[go: up one dir, main page]

KR101661730B1 - Ｇ―단백질 결합 수용체를 이용한 스크리닝 방법 및 관련 조성물 - Google Patents

Ｇ―단백질 결합 수용체를 이용한 스크리닝 방법 및 관련 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101661730B1
KR101661730B1 KR1020107000909A KR20107000909A KR101661730B1 KR 101661730 B1 KR101661730 B1 KR 101661730B1 KR 1020107000909 A KR1020107000909 A KR 1020107000909A KR 20107000909 A KR20107000909 A KR 20107000909A KR 101661730 B1 KR101661730 B1 KR 101661730B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pth
pthrp
delete delete
ala
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020107000909A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100090238A (ko
Inventor
토마스 제이. 가델라
존 티. 포트
마사루 쉬미즈
후미히코 이치카와
해럴드 주프너
마코토 오카자키
Original Assignee
더 제너럴 하스피탈 코포레이션
츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 제너럴 하스피탈 코포레이션, 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 filed Critical 더 제너럴 하스피탈 코포레이션
Publication of KR20100090238A publication Critical patent/KR20100090238A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101661730B1 publication Critical patent/KR101661730B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/645—Secretins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

본 발명은 G-단백질이 결합하지 않은 GPCR(부갑상선 호르몬 수용체와 같은)에 대한 수용체 작동자의 친화도가, 그것의 약물 동력학적 성질과 무관하게 작동자가 효력을 나타내는 시간의 길이와 관련된다는 발견에 기초한 GPCR 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 PTH- 및 PTHrP-유래 폴리펩타이드를 제공한다.

Description

Ｇ―단백질 결합 수용체를 이용한 스크리닝 방법 및 관련 조성물{Screening Methods Using G-protein Coupled Receptors and Related Compositions}
정부 지원 연구에 대한 선언
본 발명은 국립보건연구소(NIH)에 의해 주어진 그랜트 DK 11794 하의 미합중국 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 권리를 갖는다.
일반적으로, 본 발명은 긴 활성 또는 짧은 활성을 갖는 G-단백질 커플드 수용체(G-protein coupled receptors: GPCRs)에 대한 작동자(agonist)의 선별 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone: PTH) 또는 부갑상선 호르몬 수용체(PTH receptor : PTHR)에 대하여 부갑상선 호르몬(PTH(1-34))보다 더 긴 또는 더 짧은 활성을 나타내는 갑상선 호르몬-관련 단백질(PTH-related protein : PTHrP) 리간드 유사체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 동정된 PTHR 리간드 및 질병을 치료하기 위한 상기 리간드의 용도에 관한 것이다.
GPCRs은 세포막 수용체를 구성하는 큰 그룹으로, 작동자의 자극에 의해 반응하여 G-단백질을 활성화시키고, 그 결과 고리형 AMP/단백질 키나아제 A 케스케이드와 같은 적어도 하나의 신호전달 케스케이드를 활성화시킨다. 이 커다란 수용체 집단은 박테리아로부터 사람에 이르기까지 유기체에서 널리 발견되며, 예컨대, 호르몬, 신경 및 후각 신호의 변환에 관여한다.
부갑상선 호르몬 수용체(PTHR)는 PTH 및 PTH 관련 단백질(PTHrP) 모두에 대한 내인성 수용체이나, 각각의 리간드는 뚜렷이 구분되는 생물학적 기능을 가진다. PTH는 칼슘 및 인의 항상성을 조절하고, 뼈 및 신장에 위치한 표적 세포에 작용하는 샘 분비 내분비선 호르몬의 기능을 수행한다. 또한 PTH는 주로 신장의 근위세관세포(PT cell)에 존재하는 소듐-의존성 포스페이트 수송체(NaPi-IIa and NaPi-IIc)에 작용하여 무기 포스페이트의 재흡수를 감소시킨다. PTHrP은 발달 중인 세포에서 세포의 증식 및 분화 프로그램을 조절하며, 조직 원시세포 내 근접분비(paracrine) 방식에 의하여 분비 및 작동된다(Kronenberg, H.M. Ann . N.Y. Acad . Sci . 1068:1-13 (2006)).
PTH 및 PTHrP는, 그들의 아미노 말단(1-14 잔기)의 신호 도메인이 가장 유사성이 높고(8개의 아미노산이 동일), 14-34 결합 도메인이 중간 유사성을 나타낸다(3개가 동일). PTH 및 PTHrP의 완전히 활성있는 부분 (1-34 잔기)은 거의 동일한 메카니즘에 의해 PTHR과 상호작용할 것으로 일반적으로 추측되어 왔다(Caulfield et al., Endocrinology 127:83-87 (1990); Abou-Samra et al., Endocrinology 125:2215-2217 (1989)). 이 메카니즘은 두 개의 주요 단계로 구성되는 것으로 여겨지는데, 그 중 하나는 리간드의 카복실 말단 결합 도메인과 수용체의 세포외 아미노 말단(N) 도메인과의 결합이며, 다른 하나는 리간드의 아미노 말단 신호 도메인과 세포내 루프 및 7개의 막 투과 헬릭스를 포함하는 수용체의 세포막 근접영역(J)과의 결합이다(Hoare et al., J. Biol . Chem 276:7741-7753 (2001); Castro et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102:16084-16089 (2005); Witelsberger et al., Biochemistry 45:2027-2034 (2006); Shimizu et al., J. Biol. Chem . 280:1797-1807 (2005); Gensure et al., Biochem . Biophys . Res . Commun. 328:666-678 (2005)). 그러나, 두 리간드가 결합하는 메카니즘이 정확히 어느 정도로 다를 것인가(만일 다르다면)에 관한 문제는 아직 미제로 남아있다.
사람에 있어서, PTH(1-34)는 강력한 뼈 합성 효과를 가지며, 뼈 무기질 밀도 상승 및 뼈의 강도 증가에 있어서 현저한 효과를 나타낸다. 실제로, 재조합 인간 PTH(1-34)는 현재 골다공증의 가장 효과적인 치료제로서 여겨지고 있다(Tashjian and Gagel, J. Bone Miner . Res 21:354-365 (2006)). hPTH(1-34)의 뼈 형성 효과를 실제화 하기 위해서는 hPTH(1-34)는 주기적인 방식(예를 들면, 하루에 한번 피하에 주사하는 방식)에 의해 투여되어야 한다. 지속적 주입 펌프 메카니즘과 같이, 보다 연장된 투여방식에 의한다면, PTH(1-34)는 종국적으로 뼈에 이화작용을 발휘하며, 이는 조골세포(osteoblast)에 의해 매개되는 뼈 형성 반응과 비교하여 파골세포(osteoclast)에 의해 매개되는 뼈 재흡수 반응의 더 큰 활성 때문이다. 따라서 뼈의 PTH 수용체에 PTH 리간드가 지속적으로 노출되는 시간은, 리간드에 의해 유도되는 전체 뼈 형성반응, 즉 골다골증 치료제로서의 그의 효능을 결정하는 핵심요소이다.
임상실험에 따르면, 비록 높은 투여량이 요구되기는 하지만, PTHrP(1-36) 또한 인간의 뼈 무기질 밀도를 상승시킬 수 있고 PTH(1-34)와 비슷한 수준의 효능을 나타낸다는 사실이 규명되었다(Horwitz et al., J. Endocrinol . Metab . 88:569-575 (2003). 중요하게는, 그와 같이 높은 수준의 투여량에서도, PTHrP(1-36)는 PTH(1-34)를 동일 수준으로 투약하였다면 일어났을, 뼈 재흡수 및 칼슘과다혈증과 같은 부작용을 일으키지 않았다(Horwitz et al., J. Endocrinol . Metab . 88:569-575 (2003); Horwitz et al., J. Bone Miner . Res . 20:1792-1803 (2005); Horwitz et al., Osteoporosis Int .17:225-230 (2006)). 두 펩타이드의 생물학적 활성의 차이는 단지 약물 동력학의 차이에서만 비롯된 것은 아니다. 정상 상태 주입 방법을 사용하여 두 펩타이드를 직접적으로 비교해본 결과, PTHrP이 신장에서 1,25-(OH)2 비타민 D3의 합성을 자극함에 있어 PTH에 비해 훨씬 낮은 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다(Horwitz et al., J. Bone . Mineral . Research . 20:1792-1803 (2005)).
hPTH(1-34)는 골다공증뿐만 아니라, PTH 결핍증, 일명 부갑상선 기능 저하증을 치료하는데도 효과적이다. 즉, PTH(1-34)는 칼시트리올 요법을 대체할 수 있는 안전하고 효과적인 방법으로 알려졌으며, 부갑상선 기능 저하증 환자에 있어서, 과칼슘뇨증 없이도 정상의 칼슘 농도를 유지하게 할 수 있음이 알려졌다(Winer et al., J. Clin . Endocrinol . Metab . 88:4214-4220 (2003)). 상기 펩타이드는 적어도 하루에 두 번 주입되어야 했는바, 본 발명자들은 이 질병에 있어서, 오래 작용하는 PTH(1-34) 유사체의 필요성을 인식하기에 이르렀다(Winer et al., J. Clin . Endocrinol. Metab . 88:4214-4220 (2003).
따라서 PTH 수용체에 대하여 보다 연장된 또는 단축된 활성을 갖는 PTH 또는 PTHrP에 대한 요구가 본 발명이 속하는 분야에서 존재한다. 또한, 단시간-작용 효과를 갖는 PTH 펩타이드 및 장시간-작용 효과를 갖는 PTH 펩타이드를 구별할 수 있는 시험방법에 대한 요구가 있다.
전통적인 GPCR 이론에 따르면, G-단백질 결합 수용체의 두 형태는 구별가능하다: G-단백질과 결합한 형태(RG) 및 G-단백질과 결합하지 않은 형태(R). GPCR 신호는 G-단백질이 수용체에 의해 직접적으로 활성화될 것을 필요로 하는데, 즉 RG 상태가 반드시 형성되어야 하며, 이러한 RG 형성은 작동자 리간드 결합에 의해 유도될 수 있다. 작동자 리간드의 결합은 RG 상태를 유도 또는 안정화시키며, 또한 RG 상태는 작동자의 높은 친화성 결합을 상호적으로 안정화시킨다. GTP 또는 GTPγS와 같은 비가수분해성 GTP 유사체의 결합에 의해, 수용체-결합 G 단백질은 수용체를 저 친화 상태로 변환시키면서 수용체로부터 해리될 것이다. PTHR 같은 어떤 GPCR들은 심지어 GTPγS의 존재 하에서도, 즉 수용체에 G 단백질이 결합되어 있지 않다고 가정되는 경우에도 특정한 작동자 리간드를 높은 친화도로 결합시킬 수 있는 새로운 상태(R0)를 형성할 수 있음이 최근에 인식되고 있다. 일반적으로, 세포 내 RG, R 또는 R0 상태 GPCR의 비율은 세포의 종류 및 조건에 따라 달라질 수 있다. 이러한 이유로, GPCR에의 리간드 결합을 분석한 종전의 연구들은 RG, R 또는 R0 상태를 명확히 구별하지 못하였다. PTH 수용체, 예를 들면 GPCR을 연구한 본 발명자들은 RG 상태에 뿐만 아니라 R0 상태에도 높은 친화도로 결합하는 리간드는 R0 에 낮은 친화도로 결합하는 리간드 보다 긴 활성 반감기를 가지며, 이러한 연장된 활성은 상기 리간드의 인 비보에서의 생물학적 이용도 또는 약물동태학에 의존하지 않는다는 것을 발견하였다. 이와 상응하여, 단기 작용 지속시간을 갖는 작동자는 R0 상태 수용체에 대해 보다 낮은 친화도를 갖는다. 상기 발견에 기초하여, 본 발명은 장기-작용 또는 단기-작용 GPCR 작동자를 결정하는 방법 및 본 발명의 방법을 사용하여 동정된 펩타이드 작동자를 제공한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 후보 화합물이 G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 장기-작용 작동자인지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) RG 형태의 상기 GPCR과 상기 후보 화합물을 접촉시키는 단계,(b) 상기 GPCR의 RG 형태에 대한 상기 화합물의 친화도를 측정하는 단계,(c) R0 형태의 상기 GPCR과 상기 화합물을 접촉시키는 단계 및(d) 상기 GPCR의 R0 형태에 대한 상기 화합물의 친화도를 측정하는 단계를 포함하며, (i) 상기 GPCR RG 형태에 대한 친화도가 GPCR의 내인성 작동자의 최소 1%(예를 들면, 5, 10, 25, 30, 50, 60, 75, 90, 100, 125,150, 200, 150, 300, 400, 500, 750 또는 1000%)에 해당하고, (ii) GPCR R0 형태에 대한 친화도가 상기 내인성 작동자보다 높은(예를 들면, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 또는 10,000% 높은) 친화도를 갖는 화합물이 GPCR에 대한 장기-작용 작동자로 결정된다. 상기 방법은 (e) 상기 후보 화합물을 동물에 투여하는 단계 및 (f) 상기 동물의 상기 화합물에 대한 적어도 하나의 생리학적 반응을 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 수용체는 인간의 수용체일 수 있다. 상기 GPCR는 세크레틴 패밀리 수용체(예를 들면, 인간 PTH/PTHrP 수용체와 같은 PTH/PTHrP 수용체)일 수 있다. 상기 수용체가 칼슘의 항상성 또는 수송과 관련되는 경우, 상기 단계 (b) 또는 (f)는 세포 내 또는 혈액 칼슘 양을 측정하는 것에 의하여 실시될 수 있다. 어떠한 GPCR에 대하여, 상기 친화도-측정 단계 (b) 또는 단계 (d)는 경쟁 결합 분석법을 사용하여 실시될 수 있다. 상기 경쟁 결합 분석법은 상기 GPCR RG 형태에 특이적이거나 또는 상기 GPCR R0 형태에 특이적인 리간드를 사용할 수 있다. 상기 측정하는 단계 (b)는 지연된 cAMP 분석법을 사용하여(예를 들면, 여기서 기술된 바에 따라) 실시될 수 있다. 상기 GPCR R0 형태는 비가수분해성 뉴클레오타이드 유사체(예를 들면, GTPγS)를 사용하여 풍부해질 수 있다. 상기 GPCR RG 형태는 음성-도미넌트 G-단백질을 사용하여 풍부해질 수 있다. 상기 수용체는 세포상 또는 막 내에 존재할 수 있다. 상기 후보 화합물은 펩타이드를 포함하거나 화합물 라이브러리 또는 천연물 라이브러리로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 후보 화합물이 G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 단기-작용 작동자인지 여부를 결정하는 방법 또한 기술한다. 상기 방법은 (a) RG 형태의 상기 GPCR와 상기 후보 화합물을 접촉시키는 단계, (b) 상기 GPCR의 RG 형태에 대한 상기 화합물의 친화도를 측정하는 단계, (c) R0 형태의 상기 GPCR과 상기 화합물을 접촉시키는 단계 및 (d) 상기 GPCR의 R0 형태에 대한 상기 화합물의 친화도를 측정하는 단계를 포함하고, (i) GPCR의 RG 형태에 대한 친화도가 상기 GPCR의 내인성 작동자의 최소 1%(예를 들면, 5, 10, 25, 30, 50, 60, 75, 90, 100, 125, 150, 200, 150, 300, 400, 500, 750 또는 1000%)에 해당하고, (ii) GPCR의 R0 형태에 대한 친화도가 상기 내인성 작동자보다 낮은(예를 들면, 99, 95, 90, 85, 75, 65, 55, 50, 40, 30, 25, 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005 또는 0.0001% 낮은) 친화도를 갖는 화합물이 GPCR의 단기-작용 작동자로 결정된다. 상기 수용체는 인간의 수용체일 수 있다. 상기 방법은 (e) 상기 후보 화합물을 동물에 투여하는 단계 및 (f) 상기 동물의 상기 화합물에 대한 적어도 하나의 생리학적 반응을 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 GPCR는 세크레틴 패밀리 수용체(예를 들면, 인간 PTH/PTHrP 수용체와 같은 PTH/PTHrP 수용체)일 수 있다. 상기 수용체가 칼슘의 항상성 또는 수송과 관련되는 경우, 상기 측정하는 단계 (b)는 세포 내 또는 혈액 칼슘 수준을 측정하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 어떠한 GPCR에 대하여, 상기 측정하는 단계 (b) 또는 단계 (d)는 경쟁 결합 분석법을 사용(예를 들면, GPCR의 RG 형태에 특이적이거나 또는 R0 형태에 특이적인 리간드를 사용)하여 수행될 수 있다. 상기 측정하는 단계(b)는 지연된 cAMP 분석법을 사용하여 실시될 수 있다. 구현예에 의하면, 상기 GPCR의 상기 R0 형태는 비가수분해성 뉴클레오타이드 유사체(예를 들면, GTPγS)를 사용하여 풍부해질 수 있다. 상기 GPCR의 상기 RG 형태는 음성-도미넌트 G-단백질을 사용하여 풍부해질 수 있다. 상기 수용체는 세포 상 또는 막 내에 존재할 수 있다. 상기 후보 화합물은 펩타이드를 포함하거나 화합물 라이브러리 또는 천연물 라이브러리로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 PTH R0에 대한 낮은 친화도(그리고, 예를 들어 RG에 대한 높은 친화도)를 가지는 폴리펩타이드를 기술한다. 상기 폴리펩타이드는 단기-작용 작동자이거나 또는 RG 선택적일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 야생-형 PTH 또는 PTHrP 서열과 관련된 하나 이상의(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) 아미노산의 치환, 삭제 및/또는 첨가에 의해 변형된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 5번 위치에 히스티딘 또는 20, 23, 24 또는 28번 위치에 알라닌을 가질 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 Ala23-PTH(1-34), Ala23-PTHrP(1-36), His5-PTH(1-34), His5-PTHrP(1-36) 또는 그의 단편일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 도 26B의 표에서 RG 선택적인 것으로 밝혀진 것들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 약제학적 투여(예로, 여기에서 기술된 바에 따른)를 위해 조제되거나 또는 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체의 골다공증을 치료하는 방법을 기술하는데, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 골다공증을 치료하기에 충분한 양으로 상기 양태의 폴리펩타이드, RG 선택적인 폴리펩타이드(예를 들어, 여기에서 기술된 것), 여기에서 기술된 장기-작용 작동자 폴리펩타이드, 여기에서 기술된 그 어떠한 폴리펩타이드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 형태를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 골절 수선, 골연화증, 관절염, 혈소판 감소증, 부갑상선 기능 저하증 또는 고인산혈증을 치료하는 또는 대상체의 줄기 세포 유동성을 증가시키는 방법을 기술하는데, 상기 방법은 상기 질병 또는 상태를 치료 또는 줄기 세포를 유동시키기에 충분한 양으로 상기 양태의 폴리펩타이드 또는 여기에서 기술된 그 어떠한 폴리펩타이드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 형태를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 폴리펩타이드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 형태는 피하투여, 정맥투여, 비강투여, 폐통과, 피부통과 및 경구투여로 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 PTH 수용체에 결합하고 PTH 수용체의 R0 형태에 높은 친화도를 가지는 폴리펩타이드(PTH 유사체 또는 PTH 유도체)를 기술한다. 상기 폴리펩타이드는 야생-형 PTH 또는 PTHrP 서열과 관련된 하나 이상의 아미노산의 치환, 삭제 및/또는 첨가에 의해 변형된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 19번 위치에 아르기닌 또는 5번 위치에 이소루이신을 가질 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 Ala1,Aib3[M]PTH(1-28), Ala1,Aib3[M]PTH(1-34) 또는 Ile5-PTHrP(1-36) 일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 도 26B의 데이터에 근거하여, 2.9 nM 또는 7.9 nM 보다 낮거나 동등한 IC50을 갖는 도 26B의 폴리펩타이드 중 어느 하나 및 I5-hPTHrP(1-36)(#1208)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 약제학적 투여(예로, 여기에서 기술된 바에 따른)를 위해 조제되거나 또는 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 부갑상선 기능 저하증, 고인산혈증, 종양성 석회증 및 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대상체의 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 기술하는데, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 상기 질병 또는 상태를 치료하기에 충분한 양으로 상기 양태의 폴리펩타이드, 여기에서 기술된 R0 선택적인 폴리펩타이드, 여기에서 기술된 장기-작용 작동자 폴리펩타이드, 여기에서 기술된 그 어떠한 폴리펩타이드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 형태를 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 골절 수선을 필요로 하는, 또는 골연화증, 관절염, 혈소판 감소증을 가지고 있는, 또는 줄기 세포 유동을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 기술하는데, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 상기 질병을 치료 또는 줄기 세포를 유동시키기에 충분한 양으로 상기 양태의 폴리펩타이드, 여기에서 기술된 그 어떠한 폴리펩타이드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 형태 투여하는 단계를 포함한다. 상기 폴리펩타이드 또는 그의 약제학적 조성물은 피하투여, 정맥투여, 비강투여, 폐통과, 피부통과 및 경구투여로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 야생-형 PTH 또는 PTHrP 서열과 관련된 하나 이상의 아미노산의 치환, 삭제 및/또는 첨가에 의해 변형된 아미노산 서열을 가지는 PTH 또는 PTHrP 폴리펩타이드를 기술한다. 상기 폴리펩타이드는 19번 위치에 아르기닌 또는 5번 위치에 이소루이신을 가질 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 AVAEIQLMHQRGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI: M-PTH(1-11)/PTHrP(12-36)OH; AVAEIQLMHQRAKWIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI: M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)OH; AVAEIQLMHQRAKWLNSMRRRFFLHHLIAEIHTAEI: M-PTH(1-18)/PTHrP(19-36)OH; SVSEHQLMHNLGKHIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI: [H5]-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)OH; AVAEIQLMHQRAKWLNSMRRVEWLRKKLQDVHNF: [R19],M-hPTH(1-34)OH; SVSEIQLMHNLGKHIQDLERRFFLHHLIAEIHTAEI: [E19]-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)OH; AVAEIQLMHQRAKWIQDLERRFFLHHLIAEIHTAEI:[E19],M-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)OH; 및 AVAEIQLMHQRAKWLNSMERVEWLRKKLQDVHNF: [E19],M-hPTH(1-34)OH 으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 5번 위치에 히스티딘을 가질 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 다음의 식 Ala1,Aib3[M]PTH(1-28), Ala23PTH 및 Ile5-PTHrP 중의 하나에 의하여 표시될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 AVAEHQLMHQRAKWLNSMERVEWLRKKLQDVHNF: [H5,E19],M-PTH(1-34); AVAEHQLMHQRAKWIQDLERRFFLHHLIAEIHTAEI:[H5,E19],M-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36); SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEFLHHLIAEIHTAEI: hPTH(1-22)/PTHrP(23-36); SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDIHTAEI: PTH(1-30)/PTHrP(31-36); AVAEIQLMHQRAKWLNSMERVEALRKKLQDVHNF: [A23,E19],M-PTH(1-34); 및 AVAEIQLMHQRAKWLNSMRRVEALRKKLQDVHNF [A23],M-PTH(1-34)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 어떠한 치료 방법 또는 어떠한 조성물(예로, 여기에서 기술된 약제학적 조성물)에도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 하기 식에 의해 정의되는 아미노산과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 아미노산 1-10, 1-11, 1-12 또는 1-13을 포함하는 그의 단편, 또는 그의 약제학적 허용 가능한 염을 포함하는 폴리펩타이드를 기술한다:
X1-Val-X2-Glu-His-Gln-Lys-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7,
상기 서열에서
X1 는 Ser, Ala, Gly 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib)
X2 는 Ser, Ala 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib)
X3 는 Asn, Ala, Glu, Val, Asp 또는 Gln
X4 는 Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys, Arg, Leu 또는 Har
X5 는 Gly, His, Arg, Ala 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib)
X6 는 Lys, Gln, Leu, His, Trp, Ala, Arg 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib) 그리고
X7 는 Arg, Leu, Phe, Trp, His 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib)이다. 알파-헬릭스 안정화 잔기를 예시하면, 2-아미노이소부티릭산(2-aminoisobutyric acid), ACPC (1-aminocyclopropylcarboxylic acid), DEG (diethylglycine) 또는 1-아미노시클로펜탄카복실산(1- aminocyclopentanecarboxylic acid)과 같은 논-인코딩 아미노산(non-encoded amino acid)일 수 있다. 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 대응하는 야생형 PTH 서열과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 치환을 갖는다. 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 X1에 Ala, Gly 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib); X2에 Ala 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib); X3에 Ala, Glu, Val, Asp 또는 Gln; X4에 Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys, Arg 또는 Har; X5에 His, Arg, Ala 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib); X6에 Gln, Leu, His, Trp, Ala, Arg 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib); X7에 Arg, Leu, Phe, Trp또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib); 또는 그의 결합을 포함한다. 이러한 구현예 중 어느 하나에서, 상기 폴리펩타이드는 길이에 있어서 100, 50, 36, 34, 30, 25 또는 20 (예로, 10-14 아미노산)보다 짧은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 어떠한 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10 아미노산 길이를 갖는다. 상기 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물의 일부일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 식의 아미노산 서열을 포함하거나 하기 식에 의해 정의되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 기술한다:
X1-Val-X2-Glu-X3-Gln-Leu-Met-His-X4-X5-X6-X7-X8-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-X9-Val-Glu-X10-X11-Arg-Lys-Lys-X12,
상기 아미노산 서열에서,
X1 는 Ser, Ala 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib)
X2 는 Ser, Ala 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib)
X3 는 Ile 또는 His
X4 는 Asn, Glu, Val, Asp 또는 Gln
X5 는 Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys, Arg, Leu 또는 Har
X6 는 Gly, His, Arg 또는 Ala
X7 는 Lys, Gln, Leu, His, Trp, Ala 또는 Arg
X8 는 Arg, Leu, Phe, Trp, His 또는 Ser
X9 는 Arg 또는 Ala
X10 는 Trp, Ala 또는 Phe
X11 는 Leu 또는 Ala 그리고
X12 는 Leu 또는 Ala이며,
상기 아미노산 서열은 X3위치 His, X9위치 Ala, X10위치 Ala, X11위치 Ala 및 X12위치 Ala로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이상의 아미노산, 상기 아미노산 서열의 아미노산 1-24, 1-25, 1-26 또는 1-27 을 포함하는 그의 단편, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염을 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 PTH 수용체의 R0 형태에 낮은 친화도로 결합(예를 들면, PTH 수용체의 RG 형태에 높은 친화도로 결합)할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 RG 선택적이거나 수용체의 단기-작용 작동자일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 대응하는 야생형 서열과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 치환을 포함할 수 있다. 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 X1에 Ala 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib); X2에 Ala 또는 알파-헬릭스 안정화 잔기(예로, Aib); X3에 His; X4에 Glu, Val, Asp 또는 Gln ; X5에 Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys, Arg 또는 Har; X6에 His, Arg 또는 Ala; X7에 Gln, Leu, His, Trp, Ala 또는 Arg ; X8에 Arg, Leu, Phe, Trp 또는 Ser; X9에 Ala; X10에 Ala 또는 Phe; X11에 Ala; X12에 Ala; 또는 그의 결합을 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 100, 75, 60, 50, 40, 36, 34, 33, 32, 31, 30, 29 또는 28 아미노산 길이보다 짧을 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 길이에 있어 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 아미노산 길이(예로, 24-28 아미노산 길이)일 수 있다. 구현예에서, X9, X10, X11 또는 X12 중 적어도 하나(예로 2, 3 또는 4)는 알라닌이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 하기 식에 의해 정의되는 아미노산과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 아미노산 1-24, 1-25, 1-26 또는 1-27 을 포함하는 그의 단편, 또는 그의 약제학적 허용 가능한 염을 포함하는 폴리펩타이드를 기술한다:
X1-Val-X2-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7-Leu-Asn-Ser-Met-Arg-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu,
상기 아미노산 서열에서,
X1 는 Ser, Ala 또는 Aib;
X2 는 Ser, Ala 또는 Aib;
X3 는 Asn, Glu, Val, Asp 또는 Gln;
X4 는 Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys, Arg 또는 Leu;
X5 는 Gly, His, Arg 또는 Ala;
X6 는 Lys, Gln, Leu, His, Trp, Ala 또는 Arg; 그리고
X7 는 Arg, Leu, Phe, Trp, His 또는 Ser이다. 상기 폴리펩타이드는 R0 선택적이거나 수용체의 장기-작용 작동자일 수 있다. 상기 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 치환(예로, 야생형 PTH 서열과 관계있는 상기에서 기술된 어느 하나의 위치에서의)을 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 X1 위치의 Ala 또는 Aib; X2 위치의 Ala 또는 Aib; X3 위치의 Glu, Val, Asp, 또는 Gln; X4 위치의 Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys 또는 Arg; X5 위치의 His, Arg 또는 Ala; X6 위치의 Gln, Leu, His, Trp, Ala 또는 Arg; X7 위치의 Arg, Leu, Phe, Trp 또는 Ser; 또는 그의 결합을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 100, 75, 60, 50, 40, 36, 34, 33, 32, 31, 30, 29 또는 28 아미노산 길이보다 짧을 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 아미노산 길이(예로, 24-28 아미노산 길이)일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용가능한 담체를 가지는 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 하기 식에 의해 정의되는 아미노산과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 아미노산 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-29, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34 또는 1-35을 포함하는 그의 단편, 또는 그의 약제학적 허용 가능한 염을 포함하며, 대응하는 야생형 PTHrP 서열 또는 그의 단편과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드를 기술한다:
Ala-Val-Ser-Glu-His-Glu-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-X1-Arg-Arg-Arg-X2-Phe-Leu-X3-X4-Leu-Ile-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Glu-Ile
상기 아미노산 서열에서,
X1 는 Leu, Ala, Ser, Met, Phe 또는 Glu;
X2 는 Phe, Ala, Ser, Leu, Asn, Trp, Glu 또는 Lys;
X3 는 His, Leu, Arg, Lys, Trp, Ile 또는 Phe;
X4 는 His, Ala, Ser, Asn, Lys 또는 Arg;
X5 는 Ala, Gly, Ser, Asn, Gln, Trp, Glu 또는 Lys;
X6 는 Glu, Gly, Ser, Leu, Asn, Asp, Lys 또는 Ala;
X7 는 Ile, Leu, Val, Lys 또는 Ala;
X8 는 His 또는 Ala
X9 는 Thr, Asn 또는 Ala; 그리고
X10 는 Ala 또는 Phe이다. 상기 폴리펩타이드는 PTH 수용체의 R0 형태에 낮은 친화도로 결합(예를 들면, PTH 수용체의 RG 형태에 높은 친화도로 결합)할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 RG 선택적이거나 수용체의 단기-작용 작동자일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 대응하는 야생형 PTHrP 서열과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 치환을 포함할 수 있다. 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 X1에 Ala, Ser, Met, Phe 또는 Glu; X2에 Ala, Ser, Leu, Asn, Trp, Glu 또는 Lys; X3에 Leu, Arg, Lys, Trp, Ile 또는 Phe; X4에 Ala, Ser, Asn, Lys 또는 Arg; X5에 Gly, Ser, Asn, Gln, Trp, Glu 또는 Lys; X6에 Gly, Ser, Leu, Asn, Asp, Lys 또는 Ala; X7에Leu, Val, Lys 또는 Ala; X8에 Ala; X9에 Asn 또는 Ala; X10에 Phe; 또는 그의 결합을 갖는다. 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 X1에 Ala 또는 Glu; X2에 Ala; X3에 Leu; X4에 Lys; 또는 그의 결합을 갖는다. 상기 폴리펩타이드는 100, 75, 60, 50, 40, 36, 34, 33, 32, 31, 30, 29 또는 28 아미노산 길이보다 짧을 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 아미노산 길이(예로, 28-36 아미노산 길이)일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 자유 하이드록시기를 가지거나, C-말단이 아미드화될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 표 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 서열을 포함하거나, 상기 서열과 실질적으로 동일할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용가능한 담체를 가지는 조성물에 포함될 수 있다.
Figure 112010002579525-pct00001
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 N-말단이 벌키한 잔기(예를 들어, Trp)로 치환된 PTH 또는 PTHrP 펩타이드(예로, 상기 양태 또는 여기서 기술된 것 중의 하나)를 기술한다. 상기 폴리펩타이드는 Trp1-PTH(1-34), Trp1-M-PTH(1-34), TRP1-PTHrP(1-36) 또는 상기 서열 중 아미노산 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-29, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34 또는 1-35를 포함하는 그의 단편을 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 벌키한 잔기 치환을 결여한 폴리펩타이드와 비교하여 PTH 수용체에 대한 감소된(예를 들어, 적어도 1, 5, 10, 25, 50, 75, 90, 95, 99, 99.5, 99.9, 99.95 또는 99.99% 감소된) PLC 신호 활성을 가질 수 있다. 다른 벌키한 잔기로는 Phe, Tyr 및 Bpa(p-benzoylphenylalanine)를 포함한다. 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 M 또는 Mc 변형 내에 일어난 변이 중 하나(예로, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)를 포함할 수 있는데, 여기에서 M은 [Ala1,12,Aib3,Gln10,homoarginine11,Trp14,Arg19] 을 표시하고, Mc는 Ala1,3,12,Gln10,Arg11,Trp14, Arg19 PTH 시퀀스 또는 그의 결합을 표시한다. 하이브리드 펩타이드는 위치 5에서의 치환(예를 들면, 5번 위치의 히스티딘)을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 펩타이드를 예시하면, Trp1-PTH(1-28) 및 Trp1-M-PTH(1-28)을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하이브리드 PTH/PTHrP 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 하이브리드 PTH/PTHrP 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 기술한다. 상기 폴리펩타이드는 식 PTH(1-X)/PTHrP(Y-36)으로 표현될 수 있는데, 여기에서 X는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34 이고 Y = X+1이다. 구체예에서 상기 하이브리드 폴리펩타이드는 M 또는 Mc 변형 내에 일어난 어느 하나(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)의 변이를 포함하는데, 여기에서 M은 [Ala1,12,Aib3,Gln10,호모아르기닌(homoarginine)11,Trp14,Arg19]을 표시하고, Mc는 rAla1,3,12,Gln10,Arg11,Trp14, Arg19 PTH 서열 또는 그의 결합을 표시한다. 하이브리드 펩타이드는 위치 5에서의 치환(예를 들면, 5번 위치의 히스티딘)을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 기술된 폴리펩타이드 중 어느 하나에서, 상기 폴리펩타이드는 생물학적으로 유효할 수 있는데, 예를 들면, GPCR의 RG 형태에 대해 GPCR 내인성 작동자의 적어도 1%(예로, 5, 10, 25, 30, 50, 60, 75, 90, 100, 125, 150, 200, 150, 300, 400, 500, 750, or 1000%)에 해당하는 친화도를 가지며, 또한 대조군(예로, GPCR에 대한 내인성 리간드)과 비교하여 R0 형태에 대해 더 낮은 친화도(예로, 99, 95, 90, 85, 75, 65, 55, 50, 40, 30, 25, 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005 또는 0.0001%)를 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 GPCR RG 형태에 대하여 GPCR 내인성 작동자의 적어도 1%(예로, 5, 10, 25, 30, 50, 60, 75, 90, 100, 125, 150, 200, 150, 300, 400, 500, 750 또는 1000%)에 해당하는 친화도를 가지며, 또한 (ii)GPCR의 R0 형태에 대하여 내인성 작동자보다 더 큰(예로, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 또는 10,000% 더 큰) 친화도를 가지거나, 또는 GPCR에 대한 장기-작용 작동자로 동정된다. 상기 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 RG 선택적, R0 선택적, 단기-작용 작동자 또는 장기-작용 작동자 일 수 있다. 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 변형될 수 있다(예를 들어, N-말단에 아세틸화, C-말단에 아미드화 또는 여기에서 기술된 변형 중 어느 하나를 포함함).
본 발명은 또한 여기에서 기술한 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열(예로, 상기에서 기술한 것)을 포함하는 핵산을 기술한다. 상기 핵산은 작동 가능하도록 프로모터 및/또는 벡터의 부분과 연결될 수 있다. 본 발명은 또한 벡터를 포함하는 세포(예를 들면, 박테리아 세포와 같은 무핵 세포 또는 이스트 또는 포유류(예로 사람) 세포와 같은 유핵세포)를 기술한다. 본 발명은 또한 상기 핵산을 발현하는 조건 하에서 세포를 배양하는 것에 의하여, 그리고 선택적으로 상기 폴리펩타이드를 정제하는 것에 의하여, 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 기술한다.
"GPCR"이란 G 단백질 결합 수용체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 그 어떠한 폴리펩타이드를 의미한다. GPCR은 바람직하게는, 자연적으로 발생하는 GPCR에 대하여 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는다. 예시적인 GPCR들은 여기에서 기술된다.
GPCR의 "RG 형태"란 G-단백질-결합 수용체 컨포메이션을 의미한다. 예를 들어, GPCR의 RG 형태는 GPCR에 대한 G-단백질 결합 증가에 의해 유도될 수 있다. 본 발명의 분석법에서, RG 형태에 대한 친화도를 측정할 때, 수용체의 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99%가 RG 형태이다.
GPCR의 "R0 형태"란 GPCR이 G-단백질에 결합되어 있지 않은 경우에 발생하지만, 적어도 다른 수용체 리간드를 결합시킬 능력은 있는 수용체 컨포메이션을 의미한다. GPCR의 R0 형태는 RG와 비교하여, 예를 들면 GPCR에 대한 G-단백질 결합을 방지 또는 감소시키는 방법에 의해 선호될 수 있다. 본 발명의 분석법에서, R0 형태에 대한 친화도를 측정할 때, 수용체의 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99%가 R0 형태일 수 있다. “
“친화도”란 타겟 수용체와 상호작용할 수 있는 화합물의 능력을 의미한다. 본 발명의 분석법 및 폴리펩타이드에서, 친화도는 직접적으로 결합(예를 들어, 경쟁 결합 분석법 또는 FRET)에 의하여, 또는 간접적으로 활성 분석법(예를 들어, cAMP 신호 또는 세포 내 칼슘 변화)에 의하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 화합물은 GPCR의 RG 형태 또는 R0 형태에 대하여 적어도 10 μmol, 1 μmol, 500 nmol, 100 nmol, 50 nmol, 25 nmol, 10 nmol, 5 nmol, 1 nmol, 500 pmol, 200 pmol, 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol 10 pmol 또는 1 pmol EC50 값의 수용체에 대한 친화도를 갖는다.
“장기-작용 작동자”란, 동일한 수용체의 내인성 작동자와 비교하여 그것의 활성(예를 들면, 인 비보 또는 인 비트로에서 측정된 활성)이 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 500%, 1000% 또는 5000% 더 긴 반감기를 갖는 작동자를 의미한다.
“단기-작용 작동자”란, 동일한 수용체의 내인성 작동자와 비교하여 그것의 활성(예를 들면, 인 비보 또는 인 비트로에서 측정된 활성)이 적어도 95%, 90%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 더 짧은 반감기를 갖는 작동자를 의미한다.
“RG 선택적 작동자”란 대조군 작동자(예로, 내인성 작동자)와 비교할 때, 수용체의 R0 형태에 비해 RG 형태에 증가된 결합을 보이는 작동자를 말한다. 수용체 선택성은 각각의 수용체 형태 사이의 결합 상수 비율, 예를 들면 R0/RG 비율로 표현될 수 있으며, 여기에서 이 비율의 증가는 RG 형태에 대한 더 강한 결합을 의미한다. 도 26A 및 26B에서 볼 수 있듯이, COS-7 세포막 상에서 발현된 인간 PTH 수용체를 결합시킴에 있어서, PTH(1-34)의 R0/RG 비율은 67이고, 상대적으로 더 RG 선택적인 PTHrP(1-36)은 260이다. 이러한 시스템에서 RG 선택적인 작동자는 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000, 15,000, 20,000 또는 50,000 에 해당하는 R0/RG 비율을 가질 수 있다. 상기 R0/RG 비율은 대조군 작동자 값의 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, 50, 75 또는 100배에 해당할 수 있다.
“R0 선택적 작동자”란 대조군 작동자(예로, 내인성 작동자)와 비교할 때, 수용체의 R0 형태에 비해 RG 형태에 감소된 결합을 보이는 작동자를 말한다. 수용체 선택성은 각각의 수용체 형태 사이의 결합 상수 비율, 예를 들면 R0/RG 비율로 표현될 수 있으며, 여기에서 이 비율의 감소는 R0 형태에 대한 더 강한 결합을 의미한다. 도 26A 및 26B에서 볼 수 있듯이, COS-7 세포막 상에서 발현된 인간 PTH 수용체를 결합시킴에 있어서, PTH(1-34)의 R0/RG 비율은 67이고, 상대적으로 더 RG 선택적인 PTHrP(1-36)은 260이다. 이러한 시스템에서 R0 선택적인 작동자는 적어도 60, 50, 40, 30, 25, 20, 25, 10, 5, 2, 1, 0 보다 작은 R0/RG 비율을 가질 수 있다. 상기 R0/RG 비율은 대조군 작동자 값의 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.08, 0.05, 0.03, 0.01, 0.008, 0.005, 0.003 또는 0.001배 보다 작을 수 있다.
GPCR의“내인성 작동자”란 유기체에 의해 생산되는 화합물 또는 그 화합물의 합성된 표현형 모사(phenocopy), 예를 들면 상기 내인성 작동자와 동일한 약리학적 활성을 가지는 화합물을 의미한다. 예를 들면, 자연의 PTH 펩타이드는 1-84이고, PTHrP는 ~1-140 아미노산이다; 이러한 리간드의 표현형 모사는 각각 PTH(1-34) 및 PTHrP(1-36)을 포함한다. 내인성 작동자는 GPCR의 정상 생리학적 활성에 관계되거나 또는 이를 조절한다. 어떠한 GPCR는 수개의 내인성 작동자(예를 들어, PTH 및 PTHrP를 포함하는 PTHR에 대한 내인성 작동자)를 갖는다; 본 발명의 목적 상, 후보 화합물이 단기-작용 또는 장기-작용 작동자인지 여부를 결정하기 위하여, 그 어떠한 내인성 작동자라도 사용될 수 있다.
“펩타이드” 또는 “폴리펩타이드”는 적어도 4, 6, 10, 25, 50, 100,150, 200, 500 또는 1000 아미노산의 아미노산 체인을 의미한다.
폴리펩타이드의“단편”이란 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 아미노산 길이의 서열 일부분을 의미한다.
“대상체”란 인간 또는 비인간인 동물(예로, 포유류)를 의미한다.
“치료하기에 충분한 양”이란 질병 또는 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 감소, 방지 또는 제거 하는데 충분한 양을 의미한다.
“정제된 폴리펩타이드”또는 “분리된 폴리펩타이드”란 다른 화합물로부터 분리된 폴리펩타이드를 의미한다. 전형적으로, 적어도 30 중량%가 다른 구성요소로부터 자유롭다면 그 폴리펩타이드는 실질적으로 순수한 것이다. 구현예에서, 적어도 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99 중량%가 다른 다른 구성요소로부터 자유롭도록 준비된다. 예를 들어, 정제된 폴리펩타이드는 천연물로 부터의 추출, 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드의 발현 또는 상기 폴리펩타이드의 화학적 합성을 통해 얻을 수 있다. 순도는 적절한 방법을 이용해 측정할 수 있는데, 예를 들면 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 또는 HPLC 분석법에 의할 수 있다.
“생물학적으로 활성이 있는”이란 화합물 또는 조성물(예로, 여기에서 기술된 폴리펩타이드)이 세포 또는 동물(예를 들어, 인간 또는 비인간인 동물)에 투여하였을 때, 적어도 하나의 생물학적으로 중요한 효과를 갖는 것을 의미한다. PTH, PTHrP 및 그의 유사체(예로, 여기에서 기술된 것)의 생물학적 활성이란, 수용체 결합, cAMP 또는 IP3의 생산, 단백질 키나제 A, 단백질 키나제 C, 포스포리파제 C, 포스포리파제 D 및 포스포리파제 A2의 활성, 세포 내, 혈장 또는 뇨에서의 칼슘 또는 포스페이트 수준의 변화(예로, 증가 또는 감소) 및 인 비보 또는 인 비트로에서의 골 대사작용 또는 이화작용의 변화를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 생물학적으로 활성있는 펩타이드(예로, 여기서 기술된 펩타이드 중 하나)는 적절한 대조군(예로, 야생형 펩타이드 또는 PTH(1-34) 또는 PTHrP(1-36)와 같은 그의 표현형 모사)과 비교하여, 그 어떠한 생물학적 활성의 증가(예로, 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 500%, 1000%, 10,000%) 또는 감소(예로, 95%, 90%, 75%, 50%, 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 또는 0.001%)를 보일 수 있다.
“실질적으로 동일한”이란 예를 들어 하기에 기술된 방법을 사용하여 최적으로 정렬하였을 때, 두 번째 핵산 또는 아미노산 서열, 예를 들면 PTH 또는 PTHrP 서열 또는 그의 단편과 비교하여 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 공유하는 핵산 또는 아미노산을 의미한다. “실질적으로 동일한”이란, 전체-길이 서열, 항원 요소(epitopes) 또는 면역성 펩타이드, 기능적 도메인, 코딩 및/또는 조절 서열, 엑손, 인트론, 프로모터 및 게놈 서열과 같은 다양한 종류 및 길이의 서열을 언급하기 위하여 사용될 수 있다. 두 폴리펩타이드 또는 핵산 간의 퍼센트 동일성은 당업계의 기술적 범위안에서, 다양한 방법을 사용하여 결정할 수 있는데, 예를 들면 스미스 워터맨 정렬(Smith et al., J. Mol . Biol . 147:195-7 (1981)); 진매처 플러스(GeneMatcher Plus), 슈발쯔와 데이호프(1979) 단백질 시퀀스와 구조의 아틀라스(Dayhof, M. O., Ed pp 353-358)와 병합된 “베스트 핏”(Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)); BLAST 프로그램((Basic Local Alignment Search Tool; (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215: 403-10 (1990)), BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL 또는 메가라인(Megalign: DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공중이 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용할 수 있다. 이 뿐만 아니라, 해당 기술에서 통상의 기술을 가진 자는 정렬(alignment)을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있는데, 이는 비교 대상 서열 길이에 대하여 최대의 정렬을 획득하기 위해 필요한 알고리즘을 포함한다. 일반적으로 단백질에 대하여, 비교 서열 길이는 적어도 6 또는 8 아미노산이고, 바람직하게는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 500 아미노산 또는 단백질 전체 길이까지이다. 일반적으로, 핵산에 있어서 비교 서열 길이는 적어도 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93,96, 99, 102, 105, 108, 111, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 적어도 1500, 또는 핵산 분자 전체 길이까지이다. DNA 서열을 RNA 서열과 비교하여 서열 동일성을 결정하기 위한 목적에 대해서, 티민 뉴클레오타이드와 우라실 뉴클레오타이드는 동등한 것으로 이해된다. 보존적 치환(Conservative substitution)은 전형적으로 다음 그룹 내 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 그리고 페닐알라닌, 타이로신.
“벌키 아미노산”이란 분자량 100 Da 이상(예를 들어,125, 150, 175, 200, 225, 250, 300 또는 400 이상)의 아미노산을 의미한다. 각각의 코딩 아미노산의 분자량은 다음과 같다. Ala: 71.09, Arg: 156.19, Asp: 115.09, Asn: 114.11, Cys: 103.15, Glu: 129.12, Gln: 128.14, Gly: 57.05, His: 137.14, Ile: 113.16, Leu: 113.16, Lys: 128.17, Met: 131.19, Phe: 147.18, Pro: 97.12, Ser: 87.08, Thr: 101.11, Trp: 186.12, Tyr: 163.18, and Val: 99.14.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 하기의 상세한 설명, 도면 및 청구항에 의해 명확해 질 것이다.
도 1A-1C은 인간 PTH 수용체(PTHR)로부터의 PTH 및 PTHrP 유사체의 해리 및 GTPγS의 영향을 보여주는 그래프이다. 방사능 리간드 125I-[Nle8,21,Tyr34]rPTH(1-34)NH2 (도 1A), 125I-[Tyr36]PTHrP(1-36)NH2 (도 1B) 및 125I-[Ile5,Tyr36]PTHrP(1-36)NH2 (도 1C)를 HKRK-B7로부터 준비한 막에 존재하는 인간 PTHR에 90분간 선-결합시켰다; 그 다음, 표지하지 않은 유사체를 단독으로(솔리드 기호) 또는 GTPγS (5 x 10-5M, 오픈 기호)와 함께 과다(5 x 10-7 M)로 첨가하여, 해리를 개시하였다(t=0). 각 시점에서, 분취량을 반응 튜브에서 제거하고, 자유 방사능 활성으로부터 결합된 것을 분리하기 위하여 이를 즉시 96-웰 진공 여과 플레이트를 사용한 급속 진공 여과법에 적용시켰다. 선-반응 및 해리 단계 동안, 표지되지 않은 리간드(5 x 10-7 M)를 포함한 튜브 내의 비특이적 결합을 결정하였다. 각각의 시점에서 특이적으로 결합한 방사능 활성(SB)은 t = 0에서 관찰된 특이적 결합의 퍼센트로 표현되었다. 4개(도 1A), 5개(도 1B), 3개(도 1C) 실험으로 부터의 총체의 데이터를 나타내었다. 2-상(도 1A 및 1B) 또는 단일-상(도 1C) 지수 붕괴 방정식 커브를 사용하여 커브를 데이터에 맞추었다.
도 2A 및 2B는 인간 및 래트 PTHR에 대한 PTH 및 PTHrP 유사체 결합의 GTPγS 민감성을 보여주는 그래프이다. HKRK-B7(도 2A) 또는 ROS 17/2.8 세포(도 2B)로부터 준비한 세포막 내 PTHR에 대한 방사능 리간드 유사체의 결합을 다양한 농도의 GTPγS 존재 또는 부존재 하 평형-근접 조건에서 분석하였다. 데이터는 GTPγS 부재 하 특이적으로 결합(SB)하는 방사능 활성의 퍼센트로 표현하였다. 도 2A의 데이터는 3개(PTH(1-34)) 또는 5개(PTHrP(1-36) 유사체) 실험으로부터의 평균(+s.e.m.)이고, 도 2B의 것은 각각 이중으로 수행된 6개 실험으로부터 온 것이다. 연구된 방사능 리간드는 125I-[Nle8,21,Tyr34]PTH(1-34)NH2 [Tyr36]PTHrP(1-36)NH2 [Ile5,Tyr36]PTHrP(1-36)NH2 및 [Aib1,3,Nle8,Gln10,Har11,Ala12,Trp14,Tyr15]hPTH(l-15)NH2 이었다,
도 3A-3D는 hPTHR의 G 단백질-결합 및 G 단백질-미결합 컨포메이션에 대한 PTH 및 PTHrP 유사체의 결합을 보여주고 있다. 표지되지 않은 PTH 및 PTHrP 유사체의 G 단백질-결합 PTHR 컨포메이션(RG) 및 G 단백질-미결합 PTHR 컨포메이션(R0)에 대한 결합은 일시적으로 형질전환한 COS-7 세포로부터 준비한 막을 사용하여 경쟁 방법에 의해 분석하였다. RG에 대한 결합을 분석하기 위해, 세포는 hPTHR 및 음성-도미넌트 Gαs 서브유니트(GαsND)로 공동-형질전환되었다. 그리고, 추적자 방사능 리간드로 125I-[Aib1,3,M]PTH(1-15)NH2를 사용하였다. R0에 대한 결합을 분석하기 위해, 세포는 hPTHR만으로 형질전환되었고, 추적자 방사능 리간드로는 125I-[Nle8,21,Tyr34]rPTH(1-34)NH2를 사용하였으며, 결합 반응은 GTPγS 존재 하에서 수행되었다. 사용된 표지되지 않은 리간드는 [Nle8,21,Tyr34]rPTH(1-34)NH2 (도 3A); [Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2 (도 3B); [His5,Nle8,21,Tyr34]rPTH(1-34)NH2 (도 3C); 및 [Ile5,Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2(도 3D)이었다. 각각의 리간드가 RG에는 상대적으로 높은 친화도로 결합한 반면, PTHrP(1-36) 및 His5-PTH(1-34)는 R0에 PTH(1-34) 및 Ile5-PTHrP(1-36)보다 상당히 낮은 친화도로 결합하였고, 따라서 강한 RG 선택성을 나타내었다. 데이터는 각각 이중으로 수행된 3개 내지 7개 실험의 평균(+s.e.m.)이다(표 5 참조).
도 4A-4D는 HEK-293 세포 내 PTHR에 대한 리간드 결합의 형광 공명 에너지 전이(fluorescent resonance energy transfer (FRET))분석을 보여주는 그래프이다. PTHR에 대한 리간드 결합 및 해리 동태를 분석하기 위하여, 3번째 세포 내 루프에 시안 형광 단백질(CFP)을 포함하고, 카복시-말단 테일에 황색-형광 단백질(YFP)을 포함하는 PTHR 컨스트럭트(PTHR-cam)로 안정적으로 형질전환된 HEK-293 세포를 사용하였다. PTHR-cam에서, 자외선광(λexc= 436 nm)에 의한 CFP의 여기는 분자 내 FRET을 YFP(수용자)쪽으로 생성하고, 이는 YFP로부터의 광 방출(λemm = 535 nm)의 증가 및 CFP로부터의 광 방출(λemm = 480 nm)의 감소로 관찰될 수 있다. 이러한 FRET 신호는 기저-상태 수용체에서 발생하고, 작동자 결합에 의해 감소한다. 각각의 패널에서의 선 흔적(trace)은, 완충액만으로 또는 PTH 펩타이드 리간드(펩타이드 첨가 시점은 각각의 트레이스 위에 흑색 막대로 표시함)를 포함하는 완충액으로 수퍼퓨즈된 세포에서 시간별로 얻은 버퍼 형광 신호 비율(FYFP(535)/FCFP(480), 채널 유출에 대해 보정함)을 보여주고 있다. 사용한 상기 리간드는 hPTH(1-34) (도 4A); [Aib1,3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14]rPTH(1-14)NH2 (도 4B); [Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2(도 4C) 및 [Ile5,Tyr36]hPTHrP(I-36)NH2 (도 4D)이었다. PTHrP(1-36)에 의해 유도된 FRET 신호의 개시는 다른 3개의 유사체에 의해 유도된 것보다 느렸다. PTH(1-14) 및 PTHrP(1-36) 유사체에 의해 유도된 신호는 리간드 제거에 의해 붕괴된 반면, PTH(1-34) 및 Ile5-PTHrP(1-36) 유사체에 의해 유도된 신호는 안정하게 남아있었다. 데이터는 단일 실험으로부터 온 것이고, 적어도 3개의 다른 것으로부터 동일한 결과를 얻었다.
도 5A 및 5B는 인간 PTHR을 안정적으로 발현하는 세포 내에서, PTH 및 PTHrP에 의해 유도되는 cAMP-신호 반응의 지속시간을 보여주고 있다. HKRK-B7 세포(950,000 hPTHRs/셀당) 내에서 PTHrP(1-36) 또는 Ile5-PTHrP(1-36)에 의해 유도되는 cAMP 반응의 지속시간을 시간 과정 실험을 이용하여 분석하였다(도 5A). 완충액 단독(basal) 또는 리간드(100 nM)를 포함하는 완충액을 사용하여 세포를 10분간 선-처리 하였다. t = 0의 시점에서 세포를 세척하였고, 지시된 시간동안 완충액에서 항온 처리하였으며, 5분간 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)로 처리하였고, 그 다음 세포 내 cAMP을 분석하였다. 세포를 펩타이드 및 IBMX 와 부수적으로 반응시키고, 세척 단계를 생략하여 얻은 각각의 펩타이드의 최대 반응값은, PTHrP(1-36) 및 Ile5-PTHrP(1-36) 각각에 대하여 185116 및 198118 pmoles/웰 이었다. 리간드 부재 하 IBMX로 처리한 세포 내 cAMP 수준은 2.0± 0.3 pmole/웰 이었다. 데이터는 각각 이중으로 수행된 3개 실험의 평균(±s.e.m.)이다. 상기 실험에서, PTH(1-34) 또한 분석되고 각각의 시점에서 반응을 유도하였는데, 그 값은 PTHrP(1-36)에 의해 유도된 것과 다르지 않았다. HKRK-B64 세포(90,000 hPTHRs/cell) 내에서, 리간드 세척 60분 후의 단일 시점에 유사체들을 유사한 방식으로 분석하였다(도 5B). 각각의 펩타이드에 대하여, 세포를 10분 동안 해당 펩타이드 및 IBMX 와 부수적으로 반응시키고, 세척 단계를 생략한 세포 내에서 생산된 최대 cAMP 반응값(사이드 패널로 표시됨)에 대한 퍼센트로서 데이터를 표현하였다. 데이터는 각각 삼중으로 수행된 4개 실험의 평균(±s.e.m.)이다. 쌍을 이룬 반응의 통계학적인 분석은 별표로 표시하거나: PTHrP(1-36) vs. Ile5-PTHrP(1-36)(도 5A) 또는 괄호로 표시하였다(도 5B): *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.003.
도 6A-6D는 hPTHR G-단백질 결합 또는 G-단백질 미결합 컨포메이션에 대한 PTH 및 PTHrP 유사체 결합을 보여주는 그래프이다. 결합 반응은 도 3A-3D에서 상기 기술된 바와 같이 수행되었다. 사용되어진 표지되지 않은 리간드는 hPTH(1-34)NH2 (도 6A); [Aib1,3,Nle8,Gln10,Har11,Ala12,Trp14,Tyr15]rPTH(1-15)NH2 (도 6B); [His5]hPTH(1-34)NH2 (도 6C); hPTHrP(1-36)NH2 (도 6D)이었다. 데이터는 각각 이중으로 수행된 3 또는 5개 실험의 평균(±s.e.m.)이다(표 6).
도 7A 및 7B는 유사체 신호 효능의 양-반응 분석을 보여준다. HKRK-B64 세포 내에서 cAMP 형성을 자극하는 PTH 및 PTHrP 리간드의 능력을 분석하였다(도 7A). IBMX 존재 하 다양한 농도의 리간드를 가지고 30분간 실온에서 세포를 처리하였다. hPTHR을 발현하도록 일시적으로 형질 전환된 COS-7 세포 내에서 이노시톨 포스페이트(IPs) 생산을 자극하는 리간드의 능력을 분석하였다(도 7B). 다양한 농도의 리간드를 가지고 30분간 실온에서 세포를 처리하였다. 사용된 리간드는 [Nle8,21,Tyr34]rPTH(1-34)NH2; [His5,Nle8,21,Tyr34]rPTH(1-34)NH2; [Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2 및 [Ile5,Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2이었다. 데이터는 각각 이중으로 수행된 4개(도 7A) 또는 5개(도 7B) 실험의 평균(±s.e.m.)이다. EC50 및 Emax 값은 표 6에 보고되어 있으며, 그 값은 H5-PTH(1-34) 및 PTH(1-34) 유사체(P = 0.02)에 대한 cAMP EC50 값을 제외하고는 펩타이드 간에 현저히 다르지는 않다.
도 8은 래트 세포에서 cAMP 양 반응을 보여주는 그래프이다. 래트 조골세포는 hPTH(1-28)NH2 Ala1,12,Aib3,Gln10,Har11,Trp14,Arg19-hPTH(1-28)NH2 hPTH(1-34)NH2 또는 r(rat)PTH(1-34)NH2으로 처리되었다. 그 결과 생성된 세포 내 cAMP를 방사능 면역 분석법을 사용하여 적량하였다. EC50 값을 그래프 아래에 열거하였다. 비-선형 회귀 분석법(non-linear regression analysis)을 사용하여 커브를 맞추었다.
도 9A-9D는 PTH 유사체로 처리된 마우스 내 인 비보 혈장 cAMP 수준을 보여주는 그래프이다. 야생형 마우스에 부형제(0.9% NaCl/0.05% Tween-20) 또는 체중 kg 당 10 내지 1,000 nmol 펩타이드 투여량-수준으로 PTH 펩타이드를 포함하는 부형제를 피하 투여하고, 투여 후 지시된 시점에서 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하고, 방사능 면역 분석법을 이용하여 얻어진 혈장 내 cAMP의 양을 정량하였다. 그래프 기호가 지시하는 것에 따라, 각각의 커브는 정의 된 농도에서의 펩타이드에 상응한다. 혈장 cAMP 농도는 혈장 ㎕ 당 피코몰(picomole)로 도시되었다. 동일한 상승을 나타내기 위해서는 1,000 nmol/kg의 hPTH(1-28)NH2이 요구되는 반면, 상기 데이터는 50 nmol/kg에서 Ala1,12,Aib3,Gln10,Har11,Trp14,Arg19-hPTH(1-28)NH2 (Aib-50, 도 9A) 및 hPTH(1-34)NH2((1-34)-50, 도 9B)가 혈장 cAMP 농도에 있어 동일한 수준의 상승을 일으킴을 보여주고 있다((1-28)-1000, 도 9C, 또한 도 9D).
도 10A 및 10B는 PTH 유사체로 처리된 마우스에 있어서, 인 비보 혈장 포스페이트 및 이온화 칼슘 수준을 보여주는 그래프이다. 야생형 마우스에 부형제(0.9% NaCl/0.05% Tween-20), 또는 체중 kg 당 50 나노몰(nanomoles) 투여 수준으로 Ala1,12,Aib3,Gln10,Har11,Trp14,Arg19-hPTH(1-28)NH2 또는 hPTH(1-34)NH2를 포함하는 부형제, 또는 1,000 나노몰(nanomoles) 투여 수준으로 hPTH(1-28)NH2를 포함하는 부형제를 피하 투여하였고, 투여 후 지시된 시점에서 혈장 포스페이트(도 10A) 및 혈청 이온화 칼슘(도 10B)의 농도를 측정하였다. 혈청 이온화 칼슘의 농도는 치론 진단 모델 634 Ca++/pH 분석기를 사용하여 측정하였다. A 내 데이터는 각각의 투여 조건에 대해 6 마우스(n = 6)를 사용한 하나의 실험에 대한 평균(±s.e.m.)이다. 세 개의 다른 실험에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다. B 내 데이터는 각각의 투여 조건에 대해 3 마우스(n = 3)를 사용한 두개의 실험에 대한 평균(±s.e.m.)이다.
도 11은 주머니 쥐(opossum) 신장 세포에서, PTH(1-34), PTHrP(1-36) 및 장기-작용 PTH(1-28) 유사체 Ala1,12,Aib3,Gln10,Har11,Trp14,Arg19-hPTH(1-28)NH2에 대하여 포스페이트 흡수 억제의 시간 과정을 보여주는 그래프이다. 각각의 시점에서의 데이터를 동일한 시점에 부형제만으로 처리된 세포 용해물 내 32P 방사능 양에 대한 퍼센트 값으로 도시하였다. 이러한 대조군 수준은 5,864 ± 338 cpm (12h) 내지 3,429 ± 224 cpm (0 h)의 범위이다. 데이터는 각각 이중으로 수행된 2개 실험의 평균(±s.e.m.)이다.
도 12는 정상 래트에서 PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36)의 약물 동태 그래프를 보여주고 있다. 펩타이드의 혈장 내 농도는 방사능 면역 분석법(RIA)을 이용하여 측정하였다. PTHrP(1-36) His5→Ile 치환은 약물 동태 그래프를 현저히 변화시키지는 않았다.
도 13A-13C는 정상 래트에서 PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36)의 영향을 보여주는 그래프 세트이다. 도 13A는 정상 래트에서 PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36)의 일시적인 칼슘 혈증 작용을 보여주고 있다. PTHrP(1-36)에 있어서 His5→Ile 치환은 R0에 대한 친화도를 9배 상승시켰는데(삽입 표 참조), 이는 더 연장된 칼슘 혈증 작용을 초래하였다. 도 13B 및 13C는 각각의 리간드로 처리한 세포 내에서 지연된(60 분; 도 13B) 또는 최대의(도 13C) cAMP 반응을 보여주고 있다.
도 14A-14C는 Mc-PTH(1-14)/PTHrP(15-36) (Mc = Ala1,3,12,Gln10,Arg11,Trp14, Arg19)에 대하여, TPTX 래트에 있어 연장된 칼슘 혈증 작용(도 14A) 및 ROS 17/2.8 세포에 있어 연장된 cAMP 신호(도 14B 및 14C)를 보여주는 그래프이다. 도 14B 및 14C는 hPTH(1-34) 또는 Mc-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)으로 처리된 세포 내에서 지연된(60 분; 도 14B) 그리고 최대의(도 14C) cAMP 반응을 보여준다. 삽입된 표는 인 비트로에서 측정된, R0 및 RG 수용체 컨포메이션에 대한 유사체들의 결합 친화도를 보여준다.
도 15A 및 15B는 정상 래트에서, 변형된 PTH/PTHrP 하이브리드의 일시적인 칼슘 혈증 작용을 보여주는 그래프이다. Mc-PTH(1-11)/PTHrP(15-36) 및 Mc-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)에 대하여 연장된 칼슘 혈증 작용이 관찰되었다. 삽입된 표는 인 비트로에서 측정된, R0 및 RG 수용체 컨포메이션에 대한 유사체들의 결합 친화도를 보여준다.
도 16A-16C는 정상 래트에서 Ile5→His 및 Arg19→Glu 치환을 갖거나 가지지 않는 Mc-변형 PTH(1-34) 유사체의칼슘 혈증 작용(도 16A) 및 ROS 17/2.8 세포 내에서 지연된 또는 최대의 cAMP 반응을 보여주고 있다(도 16B 및 16C). 삽입된 표는 인 비트로에서 측정된, R0 및 RG 수용체 컨포메이션에 대한 유사체들의 결합 친화도를 보여준다. Ile5→His 및 Arg19→Glu 치환은 R0에 대한 친화도를 감소시키고, 인 비트로 cAMP 신호 지속시간 및 인 비보 칼슘 혈증 작용을 감소시킨다.
도 17A-17C는 정상 래트에서 Ile5→His 및 Arg19→Glu 치환이 없는 Mc-변형 PTH(1-34)/PTHrP(1-36) 유사체의 일시적인 칼슘 혈증 작용 및 ROS 17/2.8 세포 내에서 지연된 또는 최대의 cAMP 반응을 보여주고 있다(도 17B 및 17C). 삽입된 표는 인 비트로에서 측정한, R0 및 RG 수용체 컨포메이션에 대한 유사체들의 결합 친화도를 보여준다. Ile5→His 및 Arg19→Glu 치환은 R0에 대한 친화도를 감소시키고, 인 비트로 cAMP 신호 지속시간 및 인 비보 칼슘 혈증 작용을 감소시킨다.
도 18A 및 18B는 정상 래트(도 18A) 및 ROS 17/2.8 세포(도 18B)에서, Trp23→Ala 치환을 갖거나 가지지 않는 E19,Mc-변형 PTH(1-34) 유사체의 칼슘 혈증 작용 및 cAMP 활성을 보여주고 있다. 삽입된 표는 인 비트로에서 측정한, R0 및 RG 수용체 컨포메이션에 대한 유사체들의 결합 친화도를 보여준다. Trp23→Ala 치환은 [E19,Mc]PTH(1-34)의 R0에 대한 친화도를 10배 감소시켰고, 세포 내 cAMP 신호 지속시간을 감소시켰으며, 인 비보에서 상기 펩타이드의 과다 칼슘 혈증 작용을 감소시켰다.
도 19A 및 19B는 인간 PTH1 수용체를 발현하는 세포 내 천연 PTH/PTHrP 하이브리드 유사체의 cAMP 신호를 보여주고 있다. 상기 유사체는 급성 양-반응 분석법에서 유사한 효능을 보여준다.
도 20A 및 20B는 인간 PTH1 수용체에 대한 Mc-변형 PTH/PTHrP 하이브리드 유사체의 cAMP 신호를 보여주고 있다. 상기 유사체는 급성 양-반응 분석법에서 유사한 효능을 보여준다.
도 21A 및 21B는 ROS 17/2.8 세포 내 hPTH(1-34)NH2, hPTH(1-28)NH2 및 [A1,Aib3,M]-PTH(1-28)NH2 ([A1,12,Aib3,Q10,homoarginine11,W14,R19]hPTH(1-28)NH2)의 급속(도 21A) 및 지연된(도 21B) cAMP 분석을 보여주고 있다. 도 21A에서, IBMX 존재 하 10분 동안 세포와 펩타이드를 반응시키고, cAMP를 측정하였다. EC50 값은 각각 0.32, 7.6 및 0.33 nM이었다. 도 21B에서, 세포를 10-7 M의 hPTH(1-34), [A1,Aib3,M]-PTH(1-28) 또는 10-6M의 hPTH(1-28)와 10분 동안 반응시키고, 3회 세척하고, 완충액만으로 지정된 시간 동안 항온 처리하고, 최후 5분간 IBMX로 처리한 후, cAMP를 측정하였다. 도 21B의 데이터는 각각의 리간드에 대해 관찰된 최대 반응의 퍼센트로서 표현하였는데, 상기 최대반응은 IBMX 존재 하 10분 동안 세포를 리간드와 반응시켜 결정된 것이다(리간드 세척단계 없음). 상기 값은 각각 67±6; 68±3; 및 71±1 pmole/웰 이었다. 기본적인(부형제) cAMP값은 3.7±0.4 pmole/웰 이었다.
도 22A-22C은 마우스 내 투입된 PTH 리간드의 약물 동태학적 분석을 보여주고 있는데, 상기 분석은 활성 정보 판독을 위해 PTHR로 형질 전환된 COS-7 세포(도 22A 및 22C)를 사용한 바이오 분석 절차에 의해 수행되었다. pCDNA1 벡터로 형질 전환한 COS-7 세포를 대조군으로 사용하였다(도 22B). 마우스에 hPTH(1-34)(50 nmol/kg), hPTH(1-28)(1,000 nmol/kg) 또는 [A1,Aib3,M]-PTH(1-28)(50 nmol/kg)와 함께 부형제를 투여하고, 투여 후 지시된 시점에 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하고, EDTA 및 프로테나제 억제제 존재 하에서 혈장을 준비하고, 상기 혈장을 50배 희석시키고, 상기 희석된 샘플 45㎕를 96-웰 플레이트의 COS 세포에 적용하였다. 그 다음 15분간 항온처리 후 세포 내 cAMP를 측정하였다. 각각의 선 흔적(tracing)은 동일하게 처리된 6개 마우스로부터의 데이터(mean+SE)를 나타낸다.
도 23은 마우스 내 혈액 이온화 칼슘의 변화를 보여주는 그래프이다. 투여 후의 시점에서, hPTH(1-34)(50 nmol/kg), hPTH(1-28)(1,000 nmol/kg) 또는 [A1,Aib3,M]-PTH(1-28)(50 nmol/kg)으로 처리된 마우스 내 혈액 이온화 칼슘(iCa++)의 변화를 볼 수 있다(본 연구는 도 22A-22C의 연구와 연계되어 수행되었다). 데이터는 투여 전(pre) 각각의 마우스로부터 채취한 혈액 내 iCa++에 대하여 표준화하였다. 각각의 선 흔적(trace)은 동일하게 처리된 6개 마우스로부터의 데이터(mean+SE)를 나타낸다.
도 24A 및 24B는 PTH 리간드의 장기 처리 후 마우스 내 골-형성 및 골-흡수 마커의 변화를 보여주는 그래프이다. hPTH(1-34)(50 nmol/kg), 및 [A1,Aib3,]M-PTH(1-28)(50 nmol/kg)으로 처리한 마우스에서, 골-형성 마커인 오스테오칼신(도 24A) 및 골-흡수 마커, 콜라겐-타입 I C-말단 단편 (CTX)(도 24B)의 혈청 수준을 볼 수 있다. 마커들은 마우스 오스테오칼신 EIA 키트(Biomedical Technologies) 및 래트랩스 CTX ELISA(Nordic Bioscience) 키트를 사용하여 측정하였다. 각각의 선 흔적(trace)은 동일하게 처리된 6개 마우스로부터의 데이터(mean+SE)를 나타낸다.
도 25는 HKRK-B7 세포 내에서 인간 PTH 수용체에 대한 PTH/PTHrP 하이브리드 아날로그의 cAMP 신호 효능을 보여주는 표이다.
도 26A는 COS-7 세포막에서 발현된 인간 PTH 수용체에 대한 PTH/PTHrP 아날로그 R0 및 RG 결합의 경쟁 분석법을 보여주는 표이다.
도 26B는 R0 결합 값에 의해 분류된 것으로, 도 26A에서와 동일한 데이터를 보여주는 표이다.
도 27A-27D는 PTHrP(1-28)의 알라닌-스캔 및 타입-치환을 보여주는 그래프이다. PTHrP(1-28)의 15-28 지역 알라닌 치환의 cAMP 활성에 대한 영향은 세뇨관 LLCPK1-B64(도 27A) 및 ROS17/2.8(도 27B) 세포에서 측정되었다. 18, 22, 25 및 26 위치에서의 알라닌 치환은 적어도 하나의 세포 타입에서의 활성을 증가시켰다. 상기 위치들을 다양한 타입의 아미노산으로 더 치환시키고, LLCPK1-B64 세포(도 27C) 또는 SaOS-2 세포 (도 27D) 내에서 cAMP 활성을 분석하였다. IBMX 존재 하, 상온 30분 동안 세포를 3x10-9 M의 유사체로 처리하였다. 각각의 유사체에 대한 반응은 부모(자연의) PTHrP(1-28) 펩타이드에 대한 반응에 대하여 표준화하였다.
도 28A 및 28B는 PTHrP(1-28) 골격 내 치환을 가지고 있는 펩타이드에 의한 인 비트로(도 28A) 및 인 비보(도 28B) cAMP 활성을 보여주는 그래프이다. SaOS 세포 내 대표적인 변형된 PTHrP(1-28) 유사체의 cAMP 활성의 양 반응 커브를 도 28A에서 볼 수 있다. 도 28B는 부형제, PTHrP(1-36), PTHrP(1-28), A18,22,L25,K26(AALK)-PTHrP(1-28) 또는 E18,A22,L25,K26(EALK)-PTHrP(1-28)(n= 3)를 정맥 투여한 C57BL/6 마우스(3 개월 령, 웅성)로부터의 인 비보 cAMP 유도를 보여준다. 투여 10분 후 혈액을 채취하여, cAMP 혈장 수준을 RIA로 측정하였다.
도 29A 및 29B는 마우스 내에서, R0 및 RG 선택적 PTH 유사체의 혈장 cAMP 및 칼슘에 대한 영향을 보여주는 그래프이다. 도 29A 및 29B는 부형제, rPTH(1-34), M-PTH(1-34)(M=A1,Aib3,Q10,Har11,A12,W14,R19) 또는 E18,A22,L25,K26-(EALK)-PTHrP(1-30)(5 nmol/kg; cAMP에 대해 n= 7, 칼슘에 대해 n=4)를 정맥투여한 마우스(C57BL/6, 웅성, 3개월령) 내의 혈장 cAMP 농도를 보여준다. 도 29B는 동일한 펩타이드로 처리한 마우스 내 이온화 칼슘 수준을 보여준다. 칼슘 실험에서, 혈액을 사전에 채취하였고, 투여 1, 2, 4 및 6 시간 경과 후에 Ca++/pH 분석기를 사용하여 이온화 칼슘을 측정하였다.
도 30A-30F는 마우스 내 혈장 골 마커에 대한 PTH 유사체의 영향을 보여주는 그래프이다. 부형제, rPTH(1-34), M-PTH(1-34) 또는 (EALK)-PTHrP(1-30)(5 nmol/kg; n= 7 그룹)을 매일같이 14일간 마우스(C57BL/6, 웅성, 3개월령)에 정맥 투여하였다. 6일(각각 도 30A, 30C 및 30E) 및 13일(각각 도 30B, 30D 및 30F) 시점의 혈액 내 골 턴오버 마커(PINP, CTX 및 오스테오칼신)를 ELISA를 사용하여 분석하였다.
도 31은 R0 및 RG 리간드의 2-주간 매일 처방이 마우스 내 섬유주 및 외피 골 구조에 대해 미치는 영향을 보여주는 이미지 세트이다. 부형제, rPTH(1-34), M-PTH(1-34) 또는 E18,A22,L25,K26(EALK)PTHrP(1-30)(5 nmol/kg; n= 7 그룹)를 매일같이 14일간 마우스(C57BL/6, 웅성, 3개월령)에 투여(i.v.) 하고, CT로 대퇴골을 분석하였다.
도 32A 및 32B는 EALK-PTHrP(1-31) 29-31 지역(도 32A) 및 EALK-PTHrP(1-34) 29-33 지역(도 32B) 내 아미노산 치환이 MC3T3-E1 세포 내 cAMP 활성 유도에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 33은 TPTX 래트에서 0부터 24시간까지의 PTH(1-34) 및 M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)(SP-PTH)의 칼슘 혈증 작용을 보여주는 그래프이다.
도 34는 TPTX 래트에 대한 SP-PTH 또는 PTH(1-34)의 단일 주입에 따른 0-6 시점에서의 뇨 칼슘을 보여주는 그래프이다.
도 35는 TPTX 래트에서 PTH(1-34) 및 SP-PTH의 저인산혈증 작용을 보여주는 그래프이다.
도 36은 TPTX 래트에 대한 SP-PTH 또는 PTH(1-34)의 단일 주입에 따른 0-6 시점에서의 뇨 인을 보여주는 그래프이다.
도 37은 Mc-PTH(1-34), [A1,3,A23,Q10,R11]-hPTH(1-34), [A1,3,A23]-hPTH(1-34) 및 [A18,A22,L25,K26]-PTHrP(1-28)의 cAMP 신호 효과에 대한 양-반응 분석을 보여주는 그래프이다. 비교를 위해, hPTH(1-34) 및 PTHrP(1-36) 또한 나타내었다. 이러한 펩타이드들의 cAMP 형성을 자극하는 능력은 HKRK-B7 세포 내 인간 PTH1 수용체에서 측정하였다. 이러한 PTH 유사체들은 hPTH(1-34)에 필적하는 cAMP 신호를 나타낸다.
본 발명자들은 (i) G-단백질과 결합하지 않았을 때의 GPCR(R0 상태)에 GPCR 리간드가 결합하는 능력과 (ii) 상기 리간드가 상기 수용체를 활성화시키는 시간 길이 간의 상관관계를 밝혀내었다. 특히, PTH 또는 PTHrP와 비교하여, 어떠한 리간드가 인 비트로에서 예시적인 GPCR, PTH/PTHrP 수용체(PTHR)의 G-단백질과 결합하지 않은 상태(R0 상태)와 상호작용할 수 있는 향상된 능력을 갖는다는 것은, 인 비보에서 더 연장된 활성을 가할 수 있는 능력을 갖는다는 것과 밀접하게 관련된다. 이와 반대사실 또한 성립하는데, 예를 들어 GPCR의 G-단백질과 결합한 상태(RG 상태)에 선택적인 리간드는 자연의 리간드와 비교하여 더 단기의 활성 지속시간을 갖는다. 상기 발견은 어떠한 화합물이 GPCR에 대하여, 인 비보에서 장기-작용 또는 단기-작용 활성을 갖는지 결정하는 신규한 방법의 기초를 제공한다. 이러한 기초에 근거하여, 여기에서 기술된 방법을 사용하여 치료법적으로 바람직한 성질을 갖는 리간드(예를 들어 장기-작용 또는 단기-작용 리간드)를 밝혀낼 수 있다. 장기-작용 또는 단기-작용 활성을 갖는 예시적인 리간드들을 여기에서 기술하였다.
치료하고자 하는 질병에 따라, 장기-작용 또는 단기-작용 치료법이 바람직하다. 인간에게 투여한 PTHrP(1-36)를 사용한 최근의 연구는, 골다공증의 표준 치료법인 PTH(1-34)를 사용한 경우와 동일한 정도로 골 미네랄 밀도가 증가하였음을 보였는데, 이는 동일한 PTH(1-34) 투여량에 대해 나타날 수 있는 골-재흡수 반응을 유도하지 않았다(Horwitz et al., J. Endocrinol. Metab. 88:569-575 (2003)). 상기 그룹과 관련된 연구는, 급성 안전성 시험이 PTHrP(1-36)가 과다칼슘혈증 효과를 일으키지 않고서 PTH(1-34) 일반적 투여량의 거의 20배를 상회하는 양으로 투여될 수 있음을 나타냄에 따라, 상기 차이점이 오직 약물 동력학에 근거한 것은 아닐 수 있음을 제시한다(Horwitz et al., Osteoporosis Int. 17:225-230 (2006)). PTHrP(1-36) 및 PTH(1-34) 모두가 PTHR RG 형태에 대하여는 유사한 수용체 결합을 보이는 반면, PTHR R0형태에는 PTHrP가 덜 강하게 결합하며, 따라서 PTH와 비교하여 인 비보에서 덜 연장된 활성을 나타낸다는 본 발명자들의 발견은 상기 차이점을 설명할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 PTHR의 RG 선택적(예로, 상대적으로 적은 R0 친화도를 갖는) 리간드가 골다공증 치료에 있어 유용한 것으로 입증될 것을 믿는다.
다른 상황에서는, 더 긴 작용 리간드가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 1,25,(OH)2 비타민 D의 신장 생산을 자극함에 있어 PTHrP는 PTH(1-34)보다 덜 효과적인데(Horwitz et al., J. Bone Mineral. Res. 20:1792-1803 (2005)), 이는 장기-작용 PTHR 신호가 요구되는 질병을 치료하는데 있어서 PTH(1-34)가 더 효과적일 수 있음을 제안한다. 그와 같은 질병은 칼슘-인식 수용체에서의 변이를 활성화시킴에 따라 유발되는 부갑상선 기능 저하증의 특정 형태를 포함한다. 현재, 상기 질병의 치료법은 PTH(1-34)를 매일 두 번씩 투여할 것을 요구한다(Winer et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 88:4214-4220 (2003)). 본 발명의 스크리닝 방법을 사용함에 따라, 장기 작용 PTHR 리간드를 밝히는 것이 가능하게 되었는데, 이는 상기 질병들을 치료하는데 매우 유용한 것으로 입증될 수 있으며, 상기 약의 덜 빈번한 투여를 가능하게 할 수 있는 것이다.
PTH(1-34)는 R0에 안정하게 결합할 수 있는 그의 능력에 의하여, 타겟 골 및 신장 세포에 대해 PTHrP보다 더 큰 신호 반응을 축적적으로 유도할 수 있으며, R0 선택성에 대한 이러한 차이는 조골세포에서의 파골적 골 흡수 자극과 관련되는 요소(RANK 리간드)의 유도 및 신장 근위관 세포에서의 1-α-하이드록시라제(hydroxylase) mRNA 합성 촉진과 같은 생물학적 반응의 차이로 연결된다. 상기 고찰에 따를때, 특히 높은 선택성을 가지고 PTHR RG(vs. R0) 컨포메이션에 결합하는 리간드는 골 형성 반응을 촉진하는데 있어 매우 효과적일 수 있으며, 따라서 골다공증을 치료하는데 유용할 수 있다.
즉, 상기 두 리간드는 구별된 수용체 컨포메이션을 차별적으로 안정화시킨다. 현재 GPCR 분야에서는, 주어진 수용체에 대하여 구조적으로 다양한 리간드가 갖는, 구별되는 수용체 컨포메이션에 대한 다른 선택성 및 그 결과 구별되는 생물학적 효과를 나타내는 능력에 대한 많은 논의가 있다(Kenakin, T. Sci STKE 342: pg. 29 (2006)). 여기에서 수행된 동적 및 평형 결합 분석 결과는, PTH(1-34) 및 PTHrP(1-36)가 G-단백질 결합 PTHR 컨포메이션에는 유사한 친화도로 결합하는 반면, PTH(1-34)는 G-단백질 미결합 PTHR 컨포메이션 R0에 결합함에 있어, PTHrP(1-36)보다 더 큰 능력을 보임을 제안하였는데, 여기에서 R0는 GTPγS(5,14) 존재 하 리간드에 높은 친화도로 결합할 수 있는 능력을 갖는 수용체 컨포메이션을 말한다.
여기에서 제시된 지연된 cAMP 분석법은, 구별되는 수용체 컨포메이션에 대한 변화된 선택성이 PTHR-발현 세포에 있어서 변화된 신호 반응을 일으킬 수 있음을 보여준다. 즉, PTH(1-34) 및 Ile5-PTHrP(1-36)는 PTHR-발현 세포에 있어서 더 연장되고 더 축적적으로 큰 cAMP 신호 반응을 일으켰다. R0를 안정화시킴에 있어 PTHrP(1-36) 보다 큰 능력을 갖는 PTH(1-34) 및 Ile5-PTHrP(1-36)는, LR0 복합체와 헤테로 트라이머 G-단백질의 최종적 결합(LR0- LRG) 및 이에 상응하는 신호 캐스캐이드의 활성에서 기인하는 더 연장된 신호 반응을 유도할 수 있다. 안정한 LR0 결합이 갖는 또 다른 잠재적인 기전적 결론은, G 단백질 결합, 활성화 및 분리의 연속적인 사이클 후에도 LR0 복합체가 보존됨에 따라 수회의(촉매반응의) G 단백질 활성화가 허용될 수 있다는 점이다(Rodbel, M. Adv. Enzyme Regul, 37: 427-435 (1997); Heck and Hofmann, J. Biol. Chem. 276:10000-10009 (2001)).
PTH(1-34) 및 PTHrP(1-36) 리간드가 cAMP 및 이노시톨 포스페이트 반응을 자극하는 효능에 있어서 어떠한 차이가 있다 해도, 단일-시점 세포 에서 수행된, 통상적 양-반응인 cAMP 및 이노시톨 포스페이트 자극 분석법으로 상기 리간드를 분석했을 때 거의 탐지되지 않았다(도 7). 이러한 결과는 두 리간드가 PTHR와 동일 또는 유사한 메카니즘으로 상호작용한다는 관점과 일치하는 것이다. 따라서, 지연된-시간 cAMP 분석법은 종전에 진가를 인정받지 못했던 두 리간드의 2차-전달자 신호 특성의 차이를 밝혀냈는데, 이는 시간에 따라 누적되는 신호 출력의 차이에 따라 명백하다. 작동자-활성 PTHR는, 수용체 인산화, 베타-아레스틴 회복 및 수용체 내면화를 수반하는 비감각화 과정을 거치는 것으로 알려진 반면(Biselo, A. et al., (2002); Tawfeek et al., Mol. Endocrinol. (2002); Castro et al., Endocrinology 143:3854-3865 (2002); Chauvin et al.,Mol. Endocrinol. 16:2720-2732 (2002)), 그와 같은 과정이 R0 컨포메이션의 수용체에 대해서도 일어난다고 기대되지 않는데, 이는 그들이 정의에 의할 때, 적어도 G 단백질 결합의 관점에서는 기능적으로 불활성이기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 우리의 도 5의 지연된 cAMP 분석에서 관찰된 효과가 그와 같은 수용체 비감각화 메카니즘에 미치는 리간드의 특이한 효과를 어느 정도로 포함하고 있다는 가능성을 배재할 수는 없다.
일반적으로, 안정된 LR0 결합 능력은, 타겟 수용체와 관련있는 낮은 수준의 동종 헤테로 트라이머 G 단백질을 발현하는 타겟 세포 내에서, 리간드의 신호 잠재력을 촉진 또는 증대시킬 수 있다. 그것은 또한 일차적인 G 단백질보다 리간드-수용체 복합체에 대하여 낮은 친화도를 가질 것으로 추측되는 “이차적인” G 단백질에의 결합을 촉진할 수 있다. PTHR의 경우, Gαq/11, Gαi/o, 또는 Gα12/13에의 결합을 수반할 수 있는데, 이들 각각은 PTH(1-34)에 대한 반응으로 PTHR에 의해 활성화되는 것으로 알려졌다. PTHrP이 적어도 R0에 결합하고(도 3A-3D) 지연된 cAMP 신호를 활성화하는(도 5A 및 5B) 다소의 능력을 가지고 있지만, 상기 결합은 PTH(1-34)의 결합보다 적다. 물론, 안정된 LR0 복합체를 형성하는 몇몇 능력은 등급 B GPCR의 내재적 성질일 수 있는데, 이는 칼시토닌 수용체(Hilton et al., J. Endocrinol. 166:213-226 (2002)), 코티코트로핀-분비 호르몬(corticortropin-releasing hormone )(Hoare et al., Peptides 24:1881-1897 (2003)) 및 글루카곤(Post et al., J. Biol . Chem . 267:25776-25785 (1992))을 포함하는 이들 중 몇몇이, 비-가수분해성 구아닌 뉴클레오타이드 유사체 존재 하에서 그들의 동종 펩타이드 리간드와 안정한 복합체를 형성하는 것을 관찰함에 따른 것이다.
또한, 여기에서 기술한 발견들은 PTH 및 PTHrP가 정상 생리 기능에서 수행하는 메카니즘에 관련될 수 있다. 내분비 호르몬으로서 PTH는 분비 장소(부갑상선 샘)로부터 멀리 떨어진 타겟 세포(골 또는 신장 내)에 작용한다. 혈장 내 PTH 농도는 Ca2 +수준이 변동됨에 따라 조금씩 변화하지만, 일반적으로 피코몰의 낮은 범위 내이며, 이는 PTH가 그의 수용체에 결합하는 친화도 훨씬 낮은 것이다. PTH가 미결합된 수용체, R0 컨포메이션에도 안정하게 결합하는 능력은 리간드 농도의 심지어 최소한의 증가에도 반응함을 담보하기 위한 진화적인 채택일 수 있다. 반면에, 파라크린(paracrine) 요소로서의 PTHrP은 그것이 생산되는 같은 조직 내 세포(예를 들어, 발생 중인 장골의 성장-판 연골)에 작용한다. 그와 같은 조직 내 PTHrP 농도는 직접적으로 정량되지는 않았지만, 분화중인 세포 지역을 가로질러 생산 지역 근처에서 높게 나타나는 농도 구배를 형성하는 것으로 보인다(Chen et al., J. Bone Miner. Res. 21:113-123 (2006)). 이러한 세포 내 발생하는 분화 이벤트를 조절하는 그의 역할에 대한 적응으로서, 상대적으로 단기간-살아있고 또한 더 쉽게 소멸하는 신호 반응을 유도하기 위해, PTHrP는 수용체에 오직 일시적으로만 결합하도록 진화되었을 수 있다.
G-단백질 결합 수용체
본 발명은 그 어떠한 G-단백질 결합 수용체라도 사용할 수 있다. 장기-작용 또는 단기-활성 리간드는 여기에서 기술된 바에 따라 분석될 수 있고, 밝혀진 유용한 치료요법의 후보물질일 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 그와 같은 수백개의 수용체가 알려져 있다; 예를 들어 Fredriksson et al., Mol. Pharmacol.63:1256-1272, 2003 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 상기 문헌은 서열 상동 및 기능에 근거하여 인간 GPCRs을 특성화하였다. 인간 GPCRs은 5개 종류로 분류될 수 있다: 세크레틴, 로돕신, 글루타메이트, 프리즐드(frizzled)/Tas2 및 점착(adhesion). 아니면 그 대신에, 수용체는 예를 들어, 펩타이드 호르몬 또는 소분자(예로, 바이오제닉 아민)와 같은 그의 리간드에 의해 분류될 수도 있다. 다른 분류 도식으로는 A-F 분류가 있는데, 여기에서 A 등급은 로돕신 관련 수용체 및 아드레날린 수용체를 대표하고, B 등급은 칼시토닌(calcitonin) 관련 수용체 및 부갑상선 호르몬 수용체, C 등급은 대사속성(metabotropic)에 관련된 수용체, 그리고 D-F 등급은 균류 및 원시세균(archaebacteria)에서 발견되는 수용체를 대표한다.
프레드릭슨(Fredriksson) 분류를 사용할 때, 세크레틴 수용체는 4개의 주요 서브그룹을 갖는다: CRHRs/CALCRLs, PTHRs, GLPRs/GCGR/GIPR, 그리고 세크레틴 및 4개의 다른 수용체를 포함하는 서브그룹. 세크레틴 수용체는 칼시토닌 수용체(calcitonin receptor: CALCR), 코르티코트로핀-분비 호르몬 수용체(corticotropin-releasing hormone receptors: CRHRs), 글루카곤 수용체(glucagon receptor: GCGR), 위 억제 폴리펩타이드 수용체(gastric inhibitory polypeptide receptor: GIPR), 글루카곤-유사 펩타이드 수용체(the glucagon-like peptide receptors: GLPRs), 성장 호르몬-분비 호르몬 수용체(growth hormone-releasing hormone receptor: GHRHR), 뇌하수체 아데닐 시클라제-활성 단백질(pituitary adenylyl cyclase-activating protein: PACAP), 세크레틴 수용체(secretin receptor: SCTR), 그리고 혈관작용 장 펩타이드 수용체(vasoactive intestinal peptide receptor: VIPR) 뿐만 아니라 PTHR를 포함한다.
점착성 수용체는 GPCR-유사 막관통-지역의 특징을 이루는데, 이 지역은 EGF-유사 반복, 뮤신(mucin)-유사 지역 및 보존된 시스테인-풍부 모티브와 같은 N 말단 점착-유사 모티브를 갖는 하나 또는 수개의 기능적 도메인과 함께 융합되어 있다. 상기 집단은 그 구성원으로 CELSRs(EGF LAG seven-pass G-type receptors), BAIs(brain-specific angiogenesis-inhibitory receptors),LECs(lectomedin receptors) 및 EMRs(EGF-like module containing)을 포함한다. 다른 수용체는 CD97 항원 수용체(CD97) 및 EGF-TMVII-latrphilin-관련(ETL)을 포함한다. 또한, 이러한 수용체는 HE6(TMVIILN2) 및 GPR56(TMVIIXN1 또는 TMVIILN4), 그리고 GPR56 및 HE6와 관련있으며 GPR97 및 GPR110 내지 GPR116라고 명명된 최근 발견된 수용체 그룹을 포함한다.
글루타메이트 수용체는 8개의 대사성 글루타메이트 수용체(metabotropic glutamate receptors: GRM), 2개의 GABA 수용체(예로, 두 개의 접합 변이체 a 및 b를 가지는 GAB-AbR1 및 GAB-AbR2), 단일의 칼슘-감지 수용체(calcium-sensing receptor: CASR) 및 미각 수용체로 알려진 5개의 수용체(taste receptors: TAS1)로 구성된다.
다른 GPCR들은 오피오이드(opioid), 무스카린, 도파민, 아드레날린, cAMP, 옵신, 앤지오텐신, 세로토닌, 갑상선자극호르몬, 생식선자극호르몬, 물질-K, 물질-P 및 물질-R, 멜라노코르틴 및 대사성 글루타메이트 수용체들을 포함한다.
가장 큰 그룹은 로돕신 리셉터 족인데, 이들은 적어도 701 인간 수용체를 포함하며, 이중 241개가 비-후각적인 것이다. 상기 그룹의 수용체는 다양한 아세틸콜린(무스카린) 수용체, 아드레날린 수용체, 도파민 수용체, 히스타민 수용체, 세로토닌 수용체 및 옥토파민 수용체; 앤지오텐신, 봄베신, 브래디키닌, 엔도테린, 인터루킨-8, 케모킨, 멜라노코르틴, 뉴로펩타이드 Y, 뉴로텐신, 오피오이드, 소마토스타틴, 타키키닌, 트롬빈, 바소프레신, 갈라닌, 프로테나제-활성, 오렉신 및 케모킨/케모타틱 요소 수용체와 같은 펩타이드 수용체; FSH, 루트로핀-코리고나도트로핀 호르몬 및 갑상선 자극 호르몬과 같은 단백질 호르몬 수용체; 로돕신 수용체; 후각 수용체; 프로스타노이드 수용체; 아데노신 및 퓨리노셉터를 포함하는 뉴클레오타이드-유사 수용체; 대마초(cannabis) 수용체; 혈소판 활성인자 수용체; 생식선 자극-분비 호르몬 수용체; 멜라토닌 수용체, 라이소스핑고리피드 및 LPA(EDG) 수용체, 그리고 다양한 고아 수용체를 포함한다.
후보 화합물
본 발명의 스크리닝 방법에는 어떠한 종류 또는 출처의 화합물이라도 사용할 수 있다. 예를 들면, 자연적으로 발생한 화합물(예로 화합물 라이브러리로부터 온 것), 펩타이드, 변형된 펩타이드 호르몬, 항체, 나노바디, 키메릭 펩타이드 및 내인성 리간드의 단편(예로 펩타이드 리간드) 모두가 본 발명에 사용되어질 수 있다. 천연물 도서관 화합물 또는 고안된 리간드(예로 PTH 서열에 근거한 리간드)와 같이 임의의 스크리닝 관련 접근법도 본 발명의 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여, GPCR 또는 GPRC의 리간드 결합 단편에 대한 항체 또는 나노바디를 발생시킬 수 있다.
변형된 수용체 작동자
새로운 수용체 작동자를 동정하는 하나의 전략은 존재하는 작동자를 변형하는 것이다. 펩타이드 호르몬은 점 변이, 절단, 삽입 및 키메릭 펩타이드 생성에 의하여 변형되어질 수 있다. 예를 들면, PTH 수용체를 사용한, 많은 변형된 PTH 및 PTHrP 서열이 당업계에 알려져 있다. 펩타이드는 당업계에 알려진 바에 따라, 재조합적 또는 합성적으로 만들 수 있다. 예를 들면 여기에 참조로서 삽입된 미국특허 제7,057,012호, 제7,022,815호, 제6,417,333호, 제6,495,662호를 참고하는데, 상기 문헌들은 여기에서 기술된 것들 중 어느 하나 뿐만 아니라, 다양한 PTH 서열을 기술한다. 상기 서열은 키메릭 펩타이드를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 어떠한 작동자는 후보 치료제를 생성하기 위하여 항체 또는 항체 단편(Fc 단편 같은 것)에 융합되어질 수 있다.
항체 및 나노바디
GPCR에 결합하는 항체 또는 나노바디 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 방법들 중 하나를 사용하여 GPCR 또는 그의 단편(예로 GPCR의 리간드-결합 부분)에 대하여 생성될 수 있다. 하나의 구현예에서, GPCR 또는 그의 단편에 대해 유도된 IgG는 정제된 단백질을 사용하여 뉴질랜드 백색 래빗 내에서 생성될 수 있다. 초기의 면역 프로토콜은, 초기단계인 정제된 단백질 10-20 g 근육 내 주입 및 21일 후 면역 상승으로 이루어졌다. 항체가 전혀 또는 거의 감지되지 않는 경우에는, 추가적 상승 및/또는 보조제 첨가도 사용될 수 있다. 항체는 기술한 것과 유사한 ELISA에 의해 정량할 수 있다(Siber et al., J. Infect. Dis. 152:954-964, 1985; Warren et al., J. Infect. Dis. 163:1256-1266, 1991). IgG는 래빗 항 혈청으로부터 정제될 수 있는데, 예를 들면 50% 암모늄 설페이트 침전 후 단백질 G 세파로스 4B (Pharmacia) 친화도 크로마토그래피 방법에 의할 수 있다. GPCR에 대한 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 나노바디는 나노바디를 생산하는 동물(예로, 낙타 또는 라마)의 면역에 의해 생산할 수 있는데, 그 다음 표준 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 상기 항체 또는 나노바디는 장기-활성 또는 단기-작용 효능을 갖는 작동자적 분자를 위하여, 여기에서 기술된 바에 따라 스크리닝 될 수 있다.
시험 화합물 및 추출물
일반적으로 GPCR (예로, PTHR)에 결합할 능력이 있는 화합물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 방법에 따라, 천연물 또는 합성(또는 반-합성)추출물 거대 라이브러리 또는 화합물 라이브러리로부터 찾아낼 수 있다. 의약 발견 및 개발 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 시험 추출물 또는 화합물의 정확한 출처가 본 발명의 스크리닝 절차에 있어서 불가결한 것이 아님을 이해할 것이다. 따라서, 실질적으로 어떠한 화학적 추출물 또는 화합물이라도 여기에서 기술된 방법을 사용하여 스크리닝 될 수 있다. 상기 추출물 또는 화합물은 기존 화합물의 변형물 뿐만 아니라 식물-, 균류-, 원핵세포- 또는 동물-근거 추출물, 발효 액 및 합성 화합물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 어떠한 화학적 화합물을 임의로 또는 지시에 따라 합성(예를 들어, 반-합성 또는 전체 합성)하는 것에 대해 또한 수많은 방법이 가능한데, 상기 화합물은 단당류-, 지방-, 펩타이드- 및 폴리뉴클레오타이드-근거 화합물을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다. 합성 화합물 라이브러리는 상업적으로 판매되고 있다. 대안으로서, 박테리아, 균류, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물 라이브러리가 상업적으로 판매되고 있다. 그 뿐만 아니라, 만일 원한다면 당업계에서 알려진 방법, 예를 들면 표준 추출법 및 분획법(fractionation)에 의하여 합성적으로 생산된 자연의 라이브러리가 만들어 질 수 있다. 게다가, 만일 원한다면 어떤 라이브러리 또는 화합물이라도 화학적, 물리적 또는 생화학적 표준 방법을 사용하여 쉽게 변형될 수 있다.
그 뿐만 아니라, 의약 발견 및 개발 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 유용 성분 확인(dereplication) 방법(예를 들면, 분류학적 유용 성분 확인, 생물학적 유용 성분 확인 및 화학적 유용 성분 확인 또는 그의 결합) 또는 대사 장애를 치료 활성이 이미 알려진 물질의 복제 또는 반복의 제거는 가능하다면 언제나 채택되어야 한다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
천연 그대로의 추출물이 RG 상태의 GPCR에 결합하는 것이 발견되고, 상기 수용체가 R0 상태일 때 내인성 리간드와 비교하여 다른 결합(예를 들어, 더 높은 친화도 또는 더 낮은 친화도)을 나타내는 경우, 관찰된 효과를 나타내는 화학적 요소를 분리하기 위해서 양성적 리드(positive lead) 추출물에 대한 추가적인 분획이 더 필요하다. 따라서, 상기 추출, 분획 및 정제 과정의 목적은 천연 그대로의 추출물 내에 있는, 대사 장애(예로, 당뇨병 및 비만)를 치료하는데 유용할 수 있는 활성을 갖는 화학적 실체를 밝히고 특성화 하는 것이다. 상기 불균질한 추출물의 분획 및 정제의 방법은 본 발명이 속하는 기술에서 알려져 있다. 만일 필요하다면, 본 발명이 속하는 기술에서 알려진 방법에 따라 본 발명의 스크리닝 방법에서 유용한 제제로 알려진 화합물을 화학적으로 변형할 수 있다.
상기 시험 화합물은 아미노산 또는 핵산 앱타머(aptamer) 뿐만 아니라, 자연적으로 발생한 또는 합성된 화학적 화합물(소분자 포함)을 포함한다. 상기 화합물 중 하나는 합성 또는 변형 아미노산 또는 핵산을 포함할 수 있다.
후보 화합물과 수용체 접촉
본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보 화합물을 GPCR와 접촉시킨다. 상기 수용체는 세포(예로, 기관 내) 상 또는 준비한 막 상에서 발견할 수 있다. 아니면, 상기 수용체는 기능적 형태로 분리될 수 있다(Shimada et al., J. Biol. Chem.277:31,774-31780, 2002).
본 발명의 방법에서는 관심 대상 GPCR(예로, PTHR)를 자연적으로 발현하는 또는 상기 수용체를 재조합적으로 발현하는 세포를 사용할 수 있다. 대체적으로 또는 부가적으로, GPCR을 인코딩하는 재조합 유전자를 발현하도록 세포를 형질 전환(예로, 당업계에서 알려진 방법을 사용)시킬 수 있다. 또한, 특정 GPCR을 발현하는 세포는 상업적으로, 예를 들면 밀리포어(ChemiScreen™ cell lines)로부터 구입할 수도 있다.
다른 구현예에서, 상기 수용체는 관심 대상 GPCR을 포함하는 막 표본(예로, 세포로부터 분리된 것)에 존재한다. 상기 표본은 상업적으로 구입가능하다. 예를 들어, 밀리포어에서 구입가능한 ChemiSCREEN™ 수용체 표본을 참조하라. 막 표본은 또한 당업계에서 알려진 기술을 사용하여 생산될 수 도 있다(예를 들어, Mills et al., J. Biol. Chem. 263:13-16, 1988 참조).
만일 정제된 수용체 성분 준비되면, 상기 수용체 또는 수용체 복합체에 후보 화합물을 인 비트로 반응시킨다.
분석 정보판독-리간드 결합 또는 활성의 측정
본 발명의 방법에 있어서, 리간드 결합 또는 리간드 활성을 분석하기 위한 그 어떤 방법도 사용할 수 있다. 특정한 판독 방법은 결정적인 것이 아니다. 몇몇 구체예에서, 리간드의 GPCR에의 결합은, 방사능 표지된 리간드를 비-표지 화합물로 치환하고 비-표지 화합물 처리 전 및 처리 후의 세포 또는 막 표본 방사능을 측정하는 방법에 의하여 측정된다. 일반적으로 이러한 접근법은 막과 방사능 리간드가 복합체를 형성할 수 있도록 반응시키는 것과 관련이 있다. 비표지 화합물을 과량으로 첨가함에 따라 해리 단계가 개시된다. 첨가 직전(t=0) 및 그 후 일련의 시점에서, 분취량을 채취하고 즉시 진공 필터법으로 처리할 수 있다. 비특이적 결합은 선-반응 및 해리 단계 모두에서 비표지 화합물을 포함하는 패러럴 반응 튜브에서 결정된다. 각각의 시점에서 특이적으로 결합한 방사능은 t=0에서 특이적으로 결합한 방사능의 퍼센트 값으로 계산될 수 있다. 이와 같은 해리 방법은 큰 규모의 스크리닝(예를 들면, 후보 화합물 라이브러리)에 매우 적합하다.
하기의 실시예 1에 기술된 것처럼, FRET 같은 다른 방법 또한 리간드의 수용체에 대한 결합을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 적용에서, 두 개의 형광 분자를 수용체에 접합시키어 리간드 결합이 수용체 내에 컨포메이션의 변화를 일으키면, 이는 FRET 신호의 변화로 감지된다. FRET은 리간드 결합의 실시간 측정을 가능하게 하며, 따라서 본 발명에서 매우 유용하다.
다른 판독법은 여기에서 기술한 지연된 cAMP 활성 분석법을 포함하는 cAMP 활성 측정법을 포함하는데, 이 방법은 화합물의 수용체 RG 형태에 대한 결합을 간접적으로 측정한다. 세포 내 cAMP 수준은 방사능 면역 분석법(예를 들면, Shimizu et al. J. Biol . Chem . 276:49003-49012 (2001)에서 기술된 것)에 의해 측정 될 수 있다. 간단히, 상기 방법은 0.5 ml의 결합 완충액(트리스-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, 5% 열-불활성 마혈청, 0.5% 우태아혈청, HCl을 사용하여 pH 7.7로 조절)으로 씻어내고, 그리고 200 ㎕의 cAMP 분석 완충액(3-이소부틸-1-메틸잔틴(methylxanthine) 2 mM, 우혈청 알부민 1 mg/ml, 헤페스-NaOH 35 mM를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지, pH 7.4) 및 다양한 양의 후보 화합물(최종 부피= 300 ㎕)를 포함하는 100 ㎕의 결합 완충액으로 처리하는 후보 화합물로 처리하는 방법을 포함한다. 배지는 상온에서 30-60분 반응 후 제거될 수 있다. 그 다음 세포를 얼리고, 50 mM의 HCl 0.5 ml로 용해하고, 다시 얼린다(-80°C). 묽은 용해물의 cAMP 함량은 방사능 면역 분석법으로 결정한다. EC50 반응 값은 비선형 회귀법으로 계산할 수 있다.
GPCR 활성에 대한 화합물의 영향을 산정하기 위하여, GPCR 활성에 영향을 주는 그 어떤 적합한 생리학적 변화를 이용할 수 있다. 손대지 않은 세포 또는 동물을 사용하여 기능적 결론을 결정할 때, 트랜스미터 방출, 호르몬 방출, 알려진 또는 밝혀지지 않은 유전자 마커(예를 들면, 노던 블롯) 모두에 대한 전사적 변화와 같은 다양한 효과, 세포 성장 또는 pH 변화와 같은 세포 대사 변화, 그리고 Ca++, IP3 또는 cAMP와 같은 세포 내 2차 전달자의 변화 또한 측정될 수 있다.
하나의 구체예에서, 세포 내 cAMP의 변화는 면역 분석법을 이용하여 측정될 수 있다. cAMP 수준을 결정하기 위해 오퍼만 및 시몬(J. Biol. Chem. 270:15175-15180 (1995))에서 기술된 방법을 사용할 수 있다. 미국 특허 제4,115,538호에서 기술된 것과 같은 cAMP 측정을 위한 분석 키트 또한 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 분석법은 혈청/뇨 칼슘, 포스페이트 및 골-턴오버 마커(예로, 디옥시프리도놀린 연결(eoxypridonoline crosslinks))의 인 비보 변화, 뇨 내의 혈청 상호적 변화의 감소를 측정하는 방법을 포함한다.
R 0 또는 RG 결합의 측정
본 발명의 방법은 GPCR(예로, PTHR)의 RG 또는 R0 형태에 대한 후보 화합물의 결합을 측정하는 것과 관련이 있다. 따라서, 상기 분석의 판독정보는 상기 화합물의 수용체 각각의 형태에 대한 친화도를 구별할 수 있다. 하나의 가능한 접근법은 하나의 수용체 컨포메이션이 선호되는 시스템 또는 조건을 사용하는 것이다. 예를 들면 GPCR이 그의 G-단백질로부터 분리되도록 함으로써 또는 G-단백질을 결여한 시스템을 사용함으로써 R0가 선호될 수 있다. GPCR을 G-단백질로부터 분리하는 하나의 방법은 G-단백질의 GPCR에의 결합을 방해하는 화합물을 처리하는 것에 의해 달성 될 수 있다. 이러한 화합물을 예를 들면, GTPγS을 포함하는 비-가수분해성 뉴클레오타이드 유사체와 같은 뉴클레오타이드 유사체가 있다. GTPγS는 G-단백질에 결합하지만, 이 화합물을 가수분해 하는 것은 불가능하기 때문에 G-단백질은 GPCR로 되돌아가 재활용 될 수 없다. 따라서, 후보 화합물을 첨가하기 전에 세포 또는 세포막을 GTPγS와 반응시키는 것에 의해, GPCR의 R0 상태가 크게 선호되는 시스템을 만드는 것이 가능하다.
GPCR의 RG 형태를 안정화하기 위하여, 음성-도미넌트 G-단백질을 사용할 수 있다. 이러한 단백질은 GPCR에 안정적으로 결합하기 때문에, 그 결과 RG 컨포메이션을 풍부하게 한다.
R0 및 RG 간 비율을 조절하는 또 다른 접근법을 예시하면, 하나 이상의 G-단백질 발현이 다운레귤레이션 또는 제거된 동물 세포를 사용하는 것이다. 유전적인 녹아웃 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 특정의 G-단백질을 목표로 하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들어, Dean et al., Mol . Endocrinol . 20:931-943 (2006) 참조). 다른 구현예에서, G-단백질 발현을 “녹아웃”시키고, 그 결과 수용체 R0상태가 선호되게 하기 위하여 RNAi 기술(예를 들면 세포에 siRNA를 투여)을 사용할 수 있다. 아니면, 적절한 G 단백질 또는 G-단백질을 세포 내에서 과다 발현시킴에 의해 RG 형태가 선호되게 하는 것도 가능하다.
어떠한 화합물이 R0 또는 RG 상태에 결합하는 능력을 측정하는 두 번째 접근법은, 특정 상태에 선택적인 것으로 알려진 리간드로 치환하는 것과 관련되어있다. PTH 수용체에 있어서, 종전의 연구는 125I-[Aib1 ,3,M]PTH(1-15)가 RG 상태에 선택적이라는 것을 밝혔다. 후보 화합물에 의한 상기 리간드의 치환을 측정함으로써, 심지어 분석 시 수용체가 RG 및 R0 둘 다의 상태로 존재하는 경우에도, 특정 상태에 대한 상기 화합물의 결합을 특이적으로 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 밝혀진 화합물들은 전형적으로 수용체의 RG 형태에, 장기-작용 또는 단기-활성 작동자에 대한 내성적 수용체 활성의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 50%, 100%, 500%, 1000%, 10,000%)의 활성으로 결합한다. 예를 들어, 인간 PTH는 인간 PTHR에 약 0.13 nmol의 EC50으로 결합한다. 따라서 바람직한 화합물은 전형적으로 hPTHR에 상기 친화도의 적어도 10%, 즉 적어도 1.3 nmol의 EC50으로 결합한다.
본 발명의 방법을 사용하여 밝혀진 리간드
여기서 기술한 스크리닝 방법을 사용하여, 본 발명자들은 어느 한쪽 분류 펩타이드(PTH/PTHrP 하이브리드)의 다양한 조합을 표현하면서, 예시적인 GPCR, 즉 PTH 수용체에 대한 다양한 리간드를 밝혀내었는데, 이는 그들의 상대적인 R0/RG 선택성에 기초하여 단기-작용 리간드 또는 장기-작용 리간드로서 선택되어진 것이다(도 26A 및 26B). 본 발명의 스크리닝 분석 결과에 기초하여, 리간드의 생물학적 활성 결정에 있어 R0/RG 선택성이 중요하다는 개념 증거(proof of concept)를 제시하기 위하여, 본 발명자들은 상기 펩타이드들의 인 비트로 및 인 비보 활성을 시험하였다.
상기 밝혀진 펩타이드는 PTH 수용체 및 다른 GPCR에 대하여, R0/RG 선택성이 인 비보에서 생물학적 활성을 결정한다는 개념 증거(proof of concept)를 제시한다. 상기 펩타이드는 5개의 다른 그룹을 포함한다. 첫 번째 그룹은 높은 R0 선택성 및 연장된 작용을 갖는 형태로 PTHrP을 변환한 유사체 Ile5-PTHrP에 의해 대표된다. 두 번째 그룹은 PTHrP(12-36)와 결합한 MPTH(1-11) 또는 PTHrP(15-36)와 결합한 MPTH(1-14)로 구성되는, 높은 R0/RG 선택성을 갖는 하이브리드 펩타이드를 포함한다. 상기 펩타이드들은 인 비보에서 매우 연장된 생물학적 활성을 갖는다. 세 번째 타입은 감소된 R0 친화성으로 인해 단기 작용 생물학적 활성을 나타내는 [His5,Arg19]PTH이다. 화합물의 네 번째 그룹은 Ala1,Aib3-M-PTH(1-28)에 의해 예시되는데, 이는 높은 포스페이트 보유와 관계되는 질병을 치료하기 위하여 요구되는 성질인 뇨 포스페이트 배출을 촉진하는 놀라운 활성뿐만 아니라, 강력한 R0-활성화 능력을 갖는다.
5번째 그룹은 훨씬 낮은 R0 친화도를 가지므로 골다공증 치료에 있어 보다 바람직한, Ala23-PTH에 의해 대표된다.
PTH 수용체 리간드로서, 본 발명자들은 다양한 R0 및 RG 결합 친화도 및 다양한 R0/RG 선택성을 갖는 리간드들을 밝혀내었다. R0 친화도에 따라 분류된 예시적인 펩타이드를 도 26B에 나타내었다. 수용체의 R0 형태에 대한 친화도는 적어도 2000, 1000, 750, 500, 250, 150, 100, 90, 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 0.2, 0.1, 또는 0.05 nmol일 수 있다. 수용체의 RG 형태에 대한 친화도는 적어도 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2.5, 2, 1.75, 1.5, 1.25, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025 nmol일 수 있다. R0/RG 선택성은 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 400, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 2000, 2500 또는 5000일 수 있다(여기에서 높은 값은 더 큰 RG-선택성을 의미한다). 본 발명의 리간드들은 여기에서 기술된 RG 또는 R0 친화도 중 어느 하나, 또는 그의 조합을 가질 수 있다.
RG and R 0 선택적 리간드
우리는 여기에서 기술된 스크리닝 방법을 이용하여 새로운 RG 선택적 및 R0 선택적 리간드를 개발했다. 하나의 구현예에서, 본 발명자들은 PTHrP(1-28)를 시작점으로 사용했는데, 이것은 PTHrP가 PTH에 비해 더 큰 선택성을 가지고 RG 수용체 컨포메이션에 결합되기 때문이다. 표 2는 특정 유사체의 인 비트로 활성을 요약하고 있다. 추가적인 유사체는 표 3에 표시하였다. 이러한 유사체와 관련한 더 상세한 정보는 하기 실시예 3에 나타내었다. 이러한 유사체, A(E)18, A22, (L25), K26-PTHrP(1-28) 또는 (1-30)은 일반적으로 cAMP 발생에 대해 향상된 효능을 보이고, PTHrP(1-36) 에 비해 상대적으로 높은 선택성을 가지고 RG 컨포메이션에 결합한다(표 2).
대표적 PTHrP 유사체의 인 비트로 활성
Analog SaOS cAMP
EC50 ( nM ) 		MC3T3 -E1 cAMP
EC50 ( nM ) 		RG binding affinity
hPTHR IC50 ( nM ) 		R 0 binding affinity
hPTHR IC50 ( nM ) 		R0 / RG
selectivity
PTHrP (1-36) 0.190 0.322 0.33
74.8 229
PTHrP (1-28) 20.3 4.09 0.66 20449 31069
A18,22, K26 - PTHrP (1-28) 0.024 0.091 0.10 1815 18079
E18 ,A22, K26 - PTHrP (1-28) 0.241 0.251 0.24 9237 38327
A18,22, L25 , K26 - PTHrP (1-28) 0.002 0.054 0.04 310 6971
E18 ,A22, L25 , K26 - PTHrP (1-28) 0.010 0.083 0.10 1741 18317
A18,22, L25 , K26 - PTHrP (1-30) 0.008 0.067 0.05 144 3025
E18 ,A22, L25 , K26 - PTHrP (1-30) 0.063 0.059 0.08 945 11169
추가적인 펩타이드와 그러한 펩타이드에 관한 결합/활성 데이터는 하기 표 3에 나타내었다.
PTHrP 유사체의 결합/활성
screen 　 　 dose -
response 		　 　 　 　
Sequence (parent shown in bold) cAMP (% parent)1 human PIR RG (% parent)2 human PIR R0 (% parent)2 cAMP in SaOS (EC50, nM) cAMP in MC3T3-E1 (EC50, nM) human PIR RG (IC50 nM) human PIR R0 (IC50 nM) rat PIR RG (IC50 nM) rat PIR R0 (IC50 nM)
PTHrP (1-28)NH
A18-PTHrP(1-28)NH 164 　 　 　 　 　 　 　 　
S18-PTHrP(1-28)NH 121 　 　 　
M18-PTHrP(1-28)NH 113 　 　 　
F18-PTHrP(1-28)NH 109 　 　 　
E18-PTHrP(1-28)NH 140 　 　 　
A22-PTHrP(1-28)NH 185 　 　 　
S22-PTHrP(1-28)NH 141 　 　 　
L22-PTHrP(1-28)NH 142 　 　 　
N22-PTHrP(1-28)NH 138 　 　 　
W22-PTHrP(1-28)NH 129 　 　 　
E22-PTHrP(1-28)NH 121 　 　 　
K22-PTHrP(1-28)NH 150 　 　 　
A26-PTHrP(1-28)NH 142 　 　 　
S26-PTHrP(1-28)NH 107 　 　 　
N26-PTHrP(1-28)NH 113 　 　 　
K26-PTHrP(1-28)NH 142 　 　 　
R26-PTHrP(1-28)NH 143 　 　 　
L25-PTHrP(1-28)NH 325 　 　 　
W25-PTHrP(1-28)NH 270 　 　 　
K25-PTHrP(1-28)NH 163 　 　 　
R25-PTHrP(1-28)NH 204 　 　 　
A18,22,26-PTHrP(1-28)NH 343 167 160 　 　
A18,22,K26-PTHrP(1-28)NH 405 193 178 0.024 0.091 0.10 1815 　
A18,26,S22-PTHrP(1-28)NH 229 148 133 　 　
A18,S22,K26-PTHrP(1-28)NH 372 175 155 0.038 　
A18,26,N22-PTHrP(1-28)NH 265 161 136 　 　
A18,N22,K26-PTHrP(1-28)NH 326 172 139 　 　
A18,26,L22-PTHrP(1-28)NH 252 163 133 　 　
A18,L22,K26-PTHrP(1-28)NH 350 177 160 　 　
A18,26,W22-PTHrP(1-28)NH 188 120 126 　 　
A18,W22,K26-PTHrP(1-28)NH 267 115 136 　 　
E18,A22,K26-PTHrP(1-28)NH 301 145 68.8 0.241 0.251 0.24 9237 　
E18,S22,A26-PTHrP(1-28)NH 119 132 31.9 　 　
E18,N22,A26-PTHrP(1-28)NH 171 140 53.7 　 　
E18,N22,K26-PTHrP(1-28)NH 236 147 84.4 　 　
E18,L22,A26-PTHrP(1-28)NH 139 125 52.5 　 　
E18,L22,K26-PTHrP(1-28)NH 264 152 64.4 　 　
E18,W22,A26-PTHrP(1-28)NH 75 116 18.8 　 　
E18,W22,K26-PTHrP(1-28)NH 165 149 46.6 　 　
E18,K22,A26-PTHrP(1-28)NH 315 192 106.1 　 　
E18,K22,26-PTHrP(1-28)NH 374 208 119.8 　 　
E18,A22,26-PTHrP(1-28)NH 190 　 　 　
A18,22,L25,K26-PTHrP(1-28)NH 305 　 0.002 0.054 0.04 310 0.16 34.9
A18,22,K25,26-PTHrP(1-28)NH 349 　 0.012 　
A18,22,I25,K26-PTHrP(1-28)NH 342 　 　 　
A18,22,W25,K26-PTHrP(1-28)NH 329 　 　 　
A18,22,F25,K26-PTHrP(1-28)NH 337 　 　 　
A18,S22,L25,K26-PTHrP(1-28)NH 367 　 0.009 0.10 540 　
A18,S22,K25,26-PTHrP(1-28)NH 316 　 0.015 　
E18,A22,L25,K26-PTHrP(1-28)NH 340 　 0.010 0.10 1741 　
E18,A22,K25,26-PTHrP(1-28)NH 323 　 0.054 　
E18,S22,L25,K26-PTHrP(1-28)NH 337 　 0.055 0.11 2056 　
E18,S22,K25,26-PTHrP(1-28)NH 335 　 　 　
PTHrP (1-30)NH 　 　 　 　
A18,22,K26-PTHrP(1-30)NH 　 　 　 0.058 　
E18,A22,K27-PTHrP(1-30)NH 　 　 　 0.082 　
A18,22,L25,K26-PTHrP(1-30)NH 　 　 　 0.067 0.05 144 0.13 11.1
E18,A22,L25,K26-PTHrP(1-30)NH 　 　 　 0.059 0.08 945 0.21 76.3
　 　 　 　
PTHrP (1-31)NH
A18,22,K26-PTHrP(1-31)NH 　 　 　 0.060 　
E18,A22,K27-PTHrP(1-31)NH 　 　 　 0.060 0.23 54.8
A18,22,L25,K26-PTHrP(1-31)NH 　 　 　 0.20 　
E18,A22,L25,K26-PTHrP(1-31)NH 　 　 　 0.112 　
　 　 　 　
E18 ,A22, L25 , K26 - PTHrP (1-31)OH 100 　 　 0.78 　
E18,A22,L25,K26,G29-PTHrP(1-31)OH 206 　 　 　
E18,A22,L25,K26,S29-PTHrP(1-31)OH 209 　 　 0.41 　
E18,A22,L25,K26,N29-PTHrP(1-31)OH 210 　 　 　
E18,A22,L25,K26,Q29-PTHrP(1-31)OH 226 　 　 0.59 　
E18,A22,L25,K26,W29-PTHrP(1-31)OH 142 　 　 　
E18,A22,L25,K26,E29-PTHrP(1-31)OH 100 　 　 　
E18,A22,L25,K26,K29-PTHrP(1-31)OH 227 　 　 0.28 　
E18,A22,L25,K26,G30-PTHrP(1-31)OH 286 　 　 　
E18,A22,L25,K26,S30-PTHrP(1-31)OH 331 　 　 0.12 　
E18,A22,L25,K26,L30-PTHrP(1-31)OH 185 　 　 　
E18,A22,L25,K26,N30-PTHrP(1-31)OH 189 　 　 　
E18,A22,L25,K26,D30-PTHrP(1-31)OH 251 　 　 0.32 　
E18,A22,L25,K26,K30-PTHrP(1-31)OH 245 　 　 0.20 　
E18,A22,L25,K26,S31-PTHrP(1-31)OH 99 　 　 　
E18,A22,L25,K26,L31-PTHrP(1-31)OH 198 　 　 0.25 　
E18,A22,L25,K26,V31-PTHrP(1-31)OH 181 　 　 　
E18,A22,L25,K26,K31-PTHrP(1-31)OH 134 　 　 　
　 　 　 　
E18 ,A22, L25 , K26 - PTHrP (1-34)OH 100 　 　 0.45 　
E18,A22,L25,K26,A30-PTHrP(1-34)OH 237 　 　 0.14 　
E18,A22,L25,K26,A31-PTHrP(1-34)OH 249 　 　 0.15 　
E18,A22,L25,K26,A32-PTHrP(1-34)OH 197 　 　 　
E18,A22,L25,K26,A33-PTHrP(1-34)OH 196 　 　 　
E18,A22,L25,K26,Q29,D30,V31, N33,F34-PTHrP(1-34)OH　 204 　 　 　 0.56 　 　 　 　
우리는 또한 펩타이드 A20, Mc-PTH(1-34)OH, F23, Mc-PTH(1-34)OH, [A1,A3,A23,Q10,R11]-PTH(1-34)OH, [A1,A3,A23]-PTH(1-34)OH, 그리고 E18,A22,L25,K26-PTHrP(1-30)를 제조하였다. 이러한 펩타이드의 인간 PTH1 수용체에 대한 R0 및 RG 결합은 하기 표 4에 나타내었다.
예시적 펩타이드의 RG 및 R0 결합
Peptide R0 binding IC50 (nM) RG binding IC50 (nM) R0/RG ratio
hPTH(1-34) 8.7 ±1.2 0.13 ±0.02 67
hPTHrP(1-36) 37.7 ±4.7 0.14 ±0.02 260
A20,Mc-PTH(1-34)OH 31.9 ±10.5 0.40 ±0.09 80
F23,Mc-PTH(1-34)OH 1.2 ±0.4 0.23 ±0.07 5
[A1,3,23,Q10,R11]-PTH(1-34)OH 197 ±33 0.14 ±0.00 1407
[A1,3,23]-PTH(1-34)OH 1845 ±170 0.43 ±0.09 4291
E18,A22,L25,K26-PTHrP(1-30) 945.0 ±　 0.08 ±　 11813
Mc=A1,3,12,Q10,R11,W14,R19
폴리펩타이드 변형
여기에서 기술한 폴리펩타이드는 N-말단 또는 C-말단 변형과 같은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 아세틸레이션, 아크릴레이션, ADP-리보실레이션, 아미데이션, 플라빈 공유 부착, 헴 모이어티 공유 부착, 뉴클리오타이드 또는 뉴클리오타이드 유도체 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체 공유 부착, 포스포티딜이노시톨 공유 부착, 교차결합, 고리화, 디설파이드 본드 형성, 디메틸레이션, 교차 공유결합 형성, 시스틴 형성, 피로글루타메이트 형성, 포밀레이션, 감마-카복실레이션, 글리코실레이션, GPI 앵커 형성, 하이드록실레이션, 아이오디네이션, 메틸레이션, 미리스토일레이션, 산화, 프로테오리틱 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닌화 및 유비퀴틴화와 같은 트랜스퍼-RNA에 의해 매개되는 단백질에의 아미노산 추가를 포함한다(예를 들어, 다음 문헌 참조: Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al, Methods Enzymol 182:626 646 (1990) and Rattan et al, Ann NY Acad Sci 663Α& 62 (1992)).
본 발명의 어떠한 폴리펩타이드도 추가적으로 비상동성 서열(퓨젼 파트너)을 포함할 수 있고, 따라서 융합 단백질을 형성한다. 융합 단백질은 정제 또는 탐지 태그(예를 들면, 녹색 형광 단백질, 헤마글루티닌 또는 알칼린 포스파타제와 같이 직간접적으로 탐지될 수 있는 단백질), DNA 결합 도메인(예를 들면, GAL4 또는 LexA), 유전자 활성 도메인(예를 들면, GAL4 또는 VP16), 정제 태그 또는 분비 신호 펩타이드(예를 들면, 프리프로트립신 신호 서열)과 같은 퓨전 파트너를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 퓨전 파트너는 c-myc, 폴리 히스티딘 또는 FLAG와 같은 태그일 수 있다. 각각의 퓨전 파트너는 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있는데, 예를 들면 프리프로트립신 신호 서열과 FLAG 태그가 있다. 다른 사례에서 퓨전파트너는 Fc 단백질(예를 들면, 마우스 Fc 또는 인간 Fc)이다.
질병 치료의 방법
PTH 기능장애 또는 칼슘 혹은 인산 뷸균형으로 인한 어떠한 질병도 여기에서 기술된 펩타이드 중 하나에 의해서 치료될 수 있는데, 이러한 펩타이드는 도 26A 및 26B, 표 1에 표현된 것 또는 본 발명의 방법을 사용하여 밝혀진 것을 포함한다. 상기 펩타이드는 골다공증, 골절 교정, 골연화증, 관절염, 혈소판 감소증, 부갑상선 기능 저하증 또는 과다인산혈증 치료에 사용할 수 있고 대상체의 줄기 세포 유동성을 증가시키는 데 사용할 수 있다. 어떠한 투여 방법(예를 들면 경구, 정맥 내부, 근육 내부, 눈, 국부, 피부, 피하 그리고 직장을 통한 방법)도 본 발명의 치료법에 이용할 수 있다. 의사가 치료 대상 환자에게 적절한 투여방법을 결정할 것인데, 이는 환자의 체격, 질병 또는 상태의 심각성, 개별적인 질병 또는 치료되어야 하는 상태에 부분적으로 의존할 것이다.
약제학적 조성물의 조제
여기에서 기술된(예로, PTH-유래 펩타이드) 또는 본 발명의 방법을 사용하여 확인된 어떠한 화합물의 투여는, 대상 질병상태를 치료하는 화합물의 농축을 일으키는 어떠한 적합한 수단에 의할 수 있다. 상기 화합물은 적합한 담체 속에 적합한 양으로서 포함될 수 있고 일반적으로 조성물 전체무게의 1-95%로 존재한다. 상기 조성물은 구강, 비경구(예를 들어 정맥 또는 근육 안으로), 직장, 피부상, 코, 질, 흡입, 피부(패치), 눈 또는 두개골 속 투여 경로에 적합한 투여 형태로서 공급되어질 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 예를 들어 정제, 앰퓰, 캡슐, 필, 파우더, 그래뉼, 현탁제, 유제, 용액, 하이드로젤, 페이스트, 연고, 크림, 플라스터, 드렌취, 삼투성의 전달 디바이스, 좌약, 관장제, 주사약, 임플란트, 스프레이 또는 에어로졸을 포함하는 젤 형태일 수 있다. 약제학적 조성물은 전통적인 약제학적 방법(예를 들어 다음 문헌 참조, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000, ed. A.R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrickand J.C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York)에 따라 조제될 수 있다.
약제학적 조성물은 유효 화합물 투여 즉시 또는 투여 후 미리 결정된 시간 또는 시간 간격 후 방출되도록 조제될 수 있다. 조성물의 후자 형태는 일반적으로 서방성 방출 제제(controlled release formulation)로 알려져 있는데, 이는 (i) 체내에서 연장된 시간 동안 본 발명의 약제를 실질적으로 일정한 농도로 발생시키는 제제, (ii) 미리 결정된 지연 시간(lag time) 후 체내에서 연장된 시간 동안 본 발명의 약제를 실질적으로 일정한 농도로 발생시키는 제제, (iii) 약제 플라즈마 수준의 변동과 연관된 부작용을 최소화하면서 체내에서 상대적으로 일정하고 효과적인 약제의 수준을 유지시킴으로써 미리 결정된 시간 동안 약제활성을 유지시키는 조제(톱니 운동 패턴), (iv) 약제의 작용을 국부화 하는 제제(예컨대, 병든 조직 또는 기관 내 또는 그에 인접한 서방성 방출 조성물을 공간적 배치), (v) 투여의 편이성을 획득한 제제(예컨대, 일주일 또는 2주일에 한번 조성물을 투여함), 그리고 (vi) 특정 타겟 세포 타입에 화합물을 전달하기 위해 담체 또는 화학적 유도체를 사용함으로써 약제 활성의 표적을 정하는 제제를 포함한다. 서방성 방출 제제(controlled release formulation) 형태 화합물의 투여는, 위장관에서 협소한 흡수 창 또는 상대적으로 짧은 생물학적 반감기를 가지는 화합물에 대해 특히 선호된다.
방출 속도가 당해 화합물이 대사되는 속도를 넘어서는 서방성 방출을 획득하기 위하여, 수많은 방법 중 어떠한 것이라도 추구될 수 있다. 하나의 구현예에서, 서방성 방출은 예를 들어, 다양한 형태의 서방성 방출 조성물과 코팅을 포함하는 다양한 제제 파라미터와 성분의 적절한 선택에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 화합물은 적절한 부형제와 함께, 투여시 화합물을 서방성 방식으로 방출하는 약제학적 조성물로 조제된다. 예로서는 단일 또는 다중 유닛의 정제 또는 캡슐 조성물, 오일 솔루션, 현탁제, 유제, 마이크로캡슐, 분자 복합체, 마이크로스피어, 나노입자, 패치 그리고 리포솜을 들 수 있다.
비경구적인 조성물
여기에서 기술되거나 본 발명의 방법을 사용하여 확인된 화합물을 포함하는 조성물은 투여 형태, 처방에 있어서 주사, 주입, 이식(피하의, 정맥내의, 근육내의, 복막내의, 또는 동류)에 의해, 또는 약제학적으로 허용 가능한 전통적 비독성의 담체 및 보조제를 포함하는 적절한 운반 장치 또는 임플란트를 통하여 비경구적으로 투여 될 수 있다. 그러한 조성물의 조제와 준비는 약제학적 조제의 분야에서 숙련된 자들에게 잘 알려져 있다.
비경구적 사용을 위한 조성물은 유닛 투여 형태(예로, 단일-투여 앰플)또는 수회 투여 분을 포함한 약병으로 제공될 수 있고, 그 안에는 적절한 보존제를 추가할 수 있다(하기 참조). 조성은 솔루션, 현탁제, 유제, 주입장치, 혹은 이식을 위한 운반 장치 형태일 수 있고 또는 그것은 사용 전에 물 또는 다른 매체에 의해 재구성되는 건조 분말 형태로 제공될 수 있다. 유효성분은 별론으로 하고, 상기 조성물은 비경구적으로 적합하고 허용 가능한 담체 및/또는 결합제를 포함할 수 있다. 유효성분은 서방성 방출을 위하여, 마이크로스피어, 마이크로캡슐, 나노입자, 리포솜 등에 병합될 수 있다. 게다가, 상기 조성물은 현탁제, 가용화제, 안정화제, pH-조절제, 독성 조절제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다.
상기에서 기술된 바에 따라, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 무균 주입을 위한 적합한 형태일 수 있다. 그와 같은 조성물을 제조하기 위해, 적절한 유효성분을 비경구적으로 허용 가능한 액상 매체에 용해 또는 현탁시킨다. 허용가능한 매체 및 용매 중에서 채택 가능한 것으로는 물, 또한 적합한 양의 염화수소 산, 수산화 나트륨, 적정 완화물 추가에 의해 적정 pH로 조정된 물, 1,3-부탄디올, 링거의 솔루션, 덱스트로스 솔루션 및 등장의 염화나트륨 용액이 있다. 상기 수용성 제제는 또한 하나 이상의 보존제(예를 들면 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시 벤조에이트)를 포함할 수 있다. 화합물 중 하나가 단지 약간만 물에 용해 가능한 경우에 대비하여, 용해 증진제 또는 가용화제가 첨가하거나, 용매에 10-60% w/w의 프로필렌글리콜 등을 첨가할 수 있다.
하기의 실시예는 발명을 한정하기 보다는 설명하기 위한 것이다.
실시예 1
단기-활성 및 장기-작용의 PTH 펩타이드의 동정
경쟁 결합 분석법( competitive binding assay )을 이용한 리간드의 특성분석. PTHR 리간드를 동정하기 위해, PTH 및 PTHrP 방사선표지 리간드 유사체와 HKRK-B7 세포로부터 분리된 세포막에서 발현되는 인간 PTHR 사이에 형성된 복합체의 안정성을 실험하기 위하여, 속도론적 해리 실험을 수행하였다. 각각의 방사선표지 리간드에 대하여, 해리실험을 GTPγS의 존재 또는 부존재하에서 실시하여, 헤테로트라이머 G-단백질로부터 수용체가 기능적으로 언커플링 되는 효과를 평가하였다(도 1A-1C). 125I-PTH(1-34) 및 125I-PTHrP(1-36)의 경우(각각 도 1A 및 1B), GTPγS의 존재 및 부존재(각각 솔리드 기호 및 오픈 기호)의 모든 경우에, 해리 데이터는 단일-상 식 보다는 2-상 식 붕괴 식에 의해 보다 더 나타났다. 125I-PTH(1-34) 및 GTPγS의 부존재 조건의 경우, 17%의 복합체가 불안정하여 빠르게(t1 /2<1 min) 붕괴된 반면, 나머지 83%는 안정하여 천천히(t1 /2 ~ 4 h) 붕괴되었다. 여기에 GTPγS를 첨가하자, 불안정한 성분이 21%로 증가하였고, 나머지 77%는 안정한 상태(t1 /2 ~ 2 h)로 남아있었다(도 1A). 125I-PTH(1-34)에 대한 이와 같은 발견은 방사선 표지 리간드에 대해 수행되어진 과거의 해리 연구결과와도 일치하는 것이며, PTH(1-34)이 G-단백질 미결합 PTHR 형태(R0)에 높은 친화도로 결합할 수 있다는 것을 잘 보여주는 것이다(Shimizu et al., J. Biol . Chem. 280:1797-807 (2005); Dean et al., Mol . Endocrinol . 20:931-43 (2006)). 125I-PTHrP(1-36) 및 PTHR가 결합한 복합체의 경우, GTPγS 부재시 대부분 안정하였다(t1 /2~3 h의 반감기를 가지고 68%가 붕괴됨). 반면 GTPγS를 첨가하자 대부분의 복합체가 불안정해졌다(t1 /2~1분의 반감기를 가지고 72%가 붕괴됨, 도 1B). GTPγS 첨가에 의해 PTHR로부터 125I-PTHrP(1-36)가 신속히 해리되는 것은 예전에 관찰되었던 125I-[Aib1 ,3,M]PTH(1-15)를 반영한다(Dean et al., Mol . Endocrinol . 20:931-43 (2006)). 즉 이러한 각각의 방사선 표지 리간드들은 G-단백질 결합 PTHR 형태(RG)에 우세하게 결합한다는 것을 보여주는 것이다.
이어, 상기 두 리간드의 해리 실험에서 나타난 기능적 차이를 뒷받침하는 PTH(1-34)와 PTHrP(1-36) 간 구조적 차이를 규명하였다. PTH와 PTHrP의 위치 5에서의 분기 잔기(각각 Ile 및 His)는, 이들 리간드가 수용체에 결합하는 친화성(Shimizu et al., J. Biol . Chem . 280:1797-807 (2005); Gardella et al., J. Biol . Chem . 270:6584-6588 (1995)) 및 서브타입 선택성(Gardella et al., J. Biol. Chem . 271:19888-19893 (1996); Behar et al., Endocrinology 137:4217-4224 (1996))을 결정하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 왔다. 다시, GTPγS의 존재 및 부존재 하에서, 125I-Ile5-PTHrP(1-36)의 수용체-해리 특성을 분석하였다. 그 결과 이와 같은 방사능 표지 리간드는 GTPγS의 존재 및 부존재 모든 경우에 있어서 단일-상의 동태(t1 /2 > 2 h; 그림 1C)를 나타내었다. 즉, His5 Ile 치환은, G-단백질이 결합한 상태, 특히 G-단백질이 결합하지 않은 상태에서 PTHrP이 PTHR에 결합하는 안정성을 크게 향상시킨다.
평형결합에 있어서 GTP γS의 영향. 대략-평형 조건 하에서, PTHR에 대한 상기 방사능 표지 리간드의 결합에 대한 GTPγS의 영향을, 세포막을 다양한 농도의 GTPγS 존재 및 부존재 조건하에서 90분 동안 반응시켜 평가하였다. 125I-PTH(1-34) 및 125I-Ile5-PTHrP(1-36)의 경우 HKRK-B7 세포로부터 준비된 세포막에 대한 결합성은 GTPγS에 의해 거의 영향 받지 않은 반면(1 x 10-4 M GTPγS의 농도에서 20% 미만으로 억제됨), 125I-PTHrP(1-36)는 GTPγS에 의해 매우 강하게 억제되었다(1 x 10-7 M GTPγS에서 ~70% 까지 억제됨; IC50 = 1 x 10-9 M; 도 2A). 래트 PTHR에 대한 결합을 측정하기 위하여, 내성적으로 래트 PTHR를 발현하는 래트 조골세포주 ROS17/2.8으로부터 준비한 세포막을 가지고 패러럴 연구를 수행하였다. HKRK-B7 세포막 에서의 인간 PTHR와 같이, 125I-Ile5-PTHrP(1-36)의 래트 PTHR에 대한 결합은 GTPγS에 대하여 매우 둔감하였다(도 2B). 비록 결합의 대부분이 상기 뉴클레오타이드 유사체에 대하여 내성을 나타내었지만, 125I-PTH(1-34)의 래트 PTHR에 대한 결합은 인간 PTHR에 대한 결합에 비하면 더 GTPγS에 민감하였다(도 2A vs. 도 2B). 인간 PTHR에 대해서와 같이, GTPγS는 125I-PTHrP(1-36)이 래트 PTHR에 결합하는 것을 강하게 방해하였는데, 이는125I-[Aib1 ,3,M]PTH(1-15)의 결합이 상기 뉴클레오타이드 유사체에 민감한 것과 같은 정도로 민감하였다(도 2B). 즉, PTH(1-34)와 Ile5-PTHrP(1-36)는 PTHrP(1-36) 및 [Aib1 ,3,M]PTH(1-15)보다 PTHR의 G 단백질 미결합 형태(R0)에 보다 더 강하게 결합한다. 반면, 후자의 두 펩타이드는 G 단백질 결합 형태(RG)에 선호적으로 결합한다.
경쟁 방법을 이용하여 PTH 및 PTHrP 리간드의 PTHR 수용체 RG 및 R0 형태에 대한 결합의 상대적인 친화도를 분석하였다. RG에 대한 결합을 평가하기 위하여, 125I-[Aib1 ,3,M]PTH(1-15)를 방사능 표지 리간드 추적자로 사용하였는데, 이는 상기 펩타이드가 RG에 우세하게 결합하기 때문이다. R 및 R0와 관련된, RG를 인리치먼트 하는 hPTHR 및 음성-도미넌트 Gαs 서브유니트(GαsND)로 공동-형질전환된 COS-7 세포로부터 세포막을 종전에 발표된 내용에 따라 준비하였다(Dean et al., Mol . Endocrinol . 20:931-943 (2006); Berlot, C.H., J. Biol . Chem . 277:21080-21085 (2002); Dean et al., J. Biol . Chem . 281:32485-32495(2006)). RG에 대한 결합을 평가하기 위하여 125I-PTH(1-34)를 방사능 리간드로 사용하였다(R0에 우세하게 결합함). hPTHR 만으로 형질전환된 COS-7 세포로부터 세포막을 준비하였다. 수용체-헤테로트라이머 G 단백질 복합체를 기능적으로 언커플링시켜 RG 형태보다 R0 (및 R) 형태를 풍부하게 하기 위하여, GTPγS (1 x 10-5)를 결합반응에 첨가하였다. 그 다음, 표지되지 않은 PTH 및 PTHrP 리간드의 상대적인 겉보기 친화도를 상기 두 가지 분석과 비교하여 각각의 리간드가 PTHR의 R0 및 RG 형태에 결합하는 선택성을 분석하였다.
PTH(1-34)는 RG 형태와 비교하여 R0에 5배 약하게 결합하였다(IC50= 4.2 nM vs. 0.86 nM, P = 0.0002; 도 3A, 표 5). PTHrP(1-36)는 RG 형태와 비교하여 R0에 66배 약하게 결합하여 훨씬 큰 선택성을 나타내었다(P = 0.04; 도 3B; 표 5). 즉, PTHrP(1-36)의 RG에 대한 (R0 대비) 선택성은 PTH(1-34)보다 13배 컸다. 이들 펩타이드 5번째 잔기의 상호 교환은, 상기 컨포메이션 선택성에 대한 패턴을 반대로 하였다. 즉, His5-PTH(1-34)는 RG와 비교하여 R0와 750배 약한 친화도로 결합하였고, Ile5-PTHrP(1-36)는 RG와 비교하여 R0와 단지 3배 약한 친화도로 결합하였다( P < 0.002; 도 3C 및 3D; 표 5).
Figure 112010002579525-pct00002
사람 PTH 수용체의 RG 및 R0 형태에 대한 경쟁 결합 (상기 표 5)
또한, Ile5->His 치환은 인간-PTH(1-34) 및 래트-PTH(1-34) 펩타이드에 있어서 RG에 대한 친화도에 큰 영향을 주지 않고 R0에 대한 친화도를 크게 감소시켰는데, 이들 펩타이드는 대조군 PTH(1-34) 유사체에 있는 메티오닌8 ,21->노어루이신 및 Phe34 Tyr34 치환을 가지지 않은 것이다(도 6A, 6B, 6D 및 6E, 그리고 표 4). 따라서, PTH(1-34)는 PTHrP(1-36)보다 R0에 높은 친화력으로 결합하는 반면, PTH(1-34)와 PTHrP(1-36) 둘다 PTHR의 RG 형태에는 높은 친화력으로 결합한다. 리간드의 5번째 잔기는 R0 대 RG 형태에 대한 결합능력을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 그 뿐만 아니라, R0에는 약하게 결합하고, RG에는 강한 친화력을 유지하는 [Aib1 ,3,M]PTH(1-15)에 의해 알 수 있듯이, PTH(1-34)의 15번 위치의 잔기 카르복실-말단은 리간드의 R0에 대한 결합능력에 기여한다(도 6C 및 표 4).
PTHR 활성의 직접적인 기록. PTHR에 대한 리간드의 결합 및 PTHR 수용체 활성에 대하여, 온전한 세포내에서 실시간으로 분석하기 위해 형광 공명 에너지 전달(fluorescent resonance energy transfer: FRET) 방법이 최근에 사용되어 왔다. 따라서, PTH 및 PTHrP 리간드가 PTHR과 상호작용하는 시간 과정을 비교하는 독립적인 수단으로서 상기 방법을 사용하였다. 사용된 방법은 인간 PTHR 컨스트럭트, PTHR-CFPIC3/YFPCT (이전에 PTHR-캠이라 칭함)에서 발생하는 분자내 FRET 신호를 이용한다. 이 컨스트럭트는 3번째 세포내 루프에 시안-형광 단백질(cyan-fluorescent protein: CFP)과 카복실 말단 테일에 황색-형광 단백질(yellow-fluorescent protein: YFP)을 포함한다. FRET 신호는 기저 상태에서 PTHR-CFPIC3/YFPCT에 의해 생산되고, 이 신호는 작동자(agonist)의 결합에 의해 감소하며, 이는 활성화에 의해 발생하는 컨포메이션의 변화 때문일 것이다.
hPTH(1-34)는 PTHR-CFPIC3/YFPCT를 발현하는 세포에 의해 발생하는 FRET 신호를 신속하게(t1 /2= 0.7 sec) 감소시킨다(~13%)(도 4A). FRET 신호는 리간드-포함 버퍼를 리간드-불포함 버퍼로 교환한 후 적어도 60초 동안 뿐만 아니라, 리간드를 적용한 15초 동안 억제된 채로 유지된다(리간드 적용 시점은 도 4A-4C의 그래프상에 흑색 수평선으로 표시하였다). hPTH(1-34)에 의해 얻어진 상기 FRET 반응 그래프는 기존 FRET 연구에서 이 리간드에 대해 관찰된 그래프와 동일하다(Vilardaga et al., Nat . Biotechnol. 21:807-812 (2003)). 아미노-말단 펩타이드인 [Aib1 ,3,M]PTH(1-14)는 hPTH(1-34)에 비하여, 약간 빠른 반응속도(t1 /2 = 0.5 sec)와 더 적은 양(~5 %)으로 FRET 반응을 유도하였다(도 4B). 게다가, [Aib1 ,3,M]PTH(1-15)에 의해 유도되는 FRET 반응은 리간드-불포함 버퍼로 교환하자마자 붕괴되기 시작하였다(도 4B).
PTHrP(1-36)은 상대적으로 느린(t1 /2 = ~2 내지 5 초) FRET 반응을 유도하였고 상기 신호는 리간드-불포함 버퍼로 교환하자마자 붕괴되기 시작하였다(도 4C). Ile5-치환 리간드인 Ile5-PTHrP(1-36)는 반응이 빠르고(t1 /2= 0.5 - 0.7 sec) 리간드 제거 후에도 안정하다는 점에서, PTH(1-34)에 의해 유도되는 것과 매우 유사한 FRET 신호를 유도하였다(도 4D). 광학적 접근법에 의해 파생된 이러한 반응속도론적 데이터는 PTH(1-34) 및 PTHrP(1-36)이 PTHR의 특정 컨포메이션에 우세하게 결합함을 나타내는 것으로서, 상기 결합 방사능 리간드 해리 분석에서 얻은 데이터와도 충분히 일치한다. 또한 상기 데이터는 상기 컨포메이션 선택성에 리간드의 5번째 잔기가 중요한 역할을 함을 확인해준다.
HKRK -B7 세포에서 cAMP 의 측정. LR0가 LRG 복합체로 이성화 될 수 있음을 고려할 때, 리간드의 R0에 대한 안정된 결합이 갖는 잠재적 결론은, R0를 덜 안정시키는 리간드와 비교할 때, 상기 리간드에 의해 유도되는 신호 반응의 연장이다. 이러한 가능성을 시험하기 위하여, PTHR-발현 세포에서 PTH 및 PTHrP 리간드가 지속적인 cAMP 반응을 일으킬 수 있는 능력을 측정하였다. 즉 세포를 10분 동안 리간드로 처리하고, 결합하지 않은 리간드를 제거하기 위해 세척하였다. 세척 후 다양한 시점에서, IBMX를 5분간 적용하고, 유도된 세포내 cAMP를 측정하였다. 이러한 접근법을 사용하면, 마지막 5분 간 IBMX 반응 단계에서 생성된 cAMP만이 측정가능하다. 도 5A의 실험은 HKRK-B7 세포내에서 PTHrP(1-36) 및 Ile5-PTHrP(1-36)에 의해 유도되는 cAMP 반응의 시간 과정을 비교한다. 세척 단계 직후에 각각의 리간드에 의해 처리된 세포는, 거의 같은 양의 cAMP를 생성하였는데, 그것은 미처리 세포 기저 수준 cAMP의 100배에 해당한다. 세척 후 2시간 후에 Ile5-PTHrP(1-36)로 처리된 세포는 세척 직후 능력의 50%에 달하는 cAMP 신호 능력을 유지하였다(도 5A). 반면에, 2시간 뒤에 PTHrP(1-36)로 처리된 세포는 초기 반응의 19%를 보여, 2시간 뒤 시점에서 Ile5-PTHrP(1-36)에 대하여 관찰되었던 반응보다 65%가 적었다( P ≤ 0.003). PTH(1-34)는 각각의 시점에서 Ile5-PTHrP(1-36)에 의해 생산된 반응과 거의 동일한 반응을 생산하였다( P => 0.05, 데이터는 표시하지 않음). 즉, PTH(1-34) 및 Ile5-PTHrP(1-36)에 의해 유도된 신호 반응은 PTHrP(1-36)에 의해 유도된 것 보다 2배 천천히 붕괴되었다(t1 /2= ~ 2 h vs. ~1 h). PTH 및 PTHrP 유사체의 지속적인 cAMP 신호 능력 지속시간에 대한 이러한 차이점은, GTPγS 존재 하 대응하는 방사능 리간드가 PTHR로부터 해리되는 속도의 차이와 일치한다 (도 1A-1C).
HKRK -B64 세포 내 cAMP 측정. 지속적인 (또는 지연된) cAMP 신호 반응을 발생시키는 리간드의 능력을, HKRK-B7 보다 더 생리학적 수준으로 hPTHR를 발현(90,000/cell vs. 950,000/cell)하는 HKRK-B64 세포에서도 측정하였다. 시간 과정 실험은, 리간드-유도 신호 반응 지속기간의 차이가 리간드 세척 후 60분이 된 세포에서 가장 잘 분별된다는 사실을 보여줬다(데이터는 없음). 이 실험에서 최대 반응은, 세포를 리간드 및 IBMX와 함께 부수적으로 10분 동안 반응시킴으로써 각각의 펩타이드에 대해 측정하였다(세척단계 없음). 리간드 세척 60분 시점에서 관찰된 cAMP 반응은 상응하는 최대 반응의 백분위 수로서 표현하였다. HKRK-B7 세포에서처럼, PTH(1-34) 및 Ile5-PTHrP(1-36)는 세척 후 60분 시점에서, 각각 대응하는 HKRK-B64세포 내 최대 반응의 47% 및 40%에 해당하는 cAMP반응을 유도하였다(도 5B). His5-PTH(1-34) 유사체 및 PTHrP(1-36)는 60분 시점에서 그들의 최대 반응의 34% 및 19%에 해당하는 반응을 유도하였다. 2시간 시점에서 [Aib1,3,M]PTH(1-15)에 의해 유도된 반응은 그것의 최대 반응의 23%였고, 즉 이는 PTHrP(1-36)에 의한 것과 비교될 수 있다(P = 0.7). 급 양-반응 신호 분석법(acute dose-response signaling assays)에 따라 분석했을 때, 동일한 또는 비교 가능한 활성을 나타내는 다른 PTH 및 PTHrP 유사체들은 세포내에서, 양적으로 다른 축적된 신호반응을 유발할 수 있는데, 이는 주로 리간드의 수용체와 안정한 복합체를 형성할 수 있는 능력에서 기인한다(도 7; 표 6).
Figure 112010002579525-pct00003
PTH 및 PTHrP의 cAMP 및 IP 신호 특성 (상기 표 6)
a 데이터는 4개 실험의 평균(±s.e.m.)임; b 기저 캠프(공제되지 않은)는 5.2±0.9 피코몰/웰임:
c 데이터는 5개 실험의 평균(±s.e.m.)임; d 기저 값(공제되지 않은)는 330±8 cpm/웰임:
e P vs.[Nle8 ,21, Tyr34]rPTH(1-34)NH2= 0.02.
래트 조골세포에서의 cAMP 측정. 특정 리간드가 cAMP 신호 반응을 일으킬 수 있는 능력을 인 비트로에서 래트 조골세포를 사용하여 측정하였다(ROS17/2.8 세포주; 도 8). ROS 17/2.8 세포는 상온 및 IBMX 존재 하에서 10분 동안 hPTH(1-28)NH2; Ala1,12, Aib3, Gln10, Har11, Trp14, Arg19-hPTH(1-28)NH2; hPTH(1-34)NH2; 또는 r(래트)PTH(1-34)NH2로 처리하였고, 그 결과 형성된 세포 내 cAMP는 방사능 면역 분석법(radioimmuno assay)에 의해 정량하였다. 다양한 펩타이드에 대한 EC50 값은 hPTH(1-28)NH2의 경우 7.39 nM, Ala1,12, Aib3, Gln10, Har11, Trp14, Arg19-hPTH(1-28)NH2의 경우 0.37 nM, hPTH(1-34)NH2의 경우 0.31 nM, 그리고 r(래트)PTH(1-34)NH2의 경우 0.021 nM이었다.
마우스에서의 인 비보 cAMP 혈장 측정법. 야생형 마우스의 피하에 부형액(0.9% NaCl/0.05% Tween-20) 또는 부형액 포함 PTH 펩타이드를 체중 당 10 내지 1000 nmol/kg 의 농도가 되도록 주입하였다. 주입 후 일정한 시점에서, 꼬리 정맥에서 피를 채취하여 혈장 내 발생한 cAMP의 양을 방사능 면역 분석법(radioimmuno assay)으로 정량하였다(도 9A-9D).
상기 마우스의 혈장 내 포스페이트의 변화 및 이온화된 혈청 칼슘 농도의 변화를 추가적으로 분석하였다. 야생형 마우스는 체중 당 50 nmol/kg의 양으로 부형액 (0.9% NaCl/0.05% Tween-20) 또는 부형액 포함 Ala1,12,Aib3,Gln10,Har11,Trp14,Arg19-hPTH(1-28)NH2 또는 hPTH(1-34)NH2를 주입하였다. 주입 후 일정한 시점에서, 꼬리 정맥에서 피를 채취하여 혈장 포스페이트의 농도(도 10A) 및 이온화된 혈청 칼슘(도 10B)의 농도를 측정하였다. 이온화된 혈청 칼슘의 농도는 치론 진단 모델 634 Ca++/pH 분석기(Chiron Diagnostics Model 634 Ca++/pH analyzer)를 이용하여 측정하였다. 혈장 포스페이트의 농도는 포스포러스 리퀴-UV 분석 키트(Phosphorous Liqui-UV assay kit (StanBio Laboratory, Boerne, TX))를 이용하여 측정하였다. 두 펩타이드 모두 유사한 혈청 칼슘의 최대 증가 및 혈장 포스페이트의 최대 감소를 나타냈으나, Ala1,12,Aib3,Gln10,Har11,Trp14,Arg19-hPTH(1-28)NH2에 대한 반응은 Ala1,12,Aib3,Gln10,Har11,Trp14,Arg19-hPTH(1-28)NH2보다 더 연장되었다.
주머니쥐(opossum) 신장 세포에서 포스페이트 흡수 방해. 포스페이트 흡수 방해는 주머니쥐 신장(OK) 세포주를 사용하여 분석하였는데, 이는 신장 근위 세관으로부터 유래된 것이다. 이러한 세포는 PTH 수용체 리간드에 의해 조절되는 소듐 의존성 포스페이트 수송 기능을 매개한다. 따라서, OK 세포를 PTH(1-34)로 처리하면 배양 배지로 부터의 포스페이트 흡수가 억제된다.
세포의 A1,Aib3,M-PTH(1-28)에 대한 단기(10 분) 노출은 현저하게 연장된 포스페이트 흡수 억제 효과를 나타내는 반면, PTH(1-34) 및 hPTHrP(1-36) 펩타이드는 포스페이트 흡수 억제에 대해 훨씬 짧은 지속시간을 보인다(도 11).
정상 래트에서 약물동태학 및 PTHR의 과다칼슘혈증 작용. 정상 래트를 사용하여, PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36)을 주입한 iv의 약물동태 그래프를 조사하였다(도 12). PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36) 모두는 순환계에서 빠르게 사라졌고, [I5]-PTHrP(1-36)의 약물동태 그래프는 PTHrP(1-36)의 그것에 필적하였다.
또한, 본 발명자들은 PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36)을 정상 래트에 정맥 주사하여, 칼슘혈증 작용을 측정하였다(도 13). 20 및 80 nmol/kg의 PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36)은, 한 시간 시점에서 이온화된 혈중 칼슘 수준을 같은 정도로 증가시켰다. 상기 이온화된 혈중 칼슘 수준은 PTHrP(1-36)의 주입 후 2시간 시점에서 감소되었으나, [I5]-PTHrP(1-36) 주입한 경우는 주입 후 2시간 시점에서도 높은 수준을 유지했다. 즉, [I5]-PTHrP(1-36) 및 PTHrP(1-36)는 동등한 수준의 약물동태 그래프를 보였지만(도 12), [I5]-PTHrP(1-36)가 PTHR의 R0에 대하여 더 높은 친화력을 나타냈다(도 3 및 6). 그러므로, 인 비보에서 [I5]-PTHrP(1-36)의 연장된 칼슘혈증 작용은, R0 결합 친화력에 의해 가장 잘 설명할 수 있다.
인간 PTH 수용체와 PTH 또는 PTHrP 유사체의 인 비트로 및 인 비보 스트리닝. 본 발명자들은 자연의 PTH-PTHrP 하이브리드 유사체 및 [A1,3,12, Q10,R11,W14] (M-modified) PTH-PTHrP 하이브리드 유사체를 디자인 및 합성하고, 그것들이 hPTH 수용체를 발현하는 cAMP 신호능력을 HKRK-B7 세포에서 시험하였다. 각각의 자연적인 또는 M-변형된 PTH/PTHrP 하이브리드 유사체는 hPTH(1-34)와 필적할 만한 cAMP 신호능력를 보였다(도 25). 본 발명자들은 COS-7 세포막에서, 인간 PTH 수용체의 R0 및 RG 상태에 대한 자연적인 또는 M-변형된 PTH와 PTHrP 하이브리드 유사체의 친화력을 조사하였다(도 26A 및 26B).
정상 래트 및 TPTX 래트에서의 PTH 및 PTHrP 유사체의 과다칼슘혈증작용. 대조군으로서 PTH(1-34) 및 PTHrP(1-36)을 사용하여, 자연의 및 M-변형된 PTH-PTHrP 하이브리드 유사체의 일시적인 칼슘혈증작용을 정상 및 TPTX 래트에서 평가하였다(도 13A, 14A, 15A, 15B, 16A, 17A, 및 18A). I5-PTHrP(1-36), MPTH(1-14)/PTHrP(15-36), PTH(1-14)/PTHrP(15-36), PTH(1-18)/PTHrP(19-36), M-PTH(1-34)는 PTH(1-34)와 대조적으로 보다 높은 칼슘혈증작용을 보였으나, PTH(1-22)/PTHrP(23-36) 및 PTH(1-26)/PTHrP(27-36)은 PTH(1-34) 또는 PTHrP(1-36) 대조군 펩타이드보다 약한 칼슘혈증작용을 보였다. 래트 PTHR에 대한 결합도 인 비트로에서 측정하였다. 신호 작용의 길이는 지연된 cAMP 분석(delayed cAMP assay)을 통해 확인하였는데(도 13B-13C, 14B-14C, 15B, 16B-16C, 17B-17C, 및 18B), 이는 본 발명자들은 결합 데이터가 보여주는 R0/RG 선택성과 인 비트로의 지연된 cAMP 반응 및 인 비보에서의 과다칼슘혈증 모두와의 상관관계를 명확히 설명한다. 이 모든 펩타이드들의 cAMP 신호는 실질적으로 많이 변하지는 않았다(도 19A, 19B, 20A, 및 20B).
실험재료 및 방법
상기 실험을 수행하기 위하여 하기의 재료 및 방법을 사용하였다.
펩타이드 . 도 1-3 및 5-11에서 사용한 펩타이드는 Shimizu et al., J. Biol . Chem . 276:49003-49012 (2001)에서 기술한 것에 따라, M.G.H. 바이오 폴리머 코어 설비를 사용하여 합성하였다. 이러한 펩타이드는 [Nle8 ,21, Tyr34]rat(r)PTH(1-34)NH2 (PTH(1-34); [Aib1 ,3, Nle8, Gln10, homoarginine11, Ala12, Trp14, Tyr15]rPTH(1-15)NH2 ([Aib1,3, M]PTH(1-15); [Ala1,12, Aib3, Gln10, homoarginine11, Trp14, Arg19]human(h)PTH(1-28)NH2 {[Ala1, Aib3, M]PTH(1-28)}; [Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2 {(PTHrP(1-36)} [Ile5, Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2 {Ile5-PTHrP(1-36)} hPTH(1-34)NH2 [His5]hPTH(1-34)NH2 rPTH(1-34)NH2 및 [His5]rPTHrP(1-36)NH2을 포함한다. FRET 분석법(도 4)에 사용된 hPTH(1-34)COOH 펩타이드(free carboxyl)는 바켐 켈리포니아(Torrance, CA)로부터 구입하였다. 래트 연구에는 아메리칸 펩타이드 컴퍼니(California, USA)가 합성한 인간 PTHrP(1-36)를 사용하였다. 인간 PTH(1-34)는 펩타이드 인스티튜트(Osaka, Japan)에서 구입하였다. PTH 또는 PTHrP 유사체는 시그마 알드리치 재팬(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 래트 연구에 사용한 펩타이드 1 mM를 10 mM의 아세트산에 녹이고, -80℃의 냉장고에 보관하였다. 도 12-16에서 사용한 펩타이드는 아메리칸 펩타이드 컴퍼니(California, USA)(hPTHrP(1-36)COOH), 펩타이드 인스티튜트(Osaka, Japan)(hPTH(1-34)COOH) 또는 시그마 알드리치 재팬(Tokyo, Japan)(PTH/PTHrP hybrid analogs)에서 구입하였다. 모든 펩타이드는 그 농도가 0.1 mM 내지 4 mM가 되도록 10 mM의 아세트산에 녹여 -80℃에서 보관하였다. 펩타이드의 순도 및 질은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 매트릭스-어시스트 레이저 흡수/이온화 질량 분광기(matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry)를 사용하여 확인하였다. 방사능 표지된 펩타이드 변형물은 Na125I (specific activity: 2,200 Ci/mmol, Perkin Elmer/NEN Life Science Products, Boston, MA)를 사용하여 산화 클로아민-T 절차에 따라 제조하였고, 리버스-페이스 HPLC를 사용해 정제하였다.
세포 배양. 세포는 5% CO2를 포함하는 37℃의 습한 대기환경에서, 10% 우태아혈청(HyClone, Logan UT), 100 units/ml의 페니실린 G, 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 설페이트(Invitrogen Corp. Carlsbad, CA)를 보충한 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM))를 사용하여 배양하였다. 사용한 PTHR-발현 세포주는 HKRK-B7, HKRK-B64, ROS 17/2.8, 및 HEK-PTHR-cam이었다. The HKRK-B7 및 HKRK-B64 라인은, 인간 PTHR를 인코딩하는 플라스미드 DNA(pCDNA1 vector, Invitrogen Corp.)로 형질전환한 돼지 신장 세포주, LLC-PK1로부터 유래하였고, 각각의 PTH-결합 사이트 표면 밀도가 세포 당 대략 950,000 및 90,000이 되도록 발현하였다(Takasu et al., J. Bone Miner. Res. 14:11-20 (1999)). ROS 17/2.8 세포는 래트의 골육종세포(Majeska et al., Endocrinology 107:1494-1503 (1980))이고, 내성적인 래트 PTHR을 PTH-결합 사이트 표면 밀도가 세포 당 대략 70,000이 되도록 발현하였다(Yamamoto, I. et al., Endocrinology 122:1208-1217 (1988)). HEK-PTHR-cam 세포는 안정적으로 DNA 형질전환한 HEK-293세포로부터 유래하였고, 3번째 세포내 루프의 Gly395에 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein (CFP))이 삽입되고, 카복시 말단 꼬리에 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein (YFP))이 삽입된 인간 PTHR 유도체(PTHR-cam)를 발현하였다(Vilardaga et al., Nat. Biotechnol. 21:807-812 (2003)). 세포들은 T75 플라스크에서 증식되었고, 온전한 세포 분석을 위한 24-웰 플레이트, 세포막 준비를 위한 6-웰 플레이트 또는 FRET 연구를 위한 유리 커버-슬립으로 배분하였다. COS-7 세포는 PTHR를 코딩하고 있는 푸진(Fugene)-6(Roche Diagnostics, Indianapolis IN) 및 CsCl-정제된 플라스미드 DNA로 일시적으로 형질전환하거나, 또는 PTHR 인코딩 플라스미드 DNA 및 음성-도미넌트 Gαs 서브유니트 GαsND로 공동-형질전환하였다(6 Fugene, 1 each DNA per well). 이 GαsND 서브유니트 야생-형 Gαs보다 더 효과적으로, 그러나 덜 생산적으로 수용체에 결합하며(Berlot, C.H. J. Biol. Chem. 277:21080-21085 (2002)), 25I-[Aib1,3,M]PTH(1-15)NH2 방사능 리간드의 세포막 PTHR에의 결합을 촉진하는 것으로 밝혀졌다(하기 참조)(Dean, T. et al., J. Biol. Chem. (2006)).
결합 연구. 결합연구는 종래에 기술된 세포막을 사용하여 수행되었다(Dean et al., Mol Endocrinol 20(4):931-43 (2006)). 간단하게, 상온의 막 분석 버퍼(20 mM HEPES, pH 7.4, 0.1 M NaCl, 3 mM MgSO4, 20% 글리세롤, 3 mg/ml 우혈청 알부민, 프로테아제 억제제 칵테일--최종농도: 1 mM AEBSF, 0.8 아프로토닌, 20 루펩틴, 40 베스타틴, 15 펩스타틴 A, 14 E-64--시그마-알드리치 사, St. Louis, MO)에서 반응들을 수행하였다. 반응들은 전체 막 단백질 20 내지 100 /mL 농도 및 총 방사능 활성 농도 약 150,000 cpm/ml을 포함하였다. 표지되지 않은 펩타이드 리간드 및/또는 GTPγS(시그마-알드리치 사, St. Louis, MO)을 지시에 따라 반응에 첨가하였다. 반응의 말미에, 결합 또는 자유 방사능 리간드를 96-웰 진공 필터 플레이트 및 진공 필터 기구(Durapore HV를 지닌 멀티-스크린 시스템, 0.65 필터; 밀리포어 사, Milford, MA)를 이용한 진공 필터법에 의해 분리하였다. 그 다음, 공기-건조된 필터를 플레이트로부터 분리하고, 감마 계수기를 사용하여 감마 방사능 활성을 측정하였다.
방사능 리간드 해리. 이 연구는 15 mL 원형-저면 폴리스티렌 스냅-캡 튜브(Falcon)(총 반응 부피= 5.0 ml)에서, 대량 반응으로 수행하였다. 복합체를 형성하기 위하여, 세포막과 방사능 리간드를 90분 동안 선-반응 시켰다. 그 다음, GTPγS(5 x 10-5M) 존재 및 부존재하에서, 상기 방사능 리간드의 표지되지 않은 유사체(최종 농도 5 x 10-7 M)를 첨가하여 분리 단계를 개시하였다. 상기 첨가의 직전(t=0) 및 그 후 연속된 시간-시점에, 0.2 ml 분취량(~30,000 cpm)을 회수하여 상기 기술한 바와 같이 진공 필터법에 의해 처리하였다. 사전-반응 및 해리 단계 모두에 대하여, 상기 방사능 리간드의 표지되지 않은 유사체(5 x 10-7 M)를 포함하는 패러럴 반응 튜브에서의 비-특이적 결합을 측정하였다. 각 시점에서의 특이적 결합 방사능활성은, t = 0에서의 특이적 결합 방사능활성에 대한 퍼센트 값으로 계산하였다.
평형 경쟁 반응 및 GTPγS 억제. 125I-[Aib1,3,M]PTH(1-15) 방사능 리간드를 가지고 수행한 결합 반응은 96-웰, 멀티-스크린 진공 필터 플레이트의 웰에 정렬하여 반응을 수행하였다. 막, 추적자 리간드 및 다양한 농도의 표지되지 않은 리간드 및/또는 GTPγS을 90분 동안 웰에서 반응시키고, 그 다음, 결합반응 플레이트를 상기 기술한 바에 따라 고속 진공 필터법으로 처리하여, 자유 방사능 리간드로부터 결합된 리간드를 분리하였다. 25I-PTH(1-34)를 가지고 수행한 결합 반응은 96-웰 폴리스티렌 마이크로-적정 플레이트(Falcon, 총 반응 부피= 230 μl)에 정렬하여 반응을 수행하였고, 반응의 말미에 96-웰, 멀티-스크린 진공 필터 플레이트의 웰로 옮기어 상기 기술한 바에 따라 처리하였다. 이러한 이동 작전은 125I-PTH(1-34)-포함 반응의 방사능 리간드의 멀티-스크린 필터 막에의 비-특이적 결합을 최소화하기 위해 수행되었다. 두 방사능 리간드 모두에 대해, 방사능 리간드의 표지되지 않은 유사체 포화농도를 포함한 반응에서의 비-특이적 결합을 측정하였다. 특이적으로 결합한 방사능 활성은, 경쟁자 리간드 또는 GTPγS의 부재 하에서의 특이적 결합 방사능 활성에 대한 퍼센트 값으로서 산정하였다.
표지되지 않은 다양한 펩타이드 리간드의, G 단백질-언커플드 또는 G 단백질-커플드G PTHR 컨포메이션(각각 R0 및 RG)에의 결합능력을 평가하기 위하여, 일시적으로 형질전환된 COS-7 세포 및 다음의 분석 조건으로 세포막을 준비하였다. R0에의 결합능력을 평가하기 위하여, PTHR으로 형질전환한 세포로부터 막을 준비하였고, 추적자 방사능 리간드로서 125I-PTH(1-34) 및 GTPγS (1 x 10-5 M)을 반응에 첨가하였다. 이러한 결합 설정은, 125I-PTH(1-34)가 PTHR의 R0 컨포메이션에 우세하게 결합한다는 전제 및 GTPγS의 존재에 의하여 상기 컨포메이션이 RG에 비해 막에 풍부해진다는 전제를 근거로 한 것이다(Hoare et al., J. Biol. Chem. 276:7741-53 (2001); Dean et al., Mol Endocrinol (2006)). RG에의 결합을 평가하기 위하여, PTHR 및 음성-도미넌트 Gαs 서브유니트(GαsND)로 공동-형질전환된 COS-7 세포로부터 준비한 세포막을 사용하였고, 125I-[Aib1,3,M]PTH(1-15)를 추적 방사능 리간드로서 사용하였다. 이러한 결합 설정은 125I-[Aib1,3,M]PTH(1-15)가 PTHR의 RG 컨포메이션에 우세하게 결합한다는 전제 및 GαS ND의 존재에 의하여 상기 컨포메이션이 R 또는 R0에 비해 막에 풍부해진다는 전제를 근거로 한 것이다(Hoare, S. J. Biol. Chem. (2001); Berlot, C.H. J. Biol. Chem. (2002); Dean, T. et al., J Biol. Chem.(2006)). 막 표본에 존재하는 그 어떠한 낮은 친화도 PTHR 컨포메이션에 대한 결합 분석은 추적자 방사능 리간드의 반응 내 낮은 농도(~25 pM)에 의해 방지된다.
형광 공명 에너지 전달(FRET). 안정적으로 HEK-PTHR-CFPIC3/YFPCT(이전에 HEK-PTHR-Cam cells)로 불리움)을 발현하는 HEK-293 세포는 유리 커버 슬립에서 배양되었고, 기술된 바에 따라 FRET 분석을 위해 처리되었다(Vilardaga et al., Nat. Biotechnol. 21:807-812 (2003)). 이러한 세포에서, 자외선광(λmax.ex. = 436 nm; λmax.em. = 480 nm)에 의한 PTHR-CFPIC3/YFPCT 내 CFP(제공자)의 여기는 분자 내 FRET을 YFP(수용자)쪽으로 생성하고, 이로 인해 YFP로부터의 방출(λmax.ex. = 480 nm, λmax.em. = 535 nm)이 발생한다. 이러한 FRET 반응은 480 nm에서 CFP 광 방출 강도 감소 및 535 nm에서 YFP 광 방출 강도 증가로서 관찰가능하다. FRET 신호는 기저-상태 수용체 내 PTHR-CFPIC3/YFPCT에 의해 생산되고, 작동자의 결합에 의해 감소한다. PTH 리간드를 세포에 첨가 하였고, 컴퓨터-보조, 솔레노이드 밸브-조절, 고속 수퍼 퓨전 장치(ALA 사이언티픽 인스트루먼트, Westbury, NY)를 사용하여 세포로부터 세척하였다. 용액-교환 시간은 5 ms 내지 10 ms였다. 형광은 100x 대물 및 이중 방출 측광 시스템(Til Photonics)을 구비하고, 애버랜치(avalanche) 포토 다이오드 탐지 시스템 및 아날로그-디지탈 변환기와 결합된 제이스 역 전자 현미경(Zeiss inverted microscope)을 사용하여 관찰하였다. 436 nm 흥분에서 탐지된 FRET 신호는 정상화한 FRET 비율인 FYFP(535 nm)/FCFP(480 nm)로서 계산하였는데, 여기에서, FYFP(535 nm)은 CFP 신호의 YFP 채널 유출을 보정한 535 nm에서의 방출을 말하고, FCFP(480nm)는 YFP 방출의 CFP 채널 유출(최소량)을 보정한 480 nm에서의 방출을 말한다. 광-표백에 의한 형광 방출의 변화량은 공제하였다.
세포 내 cAMP 자극. 세포의 리간드 처리에 따라, 세포 내 cAMP 수준을 기술된 바에 따라 방사능 면역 분석법(radioimmuno assay)으로 측정하였다(Shimizu et al., J. Biol. Chem. 276:49003-49012 (2001)). 리간드에 단기간 노출 후, 세포에서 지연된 cAMP 반응을 일으키는 리간드의 능력을 하기에 따라 평가하였다. 24-웰 플레이트의 세포는 결합 버퍼(50 mM 트리스-HCl, pH 7.7, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 5% 열-불활성화 말(horse) 혈청, 0.5% 열-불활성화 우태아혈청으로 씻어내었고, 그 다음 펩타이드 리간드(1 x 10-7 or 3 x 10-7M) 존재 또는 부존재 결합 버퍼 내에서 10분간 상온 반응하였다. 그 다음 버퍼를 제거하고, 결합 버퍼로 세포를 세 번 세척하고, 결합 버퍼에서 변화된 시간 (1 내지 120 분)동안 반응을 더 진행하였다. 그 다음, 버퍼를 IBMX (2 mM)를 포함하는 결합 버퍼로 교환하고, 5분의 추가 반응 후에 세포 내 cAMP를 정량하였다. 이전에 PTH 수용체에 대해서 행하였던(Tawfeek, H., and Abou-Samra, A., J. Bone Miner. Res. 14:SU444 (1999); Biselo et al., J. Biol. Chem. 277:38524-38530 (2002)) 이러한 접근에 의하면, 반응의 마지막 IBMX-포함 단계 동안에 생산된 cAMP 만이 측정가능한데, 이는 IBMX 첨가 전에 생산된 cAMP는 세포 내 포스포디에스테라제에 의해 분해되기 때문이다.
도 14의 cAMP 실험에서, HKRK-B7를 1 x 105 셀/웰로 96 웰 플레이트에 접종하고 밤새 반응하였다. 그 다음날, 세포를 200 μl 결합 버퍼(50 mM 트리스-HCl, pH 7.7, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 5% 열-불활성 말(horse) 혈청, 0.5% 열-불활성 우태아혈청)로 한번 세척하고, 얼음 상에서, 100 μl cAMP 분석 버퍼(DMEM, 2 mM IBMX, 1 mg/ml 우혈청 알부민, 35 mM 헤페tm-NaOH, pH 7.4)를 첨가하였다. 그 다음, 다양한 양의 인간 PTH(1-34), 인간 PTHrP(1-36), 또는 PTH 유사체(최종 부피= 150 μl)를 포함하는 결합 버퍼 50 μl를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃의 수 욕조에 넣고 15분 동안 반응시켰다. 배지 제거 후, 세포를 얼리기 위하여, 플레이트를 드라이 아이스 분에 플레이트를 두었고, 그 다음 드라이아이스를 제거하였다. 세포를 50 mM HCl 50 μl로 녹였고, 다시 드라이 아이스로 얼렸다. 상업적으로 이용가능한 cAMP EIA 키트(바이오트랙 cAMP EIA 시스템, GE 헬스케어)를 이용하여, 세포 내 cAMP 수준을 측정하였다.
이노시톨 포스페이트의 자극. 세포 내 이노시톨 포스페이트(IPs)의 자극은 3H-myo-D-inositol (2 /ml)로 미리 표지한(16 hours), 일시적으로 형질전환된 COS-7 세포를 가지고 측정하였다. 우태아혈청(10%) 및 LiCl (30 mM)를 포함한 DMEM에서, 세포를 리간드로 30분간 처리하였다. 세포를 빙냉각 트리클로로아세트산(5%)으로 용해하고, 기술된 바에 따라 이온-교환 필터법을 사용하여 산 용해물로부터 IPs를 추출하였다(Shimizu et al., J. Biol. Chem. 276:49003-49012 (2001)).
OK 세포 방법. 세포를 배지(부형제) 또는 펩타이드 리간드(1 x 10-7M)를 포함하는 배지로 37℃에서 10분간 처리하였다. 그 후(t=0), 세포를 배지로 3회 세척하고, 변화하는 시간 동안 37℃에서 단독 배양하였다. 각각의 시점에 32PO4를 배지에 첨가하고, 5분 배양 후 세포를 세척, 용해하고, 액체섬광계수법(liquid scintillation counting)을 사용하여 용해물의 32P beta 방사능 활성을 측정하였다. 상기 실험 결과는, 같은 시간동안 부형제만으로 처리한 세포 용해물 32P 방사능 활성량의 백분위수로 도시하여, 도 11에 나타내었다.
인 비트로 결합 및 신호 분석을 위한 데이터 산정. 데이터는 곡선 맞춤 및 파라미터 결정을 위해, 마이크로소프트 엑셀 및 그래프 패드 프리즘 4.0 소프트웨어 패키지를 사용하여 처리하였다. 해리 시간 과정 데이터는, F 테스트 분석이 단일-지수 방정식이 더 나은 맞춤(Palpha > 0.02)을 제공함을 지시하는 경우를 제외하고는, 이중-지수 붕괴 방정식(bi-exponential decay equation)을 사용하여 분석하였다. 평형 결합으로부터의 데이터, 즉 cAMP 및 IP 양-반응 평가는 다양한 기울기를 갖는 시그모이달 양-반응 방정식을 사용하여 분석하였다. 이 분석법은 EC50, IC50 (최대 효과의 절반을 생산하는 리간드 농도) 및 Emax (리간드에 의해 얻어지는 최대 반응)에 관한 데이터 및 값 곡선을 산출하였다. 짝지어진 데이터 세트는, 두 세트의 동등하지 않은 불일치를 가정하는 (이중-말미의)스튜던트 t-테스트(Student's t-test (two-tailed))를 사용하여 정적으로 비교하였다.
정상 래트에서 PTHrP(1-36) 및 I5-PTHrP(1-36)의 약물 동력학적 분석. 저장액에서 인간 PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36) 농도는, 25 mmol/L 포스페이트-시트레이트 버퍼/100 mmol/L NaCl/0.05% 트윈 80 (pH.5.0)(PC-버퍼)를 사용하여 희석 조절하였다. 두 펩타이드는 적용 직전에 얼음 위에 두었다.
8주령의 암컷 SD-IGS 래트(찰스 리버 재팬 사)의 체중을 측정하였다. 인간 PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36)를 10 nmol/1 ml/kg의 양으로 래트에 정맥 주사하였다. 각각의 펩타이드 양 및/또는 시점에 대하여 3마리 래트 그룹에 펩타이드를 적용하였다. 적용 후 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 30, 60, 120 분 시점에서, 꼬리 정맥을 이용하여 EDTA (최종 0.2%) 및 아프로티닌 (최종 0.6 TIU/ml)이 존재하는 튜브로 혈액을 수집하여, 래트 혈장 내 인간 PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36)의 시간 과정을 관찰하였다. 샘플은 혈장 수집을 위해 원심분리 하였고, 인간 PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36) 수준을 분석할 때까지 -80℃에 보관하였다.
인간 PTHrP(1-36) 및 [I5]-PTHrP(1-36)은, PTH-RP 1-34 (인간, 래트) 효소 면역 분석 키트(페닌슐라 래보라토리 사) 및 PTHrP와 교차-반응한 [I5]-PTHrP(1-36) EIA 키트를 사용한 EIA 분석법을 사용하여 측정하였고, [I5]-PTHrP(1-36)는 혈장 내 [I5]-PTHrP(1-36) 수준 측정으로 위한 표준으로 사용하였다.
정상 래트에서 인간 PTH(1-34), PTHrP(1-36) 및 PTH 또는 PTHrP 유사체의 과다칼슘혈증 작용. 인간 PTH(1-34), PTHrP(1-36) 및 PTH 또는 PTHrP 유사체의 정상 래트에서의 과다칼슘혈증 작용을 하기에 따라 연구하였다. 저장액의 펩타이드 농도를 25 mmol/L 포스페이트-시트레이트 버퍼/100 mmol/L NaCl/0.05% 트윈 80 (pH.5.0) (PC-버퍼)를 사용하여 희석 조절하였다. 모든 펩타이드는 적용 직전에 얼음 위에 두었다.
8주령의 암컷 SD-IGS 래트(찰스 리버 재팬 사)의 체중을 측정하였다. 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 헤파린화한 모세 튜브에 넣고, 각각의 샘플에 대하여 pH 7.4에서 이온화된 칼슘 수준의 보정값을 설정하기 위하여, Ca++/pH 분석기(모델 634/바이엘 메디컬 사)를 사용하여 혈액 내 이온화된 칼슘 및 pH의 기저 수준을 측정하였다. 각각의 펩타이드를 1 ml/kg의 투여량으로 래트에 정맥 주사하여 투여하였다. 각각의 펩타이드를 각각 6마리 래트 그룹에 적용하였다. 적용 후 1, 2, 4, 또는 6 시간 시점에서, 보정된 혈액 이온화 칼슘 수준의 시간과정을 관찰하기 위하여 꼬리 정맥에서 혈액을 수집하였다. 보정된 이온화 칼슘 수준의 시간 과정은, 부형제와 비교하였고, +/- 표준 오차 방법에 따라 표현하였다.
통계학상 분석법. SAS 소프트웨어를 이용한 분산분석법(analysis of variance (ANOVA))에 의해 통계학상 분석법을 수행하였다. 스튜던트 t-테스트(Student's t-test) 또는 던넷 멀티 테스트(Dunnett’s multiple test)를 사용하여, 차이의 중요성을 결정하였다. P<0.05는 통계학적으로 중요하게 고려되었다.
갑상부갑상선 절제(thyroparathyroidectomy) 래트에서, [A 1,3,12 ,Q 10 ,R 11 ,W 14 ]-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)(MPTH14)의 칼슘 혈증 작용. 5주령의 수컷 Crl:CD(SD) 래트를 찰스 리버 래버러토리 재팬 사(Kanagawa, Japan)로부터 취득하고, 20-26℃ 및 35-75% 습도의 표준 실험실 환경에 1주동안 길들였다. 상기 래트는 탭수 및 1.1% 칼슘, 1.0% 포스페이트 및 250 IU/100 g의 비타민 D3를 포함한 표준 설치류 사료(CE-2)(클레아 재팬 사, Shizuoka, Japan)에 자유롭게 접근하였다.
6주령의 래트에 갑상부갑상선 절제(TPTX)를 수행하였다. 전극 방법에 의한 수술 후 24시간 또는 72 시간 시점의 꼬리 정맥 출혈로부터 채취한 샘플의 혈청 이온화 칼슘(iCa) 수준(< 1.0 mM)에 근거한 사용을 위해 TPTX 래트를 선택하였다. TPTX 래트를 수술 후 48 시간에서의 iCa 수준에 따라 5마리의 6개 그룹으로 나누었다. TPTX-부형제 그룹은 1 ml/체중kg의 투여량으로 부형제(10 mM 아세트 산 용액)만을 꼬리 정맥에 투여하였다. TPTX 래트에 각각 1.25, 5, 20 nmol/kg(3 그룹) 및 1.25, 5 nmol/kg(2 그룹)의 투여량으로, 인간 부갑상선 호르몬(1-34)(hPTH(1-34)) 및 M-PTH(1-14)/rP(15-36)(MPTH14)를 정맥주사하였다.
각각의 투여 후 1, 2, 4, 6, 및 24 시간 시점에서의 iCa를 측정하기 위해 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하였다. 이온화 칼슘 수준은 자동분석기(M-634, 치바 코닝 디아그노틱 사, Tokyo, Japan)를 사용한 전극 방법에 의해 결정하였다.
마우스 연구. 부형액(0.9% NaCI/0.05% 트윈-20) 또는 10 내지 1000 nmol/체중kg 투여 수준의 PTH 펩타이드를 포함하는 부형액을 야생형 마우스의 피하에 주입하였다. 주입 후 지시한 시점에서, 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하고, 그 결과인 혈장 내 cAMP의 양을 방사능 면역 분석법을 사용하여 정량하였다. 혈청 내 이온화 칼슘은 상기에 따라 측정하였고, 포스페이트는 U.V. 분광 키트 분석법에 의해 측정하였다.
동물연구의 통계학상 분석. 데이터는 ± 표준 오차(SE)로 제시된다. 통계학적 유의성은 SAS (Ver.5.00.010720, SAS 인스티튜트 재팬, Tokyo, Japan)를 사용하여 결정하였다. <0.05 의 p 값은 통계학적으로 유의한 것으로 고려하였다. 던넷 다중 비교 테스트(Dunnett’s multiple comparison test)에 의한 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. TPTX-부형제 수준.
실시예 2
PTH 및 PTHrP에서의 알라닌 치환의 특성화
상기에서 보여진 바와 같이, PTH(1-34)는 결합 RG 컨포메이션을 선호하는 PTHrP(1-36)보다 R0 수용체 컨포메이션에 더 큰 친화력으로 결합할 수 있는 능력을 갖는다. 이 특이한 결합 및 컨포메이션 선택성의 분자적 근간을 탐구하기 위하여, 본 발명자들은 리간드와 PTHR 상호작용에 관한, PTH 및 PTHrP 펩타이드 N-말단 및 C-말단 지역 치환의 효과를 비교하였다. 1, 3, 10, 11, 12 및 14 위치에서의 알라닌 치환이 cAMP 활성을 증가시켰던 PTH(1-14)와 달리, PTHrP(1-14)에서의 각각의 알라닌 치환은 PTHR를 발현하는 세포 내 활성을 폐기하였다. 즉, PTH 및 PTHrP의 (1-14) 지역은 PTHR의 막근접(J) 지역에 다르게 결합한다. PTHrP(1-14) 및 PTHrP(1-36)는 모두, 그들 각각의 대응 부분인 PTH(1-14) 및 PTH(1-34)와 비교하여, 세포 밖 N-말단 (N) 도메인(delNT)을 결여한 PTHR를 발현하는 세포 내 cAMP 활성에 대하여 훨씬 효과가 적었다. 그러므로 PTHrP(1-36) 활성은, PTH(1-34) 활성보다, C-말단 리간드 지역 및 PTHR N 도메인간의 상호작용에 훨씬 강하게 의존한다. 따라서 본 발명자들은 PTHrP 서열의 C-말단 지역을 실시예 3에서 기술한 바에 따라 연구하였다.
실시예 3
PTH(1-28) and PTHrP(1-28)에서의 C-말단 치환
알라닌-스캔 및 타입-치환 전략을 사용하여, 본 발명자들은 RG 수용체 컨포메이션에 자연적 PTHrP(1-28) 서열보다 훨씬 큰 선택성을 갖는 펩타이드를 생산할 수 있었다. 본 발명자들은 PTHrP 서열의 C-말단 지역 연구에 초점을 맞추었고, 따라서 PTH(1-28) 및 PTHrP(1-28) 15-28 지역에 대한 알라닌-스캔을 수행하였다(데이터는 없음). PTH(1-28) 및 PTHrP(1-28) C-말단 지역에 대한 알라닌-스캔 분석은, Arg20, Trp/Phe23, Leu24, 및 Leu/Ile28 위치에서 각각의 펩타이드 활성에 있어 강한 감소를 나타내었는데, 상기 위치는 PTH에서 코어 N 도메인-결합 모티프를 형성하는 것으로 알려진 곳이다. 활성의 증가는 각각의 골격 내에서 수개의, 그러나 다른 위치에서 발견되었다: PTHrP(1-28)에서 Leu18, Phe22 및 His26 그리고 PTH(1-28)에서 Asn16, Glu19 및 Ala22. PTH에 있어서, 16, 19 및 22 위치에서의 알라닌 치환은 delNT (N-말단 리간드 결합 도메인이 결여된 PTH 수용체)에의 결합을 증가시킨 반면에, PTHrP에서 18, 22, 26 위치 치환은 delNT에의 결합을 감소시켰다. 따라서, PTH의 16, 19 및 22 위치의 알라닌 치환이 갖는 증대 효과는 PTHR J 도메인을 통하여 매개되는 것인 반면, PTHrP 18, 22, 26 위치의 알라닌 치환은 PTHR N 도메인을 요구한다. 25 위치(Ala 치환에 중립적)뿐만 아니라, 16, 19, 22 위치에서 더 진행한 타입 치환 분석은 [Ala18,22,Leu25,Lys26]-PTHrP(1-28) 유사체를 초래하였는데, 이것은 PTH(1-34) 보다 그리고 그 어떠한 PTH 또는 PTHrP 펩타이드에 대해 관찰된 가장 높은 것 보다 더 큰 cAMP 효험 및 RG 결합 친화력을 나타낸다. 이러한 스캔은, 18, 22, 25 및 26 위치에서의 알라닌 치환 각각이 사람 및 래트 PTHR-발현 세포에 있어서, cAMP 활성을 증가시킴을 보여주었다(도 27A 및 27B). 상기 알라닌 스캔에 이어, 이들 위치를 다양한 아미노산을 가지고 개별적으로 더 치환시켜 보았는데, 이들 아미노산 중 몇몇은 cAMP 활성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(도 27C 및 27D). 그 다음, 본 발명자들은 이들 변이를 다양한 조합으로 결합하였고, 여기에서 기술한 것과 같이, 눈에 띄게 증가된 활성을 갖는 수개의 PTHrP 유사체를 얻었다.
실시예 4
예시적인 치환된 PTHrP(1-28) 펩타이드의 특성연구
PTHrP(1-36), PTHrP(1-28), A18,22,K26-PTHrP(1-28), A18,22,L25,K26 (AALK)-PTHrP(1-28), E18,A22,K26-PTHrP(1-28) 또는 E18,A22,L25,K26(EALK)-PTHrP(1-28)을 사용하여, SaOS 세포 내 cAMP 생산 양-의존적 곡선을 발생시켰다(도 28A). 모체인 PTHrP(1-28)와 비교하여, A(E)18,22,L25,K26-PTHrP(1-28) (AALK 또는 EALK)에 대한 cAMP-유도 활성의 현저한 증가가 발견되었다.
이러한 촉진 효과는, C57BL/6 마우스(3-개월-연령, 수컷)에 부형제, PTHrP(1-36), PTHrP(1-28), AALK-PTHrP(1-28) 또는 EALK-PTHrP(1-28) (n = 3)을 정맥 주입한 인 비보 연구에 의해 확인되었다(도 28B). 주입 10분 후 혈액을 채취하고, cAMP의 혈장 수준을 RIA에 의해 측정하였다. wt PTHrP(1-28)와 비교하여, AALK-PTHrP(1-28) 및 EALK-PTHrP(1-28)에 대한 마우스 분석법에서도 현저한 촉진이 관찰되었다. 상기 분석에서, PTHrP(1-36) 펩타이드의 더 크고 현저한 잠재력은, 혈액에서 더 긴-길이 펩타이드의 더 느린 제거를 반영할 수 있다.
실시예 5
RG 선택적 펩타이드 EALK-PTHrP(1-30)의 특성연구
본 발명자들은 또한 EALK-PTHrP(1-30) 펩타이드의 cAMP 생산에 대한 효과를 특성화하였다. 3개월 연령 수컷 C57BL/6 마우스에게, rPTH(1-34), M-PTH(1-34) (M=A1,Aib3,Q10,Har11,A12,W14,R19) 또는 E18,A22,L25,K26-(EALK)-PTHrP(1-30) (5 nmol/kg)을 정맥 주입하였다. cAMP 실험(도 29A)에서, 주입 10분 후 피를 채취하고 cAMP의 혈장 수준을 RIA에 의해 측정하였다. 칼슘 실험(도 29B)에서, 주입 전 및 주입 후 1, 2, 4 및 6 시간 시점에 혈액을 채취하였다. 이온화 칼슘은 Ca++/pH 분석기를 사용하여 측정하였다. 상기 리간드들은 대략 같은 수준의 혈장 cAMP를 유도하였으나, R0 선택적 리간드인 M-PTH(1-34)은 PTH(1-34) 보다, 이온화 칼슘 반응을 현저히 더 강건하게 그리고 더 지속적으로 유도하였다. 반면에, RG-선택적 리간드인 EALK-PTHrP(1-30)는 PTH(1-34)와 비교하여, 더 낮지 않다면, 비슷한 수준의 이온화 칼슘 반응을 유도하였다.
마우스에게 5 nmol/kg의 rPTH(1-34), M-PTH(1-34) 또는 EALK-PTHrP(1-30)를 14일 동안 매일 정맥 투여 처리하는 두 번째 실험 세트를 수행하였다. 6일 및 13일 시점에서 혈액을 채취하고, 골 턴오버 마커(PINP, 오스테오칼신(osteocalcin) 및 CTX)를 ELISA 로 산정하였다. R0 선택적 리간드인 M-PTH(1-34)는 6일의 이른 시점에서, 골 형성 마커(PINP, 도 30A 및 30B; 오스테오칼신, 도 30D) 및 골 재흡수 마커(CTX, 도 30E 및 30F) 모두의 증가를 강하게 유도하였다. 반면에, RG-선택적 리간드인 EALK-PTHrP(1-30)는 6일의 시점에서 명백하게, 뼈 형성 마커를 증가시켰고, 골 재흡수 마커에 대해서는 상대적으로 적은 영향을 주었다(도 30A, 30C 및 30E). 투여량 및 시간 조건 분석 하에서, PTH(1-34)는 골 마커에 오직 적은 영향을 미쳤다. 골 마커에 대한 영향과 일치하여, M-PTH(1-34)는 섬유주 골을 강건하게 증가시켰으나, 외층 골 또한 탐지 가능할 정도로 감소시켰으며, 이는 그것의 심한 과다칼슘혈증 작용과 일치한다(도 29B). 반면에, EALK-PTHrP(1-30)는 심한 과다칼슘혈증을 유도하지 않고, 말단 대퇴골에서 외층 골을 두께를 의미심장하게 증가시켰다(도 30 및 표 xx). 이러한 발견은, 다른 R0/RG 선택성을 갖는 변형된 리간드는 골 대사에 있어 다른 효과를 가짐을 설명한다. 상기 발견은 또한, EALK-PTHrP(1-30)와 같은 RG 선택성 유사체가 골 재흡수에 비하여 골 형성을 선호적으로 자극하고, 혈액 칼슘 수준에 최소의 영향만을 미치면서 말단 골에 유익한 효과를 가짐을 보여준다. M-PTH(1-34)는 말단 대퇴골 대사변화에서 섬유주 골을 크게 증가시키나, 골 내막 표면의 부식이 지시하는 것과 같이 중간-대퇴골 골간에서의 외층 골 재흡수를 유도하였다.
표 7은 상기 펩타이드를 매일 2주간 처방함에 따른 골 구조 파라미터 측정량을 보여준다. 상기 기술한 바와 같이, 부형제, rPTH(1-34), M-PTH(1-34) 또는 EALK-PTHrP(1-30)를 매일같이 14일간 마우스에 정맥 투여 처리하였다. 모든 유사체는 대퇴부 및 요추 척주 모두에 있어, 골 미네랄 농도를 의미심장하게 증가시켰다. M-PTH(1-34)에 대해서는 말단 및 중간 대퇴부 영역 모두에 있어 외층벽 두께가 심각하게 얇아졌다. 반면에 EALK-PTHrP(1-30)는 말단 되퇴부에 있어서 외층 골 두께를 중요하게 증가시켰다.
Figure 112010002579525-pct00004
마우스에 2주간 매일 처리한 후의 골 구조 파라미터(상기 표 7)
실시예 6
EALK - PTHrP 의 최적화
EALK-PTHrP 펩타이드 활성을 최적화하기 위하여, 본 발명자들은EALK-PTHrP(1-30) 및 29-33 지역을 치환한 PTHrP(1-34) 변형물을 제조하였다. 1-30 골격에서, Gly, Ser, Leu, Asn, Gln, Trp, Glu 및 Lys은 29 위치에서 치환되었다. Gly, Ser, Leu, Asn, Asp, Trp 및 Lys는 30번 위치에서 치환되었다. 그리고 Ser, Leu, Asn, Val, Trp, Glu 및 Lys은 31번 위치에서 치환되었다. EALK-PTHrP(1-34)에서, 30-33 지역을 알라닌으로 치환하거나, 또는 C-말단 6개 아미노산을 PTH(1-34) 대응 지역으로 대체하였다. PTHrP(1-30) 골격과 비교하여 이러한 더-긴 펩타이드의 예측되는 잇점은, 더 느린 제거로 인해 순환계에서 더 긴 반감기를 가질 것이라는 것이다. C-말단 치환은 부가된 사슬 길이를 제공하지만, 자연적인 PTHrP(29-34) 지역이 장착된 경우 발생하는 R0 결합 친화력의 증가는 피하기 위하여 설계되었다. 이러한 펩타이드를 MC3T3-E1 세포에서의 cAMP 활성에 대하여 시험하였다. 그림 32A 및 32B에서 알 수 있듯이, 이러한 펩타이드 중 수개는 치환되지 않은 C-말단 서열보다 더 큰 활성을 보였다.
실시예 7
신장 포스페이트 수송에 있어서 Trp 1 -M- PTH 의 특성연구
PTH 리간드가 신장 포스페이트 수송을 조절하는 신호 메타니즘을 더 설명하기 위하여, 본 발명자들은 PLC/PKC 신호에 대해서는 결함이 있으나, 여전히 효험 있는 cAMP/PKA 신호 활동을 보유하고 있는 M-PTH(1-28) 유도체를 개발하였다. 그러한 펩타이드는 근위세관(PT) 세포의 Pi 수송자인 NaPi-IIa 및 NaPi-IIc의 기능 및 표면 발현 조절에 있어서, PKA 및 PKC 신호 경로의 상대적 역할을 연구하는 것을 가능하게 한다. cAMP 및 IP3 신호 경로의 효험있는 작동자인 M-PTH(1-28) 유사체(M = Ala1,Aib3,Gln10,Har11,Ala12,Trp14,Arg19)는 쥐에 주입하였을 때, 저인산혈증 및 고칼슘혈증 효과를 연장시켰다. 또한, 상기 유사체는 또한 이를 주입한 마우스 신장 PT 세포의 솔가장자리막 및 세포질 구획에서 NaPi-IIa 면역 반응의 연장된 감소를 유도하였다. 본 발명자들은 PLC 신호를 손상시키기 위하여 M-PTH(1-28)의 1번 위치 알라닌을 트립토판으로 치환하였는데, 이는 그 위치에서의 그와 같은 벌키한 치환이 선택적으로 PLC 신호를 손상시킴을 보인 비셀로 및 그의 동료들(J Biol Chem 277:38524-30, 2002)의 발견에 따라 수행하였다. 래트 PTHR로 일시적 형질 전환한 HEK-293 세포에서, Trp1-M-PTH(1-28)는 cAMP 형성을 자극함에 있어서 M-PTH(1-28)만큼 효험이 있었으나, IP3 형성을 자극함에 있어서는 부모 펩타이드보다 적어도 100배 덜 효험이 있었다. Trp1-M-PTH(1-28)는 MPTH(1-28)에서 보여진 것처럼, 리간드 세척 후에도 MC3T3-E1 세포 내 연장된 cAMP 반응을 생산하는 능력을 유지하였다. 마우스(20 nmol/kg)에 주입되었을 때, Trp1-M-PTH(1-28)는 M-PTH(1-28)처럼, PTH(1-34) 효과와 비교하여 혈장 포스페이트 수준의 연장된 억제를 유도하였다: 각각의 유사체에 대하여 2시간 시점에서 최대 억제; PTH(1-34)에 대하여 4시간 시점에서, 그리고 M-PTH(1-28) 및 Trp1-M-PTH(1-28)에 대하여 6시간 시점에서 부형제 대조군 수준으로 회복됨. 2시간 시점에서 각각의 펩타이드로 처리한 마우스에서, 신장 PT 세포의 정점(apical) 및 세포질 NaPi-IIa 염색은 감소하였으나, PTH(1-34)로 처리 6시간 시점에서 염색이 부형제 대조군 수준으로 회복되어, M-PTH(1-28) 또는 Trp1-M-PTH(1-28)으로 처리한 마우스에 대해 적어도 6시간 동안 감소된 상태로 유지되었다. 신장 PT 세포NaPi-IIc 면역염색(immunostaining)은 4 내지 6시간의 간격으로 M-PTH(1-28)을 처리한 쥐에 대해서는 감소하였으나, Trp1-M-PTH(1-28) 또는 PTH(1-34)로 처리한 쥐에 대해서는 변화가 없었다. M-PTH(1-28)는 aPi-IIc 수송체 및 래트 PTHR를 발현하도록 바이러스성 형질전환한LLC-PK1 세포(NHERF-1/ezrin positive) 초기 경로에서의 32P 섭취를 억제하였으나(Mahon, Am J Physiol Renal Physiol . 294:F667-75 (2008)), Trp1-M-PTH(1-28)은 이러한 활성을 억제하지 못하였다. 상기 발견들은 신장 Pi 수송의 PTHR-매개 조절이 하나의 요소로서 NaPi-IIa 다운 레귤레이션 cAMP/PKA-의존적 조절을 수반하고, 아마도 더 느리고 덜 중요한 다른 요소로서 NaPi-IIc 다운 레귤레이션 PLC-의존적 조절을 수반함을 제시한다.
실시예 8
TPTX 래트에서 혈청 및 뇨의 칼슘 및 포스페이트에 대한 M- PTH (1-14)/ PTHrP (15-36)의 특성연구
또한, 본 발명자들은 M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36) 하이브리드 펩타이드(SP-PTH)의 혈청 및 뇨의 칼슘 및 포스페이트에 대한 영향을 연구하였다. 갑상부갑상선 절제(thyroparathyroidectomized) 래트(TPTX rats)에 대한, PTH(1-34) 1.25 nmol/kg의 한번의 정맥 투여는, 한시간 시점에서 일시적으로 혈청 칼슘(sCa)을 증가시켰고 혈청 포스페이트(sPi) 수준을 감소시켰으나, 정상 범위까지는 아니었는데, 이는 상기 수준이 6시간 만에 투여-전 상태로 회복되었기 때문이다(각각 도 33 및 35). PTH(1-34)는 0-6시간 동안 뇨 칼슘(도 34) 또는 뇨 포스페이트 수준(도 36)을 변화시키지 않았다. 이와 대조적으로, SP-PTH 1.25 nmol/kg의 투여는 6시간 만에 정상 수준으로 sCa을 증가시키고 sPi을 감소시켰는데, 이러한 수준은 24시간 동안 유지되었다. SP-PTH는 0-6 시간 시점에서, 뇨 칼슘을 감소시키고 뇨 포스페이트 수준을 증가시켰다. 이러한 결과는 SP-PTH가 TPTX 래트에서 과칼슘뇨증을 일으킴 없이, 저칼슘혈증을 정상화 할 수 있음을 지시하며, 따라서 상기 펩타이드가 감소된 신장 합병증 위험과 함께 부갑상선 기능저하증을 치료하는데 사용될 수 있음을 제시하는 것이다.
실시예 9
PTH 또는 PTHrP 유사체를 사용한 cAMP 자극
인간 PTH1 수용체를 세포 당 9.5 x 105 수준으로 과-발현시키는 LLC-PK1 세포인 HKRK-B를 cAMP 신호 분석법에 사용하였다. 5% CO2를 포함하는 37℃의 습한 대기환경에서, 10% 우태아혈청(HyClone), 100 units/ml의 페니실린 G 및 100 μg/ml 스트렙토 마이신 설페이트(Invitrogen Corp.)를 보충한 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM))를 사용하여 배양하였다. 인간 PTHrP(1-36)는 아메리카 펩타이드 컴퍼니 사(California, USA)에서 제조하였고, 인간 PTH(1-34)은 펩타이드 인스티튜트 사(Osaka, Japan)에서 구입하였으며, PTH 또는 PTHrP 유사체 (Mc-PTH(1-34), [A1,A3,A23,Q10,R11]-hPTH(1-34), [A1,A3,A23]-hPTH(1-34), 및[A18,A22,L25,K26]-PTHrP(1-28))는 시그마 알드리치 재팬(Tokyo, Japan)에서 합성하였다. 모든 펩타이드는 10 mM 아세트 산에 1 mM의 농도로 녹여 -80 ℃에 저장하였다. cAMP 자극 분석법은 상기 기술한 바에 따라 HKRK-B7 세포에 대하여 수행하였다. 대조군으로는 PTH(1-34) 및 PTHrP(1-36)를 사용하였다. 세포는 37 ℃에서 15분 동안 IBMX 존재하 리간드 농도를 변화시키면서 처리하였다. EC50 및 Emax 값은 표 8에 기재하였다. C-말단 변형을 갖는 모든 M-변형 PTH는 hPTH(1-34)에 대해 비교할만한 cAMP 신호를 보인다(도 37).
Figure 112010002579525-pct00005
실시예 10
골다공증을 치료하기 위한 단 -작용 PTH 펩타이드의 용도
상기 기술한 것과 같은 단-작용 펩타이드를 골다공증 환자에게 투여하였다. 일반적으로, 간헐적 i.v./i.m. 또는 피하 주입에 의한 골다공증 치료 요법의 경우, 주어진 투여량은 100 내지 1200 units (μg)/일의 범위이다.
이러한 화합물 및 조성물의 정확한 투여량 및 투여 계획은 치료 대상 개인의 필요성, 치료의 종류, 고통 또는 요구의 정도 및 당연히 의약 전문가의 판단에 필수적으로 의존할 것이다. 일반적으로, 비경구 투여는 흡수에 더 의존적인 다른 투여방식보다 적은 투여량이 요구된다.
실시예 11
PTH 결핍증을 치료하기 위한 장-작용 펩타이드의 용도
상기 기술한 것과 같은 장-작용 펩타이드를, PTH 결핍 관련 질병을 가진 환자에게 투여한다. 이러한 질병을 예를 들면, 종양성 석회증을 수반하는 고인산혈증, 만성 신장병의 초기 단계 및 부갑상선기능저하증이 있다. 투여해야 할 펩타이드의 일일 투여량은 지시에 의존한다. 일반적으로, 매일 i.v./i.m. 또는 피하 주입의 경우 바람직하게 300-2400 유니트 (μg)/일이다.
이러한 화합물 및 조성물의 정확한 투여량 및 투여 계획은 필수적으로 치료 대상 개인의 필요성, 치료의 종류, 고통 또는 요구의 정도 및 의약 전문가의 판단에 의해 결정된다. 일반적으로, 비경구 투여는 흡수에 더 의존적인 다른 투여방식보다 적은 투여량이 요구된다.
다른 구체예들
각각의 개별적인 특허, 특허출원 및 특허공개를 참조로서 삽입하였음을 특별하게 그리고 개별적으로 지시하였던 것처럼, 이 명세서에서 언급한 모든 특허, 특허출원 및 특허공개를, 그와 같은 정도로 여기에 참조로서 삽입한다. 2007. 8. 1, 2007. 8. 2 및 2007. 8. 6에 각각 출원한 미국 가출원 번호 제60/963,117호, 제60/963,082호 및 제60/963,867호를 여기에 참조로서 삽입한다.
<110> THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION <120> SCREENING METHODS USING G-PROTEIN COUPLED RECEPTORS AND RELATED COMPOSITIONS <130> PI090028 <150> PCT/US08/009288 <151> 2008-08-01 <150> US 60/963,867 <151> 2007-08-06 <150> US 60/963,082 <151> 2007-08-02 <150> US 60/963,117 <151> 2007-08-01 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 593 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Thr Ala Arg Ile Ala Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Leu Val Asp Ala Asp Asp Val Met 20 25 30 Thr Lys Glu Glu Gln Ile Phe Leu Leu His Arg Ala Gln Ala Gln Cys 35 40 45 Glu Lys Arg Leu Lys Glu Val Leu Gln Arg Pro Ala Ser Ile Met Glu 50 55 60 Ser Asp Lys Gly Trp Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Lys Pro Arg Lys 65 70 75 80 Asp Lys Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Pro Glu Ser Glu Glu Asp Lys Glu 85 90 95 Ala Pro Thr Gly Ser Arg Tyr Arg Gly Arg Pro Cys Leu Pro Glu Trp 100 105 110 Asp His Ile Leu Cys Trp Pro Leu Gly Ala Pro Gly Glu Val Val Ala 115 120 125 Val Pro Cys Pro Asp Tyr Ile Tyr Asp Phe Asn His Lys Gly His Ala 130 135 140 Tyr Arg Arg Cys Asp Arg Asn Gly Ser Trp Glu Leu Val Pro Gly His 145 150 155 160 Asn Arg Thr Trp Ala Asn Tyr Ser Glu Cys Val Lys Phe Leu Thr Asn 165 170 175 Glu Thr Arg Glu Arg Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile Tyr Thr 180 185 190 Val Gly Tyr Ser Val Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val Ala Val Leu Ile 195 200 205 Leu Ala Tyr Phe Arg Arg Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His Met 210 215 220 His Leu Phe Leu Ser Phe Met Leu Arg Ala Val Ser Ile Phe Val Lys 225 230 235 240 Asp Ala Val Leu Tyr Ser Gly Ala Thr Leu Asp Glu Ala Glu Arg Leu 245 250 255 Thr Glu Glu Glu Leu Arg Ala Ile Ala Gln Ala Pro Pro Pro Pro Ala 260 265 270 Thr Ala Ala Ala Gly Tyr Ala Gly Cys Arg Val Ala Val Thr Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Phe Leu Ala Thr Asn Tyr Tyr Trp Ile Leu Val Glu Gly Leu 290 295 300 Tyr Leu His Ser Leu Ile Phe Met Ala Phe Phe Ser Glu Lys Lys Tyr 305 310 315 320 Leu Trp Gly Phe Thr Val Phe Gly Trp Gly Leu Pro Ala Val Phe Val 325 330 335 Ala Val Trp Val Ser Val Arg Ala Thr Leu Ala Asn Thr Gly Cys Trp 340 345 350 Asp Leu Ser Ser Gly Asn Lys Lys Trp Ile Ile Gln Val Pro Ile Leu 355 360 365 Ala Ser Ile Val Leu Asn Phe Ile Leu Phe Ile Asn Ile Val Arg Val 370 375 380 Leu Ala Thr Lys Leu Arg Glu Thr Asn Ala Gly Arg Cys Asp Thr Arg 385 390 395 400 Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Leu Lys Ser Thr Leu Val Leu Met Pro Leu 405 410 415 Phe Gly Val His Tyr Ile Val Phe Met Ala Thr Pro Tyr Thr Glu Val 420 425 430 Ser Gly Thr Leu Trp Gln Val Gln Met His Tyr Glu Met Leu Phe Asn 435 440 445 Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys Phe Cys Asn Gly 450 455 460 Glu Val Gln Ala Glu Ile Lys Lys Ser Trp Ser Arg Trp Thr Leu Ala 465 470 475 480 Leu Asp Phe Lys Arg Lys Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr 485 490 495 Gly Pro Met Val Ser His Thr Ser Val Thr Asn Val Gly Pro Arg Val 500 505 510 Gly Leu Gly Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Leu Pro Thr Ala Thr Thr 515 520 525 Asn Gly His Pro Gln Leu Pro Gly His Ala Lys Pro Gly Thr Pro Ala 530 535 540 Leu Glu Thr Leu Glu Thr Thr Pro Pro Ala Met Ala Ala Pro Lys Asp 545 550 555 560 Asp Gly Phe Leu Asn Gly Ser Cys Ser Gly Leu Asp Glu Glu Ala Ser 565 570 575 Gly Pro Glu Arg Pro Pro Ala Leu Leu Gln Glu Glu Trp Glu Thr Val 580 585 590 Met <210> 2 <211> 591 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Met Gly Ala Ala Arg Ile Ala Pro Ser Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Leu Val Asp Ala Asp Asp Val Phe 20 25 30 Thr Lys Glu Glu Gln Ile Phe Leu Leu His Arg Ala Gln Ala Gln Cys 35 40 45 Asp Lys Leu Leu Lys Glu Val Leu His Thr Ala Ala Asn Ile Met Glu 50 55 60 Ser Asp Lys Gly Trp Thr Pro Ala Ser Thr Ser Gly Lys Pro Arg Lys 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ser Gly Lys Phe Tyr Pro Glu Ser Lys Glu Asn Lys Asp 85 90 95 Val Pro Thr Gly Ser Arg Arg Arg Gly Arg Pro Cys Leu Pro Glu Trp 100 105 110 Asp Asn Ile Val Cys Trp Pro Leu Gly Ala Pro Gly Glu Val Val Ala 115 120 125 Val Pro Cys Pro Asp Tyr Ile Tyr Asp Phe Asn His Lys Gly His Ala 130 135 140 Tyr Arg Arg Cys Asp Arg Asn Gly Ser Trp Glu Val Val Pro Gly His 145 150 155 160 Asn Arg Thr Trp Ala Asn Tyr Ser Glu Cys Leu Lys Phe Met Thr Asn 165 170 175 Glu Thr Arg Glu Arg Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile Tyr Thr 180 185 190 Val Gly Tyr Ser Met Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val Ala Val Leu Ile 195 200 205 Leu Ala Tyr Phe Arg Arg Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His Met 210 215 220 His Met Phe Leu Ser Phe Met Leu Arg Ala Ala Ser Ile Phe Val Lys 225 230 235 240 Asp Ala Val Leu Tyr Ser Gly Phe Thr Leu Asp Glu Ala Glu Arg Leu 245 250 255 Thr Glu Glu Glu Leu His Ile Ile Ala Gln Val Pro Pro Pro Pro Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Val Gly Tyr Ala Gly Cys Arg Val Ala Val Thr Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Phe Leu Ala Thr Asn Tyr Tyr Trp Ile Leu Val Glu Gly Leu 290 295 300 Tyr Leu His Ser Leu Ile Phe Met Ala Phe Phe Ser Glu Lys Lys Tyr 305 310 315 320 Leu Trp Gly Phe Thr Ile Phe Gly Trp Gly Leu Pro Ala Val Phe Val 325 330 335 Ala Val Trp Val Gly Val Arg Ala Thr Leu Ala Asn Thr Gly Cys Trp 340 345 350 Asp Leu Ser Ser Gly His Lys Lys Trp Ile Ile Gln Val Pro Ile Leu 355 360 365 Ala Ser Val Val Leu Asn Phe Ile Leu Phe Ile Asn Ile Ile Arg Val 370 375 380 Leu Ala Thr Lys Leu Arg Glu Thr Asn Ala Gly Arg Cys Asp Thr Arg 385 390 395 400 Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Leu Arg Ser Thr Leu Val Leu Val Pro Leu 405 410 415 Phe Gly Val His Tyr Thr Val Phe Met Ala Leu Pro Tyr Thr Glu Val 420 425 430 Ser Gly Thr Leu Trp Gln Ile Gln Met His Tyr Glu Met Leu Phe Asn 435 440 445 Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys Phe Cys Asn Gly 450 455 460 Glu Val Gln Ala Glu Ile Arg Lys Ser Trp Ser Arg Trp Thr Leu Ala 465 470 475 480 Leu Asp Phe Lys Arg Lys Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr 485 490 495 Gly Pro Met Val Ser His Thr Ser Val Thr Asn Val Gly Pro Arg Ala 500 505 510 Gly Leu Ser Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Pro Pro Ala Thr Thr Asn 515 520 525 Gly His Ser Gln Leu Pro Gly His Ala Lys Pro Gly Ala Pro Ala Thr 530 535 540 Glu Thr Glu Thr Leu Pro Val Thr Met Ala Val Pro Lys Asp Asp Gly 545 550 555 560 Phe Leu Asn Gly Ser Cys Ser Gly Leu Asp Glu Glu Ala Ser Gly Ser 565 570 575 Ala Arg Pro Pro Pro Leu Leu Gln Glu Glu Trp Glu Thr Val Met 580 585 590 <210> 3 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN <222> (32)..(115) <223> The native peptide is 32-115. <400> 3 Met Ile Pro Ala Lys Asp Met Ala Lys Val Met Ile Val Met Leu Ala 1 5 10 15 Ile Cys Phe Leu Thr Lys Ser Asp Gly Lys Ser Val Lys Lys Arg Ser 20 25 30 Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser 35 40 45 Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn 50 55 60 Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln 65 70 75 80 Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys 85 90 95 Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala 100 105 110 Lys Ser Gln 115 <210> 4 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN <222> (37)..(117) <223> The native peptide is 37-117. <400> 4 Met Gln Arg Arg Leu Val Gln Gln Trp Ser Val Ala Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Ala Val Pro Ser Cys Gly Arg Ser Val Glu Gly Leu Ser Arg 20 25 30 Arg Leu Lys Arg Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly 35 40 45 Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 50 55 60 Ala Glu Ile His Thr Ala Glu Ile Arg Ala Thr Ser Glu Val Ser Pro 65 70 75 80 Asn Ser Lys Pro Ser Pro Asn Thr Lys Asn His Pro Val Arg Phe Gly 85 90 95 Ser Asp Asp Glu Gly Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val Glu 100 105 110 Thr Tyr Lys Glu Gln Pro Leu Lys Thr Pro Gly Lys Lys Lys Lys Gly 115 120 125 Lys Pro Gly Lys Arg Lys Glu Gln Glu Lys Lys Lys Arg Arg Thr Arg 130 135 140 Ser Ala Trp Leu Asp Ser Gly Val Thr Gly Ser Gly Leu Glu Gly Asp 145 150 155 160 His Leu Ser Asp Thr Ser Thr Thr Ser Leu Glu Leu Asp Ser Arg Arg 165 170 175 His <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 6 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Ala Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Ala Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Ser Val Ser Glu His Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 10 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 11 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Har <400> 11 Ala Val Xaa Glu Ile Gln Leu Met His Gln Xaa Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 20 25 <210> 12 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Har <400> 12 Ala Val Xaa Glu Ile Gln Leu Met His Gln Xaa Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 13 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 14 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 15 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 16 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 17 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Ser Val Ser Glu His Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 18 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 19 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Glu Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 20 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Glu Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 21 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 22 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Ala Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Ser Gln <210> 23 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile Arg Ala Thr Ser Glu Val Ser Pro Asn Ser Lys Pro 35 40 45 Ser Pro Asn Thr Lys Asn His Pro Val Arg Phe Gly Ser Asp Asp Glu 50 55 60 Gly Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val Glu Thr Tyr Lys Glu 65 70 75 80 Gln Pro Leu Lys Thr Pro Gly Lys Lys Lys Lys Gly Lys Pro Gly Lys 85 90 95 Arg Lys Glu Gln Glu Lys Lys Lys Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp Leu 100 105 110 Asp Ser Gly Val Thr Gly Ser Gly Leu Glu Gly Asp His Leu Ser Asp 115 120 125 Thr Ser Thr Thr Ser Leu Glu Leu Asp Ser Arg Arg His 130 135 140 <210> 24 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Ala Val Ala Glu His Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 25 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Ala Val Ala Glu His Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Glu Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 26 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 27 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 28 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Ala Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 29 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Ala Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ser, Ala, Gly or Aib <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser, Ala or Aib <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ala, Asn, Glu, Val, Asp or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Leu, Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys, Arg or Har <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly, His, Arg, Ala or Aib <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Lys, Gln, Leu, His, Trp, Ala, Arg or Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> His, Arg, Leu, Phe, Trp or Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> His, Arg, Leu, Phe, Trp or Aib <400> 30 Xaa Val Xaa Glu His Gln Lys Met His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 31 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ser, Ala or Aib <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser, Ala or Aib <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ile or His <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Asn, Glu, Val, Asp or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Leu, Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys, Arg or Har <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly, His, Arg or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Lys, Gln, Leu, His, Trp, Ala or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> His, Arg, Leu, Phe, Trp or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Arg or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Trp, Phe or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Leu or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Leu or Ala <400> 31 Xaa Val Xaa Glu Xaa Gln Leu Met His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Xaa Val Glu Xaa Xaa Arg Lys Lys Xaa 20 25 <210> 32 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ser, Ala or Aib <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser, Ala or Aib <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Asn, Glu, Val, Asp or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Leu, Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly, His, Arg or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Lys, Gln, Leu, His, Trp, Ala or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> His, Arg, Leu, Phe, Trp or Ser <400> 32 Xaa Val Xaa Glu Ile Gln Leu Met His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 20 25 <210> 33 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Leu, Ala, Ser, Met, Phe or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Phe, Ala, Ser, Leu, Asn, Trp, Glu or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> His, Leu, Arg, Lys, Trp, Ile or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> His, Ala, Ser, Asn, Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Ala, Gly, Ser, Asn, Gln, Trp, Glu or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Glu, Gly, Ser, Leu, Asn, Asp, Lys or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Ile, Leu, Val, Lys or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> His or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Thr, Asn or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Ala or Phe <400> 33 Ala Val Ser Glu His Glu Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Xaa Arg Arg Arg Xaa Phe Leu Xaa Xaa Leu Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Glu Ile 35 <210> 34 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 35 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ser Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 36 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Met Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 37 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Phe Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 38 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 39 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 40 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Ser Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 41 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Leu Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 42 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Asn Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 43 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Trp Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 44 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Glu Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 45 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Lys Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 46 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 47 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His Ser Leu Ile 20 25 <210> 48 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His Asn Leu Ile 20 25 <210> 49 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 50 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His Arg Leu Ile 20 25 <210> 51 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Leu His Leu Ile 20 25 <210> 52 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Trp His Leu Ile 20 25 <210> 53 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Lys His Leu Ile 20 25 <210> 54 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Arg His Leu Ile 20 25 <210> 55 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 56 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 57 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ser Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 58 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ser Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 59 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Asn Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 60 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Asn Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 61 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Leu Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 62 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Leu Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 63 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Trp Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 64 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Trp Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 65 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 66 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ser Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 67 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Asn Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 68 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Asn Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 69 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Leu Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 70 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Leu Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 71 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Trp Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 72 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Trp Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 73 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Lys Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 74 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Lys Phe Leu His Lys Leu Ile 20 25 <210> 75 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu His Ala Leu Ile 20 25 <210> 76 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile 20 25 <210> 77 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu Lys Lys Leu Ile 20 25 <210> 78 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu Ile Lys Leu Ile 20 25 <210> 79 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu Trp Lys Leu Ile 20 25 <210> 80 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 80 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu Phe Lys Leu Ile 20 25 <210> 81 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 81 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ser Phe Leu Leu Lys Leu Ile 20 25 <210> 82 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ser Phe Leu Lys Lys Leu Ile 20 25 <210> 83 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile 20 25 <210> 84 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Lys Lys Leu Ile 20 25 <210> 85 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ser Phe Leu Leu Lys Leu Ile 20 25 <210> 86 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ser Phe Leu Lys Lys Leu Ile 20 25 <210> 87 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu His Lys Leu Ile Ala Glu 20 25 30 <210> 88 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu His His Lys Ile Ala Glu 20 25 30 <210> 89 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu 20 25 30 <210> 90 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu 20 25 30 <210> 91 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu His Lys Leu Ile Ala Glu Ile 20 25 30 <210> 92 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu His His Lys Ile Ala Glu Ile 20 25 30 <210> 93 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Ile 20 25 30 <210> 94 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Ile 20 25 30 <210> 95 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Gly Glu Ile 20 25 30 <210> 96 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ser Glu Ile 20 25 30 <210> 97 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Asn Glu Ile 20 25 30 <210> 98 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Gln Glu Ile 20 25 30 <210> 99 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Trp Glu Ile 20 25 30 <210> 100 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Glu Glu Ile 20 25 30 <210> 101 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Lys Glu Ile 20 25 30 <210> 102 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Gly Ile 20 25 30 <210> 103 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Ser Ile 20 25 30 <210> 104 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Leu Ile 20 25 30 <210> 105 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Asn Ile 20 25 30 <210> 106 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Asp Ile 20 25 30 <210> 107 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Lys Ile 20 25 30 <210> 108 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 108 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Ser 20 25 30 <210> 109 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 109 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Leu 20 25 30 <210> 110 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Val 20 25 30 <210> 111 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Lys 20 25 30 <210> 112 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala <210> 113 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Ala Ile His 20 25 30 Thr Ala <210> 114 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 114 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Ala His 20 25 30 Thr Ala <210> 115 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 115 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Ile Ala 20 25 30 Thr Ala <210> 116 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 116 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Ala Ala <210> 117 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 117 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 118 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 118 Trp Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 119 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Har <400> 119 Trp Val Xaa Glu Ile Gln Leu Met His Gln Xaa Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 120 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 120 Trp Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 121 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 121 Trp Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 20 25 <210> 122 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Har <400> 122 Trp Val Xaa Glu Ile Gln Leu Met His Gln Xaa Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 20 25 <210> 123 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Nle <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Nle <400> 123 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala 1 5 10 15 Ser Val Glu Arg Xaa Gln Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Tyr <210> 124 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 124 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Tyr 35 <210> 125 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 125 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Tyr 35 <210> 126 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Nle <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Har <400> 126 Xaa Val Xaa Glu Ile Gln Leu Xaa His Gln Xaa Ala Lys Trp Tyr 1 5 10 15 <210> 127 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Nle <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Nle <400> 127 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala 1 5 10 15 Ser Val Glu Arg Xaa Gln Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Tyr <210> 128 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Har <400> 128 Xaa Val Xaa Glu Ile Gln Leu Met His Gln Xaa Ala Lys Trp 1 5 10 <210> 129 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 20 25 <210> 130 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala 1 5 10 15 Ser Val Glu Arg Met Gln Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 131 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 131 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 132 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 132 Ala Val Ala Glu His Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 133 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 133 Ala Val Ala Glu His Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 134 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 134 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 135 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 135 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 136 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 136 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 137 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 137 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 138 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 138 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 139 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 139 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 140 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 140 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 141 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 141 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 142 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 142 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 143 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 143 Ser Val Ser Glu His Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Glu Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 144 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 144 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 145 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 145 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 146 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 146 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Ile His 20 25 30 Thr Ala Glu Ile 35 <210> 147 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 147 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Ala Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 148 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 148 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Ala Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 149 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 149 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Ala Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 150 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 150 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Ala Lys Trp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Arg Arg Val Glu Phe Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 151 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 151 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 152 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 152 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ala Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 153 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 153 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Ala 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 154 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 154 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Ala Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 155 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 155 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Ala Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 156 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 156 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Ala Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 157 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 157 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Ala Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 158 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 158 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Ala Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 159 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 159 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Ala His His Leu Ile 20 25 <210> 160 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 160 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Ala His Leu Ile 20 25 <210> 161 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 161 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Ala Ile 20 25 <210> 162 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 162 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ala 20 25 <210> 163 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 163 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Gly Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 164 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 164 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 165 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 165 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Asn Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 166 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 166 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Lys Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 167 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 167 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Gly Phe Leu His His Leu Ile 20 25 <210> 168 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 168 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His Gly Leu Ile 20 25 <210> 169 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 169 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His Leu Leu Ile 20 25 <210> 170 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 170 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His Trp Leu Ile 20 25 <210> 171 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 171 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His Glu Leu Ile 20 25 <210> 172 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 172 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Gly His Leu Ile 20 25 <210> 173 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 173 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Ser His Leu Ile 20 25 <210> 174 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 174 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Asn His Leu Ile 20 25 <210> 175 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 175 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Glu His Leu Ile 20 25 <210> 176 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 176 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Leu Glu Ile 20 25 30 <210> 177 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 177 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Trp Ile 20 25 30 <210> 178 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 178 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Asn 20 25 30 <210> 179 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 179 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Trp 20 25 30 <210> 180 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 180 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Glu Arg Arg Arg Ala Phe Leu Leu Lys Leu Ile Ala Glu Glu 20 25 30 <210> 181 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 181 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Gln Arg Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Ala Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 182 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 182 Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Ala Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 183 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 183 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 25 30 <210> 184 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 184 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile 20 25 30 <210> 185 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 185 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala 1 5 10 15 Ser Val Glu Arg Met Gln Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 186 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 186 Ala Glu Ile His Thr Ala 1 5

Claims (86)

  1. RG 형태의 PTH 수용체에 대하여 PTH(1-34) 친화도의 적어도 10%의 친화도를 갖고, R0 형태의 PTH 수용체에 대한 PTH(1-34)의 친화도보다 높은 친화도를 갖는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 일반식이 PTH(1-X)/PTHrP(Y-36)이고 PTH 수용체에 장기-작용 활성을 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 X는 11 및 30 사이의 정수이고 Y는 X+1이며, 상기 PTH(1-X)는 인간 PTH 서열(서열목록 제5서열)의 1에서 X까지의 아미노산을 나타내고, 상기 PTHrP(Y-36)는 인간 PTHrP 서열(서열목록 제6서열)의 Y에서 36까지의 아미노산을 나타내며, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 다음 변형을 포함한다: 1번 위치에 Ala; 3번 위치에 Ala 또는 Aib; 5번 위치에 His; 10번 위치에 Gln; 11번 위치에 Arg 또는 호모아르기닌(homoarginine); 12번 위치에 Ala; 14번 위치에 Trp; 및 19번 위치에 Arg 또는 Glu.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    (i) 1번 및 12번 위치에 Ala; 3번 위치에 Aib; 10번 위치에 Gln; 11번 위치에 호모아르기닌; 및 14번 위치에 Trp;
    (ii) 1번, 3번 및 12번 위치에 Ala; 10번 위치에 Gln; 11번 위치에 Arg; 및 14번 위치에 Trp; 또는
    (iii) Mc-PTH(1-11)/PTHrP(12-36)(#1160; 서열목록 제14서열), Mc-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)(#1161; 서열목록 제15서열), Mc-PTH(1-18)/PTHrP(19-36)(#1163; 서열목록 제16서열), 및 Mc-PTH(1-17)/PTHrP(18-36)(#1162; 서열목록 제139서열)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
  3. RG 형태의 PTH 수용체에 대하여 PTH(1-34) 친화도의 적어도 10%의 친화도를 갖고, R0 형태의 PTH 수용체에 대한 PTH(1-34)의 친화도보다 높은 친화도를 갖는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 PTH 수용체에 장기-작용 활성을 가지고,
    (i) Ala1,Aib3[M]PTH(1-28)(#809; 서열목록 제11서열), Ala1,Aib3[M]PTH(1-34)(서열목록 제12서열), F23,M-PTH(1-34)(#1348; 서열목록 제150서열), Mc-hPTH(1-34)(#1205; 서열목록 제131서열), E19,Mc-hPTH(1-34)(#1203; 서열목록 제21서열), H5,M-hPTH(1-34)(#1206; 서열목록 제132서열), A23,M-PTH(1-34)(#1314; 서열목록 제29서열), H5-hPTH(1-14)/rP(15-36)(#1209; 서열목록 제17서열), PTH(1-11)/PTHrP(12-36)(#1155; 서열목록 제137서열), PTH(1-17)/PTHrP(18-36)(#1156; 서열목록 제138서열), PTH(1-30)/PTHrP(31-36)(#1159; 서열목록 제27서열), Mc-PTH(1-11)/PTHrP(12-36)(#1160; 서열목록 제14서열), Mc-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)(#1161; 서열목록 제15서열), Mc-PTH(1-17)/PTHrP(18-36)(#1162), Mc-PTH(1-18)/PTHrP(19-36)(#1163; 서열목록 제16서열), E19, Mc-PTH(1-22)/PTHrP(23-36)(#1164; 서열목록 제144서열), E19, Mc-PTH(1-26)/PTHrP(27-36)(#1165; 서열목록 제145서열), 및 E19, Mc-PTH(1-30)/PTHrP(31-36)(#1166; 서열목록 제146서열)로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    (ⅱ) Mc-PTH(1-11)/PTHrP(12-36)(#1160; 서열목록 제14서열)이거나;
    (ⅲ) Mc-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)(#1161; 서열목록 제15서열)이거나;
    (ⅳ) Mc-PTH(1-18)/PTHrP(15-36)(#1163; 서열목록 제16서열)이거나; 또는
    (ⅴ) Mc-PTH(1-17)/PTHrP(18-36)(#1162; 서열목록 제139서열)인 폴리펩타이드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 부갑상선 기능 저하증, 골다공증, 골절 및 골연화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병 또는 상태 치료용 약제학적 조성물.
  5. 대상체의 부갑상선 기능 저하증 및 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병 또는 상태 치료용 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 상기 질병 또는 상태를 치료에 필요한 약제학적 유효량으로 투여되고, 피하투여용, 정맥투여용, 비강투여용, 폐통과용, 피부통과용 및 경구투여용으로 구성된 군으로부터 선택되는 제형인 폴리펩타이드.
  6. 대상체의 골절 또는 골연화증 치료용 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 상기 골절의 회복 또는 골연화증 치료에 필요한 약제학적 유효량으로 투여되고, 피하투여용, 정맥투여용, 비강투여용, 폐통과용, 피부통과용 및 경구투여용으로 구성된 군으로부터 선택되는 제형인 폴리펩타이드.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 핵산은 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산.
  9. 청구항 제 7 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  10. 청구항 제 9 항의 벡터를 포함하는 세포.
  11. 폴리펩타이드가 발현하는 환경에서 제 10 항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드 제조방법.
  12. 다음의 단계를 포함하는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 장기-작용 작동자(long-acting agonist)로서의 후보 화합물을 동정하는 방법:
    (a) RG 형태의 상기 GPCR과 상기 후보 화합물을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 GPCR의 RG 형태에 대한 상기 화합물의 친화도를 측정하는 단계;
    (c) R0 형태의 상기 GPCR과 상기 화합물을 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 GPCR의 R0 형태에 대한 상기 화합물의 친화도를 측정하는 단계; 및
    (e) 상기 화합물이 (i) 상기 GPCR의 RG 형태에 대한 내인성 작동자 친화도의 최소 10%에 해당하는 상기 GPCR의 RG 형태에 대한 친화도를 갖고, (ii) 상기 GPCR R0 형태에 대한 친화도가 상기 GPCR의 RG 형태에 대한 내인성 작동자의 친화도보다 높은 친화도를 갖는 경우 상기 화합물을 상기 GPCR의 장기-작용 작동자로 동정하고,
    선택적으로 상기 방법은 다음의 단계를 추가적으로 포함한다:
    (f) 상기 후보 화합물을 동물에 투여하는 단계 및 (g) 상기 화합물에 대한 상기 동물의 적어도 하나의 생리학적 반응을 측정하는 단계.
  13. 제 12 항에 있어서,
    (ⅰ) 상기 수용체는 인간의 수용체이거나;
    (ⅱ) 상기 GPCR는 세크레틴 패밀리 수용체이거나;
    (ⅲ) 상기 수용체는 인간의 PTH/PTHrP 수용체이거나; 또는
    (ⅳ) 상기 내인성 작동자는 인간의 PTH(1-34)인 방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    (ⅰ) 상기 수용체는 인간의 PTH/PTHrP 수용체이고 상기 내인성 작동자는 인간의 PTH(1-34)이고;
    (ⅱ) 상기 측정하는 단계 (b)는 세포 내 또는 혈액 칼슘 레벨을 측정하는 것에 의하여 실시되거나;
    (ⅲ) 상기 측정하는 단계 (b) 또는 단계 (d)는 경쟁 결합 분석법을 사용하여 실시되거나;
    (ⅳ) 상기 측정하는 단계 (b)는 지연된 cAMP 분석법(delayed cAMP assay)을 사용하여 실시되거나;
    (ⅴ) 상기 수용체는 세포상 또는 막 내에 존재하거나;
    (ⅵ) 상기 후보 화합물은 펩타이드를 포함하거나; 또는
    (ⅶ) 상기 후보 화합물은 화합물 라이브러리 또는 천연물 라이브러리로부터 유래한 것인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 경쟁 결합 분석법에서 상기 GPCR의 RG 형태는 비가수분해성 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 풍부해지는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 유사체는 GTPγS인 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 경쟁 결합 분석법에서 상기 GPCR의 RG 형태는 음성-도미넌트 G-단백질을 사용하여 풍부해지는 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
KR1020107000909A 2007-08-01 2008-08-01 Ｇ―단백질 결합 수용체를 이용한 스크리닝 방법 및 관련 조성물 Active KR101661730B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US96311707P 2007-08-01 2007-08-01
US60/963,117 2007-08-01
US96308207P 2007-08-02 2007-08-02
US60/963,082 2007-08-02
US96386707P 2007-08-06 2007-08-06
US60/963,867 2007-08-06
PCT/US2008/009288 WO2009017809A2 (en) 2007-08-01 2008-08-01 Screening methods using g-protein coupled receptors and related compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100090238A KR20100090238A (ko) 2010-08-13
KR101661730B1 true KR101661730B1 (ko) 2016-10-04

Family

ID=40305140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107000909A Active KR101661730B1 (ko) 2007-08-01 2008-08-01 Ｇ―단백질 결합 수용체를 이용한 스크리닝 방법 및 관련 조성물

Country Status (11)

Country Link
US (2) US8568737B2 (ko)
EP (2) EP2187902B1 (ko)
JP (1) JP5711966B2 (ko)
KR (1) KR101661730B1 (ko)
CN (2) CN101784281B (ko)
AU (1) AU2008282805B2 (ko)
BR (1) BRPI0814962B8 (ko)
CA (2) CA2694667C (ko)
MX (2) MX353986B (ko)
RU (1) RU2506274C2 (ko)
WO (1) WO2009017809A2 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101661730B1 (ko) 2007-08-01 2016-10-04 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 Ｇ―단백질 결합 수용체를 이용한 스크리닝 방법 및 관련 조성물
EP2411038B1 (en) * 2009-03-27 2016-12-28 Van Andel Research Institute Parathyroid hormone peptides and parathyroid hormone-related protein peptides and methods of use
EA022212B1 (ru) * 2009-04-24 2015-11-30 Кадила Хелзкэр Лимитед Короткоцепочечные пептиды в качестве агониста рецептора паратиреоидного гормона (pth)
EP2569003B1 (en) * 2010-05-13 2017-10-25 The General Hospital Corporation Parathyroid hormone analogs and uses thereof
WO2012158962A2 (en) * 2011-05-18 2012-11-22 Eumederis Pharmaceuticals, Inc. Improved peptide pharmaceuticals
WO2015037764A1 (ko) * 2013-09-16 2015-03-19 서울대학교 산학협력단 Gpcr19 경로의 활성화에 의한 골수 유래 면역 조절 세포 및 면역 조절 b 림프구의 체내외 증폭
US20170283844A1 (en) * 2014-09-11 2017-10-05 The State of Israel, Ministry of Agriculture & Rural Development, Argricultural Research Organiza Methods of producing mogrosides and compositions comprising same and uses thereof
US20190119348A1 (en) * 2016-04-01 2019-04-25 The General Hospital Corporation Parathyroid hormone receptor 1 antagonist and inverse agonist polypeptides and methods of their use
CN106267162A (zh) * 2016-08-25 2017-01-04 浙江省新华医院 促胰液素在制备治疗骨质疏松症药物中的用途
JP2021516222A (ja) 2018-03-16 2021-07-01 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 副甲状腺ホルモンポリペプチドコンジュゲートおよびその使用方法
US11298701B2 (en) 2018-11-26 2022-04-12 King Instrumentation Technologies Microtiter plate mixing control system
FR3092115B1 (fr) * 2019-01-30 2021-11-12 Cisbio Bioassays analogues de GTP fluorescents et utilisation
KR102264116B1 (ko) * 2019-06-19 2021-06-14 한국과학기술연구원 세포 소포체 내 g-단백질 연결 수용체(gpcr)의 실시간 활성 상태 분석 방법 및 컴퓨터 프로그램
CN112111003B (zh) * 2019-06-20 2022-02-11 中国农业大学 含有me序列的一类新型抑制血小板聚集和抗血栓形成寡肽

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4086196A (en) 1975-03-28 1978-04-25 Armour Pharmaceutical Company Parathyroid hormone
JPS5825980B2 (ja) 1976-02-12 1983-05-31 ヤマサ醤油株式会社 サイクリックヌクレオチドの定量法
US4849338A (en) 1982-07-16 1989-07-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay
US4843000A (en) 1979-12-26 1989-06-27 Syntex (U.S.A.) Inc. Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4675189A (en) 1980-11-18 1987-06-23 Syntex (U.S.A.) Inc. Microencapsulation of water soluble active polypeptides
JPS5896052A (ja) 1981-11-30 1983-06-07 Toyo Jozo Co Ltd 高活性ｈ−ＰＴＨ（１−３４）アミドの製造法
US4423037A (en) 1982-05-13 1983-12-27 The General Hospital Corporation Inhibitors of peptide hormone action
US4512922A (en) 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4518526A (en) 1982-12-22 1985-05-21 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511502A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4620948A (en) 1982-12-22 1986-11-04 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
JPS59204159A (ja) 1983-04-28 1984-11-19 Toyo Jozo Co Ltd 〔Ｍｅｔ（Ｏ）↑８’↑１↑８〕ｈＰＴＨ−（１−３４）ペプチド
JPS60201244A (ja) 1984-03-26 1985-10-11 Ricoh Co Ltd 湿度センサ
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
IL78342A (en) 1985-04-04 1991-06-10 Gen Hospital Corp Pharmaceutical composition for treatment of osteoporosis in humans comprising a parathyroid hormone or a fragment thereof
US4761406A (en) 1985-06-06 1988-08-02 The Procter & Gamble Company Regimen for treating osteoporosis
EP0232262A4 (en) 1985-08-15 1989-09-19 Stauffer Chemical Co TRYPTOPHANE GENERATING MICROORGANISM.
US5010010A (en) 1986-10-22 1991-04-23 Selmer-Sande, A.S. Production of human parathyroid hormone from microorganisms
US4771124A (en) 1987-05-26 1988-09-13 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists with simplified synthetic methodology
US5527772A (en) 1987-10-20 1996-06-18 Holick; Michael F. Regulation of cell proliferation and differentiation using peptides
US5605815A (en) 1988-03-14 1997-02-25 Yale University Nucleic acids encoding and expression of parathyroid hormone-like peptide
DE68921665T2 (de) 1988-05-09 1995-09-21 Merck & Co Inc Hemmer vom flüssigen kalziumerhöhenden Faktor.
US5217896A (en) 1988-12-30 1993-06-08 Oncogene Science, Inc. Monoclonal antibodies recognizing parathyroid hormone-like protein
CA2045129A1 (en) 1989-02-01 1990-08-02 Alfred I. Geller Herpes simplex virus type i expression vector
AU6448990A (en) 1989-09-29 1991-04-28 Her Majesty in Right of Canada, as represented by National Research Council Canada Synthesis of mature human parathyroid hormone
US5350836A (en) 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
ES2090297T5 (es) 1989-11-06 2005-03-01 Cell Genesys, Inc. Produccion de proteinas que utilizan recombinacion homologa.
IT1238348B (it) 1989-11-16 1993-07-13 Processo per la preparazione di costrutti genetici per l'espressione del fattore di crescita nervoso in cellule eucariote.
US5274113A (en) 1991-11-01 1993-12-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes and conjugates
US5648270A (en) 1995-02-06 1997-07-15 Molecular Probes, Inc. Methods of sensing with fluorescent conjugates of metal-chelating nitrogen heterocycles
US5326692B1 (en) 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
US5227487A (en) 1990-04-16 1993-07-13 Molecular Probes, Inc. Certain tricyclic and pentacyclic-hetero nitrogen rhodol dyes
US5453517A (en) 1992-02-25 1995-09-26 Molecular Probes, Inc. Reactive derivatives of bapta used to make ion-selective chelators
US5405975A (en) 1993-03-29 1995-04-11 Molecular Probes, Inc. Fluorescent ion-selective diaryldiaza crown ether conjugates
US5723218A (en) 1990-04-16 1998-03-03 Molecular Probes, Inc. Dipyrrometheneboron difluoride labeled flourescent microparticles
US5433896A (en) 1994-05-20 1995-07-18 Molecular Probes, Inc. Dibenzopyrrometheneboron difluoride dyes
US5459276A (en) 1994-05-20 1995-10-17 Molecular Probes, Inc. Benzazolylcoumarin-based ion indicators for heavy metals
US5266490A (en) 1991-03-28 1993-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mammalian expression vector
EP0464533B1 (de) 1990-06-28 1998-07-29 Hoechst Aktiengesellschaft Fusionsproteine mit immunglobulinanteilen, ihre Herstellung und Verwendung
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US5462856A (en) 1990-07-19 1995-10-31 Bunsen Rush Laboratories, Inc. Methods for identifying chemicals that act as agonists or antagonists for receptors and other proteins involved in signal transduction via pathways that utilize G-proteins
JPH0532696A (ja) 1990-09-28 1993-02-09 Takeda Chem Ind Ltd 副甲状腺ホルモン誘導体
US7150974B1 (en) 1991-04-05 2006-12-19 The General Hospital Corporation Parathyroid hormone receptor binding method
US7132260B2 (en) 1991-04-05 2006-11-07 The General Hospital Corporation DNA encoding parathyroid hormone receptor
US5261686A (en) 1992-04-06 1993-11-16 Buckler Clive E Semi-recumbent
JP3464796B2 (ja) 1991-04-05 2003-11-10 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ
US5208041A (en) 1991-05-23 1993-05-04 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Essentially pure human parathyroid hormone
ATE148889T1 (de) 1991-09-18 1997-02-15 Affymax Tech Nv Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren
WO1993006846A1 (en) 1991-10-10 1993-04-15 Pang Peter K T Parathyroid hormone analogues and use in osteoporosis treatment
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
DE4138621A1 (de) 1991-11-25 1993-06-17 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum screenen von substanzen mit modulierender wirkung auf einen rezeptorabhaengigen zellulaeren signaluebertragungsweg
SK74594A3 (en) 1991-12-17 1995-01-12 Procter & Gamble Pharma Treatment for treating of osteoporosis
US5434246A (en) 1992-03-19 1995-07-18 Takeda Chemical Industries, Ltd. Parathyroid hormone derivatives
US5382658A (en) 1992-04-03 1995-01-17 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Stability-enhanced variants of parathyroid hormone
US5814603A (en) 1992-06-12 1998-09-29 Affymax Technologies N.V. Compounds with PTH activity
US5589452A (en) 1992-07-14 1996-12-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Analogs of parathyroid hormone and parathyroid hormone related peptide: synthesis and use for the treatment of osteoporosis
US5821225A (en) 1992-07-14 1998-10-13 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for the treatment of corticosteroid induced osteopenia comprising administration of modified PTH or PTHrp
US5977070A (en) 1992-07-14 1999-11-02 Piazza; Christin Teresa Pharmaceutical compositions for the nasal delivery of compounds useful for the treatment of osteoporosis
AU672790B2 (en) 1992-07-15 1996-10-17 Novartis Ag Variants of parathyroid hormone and its fragments
IT1255723B (it) 1992-10-09 1995-11-13 Uso di paratormone,suoi frammenti biologicamente attivi e peptidi correlati, per la preparazione di composizioni farmaceutiche utili nella prevenzione e terapia dell'aborto e del parto pretermine ed in generale per il trattamento della gestazione
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
US5871486A (en) 1993-01-21 1999-02-16 Acumed, Inc. Variable pitch bone screw
EP0705334A1 (en) 1993-06-14 1996-04-10 Basf Aktiengesellschaft Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
WO1995002610A1 (en) 1993-07-13 1995-01-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Analogs of parathyroid hormone and parathyroid hormone related peptide: synthesis and use for the treatment of osteoporosis
US5496801A (en) 1993-12-23 1996-03-05 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Parathyroid hormone formulation
US5763416A (en) 1994-02-18 1998-06-09 The Regent Of The University Of Michigan Gene transfer into bone cells and tissues
US5656465A (en) 1994-05-04 1997-08-12 Therion Biologics Corporation Methods of in vivo gene delivery
US5714353A (en) 1994-05-24 1998-02-03 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vectors for gene therapy
CA2126132A1 (en) 1994-06-17 1995-12-18 Witold Neugebauer Peptide synthesis on chitosan
CA2126299C (en) 1994-06-20 2000-12-12 Gordon E. Willick Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis
US5836905A (en) 1994-06-20 1998-11-17 Lemelson; Jerome H. Apparatus and methods for gene therapy
CO4410206A1 (es) 1994-07-28 1997-01-09 Sandoz Ag DERIVADOS DE PTH o PTHrP, SU PREPARACION Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LAS COMPRENDEN
DE4434551A1 (de) 1994-09-28 1996-04-04 Forssmann Wolf Georg Prof Dr D Peptide aus der Sequenz des hPTH (1-37)
PL321094A1 (en) 1994-12-22 1997-11-24 Astra Ab Parathyroid hormone (pth) containing preparation administered by inhalation
US5717062A (en) 1995-06-07 1998-02-10 Beth Israel Hospital Association Cyclic analogs of PTH and PTHrP
JPH09157294A (ja) 1995-06-15 1997-06-17 Takeda Chem Ind Ltd 副甲状腺ホルモン誘導体
CA2178894A1 (en) 1995-06-15 1996-12-16 Tsunehiko Fukuda Parathyroid hormone derivatives and their use
US5723577A (en) 1995-07-13 1998-03-03 Biomeasure Inc. Analogs of parathyroid hormone
US6544949B1 (en) 1995-07-13 2003-04-08 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, S.A.S. Analogs of parathyroid hormone
US5955574A (en) 1995-07-13 1999-09-21 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, S.A. Analogs of parathyroid hormone
RU2157699C2 (ru) * 1996-03-29 2000-10-20 Биомежер Инкорпорэйтед Пептиды, обладающие сродством к рецептору паратгормона (ртн) и стимулирующие активность аденилатциклазы
ES2248853T3 (es) * 1996-07-31 2006-03-16 The General Hospital Corporation Nuevos analogos del peptido relacionado con la hormona paratiroidea.
NZ333809A (en) 1996-08-02 2000-07-28 Ca Nat Research Council Parathyroid hormone analogues for use as medicaments in treating osteoporosis
US5917123A (en) 1997-03-14 1999-06-29 University Of Pittsburgh Transgenic mice containing a nucleic acid encoding tumor necrosis factor-α under the control of a cardiac specific regulatory region
US6183974B1 (en) 1997-07-31 2001-02-06 The General Hospital Corporation Screening assays for G protein coupled receptor agonists and antagonists
CA2306344A1 (en) 1997-10-14 1999-04-22 Masahiko Sato Method of building and maintaining bone
ATE392431T1 (de) * 1998-05-05 2008-05-15 Sod Conseils Rech Applic Pth2 rezeptor selektive verbindungen
JP4486256B2 (ja) 1998-10-22 2010-06-23 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の生物活性ペプチドおよびペプチド誘導体
DE69938064T2 (de) 1998-11-25 2009-01-15 The General Hospital Corp., Boston Aminoterminal modifizierte parathyroidhormon (pth) analoge
ATE458054T1 (de) 1998-11-25 2010-03-15 Gen Hospital Corp Menschliches parathyroidhormon, modifikationen, herstellung und verwendung
AU4217299A (en) 1998-11-30 2000-06-19 General Hospital Corporation, The Pth1r and pth3r receptors, methods and uses thereof
US7057012B1 (en) 1998-12-31 2006-06-06 The General Hospital Corporation PTH functional domain conjugate peptides, derivatives thereof and novel tethered ligand-receptor molecules
EP1612263A1 (en) 1998-12-31 2006-01-04 The General Hospital Corporation PTH receptor and screening assay utilizing the same
EP1147133B1 (en) 1998-12-31 2008-08-06 The General Hospital Corporation Peptides consisting of two PTH functional domains fused by a linker molecule, and derivatives thereof
EP1222208B1 (en) 1999-09-29 2008-10-29 The General Hospital Corporation Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth)
AU7734800A (en) 1999-09-29 2001-04-30 General Hospital Corporation, The Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth)
US7022815B1 (en) * 1999-09-29 2006-04-04 The General Hospital Corporation Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (PTH)
US20050124537A1 (en) 2000-04-27 2005-06-09 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
US6756480B2 (en) 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
US7371721B2 (en) 2000-09-18 2008-05-13 Sanos Bioscience A/S Use of GLP-2 and related compounds for the treatment, prevention, diagnosis, and prognosis of bone-related disorders and calcium homeostasis related syndromes
US6838264B2 (en) 2000-12-05 2005-01-04 Immutopics, Inc. Antibodies and peptide antigens for producing antibodies having a selective binding specificity to bioactive intact parathyroid hormone (PTH) 1-84
WO2002068585A2 (en) 2001-01-17 2002-09-06 The General Hospital Corporation Tip39 polypeptides
JP4837888B2 (ja) 2001-07-23 2011-12-14 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション コンホメーションが拘束された副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）類似体
EP1531855A4 (en) * 2002-01-10 2009-07-22 Osteotrophin Llc TREATMENT OF BONE DISEASES WITH SKELETTAL ANABOLIKA
JP4541899B2 (ja) 2003-01-24 2010-09-08 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ラクタム架橋を有する、コンホメーションが制限された副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）アナログ
WO2004093902A1 (en) 2003-03-19 2004-11-04 The General Hospital Corporation CONFORMATIONALLY CONSTRAINED PARATHYROID HORMONES WITH α-HELIX STABILIZERS
US7910544B2 (en) 2003-07-17 2011-03-22 The General Hospital Corporation Conformationally constrained parthyroid hormone (PTH) analogs
CA2504920C (en) * 2004-05-14 2014-04-01 Euroscreen S.A. Ligand for g-protein coupled receptor fprl2 and uses thereof
EP1799240A4 (en) 2004-09-16 2009-07-22 Osteotrophin Llc TREATMENT OF BONE DISEASES USING SKELETAL ANABOLIC DRUGS
JP2009545320A (ja) 2006-08-04 2009-12-24 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）のポリペプチド誘導体
EP1961765A1 (en) 2006-12-08 2008-08-27 Zealand Pharma A/S Truncated PTH peptides with a cyclic conformation
KR101661730B1 (ko) 2007-08-01 2016-10-04 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 Ｇ―단백질 결합 수용체를 이용한 스크리닝 방법 및 관련 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Bone and Mineral Research,2006,21권,354-365면
J. Clinical Endocrinology and Metabolism,2003,88권,569-575면

Also Published As

Publication number Publication date
CN101784281B (zh) 2014-07-02
WO2009017809A3 (en) 2009-04-30
EP2650009A2 (en) 2013-10-16
RU2506274C2 (ru) 2014-02-10
US20140086842A1 (en) 2014-03-27
EP2650009B1 (en) 2018-02-21
RU2010107292A (ru) 2011-09-10
AU2008282805B2 (en) 2014-05-01
BRPI0814962A2 (pt) 2015-04-14
EP2650009A3 (en) 2014-01-29
EP2187902A2 (en) 2010-05-26
HK1201849A1 (en) 2015-09-11
CA2694667C (en) 2018-10-30
CA2694667A1 (en) 2009-02-05
WO2009017809A2 (en) 2009-02-05
US20110172153A1 (en) 2011-07-14
JP5711966B2 (ja) 2015-05-07
EP2187902A4 (en) 2010-10-27
CA3017668C (en) 2021-11-09
MX2010001183A (es) 2010-04-21
MX353986B (es) 2017-11-06
KR20100090238A (ko) 2010-08-13
CN104072606A (zh) 2014-10-01
CN101784281A (zh) 2010-07-21
EP2650009B8 (en) 2018-07-18
US8568737B2 (en) 2013-10-29
EP2187902B1 (en) 2013-04-17
BRPI0814962B1 (pt) 2020-09-08
AU2008282805A1 (en) 2009-02-05
CN104072606B (zh) 2017-09-22
BRPI0814962B8 (pt) 2021-05-25
US9057727B2 (en) 2015-06-16
JP2010536327A (ja) 2010-12-02
MX346714B (es) 2017-03-24
CA3017668A1 (en) 2009-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101661730B1 (ko) Ｇ―단백질 결합 수용체를 이용한 스크리닝 방법 및 관련 조성물
Ferrari et al. Endocytosis of ligand-human parathyroid hormone receptor 1 complexes is protein kinase C-dependent and involves β-arrestin2: real-time monitoring by fluorescence microscopy
Lee et al. Role of the extracellular regions of the parathyroid hormone (PTH)/PTH-related peptide receptor in hormone binding
JP4142743B2 (ja) 副甲状腺ホルモンに関連する新規ペプチド類似体
Halls et al. Multiple binding sites revealed by interaction of relaxin family peptides with native and chimeric relaxin family peptide receptors 1 and 2 (LGR7 and LGR8)
Cupp et al. Parathyroid hormone (PTH) and PTH-related peptide domains contributing to activation of different PTH receptor–mediated signaling pathways
Orloff et al. A midregion parathyroid hormone-related peptide mobilizes cytosolic calcium and stimulates formation of inositol trisphosphate in a squamous carcinoma cell line
Ismail et al. Internalization and desensitization of the human glucose-dependent-insulinotropic receptor is affected by N-terminal acetylation of the agonist
JP2001512664A (ja) Ｇタンパク質結合レセプターアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイ
Poyner et al. Characterization of receptors for calcitonin gene‐related peptide and adrenomedullin on the guinea‐pig vas deferens
Roosterman et al. Endothelin-converting enzyme-1 degrades internalized somatostatin-14
Yu et al. Kinetic and thermodynamic insights into agonist interactions with the parathyroid hormone receptor-1 from a new NanoBRET assay
HK1201849B (en) Screening methods using g-protein coupled receptors and related compositions
HK1142808B (en) A method for determining an agonist of a g protein coupled receptor
HK1142808A (en) A method for determining an agonist of a g protein coupled receptor
Bisello et al. Development of a photoreactive parathyroid hormone antagonist to probe antagonist–receptor bimolecular interaction
Zawilska et al. Receptors for VIP and PACAP in guinea pig cerebral cortex: effects on cyclic AMP synthesis and characterization by 125I-VIP binding
Behar Insights into the bimolecular interactions in the parathyroid hormone-receptor system
Bullock Molecular characterization of a constitutively active mutant dopamine D2 receptor and two prokineticin receptors

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20100114

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20130731

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20150501

Patent event code: PE09021S01D

E90F Notification of reason for final refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Final Notice of Reason for Refusal

Patent event date: 20151218

Patent event code: PE09021S02D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20160627

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20160926

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20160927

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200910

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20210909

Start annual number: 6

End annual number: 6