집하기 위해 피험자에게 연락을 시도하는 추가 시도를 고려할 수 있다.
9 시험 평가 및 절차
시험 평가 및 절차는 이 섹션에서 논의된다.
프로토콜 지정 사이트 방문을 위해 사이트에 올 수 없는 피험자의 경우 (예: COVID-19와 관련된 공중 보건 비상 사태로 인해), 대체 방법(예: 전화 연락, 가상 방문, 평가를 위한 대체 위치)을 사용하여 안전성 평가가 수행될 수 있다.
대유행 상황에서 시험 수행의 유연성을 높이기 위해, 가정 방문을 통해 혈액 및 생체 샘플 수집을 포함한 안전성 평가 및 절차를 수행할 수 있다. 공중 보건 비상 사태와 같은 특수한 상황과 같이, 사이트 방문, 전화 연락 또는 샘플 수집이 프로토콜 정의 기간 내에서 수행할 수 없는 경우, 이러한 작업을 이 기간 밖에서 수행하는 것이 허용된다. 대유행 상황에서, 사이트 방문 및 전화 연락을 위한 프로토콜 정의 윈도우는 지침을 위해 제공되며 엄격하게 준수하지 않는 한 편차로 간주되지 않는다.
시험 중 안전 관련 정보를 효율적으로 수집하기 위해 전자일기(eDiary)를 사용한다. 다만, 시험기간 중 일부 대상자들에 대해서는 종이일기로 대체할 수 있다.
2b상에 2개의 타깃 연령 그룹의 피험자 등록 시작은 유연하다. 1상 및 2a상 시험의 데이터 시기에 따라, 2개 연령 그룹을 2b상으로 등록하는 것은 시차를 둘 수 있으며, 처음에는 18세 내지 60세 사이의 피험자부터 시작하여 61세 이상의 피험자도 뒤따른다. 고령층이 2b상에서 전체 피험자의 20% 내지 25%를 구성할 것이기 때문에, 이 시차를 둔 시작은 2b상 코호트의 전체 등록에 영향을 미질 것으로 예상되지 않는다.
9.1 시험 평가 및 절차의 일정
사전 동의 양식에 서명함으로써, 피험자는 약 2.1년의 참여 기간 동안 시험 CV-NCOV-004 및 그것의 1년 연장 연구(Extension Study) 모두에 참여하는 데 동의하게 된다.
시험 평가 및 절차는, 시험 전에 SARS CoV-2 양성 혈청학을 알았는지와 무관하게 또는 후향적 분석에 따른 기준선에서의 혈청학 상태와 무관하게, 모든 대상체에 적용된다.
2b상에 참여하는 피험자는 체온을 경구로 측정하기 위한 체온계와 국소 주사 부위 반응의 크기를 결정하기 위한 측정 테이프를 받게 된다. 피험자는 eDiary에 7일 동안 매일 요청된 AE를 입력하는 방법에 대해 지도받는다.
시험을 수행하고 피험자와 상호 작용하는 동안, COVID-19의 조기 경고 징후가 있는 사람은 즉시 응급 의료 서비스를 받아야 한다. 이러한 징후에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다: 호흡 곤란, 가슴에 지속적인 통증 또는 압박감, 새로운 혼란(confusion), 깨지 못하거나 깨어 있지 못함, 또는 푸르스름한 입술이나 얼굴.
9.1.1 2b상: 면역원성 하위집합
2b상 면역원성 하위집합에는 18-60세 및 61세 이상의 2개 연령 그룹 각각에 등록된 처음 600명의 피험자가 2b상으로 포함된다. 따라서 목표 총 등록 대상은 약 1,200 피험자이니다.
9.1.1.1 클리닉 방문 1: 1일차 - 첫 번째 시험 백신접종
피험자 적격성을 확립하기 위한 절차, 인구통계학적 정보 및 병력 기록은 시험 백신 투여 전 21일 이내에, 즉 1일보다 더 많은 날에 걸쳐 수행될 수 있다. 그러나 모든 정보가 이용가능하고 평가 및 절차를 수행할 수 있다면, 시험 백신 투여 당일에 적격성을 설정할 수 있다. 모든 적격성 기준은 1일차 시험 백신 투여 전에 검토해야 한다.
백신접종 전 절차
ㆍ 서명된 사전 동의 양식을 얻는다.
- 피험자가 시험에 참여하기 전, 그리고 프로토콜 지시 절차를 수행하기 전에 서명된 사전 동의를 받아야 한다.
- 피험자는 사전 동의서에 서명함으로써, 총 약 2년 동안 HERALD Trial CV-NCOV-004 및 1년 연장 연구에 참여하는 데 자발적으로 동의한다.
ㆍ 포함/제외 기준을 검토하고(섹션 6.1 및 6.2 참조) 제외 기준으로 나열된 금지 약물을 검토한다(섹션 6.2 참조).
ㆍ 인구 통계 정보를 기록한다.
ㆍ 병력을 기록한다.
ㆍ 이 시험에 등록하기 전 6개월 이내에 복용한 경우 간헐적 상태에 대한 반복 약물을 포함하여 수반하는(concomitant) 약물 및 백신접종을 기록한다.
ㆍ 키와 몸무게를 포함한 완전한 신체 검사를 수행한다 (섹션 9.3.7 참조). 시험 백신 투여 전 21일 이내에 적격성을 확립하기 위한 완전한 신체 검사를 수행한 경우, 시험 백신 투여 전 백신접종 당일에 증상 지향적(symptom-directed) 신체 검사를 수행해야 한다.
ㆍ 활력 징후(체온, 맥박, 혈압; 섹션 9.3.7 참조)를 측정한다.
ㆍ 가임 여성의 경우 소변 임신 테스트를 수행한다.
ㆍ SARS-CoV-2의 S 단백질의 RBD에 대한 결합 항체 검사(혈액 ~6mL); SARS-CoV-2 바이러스 중화 활성(~6mL 혈액); 및 SARS CoV 2의 N 단백질에 대한 결합 항체 테스트(~6mL 혈액)를 위해 백신접종 전 혈액 샘플을 수집한다.
ㆍ 선택한 부위(들)에서 피험자로부터 게놈 바이오마커(~6mL 혈액)를 위해 백신접종 전 혈액 샘플을 수집한다.
ㆍ 선택한 부위(들)에서 피험자로부터 CMI(~32mL 혈액)를 위해 백신접종 전 혈액 샘플을 수집한다.
백신접종 절차
ㆍ 백신접종 연기 또는 취소 기준을 검토한다. 백신 투여를 연기하거나 취소하는 기준에 대한 개요는 섹션 6.3 및 8.1을 참조. 지연되는 경우, 허용된 시간 윈도우에 백신접종을 해야 한다. 지연 또는 취소 사유는 피험자의 차트에 기록되어야 한다.
ㆍ 피험자의 지정에 따라 시험 백신 용량을 투여한다.
백신접종 후 절차
ㆍ 안전 모니터링을 위해 백신접종 후 최소 30분 동안 사이트에서 대상을 관찰한다. 관찰 기간 종료 시:
- 활력 징후(체온, 맥박, 혈압; 섹션 9.3.7 참조)를 측정한다.
- 활력 징후가 정상 범위 내에 있거나 백신접종 전 수준으로 회복될 때까지 피험자는 퇴원하지 않을 수 있다.
- 시험 백신접종 후 AE의 발생을 기록한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 요청된 AE를 측정하는 방법과 eDiary를 작성하는 방법을 지도한다. 피험자는 백신접종 당일 및 이후 7일 이내에 발생하는 요청된 국소 및 전신 AE 및 백신접종 당일 및 이후 28일 이내에 발생하는 요청되지 않은 AE(즉, 다른 모든 AE의 발생)를 기록해야 한다.
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 그/그녀가 어떤 관련 국소적 또는 전신적 반응 또는 기타 의학적 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 모든 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 이벤트와 시험 백신 사이의 인지된 상관성에 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지 여부를 예 또는 아니오 응답으로 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 대상자가 사이트 밖에서 수행된 SARS-CoV-2 검사에서 양성인 경우, 검사 당시 증상(COVID-19 질병)이든 무증상이든 상관없이, 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
참고: 증상이 없는 피험자는 여러 가지 이유로 검사를 받았을 수 있다. 예를 들어 SARS-CoV-2 감염이 있는 알려진 사람과의 근접 노출 또는 의료 제공자로서의 일상적인 검사의 일부일 수 있다.
9.1.1.2 전화 통화: 2일차 (-0/+0일)
이 전화 연락의 목적은 피험자의 전반적인 건강 상태를 문의하고 첫 번째 시험 백신접종 후 1일 후에 안전성을 평가하는 것이다.
ㆍ 전화 통화 중:
- 요청 및 요청되지 않은 AE 또는 기타 AE(의료 참여 AE, SAE)를 포함하여 새로 보고된 안전성 데이터를 검토하고 기록한다.
- 간헐적 상태에 대한 반복 약물을 포함하여, 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
- 피험자가 어떠한 관련 국소 또는 전신 반응 또는 기타 AE(예: 의료 참여 AE, SAE)에 관해 보고하는 경우, 조사자의 판단에 따라 전화 또는 예정에 없던 사이트 방문을 통해 후속 조치를 취해야 한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- eDiary에 요청된 AE 및 요청되지 않은 AE(즉, 다른 모든 AE의 발생)를 계속 기록하도록 피험자에게 상기시킨다.
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 그/그녀가 어떠한 관련 국소적 또는 전신적 반응 또는 기타 의학적 이벤트를 경험하는 경우
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 모든 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 이벤트와 시험 백신 사이의 인지된 상관성과 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지 여부에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 대상자가 사이트 밖에서 수행된 SARS-CoV-2 검사에서 양성인 경우, 검사 당시 증상(COVID-19 질병)이든 무증상이든 상관없이, 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.1.3 클리닉 방문 2: 29일차 - 2차 시험 백신접종 (-3/+7일)
백신접종 전 절차
ㆍ 요청 및 비요청 AE 또는 기타 AE(의료 참여 AE, SAE)를 포함하여 새로 보고된 안전성 데이터를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여, 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
ㆍ 증상 지향적 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압; 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 가임 여성의 경우 소변 임신 테스트를 수행한다.
ㆍ SARS-CoV-2의 S 단백질의 RBD에 대한 결합 항체 검사(혈액 ~6mL) 및 SARS-CoV-2 바이러스 중화 활성(혈액 ~6mL)를 위해 백신접종 전 혈액 샘플을 수집한다. 이 시점에서 SARS-CoV-2의 N 단백질에 대한 항체 테스트는 수행되지 않는다.
ㆍ 선택한 부위(들)에서 피험자로부터 게놈 바이오마커(~6mL 혈액)를 위해 백신접종 전 혈액 샘플을 수집한다.
ㆍ 선택한 부위(들)에서 피험자로부터 CMI(~32mL 혈액)를 위해 백신접종 전 혈액 샘플을 수집한다.
백신접종 절차
ㆍ 백신접종 연기 또는 취소 기준을 검토한다. 백신 투여를 연기하거나 취소하는 기준에 대한 개요는 섹션 6.3 및 8.1을 참조. 지연되는 경우, 허용된 시간 윈도우 내 백신접종을 해야 한다. 지연 또는 취소 사유는 피험자의 차트에 기록되어야 한다.
ㆍ 피험자의 지정에 따라 시험 백신 용량을 투여한다.
백신접종 후 절차
ㆍ 안전 모니터링을 위해 백신접종 후 최소 30분 동안 사이트에서 대상을 관찰한다. 관찰 기간 종료 시:
- 활력 징후(체온, 맥박, 혈압; 섹션 9.3.7 참조)를 측정한다.
- 활력징후가 정상 범위 내에 있거나 백신접종 전 수준으로 회복될 때까지 피험자는 퇴원하지 않을 수 있다.
- 시험 백신접종 후 AE의 발생을 기록한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 요청된 AE를 측정하는 방법과 eDiary를 작성하는 방법을 다시 지시한다. 피험자는 백신접종 당일 및 다음 7일 내에 발생하는 요청된 국소 및 전신 AE 및 백신접종 당일 및 다음 28일 내에 발생하는 요청되지 않은 AE(즉, 다른 모든 AE의 발생)를 기록해야 한다.
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 그/그녀가 어떤 관련된 국소적 또는 전신적 반응 또는 기타 의학적 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 모든 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 이벤트와 시험 백신 사이의 인지된 상관성과 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지 여부에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 대상자가 현장 밖에서 수행된 SARS-CoV-2 검사에서 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질병)이든 무증상이든 상관없이 즉시 현장에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.1.4 전화 통화: 30일차 (-0/+0일)
이 전화 연락의 목적은 피험자의 전반적인 건강 상태를 문의하고 2차 시험 백신접종 1일 후 안전성을 평가하기 위한 것이다.
평가 및 절차는 2일 차 전화 통화에서 수행한 것과 동일하다.
9.1.1.5 클리닉 방문 3: 43일차 (-3/+3일)
ㆍ 요청 및 비요청 AE 또는 기타 AE(의료 참여 AE, SAE)를 포함하여 새로 보고된 안전성 데이터를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
ㆍ 증상 지향적 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압; 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ SARS CoV-2의 S 단백질 RBD에 대한 결합 항체 테스트(혈액 ~6mL); SARS-CoV-2 바이러스 중화 활성(~6mL 혈액); 및 SARS-CoV-2의 N 단백질에 대한 결합 항체 테스트(~6mL 혈액)를 위해 혈액 샘플을 수집한다.
ㆍ 선택된 부위(들)에서 피험자로부터 게놈 바이오마커(~6mL 혈액)를 위해 혈액 샘플을 수집한다.
ㆍ 선택한 부위(들)에서 피험자로부터 CMI(~32mL 혈액)를 위해 혈액 샘플을 수집한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- eDiary에 요청된 국소 및 전신 반응의 기록이 완료되었음을 피험자에게 알린다. 요청되지 않은 AE(모든 AE)를 계속 기록하도록 피험자에게 상기시킨다.
- 피험자에게 즉시 현장에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 관련 의료 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 모든 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 이벤트와 시험 백신 사이의 인지된 상관성과 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지 여부에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 대상자가 현장 밖에서 수행된 SARS-CoV-2 검사에서 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질병)이든 무증상이든 상관없이 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.1.6 클리닉 방문 4: 57일차(-3/+7일)
ㆍ 요청되지 않는 AE 또는 기타 AE(의료 참여 AE, SAE)를 포함하여 새로 보고된 안전성 데이터를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여, 수반되는 약물 및 예방 접종을 기록한다.
ㆍ 증상 지향적 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압; 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ SARS-CoV-2의 S 단백질의 RBD에 대한 결합 항체(혈액 ~6mL) 및 SARS-CoV-2 바이러스 중화 활성(혈액 ~6mL)에 대한 면역원성 평가를 위해 혈액 샘플을 수집한다. (이 시점에서 SARS CoV 2의 N 단백질에 대한 결합 항체 테스트는 수행되지 않는다.)
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 요청되지 않는 AE의 보고가 완료되었음을 피험자에게 알린다.
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 관련 의료 이벤트가 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이, 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 모든 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 이벤트와 시험 백신 사이의 인지된 관련성과 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 현장에 연락하도록 상기시킨다다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 또한 검사 당시 증상(COVID-19 질병)이 있었든 무증상이었든 상관없이 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.1.7 클리닉 방문 5: 120일차(-7/+7일)
ㆍ 57일째에 사이트 방문 이후 새로 보고된 AE(의료 참여 AE, SAE)를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여, 수반되는 약물 및 예방 접종을 기록한다.
ㆍ 증상 지향적 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ SARS CoV-2의 S 단백질의 RBD에 대한 결합 항체 검사(혈액 ~6mL) 및 SARS-CoV-2 바이러스 중화 활성(혈액 ~6mL)를 위해 혈액 샘플을 수집한다. (이 시점에서 SARS CoV 2의 N 단백질에 대한 결합 항체 테스트는 수행되지 않는다.)
ㆍ 선택된 부위(들)에서 피험자로부터 게놈 바이오마커(~6mL 혈액)를 위한 혈액 샘플을 수집한다.
ㆍ 선택한 부위(들)에서 피험자로부터 CMI(~32mL 혈액)를 위한 혈액 샘플을 수집한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 관련 의료 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이, 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 모든 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 상관성과 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 또한 검사 당시 증상(COVID-19 질병)이 있었든 무증상이었든 상관없이 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.1.8 클리닉 방문 6: 211일차(-7/+7일)
평가 및 절차는 다음을 제외하고 120일째 클리닉 방문 5 동안 수행된 것과 동일하다.
ㆍ SARS CoV-2의 S 단백질 RBD에 대한 결합 항체 테스트(혈액 ~6mL); SARS-CoV-2 바이러스 중화 활성(~6mL 혈액); 및 SARS-CoV-2의 N(뉴클레오캡시드) 단백질에 대한 결합 항체 테스트(~6mL 혈액)를 위해 혈액 샘플을 수집한다.
ㆍ 선택된 부위(들)에서 피험자로부터 게놈 바이오마커를 위해 혈액 샘플(~6mL 혈액)을 수집한다.
9.1.1.9 전화 통화: 302일차(-7/+7일)
이 전화 연락의 목적은 211일째에 사이트 방문 이후 피험자의 전반적인 건강 상태를 문의하고 안전성을 평가하는 것이다.
ㆍ 전화 통화 동안:
o 211일째에 사이트 방문 이후 새로 보고된 AE(SAE)를 검토하고 기록한다.
o 간헐적 상태에 대한 반복 약물을 포함하여, 수반하는 약물 및 백신접종을 기록한다.
o 피험자가 AE에 관해 어떠한 것을 전화로 보고하는 경우, 조사자의 판단에 따라 전화 통화(들) 또는 예정에 없는 사이트 방문으로 후속 조치를 취해야 한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 관련 의료 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이, 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 모든 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 또한 검사 당시 증상(COVID-19 질병)이 있었든 무증상이었든 상관없이 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.1.10 시험 방문 종료: 393일차 (-0/+21일)
시험 방문의 종료는 마지막 시험 백신 투여 후 1년인 393일째에 수행될 것이다. 가능하다면, 이 방문에는 시험 기간 동안 백신접종을 조기에 중단한 피험자가 포함되어야 한다. 다음 평가를 수행해야 한다:
ㆍ 302일차의 전화 연락 이후 새로 보고된 AE(SAE)를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여, 수반되는 약물 및 예방 접종을 기록한다.
ㆍ 키와 몸무게를 포함한 완전한 신체 검사를 수행한다 (섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ SARS CoV-2의 S 단백질의 RBD에 대한 항체 결합 테스트(혈액 ~6mL); SARS-CoV-2 바이러스 중화 활성(~6mL 혈액); 및 SARS-CoV-2의 N 단백질에 대한 결합 항체 테스트(~6mL 혈액)를 위한 혈액 샘플을 수집한다.
시험의 주요 부분을 완료했으며, 시험의 확장 부분이 이제 시작될 것이라고 피험자에게 알린다 (섹션 9.1.4 참조).
9.1.2 2b상: 비면역원성 피험자
2b상 면역원성 하위집합(Immunogenicity Subset)(n=1,200)에 대상체를 등록한 후, 18세 이상인 나머지 2,800명의 대상체를 2b상으로 등록한다.
9.1.2.1 클리닉 방문 1: 1일차 - 첫 번째 시험 백신접종
피험자 적격성을 확립하기 위한 절차, 인구통계학적 정보 및 병력의 기록은 시험 백신 투여 전 21일 이내에, 즉 1일 초과에 걸쳐 수행될 수 있다는 점에 유의하라. 그러나 모든 정보가 이용가능하고 평가 및 절차를 수행할 수 있는 경우, 시험 백신 투여 당일에 적격성이 수립될 수 있다. 모든 적격성 기준은 1일차 시험 백신 투여 전에 검토해야 한다.
백신접종 전 절차
ㆍ 서명된 사전 동의 양식을 얻는다.
- 피험자가 시험에 참여하기 전, 그리고 프로토콜 지시 절차를 수행하기 전에 서명된 사전 동의를 받아야 한다(섹션 12.4 참조).
- 피험자는 사전 동의서에 서명함으로써, 총 약 2년 동안 HERALD 시험 CV-NCOV-004 및 1년 연장 연구(Extension Study)에 참여하는 데 자발적으로 동의한다.
ㆍ 포함/제외 기준을 검토하고(섹션 6.1 및 6.2 참조) 제외 기준으로 나열된 금지 약물을 검토한다 (섹션 6.2 참조).
ㆍ 인구 통계 정보를 기록한다.
ㆍ 병력을 기록한다.
ㆍ 이 시험에 등록하기 전 6개월 이내에 복용한 경우, 간헐적 상태에 대한 반복 약물을 포함하여, 수반되는 약물 및 백신 접종을 기록한다.
ㆍ 키와 몸무게를 포함한 완전한 신체 검사를 수행한다 (섹션 9.3.7 참조). 시험 백신 투여 전 21일 이내에 적격성을 확립하기 위한 완전한 신체 검사를 수행한 경우, 시험 백신 투여 전 백신접종 당일에 증상 지향적 신체 검사를 수행해야 한다.
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 가임 여성의 경우 소변 임신 테스트를 수행한다.
ㆍ SARS-CoV-2의 N 단백질에 대한 결합 항체 검사를 위해 백신접종 전 혈액 샘플(~6mL 혈액)을 수집한다.
백신접종 절차
ㆍ 백신접종 연기 또는 취소 기준을 검토한다. 백신 투여를 연기하거나 취소하는 기준에 대한 개요는 섹션 6.3 및 8.1을 참조하라. 지연되는 경우 허용된 시간 윈도우에 백신접종을 해야 한다. 지연 또는 취소 사유는 피험자 차트에 문서화되어야 한다.
ㆍ 피험자의 지정에 따라 시험 백신 용량을 투여한다.
예방접종 후 절차
ㆍ 안전성 모니터링을 위해 백신접종 후 최소 30분 동안 사이트에서 대상을 관찰한다. 관찰 기간 종료 시:
- 활력 징후를 측정한다 (체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
- 활력징후가 정상 범위 내에 있거나 백신접종 전 수준으로 회복될 때까지 피험자는 퇴원하지 않을 수 있다.
- 시험 백신접종 후 AE의 발생을 기록한다.
피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 요청된 AE를 측정하는 방법과 eDiary를 작성하는 방법을 지도한다. 피험자는 백신접종 당일 및 다음 7일 내에 발생하는 요청된 국소 및 전신 AE 및 백신접종 당일 및 다음 28일 내에 발생하는 요청되지 않는 AE(즉, 다른 모든 AE의 발생)를 기록해야 한다.
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 그/그녀가 어떠한 국소적 또는 전신적 반응 또는 기타 의학적 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이, 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 모든 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 질병으로 진단 받은 경우. 이는 이벤트와 시험 백신 사이의 인지된 상관성과 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 대상자가 사이트 밖에서 수행된 SARS-CoV-2 검사에서 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질병)이든 무증상이든 상관없이 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
참고: 증상이 없는 피험자는 여러 가지 이유로 검사를 받았을 수 있다. 예를 들어 SARS-CoV-2 감염으로 알려진 사람과의 근접 노출 또는 의료 제공자로서의 일상적인 검사의 일부이다.
9.1.2.2 전화 통화: 2일차(-0/+0일)
이 전화 연락의 목적은 피험자의 전반적인 건강 상태를 문의하고 첫 번째 시험 백신접종 후 1일 후에 안전성을 평가하는 것이다.
ㆍ 전화 통화 중:
- 요청 및 요청되지 않은 AE 또는 기타 AE(의료 참여 AE, SAE)를 포함하여 새로 보고된 안전성 데이터를 검토하고 기록한다.
- 간헐적 상태에 대한 반복 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
- 피험자가 국소 또는 전신 반응 또는 기타 AE(예: 의료 참여 AE, SAE)에 관해 보고하는 경우, 조사자의 판단에 따라 전화 또는 예정에 없던 사이트 방문을 통해 후속 조치를 취해야 한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- eDiary에 요청된 AE 및 요청되지 않은 AE(즉, 다른 모든 AE의 발생)를 계속 기록하도록 피험자에게 상기시킨다.
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 그/그녀가 어떠한 관련 국소적 또는 전신적 반응 또는 기타 의학적 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성과 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.2.3 클리닉 방문 2: 29일차 - 2차 시험 백신접종(-3/+7일)
백신접종 전 절차
ㆍ 요청 및 비요청 AE 또는 기타 AE(의료 참여 AE, SAE)를 포함하여 새로 보고된 안전성 데이터를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
ㆍ 증상에 따른 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 가임 여성의 경우 소변 임신 테스트를 수행한다.
백신접종 절차
ㆍ 백신접종 연기 또는 취소 기준을 검토한다. 백신 투여를 연기하거나 취소하는 기준에 대한 개요는 섹션 6.3 및 8.1을 참조한다. 지연되는 경우, 백신 접종은 허용된 시간 윈도우에서 이루어져야 한다. 지연 또는 취소 사유는 피험자 차트에 기록되어야 한다.
ㆍ 피험자의 지정에 따라 시험 백신 용량을 투여한다.
백신접종 후 절차
ㆍ 안전 모니터링을 위해 백신접종 후 최소 30분 동안 사이트에서 대상을 관찰한다. 관찰 기간 종료 시:
- 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
- 활력징후가 정상 범위 내에 있거나 백신접종 전 수준으로 회복될 때까지 피험자는 퇴원하지 않을 수 있다.
- 시험 백신 접종 후 AE의 발생을 기록한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 요청된 AE를 측정하는 방법과 eDiary를 작성하는 방법을 다시 지시한다. 피험자는 백신 접종 당일 및 다음 7일 내에 발생하는 요청된 국소 및 전신 AE와 백신 접종 당일 및 다음 28일 내에 발생하는 요청되지 않은 AE(즉, 다른 모든 AE의 발생)를 기록해야 한다.
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 그/그녀가 어떤 관련된 국소적 또는 전신적 반응 또는 기타 의학적 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 현장에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.2.4 전화 통화: 30일차(0/+0일)
이 전화 연락의 목적은 피험자의 전반적인 건강 상태를 문의하고 2차 시험 백신접종 1일 후 안전성을 평가하기 위한 것이다.
평가 및 절차는 2일 차 전화 통화에서 수행한 것과 동일하다.
9.1.2.5 클리닉 방문 3: 43일차(-3/+3일)
ㆍ 요청 및 비요청 AE 또는 기타 AE(의료 참여 AE, SAE)를 포함하여 새로 보고된 안전성 데이터를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
ㆍ 증상에 따른 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ SARS-CoV-2의 N 단백질에 대한 결합 항체 검사를 위해 혈액(~6mL 혈액) 샘플을 수집한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- eDiary에 요청된 국소 및 전신 반응의 기록이 완료되었음을 피험자에게 알린다. 요청되지 않은 AE(모든 AE)를 계속 기록하도록 피험자에게 상기시킨다.
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 관련 의료 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 합니다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 현장 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.2.6 전화 통화: 57일차(-3/+7)
이 전화 연락의 목적은 43일째에 사이트 방문 이후 피험자의 전반적인 건강 상태를 문의하고 안전성을 평가하는 것이다.
ㆍ 전화 통화 중:
- 요청되지 않은 AE 또는 기타 AE(의료 참여 AE, SAE)를 포함하여 새로 보고된 안전성 데이터를 검토하고 기록한다.
- 간헐적 상태에 대한 반복 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
- 피험자가 국소 또는 전신 반응 또는 기타 AE(예: 의료 참여 AE, SAE)에 관해 보고하는 경우, 조사자의 판단에 따라 전화 또는 예정에 없던 사이트 방문을 통해 후속 조치를 취해야 한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 요청되지 않은 AE의 보고가 완료되었음을 피험자에게 알린다.
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 관련 의료 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.2.7 클리닉 방문 4: 120일차(-7/+7)
ㆍ 57일째 전화 통화 이후 새로 보고된 모든 AE(의료 참석 AE, SAE)를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
ㆍ 증상에 따른 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 관련 의료 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 합니다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.2.8 클리닉 방문 5: 211일차(-7/+7)
평가 및 절차는 아래를 제외하고 120일째 클리닉 방문 4 동안 수행된 것과 동일한다.
ㆍ SARS CoV-2의 N 단백질에 대한 결합 항체 검사를 위해 혈액 샘플(~6mL 혈액)을 수집한다.
9.1.2.9 전화 통화: 302일차(-7/+7)
이 전화 연락의 목적은 211일차 현장 방문 이후 피험자의 전반적인 건강 상태를 문의하고 안전성을 평가하는 것이다.
ㆍ 전화 통화 중:
o 211일째에 현장 방문 이후 새로 보고된 AE(SAE)를 검토하고 기록한다.
o 간헐적 상태에 대한 반복 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
o 피험자가 관련 AE에 대해 전화로 보고하는 경우, 조사자의 판단에 따라 전화 통화(들) 또는 예정되지 않은 사이트 방문으로 후속 조치를 취해야 한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 관련 의료 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.2.10 임상 클리닉 방문 종료: 393일차(-0/+21일)
시험 방문 종료는 마지막 시험 백신 투여 1년 후인 393일째에 수행될 것이다. 가능하면 이 방문에는 시험 기간 동안 백신접종을 조기에 중단한 피험자가 포함되어야 한다. 다음 평가를 수행해야 한다:
ㆍ 302일차 전화 연락 이후 새로 보고된 AE를 검토하고 기록한다(SAE).
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
ㆍ 키와 체중을 포함한 완전한 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ SARS CoV-2의 N 단백질에 대한 결합 항체 검사를 위해 혈액 샘플(~6mL 혈액)을 수집한다.
시험의 주요 부분을 완료했으며 시험의 확장 부분이 이제 시작될 것이라고 피험자에게 알린다(섹션 9.1.4 참조).
9.1.3 3상 (Phase 3) 피험자
18세 이상인 약 32,500명의 피험자가 3상에 등록된다.
9.1.3.1 클리닉 방문 1: 1일차 - 첫 번째 시험 백신접종
피험자 적격성을 확립하기 위한 절차, 인구통계학적 정보 및 병력 기록은 시험 백신 투여 전 21일 이내에, 즉 1일 이상에 걸쳐 수행될 수 있다. 그러나 모든 정보가 이용 가능하고 평가 및 절차를 수행할 수 있는 경우, 시험 백신 투여 당일에 적격성을 설정할 수 있다. 모든 적격성 기준은 1일차 시험 백신 투여 전에 검토해야 한다.
백신접종 전 절차
ㆍ 서명된 사전 동의 양식을 얻는다.
- 피험자가 시험에 참여하기 전, 그리고 프로토콜-지시 절차를 수행하기 전에 서명된 사전 동의를 받아야 한다(섹션 12.4 참조).
- 사전 동의서에 서명함으로써, 피험자는 자발적으로 총 약 2년 동안 HERALD Trial CV-NCOV-004 및 1년 연장 연구에 참여하는 데 동의한다.
ㆍ 포함/제외 기준을 검토하고(섹션 6.1 및 6.2 참조) 제외 기준으로 나열된 금지 약물을 검토한다(섹션 6.2 참조).
ㆍ 인구통계 정보를 기록한다.
ㆍ 병력을 기록한다.
ㆍ 이 시험에 등록하기 전 6개월 이내에 복용한 경우, 간헐적 상태에 대한 반복 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
ㆍ 키와 체중을 포함한 완전한 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조). 시험 백신 투여 전 21일 이내에 적격성을 확립하기 위한 완전한 신체 검사를 수행한 경우, 시험 백신 투여 전 예방 접종 당일에 증상-지향적 신체 검사를 수행해야 한다.
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 가임기 여성을 대상으로 소변 임신 검사를 실시한다.
ㆍ SARS-CoV-2의 N 단백질에 대한 결합 항체 검사를 위해 백신접종 전 혈액 샘플(~6mL 혈액)을 수집한다.
백신접종 절차
ㆍ 백신접종 연기 또는 취소 기준을 검토한다. 백신 투여를 연기하거나 취소하는 기준에 대한 개요는 섹션 6.3 및 8.1을 참조한다. 지연되는 경우, 백신접종은 허용된 시간 윈도우에서 이루어져야 한다. 지연 또는 취소 사유는 피험자 차트에 기록되어야 한다.
ㆍ 피험자의 지정에 따라 시험백신 용량을 투여한다.
백신접종 후 절차
ㆍ 안전 모니터링을 위해 백신접종 후 최소 30분 동안 사이트에서 대상을 관찰한다. 관찰 기간 종료 시:
- 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
- 활력징후가 정상 범위 내에 있거나 백신접종 전 수준으로 회복될 때까지 피험자는 퇴원하지 않을 수 있다.
- 시험 백신접종 후 새로운 AE의 발생을 기록한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 그/그녀가 어떤 관련된 국소적 또는 전신적 반응 또는 기타 의학적 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
참고: 증상이 없는 피험자는 여러 가지 이유로 검사를 받았을 수 있다. 예를 들어, SARS-CoV-2 감염이 있는 알려진 사람과의 근접 노출 또는 의료 제공자로서의 일상적인 검사의 일부).
9.1.3.2 클리닉 방문 2: 29일차 - 2차 시험 백신접종(-3/+7일)
백신접종 전 절차
ㆍ 의료 참여 AE 및 SAE를 포함하여 새로 수집된 모든 안전 데이터를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 예방 접종을 기록한다.
ㆍ 증상에 따른 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 가임 여성의 경우 소변 임신 테스트를 수행한다.
백신접종 절차
ㆍ 백신접종 연기 또는 취소 기준을 검토한다. 백신 투여를 연기하거나 취소하는 기준에 대한 개요는 섹션 6.3 및 8.1을 참조한다. 지연되는 경우, 백신 접종은 허용된 시간 윈도우에서 이루어져야 합니다. 지연 또는 취소 사유는 피험자 차트에 기록되어야 한다다.
ㆍ 피험자의 지정에 따라 시험백신 용량을 투여한다.
백신접종 후 절차
ㆍ 안전 모니터링을 위해 백신접종 후 최소 30분 동안 사이트에서 대상을 관찰한다. 관찰 기간 종료 시:
- 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
- 활력징후가 정상 범위 내에 있거나 백신접종 전 수준으로 회복될 때까지 피험자는 퇴원하지 않을 수 있다.
- 시험 백신접종 후 새로운 AE의 발생을 기록한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 그/그녀가 어떠한 관련 국소적 또는 전신적 반응 또는 기타 의학적 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.3.3 클리닉 방문 3: 43일차(-3/+3일)
ㆍ 의료 참여 AE 및 SAE를 포함하여 새로 수집된 모든 안전 데이터를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
ㆍ 증상에 따른 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ SARS CoV-2의 N 단백질에 대한 결합 항체 검사를 위해 혈액 샘플(~6mL 혈액)을 수집한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 그/그녀가 어떠한 관련 국소적 또는 전신적 반응 또는 기타 의학적 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.3.4 전화 통화: 57일차(-3/+7일) 및 120일차(-7/+7일)
이러한 전화 연락의 목적은 피험자의 전반적인 건강 상태를 문의하고 마지막 전화 연락 또는 현장 방문 이후의 안전을 평가하는 것이다.
ㆍ 전화 통화 중:
- 현장 방문 또는 전화 통화 이후 새로 보고된 모든 AE(의학적 참석 AE, SAE)를 검토하고 기록한다.
- 간헐적 상태에 대한 반복 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
- 피험자가 관련 AE에 대해 전화로 보고하는 경우, 조사관의 판단에 따라 전화 또는 예정에 없던 사이트 방문으로 후속 조치를 취해야 한다.
ㆍ 피험자에 대한 지침:
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다.
o 관련 의료 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다(섹션 9.2.1 및 섹션 9.5 참조).
- 사이트 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 현장에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.1.3.5 클리닉 방문 4: 211일차(-7/+7일)
평가 및 절차는 43일째에 클리닉 방문 동안 수행된 것과 동일하다.
9.1.3.6 전화 통화: 302일차(-7/+7일)
이 전화 연락의 목적은 211일째에 마지막 현장 방문 이후 피험자의 전반적인 건강 상태를 문의하고 안전성을 평가하는 것이다.
평가 및 절차는 57일 및 120일에 전화 통화 중에 수행된 것과 동일하다.
9.1.3.7 시험 클리닉 방문 종료: 393일차(-0/+21일)
시험 방문 종료는 마지막 시험 백신 투여 1년 후인 393일째에 수행될 것이다. 가능하면 이 방문에는 시험 기간 동안 백신접종을 조기에 중단한 피험자가 포함되어야 한다. 다음 평가를 수행해야 한다:
ㆍ 302일차(SAE)에 전화 연락 이후 새로 보고된 AE를 검토하고 기록한다.
ㆍ 간헐적 상태에 대한 반복되는 약물을 포함하여 수반되는 약물 및 백신접종을 기록한다.
ㆍ 키와 체중을 포함한 완전한 신체 검사를 수행한다(섹션 9.3.7 참조).
ㆍ 활력 징후를 측정한다(체온, 맥박, 혈압, 섹션 9.3.7 참조).
ㆍ SARS CoV-2의 N 단백질에 대한 결합 항체 검사를 위해 혈액 샘플(~6mL 혈액)을 수집한다.
ㆍ 시험의 주요 부분을 완료했으며 시험의 확장 부분이 이제 시작될 것이라고 피험자에게 알린다(섹션 9.1.4 참조).
9.1.4 연장 연구(Extension Study)(최대 1년 기간)
ㆍ 모든 피험자에 대한 일반 지침:
- 연장 연구는 본 시험의 마지막 날(Day 393)에 시작될 것임을 피험자에게 알린다. 시험 기간은 1년으로 계획되어 있지만, CVnCoV가 규제 승인(regulatory approval)을 충족하고 위약 그룹의 피험자에게 CVnCoV 백신 접종이 제공되는 경우 조기 종료될 수 있음을 설명한다. 또 다른 효과적인 백신이 지역에 배포되는 경우 시험이 조기에 종료될 수도 있다.
ㆍ 면역원성 하위집합에 참여한 2b상 대상자에 대한 지침:
- 피험자에게 다음 평가 및 절차가 수행될 것임을 알린다:
o SARS-CoV-2의 S 단백질 RBD에 대한 결합 항체 및 SARS-CoV-2 바이러스 중화 항체의 장기 지속성을 평가하기 위해 혈액 샘플을 채취하기 위해 3개월마다(484일, 575일, 665일 및 757일) 사이트 방문.
o 장기적인 효능을 평가하기 위한 COVID-19 사례 검출.
o 장기 안전성을 평가하기 위한 AESI 및 SAE 수집.
ㆍ 2b상 비면역원성 피험자와 3상 피험자에 대한 지침.
- 피험자에게 다음 평가 및 절차가 수행될 것임을 알린다.
o 장기 안전성 평가를 위한 AESI 및 SAE 수집하기 위하여, 3개월마다(484일, 575일, 665일, 757일) 전화 연락.
o 장기적인 효능을 평가하기 위한 COVID-19 사례 검출.
- 피험자에게 즉시 사이트에 전화하여 다음 사항을 보고하도록 상기시킨다:
o 관련 의료 이벤트를 경험한 경우.
o 어떤 이유로든 입원, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같이 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문.
o 심각한 의학적 이벤트를 경험하거나, 전반적인 건강에 변화가 있거나, 의사로부터 새로운 의학적 상태로 진단받은 경우. 이는 사건과 시험 백신 사이의 인지된 관련성에 관계없이 보고되어야 한다.
- 대상자가 COVID-19를 암시하는 증상이 있는 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킨다. 또한, 피험자들은 COVID-19 증상이 있는지에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 주 2회까지 메시지를 받을 것이다. "예"라고 응답한 사람들은 후속 정보를 위해 시험 직원이 연락할 것이다.
- 현장 밖에서 SARS-CoV-2 검사가 양성인 경우 검사 당시 증상(COVID-19 질환)이든 무증상이든 피험자는 즉시 사이트에 연락하도록 상기시켜야 한다.
9.2 효능 평가
9.2.1 코로나19 사례
COVID-19 사례 확인은 임상 2b상 및 3상 부분 모두에서 동일한 방식으로 진행된다. 사례 감지는 COVID 19 질병과 일치하는 표준화된 증상 목록에서 최소 1개의 증상을 보고하는 대상을 식별하는 것으로 시작된다. 임상진과의 전화인터뷰를 바탕으로, 코로나19 감염이 의심되는 대상자는 임상진이 해당 위치에서 수행하는 신속항원검사와 지정된 중앙 연구소에서 수행되는 분자기반 RT-PCR 검사로 구성된 SARS-CoV-2 감염 검사를 받게 된다. 테스트 전략은 섹션 9.5에 설명되어 있다. 대상자가 COVID-19에 감염된 것으로 확인되면, 초기 증상이 경미한 것으로 간주되더라도 질병이 해결될 때까지 대상을 추적한다. 피험자가 입원하는 경우, 조사자는 피험자의 진행 상황을 계속 따라야 하며 입원이 끝날 때 의료/퇴원 요약서를 얻어야 한다.
9.2.1.1 케이스 검출(Detection)
9.2.1.1.1 COVID-19에 대한 일상적인 감시
모든 사이트 방문 및 전화 통화 중에 피험자는 다음 증상* 중 어느 것이 있는 경우 사이트에 연락하도록 상기시킨다:
o 발열 또는 오한; 숨가쁨 또는 호흡 곤란; 새로운 맛이나 냄새의 상실; 기침; 피로; 근육통 또는 몸살; 두통; 목 쓰림; 막힘(congestion) 또는 콧물; 메스꺼움 또는 구토; 설사
* FDA Development and Licensure of Vaccines to Prevent COVID-19 guidance (US Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration (FDA). Guidance for Industry. Development and Licensure of Vaccines to Prevent COVID 19. 2020. 웹사이트 fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/development-and-licensure-vaccines-prevent-covid-19 에서 이용 가능함; October 2020, 인용에 의해 본 명세서에 포함됨).
또한 피험자들은 COVID-19 증상에 대해 예 또는 아니오 응답을 제공하기 위해 일주일에 최대 두 번 메시지를 받을 것이다. 두 번의 시험 백신접종 모두 이 기간 동안 발생하는 백신 관련 반응(예: 발열, 오한, 두통, 피로, 근육통)과 잠재적인 COVID-19 증상을 혼동하지 않도록 백신접종 후 4일까지 메시지가 시작되지 않는다.
사이트 방문 또는 전화 통화로 증상을 보고하거나, 메시지로 증상이 있다고 "예"라고 응답한 사람들은 후속 전화 인터뷰를 위해 시험 직원이 연락한다. 시험 직원은 대본 인터뷰(그/그녀가 훈련을 받은)를 사용하여 피험자의 의학적 상태에 대한 정보를 수집하고, 이 정보는 피험자가 COVID-19에 걸렸을 가능성을 결정하는 데 사용된다. 피험자가 COVID-19 질병이 의심되는 경우 SARS-CoV-2 감염 검사를 받게 된다(다음 섹션 참조). 의심이 낮으면 피험자의 질병 및 증상이 진행되었는지, COVID-19 의심이 피험자를 검사하기에 충분한 수준에 도달했는지 평가하기 위해 후속 전화가 수행된다. 임상적 판단에 따라 전화 연락은 매일 자주 할 수 있다. 모든 증상이 있는 대상에게는 가정용 온도계와 산소 포화도 모니터가 제공된다. 시험 직원은 피험자에게 하루에 최소 3~4회 또는 증상이 나타날 때마다 구강 체온과 산소 포화도를 측정하도록 지시한다.
SARS-CoV-2 감염에 대한 테스트 전략은 섹션 9.5에 나와 있다. 검사는 2가지 검사로 구성된다: 시험 직원이 현지에서 수행하는 신속한 항원 검사와 지정된 중앙 실험실에서 수행되는 분자 기반 RT-PCR 검사이다. 조사자와 그/그녀의 시설 및 시험 직원에 따라, 테스트를 위한 비인두 면봉 샘플은 현장에서 또는 가정 방문에서 수집된다. 사이트 방문 또는 시험 직원의 가정 방문은 "질병 방문(Illness Visit)"으로 간주되고 eCRF에 문서화된다.
피험자가 RT-PCR 검사에서 코로나19 양성으로 바이러스학적으로 확인된 경우, 초기 증상이 경미한 것으로 간주되더라도 질병이 소실될 때까지 피험자를 추적한다. 피험자가 입원하는 경우 조사자는 피험자의 진행 상황을 계속 따라야 하며 입원이 끝날 때 퇴원 요약서를 받아야 한다. 임상 증상 및 징후, 기간 및 중증도, 및 COVID-19 에피소드의 치료 및 결과에 대한 정보는 시험 직원이 문서화하고 eCRF에 기록한다.
문제가 해결되면, 피험자는 COVID-19에 감염되지 않은 사람들과 동일한 방식으로 계속 추적될 것이다(즉, 일상적인 사례 감시로 돌아갈 것이다). 이전 질병이 있는 대상에서 COVID-19의 두 번째 에피소드는 1차 유효성 사례로 계산되지 않지만, 백신접종 대상에서 COVID-19의 두 번째 에피소드의 발생을 평가하는 탐색 목표에 포함될 것이다.
피험자가 RT-PCR 검사에 의해 바이러스학적으로 확인되지 않은 경우, SARS-CoV-2 감염 이력이 없는 피험자로 COVID-19 질병에 대한 일상적인 감시로 복귀한다(단, N 단백질에 대한 혈청양성 검사에 의해 달리 결정되지 않는 한).
9.2.1.1.2 COVID-19에 대한 비정기적 감시(사이트 외부에서 양성 시험)
피험자는 검사 당시 증상이 있었거나(COVID 19 질병) 무증상이었건 간에, 사이트 외부에서 수행된 SARS CoV-2 검사가 양성인 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킬 것이다.
피험자가 증상이 있는 경우, 시험 직원은 대본 인터뷰를 사용하여 피험자의 COVID-19 증상 및 의학적 상태에 대한 정보를 수집한다. 결과를 확인하기 위해 가능한 한 빨리 피험자를 재검사해야 한다. RT-PCR 검사를 위해 비인두 면봉 샘플을 후원사가 지정한 중앙 실험실로 보내야 한다. RT-PCR 검사 결과는 코로나19 바이러스 감염 사례로 확정된다. 피험자가 COVID-19에 감염된 것으로 확인되면, 일상적인 감시에 의해 검출된 피험자에 대해 위에서 설명한 바와 같이, 피험자의 질병이 해결될 때까지 피험자를 추적할 것이다.
피험자가 RT-PCR 검사에 의해 바이러스학적으로 확인되지 않은 경우, SARS-CoV-2 감염 이력이 없는 피험자로 COVID-19 질병에 대한 일상적인 감시로 복귀한다(단, N 단백질에 대한 혈청양성 검사에 의해 달리 결정되지 않는 한).
9.2.1.2 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 사례의 정의
COVID-19의 바이러스학적 확진 사례는 다음 증상 중 1개 이상으로 구성된 임상 증상을 보이는 질환이 있는 사람에서 SARS-CoV-2 특이 RT-PCR 검사에서 양성으로 정의된다(상기와 동일한 선별 증상 기준):
o 발열 또는 오한; 숨가쁨 또는 호흡 곤란; 맛이나 냄새의 새로운 상실; 기침; 피로; 근육통 또는 몸살; 두통; 목 쓰림; 막힘(Congestion) 또는 콧물; 메스꺼움 또는 구토; 설사
이 정의는 COVID-19의 바이러스학적으로 확인된 임상 증상 사례의 모든 심각도를 파악하기 위한 것이다. 따라서, 중증도(예: 경증 또는 중증)로 분류된 COVID-19 사례는 이러한 사례의 하위집합이 된다.
9.2.1.3 공동 1차 효능 분석을 위한 COVID-19 사례 정의
효능에 대한 1차 분석을 위해서는 사례가 다음 기준을 충족해야 한다:
ㆍ 위의 섹션 9.2.1.2에 정의된 바와 같이, 임상적으로 증상이 있는 COVID-19가 있는 사람의 SARS CoV 2 특정 RT-PCR 검사 양성으로 정의된 COVID-19의 바이러스학적으로 확인된 사례여야 한다.
o 1차 효능 분석의 경우, COVID-19 사례는 "모든 중증도" 또는 "중등도에서 중증" 중증도로 분류된다.
ㆍ 증상 발병은 2차 시험 백신접종 후 15일 이후에 발생해야 한다.
ㆍ 피험자는 등록 시 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 질병의 병력이 없거나 두 번째 시험 백신접종 후 15일 이내에 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 사례가 발생하지 않아야 한다 {자세한 사항은 섹션 10.2.3, 효능 분석 세트(EAS) 참조}.
ㆍ 피험자는 기준선 및 43일에 SARS-CoV-2 이력이 없어야 한다(기준선 및 43일에 수집된 혈액 샘플에서 N 단백질에 대해 혈청음성으로 정의됨).
1차 유효성 사례는 심사위원회(Adjudication Committee)의 확인을 받아야 한다.
43일은 CVnCoV에 대한 면역 반응이 성숙하고 두 번째 접종 후 최대치에 도달하도록 하는 2차 접종 후 14일이다. 따라서 다음 날 ≥15일에 시작하는 COVID-19 사례 확인은 COVID-19 질병에 대한 CVnCoV의 전체 VE 평가를 나타낸다.
9.2.1.4 COVID-19 사례의 판결
COVID-19 사례를 판정하기 위해 독립적인 임상의 위원회가 구성될 것이다. 위원회는 피험자의 치료 할당에 대해 맹검될 것이다. 사례는 시험의 종점과 일치하는 다음 질문과 관련하여 회원들이 판정한다.
ㆍ 바이러스학적으로 확인된 COVID-19 사례는 섹션 9.2.1.2에 나열된 증상 중 하나 이상과 함께 임상적으로 증상이 있는 COVID-19가 있는 사람에서 양성 SARS CoV-2 특이적 RT-PCR 테스트로 정의되는지.
o CureVac 지정 중앙연구소에서 RT-PCR 검사를 하였는지?
ㆍ 2차 백신접종 15일 이후 증상이 발병하였는지? 아니면 두 번째 시험 백신접종 후 15일 전에 발생했는지?
ㆍ 피험자는 기준선과 43일째에 SARS-CoV-2에 대해 이력이 없었거나 그렇지 않았는지? (SARS-CoV-2 N 단백질에 대해 혈청음성 또는 혈청양성인 것으로 정의됨).
ㆍ 피험자는 18세 내지 60세 또는 61세 이상이었는지?
ㆍ 피험자는 무증상이었는지? 무증상인 경우, RT-PCR 검사에서 두 번째 백신접종 후 15일 이상 또는 그 이전에 양성이었는지?
ㆍ 제공된 임상 정의에 따라 COVID-19의 경증 또는 중증 사례였는지?
ㆍ 피험자가 추가 산소 공급을 필요로 했는지? 피험자는 어떤 종류의 산소 지원을 받았는지?
ㆍ 대상이 입원했는지? 대상이 중환자실에 입원했는지?
ㆍ 대상이 사망했는지? COVID-19 또는 다른 원인으로 인해?
9.2.2 SARS-CoV-2 감염의 무증상 사례
이 시험에서 무증상 SARS-CoV-2 감염에 대한 적극적인 감시는 없을 것이다. 피험자는 검사 당시 증상이 있었든(COVID 19 질병) 무증상이었든 상관없이, 사이트 외부에서 수행된 SARS CoV-2 검사 양성인 경우 즉시 사이트에 연락하도록 상기시킬 것이다. 증상이 없는 피험자는 여러 가지 이유로 검사를 받았을 수 있다. 예를 들어, SARS-CoV-2 감염이 있는 알려진 사람과의 근접 노출 또는 의료 제공자로서의 일상적인 검사의 일부이다.
피험자가 무증상인 경우, 시험 직원은 즉시 피험자에게 연락하여 보고된 피험자의 SARS-CoV-2 양성 검사에 대한 정보를 수집할 것이다. 결과를 확인하기 위해 가능한 한 빨리 피험자를 재검사해야 한다. RT-PCR 검사를 위해 비인두 면봉 샘플을 후원사가 지정한 중앙 실험실로 보내야 한다. 양성 RT-PCR 검사 결과는 바이러스학적으로 확인된 SARS-CoV-2 감염 사례로서 결정적인 것으로 간주된다.
피험자가 SARS-CoV-2 감염이 확인된 경우, 이것이 무증상 감염인지 확인하기 위해 COVID-19 증상의 발달에 대해 최소 2주 동안 시험 직원이 피험자를 추적한다. 대상자가 COVID-19에 감염되면 COVID-19 사례로 추적된다. 피험자가 무증상으로 확인되면 시험 직원이 정보를 수집하고 해당 eCRF 페이지에 문서화한다.
피험자가 RT-PCR 검사에 의해 바이러스학적으로 확인되지 않은 경우, SARS-CoV-2 감염 이력이 없는 피험자로 COVID-19 질병에 대한 일상적인 감시로 복귀한다(단, N 단백질에 대한 혈청양성 검사에 의해 달리 결정되지 않는 한).
9.3 안전성 평가
CVnCoV 2회 투여 일정의 안전성, 반응성 및 내약성은 아래 설명된 대로 평가된다.
9.3.1 2b의 피험자에 대해 특이적인 안전성 평가
ㆍ 반응원성(Reactogenicity)은 요청된 국소 AE (주사 부위 통증, 발적, 부기 및 가려움증) 및 전신 AE (발열, 두통, 피로, 오한, 근육통, 관절통, 메스꺼움/구토, 설사)를 수집하여 각 백신 접종일 및 다음 7일 동안 eDiary를 사용하여 매일 평가된다. 또한 다른 안전 지표(예: 체온)도 수집된다.
ㆍ eDiary는 또한 각 백신 접종일과 다음 28일 동안 요청되지 않은 AE 수집을 위한 피험자의 기억 보조 수단으로 사용될 것이다.
9.3.2 2b상 및 3상 모든 피험자에 대한 안전성 평가
ㆍ 의료 참여 AE는 두 번째 시험 백신접종 후 6개월 동안 수집된다.
ㆍ AESI는 두 번째 시험 백신접종 후 1년 동안 수집된다. 모니터링해야 할 AESI에는 pIMD, SARS-CoV-2 백신에 대한 AESI 및 백신접종에 대한 면역 반응에 영향을 미칠 수 있는 심각하지 않은 사이발생(intercurrent) 의학적 상태가 포함된다.
ㆍ SAE는 두 번째 시험 백신접종 후 1년 동안 수집된다.
ㆍ 백신 중단 또는 시험 중단으로 이어지는 AE는 두 번째 시험 백신접종 후 1년 동안 수집된다.
{대상자가 2차 시험 백신접종을 받지 않은 경우, AE 추적 기간(6개월 또는 1년)은 29일에 2차 접종 예정일을 기준으로 결정된다.}
ㆍ eDiary는 의학적으로 참여한 AE, AESI 및 SAE 수집을 위한 피험자를 위한 기억 보조 수단으로 사용된다.
9.3.3 1년 연장 연구의 피험자에 대한 안전성 평가
ㆍ AESI 및 SAE는 연장 연구에서 최대 1년 동안 추가로 수집된다.
ㆍ eDiary는 AESI 및 SAE 수집을 위한 피험자를 위한 기억 보조 수단으로 사용된다.
9.3.4 이상 반응(Adverse Event)
AE/SAE의 정의, AE/SAE/임신/과용량의 기록, 평가, 후속 조치 및 보고 절차, AE의 강도 및 인과성 평가.
COVID-19 질병 및 합병증/후유증은 시험의 효능 종점과 일치하므로, AE로 기록되어서는 안 된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 이러한 데이터는 시험에서 발생하는 COVID-19 질병 사례에 대한 관련 eCRF 페이지에 캡처되며, 이는 시험의 예상 결과이다. 따라서 이벤트가 SAE 기준을 충족하더라도 COVID-19 질병 및 그 합병증/후유증은 SAE에 대한 표준 신속 절차에 따라 보고되지 않는다.
9.3.4.1 요청된 유해 사례(Solicited Adverse Event)
eDiary는 예방 접종 당일 및 다음 7일 동안의 요청된 국소 AE (주사 부위 통증, 발적, 부기 및 가려움증) 및 요청된 전신 AE(발열, 두통, 피로, 오한, 근육통, 관절통, 메스꺼움/구토 및 설사)의 수집을 위해 Phase 2b의 모든 피험자에게 배포된다. 피험자는 체온을 구두로 측정하기 위한 온도계와 국소 주사 부위 반응의 크기를 결정하기 위한 측정 테이프를 받는다. 피험자는 eDiary에 7일 동안 매일 요청된 AE를 입력하는 방법에 대해 지시받을 것이다.
요청된 AE는 부재, 경증, 중등도 및 중증의 강도 척도로 평가될 것이다(상기 표 A 및 표 B). 정의에 따르면, 모든 현지 요청된 AE는 시험 백신접종과 관련된 것으로 간주된다. 요청된 전신 AE의 경우, 조사자는 시험 백신과 각 AE의 발생 사이의 관련성을 평가하고 각 AE에 대한 강도를 평가할 것이다(표 B).
피험자에 관련되거나 또는 장기간 지속되는 경우, 요청된 등급 3 AE는 즉시 조사자에게 보고되어야 한다. eDiary에 1일 이상 보고된 관련 3등급 요청된 AE의 경우, 피험자는 AE의 총 지속 기간을 가능한 한 정확하게 설정하기 위해 질문받을 것이다.
9.3.4.2 요청되지 않은 이상 반응 및 심각한 이상 반응
백신 접종일 및 다음 28일 동안에 발생하는 요청되지 않은 AE는 2회의 시험 백신접종 각각에 대해 2b상 피험자에 의해 기록될 것이다.
2b상 및 3상의 모든 피험자에 대해, 의료 참여 AE는 두 번째 시험 백신접종 후 6개월까지 수집된다. AESI는 두 번째 시험 백신접종 후 1년 동안 수집된다(섹션 9.3.4.3 참조). SAE는 두 번째 시험 백신접종 후 1년 동안 수집된다. 연장 연구에서, AESI 및 SAE는 추가 1년 동안 계속 수집된다.
의료 참여 AE는, 어떤 이유로든 입원을 위한 방문, 응급실 방문 또는 기타 예정에 없던 의료진(의사) 방문과 같은, 신체 검사 또는 백신접종을 위한 정기 방문이 아닌 의료 방문이 있는 AE로 정의된다.
AE(심각한 및 심각하지 않은)의 발생은 각 방문에서 대상자에 대한 비지시적 질문에 의해 평가될 것이다. eDiary 항목으로 방문 중 또는 방문 사이에 피험자가 자원한 AE 또는 전체 시험 동안 관찰, 신체 검사, 실험실 테스트 또는 기타 평가를 통해 감지된 AE는 eCRF에 기록된다. 이벤트와 시험 백신 사이의 인지된 관련성과 관계없이, 대상체는 심각한 증상, 주관적인 불편 또는 웰빙의 객관적인 변화가 있는 모든 AE를 즉시 조사자 또는 사이트 직원에게 보고하도록 지시해야 한다.
조사자는 시험 백신과 각 AE/SAE의 발생 사이의 관련성을 평가할 것이다.
백신접종에 대한 면역 반응에 영향을 미칠 수 있는 심각하지 않은 병발(intercurrent) 의학적 상태도 시험 기간 동안 수집된다.
9.3.4.3 특별 관심의 이상 반응
AESI는 HERALD 시험 CV NCOV 004에서 2차 시험 백신접종 후 1년, 연장 연구에서 최대 1년까지 수집된다. 다음 이벤트는 이 시험 동안 AESI로 간주된다:
ㆍ 위에 정의된 잠재적인 면역-매개 질환(pIMD)의 의심되는 면역 의약 병인(immune-medicated etiology)이 있는 AE.
체강(Celiac) 질병; 크론병; 궤양성 대장염; 궤양성 직장염; 자가면역 담관염; 자가면역 간염; 원발성 담즙성 간경변증; 원발성 경화성 담관염; 애디슨병; 자가면역 갑상선염(하시모토 갑상선염 포함; 당뇨병 1형; 그레이브병 또는 베이스도우병; 항합성효소(Antisynthetase) 증후군; 피부근염; 소아 만성 관절염(스틸병 포함); 혼합 결합 조직 장애; 류마티스성 다발성 근육통; 다발성 근염; 건선성 관절병증; 재발성 다발연골염; 류마티스 관절염; 경피증(예: 미만성 전신 형태 및 CREST 증후군 포함); 척추관절염(예: 강직성 척추염, 반응성 관절염(라이터 증후군) 및 미분화 척추관절염 포함); 전신성 홍반성 루푸스; 전신 경화증; 급성 파종성 뇌척수염, (부위 특이적 변이체(예: 비감염성 뇌염, 뇌척수염, 척수염, 골수척수염) 포함); 뇌신경 장애(예: 마비(paralyses)/부전마비(paresis)(예: 벨 마비) 포함); 길랭-바레 증후군(예: 밀러 피셔 증후군 및 기타 변이 포함); 면역-매개 말초 신경병증, 파소니지-터너 증후군 및 신경총병증, (예: 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 다초점 운동 신경병증 및 단일클론 감마병증과 관련된 다발신경병증 포함); 다발성 경화증; 기면증; 시신경염; 횡단 척수염; 원형 탈모증; 천포창(pemphigus), 천포창(pemphigoid) 및 포진 피부염을 포함한 자가면역 수포성 피부 질환; 피부 홍반성 루푸스; 결절 홍반; 형태소(Morphoea); 편평태선; 건선; 스위트 증후군; 백반증; 대혈관 혈관염(예: 거대 세포 동맥염, 예를 들어 Takayasu 동맥염 및 측두 동맥염 포함); 중형 및/또는 소형 혈관 혈관염(예: 결절성 다발동맥염, 가와사키병, 현미경적(microscopic) 다발혈관염, 베게너 육아종증, 처그-스트라우스 증후군(알레르기성 육아종성 혈관염), 버거병 폐쇄성 혈전혈관염, 괴사성 혈관염 및 항호중구 세포질 항체(ANCA) 양성 혈관염(유형 미상), Henoch-Schonlein purpura, Behcet 신드롬, 백혈구세포성 혈관염(leukocytoclastic vasculitis)); 항인지질 증후군; 자가면역 용혈성 빈혈; 자가면역 사구체신염(IgA 신병증, 급속 진행성 사구체신염, 막성 사구체신염, 막증식성 사구체신염 및 간질증식성 사구체신염 포함); 자가면역 심근염/심근병증; 자가면역 혈소판감소증; 굿파스처(Goodpasture) 증후군; 특발성 폐섬유증; 악성 빈혈; 레이노 현상; 사르코이드증; 쇼그렌 증후군; 스티븐스-존슨 증후군, 포도막염).
ㆍ SARS-CoV-2 백신 개발 또는 표적 질병과 관련된 기타 AE는 다음과 같다:
아나필락시스; 혈관염; 백신접종 후 질병의 악화; 어린이의 다기관 염증 증후군; 급성 호흡기 장애 증후군; COVID-19 질병; 급성 심장 손상; 미세혈관병증; 심부전 및 심인성 쇼크; 스트레스성 심근병증; 관상동맥 질환; 부정맥; 심근염, 심낭염; 혈소판 감소증; 심부정맥 혈전증; 폐색전증; 뇌혈관 뇌졸중; 사지 허혈; 출혈성 질환; 급성 신장 손상; 간 손상; 전신 경련; 길랭-바레 증후군; 급성 파종성 뇌척수염; 후각장애, 식욕부진; 수막뇌염; Chilblain-유사 병변; 단일 기관 피부 혈관염; 다형홍반; 백신접종 후 심각한 국소/전신 AR
ㆍ 백신접종에 대한 면역 반응에 영향을 미칠 수 있는 심각하지 않은 병발적 의학적 상태도 시험 기간 동안 수집된다.
9.3.5 임신
임신은 이 시험 등록에 대한 제외 기준이지만, 피험자는 이 시험에 적극적으로 참여하는 동안 잠재적으로 임신할 수 있다.
9.3.6 안전 실험실 평가
적격성을 확인하기 위해 시험 백신접종 전 1일째에 임신 테스트를 위한 소변 샘플을 가임 여성으로부터 채취할 것이다. 소변 임신 테스트는 적격성을 계속 결정하기 위해 29일에 두 번째 시험 백신접종 전에도 수행된다.
9.3.7 활력징후 및 신체검사
2b상 및 3상을 위한 모든 시험 방문에서, 활력 징후(체온, 수축기/이완기 혈압 및 맥박)는 대상체가 앉은 자세에서 5분 동안 휴식한 후 표준화된 방식으로 기록될 것이다.
HERALD 시험 CV NCOV-004의 모든 피험자에 대해 1일째 첫 번째 시험 방문 및 393일째 시험 방문 종료 시 전반적인 외모, 눈/귀/코/목, 머리/목/갑상선, 림프절 부위, 심혈관계, 폐/흉부, 복부 및 비뇨생식기 계통, 사지 및 신경학적 검사, 피부 검사, 체중 및 키 측정의 검사를 포함한 완전한 신체 검사가 수행된다. 다른 모든 시험 방문에서는 증상 지향적 신체 검사가 수행된다.
9.3.8 의료 및 수술 병력
등록 전에 피험자에게 존재하는 모든 중요한 발견 및 기존 상태는 eCRF의 관련 병력/현재 질병 화면에 보고되어야 한다.
의학적 및 수술 이력 및 1일차에 진행 중인 질병을 명시하는 수반되는 의학적 상태에 대한 정보가 제공되어야 한다.
9.3.9 모니터링 위원회
9.3.9.1 데이터 및 안전 모니터링 보드 (DSMB)
독립적인 DSMB는 i) 이 시험 HERALD: CV-NCOV-004에 참여하는 피험자의 안전을 감독하기 위해; ii) 시험의 진행상황과 수행을 평가하기 위해; iii) 시험의 누적 안전성 데이터를 검토하기 위해; iv) 잠재적인 안전 문제의 AE에 대한 지속적인 검토를 수행하기 위해 (섹션 5.5.2 참조); 및 v) 임상시험을 계속, 수정 또는 일시 중지할지 여부를 후원자에게 권고하기 위해 (섹션 5.5.2 참조) 소집될 것이다.
DSMB는 이러한 책임을 수행하기 위해 정기적으로 회의를 예약한다. 이 회의에서, DSMB는 CVnCoV의 다른 진행 중인 임상 시험에서 생성된 안전성 데이터에 대해서도 알릴 것이다. 섹션 5.5.2에 설명된 대로, 지속적으로 피험자 안전을 추가로 보장하기 위해, 잠재적인 안전 문제의 AE 목록은 DSMB 의장(또는 피지명인)이 정기적으로 루틴하게 모니터링된다. 섹션 7.3.2에 설명된 대로, DSMB는 시험 중 언제든지 개별 피험자 또는 특정 데이터세트의 맹검 해제를 요청할 수 있다.
안전성 데이터에 추가하여, DSMB는 시험의 위험-이득에 대한 지속적인 평가를 위해 중간 분석 또는 가능한 경우 시험 중 다른 시점에서 효능 데이터를 검토하도록 요청받을 것이다. 위험-이득 분석의 일환으로, DSMB는 VDE 신호에 대해 COVID-19 사례를 주기적으로 모니터링한다. DSMB는 또한 필요한 경우 샘플 크기의 증가를 권장하기 위해 COVID-19 사례의 발생률에 대한 맹검 검토를 수행하도록 요청받을 것이다.
DSMB 헌장은 DSMB의 구성과 목적; DSMB, CureVac 및 CRO의 책임; DSMB 회의 일정 및 수행; 및 검토할 데이터세트를 자세히 설명한다. 헌장에는 DSMB에 대한 통계 분석 계획(SAP)이 포함된다.
9.3.9.2 심사 위원회(Adjudication Committee)
1차 종점의 평가를 위해 COVID-19 사례를 판정하기 위해 독립적인 임상의의 위원회가 구성될 것이다. 위원회는 피험자의 치료 할당에 대해 맹검된다. 사례는 섹션 9.2.1.4에 제시된 질문과 관련하여 회원이 판정한다. 회의 일정과 사건 판정에 대한 접근 방식은 헌장에 정의된다. 위원회 의장은 임시 위원으로 DSMB 회의에 참석한다.
9.4 면역원성 평가
면역원성 결과가 피험자의 치료 할당을 맹검해제할 것이기 때문에, 분석을 수행하는 실험실은 결과를 엄격하게 기밀로 유지할 것이다. 시험 시작 시 지정되고 시험 수행과 무관한, 맹검해제된 사람이 면역원성 데이터의 품질을 주기적으로 검토한다. 이 사람은 결과를 철저히 비밀로 유지한다.
9.4.1 CVnCoV 백신접종에 대한 항체 반응(S 단백질의 RBD 및 바이러스 중화 항체)
CVnCoV 백신접종에 대한 항체 반응은 시험의 2b상 부분에서만 그리고 시점들에서 면역원성 하위집합의 피험자에 대해서만 평가된다. 연장 연구에서, 항체 지속성은 백신접종 후 2년차에 3개월마다 평가될 것이다.
CVnCoV 백신접종에 의해 유도된 면역 반응은 2가지 분석에 의해 평가될 것이다:
ㆍ 면역분석법에 의해 혈청에서 측정된 S 단백질의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 결합 항체.
ㆍ 기능 활성 분석에 의해 혈청에서 측정된 SARS-CoV-2에 대한 바이러스 중화 항체.
9.4.2 SARS-CoV-2(N 단백질)에 대한 항체 반응
SARS-CoV-2에 대한 항체 반응은 SARS-CoV-2 N 단백질(백신 컨스트럭트에 포함되지 않은 바이러스 항원)에 대한 결합 항체를 측정하여, 지정된 시점에서, 시험의 모든 부분과 모든 피험자에 대해 평가되며, 면역측정법으로 수행된다.
SARS-CoV-2에 대한 이전 감염의 척도로, N 단백질에 대한 혈청학적 상태가 다음에 사용된다:
1. 대상자가 시험 시작 및 43일째에 SARS-CoV-2 감염에 대해 이력이 없는지 또는 그렇지 않은지 후향적으로(retrospectively) 결정하기 위해.
a. 이력이 없는 피험자에서 CVnCoV 2회 투여 일정의 효능 평가를 위해, 피험자는 기준선과 43일째에 N 단백질에 대해 혈청음성이어야 한다.
b. 이력이 없는 피험자에서 CVnCoV의 첫 번째 투여 후 효능 평가를 위해, 피험자는 기준선에서만 N 단백질에 대해 혈청음성이어야 한다.
2. CVnCoV의 2회 접종 일정으로의 백신접종이 시험 기간 동안 SARS-CoV-2 감염을 줄일 수 있는지를, 혈청음성 환자에서 N 단백질로의 혈청 전환을 측정하여 확인한다. 1a에서 위에서 설명한 바와 같이, 이러한 대상체는 기준선 및 43일째에 N 단백질에 대해 혈청음성이어야 한다.
9.4.3 COVID-19 사례가 발생한 피험자의 CVnCoV 백신접종에 대한 항체 반응
시험에서 발생하는 모든 COVID-19 사례에 대해, 시험 백신접종에 대한 항체 반응은 시험 1일(백신접종 전 기준선), 43일, 211일 및 393일에 수집된 피험자의 혈액 샘플에서 결정된다. 이러한 분석은 면역원성 하위집합에 없는 2b상 부분의 피험자와 3상 피험자에 대해서만 수행해야 한다. 2b상 면역원성 하위집합의 피험자는 이미 코호트의 일부로 수행될 것이다. 이러한 결과는 CvnCoV 백신접종에 의해 유도된 보호 면역의 상관 관계를 탐색하는 데 사용된다.
9.4.4 세포 매개 면역(Cell-mediated Immunity)
CMI는 CVnCoV를 투여받은 200명과 위약을 투여받은 200명 등 400명의 대상에서 평가될 것이다. 각 CVnCoV 및 위약 그룹에서, 100명의 피험자는 18~60세이고 100명의 피험자는 61세 이상이다. 이것은 유럽의 한 클리닉 사이트와 라틴 아메리카 국가의 다른 사이트에서 수행될 예정이다 (각 사이트에서 약 100명의 CVnCoV + 100명의 위약 대상자가 참여).
항원 자극 후 S 특이적 T 세포 반응의 SARS-CoV-2 RBD의 빈도 및 기능은 기준선과 비교하여 PBMC에서 결정될 것이다. 예를 들어, Th1 반응 및 Th2 마커 생성을 조사하기 위한 ICS는 백신접종이 기준선에서 Th1 이동을 유도하는지 여부를 조사하는데 사용될 것이다. 더 높은 프로파일링 T 세포 면역 반응은 ELISpot 또는 CyTOF, 게놈 바이오마커 분석 또는 기타 확립된 분석과 같은 다른 기술을 사용하여 조사할 수 있다. CMI 평가는 1일(기준선), 29일, 43일, 120일 및 211일에 수행된다. 120일 및 211일 테스트는 29일 및/또는 43일차에 T 세포 반응자로 결정된 대상체에서만 수행된다.
9.5 SARS-CoV-2 감염 테스트
9.5.1 COVID-19 질병의 바이러스학적 확인
시험 기간 동안, 임상적으로 COVID-19 질병이 의심되는 대상자는 아래에 설명된 대로 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 테스트를 받게 된다. 검사를 위한 샘플 수집은 사이트에서 수행하거나 시험 직원이 가정을 방문하여 수행할 수 있다. 이상적으로는 증상이 시작된 후 5일 이내에 검체를 채취해야 한다. 테스트 결과는 해당 eCRF 페이지에 문서화된.
ㆍ 임상적으로 COVID-19가 의심되는 피험자는 사이트에서 수행되는 신속 항원 검사를 사용하여 SARS-CoV-2 감염에 대한 검사를 받게 되며, 결과는 피험자에게 제공된다. 비인두 면봉은 신속 항원 검사를 위한 샘플을 수집하는 데 사용된다.
ㆍ 신속 항원 검사 결과와 상관없이, 동시에 채취한 비인두 면봉 검체를 중앙검사실로 보내 SARS CoV 2 특이 RT-PCR 검사를 시행한다. RT-PCR 검사 결과는 SARS-CoV-2 감염에 대한 결정적인 것으로 간주된다. 피험자로부터 1개의 검체만 채취할 수 있는 드문 경우에는 중앙 실험실에서 RT-PCR로 검체를 검사해야 한다.
o RT-PCR 검사가 음성이지만 피험자의 노출 이력 및 임상 양상에 따라 COVID-19가 여전히 의심되는 경우, 가능한 한 빨리 다른 비인두 면봉 샘플을 채취하여 RT-PCR 검사를 위해 중앙 실험실로 보내야 한다. RT-PCR 재검사 결과는 SARS CoV-2 감염에 대한 결정적인 것으로 간주된다.
ㆍ 모든 검사에서 음성인 피험자는 SARS-CoV-2 감염에 대해 이력이 없는 것으로 간주된다. 피험자가 신속 항원 검사에 의해 양성이지만 RT-PCR에 의해 음성인 경우, 피험자는 RT-PCR에 의한 양성 바이러스학적 확인 없이 여전히 감염 이력이 없는 것으로 간주된다 (N 단백질에 대한 혈청양성 검사에 의해 달리 결정되지 않는 한).
9.5.2 사이트 외부에서 수행된 SARS-CoV-2 감염에 대한 양성 테스트의 확인
사이트 외부에서 수행된 SARS-CoV-2 감염에 대해 양성 테스트를 보고한 피험자의 후속 조치는 섹션 9.2.1.1.2 및 섹션 9.2.2를 참조한다.
사이트 밖에서 실시한 SARS-CoV-2 감염 검사에서 보인 양성 반응을 보고한 피험자(증상이 있는 또는 무증상인)의 경우, 검사 유형에 관계없이, 가능한 한 빨리 재검사하여 결과를 확인해야 한다. 확인을 위한 RT-PCR 검사를 위해 비인두 면봉 샘플을 중앙 실험실로 보내야 한다. 중앙 연구소의 재검사 결과가 최종적인 것으로 간주된다.
10 통계적 고려사항
10.1 표본 크기 결정
10.1.1 1차 효능 공동 목표
이것은 이벤트 기반 시험이다. 표본 크기 및 검정력 고려사항은 바이러스학적으로 확인된 모든 중증도의 COVID-19 사례 또는 공동 1차 사례 정의를 충족하는 중등도 또는 그 이상의 심각한 COVID-19 사례의 예방에서 CVnCoV의 효능을 입증하기 위한 공동 1차 목표를 기반으로 한다. O'Brien 및 Fleming 유형 오류 지출 함수(error spending-function)(Lan et al.1983)를 사용하여, 높은 수준의 효능을 나타내거나 무익에 도달하는, 모든 심각도의 COVID-19 사례에 대한 2개의 중간 분석이 있는 그룹 순차 설계(group sequential design)가 계획되고, 표본 크기는 하나의 단일 비율(즉, 모든 사례 중 CVnCoV 그룹의 사례 비율)에 대한 테스트를 기반으로 한다. 그룹 순차 설계는 모든 심각도 COVID-19 종점을 기반으로 하며, 이는 이 종점을 충족하는데 더 많은 사례 수가 필요하기 때문이다.
2개의 공동 1차 목표에 대한 타입 1 오류를 제어하기 위해, 5%의 전체 2-측면 알파가 2개의 공동 1차 목표 간에 균등하게 분할되었다. 전체 양면 알파가 2.5%인 경우, 최종 분석에서, 대립 가설 하에서 VE가 60%라고 생각할 때, VE에 대한 CI의 하한을 기준으로 하여 VE가 30% 이상임을 입증하기 위한 90%의 검정력을 갖기 위해, 총 185개의 모든 심각도의 COVID-19 사례(모든 심각도의 COVID-19에 대한 공동 1차 효능 사례 정의를 충족)가 필요하다 (즉, 대립 가설 하 비율이 0.2857과 동일하다고 생각할 때, 비율에 대한 CI의 상한에 기초하여, 동등하게 CVnCoV 그룹의 사례 비율이 0.4118 미만이라는 것을 입증하기 위해).
전체 2-면 알파가 2.5%인 경우, 대립 가설 하의 VE가 70%라고 생각할 때, VE에 대한 CI의 하한을 기준으로 하여 VE가 20% 이상임을 입증하기 위한 90%의 검정력을 갖기 위해, 최종 분석에서 총 60건의 중증도 내지 중증 COVID-19 사례(중등도 또는 중증 COVID-19의 공동 1차 효능 사례 정의를 충족)가 필요하다 (즉, 대립 가설 하 비율이 0.2308과 동일하다고 생각할 때, 비율에 대한 CI의 상한에 기초하여, 동등하게 CVnCoV 그룹의 사례 비율이 0.4444 미만이라는 것을 입증하기 위해). 모든 중증도의 COVID-19 사례 중 1/3이 중등도 내지 중증이라면, 총 COVID-19 사례 수가 180일 때 중등도에서 중증 사례 60건이 얻어진다. 이 종점에 대해 계획된 중간 분석이 없다.
모든 심각도의 COVID 19 사례에 대한 공동 1차 목표의 높은 효능 또는 무익에 대한 두 가지 중간 분석은 56/111 사례(사례의 약 30%/60%)가 발생하면 수행된다.
위약 대상자에서 월 0.15%의 COVID-19 발병률, 20%의 총 평가할 수 없는 비율(EAS 및 중도탈락(drop-out)으로부터 제외된 피험자에 해당) 및 60%의 VE를 가정하면, 약 3개월 동안 등록된 36,500명의 피험자(백신 그룹당 18,250)은 첫 번째 백신접종 후 약 9개월에 모든 중증도의 COVID-19 사례 185건을 발생시킬 것이다. 더 낮은 발병률, 더 긴 등록 기간, 또는 더 높은 비평가율 또는 VE는 185 사례의 획득 및 최종 분석 시간을 지연시킬 것이다. 피험자는 국가 및 연령 그룹(18~60세 및 61세 이상)별로 계층화되어, 1:1 비율로 CVnCoV 또는 위약을 투여받도록 무작위화된다.
10.1.2 주요 2차 효능 목표
바이러스학적으로 확인된 중증 COVID-19 사례의 예방을 평가하는 주요 2차 유효성 목표의 경우, 1차 종점에 비해 최종 분석 시점에 수집되는 사례 수가 더 적다. Verity et al. 2019의 대규모 데이터베이스 분석을 기반으로, COVID-19 사례의 약 20%가 임상적으로 중증 또는 중환자로 정의될 수 있으며, 후자는 집중 치료가 필요하다.
중증 COVID-19 사례가 37건(185 사례들 중 20%)인 경우, 시험은 VE가 70%라고 가정할 때 VE의 95% CI의 하한을 10% 이상으로 탐지하는 88%의 검정력을 갖는다. 중증 사례에 대한 VE가 75%이면, 검증력은 90%로 증가한다. HERALD 시험 CV-NCOV-004에서 1년 동안 모든 평가가능한 피험자에 대한 완전한 추적을 통해, 2차 백신접종 후 추가로 발생한 COVID-19 사례의 수가 중증 질환에 대한 CVnCoV 효능에 대한 보다 강력한 평가를 허용할 것으로 예상된다. 이 분석은 SAP에 표시된다.
SARS-COV-2 감염의 45%가 무증상이라고 가정하면(Daniel et al. 2020), 다음 주요 2차 유효성 목표의 경우, 평가가능한 모든 대상자에 대해 2차 백신접종 후 1년 동안 추적 관찰한 후 약 300명의 무증상 감염이 예상된다. 이러한 수의 사례에서, 시험은 무증상 감염에 대한 VE가 28%라고 가정할 때, VE의 95% CI의 하한을 0% 초과로 탐지하는 80%의 검정력을 갖는다.
10.2 분석을 위한 모집단(Population)
안전성 분석 세트(SAS), 안전성 분석 세트 2(SAS 2) 및 요청된 AE 안전성 분석 세트(SASsol)에서, 피험자는 실제로 받은 그룹("치료")에서 분석된다.
효능 세트 및 프로토콜별 세트의 "치료 의도" 원칙에 따라, 피험자는 무작위 배정된 그룹("무작위")에서 분석된다.
10.2.1 안전성 분석 세트(SAS)
SAS에는 CVnCoV 또는 위약을 1회 이상 투여받은 2b상 또는 3상 무작위 배정된 모든 피험자가 포함된다.
SAS는 모든 피험자(즉, 의료 참여 AE, AESI, 철회 또는 시험 중단으로 이어지는 AE 및 SAE)에서 수집된 안전성 종점 및 첫 번째 투여 후 효능을 평가하는 효능 목표에 대한 1차 모집단이 될 것이다.
10.2.2 안전성 분석 세트 2(SAS 2, SASsol)
요청된 AE 및 요청되지 않은 AE는 2b상 피험자에 대해서만 수집되므로, 이러한 분석은 2b상 피험자로 제한된다.
SAS 2 모집단에는 SAS의 모든 2b상 피험자가 포함되며, 요청되지 않은 AE 분석에 사용된다.
SASsol 모집단은 요청된 AE의 발생 또는 미발생을 나타내는 적어도 하나의 diary 모음과 함께 SAS의 모든 2b상 피험자를 포함하고, 요청된 AE 분석에 사용된다.
10.2.3 효능 분석 세트(EAS)
EAS에는 다음과 같은 2b상 또는 3상에서 무작위 배정된 모든 대상자가 포함된다:
ㆍ 무작위 배정(CVnCoV 2회 또는 위약 2회)에 따라 시험 백신의 두 번 용량을 모두 받았음.
ㆍ 시험 진입 전(제외 기준 1에 의거) 또는 두 번째 백신접종 후 15일 이내에 COVID-19의 바이러스학적으로 확인된 사례가 발생하지 않았음.
ㆍ 두 번째 백신접종 후 15일 이내에 시험을 중단하지 않았음.
ㆍ 기준선에서 SARS-CoV-2에 감염되지 않았음 (기준선에서 채취한 혈액 샘플의 N 단백질에 대한 혈청음성도를 기준으로 함).
EAS는 모든 효능 종점에 대한 1차 분석 모집단이 될 것이다(혈청전환과 관련된 주요 2차 효능 종점 및 첫 번째 투여 이후에 시작하여 효능을 평가하는 효능 종점 제외).
10.2.4 혈청전환에 대한 효능 분석 세트(EASS)
EASS 모집단은 SARS-CoV-2의 N 단백질에 대해, 기준선 및 43일째(즉, 두 번째 백신접종 후 15일 이전의 모든 테스트 시점)에서 혈청음성 테스트를 받은 EAS의 모든 대상체를 포함하고, 이들에 대해 2차 백신접종(211일 또는 393일) 후 15일 이상 경과한 시점에서 적어도 하나의 N 단백질에 대한 혈청학적 검사 결과가 분석 가능하다.
SARS-CoV-2의 N 단백질로의 혈청전환(무증상 감염)과 관련된 주요 2차 유효성 종점의 1차 분석이 이 집단에 대해 수행될 것이다.
10.2.5 프로토콜별 효능 세트(Per Protocol Efficacy Set, PPE)
프로토콜별 효능 세트에는 시험 시작 시 모든 적격성 기준을 충족하고 SAP에 명시된 효능 결과에 영향을 미칠 주요 프로토콜 편차가 없는 EAS 피험자가 포함된다.
PPE는 효능 종점들에 대한 지원 모집단이 될 것이다(혈청전환과 관련된 주요 2차 효능 종점 및 첫 번째 투여 후 시작하여 효능을 평가하는 효능 2차 종점 제외).
10.2.6 프로토콜별 면역원성 세트(PPI)
PPI 세트에는, 면역원성 하위세트(IS){즉, 2b상의 2개 연령 그룹(18-60세 및 61세 이상) 각각에 등록된 ~처음 600명의 피험자}에 속하는 모든 2b상 피험자 및 다음에 해당하는 피험자가 포함된다:
ㆍ 프로토콜에 정의된 기간 내에서 무작위로 두 용량을 모두 받았음.
ㆍ SAP에 명시된 바와 같이, 면역원성 결과에 영향을 미칠 것으로 예상되는 주요 프로토콜 편차가 없음.
ㆍ 제안된 면역원성 측정 중 하나 또는 둘 다를 방해할 수 있는 의학적 치료(예: 혈액 제제, 면역글로불린 요법)를 받은 적이 없음.
ㆍ 2차 백신접종 후 14일(43일)부터 분석에 사용할 수 있는 최소한 하나의 혈액 샘플이 수집되었음.
PPI는 S 단백질의 SARS-CoV-2 RBD 항체 반응과 SARS-CoV-2 바이러스 중화 항체에 대한 1차 분석 집단이 될 것이다.
PPE/PPI에서 제외될 피험자는 시험의 맹검해제 전에 개최된 Blinded Data Review Meeting에서 식별되고 검토될 것이다. 주요 프로토콜 편차가 나열되고 요약된다.
표 18은 각 종점의 분석을 위해 계획된 1차 및 지지 모집단의 요약을 제공한다. SAP에서 다른 분석 모집단을 정의할 수 있다.
각 종점의 분석을 위한 1차 및 지원 모집단
종점 1차 모집단 지원 모집단
1차 효능 종점 EAS PPE
1차 안전 종점
·SAE, AESI, 의료-참여(medically-attended) AE SAS -
2차 효능 종점들(Secondary Efficacy Endpoints):
·중증 COVID-19 EAS PPE
·무증상 감염 (N 단백질에 대한 혈청전환) EASS
·61세 이상의 COVID-19 EAS (61세 이상의 피험자) PPE (61세 이상의 피험자)
·모든 SARS-CoV-2 감염 (RT-PCR 양성) EAS PPE
·첫 투여 후 COVID-19 SAS (경험 없은 피험자) -
2차 면역원성 종점들:
·스파이크 (S) 단백질의 SARS-CoV-2 RBD 항체 반응 PPI -
·SARS-CoV-2 바이러스 중화 항체 PPI -
안전성 종점:
·요청된 AE SASsol -
·요청되지 않은 AE SAS 2 -
·백신 철회를 야기한 AE SAS -
탐색적 효능 종점:
·COVID-19의 중증도 EAS -
·추가 산소공급, 입원, 기계 환기, 사망 EAS SAS
·첫 투여 후 COVID-19 SAS -
·COVID-19의 2차 에피소드 EAS -
탐색적 면역원성 종점:
·Th1 반응 및 Th2 발현을 조사하기 위한, 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의한 항원 자극 후 S-특이적 T-세포 반응의 RBD PPI -
·S의 SARS-CoV-2 RBD-특이 T 세포 반응에서 감지가능한 증가가 있는 피험자의 비율 PPI -
10.3 통계적 분석
10.3.1 일반 고려 사항
5개의 분석이 계획되어 있다: 2개의 중간(56/111 케이스에 도달했을 때); 최종(185건에 도달한 경우); 1년 추적(follow-up)(393일 방문까지의 모든 데이터에 대해); 및 2년 추적(확장 연구 종료까지의 모든 데이터에 대해). 중간 및 최종 분석을 위한 SAP는 늦어도 데이터베이스 잠금 전에 준비되고 마무리된다. 이 문서는 모든 시험 목표와 누락된 데이터 처리를 다루기 위한 분석 변수 및 분석 방법론의 정의에 대한 자세한 내용을 제공한다. 최종 분석을 위해 계획된 모든 분석은 1년 추적 및 2년 추적 분석을 위해 재생성된다.
10.3.2 인구 통계, 병력 및 기타 기준선(baseline) 특성
인구통계학적 및 기준선 특성(예: 연령, 성별, 키, 체중), 병력, 기준선 면역 상태 및 전체 안전성 측정과 관련하여, 기술 통계(정량적 데이터) 및 분할표(contingency table, 정성적 데이터)를 사용하여 백신 그룹별로, 및 연령 그룹 및 백신 그룹별로 데이터가 요약됩니다. .
10.3.3 시험 백신 투여
CVnCoV 또는 대조군의 투여는 목록화될 것이며, 실제로 백신접종을 받은 피험자의 수는 백신 그룹별로 요약될 것이다.
10.3.4 병용 약물 및 백신접종
시험 시작 후 병용 약물/백신접종은 목록화될 것이고, Anatomical Therapeutic Chemical 용어에 의해, 전체 및 백신 그룹별로 요약된다.
10.3.5 효능 분석
10.3.5.1 공동 1차 효능 종점 분석
1차 효능 분석
1차 효능 분석에서, 위약을 받은 대상체과 비교하여 백신접종 대상에서 모든 중증도의 및 중등도 내지 중증의 COVID-19 사례(일차 사례 정의에 따름)의 빈도의 퍼센트 감소로 정의된 VE는 정확한 95%*로 다음과 같이 계산된다:
VE = 1- RR = 1 - (ARV/ARP) = 1 - {p / r (1-p)}
여기에서
ARV = 백신접종군의 발병률 = nv/Nv = CVnCoV 그룹에서 최소 1회의 COVID-19 에피소드를 보고한 피험자 수 / CVnCoV 그룹에서 평가가능한 피험자의 총 추적 시간(follow-up time) (인원-월 수).
ARP = 위약 그룹의 발병률 = np/Np = 위약 그룹에서 최소 1회의 COVID-19 에피소드를 보고한 피험자 수 / 위약 그룹에서 평가가능한 피험자의 총 추적 시간 (인원-월 수).
RR = 상대 위험 = ARV/ARP
p = 모든 사례 중 CVnCoV 그룹에서 발생한 COVID-19 사례(기본 사례 정의에 따름)의 비율 = nv/(nv+np).
r = 위약 그룹의 평가가능한 대상의 총 추적 시간에 대한 CVnCoV 그룹의 평가가능한 대상의 총 추적 시간의 비율 = Nv/Np.
*CI의 수준은 순차 설계로 인해 약간 조정될 수 있다(섹션 10.3.8 참조).
공동 1차 효능 종점에 대한 통계적 가설은 다음과 같다:
H0A: VE ≤ 30% versus H1A: VE > 30%
및
H0S: VE ≤ 20% versus H1S: VE > 20%
A는 모든 중증도의 COVID-19 사례와 관련이 있다;
S는 COVID-19의 중등도 내지 중증 사례와 관련이 있다;
시험은, 모든 중증도의 모든 COVID-19 사례에 대해 VE 종점의 정확한 양면 97.5%(순차 설계를 고려하기 위해 약간 조정됨) CI의 하한(LL)이 > 30%이거나, 또는 중증 내지 중등도의 COVID-19 사례에 대해 VE 종점의 정확한 양면 97.5% CI의 하한(LL)이 > 20%라면 성공적일 것이다.
모든 중증도의 COVID-19 사례에 대한 2건의 중간 분석 및 최종 분석이 각각 56/111 및 185 사례들이 보고된 후에 수행된다면, O'Brien Fleming 유형 오류 스펜딩 함수에 따라 최종 분석 시 고려할 단측 α-위험은 0.01209이고, 185명 중 60 사례 또는 그 이하가 CVnCoV 그룹인 경우 (측정된 VE ≥ 52.0%) 최종 분석에서 효능이 입증되고; 및 중등도 내지 중증의 COVID-19 사례에 대한 최종 분석에 대해서는 0.025이고, 60 중 17 사례 또는 그 이하가 CVnCoV 그룹에 있는 경우(측정된 VE ≥ 60.5%) 효능이 입증될 것이다. 참고로, r ≠ 1 (두 그룹에서 총 추적 시간이 다름)인 경우, 효능을 입증하기 위한 사례 분할의 규칙이 약간 다를 수 있다.
민감도 분석
주요 민감도 분석으로, 바이러스학적으로 확인된 COVID 19 사례의 첫 번째 발생 시간(일차 사례 정의에 따름)이 분석된다.
Kaplan-Meier 곡선은 COVID 19가 발병하지 않을 것으로 추정되는 확률을 표시하고, 로그 순위 테스트가 수행된다.
바이러스학적으로 확인된 COVID-19의 첫 번째 발생 시간(증상 발병 날짜)은 두 번째 백신접종 후 15일부터 시작된다.
COVID-19에 걸리지 않은 피험자는 시험 종료 날짜 또는 분석 마감(cut-off) 날짜 중 먼저 도래하는 날짜에 검열된다.
추가 민감도 분석에는 SAP에 지정된 관련 기준선 공변량(covariate)에 대해 조정된 Cox 비례 위험 회귀(Cox proportional hazards regression) 모델이 포함될 수 있다.
분석 방법에 대한 자세한 내용은 SAP에서 설명한다.
10.3.5.2 2차 효능 종점 분석
2가지 주요 2차 효능 종점의 통계적 테스트는 목적/종점 섹션에 정의된 순서를 사용하여 조건부 계층적 테스트 절차에 따라 수행된다. 따라서:
ㆍ 중증 사례에 대한 CVnCoV의 효능은 주요 효능 목표가 성공적으로 입증된 경우에만 입증된다.
ㆍ 무증상 감염에 대한 CVnCoV의 효능은 중증 사례에 대한 1차 효능 목표와 2차 목표가 성공적으로 입증된 경우에만 입증된다.
그렇지 않으면, 이러한 종점은 성공 기준 테스트 없이 탐색적 종점으로 분석된다.
중증 질환 및 무증상 감염 예방의 유효성을 평가하기 위해, 1차 유효성 종점에서 수행한 것과 유사한 분석이 수행된다. VE의 정확한 양측 95% CI의 LL이 중증 질환의 경우 10% 이상이고 무증상 감염의 경우 0% 이상인 경우, 효능이 입증될 것이다.
다른 2차 유효성 종점(endpoint)은 1차 유효성 평가변수와 유사하게 분석되지만, 해당 종점들에 대한 공식적인 테스트는 수행되지 않는다. 1차 접종 후의 유효성을 위해, 1차 접종 후 바이러스학적으로 확인된 COVID-19의 최초 발생 시간(증상 발병일)이 시작된다. BoD는 2가지 다른 채점 시스템을 사용하여 분석된다. 두 BoD 점수 시스템은 입원 또는 사망에 의해 반영되는 중증 COVID-19 질병 또는 중증 질병에 대한 효능에 더 많은 비중을 둔다. 또한 VE 및 관련 CI는 각 BoD 범주에 대해 계산된다.
10.3.5.3 탐색적 효능 종점 분석
모든 사례 중 경증 및 중증 COVID-19 사례의 비율(일차 사례 정의에 따름)은 그룹별로 요약된다.
빈도 및 백분율에 대한 설명은 다음과 같은 대상자에 대해 그룹별로 제공된다:
ㆍ COVID-19로 인해 추가 산소 공급이 필요함.
ㆍ COVID-19로 인해 기계 환기가 필요함.
ㆍ COVID-19로 인해 입원.
ㆍ COVID-19로 인해 사망.
ㆍ 어떤 이유로든 사망.
이는 2차 시험 백신접종(완전 VE) 후 15일 이상 후에 발생한 이벤트에 대해 수행되며, 그 다음에는 1차 시험 백신접종 후 언제든지 발생하는 이벤트에 대해 수행된다.
바이러스학적으로 확인된 모든 중증도의 코로나19 사례의 첫 번째 에피소드의 예방에 대한 VE는 두 번째 시험 백신접종 후 15일 이상에서 발생한 사례와 그 다음 첫 번째 투여 후 발생한 모든 사례에 대해 기준선에서의 혈청학적 상태에 관계없이 모든 대상에 대해 재평가된다.
마지막으로, COVID-19의 두 번째 에피소드가 발생한 피험자의 수와 비율이 그룹별로 표시된다.
10.3.6 2차 및 탐색적 면역원성 분석
면역원성에 대한 공식적인 가설은 테스트되지 않는다. 면역원성 종점에 대한 기술 통계는 각 백신 그룹 및 전체, 백신 그룹 및 연령 그룹별로 제공된다. 데이터는 각 백신 투여 후에 제시될 것이다.
S 단백질의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 항체 수준 및 중화 항체에 대해, 다음의 분석들이 기준선에서 혈청음성인 대상체 및 기준선에서 혈청양성인 대상체에서 전체 및 개별적으로 수행될 것이다:
ㆍ 기하 평균 역가(GMT)는 각 혈액 샘플링 시점에서 95% CI로 요약된다.
ㆍ 기준선으로부터의 배수 변화(FC)는 각 피험자에 대해 계산되고, FC의 기하 평균(GMFC)은 기준선 이후의 각 혈액 샘플링 시점에서 95% CI와 함께 표시된다.
검출 불가능한 항체는 임의적으로 GMT 및 GMFC 계산 목적을 위한 검출 컷오프의 절반으로 대체된다.
각 판독값(readout)에 대해, 기준선에서 혈청전환이 관찰된 SARS CoV-2 혈청음성 피험자의 수와 백분율이 요약되고, 기준선 이후 각 혈액 샘플링 시점에 정확한 95% CI로 표시된다. 혈청전환은 혈청에서 검출가능한 항체로 정의된다.
S 단백질의 SARS CoV-2 RBD 항체 및 SARS CoV-2 중화 항체에 대해 혈청전환되는 대상체의 백분율이 요약될 것이다. 백신에 의해 유도된 면역세포 집단의 빈도가 요약될 것이다. T 세포 면역 반응의 추가 특성화는 ELISpot, CyTOF 및/또는 게놈 바이오마커 분석과 같은 다른 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
그래프를 포함한 추가 면역원성 분석은 해당되는 경우 SAP에 설명된다.
10.3.7 안전성 분석
안전 데이터에 대한 공식적인 통계 테스트는 계획되어 있지 않다.
기술적 안전성 분석은 전체적으로, 백신 그룹별, 연령 그룹 및 백신 그룹별로 수행될 것이다.
다음 분석은 SARS-CoV-2 N 단백질 항체 수준에 대해 기준선에서 혈청 음성인 대상체 및 기준선에서 혈청양성인 대상체에서 전체적으로 그리고 개별적으로 수행될 것이다:
요청된 AE: 각 백신접종 후 7일 이내에 각 요청된 국소 및 전신 AE를 경험하는 대상체의 빈도 및 백분율은 강도 및 전체로 표시된다. 백신접종 후 7일 이내에 동일한 AE가 1회 초과 발생한 피험자의 경우, 최대 강도를 표에 사용한다. 시험 백신접종과 관련하여 요청된 전신 AE에 대해 유사한 표 작업이 수행될 것이다. 요청된 국소 AE는 정의상 시험 백신과 관련된 것으로 간주된다. 발병 시간(일 단위) 및 지속 기간(일 단위)도 요청된 각 국소 및 전신 AE에 대해 요약된다. 각 백신접종 후 7일 이내에 적어도 하나의 국소 또는 전신 요청된 AE의 발생을 보여주는 요약 표도 제시될 것이다.
요청되지 않은 AE: SAE 및 AESI를 포함한 요청되지 않은 AE는 System Organ Class (SOC) 및 Preferred Term (PT)에 의해 Medical Dictionary for Regulatory Activities (MedDRA)를 사용하여 코드화된다.
각 백신접종 후 28일 이내에 각각의 요청되지 않은 AE를 보고한 대상체의 빈도 및 백분율은 전체적으로 SOC 및 PT 수준에서 표로 작성될 것이다.
유사한 표가 다음에 대해 제공될 것이다: 관련 비요청 AE, 등급 3 이상의 비요청 AE, 두 번째 시험 백신접종 후 6개월 이내에 발생한 의료-참여 AE, SAE, 관련 SAE, AESI, 관련 AESI, 철회 또는 시험 중단으로 이어지는 AE 및 2차 시험 백신접종 후 1년 동안 사망을 초래하는 SAE.
AE가 1회 백신접종 후 28일 이내에 대상체에 대해 1회 초과 발생하는 경우, 백신 그룹에 대한 최대 중증도 및 가장 강한 관계가 계산될 것이다.
첫 번째 백신접종 후의 AE만 요약 표에서 고려된다. 첫 번째 백신접종 이전에 시작된 AE는 병력으로 기록될 것이다.
치명적 및 SAE의 데이터 목록은 피험자별로 제공된다.
활력 징후는 기준선으로부터의 변화를 포함하여, 각 방문 시 기술적 통계에 의해 요약되고 목록이 제공될 것이다.
10.3.8 중간 분석
맹검해제된 독립 통계학자가 이 시험에 대해 두 가지 중간 분석을 수행하고, 모든 심각도의 56/111 사례의 COVID-19 사례(공동 1차 효능 사례 정의 충족)가 관찰되면 DSMB에서 검토한다. 이 분석은 1차 효능 종점에 대한 초기의 높은 효능 또는 무익함을 평가하는 것을 목표로 하며, EAS 모집단에서만 수행될 것이다. 이 시점에서 사용할 수 있는 안전 데이터도 설명된다.
고효능 또는 무익함의 초기 증명 분석을 위해, 누적 O'Brien Fleming 유형 오류 스펜딩 함수(Lan et al.1983)를 사용하여 중간 분석을 위해 고효능(α-경계) 및 무익(β-경계)에 대한 통계적 중지 규칙을 제공하며, 이는 특정 중간 단계까지 축적된 정보를 기반으로 한다.
중간 단계에서, 1차 목적의 테스트에 대한 p-값이 α 경계보다 낮으면 CVnCoV에 대한 높은 수준의 효능이 선언된다. 반대로 p-값이 β-경계보다 높으면 무익함을 입증할 수 있다.
중간 분석은 심각도와 상관없이 56/11 사례의 COVID-19 사례가 관찰되었을 때 수행될 예정이다. 아래 표 19는 누적 오류 스펜딩 함수를 사용하여 단측 p-값 척도에서 계산된, 높은 효능 또는 무익함을 입증하기 위한 경계를 보여준다.
56 및 111 사례의 중간 분석 및 185 사례의 최종 분석에서 사용한 2단계 그룹 순차 설계(Sequential Design)
중간 분석 1 중간 분석 2 최종 분석
사례의 수 56 111 185
p-값 척도에서, 효능 α-경계 (1-측(sided)) 0.00001 0.00126 0.01209
P-값 척도에서, 무익함 β-경계 (1-측) 0.73596 0.15716 NA
효능 성공 경계(Efficacy success criteria)* 56 사례 중 CVnCoV 그룹 사례가 7 이하면 성공 (관측된 VE ≥ 85.7%) 111 사례 중 CVnCoV 그룹 사례가 29 이하면 성공 (관측된 VE ≥ 64.6%) 185 사례 중 CVnCoV 그룹 사례가 60 이하면 성공 (관측된 VE ≥ 52.0%)
무익함* 56 사례 중 CVnCoV 그룹 사례가 26 이상이면 무익함 (관측된 VE ≤ 13.3%) 111 사례 중 CVnCoV 그룹 사례가 41 이상이면 무익함 (관측된 VE ≤ 41.4%) NA
* 효능/무익함을 입증하기 위한 사례 분할에 관한 규칙은 평가가능한 전체 대상 수가 두 그룹에서 동일하지 않은 경우(r ≠ 1) 약간 다를 수 있다.
중간 분석이 정확히 56/111 사례가 보고된 후에 수행되는 경우, 0.00001/0.00126보다 낮은 단측 p-값(즉, 양측 99.99%/99.99% CI의 하한 > 30%)은 높은 효능의 결론을 이끌 것이며, 반면에 0.73596/0.15716보다 높은 단측 p-값은 무익함을 입증하는 결과일 것이다. 그렇지 않으면 최종 분석은 185건에서 수행된다. 유사하게, 평가가능한 피험자의 수가 두 그룹 모두에서 동일하다면, 이는 56/111 중 7/29 사례 이하가 CVnCoV 그룹에서 나오는 경우 시험이 조기에 높은 효능을 나타내는 것으로 결론지어지는 반면, 26/41 사례 이상이 CVnCoV 그룹에서 오는 경우 시험의 무의미함이 입증된다는 것을 의미한다.
중요하게, 의사 결정에 사용되는 실제 경계는 각 분석(중간 및 최종)에서 발생하고 보고된 정확한 사례 수에 따라 달라진다.
의사 결정 과정의 일부가 될 다른 많은 요소가 있으므로 경계는 구속력이 없는 방식으로 적용된다.
10.3.9 누락된 데이터 및 중단
백신접종 변수의 분석은 유효한 사례 기반으로 수행된다. 즉, 누락된 관찰의 경우, 이월된 마지막 관찰과 같은 누락된 데이터에 대한 전가(imputation)가 적용되지 않는다.
S 단백질의 SARS-CoV-2 RBD 항체의 경우, 정량 하한(LLOQ) 이하로 표시된 농도 값은 0.5*LLOQ로 설정된다.
분석에 대해 누락된 값의 전가는 수행되지 않는다(SAP에 명시된 바와 같이 AE 및 수반 약물의 누락 부분 날짜에 대한 전가는 제외).
현재 중도탈락(drop-out)한 피험자의 교체는 예상되지 않는다.
실시예 14 : LNP에서 제형화된 SARS- CoV -2 항원 S_stab을 코딩하는 mRNA로 래트의 백신접종
본 실시예는 3' 말단(A64-N5-C30-hSL-N5 또는 hSL-A100) 및 UTR 조합 (i-3 (-/muag) 또는 a-1 (HSD17B4/PSMB3))의 대안적 형태를 포함하는 mRNA를 가진 SARS-CoV-2 S mRNA 백신이 래트에서 강한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도함을 보여준다. hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)을 포함하는 SARS-CoV-2 S_stab을 코딩하는 mRNA는 더 강력하고 매우 빠른 면역 반응 유도를 나타내며, 이는 1회 1차 백신접종 후에도 결합 및 중화 항체의 유도가 더 강력함을 보여준다.
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1 (RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 생체내 백신접종 실험에서 사용하기 전에 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
면역:
표 18에 나타낸 바와 같이, mRNA 백신 조성물 및 용량을 래트에 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 래트의 한 그룹을 완충제로 백신접종하였다(그룹 A). 모든 동물을 0일 및 21일에 백신 접종하였다. 항체 역가의 측정을 위해 14일, 21일(프라임 후) 및 42일(부스트 후)에 혈액 샘플을 수집하였다.
백신접종 요법 ( 실시예 14):
그룹 백신 조성물 mRNA ID CDS opt. 5'- UTR /
3'- UTR ;
UTR 설계 		3'-말단 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA 용량
완충액 - - - - -
A LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 -/muag; A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 0,5μg
B LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 -/muag; A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 2μg
C LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 -/muag; A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 8μg
D LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 -/muag; A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 20μg
E LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 -/muag; A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 40μg
F LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 0,5μg
G LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 2μg
H LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 8μg
I LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 20μg
J LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 40μg
ELISA를 사용한 IgG1 및 IgG2 항체 역가 측정:
ELISA는 실시예 12에 기재된 바와 같이 수행하였다.
바이러스 중화 항체 역가(VNT)의 측정
쥐 혈청 샘플의 바이러스 중화 항체 역가(VNT)를 마우스 혈청을 사용한 실시 예 6에 이전에 기재된 바와 같이 분석하였다.
결과:
도 16A에 나타낸 바와 같이, LNP(R9709)에 제형화된, 3' 말단 hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)을 갖는 비코딩 영역을 포함하는 mRNA 전장 S 안정화된 단백질로의 백신접종은 0.5μg, 2μg, 8μg, 20μg 및 40μg의 용량을 사용한 첫 번째 백신접종 후 이미 14일 및 21일에 랫트에서 강력하고 용량 의존적인 수준의 결합 항체 역가(IgG1 및 IgG2a 종점 역가로 나타냄)를 유도하였다. LNP(R9515, CVnCov)로 제형화된, 3' 말단 A64-N5-C30-hSL-N5 및 UTR 조합 i-3 (-/muag;)을 포함하는 비코딩 영역을 포함하는 mRNA 전장 S 안정화된 단백질을 사용한 백신접종은 래트에서 더 높은 용량(8μg, 20μg 및 40μg)을 사용한 첫 번째 백신접종 후 이미 14일 및 21일에 용량 의존적 수전의 결합 항체 역가(IgG1 및 IgG2a 종점 역가로 표시)를 유도하였다.
도 16B에 나타낸 바와 같이, LNP(R9709)에서 제형화된, 3' 말단 hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)을 갖는 비코딩 영역을 포함하는 전장 S 안정화 단백질을 코딩하는 mRNA를 사용한 백신접종은 래트에서 최소 2 μg의 용량으로 첫 번째 백신접종 후 14일 후에 이미, 용량 의존적이고 매우 높은 수준의 VNT를 유도하였다.
도 16C에 도시된 바와 같이, LNP로 제형화된, 전장 S 안정화 단백질을 코딩하는 mRNA 백신 포맷 2가지 모두를 사용한 백신접종은 용량 의존적 방식으로 강력한 VNT를 유도한다. hSL-A100 및 UTR 조합 a-1 (HSD17B4/PSMB3)을 포함하는 SARS-CoV-2 S_stab을 암호화하는 mRNA를 이용한 VNT의 유도는, A64-N5-C30-hSL-N5 및 UTR 조합 i-3 (-/muag)을 포함하는 SARS-CoV-2 S_stab을 코딩하는 mRNA와 비교할 때, 단 2 μg의 용량에서도 매우 높은 중화 항체 역가의 더 강력하고 매우 튼튼한(robust) 유도를 보여준다. mRNA R9709를 포함하는 백신 조성물에 의해 생성된 중화 항체의 역가는 두 번째 백신접종에 의해 더욱 현저하게 증가될 수 있다.
R9709를 포함하는 백신 조성물의 강도는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대하여 대상체의 치료 또는 예방을 위한, 조성물 또는 백신의 단 1회 용량을 포함하는 면역화 프로토콜을 뒷받침할 수 있다.
실시예 15 : LNP에 제형화된 SARS- CoV -2 항원 S_stab을 코딩하는 mRNA로 NHP 의 백신접종 및 챌린지
LNP로 제형화된 S_stab을 코딩하는 mRNA(CVnCoV)의 보호 효능은 붉은털 원숭이 SARS-CoV-2 챌린지 모델에서 밝혀졌다. 인간이 아닌 영장류는 SARS-CoV-2 감염 시 상기도 및 하기도 모두에서 높은 수준의 바이러스 복제 및 바이러스성 폐렴을 나타내는 병리학적 변화가 있는 경증의 임상 질환을 발생시킨다 (Munoz-Fontela et al., 2020). 결과는 CVnCoV가 COVID-19의 NHP 생체 내 모델에서 비강(IN) 및 기관 내(intra tracheal, IT) 경로를 통한 5 × 106 PFU 챌린지에 대해 보호 효과가 있음을 나타냈다. 보호 종점에는 폐 병리학에 대한 보호 외에도 바이러스 로드가 크게 감소했다.
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조하였다. HPLC 정제된 mRNA는 생체내 백신접종 실험에서 사용하기 전에 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
면역 및 챌린지 :
인도산 붉은털원숭이(Macaca mulatta) 18마리를 6마리씩 세 그룹으로 나누었는데, 각각 수컷 3마리와 암컷 3마리(체중 4.5kg 이상, 나이 3-6세)로 구성되어 있었다. 동물에게 SARS-CoV-2 항원 S_stab를 암호화하는 LNP로 제형화된 mRNA (SARS-CoV-2 S-2P(CVnCoV)) 0.5μg 또는 8μg을 두 번 백신접종하거나 또는 두 번째 백신접종 4주 후 야생형 SARS-CoV-2로 챌린지하기 전까지 백신을 접종하지 않은 상태로 유지했다 (도 17A 참조). 표 21에 나타낸 바와 같이, 0.5 ml의 부피 및 용량으로 mRNA 백신 조성물을 상완의 이두박근에 동물에게 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, NHP의 한 그룹은 챌린지 전에 처리/백신접종하지 않았다 (그룹 A). 항체 역가의 측정을 위해, 0, 14, 28일(첫 번째 백신접종 후), 42 및 56일(두 번째 백신접종 후), 및 챌린지 후 1, 3, 5, 7일에 혈액 샘플을 수집했다. 동물은 56일째에 기관지경을 사용하여 기관의 pre-carinal 섹션에 2ml의 바이러스 제제를 적용한 후 비강내로 1ml를 적용함으로써 5.0 × 106 PFU SARS-CoV-2의 용량으로 비강내 챌린지를 받았다 (0.5ml/콧구멍). 각 그룹의 2마리의 동물을 챌린지 후 (p.c.) 6, 7 또는 8일 동안 추적하고, 실험 62, 63 또는 63일째에 안락사시켰다.
백신접종 요법 ( 실시예 15):
그룹 백신 조성물 mRNA ID 용량 백신접종 CDS opt. 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA
A LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA (CVnCoV) R9515 0,5㎍ d0, d28 opt1 10 163
B LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA (CVnCoV) R9515 8㎍ d0, d28 opt1 10 163
C 비백신접종(Unvaccinated)
IgG ELISA
SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 전장 삼량체 및 안정화 버전은 Lake Pharma(#46328)에서 제공했다. 재조합 SARS-CoV-2 수용체-결합-도메인(319-541) Myc-His는 MassBiologics에서 개발하여 친절하게 제공했다. 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 및 RBD 특이적 IgG 반응은 ELISA에 의해 결정되었다. 고-결합 96웰 플레이트(Nunc Maxisorp, 442404)를 1× PBS(Gibco)에서 웰당 50μl의 2 μg/ml 스파이크 삼량체 또는 스파이크 RBD로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양했다. ELISA 플레이트를 세척하고 실온에서 1시간 동안 1× PBS/0.1% 트윈 20 내 5% 소 태아 혈청(FBS, Sigma, F9665)으로 블로킹했다. 백신접종 후 동물로부터 수집한 혈청은 1/50의 시작 희석에 이어 8번, 2배 연속 희석을 하였다. 챌린지 후 샘플은 0.5% 트리톤에서 비활성화되었고, 1/100의 시작 희석에 이어 8번, 3배 연속 희석이 있었다. 1× PBS/0.1% Tween 20 내 10% FBS에서 연속 희석을 수행했다. 플레이트를 세척한 후, 각 혈청 희석액 50μl/웰을 항원 코팅된 플레이트에 이중으로 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 세척 후, HRP(Invitrogen, PA1-84631)에 접합된 항-원숭이 IgG를 1× PBS/0.1% Tween 20 내 10% FBS에 희석하고(1:10,000), 100 μl/웰을 플레이트에 첨가했다. 이어서 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 1 mg/ml O-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 용액(Sigma P9187)을 제조하고, 웰당 100 μl를 첨가하였다. 웰당 50μl의 1M 염산(Fisher Chemical, J/4320/15)으로 진전(development)을 중단하고, Softmax (버전 7.0)를 사용하여 Molecular Devices versamax 플레이트 판독기에서 490nm에서의 흡광도를 판독했다. 모든 테스트 샘플 용량 반응 곡선은 Softmax Pro(버전 7.0)의 4PL 모델에 맞춰졌고, OD 0.5(0.5의 흡광도 반응을 제공하는 데 필요한 혈청 희석의 역수(reciprocal)로 정의됨)에서의 종점 역가는 각 곡선에서 보간(interpolate)되었다. 결과가 검출 한계 미만인 경우, 면역화 후 샘플에 대해 25의 값을 할당하고 챌린지 후 샘플에 대해 50의 값을 할당했다. 흡광도가 0.5 값에 도달하지 않은 낮은 샘플의 경우, 곡선의 외삽 부분에서 역가를 추정했다. 컷-오프는 미감염 동물로부터 수집된 혈청의 평균 역가(0일) + 1 표준 편차로 설정되었다. 컷 오프는 각 항원에 대해 별도로 계산되었다.
SARS- CoV -2 초점 감소 중화 테스트(focus reduction neutralisation test)
바이러스 중화 역가는 열-불활성화된 혈청 샘플(30분 동안 56 ℃)에서 측정되었다. SARS-CoV-2(Victoria/01/2020, Doherty Institute)는 바이러스 전용 대조군 웰에서 웰당 100 내지 250 foci를 제공하는 농도에서 1 × 항생제/항진균제 함유 1% FCS MEM (Gibco, 15240-062) 내에서 50:50으로 혼합되어, 96웰 V-바닥 플레이트에서 1:20에서 1:640까지(또는 항체 수준에 따라 더 높게) 혈청 더블링 희석하였다. 플레이트를 1시간 동안 가습된 상자에서 37℃에서 인큐베이션하여 혈청 샘플의 항체가 바이러스에 결합하도록 하였다. 100 마이크로리터의 혈청/바이러스 혼합물을 96-웰 플레이트의 바이러스 감수성 Vero/E6 단층으로 옮기고, 밀봉된 가습 상자에서 37℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션했다. 흡착 후, 바이러스/항체 혼합물을 제거하고, 완전한 배지 오버레이에 100㎕의 1% w/v CMC를 첨가하였다. 상자를 다시 밀봉하고 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 100㎕의 20% 포르말린/PBS 용액으로 고정하고 면역염색 전에 밤새 플레이트를 훈증하였다. ELISA 워셔(BioTek 405 TSUS)를 사용하여 물로 세척한 후, 20분 동안 0.3% 과산화수소를 첨가하여 잔류 내인성 퍼옥시다제 활성을 제거했다. 그런 다음 플레이트를 PBS에서 1:2,000으로 희석된 1차/검출 SARS-CoV-2 항-RBD 토끼 다클론 항체(SinoBiologicals; 40592-T62)와 함께 1시간 동안 인큐베이션했다. 세척 후, 플레이트를 PBS에서 1:4,000으로 희석된 2차 항-토끼 HRP-접합체 항체(Invitrogen; G-21234)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 병소(foci)는 TrueBlue™ Peroxidase Substrate(KPL seracare; 5510-0030)를 사용하여 시각화한 후, 플레이트를 물로 세척하고 건조했다. ImmunoSpot S6 Ultra-V 분석기(CTL) 및 BioSpot 소프트웨어(7.0.28.4 Professional; CTL)를 사용하여 Foci를 계수하고, SoftMax Pro(Molecular Devices; v7.0.3 GxP)에서 결과를 분석했다. 간단히 말해서, 계수 데이터는 각 혈청 희석액에 대한 VOC의 백분율, 즉 foci 감소 백분율로 표현되었고, 4-파라미터 로지스틱(4PL) 곡선에 플롯되었다. 바이러스 중화 역가(VNT)는 바이러스 foci의 50%를 중화한 혈청 희석액으로 보고된다.
대안적으로, 바이러스 중화 역가는 돌연변이 D614G를 특징으로 하는 SARS-CoV-2 바이러스를 사용하여 실시예 9에 이전에 기재된 바와 같이 측정하였다.
ELISpot
Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare, USA)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 전체 헤파린처리된 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리했다. IFN-γ ELISpot 분석은 인간/유인원 IFN-γ 키트(MabTech, Nacka, Sweden)를 사용하여 PBMC에서 SARS-CoV-2-특이적 T 세포의 빈도 및 IFN-γ 생산 능력을 평가하는 데 사용되었다. 세포를 웰당 2 × 105개 세포로 분석하였다. 세포는 SARS-CoV-2 펩타이드 풀과 스파이크 단백질의 '메가풀'(Mimotopes, Australia)로 밤새 자극되었다. 펩티드 서열은 GenBank: MN908947.3을 기반으로 했다. 11개의 아미노산이 겹치는, 15mer 펩티드로 구성된 10개의 펩티드 풀이 사용되었다. 3개의 메가풀은 다음과 같이 구성되었다: 메가풀 1(MP1)은 펩타이드 풀 1-3으로, 메가풀 2(MP2)는 펩타이드 풀 4-6으로, 메가풀 3(MP3)은 펩타이드 풀 7-10으로 구성되었다. 모든 펩티드는 펩티드당 1.7㎍/ml의 최종 농도로 사용되었다. Phorbol 12-myristate(Sigma-Aldrich Dorset, UK)(100ng/ml) 및 이노마이신 (CN Biosciences, Nottingham, UK)(1mg/ml)을 양성 대조군으로 사용했다. 결과는 백만 셀당 스폿 형성 단위(SFU)로 보고되도록 계산되었다. 모든 SARS-CoV-2 펩티드 및 메가풀을 이중으로 분석하고, 배지 전용 웰을 빼서 항원 특이적 SFU를 제공했다. ELISpot 플레이트는 CTL 스캐너 및 소프트웨어(CTL, 독일)를 사용하여 분석하고, 추가 분석은 GraphPad Prism(버전 8.0.1)(GraphPad Software, USA)을 사용하여 수행했다.
기관지폐포 세척( BAL )
생존 중(in-life) BAL 세척은 두 번째 분기 위의 폐 오른쪽에 삽입된 기관지경을 사용하여 6ml 또는 10ml PBS를 사용하여 수행되었다. 사후에 수행된 BAL 세척은 20 ml PBS를 사용하여 좌측 1차 기관지를 결찰한 후 우측 폐엽에서 수행하였다.
정량적 중합효소 연쇄 반응
비강 면봉, 인후 면봉, EDTA 처리 전혈, BAL 및 조직 샘플(비장, 신장, 간, 결장, 십이지장, 편도, 기관 및 폐)에서 RNA를 분리했다. RNAprotect(Qiagen) 내 조직 샘플은 CK28 경조직 균질화 2.0ml 튜브(Bertin) 및 1%(v/v) 베타-메르캅토에탄올이 보충된 1ml의 RLT 완충액(Qiagen)이 있는 Precellys 24 균질화기에서 균질화되었다. 조직 균질액을 QIAshredder 균질화기(Qiagen)에 통과시키고, 제조업체의 지침에 따라 BioSprint™96 One-For-All vet 키트(Qiagen) 및 Kingfisher Flex 플랫폼을 사용하여 조직 17.5mg에 해당하는 부피를 추출했다. 샘플을 AVL 완충액(Qiagen)에 넣고 100% 에탄올을 첨가하여 비조직 샘플을 불활성화시켰다. 이 샘플의 추출은 제조업체의 지침에 따라 BioSprint™96 One-For-All vet 키트(Qiagen) 및 Kingfisher Flex 플랫폼을 사용하여 수행되었다.
역전사-정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)은 TaqPath™ 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG(Applied Biosystems™), 2019-nCoV CDC RUO Kit(Integrated DNA Technologies) 및 QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems™)을 사용하여 수행되었다. PCR 앰플리콘은 시험관 내 전사된 RNA N 유전자 단편 표준품에 대해 정량화되었다. 10 카피/㎕의 정량 하한(LLOQ) 미만으로 검출된 양성 샘플에는 5 카피/㎕의 값이 할당되었고, 검출되지 않은 샘플에는 2.3 카피/㎕의 값이 할당되었으며, 이는 분석 LLOD와 동일하다. 비강 면봉, 인후 면봉, BAL 및 혈액 샘플 추출 샘플의 경우, 이는 1.29 × 104 카피/ml의 LLOQ 및 2.96 × 103 카피/ml의 LLOD에 해당한다. 조직 샘플의 경우 이는 LLOQ 5.71 × 104 카피/g 및 LLOD 1.31 × 104 카피/g에 해당한다.
TaqMan™ Fast Virus 1-Step Master Mix(Thermo Fisher Scientific)를 사용한 QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR 시스템에서 서브게놈 RT-qPCR을 수행했고, 각각 250nM, 125nM 및 500nM의 최종 농도로 정방향 프라이머, 프로브 및 역방향 프라이머가 이용되었다. sgE 프라이머 및 프로브의 서열은: 2019-nCoV_sgE-forward, 5' CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC 3' (서열 번호: 22729); 2019-nCoV_sgE-reverse, 5' ATATTGCAGCAGTACGCACACA 3' (서열 번호: 22730); 2019-nCoV_sgE-probe, 5' FAM- ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1 3' (서열 번호: 22731)이었다. 사이클링 조건은 50℃ 10분, 95℃ 2분, 이후 45 사이클의 95℃ 10초, 60℃ 30초이었다. RT-qPCR 앰플리콘은 UTR 리더 서열과 추정되는 E 유전자 전사 조절 서열이 선행하는 전장 SARS-CoV-2 E ORF(수탁 번호 NC_045512.2)의 시험관 내 전사된 RNA 표준품에 대해 정량화되었다. 정량 하한선(LLOQ) 미만으로 검출된 양성 샘플에는 5 카피/μl 값이 할당된 반면, 검출되지 않은 샘플에는 LLOD(검출 하한선)에 해당하는 ≤0.9 카피/μl 값이 할당되었다. 비강 면봉, 인후 면봉, BAL 및 혈액 샘플 추출 샘플의 경우, 이는 1.29 × 104 카피/ml의 LLOQ 및 1.16 × 103 카피/ml의 LLOD에 해당한다. 조직 샘플의 경우, 이는 LLOQ 5.71 × 104 카피/g 및 LLOD 5.14 × 103 카피/g에 해당한다.
조직병리학
왼쪽 두개골 및 꼬리 폐엽, 기관, 후두, 종격동 림프절, 편도선, 심장, 흉선, 췌장, 비장, 간, 신장, 십이지장, 결장, 뇌, 백신접종 부위(피하 및 기저 근육을 포함한 피부) 및 배액(draining) 림프절(왼쪽 및 오른쪽)로부터의 조직 샘플들을 10% 중성 완충 포르말린으로 고정하고 파라핀 왁스에 포매했다. 4 μm 두께의 절편을 자르고 헤마톡실린과 에오신(HE)으로 염색했다. 조직 슬라이드는 치료 및 그룹 세부 사항에 대해 맹검된 두 명의 수의 병리학자가 독립적으로 스캔하고 검사했다.
폐의 경우, 1차 엽 기관지에서 근위, 중간 및 원위의 서로 다른 위치에서 각 왼쪽 폐 엽의 3개 섹션을 샘플링했다. 점수 시스템(Salguero et al., 2020)을 사용하여 폐 조직 섹션에서 관찰된 조직병리학적 병변을 객관적으로 평가했다. 각 조직병리학적 파라미터에 대한 점수는 동물당 평가된 6개의 폐 조직 섹션에서 관찰된 점수의 평균으로 계산되었다.
또한, RNAscope ISH(in-situ hybridization) 기술을 사용하여 두 폐엽에서 SARS-CoV-2 바이러스를 식별했다. 간단히 말해서, 조직은 10분 동안(RT) 과산화수소, 15분 동안(98-101℃) 표적 검색 및 30분 동안(40℃) 프로테아제 플러스로 사전 처리되었다(모두 Advanced Cell Diagnostics). S-단백질 유전자를 표적으로 하는 V-nCoV2019-S 프로브(Advanced Cell Diagnostics)를 40℃에서 2시간 동안 조직에서 배양하였다. 신호 증폭은 RNAscope 2.5 HD 레드 키트(Advanced Cell Diagnostics)를 사용하여 RNAscope 프로토콜(RNAscope 2.5 HD Detection Reagent - Red)에 따라 수행되었다. 각 ISH 실행에 적절한 통제가 포함되었다. 바이러스 RNA에 대해 양성인 폐 섹션의 전체 면적을 계산하기 위해, Nikon NIS-Ar 소프트웨어로 디지털 이미지 분석을 수행했다.
데이터는 CVnCoV 백신접종 동물에서 S 특이적 세포 반응의 강력한 유도를 입증한다. 8 μg의 CVnCoV 백신을 접종한 동물에서, S 단백질의 전체 길이를 커버하는 펩타이드에 대한 반응 증가가 첫 번째 및 두 번째 백신접종 후에 유도되었다. 이러한 데이터는 높은 S-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 CVnCoV의 능력을 입증한 마우스의 이전 데이터와 일치한다(예: 실시예 6 및 7). 강력한 T 세포 반응의 생성은 SARS-CoV-2에 대한 백신 효능을 뒷받침할 것이다. 최근 데이터에 따르면 CD8+ T가 붉은털 원숭이 모델에서 바이러스 통제에 기여한다는 것이 입증되었다(McMahan et al., 2020). SARS-CoV-2에 대한 T 세포 반응은 인간에서 쉽게 감지할 수 있으며 장기 보호에서 역할을 할 수 있다(Grifoni et al., 2020)(Sekine et al., 2020)(Ni et al., 2020).
증가된 스파이크 특이적 IFN-γ 반응은 챌린지 후 62-64일에 모든 동물에서 검출 가능했다(도 18 B 패널 1-4). 참고로, 8μg의 CVnCoV 백신을 접종한 동물에서 세포 반응의 증가는 다른 그룹에서보다 덜 뚜렷했으며, 이는 아마도 이 동물에서 더 낮은 수준의 바이러스 복제를 나타내는 것 같다(도 18 B 패널 3).
챌린지 감염 시 바이러스 RNA 카피의 정량화는 8μg CVnCoV 백신을 접종한 동물의 상기도에서 바이러스 복제의 감소를 입증했다. 중요하게도, 이 백신 용량은 챌린지된 동물의 폐를 보호할 수 있었다. 보호는 검출할 수 없는 수준의 바이러스 RNA와 백신접종을 하지 않은 동물과 비교하여 챌린지 시 감소된 병리학적 변화에 의해 입증되었다. 강력한 면역 반응이 있는 상태에서 상부 호흡기보다 하기도의 보호가 더 우수하다는 것은 햄스터의 결과(실시예 9) 및 NHP 챌린지 모델(Corbett et al. al., 2020) (Vogel et al., 2020)의 다른 mRNA 기반 SARS-CoV-2 백신의 결과와 일치한다.
챌린지 후 상부 및 하기도 내 SARS-CoV-2 총 RNA 또는 존재를 qRT-PCR을 통해 모니터링했다(도 19). 상기도에서의 바이러스 복제는 백신접종되지 않은 동물에서 59일에 최고조에 달했으며, 이는 비강 면봉에서 2.7 × 107 cp/ml의 중앙값에 도달했고(도 19A) 62-64일에 종료될 때까지 검출가능한 상태로 유지되었다. 0.5μg CVnCoV 백신을 접종한 동물과 백신접종하지 않은 대조군 동물의 바이러스 복제 사이에 유의미한 차이가 코 면봉에서 측정되지 않았다. 전반적으로, 8μg CVnCoV 백신접종은 상기도에서 가장 낮은 수의 바이러스 RNA 복제를 유도했으며, 비강 면봉에서 각각 2.9 × 106 cp/ml의 중앙값이 59일째에 검출 가능했다. 그러나 연구 그룹 간의 차이 통계적으로 유의하지 않았다. 인후 면봉에서 유사한 결과가 생성되었다(도 20A).
바이러스 복제를 나타내는 qRT PCR을 통해 서브게놈(sg) RNA를 평가하는 추가 분석은 상부 호흡기에서 전반적으로 낮은 sgRNA 수준을 산출했다. 값은 모든 동물에서 59일에 최고조에 이르렀고, 62일에 기준선으로 돌아갔다. 비강 면봉에서, sg RNA 수준은 백신 미접종 대조군 동물의 3.7 × 104 cp/ml에 비해 0.4 × 104의 값으로 CVnCoV 백신을 접종한 동물에서 가장 낮았다. 8 μg CVnCoV 백신접종 그룹의 동물 6마리 중 3마리는 모든 시점에서 음성을 유지한 반면, 백신 미접종 그룹의 동물 5/6은 검출 가능한 수준의 서브게놈 바이러스 RNA를 가졌다(도 19D). 인후 면봉의 분석은 그룹 간의 서브게놈 RNA의 유의미한 차이를 나타내지 않았고, 중앙값은 모든 동물에서 정량의 하한 미만으로 유지되었다(도 20B).
생존 (59일) 및 사후(62-64일) 기관지폐포 세척액(BAL) 샘플의 하기도의 병렬 분석은 두 시점 모두에서 8μg CVnCoV 백신접종 시 총 바이러스 RNA 수준이 유의하게 감소한 것으로 나타났다(도 19B). 59일과 62-64일에 총 RNA의 중앙값은 대조군에서 4.3 × 106 및 1.1 × 105 cp/ml인 반면, 8㎍의 CVnCoV 백신을 접종한 동물은 각각 0.6 × 104 및 0.3 × 104의 중앙값 역가를 나타냈다. BAL의 RNA 수준은 59일째에 8μg CVnCoV 그룹에서 한 마리를 제외한 모든 동물에서 정량 하한선 미만이었고, 이는 낮은 RNA 수를 특징화했다. 0.5μg CVnCoV 백신접종한 동물의 총 바이러스 RNA 수준은 대조군과 비슷했다. 참고로, 59일째의 BAL 분석은 백신 미접종 그룹의 암컷 동물들과 수컷 한 마리만 나타낸다. 추가 평가를 방해하는 차선의 BAL 샘플링 조건이 선택되었기 때문에, 나머지 동물은 이 분석에서 제외되었다.
부검에서 수집된 폐 조직의 분석은 BAL 샘플에서 얻은 결과를 확인했다. 2.9 × 108 cp/g의 중앙값 역가는 백신 미접종 그룹에서 검출할 수 있었던 반면, CVnCoV 8 μg 백신을 접종한 그룹의 모든 동물은 정량화 하한 미만으로 유지되었다(도 19C). 0.5 μg CVnCoV의 동물과 백신 미접종 그룹 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다.
백신 안전성 측면에서, CVnCoV 0.5μg 또는 8μg 주사는 백신접종에 대한 부작용을 일으키지 않았고, 연구의 백신접종 단계에서 그룹 간에 체중이나 온도의 차이가 관찰되지 않아(데이터는 표시되지 않음) 사용된 용량에서 붉은털 원숭이에서 백신의 양호한 안전성 프로파일을 뒷받침한다. 또한, 이 연구에서는 백신 강화 질병의 징후가 검출되지 않았다.
BAL 및 폐 조직 샘플에서 서브게놈 바이러스 RNA 분석은 유사한 결과를 산출했다. 복제 바이러스를 나타내는 RNA는 각각 59일 및 62-64일에 백신 미접종 동물 및 0.5μg CVnCoV 백신 접종된 동물의 BAL 및 폐 샘플에서 검출 가능했다. 8 μg CVnCoV 그룹의 모든 동물은 이러한 분석에서 음성이었다(도 19 E 및 F).
부검에서 수집된 추가 조직 샘플의 평가에서는, 0.5μg CVnCoV 및 백신 미접종 동물의 기관 및 편도선에서 SARS-CoV-2 총 RNA의 낮지만 감지가능한 신호가 밝혀진 반면, 8μg CVnCoV 백신접종 동물은 음성으로 남아 있었다(도 20 C 및 D). 어떤 그룹에서도 비장, 십이지장, 결장, 간 또는 신장에서 바이러스 RNA가 검출되지 않았다(도 20 E-I).
부검 시 채취한 폐 샘플의 조직병리학적 분석은 챌린지 동물의 폐에서 SARS-CoV-2 감염과 일치하는 병변을 보여주었다(도 21). 간단히 말해서, 폐 실질은 영향을 받지 않은 실질로 둘러싸인 폐렴의 융합 영역(coalescing area)에 다병소(multifocal)을 보여주었다. 폐포의 괴사를 동반한 폐포 손상은 영향을 받은 부위에서 두드러진 특징이었다. 이 영역 내의 폐포 공간은 종종 두꺼워지고, 손상된 폐포 벽에는 혼합 염증 세포(대식세포, 림프구, 생존 및 퇴행성 호중구, 때때로 호산구 포함)가 포함되어 있었다. 폐포 부종과 폐포 II형 폐세포 증식도 관찰되었다. 말단 세기관지 및 세기관지-폐포 접합부에서, 상피 세포의 변성 및 박리가 존재하였다. 더 큰 기도에서, 때때로, 국소, 상피 변성 및 박리가 호흡기 상피에서 관찰되었다. 호중구, 림프구 세포, 때때로 호산구를 포함하는, 적은 수의 혼합 염증 세포가 기관지 및 세기관지 벽에 침윤되었다. 일부 기도의 내강에서는, 퇴화 세포, 주로 호중구 및 상피 세포와 혼합된 점액이 관찰되었다. 실질 내에서, 혈관주위 및 세기관지주위 커핑(cuffing)도 관찰되었으며, 대부분 림프성 세포들이 침윤물을 포함하였다. 비폐 조직에서는 현저한 변화가 관찰되지 않았다.
감소된 수준의 바이러스 RNA와 일치하여, 조직병리학 스코어링 시스템을 사용한 폐 샘플의 평가는 0.5㎍ CVnCoV 백신 접종 및 미접종 그룹과 비교하여 CVnCoV 백신 접종 동물에서 폐 병변의 중증도의 유의한 감소를 보여주었다(도 22 A 및 B).
바이러스 RNA는 폐포 상피 세포 내 및 염증 세포 침윤물 이내에서 관찰되었다(도 21). in situ 교잡(ISH)에 의해 관찰된 바이러스 RNA의 양은 또한 0.5㎍ CVnCoV 및 백신 미접종 동물과 비교할 때 8㎍ CVnCoV 백신접종 동물에서 상당히 감소하였다(도 22C).
완전한 폐에서 SARS-CoV-2 감염 시 유도된 병리학적 변화에 대한 생존 중 관찰(view)을 얻기 위해, 시험 61일째 챌린지 전 및 챌린지 후에 CT 스캔을 수행했다. 전반적으로, 질병의 겉보기 수준은 상대적으로 경미하고 폐의 25% 미만에만 영향을 미쳤다. 챌린지 후, 0.5μg CVnCoV 그룹의 동물 6마리 중 6마리에서 폐의 이상이 발견되었고, 백신 미접종 대조군에서는 6마리 중 5마리에서 폐의 이상이 검출된 반면, 8μg CVnCoV 백신을 접종한 동물은 3/6만이 감지가능한 변화를 보였다. CT 스캔에서 총 점수의 가장 낮은 수준은 8㎍의 CVnCoV로 백신접종된 동물에서 관찰되었다(도 22D). 참고로, 이 분석에서 0.5μg CVnCoV 그룹에서 가장 높은 점수가 나타났다. 그러나 값은 대조군과 통계적으로 다르지 않았다.
챌린지 후 임상 징후의 평가에서 질병이 강화되었다는 징후는 검출되지 않았으며, 조성물은 붉은털 원숭이에서 면역원성이 높은 것으로 밝혀졌다. 챌린지 후 그룹 간에 체중이나 체온의 명확한 차이 또는 열의 징후는 없었다. 백신 강화 질병은 고양이 코로나바이러스(Olsen et al., 1992)에 대해 이전에 기술된 바와 같이 항체(항체 의존적 강화 질병, ADE ((Lee et al., 2020)에서 리뷰됨)에 의해 유발될 수 있다. 이러한 항체는 대부분 중화되지 않는 활성을 가지며, 바이러스 유입을 증가시켜 바이러스 복제를 증가시키고 질병을 악화시킨다. 여기에 제시된 결과는 CVnCoV 백신을 접종한 동물에서 증가된 바이러스 복제의 징후를 나타내지 않는다. 중요하게는, 호흡기관 또는 비장, 십이지장, 결장, 간 또는 신장과 같은 말단 기관에서의 향상된 복제도 연구의 0.5μg 그룹에서 검출되지 않았다. 이 동물들은 낮은 수준의 S 결합을 특징으로 하지만 챌린지 감염 시 VNT의 감지할 수 없는 수준을 나타내어 ADE가 가설적으로 발생할 수 있는 조건을 만든다.
질병 강화의 또 다른 원인은 TH2 편향 면역 반응과 중화 항체에 대한 비중화 항체의 높은 비율로 인한 염증 증가를 특징으로 하는 백신 관련 강화 호흡기 질환(vaccine-associated enhanced respiratory disease, VAERD)일 수 있다((Graham, 2020), (Lee et al., 2020), (Smatti et al., 2018)에서 리뷰됨). CVnCoV 백신을 접종한 동물의 폐 병리학 분석은 8 μg CVnCoV의 보호성을 보여주었으며, 최선이 아니게(suboptimally) 투여된 동물에서 염증 증가 및 병리학적 변화에 대한 징후를 나타내지 않았다.
이 결과는 SARS-CoV-2와 관련성이 높은 모델 시스템에서 CVnCoV 안전성, 면역원성 및 보호 효능에 대한 우리의 지식을 확장한다. 면역원성, 보호 효능 및 병리학 측면에서 비인간 영장류에 대한 연구의 전체 결과는 햄스터 모델(실시예 9 참조)의 결과와 유사하여, SARS-CoV에 대한 모델 시스템으로서 햄스터에 대한 지지를 제공한다. 따라서 CVnCoV는 COVID-19 NHP 챌린지 모델에서 8μg의 낮은 용량에서 매우 효과적이며, 질병 강화의 징후가 없이 테스트된 두 용량 모두에서 안전하다.
또 다른 유사한 NHP 연구에서, 3' 말단(hSL-A100) 및 UTR 조합 (a-1(HSD17B4/PSMB3))(R9709)의 본 발명의 형태를 포함하는, LNP에서 제형화된 S_stab을 암호화하는 mRNA를 포함하는 백신 조성물을 분석하고 CVnCoV (R9515)와 비교한다.
실시예 16 : LNP에서 제형화된 SARS-CoV-2 항원 S_stab을 코딩하는 mRNA로 마우스의 백신접종
본 실시예는 개선된 비코딩 영역을 포함하는 mRNA를 갖는 SARS-CoV-2 S mRNA 백신이 강한 면역 반응을 유도함을 보여준다. 일부 추가 마우스 그룹은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 (N(1)-메틸슈도우리딘, m1ψ)를 포함하는 mRNA 백신 조성물을 받았다. 한 그룹의 마우스는 대체 캡(3'OME Clean Cap)으로 생성된 mRNA를 포함하는 mRNA 백신 조성물을 받았다. 자세한 내용은 표 22에 나와 있다.
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 자극
인간 PBMC의 준비
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 표준 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리(Ficoll 1.078g/ml)에 의해 익명 기증자의 전혈에서 분리되었다. PBMC를 PBS로 세척되었고, 20% 열-불활성화 FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640에 재현탁했다. 계수 후, 세포를 소태아 혈청, 10% DMSO에 ml당 5천만 개 세포로 재현탁시키고 동결시켰다. 사용하기 전에 세포를 해동하였다.
PBMC 자극
PBMC는 37℃에서 가습된 5% CO2 분위기에서 200μl의 총 부피 내에 4×105 세포의 밀도로 10μg/ml의 LNP-제형화된 mRNA(표 22, 행 B-M)로 자극되었다. 백그라운드 자극을 정량화하기 위해, PBMC를 배지만으로 인큐베이션하였다(표 22, A행). 형질감염 24시간 후, 상청액을 수집하였다.
사이토카인 수준의 정량화
인간 IFNa는 제조업체의 지침에 따라 PBL의 IFNa ELISA를 사용하여 정량화되었다. PBMC 상층액을 1:20 또는 1:40 희석으로 사용하고 희석액 50μl를 미리 채워진 완충액 50μl에 첨가한다.
면역:
암컷 BALB/c 마우스(6-8주령, n = 8)에 표 22에 표시된 mRNA 백신 조성물을 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 한 그룹의 마우스에 완충액(그룹 A)을 백신접종하였다. 모든 동물을 0일 및 21일에 백신접종하였다. 항체 역가의 결정을 위해 21일(프라임 후) 및 42일(부스트 후)에 혈액 샘플을 수집하고, T-세포 분석을 위해 42일에 비장세포를 단리하였다.
백신접종 요법(실시예 16):
그룹 백신 조성물 mRNA ID CDS opt. 5'-UTR/
3'-UTR;
UTR 디자인 		3'-말단 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA 용량 수정 뉴클레오티드
A 완충액 - - - - -
B LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 -/muag A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 1μg -
C LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 1μg -
D LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10153 opt1 HSD17B4/ PSMB3 A100 10 24837 1μg -
E LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10154 opt1 -/muag A100 10 25717 1μg -
F LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10155 opt1 Rpl31/RPS9 hSL-A100 10 23957 1μg -
G LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10156 opt1 Rpl31/RPS9 A100 10 25277 1μg -
H LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10157 opt1 -/muag A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 1μg m1ψ
I LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10158 opt1 -/muag hSL-A100 10 24397 1μg m1ψ
J LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10159 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 1μg m1ψ
K LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10160* opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 1μg -
L LNP로 제형화된, S 코딩 mRNA R10161* opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 1 148 1μg -
M LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10162 opt10 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 151 1μg m1ψ
*mRNA R10160(그룹 K) 및 R10161(그룹 L)은 3'OME Clean Cap으로 생산되었다.
ELISA를 사용한 IgG1 및 IgG2 항체 역가의 측정 및 CPE(세포변성(cytopathic) 효과)를 통한 바이러스 중화 역가를 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다. 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의한 T-세포 분석은 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과:
도 23에 나타낸 바와 같이, 전장 S 안정화 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA는 인간 PBMC에서 상이한 수준의 IFNa를 유도하였다. 대부분의 컨스트럭트에 대해 중간 수준의 INFα가 유도된 반면, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 LNP-제형화된 mRNA는 INFα를 유도하지 않았다.
개선된 비암호화 영역을 포함하는 전장 S 안정화 단백질(S_stab)을 코딩하는 mRNA를 사용한 백신접종은 제1 백신접종 후 21일째에 이미 강한 수준의 바이러스 중화 항체 역가(VNT)를 유도하였다(도 23B에 도시됨). 3' 말단 "hSL-A100" 또는 "A-100"(그룹 C-G, I-M)을 포함하는 mRNA를 갖는 모든 mRNA 백신 조성물은 VNT의 개선된, 빠르고 강력한 유도를 보여주었다. 이러한 컨스트럭트에서, 폴리(A) 서열은 RNA의 3' 말단에 직접 위치한다.
화학적으로 변형된 뉴클레오티드(그룹 H, I, J, M)의 도입은 유사한 VNT로 이어졌다.
42일째에 두 번째 백신접종 후(도 23C에 나타냄), 대부분의 mRNA 백신은 높은 역가의 VNT의 강력한 유도를 보여준다. 또한 3' 말단 A64-N5-C30-hSL-N5(그룹 B)를 갖는 mRNA를 포함하는 백신 조성물인 CVnCoV는 매우 높은 양의 VNT를 유도하였다. 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(m1ψ, 그룹 H)의 도입은 수준을 감소시켰다. 3' 말단 "hSL-A100" 또는 "A-100"(그룹 C-G, I-M)을 포함하는 mRNA를 갖는 모든 mRNA 백신 조성물은, m1ψ의 사용 여부에 관계없이, VNT의 개선된, 빠르고 강력한 유도를 보여주었다. 이러한 컨스트럭트에서 폴리(A) 서열은 RNA의 3' 말단에 직접 위치한다.
실시예 17 : LNP에서 제형화된 SARS-CoV-2 항원 S_stab을 코딩하는 mRNA로 마우스의 백신접종
본 실시예는 개선된 비암호화 영역을 포함하는 mRNA를 갖는 SARS-CoV-2 S mRNA 백신이 강한 면역 반응을 유도함을 보여준다. 이 연구는 "프라임만"과 "프라임-부스트" 백신 요법을 비교한다. 일부 그룹의 마우스에는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(N(1)-메틸슈도우리딘, m1ψ)를 포함하는 mRNA 백신 조성물이 제공되었다. 자세한 내용은 표 23에 나와 있다.
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
면역:
암컷 BALB/c 마우스(6-8주령, n=8)에 표 23에 나타낸 mRNA 백신 조성물을 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 한 그룹의 마우스에 완충액(그룹 K)을 백신접종하였다. 동물은 0일째에 1회(그룹 A-E), 또는 0일 및 21일에 2회(그룹 F-J) 백신을 접종하였다. 혈액 샘플은 항체 역가의 결정을 위해 21일 및 42일에 수집되었고, 비장세포는 T-세포 분석을 위해 42일에 분리되었다.
백신접종 요법(실시예 17):
그룹 백신 조성물 mRNA ID CDS opt. 5'-UTR/
3'-UTR;
UTR 디자인 		3'-말단 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA 용량 수정 뉴클레오티드
A LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 -/muag A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 1㎍day0 -
B LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 1㎍day0 -
C LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10157 opt1 -/muag A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 1㎍day0 m1ψ
D LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10159 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 1㎍day0 m1ψ
E LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10162 opt10 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 151 1㎍day0 m1ψ
F LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 -/muag A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 1㎍day0
day21		 -
G LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 1㎍day0
day21		 -
H LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10157 opt1 -/muag A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 1㎍day0
day21		 m1ψ
I LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10159 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 1㎍day0
day21		 m1ψ
J LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R10162 opt10 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 151 1㎍day0
day21		 m1ψ
K 완충액 - - - - day0day21 -
CPE(세포변성 효과)를 통한 바이러스 중화 역가의 결정을 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다. 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의한 T-세포 분석을 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과:
도 24A는 단 1회의 백신접종 후 VNT의 유도를 나타낸다. 실시예 17에서 나타낸 바와 같이, 3' 말단 "hSL-A100" 또는 "A-100"(그룹 A, D, E, G, I 및 J)을 포함하는 mRNA를 갖는 mRNA 백신 조성물은 개선된, 빠르고 강력한 VNT의 유도를 보여주었다. 이러한 컨스트럭트에서, 폴리(A) 서열은 RNA의 3' 말단에 직접 위치한다.
도 24B는 42일째에 단 1회의 백신접종 후(그룹 A-E) 또는 2회 백신접종 후(그룹 F-J) VNT의 유도를 입증한다. R9709(그룹 B)를 포함하는 mRNA 백신 조성물은 단 1회의 백신접종을 받은 그룹 사이에서 가장 두드러진 VNT 역가를 유도하였다. R9709를 포함하는 백신 조성물의 강도는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 대상체의 치료 또는 예방을 위해 상기 조성물 또는 백신의 단 1회 용량을 포함하는 면역화 프로토콜을 뒷받침할 수 있다.
3' 말단 "hSL-A100" 또는 "A-100"(그룹 A, D, E, G, I 및 J)을 포함하는 mRNA를 갖는 mRNA 백신 조성물은 VNT의 개선된, 빠르고 강력한 유도를 나타내었다. 이러한 컨스트럭트에서, 폴리(A) 서열은 RNA의 3' 말단에 직접 위치한다.
실시예 18 : SARS-CoV-2 감염에 대한 K18-hACE2 마우스 모델에서 mRNA 백신의 효능
마우스는 SARS-CoV-2에 감염되기 쉽지 않지만, K18 프로모터에 따라 바이러스가 숙주 세포로 들어가는 데 필요한 인간 수용체 ACE2(hACE2)를 발현하는 유전자 조작된 마우스 모델이 개발되었다. 이 모델은 원래 SARS (SARS-CoV)의 원인 인자를 조사하기 위해 개발되었지만 (MCCRAY, Paul B., et al. Lethal infection of K18-hACE2 mice infected with severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of virology, 2007, 81. Jg., Nr. 2, S. 813-821), 현재 COVID-19에 적합한 작은 동물 모델로도 사용된다. 이전에, hACE2 마우스는 SARS-CoV-2에 민감하고 체중 감소, 폐 병리 및 인간과 유사한 증상을 갖는 질병 경과를 나타내는 것으로 나타났다(예를 들어, BAO, Linlin, et al. The pathogenicity of SARS-CoV-2 in hACE2 transgenic mice. Nature, 2020, 583. Jg., Nr. 7818, S. 830-833, 또는 YINDA, Claude Kwe, et al. K18-hACE2 mice develop respiratory disease resembling severe COVID-19. PLoS pathogens, 2021, 17. Jg., Nr. 1, S. e1009195; DE ALWIS, Ruklanthi M., et al. A Single Dose of Self-Transcribing and Replicating RNA Based SARS-CoV-2 Vaccine Produces Protective Adaptive Immunity In Mice.　BioRxiv, 2020.). 원칙적으로 K18-hACE2 마우스는 SARS-CoV-2 감염 예방이나 바이러스 부하 감소를 조사하는 동시에 mRNA 백신의 COVID-19에 대한 보호 효과의 상관관계와 원인을 조사하기 위한 백신 연구에 적합하며, 이는 일반적으로 마우스 모델에서 사용할 수 있는 잘 정립된 면역학적 방법이다.
본 실시예는 SARS-CoV-2 S mRNA 백신이 K18-hACE2 마우스에서 강한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도함을 보여준다. SARS-CoV-2 S mRNA 백신은 SARS-CoV-2 바이러스 챌린지로부터 K18-hACE2 마우스를 보호하며, 이것은 감염된 동물의 바이러스 부하를 측정하거나, 체중 감소, 폐 병리 및 기타 증상을 가진 질병 진행을 모니터링하거나, 또는 조직병리학 및 생존에 의해 보여질 수 있다.
LNP 제형화된 mRNA 백신의 제조:
SARS-CoV-2 S mRNA 컨스트럭트는 실시예 1(RNA 시험관내 전사)에 기재된 바와 같이 제조된다. HPLC 정제된 mRNA는 생체내 백신접종 실험에서 사용하기 전에 실시예 1.4에 따라 LNP로 제형화되었다.
면역 및 챌린지:
K18-hACE2 마우스에 표 24에 나타낸 mRNA 백신 조성 및 용량을 근육내(i.m.) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 한 그룹은 완충액으로 백신접종하였다. 대조군으로 한 그룹에 Alum이 애주번트 보강된 포르말린-비활성화 SARS-CoV-2 바이러스(106 PFU) 20μl를 근육 주사한다. 모든 동물은 0일 및 28일에 백신접종을 받았다. 항체 역가를 결정하기 위해 0일, 28일(프라임 후) 및 56일(부스트 후, 챌린지 전)에 혈액 샘플을 수집하였다. 동물은 56일째에, 예를 들어 105 PFU SARS-CoV-2 (Bavaria 1)로 비강내로 챌린지된다. 챌린지 후 4 내지 10일 동안 동물을 관찰했다.
백신접종 요법(실시예 18):
그룹 백신 조성물 mRNA ID CDS opt. 5'-UTR/
3'-UTR;
UTR 디자인 		3'-말단 서열 번호: 단백질 서열 번호: RNA 용량
A 완충액 - - - - 20 ㎕
B LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9515 opt1 -/muag; A64-N5-C30-hSL-N5 10 163 8㎍
C LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 8㎍
D LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 2㎍
E LNP로 제형화된, S_stab 코딩 mRNA R9709 opt1 HSD17B4/ PSMB3 hSL-A100 10 149 0,5㎍
F 포르말린-비활성화 바이러스 + Alum - - - - - - 106 PFU, 20㎕,
ELISA를 사용한 IgG1 및 IgG2 항체 역가의 결정, CPE(세포변성 효과) 기반 미세중화 검정을 통한 바이러스 중화 역가의 결정 및 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의한 T-세포 분석을 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다.
본 실시예에 기재된 바와 같은 K18-hACE2 마우스의 면역화 및 챌린지는 추가적인 본 발명의 mRNA 컨스트럭트 및 조성물의 보호 효능을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 또한, SARS-CoV-2의 돌연변이된 바이러스 변이체 또는 분리주(예: B.1.351, 또한 표 25 참조)를 사용함으로써, 본 발명의 mRNA 백신 조성물이 이러한 돌연변이된 바이러스 변이체 또는 분리주에 대해 추가로 효과적임을 나타낼 수 있다.
실시예 19 : 신종 SARS-CoV-2 변이체에 대한 mRNA 백신의 중화 활성
2μg, 4μg, 8μg 또는 12μg CVnCoV(임상 연구 개요에 관한 실시예 10 참조)의 2회 용량을 투여받은 20명의 1상 임상 시험 참가자(18-60세, 남성 및 여성)의 혈청의 중화 활성은 새로운 SARS-CoV-2 변이체 또는 분리주에 대해 시험된다. 혈청 샘플은 임상 연구의 36일, 43일 또는 57일에 얻었고, 10-1280 (MN 25TCID50) 범위에서 바이러스 중화 항체 역가(VNT)를 나타냈으며, 이는 샘플이 낮은(10-20) 및 높은(452-1280) VNT를 가짐을 나타낸다.
VNT는 예를 들어 실시예 9에서 햄스터 혈청의 분석을 위해 설명된 대로 분석되고, 그것에 의하여 혈청 샘플은 신종 바이러스 변이체와 함께 인큐베이션된다. SARS-CoV-2/human/ITA/INMI1/2020 균주 또는 UVE/SARS-CoV-2/2020/FR/702 균주를 참조("야생형 균주")로 사용할 수 있다. 분석을 위한 새로운 SARS-CoV-2 변이체 또는 분리주가 표 25에 나열되어 있다. 추가 변이체가 발생할 수 있으며 테스트될 수 있다.
새로운 SARS-CoV-2 변이체들의 목록(실시예 19):
변이체(Variant) 스파이크 단백질 내 아미노산 변화
Mink Cluster 5 variant GISAID: EPI_ISL_616802 (hCoV-19/Denmark/DCGC-3024/2020) delH69, delV70, Y453F, D614G, I692V, M1229I
B.1.1.7 (a.k.a., 20B/501Y.V1, 501Y.V1, Variant of Concern-202012/01, VOC-202012/01, VUI-202012/01, B117, "UK variant") delH69, delV70, delY144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H
B.1.351 (a.k.a., 20C/501Y.V2, 501Y.V2, N501Y.V2, "SA variant", "South Africa variant") L18F, D80A, D215G, delL242, delA243, delL244, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V
P.1 (a.k.a., "Brazil variant" = "Japan variant") L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I
CAL.20C (a.k.a., "California variant")
NCBI: QQN00429.1 (CAL.20.C example: SARS-CoV-2/human/USA/CA-LACPHL-AF00114/2021)		 S13I, W152C, L452R, D614G
중화는 또한 SARS-CoV-2 변이체 균주에 존재하는 스파이크 돌연변이를 통합하는 재조합 VSV- 또는 렌티바이러스-기반 슈도바이러스 중화(PsVN) 분석으로 측정할 수 있다.
결합 항체의 능력은 예를 들어 신생 바이러스 변이체의 돌연변이를 특징으로 하는 코팅용 재조합 스파이크 단백질을 가진 상기 실시예 10에서 설명된 바와 같이 ELISA 분석으로 시험될 수 있다.
mRNA 백신의 효능은 또한 예를 들어 hACE-마우스에 대한 실시예 17, NHP에 대한 실시예 15, 및 챌린지 감염을 위해 신종 SARS-Cov-2 변이체를 사용하는 햄스터에 대한 실시예 9에서 설명된 바와 같이, 챌린지 모델로 테스트될 수 있다.

Claims (275)

  1. SARS-CoV-2 코로나바이러스로부터인 또는 이로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 핵산으로서, 여기서 핵산은 적어도 하나의 이종 비번역 영역(UTR)을 포함하는 핵산.
  2. 청구항 1에 있어서, 핵산이 백신에 적합한 것인 핵산.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 구조 단백질(structural protein), 부속 단백질(accessory protein) 또는 레플리카제 단백질이거나 그로부터 유래된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  4. 청구항 3에 있어서, 구조 단백질이 스파이크 단백질(S), 외피 단백질(E), 막 단백질(M) 또는 뉴클레오캡시드 단백질(N), 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체이거나 이로부터 유래된 핵산.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 스파이크 단백질(S), 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체이거나 이로부터 유래된 핵산.
  6. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 1-111, 274-11663, 13176-13510, 13521-14123, 22732-22758, 22917, 22923, 22929-22964, 26938, 26939 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
  7. 청구항 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 스파이크 단백질(S)이 스파이크 단백질 단편 S1, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
  8. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 1-27, 29, 31-48, 58-111, 274-1345, 1480-1546, 1614-11663, 13377-13510, 13521-14123, 22732, 22737-22758, 22929-22964 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
  9. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 27, 1279-1345, 29, 1480-1546, 13243-13309, 22733-22736, 26938, 26939 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
  10. 청구항 4 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 스파이크 단백질(S)이 스파이크 단백질 단편 S1 또는 그의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체, 및 스파이크 단백질 단편 S2 또는 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
  11. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 1-26, 31-48, 58-111, 274-1278, 1614-11663, 13377-13510, 13521-14177, 22732, 22737-22758, 22929-22964 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산.
  12. 청구항 4 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 스파이크 단백질(S)이 적어도 하나의 융합전(pre-fusion) 안정화 돌연변이를 포함하는 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)인 핵산.
  13. 청구항 12에 있어서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이는 K986P 및 V987P의 아미노산 치환을 포함하는 것인 핵산.
  14. 청구항 12 또는 13에 있어서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이가 공동 충전(cavity filling) 돌연변이를 포함하는 핵산.
  15. 청구항 14에 있어서, 적어도 하나의 공동 충전 돌연변이가 T887W; A1020W; T887W 및 A1020W; 또는 P1069F을 포함하는 리스트로부터 선택되는 핵산.
  16. 청구항 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이가 돌연변이된 양성자화 부위를 포함하는 핵산.
  17. 청구항 16에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이된 양성자화 부위가 H1048Q 및 H1064N; H1083N 및 H1101N; 또는 H1048Q 및 H1064N 및 H1083N 및 H1101N을 포함하는 리스트로부터 선택되는 핵산.
  18. 청구항 12 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 융합전 안정화 돌연변이가 하나 이상의 인공 분자내 이황화 결합을 생성하는 핵산.
  19. 청구항 18에 있어서, 적어도 하나의 인공 분자내 이황화 결합이 I712C 및 T1077C; I714C 및 Y1110C; P715C 및 P1069C; G889C 및 L1034C; I909C 및 Y1047C; Q965C 및 S1003C; F970C 및 G999C; A972C 및 R995C; A890C 및 V1040C; T874C 및 S1055C, 또는 N914C 및 S1123C인 아미노산 치환에 의해 생성되는 것인 핵산.
  20. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 10-26, 40-48, 85-111, 341-1278, 1681-2618, 2686-3623, 3691-4628, 4696-5633, 5701-6638, 6706-7643, 7711-8648, 8716-9653, 9721-10658, 10726-11663, 13377-13510, 13521-14123, 22732, 22738, 22740, 22742, 22744, 22746, 22748, 22750, 22752, 22754, 22756, 22758, 22947-22964 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  21. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 10-26, 341-407, 609-1278, 13521-13587, 22738, 22740, 22742, 22744, 22746, 22748, 22750, 22752, 22754, 22756, 22758, 22947-22964 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  22. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 신호 펩티드, 링커, 헬퍼 에피토프, 항원 클러스터링 요소, 삼량체화 요소, 막횡단 요소, 및/또는 VLP-형성 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 이종성 펩티드 또는 단백질 요소를 추가로 코딩하는 것인 핵산.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종성 펩티드 또는 단백질 요소가 이종 항원-클러스터링 요소, 이종 삼량체화 요소, 및/또는 VLP-형성 서열인 핵산.
  24. 청구항 22 또는 23에 있어서, 적어도 하나의 이종 항원 클러스터링 요소가 페리틴 요소, 루마진 신타제 요소, B형 간염 바이러스(HBsAg)의 표면 항원, 또는 캡슐린으로부터 선택되는 핵산.
  25. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 58-75, 85-102, 3624-5633, 7644-9653, 13588-13721, 13856-13989, 22733, 22735, 22736 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  26. 청구항 22 또는 23에 있어서, 적어도 하나의 이종 삼량체화 요소가 폴돈 요소, 바람직하게는 피브리틴 폴돈 요소인 핵산.
  27. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 76-84, 103-111, 5634-6638, 9654-10658, 13722-13788, 13990-14056, 22734, 26938, 26939 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  28. 청구항 22 또는 23에 있어서, 적어도 하나의 VLP-형성 서열이 우드척 간염 코어 항원 요소(WhcAg)인 핵산.
  29. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 6639-7643, 10659-11663, 13789-13855, 14057-14123 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  30. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 1, 10, 21, 22, 25, 27, 274, 341, 408, 475, 542, 743, 810, 1011, 1145, 1212, 1279, 8716, 10726, 22732-22758, 22929-22942, 22947-22964 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  31. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질이 서열 번호: 10, 22960, 22961 또는 22963 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  32. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 116-132, 134-138, 140-143, 145-175, 11664-11813, 11815, 11817-12050, 12052, 12054-13147, 13514, 13515, 13519, 13520, 14124-14177, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23184, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937 또는 이들 중 임의의 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  33. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 서열 번호: 10, 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 융합전 안정화 K986P 및 V987P 돌연변이를 포함하는 S 단백질인 핵산.
  34. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 코돈 변형된 코딩 서열이고, 여기서 적어도 하나의 코돈 변형된 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 바람직하게는 상응하는 야생형 또는 참조 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는 것인 핵산.
  35. 청구항 34에 있어서, 적어도 하나의 코돈 변형된 코딩 서열이 C 최대화된 코딩 서열, CAI 최대화된 코딩 서열, 인간 코돈 사용(usage)에 적합한 코딩 서열, G/C 함량 변형된 코딩 서열, 및 G/C 최적화된 코딩 서열, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 핵산.
  36. 청구항 34 또는 35에 있어서, 적어도 하나의 코돈 변형된 코딩 서열이 G/C 최적화된 코딩 서열, 인간 코돈 사용에 적합한 코딩 서열, 또는 G/C 함량 변형된 코딩 서열인 핵산.
  37. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 136-138, 140, 141, 148, 149, 152, 155, 156, 159, 162, 163, 166, 169, 170, 173, 11731-11813, 11815, 11817-11966, 12271-12472, 12743-12944, 13514, 13515, 14124-14132, 14142-14150, 14160-14168, 22759, 22764-22786, 22791-22813, 22818-22839, 22969-23040, 23077-23148, 23189-23260, 23297-23368, 23409-23480, 23517-23588, 23629-23700, 23737-23808, 23849-23920, 23957-24028, 24069-24140, 24177-24248, 24289-24360, 24397-24468, 24509-24580, 24617-24688, 24729-24800, 24837-24908, 24949-25020, 25057-25128, 25169-25240, 25277-25348, 25389-25460, 25497-25568, 25609-25680, 25717-25788, 25829-25900, 25937-26008, 26049-26120, 26157-26228, 26269-26340, 26377-26448, 26489-26560, 26597-26668, 26709-26780, 26817-26888, 26925-26937 또는 이들 서열의 임의의 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 G/C 최적화된 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  38. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 142, 143, 145, 150, 153, 157, 160, 164, 167, 171, 174, 11967-12033, 12473-12539, 12945-13011 또는 이들 서열의 임의의 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 인간 코돈 사용에 적합한 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  39. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 146, 147, 151, 154, 158, 161, 165, 168, 172, 175, 12034-12050, 12052, 12054-12203, 12540-12675, 13012-13147, 13519, 13520, 14133-14141, 14151-14159, 14169-14177, 23041-23076, 23149-23184, 23261-23296, 23369-23404, 23481-23516, 23589-23624, 23701-23736, 23809-23844, 23921-23956, 24029-24064, 24141-24176, 24249-24284, 24361-24396, 24469-24504, 24581-24616, 24689-24724, 24801-24836, 24909-24944, 25021-25056, 25129-25164, 25241-25276, 25349-25384, 25461-25496, 25569-25604, 25681-25716, 25789-25824, 25901-25936, 26009-26044, 26121-26156, 26229-26264, 26341-26376, 26449-26484, 26561-26596, 26669-26704, 26781-26816, 26889-26924 또는 이들 서열의 임의의 것의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 G/C 함량 변형된 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  40. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 적어도 약 50%, 55%, 또는 60%, 바람직하게는 약 63.9%의 G/C 함량을 갖는 핵산.
  41. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 코딩 서열은 융합전 안정화 K986P 및 V987P 돌연변이를 포함하는 S 단백질을 코딩하고, 여기서 코딩 서열은 서열 번호 137, 23090, 23091, 23093, 23094 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일한 핵산 서열을 포함하는 G/C 최적화된 코딩 서열을 포함하거나 이로 구성된 것인 핵산.
  42. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 이종성 비번역 영역은 적어도 하나의 이종성 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종성 3'-UTR로부터 선택되는 핵산.
  43. 청구항 42에 있어서, 적어도 하나의 이종성 3'-UTR이 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9, 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 것인 핵산.
  44. 청구항 42에 있어서, 적어도 하나의 이종성 5'-UTR이 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B 및 UBQLN2, 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 것인 핵산.
  45. 청구항 42에 있어서, 적어도 하나의 이종성 5'-UTR 및 적어도 하나의 이종성 3' UTR이 UTR 디자인 a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-3 (SLC7A3/PSMB3), e-2 (RPL31/RPS9), 및 i-3 (-/muag)으로부터 선택되고, 여기서 UTR 디자인 a-1 (HSD17B4/PSMB3) 및 i-3 (-/muag)이 특히 바람직한 것인, 핵산.
  46. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 적어도 하나의 폴리(A) 서열, 바람직하게는 30 내지 200개의 아데노신 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 폴리(C) 서열, 바람직하게는 10 내지 40개의 시토신 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  47. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 적어도 하나의 히스톤 스템-루프를 포함하는 핵산.
  48. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 DNA 또는 RNA인 핵산.
  49. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 코딩 RNA인 핵산.
  50. 청구항 49에 있어서, 코딩 RNA가 mRNA, 자가-복제 RNA, 원형 RNA, 또는 레플리콘 RNA인 핵산.
  51. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 바람직하게는 코딩 RNA가 mRNA인 핵산.
  52. 청구항 51에 있어서, mRNA가 레플리콘 RNA 또는 자가-복제 RNA가 아닌 핵산.
  53. 청구항 51에 있어서, mRNA가 30 내지 200개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 폴리(A) 서열을 포함하고 3' 말단 뉴클레오티드가 아데노신인 핵산.
  54. 청구항 48 내지 51 중 어느 하나에 있어서, RNA, 바람직하게는 코딩 RNA가 5'-캡 구조, 바람직하게는 m7G, cap0, cap1, cap2, 변형된 cap0 또는 변형된 cap1 구조, 바람직하게는 5'-cap1 구조를 포함하는 핵산.
  55. 청구항 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 바람직하게는 mRNA가 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함하는 핵산:
    A) 5'-cap1 구조;
    B) 서열 번호: 137, 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코딩 서열;
    C) 알파-글로빈 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 267 또는 268에 따른 3'-UTR;
    D) 약 64개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열;
    E) 약 30개의 C 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(C) 서열;
    F) 서열 번호: 178 또는 179에 따른 히스톤 스템-루프.
  56. 청구항 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 바람직하게는 mRNA는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함하는 핵산:
    A) 5'-cap1 구조;
    B) HSD17B4 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 5'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 231 또는 232에 따른 5'-UTR;
    C) 서열 번호: 137, 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코딩 서열;
    D) PSMB3 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 253 또는 254에 따른 3'-UTR;
    E) 서열 번호: 178 또는 179로부터 선택된 히스톤 스템-루프;
    F) 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열.
  57. 청구항 56에 있어서, 3' 말단 뉴클레오티드가 아데노신인 핵산.
  58. 청구항 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 바람직하게는 mRNA가 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함하는 핵산:
    A) 5'-cap1 구조;
    B) 서열 번호: 23090 또는 23091, 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코딩 서열;
    C) 알파-글로빈 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 267 또는 268에 따른 3'-UTR;
    D) 약 64개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열;
    E) 약 30개의 C 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(C) 서열;
    F) 서열 번호: 178 또는 179에 따른 히스톤 스템-루프.
  59. 청구항 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 바람직하게는 mRNA가 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함하는 핵산:
    A) 5'-cap1 구조;
    B) HSD17B4 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 5'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 231 또는 232에 따른 5'-UTR;
    C) 서열 번호: 23090 또는 23091, 또는 이의 단편 또는 변이체에 따른 코딩 서열;
    D) PSMB3 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 253 또는 254에 따른 3'-UTR;
    E) 서열 번호: 178 또는 179로부터 선택된 히스톤 스템-루프;
    F) 약 100개의 A 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열.
  60. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 148-175, 12204-13147, 14142-14177, 22786-22839, 23189-23404, 23409-23624, 23629-23844, 23849-24064, 24069-24284, 24289-24504, 24509-24724, 24729-24944, 24949-25164, 25169-25384, 25389-25604, 25609-25824, 25829-26044, 26049-26264, 26269-26484, 26489-26704, 26709-26937148 또는 이들 서열 중 어느 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  61. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 149, 156, 12338, 150, 157, 151, 158, 12541, 163, 170, 12810, 164, 171, 165, 172, 13013, 12342-12351, 12545-12554, 12814-12823, 13017-13026, 14133 또는 이들 서열 중 어느 것의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 서열 번호: 149, 150, 151, 163, 164, 165 또는 이들 서열 중 어느 것의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  62. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 163 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  63. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 149 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  64. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 24837 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  65. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 23311, 23531, 24851 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  66. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 23310, 23530, 24850 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  67. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호: 23313, 23533, 24853, 23314, 23534, 24854 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
  68. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 1-메틸슈도우리딘 치환을 포함하지 않는 RNA인 핵산.
  69. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는 RNA인 핵산.
  70. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 시험관내 전사된 RNA이고, 여기서 RNA 시험관내 전사는 서열 최적화된 뉴클레오티드 혼합물 및 캡 유사체의 존재 하에 수행되며, 바람직하게는 여기서 서열 최적화된 뉴클레오티드 혼합물은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는 핵산.
  71. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 정제된 RNA, 바람직하게는 RP-HPLC 및/또는 TFF에 의해 정제된 RNA인 핵산.
  72. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RP-HPLC 및/또는 TFF에 의해 정제되고, RP-HPLC 및/또는 TFF로 정제되지 않은 RNA 대비 약 5%, 10% 또는 20% 미만의 이중 가닥 RNA 부산물을 포함하는 핵산.
  73. 앞선 청구항들 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RP-HPLC 및/또는 TFF에 의해 정제되고, Oligo dT 정제, 침전, 여과 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피로 정제된 RNA 대비 약 5%, 10% 또는 20% 미만의 이중 가닥 RNA 부산물을 포함하는 핵산.
  74. 청구항 1 내지 73 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 조성물.
  75. 청구항 74에 있어서, 조성물이 서열 번호: 149,163, 24837, 23311, 23531, 23310, 23530, 23313 또는 23533, 또는 이들 서열의 어느 것의 단편 또는 변이체에 따른 mRNA를 포함하는 조성물.
  76. 청구항 74에 있어서, 조성물은 청구항 1 내지 73 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 핵산을 복수 또는 적어도 하나 초과 포함하는 다가 조성물인 조성물.
  77. 청구항 76에 있어서, 다가 조성물의 복수 또는 적어도 하나 초과 핵산 서열은 각각 상이한 스파이크 단백질, 바람직하게는 융합전 안정화된 스파이크 단백질을 코딩하는 것인 조성물.
  78. 청구항 77에 있어서, 상이한 스파이크 단백질 또는 융합전 안정화된 스파이크 단백질이 상이한 SARS-CoV-2 바이러스 변이체/분리주로부터 유래된 것인, 조성물.
  79. 청구항 78의 조성물에 있어서, 상이한 스파이크 단백질 또는 융합전 안정화된 스파이크 단백질은 적어도 B.1.1.7, B.1.351, P.1, 또는 CAL.20C로부터 유래된 것인 조성물.
  80. 청구항 78에 있어서, 상이한 스파이크 단백질 또는 융합전 안정화된 스파이크 단백질이 다음을 포함하는 S 단백질의 아미노산 변화를 가지는 것인 조성물:
    (i) delH69, delV70, Y453F, D614G, I692V 및 M1229I;
    (ii) delH69, delV70, delY144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A 및 D1118H;
    (iii) L18F, D80A, D215G, delL242, delA243, delL244, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G 및 A701V;
    (iv) L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y and T1027I; 및/또는
    (v) S13I, W152C, L452R, 및 D614G.
  81. 청구항 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 다가 조성물은 서열 번호: 10, 22961; 22960, 22963, 22941, 22964 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 적어도 두 개의 핵산 종을 포함하는 것인 조성물.
  82. 청구항 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 다가 조성물은 서열 번호: 149 또는 24837, 23531 또는 24851, 23530 또는 24850, 23533 또는 24853, 23439 또는 24759 또는 23534 또는 24854 중 어느 것과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 적어도 두 개의 핵산 종을 포함하는 것인 조성물.
  83. 청구항 74 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 70% 이상의 RNA 완전성(integrity)을 갖는 mRNA를 포함하는 조성물.
  84. 청구항 74 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 캡핑 정도가 70% 이상인 mRNA를 포함하고, 바람직하게는 mRNA 종의 적어도 70%, 80%, 또는 90%가 Cap1 구조를 포함하는 조성물.
  85. 청구항 74 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 핵산은 하나 이상의 양이온성 또는 다가양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 또는 다가양이온성 중합체, 양이온성 또는 다중양이온성 다당, 양이온성 또는 다중양이온성 지질, 양이온성 또는 다중양이온성 단백질, 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합과 복합체화 또는 회합(associated)되거나 또는 적어도 부분적으로 복합체화 또는 회합되는 것인 조성물.
  86. 청구항 85에 있어서, 적어도 하나의 핵산이 하나 이상의 지질 또는 지질계 담체와 복합체를 형성하거나 회합되어, 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜을 형성하고, 바람직하게는 적어도 하나의 핵산을 캡슐화하는 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜을 형성하는 조성물.
  87. 청구항 85 또는 86에 있어서, 적어도 하나의 핵산이 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자를 형성하는 것인 조성물.
  88. 청구항 86 또는 87에 있어서, LNP가 화학식 III-3에 따른 양이온성 지질을 포함하는, 조성물:
    Figure pct00029
    (III-3).
  89. 청구항 86 내지 88 중 어느 한 청구항에 있어서, LNP가 하기 화학식 (IVa)의 PEG 지질을 포함하는 조성물:
    Figure pct00030
    (IVa),
    여기서 n은 30 내지 60 범위의 평균값을 갖고, 바람직하게는 n은 약 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54의 평균값을 가지며, 가장 바람직하게는 n은 49 또는 45의 평균값을 가짐.
  90. 청구항 86 내지 88 중 어느 하나에 있어서, LNP가 하기 화학식 IVa의 PEG 지질을 포함하는 조성물:
    Figure pct00031
    (IVa),
    여기서 n은 PEG 지질의 평균 분자량이 약 2500g/mol이 되도록 선택된 정수임.
  91. 청구항 86 내지 90 중 어느 하나에 있어서, LNP가 하나 이상의 중성 지질 및/또는 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 포함하는 조성물.
  92. 청구항 91에 있어서, 중성 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이고, 바람직하게는 양이온성 지질 대 DSPC의 몰비가 약 2:1 내지 약 8:1인, 조성물.
  93. 청구항 91에 있어서, 스테로이드가 콜레스테롤이고, 바람직하게는 양이온성 지질 대 콜레스테롤의 몰비가 약 2:1 내지 약 1:1 범위인 조성물.
  94. 청구항 86 내지 93 중 어느 하나에 있어서, LNP는
    (i) 적어도 하나의 양이온성 지질, 바람직하게는 화학식 III의 지질, 더욱 바람직하게는 지질 III-3;
    (ii) 적어도 하나의 중성 지질, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
    (iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 콜레스테롤; 및
    (iv) 적어도 하나의 중합체 접합 지질, 바람직하게는 화학식 IVa로부터 유도된 PEG-지질(n = 49)를 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는 것인, 조성물.
  95. 청구항 86 내지 93 중 어느 하나에 있어서, LNP는
    (i) 하나 이상의 양이온성 지질, 바람직하게는 화학식 III의 지질, 더욱 바람직하게는 지질 III-3;
    (ii) 적어도 하나의 중성 지질, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
    (iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 콜레스테롤; 및
    (iv) 적어도 하나의 중합체 접합 지질, 바람직하게는 화학식 IVa로부터 유도된 PEG-지질 (n = 45)을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는 것인, 조성물.
  96. 청구항 94 또는 95에 있어서, (i) 대 (iv)는 약 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 더욱 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비로 존재하는 조성물.
  97. 청구항 87 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 RNA이고 조성물은 약 20% 미만의 유리(복합화되지 않은 또는 캡슐화되지 않은) RNA, 바람직하게는 약 15% 미만의 유리 RNA, 더 바람직하게는 약 10% 미만의 유리 RNA를 포함하는 것인 조성물.
  98. 청구항 87 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 지질 대 핵산의 중량/중량 비는 약 10:1 내지 약 60:1, 바람직하게는 약 20:1 내지 약 30:1, 예를 들어, 약 25:1인 조성물.
  99. 청구항 87 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 핵산을 캡슐화하는 LNP의 n/p 비율은 약 1 내지 약 10의 범위, 바람직하게는 약 5 내지 약 7의 범위, 보다 바람직하게는 약 6인 조성물.
  100. 청구항 87 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 약 0.4 미만, 바람직하게는 약 0.3 미만, 보다 바람직하게는 약 0.2 미만, 가장 바람직하게는 약 0.1 미만의 다분산 지수(polydispersity index (PDI)) 값을 갖는 것인 조성물.
  101. 청구항 86 내지 100 중 어느 하나에 있어서, LNP는 약 60nm 내지 약 120nm, 바람직하게는 약 120nm 미만, 보다 바람직하게는 약 100nm 미만, 가장 바람직하게는 약 80nm 미만 범위의 Z-평균 크기를 갖는 조성물.
  102. 청구항 86 내지 101 중 어느 하나에 있어서, LNP는 입자 크기가 약 500nm를 초과하는 LNP가 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만인 것인 조성물.
  103. 청구항 86 내지 102 중 어느 하나에 있어서, LNP는 입자 크기가 약 20nm보다 작은 LNP가 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만 포함되는 것인 조성물.
  104. 청구항 86 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 지질계 담체의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%가 구형 형태를 갖고, 바람직하게는 고체 코어 또는 부분적 고체 코어를 포함하는 조성물.
  105. 청구항 86 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 약 150 FNU 내지 약 0.0 FNU, 바람직하게는 약 50 FNU 이하, 보다 바람직하게는 약 25 FNU 이하 범위의 탁도를 갖는 조성물.
  106. 청구항 74 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 약 50 내지 약 300mM 농도의 당, 바람직하게는 약 150mM 농도의 수크로스를 추가로 포함하는, 조성물.
  107. 청구항 74 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 약 10mM 내지 약 200mM 농도의 염, 바람직하게는 약 75mM 농도의 NaCl을 추가로 포함하는, 조성물.
  108. 청구항 74 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 1mM 내지 약 100mM 농도의 완충제, 바람직하게는 약 10mM 농도의 Na3PO4를 추가로 포함하는, 조성물.
  109. 청구항 74 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0, 바람직하게는 약 pH 7.4의 pH를 갖는 조성물.
  110. 청구항 86 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 융합전 안정화 K986P 및 V987P 돌연변이를 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질을 코딩하는 RNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하며,
    여기에서 LNP는
    (i) 화학식 III-3의 양이온성 지질;
    (ii) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa의 PEG-지질(n=49))을 포함하고,
    여기에서 (i) 대 (iv)는 약 47.4% 양이온성 지질, 10% DSPC, 40.9 콜레스테롤, 1.7% PEG-지질의 몰비이고;
    여기서 RNA는 서열 번호: 163 또는 149의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하며;
    여기서 RNA는 화학적으로 변형되지 않고;
    여기서 RNA는 5'-Cap1 구조를 포함하고;
    여기서 RNA의 완전성(integrity)은 적어도 약 70%이고;
    여기서 RNA를 캡슐화하는 LNP의 n/p 비는 약 6이고;
    여기서 RNA를 캡슐화하는 LNP는 약 60nm 내지 약 120nm의 Z-평균 크기를 가지며;
    상기 조성물은 약 20% 미만의 유리(비복합체; 비캡슐화) RNA를 포함하고;
    임의로, 여기서 조성물은 약 150mM 농도의 수크로스, 약 75mM 농도의 NaCl, 약 10mM 농도의 Na3PO4를 추가로 포함하고;
    임의로, 여기서 조성물은 약 pH 7.4의 pH를 갖는, 조성물.
  111. 청구항 86 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 융합전 안정화 K986P 및 V987P 돌연변이를 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질을 코딩하는 RNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하며,
    여기서 LNP는
    (i) 화학식 III-3의 양이온성 지질;
    (ii) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa의 PEG-지질(n=45))을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 47.4% 양이온성 지질, 10% DSPC, 40.9 콜레스테롤, 1.7% PEG-지질의 몰비이고;
    여기서 RNA는 서열 번호: 163 또는 149와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하고;
    여기서 RNA는 화학적으로 변형되지 않고;
    여기서 RNA는 5'-Cap1 구조를 포함하고;
    여기서 RNA의 완전성은 적어도 약 70%이고;
    여기서 RNA를 캡슐화하는 LNP의 n/p 비는 약 6이고;
    여기서 RNA를 캡슐화하는 LNP는 약 60nm 내지 약 120nm의 Z-평균 크기를 가지며;
    여기서 조성물은 약 20% 미만의 유리(비복합체) RNA를 포함하고;
    임의로, 여기서 조성물은 약 150mM 농도의 수크로스, 약 75mM 농도의 NaCl, 약 10mM 농도의 Na3PO4를 추가로 포함하고;
    임의로, 여기서 조성물은 약 pH 7.4의 pH를 갖는, 조성물.
  112. 청구항 86 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 지질 나노입자(LNP)로 제형화된, 화학적으로 변형되지 않은 RNA를 포함하고, RNA는 서열 번호: 163의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하며, LNP는 약 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 보다 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7의 비율(몰%)의 양이온성 지질 III-3, DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 (IVa) PEG-지질의 몰 비율을 갖는, 조성물.
  113. 청구항 86 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 지질 나노입자(LNP)로 제형화된, 화학적으로 변형되지 않은 RNA를 포함하고, RNA는 서열 번호: 149의 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하며, LNP는 약 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 보다 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7의 비율(몰%)의 양이온성 지질 III-3, DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 (IVa) PEG-지질의 몰 비율을 갖는, 조성물.
  114. 청구항 74 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 하나 이상의 융합전 안정화 돌연변이를 포함하는 융합전 안정화된 스파이크 단백질(S_stab)인 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(S)을 코딩하는 mRNA를 포함하는 조성물.
  115. 청구항 114에 있어서, mRNA가 서열 번호: 163과 적어도 95% 동일한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 코딩하거나 서열 번호: 163과 동일한 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는, 조성물.
  116. 청구항 114에 있어서, LNP가
    (i) 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) 적어도 하나의 중성 지질;
    (iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체; 및
    (iv) 적어도 하나의 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는, 조성물.
  117. 청구항 114에 있어서, LNP가
    (i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) DSPC;
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는, 조성물.
  118. 청구항 114에 있어서, LNP가
    (i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) DSPC;
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 47.5:10:40.8:1.7의 몰비인, 조성물.
  119. 청구항 114에 있어서, LNP가
    (i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) DSPC;
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비인, 조성물.
  120. 청구항 107 내지 118 중 어느 하나에 있어서, mRNA 대 총 지질의 비율이 약 0.03 내지 0.04 w/w인, 조성물.
  121. 청구항 120에 있어서, mRNA가 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP가
    (i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) DSPC;
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 47.5:10:40.8:1.7의 몰비이고,
    여기서 mRNA 대 총 지질(mRNA to total lipid)의 비율은 약 0.03 내지 0.04 w/w인, 조성물.
  122. 청구항 120에 있어서, mRNA가 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP가
    (i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) DSPC;
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비이고,
    여기서 mRNA 대 총 지질의 비율은 약 0.03 내지 0.04 w/w인 조성물.
  123. 청구항 74-99 또는 110-122 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 동결건조된 조성물인, 조성물.
  124. 청구항 123에 있어서, 동결건조된 조성물이 약 10% 미만의 수분 함량을 갖는, 조성물.
  125. 청구항 124에 있어서, 동결건조된 조성물이 약 0.5% 내지 5%의 수분 함량을 갖는, 조성물.
  126. 청구항 86 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고 조성물이, 조성물이 약 5℃의 온도에서 액체로서 저장 후 적어도 약 2주 동안 안정한 조성물.
  127. 청구항 126에 있어서, 핵산이 RNA이고, 조성물이 약 5℃의 온도에서 액체로서 저장 후 적어도 1개월 동안 안정한 조성물.
  128. 청구항 126에 있어서, 핵산은 RNA이고, 조성물이 약 5℃의 온도에서 액체로서 저장 후 약 2주 내지 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년 동안 안정한 조성물.
  129. 청구항 126에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 약 5℃의 온도에서 액체로서 적어도 약 2주 동안 저장 후 온전한(intact) 것인 조성물.
  130. 청구항 129에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 약 5℃의 온도에서 액체로 적어도 1개월 저장 후에 온전한 조성물.
  131. 청구항 126에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 약 5℃의 온도에서 액체로 약 2주 내지 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년 저장 후 온전한 조성물.
  132. 청구항 126에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 적어도 80%가 약 5℃의 온도에서 액체로서 약 2주 저장 후에 온전한 조성물.
  133. 청구항 86 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 응집 감소 지질을 포함하는 조성물.
  134. 청구항 86 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 농도가 약 10㎍/ml 내지 약 10mg/ml 범위, 바람직하게는 약 100㎍/ml 내지 약 1 mg/ml 범위인 조성물.
  135. 청구항 86 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA의 농도가 적어도 100㎍/ml, 보다 바람직하게는 적어도 200㎍/ml, 가장 바람직하게는 적어도 500㎍/ml인 조성물.
  136. 청구항 86 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA가 적어도 약 50% 이상, 바람직하게는 적어도 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 약 80% 이상의 RNA 완전성을 갖는 조성물.
  137. 청구항 86 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 조성물이 약 20% 미만의 유리 RNA, 바람직하게는 약 15% 미만의 유리 RNA, 더 바람직하게는 약 10% 미만의 유리 RNA를 포함하는 조성물.
  138. 청구항 86 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 조성물이 g RNA당 약 100nM 미만의 2가 양이온, 바람직하게는 g RNA당 약 50nM 미만의 2가 양이온, 더 바람직하게는 g RNA당 약 10nM 미만의 2가 양이온을 포함하는 조성물.
  139. 청구항 138에 있어서, 2가 양이온이 Mg2+ 및/또는 Ca2+로부터 선택되는 조성물.
  140. 청구항 86 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 지질의 농도가 약 250㎍/ml 내지 약 250mg/ml 범위, 바람직하게는 약 2.5mg/ml 내지 약 25mg/ml 범위인, 조성물.
  141. 청구항 86 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 지질의 농도는 적어도 약 2.5mg/ml, 바람직하게는 적어도 5mg/ml, 더 바람직하게는 적어도 12.5mg/ml인 조성물.
  142. 청구항 133 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 응집 감소 지질의 농도가 약 17.5㎍/ml 내지 약 17.5mg/ml 범위, 바람직하게는 약 175㎍/ml 내지 약 1.75 mg/ml 범위인 조성물.
  143. 청구항 133 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 응집 감소 지질의 농도가 적어도 약 175㎍/ml, 바람직하게는 적어도 약 350㎍/ml, 보다 바람직하게는 적어도 875㎍/ml인, 조성물.
  144. 청구항 86 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 지질 대 RNA의 wt/wt 비가 약 10:1 내지 약 60:1, 바람직하게는 약 20:1 내지 약 30:1, 보다 바람직하게는 약 25:1인 조성물.
  145. 청구항 86 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 지질계 담체 대 RNA(the lipid-based carriers to the RNA)의 N/P 비율이 약 1 내지 약 10 범위, 바람직하게는 약 5 내지 약 7 범위, 보다 바람직하게는 약 6인 조성물.
  146. 청구항 86 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA를 캡슐화하는 지질계 담체가 응집 감소 지질을 약 0.5%-15%의 몰비, 바람직하게는 약 1.0% 내지 약 2.5% 몰비, 보다 바람직하게는 약 1.7%의 몰비로 포함하는 조성물.
  147. 청구항 133 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 응집 감소 지질은 폴리머 접합 지질, 예를 들어, PEG-결합 지질인 것인 조성물.
  148. 청구항 86 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA 및 RNA를 캡슐화하는 지질계 담체가 적어도 하나의 정제 단계, 바람직하게는 적어도 하나의 단계의 TFF 및/또는 적어도 하나의 단계의 정화(clarification) 단계 및/또는 적어도 하나의 여과 단계로 정제된 것인 조성물.
  149. 청구항 86 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 약 500ppM 미만의 에탄올, 바람직하게는 약 50ppM 미만의 에탄올, 더 바람직하게는 약 5ppM 미만의 에탄올을 포함하는 조성물.
  150. 청구항 86 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 조성물의 삼투압 농도가 약 250 mOsmol/kg 내지 약 450 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 335 mOsmol/kg인 조성물.
  151. 청구항 86 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 약 25 ℃의 액체로 저장 시 적어도 1주, 바람직하게는 적어도 2주, 보다 바람직하게는 적어도 3주, 가장 바람직하게는 적어도 4주 동안 안정한 조성물.
  152. 청구항 86 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 약 40 ℃의 액체로 저장 시 적어도 1일, 바람직하게는 적어도 2일, 더욱 바람직하게는 적어도 3일, 가장 바람직하게는 적어도 4일 동안 안정한 조성물.
  153. 청구항 86 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 액체로서 저장 시, RNA의 완전성은 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만으로 감소하는 것인 조성물.
  154. 청구항 86 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 액체로서 저장 시, 유리 RNA의 양이 10% 초과, 바람직하게는 5% 초과만큼 증가하지 않는 것인 조성물.
  155. 청구항 86 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 액체로서 저장 시 RNA를 캡슐화하는 지질계 담체의 PDI 값이 약 0.2의 값보다 증가하지 않는, 바람직하게는 약 0.1 이하의 값인 조성물.
  156. 청구항 86 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, 액체로서 저장 시 RNA를 캡슐화하는 지질계 담체의 Z-평균 크기가 20% 이상 증가하지 않는, 바람직하게는 10% 이하인 조성물.
  157. 청구항 86 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 액체로서 저장 시 조성물의 탁도가 20% 이상 증가하지 않는, 바람직하게는 10% 이하인 조성물.
  158. 청구항 86 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 액체로서 저장 시, pH 및/또는 삼투압 농도는 20% 이상 증가하거나 감소하지 않는, 바람직하게는 10% 이하만큼 증가하거나 감소하지 않는 것인 조성물.
  159. 청구항 86 내지 158 중 어느 하나에 있어서, 액체로서 저장시, 조성물의 효능은 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만으로 감소하는 조성물.
  160. 청구항 86 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA가 정제된 RNA, 바람직하게는 RP-HPLC 정제된 RNA 및/또는 접선 유동 여과(TFF) 정제된 RNA인 조성물.
  161. 청구항 74 내지 160 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게는 TLR7 수용체 및/또는 TLR8 수용체의 적어도 하나의 길항제를 추가로 포함하는, 조성물.
  162. 청구항 161에 있어서, TLR7 수용체 및/또는 TLR8 수용체의 적어도 하나의 길항제가 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 p5'-GAG CGmG CCA-3'인 조성물.
  163. 코로나바이러스 SARS-CoV-2, 또는 이의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체이거나 이로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 포함하는 백신용 폴리펩티드로서, 바람직하게는 상기 항원성 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 1-111, 274-11663, 13176-13510, 13521-14123, 22732-22758, 22917, 22923, 22929-22964, 26938, 26939, 또는 이들 중 어느 것의 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것인, 펠리펩티드.
  164. 청구항 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 및/또는 청구항 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 및/또는 청구항 163의 폴리펩티드를 포함하는 백신.
  165. 청구항 164에 있어서, 백신이 적응 면역 반응, 바람직하게는 코로나바이러스, 바람직하게는 코로나바이러스 SARS-CoV-2에 대한 보호 적응 면역 반응을 유도하는 백신.
  166. 청구항 164 또는 165에 있어서, 백신이 청구항 1 내지 73 중 어느 하나에 정의된 핵산 중 복수 또는 적어도 하나 초과, 또는 청구항 74 내지 162 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 조성물 중 복수 또는 적어도 하나 초과를 포함하는 다가 백신인 백신.
  167. 청구항 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 및/또는 청구항 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 및/또는 청구항 163의 폴리펩티드, 및/또는 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클을 포함하는 청구항 164 내지 166의 백신, 및 선택적으로 성분의 투여 및 투여량에 대한 정보를 제공하는 기술 설명서를 포함하는 키트 또는 부품 키트(kit of parts).
  168. 의약품으로 용도를 위한, 청구항 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 청구항 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 청구항 163의 폴리펩티드, 청구항 164 내지 166의 백신, 청구항 167의 키트 또는 부품 키트.
  169. 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 의한 감염, 또는 이러한 감염, 바람직하게는 COVID-19와 관련된 장애의 치료 또는 예방용 청구항 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 청구항 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 청구항 163의 폴리펩티드, 청구항 164 내지 166의 백신, 청구항 167의 키트 또는 부품 키트.
  170. 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 청구항 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 청구항 163의 폴리펩티드, 청구항 164 내지 166의 백신 및/또는 청구항 167의 키트 또는 부품 키트를 이를 필요로 하는 대상체에게 적용 또는 투여하는 것을 포함하는 방법.
  171. 청구항 170에 있어서, 장애가 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염이거나, 또는 이러한 감염과 관련된 장애, 바람직하게는 COVID-19인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  172. 청구항 170 또는 171에 있어서, 필요로 하는 대상체는 포유동물 대상체, 바람직하게는 인간 대상체인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  173. 청구항 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체는 노인 인간 대상체, 바람직하게는 적어도 50, 60, 65, 또는 70세의 연령인 인간 대상체인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  174. 청구항 173에 있어서, 인간 대상체가 61세 이상인 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  175. 청구항 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체가 18 내지 60세인 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  176. 청구항 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 임신 중인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  177. 청구항 170 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 조성물의 첫 번째 용량 후 등급 3 전신 유해 사례를 경험하는 대상체가 25% 이하이거나, 조성물의 첫 번째 용량 후 등급 2 또는 더 높은 등급의 국소 유해 사례를 경험하는 대상체가 30% 이하인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  178. 청구항 170 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 조성물의 두 번째 용량 후 등급 3 전신 유해 사례를 경험하는 대상체가 40% 이하인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  179. 청구항 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체는 신생아 또는 유아, 바람직하게는 3세 이하, 2세 이하, 1.5세 이하, 1세(12개월) 이하, 9개월, 6개월 또는 3개월 이하, 또는 6개월에서 2세 사이의 연령인, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  180. 청구항 170에 있어서, 대상체의 질병 부담을 줄이는 방법으로 추가로 정의되는 방법.
  181. 청구항 180에 있어서, 방법이 COVID-19 질병의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 방법.
  182. 청구항 181에 있어서, 방법은 대상체가 병원 입원, 중환자실 입원, 보충 산소 치료 및/또는 인공호흡기를 사용한 치료를 필요로 할 확률을 감소시키는 방법.
  183. 청구항 181에 있어서, 방법은 대상체가 중증 또는 중등도의 COVID-19 질병에 걸릴 확률을 감소시키는 방법.
  184. 청구항 181에 있어서, 방법이 대상체에서 적어도 약 6개월 동안 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
  185. 청구항 184에 있어서, 대상체가 서열 번호: 1과 비교하여 S 단백질에서 적어도 첫 번째 아미노산 변화를 갖는 SARS CoV-2 변이체에 노출될 때 대상체에서 심각한 COVID-19 질병을 예방하는 것인 방법.
  186. 청구항 185에 있어서, SARS CoV-2 변이체가 다음을 포함하는 S 단백질에서 아미노산 변화를 갖는 방법:
    (i) delH69, delV70, Y453F, D614G, I692V 및 M1229I;
    (ii) delH69, delV70, delY144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A 및 D1118H;
    (iii) L18F, D80A, D215G, delL242, delA243, delL244, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G 및 A701V;
    (iv) L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y and T1027I; 및/또는
    (v) S13I, W152C, L452R, 및 D614G.
  187. 청구항 181에 있어서, 방법은 대상체가 열, 호흡 곤란; 후각 상실 및/또는 미각 상실을 겪을 확률을 감소시키는 것인 방법.
  188. 청구항 181에 있어서, 방법은 대상체가 열, 호흡 곤란; 후각 상실 및/또는 미각 상실을 겪을 확률을 감소시키는 것인 방법.
  189. 청구항 170에 있어서, 대상체는 질병이 있거나 면역이 손상된 것인 방법.
  190. 청구항 189에 있어서, 대상체가 간 질환, 신장 질환 당뇨병, 고혈압, 심장 질환, 폐 질환, 암을 갖거나 HIV 양성인 방법.
  191. 청구항 170에 있어서, 대상체가 지난 6개월 동안 14일 초과 동안 면역억제제로 치료되지 않은 방법.
  192. 청구항 170에 있어서, 대상체가 투여 전 적어도 28일 동안 생백신을 받지 않았거나 및/또는 투여 전 적어도 14일 동안 불활성화 백신을 받지 않은 것인 방법.
  193. 청구항 1 내지 73 중 어느 하나의 핵산, 바람직하게는 mRNA를 포함하는 적어도 제1 조성물, 청구항 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 청구항 163의 폴리펩티드, 청구항 164 내지 166의 백신, 및/또는 청구항 167의 키트 또는 부품 키트를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  194. 청구항 193에 있어서, 대상체는 이전에 SARS CoV-2에 감염되었던 것인 방법.
  195. 청구항 193에 있어서, 대상체가 적어도 제1 SARS CoV-2 백신 조성물로 이전에 치료된 것인 방법.
  196. 청구항 195에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 mRNA 백신인 방법.
  197. 청구항 196에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 BNT162 또는 mRNA-1273인 방법.
  198. 청구항 195에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 단백질 서브유닛 백신인 방법.
  199. 청구항 198에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 NVX-CoV2373 또는 COVAX인 방법.
  200. 청구항 195에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 아데노바이러스 벡터 백신인 방법.
  201. 청구항 200에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 ADZ1222 또는 Ad26.COV-2.S인 방법.
  202. 청구항 193 내지 201 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 검출가능한 SARS CoV-2 결합 항체를 갖는 것인 방법.
  203. 청구항 202에 있어서, 대상체가 검출가능한 SARS CoV-2 S 단백질-결합 항체를 갖는 것인 방법.
  204. 청구항 202에 있어서, 대상체가 검출가능한 SARS CoV-2 N 단백질-결합 항체를 갖는 것인 방법.
  205. 청구항 195 내지 201 중 어느 하나에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 환자에게 적어도 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 전에 투여된 방법.
  206. 청구항 195 내지 201 중 어느 하나에 있어서, 제1 SARS CoV-2 백신 조성물이 약 3개월 내지 2년 전 또는 약 6개월 내지 2년 전에 환자에게 투여된 것인 방법.
  207. 청구항 193 내지 206 중 어느 하나에 있어서, 방법이 치료 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
  208. 청구항 207에 있어서, 방법은 상기 투여 후 약 2주 내지 약 1년에서 치료 대상의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
  209. 청구항 207에 있어서, 방법은 치료 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 투여 후 약 2주 내지 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 동안 예방하는 방법.
  210. 청구항 193 내지 209 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체의 SARS CoV-2 감염 및/또는 대상체로부터의 SARS CoV-2 전파를 치료 대상체의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 예방하는 방법.
  211. 청구항 210에 있어서, 대상체의 SARS CoV-2 감염 및/또는 대상체로부터의 SARS CoV-2 전파를 투여 후 약 2주 내지 약 1년 사이에 치료 대상체에서 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 예방하는 방법.
  212. 청구항 211에 있어서, 방법은 대상체의 SARS CoV-2 감염 및/또는 대상체로부터의 SARS CoV-2 전파를 투여 후 약 2주 내지 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 사이에 치료 대상체의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 예방하는 방법.
  213. 청구항 193 내지 212 중 어느 하나에 있어서, 적어도 제2 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 제2 조성물은 청구항 1 내지 61 중 어느 하나의 핵산, 바람직하게는 mRNA, 청구항 74 내지 128 중 어느 하나의 조성물, 청구항 163의 폴리펩티드, 청구항 164 내지 166의 백신, 및/또는 청구항 167의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 것인, 방법.
  214. 청구항 213에 있어서, 제2 조성물이 상기 제1 조성물 후 적어도 약 7일에 투여되는 방법.
  215. 청구항 214에 있어서, 제2 조성물이 상기 제1 조성물 후 적어도 약 10일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일 또는 56일 후에 투여되는 방법.
  216. 청구항 213에 있어서, 제2 조성물이 상기 제1 조성물 후 약 7일 내지 약 56일 사이에 투여되는 방법.
  217. 청구항 216에 있어서, 제2 조성물이 상기 제1 조성물 후 약 14일 내지 약 56일; 약 21일 내지 약 56일; 또는 약 28일 내지 약 56일 사이에 투여되는 것인 방법.
  218. 청구항 193 내지 212 중 어느 한 청구항에 있어서, 적어도 제3 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 제3 조성물은 청구항 1 내지 61 중 어느 하나의 핵산, 청구항 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물, 청구항 163의 폴리펩티드, 청구항 164 내지 166의 백신, 및/또는 청구항 167의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 것인 방법.
  219. 청구항 213 내지 218 중 어느 하나에 있어서, 방법이 치료 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
  220. 청구항 219에 있어서, 방법은 제2 또는 후속 조성물을 투여한 후 약 2주 내지 약 1년 사이에 치료 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
  221. 청구항 219에 있어서, 방법은 후속 조성물을 투여한 후 약 2주 내지 약 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년 또는 3년 동안 치료 대상체의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%에서 중등도 및 중증 COVID-19 질병을 예방하는 방법.
  222. 청구항 193 내지 221 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 항체, CD4+ T 세포 반응 또는 CD8+ T 세포 반응을 자극하는 방법으로 추가로 정의되는 방법.
  223. 청구항 193 내지 221 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 중화 항체 반응을 자극하는 방법으로 추가로 정의되는 방법.
  224. 청구항 193 내지 221 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체의 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 10 내지 약 500개의 코로나바이러스 스파이크 단백질-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
  225. 청구항 224에 있어서, 방법은 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 200개 이하의 스파이크 단백질 결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
  226. 청구항 224에 있어서, 방법은 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 10 내지 약 300; 약 20 내지 약 300; 약 20 내지 약 200; 또는 약 30개 내지 약 100개 코로나바이러스 스파이크 단백질-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
  227. 청구항 226에 있어서, 방법은 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 30 내지 약 80개의 코로나바이러스 스파이크 단백질 결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
  228. 청구항 223에 있어서, 방법은 대상체의 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 1 내지 약 500개의 코로나바이러스 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
  229. 청구항 228에 있어서, 방법이 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 50개 이하의 스파이크 단백질 RBD-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
  230. 청구항 228에 있어서, 방법이 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 1 내지 약 200; 약 2 내지 약 100; 약 3 내지 약 200; 약 5 내지 약 100; 또는 약 5 내지 약 50개의 스파이크 단백질 RBD-결합 항체을 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
  231. 청구항 230에 있어서, 방법은 모든 코로나바이러스 중화 항체에 대해 약 5 내지 약 20개의 코로나바이러스 스파이크 단백질 RBD-결합 항체를 생성하는 항체 반응을 자극하는 것인 방법.
  232. 청구항 222에 있어서, 대상체가 SARS-CoV-2에 이전에 감염된 적이 있는 방법.
  233. 청구항 222에 있어서, 대상체에서 보호 면역 반응을 자극하는 방법으로 추가로 정의되는 방법.
  234. 청구항 193 내지 233 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  235. 청구항 234에 있어서, 대상체가 6개월 내지 100세, 6개월 내지 80세, 1세 내지 80세, 1세 내지 70세, 2세 내지 80세 또는 2세 내지 60세인 방법.
  236. 청구항 234에 있어서, 대상체가 3세 이하, 2세 이하, 1.5세 이하, 1세(12개월) 이하, 9개월, 6개월 또는 3개월 이하 또는 6개월 내지 2년 사이의 신생아 또는 유아인 방법.
  237. 청구항 234에 있어서, 대상체가 50, 60, 65, 또는 70세 이상의 고령 대상체인 방법.
  238. 청구항 237에 있어서, 대상체가 60세 이상의 고령 대상체인 방법.
  239. 청구항 234 내지 238 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 아메리카 원주민, 아프리카인, 아시아인 또는 유럽인 혈통(heritage)을 갖는 방법.
  240. 청구항 238에 있어서, 대상체가 적어도 약 10%, 25%, 또는 50%의 아메리카 원주민, 아프리카인, 아시아인 또는 유럽인 혈통을 갖는 방법.
  241. 청구항 238에 있어서, 대상체가 아메리카 원주민 혈통을 갖는 방법.
  242. 청구항 238에 있어서, 대상체가 적어도 약 10%, 25% 또는 50%의 아메리카 원주민 혈통을 갖는 방법.
  243. 청구항 193 내지 242 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체에서 Th2 사이토카인, 바람직하게는 IL-4, IL-13, TNF 및/또는 IL-1β의 증가를 본질적으로 유도하지 않는 방법.
  244. 청구항 193 내지 242 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 Th1 지정(directed) 면역 반응을 유도하는 방법으로 추가로 정의되는 방법.
  245. 청구항 193 내지 244 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 항응고 치료를 받고 있는 방법.
  246. 청구항 193 내지 245 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 근육내 주사에 의해 투여되는 방법.
  247. 청구항 193 내지 246 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 적어도 하나의 예비전 안정화 돌연변이를 포함하는 융합전 안정화 스파이크 단백질(S_stab)인 코로나바이러스 스파이크 단백질(S)을 코딩하는 mRNA를 포함하는 방법.
  248. 청구항 247에 있어서, mRNA가 서열 번호: 163과 적어도 95% 동일한 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  249. 청구항 248에 있어서, mRNA가 서열 163과 동일한 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  250. 청구항 247에 있어서, mRNA가 서열 번호: 149와 적어도 95% 동일한 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  251. 청구항 248에 있어서, mRNA가 서열 번호: 149와 동일한 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  252. 청구항 250 또는 251에 있어서, 조성물의 단일 용량이 적어도 약 6개월 동안 중증 COVID-19 질병으로부터 대상체를 보호하기에 충분한 면역 반응을 제공하는 방법.
  253. 청구항 252에 있어서, 조성물의 단일 용량은 약 6개월 내지 약 1년, 1.5년, 2년, 2.5년, 3년, 4년 또는 5년 동안 중증 COVID-19 질병으로부터 대상체를 보호하기에 충분한 면역 반응을 제공하는 것인 방법.
  254. 청구항 247 내지 249 중 어느 하나에 있어서, mRNA가 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 LNP를 형성하는 것인 방법.
  255. 청구항 254에 있어서, LNP가
    (i) 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) 적어도 하나의 중성 지질;
    (iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체; 및
    (iv) 적어도 하나의 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  256. 청구항 255에 있어서, LNP가
    (i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) DSPC;
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  257. 청구항 256에 있어서, LNP가
    (i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) DSPC;
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 47.5:10:40.8:1.7의 몰비인, 방법.
  258. 청구항 256에 있어서, LNP가
    (i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) DSPC;
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비인, 방법.
  259. 청구항 254 내지 258 중 어느 하나에 있어서, mRNA 대 총 지질의 비율은 약 0.03-0.04 w/w인, 방법.
  260. 청구항 249에 있어서, mRNA는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP는
    (i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) DSPC;
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 약 47.5:10:40.8:1.7의 몰비이고,
    여기서 mRNA 대 총 지질의 비율은 약 0.03-0.04 w/w인, 방법.
  261. 청구항 249에 있어서, mRNA는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성하고, 여기서 LNP는
    (i) 화학식 III-3에 따른 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) DSPC;
    (iii) 콜레스테롤; 및
    (iv) 화학식 IVa에 따른 PEG-지질을 포함하고,
    여기서 (i) 대 (iv)는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비이고,
    여기서 mRNA 대 총 지질의 비율은 약 0.03-0.04 w/w인, 방법.
  262. 청구항 247 내지 261 중 어느 하나에 있어서, 대상체에게 약 2 ㎍ 내지 약 50 ㎍의 mRNA를 포함하는 조성물이 투여되는 방법.
  263. 청구항 262에 있어서, 대상체에게 약 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍의 mRNA인 조성물이 투여되는 방법.
  264. 청구항 263에 있어서, 대상체에게 약 10 ㎍ 내지 약 30 ㎍의 mRNA인 조성물이 투여되는 방법.
  265. 청구항 264에 있어서, 대상체에게 약 12 ㎍의 mRNA를 포함하는 조성물이 투여되는 방법.
  266. 청구항 264 내지 265 중 어느 하나에 있어서, 투여는 조성물이 투여되는 대상체의 100%에서 혈청전환(seroconversion)을 제공하는 방법.
  267. 청구항 193 내지 266 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체가 61세 이상인 방법.
  268. 청구항 193 내지 266 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체가 18세 내지 60세인 방법.
  269. 청구항 193 내지 268 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체는 이전에 백신 알레르기가 있었던 것인 방법.
  270. 청구항 193 내지 269 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 검출가능한 항-PEG 항체를 갖는 것인 방법.
  271. 청구항 193 내지 270 중 어느 하나에 있어서, 방법은
    (i) 청구항 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물을 얻는 단계로서, 여기서 조성물은 동결건조되는 단계;
    (ii) 약학상 허용되는 액체 담체에 동결건조된 조성물을 가용화하여 액체 조성물을 생성하는 단계; 및
    (iii) 유효량의 액체 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  272. 조성물을 동결건조하여 안정화된 조성물을 생성하는 것을 포함하는, 청구항 74 내지 162 중 어느 하나의 조성물을 안정화시키는 방법.
  273. 청구항 272에 있어서, 안정화된 조성물이 약 10% 미만의 수분 함량을 갖는 방법.
  274. 청구항 273에 있어서, 안정화된 조성물이 약 0.5% 내지 5.0%의 수분 함량을 갖는 방법.
  275. 청구항 272-274 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 안정화되고 동결건조된 조성물.
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