HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die für
ein humanes vasokonstriktives Peptid, nämlich Endothelin-3,
codierend ist, eine Transformante, die einen diese DNA
umfassenden Vektor enthält, ein Vorläuferprotein (oder ein
Vorläufer-Polypeptid) von Endothelin-3 und ein Verfahren zur
Herstellung des reifen Proteins (Endothelin-3).
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In dieser Beschreibung wird der Begriff "Vorläuferprotein"
vorzugsweise verwendet, um ein Protein zu beschreiben, das
eine Aminosäure-Sequenz eines reifen Peptids umfasst und wobei
ein Teil einer Aminosäuresequenz oder die gesamte
Aminosäüresequenz mit einem DNA-Segment des Peptids am N-Terminus, dem
C-Terminus oder an beiden Termini davon codiert ist.
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Es liegen Berichte über Endothelium-abhängige Vasokonstriktor-
Reaktionen auf verschiedene mechanische und chemische Stimuli
sowie Endothelium-abhängige vasodilatative Reaktionen vor.
Beispielsweise ist bekannt, dass eine Vasokonstriktion durch
mechanische Belastungen wie eine Gefäßdehnung und einen
erhöhten Gefäßinnendruck induziert werden kann oder durch Mittel
wie Thrombin chemisch induziert werden kann. Weiterhin kann
eine Vasokonstriktion durch Anoxie-Bedingungen induziert
werden. Eine durch Noradrenalin induzierte Vasokonstriktion
kann durch die Verwendung von Neuropeptid Y verstärkt werden
[K. Takemoto, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79, 5485 (1982);
C. Minth et al., ibid. 81, 4577 (1984)]. Von endothelialen
Zellen stammende koronarvaskuläre Konstriktorfaktoren (jeweils
mit Molmassen von 8500 und 3000) werden in K. A. Hickey et
al., Am. J. Physiol. 248, C550 (1985), und in R. F. O'Brien,
J. Cell Physiol. 132, 263 (1987), beschrieben. Deren
Strukturen waren jedoch unbekannt. Eine von endothelialen Zellen
stammende, peptidartige Substanz wird auch von M. N. Gillespie
et al., J. Pharac. Exp. Ther. 236, 339 (1985), beschrieben.
Die Struktur dieser Substanz ist jedoch ebenfalls unbekannt.
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Vasopressin ist als Peptid mit einer vasokonstriktorischen
Wirkung bekannt, und seine Aminosäuresequenz wurde bestimmt.
Es gibt jedoch keine Berichte darüber, dass Vasopressin aus
vaskulären Endothelialzellen von Säugetieren oder Vögeln
erhalten wurde. Obwohl ein Bericht darüber vorliegt, dass ein
Angiotensin mit einer vasokonstriktorischen Wirkung aus den
Endothelialzellen von Rinder-Aorten erhalten wurde [I. Kifor
und V. J. Dzav, Circ. Res. 60, 422 (1987)], ist das
Angiotensin ein Peptid mit einer Molmasse von nur etwa 1000.
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Einigen Erfindern der vorliegenden Erfindung gelang zuvor die
Isolierung eines Schweine-Endothelins als Peptid mit einer
ähnlichen vasokonstriktorischen Wirkung aus den
Endothelialzellen von Schweine-Aorten (japanische Offenlegungsschrift Nr.
206997/1989). Einigen der Erfinder der vorliegenden Erfindung
gelang auch die Isolierung von humanem Endothelin und das
Klonieren von Schweine-EndothelincDNA und humanem
EndothelincDNA (japanische Patentanmeldungen Nr. 275613/1987,
313155/1987, 148158/1988 und 274454/1988). Die reifen
Polypeptide des Schweine-Endothelins und des humanen Endothelins
haben dieselbe Aminiosäuresequenz und werden als Endothelin-1
bezeichnet.
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Weiterhin haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung
Patentanmeldungen mit Bezug auf die Isolierung von Ratten-
Endothelin und die Klonierung der cDNA davon eingereicht
(japanische Patentanmeldung Nr. 174935/1988 und 188083/1988),
und dieses Ratten-Endothelin wird als Endothelin-3 bezeichnet.
Die Aminosäuresequenz des reifen Ratten-Endothelin-3 ist
weiterhin aus Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 85, S. 6964-
6967, September 1988, bekannt.
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Weiterhin haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung auch
eine Patentanmeldung mit Bezug auf die Isolierung von Maus-
Endothelin und die Klonierung der cDNA davon eingereicht
(japanische Patentanmeldung Nr. 223389/1988), und dieses Maus-
Endothelin wird als Endothelin B bezeichnet.
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Die Aminosäuresequenzen von Endothelin-1, Endothelin-B und
Endothelin-3 sind in Fig. 3 vergleichend dargestellt.
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Endothelin ist ein allgemeiner Begriff für Peptide mit einer
Molmasse von 2500 ±300 und 21 Aminosäureresten einschließlich
vier Cysteingruppen, die am 1., 3., 11. und 15. Rest ab dem
N-Terminus der Aminosäuresequenz, die zwei Sätze Disulfid-
Bindungen bilden, lokalisiert sind. Eine der Kombinationen der
Disulfid-Bindungen kann über die Cysteingruppen 1-15 und 3-11
und die andere über 1-11 und 3-15 verlaufen. Die
Bildungsgeschwindigkeit und Aktivität von ersterer sind höher als die
von letzterer.
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Diese obigen Endotheline werden verschieden bezeichnet, und
in der vorliegenden Erfindung werden neu vereinheitlichte
Namen für die Endotheline in der vorliegenden Erfindung
verwendet. Sie sind nachfolgend zum Vergleich mit den bisherigen
Namen aufgeführt:
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Neu vereinheitlichte Namen Bisherige Namen
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Endothelin-1 Endothelin A
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Humanes Endothelin
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Schweine-Endothelin
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Endothelin a
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Endothelin-B Maus-Endothelin
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Endothelin B
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Endothelin β
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Endothelin-3 Endothelin C
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Endothelin γ
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Ratten-Endothelin
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Wie oben beschrieben wurde, sind homologe Endothelin-Peptide
aus verschiedenartigen Tieren gefunden worden. Es sind jedoch
keine neuen homologen Gene aus denselben Tierspezies gefunden
worden. Es ist daher ein aktuelles Thema, neues homologes
Endothelin weiter zu screenen und die Struktur und Aktivität
des Endothelins zu untersuchen, um dadurch seine Brauchbarkeit
zu untersuchen, und das neue Peptid durch Gen-Rekombination
zu klonen oder dessen Massenherstellung einzuführen.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben
verschiedenartige Untersuchungen durchgeführt, wobei sie berücksichtigt
haben, dass wichtige Beiträge zu zukünftigen Untersuchungen
und medizinischen Behandlungen geleistet werden, wenn ein
neues homologes Gen mit der oben beschriebenen
vasokonstriktorischen Wirkung gesammelt und weiterhin durch
Gen-Rekombination hergestellt werden kann. Als Ergebnis wurden die folgenden
Informationen erhalten, wodurch die vorliegende Erfindung
bewerkstelligt wurde.
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Den Erfindern der vorliegenden Erfindung ist es nämlich
gelungen, eine neue humane Endothelin-DNA zu klonen, deren
Aminosäuresequenz des reifen Proteins dieselbe wie die des
obigen Endothelin-3 [Ratten-Endothelin (Endothelin C)] ist,
sich davon jedoch durch die Codierung der Nucleotid-Sequenz
für das reife Protein und die Sequenz der Vorläufer-Aminosäure
unterscheidet. Die Erfinde r haben diese DNA als "humane
Endothelin-3-DNA" und den Vorläufer als "Vorläuferprotein von
humanem Endothelin-3" bezeichnet.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung werden (I) eine DNA-Sequehz,
die für ein Vorstufenprotein von humanem Endothelin-3 cödie =
rend ist, (2) ein Vorläuferprotein von humanem Endothelin-3,
(3) eine Transformante, enthaltend einen Vektor, der die in
(I) beschriebene DNA-Sequenz umfasst, und (4) ein Verfahren
zur Herstellung von reifem Endothelin-3, umfassend das
Kultivieren der in (3) beschriebenen Transformante, die Herstellung
und das Akkumulieren eines Proteins in einem Kulturmedium und
das Sammeln des so erhaltenen Proteins, verfügbar gemacht.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 zeigt vereinfachte Karten von Restriktionsenzymen einer
DNA-Sequenz, die einen Endothelin-2-Vorläufer oder ein reifes
Peptid-DNA-Segment enthält, und einer DNA-Sequenz, die ein
menschliches Endothelin-3-DNA-Segment enthält.
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Fig. 2 zeigt eine Nucleotidsequenz des Endothelin-2-Vorläufers
oder des reifen Peptid-DNA-Segments, eine Nucleotidsequenz des
humanen Endothelin-3-DNA-Segments, Nucleotidsequenzen von
Endothelin-1 und Ratten-Endothelin-3 als Vergleichsbeispiele
und deren Aminosäuresequenzen, die daraus geschlossen werden,
und
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Fig. 3 zeigt eine Aminosäuresequenz des reifen humanen
Endothelin-2-Peptids, das aus der in Fig. 2 dargestellten
Nucleotidsequenz geschlossen wurde, und die
Aminosäuresequenzen von Endothelin-1, Endothelin B und Endothelin-3.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die DNA der vorliegenden Erfindung, die für einen Vorläufer
von menschlichem Endothelin-3 codierend ist, wird durch die
folgende Formel (3) oder einen Teil davon dargestellt:
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In Fig. 2 ist dargestellt, dass diese DNA-Sequenz von den
bekannten Sequenzen verschieden ist.
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Die DNA-Sequenz, die reifen Proteinen entspricht, ist in
Formel (3) durch Nr. 34 bis 96 dargestellt.
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Vorläufer von humanem Endothelin-3 umfassen die folgende,
durch Formel (4) dargestellte Aminosäuresequenz, die sich von
der in Fig. 2 dargestellten Aminosäuresequenz des Ratten-
Endothelin-3-Vorläufers unterscheidet.
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In der
vorliegenden Erfindung kann beispielsweise ein
Expressionsvektor mit derjenigen DNA-Sequenz, die die für reifes
Endothelin-3 codierende Nucleotidsequenz enthält, durch das
folgende Verfahren hergestellt werden:
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(a) Messenger-RNA (mRNA) wird aus Endothelin-3 produzierenden
Zellen isoliert.
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(b) Einsträngige Komplementär-DNA (cDNA) wird aus der mRNA
synthetisiert, gefolgt von der Synthese von
doppelsträngiger DNA.
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(c) Die Komplementär-DNA wird in einen Klonierungsvektor wie
einen Phagen oder ein Plasmid eingeführt.
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(d) Wirtszellen werden mit dem so erhaltenen rekombinanten
Phagen oder Plasmid transformiert.
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(e) Nach der Kultivierung der so erhaltenen Transformanten
werden Plasmide oder Phagen, die die erwünschte DNA
enthalten, durch ein geeignetes Verfahren wie die
Hybridisierung mit einer DNA-Sonde, die für einen Teil von
Endothelin-3 codierend ist, oder einen Immunoassay unter
Verwendung eines Anti-Endothelin-3-Antikörpers isoliert.
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(f) Die erwünschte geklonte DNA-Sequenz wird aus der
rekombinanten DNA geschnitten.
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(g) Die geklonte DNA-Sequenz oder ein Teil davon wird
stromabwärts von einem Promotor im Expressionsvektor ligiert.
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Die für Endothelin-3 codierende mRNA kann aus verschiedenen
Endothelin produzierenden Zellen wie endothelialen Zellen von
humanen Aorten und humanen Plazenten erhalten werden.
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Methoden zur Herstellung der mRNA aus Endothelin-3
produzierenden Zellen umfassen das Guanidinthiocyanat-Verfahren [J.
M. Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)] und
dergleichen.
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Unter Verwendung der so erhaltenen mRNA als Matrize wird cDNA
mittels reverser Transcriptase beispielsweise gemäß dem
Verfahren von H. Okayama et al. [Molecular and Cellular Biology
2, 161 (1979); ibid. 3, 280, (1983)] synthetisiert. Die so
erhaltene cDNA wird in das Plasmid eingeführt.
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Die Plasmide, in die die cDNA eingeführt werden kann, umfassen
beispielsweise pBR322 [Gene 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene 4, 121
(1978)], pUCl2 [Gene 19, 259 (1982)] bzw. pUCl3 [Gene 19, 259
(1982)], die jeweils von Escherichia coli stammen, und pUB110,
das von Bacillus subtilis stammt [Biochemical and Bionhysical
Research Communication 112, 678 (1983)]. Jedes andere Plasmid
kann jedoch verwendet werden, solange es in der Wirtszelle
replizierbar und vermehrbar ist. Beispiele für die
Phagenvektoren, in die die cDNA eingeführt werden kann, umfassen
λgtll [R. Young und R. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
80, 1194 (1983)]. Es kann jedoch jeder andere Phagenvektor
verwendet werden, solange er in der Wirtszelle vermehrbar ist.
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Methoden zum Einführen der cDNA in das Plasmid umfassen
beispielsweise die Methode, die in T. Maniatis et al., Molecular
Clonina, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 239 (1982)
beschrieben ist. Methoden zum Einführen der cDNA in den
Phagenvektor umfassen beispielsweise die Methode von T. V. Hyunh et
al. [DNA Clonina, A Practical Approach 1, 49 (1985)].
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Das so erhaltene Plasmid wird in eine geeignete Wirtszelle wie
Escherichia und Bacillus eingeführt.
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Beispiele für die oben beschriebene Escherichia umfassen
Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 60, 160
(1968)], M103 [Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)], JA221
[Journal of Molecular Biöloay 120, 517 (1978)], HB101 [Journal
of Molecular Biology 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics 39,
440 (1954)].
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Beispiele für den oben beschriebenen Bacillus umfassen
Bacillus subtilis MI114 [Gene 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal
of Biochemistrv 95, 87 (1984)].
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Methoden zum Transformieren der Wirtszelle mit dem Plasmid
umfassen beispielsweise die Calciumchlorid-Methode oder die
Calciumchlorid/Rubidiumchlorid-Methode, die in T. Maniatis et
al., Molecular Clonina, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 249
(1982) beschrieben ist.
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Wenn ein Phagenvektor verwendet wird, kann der Phagenvektor
beispielsweise mittels der in-vitro-Verpackungsmethode in
vermehrte Escherichia coli transduziert werden.
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Human-cDNA-Bibliotheken, die Endothelin-3-cDNA enthalten,
können durch zahlreiche, im Fachgebiet wohlbekannte Techniken
einschließlich ihres Kaufs auf dem Markt erhalten werden,
obwohl sie durch die oben beschriebenen Methoden erhältlich
sind. Zum Beispiel ist eine cDNA-Bibliothek von humanen
Plazentas von Clontech Laboratories, Inc., U. S. A., erhältlich.
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Methoden zum Klonieren einer Endothelin-3-DNA aus der
Bibliothek mit menschlichem DNA umfassen beispielsweise die Methode
der Plaque-Hybridisierung mittels Oligonucleotiden, die auf
der Grundlage des Phagenvektors ÄCharon 4A und der
Aminosäuresequenz von Endothelin-2 als Sonde chemisch synthetisiert
wurden [T. Maniatis et al., Molecular Clonina, Cold Spring
Harbor Laboratory, (1982)]. Die so klonierte Endothelin-2-DNA
kann beispielsweise in pBR322, pUC12, pUC13, pUCl9, pUC118 und
pUC119 subkloniert werden, wodurch bei Bedarf die Endothelin-
2-DNA erhalten wird.
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Die Nucleotidsequenz der so erhaltenen DNA-Sequenz wird
beispielsweise durch die Maxam-Gilbert-Methode [A. M. Maxam und
W. Gilbert, [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 560 (1977)],
oder die Dideoxy-Methode [S. Messing et al., Nucleic Acids
Research 9, 309 (1981)] bestimmt, und das Vorhandensein der
Endothelin-2-DNA wird im Vergleich mit der bekannten
Aminosäuresequenz bestätigt.
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Wie oben beschrieben wurde, wird die für Endothelin-3
codierende DNA-Sequenz [Endothelin-3-DNA, dargestellt durch Formel
(3)] erhalten.
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Fig. 1 zeigt die Karten der Restriktionsenzym-Fragmente der
DNA-Sequenz, die das im unten beschriebenen Beispiel 2
erhaltene, für Endothelin-2 codierende DNA-Segment enthält, und der
DNA-Sequenz, die die im unten beschriebenen Beispiel 3
erhaltene humane Endothelin-3-DNA enthält. Fig. 2 zeigt die
Nucleotidsequenzen der mittels der Dideoxy-Methode bestimmten DNA-
Sequenzen, und Fig. 3 zeigt die Aminosäuresequenzen, die aus
den Nucleotidsequenzen bestätigt wurden.
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Die wie oben beschrieben klonierte, für Endothelin-3
codierende DNA-Sequenz kann so, wie sie ist, oder, falls erwünscht,
in Abhängigkeit von der vorgesehenen Verwendung nach einem
Aufschluss mit einem Restriktionsenzym verwendet werden.
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Der für die Expression vorgesehene Bereich wird aus der
geklonten DNA ausgeschnitten und stromabwärts vom Promotor in
einem für die Expression geeigneten Vehikel (Vektor) ligiert,
wodurch der Expressionsvektor erhalten werden kann.
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Die DNA-Sequenz weist an ihrem 5'-Terminus ATG als
translationsinitiierendes Codon auf und kann als
translationsterminierendes Codon am 3'-Terminus TAA, TGA oder TAG
aufweisen. Das translationsinitiierende Codon und das
translationsterminierende Codon kähnen durch- die Verwendung eines
geeigneten synthetischen DNA-Adapters hinzugefügt werden.
Weiterhin wird ein Promotor zum Zweck der Expression der DNA-
Sequenz stromaufwärts davon ligiert.
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Beispiele für die Vektoren umfassen die obigen, von
Escherichia coli stammenden Plasmide, wie pBR322, pBR325, pUC12 und
pUC13, die von Bacillus subtilis stammenden Plasmide, wie
pUB110, pTPS und pC194, von Hefe stammende Plasmide, wie pSH19
und pSH15, Bakteriophagen, wie der X-Phage, und Tierviren wie
Retroviren und Vakziniaviren.
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Als der in der vorliegenden Erfindung verwendete Promotor ist
jeder Promotor geeignet, solange er zur Expression in der für
die Genexpression ausgewählten Wirtszelle geeignet ist.
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Wenn es sich bei der zur Transformation verwendeten Wirtszelle
um Escherichia handelt, ist die Verwendung eines
tpr-Promotors, eines lac-Promotors, eines recA-Promotors, eines λPL-
Promotors oder eines lpp-Promotors zu bevorzugen. Wenn es sich
bei der Wirtszelle um Bacillus handelt, ist die Verwendung
eines PHo5-Promotors, eines PGK-Promotors, eines GAP-Promotors
oder eines ADH-Promotors zu bevorzugen. Insbesondere ist zu
bevorzugen, dass es sich bei der Wirtszelle um Escherichia
handelt und der Promotor der trp-Promotor oder der
APL-Promotor ist.
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Wenn die Wirtszelle eine tierische Zelle ist, sind ein von SV-
40 stammender Promotor, ein Retrovirus-Promotor, ein
Metallothionein-Promotor und ein Hitzeschock-Promotor alle brauchbar.
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Zur Expression wird ein Enhancer, eine bestimmte, für die
Aktivität, des Promotors in der Zelle wichtige DNA-Sequenz,
ebenfalls wirksam verwendet.
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Unter Verwendung eines Vektors, der die für das so
konstruierte, reife Endothelin-3-Peptid (Endothelin-3) codierende DNA-
Sequenz enthält, werden Transformanten hergestellt.
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Die Wirtszellen umfassen beispielsweise Escherichia, Bacillus,
Hefe und tierische Zellen.
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Als Beispiele für die obigen Escherichia und Bacillus können
Stämme erwähnt werden, die den oben beschriebenen ähnlich
sind.
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Beispiele für die obige Hefe umfassen Saccharomyces cerevisiae
AH22, AH22R-, NA87-11A und DKD-5D.
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Beispiele für die tierischen Zellen umfassen die Affenzelle
COS-7, Vero, die Eierstock-Zelle des chinesischen Hamsters
(CHO), die Maus-L-Zelle und die humane FL-Zelle.
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Die Transformation der obigen Escherichia wird beispielsweise
gemäß der in Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 2110 (1972),
oder Gene 17, 107 (1982), beschriebenen Methode durchgeführt.
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Die Transformation des obigen Bacillus wird beispielsweise
gemäß der in Molecular General Genetics 168, 111 (1979)
beschriebenen Methode durchgeführt.
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Die Transformation der Hefe wird beispielsweise gemäß der in
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 1929 (1978) beschriebenen
Methode durchgeführt.
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Die Transformation der tierischen Zellen wird beispielsweise
gemäß der in Virology 456 (1973) beschriebenen Methode
durchgeführt.
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Somit werden Transformanten erhalten, die mit einem
Expressionsvektor transformiert sind, der die DNA-Sequenz enthält,
die für das reife Endothelin-3-Peptid (Endothelin-3) codierend
ist.
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Wenn Bakterien-Transformanten kultiviert werden, ist ein
flüssiges Medium als das zum Kultivieren eingesetzte Medium
besonders geeignet. Darin sind Kohlenstoff-Quellen,
Stickstoff-Quellen, anorganische Verbindungen und andere enthalten,
die für das Wachstum des darin enthaltenen Transformanten
erforderlich sind. Beispiele für die Kohlenstoff-Quellen
umfassen Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Saccharose.
Beispiele für die Stickstoffquellen umfassen anorganische oder
organische Materialien wie Ammoniumsalze, Nitrate,
Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Sojabohnenmehl und
Kartoffelextrakt-Lösung. Die anorganischen Verbindungen
umfassen beispielsweise Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat
und Magnesiumchlorid. Weiterhin können Hefeextrakt, Vitamine,
wachstumsfördernde Faktoren und so weiter dazugegeben werden.
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Der pH-Wert des Mediums beträgt vorzugsweise 5 bis 8. Als das
Medium, das zur Kultivierung von Escherichia verwendet wird,
ist zum Beispiel das Medium M9 bevorzugt, das Glucose und
Casaminosäuren enthält (Miller, Journal of Experiments in
Molecular Genetics 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory,
New York, 1972). Um eine effektive Wirkung des Promotors zu
erzielen, kann bei Bedarf ein Medikament wie
3-Indolylacrylsäure dazu gegeben werden.
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Wenn die Wirtszelle Escherichia ist, wird die Kultivierung
gewöhnlich 3 bis 24 h lang bei 15 bis 43ºC durchgeführt,
wobei bei Bedarf belüftet oder gerührt wird.
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Wenn Hefetransformanten kultiviert werden, wird beispielsweise
das Burkholder-Minimum-Medium [K. L. Bostian et, al., Proc:
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4505 (1980) als Medium verwendet.
Der pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf 5 bis 8
eingestellt. Die Kultivierung wird gewöhnlich 24 bis 72 h lang bei
20 bis 35ºC durchgeführt, wobei nach Bedarf belüftet oder
gerührt wird.
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Wenn Transformanten aus tierischen Zellen kultiviert werden,
umfassen Beispiele für die Medien das MEM-Medium, das 5 bis
20% fötales Kälberserum [Science 122, 501 (1952)], DMEM-
Medium [Viroloav 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium (Journal of
the American Medical Association 199, 519 (1967) und 199-
Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine
73, 1 (1950) enthält. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 6 bis
8. Die Kultivierung wird gewöhnlich 15 bis 60 h lang bei 30
bis 40ºC durchgeführt, wobei nach Bedarf belüftet oder
gerührt wird.
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Das reife Endothelin-3-Peptid (Endothelin-3) kann
beispielsweise durch das folgende Verfahren aus der oben beschriebenen
Kultur isoliert und gereinigt werden.
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Wenn das reife Endothelin-Peptid aus den kultivierten Zellen
extrahiert werden soll, werden die Zellen nach der
Kulti
vierung durch Methoden gesammelt, die im Fachgebiet bekannt
sind. Dann werden die gesammelten Zellen in einer geeigneten
Pufferlösung suspendiert und durch Ultraschall-Behandlung, ein
Lysozym und/oder Frieren/Tauen zerstört. Danach wird eine
rohe, extrahierte Lösung des reifen Endothelin-3-Peptids durch
Zentrifugieren oder Filtration erhalten. Die Pufferlösung kann
ein Protein-Denaturierungsmittel wie Harnstoff oder
Guanidinhydrochlorid oder ein Tensid wie Triton® X-100 enthalten.
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Wenn das Endothelin-3-Vorläuferprotein oder das reife Peptid
in der Kulturlösung sezerniert wird, wird der Überstand durch
Methoden, die im Fachgebiet bekannt sind, nach Abschluss der
Kultivierung von den Zellen getrennt und dann gesammelt.
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Die Trennung und Reinigung des Endothelin-3-Vorläuferproteins
oder des reifen Peptids, das im Überstand der Kultur oder in
der extrahierten Lösung enthalten ist, kann durch eine
geeignete Kombination bekannter Trennungs- und
Reinigungsmethoden erfolgen. Die bekannten Trennungs- und Reinigungsmethoden
umfassen Methoden, bei denen die Löslichkeit ausgenutzt wird,
wie die Salzausfällung und die Lösungsmittelausfällung,
Methoden, bei denen hauptsächlich eine Molmassen-Differenz
ausgenutzt wird, wie die Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration
und die Elektrophorese an SDS-Polyacrylamid-Gel, Methoden, bei
denen ein Unterschied der elektrischen Ladung ausgenutzt wird,
wie die Ionenaustausch-Säulenchromatographie, Methoden, bei
denen eine spezielle Affinität ausgenutzt wird, wie die
Affinitäts-Chromatographie, Methoden, bei denen ein
Unterschied der Hydrophobie ausgenutzt wird, wie die Reversed-
Phase-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, und Methoden,
bei denen eine Differenz des isoelektrischen Punkts ausgenutzt
wird, wie Elektrophorese mit isoelektrischer Fokussierung.
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Die Aktivität des Endothelin-3-Vorläuferproteins oder des so
gebildeten reifen Peptids kann mittels eines
Enzym-Immuno
assays unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers
gemessen werden. Wenn die Produkte eine vasokonstriktive Aktivität
aufweisen, kann diese Aktivität ebenfalls als Index gemessen
werden.
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Die Zellen, wie die tierischen Zellen oder Escherichia coli,
die durch die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung
transfiziert oder transformiert sind, ermöglichen die Herstellung
großer Mengen des reifen Endothelin-3-Peptids. Somit kann die
Herstellung dieser Peptide vorteilhaft bewerkstelligt werden.
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Das hier hergestellte reife Endothelin-3-Peptid kann nicht nur
als Hypotonie-Therapeutika oder lokale Vasokonstriktoren
verwendet werden, sondern gibt auch einen Hinweis auf die
Analyse des Mechanismus der Vasokonstriktor-Reaktionen in vivo
und die Aufklärung von Antagonisten für die Vasokonstriktor-
Faktoren einschließlich der anderen Endothelin-Peptide.
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Das Peptid hat Wirkungen als Vasokonstriktor wie bei der
Verhinderung verschiedener Arten Blutungen, zum Beispiel von
Magen- oder Speiseröhren-Blutungen, und kann auch zum Heilen
von verschiedenen Schocksymptomen brauchbar sein. Die Peptide
können oral, lokal, intravenös oder parenteral, vorzugsweise
lokal oder intravenös verabreicht werden. Die Dosis beträgt
0,001 ug bis 100 ug/kg, vorzugsweise 0,01 ug bis 10 ug/kg. Die
Dosis hängt vorzugsweise vom Gewicht ab und wird vorzugsweise
in Form einer Lösung in 1 bis 10 ml einer Kochsalzlösung
verwendet.
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Die Peptide der vorliegenden Erfindung können zusammen mit
zusätzlichen Komponenten in Form verschiedener Präparate wie
Emulsionen, hydratisierten Mischungen, Tabletten, Lösungen,
Pulvern, Körnern, Kapseln und Pillen ausgebildet sein.
Beispiele für die zusätzlichen Komponenten umfassen
pharmazeutisch annehmbare Vehikel, zerfallsfördernde Stoffe,
Gleit
mittel, Bindemittel, Dispergiermittel, Weichmacher, Füllmittel
und Träger. Hinsichtlich der zusätzlichen Komponenten umfassen
Beispiele für die Vehikel Lactose, Glucose und weißen Zucker;
diejenigen für die zerfallsfördernden Stoffe umfassen Stärke,
Natriumalginat, Agar-Pulver und Carboxymethylcellulosecalcium;
diejenigen für die Gleitmittel umfassen Magnesiumstearat, Talk
und flüssiges Paraffin; diejenigen für die Bindemittel
umfassen Sirup, Gelatinelösung, Ethanol und Polyvinylalkohol;
diejenigen für die Dispergiermittel umfassen Methylcellulose,
Ethylcellulose und Schellack, und diejenigen für die
Weichmacher umfassen Glycerin und Stärke.
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Wenn Nucleotide, Aminosäuren und so weiter in dieser
Beschreibung und in diesen Zeichnungen durch Abkürzungen bezeichnet
werden, werden die Abkürzungen verwendet, die von der IUPAC-
IUB Commission on Biochemical Nomenclature verwendet werden
oder gewöhnlich im Fachgebiet verwendet werden. Zum Beispiel
werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn Aminosäuren
als optische Isomere existieren können, sind die L-Formen
angegeben, sofern nichts anderes spezifiziert ist.
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DNA Desoxyribonucleinsäure
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cDNA Komplementäre Desoxyribonucleinsäure
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A Adenin
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T Thymin
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G Guanin
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C Cytosin
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RNA Ribonucleinsäure
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mRNA Messenger-Ribonucleinsäure
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dATP Desoxyadenosintriphosphat
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dTTP Desoxythymidintriphosphat
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dGTP Desoxyguanosintriphosphat
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dCTP Desoxycytidintriphosphat
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ATP Adenosintriphosphat
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EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
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SDS Natriumdodecylsulfat
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Gly oder G Glycin
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Ala oder A Alanin
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Val oder V Valin
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Leu oder L Leucin
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Ile oder I Isoleucin
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Ser oder 5 Serin
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Thr oder T Threonin
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Cys oder C Cystein
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Met oder M Methionin
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Glu oder E Glutaminsäure
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Asp oder D Asparaginsäure
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Lys oder K Lysin
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Arg oder R Arginin
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His oder H Histidin
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Phe oder F Phenylalanin
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Tyr oder Y Tyrosin
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Trp oder W Tryptophan
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Pro oder P Prolin
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Asn oder N Asparagin
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Gln oder Q Glutamin
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Die vorliegende Erfindung wird hiernach ausführlich durch das
folgende Bezugsbeispiel und die folgenden Beispiele
beschrieben.
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Der in Beispiel 2 erhaltene Transformant Escherichia coli
XL-1/pghET20SG1 und der in Beispiel 3 erhaltene Transformant
Escherichia coli XL-1/pghET3El wurden beim Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI),
unter den Zugangsnummern FERM BP-2118 bzw. FERM BP-2119 am 24.
Oktober 1988 hinterlegt.
Bezugsbeispiel
(I) Assay der vaskularkonstriktorischen Wirkung eines glatten
Muskels
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Spiralförmige Proben einer rechten Koronararterie vom Schwein
(0,5 · 20 mm), deren Tunica intima durch Reiben mit einem
kleinen Tupfer freigelegt wurde, werden in 3 ml Krebs-Ringer-
Lösung suspendiert, die auf 37 0C gehalten wurde und mit einem
Mischgas gesättigt wurde, das, bezogen auf das Volumen, 5%
Kohlendioxid und 95% Sauerstoff enthielt. Nach Einstellung
der Basalspannung auf 2 g wird die isometrische Spannung
mittels Spannungs-Transducer gemessen.
(2) Assay der cardiotonischen Wirkung
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Statt der spiralförmigen Proben einer rechten Koronararterie
vom Schwein, die unter dem obigen Punkt (I) beschrieben
wurden, wurden suspendierte Proben des rechten Atriums von
Meerschweinchen verwendet, und die Spannung und die Herzrate pro
Minute werden gemäß demselben, in (I) beschriebenen Verfahren
gemessen.
Beispiel 1
Herstellung einer DNA-Sonde, die für einen Teil von
Endothelin-1 [Schweine-Endothelin (humanes Endothelin I)]
codierend ist
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Die Sequenz der Messenger-RNA, die aus der Aminosäure-Sequenz
erwartet wurde, bestand aus dem 7. bis 16. Rest von
Endothelin-1,
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Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile,
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die dazu verwendet wurde, eine DNA-Sonde mit der folgenden
Sequen z chemisch zu synthetisieren.
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5'ATG GAC AAG GAG TGT GTC TAC TTC TGC CAT CTG GAC ATC ATC3
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Der 5'-Terminus dieser DNA-Sonde wurde unter Verwendung von
T4-Polynucleotidkinase mit [y-32P]ATP phosphoryliert. Die
phosphorylierte DNA-Sonde wurde für das Screening einer
genomischen DNA-Bank verwendet.
Beispiel 2 (Bezugsbeispiel)
Isolierung von genomischer Endothelin-2-Vorläufer-DNA und
Bestimmung von deren Nucleotidsequenz
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Escherichia coli Le392 wurde mit der obigen humanen
genomischen DNA-Bank (Clontech Laboratories, Inc.) infiziert und
plattiert, wodurch man Phagen-Plaques erscheinen ließ. Nach
dem Bericht von W. Benton und R. Davis [Science 196, 180-182
(1977)] wurde ein Teil der Plaque-DNA auf einen Nylonfilter
überführt und mit der DNA-Sonde hybridisiert, die in Beispiel
1 mit 32P markiert worden war. Die Hybridisierung wurde bei
42ºC in Gegenwart von 20% Formamid durchgeführt, und dann
wurde der Filter bei 20ºC in 0,2 · SSC gewaschen. Es wurden
hybridisierungspositive Klone isoliert. Dann wurde ein reifer
Codebereich von XghET20, einer dieser Klone, mit SacI
ausgeschnitten und im Plasmid pUC118 subkloniert. Durch das
Transformieren von Escherichia coli XL-1 mit dem resultierenden
Plasmid wurde die Transformante Escherichia coli XL-
1/pghET20SG1 erhalten. In Fig. 1 ist die vereinfachte
Restriktionsenzym-Karte eines in diesem Plasmid enthaltenen
humanen genomischen DNA-Fragments enthalten. In der Figur
veranschaulicht der fettgedruckte Balken ( ) einen
reifen Endothelin-2-Codebereich.
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Dieser reife Peptid-Codebereich und die Nucleotidsequenz in
dessen Nähe wurden durch das Verfahren von Sanger [Proc. Nat.
Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977)] bestimmt. Die
Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz, die daraus
geschlossen wurden, sind in Fig. 2 dargestellt. Der von
umrandete Bereich zeigt den reifen Peptidteil. Fig. 3 zeigt zum
Vergleich die Aminosäuresequenzen der reifen Peptide von
Endothelin-1, Endothelin B und Ratten-Endothelin-3, die zuvor
gefunden wurden, zusammen mit der Aminosäuresequenz des reifen
Endothelin-2-Peptids.
Beispiel 3
Isolierung des Codebereichs von reifem humanem Endothelin-3
und Bestimmung von dessen Nucleotidsequenz
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Unter Anwendung von Methoden, die denen von Beispiel 2 ähnlich
waren, wurden hybridisierungspositive Klone isoliert. Dann
wurde ein reifer Codebereich von λghET3, einem dieser Klone,
mit EcoRI ausgeschnitten und in Plasmid pUC118 subkloniert.
Durch Transformieren von Escherichia coli XL-1 mit dem
resultierenden Plasmid wurde die Transformante Escherichia coli XL-
1 mit dem resultierenden Plasmid, die Transformante
Escheri
chia coli XL-1/pghET3El, erhalten. In Fig. 1 ist die
vereinfachte Restriktionsenzym-Karte eines in diesem Plasmid
enthaltenen humanen, genomischen DNA-Fragments dargestellt. In der
Figur veranschaulicht der fettgedruckte Balken ( ) einen
reifen Endothelin-2-Codebereich.
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Dieser reife Peptid-Codebereich und die Nucleotidsequenz in
dessen Nähe wurden durch das Verfahren von Sanger [Proc. Nat.
Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977)] bestimmt. Die
Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz, die daraus
geschlossen wurden, sind in Fig. 2 dargestellt. Der eingerahmte
ßereich zeigt den reifen Peptidteil von Endothelin-3.
Beispiel 4 (Bezugsbeispiel)
Synthese von Endothelin-2
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Humanes Endothelin-2 A-II wurde durch ein herkömmliches
Verfahren synthetisiert, indem 0,7 g (0,5 mmol) des kommerziell
erhältlichen Boc-Trp(CHO)-PAM-Harzes (Applied Biosystems) und
eine Peptid-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems, Modell
430A) eingesetzt wurden.
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Ein Kondensationsverfahren wurde wie folgt durchgeführt:
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Eine Boc-Gruppe des Harzes wurde in Methylenchlorid mit 50%
Trifluoressigsäure behandelt, wodurch eine freie terminale
Aminogruppe gebildet wurde, an der die folgenden Aminosäuren
in der Endothelin-2 entsprechenden Reihenfolge vom C-Terminus
aus in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) kondensiert
wurden:
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Boc-Ile, Boc-Asp(OBzl), Boc-Leu, Boc-His(Tos), Boc-Cys(Acm),
Boc-Tyr(Br-z), Boc-Val, Boc-Phe, Boc-Glu(OBzl), Boc-Lys(Cl-Z),
Boc-Trp (CHO) und Boc-Ser (Bzl).
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890 mg von 2,53 g des so erhaltenen geschützten Endothelin-2-
Harzes wurden mit 1 ml Anisol und 1 ml 1,2-Ethandithiol
quellen gelassen und dann 60 min lang bei 0ºC mit 10 ml
Hydrogenfluorid behandelt, gefolgt vom Entfernen von überschüssigem
Hydrogenfluorid unter vermindertem Druck. Nach dem Waschen mit
5 ml Diethylether wurde der Rückstand mit Trifluoressigsäure
extrahiert, und das Harz wurde abfiltriert. Nach der
Entfernung von Trifluoressigsäure durch Destillation unter
vermindertem Druck wurde der Extrakt in 50-%iger wässriger
Essigsäure gelöst und auf eine Dextrangel-Säule (Sephadex® G-50,
2 · 90 cm) aufgegeben. Die mit dem obigen Lösungsmittel
eluierten Peak-Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert,
wodurch 180 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. In 4 ml
einer 50-%igen wässrigen Essigsäure wurden 31 mg des Pulvers
gelöst, und 19 mg Trifluoracetatquecksilber(II) wurden
dazugegeben, gefolgt von einem 16-stündigen Rühren bei
Raumtemperatur. Die resultierende Mischung wurde durch die Zugabe
von 100 ml n-Butanol, 50 ml Methanol und 50 ml Wasser
verdünnt, und dadurch wurde Hydrogensulfid-Gas geleitet. Dann
wurde 5-%iges NH&sub4;OH dazugebeben, um den pH-Wert auf 8
einzustellen, und danach wurde die Mischung 6 h lang einer
Oxidation an Luft ausgesetzt. Weiterhin wurde Essigsäure
dazugegeben, wodurch ein pH-Wert von 3 erhalten wurde, gefolgt von
einer Lyophilisierung. Die lyophilisierte Mischung wurde auf
eine Sephadex-G-50-Säule (2 · 90 cm) aufgebracht, die mit 50-
%iger Essigsäure gefüllt war, und die Peak-Fraktionen wurden
gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden weiterhin mittels
HPLC [Säule: YMC (YMC Co., Ltd.), Lösungsmittel: eluiert mit
einem linearen Gradienten von 0,1-%iger wässriger
Trifluoressigsäure und Acetonitril, das 0,1-%ige Trifluoressigsäure
enthielt] fraktioniert, wodurch 1,0 mg des erwünschten
Produkts erhalten wurde.
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Synthetisiertes Endothelin-2 wurde mittels HPLC bei 41,4 min
eluiert, im Gegensatz zu 40,2 min für Endothelin-1.
Säulenbedingungen
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Wakosil 5C18 (Wako Chem. Ind. Ltd., Japan) (4,6 · 250 mm)
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Eluent: A (0,1-%ige wässrige Trifluoressigsäure)
B (Acetonitril, das 0,1-%ige Trifluoressigsäure
enthielt)
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Elution von A zu B mit einem linearen Konzentrationsgradienten
(50 min)
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Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
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Werte der Analysen von Aminosäuren: Analysenwerte (Anzahl im
synthetisierten Produkt)
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* Aufgrund einer Säurezersetzung wurden keine Daten erhalten.
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Die Kombination der Disulfid-Bindungen der Cysteingruppen im
reifen Endothelin-2 war 1-15 und 3-11.