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KR20080093112A - 돼지에서 임상 증상을 경감시키기 위한 ｐｃｖ2 면역원성조성물의 용도 - Google Patents

돼지에서 임상 증상을 경감시키기 위한 ｐｃｖ2 면역원성조성물의 용도 Download PDF

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KR20080093112A
KR20080093112A KR1020087018597A KR20087018597A KR20080093112A KR 20080093112 A KR20080093112 A KR 20080093112A KR 1020087018597 A KR1020087018597 A KR 1020087018597A KR 20087018597 A KR20087018597 A KR 20087018597A KR 20080093112 A KR20080093112 A KR 20080093112A
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KR
South Korea
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pcv2
group
pigs
antigen
orf2
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Ceased
Application number
KR1020087018597A
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English (en)
Inventor
마이클 비 루프
필립 웨인 헤이스
마르크 아이흐마이어
그레그 니첼
메릴 쉐퍼
Original Assignee
베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 filed Critical 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 여러 임상적 증상(질환)을 치료하기 위한, 돼지 시르코바이러스 2형(PCV2) 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 임상적 증상은 PCV2 감염과 관련된다. 바람직하게, 이들은 림프선병증, 림프계 고갈 및/또는 다핵화된/거대 조직구를 포함한다. 더욱이, 임상적 증상은 돼지에서 하기의 하나 또는 다중의 증상과 복합된 림프선병증을 포함한다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등. 추가로, 임상적 증상은 로소니아 세포내 감염과 관련된 것으로 공지된 연막형 병변을 포함한다.
Figure P1020087018597
PCV2 면역원성 조성물, 돼지, 바쿨로바이러스, 돼지 시르코바이러스 2형 항원

Description

돼지에서 임상 증상을 경감시키기 위한 ＰＣＶ2 면역원성 조성물의 용도{Use of a PCV2 immunogenic composition for lessening clinical symptoms in pigs}
서열 목록
본 출원은 서지 포맷 및 컴퓨터 판독 포맷으로 서열 목록을 포함하고 이의 교시 및 내용이 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명은 여러 임상 증상(질환)을 치료하기 위한 돼지 시르코바이러스 2형(PCV2) 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게 당해 임상 증상은 PCV2 감염과 관련된다. 보다 특히, 본 발명은 PCV2 감염과 관련된 임상 증상의 중증도를 감소시키거나 경감시키는 면역 반응을 제공하는데 효과적인 면역학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 면역학적 조성물은 재조합적으로 제조된 PCV2의 항원을 포함한다. 보다 바람직하게, PCV2 항원은 PCV2 게놈에서 개방 판독 프레임(ORF)중 하나에 의해 암호화된 재조합적으로 제조된 단백질이다. 보다 더 바람직하게, 항원은 PCV2 ORF2 단백질이다. 가장 특히, 본 발명은 면역학적 조성물을 투여받은 돼지에서 PCV2 감염과 관련된 임상 증상의 치료를 위해 효과적인 면역학적 조성물에 관한 것이고 이때, 당해 조성물은 PCV2의 ORF2에 의해 발현되는 단백질을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 약물로서, 바람직하게, 수의 약물로서, 보다 더 바람직하게 백신으로서 이와 함께 제공되는 임의의 조성물의 용도이다. 더욱이, 본 발명은 또한 PCV2 감염과 관련된 임상 증상의 중증도를 감소시키거나 경감시키기 위한 약물을 제조하기 위한 본원에 기재된 임의의 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 당해 약물은 보다 더 바람직하게 돼지에서 PCV2 감염을 예방하기 위한 것이다. 본 발명의 추가의 측면은 여러 임상 증상의 치료를 위해 PCV2의 면역원성 조성물을 포함하는 약물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
돼지 시르코바이러스 2형 (PCV2)은 소형(직경 17 -22 nm)의 정20면체 외피 부재 DNA 바이러스이고 일본쇄 환형 게놈을 함유한다. PCV2는 돼지 시르코바이러스 1형(PCV1)과 약 80%의 서열 동일성을 공유한다. 그러나, 일반적으로 비독성인 PCV1과는 대조적으로, PCV2로 감염된 돼지는 일반적으로 이유후전신소모성증후군 (PMWS)으로 언급되는 증후군을 나타낸다. PMWS는 임상적으로 쇠약, 피부의 창백함, 수척, 호흡 곤란, 설사, 황달(icterus) 및 황달(jaundice)을 특징으로 한다. 몇몇 감염된 돼지에서, 모든 증상의 합병증이 명백하지만 다른 감염된 돼지는 이들 증상중 하나 또는 2개를 앓는다. 검시동안에, 현미경적 및 거시적 병변이 또한 다수의 조직 및 기관상에 나타나고 림프 기관은 병변에 대한 가장 흔한 부위이다. PCV2 핵산 또는 항원의 양과 현미경적 림프 병변의 중증도간의 강한 관련성이 관찰되었다. PCV2로 감염된 돼지의 치사율은 80%에 달할 수 있다. PMWS 뿐만 아니라, PCV2는 위(僞)광견병, 돼지 생식 및 호흡 증후군(PRRS), 글래써병, 구균성 수막염, 살모넬라증, 이유후대장균증, 식이성간증 및 화농성 기관지폐렴을 포함하는 수개의 다른 감염과 관련되어 있다. 그러나, 지금까지 당해 연구는 이들 임상 증상들중 어느 것이 실질적으로 직접적인 PCV2 감염 때문인지는 확인하지 못했다. 더욱이, 이들 임상적 증상들중 어느것이 PCV2에 대해 지시된 활성제에 의해 감소되거나 치료될 수 있는지는 아직 공지되어 있지 않다.
PCV2 감염을 치료하기 위한 현재 방법은 미국 특허 제7,703,023호에 기재된 것을과 같은 DNA 계열 백신을 포함한다. 그러나, 당해 백신은 PCV2 감염에 대해 보호 면역을 제공하거나 이와 관련된 임의의 임상적 증상들의 중증도를 경감시키거나 치료하는데 효과적이지 못했다. 더욱이, 이전의 문헌에 기재된 백신은 유일하게 돼지에서 PCV2 감염 예방에만 집중되었고 임의의 추가의 의학적 용도는 고려하지 않았다.
따라서, 당업계에 필요한 것은 여러 임상적 증상의 치료를 위한 면역원성 조성물이다. 추가로, 당업계에 필요한 것은 PCV2 감염에 대해 보호 면역을 제공하고 또한 PCV2 감염과 관련된 기존의 임상적 증상들을 치료하는데 사용될 수 있는 면역학적 조성물이다.
발명의 기재
본 발명은 당업계에서의 기존 문제점을 극복하고 당업계의 상태를 명백히 진전시키는 것이다. 본 발명은 PCV2 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 의학적 용도를 제공한다.
일반적으로, 본원에서 사용된 바와 같은 임의의 PCV2 항원 면역원성 조성물에 대해서 어떠한 부작용 또는 주사 부위 반응을 나타내지 않았다. 따라서, 본원에 사용된 면역원성 조성물은 젊은 돼지, 바람직하게 15주령 이하의 돼지, 보다 바람직하게는 6주령 이하의 돼지, 보다 더 바람직하게는 3주령 이하의 돼지, 가장 바람직하게는 2주령 이하의 돼지에 투여되는 경우 안전한 것으로 나타난다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여는 독성 PCV에 노출된지 적어도 2주 이내 및 바람직하게는 적어도 3주 이내에 수행되는 것이 바람직하다. 추가의 양태에 따라, 본원에 기재된 임의의 의학적 용도에 데해 본원에 사용된 면역원성 조성물은 3주령 이상의 돼지 또는 바람직하게 2주령 이상의 돼지, 가장 바람직하게는 15주령 이하의 돼지에게 투여된다.
예상치않게, 하기에 기재된 면역원성 조성물의 치료학적 용도는 돼지에서 다양한 임상적 중증도를 경감시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 특히, 본 발명의 면역원성 조성물 및 특히 PCV2 ORF2 항원을 포함하는 조성물은 PCV2로 감염된 돼지에서 림프선병증, 림프계 고갈 및/또는 다핵화된/거대 조직구를 감소시키거나 경감시키기 위해 효과적이다. 더욱이, 여기에 제공된 바와 같이 PCV2 항원, 바람직하게 ORF2 항원을 포함하는 항원 조성물의 치료학적 사용은 전체 시르코바이러스 적재량 및 면역억제 충격을 감소시키고 이에 의해 일반 질환 내성 수준을 보다 증가 시키고 PCV2 매개 질환 및 증상의 발생빈도를 감소시킨다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 여기에 제공된 바와 같이, 돼지에서 림프선병증, 림프계 고갈 및/또는 다핵화된/거대 조직구를 예방, 경감 및/또는 감소시키기 위한 약물의 제조를 위해 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 당해 약물은 돼지에서 림프선병증, 림프계 고갈 및/또는 다핵화된/거대 조직구를 예방, 경감 및/또는 감소시키는데 효과적이다. 보다 더 바람직하게, 당해 약물은 15주령 이하, 보다 바람직하게는 6주령 이하, 보다 더 바람직하게는 3주령 이하 및 가장 바람직하게는 2주령 이하의 돼지에게 투여되는 경우 돼지에서의 PCV2 감염과 관련된 림프선병증, 림프계 고갈 및/또는 다핵화된/거대 조직구를 예방, 경감 및/또는 감소시키는데 효과적이다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여는 독성 PCV에 노출된지 적어도 2주 이내 및 바람직하게 적어도 3주 이내에 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에서 제공되는 바와 같이 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 돼지에게 투여함을 포함하는, 돼지에서 림프선병증, 림프계 고갈 및/또는 다핵화된/거대 조직구를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 바와 같이 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 돼지에게 투여함을 포함하는, 돼지에서 PCV2의 감염과 관련된 림프선병증, 림프계 고갈 및/또 는 다핵화된/거대 조직구를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 당해 치료는 면역원성 조성물을 투여받은 돼지에서 림프선병증, 림프계 고갈 및/또는 다핵화된/거대 조직구를 경감, 감소, 예방 및/또는 치료한다. 추가의 측면에 따라, 당해 치료 방법은 추가로 15주령 이하, 보다 바람직하게는 6주령 이하, 보다 더 바람직하게는 3주령 이하 및 가장 바람직하게는 2주령 이하의 돼지에게 당해 면역원성 조성물의 투여를 포함한다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여는 독성 PCV에 노출된지 적어도 2주 이내 및 바람직하게 적어도 3주 이내에 수행하는 것이 바람직하다.
추가로, 여기에 제공된 바와 같은 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 가장 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물의 치료학적 사용은 감염된 돼지에서 하나 또는 다중의 하기 증상과 관련된 림프선병증을 감소시키거나 경감시킬 수 있다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등.
따라서, 본 발명의 한 측면은 돼지에서 하기의 증상중 하나 또는 다수의 증상과 복합된 림프선병증의 예방, 경감 및/또는 감소시키는 약물을 제조하기 위한, 본원에 제공된 바와 같은 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등. 바람직하게, 당해 약물은 돼지에서 PCV2 감염과 관련된 하기의 증상들중 하나 또는 다수의 증상과 복합된 림프선병증을예방, 경감 및/또는 감소시키는데 효과적이다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등. 추가의 측면에 따라, 당해 약물은 15주령 이하, 보다 바람직하게는 6주령 이하, 보다 더 바람직하게는 3주령 이하 및 가장 바람직하게는 2주령 이하의 돼지에게 투여되는 경우 돼지에서 하기의 증상들중 하나 또는 다수의 증상과 복합된 림프선병증을 예방, 경감 및/또는 감소시키는데 효과적이다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여는 독성 PCV에 노출된지 적어도 2주 이내 및 바람직하게 적어도 3주 이내에 수행하는 것이 바람직하다.
더욱이, 본 발명은 또한 본원에 제공된 바와 같은 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물의 투여를 포함하는, 돼지에서 하기의 증상들중 하나 또는 다수의 증상과 복합된 림프선병증을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등. 바람직하게, 본 발명은 또한 본원에 제공된 바와 같은 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 돼지에게 투여함을 포함하 는, 돼지에서 하기의 증상들중 하나 또는 다수의 증상과 복합된 림프선병증을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등. 바람직하게, 당해 치료는 돼지에서 림프선병증 및 PCV2 감염과 관련된 하기의 증상들중 하나 또는 다수의 증상들을 경감시키거나 감소시킨다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등. 추가의 측면에 따라 당해 치료 방법은 추가로 본원에 제공된 바와 같은 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 15주령 이하, 보다 바람직하게는 6주령 이하, 보다 더 바람직하게는 3주령 이하 및 가장 바람직하게는 2주령 이하의 돼지에게 투여함을 포함한다. 또한 본 발명의 면역원성 조성물의 투여는 독성 PCV에 노출된지 적어도 2주 이내 및 바람직하게 적어도 3주 이내에 수행하는 것이 바람직하다.
또한 예상치않게 본원에 제공된 바와 같은 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물의 치료학적 사용이 또한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracelluaris) 감염(회장염)과 통상적으로 관련된 것으로 공지된 연막형(pia like) 병변을 감소시키거나 경감시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 돼지에서 로소니아 인트라셀룰라리스 감염과 통상적으로 관련된 것으로 공지된 연막형 병변을 예방, 이의 중증도를 경감시키고/시키거나 감소시키는 약물의 제조를 위한 본원에 제공된 바와 같은 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다. 추가의 측면에 따라, 당해 약물은 15주령 이하, 보다 바람직하게는 6주령 이하, 보다 더 바람직하게는 3주령 이하 및 가장 바람직하게는 2주령 이하의 돼지에게 투여되는 경우 로소니아 인트라셀룰라리스 감염과 통상적으로 관련된 것으로 공지된 연막형 병변을 예방, 이의 중증도를 경감시키고/시키거나 감소시키는데 효과적이다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여는 독성 PCV에 노출된지 적어도 2주 이내 및 바람직하게 적어도 3주 이내에 수행하는 것이 바람직하다.
더욱이, 본 발명은 또한 본원에 제공된 바와 같은 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 돼지에게 투여함을 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 감염과 통상적으로 관련된 것으로 공지된 연막형 병변의 치료 방법에 관한 것이다. 바람직하게 당해 치료는 로소니아 인트라셀룰라리스 감염과 통상적으로 관련된 것으로 공지된 연막형 병변을 경감시키거나 감소시킨다. 추가의 측면에 따라, 상기된 치료 방법은 본원에 제공된 바와 같은 PCV2 항원, 바람직하게 재조합 PCV2 항원 및 보다 바람직하게 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 15주령 이하, 보다 바람직하게는 6주령 이하, 보다 더 바람직하게는 3주령 이하 및 가장 바람직하게는 2주령 이하의 돼지에게 투여함을 포함한다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여는 독성 PCV 에 노출된지 적어도 2주 이내 및 바람직하게 적어도 3주 이내에 수행하는 것이 바람직하다.
면역원성 조성물
본원에 사용된 바와 같은 면역원성 조성물은 PCV2에 대한 면역 반응을 유도하고 PCV2 감염과 연관된 임상적 증상을 예방하고, 감소시키고/시키거나 경감시키는데 효과적이다. 당해 조성물은 일반적으로 하나 이상의 PCV2 항원을 포함한다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역원성 조성물 "은 PCV2 항원을 함유하는 임의의 조성물을 언급하고 당해 조성물은 피험자에서 PCV2 감염 관련 질환 또는 증상을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 면역원성 조성물은 PCV2에 대한 면역반응을 유도하거나 자극하거나 증진시킬 수 있다. 따라서 당해 용어는 전체 사멸되거나 약독화되고/되거나 불활성화된 PCV2를 함유하는 조성물 뿐만 아니라 하기된 바와 같은 면역원성 조성물 둘다를 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "서브유니트 면역원성 조성물 "은 하나 이상의 면역원성 폴리펩타이드 또는 항원을 함유하지만 PCV2로부터 유래하거나 이와 상동성인 모든 항원을 함유하지는 않는 조성물을 언급한다. 당해 조성물에는 실질적으로 온전한 PCV2가 없다. 따라서, "서브유니트 면역원성 조성물 "은 PCV2로부터 기원하는 하나 이상의 부분적으로 정제되거나 분획화된(바람직하게 실질적으로 정 제된) 면역원성 폴리펩타이드 또는 이의 재조합 유사체로부터 제조된다. 서브유니트 면역원성 조성물은 PCV2로부터의 항원 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 부재이거나 분획화된 형태인 목적하는 서브유니트 항원 또는 항원들을 포함할 수 있다. 바람직한 면역원성 서브유니트 조성물은 하기된 바와 같은 PCV2 ORF2 단백질을 포함한다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 또는 면역 반응 "은 목적하는 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체 매개 면역 반응의 숙주에서 발생한다. 일반적으로, "면역 반응 "은 하나 이상의 하기의 효과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 목적하는 조성물 또는 백신에 포함된 항원에 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 서프레서 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 yd T 세포의 생산 또는 활성화. 바람직하게, 당해 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 증진되고/되거나 질환의 임상적 중증도가 감소될 정도로 치료학적 또는 보호 면역학적 반응을 나타낸다. 당해 보호는 상기된 바와 같은 PCV2 감염과 연관된 하나 이상의 증상의 수적 감소 또는 증증도의 감소 또는 증상의 부재에 의해 입증된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역원성 " 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 "항원"은 상기된 바와 같은 면역학적 반응을 유발하는 아미노산 서열을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 "면역원성 " 단백질 또는 폴리펩타이드는 임의의 PCV2 단백질의 전장 서열, 이의 유사체 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다. 당해 용어 "면역원성 단편"은 하나 이상의 에피토프를 포함하고 따라서 상기된 면역학적 반응을 유발하는 단백질의 단편을 언급한다. 당해 단편은 당업계에 공지된 임의의 다 수의 에피토프를 사용하여 동정될 수 있다[문헌참조: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 단백질 분자의 일부에 상응하는 다수의 펩타이드를 고형 지지체상에서 합성하고 펩타이드가 여전히 지지체에 부착되어 있는 상황에서 항체를 펩타이드와 반응시킴에 의해 결정될 수 있다. 당해 기술은 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, 문헌[참조: 미국 특허 제4,708,871호;; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715]에 기재되어 있다. 유사하게, 형태적 에피토프는 예를 들어, x선 결정 및 2차원 핵 자기 공명에 의한 것과 같이 아미노산의 공간적 형태를 결정함에 의해 용이하게 동정된다[문헌참조: Epitope Mapping Protocols, supra].
합성 항원은 또한 예를 들어, 당의 정의에 포함되고 예를 들어, 다중에피토프, 플랭킹 에피토프 및 기타 재조합 또는 합성적으로 유래된 항원이 있다[문헌참조: Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998].
본 발명의 바람직한 양태에서, 면역 반응을 유도하고 가장 바람직하게 PCV2 감염의 임상적 징후에 대해 보호 면역을 제공하는 면역원성 조성물이 제공된다. 가장 바람직하게 당해 조성물은 조성물의 항원 성분으로서 PCV2의 ORF2에 의해 발 현되는 당해 조성물은 가장 바람직하게 조성물의 항원 성분으로서 PCV2의 ORF2에 의해 발현되는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함한다. 본원에 제공된 방법에서 및 조성물의 제조를 위해 본원에 사용되는 PCV2 ORF2 DNA 및 단백질은 PCV2 분리물내에서 고도로 보존된 도메인이고 이에 의해 임의의 PCV2 ORF2는 본원에 사용된 바와 같은 PCV ORF2 DNA 및/또는 폴리펩타이드의 공급원으로서 효과적이다. 바람직한 PCV2 ORF2 단백질은 서열번호 11의 단백질이다. 바람직한 PCV ORF2 폴리펩타이드는 서열번호 5로서 본원에 제공되고 당해 서열이 서열 상동성에 있어서 6 내지 10% 정도로 다양할 수 있고 면역원성 조성물중에 이의 유용성을 부여하는 항원 특성을 여전히 보유하는 것으로 당업자에 의해 이해된다. 면역학적 조성물의 항원 특징은 예를 들어, 실시예 4에 의해 제공된 챌린지 실험에 의해 평가될 수 있다. 더욱이, 변형된 항원의 항원 특징은 변형된 항원이 서열번호 3 또는 4의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 PCV2 ORF2 단백질과 비교하여 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 보호 면역을 제공하는 경우 여전히 보유된다. 본원에 사용된 바와 같은 "면역원성 조성물"은 PCV2 ORF2 단백질에 대한 세포성 및/또는 항체 매개 면역 반응의 숙주에서 "면역학적 반응"을 유발하는 PCV2 ORF2 단백질을 의미한다. 바람직하게, 당해 면역원성 조성물은 PCV2에 대한 면역반응을 유발하거나 증진시킬 수 있고 이에 의해 PCV2 감염에 대한 보호 면역을 제공하고 이와 연관된 하나 이상의 임상적 징후 및 바람직하게는 모든 임상적 징후의 발생 빈도, 이의 중증도를 감소시키거나 예방한다.
몇몇 형태에서, PCV2 ORF2 단백질의 면역원성 부분은 절단되고/되거나 치환 된 형태 또는 각각 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 단편을 언급한다. 바람직하게, 당해 절단된 및/또는 치환된 형태 또는 단편은 전장의 ORF2 폴리펩타이드로부터의 6개 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 보다 바람직하게, 절단된 또는 치환된 형태, 또는 단편은 전장 ORF2 폴리펩타이드로부터의 10개 이상, 보다 바람직하게는 15개 이상 및 여전히 보다 바람직하게는 19개 이상의 연속 아미노산을 갖는다. 당해 측면에서 2개의 바람직한 서열은 본원에서 서열번호 9 및 10으로서 제공된다. 추가로 당해 서열은 대형 단편 또는 절단된 형태의 일부일 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 제공된 추가의 바람직한 PCV2 ORF2 폴리펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 그러나, 이것은 당업자에 의해 당해 서열이 서열 상동성에 있어서 6 내지 20% 정도로 다양할 수 있고 면역원성 조성물에서 이의 유용성을 부여하는 항원 특성을 보유하고 있는 것으로 이해된다. 몇몇 양태에서, 당해 PCV2 ORF2 폴리펩타이드의 절단된 또는 치환된 형태, 또는 단편은 당해 조성물에서 항원성 성분으로서 사용된다. 바람직하게, 당해 절단되거나 치환된 형태, 또는 단편들은 예를 들어 서열번호 3 또는 4의 전장 ORF2 뉴클레오타이드 서열로부터의 18개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, 절단된 또는 치환된 형태, 또는 단편은 예를 들어, 서열번호 3 또는 4의 전장의 ORF2 뉴클레오타이드의 45개 이상 및 보다 더 바람직하게는 57개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖는다.
당업계에 공지된 바와 같은 "서열 동일성" 은 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열, 즉 표준 서열 및 표준 서열과 비교될 소정의 서열간의 관계를 언급한다. 서열 동일성은 서열이 당해 일련의 서열간의 매치에 의해 측정되는 바와 같이 최고의 서열 유사성을 나타내도록 최적으로 배열된 후 소정의 서열을 표준 서열과 비교함에 의해 측정된다. 당해 배열 즉시, 서열 동일성은 위치 대 위치 기준으로 확인되고 예를 들어, 당해 서열은 특정 위치에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 동일한 경우 당해 위치에서 동일하다. 이어서 당해 위치 동일성의 총 수는 표준 서열에서의 뉴클레오타이드 또는 잔기의 총수로 나누어 % 서열 동일성을 나타낸다. 서열 동일성은 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]에 기재된 방법들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 서열 동일성을 측정하기 위해 바람직한 방법은 시험된 서열간에 최대 매치를 나타내도록 디자인하는 것이다. 서열 동일성을 측정하는 방법은 소정의 서열간의 서열 동일성을 측정하는 대중에게 유용한 컴퓨터 프로그램으로 기록되어 있다. 당해 프로그램 의 예는 GCG 프로그램 팩키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. BLASTX 프로그램은 공개적으로 NCBI 및 기타 공급원으로부터 구입할 수 있다 (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), 본원에 참조로서 인용됨). 당해 프로그램은 디폴트 갭을 사용하여 소정의 서열과 표준 서열간에 최고 수준의 서열 동일성을 나타내도록 최적으로 서열을 배열시킨다. 한 예로서, 표준 서열과 예를 들어, 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 "서열 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 소정의 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 표준 서열과 동일함을 의미하고 단, 소정의 폴리뉴클레오타이드 서열은 표준 뉴클레오타이드 서열의 각각 100개의 뉴클레오타이드당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 더 바람직하게는 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 말로, 표준 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에서, 표준 서열중의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 뉴클레오타이드가 결실되거나 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있거나 참조 서열중의 총 뉴클레오타이드의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 뉴클레오타이드 수가 표준 서열에 삽입될 수 있다. 당해 표준 서열의 돌연변이는 표준 뉴클레오타이드 서열의 5' 또 는 3' 말단 위치에서 또는 양 말단 위치 사이의 임의의 곳에서 발생할 수 있고 표준 서열 또는 표준 서열내 하나 이상의 연속 그룹에서 뉴클레오타이드중에 개별적으로 분산되어 발생할 수 있다. 유사하게, 표준 아미노산 서열과 예를 들어, 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 "서열 동일성"을 갖는 소정의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 소정의 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 표준 서열과 동일함을 의미하고 단, 소정의 폴리뉴클레오타이드 서열은 표준 뉴클레오타이드 서열의 각각 100개의 뉴클레오타이드당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 더 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 변이를 포함할 수 있다. 다른 말로, 표준 아미노산 서열과 비교하여 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 소정의 폴리펩타이드 서열을 수득하는데 있어서, 표준 서열중의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나 참조 서열중의 아미노산 잔기 총수의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 수가 표준 서열에 삽입될 수 있다. 당해 표준 서열의 변형은 표준 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치 또는 당해 말단 위치 사이의 임의의 곳에서 발생할 수 있고 표준 서열 또는 표준 서열내 하나 이상의 연속 그룹에서 잔기중에 개별적으로 분산되어 발생할 수 있다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환에 의해 상이하다. 그러나, 보존성 치환은 서열 동일성을 결정하는 경우 매치로서 포함되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "서열 상동성"은 2개 서열의 관련성을 측정하는 방 법을 언급한다. 서열 상동성을 측정하기 위해, 2개 이상의 서열은 최적으로 배열되고 필요한 경우 갭을 도입한다. 그러나, "서열 동일성"과는 대조적으로, 보존성 아미노산 치환은 서열 상동성을 결정하는 경우 매치로서 계수한다. 다른 말로, 표준 서열과 95%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 수득하는데 있어서, 표준 서열에서 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95%의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드는 매치해야만 하거나 다른 아미노산 또는 뉴클레오타이드에 의한 보존성 치환을 포함해야만 하거나 표준 서열에서 총 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드중 15%, 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 수(보존성 치환은 포함하지 않음)가 표준 서열에 삽입될 수 있다. 바람직하게, 상동성 서열은 50개 이상, 보다 더 바람직하게는 100개 이상, 보다 더 바람직하게는 250개 이상 및 보다 바람직하게는 500개 이상의 일련의 뉴클레오타이드를 포함한다.
"보존성 치환"은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가, 크기, 소수성등을 포함하는 유사한 특성 또는 성질을 갖는 아미노산 또는 뉴클레오타이드로 치환되어 전체 기능이 상당히 변화하지 않은 치환을 언급한다.
"분리된"은 천연 상태로부터 인위적으로 변형된 것을 의미하는데, 즉 천연에 존재하는 경우 이의 본래 환경으로부터 변화되거나 제거되거나 둘다인 것을 의미한다. 예를 들어, 생물 유기체에 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이 "분리된"이 아니지만 천연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "분리 된"이다.
따라서, 본원에 사용된 바와 같은 면역원성 조성물은 또한 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 조성물을 언급하고 이때, PCV2 ORF2 단백질은 상기된 바와 같은 임의의 단백질이다. 바람직하게, 당해 PCV2 ORF2 단백질은,
i) 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
ii) i)의 폴리펩타이드와 80% 이상 상동성인 임의의 폴리펩타이드,
iii) i) 및/또는 ii)의 폴리펩타이드의 임의의 면역원성 부분,
iv) 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열에 포함되는 10개 이상의 연속 아미노산을 포함하는, iii)의 면역원성 부분,
v) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드,
vi) v)의 폴리펩타이드와 80% 이상 상동성인 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 임의의 폴리펩타이드,
vii) v) 및/또는 vi)의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 임의의 부분 또는
viii) 면역원성 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열에 포함되는 30개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, vii)의 면역원성 부분이다.
바람직하게, 임의의 당해 면역원성 부분은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열에 의해 암호화된 PCV2 ORF2의 면역원성 특징을 갖는다
추가의 측면에 따라, PCV2 ORF2 단백질은 즉, PCV2 감염으로부터 비롯되는 하나 이상의 임상적 징후의 발생 빈도를 감소시키거나 이의 중증도를 경감시키거나 당해 징후를 예방하는데 효과적인 항원 내포 수준에서 면역학적 조성물로 제공된다. 바람직하게, PCV2 ORF2 단백질 내포 수준은 최종 면역원성 조성물의 0.2㎍ 항원 / ml (g/ml)이상, 보다 바람직하게, 약 0.2 내지 약 400㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.3 내지 약 200㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 약 100㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.4 내지 약 50㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.45 내지 약 30㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.6 내지 약 15㎍ /ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.75 내지 약 8㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 약 1.0 내지 약 6㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 약 1.3 내지 약 3.0㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 약 1.4 내지 약 2.5㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 약 1.5 내지 약 2.0㎍/ml, 및 가장 바람직하게는 약 1.6㎍/ml이다.
추가의 측면에 따라, ORF2 항원 내포 수준은 최종 항원 조성물의 용량당 상기된 바와 같은 0.2㎍ 이상의 PCV2 ORF2 단백질(g/용량), 보다 더 바람직하게 약 0.2 내지 약 400㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 0.3 내지 약 200㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 0.35 내지 약 100㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 0.4 내지 약 50㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 0.45 내지 약 30㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 0.6 내지 약 15㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 0.75 내지 약 8㎍/용 량, 보다 더 바람직하게는 약 1.0 내지 약 6㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 1.3 내지 약 3.0㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 1.4 내지 약 2.5㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 1.5 내지 약 2.0㎍/용량, 또는 가장 바람직하게 약 1.6㎍/용량이다.
본 발명에 따라 면역원성 조성물에 사용되는 PCV2 ORF2 폴리펩타이드는 PCV2 ORF2의 분리 및 정제, 표준 단백질 합성 및 재조합 방법을 포함하는 임의의 양상으로 유래될 수 있다. PCV2 ORF2 폴리펩타이드를 수득하기 위해 바람직한 방법은 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허원 제11/034,797호에 기재되어 있다. 요약하면, 민감성 세포를 PCV2 ORF2 DNA 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 벡터로 감염시키고, PCV2 ORF2 폴리펩타이드를 재조합 바이러스로 발현시키고 발현된 PCV2 ORF2 폴리펩타이드를 여과에 의해 상등액으로부터 회수하고 통상적인 방법, 바람직하게 2급 에틸렌이민을 사용하여 불활성화시키고 이어서 중화시켜 불활성화 과정을 종료시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 면역원성 조성물은 또한 바람직하게 i) 상기된 농도의 상기된 임의의 PCV2 ORF2 단백질 및 ii) 바람직하게 재조합 바쿨로바이러스의 당해 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부를 포함하는 조성물을 언급한다. 더욱이, 면역원성 조성물은 i)상기된 농도의 상기된 임의의 PCV2 ORF2 단백질, ii) 바람직하게 재조합 바쿨로바이러스의 당해 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부 및 iii) 세포 배양 상등액 부분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 면역원성 조성물은 i)상기된 농도의 상기된 임의의 PCV2 ORF2 단백질, ii) 바람직하게 재조합 바쿨로바이러스의 당해 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부 및 iii) 세포 배양액 부분을 포함하고 당해 성분의 약 90%가 1㎛ 보다 작은 크기를 갖는 조성물을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 면역원성 조성물은 i)상기된 농도의 상기된 임의의 PCV2 ORF2 단백질, ii) 바람직하게 재조합 바쿨로바이러스의 당해 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부, iii) 세포 배양액 부분 및 iv) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키기 위한 불활성화제, 바람직하게 BEI 를 포함하고 당해 i) 내지 iii) 성분의 약 90%가 1㎛ 보다 작은 크기를 갖는 조성물을 언급한다. 바람직하게, BEI는 바쿨로바이러스를 불활화시키는 유효량의 농도로 존재한다. 유효 농도는 상기된 바와 같다.
본원에 사용된 바와 같은 면역원성 조성물은 i)상기된 농도의 상기된 임의의 PCV2 ORF2 단백질, ii) 바람직하게 재조합 바쿨로바이러스의 당해 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부, iii) 세포 배양액 부분, iv) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키기 위한 불활성화제, 바람직하게 BEI 및 v) 불활성화제에 의해 매개되는 불활성화를 종료시키기 위한 중화제를 포함하고 당해 i) 내지 iii) 성분의 약 90%가 1㎛ 보다 작은 크기를 갖는 조성물을 언급한다. 바람직하게, 불활성화제가 BEI인 경우, 당해 조성물은 BEI와 등가량으로 나트륨 바쿨로바이러스를 불활성화시키는 유효량의 농도로 존재한다.
폴리펩타이드는 PCV2 감염에 민감한 동물에 투여될 수 있는 조성물에 혼입된 다. 바람직한 형태에서, 당해 조성물은 또한 당업자에게 공지된 추가의 성분들을 포함할 수 있다(문헌참조: Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton). 추가로, 당해 조성물은 하나 이상의 수의적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "수의적으로 허용되는 담체 "는 임의의 모든 용매, 분산 매질. 피복물, 보조제, 안정화제, 희석제, 방부제, 항세균제 및 항진균제, 등장제, 흡수 지연제등을 포함한다. 바람직한 양태에서, 면역원성 조성물은 보조제, 바람직하게 Carbopol 및 생리 식염수와 혼합된, 바람직하게 상기된 농도로 여기에 제공된 바와 같은 PCV2 ORF2 단백질을 포함한다.
당업자는 본원에 사용된 조성물이 공지된 주사가능한 생리학적으로 허용되는 멸균 용액 형태일 수 있음을 이해한다. 비경구 주사 또는 주입으로 즉시 사용가능한 용액을 제조하기 위해, 등장성 수용액, 예를 들어, 식염수 또는 상응하는 혈장 단백질 용액을 용이하게 유용하다. 추가로, 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물은 희석제, 등장제, 안정화제 또는 보조제를 포함할 수 있다. 희석제는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올 및 글리세롤등을 포함할 수 있다. 등장제는 무엇보다 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정화제는 무엇보다 알부민 및 에틸렌디아민테트라세트산의 알칼리 염을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "보조제"는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 사포닌, 예를 들어, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유중수 에멀젼, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼을 포함할 수 있다. 당해 에멀젼은 특히 경액체 파라핀 오일 (유럽 약전 유형); 이소프레노이드 오일(예를 들어, 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 테올리고머화로부터 비롯되는 스쿠알란 또는 스쿠알렌); 선형 알킬 그룹을 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 보다 특히 식물 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 측쇄 지방산 또는 알코올의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 주성분으로 할 수 있다. 당해 오일은 에멀젼을 형성하기 위해 유화제와 배합하여 사용된다. 유화제는 바람직하게 비온성 계면활성제, 특히 소르비탄의 에스테르, 만니드의 에스테르(예를 들어, 언하이드로만니톨 올레에이트), 글리콜 에스테르, 폴리글리세롤 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르 및 올레산 에스테르, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르이고 이들은 임의로 에톡실화되고, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히 Pluronic 제품, 특히 L121이다[문헌참조: Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)].
예를 들어, 문헌["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 147면에 기재된 SPT 에멀젼 및 당해 문헌의 183면에 기재된 에멀젼 MF59를 사용할 수 있다.
보조제에 대한 추가의 예는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택된 화합물이다. 유리한 보조제 화 합물은 특히, 당 또는 폴리알콜과 가교 결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 당해 화합물은 용어 카보머로 공지되어 있다 (문헌참조: Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). 당업자는 또한 3개 이상의 하이드록실 그룹, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록실 그룹을 갖고 3개 이상의 하이드록실의 수소 원자가 2개 이상의 탄소원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 치환된 폴리하이드록실화 화합물로 가교 결합된 아크릴 중합체를 기재하는 미국 특허 제2,909,462호를 참조할 수 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소원자를 함유하는 것들, 예를 들어, 비닐, 알릴 및 기타 에틸렌적으로 불포화된 그룹이다. 불포화된 라디칼 그 자체는 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수 있다. 상표명 Carbopol로 시판되고 있는 제품 (BF Goodrich, Ohio, USA)이 특히 적합하다. 이들은 알킬 슈크로스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교결합된다. 이들중에서, Carbopol 974P, 934P 및 971P가 언급될 수 있다. 가장 바람직하게는 Carbopol이 사용되고, 특히 Carbopol 971P이 사용되고, 바람직하게 이의 양은 용량당 약 500㎍ 내지 약 5 mg이고, 보다 더 바람직한 양은 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5 mg 이고 가장 바람직하게는 용량당 약 1mg의 양이다.
추가로 적합한 보조제는 RIBI 보조제 시스템 (Ribi Inc.), 블록 공중합체 (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민 보조제, 이. 콜리 기원의 열 불안정 장독소(재조합 또는 기타), 콜레라 독소, IMS 1314 또는 무엇보다 무라밀 디펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 보조제는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10 mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게, 보조제는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10 mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게, 보조제는 용량당 약 500㎍ 내지 약 5 mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게, 보조제는 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5 mg의 양으로 첨가된다. 가장 바람직하게, 보조제는 용량당 약 1mg의 양으로 첨가된다.
추가로, 당해 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 안정화제, 희석제, 방부제, 항세균 및 항진균제, 등장제, 흡수 지연제등을 포함한다. 가장 바람직하게, 본원에 제공된 조성물은 시험관내 배양된 세포의 상등액으로부터 회수된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하고 여기서, 세포 배양물은 당해 세포는 PCV2 ORF2 DNA를 함유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터로 감염시키고 세포 배양물은 바이러스 벡터를 불활성화시키기 위해 약 2 내지 8mM BEI, 바람직하게는 약 5mM BEI로 처리하고 최종 농도가 약 2 내지 약 8mM, 바람직하게는 약 5mM인 등가 농도의 중화제, 바람직하게 티오황산나트륨 용액으로 처리하였다.
본 발명은 또한 i)상기된 농도의 상기된 임의의 PCV2 ORF2 단백질, ii) 당해 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부, iii) 세포 배양액 부분, iv) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키기 위한 불활성화제, 바람직하게 BEI, 및 v) 불활성화제에 의해 매개되는 불활성화를 종료시키기 위한 중화제, 바람직하게는 BEI와 등가량의 티오황산나트륨 및 vi) 상기된 양의 적합한 보조제, 바람 직하게 Carbopol 971을 포함하고 당해 i) 내지 iii) 성분의 약 90%가 1㎛ 보다 작은 크기를 갖는 조성물을 언급한다. 추가의 측면에 따라, 당해 면역원성 조성물은 추가로 생리학적으로 허용되는 농도로 약제학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 포스페이트 염을 포함한다. 바람직하게, 면역원성 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5를 의미하는 생리학적 pH로 조정한다.
또한 본원에 사용된 바와 같은 면역원성 조성물은 1ml당 i) 1.6㎍ 이상의 상기된 PCV2 ORF2 단백질, ii) 당해 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바쿨로바이러스 벡터의 적어도 일부, iii) 세포 배양액 부분, iv) 약 2 내지 8 mM BEI 및 v) BEI와 등가량의 티오황산나트륨 및 vi) 약 1mg의 Carbopol 971 및 vii) 생리학적으로 허용되는 농도의 포스페이트 염을 포함하고 당해 i) 내지 iii) 성분의 약 90%가 1㎛ 보다 작은 크기를 갖고 면역원성 조성물의 pH가 약 6.5 내지 7.5로 조정되는 조성물을 언급한다.
면역원성 조성물은 추가로 예를 들어, 인터류킨, 인터페론 또는 기타 사이토킨와 같음 하나 이상의 기타 면역조절제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 젠타미신 및 머티올레이트를 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 보조제 및 첨가제의 양 및 농도는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있지만 본 발명은 약 50㎍ 내지 약 2000㎍의 보조제 및 바람직하게 약 250㎍/ ml의 백신 조성물을 포함하는 조성물을 고려한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 면역원성 조성물은 또한 약 1ug/ml 내지 약 60㎍/ml 의 항생제 또는 보다 바람직하게는 약 30㎍/m 미만의 항생제를 포함하는 조성물을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 면역원성 조성물은 또한 i) 바람직하게 상기된 농도의 상기된 임의의 PCV2 ORF2 단백질, ii) 당해 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부, iii) 세포 배양액 부분, iv) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키기 위한 불활성화제, 바람직하게 BEI, 및 v) 불활성화제에 의해 매개되는 불활성화를 종료시키기 위한 중화제, 바람직하게는 BEI와 등가량의 티오황산나트륨 및 vi) 상기된 양의 적합한 보조제, 바람직하게 Carbopol 971; vii ) 약제학적으로 허용되는 농도의 식염 완충액, 바람직하게 포스페이트 염 및 viii) 항미생물제를 포함하고, 당해 i) 내지 iii) 성분의 약 90%가 1㎛ 보다 작은 크기를 갖는 조성물을 언급한다.
놀랍게도, PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물이 24개월 기간동안 매우 안정한 것으로 밝혀졌다. 또한 면역원성 조성물이 PCV2 감염과 관련된 임상적 증상을 감소시키는데 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기된 바와 같이, 재조합 바쿨로바이러스 발현된 PCV2 ORF2를 포함하는 면역원성 조성물이 놀랍게도 불활성화 형태의 온전한 PCV2 바이러스 또는 분리된 바이러스 PCV2 ORF2 항원을 포함하는 면역원성 조성물보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 특히, 놀랍게도 재조합 바쿨로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질이 0.25㎍/용량 이하의 농도를 의미하는 매우 저농도에서 효과적인 것으로 밝혀졌다. PCV2 ORF2 단백질의 당해 예상치 않은 높은 면역원성 잠재력은 Carbopol에 의해 증가된다. 실시예 1 내지 3은 PCV2 ORF2 함유 면역원성 조성물의 제법을 상세히 기재한다.
본원에 사용된 바와 같은 면역원성 조성물은 또한 CircoFLEX, (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, MO, USA), CircoVac (Merial SAS, Lyon, France), CircoVent (Intervet Inc., Millsboro, DE, USA) 또는 Suvaxyn PCV-2 One Dose (Fort Dodge Animal Health, Kansas City, KA, USA)을 언급한다.
면역원성 조성물의 투여
본 발명에 따른 조성물은 피부내, 기관지내 또는 질내로 적용될 수 있다. 당해 조성물은 바람직하게 근육내 또는 비강내, 가장 바람직하게는 근육내로 적용될 수 있다. 동물 신체에서, 상기된 바와 같은 약제학적 조성물을 정맥내 또는 표적 조직으로의 직접 주사를 통해 적용하는 것이 유리함을 입증할 수 있다. 전신 적용을 위해, 정맥내, 혈관내, 근육내, 비강내, 동맥내, 복강내, 경구 또는 수막강내가 바람직하다. 보다 국소적인 적용은 피하, 피내, 피부내, 심장내, 폐내, 경막내, 폐내, 또는 처리될 조직(연결-, 골-, 근육-, 신경-, 상피 조직)에 직접 또는 근처에 적용하여 수행될 수 있다. 목적하는 처리 기간 및 효과에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로 예를 들어, 수일, 수주 또는 수개월동안 매일 및 상이한 용량으로 투여될 수 있다.
바람직하게, 상기된 바와 같은 하나 이상의 면역원성 조성물의 용량은 이를 필요로 하는 피험자에게 근육내로 투여된다. 추가의 측면에 따라, PCV2 항원 또는 상기된 바와 같은 임의의 당해 PCV-2 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제형화되고 용량당 1ml로 투여된다. 따라서, 추가의 측면에 따라 본 발명은 또한 PCV2로 감염된 돼지에서 림프선병증, 림프계 고갈 및/또는 다핵화된/거대 조직구를 감소시키거나 경감시키기 위해 본원에 기재된 PCV-2 항원을 포함하는 1ml의 면역원성 조성물에 관한 것이다.
추가의 측면에 따라, 본 발명은 또한 돼지에서 하기의 증상중 하나 또는 다수의 증상과 복합된 림프선병증을 감소시키거나 경감시키기 위해 본원에 기재된 바와 같은 PCV-2 항원을 포함하는 1ml의 면역원성 조성물에 관한 것이다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등.
추가의 측면에 따라, 상기된 바와 같은 1용량 이상의 면역원성 조성물은 이를 필요로 하는 피험자에게 투여되고 2번째 또는 추가의 투여는 첫번째 또는 임의의 이전의 투여 시기를 적어도 14일 지난 시점에 주어진다. 바람직하게, 면역원성 조성물은 면역 자극제와 함께 투여된다. 바람직하게, 당해 면역 자극제는 2회 이상 주어진다. 바람직하게, 면역 자극제의 첫번째와 두번째 또는 임의의 추가의 투여 시점간의 공백은 3일 이상, 보다 바람직하게는 5일 이상, 보다 더 바람직하게는 7일 이상이다. 바람직하게, 면역 자극제는 본원에 제공된 면역원성 조성물의 초기 투여 시점 이후 10일째, 바람직하게는 15일째, 보다 더 바람직하게는 20일째, 보다 더 바람직하게는 22일째에 주어진다. 바람직한 면역 자극제는 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLA)이고, 바람직하게는 불완전 프로인트 보조제(KLH/ICFA)로 유화된다. 여기서, 그러나 당업자에게 공지된 임의의 다른 면역 자극제가 또한 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "면역 자극제"는 바람 직하게 특정 면역 반응, 예를 들어, 특정 병원체에 대한 면역 반응을 개시하거나 증가시키는 것 없이 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 제제 또는 조성물을 의미한다. 이것은 추가로 적합한 용량으로 면역 자극제를 투여하도록 지시된다.
더욱이, 이것은 또한 놀랍게도 본원에 사용된 면역원성 조성물, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 조성물, 보다 더 바람직하게는 Carbopol과 배합된 조성물의 면역원성 잠재력이 추가로 IngelVac PRRS MLV 백신의 투여에 의해 확인될 수 있는 것으로 밝혀졌다 ( 실시예 5 참조). PCV2 임상적 징후 및 질환 증상은 PRRS 감염이 존재하는 경우 크게 증대된다. 그러나, 본원에 제공된 바와 같은 면역원성 조성물 및 백신 접종 전략은 당해 효과를 예상되는 것 보다 훨씬 크게 경감시킨다. 다른 말로, 동물, 바람직하게는 애기 돼지가 본원에 제공된 바와 같은 임의의 PCV2 ORF2 면역원성 조성물 및 Ingelvac PRRS MLV 백신 (Boehringer Ingelheim)으로 처리되는 경우 예상치 않은 공동상승 효과가 관찰되었다.
도 1은 PCV2 ORF2 재조합 바쿨로바이러스의 바람직한 작제에 대한 도식적 흐름도이고,
도 2a 및 2b는 각각 본 발명에 따라 사용되는 조성물중 하나를 제조하는 방법에 대한 도식적 흐름도이다.
하기의 실시예는 본 발명에 따른 바람직한 재료 및 과정을 제시한다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 및 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 현재 기재되어 있다. 그러나 당해 실시예가 단지 설명을 목적으로 제공되는 것이지 여기에 어떠한 것도 본 발명의 전체 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 하는 것으로 이해되어야만 한다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 방법을 사용한 ORF2의 상대적 수율을 당업계에 공지된 방법에 의한 수율과 비교한다. 4개의 1000mL 스피너 플라스크에 각각 300ml의 곤충 무혈청 배지, Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) 중의 약 1.0 x 106 Sf+ 세포/ml을 씨딩하였다. 마스터 세포 배양물을 SF+ (스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)) 마스터 세포 스톡, 계대 19, Lot#N112-095W로 표시한다. SF+ 마스터 세포 스톡을 생성하기 위해 사용되는 세포는 기관[Protein Sciences Corporation, Inc., Meriden, CT]으로부터 수득하였다. 본 실시예용의 SF+ 세포주는 계대 19회 내지 59회로 국한한다. 다른 계대수도 본 발명의 목적을 위해 작용하지만 대량 생산을 위해 당해 과정을 스케일 업하기 위해서는 적어도 19회 계대가 필요할 수 있고 59회 초과의 계대는 발현에 대해 효과를 나타낼 수 있지만 이것은 연구되지 않았다. 보다 상세하게, 액체 질소 저장으로부터 초기 SF+ 세포 배양물을 일정한 진탕과 함께 멸균 스피너 플라스크에서 Excell 420 배지에서 현탁 상태로 성장시켰다. 배양물을 100mL 내지 250mL용 스피너 플라스크에서 25 내지 150ml의 Excell 420 무혈청 배지를 사용하여 성장시켰다. 세포가 세포 밀도 1.0 - 8.0 x 106 세포 /mL로 증식한 경우, 이들을 새로운 용기에 밀도 0.5 - 1.5 x 106 세포/mL로 나누어 분주한다. 후속 현탁 배양물을 25 내지 29℃에서 2 내지 7일동안 36리터 이하 크기의 스피너 플라스크에서 성장시키거나 300리터 이하의 스테인레스강 생물반응기에서 성장시켰다.
씨딩 후, 당해 플라스크를 4시간동안 27℃ 에서 배양하였다. 이어서, 각각의 플라스크에 PCV2 ORF2 유전자(서열번호 4)를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스를 씨딩하였다. PCV2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스를 다음과 같이 제조하였다: PCV2의 북아메리카 균주 기원의 PCV2 ORF2 유전자를 5' Kozak 서열(서열번호 1) 및 5' EcoR1 부위(서열번호 2)를 함유하도록 PCR 증폭시키고 pGEM-T-Easy 벡터(Promega, Madison, WI)에 클로닝하였다. 이어서, 후속적으로 절단하여 절단 벡터 pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)에 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 부분은 본원에서 서열번호 7로서 나타낸다. PCV2 ORF 2 유전자를 함유하는 pVL1392 플라스미드는 N47-064Y로 지정함에 이어서 BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen) 바쿨로바이러스 DNA와 함께 Sf+ 곤충 세포 (Protein Sciences, Meriden, CT)를 동시 형질감염시켜 PCV2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스를 제조하였다. 새로운 작제물은 서열번호 8로서 본원에 제공된다. PCV2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스는 플라크 정제하고 마스터 씨드 바이러스(MSV)는 SF+ 세포주상에서 증식시키고 분취하여 -70℃ 에 저장하였다. MSV는 바쿨로바이러스 특이적 프라이머에 의해 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스로서 양성으로 확인되었다. MSV 또는 워킹 씨드 바이러스를 제조하기 위해 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스로 감염된 곤충 세포는 간접 형광 항체 분석에서 폴리클로날 혈청 또는 모노클로날 항체에 의해 검출되는 바와 같은 PCV2 ORF2 항원을 발현한다. 추가로, PCV2 ORF2 바쿨로바이러스의 실체는 N- 말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다. PCV2 ORF2 바쿨로바이러스 MSV는 또한 9 C.F.R. 113.27 (c), 113.28, 및 113.55에 따라 순도에 대해 시험하였다. 스피너 플라스크에 씨딩된 각각의 재조합 바쿨로바이러스는 다양한 감염 다중도(MOI)를 갖는다. 플라스크 1에 7.52mL의 .088 MOI 씨드를 씨딩하고; 플라스크 2에 3.01mL의 0.36MOI 씨드를 씨딩하고; 플라스크 3에 1.5mL의 0.18MOI 씨드를 씨딩하고; 플라스크 4에 0.75mL의 0.09MOI 씨드를 씨딩하였다. PCV2 ORF2 재조합 바쿨로바이러스를 작제하는데 사용되는 기본 단계를 설명하는 도식적 흐름도는 도 1로서 제공된다.
바쿨로바이러스를 씨딩한 후, 이어서 플라스크를 7일동안 27℃ ±2℃ 에서 배양하고 또한 당해 시간동안에 100rpm으로 진탕시켰다. 플라스크는 통기 캡을 사용하여 공기가 통하도록 한다. 각각의 플라스크 기원의 샘플은 다음 7일동안 24시간 마다 채취하였다. 추출 후, 각각 샘플을 원심분리하고 펠렛 및 상등액 둘다를 분리하고 이어서 0.45-1.0 m 공극 크기 막을 통해 미세 여과하였다.
이어서 수득한 샘플내에 존재하는 ORF2의 양을 ELISA 분석을 통해 정량하였다. ELISA 분석은 포획 항체 돼지 항-PCV2 Pab IgG Prot를 사용하여 수행하였다. 정제된 G(PBS중에서 1:250으로 희석됨)를 0.05M 카보네이트 완충액 (pH 9.6)중에서 1:6000으로 희석시켰다. 이어서 100㎕의 항체를 미세역가 플레이트의 웰에 위치시키고 밀봉하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 당해 플레이트를 0.5mL의 Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO), 100mL의 10X D-PBS (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 899.5mL의 증류수로 구성된 세척 용액으로 3회 세척하였다. 이어서, 250㎕의 차단 용액 (10ml의 D-PBS QS과 100ml까지 채워지는 증류수중의 5g 카네이션 비지방 건조 우유(Carnation Non-fat dry milk) (Nestle, Glendale, CA))을 각각의 웰에 첨가하였다. 다음 단계는 시험 플레이트를 세척하고 이어서 미리 희석된 항원을 첨가하는 것이다. 예비 희석된 항원은 200㎕의 희석 용액(999.5ml의 D-PBS중의 0.5ml Tween 20) 을 희석 플레이트상의 웰 각각에 첨가하여 제조하였다. 이어서 당해 샘플을 1:240 비율 및 1:480 비율로 희석하고 이어서 각각 희석된 샘플 100㎕를 희석 플레이트상의 상부 웰중 하나에 첨가하였다(즉, 하나의 상부 웰에 100㎕의 1:240 희석액을 첨가하고 나머지에는 100㎕의 1:480 희석액을 첨가하였다). 이어서 각각의 연속 웰로부터 100㎕을 제거하고 이를 플레이트상의 다음 웰에 첨가하여 플레이트의 나머지 웰을 연속 희석시켰다. 각각의 웰은 다음 전달을 하기 전에 혼합하였다. 시험 플레이트 세척은 세척 완충액으로 플레이트를 3회 세척시키는 것을 포함했다. 이어서 플레이트를 밀봉하고 세척 완충액으로 3회 이상 세척하기 전에 1시간동안 37℃에서 항온처리하였다. 사용되는 검출 항체는 PCV ORF2에 대한 모노클로날 항체였다. 희석 용액중에서 1:300으로 희석시키고 이어서 희석된 검출 항체 100㎕를 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 밀봉하고 세척 완충액으로 3회 세척하기 전에 37℃에서 1시간동안 항온처리하였다. 이어서 접합체 희석액은 정상 래빗 혈청 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)을 희석 용액에 첨가하여 1% 농도가 되게함에 의해 제조하였다. 접합체 항체 염소 항-마우스 (H+l)-HRP (Jackson Immunoresearch)을 접합체 희석액에서 1:10,000으로 희석시켰다. 이어서 100㎕의 희석된 접합체 항체를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 밀봉하고 세척 완충액으로 3회 세척하기 전에 37℃에서 45분동안 항온처리하였다. 이어서 100㎕의 기질 (TMB Peroxidase Substrate, Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersberg, MD)을 동량의 퍼옥시다제 기질 B(KPL)과 혼합하고 각각의 웰에 첨가하였다. 당해 플레이트를 15분동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서 100㎕의 1N HCL 용액을 모든 웰에 첨가하여 반응을 종료시켰다. 이어서 플레이트를 ELISA 판독기로 판독하였다. 당해 분석 결과는 하기 표 1에 나타낸다:
Figure 112008054440425-PCT00001
당해 결과는 항온처리 시간이 연장되는 경우 원심분리된 세포 및 배지의 상등액으로의 ORF2의 발현이 원심분리된 세포 및 배지의 펠렛에서의 발현 보다 높았다. 따라서, 5일 이상 동안 발현을 진행시키고 세포로부터 ORF2를 회수하는 것이 5일 미만 동안 발현을 진행시키고 세포로부터 ORF2를 회수하는 것 보다 ORF2의 수율을 크게 증가시키고 이전 방법 보다 크게 개선된 방법을 제공한다.
실시예 2
본 실시예는 본원에 청구된 발명의 효능에 대한 데이터를 제공한다. 1000mL 스피너 플라스크에 300ml의 Excell 420 배지중의 약 1.0 x 106 Sf+ 세포/ml을 씨딩하였다. 이어서 플라스크를 27℃에서 배양하고 100rpm에서 진탕시켰다. 이어서 배양 24시간 후 0.1의 MOI로서, 당해 플라스크에 10 mL의 PCV2 ORF2/Bac p+6 (Sf9 곤충 세포중 6회 추가로 계대된 PCV2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스) 바이러스 씨드로 씨딩하였다.
이어서 플라스크를 총 6일동안 27℃에서 배양하였다. 배양 후, 이어서 플라스크를 원심분리하고 수득한 상등액의 3개의 샘플을 수거하고 불활성화시켰다. 상등액의 온도가 37 ±2℃가 되도록 하여 상등액을 불활성화시켰다. 제1 샘플에 대해, 0.3N NaOH중의 0.2M 2급 에틸렌이민(BEI)으로 폐환된 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드 0.4M 용액을 상등액에 첨가하여 BEI의 최종 농도가 5mM이 되도록 하였다. 제2 샘플에 대해, 10mM BEI를 상등액에 첨가하였다. 제3 샘플에 대해, 어떠한 BEI도 상등액에 첨가하지 않았다. 이어서 당해 샘플을 48시간동안 연속으로 교반하였다. 최종 최소 농도가 5mM인 1.0 M의 티오황산나트륨 용액을 첨가하여 임의의 잔류 BEI를 중화시켰다. 이어서 각각의 샘플중의 ORF2의 양은 실시예 1에 기재된 바와 같이 동일한 ELISA 분석 과정을 사용하여 정량하였다. 이의 결과는 하기 표 2에 나타낼 수 있다:
Figure 112008054440425-PCT00002
본 실시예는 BEI로의 중화가 상당량의 PCV2 ORF2 단백질 생성물을 제거하거나 분해시키지 못함을 입증한다. 이것은 BEI 또는 승온에 의해 상등액중의 ORF2가 크게 손실되지 않는다는 사실에 의해 입증된다. 당업자는 회수된 ORF2가 안정한 단백질 생성물임을 인지할 것이다.
실시예 3
본 실시예는 본 발명이 재조합 PCV2 ORF2의 소규모 생산으로부터 재조합 PCV2 ORF2의 대규모 생성으로 증가될 수 있음을 입증한다. 7000ml의 ExCell 420 배지중 5.0 x 105 세포 /ml 의 SF+ 세포 /ml을 20000mL Applikon 생물반응기에 분주하였다. 이어서 배지 및 세포를 27℃에서 항온처리하고 다음 68시간동안 100RPM에서 진탕시켰다. 68시간 째에, 41.3mL의 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스 MSV+3를 7000mL의 ExCell 420 배지에 첨가하였다. 이어서 수득한 혼합물을 생물반응기에 첨가하였다. 다음 7일동안, 당해 혼합물을 27℃에서 배양하고 100RPM에서 진탕시켰다. 생물반응기로부터의 샘플을 감염 후 4일째에 개시하여 24시간 마다 추출하고 각각의 샘플을 원심분리하였다. 샘플의 상등액을 보존하고 이어서 ORF2의 양을 SDS-PAGE 밀도측정기를 사용하여 정량하였다. 당해 결과는 하기 표 3에 나타낼 수 있다:
Figure 112008054440425-PCT00003
실시예 4
본 실시예는 7개의 PCV2 후보 백신의 효능을 시험하고 추가로 독성 PCV2 종으로의 노출 후 효능 계수를 한정한다. 108마리의 제왕 절개 유래 초유 고갈(CDCD) 새끼 돼지(9 내지 14일령)를 무작위로 동일 크기의 9개 그룹으로 나누었다. 표 4는 본 실시예에 대한 일반적인 연구 디자인을 제시한다.
Figure 112008054440425-PCT00004
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적합한 세포 배양에서 증식한 PCV2 바이러스
7개의 그룹 (그룹 1 - 7)에 PCV2 ORF2 폴리펩타이드 용량을 투여하고 그룹중 하나는 챌린지 대조군으로서 작용하고 어떠한 PCV2 ORF2를 함유하지 않고 또 다른 그룹은 엄중 네가티브 대조군 그룹으로서 작용하고 또한 PCV2 ORF2를 함유하지 않았다. 0일째에, 그룹 1 내지 7을 할당 백신으로 처리하였다. 그룹 7에서 새끼 돼지에 14일째에 부스터 처리를 하였다. 새끼 돼지는 백신 접중 후 부작용 및 주사 부위 반응에 대해 관찰되었고 새끼 돼지는 제2 연구 장소로 이동시켰다. 제2 연구 장소에서, 그룹 1-8은 하나의 빌딩에 거주된 그룹인 반면 그룹 9는 별도의 빌딩에 거주시켰다. 모든 돼지에 21일 및 27일 및 24일째에 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)/불완전 프로인트 보조제(ICFA)를 투여하였고 그룹 1 내지 8은 독성 PCV2를 챌린지하였다.
챌린지 전후, PCV2 혈청 분석을 위해 혈액 샘플을 채취하였다. 챌린지 후, 평균 하루 체중 증가(ADWG)에 대한 체중 데이터 및 임상적 증상, 및 비강 면봉 샘플을 수거하여 PCV2 비강 발산을 측정하였다. 49일째에, 모든 생존 돼지를 검시하고 폐를 병변에 대해 스코어링하고 선택된 조직을 훗날 면역조직화학(IHC) 시험을 위해 포르말린중에 보존하였다.
재료 및 방법
이것은 0일째에 9 내지 14일령의 CDCD 돼지에서 수행된 부분적 맹검 백신접종 챌린지 실행가능 연구였다. 당해 연구에 포함되는 암퇘지의 PCV2 IFA 역가는 1:1000 이하이었다. 추가로, 혈청학적 상태의 암퇘지는 공지된 PRRS-네가티브 무리로부터 기원하였다. 28마리의 암퇘지를 PCV2 혈청학적 상태에 대해 시험하였다. 14마리의 암퇘지는 1000이하의 PCV2 역가를 가졌고 제1 연구 장소로 이동시켰다. 110마리 (110)의 새끼 돼지가 제왕 절개 수술에 의해 출산되었고 -4일째에 당해 연구를 위해 유용하였다. -3일째에, 제1 연구 장소에서 108마리의 CDCD 돼지의 무게를 재고 귀에 태그하여 표시하고 무게에 따라 구획화하여 무작위로 9개 그룹중 하나에 할당하고 이는 표 4에 제시되어 있다. 내부 표준을 충족시키는 임의의 시험 동물이 당해 연구에 입회되고 이후에 임의의 이유 때문에 배제되는 경우, 연구자 및 관리자는 협의하여 최종 분석에서 동물로부터 수거된 데이터의 용도를 결정하였다. 입회된 새끼 돼지가 배제된 날짜 및 배제 이유를 작성하였다. 처음에는 어떠한 암퇘지도 배제되지 않았다. 가용한 110마리의 돼지중 총 108마리를 -3일째에 9개 그룹중 하나에 무작위로 할당하였다. 2개의 최소 돼지 (17번 및 19번)는 그룹에 할당하지 않았고 경우에 따라 여분으로서 유용하였다. 연구 과정동안에, 여러 동물을 제거하였다. -1일째 돼지 82번 (그룹 9), 3일째 돼지 56번(그룹 6), 4일째 돼지 53번(그룹 9), 8일째 돼지 28번(그룹 8), 7일째 돼지 69번(그룹 8) 및 9일째 돼지 93번(그룹 4)은 각각 챌린지전에 죽은채로 발견되었다. 이들 6마리의 돼지는 최종 연구 결과에서 배제되지 않았다. 돼지 17번(여분의 돼지중 하나)을 그룹 9에 할당하였다. 나머지 여분의 돼지 19번은 연구로부터 배제하였다.
그룹 각각에 주어진 제형은 다음과 같다: 그룹 1은 16㎍의 ORF2/ml.을 함유하는 1ml의 바이러스 ORF(vORF)2를 투여받도록 디자인하였다. 이것은 10.24 ml의 바이러스 ORF2 (256㎍/25㎍/ml = 10.24 ml vORF2) 를 3.2 ml의 0.5% Carbopol 및 2.56 ml의 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4)와 혼합하여 수행하였다. 이로써 그룹 1에 대한 16ml의 제형을 제조하였다. 그룹 2는 8ug의 vORF2/ml을 함유하는 1ml의 vORF2를 투여받도록 디자인하였다. 이것은 5.12 ml의 vORF2 (128㎍/25㎍/ml = 5.12 ml vORF2) 를 3.2 ml의 0.5% Carbopol 및 7.68 ml의 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4)와 혼합하여 수행하였다. 이로써 그룹 2에 대한 16ml의 제형을 제조하였다. 그룹 3은 4g의 vORF2/ml을 함유하는 1ml의 vORF2를 투여받도록 디자인하였다. 이것은 2.56 ml의 vORF2 (64㎍/25㎍/ml = 2.56 ml vORF2) 를 3.2 ml의 0.5% Carbopol 및 10.24 ml의 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4)와 혼합하여 수행하였다. 이로써 그룹 3에 대한 16ml의 제형을 제조하였다. 그룹 4는 16g의 rORF2/ml을 함유하는 1ml의 재조합 ORF2(rORF2)를 투여받도록 디자인하였다. 이것은 2.23 ml의 rORF2 (512㎍/230㎍/ml = 2.23 ml rORF2) 를 6.4 ml의 0.5% Carbopol 및 23.37 ml의 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4)와 혼합하여 수행하였다. 이로써 그룹 4에 대한 32ml의 제형을 제조하였다. 그룹 5는 8ug의 rORF2/ml을 함유하는 1ml의 rORF2를 투여받도록 디자인하였다. 이것은 1.11 ml의 rORF2 (256㎍/230㎍/ml = 1.11 ml rORF2) 를 6.4 ml의 0.5% Carbopol 및 24.49 ml의 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4)와 혼합하여 수행하였다. 이로써 그룹 5에 대한 32ml의 제형을 제조하였다. 그룹 6은 8ug의 rORF2/ml을 함유하는 1ml의 rORF2를 투여받도록 디자인하였다. 이것은 0.56 ml의 rORF2 (128㎍/230㎍/ml = 0.56 ml rORF2) 를 6.4 ml의 0.5% Carbopol 및 25.04 ml의 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4)와 혼합하여 수행하였다. 이로써 그룹 6에 대한 32ml의 제형을 제조하였다. 그룹 7은 MAX PCV2 KV를 함유하는 2ml의 PCV2 전체 사멸 세포 백신(PCV2 KV)를 투여받도록 디자인하였다. 이것은 56ml의 PCV2 KV를 14ml의 0.5% Carbopol과 혼합하여 수행하였다. 이로써 그룹 7에 대한 70ml의 제형을 제조하였다. 최종적으로 그룹 8은 2ml의 용량당 0.5㎍/ml 또는 1.0㎍/ml에서 KLH를 투여받도록 디자인하였다. 이것은 40.71 ml의 KLH (0.5㎍/ml = 570 ml (7.0㎍/ml)(x) = (0.5)(570 ml)에서 7.0㎍ 단백질 /ml)를 244.29 ml의 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4) 및 285ml의 프로인트 보조제와 혼합하여 수행하였다. 표 5는 당해 실시예의 주요 활성에 대한 시간 프레임을 기재한다.
Figure 112008054440425-PCT00005
연구의 생존 기간내(in-life) 단계의 종료 후, 포르말린 고정된 조직은 병리학자에 의한 PCV2 항원의 검출을 위해 면역조직화학(IHC)에 의해 조사하였고 혈액 샘플은 PCV2 혈청 분석을 위해 평가하고 비강 면봉 샘플은 PCV2 발산에 대해 평가하고 평균 하루 체중 증가(ADWG)는 24일 내지 49일에 측정하였다.
동물들은 생후 11일령까지 5개의 방에 각각의 케이지로 제1 연구 장소에 거주시켰다(대략 연구 0일째). 각각의 방은 구획 배치가 동일하고 각각의 분리 유니트에 별도로 가열되고 여과된 공기가 공급되는 겹겹이 쌓여진 스테인레스 강 케이지로 구성되어 있다. 각각의 방은 별도의 열 및 통기 장치를 가져 방간의 공기가 교차 오염되는 것을 방지한다. 동물은 제2 연구 장소에서 2개의 상이한 빌딩에 거주시켰다. 그룹 9 (엄중 네가티브 대조군 그룹)은 변형된 사육 빌딩에 거주시키고 그룹 1-8은 변형된 골진 빌딩에 거주시켰다. 각각 그룹은 별도의 펜(펜당 11마리 또는 12마리 돼지)에 거주시키고 각각의 펜은 돼지당 약 3.0 평방 피트를 제공하였다. 각각의 펜은 플라스틱 창살 층을 갖는 상승된 갑판상에 위치하였다. 펜 아래 구덩이는 배설물 및 폐기물을 위한 저장 탱크로서 사용하였다. 각각의 빌딩은 자신의 별도 가열 및 통기 시스템을 갖고 있어 빌딩간의 공기가 교차 오염될 가능성이 적다.
제1 연구 장소에서, 새끼 돼지에는 생후 약 3주령까지 특별히 제형화된 우유 사료를 공급하였다. 모든 새끼 돼지는 19일까지는 고형의 특별한 혼합 사료를 소비하였다(대략 4 1/2 주령). 제2 연구 장소에서, 모든 새끼 돼지에는 임의로 이들의 나이 및 체중에 적당한 통상의 비-약제 시판용 혼합 사료를 공급하였다. 양 연구 장소에서 물은 또한 임의로 가용하였다.
모든 시험 돼지를 2일째에 비타민 E로 처리하였고 1일째에 철을 주사하고 16, 17, 18 및 19일째에는 NAXCEL® (1.0 mL, IM, 교대로 돼지의 허벅다리)를 주사하였다. 또한, 다양한 건강 이유 때문에, 돼지 52번 (그룹 9)는 3일째에 철을 주사하여 처리하였고 돼지 45번(그룹 6)은 11일째에 철을 주사하여 처리하였고, 돼지 69번(그룹 8)은 6일째에 NAXCEL®를 처리하였고, 돼지 74번 (그룹 3)은 14일째에 덱사메타존 및 페니실린을 처리하였고 돼지 51번(그룹 1)은 13일째에 덱사메타존 및 페니실린으로 처리하였고 14일째에는 NAXCEL® 을 처리하였다.
2개의 연구 장소에서 연구동안에 돼지는 수의적 보호하에 있었다. 동물 건강 검사는 0일째에 수행하고 건강 검사 기록 형태상에 기록하였다. 모든 동물은 0일째 관찰에 의해 측정된 바와 같이 백신 접종 전에 양호한 건강 및 영양 상태에 있었다. 모든 시험 동물은 챌린지 전에 양호한 건강 및 영양 상태에 있는 것으로 관찰되었다. 시체 및 조직은 렌더링에 의해 처분하였다. 연구 동물의 최종 처리는 동물 처리 기록물에 기록하였다.
0일째에, 그룹 1-6으로 할당된 돼지에 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1/2" 바늘을 사용하여 좌측 경부 영역에 각각 1.0ml의 PCV2 백신 1-6번(IM)을 투여하였다. 그룹 7에 할당된 돼지에는 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x " 바늘을 사용하여 좌측 경부 영역에 각각 2.0ml의 PCV2 백신 7번(IM)을 투여하였다. 14일째에, 그룹 7에 할당된 돼지에 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x " 바늘을 사용하여 우측 경부 영역에 각각 2.0ml의 PCV2 백신 7번(IM)을 투여하였다.
21일째에, 모든 시험 돼지에는 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 우측 허벅다리 영역에 2.0ml의 KLH/ICFA(IM)을 투여하였다. 27일째에 모든 시험 돼지에는 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 좌측 허벅다리 영역에 2.0ml의 KLH/ICFA을 투여하였다.
24일째에, 그룹 1-8에 할당된 돼지에는 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 좌측 경부 영역에 1.0ml의 PCV2 ISUVDL 챌린지 재료((5.11 log10 TCID50/mL)(IM)을 투여하였다. 추가로 동일한 재료 1.0ml은 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 비강 캐뉼라를 사용하여 각각의 돼지(콧구멍당 0.5ml)에 IN으로 투여하였다.
시험 돼지는 4일째 및 0일부터 19일까지 전반적인 건강 및 부작용에 대해 매일 관찰하였다. 관찰은 임상 관찰 기록부에 기록하였다. 모든 시험 돼지는 0일부터 7일까지 관찰하고 그룹 7은 주사 부위 반응에 대해 14일부터 21일까지 추가로 관찰하였다. 평균 하루 체중 증가는 각각의 돼지를 3일, 24일 및 49일째 또는 챌린지 후 돼지가 죽은채로 발견된 날에 보정된 눈금상에서 칭량하여 결정하였다. 체중은 체중 양식에 기록하였다. 3일째의 체중을 사용하여 무작위화전에 돼지를 나누었다. 24일째 및 49일째에 체중 데이터를 사용하여 당해 시점동안에 각각의 돼지에 대한 평균 하루 중량 증가(ADWG)를 측정하였다. 챌린지 후 및 49일째 전에 죽은 돼지에 대해 ADWG가 24일째부터 죽은 날까지의 ADWG를 나타내도록 조정하였다.
PCV2 혈청 상태를 측정하기 위해, 정맥 전혈을 3일째 및 14일째에 각각의 돼지의 안와 정맥동으로부터 채혈하였다. 각각의 새끼 돼지에 대해, 멸균 모세관 튜브를 안구중 하나의 내측 안각으로 삽입하고 약 3.0ml의 전혈을 4.0ml의 혈청 분리기 튜브(SST)에 뽑아내어 채혈하였다. 24일째, 31일째 및 49일째에, 각각의 돼지로부터 정맥 전혈을, 멸균 18g x 1 1/2" Vacutainer 바늘 (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey), Vacutainer 바늘 홀더 및 13 mL SST를 사용하여 전방 대정맥으로부터 채혈하였다. 각각의 시점에서 채혈은 샘플 수거 기록부에 기록하였다. 각각의 SST에서의 혈액은 방치하여 응고시키고 이어서 각각의 SST는 회전 침강시키고 혈청을 수거하였다. 수거된 혈청은 멸균 스냅 튜브로 옮기고 훗날에 시험될때까지 -70 ±10℃에서 저장하였다. 혈청 샘플은 BIVI-R&D 퍼스널에 의해 PCV2 항체의 존재에 대해 시험하였다.
돼지는 임상적 징후에 대해 20일째부터 49일째까지 하루 1회 관찰하고 임상적 관찰은 임상적 관찰 기록부에 기록하였다.
PCV2 비강 발산에 대해 시험하기 위해, 24일째, 25일째 및 이어서 격일로 49일을 포함한 홀수날짜 연구일까지, 멸균 데이크론 면봉을 비강내부로 가능한한 무균적으로 각각의 돼지의 좌측 또는 우측 콧구멍(돼지 당 하나의 면봉)에 삽입하고 몇초동안 주변을 후비고 이어서 제거하였다. 각각의 면봉을 이어서 2% IFBS, 500 유니트 /mL의 페니실린, 500㎍/mL의 스트렙토마이신 및 2.5㎍/mL의 펀지존이 첨가된 1.0ml의 EMEM 배지 1.0ml을 함유하는 단일 멸균 스냅-캡 튜브에 위치시켰다. 당해 면봉을 튜브에서 잘라내고 스냅 튜브를 밀봉하고 동물 번호, 연구 번호, 수거 날짜, 연구일 및 "비강 면봉"으로 적당히 표지하였다. 밀봉된 스냅 튜브를 빙상에서 밤새 BIVI-St. Joseph으로 운송될때까지 -40 ±10℃에서 보관하였다. 비강 면봉 수거물을 비강 면봉 샘플 수거양식에 기록하였다. BIVI-R&D는 비강 면봉 샘플에 대해 PCV2에 대한 정량적 바이러스 분리(VI) 시험을 수행하였다. 당해 결과는 log10 값으로 표시하였다. 1.3 로그 이하의 값은 네가티브인 것으로 간주하고 1.3 로그 보다 큰 임의의 값은 포지티브인 것으로 간주하였다.
제1 연구 장소에서 죽은 돼지(번호 28, 52, 56, 69, 82, 및 93)은 진단하는데 필요한 수준까지 검시하였다. 그로스 병변을 기록하고 어떠한 조직도 당해 돼지로부터 유지되지 않았다. 제2 연구 장소에서, 49일째 전에 죽은 돼지 (번호 45, 23, 58, 35), 안락사전 49일째에 죽은 돼지 (번호 2, 43), 및 49일째 안락사된 돼지를 검시하였다. 임의의 그로스 병변을 기록하고 병변을 폐 부위의 %를 검시 보고양식에 기록하였다.
제2 연구 장소에서 검시된 103마리의 돼지 각각으로부터의 편도선, 폐, 심장, 간, 장간막 림프계, 신장 및 서혜부 림프계의 조직 샘플을 완충 10% 포르말린이첨가된 단일 용기에 위치시키고 동일한 상기 언급된 기관으로부터의 샘플을 휘를-팩(Whirl-pak) (M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, UK) 에 위치시키고 각각의 휘를 팩을 빙상에 위치시켰다. 각각의 용기를 적당해 표지시켰다. 샘플 수거를 검시 보고 양식에 기록하였다. 이후, 포르말린 고정된 조직 샘플 및 진단 요구 양식을 IHC 시험을 위해 제출하였다. IHC 시험은 수용 샘플, 샘플 및 슬라이드 제제 및 염색 기술을 위한 표준 ISU 연구 과정에 따라 수행하였다. 휘를 팩에서의 새로운 조직을 빙 팩과 함께 보관(-70 ±10℃) 및 가능한 향후 사용을 위해 연구 모니터로 운송하였다. 포르말린 고정된 조직은 IHC에 의한 PCV2 검출을 위해 병리학자에 의해 조사되었고 하기의 스코어링 시스템을 사용하여 스코어되었다: 0 = 부재; 1 = 약간의 포지티브 염색, 소수 부위; 2 = 중간정도의 포지티브 염색, 다수 부위; 및 3 = 풍부한 포지티브 염색, 조직을 통해 확산. 병리학자가 장간막 LN과 서혜부 LN을 능히 구별할 수 없었다는 사실로 인해, 당해 조직에 대한 결과는 단순히 림프계로서 표시하고 동물당 2개의 조직 각각에 대해 최고의 스코를 부여하였다.
결과
당해 실시예의 결과는 하기에 주어진다. 그룹 9 기원의 하나의 돼지가 0일째 전에 죽었고 5마리 이상의 돼지(그룹 4로부터의 1마리 돼지, 그룹 6으로부터 1마리의 돼지, 그룹 8로부터 2마리의 돼지 및 그룹 9로부터 1마리의 돼지)가 백신접종후 죽었음을 인지한다. 사후 조사는 모든 6마리가 백신접종 또는 PMWS과 관련되지 않은 잠재적인 감염으로 인해 죽었음을 지적했다. 추가로, 어떠한 부작용 또는 주사 부위 반응도 임의의 그룹에서 나타나지 않았다.
평균 하루 체중 증가 (ADWG) 결과는 하기 표 6에 나타낸다. 그룹 9인 엄중 네가티브 대조군 그룹은 최고의 ADWG (1.06 ± 0.17 lbs/일)을 갖고 이어서 그룹 5 (0.94 ±0.22 lbs/일)가 뒤를 이었고, 여기에는 8㎍의 rORF2의 1개 용량이 투여되었다. 4㎍의 vORF2의 1개 용량이 투여된 그룹 3은 최저의 ADWG (0.49 ±0.21 lbs/일)를 가졌고 이어서 사멸된 백신 2개 용량을 투여받은 그룹 7 (0.50 ±0.15 lbs/일)이 뒤를 이었다.
Figure 112008054440425-PCT00006
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
PCV2 혈청 분석 결과는 표 7에 나타낸다. 모든 9개의 그룹은 3일째에 PCV2 에 대해 혈청 음성이었다. 14일째에, vORF 백신을 투여받은 그룹은 187.5 내지 529.2에 이르는 최고의 역가를 나타내었다. 사멸된 바이러스 백신을 투여받은 돼지는 다음으로 최고의 역가를 나타내었고 다음으로는 rORF2 백신을 투여받은 그룹에서 나타났다. 그룹 8 및 9는 이 시점에서 혈청 음성으로 남아있었다. 24일 및 31일째에 vORF2 백신을 투여받은 돼지는 계속 강한 혈청학적 반응을 나타내었고 바로 뒤이어서 2회 용량의 사멸된 바이러스 백신을 투여받은 그룹에서 당해 반응이 나타났다. RORF2 백신을 투여받은 돼지는 혈청학적 반응이 느리게 나타났고 그룹 8 및 9는 계속 혈청음성이었다. 49일째에, vORF2 백신 및 2회 용량의 사멸된 바이러스 백신 및 최저 용량의 rORF2를 투여받은 돼지는 가장 강한 혈청학적 반응을 나타내었다. 16㎍ 및 8㎍의 rORF2 백신을 투여받은 돼지는 챌린지 대조군 보다 약간 높은 IFA 역가를 가졌다. 49일째에 그룹 9 는 강한 혈청학적 반응을 나타내었다.
Figure 112008054440425-PCT00007
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
*계산을 목적으로, a ≤100 IFA 역가는 "50"의 역가로서 지정하였고; a ≥6400 IFA 역가는 "12,800"의 역가로서 지정하였다.
**챌린지 일
***검시 일
챌린지 후 임상적 관찰로부터의 결과는 하기 표 8에 나타내었다. 당해 요약된 결과는 비정상적 행동, 비정상적 호흡, 기침 및 설사에 대한 관찰을 포함한다. 표 9는 그룹 전체에 대한 임상적 증상의 발생 빈도를 요약한 결과를 포함하고 표 10은 챌린지 후 그룹 치사율을 요약한 결과를 포함한다. 당해 연구에서 주지되는 가장 공통적인 임상적 증상은 비정상적 행동이었고 이것은 경증 내지 중증 무기력증으로 스코어되었다. 2회 보다 낮은 용량의 vORF2를 투여받은 돼지, 16㎍의 rORF2를 투여 받은 돼지 및 2회 용량의 KV 백신을 투여받은 돼지는 ≥ 27.3%의 발생 빈도율을 나타냈다. 8㎍의 rORF2 을 투여받은 돼지 및 엄중 음성 대조군 그룹은 어떠한 비정상적인 행동을 나타내지 않았다. 기침은 모든 그룹에서 자주 나타났고 (0 내지 25%), 설사도 나타났다 (0-20%). 주지된 임상적 증상의 어떠한 것도 PMWS에 대한 병 징후가 아니었다.
임상적 증상의 전체 발생 빈도는 그룹 마다 다양하였다. 임의의 vORF2 백신을 투여받은 그룹, 16㎍의 rORF2를 투여받은 그룹, 2회 용량의 KV 용량을 투여받은 그룹 및 챌린지 그룹은 전체 임상적 증상에 대해 최고의 발생 빈도 (≥36.4%)를 나타내었다. 엄중 음성 대조군 그룹, 8㎍의 rORF2를 투여받은 그룹 및 4㎍의 rORF2를 투여받은 그룹은 각각 임상적 증상에 대해 0%, 8.3% 및 9.1%의 전체 발생 빈도율을 나타냈다.
그룹 간의 전체 치사율은 또한 그룹마다 다양하였다. 2회 용량의 KV 백신을 투여받은 그룹은 최고의 치사율 (16.7%)을 나타내었고; 4㎍의 vORF2, 16㎍의 rORF2, 또는 8㎍의 rORF2를 투여받은 그룹 및 엄중 음성 대조군 그룹 모두는 0%의 치사율을 나타내었다.
Figure 112008054440425-PCT00008
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
1 각각의 그룹에서 1일 이상동안 임의의 비정상적인 행동을 나타낸 돼지의 총수
2 각각의 그룹에서 1일 이상동안 임의의 비정상적 호흡을 나타낸 돼지의 총수
3 각각의 그룹에서 1일이상동안 기침을 나타낸 돼지의 총수
4 각각의 그룹에서 1일 이상동안 설사를 나타낸 돼지의 총수
Figure 112008054440425-PCT00009
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
1 각각의 그룹에서 1일 이상동안 임의의 임상적 증상을 나타낸 돼지의 총수
Figure 112008054440425-PCT00010
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
PCV2는 비강 발산 결과는 하기 표 11에 나타낸다. 24일째에 챌린지 후, 그룹 7에서 1마리의 돼지는 27일째에 PCV2를 발산하기 시작하였다. 다른 어떠한 그룹도 33일까지는 발산을 경험하지 않았다. 비강 발산 양은 35일째부터 45일째까지 기록하였다. 3개의 vORF2 백신중 어느 하나를 투여 받은 그룹 및 4 또는 8㎍의 rORF2를 투여받은 그룹은 PCV2에 대해 최저의 비강 발생 빈도를 나타냈다 (≤9.1%). 챌린지 대조군 그룹 (그룹 8)은 최고의 발산율 (80%)을 나타냈고 그 다음으로는 엄중 음성 대조군 그룹(그룹 9)에서 나타났고 이의 발생 빈도율은 63.6%이었다.
Figure 112008054440425-PCT00011
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
황달(Icterus)의 그룹 발생 빈도, 위궤양의 그룹 발생 빈도, 그룹 평균 폐 병변 스코어 및 폐 병변의 그룹 발생 빈도에 대한 요약은 하기 표 12에 나타낸다. 6마리의 돼지는 백신 접종 후 연구 단계동안에 제1 시험 장소(그룹 4, N=1; 그룹 6, N=1; 그룹 8, N=2; 그룹 9, N=2)에서 죽었다. 6마리의 돼지중 4마리는 하나 이상의 체강에서 섬유소성 병변을 가졌고, 1마리의 돼지 (그룹 6)는 클로스트리디움 속 질환과 일치하는 병변을 가졌고 1마리의 돼지 (그룹 9)는 어떠한 육안적 병변을 갖지 않았다. 백신 접종 후 연구 단계동안에 죽은 돼지중 어떠한 것도 PMWS와 일치하는 병변을 갖지 않았다.
챌린지 후 죽은 돼지 및 49일째 안락사된 돼지를 검시하였다. 검시에서, 황달(icterus) 및 위궤양은 어떠한 그룹에도 나타나지 않았다. 평균 % 폐 병변과 관련하여, 그룹 9는 최저의평균 % 폐 병변(0%)를 나타내었고 이어서 그룹 1에서는 0.40 ±0.50% 로 나타났고 그룹 5에서는 0.68 ±1.15%로 나타났다. 그룹 2, 3, 7 및 8은 최고의 평균 % 폐 병변 (≥7.27%)을 나타내었다. 당해 4개 그룹의 각각은 ≥71.5%의 % 폐 병변을 가진 1마리의 돼지를 포함했고, 이는 당해 4개 그룹에 대한 보다 높은 결과를 왜곡시켰다. 0% 폐 병변이 나타난 그룹 9를 제외하고, 나머지 8개 그룹은 ≤36% 의 폐 병변을 나타냈다. 주지된 거의 모든 폐 병변은 적색/자주색으로 나타내어 공고히 하였다.
Figure 112008054440425-PCT00012
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
그룹 IHC 양성 발생 빈도 결과 요약은 표 13에 나타낸다. 그룹 1 (vORF2 - 16㎍) 및 그룹 5 (rORF2 - 8㎍)는 최저율의 IHC 양성 결과 (16.7%)를 나타내었다. 그룹 8 (챌린지 대조군) 및 그룹 9(엄중 음성 대조군) 는 각각 90% 및 99.9%의 최고의 IHC 양성 결과를 나타내었다.
Figure 112008054440425-PCT00013
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
챌린지 후, 1회 용량의 8ug의 rORF2 항원을 투여받은 그룹 5는 다른 6개 백신 그룹을 능가했다. 그룹 5는 최고의 ADWG (0.94 ± 0.22 lbs/일), 최저의 비정상적 행동의 발생 빈도 (0%), 2번째 최저의 기침 발생 빈도 (8.3%), 최저의 전체 임상적 증상의 발생 빈도 (8.3%), 최저의 치사율 (0%), PCV2에 대한 최저의 비강 발산율 (8.3%), 2번째 최저의 평균 % 폐 병변율 (0.68 ±1.15%) 및 양성 조직에 대한 최저의 발생 빈도율 (16.7%)을 나타내었다. 다양한 수준의 rORF2 항원 전체를 투여받은 그룹들은 다양한 수준의 vORF2를 투여받은 그룹을 능가했고 2회의 사멸된 전체 세포 PCV2 백신을 투여받은 그룹은 최악으로 나타났다. 표 14 및 15는 그룹 챌린지 후 데이터를 요약한 것이다.
Figure 112008054440425-PCT00014
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
Figure 112008054440425-PCT00015
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
당해 연구 결과는 모든 추가의 백신 연구 노력이 rORF2 백신에 집중되어야함을 지적한다. 전반적으로, PCV2의 비강 발산은 챌린지 후에 검출되었고 PCV2 백신을 사용한 백신 접종은 발산을 감소시켰다. 선택된 림프 조직의 면역조직화학은 백신 효능에 대한 우수한 파라미터로서 작용하고 ADWG, 임상적 증상 및 육안적 병변은 그룹간에 검출되지 않았다. 당해 연구는 외인성 PCV2가 연구동안에 몇몇 시점에 도입된다는 사실에 의해 복잡해지고 이는 엄중 음성 대조군 그룹인 그룹 9에서 PCV2의 비강 발산, PCV2 혈청전환 및 양성 IHC 조직에 의해 입증되었다.
논의
7개의 PCV2 백신은 본 연구에서 평가하였고 이는 0일째에 1회로 3개의 상이한 용량 수준의 vORF2 항원의 투여, 0일째에 1회로 3개의 상이한 용량 수준의 rORF2 항원의 투여 및 0일째 및 14일째 1회 용량의 사멸된 전세포 PCV2 백신의 투여를 포함했다. 전체적으로 8㎍ 의 rORF2 항원을 함유하는 1회 용량의 백신을 투여받은 그룹 5는 최상의 결과를 나타냈다. 그룹 5는 최상의 ADWG, 비장상적 행동의 최저 발생 빈도, 2번째 최저의 기침 발생 빈도, 최저율의 전체 임상적 증상, 최저의 치사율, PCV2에 대한 최저율의 비강 발산 발생 빈도율, 2번째 최저의 평균 % 폐 병변율 및 양성 IHC 조직에 대한 최저 발생 빈도율을 나타냈다.
흥미롭게도, 그룹 5보다 높은 용량의 rORF2를 투여받은 그룹 4는 또한 그룹 5와 유사하거나 이보다 우수하지 않았다. 그룹 4는 그룹 5보다 약간 최저의 ADWG, 보다 높은 발생 빈도율의 비정상적 행동, 보다 높은 발생 빈도율의 전체 임상적 증상, PCV2에 대해 보다 높은 비율의 비강 발산, 보다 높은 평균 % 폐 병변 및 보다 높은 비율의 양성 IHC 조직을 나타냈다. 2개의 그룹간의 차이를 지적할 수 있는 통계학적 분석은 통계적으로 중요하지 않아 이들 데이터에 대해 수행되지 않았지만 그룹 4가 그룹 5 만큼 우수하게 성취되지 않는다는 경향의 관찰이 있었다.
백신 접종 후, 6마리의 돼지는 제1 연구 장소에서 죽었다. 6마리의 돼지중 4마리는 그룹 8 또는 그룹 9 소속이었고 당해 그룹은 어떠한 백신도 투여받지 않았다. 6마리의 돼지중 어떠한 것도 PMWS와 일치하는 병변을 나타내지 않았고 어떠한 부작용도 보고되지 않았으며 전반적으로 모든 7개의 백신은 대략 11일령의 돼지에게 투여되는 경우 안전한 것으로 나타났다. 백신 접정 후 연구 단계 동안에, 3개 용량 수준의 vORF2 백신 또는 사멸된 전체 세포 백신중 어느 하나를 투여받은 돼지는 최고의 IFAT 수준을 나타낸 반면, 그룹 5는 백신 그룹의 챌린지 바로 전에 최저의 IFAT 수준을 나타냈다.
공식적으로 입증되지는 않았지만, PCV2가 이유 바로 직후 어린 새끼 돼지에게 전염되는 주요 경로는 구개비강의 직접적인 접촉에 의한 것으로 사료되고 생산 셋팅에서 PCV2에 대한 비강 발산을 감소시키는 효능적인 백신은 감염 전파의 억제를 도와준다. 3개의 vORF2 항원 수준중 하나를 투여받은 그룹 및 8ug의 rORF2를 투여받은 그룹은 PCV2에 대해 최저의 비강 발생 빈도율 (8.3%)을 나타냈다. 예상된 바와 같이, 챌린지 대조군 그룹은 최고의 비강 발산 발생 빈도율 (80%)을 나타냈다.
PCV2 감염에 따른 PMWS를 앓는 돼지에서 육안적 병변은 전형적으로 하기중 하나 이상과 복합된 일반화된 림프선병증으로 이루어진다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등. 검시에서, 황달(icterus), 간염, 신염 및 위궤양은 임의의 그룹에서 나타나지 않았고 림프선병증에 대해서는 구체적으로 조사되지 않았다. 평균 % 폐 병변 스코어는 그룹간에 다양하였다. 16㎍의 vORF2 항원을 투여받은 그룹은 최저 평균 % 폐 병변 스코어 (0.40 ±0.50%)를 나타냈고 다음으로는 , 8㎍의 rORF2를 투여받은 그룹에서 0.68 ±1.15% 스코어로 나타났다. 예상된 바와 같이, 챌린지 대조군 그룹은 최고의 평균 % 폐 병변 스코어 (9.88 ±29.2%)를 나타냈다. 모든 4개의 그룹에서, 평균 % 폐 병변 스코어는 매우 높은 폐 병변 스코어를 나타낸 각각의 그룹의 1마리의 돼지 때문에 상승하였다. 폐 병변의 대부분은 적색/자주색으로 나타내어 공고히하였다. 전형적으로, PMWS와 관련된 폐 병변은 갈색으로 나타냈고 소엽사이 부종과 중복하지 않는다. 본 연구에서 나타난 폐 병변은 또한 PCV2 감염 또는 존재할 수 있는 2차 폐 감염성 제제와는 관련이 없었다. 본 연구 내용에서, % 폐 병변 스코어는 PCV2로 인한 폐 감염 양에 대해 진실한 척도를 반영할 수 없다.
다른 연구자들은 IHC 및 조직병리 검사에 의해 PCV2 항원의 존재간에 직접적인 관련성을 입증했다. 선택된 조직에 대한 조직병리 검사는 본 연구에서 수행되지 않았다. 그룹 1 (16㎍의 vORF2) 및 그룹 5 (8㎍의 rORF2)는 PCV2 항원에 대해 최저 발생 빈도율의 돼지 양성을 나타냈고(8.3%), 그룹 9(엄중 음성 대조군 그룹 - 90.9%) 및 그룹 8 (챌린지 대조군 그룹 - 90.0%)은 PCV2 항원에 대해 최고 발생 빈도율의 돼지 양성을 나타냈다. 당해 시험의 비주관적 특성 때문에 IHC 결과는 백신 효능을 판단하는 최상의 파라미터중 하나 일 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 측면에서, PCV2 챌린지를 접한 CDCD 돼지 모델에서 추출된 PCV2 ORF2 (rORF2) 항원과 함께 1ml/1 용량 재조합 생성물의 최저 보호 용량(MPD)를 측정하였다. 다양한 수준의 rOFR2 항원을 투여받은 3개의 그룹에서, 그룹 5 (8㎍의 rORF2 항원)는 명백하게 최고 수준의 보호를 나타내었다. 그룹 5는 또한 최상의 결과를 나타내거나 시험된 모든 파라미터와 관련하여 최상의 유리한 결과와 동일하였다. 그룹 5가 챌린지 후 다른 6개의 백신 그룹과 비교되는 경우, 그룹 5는 최상의 ADWG (0.94 ±0.22 lbs/일), 비장상적 행동의 최저 발생 빈도(0%), 2번째 최저의 기침 발생 빈도(8.3%), 최저율의 전체 임상적 증상(8.3%), 최저의 치사율(0%), PCV2에 대한 최저의 비강 발산 발생 빈도율(8.3%), 2번째 최저의 평균 % 폐 병변율(0.68 ±1.15%) 및 양성 IHC 조직에 대한 최저 발생 빈도율(16.7%)을 나타냈다.
본 발명의 또 다른 측면에서, PCV2 챌린지에 접하게 되는 CDCD 돼지 모델에서 부분적으로 정제된 PCV2 ORF2(vORF2)인 1ml/l 용량의 통상적인 생성물의 MPD를 측정하였다. 다양한 수준의 vORF2 항원을 투여받은 3개의 그룹중, 그룹 1(16㎍의 vORF2)은 최고 수준의 보호를 나타내었다. 그룹 1은 ADWG, 평균 % 폐 병변 및 IHC와 관련하여 그룹 2 및 3을 능가했다. 그룹 1 및 2 (8㎍의 vORF2 항원)는 전체 임상적 증상의 발생 빈도과 관련하여 동일한 수행능을 가졌고, 그룹 3 (4㎍의 vORF2 항원)은 최저의 치사율을 나타냈고 모든 3개의 그룹은 비강 발산과 관련하여 동일한 수행능을 가졌다. 전체적으로, vORF 백신은 rORF 백신과 만큼 양호한 수행능을 갖지 못했다.
본 발명의 또 다른 측면에서, PCV2 챌린지를 접하는 CDCD 돼지 모델에서 2ml/2 용량의 통상적인 사멸된 PCV2 백신의 최대 용량 효능을 측정하였다. 본 연구에서 평가된 7개의 백신 중 사멸된 전체 세포 PCV2 백신은 최악의 수행능을 가졌다. 2회 용량의 사멸된 전체 세포 PCV2 백신을 투여받은 돼지는 최저의 ADWG, 2번째 최고율의 비정상적 행동(58.3%), 2번째 최고의 전반적 임상적 증상의 발생 빈도 (58.3%), 최고의 치사율 (16.7%), 2번째 최고의 비강 발산 발생 빈도율 (41.7%), 최고의 평균 % 폐 병변 (9.88 ±29.2%), 주지된 최고 발생 빈도의 폐 병변 (75%) 및 조직에서 중간 정도의 IHC 발생 빈도율 (41.7%)을 나타냈다. 그러나, 이것은 면역 반응을 유발하는데 여전히 효과적이었다.
본 발명의 또 다른 측면에서, PCV2의 비강 발산은 효능 파라미터로서 평가하였고 이전 연구의 이전 PCV2 효능 파라키미터를 재확인하였다. 이러한 연구로부터의 결과는 PCV2 비강 발산이 비강내 챌린지 후 발생하고 PCV2 백신이 챌린지 후 PCV2의 비강 발산을 감소시킴을 지적한다. 추가로, 당해 연구 및 문헌의 보고 결과는 IHC가 또한 향후 PCV2 백신 시험에서 계속 평가되어야함을 지적한다.
당해 연구로부터 비롯된 몇몇 추가의 결론은 림프선병증이 PMWS의 특징중 하나라는 것이다. PMWS의 특징 중 다른 하나는 림프 고갈 및 다핵화된/거대 조직구이다. 추가로, 어떠한 부작용 또는 주입 부위 반응이 임의의 7개의 PCV2 백신에 대해 나타나지 않았고 모든 7개의 PCV2는 어린 돼지에게 투여되는 경우 안전한 것으로 나타났다.
실시예 5
본 실시예는 8개의 PCV2 후보 백신의 효능을 시험하고 PCV2 독성 종에 노출에 따른 조기 챌린지 연구로부터의 PCV2 챌린지 파라미터를 재확인한다. 150마리의 제왕절개 유래 초유 유래(CDCD) 6 내지 16일령의 돼지는 중량에 따라 나누고 무작위로 동일 크기의 10개 그룹으로 나누었다. 표 16은 본 실시예에 대한 일반 연구 디자인을 제시한다.
Figure 112008054440425-PCT00016
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
각각의 그룹에 주어지는 백신 제형은 다음과 같다. 1 x 2ml의 용량으로 그룹 1에 투여되는 PCV2 백신 1번은 IMS 1314 (16 ug의 rORF2-IMS 1314)가 보조제로 추가되는 고용량(16 ug/2 ml 용량)의 불활성화된 재조합 ORF2 항원이었다. 1 x 2ml의 용량으로 그룹 2에 투여되는 PCV2 백신 2번은 Carbopol(16 ug vORF2-Carbopol)이 보조제로 추가된 고용량(16 ug/2 ml 용량)의 부분적으로 정제된 VIDO R-1 합성된 PCV2 ORF2 항원이었다. 1 x 2ml의 용량으로 그룹 3에 투여되는 PCV2 백신 3번은 Carbopol(16 ug vORF2-Carbopol)이 보조제로 추가된 고용량(16 ug/2 ml 용량)의 불활성화된 재조합 ORF2 항원이었다. 1 x 1ml의 용량으로 그룹 4에 투여되는 PCV2 백신 4번은 Carbopol(16 ug vORF2-Carbopol)이 보조제로 추가된 고용량(16 ug/2 ml 용량)의 부분적으로 정제된 VIDO R-1 합성된 PCV2 ORF2 항원이었다. 1 x 2ml의 용량으로 그룹 5에 투여되는 PCV2 백신 5번은 Carbopol(4 ug vORF2-Carbopol)이 보조제로 추가된 4ug/2 ml 용량의 불활성화된 재조합 ORF2 항원이었다. 1 x 2ml의 용량으로 그룹 6에 투여되는 PCV2 백신 6번은 Carbopol(1ug vORF2-Carbopol)이 보조제로 추가된 1ug/2 ml 용량의 불활성화된 재조합 ORF2 항원이었다. 1 x 2ml의 용량으로 그룹 7에 투여되는 PCV2 백신 7번은 Carbopol(0.25 ug vORF2-Carbopol)이 보조제로 추가된 저용량(0.25 ug/2 ml 용량)의 불활성화된 재조합 ORF2 항원이었다. 1 x 2ml의 용량으로 그룹 8에 투여되는 PCV2 백신 8번은 Carbopol(> 8.0 log KV Carbopol)이 보조제로 추가된 고용량(>8.0 log/2ml 용량)의 불활성화된 통상적인 사멸된 VIDO R-1 합성된 PCV2 Struve 항원이었다. 0일째에, 그룹 1-8을 이의 할당된 백신으로 처리하였다. 그룹 1-3 및 5-8에는 14일째 다시 이들 각각의 백신 부스터를 투여하였다. 1회 용량의 16㎍의 vORF2-Carbopol의 효과는 14일째 부스터를 투여받지 않았던 그룹 4에 대해 시험하였다. 2개의 백신 접종 후 돼지에 대해 부작용 및 주입 부위 반응을 관찰하였다. 21일째에 돼지를 제2 연구 장소로 이동시키고 이때, 그룹 1-9은 하나의 빌딩에 거주한 그룹이고 그룹 10은 별도의 빌딩에 거주하였다. 모든 돼지에는 22일 및 28일째에 불완전 프로인트 보조제(KLH/ICFA)로 유화된 키홀 림펫 헤모시아닌을 투여하였다. 25일째에, 그룹 1-9에는 약 4log의 독성 PCV2 바이러스를 챌린지하였다. 46일까지 챌린지 대조군 그룹에서는 거의 죽지 않았다. 돼지를 면역자극시키고 PCV2 챌린지 물질의 독성을 증가시키기 위한 시도에서, 모든 그룹을 46일째에 INGELVAC PRRSV MLV (돼지 생식 및 호흡 백신, 변형된 생바이러스)를 처리하였다.
챌린지 전 후 혈액 샘플은 PCV2 혈청 분석을 위해 수거하였다. 챌린지 후, 평균 체중 하루 증가분(ADWG)을 측정하고 임상적 징후를 관찰하기 위한 체중 데이터를 수거하였다. 30일째에, 모든 생존 돼지를 검시하고 육안적병변을 기록하고 폐는 병리 분석을 위해 스코어하고 선택된 조직은 훗날 PCV2 항원 검출을 위한 면역조직화학(IHC)에 의한 조사를 위해 포르말린중에서 보존시켰다.
재료 및 방법
이것은 0일째 6 내지 16일령의 CDCD 돼지에 수행된 부분적인 맹검 백신 접종-챌린지 실행가능성 연구이다. 연구에 포함된 것은 암퇘지의 PCV2 IFA 역가가 ≤ 1:1000인 것이었다. 추가로, 암퇘지의 혈청학적 상태는 공지된 PRRS-음성 무리에 속한 것이었다. 16마리 (16) 암퇘지를 PCV2 혈청학적 상태에 대해 시험하였고 모든 16마리는 ≤1000의 PCV2 역가를 가졌고 제1 연구 장소로 옮겼다. 150마리의 돼지를 제왕절개 수술로 출산시키고 본 연구를 위해 -3일째에 사용하였다. -3일째에, 제1 연구 장소에서 150마리의 CDCD 돼지의 체중을 재고 귀에 태그를 붙여 표시하고 표 16에 제시된 바와 같이 체중에 따라 나누고 무작위로 10개 그룹중 하나에 할당하였다. 모든 돼지로부터 혈액 샘플을 수거하였다. 내부 표준을 충족하는 임의의 시험 동물이 당해 연구에 입회되고 이후 임의의 이유 때문에 배제되는 경우, 연구자 및 모니터 관리자는 협의하여 최종 분석에서 동물로부터 수거된 데이터의 사용을 결정한다. 당해 날짜로 입회된 돼지는 배제하고 배제 이유를 문서화하였다. 본 연구를 위해 선택되고 제1 연구 장소로 옮겨진 내부 표준을 충족하는 암퇘지는 배제하지 않았다. 본 연구로부터 어떠한 돼지도 배제하지 않았고 어떠한 시험 동물도 종료전에 연구로부터 배제되지 않았다. 표 17은 당해 실시예의 주요 활성에 대한 시간표를 기재한다.
Figure 112008054440425-PCT00017
생존 기간내 연구 단계 종료 후, 포르말린 고정된 조직은 병리학자에 의해 PCV2 항원에 대한 면역조직화학(IHC) 분석으로 조사되었고, 혈액 샘플은 PCV2 혈청 분석을 위해 평가되었고 평균 하루 체중 증가(ADWG)는 25일에서 50일까지 측정하였다.
동물은 생후 약 11일령(대략 연구 0일째)까지 동물을 각각의 케이지에서 제1 연구 장소에서 거주시켰다. 각각의 방은 구획 배치가 동일하고 각각의 분리 유니트에 별도로 가열되고 여과된 공기가 공급되는 겹겹이 쌓여진 스테인레스 강 케이지로 구성되어 있다. 각각의 방은 별도의 열 및 통기 장치를 가져 방간의 공기가 교차 오염되는 것을 방지한다. 동물은 제2 연구 장소에서 2개의 상이한 빌딩에 거주시켰다. 그룹 10 (엄중 네가티브 대조군 그룹)은 변형된 사육 빌딩에 따로 거주시키고 그룹 1-9는 변형된 골진 빌딩에 거주시켰다. 각각 그룹은 별도의 펜(펜당 14마리 또는 15마리 돼지)에 거주시키고 각각의 펜은 돼지당 약 2.3 평방 피트를 제공하였다. 그룹 2, 4 및 8은 통로의 한 측면상에 3개의 인접 펜으로 감금시키고 그룹 1, 3, 5, 6, 7 및 9는 통로의 다른 측면상에 6개의 인접 펜으로 감금시킨다. 그룹 분리는 그룹 2, 4 및 8로 투여된 백신이 완전히 불활성화되지 않았다는 연구 모니터에 의한 걱정 때문이었다. 각각의 펜은 플라스틱 창살 층을 갖는 상승된 갑판상에 위치하였다. 펜 아래 구덩이는 배설물 및 폐기물을 위한 저장 탱크로서 사용하였다. 각각의 빌딩은 자신의 별도 가열 및 통기 시스템을 갖고 있어 빌딩간의 공기가 교차 오염될 가능성이 적다.
제1 연구 장소에서, 새끼 돼지에는 생후 약 3주령까지 특별히 제형화된 우유 사료를 공급하였다. 모든 새끼 돼지는 21일까지는 고형의 특별한 혼합 사료를 소비하였다(대략 4 1/2 주령). 제2 연구 장소에서, 모든 새끼 돼지에는 임의로 이들의 나이 및 체중에 적당한 통상의 비-약제 시판용 혼합 사료를 공급하였다. 양 연구 장소에서 물은 또한 임의대로 가용하였다.
모든 시험 돼지에서 19, 20 및 21일째에 NAXCEL® IM 1.0 mL 를 교대로 돼지의 허벅다리에 처리하였다. 또한, 다양한 건강 이유 때문에, 돼지 11번 (그룹 1)는 10일째에 NAXCEL® IM 0.5ml을 처리하였고, 돼지 13번 (그룹 10)은 10일째에 1ml의 페니실린 및 1ml의 PREDEF® 2X을 처리하였고 돼지 4번(그룹 9)은 11일째에 1.0ml의 NAXCEL® 을 처리하였고 돼지 1번(그룹 1), 4번 및 11번에는 각각 14일째에 1.0ml의 NAXCEL®를 처리하였다.
2개의 연구 장소에서 연구동안에 돼지는 수의적 보호하에 있었다. 동물 건강 검사는 -3일째에 수행하고 건강 검사 기록판에 기록하였다. 모든 동물은 0일째 관찰에 의해 측정된 바와 같이 백신 접종 전에 양호한 건강 및 영양 상태에 있었다. 모든 시험 동물은 챌린지 전에 양호한 건강 및 영양 상태에 있는 것으로 관찰되었다. 시체 및 조직은 렌더링에 의해 처분하였다. 연구 동물의 최종 처리는 동물 처리 기록물에 기록하였다.
0일 및 14일째에, 그룹 1-3 및 5-8로 할당된 돼지에 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x " 바늘을 사용하여 좌측 경부 영역에 각각 2.0ml의 할당된 PCV2 백신 1-4번(IM)을 투여하였다. 그룹 4에 할당된 돼지에는 0일째에만 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x " 바늘을 사용하여 우측 경부 영역에 1.0ml의 PCV2 백신 2번(IM)을 투여하였다..
22일째에, 모든 시험 돼지에는 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 좌측 경부 영역에 2.0ml의 KLH/ICFA(IM)을 투여하였다. 28일째에 모든 시험 돼지에는 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 우측 허벅다리 영역에 2.0ml의 KLH/ICFA을 투여하였다.
25일째에, 그룹 1-9에 할당된 돼지에는 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 우측 경부 영역에 1.0ml의 PCV2 ISUVDL 챌린지 재료((3.98 log10 TCID50/mL)(IM)을 투여하였다. 추가로 동일한 재료 1.0ml은 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 비강 캐뉼라를 사용하여 각각의 돼지(콧구멍당 0.5ml)에 IN으로 투여하였다.
46일째에 모든 시험 돼지에는 멸균 3.0ml의 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여, 우측 경부 영역에 2.0ml의 INGELVACPRRS MLV(IM)을 투여하였다. PRRSV MLV는 PCV2 챌린지 물질의 독성을 증가시키기 위한 시도로 투여하였다.
시험 돼지는 -3일째 및 0일부터 21일까지 전반적인 건강 및 부작용에 대해 매일 관찰하였다. 각각의 돼지는 정상적이거나 비정상적 행동에 대해 스코어하였다. 관찰은 임상 관찰 기록부에 기록하였다. 모든 시험 돼지는 0일부터 7일까지 관찰하고 그룹 7은 주사 부위 반응에 대해 14일부터 21일까지 추가로 관찰하였다. 평균 하루 체중 증가는 각각의 돼지를 -3일, 25일 및 50일째 또는 챌린지 후 돼지가 죽은채로 발견된 날에 보정된 눈금상에서 칭량하여 결정하였다. 체중은 체중 양식에 기록하였다. -3일째의 체중을 사용하여 무작위화전에 돼지를 나누었다. 25일째 및 50일째에 데이터를 사용하여 당해 시점동안에 각각의 돼지에 대한 평균 하루 중량 증가(ADWG)를 측정하였다. 챌린지 후 및 50일째 전에 죽은 돼지에 대해 ADWG가 24일째부터 죽은 날까지의 ADWG를 나타내도록 조정하였다.
PCV2 혈청 상태를 측정하기 위해, 정맥 전혈을 -3일째 및 14일째에 각각의 돼지의 안와 정맥동으로부터 채혈하였다. 각각의 새끼 돼지에 대해, 멸균 모세관 튜브를 안구중 하나의 내측 안각으로 삽입하고 약 3.0ml의 전혈을 4.0ml의 혈청 분리기 튜브(SST)에 뽑아내어 채혈하였다. 25일째, 32일째 및 50일째에, 각각의 돼지로부터 정맥 전혈을, 멸균 18g x 1 " Vacutainer 바늘 (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey), Vacutainer 바늘 홀더 및 13 mL SST를 사용하여 전방 대정맥으로부터 채혈하였다. 각각의 시점에서 채혈은 샘플 수거 기록부에 기록하였다. 각각의 SST에서의 혈액은 방치하여 응고시키고 이어서 각각의 SST는 회전 침강시키고 혈청을 수거하였다. 수거된 혈청은 멸균 스냅 튜브로 옮기고 훗날에 시험될때까지 -70 ±10℃에서 저장하였다. 혈청 샘플은 BIVI-R&D 퍼스널에 의해 PCV2 항체의 존재에 대해 시험하였다.
돼지는 임상적 징후에 대해 22일째부터 50일째까지 하루 1회 관찰하고 정상적이거나 비정상적인 행동, 호흡 또는 기침에 대해 스코어하였다. 임상적 관찰은 임상적 관찰 기록부에 기록하였다.
돼지 46번 (그룹 1) 및 98번(그룹 9)은 제1 연구 장소에서 죽었다. 이들 죽은 2마리의 돼지는 출혈 죽음으로서 분류하고 이들 2마리의 돼지에 대해 검시는 수행하지 않았다. 제2 연구 장소에서, 챌린지 후 및 50일전에 죽은 돼지 및 50일째 안락사시킨 돼지를 검시하였다. 임의의 육안적병변을 기록하고 병변을 갖는 폐엽 %를 검시 보고 양식에 기록하였다.
제2 연구 장소에서 검시된 각각의 돼지로부터, 편도선, 폐, 심장, 간, 장간막 림프계의 조직 샘플을 완충 10% 포르말린이 첨가된 단일 용기에 위치시키고 동일한 상기 언급된 기관으로부터의 또 다른 샘플을 휘를-팩(Whirl-pak) (M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, UK) 에 위치시키고 각각의 휘를 팩을 빙상에 위치시켰다. 각각의 용기를 적당해 표지시켰다. 샘플 수거를 검시 보고 양식에 기록하였다. 이후, 포르말린 고정된 조직 샘플 및 진단 요구 양식을 IHC 시험을 위해 제출하였다. IHC 시험은 수용 샘플, 샘플 및 슬라이드 제제 및 염색 기술을 위한 표준 ISU 연구 과정에 따라 수행하였다. 휘를 팩에서의 새로운 조직을 빙 팩과 함께 보관(-70 ±10℃) 및 가능한 향후 사용을 위해 연구 모니터로 운송하였다.
포르말린 고정된 조직은 IHC에 의한 PCV2 검출을 위해 병리학자에 의해 조사되었고 하기의 스코어링 시스템을 사용하여 스코어되었다: 0 = 부재; 1 = 약간의 포지티브 염색, 소수 부위; 2 = 중간정도의 포지티브 염색, 다수 부위; 및 3 = 풍부한 포지티브 염색, 조직을 통해 확산. 분석 목적을 위해, 0의 스코어는 "네가티브"로서 간주하고 0 초과의 스코어는 "포지티브"로서 간주하였다.
결과
당해 실시예의 결과는 하기에 주어진다. 돼지 46번 및 98번은 각각 14일째 및 25일째에 죽었음을 주지한다. 이들 죽음은 출혈 죽음으로서 분류하였다. 돼지 11번(그룹 1)은 15일째에 급한 호흡으로 헐떡였다. 반면, 모든 돼지는 당해 관찰 기간동안에 행동, 호흡 및 기침에 대해 정상적이었고 어떠한 전신성 부작용이 임의의 그룹에서 나타나지 않았다. 어떠한 주사 부위 반응도 0일째 하기 백신 접종 후 나타나지 않았다. 14일째 백신 접종 후, 14마리의 그룹 1 돼지중 7마리 (50.0%)는 15일째에 스코어 "2"의 종창을 가졌다. 14마리의 그룹 1중 4마리 (28.6%)는 여전히 15일째 "2"의 종창을 가졌다. 다른 어떠한 그룹은 백신 접종 후 주사 부위 반응을 경험하지 않았다.
평균 하루 체중 증가 (ADWG) 결과는 표 18에 나타낸다. 출혈로부터 죽은 돼지 46번 및 98번은 그룹 결과로부터 배제하였다. 1회 용량의 16 ug vORF2-Carbopol를 투여받은 그룹 4는 최고의 ADWG (1.16 ±0.26 lbs/일)을 나타냈고 그 다음으로는 그룹 1, 2, 3, 5, 6, 및 10이 ADWG를 나타냈고 이의 범위는 1.07 ±0.23 lbs/일 내지 1.11 ±0.26 lbs/일이다. 그룹 9는 최저의 ADWG (0.88 ±0.29 lbs/일)을 나타냈고 이어서 그룹 8 및 7이 ADWG를 나타냈고 이는 각각 0.93 ±0.33 lbs/일 및 0.99 ±0.44 lbs/일이다.
Figure 112008054440425-PCT00018
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
PCV2 혈청 분석 결과는 표 19에 나타낸다. 모든 10개의 그룹은 -3일째에 PCV2 에 대해 혈청 음성이었다. 14일째에, PCV2 역가는 모든 10개의 그룹에 대해 낮게 유지되었다(범위 50 내지 113). 25일째에 전세포 사멸된 바이러스 백신을 투여받은 그룹 8은 PCV2 역가(4617)를 나타냈고 다음으로는 16 ug의 vORF2-Carbopol를 투여받은 그룹 2 , 1회 용량의 16 ug의 vORF2-Carbopol를 투여받은 그룹 4 , 및 16 ug의 rORF2 Carbopol를 투여받은 그룹 3에서 나타났고 이들 은 각각 2507, 1920 및 1503의 역가를 나타냈다. 32일째 (챌린지 후 1주)에, 그룹 1 내지 6 및 그룹 8에 대한 역가는 2360 내지 7619의 범위인 반면, 그룹 7 (0.25 ug의 rORF2 Carbopol), 9 (챌린지 대조군), 및 10 (엄중 네가티브 대조군)은 각각 382, 129 및 78의 역가를 가졌다. 50일째(검시일)에 모든 10개 그룹은 고가의 PCV2 역가(≥ 1257)를 나타냈다.
25일, 32일 및 50일째에, 2회 용량의 16 ug의 rORF2 Carbopol를 투여받은 그룹 3은 2회 용량의 16 ug의 rORF2-IMS 1314를 투여받은 그룹 1 보다 높은 항체 역가를 나타냈다. 25일, 32일 및 50일째에, 2회 용량의 16 ug의 vORF2를 투여받은 그룹 2는 1회 용량의 동일 백신을 투여받은 그룹 4보다 높은 역가를 나타냈다. 각각 감소하는 수준(16, 4, 1, 및 0.25 ug)의 rORF2-Carbopol를 투여받은 그룹 3, 5, 6 및 7은 25일 및 32일째에 상응하게 감소하는 항체 역가를 나타내었다.
Figure 112008054440425-PCT00019
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
*계산을 목적으로, a ≤100 IFA 역가는 "50"의 역가로서 지정하였고; a ≥6400 IFA 역가는 "12,800"의 역가로서 지정하였다.
**챌린지 일
***검시 일
챌린지 후 임상적 관찰로부터의 결과는 하기에 나타내었다. 표 20은 비정상적 행동, 비정상적 호흡, 기침 및 설사에 대한 관찰을 포함한다. 표 21은 그룹 전체에 대한 임상적 증상의 발생 빈도를 요약한 결과를 포함하고 표 22는 챌린지 후 그룹 치사율을 요약한 결과를 포함한다. 챌린지 후 비정상적 행동, 호흡 및 기침의 발생 빈도는 16 ug의 rORF2-IMS 1314 (그룹 1), 16 ug의 rORF2-Carbopol (그룹 3), 1 ug의 rORF2-Carbopol (그룹 6), 0.25 ug의 rORF2-Carbopol (그룹 7)을 투여받은 돼지 및 챌린지 대조군 그룹(그룹 9)의 돼지에서 낮았다. 챌린지 후 비정상적 행동, 호흡 및 기침의 발생 빈도는 16 ug의 vORF2-Carbopol (그룹 2), 1회 용량의 16ug의 vORF2-Carbopol (그룹 4), 4 ug의 rORF2-Carbopol (그룹 5), >8 로그 KVCarbopol (그룹 8)을 투여받은 돼지 및 엄중 네가티브 대조군 그룹(그룹 10)의 돼지에서 0이었다.
임상적 증상의 전체 발생 빈도는 그룹 마다 다양하였다. 16㎍의 rORF2-Carbopol(그룹 2) 및 1회 용량의 16ug의 vORF2-Carbopol (그룹 4)를 투여받은 돼지 및 엄중 네가티브 대조군 그룹(그룹 10)의 돼지는 0% 발생 빈도를 나타냈고, 16 ug의 rORF2-Carbopol (그룹 3) 및 1 ug의 rORF2-Carbopol (그룹 6)을 투여받은 돼지는 6.7%의 발생 빈도를 나타냈고, 16 ug의 rORF2-IMS 1314(그룹 1)을 투여받은 돼지는 7.1%의 전체 발생 빈도를 나타냈고, 4ug의 rORF2-Carbopol (그룹 5), 0.25 ug의 rORF2-Carbopol (그룹 7) 및 >8 로그 KV 백신을 투여받은 돼지는 13.3%의 발생 빈도율을 나타냈고, 챌린지 대조군 그룹(그룹 9)에서의 돼지는 14.3%의 발생 빈도율을 나타냈다.
그룹 간의 전체 치사율은 또한 그룹마다 다양하였다. 2회 용량의 KV 백신을 투여받은 그룹은 20.0%의 최고의 치사율을 나타내었고, 그 다음으로는 그룹 9인 챌린지 대조군 그룹 및 0.25㎍의 rORF2-Carbopol을 투여받은 그룹 7에서 나타났고 이의 치사율은 각각 14.3% 및 13.3% 였다. 1회 용량의 16㎍의 rORF2-Carbopol을 투여받은 그룹 4는 6.7%의 치사율을 나타냈다. 다른 모든 그룹 1, 2, 3, 5, 6 및 10은 0%의 치사율을 나타냈다.
1 각각의 그룹에서 1일 이상동안 임의의 비정상적인 행동을 나타낸 돼지의 총수
2 각각의 그룹에서 1일 이상동안 임의의 비정상적 호흡을 나타낸 돼지의 총수
3 각각의 그룹에서 1일이상동안 기침을 나타낸 돼지의 총수
Figure 112008054440425-PCT00021
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
1 각각의 그룹에서 1일 이상동안 임의의 임상적 증상을 나타낸 돼지의 총수
Figure 112008054440425-PCT00022
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
그룹 평균 % 폐 병변 및 잠정 진단에 대한 요약은 하기 vORF2-IMS에 나타낸다. 챌린지 대조군 그룹인 그룹 9는 평균 10.81 ±23.27%의 최고의 % 폐 병변을 나타냈고, 다음으로는 0.25 ug의 rORF2-Carbopol을 투여받은 그룹 7이 평균 6.57 ± 24.74%을 나타냈고, 4 ug의 rORF2-Carbopol을 투여받은 그룹 5가 평균 2.88 ± 8.88%을 나타냈고, KV 백신을 투여받은 그룹 8이 평균 2.01 ±4.98%을 나타냈다. 나머지 6개 그룹은 보다 낮은 평균 % 폐 병변을 나타냈꼬 이의 범위는 0.11 ± 0.38% 내지 0.90 ±0.15%이다.
폐렴에 대한 잠정 진단은 그룹 마다 다양하였다. 2회 용량의 16 ug의 rORF2-Carbopol를 투여 받은 그룹 3은 13.3%로서 최저의 잠정적인 폐렴 진단을 받았다. 챌린지 대조군 그룹인 그룹 9는 그룹의 50%가 폐렴으로 잠정적으로 진단되었고 이어서 엄중 네가티브 대조군 그룹인 그룹 10 및 2회 용량의 16 ug의 vORF2-Carbopol을 투여받은 그룹 2에서 각각 46.7% 및 40%가 잠정적으로 폐렴으로 진단되었다.
그룹 1, 2, 3, 5, 9, 및 10은 그룹의 0%가 PCV2가 감염된 것으로서 잠정적으로 진단된 반면, 2회 용량의 KV 백신을 투여받은 그룹 8은 20%로서 잠정적으로 최고율의 PCV2 감염으로서 진단되었다. 2회 용량의 0.25 ug 의 rORF2-Carbopol을 투여받은 그룹 7 및 1회 용량의 16 ug의 vORF2-Carbopol를 투여받은 그룹 4는 각각 13.3% 및 6.7%로서 PCV2 감염으로 잠정 진단되었다.
위 궤양은 그룹 7에서 하나의 돼지에서 진단된 반면 (6.7%), 다른 9개 그룹은 위 궤양이 없는 것으로 나타났다.
Figure 112008054440425-PCT00023
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
그룹 IHC 포지티브 발생 빈도 결과에 대한 요약은 하기 표 24에 나타낸다. 그룹 1 (16 ug의 rORF2-IMS 1314)는 돼지가 PCV2에 대해 0%로서 최저의 IHC 양성 결과를 나타내었고 그 다음으로는 Group 2 (16 ug vORF2-Carbopol) 및 그룹 4 (1회 용량 16 ug vORF2-Carbopol)가 각각 6.7% 및 13.3%의 IHC율을 나타냈다. 챌린지 대조군 그룹인 그룹 9는 PCV2에 대해 돼지의 100%가 양성인 최고의 IHC 양성 발생 빈도를 나타내었고 그 다음으로는 엄중 네가티브 대조군 그룹인 그룹 10 및 그룹 8(KV 백신)에서 각각 PCV2에 대해 돼지의 93.3% 및 80%가 양성이었다.
Figure 112008054440425-PCT00024
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전세포 바이러스 = 적합한 세포 배양물에서 증식한 PCV2 바이러스
논의
본 실시예에서 7개의 PCV2 백신을 평가하였고 이는 IMS 1314가 보조제로서 추가된 고용량의 (16㎍)의 rORF2 항원을 돼지의 하나의 그룹에 1회 및 돼지의 제 2 그룹에 2회 투여하고, Carbopol 이 보조제로서 추가된 고용량(16㎍)의 rORF2 항원을 2회 투여하고, Carbopol이 보조제로서 추가된 4㎍ 용량의 rORF2 항원을 3회 투여하고, Carbopol이 보조제로서 추가된 1㎍ 용량의 rORF2 항원을 2회 투여하고, Carbopol이 보조제로서 추가된 저용량 (0.25㎍)의 rORF2 항원을 2회 투여하고, Carbopol이 보조제로서 추가된 고용량의 (> 8 log)의 사멸된 전세포 PCV2 백신을 투여한다. 전체적으로, 2회 용량의 16㎍의 rORF2-IMS 1314를 투여받은 그룹 1이 Carbopol이 보조제로서 추가된 다양한 수준의 vORF2 또는 rORF2 항원을 함유하는 백신을 투여받은 그룹 2 내지 7 보다 약간 우수한 수행능을 나타냈고 2회 용량의 사멸된 전세포 PCV2 백신을 투여받은 그룹 8보다는 매우 우수한 수행능을 나타내었다. 그룹 1은 3번째 최고의 ADWG (1.80 ±0.30 lbs/일), 최저의 비정상적 행동 발생 빈도 (0%), 최저의 비정상적 호흡 발생 빈도 (0%), 기침의 낮은 발생 빈도 (7.1%), 낮은 빈도의 전체 임상적 증상 (7.1%)을 나타내었고 최저의 치사율(0%), 2번째 최저율의 평균 %, 폐 병변 (0.15 ±0.34%), 2번째 최저율의 폐렴 (21.4%) 및 최저의 발생 빈도율의 양성 IHC 조직 (0%)을 나타내는 나머지 3개의 다른 그룹과 동일하였다. 그룹 1은 그러나 주사 부위 반응이 나타난 유일 그룹이고 이는 제2 백신 접종 1일 후 백신 접종물의 50%에서 나타났다. 그룹 2 내지 7에 투여된 기타 백신은 사멸된 백신 보다 우수한 수행능을 가졌고 그룹 1에 투여된 백신 만큼 거의 양효하였다.
Carbopol이 보조제로 추가된 2회 용량의 사멸된 PCV2 백신을 투여받은 그룹 8은 임의의 백신 그룹에 대해 최악 세트의 결과를 나타냈다. 그룹 8은 최저의 ADWG (0.93 ±0.33 lbs/일), 2번째로 최고율의 비정상적 행동(6.7%), 최고율의 비정상적 호흡 (6.7%),을 나타냈고 최고 발생 빈도율의 전반적인 임상 증상을 나타내는 3개의 다른 그룹과 동일하였고 (13.3%), 모든 그룹중에서 최고의 치사율을 나타냈고 (20%), 임의의 백신 그룹의 최고의 포지티브 IHC 율(80%)을 나타내었다. 사멸된 전세포 PCV2 백신이 그룹 8로의 투여 전에 완전히 불활성화되지 않을 수 있다는 걱정이 있고 이는 당해 그룹의 불량한 결과를 설명할 수 있다. 불행하게, 구체적인 데이터가 당해 걱정을 확인시키는데 유용하지 않았다. 전반적으로, 당해 실시예의 내용에서, 통상적인 사멸된 PCV2 백신은 PCV2 관련 질환을 감소시키는데 일조하지 않았다.
이전에 언급된 바와 같이, 어떠한 부작용도 IMS 1314가 보조제로서 추가된 백신을 제외하고는 시험 백신과 관련이 없었다. 주사 부위 반응은 IMS 1314로 제형화된 백신으로 2차 백신 접종 1일 후 돼지에서 50.0%로 나타났고 2차 백신 접종 2일 후 돼지에서 28.6%로 나타났다. Carbopol 보조제 추가된 백신을 투여받은 임의의 돼지에서 어떠한 반응이 나타나지 않았다. IMS 1314 보조제가 추가된 백신으로 백신 접종된 돼지를 포함하는 임의의 추가 연구는 주사 부위 반응에 대해 돼지를 세밀하게 계속 모니터해야만 한다.
모든 돼지는 3일째에 PCV2에 대해 혈청 음성이었고 그룹 2에서만 14일째 100 이상의 역가를 나타냈다. 25일째 (챌린지 일)에, 그룹 8은 최고의 PCV2 항체 역가(4619)를 나타내었고 그 다음으로는 그룹에서 2507로 나타났다. 그룹 7, 9 및 10을 제외하고는 모든 그룹이 32일까지 강한 항체 반응을 나타냈다. 50일까지 그룹 7, 9 및 10을 포함하는 모든 그룹은 강한 항체 반응을 나타냈다.
후기 단계 PCV2 감염 및 후속 PMWS 발병의 특징중 하나는 이유 돼지에서 성장 지체이고 몇몇 경우에는 체중 감소가 나타난다. 그룹의 평균 하루 체중 증가는 성장 지체 또는 체중 감소를 입증하는 정량적 방법이다. 본 실시예에서, 그룹간의 ADWG는 큰 차이가 없었다. 그룹 8은 0.88 ±0.29 lbs/일의 최저의 ADWG를 나타냈고, 그룹 4는 1.16 ±0.26 lb/일의 최고의 ADWG를 나타냈다. 본 연구에서는 ADWG에 대한 향후 백신 효능을 근거로 그룹간에는 상당한 차이가 없었다.
최중 감소 뿐만 아니라, 호릅 곤란, 무기력, 피부의 창백 및 때대로 황달( icterus)이 PMWS와 관련된 임상적 증상이다. 본 실시예에서, 비정상적인 행동 및 비정상적인 호흡 및 기침은 각각의 그룹에서 드물게 나타난다. 본 연구에서 입증된 바와 같이, 당해 챌린지 모델 및 챌린지 종은 압도적인 임상적 증상을 나타내지 않았고 이것은 백신 효능의 근거가되는 강한 파라미터가 아니다.
전반적으로, 치사율은 본 실시예에서 높지 않고 챌린지 대조군 그룹에서 고치사율의 부재는 백신 효능이 기초가 되는 당해 파라미터를 제한한다. 46일전에, 그룹 4 및 7에서는 각각 15마리의 돼지중 1마리가 죽고, 그룹 9에서는 14마리의 돼지중 2마리가 죽었고 그룹 8에서는 15마리의 돼지중 3마리가 죽었다. 챌린지 대조군 그룹인 그룹 8이 PCV2 임상적 증상을 나타내지 않고 단지 2개의 죽음이 46일까지 발생한다는 사실로 인해, 돼지 호흡 및 생식 증후군 바이러스 (PRRSV) MLV 백신을 46일째에 모든 돼지에 투여하였다. 조기 연구는 면역자극제로서 INGELVAC PRRS MLV를 사용하여 PCV2 관련 PMWS 질환을 악화시켰고 치사율은 이들 조기 연구에서 보다 높았다. 46일째 PRRS 백신을 투여한 직후 2마리(그룹 4에서 46일째가 1마리가 죽었고 그룹 7에서 47일째에 1마리가 죽었다)가 죽었고 이는 PRRS 백신의 투여와 관련된 것일 수 없다. 50일까지, 2회 용량의 사멸된 백신을 투여받은 그룹 8은 최고의 치사율 (20%)을 나타냈고 그 다음으로는 그룹 9(챌린지 대조군) 및 그룹 7(0.25 ug rORF2 Carbopol)에서 나타났고 이의 치사율은 각각 14.3% 및 13.3%이었다. 전반적으로, 본 실시예의 챌린지 후 관찰 단계에서 챌린지 후반 모델로의 PRRS 백신 투여는 치사율을 상당히 증가시키지 않았다.
PCV 2 감염에 따른 PMWS를 갖는 돼지에서 육안적 병변은 전형적으로 하기중 하나 이상과 복합된 일반화된 림프선병증으로 이루어진다: (1) 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, (2) 피부 창백 또는 황달, (3) 반점 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신염 및 (6) 생식 장애(예를 들어, 유산, 사산, 미이라) 등. 검시(50일)에서, 황달(icterus), 간염, 신염 및 위궤양은 임의의 그룹에서 나타나지 않았다. 위궤양은 하나의 그룹 7 돼지에서 나타났지만 림프선병증에 대해서는 구체적으로 조사되지 않았다. PCV2 감염과 일치하는 병변의 존재를 기초로, 3개의 그룹에서는 하나 이상의 돼지가 PCV2(PMWS)로 잠정적으로 진단되었다. 2회 용량의 사멸된 백신을 투여 받은 그룹 8에서는 20%가 PCV2로 잠정적으로 진단된 반면 그룹 7 및 4에서는 각각 13.3% 및 6.7%가 PCV2로 잠정적으로 진단되었다. 평균 % 폐 병변 스코어는 검시에서 그룹 마다 다양하였다. 그룹 1, 2, 3, 4, 6 및 10은 0.11 0.38% 내지 0.90 0.15% 범위의 낮은 % 폐 병변 스코어를 나타냈다. 예상된 바와 같이, 챌린지 대조군 그룹인 그룹 9는 최고의 평균 % 폐 병변 스코어 (10.81 ±23.27%)를 나타냈다. 4개의 그룹에서, 평균 % 폐 병변은 이들 각각의 그룹에서 1마리 내지 3마리의 돼지가 높은 폐 병변 스코어를 가져 상승하였다. 폐 병변은 적색/자주색으로 나타내어 공고히하였다. 전형적으로, PMWS와 관련된 폐 병변은 갈색으로 나타냈고 소엽사이 부종과 중복하지 않는다. 본 연구에서 나타난 폐 병변은 또한 PCV2 감염 또는 존재할 수 있는 2차 폐 감염성 제제와는 관련이 없었다. 본 연구 내용에서, % 폐 병변 스코어는 PCV2로 인한 폐 감염 양에 대해 진실한 척도를 반영할 수 없다. 또한, 폐렴의 잠정적인 진단은 또한 과용될 수 있다. 0.10%의 몇몇 소수의 폐 병변을 가진 임의의 돼지는 잠정적인 폐렴 진단으로서 열거된다. 본 실시예에서, 백신 효능이 기초로 하는 육안적 병변 및 % 폐 병변과 관련하여 그룹간에는 상당한 차이가 없었다.
IHC 결과는 그룹간에 최대의 차이를 나타내었다. 그룹 1 (16㎍ rORF2-IMS 1314)은 PCV2 항원에 대해 최저의 양성 IHC 결과를 나타낸 반면(0%); 그룹 9 및 10에서는 최고의 양성 IHC 결과를 나타내었고 각각 발생 빈도율은 100% 및 93.3%이었다. Carbopol이 보조제로 추가된 16, 4, 1 또는 0.25㎍의 rORF2 항원을 투여받은 그룹 3, 5, 6 및 7은 각각 Carbopol이 보조제로 추가된 20%, 20%, 40% 및 46.7%의 IHC 양성 비율을 나타내었다. Carbopol이 보조제로서 추가된 2회 용량의 16㎍의 vORF2을 투여받은 그룹 2는 6.7%의 IHC 양성 비율을 나타낸 반면, 단지 1회 용량의 동일한 백신을 투여받은 그룹 4는 13.3%의 IHC 양성 비율을 나타냈다. 당해 시험의 객관적 특성 및 IHC 결과가 예상된 결과와 연관되는 사실 때문에, IHC 시험은 백신 효능을 기초로 하는 최상의 파라미터중 하나일 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서, PCV2 챌린지를 접한 CDCD 돼지 모델에서 Carbopol이 보조제로서 추가된 PCV2 rORF2 항원의 최소 보호 용량 (MPD)을 측정한다. 그룹 3, 5, 6 및 7에는 각각 Carbopol이 보조제로서 추가된 2회 용량의 rORF2 항원을 투여하였지만 rORF2 항원의 수준은 그룹 마다 다양하였다. 그룹 3, 5, 6 및 7에는 각각 16, 4, 1 또는 0.25㎍의 rORF2 항원을 투여하였다. 일반적으로, rORF2 항원의 수준을 감소시키면 PCV2 항체 역가도 감소하였고 치사율, 평균 % 폐 병변 및 IHC 양성 조직의 발생 빈도를 증가시켰다. 다양한 수준의 rORF2-Carbopol을 투여받은 4개의 그룹중에서, 각각 2회 용량의 16 또는 4㎍의 rORF2 항원을 투여받은 그룹 3 및 5는 각각 단지 20%의 IHC 양성 비율을 나타냈고 각각은 유사한 항체 역가를 나타냈다. 전반적으로, IHC 양성 결과를 근거로, 2회 투여되는 rORF2 항원의 최소 보호 용량은 약 4㎍이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 재조합 (rORF2) 및 VIDO R-1 (vORF2) PCV2 항원의 항원성을 평가하였다. 그룹 2에는 2회 용량의 16㎍의 vORF2을 투여하였고 그룹 3에는 2회 용량의 16㎍의 rORF2를 투여하였다. 2개의 백신에는 Carbopol 보조제를 추가하였다. 2개의 백신은 안전한 것으로 밝혀졌고 둘다는 0%의 치사율을 나타내었다. 그룹 2는 25일째에 2507의 PCV2 항체 역가를 나타낸 반면 그룹 3은 1503의 PCV2 항체 역가를 나타냈다. 그룹 3은 그룹 2(0.11 ± 0.38% 대 0.90 ± 0.15%) 보다 낮은 평균 % 폐 병변 스코어를 나타냈지만 그룹 2는 그룹 3(6.7% 대 20%) 보다 낮은 IHC 양성 발생 빈도율을 나타냈다. 전반적으로, 2개의 백신은 유사한 항원성을 나타냈지만 vORF2는 약간 우수한 IHC 결과와 관련이 있었다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 2개의 상이한 보조제(Carbopol 및 IMS 1314)의 적합성을 측정하였다. 그룹 1 및 3 둘다에는 16 ug의 rORF2 항원을 함유하는 2회 용량의 백신을 투여하였지만 그룹 1에는 IMS 1314 보조제가 추가된 항원을 투여하였고 그룹 3에는 Carbopol이 보조제로서 추가된 항원을 투여하였다. 2개 그룹은 필수적으로 동일한 ADWG를 나타내었고 챌린지 후 임상적 증상에 대해 필수적으로 동일한 발생 빈도, 동일한 치사율 및 필수적으로 동일한 평균 % 폐 병변을 나타냈지만 그룹 1에서는 0%의 IHC 양성 비율을 나타낸 반면 그룹 3에서는 20%의 IHC 양성 비율을 나타내었다. 그러나, Carbopol이 보조제로 추가된 백신을 투여받은 그룹 3은 IMS 1314가 보조제로 추가된 백신을 투여받은 그룹 1 보다 25일, 32일 및 50일째에 보다 높은 IFAT PCV2 역가를 나타내었다. 전반적으로, IMS 1314가 보조제로 추가된 PCV2 백신이 우수한 IHC 결과를 제공하였지만 이것은 PCV2 감염으로부터 압도적으로 우수한 보호를 제공하지 못했고 주사 부위 반응을 유발하였다. 반면, Carbopol이 보조제로 추가된 PCV2 백신은 IMS 1314 보조제 추가된 백신과 거의 동일한 수행능을 가졌고 임의의 부작용과 관련이 없었다.
본 발명의 추가의 측면에서, 1ml로서 PCV2 ORF2의 실행 가능성과 관련하여, 1회 용량 생성물을 측정하였다. 그룹 2 및 4 둘다에는 0일째에 Carbopol이 보조제로서 추가된 16㎍의 vORF2 백신을 투여하였고 그룹 2에는 14일째에 제2 용량을 투여하였다. 그룹 4는 그룹 2 보다 약간 높은 ADWG 및 낮은 평균 % 폐 병변을 나타냈고 그룹 2는 25일, 32일 및 50일째에 보다 높은 IFAT PCV2 역가를 나타냈고 IHC 양성 조직에 대해 약간 낮은 발생 빈도율을 나타냈다. 이들 2개 그룹에 대한 모든 다른 결과는 유사하였다. 전반적으로, Carbopol이 보조제로서 추가된 1회 용량의 vORF2는 2회 용량의 동일한 백신과 유사한 수행능을 가졌다.
<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. <120> USE OF A PCV2 IMMUNOGENIC COMPOSITION FOR LESSENING CLINICAL SYMPTOMS IN PIGS <130> 34816-CIP1 <150> US 60/755,016 <151> 2005-12-29 <150> US 60/829,809 <151> 2006-10-17 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is a modified Kozak's sequence. <400> 1 ccgccatg 8 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is a recombinant Eco R1 sequence. <400> 2 gaattc 6 <210> 3 <211> 713 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 3 cagctatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtggaga 180 aggaaaaatg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtgacgact 240 ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360 gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420 acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480 gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540 aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600 gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttaa accctaaatg aat 713 <210> 4 <211> 713 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 4 ccgccatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtcaagg 180 ctaccacagt cacaacgccc tcctgggcgg tggacatgat gagatttaat attgacgact 240 ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360 gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420 acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480 gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540 aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600 gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttga accctaagaa ttc 713 <210> 5 <211> 233 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 5 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230 <210> 6 <211> 233 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 6 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro 225 230 <210> 7 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This sequence is from porcine circovirus type 2, open reading frame 2, together with a portion from the pGEM T-easy vector. <400> 7 gcggccgcgg gaattcgatc cgccatgacg tatccaagga ggcgttaccg cagaagaaga 60 caccgccccc gcagccatct tggccagatc ctccgccgcc gcccctggct cgtccacccc 120 cgccaccgct accgttggag aaggaaaaat ggcatcttca acacccgcct ctcccgcacc 180 ttcggatata ctgtcaaggc taccacagtc acaacgccct cctgggcggt ggacatgatg 240 agatttaata ttgacgactt tgttcccccg ggagggggga ccaacaaaat ctctataccc 300 tttgaatact acagaataag aaaggttaag gttgaattct ggccctgctc ccccatcacc 360 cagggtgata ggggagtggg ctccactgct gttattctag atgataactt tgtaacaaag 420 gccacagccc taacctatga cccatatgta aactactcct cccgccatac aatcccccaa 480 cccttctcct accactcccg ttacttcaca cccaaacctg ttcttgactc cactattgat 540 tacttccaac caaataacaa aaggaatcag ctttggctga ggctacaaac ctctagaaat 600 gtggaccacg taggcctcgg cactgcgttc gaaaacagta aatacgacca ggactacaat 660 atccgtgtaa ccatgtatgt acaattcaga gaatttaatc ttaaagaccc cccacttgaa 720 ccctaagaat tctatcacta gtgaattcgc ggccgc 756 <210> 8 <211> 10387 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is the porcine circovirus type 2, ORF2 construct, which includes baculovirus and pGEM T-easy coding sequences. <400> 8 aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60 gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120 ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180 gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240 ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300 gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360 gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420 ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg 480 cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac 540 aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc 600 tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta 660 tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag 720 gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt 780 ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 840 cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat 900 ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt 960 tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt 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ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 9420 agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 9480 gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 9540 gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 9600 acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 9660 acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 9720 agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 9780 aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 9840 gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 9900 tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 9960 aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct 10020 ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag 10080 acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc 10140 ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 10200 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca 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Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Lys Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230

Claims (28)

  1. 돼지에게 돼지 시르코바이러스(circovirus) 2형 항원을 투여함을 포함하는, 동물의 전체 돼지 시르코바이러스 적재량을 경감시키고/시키거나 돼지에서 돼지 시르코바이러스 감염의 면역억제 효과를 감소시키는, PCV2 감염과 관련된 임상적 증상의 중증도를 감소시키거나 경감시키기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항원이 돼지 시르코바이러스 2형 바이러스의 ORF2와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 DNA 서열에 의해 암호화된 단백질을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 돼지 시르코바이러스 2형 항원이 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2 항원인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 시르코바이러스 2형 항원이 용량당 1ml로 제형화되고 투여되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 임상적 증상이 림프선병증, 림프계 고갈 및 다핵화되거나 거대한 조직구로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 림프선병증, 림프계 고갈 및/또는 다핵화되거나 거대한 조 직구가 소엽사이 부종을 갖는 간질성(interstitial) 폐렴, 피부 창백 또는 황달, 반점 위축성 간, 위궤양, 신염, 연막형 병변 및 생식 장애와 복합된 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 15주령 미만의 돼지에게 투여되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 3주령 이하, 바람직하게는 2주령 이하의 돼지에게 투여되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 독성 돼지 시르코바이러스 2형 항원에 노출된지 약 3주 이내에 투여되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 수의학적으로 허용되는 담체, 약제학적으로 허용되는 담체 및 면역조절제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 피부내, 기관내, 질내, 근육내, 비내, 정맥내, 혈관내, 동맥내, 복강내, 경구, 수막강내, 피하, 피내, 심장내, 엽내, 골수내 또는 폐내로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 시르코바이러스 2형 항원의 투여가 부작용 또는 주사 부위 반응을 나타내지 않는 방법.
  13. 돼지 시르코바이러스 2형 항원을 돼지에게 투여함을 포함하는, 돼지의 일반 질환 내성 수준을 개선시키는 방법.
  14. 돼지 시르코바이러스 항원을 수득하는 단계 및 당해 항원을 수의학적으로 허용되는 담체, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 면역조절제와 배합하는 단계를 포함하는, 동물의 전체 돼지 시르코바이러스 적재량을 경감시키거나 돼지 시르코바이러스 감염의 면역억제 효과를 감소시키는, PCV2 감염과 관련된 임상적 증상의 중증도를 감소시키거나 경감시키기 위한 약물의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항원이 돼지 시르코바이러스 2형의 ORF2에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
  16. 돼지에게 투여되어 동물의 전체 돼지 시르코바이러스 적재량을 경감시키고/시키거나 돼지에서 돼지 시르코바이러스 감염의 면역억제 효과를 감소시키는, PCV2 감염과 관련된 임상적 증상의 중증도를 감소시키거나 경감시키는 약물의 제조를 위한 돼지 시르코바이러스 2형 항원의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 항원이 돼지 시르코바이러스 2형 바이러스의 ORF2와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 DNA 서열에 의해 암호화된 단백질을 포함하는 용도.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 돼지 시르코바이러스 2형 항원이 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2 항원인 용도.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 시르코바이러스 2형 항원이 용량당 1ml로 제형화되고 투여되는 용도.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 임상적 증상이 림프선병증, 림프계 고갈 및 다핵화되거나 거대한 조직구로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
  21. 제20항에 있어서, 림프선병증, 림프계 고갈 및/또는 다핵화되거나 거대한 조직구가 소엽사이 부종을 갖는 간질성 폐렴, 피부 창백 또는 황달, 반점 위축성 간, 위궤양, 신염, 연막형 병변 및 생식 장애와 복합된 용도.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 15주령 미만의 돼지에게 투여되는 용도.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 3주령 이하, 바람직하게는 2주령 이하의 돼지에게 투여되는 용도.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 독성 돼지 시르코바이러스 2형 항원에 노출된지 약 3주 이내에 투여되는 용도.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 수의학적으로 허용되는 담체, 약제학적으로 허용되는 담체 및 면역조절제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함하는 용도.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 피부내, 기관내, 질내, 근육내, 비내, 정맥내, 혈관내, 동맥내, 복강내, 경구, 수막강내, 피하, 피내, 심장내, 엽내, 골수내 또는 폐내로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 시르코바이러스 2형 항원의 투여가 부작용 또는 주사 부위 반응을 나타내지 않는 용도.
  28. 돼지의 일반 질환 내성 수준을 개선시키는 약물을 제조하기 위한 돼지 시르코바이러스 2형 항원의 용도.
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