DE68921665T2

DE68921665T2 - Hemmer vom flüssigen kalziumerhöhenden Faktor.

Info

Publication number: DE68921665T2
Application number: DE68921665T
Authority: DE
Inventors: Michael P Caulfield; Roberta L Mckee; Ruth F Nutt; Michael Rosenblatt
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1988-05-09
Filing date: 1989-05-08
Publication date: 1995-09-21
Anticipated expiration: 2009-05-09
Also published as: JPH0222292A; EP0341962B1; DE68921665D1; EP0341962A3; CA1321281C; EP0341962A2; JPH0725799B2

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Peptidanaloga, die zur Hemmung des natürlich vorkommenden Peptids in vivo und in vitro geeignet sind. Bei Verabreichung an einen Vertebraten, wie an Säuger, blockieren diese Peptidanaloga die Aktivität des Peptids oder weiterer analoger Moleküle. Die Peptidanaloga sind ferner in vitro in Kombination mit einem Biotest für das natürlich vorkommende Peptid geeignet. Die Peptidanaloga sind zur Behandlung verschiedener Krankheiten geeignet, die verursacht werden durch einen Überschuß des natürlich vorkommenden Peptids, und zur Behandlung von Peptid-abhängigen Tumoren. Ein Beispiel für die Erfindung betrifft die Verwendung und Synthese von Analoga des humoralen hypercalcämischen Faktors (HCF), die zur Hemmung der Wirkung von HCF sowohl in vivo als auch in vitro geeignet sind.
Unlängst isolierten und erhielten mehrere Forscher Aminosäure-Teilsequenzen eines Peptids, das von mehreren verschiedenen menschlichen Tumoren stammt (dem squamösen Brochialkarzinom, dem Nierenzellenkarzinom und von Brustkrebs) J.M. Moseley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 5048 (1987); G.J. Strewler et al.,J.Clin. Invest., 80, 1803 (1987); A.F. Stewart et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 146, 672 (1987); M. Mangin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 597 (1988). Eine Gruppe veröffentlichte auf der Grundlage der komplementären DNA-(cDNA)-Nucleotidsequenz die vermeintliche Peptidstruktur in voller Länge (141 Aminosäuren), L.J. Suva et al., Science 237, 893 (1987).
Dieser neue Faktor wurde menschlicher "humoraler hypercalcämischer Faktor" (hHCF) genannt und wird hinsichtlich der biologischen Wirkungen als verwandt mit dem Parathyroidhormon (PTH) betrachtet. HCF zeigt eine beträchtliche Homologie mit der biologisch kritischen NH&sub2;-terminalen Region von PTH. Jedoch bestehen deutliche Unterschiede in den Peptidsequenzen zwischen PTH und HCF, und dieser neue Faktor ist anscheinend das Produkt eines unterschiedlichen Gens.
Bisher wurde vorgeschlagen, daß Tumore PTH ektop sezernieren und eine maligne Hypercalcämie verursachen könnten. Jedoch wurde keine Messenger-RNA für PTH in solchen Tumoren gefunden. Mehrere Studien zeigten, daß ein PTH-artiger Faktor, der physikochemisch und immunologisch von PTH verschieden ist, von Tumorzellen sezerniert wird. S.B. Rodan et al., J. Clin. Invest. 72, 1511 (1983); A.F. Stewart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S A 80, 1454 (1983); G.J. Strewler et al., J. Clin. Invest., 71, 769 (1983). Es ist ferner bekannt, daß dieser PTH-artige Faktor die Adenylatcyclase in den PTH-Zielzellen stimuliert und daß diese Aktivität von PTH-Antagonisten gehemmt werden kann. Somit wird derzeit HCF als Faktor betrachtet, aufgrund seiner Sekretion aus dem Tumor und seiner verändernden Wirkung auf den Calciumstoffwechsel der für eine maligne Hypercalcämie verantwortlich ist.
Aufgabe der Erfindung ist es darum, Antagonisten von HCF bereitzustellen. Wenn ein Peptidanalogon von HCF konstruiert werden könnte, das an den Zelloberflächen-Rezeptor von HCF binden würde, dann könnte das Peptidanalogon zur Blockierung der Wirkung des natürlich vorkommenden Peptids verwendet werden. Somit besteht eine Aufgabe der Erfindung ferner darin, Peptidanaloga bereitzustellen, die zur Behandlung der malignen Hypercalcämie geeignet sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung neuer HCF-Analoga. Weitere Aufgaben der Erfindung bestehen darin, Verfahren zur Hemmung der Wirkung von HFC durch Verabreichung der neuen HCF-Analoga bereitzustellen. Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, HCF-Analoga bereitzustellen, worin Aminosäure-Modifikationen zu einer Bindung an die Zelloberflächen-Rezeptoren führen, ohne daß ein zweites Messenger-Molekül aktiviert wird. Die obigen und weitere Aufgaben werden von der Erfindung auf die im Anschluß ausführlicher beschriebene Weise erfüllt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Im ersten Teil stellt die Erfindung Peptide bereit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hHCF(14-34)NH&sub2;, hHCF(13-34)NH&sub2;, hHCF(12-34)NH&sub2;, hHCF(11-34)NH&sub2;, hHCF(10-34)NH&sub2;, hHCF(9-34)NH&sub2; und hHCF(8-34)NH&sub2;.
Zusätzlich stellt der erste Teil der Erfindung die obigen Peptide bereit, in denen (a) Ala³&sup4; durch Tyr³&sup4; ersetzt ist und/oder (b) Phe²³ durch eine hydrophobe Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Leu, Nle, Val, Tyr, Trp, β-Naphthylalanin und α-Naphthylalanin und/oder (c) irgendeines oder jedes von Asp¹&sup0;, Lys¹¹ oder Ile¹&sup4; mit einer N-Alkyl-Aminosäure oder einem D- oder L-Stereoisomer einer Aminosäure, insbesondere mit Asn, Leu oder His, ersetzt ist.
Die Peptide, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hHCF(12-34)NH&sub2;, hHCF(11-34)NH&sub2;, hHCF(10-34) NH&sub2;, hHCF(9-34) NH&sub2; und hHCF(8-34)NH&sub2;, worin Gly¹² mit einer Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Trp, Pro, Ala, Aib, Naphthyl-Ala, α-MeTrp und NMe-Gly, stellen ebenfalls einen Gesichtspunkt des ersten Teils der Erfindung dar. Diese Peptide des ersten Teils, worin (a) Ala³&sup4; mit Tyr³&sup4; ersetzt ist und/oder (b) Phe²³ mit einer hydrophoben Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Leu, NIe, Val, Tyr, Trp, β-Naphthylalanin und α-Naphthylalanin und/oder (c) irgendeines oder jedes von Asp¹&sup0;, Lys¹¹ oder Ile¹&sup4; mit einer N-Alkyl-Aminosäure oder einem D- oder L-Stereoisomeren einer Aminosäure, insbesondere mit Asn, Leu oder His, ersetzt ist, sind ebenfalls eingeschlossen.
Eine weiteres Charakteristikum des ersten Teils der Erfindung ist das Peptid, das durch [Nle8,18] hHCF (8-34) NH&sub2; dargestellt wird, worin (a) Ala³&sup4; mit Tyr³&sup4; ersetzt ist und/oder (b) Phe²³ mit einer Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Leu, Nle, Val, Tyr, Trp, β-Naphthylalanin und α-Naphthylalanin und/oder (c) Gly¹² mit einer Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Trp, Pro, Ala, Aib, Naphthyl- Ala, α-MeTrp und NMe-Gly und/oder (d) irgendeines oder jedes von Asp¹&sup0;, Lys¹¹ oder Ile¹&sup4; mit einer N-Alkylaminosäure oder einem D- oder L-Stereoisomeren einer Aminosäure, insbesondere mit Asn, Leu oder His, ersetzt ist. Ein bevorzugtes Peptid ist hHCF(14-34)NH&sub2; und das Peptid, das die oben angegebenen Substitutionen enthält, wo es erlaubt ist.
Im zweiten Teil stellt die Erfindung Peptide bereit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hHCF(3-34)NH&sub2;,
[Tyr³&sup4;]hRCF(3-34)NR&sub2;, [Nle8,18, Tyr³&sup4;)hHCF(3-34)Nh&sub2;, [Nle8,18]hHCF(3-34)NH&sub2;; hHCF(4-34)NH&sub2;; [Tyr³&sup4;]hHCF(4-34)NH&sub2;, [Nle8,18, Tyr³&sup4;]hHCF(4-34)NH&sub2;, [Nle8,18)hHCF(4-34)NH&sub2;; hHCF(5-34)NH&sub2;, [Tyr³&sup4;)hHCF(5-34)NH&sub2;, [Nle8,18, Tyr³&sup4;)hHCF(5-34)NH&sub2;, [Nle8,18]hHCF(5-34)NH&sub2;; hHCF(6-34)NH&sub2;, (Tyr³&sup4;)hHCF(6-34)NH&sub2;, [Nle8,18, Tyr³&sup4;] hHcF(6-34)NH&sub2;, [Nle8,18]hHCF(6-34)NH&sub2;; hHCF(7-34)NH&sub2;, [Tyr³&sup4;)hHCF(7-34)NH&sub2;, [Nle8,18 Tyr³&sup4;)hHCF(7-34)NH&sub2; und [Nle8,18)hHcF(7-34)NH&sub2;.
Außerdem stellt der zweite Teil der Erfindung die obigen Peptide bereit, worin (a) Gly¹² ersetzt ist mit einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Trp, Pro, Ala, Aib, Naphthyl-Ala, α-MeTrp und NMe-Gly und/oder (b) irgendeines oder jedes von Asp¹&sup0;, Lys¹¹ oder Ile¹&sup4; mit irgendeiner Aminosäure, die ein N-Alkyl enthält, oder mit dem D- oder L-Stereoisomeren einer Aminosäure, insbesondere mit Asn, Leu oder His, ersetzt ist.
Bevorzugte Peptide des zweiten Teils lauten [D-Trp¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;, (D-Trp¹², Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2;, [D-Trp¹²,Nle8,18, Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2;, (D-Trp¹², Nie 8,18]hHCF(7-34)NH&sub2; [Asn¹&sup0;, Leu¹¹]hHCF(7-34)NH&sub2;, [Asn¹&sup0;, leu¹¹, Nle8,18]hHCF(7-34)NH&sub2;, [Nle8,18]hHCF (7-34)NH&sub2;, [Asn¹&sup0;, Leu¹¹, Nle8,18, Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2;, [Asn¹&sup0;, Leu¹¹, Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2; [Nle8,18, Try³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2;.
Bevorzugt werden ferner [Asn¹&sup0;, D-Trp¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;, [Leu¹¹, D-Trp¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;,[Ser¹&sup0;, Leu¹¹, D-TrP¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;, [Ser¹&sup0;, pro¹¹, D-Trp¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;, [ser¹&sup0;, Sar¹¹, D-Trp¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;, [Leu¹¹, D-Trp¹², Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2;.
Die Anwendung der Bezeichnungen "und/oder" in der obigen Beschreibung der Erfindung bedeutet, daß die beschriebenen Substitutionen einzeln oder in irgendeiner und allen beschriebenen Kombinationen vorgenommen werden können. Beispielsweise ist jedes von
hHCF(14-34)NH&sub2;,[Tyr³&sup4;]hHCF(14-34)NH&sub2;, [Leu²³] hHCF(7-34)NH&sub2;, [Leu²³,Tyr³&sup4;]hHCF(14-34)NH&sub2;, [Leu¹¹]hHCF(7-34)NH&sub2;, [Leu11,23]hHCF(7-34) NH&sub2;, [Leu 11,23,Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2;,
sowie die weiteren beschriebenen Kombinationen in der Erfindung eingeschlossen.
Irgendeines der oben erwähnten Peptide kann bei einem Verfahren verwendet werden, das auf einen HCF-Rezeptor einwirkt und die Verabreichung einer wirksamen Menge eines solchen Peptids an einen Säuger umfaßt. Ein Gesichtspunkt der Erfindung ist außerdem ein In-vitro-Biotest für HCF, bei dem eine dosierte Menge solcher Peptide die Bindung von HCF an einen HCF-Rezeptor in vitro hemmt. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines solchen Peptids und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff umfaßt, stellt ein weiteres Charakteristikum der Erfindung dar.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Hemmung der Wirkung von HCF bereit, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der vorstehend beschriebenen HCF-Analoga. Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Behandlung von Osteoporose oder Hypercalcämie bereit, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines vorstehend beschriebenen HCF-Analogons. Ein Verfahren zur Behandlung des Hyperparathyroidismus, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen HCF-Analoga umfaßt, wird außerdem bereitgestellt. Ein Verfahren zur Behandlung von Hyperparathyroidismus, der sich als Hypercalcämiekrise, Nierenversagen oder Bluthochdruck äußert, wird ebenfalls bereitgestellt. Ein Verfahren zur Behandlung des Krankheitszustandes, der von einem Tumor oder einer anderen Zelle erzeugt wird, die ein peptidhormonartiges Molekül im Übermaß produziert, und ein Verfahren zur Behandlung von Immunkrankheiten, bei denen der Krankheitszustand eine Entzündung, allergische Reaktion oder hyperaktive Lymphozyten umfaßt, wird ebenfalls durch die neuen erfindungsgemäßen Peptidanaloga bereitgestellt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Verschiedene weitere Aufgaben, Eigenschaften und die damit verbundenen Vorteile der Erfindung werden besser geschätzt, da dieselben anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung besser verstanden werden.
Ausgedehnte Struktur- und Aktivitätsstudien haben nun zu der Konstruktion von Peptidanaloga geführt, die eine hohe Bindungsaktivität für ihre entsprechenden Zelloberflächen-Rezeptoren aufweisen, während sie die Produktion von sekundären Messenger-Molekülen nicht stimulieren.
HCF-Analoga mit zwei bis dreizehn Aminosäuren, die von dem N-Ende entfernt worden sind, liefern einen Hemmstoff, der immer noch mit hoher Affinität an den Peptidhormonrezeptor bindet, ohne eine Veränderung in der Konzentration von cyclischem AMP zu verursachen.
Im Folgenden wird die 34-Aminosäureseguenz des menschlichen humoralen Hypercalcämiefaktors (hHCF) dargestellt:
Ala-Val-Ser-Glu-His(5)-Gln-Leu-Leu-His-Asp(10)-Lys-Gly-Lys- Ser-Ile(15)-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg(20)-Arg-Phe-Phe-Leu-His(25)- His-Leu-Ile-Ala-Gln(30)-Ile-His-Thr-Ala.
Standardabkürzungen, die in der Peptidchemie gut bekannt sind, werden hier verwendet. Aib steht für einen Aminoisobutyryl-Substituenten.
Peptidfragmente, die die Region enthalten, die für die Bindung an den Zelloberflächenrezeptor spezifisch ist, können als Hemmstoffe oder Blockierungsmittel verwendet werden. Für HCF wird angenommen, daß die 34 N-terminalen Aminosäuren genügen, um die Bindungsspezifität gegenüber dem Zelloberflächenrezeptor zu definieren.
Das Vorliegen von D-Aminosäuren anstelle von L-Aminosäuren in dem Peptid führt manchmal zu einem Peptid, das gegenüber einem Stoffwechselabbau resistent ist. Jedoch führen nicht alle derartigen Substitutionen zu einem aktiven Peptid. Somit werden solche Substitutionen, die zu einem aktiven Peptid führen, als innerhalb des Umfangs der Erfindung betrachtet. Die Verwendung von D-Aminosäuren bei der Peptidhormonsynthese wird in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben, die hier als Referenz einbezogen sind: Coltrera et al., Biochemistry, 19:4380-4385, 1980; Rosenblatt et al., Biochemistry, 20:7246-7250, 1981. Ferner werden die Ersatzverbindungen von Aminosäuren, die den hier beschriebenen Aminosäuren entsprechen, als innerhalb des Umfangs der Erfindung betrachtet.
Der Rest der Beschreibung teilt sich in zwei Abschnitte. Abschnitt I beschreibt Herstellung und Struktur von Hemmstoffen der Peptidhormone, Abschnitt II diskutiert die Verwendung der Peptidhormonhemmstoffe.

I. Herstellung und Struktur von Peptidhormon-Hemmstoffen

Die Technik der Festphasen-Peptidsynthese, entwickelt von Merrifield ("Solid-Phase Peptide Synthesis", Advances in Enzymology, 32:221-296, (1969), G. Barany und R.B. Merrifield "Solid-Phase Peptide Synthesis" in The Peptides, Band 2, Herausgeber: E. Gross & J. Meienhofer (1980)), wurde erfolgreich zur Synthese von Peptiden, einschließlich HCF, eingesetzt. Dieses Verfahren beruht auf der Strategie, daß das Carboxyende des Peptids kovalent mit einem festen Träger verknüpft wird. Die gewünschte Peptidsequenz wird hergestellt, indem die einzelnen Aminosäuren stufenweise an eine Peptidkette gekuppelt werden, die von dem Carboxyende in Richtung des Aminoendes wächst. Die Kupplung wird typischerweise durch Aktivierung der Carboxygruppe der Aminosäure, die an das Harz gebunden ist, erreicht, die weitere potentiell reaktive Gruppen in blockierter Form aufweisen kann. Nach Zugabe einer Aminosäure zu der wachsenden Polypeptidkette und vor einer weiteren Kettenverlängerung wird die α-Amino-(Boc)- Schutzgruppe typischerweise entfernt. Da jede Aminosäure nahezu durch dieselbe Serie von Reaktionen gekuppelt wird, ist der Bedarf an komplizierten Strategien bei der Synthese möglichst gering. Die Löslichkeit ist während der Synthese nicht der Hauptfaktor, da das Peptid an einen festen Träger gebunden ist. Dieses Verfahren ist schnell und kann von einem einzigen Arbeiter durchgeführt werden. Es ist zur Synthese von vielen Analoga mit Substitutionen am Aminoende sehr zweckmäßig, da sich eine einzige Synthese in der Nähe des Aminoendes in mehrere Richtungen aufspalten kann, wodurch viele Analoga erzeugt werden, die nur hinsichtlich der aminoterminalen Region variieren.

II. Verwendung der Peptidhemmstoffe

Das Verfahren zur Hemmung der Wirkung des HCF-Peptids umfaßt die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines HCF-Peptidanalogons. Diese Peptidanaloga behalten die Spezifität gegenüber dem Zelloberflächenrezeptor ohne Stimulation einer physiologischen Reaktion bei. Dieses Anwendungsverfahren läßt sich auf das gesamte Peptid oder sein Analogon oder auf ein Peptidfragment oder Analogon, das die Rezeptorbindungsstelle enthält, anwenden.
Die Verwendung von Peptidanaloga wird anhand der HCF-Analoga erläutert. HCF ist menschlichen Ursprungs, jedoch kann sich HCF von Rind, Ratte oder irgendeinem Säuger als Ursprung mit dem menschlichem HCF als ebenbürtig erweisen. Das Analogon kann sämtliche angegebenen Aminosäuren enthalten oder zusätzlich Fragmente oder Verlängerungen. Zur Verbesserung der biologischen oder chemischen Stabilität können einzelne Aminosäuren substituiert sein.
Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga können in vitro zur Messung der Konzentration des natürlich vorkommenden Peptids verwendet werden. Dieses Biotest-Verfahren wird anhand eines Biotests für HCF erläutert. Die unbekannte HCF-Konzentration in einer Lösung kann bestimmt werden, indem die Menge des HCF-Analogons gemessen wird, die zur Hemmung seiner Bindung an den HCF-Zelloberflächenrezeptor erforderlich ist. Die Konzentration des HCF-Analogons, die zur Blockierung der Wirkung von HCF erforderlich ist, ist ein direktes Zeichen für die HCF-Konzentration.
HCF-Analoga können zur Diagnose der Ethiologie oder zur Behandlung der Osteoporose oder Hypercalcämie durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen HCF-Analoga verwendet werden. Gleichermaßen können Hyperparathyroidismus und weitere Gesichtspunkte des Hyperparathyroidismus, wie eine hypercalcämische Krise, Nierenversagen oder Bluthochdruck, durch Verabreichung der erfindungsgemäßen HCF-Analoga behandelt werden.
Tumore und weiteres übermäßiges Zellwachstum erzeugen hormonartige Substanzen, die zu einem Krankheitszustand führen. Die Verwendung von Peptidanaloga zur Blockierung der Stimulation, die von solchen hormonartigen Substanzen verursacht wird, kann zur Linderung des Krankheitszustandes führen. Ein Beispiel hierfür ist der humorale maligne hypercalcämische Faktor. Darum können die erfindungsgemäßen HCF-Peptidanaloga zur Behandlung von Krankheiten verabreicht werden, die durch eine übermäßige Produktion hormonartiger Substanzen verursacht werden.
Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga zeigen sowohl eine orale als auch parenterale Aktivität und können in Dosierungsformen zur oralen, parenteralen, intranasalen oder topischen Verabreichung formuliert werden. Feste Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate. In solchen festen Dosierungsformen wird die aktive Verbindung mit wenigstens einem inerten Verdünnungsmittel, wie Saccharose, Lactose oder Stärke, vermischt. Solche Dosierungsformen können ferner, wie es normalerweise praktiziert wird, abgesehen von dem inerten Verdünnungsmittel, weitere Substanzen umfassen. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch Puffermittel umfassen. Tabletten und Pillen können außerdem mit einem magensaftresistenten Überzug hergestellt werden.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen eine pharmazeutisch verträgliche Emulsion, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, die im allgemeinen in der pharmazeutischen Technik verwendet werden. Abgesehen von inerten Verdünnungsmitteln können solche Zusammensetzungen auch Hilfsstoffe, wie Netzmittel, Emulgatoren oder Suspensionsmittel und Süßstoff, enthalten. Die erfindungsgemäßen Präparationen zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Beispiele für nichtwäßrige Lösungsmittel oder Hilfsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat.
Die Dosierung des aktiven Bestandteils in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können variiert werden, jedoch ist es notwendig, daß die Menge des aktiven Bestandteils so ist, daß eine geeignete Dosierungsform erhalten wird. Die ausgewählte Dosierungsform hängt von der gewünschten therapeutischen Wirkung, von dem Verabreichungsweg und von der Dauer der Behandlung ab.
Es ist offensichtlich, daß im Lichte der obigen Lehren zahlreiche Modifikationen und Variationen der Erfindung möglich sind. Darum versteht es sich auch, daß es innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche liegt, daß die Erfindung anders praktiziert wird als hier speziell beschrieben.

BEISPIEL 1

Synthese und Reinigung von Peptidanaloga von HCF

HCF-Analoga wurden durch eine Modifikation des Festphasenverfahrens von Merrifield hergestellt. Die Synthesen wurden unter Verwendung eines 430A-Synthesizers von Applied Biosystems durchgeführt. 4-Methylbenzhydrylamin-Hydrochlorid-Harz (Polystyrol, 1 % in Divinylbenzol, USB) wurde als fester Träger eingesetzt, um die COOH-terminale Carboxamid-(CONH&sub2;)-Modifikation durchzuführen.
Die tertiäre Ethyloxycarbonyl-(Boc)-Gruppe wurde zum Schutz der α-Aminogruppe einer jeden Aminosäure während des Kuppelns verwendet. Der Schutz einer Seiten-Funktion wurde wie folgt erzielt: (a) die Hydroxygruppe von Serin wurde als O-Benzylether (Bzl) geschützt, (b) die Hydroxygruppe von Tyrosin wurde als 0-2,6-Dichlorbenzylether (DCB) oder p-Brombenzyloxycarbonylester (Brz) geschützt, (c) die Carboxygruppe von Glutamin- und Aspartamsäure als Benzyl (BZ) oder Cyclohexylester (Chx), (d) der Imidazolstickstoff von Histidin durch die Benzyloxyinethyl-(BOM)-Funktion, und die Guanidinfunktion von Arginin wurde durch die p-Toluolsulfonyl-(TOS)-Gruppe und das Indolimin durch Formylgruppen (For) geschützt und (e) die Lysin-&epsi;-Aminogruppe durch 2-Chlorbenzyloxycarboxyl (ClZ). Sämtliche Aminosäuren wurden von Applied Biosystems, Inc., Peninsula Laboratories oder von Bachem Chemicals bezogen.
Die Peptidharz-Synthesen wurden unter Anwendung der beschriebenen Protokolle von Applied Biosystems, Inc., durchgeführt. Doppelte Kupplungen wurden zum Einbau jeder Aminosäure durchgeführt. Nach der letzten Kupplung eines jeden Arginins (Reste 18-21) wurden die verbleibenden freien Aminogruppen acetyliert, um die Bildung von Deletionspeptiden zu verhindern. Die Zeiten zur Entfernung der Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure (TFA) wurden im Vergleich zu den Herstellerprotokollen um 6 Minuten verlängert.
Das Peptid wurde von dem Copolymerharz unter gleichzeitiger Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen ähnlich dem zweistufigen HF-Spaltungsverfahren, das von Tam, J.A.C.S. 105: 6442-6455 (1983) beschrieben worden ist, abgespalten. In der ersten HF-Stufe wurden die folgenden Verhältnisse von Reagentien angewendet: 5 % p-Cresol, 5 % Thiocresol, 65 % Dimethylsulfid und 25 % HF. 1O ml des Gemisches pro g Peptidharz wurden 2 Stunden lang bei 0 ºC verwendet. In der zweiten HF-Stufe wurde das folgende Verhältnis an Reagentien verwendet: 5 % P-Cresol, 5 % p-Thiocresol und 90 % HF. Die Spaltung wurde 75 Minuten lang bei 0 ºC durchgeführt. Nach Entfernung von HF wurde das Peptid-Harzgemisch zur Entfernung der Radikalfänger mit wasserfreiem Ether gewaschen. Das Peptid wurde anschließend mit 50 % Essigsäure und Wasser extrahiert. Die Waschwasser wurden vereinigt und unter Verwendung von Sephadex G-50F chromatographiert, wobei mit 50 % HOAc eluiert wurde.
Nach der Lyophilisation wurde das teilweise gereinigte Peptid durch Reverse-phase-HPLC (C&sub4;-gebundenes Siliciumdioxid von Vydac, 15 u Teilchengröße, 300 Å Porengröße unter Verwendung eines Gradienten aus wäßrigem Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA) chromatographiert.

BEISPIEL 2

Ergebnisse des HCF-Bindungstests

HCF-Analoga wurden anhand eines neuen Rezeptortests (Goldman et al., Endocrinol. (1988) 123: 1468-1475) analysiert, der den Test modifizierte, der von Rosenblatt et al., Endocrin 107: 545-550 (1980) beschrieben wurde. Der Bindungstest verwendete [Nle8,18 (¹²&sup5;I)-Tyr³&sup4;]bPTH(1-34)NH&sub2;, das durch HPLC (Novapak-C&sub1;&sub8;, 32-35 % CH&sub3;CN in 0,1 % TFA) gereinigt und in Form von Aliquoten in 25 mM Tris -HCl/1 % BSA bei -70 ºC aufbewahrt wurde. Nierenrinden-Plasmainembranen von Rindern wurden mit radioaktivem Liganden (25 000 cpm) in Abwesenheit oder Gegenwart von HCF-Analoga in einem Tris-haltigen Puffer (250 ul) 30 Minuten lang bei 21 ºC inkubiert. Nach Erreichen des Gleichgewichts wurden der gebundene und freie radioaktive Ligand durch Zentrifugieren getrennt. Is wurde durchwegs eine hochspezifische Bindung (85 %) an die kortikalen Rinder- Nierenmembranen erhalten. Struktur Bindung KI(nM)

BEISPIEL 3

HCF-Analoga wurden in einem Test mit Adenylatcyclase aus der Rinder-Nierenmembran, wie bei Horiuchi et al., Science 238: 1566 (1987), Goldman et al., Endocrin (1988) 123(5), 1468- 1475 beschrieben, analysiert. 3 nM [Nle8,18, Tyr34]bPTH(1- 34)NH&sub2; wurde zur Stimulation der Adenylatcyclase verwendet. Struktur Bindung KI(nM)

BEISPIEL 4

HCF-Analoga wurden in einer Ratten-Osteosarcom-Zellinie, ROS 17/2,8, auf die Fähigkeit analysiert, die cAMP-Stimulation durch 1 nM[Nle8,18, Tyr³&sup4;]bPTH(1-34)NH&sub2; durch das bei McKee, R. et al., Endocrinol. (1988) 122(6): 3008-10 beschriebene Verfahren zu hemmen. Struktur Bindung KI(nM)

BEISPIEL 5

HCF-Analoga wurden auf ähnliche Weise, wie in Beispiel 4 beschrieben, auf ihre Fähigkeit getestet, die PTH-stimulierte Adenylatcyclase in menschlichen Osteosarkomzellen (B10) zu hemmen. Struktur Bindung KI(nM)

BEISPIEL 6

HCF-Analoga wurden wie in Beispiel 2 beschrieben auf ihre Fähigkeit getestet, die I¹²&sup5;-markierte PTH-Bindung an Plasmamembranen, die von der menschlichen Osteosarkomzelle (B10) stammen, auf ähnliche Weise zu hemmen. Struktur Bindung KI(nM)

Claims

1. Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hHCF(14-34)NH&sub2;, hHCF(13-34)NH&sub2;, hHCF(12-34)NH&sub2;, hHCF(11-34)NH&sub2;, hHCF(10-34)NH&sub2;, hHCF(9-34)NH&sub2; und hHCF(8-34)NH&sub2;.

2. Peptid nach Anspruch 1, worin (a) Ala³&sup4; durch Tyr³&sup4; ersetzt ist und/oder (b) Phe²³ durch eine Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Leu, Nie, Val, Tyr, Trp, beta-Naphthylalanin und alpha-Naphthylalanin, und/oder (c) irgendeines oder jedes von Asp¹&sup0;, Lys¹¹ oder Ile¹&sup4; durch eine N-Alkylaminosäure oder ein D- oder L-Stereoisomer einer Aminosäure, insbesondere Asn, Leu und His, ersetzt ist.

3. Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hHCF(12-34) NH&sub2;, hHCF(11-34)NH&sub2;, hHCF(10-34)NH&sub2;, hHCF(9-34)NH&sub2; und hHCF(8-34)NH&sub2;, worin Gly¹² durch eine Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Trp, Pro, Ala, Aib, Naphthyl-Ala, alpha-MeTrp und NMeGly.

4. Peptid nach Anspruch 3, worin (a) Ala³&sup4; durch Tyr³&sup4; ersetzt ist und/oder (b) Phe²³ durch eine Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Leu, NIe, Val, Tyr, Trp, beta-Naphthylalanin und alpha-Naphthylalanin, und/oder (c) irgendeines oder jedes von Asp¹&sup0;, Lys¹¹ oder Ile¹&sup4; durch eine N-Alkylaminosäure oder ein D- oder L-Stereoisomer einer Aminosäure, insbesondere Asn, Leu und His, ersetzt ist.

5. Peptid, das [Nle8,18]hHCF(8-34)NH&sub2; ist, worin (a) Ala³&sup4; durch Tyr³&sup4; ersetzt ist und/oder (b) Phe²³ durch eine Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Leu, Nle, Val, Tyr, Trp, beta-Naphthylalanin und α-Naphthylalanin, und/oder (c) irgendeines oder jedes von Asp¹&sup0;, Lys¹¹ oder Ile¹&sup4; durch eine N-Alkylaminosäure oder ein D- oder L-Stereoisomer einer Aminosäure, insbesondere Asn, Leu oder His, ersetzt ist, und/oder (d) Gly¹² durch eine Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- oder L-Stereoisomeren von Trp, Pro, Ala, Aib, Naphthyl-Ala, alpha-MeTrp und NMeGly.

6. Peptid nach Anspruch 1, das hHCF(14-34)NH&sub2; ist.

7. Peptid nach Anspruch 3, das [D-Trp¹²])hHCF(10-34)NH&sub2; ist.

8. Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

hHCF(3-34)NH&sub2;, [Tyr³&sup4;]hHCF(3-34)NH&sub2;, [Nle8,18, Tyr³&sup4;]hHCF(3-34)NH&sub2;, [Nle8,18]hHCF(3-34)NH&sub2;; hHCF(4-34)NH&sub2;; [Tyr34]hHCF(4-34)NH&sub2;, [Nle8,18, Tyr³&sup4;]hHCF(4-34)NH&sub2;, [Nle8,18]hHCF(4-34)NH&sub2;; hHCF(5-34)NH&sub2;, [Tyr³&sup4;]hHCF(5-34)NH&sub2;, [Nle8,18, Tyr³&sup4;]hHCF(5-34)NH&sub2;, [Nle8.18]hHCF(5-34)NH&sub2;; hHCF(6-34)NH&sub2;, [Tyr³&sup4;]hHCF(6-34)NH&sub2;, [Nle8,18, Tyr³&sup4;]hHCF(6-34)NH&sub2;, [Nle8,18]hHCF(6-34)NH&sub2;; hHCF(7-34)NH&sub2;, [Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2;, [Nle8,18, Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2; und [Nle8,18]hHCF(7-34)NH&sub2;.

9. Peptid nach Anspruch 8, worin (a) Gly¹² durch eine Aminosäure ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den L- oder D-Stereoisomeren von Trp, Pro, Ala, Aib, Naphthyl-Ala, alpha-MeTrp und NMeGly, und/oder (b) irgendeines oder mehrere von Asp¹&sup0;, Lys¹¹ oder Ile¹&sup4; durch eine N-Alkylaminosäure oder ein D- oder L-Stereoisomer einer Aminosäure, insbesondere Asn, Leu oder His, ersetzt sind.

10. Peptid nach Anspruch 8 oder 9, das

[D-Trp¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;, [D-Trp¹², Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2;, [D-Trp¹², Nle8,18, Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2;, [D-Trp¹², Nle8,18]hHCF(7-34)NH&sub2;, [Asn¹&sup0;, Leu¹¹]hHCF(7-34)NH&sub2;,[Asn¹&sup0;, [D-Trp¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;,[Ser¹&sup0;, Leu¹¹, [D-Trp¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;,[Ser¹&sup0;, Pro¹¹, [D-Trp¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;,[Ser¹&sup0;, Sar¹¹, [D-Trp¹²]hHCF(7-34)NH&sub2;,[Leu¹¹, D-Trp¹², Tyr³&sup4;]hHCF(7-34)NH&sub2;.

ist.

11. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Einwirkung auf einen HCF-Rezeptor bei Säugern geeignet ist.

12. Pharmazeutisches Präparat, das eine wirksame Menge eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff umfaßt.