ME01156B

ME01156B - Postupci i kompozicije za imunizaciju svinja protiv svinjskog cirkovirusa

Info

Publication number: ME01156B
Application number: MEP-2010-93A
Authority: ME
Inventors: Stephen Qitu Wu
Original assignee: Zoetis Services Llc
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2013-03-20
Also published as: US20110305725A1; US20090162398A1; RU2493254C9; RU2493254C2; KR20100094587A; AU2008343172A1; BRPI0821286A2; CO6290791A2; AU2008343172B2; CA2710247C; NZ586238A; BRPI0821286A8; RU2010124791A; CN101932700A; JP2011507522A; JP2017060473A; CL2008003813A1; WO2009085912A1; AR069882A1; CA2710247A1

Abstract

Predstavljeni pronalazak se odnosi na izolaciju identifikaciju dva nova soja svinjskog cirkoviru a tipa 28. Ova dva nova soja svinjskog cirkovirusa mogu se koristiti za pripremu kompozicija vakcine ili imunogenih kompozicija za imunizaciju svinja protiv multisistemskog sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS) . Prema tome, pronalazak daje postupke za izazivanje zaštitnog imunog odgovora protiv patogenog svinjskog cirkovirusa primenom na svinju imunogeno efikasne koli č ine kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije svinjskog cirkovirusa tipa 28 koja sadrži najmanje jedan od svinjskih cirkovirusa koji imaju nukleinsko kiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: l ili 2, ili najmanje jedan protein od najmanje jednog od dva nova soja svinj skog cirkovirusa tipa 2B kao što je ovde opisano. Pronalazak se dalje odnosi na zaštitu svinje od bilo kog ili vise simptoma ili posledica povezanih sa PMWS. Predstavljeni pronalazak se odnosi na izolaciju i identifikaciju dva nova soja svinjskog cirkovirua tipa 2B. Ova dva nova soja svinjskog cirkovirusa mogu se koristiti za pripremu kompozicija vakcine ili imunogenih kompozicija za imunizaciju svinja protiv multisistemskog sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS). Prema tome, pronalazak daje postupke za izazivanje zaštitnog imunog odgovora protiv patogenog svinjskog cirkovirusa primenom na svinju imunogeno efikasne količine kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije svinjskog cirkovirusa tipa 2B koja sadrži najmanje jedan od svinjskih cirkovirusa koji imaju nukleinsko kiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1 ili 2, ili najmanje jedan protein od najmanje jednog od dva nova soja svinjskog cirkovirusa tipa 2B kao što je ovde opisano. Pronalazak se dalje odnosi na zaštitu svinje od bilo kog ili više simptoma ili posledica povezanih sa PMWS.

Description

OBLAST PRONALASKA

Predstavljeni pronalazak je iz oblasti zdravlja životinja i pruža postupke i kompozicije za zaštitu svinja od patogenih sojeva svinjskog cirkovirusa tipa 2B. Naročito, predstavljeni pronalazak se odnosi na novo-identifikovane patogene sojeve svinjskog cirkovirusa tipa 2B, nukleinsko kiselinske sekvence koje kodiraju ove sojve tipa 2B i proteine koji su kodirani od strane ovih nukleinskih kiselina. Pronalazak se takođe odnosi na postupke i kompozicije za izazivanje imunog odgovora na patogeni svinjski cirkovirus primenom kompozicije koja sadrži imunogeno efikasnu količinu najmanje jednog od ovih svinjskih cirkovirusa tipa 2B, ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan od ovih svinjskih cirkovirusa tipa 2 ili najmanje jedan od proteina kodiranih od strane ovih nukleinskih kiselina.

OSNOVA PRONALASKA

Svinjski cirkovirus (PCV) je mali ikosaedarni virus bez omotača koji sadrži jednolančani kružni DNK genom od oko 1.76 kb. Prvobitno je izolovan kao zagađivač ćelijske strukture ćelijske linije svinjskog bubrega PK-15 (I. Tischer et al., Nature 295:64-66 (1982); I. Tischer et al., Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2): 153-167 (1974)). PCV je klasifikovan u familiju Circoviridae, koja se sastoji od tri cirkovirusa drugih životinja (virus anemije pilića (CAV), virus bolesti kljuna i perja (PBFDV) i nedavno otkriven kolumbidni cirkovirus (CoCV) iz golubova) i tri biljna cirkovirusa (,,bunchy top“ virus kod banane, virus koji izaziva propadanje listova kod kokosove palme i virus koji napada podzemni deo deteline) (M. R. Bassami et al., Virology 249:453-459 (1998); J. Mankertz et al., Virus Genes 16:267-276 (1998); A. Mankertz et al., Arch. Virol. 145:2469-2479 (2000); B. M. Meehan et al., J. Gen. Virol. 78:221-227 (1997); B. M. Meehan et al„ J. Gen. Virol. 79:2171-2179 (1998); D. Todd et al., Arch. Virol. 1 17:129-135 (1991)). Članovi tri prethodno priznata životinjska cirkovirusa (PCV, CAV i PBFDV) međusobno ne dele homologiju nukleotidne sekvence ili antigene determinante (M. R. Bassami et al., 1998, supra; D. Todd et al., 1991, supra). Eksperimentalna infekcija svinja sa PCV poreklom od PK-15 ćelija nije proizvela kliničku bolest i na taj način, ovaj virus se ne smatra patogenim kod svinja (G. M. Allan et al., Vet. Microbiol. 44:49-64 (1995); I. Tischer et al., Arch. Virol. 91 :271-276 (1986)). Ovaj nepatogeni PCV poreklom od kontaminirane PK-15 ćelijske linije označen je kao svinjski cirkovirus tip 1 ili PCV1.

Multisistemski sindrom kržljavosti odbijene prasadi (PMWS), koji je prvi put opisan 1991. (J. C. Harding and E. G. Clark, Swine Health and Production 5:201-203 (1997)), je složena bolest kržljavosti odbijene prasadi koji postaje sve više raširen. PMWS uglavnom pogađa prasiće starosti između 5-18 nedelja. Klinički simptomi PMWS obuhvataju progresivan gubitak telesne težine, dispneju, tahipneju, anemiju, dijareju i žuticu. Stopa mortaliteta može da varira od 1% do 2%, i do 40% u nekim komplikovanim slučajevima u U.K. (M. Muirhead, Vet. Rec. 150:456 (2002)). Mikroskopske lezije karakteristične za PMWS obuhvataju granulomatoznu intersticijalnu pneumoniju, limfadenopatiju, hepatitis i nefritis (G. M. Allan and J. A. Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12:3-14 (2000); J. C. Harding and E. G. Clark, Swine Health and Production 5:201-203 (1997)).

Dok je PCV1 prisutan svuda kod svinja, nije patogen kod njih. Primami uzročnik PMWS je obično patogeni soj PCV označen kao svinjski cirkovirus tip 2 ili PCV2 (G. M. Allan et al., Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan et al., J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan et ah, Vet. Microbiol. 66:1 15-23 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12:3-14 (2000); J. Ellis et al. Can. Vet. J. 39:44-51 (1998); A. L. Hamel et ah, J. Virol. 72:5262-5267 (1998); B. M. Meehan et ah, 1998, supra; I. Morozov et ah, J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)). Određena je kompletna genomska sekvenca PCV2 povezanog sa PMWS (M. Fenaux et ah, J. Clin. Microbiol. 38:2494- 503 (2000); A. L. Hamel et ah, 1998, supra; J. Mankertz et ah, 1998, supra; B. M. Meehan et ah, 1997, supra; B. M. Meehan et ah, 1998, supra; I. Morozov et ah, 1998, supra).

Analize sekvenci otkrivaju da PCV2 povezan sa PMWS deli samo oko 75% identičnosti nukleotidne sekvence sa nepatogenim PCV1. ORF2 gen nepatogenog PCV1 i patogenog PCV2 kodira glavni imunogeni virusni protein kapsida (P. Nawagitgul et ah, Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1 :33-40 (2002); P. Navvagitgul et ah, J. Gen. Virol. 81: 2281-2287(2000)).

Zbog svog potencijalnog uticaja na industriju svinja, razvoj vakcine protiv PCV2 dobio je veliki značaj. Na primer, SAD Pat. br. 6,287,856 (Poet et ah) i WO 99/45956 opisuju nukleinske kiseline iz virusa bolesti kljuna i perja (BFDV), cirkovirusa koji inficira ptičje vrste i iz svinjskog cirkovirusa (PCV). Kompozicije vakcine za patentne svrhe sadrže golu DNK ili iRNK i otkrivaju nukleinsko kiselinski vektor za prolaznu ekspresiju PCV u eukariotskoj ćeliji koja sadrži cis-delujuću transkripcionu ili translacionu regulatomu sekvencu poreklom od neposrednog ili ranog genskog pojačivača ili promotora humanog citomegalovirusa koji je funkcionalno vezan za nukleinsku kiselinu sekvence.

SAD Pat. br. 6,217,883 (Allan et al.) i Francuski Patent br. 2,781,159B opisuju izolaciju pet PCV sojeva iz plućnih ili ganglijskih uzoraka uzetih od svinja inficiranih sa PMWS u Kanadi, Kaliforniji i Francuskoj (Bretanja), i njihovu primenu u kombinaciji sa najmanje jednim antigenom svinjskog parvovirusa u kompozicijama vakcine/imunogenim kompozicijima. Dok su proteini koji su kodirani od strane otvorenih okvira čitanja (ORF) PCV2 koji se sastoje od ORF1 do ORF 13 široko opisani u patentu, nema ilustracije bilo koje od specifičnih imunogenih osobina koje ispoljava protein. Patent dalje opisuje vektore koji se sastoje od DNK plazmida, linearnih DNK molekula i rekombinantnih virusa koji sadrže i eksprimiraju in vivo molekul nukleinske kiseline koji kodira PCV antigen.

Nekoliko drugih referenci, na primer, SAD Pat. br. 6,391,314 BI; SAD Pat. br. 6,368,601 BI; Francuski Patent br. 2,769,321; Francuski Patent br. 2,769,322; WO 01/96377 A2; WO 00/01409; WO 99/18214; WO 00/77216 A2; WO 01/16330 A2; WO 99/29871; itd., opisuju primenu PCV1 ili PCV2 polipeptida ili nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide različitih sojeva kao kompozicije vakcine.

Citiranje bilo koje od referenci ne bi trebalo smatrati kao dokaz da je ta referenca dostupna kao stanje tehnike za ovaj pronalazak.

REZIME PRONALASKA

U njegovom najširem aspektu, predstavljeni pronalazak daje izolaciju i identifikaciju dva nova soja svinjskih cirkovirusa tipa 2 (PCV2), pri čemu se svaki od njih može koristiti pojedinačno, ili u kombinaciji, za pripremu kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije za primenu u zaštiti svinja od infekcije patogenim PCV2 ili za poboljšanje najmanje jednog simptoma povezanog sa multisistemskim sindromom kržljavosti odbijene prasadi (PMWS).

Prema tome, prvi aspekt pronalaska daje izolovani svinjski cirkovirus tip 2 čiji genom sadrži molekul nukleinske kiseline od SEQ ID NO: 1 (označen kao FD07) ili 2 (označen kao FDJE), ili čiji genom sadrži molekul nukleinske kiseline koji ima najmanje 95% homologije sekvence sa SEQ ID NO: 1 ili 2.

U jednoj varijanti, dva novo identifikovana i izolovana svinjska cirkovirusa su svinjski cirkovirusi tipa 2B (PCV2B).

U jednoj varijanti, izolovani svinjski cirkovirusi imaju ORF2 protein sa najmanje 92% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 3 (iz FD07) ili sa 4 (iz FDJE).

U jednoj varijanti, izolovani svinjski cirkovirusi imaju ORF2 protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili 4.

Drugi aspekt pronalaska daje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira patogeni svinjski cirkovirus tip 2B, ili koji kodira najmanje jedan protein iz navedenog cirkovirusa, pri čemu molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 95% homologije sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1 ili 2. U jednoj varijanti, izolovani molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1 ili 2.

U jednoj varijanti, izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira ORF 1 protein replikaze FD07 sadrži ostatke 51-995 iz SEQ ID NO: 5 i izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira ORF 2 protein kapsida FD07 sadrži ostatke 1033-1734 iz SEQ ID NO: 5.

U jednoj varijanti, izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira ORF 1 protein replikaze FDJE sadrži ostatke 51-995 iz SEQ ID NO: 6 i izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira ORF 2 protein kapsida FDJE sadrži ostatke 1033-1734 iz SEQ ID NO: 6. U jednoj varijanti, izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira ORF2 protein koji ima aminokiselinsku sekvencu kao stoje data u SEQ ID NO: 3 ili 4.

Treći aspekt pronalaska daje imunogenu kompoziciju ili kompoziciju vakcine koja sadrži najmanje jedan od sledećih: najmanje jedan od izolovanih svinjskih cirkovirusa tipa 2B kao stoje ovde opisano, ili njihovu kombinaciju; najmanje jedan molekul nukleinske kiseline koji kodira najmanje jedan od svinjskih cirkovirusa tipa 2B koji su ovde opisani; najmanje jedan molekul nukleinske kiseline koji kodira najmanje jedan protein iz najmanje jednog od svinjskih cirkovirusa tipa 2B koji su ovde opisani; ili najmanje jedan protein dobijen iz najmanje jednog od svinjskih cirkovirusa tipa 2B koji su ovde opisani i farmaceutski prihvatljiv adjuvant.

U jednoj varijanti, kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija može da sadrži jedan ili više od sledećih:

a) živi/oslabljeni, ili modifikovani živi PCV2B čiji genom sadrži molekul nukleinske kiseline bilo koje od SEQ ID NO: 1 ili 2;

b) ubijen/inaktiviran PCV2B čiji genom sadrži molekul nukleinske kiseline bilo koje od SEQ ID NO: 1 ili 2;

c) PCV2B DNK vakcina (npr. plazmidni vektor koji eksprimira ORF2 PCV2B čiji genom sadrži molekul nukleinske kiseline bilo koje od SEQ ID NO: 1 ili 2); ili

d) inaktivirani virusni vektor (npr. bakulovirus, adenovirus ili poksvirus, kao što je poksvirus rakuna; ili bakterija, kao što je E.coli), koji eksprimira ORF2 PCV2B čiji genom sadrži molekul nukleinske kiseline bilo koje od SEQ ID NO: 1 ili 2. U jednoj varijanti, kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija pri čemu je ORF 2 gen dobijen od svinjskog cirkovirusa tipa 2B od SEQ ID NO: 1 ili 2 može unakrsno da štiti od infekcija sa svinjskim sojem tipa 2A, tipa 2C ili tipa 2D, ili bilo koje druge varijante. Primena takve kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije ima za rezultat zaštitu svinje od sojeva tipa 2A niske virulencije/niskog mortaliteta, i takođe ima za rezultat unakrsnu zaštitu od sojeva tipa 2B visoke virulencije/visokog mortaliteta patogenih svinjskih cirkovirusa. Korišćena kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija može se primenjivati kao jedna doza ili kao višestruke doze. Rezultati primene u zaštiti svinja od jednog ili više od simptoma ili posledica povezanih sa multisistemskim sindromom kržljavosti odbijenih prasadi (PMWS). Pored toga, primena kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije koja sadrži bilo koju od prethodno navedenih varijanti takođe ima za rezultat smanjenje mortaliteta koji je veći od prošeka koji je povezan sa sojevima svinjskog cirkovirusa tipa 2B visoke virulencije/visokog mortaliteta.

U jednoj varijanti, imunogena kompozicija ili kompozicija vakcine opisana u prethodnom tekstu može se koristiti za izazivanje imunog odgovora protiv svinjskog cirkovirusa, ili za zaštitu svinja od infekcije patogenim PCV2, ili za poboljšanje najmanje jednog simptoma koji je povezan sa bolešću. U jednoj varijanti, imunogena kompozicija ili kompozicija vakcine koja je opisana u prethodnom tekstu dalje sadrži najmanje jedan drugi mikroorganizam, ili antigen dobijen od navedenog mikroorganizma protiv koga je poželjan imuni odgovor. U jednoj varijanti, imunogena kompozicija ili kompozicija vakcine opisana u prethodnom tekstu dalje sadrži najmanje jedan drugi molekul nukleinske kiseline koji kodira najmanje jedan antigen od najmanje jednog različitog (drugog) mikroorganizma protiv koga je poželjan imuni odgovor. Drugi mikroorganizam može biti izabran iz grupe koju čine virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS), svinjski parvovirus (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bakterija leptospira, virus svinjskog gripa, Escherichia coli antigen, svinjski respiratorni koronavirus, rotavirus, patogen uzročnik Aujeszky-eve bolesti, patogen uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa, i drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa. Drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa može biti cirkovirus tip 2A ili tip 2B.

U jednoj varijanti, imunogena kompozicija ili kompozicija vakcine primenjuje se sa ili bez adjuvanta.

U jednoj varijanti, imunogena kompozicija ili kompozicija vakcine primenjuje se u jednoj dozi ili u višestrukim dozama subkutano, intramuskularno, intranazalno, transdermalno, intrahepatički ili preko intralimfoidnog puta.

Četvrti aspekt pronalaska daje postupak za imunizaciju svinja protiv virusne infekcije ili multisisitemskog sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS), ili za prevenciju PMWS kod svinja uzrokovanu sojem PCV2, ili za poboljšanje najmanje jednog simptoma povezanog sa PMWS, koji sadrži primenu na svinju imunogeno efikasne količine kompozicije koja sadrži jedno ili više od sledećih:

a) imunogeno efikasnu količinu najmanje jednog svinjskog cirkovirusa tipa 2 kodiranog od strane molekula nukleinske kiseline bilo koje od SEQ ID NO: 1 ili 2, kao što je ovde opisano;

b) molekul nukleinske kiseline koji kodira najmanje jedan od svinjskih cirkovirusa tipa 2 iz a);

c) imunogeno efikasnu količinu najmanje jednog proteina koji je izolovan iz najmanje jednog od svinjskih cirkovirusa tipa 2 iz a); ili

d) imunogeno efikasnu količinu najmanje jednog molekula nukleinske kiseline koji kodira najmanje jedan protein iz c).

U jednoj varijanti, pronalazak daje postupke za imunizaciju ili zaštitu svinja od najmanje jednog patogenog soja svinjskog cirkovirusa primenom kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije koja sadrži netoksičan, fiziološki prihvatljiv nosač i imunogeno efikasnu količinu ubijenog/inaktiviranog svinjskog cirkovirusa tipa 2, ili živog, oslabljenog svinjskog cirkovirusa tipa 2 kao što je ovde opisano, čiji genom sadrži molekul nukleinske kiseline bilo koje od SEQ ID NO: 1 ili 2. U jednoj varijanti, dati su postupci prema pronalasku za imunizaciju ili zaštitu svinja od infekcije svinjskim cirkovirusom primenom kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije, kao što je opisano u prethodnom tekstu, koja dalje sadrži adjuvant.

U jednoj varijanti, pronalazak daje postupke za imunizaciju ili zaštitu svinja od patogenog soja svinjskog cirkovirusa tipa 2B, primenom kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije koji sadrže infektivnu nukleinsku kiselinu koja kodira svinjski cirkovirus tip 2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 ili 2, pri čemu primena ima za rezultat olakšanje jednog ili više simptoma infekcije svinjskim cirkovirusom. U jednoj varijanti, pronalazak daje postupke za imunizaciju ili zaštitu svinja od patogenog soja svinjskog cirkovirusa tipa 2B, primenom imunogeno efikasne količine kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije, pri čemu kompozicija sadrži najmanje jedan protein iz cirkovirusa tipa 2 kao što je opisano u predstavljenom pronalasku, ili nukleinsku kiselinu koja kodira protein iz svinjskog cirkovirusa tipa 2 prema predstavljenom pronalasku. U jednoj varijanti, protein iz svinjskog cirkovirusa tipa 2B prema predstavljenom pronalasku je ORF2 protein. U jednoj varijanti, ORF-2 gen koji kodira ORF2 protein iz svinjskih cirkovirusa tipa 2B prema predstavljenom pronalasku, označen kao FD07 i FDJE, sadrži ostatke 1033-1074 nukleotidne sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 5 i 6, redom, i protein koji je kodiran od strane ORF-2 gena FD07 i FDJE sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 3 ili 4, redom.

U jednoj varijanti, pronalazak daje postupke za imunizaciju ili zaštitu svinja od patogenog soja svinjskog cirkovirusa tipa 2B, koji sadrže primenu kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije koja sadrži svinjski cirkovirus tipa 2, ili nukleinsku kiselinu koja kodira svinjski cirkovirus tipa 2, pri čemu je svinjski cirkovirus kodiran od strane nukleotidne sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1 ili 2, njihovih komplementarnih lanaca, ili nukleinsko kiselinske sekvence koja ima najmanje 95% homologije sa nukleotidnom sekvencom iz SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2.

U jednoj varijanti, pronalazak daje postupke za imunizaciju ili zaštitu svinja od patogenog soja svinjskog cirkovirusa tipa 2B primenom kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije koja sadrži najmanje jedan od dva nova svinjska cirkovirusa tipa 2B ili nukleinsku kiselinu koja kodira najmanje jedan od dva nova svinjska cirkovirusa tipa 2B prema predstavljenom pronalasku, ili najmanje jedan protein iz najmanje jednog od dva soja tipa 2B prema predstavljenom pronalasku, ili nukleinsku kiselinu koja kodira najmanje jedan od ova dva proteina, pri čemu je patogeni soj svinjskog cirkovirusa tipa 2B soj svinjskog cirkovirusa koji sadrži protein kapsida koji je kodiran od strane ORF 2 gena koji ispoljava ne više od 92% identičnosti sekvence sa proteinom kapsida koji je kodiran od strane ORF 2 gena od najmanje jednog od dva soja svinjskog cirkovirusa tipa 2B koji su opisani u predstavljenom pronalasku. Aminokiselinske sekvence proteina kapsida sojeva svinjskog cirkovirusa tipa 2B prema predstavljenom pronalasku prikazane su u SEQ ID NO: 3 i 4.

U jednoj varijanti, dati su postupci za imunizaciju ili zaštitu svinja od infekcije patogenim sojem svinjskog cirkovirusa tipa 2B. koji sadrže primenu na svinju kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije koja sadrži svinjski cirkovirus tipa 2B, ili nukleinsku kiselinu koja kodira svinjski cirkovirus tipa 2B, ili koja kodira najmanje jedan protein iz navedenog svinjskog cirkovirusa prema predstavljenom pronalasku, pri čemu navedena primena ima za rezultat poboljšanje jednog ili više od sledećih kliničkih simptoma:

smanjenje mikroskopskih lezija u jednom ili više limfoidnih ili ne-limfoidnih tkiva svinja izloženih virulentnom obliku svinjskog cirkovirusa tipa 2B;

smanjenje viremije povezane sa infekcijom svinjskim cirkovirusom; smanjenje nivoa nukleinske kiseline tipa 2A ili tipa 2B u jednom ili više tkiva.

U jednoj varijanti, postupak dalje sadrži primenu imunogeno efikasne količine druge različite imunogene kompozicije pre, zajedno sa, ili posle, primene imunogene kompozicije svinjskog cirkovirusa tipa 2 kao što je ovde opisano.

U jednoj varijanti, druga različita imunogena kompozicija sadrži imunogeno efikasnu količinu najmanje jednog drugog mikroorganizma koji je patogen za svinje, ili najmanje jedan antigen dobijen od navedenog mikroorganizma ili molekul nukleinske kiseline koji kodira navedeni antigen, pri čemu je mikroorganizam izabran iz grupe koju čine virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS), svinjski parvovirus (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bakterija leptospira, virus svinjskog gripa, Escherichia coli antigen, svinjski respiratorni koronavirus, rotavirus, patogen uzročnik Aujeskyeve bolesti, patogen uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa i drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa. Drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa može biti cirkovirus tipa 2A ili 2B.

Peti aspekt pronalaska daje vektor koji sadrži najmanje jedan egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira protein svinjskog cirkovirusa tipa 2A ili tipa 2B, pri čemu je protein svinjskog cirkovirusa ORF2 protein, i pri čemu je egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira navedeni protein naveden u ostacima 1033- 1734 iz SEQ ID NO: 5 ili 6.

U jednoj varijanti, vektor je vektor poksvirusa rakuna koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira najmanje jedan protein iz PCV2A ili PCV2B svinjskog cirkovirusa kao što su ovde opisani, ili oba.

U jednoj varijanti, vektor dalje sadrži jedan ili više egzogenih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antigen iz mikroorganizma koji je patogen za svinje, pri čemu je mikroorganizam izabran iz grupe koju čine virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS), svinjski parvovirus (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bakterija leptospira, virus svinjskog gripa, Escherichia coli antigen, svinjski respiratorni koronavirus, rotavirus, patogen uzročnik Aujeskyeve bolesti, patogen uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa i drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa.

Šesti aspekt pronalaska daje postupak za određivanje da li svinja ima, ili je u riziku od razvoja multisistemskog sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS), pri čemu taj postupak sadrži:

(I) merenje količine PCV2 nukleinske kiseline ili proteina kodiranog od strane navedene nukleinske kiseline u uzorku tkiva poreklom od sisara, pri čemu je navedena PCV2 nukleinska kiselina ili protein:

a) nukleinska kiselina koja sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 1, 2, 5 ili 6, ili nukleinska kiselina poreklom od nje;

b) protein koji sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 3 ili 4;

c) nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja se može hibridizovati sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1, 2, 5 ili 6, ili njihovim komplementima pod uslovima za visoku specifičnost vezivanja, ili protein koji sadrži sekvencu koja je kodirana od strane navedene sekvence koja se može hibridizovati;

d) nukleinska kiselina koja je najmanje 95% homologna sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1, 2, 5 ili 6, ili njihovim komplementom kao što je određeno primenom NBLAST algoritma; ili protein koji je njome kodiran; i

(II) upoređivanje količine navedene nukleinske kiseline ili proteina u uzorku tkiva od sisara koji je suspektan da ima, ili je u riziku od razvoja PMWS sa količinom nukleinske kiseline ili proteina koja je prisutna u uzorku tkiva od normalnog sisara, ili unapred određenog standarda za uzorak normalnog tkiva, pri čemu povećana količina navedene nukleinske kiseline ili proteina u uzorku tkiva od svinje koja ima ili je suspektna da ima PMWS u poređenju sa količinom u uzorku normalnog tkiva ili unapred određenim standardom za uzorak normalnog tkiva ukazuje na to da sisar ima ili daje u riziku od razvoja PMWS.

U jednoj varijanti, postupak za određivanje da li svinja ima, ili je u riziku od razvoja PMWS sadrži merenje količine PCV 2B nukleinske kiseline ili proteina prema pronalasku u uzorku tkiva izabranom iz grupe koju čine preponski površinski limfni čvor, traheobronhijalni limfni čvor, submandibulami limfni čvor, pluća, krajnik, slezina, jetra, bubreg, ćela krv i krvne ćelije.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slika 1. Kompletna genomska sekvenca svinjskog cirkovirusa tipa 2B koji je označen kao FD07 (SEQ ID NO: 1).

Slika 2. Kompletna genomska sekvenca svinjskog cirkovirusa tipa 2B koji je označen kao FDJE (SEQ ID NO: 2).

Slika 3. Aminokiselinska sekvenca ORF2 proteina kapsida PCV2B koji je označen kao FD07 (SEQ ID NO: 3).

Slika 4. Aminokiselinska sekvenca ORF2 proteina kapsida PCV2B koji je označen kao FDJE (SEQ ID NO: 4).

Slika 5. Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira ORF1 i ORF2 proteine FD07 (SEQ ID NO: 5).

Slika 6. Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira ORF1 i ORF2 proteine FDJE (SEQ ID NO: 6).

DETALJAN OPIS

Pre opisa predstavljenih postupaka i metodologije tretmana, potrebno je razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene postupke, i opisani eksperimentalni uslovi, kao takvi postupci i uslovi mogu da variraju. Takođeje potebno razumeti daje terminologija koja se ovde koristi za svrhe opisivanja samo određenih varijanti, i ne bi trebalo da bude ograničavajuća.

Kao što su korišćeni u ovoj prijavi i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine "a", "an" i "the" obuhvataju i množinu, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Na taj način, na primer, "postupak" obuhvata jedan ili više postupaka, i/ili koraka tipa koji je ovde opisan i/ili koji će postati jasan stručnjacima iz date oblasti tehnike čitanjem ovog opisa.

Prema tome, u predstavljenoj prijavi, mogu se koristiti uobičajene tehnike molekularne biologije, mikrobiologije i tehnike rekombinantne DNK koje spadaju u poznatu tehniku. Takve tehnike su potpuno objašnjene u literaturi. Videti, npr., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Flarbor, New York (ovde "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & SJ. Fliggins eds. (1985)); Transcription And Translation (B. D. Hames & SJ. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Ine. (1994).

Iako se svi postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u izvođenju ili testiranju pronalaska, ovde su opisani poželjni postupci i materijali. Sve publikacije koje su ovde navedene obuhvaćene su ovde u celini.

Definicije

Termini koji su ovde korišćeni imaju značenja koja prepoznaju i poznaju stručnjaci iz date oblasti tehnike, međutim, radi pogodnosti i kompletnosti, određeni termini i njihova značenja dati su u daljem tekstu.

Termin "adjuvant" označava jedinjenje ili smešu koja pojačava imuni odgovor na antigen. Adjuvant može da služi kao tkivni depo koji sporo oslobađa antigen i takođe kao aktivator limfoidnog sistema koji ne-specifično pojačava imuni odgovor (Hood et ah, Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, Califomia, p. 384). U zavisnosti od okolnosti, primarna imunizacija samo sa antigenom, u odsustvu adjuvanta, može biti neuspešna u izazivanju humoralnog ili ćelijskog imunog odgovora. Adjuvanti obuhvataju, ali bez ograničenja na, kompletni Freund-ov adjuvant, nekompletni Freund-ov adjuvant, saponin, mineralne gelove kao što su aluminijum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što je lizolecitin, pluronska kiselina, poboli, polianjoni, peptidi, uljane ili ugljovodonične emuzije, hemocijanin iz prilepaka, dinitrofenol, i potencijalno korisni humani adjuvanti kao što je BCG (Calmette-Guerin bacil) i Corynebacterium parvum. Poželjno, adjuvant je farmaceutski prihvatljiv.

"Antigen" označava molekul koji sadrži jedan ili više epitopa koji su sposobni da stimulišu imuni sistem domaćina da bi se formirao ćelijski antigen-specifičan imuni odgovor ili humoralni odgovor antitela kada je antigen prisutan u skladu sa predstavljenim pronalaskom Normalno, epitop će sadržati između oko 3-15, generalno oko 5-15, aminokiselina. Epitopi datog proteina mogu biti identifikovani primenom bilo kog broja tehnika za mapiranje epitopa, koje su dobro poznate u tehnici. Videti, npr., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totovva, N. J. Na primer, linearni epitopi mogu biti određeni npr., istovremenim sintetisanjem velikog broja peptida na čvrstim podlogama, pri čemu peptidi odgovaraju delovima proteinskog molekula, i reakcijom peptida sa antitelima dok su peptidi još uvek vezani za podloge. Takve tehnike su poznate u tehnici i opisane u, npr., SAD Pat. br. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, gde su sve ove reference ovde obuhvaćene u celini. Slično, konformacioni epitopi se jednostavno identifikuju određivanjem prostorne konformacije aminokiselina kao što je na primer putem, npr., rendgenske kristalografije i 2-dimenzionalne nuklearne magnetne rezonance. Videti, npr., Epitope Mapping Protocols, supra. Pored toga, za svrhe predstavljenog pronalaska, "antigen" označava protein koji obuhvata modifikacije, kao što su delecije, adicije i supstitucije (generalno konzervativne po prirodi, ali one mogu biti i ne-konzervativne), nativne sekvence, sve dok protein održava sposobnost da izazove imuni odgovor. Ove modifikacije mogu biti namerno izazvane, kao što je preko mutageneze usmerene na mesto, ili preko određenih sintetičkih postupaka, ili preko pristupa genetičkog inženjeringa, ili mogu biti slučajne, kao što je preko mutacija domaćina, koji proizvode antigene.

Termin "oslabljen", kao što je ovde korišćen za opisivanje, na primer, "oslabljenog virusa" i slično, označava mikroorganizam, na primer, virus, koji je ograničen u svojoj sposobnosti da raste ili da se replicira in vitro ili in vivo.

Termin "cirkovirus", kao što je ovde korišćen, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, označava bilo koji soj cirkovirusa koji spada unutar familije Circoviridae. Na primer, u predstavljenom pronalasku, cirkovirus je patogeni svinjski cirkovirus. U posebnim varijantama, patogeni svinjski cirkovirus je soj svinjskog cirkovirusa tipa 2B visoke virulencije/niskog mortaliteta ili soj svinjskog cirkovirusa tipa 2B visoke virulencije/visokog mortaliteta.

"Komplementarnost" se podrazumeva u svom priznatom značenju kao identifikovanje nukleotida u jednoj sekvenci koji hibridizuje (približava) sa nukleotidom u drugoj sekvenci prema pravilu A—»T, U i C—>G (i obrnuto) i na taj način "poklapa se" sa svojim partnerom za svrhe ove definicije. Enzimatska transkripcija ima merljive i dobro poznate učestalosti grešaka (u zavisnosti od specifičnog enzima koji je korišćen), na taj način unutar granica tačnosti transkripcije primenom načina koji su ovde opisani, stručnjak iz date oblasti bi razumeo da tačnost enzimatske sinteze komplementarnog lanca nije apsolutna i da amplikon ne mora potpuno da se poklapa u svakom nukleotidu sa ciljnom ili šablonskom RNK. Postupci sa primenom uslova za visoko specifično vezivanje su kao što sledi. Prehibridizacija filtera koji sadrže DNK izvodi se 8 časova do preko noći na 65°C u puferu sastavljenom od 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA i 500 µg/ml denaturisane DNK sperme lososa. Filteri su hibridizovani 48 časova na 65°C u prehibridizacionoj smeši koja sadrži 100 µg/ml denaturisane DNK sperme lososa i 5-20 X 106 cpm 32P-obeležene probe. Ispiranje filtera je izvedeno na 37°C za 1 čas u rastvoru koji sadrži 2X SSC, 0.01% PVP, 0.01% Ficoll i 0.01% BSA. Zatim sledi ispiranje u 0.1 X SSC na 50°C 45 min pre autoradiografije. Drugi uslovi za visoko specifično vezivanje koji se mogu koristiti dobro su poznati u tehnici, (videti, npr., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; videti takođe, Ausubel et al., eds., in the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1997 Current Protocols,© 1994-1997 John Wiley and Sons, Ine.).

U ovom opisu, termini kao što su "sadrži", "sastavljen" i slično mogu imati značenje koje im je pripisano u patentnom zakonu SAD-a; npr., oni mogu da znače "obuhvata", "obuhvaćen", "uključujući" i slično. Termini kao što je "sastoji se uglavnom od" imaju značenja koja im se pripisuju u patentnom zakonu SAD-a, npr., oni omogućavaju uključenost dodatnih sastojaka ili koraka koji ne umanjuju nove ili osnovne osobine pronalaska, tj., oni isključuju dodatne sastojke ili korake koji nisu navedeni koji umanjuju nove ili osnovne osobine pronalaska, i oni isključuju sastojke ili korake iz stanja tehnike, kao što su dokumenti u tehnici koji su ovde citirani ili koji su ovde obuhvaćeni referencom, naročito pošto je cilj ovog dokumenta da se defmišu varijante koje su patentabilne, npr., nove, nisu očigledne, inventivne su, u odnosu na stanje tehnike, npr., u odnosu na dokumente koji su ovde citirani ili obuhvaćeni referencom. I, termin "sastoji se od" ima značenje koje mu je dodeljeno u patentnom zakonu SAD-a; to jest, ovaj termini je nedvosmislen.

"Kodiran od strane" ili "kodiranje" označava nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu, pri čemu polipeptidna sekvenca sadrži aminokielinsku sekvencu od najmanje 3 do 5 aminokiselina, poželjnije najmanje 8 do 10 aminokiselina, i čak poželjnije najmanje 15 do 20 aminokiselina, pri čemu je polipeptid kodiran od strane nukleinsko kiselinskih sekvenci. Takođe su obuhvaćene polipeptidne sekvence, koje se imunološki mogu identifikovati sa polipeptidom koji je kodiran od strane sekvence. Na taj način, "polipeptidna", "proteinska" ili "aminokiselinska" sekvenca antigena može imati najmanje 70% sličnosti, poželjno najmanje oko 80% sličnosti, poželjnije oko 90-95% sličnosti, i najpoželjnije oko 99% sličnosti, sa polipeptidnom ili aminokiselinskom sekvencom antigena.

"Gen" kao što je korišćen u kontekstu predstavljenog pronalaska je sekvenca nukleotida u molekulu nukleinske kiseline (hromozom, plazmid, itd.) sa kojom je povezana genetička funkcija. Gen je jedinica nasleđivanja, na primer organizma, koja sadrži polinukleotidnu sekvencu (npr., DNK sekvenca za sisare) koja zauzima specifično fizičko mesto ("genski lokus" ili "genetički lokus") unutar genoma organizma. Gen može da kodira eksprimirani proizvod, kao što je polipeptid ili polinukleotid (npr., tRNK). Alternativno, gen može da defmiše genomsku lokaciju za određeni događaj/funkciju, kao što je vezivanje proteina i/ili nukleinskih kiselina (npr., mesta vezivanja faga), pri čemu gen ne kodira eksprimirani proizvod. Tipično, gen obuhvata kodirajuće sekvence, kao što su sekvence koje kodiraju polipeptid, i ne-kodirajuće sekvence, kao što su promotorske sekvence, poli-adenilacione sekvence, transkripcione regulatorne sekvence (npr., pojačivačke sekvence). Mnogi eukariotski geni imaju "egzone" (kodirajuće sekvence) isprekidane "intronima" (ne-kodirajućim sekvencama). U određenim slučajevima, gen može da deli sekvence sa drugim genom (genima) (npr., preklapajući geni).

Na taj način, "homologija" ili "identičnost" ili "sličnost" označava sličnost sekvence između dva peptida ili između dva molekula nukleinske kiseline. Homologija se može odrediti poređenjem položaja u svakoj sekvenci, koja može biti poravnata za svrhe poređenja. Kada je položaj u upoređivanoj sekvenci zauzet istom bazom ili aminokiselinom, tada su molekuli identični na tom položaju. Stepen homologije, sličnosti ili identičnosti između nukleinsko kiselinskih sekvenci je funkcija broja identičnih ili poklapajućih nukleotida na položajima koje dele nukleinsko kiselinske sekvence. Stepen identičnosti aminokiselinskih sekvenci je funkcija broja identičnih aminokiselina na položajima koje dele aminokiselinske sekvence. Stepen homologije ili sličnosti aminokiselinskih sekvenci je funkcija broja aminokiselina, tj. strukturno srodnih, na položajima koje dele aminokiselinske sekvence. "Nesrodne" ili "ne-homologne" sekvence dele manje od 40% identičnosti, mada poželjno manje od 25% identičnosti, sa jednom od sekvenci prema predstavljenom pronalasku. Prema tome, "homolog" svinjskog cirkovirusa ili njegov fragment, trebalo bi da deli najmanje oko 75% homologije sa svinjskim cirkovirusom ili njegovim fragmentom (poželjno oko 80% homologije, poželjnije oko 90-95% homologije i najpoželjnije oko 99% homologije).

"Imuni odgovor" na kompoziciju vakcine ili imunogenu kompoziciju je razvoj u subjektu humoralnog i/ili ćelijski-posredovanog imunog odgovora na molekule prisutne u kompoziciji antigena ili kompoziciji vakcine od interesa. Za svrhe predstavljenog pronalaska, "humoralni imuni odgovor" je imuni odgovor posredovan preko antitela i obuhvata stvaranje antitela sa afinitetom za antigen/vakcinu prema pronalasku, dok je "ćelijski-posredovan imuni odgovor" onaj koji je posredovan preko T-limfocita i/ili drugih leukocita. "Celijski-posredovani imuni odgovor" je izazvan predstavljanjem antigenih epitopa u vezi sa molekulima Klase I ili Klase II glavnom kompleksu histokompatibilnosti (MHC). Ovim se aktiviraju antigen-specifične CD4+ T pomoćne ćelije ili CD8+ citotoksični T limfociti ("CTL"). CTL imaju specifičnost za peptidne antigene koji su predstavljeni u vezi sa proteinima kodiranim od strane glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i ekspirimirani na površini ćelija. CTL pomažu u indukciji i stimulišu unutarćelijsko uništavanje unutarćelijskih mikroba, ili ližu ćelija inficiranih takvim mikrobima. Sledeći aspekt ćelijskog imuniteta obuhvata antigen-specifičan odgovor od strane pomoćnih T-ćelija. Pomoćne T-ćelije deluju tako što pomažu u stimulaciji funkcije, i fokusiraju se na aktivnost nespecifičnih efektornih ćelija protiv ćelija koje prikazuju peptidne antigene u vezi sa MHC molekulima na njihovoj površini. "Celijski-posređovan imuni odogovor" takođe označava proizvodnju citokina, hemokina i drugih takvih molekula proizvedenih od strane aktiviranih T-ćelija i/ili drugih leukocita, uključujući one poreklom od CD4+ i CD8+ T-ćelija. Sposobnost određenog antigena ili kompozicije da stimulišu ćelijski-posredovan imunološki odgovor može biti određena pomoću određenog broja testova, kao što su limfoproliferacioni (aktivacija limfocita) testovi, CTL citotoksični ćelijski testovi, testiranjem T-limfocita specifičnih za antigen u senzitizovanom subjektu, ili merenjem proizvodnje citokina od strane T ćelija kao odgovor na restimulaciju sa antigenom. Takvi testovi su dobro poznati u tehnici. Videti, npr., Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151 :4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376.

Termin "imunogen" označava sposobnost antigena ili vakcine da izazovu imuni odgovor, bilo humoralni ili ćelijski posredovan, ili oba. "Imunogeno efikasna količina" kao što je ovde korišćena označava količinu antigena ili vakcine koja je dovoljna da izazove imuni odgovor, bilo ćelijski (T ćelijski) ili humoralni (B ćelije ili antitelo) odgovor, ili oba. kao što je mereno standardnim testovima koji su poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike. Efikasnost antigena kao imunogena, može se meriti bilo preko proliferacionih testova, citolitičkih testova, kao što su testovi oslobađanja hroma da bi se merila sposobnost T ćelija da liziraju svoju specifičnu ciljnu ćeliju, ili merenjem nivoa aktivnosti B ćelija preko merenja nivoa antitela u cirkulaciji specifičnih za antigen u serumu. Pored toga, nivo zaštite imunog odgovora može se meriti izlaganjem imunizovanog domaćina antigenu koji je injektiran. Na primer, ako je antigen za koji se želi imuni odgovor, virus ili ćelija tumora, nivo zaštite indukovan "imunogeno efikasnom količinom" antigena meri se detekcijom procenta preživljavanja ili procenta mortaliteta posle izlaganja životinja virusu ili ćeliji tumora. U jednoj varijanti, "imunogeno efikasna količina" kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije označava titar virusnih čestica u opsegu od oko 1 do 7 Logio virusnih čestica/ml kao što je mereno preko FAID50 postupka (King et al., Journal of Comparative Medicine and Vet. Science, 29:85-89 (1965)) i u SAD patentu broj 4,824,785. U jednoj varijanti, "imunogeno efikasna količina" kompozicija vakcine ili imunogenih kompozicija je titar virusnih čestica u opsegu od oko 2 do 5 Logio virusnih čestica/ml kao što je mereno preko FAID50 postupka (King et al., Journal of Comparative Medicine and Vet. Science, 29:85-89 (1965)) i u SAD patentu broj 4,824,785. U jednoj varijanti, "imunogeno efikasna količina" kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije infektivne DNK može biti u opsegu od oko 50 do 5000 pg. U jednoj varijanti, " imunogeno efikasna količina" kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije infektivne DNK može biti u opsegu od oko 50 do 1000 pg. U određenim varijantama, termin "oko" označava unutar 20%, poželjno unutar 10%, i poželjnije unutar 5%.

Termin "imunogena kompozicija" označava svaku farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antigen, npr. mikroorganizam, pri čemu se ta kompozicija može koristiti za izazivanje imunog odgovora kod sisara. Imuni odgovor može da obuhvata T ćelijski odgovor, B ćelijski odgovor, ili oba T ćelijski i B ćelijski odgovor. Kompozicija može da služi za senzitizaciju sisara predstavljanjem antigena u vezi sa MHC molekulima na ćelijskoj površini. Pored toga, antigen-specifični T-limfociti ili antitela mogu biti stvoreni tako da omoguće buduću zaštitu imunizovanog domaćina. "Imunogena kompozicija" može da sadrži živu, oslabljenu ili ubijenu/inaktiviranu vakcinu koja sadrži ceo mikroorganizam ili imunogeni deo poreklom od njega koji indukuje bilo ćelijski posredovan (T ćelijski) imuni odgovor ili imuni odgovor posredovan preko antitela (B ćelijski), ili oba, i može da zaštiti životinju od jednog ili više simptoma povezanih sa infekcijom mikroorganizmom, ili može da zaštiti životinju od smrti kao posledice infekcije mikroorganizmom.

"Imunogeni ORF" označava otvoreni okvir čitanja koji izaziva imuni odgovor, na primer, ORF2 kodira imunogeni protein kapsida.

Vakcine i imunogene kompozicije prema predstavljenom pronalasku mogu dalje da sadrže jedan ili više dodatnih "imunomodulatora", koji su sredstva koja narušavaju ili menjaju imuni sistem, tako da se zapaža ushodna regulacija ili nishodna regulacija humoralnog i/ili ćelijski poredovanog imuniteta. U jednoj određenoj varijanti, poželjna je ushodna regulacija humoralne i/ili ćelijski posredovane grane imunog sistema. Primeri određenih imunomodulatora obuhvataju, na primer, "farmaceutski prihvatljiv adjuvant" ili citokin, pored ostalih. Ne-ograničavajući primeri "farmaceutski prihvatljivih adjuvanata" koji se mogu koristiti u vakcini prema predstavljenom pronalasku obuhvataju RIBI adjuvant sistem (Ribi Ine., Hamilton, Mont.), stipsu, mineralne gelove kao što su aluminijum hidroksid gel, ulje-u-vodi emulzije, voda-u-ulju emulzije kao što su, npr., Freund-ovi kompletni i nekompletni adjuvanti, Block kopolimer (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Ine., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif), AMPFIIGEN® adjuvant, saponin, kvil A ili druga frakcija saponina, monofosforil lipid A, i avridine lipid-amin adjuvant. Ne-ograničavajući primeri ulje-u-vodi emulzija koje su korisne u vakcini prema pronalasku obuhvataju modifikovane SEAM62 i SEAM 1/2 formulacije. Modifikovani SEAM62 je ulje-u-vodi emulzija koja sadrži 5% (zapr. /zapr. ) skvalena (Sigma), 1% (zapr. /zapr. ) ŠPAN® 85 deterdženta (ICI Surfactants), 0. 7% (zapr. /zapr. ) TWEEN® 80 deterdženta (ICI Surfactants), 2. 5% (zapr. /zapr. ) etanola, 200 µg/ml kvila A, 100 µg/ml holesterola i 0. 5% (zapr. /zapr. ) lecitina. Modifikovani SEAM 1/2 je ulje-u-vodi emulzija koja sadrži 5% (zapr. /zapr. ) skvalena, 1% (zapr. /zapr. ) ŠPAN® 85 deterdženta, 0. 7% (zapr. /zapr. ) Tween 80 deterdženta, 2. 5% (zapr. /zapr. ) etanola, 100 µg/ml kvila A, i 50 µg/ml holesterola. Drugi "imunomodulatori" koji mogu biti uključeni u vakcinu obuhvataju, npr., jedan ili više interleukina, interferona ili drugih poznatih citokina. U jednoj varijanti, adjuvant može biti derivat ciklodekstrina ili polianjonski polimer, kao što su oni opisani u SAD patentima br. 6, 165, 995 i 6, 610, 310, redom.

Termin "infektivan" označava da se virus replicira ili je sposoban da se replicira u svinjama, bez obzira na to da li virus izaziva bilo koju bolest. U predstavljenom pronalasku, primer "infektivne" DNK prikazanje kao PCV2 DNK od SEQ ID NO: 1 ili 2.

Termin "izolovan" ili "prečišćen" označava daje materijal uklonjen iz svoje originalne sredine (npr., prirodna sredina ako je on prirodan). Na primer, "izolovani" ili "prečišćeni" peptid ili protein je značajno bez ćelijskog materijala ili drugih kontaminirajućih proteina iz ćelijskog ili tkivnog izvora od koga je protein izveden, ili značajno bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisan. Izraz "značajno bez ćelijskog materijala" obuhvata preparate polipeptida/proteina u kojima je polipeptid/protein odvojen od ćelijskih komponenti ćelija od kojih je izolovan ili rekombinantno proizveden. Na taj način, polipeptid/protein koji je značajno bez ćelijskog materijala obuhvata preparate polipeptida/proteina koji imaju manje od oko 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% ili 1%, (po suvoj težini) kontaminirajućeg proteina. Kada je polipeptid/protein rekombinantno proizveden, on je takođe poželjno značajno bez podloge za kulturu, tj., podloga za kulturu predstavlja manje od oko 20%, 10% ili 5% zapremine proteinskog preparata. Kada je polipeptid/protein proizveden hemijskom sintezom, on je poželjno značajno bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija, tj., on je odvojen od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija koje su uključene u sintezu proteina. Prema tome, takvi preparati polipeptida/proteina imaju manje od oko 30%, 20%, 10%, 5% (po suvoj težini) hemijskih prekursora ili jedinjenja osim polipeptidnog/proteinskog fragmenta od interesa. "Izolovani" ili "prečišćeni" molekul nukleinske kiseline je onaj koji je odvojen od drugih molekula nukleinskih kiselina koje su prisutne u prirodnom izvoru molekula nukleinske kiseline. Pored toga, "izolovani" molekul nukleinske kiseline, kao što je cDNK molekul ili RNK molekul, može biti značajno bez drugog ćelijskog materijala, ili podloge za kulturu kada je proizveden rekombinantnim tehnikama, ili značajno bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisan.

Termini "ubijen" ili "inaktiviran" ovde se koriste naizmenično i označavaju značajno ili potpuno smanjenje u infektivnosti virusa (jednog ili više) korišćenog za pripremu kompozicija vakcine. Ubijanje ili inaktivacija virusa mogu biti procenjeni prema bilo kom postupku koji je poznat stručnjacima iz date oblasti tehnike, na primer, pomoću postupaka molekularne biologije (PCR), postupaka za titraciju virusnog titra, fluorescentnih, imunoloških postupaka (ELISA, RIA i slično), imunoenzimatskih postupaka koji omogućavaju detekciju jednog ili više virusnih polipeptida (Westem i slično). Korišćen je određeni broj različitih inaktivirajućih sredstava i načina uključjući formalin, azid, zamrzavanje-topljenje, ultrazvučnu obradu, toplotni tretman, iznenadni pad pritiska, deterdžent (naročito ne-jonski deterdženti), lizozim, fenol, proteolitičke enzime i beta-propiolakton.

Termin "limfoidno tkivo" označava svako tkivo koje je bogato u limfocitima i pomoćnim ćelijama kao što su makrofagi i retikularne ćelije i koje podržava mreža od vezivnog tkiva. Limfoidno tkivo obuhvata koštanu srž, timus, limfne čvorove, slezinu, krajnike, adenoide, Peyer-ova ostrvca i agregate limfocita na mukoznim površinama. "Ne-limfoidno" tkivo označava bilo koje drugo tkivo koje nije bogato u limfocitima i pomoćnim ćelijama kao što je ovde defmisano.

Kao što je ovde korišćen, izraz "nukleinska kiselina" ili "molekul nukleinske kiseline" označava DNK, RNK, kao i svaki od poznatih baznih analoga DNK i RNK ili od njih formirane himere. Na taj način, "nukleinska kiselina" ili "molekul nukleinske kiseline" označava fosfatni estar polimerni oblik ribonukleozida (adenozin, guanozin, uridin ili citidin; "RNK molekuli") ili deoksiribonukleozida (deoksiadenozin, deoksiguanozin, deoksitimidin, ili deoksicitidin; "DNK molekuli") bilo u jednolančanom obliku, ili dvolančane spirale. Dvolančane DNK-DNK, DNK-RNK i RNK-RNK spirale su moguće. Termin molekul nukleinske kiseline, i naročito DNK ili RNK molekul, označava samo primarnu i sekundarnu strukturu molekula, i ne ograničava ga na bilo koje određene tercijarne oblike. Na taj način, ovaj termin obuhvata dvolančanu DNK koja se nalazi, pored ostalog, u linearnim ili kružnim molekulima DNK (npr., restrikcioni fragmenti), plazmidima i hromozomima. Prilikom razmatranja strukture odrešenih dvolančanih molekula DNK, ove mogu biti opisane sekvence prema normalnoj konvenciji davanja samo sekvence u 5N do 3N smeru zajedno sa netranskribovanim lancem DNK (tj., lanac koji ima sekvencu homolognu sa iRNK).

"Rekombinantni molekul DNK" je molekul DNK koji je podvrgnut molekularnoj biološkoj manipulaciji.

"Nukleotid" označava podjedinicu DNK ili RNK koja se sastoji od azotnih baza (adenin. guanin, citozin i timin), fosfatnog molekula i molekula šećera (deoksiriboza u DNK i riboza u RNK).

Termin "otvoreni okvir čitanja" ili "ORF", kao što je ovde korišćen, označava minimalnu nukleotidnu sekvencu koja je potrebna da kodira određeni protein ili antigen cirkovirusa bez umetnutih stop kodona.

Termin "parenteralni" označava supstancu koja je uneta u telo ili primenjena na način koji ne obuhvata primenu preko digestivnog trakta, na primer, kao što je intravenskom ili intramuskulamom injekcijom.

Termin "patogeni" označava sposobnost bilo kog agensa infekcije, kao što je bakterija ili virus, da izazove bolest. U predstavljenom pronalasku, termin "patogeni" označava sposobnost svinjskog cirkovirusa, naročito, svinjskog cirkovirusa tipa 2, da izazove bolest kod svinja označenu kao "multisistemski sindrom kržljavosti odbijene prasadi" ili "PMWS". Ova bolest je često okarakterisana kržljanjem ili slabim učinkom kod odbijene prasadi i umerenim do teškim limfoidnim lezijama sa limfoidnom deplecijom i histiocitnom zamenom folikula u limfoidnim tkivima. Svinje koje pate od PMWS takođe je poznato da imaju respiratornu bolest, na primer, intersticijalna pneumonija, limfohistiocitni hepatitis i limfohistiocitni intersticijalni nefritis. Druga stanja povezana sa "patogenim" svinjskim cirkovirusom tipa 2 obuhvataju sporadične reproduktivne poremećaje, enteritis i sindrom svinjskog dermatitisa i nefropatije (PDNS). "Ne-patogeni" mikroorganizam označava mikroorganizam kome nedostaju osobine navedene u prethodnom tekstu za "patogene" sojeve svinjskog cirkovirusa. "Ne-patogeni" svinjski cirkovirus je generalno označen kao svinjski cirkovirus tip 1. "Patogeni" sojevi svinjskog cirkovirusa generalno su označeni kao svinjski cirkovirusi tipa 2. "Ne-patogeni" svinjski cirkovirus generalno je označen kao svinjski cirkovirus tip 1.

Na taj način, termin "procenat identičnosti" ili "procenat identičnosti sekvence" označava identičnost sekvence između dve aminokiselinske sekvence ili između dve nukleotidne sekvence. Mogu se koristiti različiti algoritmi i/ili programi za poravnanje, uključujući FASTA, BLAST ili ENTREZ. FASTA i BLAST su dostupni kao deo GCG paketa za analizu sekvence (University of Wisconsin, Madison, Wis.), i mogu se koristiti sa, npr., podrazumevanim podešavanjima. ENTREZ je dostupan preko National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Flealth, Bethesda. Md. U jednoj varijanti, procena identičnosti dve sekvence može se odrediti pomoću

GCG programa sa ,,gap weight“ od 1, npr., svaka aminokiselinska praznina je izmerena kao daje to jedno aminokiselinsko ili nukleotidno nepoklapanje između dve sekvence.

Termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" označava nosač odobren od strane regulatome agencije Federalne, savezne Vlade, ili druge regulatome agencije, ili naveden u Farmakopeji SAD-a ili drugoj priznatoj farmakopeji za primenu na životinjama, uključujući ljude kao i ne-humane sisare. Termin "nosač" označava razblaživač, adjuvant, inertni punilac ili prenosilac sa kojim se primenjuje farmaceutska kompozicija. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući one od nafte, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što je ulje od kikirikija, soj ino ulje, mineralno ulje, sezamovo ulje i slično. Voda je poželjan nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenski. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola takođe se mogu koristiti kao tečni nosači, naročito za injektabilne rastvore. Pogodni farmaceutski inertni punioci obuhvataju škrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrij um stearat, glicerol monostearat, talk, natrij um hlorid, suvo obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Kompozicija, ako je poželjna, takođe može da sadrži manje količine sredstava za vlaženje ili emulgatore, ili sredstva za puferovanje pH. Ove kompozicije mogu biti u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. Kompozicija može biti formulisana kao supozitorija, sa tradicionalnim vezujućim sredstvima i nosačima kao što su trigliceridi. Oralna formulacija može da obuhvata standardne nosače kao što su farmaceutske klase manitola, laktoze, škroba, magnezijum stearata, natrijum saharina, celuloze, magnezij um karbonata, itd. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača opisani su u "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. Formulacija bi trebalo da odgovara načinu primene.

"Polinukleotid" je polimer nukleinske kiseline, koji tipično kodira biološki aktivan (npr., imunogeni) protein ili polipeptid. U zavisnosti od prirode polipeptida kodiranog od strane polinukleotida, polinukleotid može da obuhvata malo nukleotida kao 10 nukleotida, npr., pri čemu polinukleotid kodira antigen. Pored toga, "polinukleotid" može da obuhvata kako dvolančane tako i jednolančane sekvence i označava, ali bez ograničenja na, cDNK od virusnih, prokariotskih ili eukariotskih iRNK, genomskih RNK i DNK sekvenci od virusne (npr. RNK i DNK virusi i retrovirusi) ili prokariotske DNK, i takođe sintetičke DNK sekvence. Ovaj termin takođe obuhvata sekvence koje obuhvataju bilo koji od poznatih baznih analoga DNK i RNK. Ovaj termin dalje obuhvata modifikacije, kao što su delecije, adicije i supstitucije (npr. metilacije ili terminalna modifikacija), nativne sekvence, poželjno tako da molekul nukleinske kiseline koditra, na primer, antigeni protein. Ove modifikacije mogu biti nameme, kao preko mutageneze usmerene na mesto, ili preko određenih sintetičkih postupaka, ili preko pristupa genetičkog inženjeringa, ili slučajne, kao što je preko mutacija domaćina, koje proizvode antigene. Termini "oligonukleotid" ili "oligo" ovde se koriste naizmenično.

Termini "svinja" i "svinjski" koriste se naizmenično i označavaju svaku životinju koja je član porodice Suidae kao stoje, na primer, svinja.

Termin "zaštita" označava zaštitu npr. sisara, naročito, svinje, od infekcije ili bolesti, indukcijom imunog odgovora na određeni patogen, npr. cirkovirus. Takva zaštita se generalno postiže posle tretmana sisara sa kompozicijama vakcine koje su ovde opisane.

Termini "protein", "polipeptid" i "peptid" označavaju polimer od aminokiselinskih ostataka i nisu ograničeni na minimalnu dužinu proizvoda. Na taj način, peptidi, oligopeptidi, dimeri, multimeri. i slično, uključeni su unutar definicije. Definicijom su obuhvaćeni kako ćeli proteini tako i njihovi fragmenti. Ovi termini takođe obuhvataju modifikacije, kao što su delecije, adicije i supstitucije (generalno konzervativne po prirodi, ali koje mogu biti nekonzervativne), nativne sekvence, poželjno takve da protein zadržava sposobnost da izazove imunološki odgovor unutar životinje na koji je protein primenjen. Takođe su obuhvaćene post-ekspresione modifikacije, npr. glikozilacija, acetilacija, fosforilacija i slično.

Kao što je ovde korišćen, termin "homologija sekvence" u svim njegovim gramatičkim oblicima označava vezu između proteina koji imaju zajedničko evolutivno poreklo, uključujući homologne proteine iz različitih vrsta (Reeck et al., 1987, Cell 50:667).

DNK sekvence su "značajno homologne" ili "značajno slične" kada se najmanje oko 75% (poželjno najmanje oko 80%, i poželjnije najmanje oko 90 ili 95%, i najpoželjnije oko 99%) nukleotida poklapa duž određene dužine DNK sekvenci. Sekvence koje su značajno homologne mogu biti identifikovane poređenjem sekvenci primenom standardnog softvera koji je dostupan u bankama podataka o sekvencama, ili u Southern hibridizacionom eksperimentu pod, na primer, specifičnim uslovima kao što je defmisano za taj određeni sistem. Definisanje odgovarajućih uslova hibridizacije je u okviru stručnosti u datoj oblasti tehnike. Videti, npr., Maniatis et ah, supra; DNA Cloning, Vols. 1 & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Slično, dve aminokiselinske sekvence su "značajno homologne" ili "značajno slične" kada je više od 70% aminokiselina identično, ili funkcionalno identično. Poželjno, slične ili homologne sekvence identifikovane su poravnanjem primenom, na primer, GCG (Genetics

Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) programa za poravnanje.

Kao stoje ovde korišćen, "tretman" (uključujući njegove varijacije, na primer, "lečiti" ili "tretiran") označava bilo koji ili više od sledećih: (i) prevenciju infekcije ili reinfekcije, kao u tradicionalnoj vakcini, (ii) redukciju težine, ili, eliminaciju simptoma, i (iii) značajnu ili potpunu eliminaciju dotičnog patogena ili poremećaja. Stoga, tretman može biti postignut profilaktički (pre infekcije) ili terapeutski (posle infekcije). U predstavljenom pronalasku, profilaktički tretman je poželjan način. Prema određenoj varijanti predstavljenog pronalaska, obezbeđene su kompozicije i postupci koje leče, uključujući profilaktičku i/ili terapeutsku imunizaciju, životinje domaćina protiv virusne infekcije. Postupci predstavljenog pronalaska su korisni za pružanje profilaktičkog i/ili terapeutskog imuniteta sisaru, poželjno svinji. Postupci prema predstavljenom pronalasku takođe mogu biti izvedeni na sisarima za primene u biomedicinskim istraživanjima.

Termini "vakcina" ili "kompozicija vakcine", koji se koriste naizmenično, označavaju farmceutske kompozicije koje sadrže najmanje jednu imunogenu kompoziciju koja indukuje imuni odgovor kod životinje. Vakcina ili kompozicija vakcine može da štiti životinju od bolesti ili moguće smrti kao posledice infekcije, i može ili ne mora da obuhvata jednu ili više dodatnih komponenti koje pojačavaju imunološko dejstvo aktivne komponente. Vakcina ili kompozicija vakcine može dodatno da sadrži dodatne komponente tipične za farmaceutske kompozicije. Vakcina ili kompozicija vakcine može dodatno da sadrži dodatne komponente tipične za vakcine ili kompozicije vakcine, uključujući, na primer, adjuvant ili imunomodulator. Imunogeno aktivna komponenta vakcine može da sadrži ćele žive organizme bilo u njihovom originalnom obliku, ili kao oslabljene organizme u modifikovanoj živoj vakcini, ili organizme inaktivirane odgovarajućim postupcima u ubijenoj ili inaktiviranoj vakcini, ili podjedinične vakcine koje sadrže jednu ili više imunogenih komponenti virusa, ili genetičkim inženjeringom dobijene, mutirane ili klonirane vakcine pripremljene pomoću postupaka koji su poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike. Vakcina može da sadrži jedan ili istovremeno više od jednog elemenata opisanih u prethodnom tekstu. U predstavljenom pronalasku, kompozicije vakcine obuhvataju, ali bez ograničenja na, žive, oslabljene ili ubijene/inaktivirane oblike celih himernih svinjskih cirkovirusa, infektivne nukleinske kiseline koje kodiraju himerne svinjske cirkoviruse, ili vakcine drugih infektivnih DNK uključujući plazmide, vektore ili druge nosače za direktno injektiranje DNK u svinje.

Opšti opis

Zbog njenog potencijalnog uticaja na industriju svinja, razvoj vakcine protiv patogenih oblika svinjskog cirkovirusa tipa 2 (PCV2) je od velikog značaja. Veruje se da će nepatogeni PCVI biti od ograničene upotrebe protiv PCV2 infekcija.

Pored toga, pojavili su se novi virulentni sojevi PCV2, koje delimično karakteriše stopa mortaliteta koja je viša od prosečne. Ovi patogeni sojevi PCV2 visoke virulencije/visokog mortaliteta označeni su kao PCV2B, dok su patogeni sojevi niske virulencije/niskog mortaliteta označeni kao PCV2A. Nedavno predložena alternativna nomenklatura za ova dva soja PCV2A soj označava kao "genotip II", ili "RFLP 422", dok je PCV2B soj označen kao "genotip I", ili "RFLP 321". Dok se određene od prethodno opisanih kompozicija vakcine mogu dokazati kao efikasne protiv patogenih sojeva PCV2A nižeg mortaliteta/manje virulentnosti, nijedan nije pokazan kao efikasan protiv patogenih sojeva PCV2B visoke virulencije, koje delimično karakterišu više od prosečne stope mortaliteta.

Imajući u vidu težinu infekcija i stopu mortaliteta koja je veća od prosečne povezane sa ovim visoko virulentnim patogenim PCV2B sojevima svinjskog cirokovirusa, bilo bi korisno identifikovati, izolovati i koristiti jedan ili više od ovih sojeva za pripremu imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine za imunizaciju i zaštitu svinja od multisistemskog sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS).

Predstavljeni pronalazak je usmeren na identifikaciju i izolaciju takvih sojeva PCV2B.

U jednoj varijanti, novo identifikovani i izolovani svinjski cirkovirus je soj tipa 2B koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu kao što je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1 ili 2. U jednoj varijanti, izolovani svinjski cirkovirus je soj tipa 2B koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 95% homologije sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1 ili 2. U jednoj varijanti, ORF2 protein novo identifikovanih i izolovanih svinjskih cirokovirusa tipa 2B ima najmanje 92% identičnosti sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 3 ili 4.

U jednoj varijanti predstavljenog pronalaska, dati su postupci za imunizaciju svinje od patogenog svinjskog cirkovirua tipa 2A ili 2B (PCV2) koji sadrže primenu imunogeno efikasne količine imunogene kompozicije koja sadrži svinjski cirkovirus koji je kodiran od strane nukleinskih kiselina prema predstavljenom pronalasku.

Naročito, dati su postupci prema predstavljenom pronalasku za primenu kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije koja sadrži jedno ili više od sledećih:

a) imunogeno efikasnu količinu najmanje jednog od svinjskih cirkovirusa tipa 2 kao što je ovde opisano, bilo u oslabljenom ili inaktiviranom/ubijenom obliku;

c) imunogeno efikasnu količinu najmanje jednog proteina izolovanog iz najmanje jednog od svinjskih cirkovirusa tipa 2 iz a); ili

U jednoj varijanti, kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija može da sadrži PCV2B DNK vakcinu (npr. plazmidni vektor koji eksprimira PCV2B ORF2). U jednoj varijanti, kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija može da sadrži inaktivirani virusni vektor (npr. bakulovirus, adenovirus ili poksvirus, kao što je poksvirus rakuna; ili bakterija, kao stoje E. coli), koji eksprimira PCV2B ORF2.

Takođe je razmatrano da su kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije kao što su ovde opisane efikasne za prevenciju jednog ili više simptoma povezanih sa multisistemskim sindromom kržljavosti odbijene prasadi (PMWS). Ovi simptomi mogu da obuhvataju, na primer, jedan ili više od sledećih: respiratornu bolest, mikroskopske lezije u jednom ili više tkiva ili organa, histiocitnu inflamaciju ili limfoidnu depleciju.

Pored toga, kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije koje su ovde opisane mogu se koristiti sa drugom ili trećom kompozicijom vakcine ili imunogenom kompozicijom koja štiti svinje od jednog ili više patogenih svinjskih cirkovirusa ili bakterija uključujući: virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS), svinjski parvovirus (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bakterija leptospira, virus svinjskog gripa, Escherichia coli antigen, svinjski respiratorni koronavirus, rotavirus, patogen uzročnik Aujeszky-eve bolesti, patogen uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa. Na primer, u jednoj varijanti, PCV kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija može se kombinovati sa kompozicijom vakcine ili imunogenom kompozicijom virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS). U jednoj varijanti, PCV kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija može se kombinovati sa kompozicijom vakcine ili imunogenom kompozicijom Mycoplasma hyopneumoniae. U jednoj varijanti, PCV kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija može se kombinovati sa kompozicijom vakcine ili imunogenom kompozicijom Mycoplasma hyopneumoniae i sa kompozicijom vakcine ili imunogenom kompozicijom virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS).

Primena PCV1-2 vakcina i imunogenih kompozicija

Predstavljeni pronalazak daje identifikaciju i izolaciju dva nova patogena PCV2B svinjskog cirkovirusa. Imajući u vidu potrebu za kompozicijom vakcine ili imunogenom kompozicijom za primenu na svinje za prevenciju PMWS koji uzrokuje patogeni soj svinjskog cirkovirusa, ili za poboljšanje najmanje jednog simptoma povezanog sa ovom bolešću kod svinja, predviđeno je da najmanje jedan od ova dva nova soja, ili najmanje jedna nukleinska kiselina koja kodira ova dva nova soja, ili najmanje jedan od proteina dobijenih od najmanje jednog od ovih sojeva, mogu biti formulisani u kompoziciji vakcine ili imunogenoj kompoziciji za primenu na svinju u cilju imunizacije svinje protiv ove bolesti, na taj način obezbeđujući zaštitu svinja od virusne infekcije i multisistemskog sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS).

Kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija koja sadrži najmanje jedan od novo identifikovanih i izolovanih PCV2B svinjskih cirkovirusa koja je predložena za primenu kao kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija u predstavljenim studijama pripremljena je upotrebom postupaka koji su ovde opisani.

Nukleinske kiseline prema pronalasku

Prečišćeni i izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodira ceo patogeni svinjski cirkovirus tipa 2B, kao što je ovde opisano, navedeni su u SEQ ID NO: 1 i 2. Uobičajeni postupci koji su dobro poznati u tehnici mogu se koristiti za pripremu komplementarnih lanaca ili nukleotidnih sekvenci koje poseduju visoku homologiju, na primer, pomoću standarda priznatog u tehnici ili tehnika hibridizacije za visoko specifično vezivanje. Prečišćeni i izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži DNK sekvencu gena imunogenog kapsida PCV2 DNK naveden je u ostacima 1033-1734 iz SEQ ID NO 5 i 6.

Prema tome, svaka pogodna životinjska ćelija koja sadrži PCV2B molekul nukleinske kiseline koji je ovde opisan može da proizvede žive, infektivne svinjske cirkoviruse. Živi, infektivni virus izveden je od DNK klona transfekcijom, na primer, PK-15 ćelija in vitro ili in vivo. Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, jedan primer PCV2 DNK je nukleotidna sekvenca navedena u SEQ ID NO: 1 i 2. Pronalazak dalje predviđa da se virus može izvesti od komplementarnog lanca ili nukleotidne sekvence koja ima visoku homologiju, najmanje 80%, i poželjnije, 95- 99% homologije, sa nukleotidnom sekvencom.

Takođe obuhvaćeni unutar obima predstavljenog pronalaska su biološki funkcionalni plazmidi, virusni vektori i slično koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji su ovde opisani, pogodne ćelije domaćini transficirane vektorima koji sadrže DNK klonove i imunogeni polipeptidni ekspresioni proizvodi. U jednoj varijanti, imunogeni protein je protein kapsida kodiran od strane ORF2 iz patogenog soja svinjskog cirkovirusa tipa 2B, kao što je ovde opisano. Aminokiselinska sekvenca ovog proteina kapsida u svinjskom cirkovirusu navedena je u SEQ ID NO: 3 i 4. Dalje su pronalaskom obuhvaćene njene biološki aktivne varijante. Stručnjak iz date oblasti tehnike bi znao kako da modifikuje, supstituiše, deletira, itđ., aminokiselinu (aminokiseline) iz polipeptidne sekvence i proizvede biološki aktivne varijante koje zadržavaju istu, ili značajno istu aktivnost kao ishodna sekvenca bez neodgovarajućeg napora.

Da bi se proizveli imunogeni polipeptidni proizvodi prema ovom pronalasku, postupak može da obuhvata sledeće korake: uzgajanje, pod pogodnim hranljivim uslovima, prokariotskih ili eukariotskih ćelija domaćina transficiranih sa molekulima nukleinske kiseline koji su ovde opisani na način koji omogućava ekspresiju polipeptidnih proizvoda, i izolaciju željenih polipeptidnih proizvoda standardnim postupcima koji su poznati u tehnici. Razmatrano je da imunogeni proteini mogu biti pripremljeni pomoću drugih tehnika kao što su, na primer, biohemijska sinteza i slično.

Vakcine i imunogene kompozicije

Priprema vakcina i imunogenih kompozicija koje sadrže patogene PCV2B viruse, kao što su opisani, i postupci njihove primene za zaštitu svinja od infekcije patogenim sojevima svinjskog cirkovirusa i PMWS, takođe su uključeni unutar obima predstavljenog pronalaska. Predviđeno je da se novi izolati PCV2B mogu koristiti kao ubijeni/inaktivirani preparat, ili mogu biti oslabljeni ili genetički modifikovani za primenu za imunizaciju svinja protiv virusne infekcije i PMWS. Prema tome, predstavljeni pronalazak predlaže postupke za imunizaciju svinja protiv infekcije patogenim cirkovirusom ili protiv PMWS primenom imunogeno efikasne količine kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije koja sadrži najmanje jedan od dva nova patogena svinjska cirkovirusa koji su ove opisani, ili najmanje jedan molekul nukleinske kiseline koji kodira najmanje jedan od ova dva cirkovirusa, ili najmanje jedan protein dobijen od najmanje jednog od ova dva cirkovirusa. Ovaj postupak može da štiti svinje kod kojih postoji potreba za zaštitom od virusne infekcije ili PMWS primenom na svinju imunogeno efikasne količine vakcine prema pronalasku, kao što je, na primer, vakcina koja sadrži imunogenu količinu PCV2B DNK. kloniranog virusa, plazmidnog ili virusnog vektora koji sadrži DNK PCV2B, polipeptidnih ekspresionih proizvoda, itd. Vakcina kao što je ovde opisana može se primenjivati sa drugom ili trećom kompozicijom vakcine ili imunogenom kompozicijom protiv drugih svinjskih patogena, uključujući na primer, PRRSV, PPV, i druge infektivne svinjske agense izabrane od sledećih: Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bakterija leptospira, virus svinjskog gripa, Escherichia coli antigen, svinjski respiratorni koronavirus, rotavirus, patogen uzročnik Aujeskyeve bolesti, patogen uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa. Određene kombinacije mogu da obuhvataju PCV kompoziciju vakcine ili imunogenu kompoziciju u kombinaciji sa PRRSV kompozicijom vakcine ili imunogenom kompozicijom; PCV kompoziciju vakcine ili imunogenu kompoziciju u kombinaciji sa kompozicijom vakcine ili imunogenom kompozicijom Mycoplasma hyopneumoniae; ili PSV kompoziciju vakcine ili imunogenu kompoziciju u kombinaciji sa obe prethodno navedene kompozicije vakcina ili imunogene kompozicije. Imuni stimulanti mogu se svinji davati istovremeno da bi se obezbedio širok spektar zaštite od drugih virusnih ili bakterijskih infekcija.

Vakcine ili imunogene kompozicije korišćene u postupcima prema pronalasku nisu ograničene na bilo koji određeni tip ili postupak pripreme. Vakcine ili imunogene kompozicije mogu da obuhvataju, na primer, nukleinsku kiselinu koja kodira jedan ili više proteina svinjskog cirkovirusa, vakcine infektivne DNK (tj. primenom plazmida, vektora ili drugih uobičajenih nosača za direktno injektiranje DNK u svinje), žive vakcine, modifikovane žive vakcine, inaktivirane vakcine, podjedinične vakcine, oslabljene vakcine, genetičkim inženjeringom dobijene vakcine, itd. U određenim varijantama, vakcina može da obuhvata infektivnu PCV2B DNK, klonirani PCV DNK genom u pogodnim plazmidima ili vektorima kao što su, na primer, pSK vektor, avirulentni, živi virus, inaktivirani virus, itd., ili virusni vektor mogu biti korišćeni, kao što su, ali bez ograničenja na, bakulovirusni vektor, adenovirusni vektor ili oksvirusni vektor, kao što je poksvirus rakuna, ili bakterijski vektor, kao što je E. coli. Bilo koji od prethodnih može se koristiti u kombinaciji sa netoksičnim, fiziološki prihvatljivim nosačem i, izborno, jednim ili više adjuvanata.

Inaktivirane virusne vakcine ili imunogene kompozicije mogu biti pripremljene tretmanom virusa poreklom od klonirane PCV DNK sa inaktivirajućim agensima kao što su formalin ili hidrofobni rastvarači, kiseline, itd., zračenjem ultraljubičastom svetlošću ili rendgenskim zracima, zagrevanjem, itd. Inaktivacija je izvedena na način koji se razume u tehnici. Na primer, u hemijskoj inaktivaciji, pogodan virusni uzorak ili uzorak seruma koji sadrži virus tretiranje dovoljno dugo dovoljnom količinom ili koncentracijom inaktivirajućeg agensa na dovoljno visokoj (ili niskoj, u zavisnosti od inaktivirajućeg agensa) temperaturi ili pH vrednosti da bi se virus inaktivirao. Inaktivacija zagrevanjem je izvedena na temperaturi i tokom vremena koji su dovoljni da inaktiviraju virus. Inaktivacija zračenjem izvedena primenom talasne dužine svetlosti ili drugog izvora energije tokom vremena koje je dovoljno da inaktivira virus. Virus se smatra inaktiviranim ako nije sposoban da inficira ćeliju koja je podložna infekciji.

Priprema podjediničnih vakcina tipično se razlikuje od pripreme modifikovane žive vakcine ili inaktivirane vakcine. Pre pripreme podjedinične vakcine, moraju se identifikovati zaštitne ili antigene komponente vakcine. Takve zaštitne ili antigene komponente obuhvataju određene aminokiselinske segmente ili fragmente proteina virusnog kapsida koji formiraju naročito snažan zaštitni ili imunološki odgovor kod svinja; pojedinačni ili višestruki proteini virusnog kapsida sami po sebi, njihovi oligomeri, i veze višeg reda proteina virusnog kapsida koje formiraju virusne strukture ili delove ili jedinice takvih podstruktura koji se mogu identifikovati; oligoglikozidi, glikolipidi ili glikoproteini su prisutni na ili blizu površine virusa ili u virusnim podstrukturama kao što su lipoproteini ili lipidne grupe povezane sa virusom, itd. Poželjno, protein kapsida, kao što je protein koji je kodiran od strane ORF2 gena, korišćen je kao antigena komponenta podjedinične vakcine. Drugi proteini kodirani od strane infektivnog DNK klona takođe mogu biti korišćeni. Ove imunogene komponente se lako identifikuju pomoću postupaka koji su poznati u tehnici. Pošto su identifikovani, zaštitni ili antigeni delovi virusa (tj., "podjedinica") zatim su prečišćeni i/ili klonirani pomoću postupaka koji su poznati u tehnici. Podjedinična vakcina obezbeđuje korist u odnosu na druge vakcine zasnovane na živom virusu s obzirom na to daje podjedinica, kao što su visoko prečišćene podjedinice virusa, manje toksična od celog virusa.

Ako je podjedinična vakcina proizvedena pomoću rekombinantnih genetičkih tehnika, ekspresija klonirane podjedinice kao što je ORF2 (kapsidni) gen, na primer, može se optimizovati pomoću postupaka koji su poznati u tehnici (vieti, na primer, Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Mass., 1989). Ako podjedinica koja se koristi predstavlja intaktnu strukturnu karakteristiku virusa, kao što je ceo protein kapsida, postupak za njegovu izolaciju iz virusa tada mora biti optimizovan. U svakom slučaju, posle optimizacije inaktivacionog protokola, protokol prečišćavanja podjedinice mora biti optimizovan pre proizvodnje.

Da bi se pripremile oslabljene vakcine od patogenih klonova, kultura tkiva prilogođenog, živog, patogenog PCV2 je prvo oslabljena (napravljena nepatogenom ili bezopasnom) pomoću postupaka koji su poznati u tehnici, tipično napravljena serijom pasaža kroz ćelijske kulture. Slabljenje patogenih klonova takođe se može napraviti genskim delecijama ili genskim mutacijama koje proizvodi virus. Zatim, oslabljeni PCV2 virusi mogu se koristiti za konstrukciju dodatnih PCV2 virusa koji zadržavaju nepatogeni fenotip PCV1, ali koji mogu da variraju u jačini imunogenih karakteristika selektovanih iz PCV2 genoma pomoću rekombinantne tehnologije.

Dodatne genetičkim inženjeringom dobijene vakcine, koje su poželjne u predstavljenom pronalasku, proizvedene su pomoću tehnika koje su poznate u tehnici. Takve tehnike obuhvataju, ali bez ograničenja na, dodatnu manipulaciju rekombinantne DNK, modifikaciju ili supstitucije aminokiselinskih sekvenci rekombinantnih proteina i slično.

Genetičkim inženjeringom dobijene vakcine na bazi rekombinantne DNK tehnologije napravljene su, na primer, identifikacijom alternativnih delova virusnog gena koji kodira proteine odgovorne za indukovanje jačeg imunog ili zaštitnog odgovora kod svinja (npr., proteine poreklom od ORF3, ORF4, itd.). Takvi identifikovani geni ili imunodominantni fragmenti mogu biti klonirani u standardne proteinske ekspresione vektore, kao što je bakulovirusni vektor, i korišćeni za inficiranje odgovarajućih ćelija domaćina (videti, na primer, 0'Reilly et ah, "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual," Freeman & Co., 1992). Ćelije domaćini su kultivisane na taj način da eksprimiraju željene proteine vakcine, koji mogu biti prečišćeni do željenog strepena i formulisani u pogodan proizvod vakcine.

Ako klonovi zadržavaju bilo koje neželjene prirodne sposobnosti uzrokovanja bolesti, takođe je moguće da se ukaže na nukleotidne sekvence u virusnom genomu koje su odgovorne za virulenciju, i genetičkim inženjeringom dobije avirulentan virus preko, na primer, mutageneze usmerene na mesto. Mutageneza usmerena na mesto može da doda, izbaci ili promeni jedan ili više nukleotida (videti, na primer, Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984). Sintetisan je oligonukleotid koji sadrži željenu mutaciju i vezanje za deo jednolančane virusne DNK. Hibridni molekul, koji je rezultat tog postupka, korišćen je za transformaciju bakterija. Zatim je dvolančana DNK, koja je izolovana tako da sadrži odgovarajuću mutaciju, korišćena za proizvodnju ćele DNK ligacijom za restrikcioni fragment ćele DNK koja je zatim transficirana u pogodnu ćelijsku kulturu. Ligacija genoma u pogodan vektor za transfer može se postići pomoću bilo koje standardne tehnike poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike. Transfekcija vektora u ćelije domaćine za proizvodnju virusnog progenitora može se izvesti primenom bilo kojih od uobičajenih postupaka kao što je kalijum-fosfatom ili DEAE-dekstratom posredovana transfekcija, elektroporacija, fuzija protoplasta i druge dobro poznate tehnike (npr., Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Klonirani virus zatim ispoljava željenu mutaciju. Alternativno, dva oligonukleotida mogu biti sintetisana tako da sadrže odgovarajuću mutaciju.

Oni mogu biti vezani tako da formiraju dvolančanu DNK koja može inserirana u virusnu DNK tako da proizvode ćelu DNK.

Genetičkim inženjeringom dobijeni proteini, korisni u vakcinama, na primer, mogu biti eksprimirani u ćelijama insekata, ćelijama kvasca ili sisarskim ćelijama. Genetičkim inženjeringom dobijeni proteini, koji mogu biti prečišćeni ili izolovani uobičajenim postupcima, mogu biti direktno inokulisani u svinje kako bi obezbedili zaštitu od virusne infekcije ili multisistemskog sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS) uzrokovane sa PCV2.

Insekatska ćelijska linija (kao HI-FIVE) može biti transformisana sa transfer vektorom koji sadrži molekule nukleinske kiseline dobijene od virusa ili kopirane iz virusnog genoma koji kodira jedan ili više imuno-dominantnih proteina virusa. Transfer vektor obuhvata, na primer, linearizovanu DNK bakulovirusa i plazmid koja sadrži željene polinukleotide. Ćelijska linija domaćina može biti ko-transficirana sa linearizovanom DNK bakulovirusa i plazmidom u cilju stvaranja rekombinantnog bakulovirusa.

Alternativno, DNK iz svinje koja pati od PMWS, koja kodira jedan ili više proteina kapsida, infektivni PCV2 molekularni DNK klon ili klonirani PCV DNK genom mogu biti inserirani u žive vektore, kao što je poksvirus ili adenovirus i korišćeni kao vakcina.

Imunogeno efikasna količina kompozicija prema predstavljenom pronalasku primenjuje se na svinju kod koje postoji potreba za zaštitom od virisne infekcije ili PMWS. Imunogeno efikasna količina ili imunogena količina koja inokuliše svinju može biti jednostavno određena ili jednostavno titrirana rutinskim testiranjem. Efikasna količina je ona kod koje se dobija dovoljan imunološki odgovor na vakcinu za zaštitu svinje izložene virusu koji uzrokuje PMWS. Poželjno, svinja je zaštićena u meri u kojoj su jedan do svi štetni fiziološki simptomi ili efekti virusne bolesti značajno redukovani, ublaženi ili potpuno sprečeni.

Kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija može se primenjivati u jednoj dozi ili u ponovljenim dozama. Doze mogu biti u opsegu, na primer, od 50 do 5,000 mikrograma plazmidne DNK koja sadrži infektivan DNK genom (u zavisnosti od koncentracije imuno-aktivne komponente vakcine), ali ne bi trebalo da sadrži količinu antigena na bazi virusa koja je dovoljna da rezultira u štetnoj reakciji ili fiziološkim simptomima virusne infekcije. U tehnici su poznati postupci za određivanje ili titraciju pogodnih doza aktivnog antigenog agensa na osnovu težine svinje, koncentracije antigena i drugih tipičnih faktora. Poželjno, infektivni virusni DNK klon je korišćen kao vakcina, ili živi infektivni virus može biti stvoren in vitro i zatim živi virus može se oslabiti i zatim koristiti kao vakcina. U tom slučaju, svinji se može dati 100 do 200 mikrograma klonirane PCV DNK ili oko 10,000 50% infektivne doze kulture tkiva (TCID50) živog oslabljenog virusa.

Poželjno, kompozicija vakcine ili imunogena kompozicija primenjuje se na svinju koja nije bila izložena PCV virusu. Vakcina koja sadrži PCV2 infektivni DNK klon ili njegove druge antigene oblike može se pogodno primenjivati intranazalno, transdermalno (tj., naneto na površinu kože za sistemsku apsorpciju), parenteralno, itd. Parenteralni način primene obuhvata, ali bez ograničenja na, intramuskularni, intravenski, intraperitonealni, intradermalni (tj., injektiran ili na drugi način postavljen pod kožu) način i slično. S obzirom na to da su intramuskularni i intradermalni način inokulacije bili uspešni u drugim studijama sa primenom virusnih infektivnih DNK klonova (E. E. Sparger et al., "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 (1997); L. Willems et al., "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992)), ovi načini su najpoželjniji, pored praktičnog intranazalnog načina primene. Iako manje pogodan, takođe je razmatrano da se vakcina daje svinji intralimfoidnim načinom inokulacije. Jedinstven, visoko poželjan postupak primene obuhvata direktno injektiranje plazmidne DNK koja sadrži PCV2 ili PCV2 virusa (oslabljen ili inaktiviran) u svinju intramuskularno, intradermalno, intralimfoidno, itd.

Kada se primenjuje kao tečnost, predstavljena vakcina može biti pripremljena u obliku vodenog rastvora, sirupa, eliksira, tinkture i slično. Takve formulacije su poznate u tehnici i tipično se pripremaju rastvaranjem antigena i drugih tipičnih aditiva u odgovarajućem nosaču ili sistemima rastvarača. Pogodni "fiziološki prihvatljivi" nosači ili rastvarači obuhvataju, ali bez ograničenja na, vodu, slani rastvor, etanol, etilen glikol, glicerol, itd. Tipični aditivi su, na primer, sertifikovane boje, arome, zaslađivači i antimikrobni konzervansi kao što je timerosal (natrijum etilmerkuritiosalicilat). Takvi rastvori mogu biti stabilizovani, na primer, dodavanjem delimično hidrolizovanog želatina, sorbitola ili podloge za ćelijsku kulturu, i mogu biti puferisani uobičajenim postupcima primenom reagenasa koji su poznati u tehnici, kao što su natrijum hidrofosfat, natrijum dihidro fosfat, kalijum hidrofosfat, kalijum dihidro fosfat, njihova smeša, i slično.

Tečne formulacije takođe mogu da obuhvataju suspenzije i emulzije koje sadrže suspendujuća sredstva ili emulgatore u kombinaciji sa drugim standardnim ko-formulantima. Ovi tipovi tečnih formulacija mogu biti pripremljeni pomoću uobičajenih postupaka. Suspenzije, na primer, mogu biti pripremljene primenom koloidnog mlina. Emulzije, na primer, mogu biti pripremljene primenom homogenizatora.

Parenteralne formulacije, dizajnirane za injektiranje u telesne tečne sisteme, zahtevaju odgovarajuću izotoničnost i puferovanje pH do nivoa koji odgovaraju svinjskim telesnim tečnostima. Izotoničnost može biti odgovarajuće podešena natrijum hloridom i drugim solima ukoliko je to potrebno. Pogodni rastvarači, kao što su etanol ili propilen glikol, mogu se koristiti za povećanje rastvorljivosti sastojaka u formulaciji i stabilnost tečnog preparata. Dodatni aditivi koji se mogu koristiti u predstavljenoj vakcini obuhvataju, ali bez ograničenja na, dekstrozu, uobičajene antioksidante i uobičajena helatirajuća sredstva kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA). Parenteralni oblici doze takođe moraju biti sterilizovani pre primene.

U jednoj varijanti, imunogeni ORF2 kapsidni gen poreklom od najmanje jednog od cirkovirusa tipa 2B koji su ovde opisani mogu se koristiti u kompoziciji vakcine ili imunogenoj kompoziciji.

Adjuvanti

Predstavljeni pronalazak daje izolaciju i identifikaciju dva nova svinjska cirkovirusa tipa 2B (PCV2B) kodirana od strane nukleinsko kiselinskih sekvenci iz SEQ ID NO: 1 i 2. Ovi novi sojevi PCV2B izolovani su iz svinja koje su bile izložene u sredini i kao takvi, mogu biti idealni kandidati za primenu u pripremi kompozicija vakcine i imunogenih kompozicija. Cilj pronalaska je upotreba ovih sojeva u ubijenim/inaktiviranim oblicima, ili priprema oslabljenih oblika ova dva soja za pripremu kompozicija vakcine ili imunogenih kompozicija. Cilj pronalaska je takođe njihova primena sa ili bez adjuvanta na populaciju svinja za prevenciju PMWS ili poboljšanje najmanje jednog simptoma povezanog sa ovom bolešću.

Prema tome, živ, oslabljeni svinjski cirkovirus tipa 2B, ili ubijeni/inaktivirani svinjski cirkovirusi, kao što su ovde opisani, ili nukleinska kiselina koja kodira ove svinjske cirkoviruse, ili najmanje jedan protein dobijen od ovih cirkovirusa može biti primenjen sa ili bez adjuvanta. U jednoj varijanti, vakcina je ubijen/inaktiviran PCV2B cirkovirus, koji se primenuje sa adjuvantom. Adjuvant je supstanca koja povećava imunološki odgovor svinje na vakcinu. Adjuvant se može primenjivati u isto vreme i na isto mesto kao vakcina, ili u različito vreme, na primer, kao ,,booster“. Adjuvanti takođe se korisno mogu primenjivati na svinju na način ili na mesto koje se razlikuje od načina ili mesta na koje se primenjuje vakcina. Pogodni adjuvanti obuhvataju, ali bez ograničenja na, aluminijum hidroksid (stipsa), imunostimulatome komplekse (ISCOMS), ne-jonske blok polimere ili kopolimere, citokine (kao što su IL-1, IL-2, IL-7, IFN-a, IFN-fl, IFN-y, itd.), saponine, monofosforil lipid A (MLA), muramil dipeptide (MDP) i slično. Drugi pogodni adjuvanti obuhvataju, na primer,

aluminij um kalijum sulfat, termolabilni ili termostabilni enterotoksin koji je izolovan iz Escherichia coli, toksin kolere ili njegovu B podjedinicu, toksin difterije, toksin tetanusa, toksin velikog kašlja, Freund-ov nekopletni ili kompletni adjuvant, itd. Adjuvanti na bazi toksina, kao što su toksin difterije, toksin tetanusa i toksin velikog kašlja mogu biti inaktivirani pre upotrebe, na primer, tretmanom sa formaldehidom.

Testovi za merenje imunih odgovora

Funkcionalni ishod vakcinacije svinje protiv svinjskog cirkovirusa može biti procenjen pomoću pogodnih testova koji prate indukciju ćelijskog ili humoralnog imuniteta ili T ćelijske aktivnosti. Ovi testovi su poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike, ali mogu da obuhvataju merenje citolitičke T ćelijske aktivnosti primenom na primer, testa oslobađanja hroma. Alternativno, testovi proliferacije T ćelija mogu se koristiti kao indikacija imune reaktivnosti ili njenog nedostatka. Pored toga, in vivo studije mogu se izvesti za procenu nivoa zaštite kod sisara vakcinisanog protiv patogena primenom postupaka prema predstavljenom pronalasku. Tipični in vivo testovi mogu da obuhvataju vakcinaciju životinje sa antigenom, kao stoje himerni svinjski cirkovirus koji je ovde opisan. Posle čekanja tokom vremena koje je dovoljno za indukciju odgovora antitela ili T ćelija, generalno od oko jedne do dve nedelje posle injekcije, životinje će biti izlagane antigenu, kao što je virus, i praćeno je poboljšanje jednog ili više simptoma povezanih sa virusnom infekcijom ili preživljavanja životinja. Uspešan režim vakcinisanja protiv svinjskog cirkovirusa imaće za rezultat značajno smanjenje jednog ili više simptoma povezanih sa virusnom infekcijom, ili smanjenje viremije, ili smanjenje broja ili težine lezija povezanih sa virusnom infekcijom, ili preživljavanja u poređenju sa ne-vakcinisanim kontrolama. Serum takođe može biti sakupljan da bi se pratili nivoi antitela stvoreni kao odgovor na injekcije vakcine, kao što je mereno pomoću postupaka poznatih stručnjacima u tehnici.

Postupci za poređenje izolata svinjskog cirkovirusa tipa 2A i tipa 2B

Može biti moguće da novo identifikovani svinjski cirkovirusi tipa 2B mogu biti efikasni kao kompozicije vakcine ili imunogene kompozicije za zaštitu od infekcije cirkovirusom tipa 2A ili tipa 2B, pri čemu su oba patogeni kod svinja. Sojevi tipa 2A i tipa 2B mogu se razlikovati preko primene analize polimorfizma dužine restrikcionog fragmenta (RFLP). RFLP koristi enzimsku razgradnju virusne nukleinske kiseline (delimično ili ćele), koja ima za rezultat specifičan obrazac sečenja koji je vizuelizovan na gelu. Ako postoje razlike između virusa na mestu enzimskog sečenja, mogu se zabeležiti različiti obrasci. Ova tehnika fmgerprinting-a uobičajeno se koristi za DNK viruse. Meng et al. (SAD patentna objava 2005/0147966) opisuju primenu PCR-RFLP testa primenom Ncol restrikcionog enzima da bi se napravila razlika između nepatogenih svinjskih cirkovirusa tipa 1 i patogenih svinjskih cirkovirusa tipa 2. Test PCR-RFLP na bazi ORF2 koji je opisan 2000. koji koristi Hinfl, HinPI, Kpnl, Mse\ i Rsal enzime sposoban je za razlikovanje PCV2 izolata (PCV2A, B. C, D i E) (Hamel AL, Lin LL, Sachvie C, Grudeski E, Nayar GP: PCR detection and characterization of type-2 porcine circovirus. Can J Vet Res. 64:44-52, 2000).

Test PCR-RFLP na bazi ORF2 koji koristi Sau'.3AI, Banll, Nspl, Xba\ i Cfr\ enzime nedavno je opisan i može da razlikuje 9 različitih PCV2 genotipova (Wen L, Guo X, Yang H: Genotyping of porcine circovirus type 2 from a variety of clinical conditions in China. Vet Microbiol. 1 10:141-146, 2005). PCV2 RFLP analiza je pokazala da postoji značajna promena od RFLP tipa 422 do tipa 321 2005. u Ontariju, Kanadi (Delay J, McEwen B, Carman S, van Dreuel T, Fairies J: Porcine circovirus type 2-associated disease is increasing. AHL Nevvsletter. 9:22, 2005).

Pored primene RFLP analize za razlikovanje svinjskih cirkovirusa tipa 2A i tipa 2B, veruje se da se ova dva soja mogu razlikovati na osnovu analize sekvenci.

Na primer, sa analizom sekvenci moguće je okarakterisati genetičku informaciju i međusobno uporediti izolate (Choi J, Stevenson GW, Kiupel M, Flarrach B, Anothayanontha L, Kanitz CL, Mittal SK: Sequence analysis of old and new strains of porcine circovirus associated with congenital tremors in pigs and their comparison with strains involved with postweaning multisystemic wasting syndrome. Can J Vet Res. 66:217-224, 2002; De Boisseson C, Beven V, Bigarre L, Thiery R, Rose N, Eveno E, Madec F, Jestin A: Molecular characterization of porcine circovirus type 2 isolates from post-weaning multisystemic wasting syndrome-affected and non- affected pigs. .1 Gen Virol. 85:293-304, 2004; Fenaux M, Halbur PG, Gill M, Toth TE, Meng XJ: Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postvveaning multisystemic vvasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2. J Clin Microbiol. 38:2494-2503, 2000; Grierson SS, King DP, Sandvik T, Hicks D. Spencer Y, Drew TW, Banks M: Detection and genetic typing of type 2 porcine circovirus in archived pig tissues from the UK. Arch Virol. 149:1171-1183, 2004; Kim JH, Lyoo YS: Genetic characterization of porcine circovirus-2 field isolates from PMWS pigs. J Vet Sci. 3:31-39, 2002 ; Mankertz A, Domingo M, Folch JM, LeCann P, Jestin A, Segales J, Chmielewicz B, Plana-Duran J, Soike D: Characterisation of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France.

Virus Res. 66:65-77, 2000). Da bi se dalje ispitale moguće razlike među PCV2 izolatima, moguće je sekvencirati ceo PCV2 genom ili sekvencirati samo ORF2.

Dva soja se takođe razlikuju u pogledu patologije, kliničkih simptoma i mortaliteta povezanih sa samom bolešću, pri čemu tip 2A pokazuje manje teške lezije u telesnim tkivima i nižu stopu mortaliteta, u poređenju sa težim lezijama i višom stopom mortaliteta povezanim sa sojevima tipa 2B. Ovi klinički parametri mogu se meriti primenom standardnih postupaka koji su poznati u tehnici i kao što je pokazano u predstavljenom pronalasku.

PRIMERI

Sledeći primeri pokazuju određene aspekte predstavljenog pronalaska. Međutim, potrebno je razumeti da su ovi primeri dati samo kao ilustracija i ne ograničavaju uslove i obim ovog pronalaska. Potrebno je razumeti da kada su dati tipični reakcioni uslovi (npr., temperatura, reakciono vreme, itd.), takođe se mogu koristiti i uslovi kako iznad tako i ispod naznačenih opsega, iako generalno manje pogodno. Svi delovi i procenti koji su ovde navedeni su na bazi težine i sve temperature su izražene u stepenima Celzijusove skale osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

PRIMER 1

IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA DVA NOVA SOJA SVINJSKOG CIRKOVIRUSA TIPA 2B

Planirana je studija za testiranje nove formulacije vakcine kod svinja da bi se procenila efikasnost protiv svinjskog cirkovirusa i M. hyopneumoniae. Tokom trajanja studije, zabeleženo je da je nekoliko od svinja u kontrolnoj i vakcinisanoj grupi ispoljilo simptome PMWS. Zatim je potvrđeno da su ove svinje izložene sredinskom PCV2 pre izlaganja antigenu. Molekulama analiza krvi i uzoraka tkiva iz ovih svinja otkrila je da oni sadrže soj tipa 2B koji se razlikuje od soja korišćenog za izlaganje antigenu. Pored toga, analizom sekvence je ustanovljeno da se PCV2B soj označen kao FD07 i drugi nov PCV2B soj izolovani iz svinje na farmi (označen kao FDJE) razlikuju od drugih sojeva tipa 2B identifikovanih u drugim terenskim studijama i od onih koje su prethodno drugi identifikovali. Materijal i metode za izolaciju i karakterizaciju ova dva nova soja PCV2B opisani su u daljem tekstu.

Materijal i metode

Testirane životinje

Za ovu studiju su korišćeni mužjaci mešane rase i ženke običnih svinja. Bilo je 24 vakcinisanih i 24 kontrole. Svinje su bile starosti 3 nedelje u vreme vakcinacije.

Svinje za studiju su kupljene sa komercijale farme i identifikovane primenom obeleživača na uhu. Svinje su dobijene iz jednog izvornog krda. U vreme prve vakcinacije svinje su bile seronegativne na PCV2 kao stoje određeno pomoću ELISA (S/P odnos < 0.5). Ciljna populacija za studiju bile su zdrave svinje za ishranu. U vezi sa njihovom imunom funkcijom, životinje koje su izabrane za ovu studiju smatraju se reprezentativnim za svinje za ishranu u SAD.

Svinje su smeštene u izolacione objekte u FDAH, Fort Dodge, IA. Vakcinisane životinje i kontrole su bile izmešane kroz ćelu studiju u sličnim životnim sredinama. Prasad je blokirana u sobama pomoću reze. Prostor za njihov smeštaj bio je u skladu sa važećim pravilima za dobrobit životinja. Svinje su hranjene standardnom komercijalnom ishranom sa slobodnim pristupom vodi i hrani.

Svinje koje zahtevaju medicinsku negu tretirane su kako je smatrano za neophodno i to od strane veterinara posle konsultacija sa istraživačem ove studije.

Rezultati PCV2-PCR testiranja uzoraka seruma ukazali su na slučajno/sredinsko izlaganje prasadi PCV2 virusu u jednoj od soba pre eksperimentalnog izlaganja virusu. PCV2 je prvo detektovan u serumu jednog kontrolnog praseta 28 dana posle vakcinacije, i identifikovan je kao soj svinjskog cirkovirusa tipa 2B (PCV2B) putem DNK sekvenciranja. Ovaj PCV2B inficirao je još 6 prasića. Dve od nevakcinisanih kontrolnih svinja razvile su kliničke simptome vezane za PCV2 i eutanazirane su 18 dana posle izlaganja virusu zbog slabog zdravstvenog stanja. Klinički simptomi su obuhvatali, ali bez ograničenja na, gubitak apetita, letargiju, depresiju, kijanje, kašalj, nazalnu sekreciju, sekreciju iz oka i dispneu. Pre eutanazije, uzeti su uzorci tkiva i krvi za analizu cirkovirusa i sekvenciranje.

Sakupljanje i testiranje uzoraka

Sakupljanje uzoraka

Nazalni bris

Nazalni bris je sakupljan 0-dana posle vakcinacije (DPV) za izolaciju PCV2 da bi se osiguralo da nema infekcije PCV2 u testiranim živoinjama pre vakcinacije. Uzorci nazalnog brisa postavljeni su u pojedinačne sterilne epruvete koje sadrže 3 ml MEM sa laktalbumin hidrolizatom (LAH) i gentamicinom (60 µg/ml), penicilinom (100 U/mL) i streptomicinom (100 µg/ml), i čuvane na ili ispod -50°C do testiranja.

Uzorci seruma

Svinjama je uzimana krv za uzorke seruma (ne više od deset ml) na dane 0, 13, 28 posle vakcinacije, i -1, 7, 14, 20 dana posle izlaganja virusu za ELISA testiranje, i na dane 0, 13, 28 posle vakcinacije, na dane -1, 3, 7, 10, 14, 17, 20 posle izlaganja virusu za PCR testiranje.

Uzorci tkiva

Izvršena je autopsija svih životinja na dane 20/21 posle izlaganja virusu. Isečci iz tri limfna čvora (traheobronhijalnog, ilijačnog i preponskog), krajnika i slezine sakupljeni su i fiksirani u formalinu za histopatološko ispitivanje i imunohistohemijsko (IHC) testiranje PCV2.

Testiranje uzorka

Enzimski vezani imunosorbent test (ELISA)

Indirektna ELISA je korišćena za detekciju anti-PCV2 antitela u uzorcima seruma primenom rekombinantnog proteina kapsida PCV2 (eksprimiran u bakulovirusu) kao antigen za hvatanje. Ukratko, 96-komoma polisitrenska ploča je obložena pozitivnim antigenom za hvatanje (Sf9 ćelije inficirane rekombinantnim bakulovirusom koji eksprimira protein kapsida PCV2). Šest komorica na svakoj ploči su obložene negativnim antigenom za hvatanje (SF9 ćelije insekata) kao kontrola. Posle tretmana ploče blokirajućim reagensom ploča je inkubirana sa test i kontrolnim uzorcima seruma. Svaki uzorak test seruma dodat je u komorice imuno-ploče obložene sa Antigen pozitivnim (3 komorice po svakom test uzorku). Pozitivan kontrolni uzorak seruma dodat je u šest komorica imuno-ploče obložene sa Anigen pozitivnim (pozitivna kontrola) i šest komorica imuno-ploče obložene sa Antigen negativnim (negativna kontrola). Zatim je u ploču dodato HRP konjugovano kozje anti-svinjsko sekundarno antitelo. Konačno, dodat je TMB (peroksidazni supstrat) i inkubiran tokom odgovarajućeg i za sve, istog vremena. Boja koja se razvila kvantitativno je određivana sa ELISA uređajem za očitavanje ploče. Svaki reagens u ELISA ploči je inkubiran na dobro defmisani način i ploča je ispirana da bi se uklonio višak reganesa pre svakog narednog koraka. OD (optička gustina) test uzoraka i pozitivne kontrole izračunata je oduzimanjem prosečne OD negativne kontrole od prosečne OD test uzoraka i pozitivne kontrole. Titar seruma je izražen kao S/P (uzorak/pozitivna kontrola) odnos, to jest, OD test uzorka podeljena sa onom kod uzorka pozitivne kontrole.

PCR testiranje

PCV2-specifično PCR testiranje je korišćeno za detekciju prisustva PCV2 virusne genomske DNK u uzorcima seruma. Virusna genomska DNK je prečišćena iz seruma primenom QIAGEN MatAttract Virus Mini Kit i QIAGEN BioRobot M48 VVorkstation. Da bi se detektovale PCV2 specifične sekvence, 592-bp fragment je amplifikovan primenom ABI AmpliTaq Gold DNK polimeraze i gen-specifičnih prajmera: F1PCV2, 5'-ATGCCCAGCAAGAA GAATGG-3' (SEQ ID NO: 7) i RPCV2, 5'- TGGTTTCCAGTATGT GGTTTCC-3' (SEQ ID NO: 8). Prečišćena virusna DNK je korišćena kao obrazac i denaturisana na 95°C u trajanju od 10 min. PCR program reakcija sastojao se od 35 ciklusa denaturacije na 94°C u trajanju od 30 sek., spajanje na 59°C u trajanju od 1 min, i produženje na 72°C u trajanju od 1 min. Deset pL PCR proizvoda je korišćeno za detekciju 592 bp PCV2 DNK fragmenta pomoću elektroforeze na agaroznom gelu.

Histopatologija

Uzorci tkiva slezine, krajnika i tri (traheobronhijalnog, ilijačnog i preponskog) limfna čvora, sakupljeni su iz svake životinje tokom autopsije, fiksirani u 10% neutralno puferisanom formalinu u trajanju od 2 do 4 dana i ukalupljeni u parafinu. Isečci od četiri mikrometra su obojeni hematoksilinom i eozinom i posmatrani pod svetlosnim mikroskopom za histopatološku procenu.

Uzorci su procenjivani u odnosu na stepen deplecije limfocita/histiocitne zamene. Ukratko, sva tkiva su ispitivana na ,,slepi“ način i davane su im subjektivne ocene za nivo deplecije limfocita i histiocitne zamene. Rangirane ocene limfoidne deplecije od 0 do 3 određene su na sledeći način: 0 - normalna, 1 - blaga limfoidna deplecija sa gubitkom opšte celulamosti, 2 - umerena limfoidna deplecija, 3 - teška limfoidna deplecija sa gubitkom limfoidne folikulame strukture. Rangirane ocene histiocitne zamene od 0 do 3 određene su na sličan način kao što sledi: 0 - normalna, 1 - blaga histiocitna-do-granulomatozna inflamacija, 2 - umerena histiocitna-do-granulomatozna inflamacija, 3 - teška histiocitna-do-

granulomatozna inflamacija sa zamenom folikula.

Histopatološke procene izvodi ovlašćeni patolog u Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Iowa State University (Ames, IA).

Imunohistohemijsko (IHC) testiranje

PCV2-specifičan antigen u tkivima limfnih čvorova, krajnika i slezine detektovan je pomoću imunohistohemijskolg testiranja. Ukratko, isečci od četiri mikrometra postavljeni su na staklene pločice i tretirani ksilenom da bi se uklonio parafin. Deparafmizovani isečci su ugašeni za endogenu peroksidazu sa 3% H2O2 u PBS u trajanju od 20 min. Posle ispiranja destilovanom vodom isečci su inkubirani na sobnoj temperaturi preko noći sa zečjim anti PCV2 poliklonalnim serumom razblaženim 1:1000 u PBS. Posle ispiranja sa PBS isečci su inkubirani biotinilovanim kozjim anti-zečjim IgG u trajanju od 30 min na sobnoj temperaturi. Zatim su isečci inkubirani sa streptavidin peroksidaza konjugatom i "vizuelizovani" sa diaminobenzidin tetrahidrohloridnim supstratom. Količina PCV2 antigena je procenjena na ,,slepi“ način na osnovu nivoa bojenja PCV2 antigena. Rangirane ocene su određene kao što sledi: 0 - nema bojenja, 1 - nizak nivo bojenja, 2 - srednji nivo bojenja i 3 - visok nivo bojenja. IHC na tkivima je izveden u Veterinary Diagnostic Laboratory in the Iowa State University College of Veterinary Medicine (Ames, IA).

REZULTATI

Izolacija virusa

Nazalni brisevi su sakupljani na dan 0 posle vakcinacije (DPV) za izolaciju PCV2 da bi se osiguralo da nema infekcije PCV2 kod test životinja pre vakcinacije. Virus nije izolovan iz nazalnih briseva nijedne od test životinja, što ukazuje na nedostatak izlaganja ovih svinja infekciji PCV2 iz životne sredine u vreme vakcinacije.

Titracija materijala za izlaganje PCV2

Rezultati titracije virulentnog materijala za izlaganje PCV2 (soj 40895) prikazani su u Tabeli 1. Prosečan titar virusa za izlaganje iz po tri titracije bio je 4.6 Logio FAIDso/mL.

Serologija

Rezultati ELISA testa PCV2-specifičnog antitela prikazani su u Tabeli 2.

Na dan 0 posle vakcinacije 1, ELISA S/P odnosi kod kontrolnih životinja (Grupa C) varirali su od -0.009 do 0.366 sa prosečnim S/P odnosom od 0.135. Posle vakcinacije, ELISA titri antitela kod kontrola su smanjeni u odnosu na osnovne nivoe za 13 dana posle vakcinacije i svi prasići su ostali seronegativni do dana izlaganja infekciji. Prosečni S/P odnosi bili su 0.049 na dan 13 posle vakcinacije, 0.023 na dan 28 posle vakcinacije, i 0.004 na dan 35 posle vakcinacije (-1 dan posle izlaganja infekciji), redom. Posle izlaganja infekciji PCV2 prosečni S/P odnosi su se značajno povećali od 0.125 na dan 7 posle izlaganja infekciji, 0.612 na dan 14 posle izlaganja infekciji, do 0.922 na dan 20 posle izlaganja infekciji.

Na dan 0 posle vakcinacije 1, ELISA S/P odnosi kod vakcinisanih životinja (Grupa V) varirali su od -0.028 do 0.364 sa prosečnim S/P odnosom od 0.126. Posle vakcinacije prosečni S/P odnosi bili su 0.041 na dan 13 posle vakcinacije, 0.097 na dan 28 posle vakcinacije i 0.167 na dan 35 posle vakcinacije (-1 dan posle izlaganja infekciji). Posle izlaganja infekciji PCV2, zabeležen je značajan povećanje u ELISA titrima kod prasadi ove grupe već od dana 7 posle izlaganja infekciji, sa prosečnim S/P odnosima od 1.069 na dan 7 posle izlaganja infekciji, 1.373 na dan 14 posle izlaganja infekciji i 1.356 na dan 20 posle izlaganja infekciji.

Viremija PCV2

Detekcija viremije PCV2 pomoću PCV2-specifičnog PCR-a u serumima vakcinisanih i kontrolnih životinja prikazana je u Tabeli 3A. Ovaj PCV2-specifičan PCR je najmanje 1000 puta osetljiviji od uobičajenog postupka ćelijske kulture.

Na dan -1 posle izlaganja infekciji (DPC), neočekivano, nađeno je da 3 su od ukupno 24 vakcinisane životinje (svinje #P102, P103 i P104) i 6 od ukupno 24 kontrolnih životinja (svinje # G197, G205, 0162, P107, P108 i P110) detektovane kao pozitivne za PCV2 DNK u uzorcima seruma dok su ostale bile negativne. Svih 9 PCV2 pozitivnih svinja smešteno je u istu sobu (#12). Nažalost, šest PCV2-inficiranih svinja (svinja #P102, P103, P104, P107, P108 i P110) i dve ne-inficirane svinje su prebačene u sobu #13 i pomešane sa 8 ne-inficiranih svinja iz sobe #11 na dan -1 posle izlaganja infekciji zbog nedostatka prostora. Prema tome, sve životinje u sobama #12 i 13 bile su potencijalno izložene PCV2 u životnoj sredini.

Da bi se ispitao izvor izlaganja infekciji PCV2 iz životne sredine, uzorci seruma sakupljeni na dan 0, 13 i 28 posle vakcinacije, testirani su pomoću PCV2-specifičnog PCR-a. Sve svinje bile su PCV2 negativne osim svinje #P 108 (kontrola, soba #12) sa ekstremno jakom pozitivnom PCR trakom na dan 13 posle vakcinacije. Ovaj rezultat sugeriše da je slučajno izlaganje PCV2 iz životne sredine poteklo od svinje #P108, i zatim se raširilo na druge svinje u sobi #12 i #13. Tačno poreklo ovog PCV2 nije poznato, međutim, najverovatnije iz životne sredine ili farme u kojoj je svinja #P108 inficirana na nivou koji se ne može detektovati pre učestvovanja u studiji.

Da bi se odredio genotip PCV2 poreklom iz životne sredine, PCR proizvodi svinje #P 108 klonirani su za sekvenciranje. Analiza DNK sekvence pokazala je daje PCV2 iz svinje #P108 soja tipa 2B, koji se razlikuje od soja -#40895 (2A). Genomi ova dva soja PCV2 dele 95.98% identičnosti DNK sekvence. Da bi se dalje napravila razlika između izlaganja eksperimentalnom PCV2 (soj #40895) od izlaganja preko kontakta u životnoj sredini (2B od svinje #P108), PCR proizvodi od svih PCV2 viremičnih svinja klonirani su za sekvenciranje DNK. Rezultati genotipizacije prikazani su u koloni "izlaganje infekciji PCV2": "A" označava da u uzorcima seruma nije detektovan PCV2B i da je izlaganje infekciji izvedeno samo eksperimentalnim PCV2-#40895 sojem; "A + B" označava da je pored eksperimentalnog izlaganja infekciji, takođe detektovan PCV2B i svi PCV2B bili su od svinje #P 108 zbog identične sekvence; i "A + (B)" označava da pored eksperimentalnog izlaganja infekciji, svinje su potencijalno inficirane sa PCV2B zbog toga što su ove svinje pomešane sa svinjom #P108 u sobi #12/13. Međutim, sve ove svinje su zaštićene od izlaganja infekciji PCV2.

U cilju procene uticaja eksperimentalnog izlaganja infekciji i izlaganja infekciji preko kontakta u životnoj sredini, rezultati PCR-a za PCV2 viremiju razmatrani su u tri kategorije: ukupno poređenje (Tabela 3A), eksperimentalno izlaganje infekciji (Tabela 3B), i eksperimentalno izlaganje infekciji i izlaganje infekciji preko kontakta u životnoj sredini (Tabela 3C).

Ukupno poređenje između grupa pokazalo je da su 10/24 (41.7%) vakcinisanih životinja bile pozitivne za prisustvo PCV2 DNK u serumima, sa najmanje jednim pozitivnim i jednim slučajem koji nije dokazan. Ako se jedan slučaj koji nije dokazan ne može uračunati, 5/24 (20.8%) vakcinisanih životinja bilo je PCV2 DNK pozitivno. Nasuprot tome, 24/24 (100%) kontrolnih životinja bilo je pozitivno za prisustvo PCV2 DNK u serumu za višestruke slučajeve. Učestalost i gustina PCV2 pozitivne trake kod kontrola bili su značajno veći i jači nego kod vakcinisanih životinja (videti Tabelu 3A).

Poređenje između grupa eksperimentalno izloženih PCV2 (Tabela 3B) pokazalo je da je 1/9 (11.1%) vakcinisanih životinja bilo PCV2 DNK pozitivno sa samo jednim pozitivnim slučajem. Suprotno tome, 14/14 (100%) kontrolnih životinja bilo je pozitivno za prisustvo PCV2 DNK u serumima sa višestrukim slučajevima.

Poređenje između grupa eksperimentalno izloženih PCV2 i izloženih PCV2 preko kontakta u životnoj sredini (Tabela 3C) pokazalo je daje 4/15 (26.7%) vakcinisanih životinja bilo PCV2 DNK pozitivno, sa najmanje jednim pozitivnim slučajem. Suprotno tome, 10/10 (100%) kontrolnih životinja bilo je pozitivno za prisustvo PCV2 DNK u serumima sa višestrukim slučajevima.

Mikroskopske lezije - limfoidna deplecija

Tkiva limfnih čvorova, slezine i krajnika su mikroskopski ispitivana u odnosu na limfoidnu depleciju. Ukupni rezultati mikroskopskih lezija - limfoidne deplecije sažeti su u Tabeli 4A (broj životinja sa ocenom 0-3).

Ukupno poređenje između grupa je pokazalo da je abnormalna ocena za limfoidnu depleciju u najmanje jednom tkivu zabeležena kod 15/24 (62.5%) vakcinisanih svinja, u poređenju sa 23/24 (95.8%) kontrolnih svinja. Umerene do jake lezije limfoidne deplecije zabeležene su kod 4/24 (16.7%) vakcinisanih životinja, u poređenju sa 14/24 (58.3%) kontrolnih životinja.

Poređenje između grupa eksperimentalno izloženih PCV2 (Tabela 4B) pokazalo je da je abnormalna ocena limfoidne deplecije u najmanje jednom tkivu zabeležena kod 6/9 (66.7%) vakcinisanih svinja, u poređenju sa 13/14 (92.9%) kontrolnih svinja.

Poređenje između grupa eksperimentalno izloženih infekciji PCV2 i izloženih infekciji PCV2 preko kontakta u životnoj sredini (Tabela 4C) pokazalo je da je abnormalna ocena limfoidne deplecije u najmanje jednom tkivu zabeležena kod 9/15 (60%) vakcinisanih svinja, u poređenju sa 10/10 (100%) kontrolnih svinja.

Mikroskopske lezije - histiocitna zamena

Tkiva limfnih čvorova, slezine i krajnika mikroskopski su ispitivana u odnosu na histiocitnu-do-granulomatoznu inflamaciju sa zamenom folikula. Ukupni rezultati mikroskopskih lezija- histiocitne zamene sažeti su u Tabeli 5.

Ukupno poređenje je pokazalo da je zabeleženo 22/24 (91.7%) kontrolnih životinja, 15/24 (62.5%) vakcinisanih životinja sa abnormalnom ocenom histiocitne zamene u najmanje jednom limfnom čvoru.

Imunohistohemija

Rezultati detekcije količine PCV2 antigena pomoću IHC bojenja u limfnim čvorovima, slezini i krajniku sažeti su u Tabeli 6 (broj životinja sa ocenom 0-3).

Ukupno poređenje je pokazalo da je u poređenju sa 23/24 (95.8%) kontrolnih životinja, 7/24 (29.2%) vakcinisanih životinja PCV2 specifično IHC obojeno u najmanje jednom limfnom tkivu.

Klinička posmatranja posle izlaganja infekciji

Rezultati svakodnevnih posmatranja za kliničke simptome posle izlaganja infekciji kod pojedinačnih svinja prikazani su u Tabeli 7. Nikakvi klinički simptomi nisu zabeleženi ni kod jedne svinje osim 2 kontrolne svinje (#P108 i 0162).

Kod svinje #P 108 zabeležen je kašalj na dan 1 posle izlaganja infekciji, dijareja na dan 10 posle izlaganja infekciji, slabljenje, dijareja i neaktivnost na dan 17 posle izlaganja infekciji. Ova svinja je razvila očigledne kliničke simptome kržljavosti. Zbog slabog stanja prase je eutanazirano na dan 18 posle izlaganja infekciji. Autopsija je otkrila veoma malo potkožne masti, umerenu kranioventralnu konsolidaciju u plućima, prazan želudac i creva. Kod svinje se razvila bolest povezana sa PCV, što je podržano nalazima kod PCV2 viremije (ekstremno snažno PCR pozitivan), snažna limfoidna deplecija, i visoka koncentracija PCV2 antigena (preko IHC bojenja) u limfnim tkivima.

Prase #0162 zabeleženo je kao mršavo i sa hromom levom zadnjom nogom na dan 14 posle izlaganja infekciji. Na dan 17 posle izlaganja infekciji ova svinja je ponovo zabeležena kao mršava, nesposobna da se kreće, i sa naduvenim tarzalnim zglobovima u zadnjim nogama. Zbog slabog stanja prase je eutanazirano na dan 18 posle izlaganja infekciji. Autopsija je otkrila umerenu do snažnu konsolidaciju pluća sa fibroznim adhezijama. Mikroskopska procena plućnih tkiva pokazala je jaku akutnu bronhopneumoniju i hroničnu fokalnu intersticijalnu fibrozu. Kod ove svinje razvila se bolest povezana sa PCV, što je podržano nalazima kod PCV2 viremije (ekstremno snažan PCR pozitivan), snažna limfoidna deplecija, i visoka koncentracija PCV2 antigena (preko IHC bojenja) u limfnim tkivima.

Tabela 1. PCV2 (#40895) Titracija materijala za izlaganje infekciji

*Logio FAID50 po mL

Sred. vr. ± SD = srednja vrednost titra ± standardna devijacija

Tabela 2. Serokonverzija u PCV2 u serumima vakcinisanih i kontrolnih svinja merena preko ELISA PCV2 antitela

'Rezultati izraženi kao odnosi uzorka/pozitivne kontrole (S/P); sred. vr. (S/P odnos) ± SD = prosečan S/P odnos ± standardna devijacija NA = nije određeno; V = vakcinisana grupa; C = kontrolna grupa. DPV - dana posle vakcinacije, DPC - dana posle izlaganja infekciji.

Tabela 3A. Detekcija PCV2 viremije pomoću PCV2-specifičnog PCR-a u serumima vakcinisanih i kontrolnih svinja: ukupno poređenje

V = Vakcinisana grupa; C = kontrolna grupa; NA = nije određeno; Sobe 11 ili 12: prasići su tu bili smešteni tokom ćele studije (faze vakcinacije i izlaganja infekciji); Sobe 11-13 i 12-13: prasići su bili smešteni u sobi 11 ili 12 tokom faze vakcinacije i prebačeni u sobu 13 na 0 dana posle izlaganja infekciji (faza izlaganja infekciji).

Soj PCV2 za izlaganje infekciji: A = eksperimentalno izlaganje-PCV2 #40895; A + (B) = pored eksperimentalnog izlaganja-PCV2 #40895, potencijalno izlaganje preko kontakta u životnoj sredini zbog mešanja sa svinjom #108 tokom faze vakcinacije ili faze izlaganja infekciji. Međutim, ove svinje su zaštićene od izlaganja infekciji PCV2, i nijedan PCR proizvod ne može biti sekvenciran za PCV2B; A + B = eksperimentalno izlaganje-PCV2 #40895, izlaganje preko kontakta u životnoj sredini zbog svinje #108, i PCR proizvod je sekvenciran i identifikovan kao PCV2B iz istog izvora (svinja #108)

Ocena intenziteta PCR trake: - Negativna; ± Veoma bleda, na granici vidljivosti PCR traka; + pozitivna; ++ snažno pozitivna; +++ veoma snažno pozitivna; ++++ Ekstremno snažno pozitivna; PCV2 viremija: - = Negativna; P = pozitivna; P* = nije moguće odrediti (jedan ili dva slučaja nije moguće odrediti PCR trake). DPV - dana posle vakcinacije, DPC - dana posle izlaganja infekciji.

Tabela 3B. Detekcija PCV2 viremije pomoću PCV2-specifičnog PCR-a u serumima vakcinisanih i kontrolnih svinja: Eksperimentalno izlaganje PCV2 (#40895)

V = Vakcinisana grupa; C = kontrolna grupa; NA = nije određeno

Sobe 11 i 12: prasići su bili smešteni ovde tokom ćele studije (faze vakcinacije i izlaganja infekciji); sobe 11-13 i 12-13: prasići su bili smešteni u sobi 11 ili 12 tokom faze vakcinacije i prebačeni u sobu 13 na dan o posle izlaganja infekciji (faza izlaganja infekciji).

Soj PCV2 za izlaganje infekciji: A = eksperimentalno izlaganje-PCV2 #40895

Tabela 3C. Detekcija PCV2 viremije pomoću PCV2-specifičnog PCR-a u serumima vakcinisanih i kontrolnih svinja: eksperimentalno izlaganje PCV2 (#40895) i izlaganje infekciji preko kontakta u životnoj sredini

V = Vakcinisana grupa; C = kontrolna grupa; NA = nije određeno

Soj PCV2 za izlaganje infekciji: A + (B) = pored eksperimentalnog izlaganja-PCV2 #40895, potencijalno izlaganje infekciji preko kontakta u životnoj sredini zbog mešanja sa svinjom #108 tokom faze vakcinacije ili faze izlaganja infekciji. Međutim, ove svinje su zaštićene od izlaganja PCV2 infekciji, i nijedan proizvod PCR-a ne može biti sekvenciran za PCV2B; A + B = eksperimentalno izlaganje-PCV2 #40895, izlaganje infekciji preko kontakta u životnoj sredini zbog svinje #108, i proizvod PCR-a je sekvenciran i identifikovan kao PCV2B iz istog izvora (svinja #108)

Ocena intenziteta PCR trake: - negativna; ± Veoma bleda, na granici vidljivosti PCR traka; + pozitivna; ++ snažno pozitivna; +++ veoma snažno pozitivna; ++++ Ekstremno snažno pozitivna; PCV2 viremija: - = Negativna; P = pozitivna; P = nije moguće odrediti (jedan ili dva slučaja nije moguće odrediti PCR trake). DPV - dana posle vakcinacije, DPC - dana posle izlaganja infekciji.

Tabela 4A. Limfoidna deplecija u limfnim čvorovima, slezini i krajniku: ukupno poređenje*

Tabela 4B. Limfoidna deplecija u limfnim čvorovima, slezini i krajniku:

eksperimentano izlaganje PCV2 (#40895)

Tabela 4C. Limfoidna deplecija u limfnim čvorovima, slezini i krajniku:

eksperimentano izlaganje PCV2A (#40895) i izlaganje preko kontakta u životnoj sredini

*Ocena histiocitne zamene: 0 = Normalna, 1 = blaga, 2 = umerena i 3 = teška

Tabela 6. Količina PCV2-specifičnog antigena demonstrirana pomoću imunohistohemije (IHC) u limfnim čvorovima, slezini i krajniku: ukupno poređenje

Ocena IHC bojenja: 0 = Nema, 1 = nizak nivo, 2 = srednji nivo i 3 = visok nivo

Tabela 7.Klinička posmatranja posle izlaganja infekciji

A = Normalno; E = kašalj; I = drugo (videti komentare u Delu 6.8) V = vakcinisana grupa; C = kontrolna grupa

. = NA

DPV - dana posle vakcinacije, DPC - dana posle izlaganja infekciji.

Claims

1.Izolovani svinjski cirkovirus, naznačen time što njegov genom sadrži molekul nukleinske kiseline bilo koje od SEQ ID NO: 1 ili 2, ili što njegov genom sadrži molekul nukleinske kiseline koji ima najmanje 95% homologije sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1 ili 2.

2.Izolovani svinjski cirkovirus prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što njegov genom sadrži molekul nukleinske kiseline bilo koje od SEQ ID NO: 1 ili 2.

3.Izolovani svinjski cirkovirus prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, naznačen time što je on svinjski cirkovirus tipa 2B.

4.Izolovani svinjski cirkovirus prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što ima ORF2 protein sa najmanje 92% identičnosti sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 3 ili 4.

5.Izolovani svinjski cirkovirus prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što nukleinska kiselina koja kodira ORF2 protein sadrži ostatke 1033-1734 iz SEQ ID NO: 5 ili 6.

6.Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira patogeni svinjski cirkoirus tipa 2B, ili koji kodira najmanje jedan protein iz navedenog cirkovirusa, pri čemu molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 2, 5 ili 6 ili nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 95% homologije sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1,2, 5 ili 6.

7.Izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6, koji asdrži nukleotidnu sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 2, 5 ili 6.

8.Izolovani molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od patentnih zahteva 6 ili 7, naznačen time što se nukleinska kiselina koja kodira ORF2 protein nalazi na ostacima 1033- 1734izSEQ ID NO: 5 ili 6.

9.Izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što kodira ORF2 protein koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 3 ili 4.

10.Imunogena kompozicija naznačena time što sadrži izolovani svinjski cirkovirus prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, i farmaceutski prihvatljiv adjuvant.

11.Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što je izolovani svinjski cirkovirus oslabljen ili inaktiviran.

12.Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 11, naznačena time što dalje sadrži najmanje jedan drugi mikroorganizam, ili antigen dobijen od navedenog mikroorganizma protiv koga je poželjan imuni odgovor.

13.Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 12, naznačena time što je drugi mikroorganizam izabran iz grupe koju čine virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRR.S), svinjski parvovirus (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bakterija leptospira. virus svinjskog gripa, Escherichia coli antigen, svinjski respiratorni koronavirus, rotavirus, patogen uzročnik Aujeskyeve bolesti, patogen uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa, i drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa.

14.Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 13, naznačena time što je drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa cirkovirus tipa 2A ili tipa 2B.

15.Imunogena kompozicija naznačena time što sadrži najmanje jedan izolovani molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od patentnih zahteva 6-9, i farmaceutski prihvatljiv adjuvant.

16.Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 15, naznačena time što dalje sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira najmanje jedan antigen od najmanje jednog drugog mikroorganizma protiv koga je poželjan imuni odgovor.

17.Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 16, naznačena time stoje drugi mikroorganizam izabran iz grupe koju čine virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS), svinjski parvovirus (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bakterija leptospira, virus svinjskog gripa, Escherichia coli antigen, svinjski respiratorni koronavirus, rotavirus, patogen uzročnik Aujeskyeve bolesti, patogen uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa i drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa.

18.Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 17, naznačena time što je drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa cirkovirus tipa 2A ili tipa 2B.

19.Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 10 ili 15, naznačena time što se kompozicija primenjuje u jednoj dozi ili u višestrukim dozama subkutano, intramuskulamo, intranazalno, transdermalno, intrahepatički ili preko intralimfoidnog puta.

20.Postupak za imunizaciju svinje protiv virusne infekcije ili, protiv virusne infekcije ili multisisitemskog sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS), ili za prevenciju multisistemskog sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS) kod svinja uzrokovanu sojem PCV2, naznačen time što sadrži primenu na svinju imunogeno efikasne količine kompozicije koja sadrži jedno ili više od sledećih: a)imunogeno efikasnu količinu svinjskog cirkovirusa tipa 2 prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5; b)molekul nukleinske kiseline koji kodira svinjski cirkovirus tipa 2 iz a); c)imunogeno efikasnu količinu najmanje jednog proteina koji je izolovan iz svinjskog cirkovirusa tipa 2 prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5; ili d)molekul nukleinske kiseline koji kodira najmanje jedan protein iz c).

21.Postupak prema patentnom zahtevu 20, naznačen time što taj postupak dalje sadrži primenu imunogeno efikasne količine druge različite imunogene kompozicije pre, zajedno sa, ili posle, primene imunogene kompozicije svinjskog cirkovirusa tipa 2.

22.Postupak prema patentnom zahtevu 21, naznačen time što druga različita imunogena kompozicija sadrži imunogeno efikasnu količinu najmanje jednog drugog mikroorganizma koji je patogen za svinje, ili najmanje jednog antigena dobijenog od navedenog mikroorganizma ili molekula nukleinske kiseline koji kodira navedeni antigen, pri čemu je mikroorganizam izabran iz grupe koju čine virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS), svinjski parvovirus (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bakterija leptospira, virus svinjskog gripa, Escherichia coli antigen, svinjski respiratorni koronavirus, rotavirus, patogen uzročnik Aujeskyeve bolesti, patogen uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa i drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa.

23.Postupak prema patentnom zahtevu 22, naznačen time što je drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa cirkovirus tipa 2A ili 2B.

24.Vektor naznačen time što sadrži najmanje jedan egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira protein svinjskog cirkovirusa tipa 2A ili tipa 2B, pri čemu je protein svinjskog cirkovirusa ORF2 protein, i pri čemu je egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira navedeni protein naveden u ostacima 1033-1734 iz SEQ ID NO: 5 ili 6.

25.Vektor prema patentnom zahtevu 24, naznačen time što je taj vektor vektor poksvirusa rakuna.

26.Vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 24 ili 25, naznačen time što dalje sadrži jedan ili više egzogenih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antigen iz mikroorganizma koji je patogen za svinje, pri čemu je mikroorganizam izabran iz grupe koju čine virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS), svinjski parvovirus (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bakterija leptospira, virus svinjskog gripa, Escherichia coli antigen, svinjski respiratorni koronavirus, rotavirus, patogen uzročnik Aujeskyeve bolesti, patogen uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa i drugi različiti soj svinjskog cirkovirusa.