DE69938064T2

DE69938064T2 - Aminoterminal modifizierte parathyroidhormon (pth) analoge

Info

Publication number: DE69938064T2
Application number: DE69938064T
Authority: DE
Inventors: F. Richard Walpole BRINGHURST; Hisashi Mishima-shi TAKASU; Thomas J. Needham GARDELLA
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1998-11-25
Filing date: 1999-11-23
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: ATE384743T1; US6537965B1; JP2003533167A; EP1175444B1; DE69938064D1; US20030144209A1; AU1918300A; EP1175444A1; WO2000031137A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Ein Teil der während der Entwicklung dieser Erfindung durchgeführten Arbeit nutzte Geldmittel der US-Regierung. Die US-Regierung hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Diese Arbeit wurde durch National Institutes of Health Grant DK 1 1794 unterstützt.
Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Parathyroidhormon-Peptid (PTH)-Derivate. Insbesondere betrifft die Erfindung PTH-Derivate mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, die den Derivaten PTH-1/PTH2-Rezeptoragonist- oder -antagonist-Eigenschaften verleihen.
Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Volles Verständnis der komplexen biologischen Rollen von Parathyroidhormon (PTH) und Anstrengungen, sein therapeutisches Potential zu nutzen, erfordern Zergliederung der multiplen Signalisierungsmuster und zellulären Wirkungswege des Hormons. PTH bindet und aktiviert spezifische Rezeptoren in renalen und ossalen Zielzellen, die auch PTH-verwandtes Peptid (PTHrP) erkennen (Kronenberg H., et al., „The PTH/PTHrP receptor: one receptor for two ligands." in Genetics of Endocrine and Metabolic Disorders, Thakker, R., Hrsg., Chapman & Hall, London (1997), pp 389–420). In renalen und osteoblastischen Zelllinien löst PTH mehrere parallele intrazelluläre Signalisierungsantworten aus, einschließlich Aktivierung von Adenylylcyclase (AC), Proteinkinase A (PKA), Phospholipase C (PLC) und Proteinkinase (PKC) und Erzeugung von sekundären Messengern wie cyclischem AMP (cAMP), Inositoltrisphosphat (IP₃), Diacylglycerol und erhöhtem cytosolischem freien Calcium (Ca_i ^–+) (Abou-Samra, A.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89(7): 2732–2736 (1992); Azarani, A., et al., J. Biol. Chem. 271(25): 14931–14936 (1996); Bringhurst, F.R., et al., Endocrinology 132(5): 2090–2098 (1993); Civitelli, R., et al., Am. J. Physiol. 225(5 Pt 1): E660–667 (1988); Donahue, H.J., et al., J. Biol. Chem. 263: 13522–13527 (1988); Dunlay, R., und Hruska, K., Am. J. Physiol. 258 (2 Pt 2): F223–231 (1990); Fujimori, A., et al., Endocrinology 128(6): 3032–3039 (1991); Fujimori, A., et al., Endocrinology 130(1): 29–36 (1992); Guo, J., et al., Endocrinology 136(9): 3884–3891 (1995); Janulis, M., et al., Endocrinology 133: 713–719 (1993); Jouishomme, H., et al., J. Bone Miner. Res. 9(6): 943–949 (1994); Juppner, H., et al., Science 254 (5034): 1024–1026 (1991); Pines, M., et al., Bone 18(4): 381–389 (1996); Seuwen, K., et al., Brit. J. Pharm. 114(8): 1613–1620 (1995); Siegfried, G., et al., Endocrinology 136(3): 1267–1275 (1995).
Bis heute sind zwei strukturell verwandte aber verschiedene Arten von PTH-Rezeptoren kloniert worden (Abou-Samra, A.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89(7): 2732–2736 (1992); Usdin, T.B., et al., J. Biol. Chem. 270(26): 15455–15458 (1995); Schipani, E., et al., Endocrinology 132(5): 2157–2165 (1993)). Die erste davon, Typ A, wurde aus sowohl Knochen-, als auch Nierenzellen isoliert und es wurde gezeigt, dass sie multiple Signalisierungsantworten auf PTH-(1-34) oder PTHrP(1-36) transduziert, wenn sie heterolog in Zellen exprimiert wird, denen es an endogenen Typ 1 PTH/PTHrP Rezeptoren (PTHRs) mangelt (Abou-Samra, A.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89(7): 2732–2736 (1992); Azarani, A., et al., J. Biol. Chem. 271(25): 14931–14936 (1996); Bringhurst, F.R., et al., Endocrinology 132(5): 2090–2098 (1993); Guo, J., et al., Endocrinology 136(9): 3884–3891 (1995); Pines, M., et al., Bone 18(4): 381–389 (1996); Jobert, A.-S., et al., Endocrinology 138(12): 5282–5292 (1997); Schneider, H., et al., Eur. J. Pharm. 246(2): 149–155 (1993)).
Vorhergehende Anstrengungen, die Beiträge von spezifischen Regionen des PTH-Moleküls zu seinen bindenden und signalisierenden Eigenschaften zu definieren, sind hauptsächlich unter Verwendung von komplexen in vivo Bioassays, Organkulturen, isolierten Zellmembranen oder Zelllinien, im Allgemeinen aus Nager-Ursprung, unternommen worden, die mehr als einen Typ von endogenen PTH-Rezeptoren exprimieren können (Janulis, M., et al., Endocrinology 133: 713–719 (1993); Siegfried, G., et al., Endocrinology 136(3): 1267–1275 (1995); Yamamoto, S., et al., Endocrinology 138: 2066–2072 (1997); Jouishomme, H., et al., Endocrinology 130(1): 53–60 (1992); Segre, G.V., et al., J. Biol. Chem. 254: 6980–6986 (1979); Tregear, G.W., und Potts, J.T., Jr. Endocr. Res. Commun. 2: 561–567 (1975); Takasu, H., et al., Endocrinology 137(12): 5537–5543 (1996); Orloff, J.J., et al., Am. J. Physiol. 262 (5 Pt 1): E599–607 (1992)). Es sind zum Beispiel relativ wenig Modifikationen an dem extremen Amino-Terminus von PTH durchgeführt worden: Synthetisches [Desamino-Ala-1]bPTH-(1-34) wurde durch Tregear et al., (Endocr. Res. Commun. 2: 561–570, Seite 566 (1975)), durch Goltzmann et al. (J. Biol. Chem. 250: 3199–3203, (1975)), und durch Parsons et al. (Pharmacology of parathyroid hormone and some of its fragments and analogues. In: Talamage RV, Owen M. Parsons JA (Hrsg.) Calcium-Regulating Hormones. American Elsevier, New York, pp. 33–39 (1975)) offenbart; synthetisches [Desamino Ser¹]-hPTH(1-34) wurde durch Tregear et al. (Endocr. Res. Commun. 2: 561–570 (1975)) und durch Rixon et al. (J. Bone and Mineral Res. 9: 1179–1189 (1994)) offenbart; synthetisches 1-Desamino-hPTH-(1-31) wurde durch Rixon et al. (J. Bone and Mineral Res. 9: 1179–1189, (1994)) offenbart und synthetisches [Ala¹]-hPTH(1-34) und [Gly¹]-hPTH(1-34) wurde durch Tregear et al. (Endocr. Res. Commun. 2: 561–570, Seite 563 (1975)) offenbart.
Frühe Struktur/Funktionsstudien von boviner PTH-(1-34), ausgeführt mit isolierten renalen Membranen, identifizierten die Schlüsselrolle der Carboxyl(C)-terminalen bPTH-(25-34)-Region für Rezeptorbindung und des Amino(N)-Terminus (z. B. Ser¹) für AC-Aktivierung (Segre, G.V., et al., J. Biol. Chem. 254: 6980–6986 (1979) Tregear, G.W. und Potts, J.T., Jr. Endocr. Res. Commun. 2: 561–567 (1975)). Spätere Arbeit, durchgeführt in vitro mit intakten renalen Tubuli oder mit kultivierten renalen oder knöchernen Zellen zeigte jedoch, dass N-gestutzte Analoga wie PTH(3-34), obwohl sie nicht in der Lage sind, AC zu stimulieren, PKC vollständig aktivieren konnten und bestimmte PKC-abhängige distale biologische Antworten regulieren konnten (Janulis, M., et al., Endocrinology 133: 713–719 (1993); Siegfried, G., et al., Endocrinology 136(3): 1267–1275 (1995); Jouishomme, H., et al., Endocrinology 130(1): 53–60 (1992)). Von Amino-gestutzten Analoga von PTH-(1-34) wurde ebenfalls gefunden, dass sie PLC-Wirksamkeit oder Ca_i ⁺⁺ in einigen Zellen erhöhen (Donahue, H.J., et al., J. Biol. Chem. 263: 13522–13527 (1988); Fujimori, A., et al., Endocrinology 128(6): 3032–3039 (1991); Siegfried, G., et al., Endocrinology 136(3): 1267–1275 (1995)), in anderen jedoch nicht (Reid, I.R., et al., Am. J. Physiol. 253 (1 Pt 1): E45–51 (1987); Tamura, T., et al., Biochem. Biophys., Res. Commun. 159: 1352–1358 (1989)). Studien der Signalisierungseigenschaften des klonierten Typ 1 PTHR haben sich fast ausschließlich auf Akti vierung von AC, PLC oder Ca_i ⁺⁺ fokussiert (Abou-Samra, A.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89(7): 2732–2736 (1992); Bringhurst, F.R., et al., Endocrinology 132(5): 2090–2098 (1993); Guo, J., et al., Endocrinology 136(9): 3884–3891 (1995); Pines, M., et al., Bone 18(4): 381–389 (1996); Jobert, A.-S., et al., Endocrinology 138(12): 5282–5292 (1997); Schneider, H., et al., Eur. J. Pharm. 246(2): 149–155 (1993)), obwohl Stimulation von PKC und von PKC-abhängigem Ionentransport durch hPTH(1-34), hPTH-(3-34) und anderen hPTH-Fragmenten in CHO-Zellen, transfiziert mit Ratten PTHR cDNA, berichtet wurde (Azarani, A., et al., J. Biol. Chem. 271(25): 14931–14936 (1996)).
Gemeinsam haben diese Beobachtungen das Konzept erzeugt, dass die strukturellen Determinanten für Aktivierung von AC/PKA-Signalisierung verschiedenen sind von jenen, welche für Aktivierung von PLC oder PKC erforderlich sind, und dass diese sich jeweils innerhalb der N- und C-terminalen Domänen von PTH-(1-34) befinden (Jouishomme, H., et al., J. Bone Miner. Res. 9(6): 943–949 (1994); Tregear, G.W., und Potts, J.T., Jr. Endocr. Res. Commun. 2: 561–567 (1975); Whitfield, J.F., und Morley, P. Trends Pharm. Sci. 16(11): 382–386 (1995)). Insbesondere wurde die Region hPTH-(29-32) spezifisch als eine kritische PKC-Aktivierungsdomäne identifiziert (Jouishomme, H., et al., J. Bone Miner. Res. 9(6): 943–949 (1994); Whitfield, J.F. und Morley, P. Trends Pharm. Sci. 16(11): 382–386 (1995)).
Verglichen damit, was aus diesen Studien des Ratten-PTHR bekannt ist, ist viel weniger Information bezüglich der strukturellen Merkmale von humanem PTH bekannt, welche zum Binden des humanen PTHR oder für Aktivierung seiner verschiedenen Signalisierungsweisen erforderlich sind. Alanin-Scanning Mutagenese hat die Wichtigkeit des C-terminalen Anteils von hPTH-(1-34) für Binden an den Ratten-PTHR (30) hervorgehoben. Funktionelle Studien von transfizierten humanen PTHRs in COS-7 oder HEK 293 Zellen bestätigten, dass hPTH-(1-34) AC und Ca_i ^-- aktiviert, obwohl Stimulation von PLC nicht durchweg beobachtet wurde und Antworten, die berichtet wurden, mäßig waren (Pines, M., et al., Bone 18(4): 381–389 (1996); Seuwen, K., et al., Brit. J. Pharm. 114(8): 1613–1620 (1995); Jobert, A.-S., et al., Endocrinology 138(12): 5282–5292 (1997); Schneider, H., et al., FEBS Lett. 351(2): 281–285 (1994);). Die Wirkungen von hPTH-(3-34) auf Ca_i ⁺⁺ sind ähnlich kontrovers (Pines, M., et al., Bones 18(4): 381–389 (1996); Jobert, A.-S., et al., Endocrinology 138(12): 5282–5292 (1997)), wobei die Rollen von anderen Regionen des hPTH-(1-34)-Moleküls beim Signalisieren über den humanen PTHR nicht systematisch behandelt worden sind. Synthetisches hPTH-(1-30)NH₂, hPTH-(1-29)NH₂, hPTH-(1-28)NH₂, hPTH-(1-27)NH₂ und hPTH-(1-26)NH₂ waren jeweils nicht in der Lage, die Wirksamkeit von Membran-gebundenen PKCs in Osteoblast-ähnlichen ROS17/2 Zellen zu stimulieren (Neugebauer et al. (Biochem. 34: 8835–8842 (1995)).
Zusammenfassung der Erfindung
Die relativ große Größe von nativem PTH stellt Herausforderungen zur Verwendung dieser Peptide als Behandlungen für Osteoporose dar. Im Allgemeinen ist ein Protein von dieser Größe nicht zur Verwendung als Arznei geeignet, da es durch einfache Verfahren wie nasale Inhalation nicht wirksam abgegeben werden kann. Stattdessen ist Injektion erforderlich und im Fall von PTH wären tägliche oder fast tägliche Injektionen sehr wahrscheinlich notwendig, um Erhöhungen bei Knochenbildungsraten zu erzielen. Zusätzlich sind größere Peptide technisch schwierig und teuer durch herkömmliche synthetische Verfahren der Chemie herzustellen. Alternative Verfahren unter Einsatz von rekombinanter DNA und zellbasierten Expressionssystemen sind ebenfalls teuer, potentiell gefährdet durch Verunreinigung durch fremde Proteine und umgehen nicht das Abgabeproblem.
Entsprechend wäre es vorteilhaft für die Fachleute, in der Lage zu sein, ein kleines Molekülanalog (entweder Peptid oder Nicht-Peptid) zu identifizieren, das auf dem größeren Peptid basiert und welches dennoch die gewünschten biologischen Wirksamkeiten beibehält. Die Wirksamkeit ist größer bezogen auf das intakte Peptid, aber weitere Optimierung kann zu verstärkter Wirksamkeit und Wirkkraft führen.
Wir beobachteten kürzlich, dass hPTH-(1-31), von welchem von anderen gezeigt wurde, dass es ein voller AC-Agonist ist, aber nicht in der Lage ist, PKC über Nager-PTHRs zu aktivieren (Jouishomme, H., et al., Endocrinology 130(1): 53–60 (1992)) so wikkräftig wie hPTH-(1-34) beim Aktivieren von sowohl AC, als auch PLC über PTHRs, exprimiert in LLC-PKl, COS-7 oder HEK 293 Zellen war (Takasu, H., und Bringhurst, F.R., Endocrinology 139(10): 4293–4299 (1998)). Diese unerwarteten Beobachtungen veranlassten uns, eine detailliertere Analyse der relativen Rol len der extremen N-terminalen Region von hPTH-(1-34) beim Binden an den und selektiver Aktivierung des humanen PTH-1/PTH-2 Rezeptors, mit einem besonderen Fokus auf PLC-Aktivierung durchzuführen.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Amino-terminale Modifikationen von humanem Parathyroidhormon 1-34 Peptid, welche den PTH-2 Rezeptor viel wirksamer selektiv aktivieren, als es der native hPTH(1-34)NH₂-Ligand macht, aber welche noch den klassischen PTH-1 Rezeptor aktivieren, wenn auch bei einem verringerten Level. Dieser unerwartete Fund hat wichtige Folgen für die Gestaltung von hervorragenden Rezeptor-selektiven PTH-Agonisten in Systemen einschließlich in vivo, wo beide Rezeptoren exprimiert werden. Wichtigerweise sind die Desaminopeptide der vorliegenden Erfindung noch Signal-selektiv über den PTH-1 Rezeptor, weil sie etwas cAMP-Wirksamkeit, aber minimale PLC-Wirksamkeit besitzen. Demgemäß werden die hierin beschriebenen Desaminopeptide als Knochen-anabolische Wirkstoffe für die therapeutische Behandlung von Knochenerkrankung in vivo brauchbar sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft PTH(1-34)-Peptide und Derivate davon. Verbindungen der Erfindung, welche PTH(1-34)-Peptide, Fragmente davon, Derivate davon, pharmazeutisch annehmbare Salze davon und N- oder C-Derivate davon einschließen, werden hiernach gemeinsam als „Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 und Derivaten davon" bezeichnet.
Die Erfindung sieht synthetische und/oder rekombinante biologisch wirksame Peptidderivate von PTH(1-34) vor. In einem Aspekt sieht diese Erfindung ein Peptid vor, bestehend aus der Formel:

(a) X₀₁ ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 1); wobei (i) X₀₁ ein Desamino Ser, Desamino Ala oder Desamino Gly ist; und (ii) vorausgesetzt ist, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-34)NH₂ ist;
(b) Fragmenten von (a) enthaltenden Aminosäuren 1-29, 1-30, 1-31, 1-32 oder 1-33; vorausgesetzt, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-31)NH₂ ist; oder
(c) pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon.

Bevorzugte Merkmale dieses Aspekts werden in abhängigen Ansprüchen 2 bis 5 vorgesehen.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht diese Erfindung ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, umfassend

(a) ein Peptid bestehend aus der Formel: X₀₁ ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 1); wobei (i) X₀₁ ein Desamino Ser, Desamino Ala oder Desamino Gly ist; und (ii) vorausgesetzt ist, dass besagtes Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-34)NH₂ ist;
(b) Fragmenten von (a) enthaltenden Aminosäuren 1-29, 1-30, 1-31, 1-32 oder 1-33; vorausgesetzt, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-31)NH₂ ist; oder
(c) pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon; und einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Gemäß einem noch weiteren Aspekt sieht diese Erfindung die Verwendung eines Peptids, bestehend aus der Formel:

(a) X₀₁ ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 1); wobei (i) X₀₁ ein Desamino Ser, Desamino Ala oder Desamino Gly ist; und (ii) vorausgesetzt ist, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-34)NH₂ ist;
(b) Fragmenten von (a) enthaltenden Aminosäuren 1-29, 1-30, 1-31, 1-32 oder 1-33; vorausgesetzt, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-31)NH₂ ist; oder
(c) pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon; und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger; in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Osteoporose oder Osteopenie vor.

Kurze Beschreibung der Figuren
1 Messung von cyclischer AMP-Akkumulierung in HKRK C53 Zellen. Diese sind LLC-PK porkine renale Zellen, welche annä hernd 150000 rekombinante hPTH-1 Rezeptorzellen stabil exprimieren. Daten werden für zwei Konzentrationen von Peptid 10⁹-M ( ) und 10⁷-M ( ) präsentiert. Es kann gesehen werden, dass die Ala¹- und Gly¹-substituierten hPTH(1-34)NH₂-Moleküle fast die gleiche Wirksamkeit in diesem Test haben, wie natives hPTH(1-34)NH₂, während ihre Desamino-Gegenstücke stark verringerte Wirksamkeit haben, insbesondere bemerkbar bei der 1 nM Konzentration.
Das Peptid hPTH(2-34) hat ähnlich verringerte Wirksamkeit über den PTH-1 Rezeptor.
2 cAMP Messungen in SaOS-2 Zellen. Dieser sind transformierte humane Osteosarkomzellen, von welchen bekannt ist, dass sie relativ wenig (10000–20000 pro Zelle) humane PTH-1 Rezeptoren exprimieren. Wie in der Figur gezeigt, ist die Cyclase-Wirksamkeit der [Gly¹]
und [Ala¹] hPTH(1-34)NH₂
Analoga wieder mit der des Kontrollpeptids hPTH(1-34) Peptid
vergleichbar, während die Desamino-[Ala¹]
und -[Gly¹]
Peptide, wie das hPTH(2-34) Peptid minimale Wirksamkeit zeigen, selbst bei sehr hohen Konzentrationen (also mikromolar).
3 cAMP Messungen in klonalen LLC-PK₁-Zellen (HPR2-7). Klonale LLC-PK₁ Zellen (HPR2-7) exprimieren annähernd 250000 rekombinante humane PTH-2 Rezeptoren pro Zelle. Desamino-[Ala¹]
und -[Gly¹]
Peptide zeigen verstärkte Wirksamkeit im Vergleich mit hPTH(1-34)NH₂
hPTH(2-34)
oder ihren [Ala¹]
und [Gly¹]
substituierten Gegenstücken. Die Desaminopeptide zeigen eine wesentlich größere maximale Cyclase-Aktivierung bei sehr hohen Konzentrationen (1 mikromolar).
4 Messung von Phospholipase C(PCL) Wirksamkeit in LLC-PK Zellen (HKRK-B7), die annähernd 1 Million humane PTH-1 Rezeptoren pro Zelle stabil exprimieren. Desamino-[Ala¹] und -[Gly¹] Verbindungen üben keine Aktivierung von PLC über diesen Rezeptor aus, während hPTH(1-34)NH₂ und [Ala¹]hPTH(1-34)NH₂ volle Agonisten sind. [Gly¹]hPTH(1-34)NH₂ und hPTH(1-34)NH₂ sind nur partielle Agonisten für OLC-Aktivierung über den Typ 1 hPTH-Rezeptor). Humanes PTH(2-34), wie die Desamino-Peptide, ist in diesem Test unwirksam (1000 nM Konzentration).
5 Phospholipase C aktivierende Profile dieser Peptide in Zellen (HPR2-22), die 1,5 Millionen rekombinante humane PTH-2 Rezeptoren pro Zelle exprimieren. Wie in der Figur gesehen, üben beide Desaminopeptide größere maximale Aktivierung von Phospho lipase C bei der getesteten Konzentration (1000 nM) aus, als humanes PTH(1-34)NH₂. Humanes PTH(2-34), welches eine Wirksamkeit ähnlich den Desaminopeptiden über den PTH-1 Rezeptor hat, wird in diesem Test nur als partieller Agonist gesehen.
6 Radioligand-Bindung der hPTH-Analoga. Die verstärkte Wirkkraft der Desaminopeptide für den PTH-2 Rezeptor wird mit einer 10-fach höheren offenbaren Bindungsaffinität bezogen auf hPTH(1-34) zu dem Rezeptor (gegenüber dem PTH-1 Rezeptor) assoziiert. Wie in der Figur gezeigt, weisen hPTH(1-34)
HPTH(2-34)( ) und die Desaminopeptide ähnliche Wettbewerbsersetzung von ¹²⁵I-[Nle^8,21]rPTH(1-34)Radioligandbindung an HKRK 828 Zellen auf, die 280000 rekombinante PTH-1 Rezeptoren/Zelle exprimieren, während die Desamino-Verbindungen 10-fach wirkkräftiger beim Ersetzen dieses Radioligands von HPR2-7 Zellen sind, die den humanen PTH-2 Rezeptor exprimieren.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Definitionen
In der Beschreibung, die folgt, werden eine Anzahl an Begriffen, welche in rekombinanter DNA-Technologie und Peptidsynthese verwendet werden, umfangreich genutzt. Um ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und Ansprüche vorzusehen, einschließlich des Umfangs, der solchen Begriffen gegeben wird, werden die folgenden Definitionen vorgesehen.
Klonierungsvektor: Plasmid oder Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenz, welche in der Lage ist, autonom in einer Wirtszelle zu replizieren, und welche durch eine oder eine geringe Anzahl an Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen gekennzeichnet ist, an welchen solche DNA-Sequenzen auf eine bestimmbare Weise ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vektors geschnitten werden können, und in welche ein DNA-Fragment gespleißt werden kann, um seine Replikation und Klonierung herbeizuführen. Der Klonierungsvektor kann ferner einen Marker enthalten, welcher zur Verwendung bei der Identifikation von mit dem Klonierungsvektor transformierten Zellen geeignet ist. Marker sehen beispielsweise Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz vor.
Expressionsvektor: Ein Vektor ähnlich einem Klonierungsvektor, aber welcher in der Lage ist, die Expression eines Gens zu verstärken, welches in ihn kloniert worden ist, nach Transforma tion in einen Wirt. Das klonierte Gen wird üblicherweise unter die Kontrolle von (also operabel gebunden an) bestimmten Kontrollsequenzen wie Promotorsequenzen gestellt. Promotorsequenzen können entweder konstitutiv oder induzierbar sein.
Rekombinanter Wirt: Gemäß der Erfindung kann ein rekombinanter Wirt jede prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle sein, welche die gewünschten klonierten Gene an einem Expressionsvektor oder Klonierungsvektor enthält. Dieser Begriff ist ebenfalls so gemeint, dass er jene prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen einschließt, die genetisch konstruiert worden sind, um das/die gewünschte(n) Gen(e) in dem Chromosom oder Genom dieses Organismus zu enthalten. Für Beispiele solcher Wirte siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). Bevorzugte rekombinante Wirte sind eukaryotische Zellen, transformiert mit dem DNA-Konstrukt der Erfindung. Spezieller werden Sängerzellen bevorzugt.
Promotor: Eine DNA-Sequenz, allgemein beschrieben als die 5'-Region eines Gens, welche sich proximal zum Startkodon befindet. Die Transkription von (einem) angrenzenden Gen(en) wird an der Promotorregion initiiert. Falls ein Promotor ein induzierbarer Promotor ist, dann erhöht sich die Transkriptionsrate als Antwort auf ein Induktionsmittel. Im Gegensatz dazu wird die Transkriptionsrate nicht durch ein Induktionsmittel reguliert, falls der Promotor ein konstitutiver Promotor ist. Beispiele für Promotoren schließen den CMV-Promotor (InVitrogen, San Diego, CA), die SV40, MMTV und hMTIIa-Promotoren ( U.S. Pat. Nr. 5457034 ), den HSV-l 4/5 Promotor ( U.S. Pat. Nr. 5501979 ) und den Early-Immediate HCMV Promotor ( WO92/17581 ) ein. Es können auch Gewebe-spezifische Verstärkerelemente eingesetzt werden. Zusätzlich können solche Promotoren gewebe- und zellspezifische Promotoren eines Organismus einschließen.
Polynukleotid: Dieser Begriff bezieht sich allgemein auf ein Polyribonukleotid oder Polydeoxribonukleotid, welches unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann. „Polynukleotide" schließen ohne Einschränkung ein- und doppelsträngige DNA, DNA, die ein Gemisch aus ein- und doppelsträngigen Regionen ist, ein- und doppelsträngige RNA und RNA, die ein Gemisch aus ein- und doppelsträngigen Regionen ist, Hybrid-Moleküle, welche DNA und RNA enthalten, die einsträngig oder ty pischer doppelsträngig sein können oder ein Gemisch aus ein- und doppelsträngigen Regionen ein. Zusätzlich bezieht sich „Polynukleotid" auf dreisträngige Regionen, welche RNA oder DNA oder sowohl RNA, als auch DNA umfassen. Der Begriff Polynukleotid schließt auch DNAs oder RNAs ein, welche eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten, und DNAs oder RNAs mit für Stabilität oder aus anderen Gründen modifizierten Hauptketten. „Modifizierte" Basen schließen zum Beispiel triethylierte Basen und unübliche Basen wie Inosin ein. Eine Vielfalt an Modifikationen ist an DNA und RNA durchgeführt worden; somit umfasst „Polynukleotid" chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Formen von Polynukleotiden, wie typischerweise in der Natur gefunden, als auch chemische Formen von DNA und RNA, welche für Viren und Zellen charakteristisch sind. „Polynukleotid" umfasst ebenfalls relativ kurze Polynukleotide, welche häufig als Oligonukleotide bezeichnet werden.
Polypeptid: Dieser Begriff bezieht sich auf ein Peptid oder Protein, welches zwei oder mehr Aminosäuren, gebunden aneinander durch Peptidbindungen oder modifizierte Peptidbindungen, also Peptidisoester umfassen. „Polypeptid" bezieht sich auf sowohl kurze Ketten, welche gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Ketten, welche im Allgemeinen als Proteine bezeichnet werden. Polypeptide können andere Aminosäuren, als die 20 für Gen-kodierten Aminosäuren enthalten. „Polypeptide" schließen Aminosäuresequenzen ein, modifiziert entweder durch natürliche Prozesse wie post-translationale Verarbeitung, oder durch chemische Modifikationstechniken, welche nach Stand der Technik gut bekannt sind. Solche Modifikationen werden in Grundlagentexten und in detaillierteren Monographien, als auch in der Forschungsliteratur gut beschrieben. Modifikationen können überall in einem Polypeptid auftreten, einschließlich der Peptid-Hauptkette, den Aminosäure-Seitenketten und den Amino- oder Carboxyltermini. Es wird anerkannt werden, dass der selbe Modifikationstyp in gleichen oder variierenden Graden an mehreren Stellen in einem gegebenen Polypeptid vorhanden sein kann. Auch kann ein gegebenes Polypeptid viele Modifikationstypen enthalten. Siehe zum Beispiel Protein-Structure and Molecular Properties, 2. Aufl., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993 und Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, Seiten 1–12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., „Analysis for Protein modifications and nonprotein cofactor", Methods in Enzymol. 182: 626–646 (1990) und Ratten et al., „Protein Synthese: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci 663: 48–62 (1992).
Homolog/nicht-homolog: Zwei Nukleinsäuremoleküle werden als „homolog" angesehen, falls ihre Nukleotidsequenzen eine Ähnlichkeit von mehr als 40% teilen, wie durch HASH-Kodierungsalgorithmus (Wilber, W.J. und Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 726–730 (1983)) bestimmt. Zwei Nukleinsäuremoleküle werden als „nicht-homolog" angesehen, falls ihre Nukleotidsequenzen eine Ähnlichkeit von weniger als 40% teilen.
Isoliert: Ein Begriff, welcher verändert „durch menschliche Hand" vom natürlichen Zustand bedeutet. Falls eine Zusammensetzung oder Substanz in der Natur auftritt, ist die isolierte Form verändert oder von seiner ursprünglichen Umgebung entfernt oder beides worden. Zum Beispiel ist ein Polynukleotid oder ein Polypeptid, welches in einem lebenden Tier natürlich vorhanden ist, nicht „isoliert", aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid ist, getrennt von den co-existierenden Materialien seines natürlichen Zustands „isoliert", wie der Begriff hierin verwendet wird. Somit wird ein Polypeptid oder Polynukleotid, hergestellt und/oder enthalten innerhalb einer rekombinanten Wirtszelle, für Zwecke der vorliegenden Erfindung als isoliert angesehen. Ebenfalls beabsichtigt als ein „isoliertes Polypeptid" oder ein „isoliertes Polynukleotid" sind Polypeptide oder Polynukleotide, die teilweise oder wesentlich von einer rekombinanten Wirtszelle oder von einer nativen Quelle gereinigt worden sind. Zum Beispiel kann eine rekombinant hergestellte Version von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 und Derivaten davon durch das in Smith und Johnson, Gene 67: 31–40 (1988) beschriebene einstufige Verfahren wesentlich gereinigt werden.
Identität: Dieser Begriff bezieht sich auf ein Maß der Identität von Nukleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen. Im Allgemeinen werden die Sequenzen abgeglichen, so dass die höchstgradige Übereinstimmung erhalten wird. „Identität" hat per se eine nach Stand der Technik erkannte Bedeutung und kann unter Verwendung von veröffentlichten Techniken errechnet werden. (Siehe z. B.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects; Smith, D.W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Teil I, Griffin, A.M., und Griffin, H.G., Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg., M. Stockton Press, New York, 1991). Während es eine Anzahl an Methoden gibt, um Identität zwischen zwei Polynukleotid- oder Polypeptidsequenzen zu messen, ist der Begriff „Identität" den Fachleuten gut bekannt (Carill, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)). Verfahren, welche üblicherweise eingesetzt werden, um Identität oder Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf jene, welche in Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop. Hrsg., Academic Press, San Diego, 1994 und Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988) offenbart werden. Verfahren, um Identität und Ähnlichkeit zu bestimmen, sind in Computerprogrammen kodifiziert. Bevorzugte Computerprogrammverfahren, um Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf GCG Programmpaket (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(i): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASIA (Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215: 403 (1990)).
Fragment: Ein „Fragment" eines Moleküls wie einer Verbindung von SEQ ID Nr. 1 oder Derivat davon ist so gemeint, dass es sich auf eine Polypeptid-Teilmenge dieser Moleküle bezieht.
Funktionelles Derivat: Der Begriff „Derivate" ist so beabsichtigt, dass er „Varianten", die „Derivate" oder „chemischen Derivate" des Moleküls einschließt. Eine „Variante" eines Moleküls wie einer Verbindung von SEQ ID Nr. 1 oder Derivat davon ist so gemeint, dass sie sich auf ein Molekül bezieht, welches im Wesentlichen ähnlich entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon ist. Ein „Analog" eines Moleküls wie einer Verbindung von SEQ ID Nr. 1 oder Derivat davon ist so gemeint, dass es sich auf ein nicht-natürliches Molekül bezieht, welches im Wesentlichen entweder den SEQ ID Nr. 1 Molekülen oder Fragmenten davon ähnlich ist.
Von einem Molekül wird gesagt, dass es „im Wesentlichen ähnlich" einem anderen Molekül ist, wenn die Sequenz von Aminosäuren in beiden Molekülen im Wesentlichen gleich ist und wenn bei de Moleküle ähnliche biologische Wirksamkeit besitzen. Mit der Maßgabe, dass zwei Moleküle eine ähnliche Wirksamkeit besitzen, werden sie somit als Varianten, Derivate oder Analoga angesehen, wie der Begriff hierin verwendet wird, selbst wenn eines der Moleküle zusätzliche Aminosäurereste enthält, welche in dem anderen nicht gefunden werden, oder wenn die Sequenz von Aminosäureresten nicht identisch ist.
Wie hierin verwendet wird von einem Molekül gesagt, dass es ein „chemisches Derivat" von einem anderen Molekül ist, wenn es zusätzliche chemische Komponenten enthält, welche normalerweise nicht Teil des Moleküls sind. Solche Komponenten können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit usw. des Moleküls verbessern. Die Komponenten können alternativ die Toxizität des Moleküls verringern, eine unerwünschte Nebenwirkung des Moleküls beseitigen oder abschwächen usw. Beispiele für Komponenten, welche in der Lage sind, solche Wirkungen zu vermitteln, werden in Remingtons's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart und werden den gewöhnlichen Fachleuten offensichtlich sein.
Biologische Wirksamkeit des Proteins: Dieser Ausdruck bezieht sich auf die metabolische oder physiologische Funktion von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon, einschließlich ähnliche Wirksamkeiten oder verbesserte Wirksamkeiten oder jene Wirksamkeiten mit verringerten unerwünschten Nebenwirkungen. Ebenfalls eingeschlossen sind antigene und immunogene Wirksamkeiten von besagten Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon.
Gentherapie: Ein Therapiemittel, welches auf Verändern des normalen Musters von Genexpression von einem Organismus gerichtet ist. Im Allgemeinen wird ein rekombinantes Polynukleotid in Zellen oder Gewebe des Organismus eingeführt, um eine Veränderung der Genexpression zu bewirken.
Wirtstier: Tansgene Tiere, deren gesamte Keim- und Körperzellen das DNA-Konstrukt der Erfindung enthalten. Solche transgenen Tieren sind im Allgemeinen Wirbeltiere. Bevorzugte Wirtstiere sind Säuger, wie nicht-humane Primaten, Mäuse, Schafe, Schweine, Rinder, Ziegen, Meerschweinchen, Nager, z. B. Ratten und Ähnliche. Der Begriff Wirtstier schließt ebenfalls Tiere in allen Entwicklungsstadien einschließlich embryonischer und fötaler Stadien ein.
I. Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 und Derivaten davon – strukturelle und funktionelle Eigenschaften
Die Signifikanz dieser Erfindung betrifft die Existenz von zwei klonierten Arten von Parathyroidhormon-Rezeptoren, PTH-1 und PTH-2. Diese beiden Rezeptoren teilen signifikante (mehr als 50%) Sequenzhomologie und sind deutlich Mitglieder einer gemeinsamen Rezeptorfamilie. Sie scheinen jedoch in sehr unterschiedlichen Geweben exprimiert zu werden. Spezifisch wird der PTH-2 Rezeptor unter anderem in bestimmten Regionen des Gehirns, der Lunge, dem Endothelium und der Bauchspeicheldrüse exprimiert, während der Typ-1 Rezeptor allgegenwärtiger exprimiert wird, insbesondere in Niere und Knochen. Bis jetzt ist nur bekannt gewesen, dass der PTH-2 Rezeptor für PTH selektiv war, weil natives PTH-bezogenes Peptid (PTHrP) weder an diesen Rezeptor bindet, noch ihn aktiviert. Der PTH-2 Rezeptor ist bei hohen Graden in homologen Zellsystemen wie HEK-Nierenzellen exprimiert worden, und von ihm ist gezeigt worden, dass er sowohl Adenylylcyclase, als auch cytosolische freie Calciumtransienten signalisiert.
Es ist die Entdeckung gemacht worden, dass bestimmte Aminoterminal modifizierte Analoga von hPTH(1-34)NH₂, spezifisch Desamino-[Gly¹]hPTH(1,34)NH₂ und Desamino-[Ala¹]hPTH1-34)NH₂ den PTH-2 Rezeptor viel wirksamer aktivieren, als der native hPTH(1-34)NH₂-Ligand. Zur gleichen Zeit aktivieren diese beiden Peptide den klassischen PTH-1 Rezeptor, wenngleich in einem verringertem Grad. Die unmittelbare Implikation dieser Entdeckung ist, dass diese Amino-modifizierten PTH-Analoga selektive Agonisten für den PTH-2 Rezeptor sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft hPTH(1-34)-Peptide und Derivate davon. Verbindungen der Erfindung, welche hPTH(1-34)-Peptide, Fragmente davon, Derivate davon, pharmazeutisch annehmbare Salze davon und N- oder C-Derivate davon einschließen, werden hiernach gemeinsam als „Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 und Derivate davon" bezeichnet.
Im Detail sieht die Erfindung synthetische und/oder rekombinante biologisch wirksame Peptidderivate von hPTH(1-34) vor. In einer spezifischen Ausführungsform sieht diese Erfindung ein Peptid vor, bestehend aus der Formel:

Die vorliegende Erfindung sieht so ein neuartiges hPTH(1-34)-Derivat vor, das ein wirkkräftiger selektiver PTH-2 Rezeptoragonist ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das hPTH(1-34)-Derivat an Rest 1 verändert. Insbesondere bevorzugt schließt die Erfindung ein hPTH(1-34)-Derivat mit einer Aminosäuresubstitution von Desaminoalanin oder Desaminoglycin für Serin an Position 1 von hPTH(1-34) ein.
Zusätzlich sind weitere Aminosäuresubstitutionen von einer Art, welche nicht die Fähigkeit des hPTH(1-34)Derivats zerstören, selektiv den PTH-1/PTH-2 Rezeptor zu agonisieren (wie durch Tests bestimmt, welche dem Fachmann bekannt sind und unten diskutiert werden), in den Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Als Proteinprodukte sind Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivate davon der vorliegenden Erfindung empfänglich für Herstellung durch die Technik der Lösungs- oder Festphasen-Peptidsynthese. Die Festphasen-Peptidsynthesetechnik ist insbesondere bei der Herstellung von humanem PTH erfolgreich angewendet worden und kann für die Herstellung von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon der vorliegenden Erfindung verwendet werden (für Anleitung siehe Kimura et al., supra, und siehe Fairwell et al., Biochem. 22: 2691 (1983)). Erfolg mit der Herstellung von humanem PTH in relativ großem Maßstab ist von Goud et al., in J. Bone Min. Res. 6(8): 781 (1991) berichtet worden, was hierein durch Verweis eingeschlossen wird. Die Herangehensweise der synthetischen Peptid-Synthese schließt im Allgemeinen die Verwendung von automatisierten Synthetisierern und geeignetem Harz als Festphase ein, an welche die C-terminale Aminosäure der gewünschten Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon gebunden werden. Erweiterung des Peptids in N-terminaler Richtung wird dann durch aufeinander folgendes Koppeln einer geeignet geschützten Form der nächsten gewünschten Aminosäure unter Verwendung von entweder FMOC- oder BOC-basierten chemischen Protokollen erreicht, typischerweise bis die Synthese vollständig ist. Schutzgruppen werden dann vom Peptid abgespalten, üblicherweise gleichzeitig mit der Abspaltung von Peptid vom Harz, und das Peptid wird dann unter Verwendung von herkömmlichen Techniken wie durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Acetonitril als Lösungsmittel und Trifluoressigsäure als Ionenpaarbildner isoliert und gereinigt. Solche Verfahren werden allgemein in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben und man kann zum Beispiel auf Stewart und Young, „Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Auflage, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (9184) verweisen. Es wird anerkannt werden, dass die Herangehensweise der Peptidsynthese zur Herstellung von SEQ ID Nr. 1 und Derivaten davon, Varianten erforderlich ist, welche Aminosäuren einschließen, für die nicht genetisch kodiert wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können Substituenten an das freie Amin der N-terminalen Aminosäure von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon durch nach Stand der Technik bekannte Standardverfahren gebunden werden. Zum Beispiel können Alkylgruppen, z. B. C_1-12-Alkyl, unter Verwendung von reduktiver Alkylierung angebunden werden. Hydroxyalkylgruppen, z. B. C_1-12-Hydroxyalkyl, können ebenfalls unter Verwendung von reduktiver Alkylierung angebunden werden, wobei die freie Hydroxygruppe mit einem t-Butylester geschützt wird. Acylgruppen, z. B. COE₁, können durch Koppeln der freien Säure, z. B. E₁COOH, an das freie Amino der N-terminalen Aminosäure angebunden werden. Ebenfalls werden innerhalb des Umfangs dieser Erfindung jene Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 und Derivaten davon erwogen, die sekundäre oder tertiäre Struktur oder Stabilität von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon verändern, welche noch die biologische Wirksamkeit beibehalten. Solche Derivate können durch Lactam-Cyclisierung, Disulfidbindungen oder andere Mittel erzielt werden, welche einem gewöhnlichen Fachmann bekannt sind.
Unter den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind jene Verbindungen, welche als selektive Agonisten des PTH-1/PTH-2 Rezeptors dienen können. Insbesondere sind bevorzugte Ausführungsformen jene Verbindungen, wo X₀₁ für Desamino Gly steht. Die Aminosäuresequenz von dieser bevorzugten Ausführungsform ist somit DesaminoGlyValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGlyArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 2) oder Derivate davon. [[DesaminoGly¹]hPTH(1-34)].
Ein weiterer Satz der bevorzugten Ausführungsformen sind jene Verbindungen mit einer Eine-Aminosäure-Deletion am Carboxy-Terminus von SEQ ID Nr. 2, wo X₀₁ für Desamino Gly steht. Die Aminosäuresequenz dieser bevorzugten Ausführungsform ist somit DesaminoGlyValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSer-MetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsn (SEQ ID Nr. 3) oder Derivate davon [[DesaminoGly¹]hPTH(1-33)].
Ein weiterer Satz der Ausführungsformen für Vergleichszwecke sind jene Verbindungen mit einer Sieben-Aminosäure-Deletion am Carboxy-Terminus von SEQ ID Nr. 2, wo X₀₁ Desamino Gly darstellt. Die Aminosäuresequenz dieser vergleichenden Ausführungsform ist somit DesaminoGlyValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLys (SEQ ID Nr. 4) oder Derivate davon. [[DesaminoGly¹]hPTH(1-27)].
Ein weiterer Satz der bevorzugten Ausführungsformen sind jene Verbindungen, wo X₀₁ für Desamino Ala steht. Die Aminosäuresequenz von dieser bevorzugten Ausführungsform ist somit DesaminoAlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 5) oder Derivate davon. [[DesaminoAla¹]hPTH(1-34)].
Ein weiterer Satz der bevorzugten Ausführungsformen sind jene Verbindungen mit einer Eine-Aminosäure-Deletion am Carboxy-Terminus von SEQ ID Nr. 5, wo X₀₁ für Desamino Ala steht. Die Aminosäuresequenz von dieser bevorzugten Ausführungsform ist somit DesaminoAlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsn (SEQ ID Nr. 6) oder Derivate davon. [[DesaminoAla¹]hPTH(1-33)].
Ein weiterer Satz der Ausführungsformen für Vergleichszwecke sind jene Verbindungen mit einer Sieben-Aminosäure-Deletion am Carboxy-Terminus von SEQ ID Nr. 5, wo X₀₁ für Desamino Ala steht. Die Aminosäuresequenz von dieser vergleichenden Ausführungsform ist somit DesaminoAlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeu-AsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLys (SEQ ID Nr. 7) oder Derivate davon. [[DesaminoAla¹]hPTH(1-27)].
Ein weiterer Satz der bevorzugten Ausführungsformen sind je ne Verbindungen mit einer Eine-Aminosäure-Deletion am Carboxy-Terminus von SEQ ID Nr. 8, wo X₀₁ für Desamino Ser steht. Die Aminosäuresequenz dieser bevorzugten Ausführungsform ist somit DesaminoSerValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsn (SEQ ID Nr. 9) oder Derivate davon. [[DesaminoSer¹]hPTH(1-33)].
Ein weiterer Satz der Ausführungsformen für vergleichende Zwecke sind jene Verbindungen mit einer Sieben-Aminosäure-Deletion am Carboxy-Terminus von SEQ ID Nr. 8, wo X₀₁ für Desamino Ser steht. Die Aminosäuresequenz dieser vergleichenden Ausführungsform ist somit DesaminoSerValSerGlulleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLys (SEQ ID Nr. 10) oder Derivate davon. [[DesaminoSer¹]hpPH(1-27)].
III. Vektoren, Wirtszellen und rekombinante Expression
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Vektoren, die ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfassen, und Wirtszellen, welche mit Vektoren der Erfindung genetisch konstruiert sind, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls eingesetzt werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs herzustellen, welche von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet werden.
Für rekombinante Herstellung können Wirtszellen genetisch konstruiert werden, um Expressionssysteme oder Teile davon für Polynukleotide der vorliegenden Erfindung einzuschließen. Einführung von Polynukleotiden in Wirtszellen kann durch in vielen Standardlaborhandbüchern wie Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) und Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) beschriebene Verfahren bewirkt werden, wie Calciumphosphat-Transfektion, DEAEDextranvermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjektion, kationischer Lipid-vermittelter Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Kratzladung, ballistischer Einführung oder Infektion.
Repräsentative Beispiele für passende Wirte schließen bakterielle Zellen wie streptococci, staphylococci, E. coli, Streptomyces und Bacillus subtilis Zellen; Pilzzellen wie Hefezellen und Aspergilluszellen; Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 Zellen; Tierzellen wie CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 und Bowes Melanomzellen; und Pflanzenzellen ein.
Eine große Vielfalt an Expressionssystemen kann verwendet werden. Solche Systeme schließen unter anderem chromosomale, episomale und Virus-abgeleitete Systeme ein, z. B. Vektoren, abgeleitet von bakteriellen Plasmiden, von Bakteriophage, von Transposonen, von Hefe-Episomen, von Insertionselementen, von Hefe-chromosomalen Elementen, von Viren wie Baculoviren, Papovaviren wie SV40, Vakziniaviren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudotollwut-Viren und Retroviren und Vektoren, welche von Kombinationen davon abgeleitet werden, wie jene, welche von Plasmid und Bakteriophage genetischen Elementen abgeleitet werden wie Cosmide und Phagenide. Die Expressionssysteme können Kontrollregionen enthalten, die Expression sowohl regulieren, als auch erzeugen. Im Allgemeinen kann jedes System oder Vektor, welcher geeignet ist, Polynukleotide aufrechtzuerhalten, zu propagieren oder exprimieren, um ein Polypeptid in einem Wirt herzustellen, verwendet werden. Die passende Nukleotidsequenz kann durch jede von einer Vielfalt von gut bekannten und routinemäßigen Techniken wie zum Beispiel jenen, welche in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (supra) dargelegt werden, in ein Expressionssystem insertiert werden.
RNA-Vektoren können ebenfalls für die Expression der Nukleinsäuren genutzt werden, welche für in dieser Erfindung offenbarte Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon kodieren. Diese Vektoren basieren auf Positiv- oder NegativStrang RNA Viren, die natürlich in einer breiten Vielfalt von eukaryotischen Zellen replizieren (Bredenbeek, P.J. & Rice, C.M., Virology 3: 297–310, 1992). Anders als Retroviren mangelt es diesen Viren an intermediärer DNA-Lebenszyklus Phase, welche vollständig in RNA-Form vorkommt. Zum Beispiel werden Alphaviren als Expressionsvektoren für fremde Proteine verwendet, weil sie in einer großen Bandbreite von Wirtszellen genutzt werden können und einen hohen Expressionsgrad vorsehen; Beispiele für Viren dieses Typs schließen den Sindbis-Virus und Semliki-Forest-Virus (Schlesinger, S., TIBTECH 11: 18–22, 1993; Frolov, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 11371–11377, 1996) ein. Wie durch Invitrogen's Sinbis Expressionssystem beispielhaft dargestellt kann der Forscher bequem das rekombinante Molekül in DNA-Form (pSinrep5 Plasmid) im Labor beibehalten, aber Propagierung in RNA-Form ist ebenfalls machbar. In der Wirtszelle, welche für Expression verwendet wird, besteht der Vektor, der das Gen von Interesse enthält, vollständig in RNA-Form und kann falls gewünscht kontinuierlich in dem Zustand propagiert werden.
Für Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmischen Retikulum in den periplasmischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung können passende Sekretionssignale in das gewünschte Polypeptid eingeschlossen werden. Diese Signale können zum Polypeptid endogen sein oder sie können heterologe Signale sein.
Die Expression einer DNA-Sequenz erfordert, dass die DNA-Sequenz an DNA-Sequenzen, welche transkriptionale und translationale regulatorische Informationen enthalten, „funktionsfähig gebunden" wird. Eine funktionsfähige Verbindung ist eine Verbindung, in welcher die Kontroll- oder regulatorischen DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz, die zu exprimieren angestrebt wird, auf solch eine Weise verbunden werden, dass Genexpression erlaubt wird. Die genaue Natur der „Kontrollregionen", welche für Genexpression gebraucht werden, kann von Organismus zu Organismus variieren, aber wird im Allgemeinen eine Promotorregion einschließen, welche, in prokaryotischen Zellen sowohl den Promotor (welcher die Initiierung von RNA-Transkription dirigiert), als auch DNA-Sequenzen enthält, welche, wenn sie in RNA transkribiert werden, die Initiierung von Proteinsynthese signalisieren werden. Regulatorische Regionen in eukaryotischen Zellen werden im Allgemeinen eine Promotorregion einschließen, welche ausreichend ist, die Initiierung von RNA-Synthese zu dirigieren.
Von zwei DNA-Sequenzen wird gesagt, dass sie funktionsfähig verbunden sind, wenn die Art der Verbindung zwischen den beiden DNA-Sequenzen (1) keine Einführung einer Rahmenverschiebung ergibt, (2) nicht die Fähigkeit der Promotorregion-Sequenz stört, die Transkription der für Fusionsprotein kodierenden Sequenz zu dirigieren, oder (3) nicht die Fähigkeit der für Fusionsprotein kodierenden Sequenz stört, durch die Promotorregion-Sequenz transkribiert zu werden. Somit wäre eine Promotorregion funktionsfähig an eine DNA-Sequenz gebunden, wenn der Promotor in der Lage wäre, diese DNA-Sequenz zu transkribieren.
Die Verbindung von verschiedenen DNA-Fragmenten, um die Expressionsvektoren dieser Erfindung herzustellen, wird gemäß den herkömmlichen Techniken durchgeführt, welche stumpf-endende oder versetzt-endende Termini für Ligation, Restriktionsenzymverdau, um passende Termini vorzusehen, Einfüllen von kohäsiven Enden wie passend, Alkali- und Phosphatasebehandlung, um unerwünschtes Verbinden zu vermeiden, und Ligation mit passenden Lipasen einsetzen. Im Fall eines Fusionsproteins kodiert das genetische Konstrukt für einen induzierbaren Promotor, welcher funktionsfähig an die 5'-Gensequenz des Fusionsproteins gebunden ist, um wirksame Expression des Fusionsproteins zu ermöglichen.
Um Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon in einer prokaryotischen Zelle (wie zum Beispiel E. coli, B. Subtiles, Pseudomonas, Streptomyces usw.) zu exprimieren, ist es notwendig, die für SEQ ID Nr. 1 kodierende DNA-Sequenz funktionsfähig an einen funktionalen prokaryotischen Promotor zu binden. Solche Promotoren können entweder konstitutiv oder bevorzugter regulierbar (also induzierbar oder dereprimierbar) sein. Beispiele für konstitutive Promotoren schließen den int-Promotor von Bakteriophage λ, den bla-Promotor des β-Lactamasegens von pBR322 und den CAT-Promotor des Chloramphenicolacetyltransferasegens von pBR325 usw. ein. Beispiele für induzierbare prokaryotische Promotoren schließen die Major-rechts und -links Promotoren von Bakteriophage λ (PL und PR), die trp-, recA-, LacZ-, LacI- und gal-Promotoren von E. coli, die α-Amylase (Ulmanen, I. et al., J. Bacteriol. 162: 176–182 (1985)) und die σ-28-spezifischen Promotoren von B. Subtilis (Gilman, M.Z. et al., Gene 32: 11–20 (1984)), die Pomotoren der Bakteriophagen von Bacillius (Gryczan, T. J., In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)), und Streptomyces Promotoren (Ward, J.M. et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468–478 (1986)) ein. Prokaryotische Promotoren werden durch Glick, B.R., J. Ind. Microbiol. 1: 277–282 (1987); Cenatiempo, Y., Biochimie 68: 505–516 (1986)); und Gottesman, S., Ann. Rev. Genet. 18: 415–442 (1984)) besprochen.
Falls Expression in einer eukaryotischen Zelle wie Hefe, Fungi, Säugerzellen oder Pflanzenzellen gewünscht wird, ist es notwendig, einen Promotor einzusetzen, der in der Lage ist, Transkription in solch einem eukaryotischen Wirt zu dirigieren. Bevorzugte eukaryotische Promotoren schließen den Promotor des Maus-Metallothionein I Gens (Hamer, D., et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273–288 (1982)); den TK-Promotor von Herpesvirus (McKnight, S., Cell 31: 355–365 (1982)); den SV40 Early-Promotor (Benoist, C., et al., Nature (London) 290: 304–310 (1981)); und den Hefe ga14-Gen-Promotor (Johnston, S. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971–6975 (1982); Silver, P.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951–5955 (1984)) ein.
Vorzugsweise wird die eingeführte DNA-Sequenz in ein Plasmid oder viralen Vektor eingeschlossen, welcher zu autonomer Replikation im Rezeptor-Wirt in der Lage ist. Jeder beliebige einer großen Vielfalt an Vektoren kann für diesen Zweck eingesetzt werden. Faktoren von Wichtigkeit beim Auswählen eines bestimmten Plasmids oder Virusvektors schließen ein: die Leichtigkeit, mit welcher Rezeptorzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und von jenen Zellen selektiert werden können, welche den Vektor nicht enthalten; die Anzahl an Kopien des Vektors, welche in einem bestimmten Wirt erwünscht sind; und ob es wünschenswert ist in der Lage zu sein, den Vektor zwischen Wirtszellen von unterschiedlichen Arten „hin- und her zu bewegen".
Bevorzugte prokaryotische Vektoren schließen ohne Begrenzung ein: Plasmide wie jene, welche zur Replikation in E. coli in der Lage sind (wie zum Beispiel pBR322, ColEl, pSC101, pACYC 184, πVX. Solche Plasmide werden zum Beispiel durch Maniatis, T., et al., in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)) offenbart. Bevorzugte Plasmid-Expressionsvektoren schließen das pGFP-1 Plasmid, beschrieben in Gardella et al., J. Biol. Chem. 265: 15854–15859 (1989) oder ein modifiziertes Plasmid, basierend auf den pET-Vektoren, beschrieben durch Studier und Dunn, Methods in Enzymology 185: 60–89 (1990) ein. Bacillus Plasmide schließen pC194, pC221, pT127 usw. ein. Solche Plasmide werden durch Gryczan, T. In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY pp. 307–329 (1982) offenbart. Geeignete Streptomyces Plasmide schließen pIJIOI (Kendall, K.J. et al., J. Bacteriol. 169: 4177–4183 (1987)) und Streptomyces Bakteriophagen wie ϕ31 (Chater, K.F. et al., in: Sixth International Symposium an Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Ungarn, pp. 45–54 (1986)) ein. Pseudomonas Plasmide werden durch John, J.F. et al., Rev. Infect. Dis. 8: 693–704 (1986)) und Izaki, K., Jon. J. Bacteriol. 33: 729–742 (1978)) besprochen.
Bevorzugte eukaryotische Expressionsvektoren schließen ohne Einschränkung BPV, Vaccinia, 2-Micron Circle usw. ein. Solche Expressionsvektoren sind nach Stand der Technik gut bekannt (Kotstein, D., et al., Miami Wntr. Symp. 19: 265–274 (1982); Broach, J.R., in: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY pp. 445–470 (1981); Broach, J.R., Cell 28: 203–204 (1982); Bollon, D.P., et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39–48 (1980); Maniatis, T., in: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Expression, Academic Press, N.Y. pp. 563–608 (1980)).
Zusätzlich zu Mikroorganismen können Kulturen von Zellen, welche von multizellulären Organismen abgeleitet sind, ebenfalls als Wirte verwendet werden. Im Prinzip ist jede solcher Zellkulturen verarbeitbar, ob von zellulären Quellen von wirbellosen oder Wirbeltieren. Das Interesse ist jedoch für Zellen von Wirbeltierquellen größer gewesen. Beispiele für brauchbare Wirbeltier-Wirt-Zelllinien sind VERO und HeLa Zellen, Zelllinien vom Ovarium des chinesischen Hamsters (CHO), WI38, BHK, COS-7 und MDCK Zelllinien. Expressionsvektoren für solche Zellen schließen (falls notwendig) gewöhnlich einen Replikationsursprung, einen Promotor, welcher sich vor oder stromaufwärts vom zu exprimierenden Gen befindet, zusammen mit notwendigen Ribosom-Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und transkriptionalen Terminatorsequenzen ein.
Zur Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen der Expressionsvektoren häufig durch Virusmaterial vorgesehen. Zum Beispiel werden gewöhnlich verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und Cytomegalovirus abgeleitet. Die Early- und Late-Promotoren von SV40 Virus sind besonders brauchbar, weil beide leicht aus dem Virus als ein Fragment erhalten werden können, welches ebenfalls den SV40 Virus-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273: 113 (1978)).
Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruktion des Vektors, um einen exogenen Ursprung einzuschließen, wie er von SV40 oder anderer viraler (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) Quelle abgeleitet werden kann, vorgesehen werden, oder kann durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle vorgesehen werden. Falls der Vektor in dem Wirtszellenchromosom integriert ist, ist das Letztere häufig ausreichend.
Falls Zellen ohne gewaltige Zellmembranbarrieren als Wirtszellen verwendet werden, wird Transfektion durch das Calciumphosphat-Ausfällungsverfahren durchgeführt, wie durch Graham und Van der Erb, Virology 52: 546 (1978) beschrieben. Jedoch können andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie durch nukleare Injektion oder durch Protoplastenfusion ebenfalls verwendet werden. Im Fall von Gentherapie sieht das direkte nackte Plasmid oder Virus-DNA Injektionsverfahren mit oder ohne Transfektion-erleichternde Mittel wie, ohne Begrenzung, Liposome eine alternative Herangehensweise an die gegenwärtigen Verfahren von in vivo oder in vitro Transfektion von Säugerzellen vor. Falls prokaryotische Zellen oder Zellen, welche wesentliche Zellwandkonstruktionen enthalten, verwendet werden, ist das bevorzugte Transfektionsverfahren Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie in Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 (1972) beschrieben.
IV. Verabreichung und therapeutischer Nutzen von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon
(A) Verabreichung von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon
Im Allgemeinen werden Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivate davon von dieser Erfindung oder Salze davon in Mengen zwischen etwa 0,01 und 1 μg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise von etwa 0,07 bis etwa 0,2 μg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. Für eine 50 kg menschliche weibliche Person ist die tägliche Dosis von biologisch wirksamen Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon von etwa 0,5 bis etwa 50 μg, vorzugsweise von etwa 3,5 bis etwa 10 μg. Bei anderen Säugern wie Pferden, Hunden und Rindern können höhere Dosen erforderlich sein. Diese Dosierung kann in einer herkömmlichen pharmazeutischen Zusammensetzung durch eine einzelne Verabreichung, durch mehrfache Verabreichungen oder über kontrollierte Abgabe, wie benötigt, um die wirksamsten Ergebnisse zu erzielen, vorzugsweise einmal oder mehrere Male täglich durch Injektion abgegeben werden. Insbesondere bevorzugt kann diese Dosierung in einer herkömmlichen pharmazeutischen Zusammensetzung durch nasale Insufflation abgegeben werden.
Die Auswahl der genauen Dosis und Zusammensetzung und der angemessenste Abgabeplan wird unter anderem durch die pharmakologischen Eigenschaften der gewählten Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon, der Art und Schwere des behandelten Zustands und dem physikalischen Zustand und der Geistesschärfe des Empfängers beeinflusst werden.
Repräsentative bevorzugte Abgabesysteme schließen ohne Einschränkung oral, parenteral (einschließlich subkutan, transkutan, intramuskulär und intravenös), rektal, bukkal (einschließlich sublingual), transdermal und intranasale Insufflation ein.
Pharmazeutisch annehmbare Salze behalten die gewünschte biologische Wirksamkeit der Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon ohne toxische Nebenwirkungen. Beispiele für solche Salze sind (a) Säureadditionssalze, gebildet mit anorganischen Säuren, zum Beispiel Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und Ähnliche; und Salze, gebildet mit organischen Säuren wie zum Beispiel Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Gerbsäure, Pamoasäure, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalinsulfonsäuren, Naphthalindisulfonsäuren, Polygalacturonsäure und Ähnlichen; (b) Basenadditionssalze, gebildet mit mehrwertigen Metallkationen wie Zink, Calcium, Bismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Cobalt, Nickel, Cadmium und Ähnlichen; oder mit einem organischen Kation, gebildet aus N,N'-Dibenzylethylendiamin oder Ethylendiamin; oder (c) Kombinationen von (a) und (b), z. B. einem Zinktannatsalz und Ähnlichem.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, welche als einen wirksamen Inhaltsstoff Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivate davon der vorliegenden Erfindung oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon, in Vermischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Träger umfassen. Wie oben erwähnt, können solche Zusammensetzungen für parenterale (subkutane, transkutane, intramuskuläre oder intravenöse) Verabreichung, insbesondere in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen; für orale oder bukkale Verabreichung, insbesondere in Form von Tabletten oder Kapseln; für rektale, transdermale Verabreichung; und für intranasale Verabreichung, insbesondere in Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen hergestellt werden.
Die Zusammensetzungen können bequem in Einheitsdosierungsform verabreicht werden und können durch eines der Verfahren, welche nach Stand der pharmazeutischen Technik bekannt sind, hergestellt werden, zum Beispiel wie in Remingtons's Pharmaceu tical Sciences, 17. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985), hierin durch Verweis eingeschlossen, beschrieben. Formulierungen für parenterale Verabreichung können als Arzneimittelträger steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Alkylenglycole wie Propylenglycol, Polyalkylenglycole wie Polyethylenglycol, Öle von pflanzlichem Ursprung, hydrierte Naphthaline und Ähnliches enthalten. Für orale Verabreichung kann die Formulierung durch die Zugabe von Gallensalzen oder Acylcarnitinen verstärkt werden. Formulierungen für nasale Verabreichung können fest sein und können Arzneimittelträger, zum Beispiel Lactose oder Dextran enthalten, oder können wässerige oder ölige Lösungen zur Verwendung in Form von Nasentropfen oder dosiertem Spray sein. Für bukkale Verabreichung schließen typische Arzneimittelträger Zucker, Calciumstearat, Magnesiumstearat, vorgelatinierte Stärke und Ähnliches ein.
Wenn für den am meisten bevorzugten Verabreichungsweg, der nasalen Verabreichung, formuliert, kann die Absorption über die Nasenschleimhautmembran durch Surfactantsäuren wie zum Beispiel Glykocholsäure, Cholsäure, Taurocholsäure, Ethocholsäure, Deoxycholsäure, Chenodeoxycholsäure, Dehydrocholsäure, Glycodeoxycholsäure, Cyclodextrinen und Ähnlichem in einer Menge im Bereich zwischen etwa 0,2 und 15 Gew.-%, vorzugsweise zwischen etwa 0,5 und 4 Gew.-%, insbesondere bevorzugt 2 Gew.-% verstärkt werden.
Abgabe der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an das Objekt über verlängerte Zeiträume, zum Beispiel Zeiträume von einer Woche bis zu einem Jahr, können durch eine einzelne Verabreichung eines gesteuerten Abgabesystems erreicht werden, welches ausreichend wirksamen Inhaltsstoff für den gewünschten Abgabezeitraum enthält. Verschiedene gesteuerte Abgabesysteme wie monolithische oder Depot-artige Mikrokapseln, Depot-Implantate, osmotische Pumpen, Vesikel, Mizellen, Liposome, transdermale Pflaster, iontophoretische Vorrichtungen und alternative injizierbare Dosierungsformen können für diesen Zweck genutzt werden. Lokalisierung der Stelle, an welche Abgabe des wirksamen Inhaltsstoffs gewünscht wird, ist ein zusätzliches Merkmal einiger gesteuerter Abgabevorrichtungen, welches sich als zuträglich bei der Behandlung bestimmter Störungen erweisen kann.
Eine Form der gesteuerten Abgabeformulierung enthält das Polypeptid oder sein Salz, dispergiert oder eingekapselt in einem langsam zerfallenden, nicht-toxischen, nicht-antigenen Polymer wie Copoly(milch/glycol)säure, wie in der Pionierarbeit von Kent, Lewis, Sanders und Tice, US.-Pat. Nr. 4675189 beschrieben, hierin durch Verweis eingeschlossen. Die Verbindungen oder vorzugsweise ihre relativ unlöslichen Salze können ebenfalls in Cholesterin oder anderen Lipidmatrix-Pellets oder Silastomer-Matrix-Implantaten formuliert werden. Zusätzliche langsame Abgabe, Depot-Implantat oder injizierbare Formulierungen werden dem Fachmann offensichtlich sein. Siehe zum Beispiel Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson Hrsg., Marcel Dekker Inc., New York, 1978 und R.W. Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Wiley & Sons, New York, 1987, hierin durch Verweis eingeschlossen.
Wie PTH können die Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 und Derivate davon in Kombination mit anderen Wirkstoffen verabreicht werden, welche beim Behandeln eines gegebenen klinischen Zustands brauchbar sind. Beim Behandeln von Osteoporose und anderen Knochen-bezogenen Störungen zum Beispiel können die Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 und Derivate davon zusammen mit einer Diät-Calciumergänzung oder mit einem Vitamin D Analog verabreicht werden (siehe U.S. Pat. Nr. 4698328 ). Alternativ können die Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 und Derivate davon vorzugsweise unter Verwendung eines cyclischen therapeutischen Systems in Kombination mit Bisphosphonaten wie zum Beispiel in U.S. Pat. Nr. 4761406 beschrieben oder in Kombination mit einem oder mehreren Knochen-therapeutischen Wirkstoffen wie ohne Einschränkung Calcitonin und Estrogen verabreicht werden.
(B) Therapeutischer Nutzen von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 und Derivaten davon
Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivate davon von dieser Erfindung sind brauchbar für die Verhinderung und Behandlung einer Vielfalt von Zuständen von Säugern, welche sich durch den Verlust von Kochenmasse manifestieren. Insbesondere sind die Verbindungen dieser Erfindung zur Prophylaxe und therapeutischen Behandlung von Osteoporose und Osteopenie in Menschen angezeigt. Ferner sind die Verbindungen dieser Erfindung für die Prophylaxe und therapeutische Behandlung von anderen Knochenerkrankungen angezeigt. Die Verbindungen dieser Erfindung sind für die Prophylaxe und therapeutische Behandlung von Hypoparathyroidismus angezeigt. Schließlich sind die Verbindungen dieser Erfindung zur Verwendung als Agonisten für Frakturbehebung und als Antagonisten für Hypercalcämie angezeigt.
Einige Formen von Hypercalcämie und Hypocalcämie beziehen sich auf die Interaktion zwischen PTH und PTHrP und die PTH-1 und PTH-2 Rezeptoren. Hypercalcämie ist ein Zustand, bei welchem es eine abnorme Höhe im Serum-Calciumgehalt gibt; sie wird häufig mit anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich Hyperparathyroidismus, Osteoporose, Karzinom der Brust, Lunge und Prostata, epidermoiden Krebsen des Kopfes und Nackens und der Speiseröhre, multiplem Myelom und Hypernephrom. Hypocalcämie, ein Zustand, in welchem der Serum-Calciumgehalt abnorm niedrig ist, kann sich aus einem Mangel an wirksamem PTH ergeben. z. B. nach Schilddrüsenchirurgie.
Nukleinsäuren der Erfindung, welche für Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivate davon kodieren, können ebenfalls an einen ausgewählten Gewebe-spezifischen Promotor und/oder Verstärker gebunden werden und das sich ergebende Hybridgen durch Standardverfahren (z. B. wie durch Leder et al., U.S. Pat. Nr. 4736866 beschrieben, hierin durch Verweis eingeschlossen) in einen Tierembryo bei einer frühen Entwicklungsstufe (z. B. dem befruchteten Oozytenstadium) eingeführt werden, um ein transgenes Tier herzustellen, welches erhöhte Grade von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivate davon in ausgewählten Geweben exprimiert (z. B. den Osteocalcin-Promotor für Knochen). Solche Promotoren werden verwendet, um Gewebe-spezifische Expression von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivate davon im transgenen Tier zu dirigieren.
Zusätzlich werden jegliche anderen Aminosäure-Substitutionen einer Art, welche nicht die Fähigkeit des PTH-Analogs zerstört, den PTH-1/PTH-2 Rezeptor zu agonisieren (wie durch Tests gezeigt, welche dem Fachmann bekannt sind und unten diskutiert werden), in den Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Mit „Agonist" ist ein Ligand beabsichtigt, welcher in der Lage ist, eine zelluläre Antwort, vermittelt durch den PTH-1/PTH-2 Rezeptor zu verstärken oder potenzieren. Ob ein Kandidat-„Agonist” der vorliegenden Erfindung solch eine zelluläre Antwort verstärken oder hemmen kann, kann durch Verwendung von nach Stand der Technik bekannten Protein-Ligand/Rezeptor zellu lären Antwort- oder Bindungstests bestimmt werden, einschließlich jenen, welche woanders in dieser Anmeldung beschrieben werden.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Peptids, bestehend aus der Formel:

(a) X₀₁ ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 1); wobei (i) X₀₁ ein Desamino Ser, Desamino Ala oder Desamino Gly ist; und (ii) vorausgesetzt ist, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-34)NH₂ ist;
(b) Fragmenten von (a) enthaltenden Aminosäuren 1-29, 1-30, 1-31, 1-32 oder 1-33; vorausgesetzt, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-31)NH₂ ist; oder
(c) pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers; in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Behandeln von Osteoporose oder Osteopenie vorgesehen.

Bevorzugte Merkmale dieses Aspekts werden in abhängigen Ansprüchen 8 bis 10 vorgesehen.
Um den Agonist zu verabreichen, wird die passende Verbindung von SEQ ID Nr. 1 oder ein Derivat davon bei der Herstellung eines Medikaments verwendet, im Allgemeinen indem es in einen passenden Träger oder Arzneimittelträger wie z. B. physiologischer Kochsalzlösung formuliert wird und vorzugsweise intravenös, intramuskulär, subkutan, oral oder intranasal bei einer Dosierung verabreicht wird, die selektive Aktivierung der PTH-1/PTH-2 Rezeptors nach Binden einer Verbindung von SEQ ID Nr. 1 oder eines Derivats davon vorsieht. Typische Dosierung wäre 1 ng bis 10 mg des Peptids pro kg Körpergewicht pro Tag. Solche Dosierungen und Verabreichung kann zur Verabreichung eines PTH-Agonist, z. B. zur Behandlung von Zuständen wie Osteoporose, anderen metabolischen Konchenstörungen und Hyperparathyroidismus und verwandten Störungen verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Verbindung von SEQ ID Nr. 1 oder ein Derivat davon, welches in der Erfindung verwendet wird, eine Aminosäuresubstitution von Desaminoalanin für Serin an Aminosäureposition 1 einer Verbindung von SEQ ID NR. 1. In dieser besonderen Ausführungsform ist das PTH-Derivat [Desamino Ala¹]PTH(I-34)(SEQ ID Nr. 5). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat die Verbindung von SEQ ID Nr. 1 oder ein Derivat davon, welches in der Erfindung verwendet wird, eine Aminosäuresubstitution von Desaminoglycin für Serin an Aminosäureposition 1 von Verbindung von SEQ ID Nr. 1. In dieser besonderen Ausführungsform ist das PTH-Derivat [DesaminoGly¹]PTH(1-34) (SEQ ID Nr. 2).
V. Rezeptor-Signalisierungswirksamkeiten von Verbindungen von SEQ ID Nr. 1 oder Derivaten davon
Ein entscheidender Schritt in der Expression von hormonaler Wirkung ist die Interaktion von Hormonen mit Rezeptoren an der Plasmamembranoberfläche von Zielzellen. Die Bildung von Hormonrezeptorkomplexen ermöglicht die Transduktion von extrazellulären Signalen in die Zelle, um eine Vielfalt an biologischen Antworten auszulösen.
A. Screening für PTH-2 Rezeptoragonisten
Polypeptide der Erfindung können für ihre agonistischen Eigenschaften unter Verwendung des cAMP-Akkumulationstests gescreent werden. Zellen, welche PTH-2 Rezeptor an der Zelloberfläche exprimieren, werden mit nativem PTH(1-84) für 5–60 Minuten bei 37°C in Gegenwart von 2 mM IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin, Sigma, St. Louis, MO) inkubiert. Cyclische AMP-Akkumulation wird durch spezifischen Radio-Immuntest, wie oben beschrieben, gemessen.
Eine Verbindung von SEQ ID Nr. 1 oder ein Derivat davon, die mit nativem PTH(1-84) um Bindung an den PTH-2 Rezeptor konkurriert, und welche cAMP-Akkumulation in Gegenwart oder Abwesenheit von nativem PTH(1-84) stimuliert, ist ein kompetitiver Agonist. Eine Verbindung von SEQ ID Nr. 1 oder ein Derivat davon, die nicht mit nativem PTH(1-84) um Bindung an den PTH-2 Rezeptor konkurriert, aber welche noch in der Lage ist, cAMP-Akkumulation in Gegenwart oder Abwesenheit von nativem PTH(1-84) zu stimulieren, oder welche eine höhere cAMP-Akkumulation stimuliert als jene, welche durch eine Verbindung von SEQ ID Nr. 1 oder einem Derivat davon allein beobachtet wird, würde als nicht-kompetitiver Agonist angesehen werden.
Es wird von den Fachleuten anerkannt werden, dass die Erfin dung innerhalb einer großen Bandbreite an äquivalenten Parametern von Zusammensetzung, Konzentration, Verabreichungsarten und Bedingungen durchgeführt werden kann, ohne vom Geist oder Umfang der Erfindung oder einer Ausführungsform davon abzuweichen.
Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben worden ist, wird selbige leichter mit Verweis auf spezifische Beispiele verstanden werden, welche als Veranschaulichung vorgesehen werden und nicht beabsichtigt sind, die Erfindung zu begrenzen, sofern nicht hierin spezifiziert.
Beispiel 1
Materialien und Verfahren Zellkultur
Die folgenden Zelllinien wurden in diesen Studien verwendet. HKRK C53 Subklone von LLC-PKI porkinen renalen epithelialen Zellen, welche humane PTH-1 Rezeptoren stabil exprimieren (150000 Rezeptoren/Zelle). SaOS-2 Zellen sind transformierte humane Osteosarkomzellen, welche relativ wenig (10000–20000 pro Zelle) humane 9TH-1 Rezeptoren exprimieren. HPR2-7 Zellen sind Subklone von LLC-PK₁, welche annähernd 250000 rekombinante humane PTH-2 Rezeptoren pro Zelle exprimieren. HKRK-E7 Zellen sind Subklone von LLC-PK, welche annähernd 1 Million hPTH-1 Rezeptoren pro Zelle stabil exprimieren. HPR2-22 Zellen sind Subklone von LLC-PK1, welche 1,5 Millionen rekombinante hPTH-2 Rezeptoren pro Zelle exprimieren. Die HPR2-27 und HPR2-22 Zelllinien wurden auf die gleiche Weise erzeugt, wie die HKRK-Zellen, aber unter Einsatz von stattdessen Typ 2 PTH Rezeptor cDNA unter Verwendung der Transfektionstechnik von (Bringhurst, F.R. et al., Endocrinology 132(5): 2090–2098 (1993); Guo, J., et al., Endocrinology 136(9): 3884–3891 (1995)).
Alle Zellen wurden unter 5% CO₂ in Luft in Dulbecco's modifiziertem essentiellen Medium, enthaltend 7% fötales Rinderserum (FES) und 1% Penicillin/Streptomycin (GIECO-BRL, Grand Island, NY) gehalten. Zellen wurden in 24-Muldenplatten zwei Tage vor dem Test bei einer geeigneten Zelldichte (annähernd 2–2,5 × 10⁵ Zellen/Mulde) gesät. DNA-Transfektion in COS/HEK-Zellen wurde 24 Std. nach Pflanzen durchgeführt und Inositol-Radiomarkierung wurde 24 Std. danach zugegeben (siehe unten). Zelltransfektionen wurden wie vorhergehend beschrieben durchgeführt (Gardella, T.J., et al., Endocrinology 132(5): 2024–2030 (1993)).
Radioligand-Bindungs- und Signalisierungstests
Intrazelluläre cAMP-Akkumulation, PLC-Aktivierung und PTHR-Bindungsaffinität wurden wie vorhergehend berichtet (Bringhurst, F.R., et al., Endocrinology 132(5): 2090–2098 (1993); Guo, J., et al., Endocrinology 136(9): 3884–3891 (1995)) gemessen. Intrazelluläre cAMP-Akkumulation wurde in Extrakten von Zellen gemessen, die humanen PTH-Peptiden in der Gegenwart von Isobutylmethyxanthin (IBMX, 1 mM) bei 37°C für 15 Min. ausgesetzt waren. Nach Beendigen der Umsetzungen durch Aspiration und Gefrieren in flüssigem Stickstoff wurden Zell-Monoschichten mit 50 mM HCl extrahiert und cAMP wurde unter Verwendung eines Radioimmuntestkits (Dupont-New England Nuclear, Boston, MA) gemessen.
PLC wurde durch PTH-Agonisten in Gegenwart von 30 mM LiCl bei 37°C für 30 Min. nach 16 Std. Markierung mit [³H]Myo-Inositol (3uCi/ml) in Serum-freiem Medium, enthaltend 0,1% Rinderserum Albumin aktiviert. Die Umsetzungen wurden durch schnelle Aspiration und Zugabe von kaltem 5% TCA gestoppt. Wasserlösliches radiomarkiertes Inositoltrisphosphat (IP₃) wurde nach Etherextraktion durch Ionenaustausch-Chromatographie extrahiert (Guo, J., et al., Endocrinology 136(9): 3884–3891 (1995)). In Experimenten unter Einbeziehung von HEK 293 Zellen wurden vorhergehend mit humaner PTHR cDNA (im pcDNA1 Expressionsvektor HKRK) unter Verwendung von Lipofectamin (Gibco BRL) transfizierte Zellen mit [³H]Myo-Inositol markiert und wie oben beschrieben getestet, außer dass gesamte wasserlösliche [³H]Inositolpolyphosphate als einzelne Fraktionen von den Ionenaustauschsäulen gesammelt wurden.
Radioligand-Wettbewerb-Bindungstests wurden bei 2–8°C für 6 Std. unter Verwendung von ¹²⁵I-[Nle^8,21]Ratte-PTH-(1-34) (100000 cpm/Mulde) in Gegenwart oder Abwesenheit von nicht-radioaktiven hPTH-(1-34) Analoga durchgeführt. Zellschichten wurden dreimal vor Solubilisierung zur Bestimmung von Zell-assoziierter Radioaktivität gewaschen.
Die durchschnittlichen Grade basal und in Gegenwart von maximalen Konzentrationen von hPTH-(1-34), welche in HKRK C53 Zellen für die Tests beobachtet wurden, waren jeweils 12 ± 4 und 207 ± 37 pMol/Mulde/15 Min. für cAMP-Akkumulation, 898 ± 142 und 1908 ± 251 cpm/Mulde für IP₃-Bildung und 25520 ± 1909 und 956 ± 135 cpm/Mulde für Bindung. Die Durchschnittsgrade basal und in Gegenwart von maximalen Konzentrationen von hPTH-(1-34), welche in HKRK B28 Zellen für die hier berichteten Tests beobachtet wurden, waren jeweils 1,6 ± 0,5 und 337 ± 55 pMol/Mulde/15 Min. für cAMP-Akkumulierung und 1497 ± 121 und 16137 ± 919 cpm/Mulde für Bindung. Die Durchschnittsgrade basal und in Gegenwart von maximalen Konzentrationen von hPTH-(1-34), welche in HPR2-7 Zellen für die hier berichteten Tests beobachtet wurden, waren jeweils 2,5 ± 1,0 und 133 ± 14 pMol/Mulde/15 Min. für cAMP-Akkumulation und 1156 ± 243 und 4541 ± 386 cpm/Mulde für Bindung. Die Durchschnittsgrade basal und in Gegenwart von maximalen Konzentrationen von hPTH-(1-34), welche in HPR2-22 Zellen für die hier berichteten Tests beobachtet wurden, waren jeweils 5,2 ± 0,5 und 286 ± 8 pMol/Mulde/15 Min. für cAMP-Akkumulation und 335 ± 68 cpm/Mulde (basal) für IP₃-Bindung.
Peptide und andere Reagenzien
Alle Reagenzien wurden von Sigma (St. Louis, MO) gekauft, sofern nicht anders spezifiziert. Alle Isotope wurden von Dupont-New England Nuclear (Boston, MA) erhalten. Humane PTH-Peptide wurden im Biopolymer Core Laboratory der Endocrine Unit mit C-terminaler Amidation und, wenn vorhanden, Substitution von Tyr³⁴ für das natürlich auftretende Phe³⁴ synthetisiert. [Tyr⁰]hPTH-(1-34) wurde von Sigma Co. gekauft. ¹²⁵I-[Nle^8,21]Ratte-PTH-(1-34) wurde wie vorhergehend beschrieben iodiniert und gereinigt (Bringhurst, F.R., et al., Endocrinology 132(5): 2090–2098 (1993); Guo, J., et al., Endocrinology 136(9): 3884–3891 (1995)).
Ergebnisse
N-terminal modifizierte hPTH-Analoge
Wir sprachen die Rolle des N-terminalen Ser¹-Rests und seiner α-Aminogruppe beim Binden an und Aktivieren des humanen PTH-1 und PTH-2 Rezeptors an. Weil frühere Arbeit mit isolierten renalen Membranen von Ratten gezeigt hatte, dass Substitution von Ala¹ für Ser¹ in hPTH-(1-34) seine AC-Wirksamkeit erhöht, während eine Gly¹-Substitution AC-Wirksamkeit durch bPTH-(1-34) beeinträchtigte (Tregear, G.W., und Potts, J.T., Jr. Endocr. Res. Commun. 2: 561–567 (1975)), wurden diese Position-1 Modifikationen in hPTH-(1-34) eingeführt und die sich ergebenden Peptide wurden verwendet, um die Wirkung der Modifikationen am N-Terminus von hPTH(1-34) auf Bindung an und Aktivierung von die sen beiden Rezeptoren, exprimiert in den verschiedenen getesteten Zelllinien, zu vergleichen. Die Ergebnisse für Messungen von cyclischer AMP-Akkumulation werden in 1-3 gezeigt.
1 zeigt Messungen von cyclischer AMP-Akkumulation in HKRK C53 Zellen. Es gibt LLC-PK₁ porkine renale Zellen, welche annähernd 150000 rekombinante hPTH-1 Rezeptoren pro Zelle stabil exprimieren. Es werden Daten für zwei Konzentrationen von Peptid (10^–9 M und 10^–7 M) präsentiert. Es kann gesehen werden, dass die Ala¹- und Gly¹-substituierten hPTH(1-34)NH₂-Moleküle fast die gleiche Wirksamkeit in diesem Test haben, wie natives hPTH(1-34)NH₂, während ihre Desamino-Gegenstücke stark verringerte Wirksamkeit haben, insbesondere bemerkbar bei der 1 nM Konzentration. Das Peptid hPTH(2-34) hat ähnlich verringerte Wirksamkeit über den PTH-1 Rezeptor.
2 zeigt cAMP Messungen in SaOS-2 Zellen. Dies sind transformierte humane Osteosarkomzellen, von welchen bekannt ist, dass sie relativ wenig (10000–20000 pro Zelle) humane PTH-1 Rezeptoren exprimieren. Wie in 2 gezeigt, ist die Cyclasewirksamkeit von [Gly¹] und [Ala¹] hPTH(1-34)NH₂-Analoga wieder mit der des Kontrollpeptids hPTH(1-34)NH₂ vergleichbar, während die Desamino-Analoga wie hPTH(2-34) sehr schwache Agonisten bei der höchsten getesteten Konzentration (1 μM) sind.
Im Gegensatz zu diesen Beobachtungen, welche in Zellen gemacht wurden, die PTH-1 Rezeptoren exprimieren, zeigt 3 die cAMP-Ansprechempfindlichkeit auf die gleichen Peptide, wenn sie zu anderen klonalen LLC-PK₁-Zellen (HPR2-7) zugegeben werden, die annähernd 250000 rekombinante humane PTH-2 Rezeptoren pro Zelle exprimieren. Es ist von 3 offensichtlich, dass die Desamino-[Ala¹] und -[Gly¹]-Peptide verstärkte Wirksamkeit im Vergleich mit hPTH(1-34)NH₂, hPTH(2-34) oder ihren [Ala¹] und [Gly¹] substituierten Gegenstücken zeigen. Zusätzlich zeigen die Desaminopeptide eine wesentlich größere maximale Cyclase-Aktivierung bei sehr hohen Konzentrationen (1 Mikromolar).
Humanes PTH-(3-34) ist vorhergehend als ein PLC/PKC-selektives Peptid über Nager PTH Rezeptoren gekennzeichnet worden (Azarani, A., et al., J. Biol. Chem. 271(25): 14931–14936 (1996); Fujimori, A., et al., Endocrinology 128(6): 3032–039 (1991); Jouishomme, H., et al., Endocrinology 130(1): 53–60 (1992)). Wir haben jedoch beobachtet, dass dieses Peptid bei Konzentrationen so hoch wie 1000 nM PLC in HKRK B7 Zellen oder in COS-7 Zellen, die Ratten oder humane PTHRs exprimierten, (Takasu et al., J. Bone Miner. Res., In Press) nicht aktivierten. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die ersten beiden Aminosäuren am N-Terminus von hPTH-(1-34) (Ser¹-Val²) wichtig für PLC-, als auch AC-Aktivierung über den humanen PTHR sein müssen.
Um diese Analyse zu verfeinern, untersuchten wir zuerst die Eigenschaften von hPTH-(2-34) in verschiedenen Zelllinien. Wie in 4 und 5 gezeigt, löste hPTH-(2-34) keine PLC-Wirksamkeit in HKRK B7 Zellen aus, obwohl seine Aktivierung von AC in Höhe und Sensibilität mit der von hPTH-(1-34) vergleichbar war. Zusätzlich, wie in 6 gezeigt, bindet PTH(2-34) auch ebenso gut an den hPTH-Rezeptor, wie PTH(1-34). Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von COS-7 Zellen erhalten, welche reichlich humane PTHRs exprimieren (Daten nicht gezeigt). Die Unfähigkeit von hPTH-(2-34), PLC über den humanen PTH-1 Rezeptor zu aktivieren, wurde in einem vollständig homologen System durch Verwendung von HEK-293 humanen embryonischen Nierenzellen bestätigt, die mit humaner PTHR cDNA vorübergehend transfiziert wurden (Daten nicht gezeigt).
Wir befassten uns als nächstes mit der Wirkung der extremen N-terminalen Aminosäure von PTH(1-34) auf die Aktivierung des PLC/PKC-Wegs. 4 zeigt Messungen von Phospholipase C (PLC) Wirksamkeit nach Zugabe der angezeigten Peptide bei einer Endkonzentration von 1000 nM zu LLC-PK Zellen (HKRK-B7), die annähernd 1 Million hPTH-1 Rezeptoren pro Zelle stabil exprimieren. Wie in 4 gezeigt, üben die Desamino-[Ala¹] und -[Gly¹]-Verbindungen keine Aktivierung von PLC über diesen Rezeptor aus, während hPTH(1-34)NH₂ und [Ala¹]hPTH(1-34)NH₂ beide volle Agonisten sind. Das [Gly¹]hPTH(1-34)NH₂ substituierte Peptid zeigte abgeschwächte PLC-Wirksamkeit (annähernd 50% des hPTH(1-34) Maximums) bei der getesteten Konzentration und ist somit nur ein partieller Agonist für PLC-Aktivierung über diesen Rezeptor. Humanes PTH(2-34) ist wie die Desamino-Peptide in diesem Test unwirksam.
In 5 werden im Gegensatz Phospholipase C Aktivierungsprofile dieser Peptide in HPR2-22 Zellen gezeigt, die 1,5 Millionen rekombinante hPTH-2 Rezeptoren pro Zelle exprimieren. Wie in der Figur gesehen, üben sowohl die Desamino-[Ala¹]-, als auch -[Gly¹] hPTH(1-34) Peptide größere maximale Aktivierung von Phospholipase C bei den getesteten Konzentrationen (1000 nM) aus, als humanes PTH(1-34)NH₂. Humanes PTH(2-34), welches eine Wirksamkeit ähnlich den Desaminopeptiden über den PTH-1 Rezeptor hat, wird in diesem Test nur als partieller Agonist gesehen.
Wie in 6 gezeigt, ist die verstärkte Wirkkraft der Desaminopeptide für den PTH-2 Rezeptor mit einer 10-fach höheren offensichtlichen Bindungsaffinität bezogen auf hPTH(1-34), an den Rezeptor (gegenüber dem PTH-1 Rezeptor) verbunden. Wie in der Figur gezeigt, weisen hPTH(1-34), HPTH(2-34) und die Desaminopeptide ähnliche kompetitive Ersetzung von ¹²⁵I-[Nle^8,21]rPTH(1-34)-Radioligandbindung an HKRK B28 Zellen auf, die 280000 rekombinante humane PTH-1 Rezeptoren/Zelle exprimieren, während die Desamino-Verbindungen 10-fach wirkkräftiger beim Ersetzen dieses Radioligands von HPR2-7 Zellen sind, die den humanen PTH-2 Rezeptor exprimieren.
Diskussion
Die in diesen Experimenten präsentierten Funde erfordern, dass einige Schlüsselaspekte gegenwärtiger Modelle der strukturellen Determinanten von PTH-1 und PTH-2 Signalisierung nochmal untersucht werden. Arbeit, welche vorhergehend mit Nager und Opossumzellen durchgeführt wurde, welche endogene PTHRs exprimieren, hatte gezeigt, dass es N-gestutzten PTH-Analoga wie PTH-(3-34) an AC-Wirksamkeit mangelt, aber sie dennoch wirkkräftig PKC aktivieren können, und in einigen Systemen (Donahue, H.J., et al., J. Biol. Chem. 263: 13522–13527 (1988); Fujimori, A., et al., Endocrinology 128(6): 3032–3039 (1991); Siegfried, G., et al., Endocrinology 136(3): 1267–1275 (1995)), aber nicht in anderen (Reid, I.R., et al., Am. J. Physiol. 253(1 Pt 1): E45–51 (1987); Tamura, T., et al., Biochem. Biophys., Res. Commun. 159: 1352–1358 (1989)) Ca^-- Zwischenverbindungen. Detaillierte Analyse der PKC-aktivierenden Eigenschaften von N- und C-gestutzten hPTH-(1-34)-Analoga führte zur Schlussfolgerung, dass die Sequenz hPTH-(29-32) eine kritische „PKC-Aktivierungsdomäne" (Jouishomme, H., et al., J. Bone Miner. Res. 9(6): 943–949 (1994); Jouishomme, H., et al., Endocrinology 130(1): 53–60 (1992); Whitfield, J.F., und Morley, P. Trends Pharm. Sci. 16(11): 382–386 (1995)) repräsentiert.
Um zu bestimmen, ob die PTH-1 und PTH-2 Rezeptoren die gleichen Strukturmerkmale des PTH-Ligands erkennen, verglichen wir die Wirkung von Modifikationen des N-Terminus von hPTH(1-34) auf Bindung an und Aktivierung von diesen beiden Rezeptoren. Im Vergleich zwischen klonalen LLC-PK1 Zellen, die humanes PTH-1 stabil exprimierten, gegenüber humanen PTH-2 Rezeptoren, löste hPTH(1-34) konzentrationsabhängige Aktivierung von AC mit EC50ern von 1 jeweils nM aus. Humanes PTH(2-34) war weniger wirksam (≤ 10-fach) über beide Rezeptoren. Substitution von Ala oder Gly für den N-terminalen Ser-Rest von hPTH(1-34) veränderte nicht AC-Aktivierung über einen der Rezeptoren wenn in Zellen getestet, welche entweder 150000 (HKRK C53) oder 10000–20000 (SaOS) humane PTH-1 Rezeptoren pro Zelle exprimieren. Entfernung der α-Aminogruppe, um Desamino-[Ala¹]hPTH(1-34) oder Desamino-[Gly¹]hPTH(1-34) herzustellen, verringerte AC-Wirksamkeit über den PTH-1 Rezeptor 10-fach. Im auffälligen Gegensatz fanden wir, dass diese Desaminopeptide den humanen PTH-2 Rezeptor mit stark erhöhter Wirkkraft aktivierten: der EC50 für beide war 3-fach niedriger (10 nM gegenüber 30 nM) und die maximalen Antworten doppelt von dem, was mit hPTH(1-34) gesehen wurde.
Von Amino-gestutzten Analoga, einschließlich bPTH-(2-34), hPTH-(2-38) und Desamino-PTH-(1-34) wurde vorhergehend gefunden, dass sie nur schwache AC-Wirksamkeit aufweisen, wenn in vitro getestet (Fujimori, A., et al., Endocrinology 128(6): 3032–3039 (1991); Fujimori, A., et al., Endocrinology 130(1): 29–36 (1992); Tregear, G.W., und Potts, J.T., Jr. Endocr. Res. Commun. 2: 561–567 (1975); Rixon, R.H., et al., J. Bone Miner. Res. 9(8): 1179–1189 (1994)), während wir fanden, dass hPTH-(2-34), Desamino-[Ala¹]hPTH-(1-34) und Desamino-[Gly¹]hPTH-(1-34) annähernd gleich wirkkräftig mit hPTH-(1-34) waren. Dieser Unterschied in AC-Aktivierung wird wahrscheinlich durch die viel größere Anzahl an humanen PTH-1 Rezeptoren erklärt, welche durch die HKRK B7 Zellen exprimiert werden, als durch die Osteosarkomzellen oder teilweise gereinigten Membranen, welche in vorhergehenden Studien verwendet wurden (Fujimori, A., et al., Endocrinology 128(6): 3032–3039 (1991); Fujimori, A., et al., Endocrinology 130(1): 29–36 (1992); Tregear, G.W., und Potts, J.T., Jr. Endocr. Res. Commun. 2: 561–567 (1975); Rixon, R.H., et al., J. Bone Miner. Res. 9(8): 1179–1189 (1994)).
Die HKRK B7 Zellen wurden auch für diese Studien gewählt, um Analyse der strukturellen Basis von PLC-Signalisierung über humane PTHRs zu optimieren, was einen höheren Grad der Rezeptorexpression erfordert. (Guo, J., et al., Endocrinology 136(9): 3884–3891 (1995); Pines, M., et al., Endocrinology 135(4): 1713–1716 (1994)). Wenn diese N-gestutzten Peptide mit anderen LLC-PKI Subklonen getestet wurden, die weniger humane PTHRs exprimieren (also 100000–300000 pro Zelle), waren ihre AC-Antworten tatsächlich um soviel wie das 10-Fache bezogen auf hPTH-(1-34) verringert (Daten nicht gezeigt). Andererseits haben Studien von solchen N-gestutzten PTH-Analoga in vivo größere biologische Wirkkraft gezeigt, als von Messungen von AC-Wirksamkeit in vitro vorhergesagt (Tregear, G.W., et al., Endocrinology 93: 1349–1353 (1973); Hilliker, S., et al., Bone 19: 469–477 (1996)). Auch bleibt die tatsächliche Anzahl von PTH-1 Rezeptoren, welche durch relevante Zielzellen in vivo exprimiert werden, unsicher, aber könnte innerhalb der hier untersuchten Bandbreite sein (Shukunani, C., et al., J. Cell Biol. 133(2): 457–468 (1996); Bos, M.P., et al., Calcif, Tiss. Internat. 58(2): 95–100 (1996)).
Vorhergehende Studien der Wirkungen von hPTH-(1-34) oder PTH-(3-34) auf PLC-Aktivierung oder Ca_i ⁺⁺-Signalisierung über rekombinanten humane PTHRs, heterolog exprimiert in COS-7 oder HEK-293 Zellen, erzeugte sich widersprechende Funde (Pines, M., et al., Bone 18(4): 381–389 (1996); Seuwen, K., et al., Brit. J. Pharm. 114(8): 1613–1620 (1995); Jobert, A.-S., et al., Endocrinology 138 (12): 5282–5292 (1997); Schneider H., et al., FEBS Lett. 351(2): 281–285 (1994)). Wegen der zahlreichen Beobachtungen, dass N-terminal gestutzte PTH-Analoga Aktivierung von PKC und Ca_i ⁺⁺ in anderen Systemen auslösen (Azarani, A., et al., J. Biol. Chem. 271(25): 14931–14936 (1996); Donahue, H.J., et al., J. Biol. Chem. 263: 13522–13527 (1988); Fujimori, A., et al., Endocrinology 128(6): 3032–3039 (1991); Fujimori, A., et al., Endocrinology 130(1): 29–36 (1992); Janulis, M., et al., Endocrinology 133: 713–719 (1993); Jouishomme, H., et al., Endocrinology 130(1) 53–60 (1992); Chakravarthy, B.R., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 171(3): 1105–1110 (1990); Cole, J.A., et al., Endocrinology 1229: 2981–2989 (1988); Rixon, R.H. et al., J. Bone Miner. Res. 9(8): 1179–1189 (1994)), war jedoch unser Fund, dass eine freie α-Aminogruppe an Position-1 von hPTH-(1-34) eine absolute Erfordernis für PLC-Aktivierung über den humanen PTH-1 Rezeptor ist, ziemlich unerwartet. Tatsächlich zeigen unsere Daten an, dass PLC-Aktivierung über den PTH-1 Rezeptor sogar noch empfindlicher für solche subtilen N-terminalen Modi fikationen ist, als AC, und im Gegensatz zu den Konsequenzen von schrittweiser C-terminaler Stutzung von hPTH-(1-34) (Daten nicht gezeigt) kann die Verringerung von PLC-Wirkkraft dieser Analoga nicht geringerer Bindungsaffinität zugeschrieben werden. Dies legt nahe, dass der extreme N-Terminus von hPTH-(1-34) eine wahre „Aktivierungsdomäne" für PLC-Signalisierung über den humanen PTH-1 Rezeptor beiträgt. Wir sollten anmerken, dass andere vorhergehend von Aktivierung von PLC durch die N-gestutzten Peptide bPTH-(2-34) und bPTH-(3-34) in Ratten UMR 106-01 Osteosarkomzellen berichtet haben (Fujimori, A., et al., Endocrinology 128(6): 3032–3039 (1991)). Die Erklärung für diese Diskrepanz könnte in Arten-Unterschieden (in Zellen und Liganden) oder in der möglichen Expression durch UMR Osteosarkomzellen von alternativen Arten von PLC-gekoppelten PTH-Rezeptoren liegen, deren Anwesenheit in Ratten-Osteosarkomzellen nicht ausgeschlossen werden konnte, die ebenfalls endogene PTH-1 Rezeptoren exprimierten (Murray, T.M., et al., Calcif. Tiss. Intemat. 49(2): 120–123 (1991); Inomata, N., et al., Endocrinology 136(11): 4732–4740 (1995)). Das Versagen von hier untersuchten N-gestutzten hPTH-(1-34) Analoga, PLC über klonierte humane PTH-1 Rezeptoren zu aktivieren, war jedoch für die porkinen Wirtszellen nicht einzigartig, da diese Funde in sowohl COS-7 Zellen, als auch in einem homologen humanen Zellsystem ebenfalls bestätigt wurden (Daten nicht gezeigt).
Es können mehrere Hauptschlussfolgerungen hinsichtlich der Interaktion von hPTH-(1-34) und dem PTH-1 und PTH-2 Rezeptor aus diesen Ergebnissen von diesen Experimenten gezogen werden. Zuerst ist klar, dass ein intakter N-Terminus des hPTH-(1-34) Ligands unabdingbar für wirksame Aktivierung von PLC über den PTH-1 Rezeptor ist. Zweitens, obwohl der N-Terminus von hPTH für Aktivierung von sowohl AC, als auch PLC über den PTH-1 Rezeptor wichtig ist, sind die Rollen von spezifischen strukturellen Merkmalen innerhalb des N-Terminus des Ligands beim Aktivieren dieser beiden Effektoren unterschiedlich. Spezifisch haben wir gefunden, dass PLC-Aktivierung viel empfindlicher gegenüber der Struktur des N-Terminus – also sowohl der Identität der N-terminalen Aminosäure, als auch der Gegenwart der N-terminalen α-Aminogruppe – ist, als die AC-Antwort, welche anders als PLC normalerweise sogar in Abwesenheit einer Aminosäure an Position 1 auftreten kann. Wir hatten vorhergehend solche Signalisierungsselektivität durch Mutationen im PTH-Rezeptor (durch Verän dern des EKKY Sequenz in intrazellulärem Loop 2 an DSEL (Iida-Klein, A., et al., J. Biol. Chem. 272(11): 6882–6889 (1997)) erreicht, aber es ist nun klar, dass ein hochgradig Signalselektiver Ligand, welcher durch den Wild-Typ Rezeptor wirksam ist, ebenfalls entworfen werden kann.
Ferner, weil die Desaminopeptide in diesen Studien PLC durch den PTH-1 Rezeptor nicht aktivierten, aber PLC über den PTH-2 Rezeptor auf einen Grad 50% größer als die maximalen mit 1000 nM hPTH(1-34) beobachteten Antworten stimulierten, schließen wir, dass die humanen PTH-1 und PTH-2 Rezeptoren sich in ihrere Erkennung von strukturellen Schlüsselmerkmalen am N-Terminus des hPTH-Ligands unterscheiden. Darüber hinaus legt die stark verringerte Wirksamkeit von hPTH(1-34) für AC-Aktivierung über PTH-2 gegenüber PTH-1 Rezeptoren in Zellen mit vergleichbarer Rezeptorexpression zusammen mit dem verstärkten Signalisieren und Binden, welches mit Amino-terminal modifizierten hPTH-Peptiden beobachtet wurde, nahe, dass PTH nicht der natürliche Ligand für den PTH-2 Rezeptor sein mag.
Natürlich müssen, bis physiologische Grade von PTH-1/PTH-2 Rezeptorexpression in relevanten Zielzellen in vivo definiert worden sind, Schätzungen der AC-Wirksamkeit von PTH-Analoga oder mimetischen Verbindungen, welche unter Verwendung dieser hochgradig empfindlichen in vitro Systeme erhalten werden, vorsichtig interpretiert werden. Zur gleichen Zeit scheinen solche Systeme wichtige Vorteile zum Identifizieren von schwachen humanen PTH-1/PTH-2 Rezeptor-Agonisten und Definieren der elementaren strukturellen Merkmale von Liganden, einbezogen in Bindung und multiple parallele Signalisierung durch diesen Rezeptor, zu bieten.
Vorsichtige Analyse der Eigenschaften dieser Analoga in vitro und in vivo sollte helfen, die Rolle von PTH-1/PTH-2-Rezeptor-abhängiger PLC-Aktivierung in PTH-Wirkung(en) zu klären und weitere Richtung für die Entwicklung von anderen Signalselektiven hPTH-Analoga vorsehen.
Weitere Klärung der Signifikanz dieser verschiedenen Aktivierungsdomänen für physiologische oder pharmakologische Wirkungen von PTH in vivo wird bessere Definition der Rollen von zellulären Schlüsselwegen, aktiviert durch PTH-1/PTH-2-Rezeptor vermitteltem AC, und PLC-Signalisierung erfordern. Diese Themen können nun durch Vergleichen biologischer Wirkungen der hierin beschriebenen N-terminal modifizierten PTH-Analoga mit denen der N-terminal gekürzten PTH-Analoga, beschrieben durch andere (Arazani, A., et al., J. Biol. Chem. 271(25): 14931–14936 (1996); Janulis, M., et al., Endocrinology 133: 713–719 (1993); Siegfried, G., et al., Endocrinology 136(3): 1267–1275 (1995); Rixon, R.H., et al., J. Bone Miner. Res. 9(8): 1179–1189 (1994)), die PKC-Aktivierung, aber nicht PLC auslösen, klarer behandelt werden. Zum Beispiel fanden wir vorhergehend, dass selektive Ablation der PLC-Antwort auf PTH-(1-34) über Mutationen innerhalb des zweiten intrazellulären Loops der Ratten-PTHR bestimmte biologische Antworten stromabwärts blockiert, wie Natrium-abhängigen Phosphattransport in LLC-PK1 Zellen (Iida-Klein, A., et al., J. Biol. Chem. 272(11): 6882–6889 (1997)) und Interleukin-6 Produktion durch Wachstumsplatten Chondrozyten (unveröffentlichte Daten). Die Verfügbarkeit von neuartigen Liganden mit Rezeptor-spezifischer selektiver Signalisierung über die Wild-Typ PTH-1/PTH-2 Rezeptoren bietet nun eine ergänzende Herangehensweise an das Ansprechen wichtiger Fragen in vitro. Letztendlich wird sorgfältige Korrelation von in vitro Tests mit Studien von analoger Wirksamkeit in vivo erforderlich sein, um die physiologischen Rollen dieser separaten Rezeptorspezifischen Signale aufzugliedern und vollständig zu definieren. SEQUENCE LISTING

Claims

Peptid, bestehend aus der Formel: (a) X₀₁ ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 1); wobei (i) X₀₁ ein Desamino Ser, Desamino Ala oder Desamino Gly ist; und (ii) vorausgesetzt ist, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-34)NH₂ ist (b) Fragmenten von (a) enthaltend Aminosäuren 1-29, 1-30, 1-31, 1-32 oder 1-33; vorausgesetzt, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-31)NH₂ ist; oder (c) pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon.
Peptid nach Anspruch 1, das DesaminoAlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 5) ist.
Peptid nach Anspruch 1, das DesaminoGlyValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 2) ist.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid mit einer Markierung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Radiomarkierung („radio label"), fluoreszierende Markierung, biolumineszierende Markierung oder chemilumineszierende Markierung markiert ist.
Peptid nach Anspruch 4, wobei die Radiomarkierung ^99mTc ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend (a) ein Peptid bestehend aus der Formel: X₀₁ ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 1); wobei (i) X₀₁ ein Desamino Ser, Desamino Ala oder Desamino Gly ist; und (ii) vorausgesetzt ist, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-34)NH₂ ist (b) Fragmente von (a) enthaltend Aminosäuren 1-29, 1-30, 1-31, 1-32 oder 1-33; vorausgesetzt, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-31)NH₂ ist; oder (c) pharmazeutisch akzeptable Salze davon; und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verwendung eines Peptids bestehend aus der Formel: (a) X₀₁ ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspValHisAsnPhe (SEQ ID Nr. 1); wobei (i) X₀₁ ein Desamino Ser, Desamino Ala oder Desamino Gly ist; und (ii) vorausgesetzt ist, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-34)NH₂ ist (b) Fragmenten von (a) enthaltend Aminosäuren 1.29, 1-30, 1-31, 1-32 oder 1-33; vorausgesetzt, dass das Peptid kein Desamino Ser¹ hPTH(1-31)NH₂ ist; oder (c) pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon; und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger; in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Osteoporose oder Osteopenie.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Osteoporose eine Osteoporose ist, die im hohen Alter oder nach den Wechseljahren auftritt.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Medikament eine effektive Menge an diesem Peptid umfasst, die zur Verabreichung von ca. 0,01 μg/kg/Tag bis ca. 1,0 μg/kg/Tag adaptiert ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Medikament zur parenteralen, subkutanen oder nasalen Insufflationsverabreichung adaptiert ist.