JPS6210229B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗生物質およびその製造法に関するも
のである。さらに詳しく述べると、新規な抗生物
質BN−227物質、およびシユードモナス属に属す
るBN−227物質生産菌を培地に培養し、得られた
培養物からBN−227物質を単離、採取することか
らなる抗生物質BN−227物質の製造法に関するも
のである。 本発明者らは、シユードモナス属に属する菌株
の培養物中にグラム陽性細菌および陰性細菌に活
性を示す物質が生産されていることを見出し、そ
の有効物質を培養物中から純粋に単離し、その性
状を調べた結果、新抗生物質であることを確認
し、この有効物質をBN−227物質と命名し本発明
を完成した。 本発明に使用されるシユードモナス属の菌株の
一例としては、本発明者らによつて静岡県の腐敗
植物から新たに分離されたシユードモナス・エ
ス・ピー・BN−227株があり、この菌株は工業技
術院微生物工業技術研究所に受託番号、微工研菌
寄第4357号として保管されている。 シユードモナス・エス・ピー・BN−227株の菌
学的性質は以下に記すとおりである。 (a) 形態的性質 肉汁寒天上で培養した細胞は0.6〜0.8×1.0〜
2.0μの桿菌であり、極毛性のべん毛で運動す
る。胞子は形成せず、グラム染色は陰性であ
り、多形性は示さない。 (b) 培養的性質 (1) 肉汁寒天培養：菌体はクリーム色であり、
増殖はさかんである。色素は生産しない。 (2) 肉汁液体培養：培地が全体に濁る。 (3) 肉汁ゼラチン穿刺培養：液化される。 (4) ミルク培養：アルカリ性を呈しながら液化
される。 (c) 生理的性質 １ 硝酸塩の還元：陽性 ２ 脱窒反応：陰性 ３ MRテスト：陽性 ４ VPテスト：陰性 ５ インドール生産：陰性 ６ 硫化水素の生成：陰性 ７ でんぷんの加水分解：陰性 ８ クエン酸の利用：陽性 ９ 無機窒素源の利用：アンモニウム塩の形で
利用可能 10 色素の生成：生成せず 11 ウレアーゼ：陰性 12 オキシダーゼ：弱陽性 13 カタラーゼ：陽性 14 アルギニン分解酵素（メラーの培地）陰性 15 生育温度：４℃で生育しない。10℃〜37℃
では生育するが41℃では生育しない。 16 嫌気条件下では生育しない。 17 OFテスト：Ｏ型 18 栄養要求性なし 19 卵黄反応：陽性 20 ポリベーター・ハイドロキシブチレートの
菌体内蓄積：陽性 21 炭素源の利用性 次の炭素化合物を唯一の炭素源として生育す
る。 グルコース、トレハロース、２−ケト−グル
コン酸、イノシトール、バリン、アラニン、ア
ルギニン、アラビノース、シユークロース、Ｌ
−フコース、サツカレート、プロピオン酸、ブ
チレート、ソルビトール、アドニトール、２・
３−ブチレングリコール、トリブタミン、セロ
ビオース、セバシン酸、ベタイン、リボース、
スレオニン、Ｄアラビノース、Ｏ−ハイドロキ
シベンゾエート、シトラコン酸 次の炭素化合物は利用できない。 ゲラニオール、プロピレングリコール、エタ
ノール、Ｄ（−）酒石酸、メゾ酒石酸、エリス
リトール 以上の菌学的性質を有するBN−227株を
Bergey′s Manual of Determinative
Becteriology 8th Edition（1974）に従つて同定
し以下の結論を得た。 (i) グラム陰性桿菌で胞子を作らず極毛性ベン毛
を有し絶対好気性であることからこの菌株はシ
ユードモナス属（Pseudomonas）に所属する
と同定した。 (ii) 栄養要求性がなく、ポリベーターハイドロキ
シブチレートの菌体内蓄積が認められ、アルギ
ニン、ベタインを唯一の炭素源として利用でき
ることから、この菌株はシユードモナス属の中
のSectionに所属すると判定した。 (iii) Sectionには、６菌種が記載れており、BN
−227株はPseudomonas cepaciaの記載に似て
いるが完全には一致しない。従つてこの菌株を
Pseudomonas sp.BN−227と命名した。 シユードモナス・エス・ピーBN−227株は、紫
外線、エツクス線、高周波、放射線、薬品等を用
いる人工的変異手段によつて変異しうるものであ
り、このようにして得られる変異株であつても
BN−227物質の生産能を有するシユードモナス属
の菌株はすべて本発明に使用することができる。 BN−227物質生産菌を培養し、BN−227物質を
生産、蓄積させるには、通常の微生物発酵に用い
られる各種の培地が使用される。すなわち、炭素
源としてはグルコース、グリセリン、シユークロ
ース、デキストリン、澱粉、水あめなどが用いら
れ、窒素源としてはペプトン、肉エキス、粉末ブ
イヨン、コーンステイープリカー、大豆粕、小麦
胚芽、魚粉、硫安、塩安などが用いられる。ま
た、食塩、塩化カリウム、炭酸カルシウムなどの
無機塩を併用することもあり、必要に応じて消泡
剤を添加することもできる。 培養方法としては、振盪培養法、深部通気撹拌
培養法などの液体培地を使用する方法が適当であ
り、培養温度は20〜35℃の範囲で選択され、培養
時間は24時間から40時間が適当である。 BN−227物質の検定に当つては、次の方法が用
いられる。検定培地としてはペナツセイアガー
（共栄製薬）３％を用いる。検定菌としては、ス
タフイロコツカス・アウレウス209P（Staphylo
−coccus aureus209P）を用いる。BN−227物質
（純品）は上記方法による検定において、
125mcg／ml〜2000mcg／mlにおいて、濃度の対
数と阻止円径との関係は直線関係を示し、それぞ
れ10.0mm〜20.3mmの阻止円径を与える。（ペーパ
ーデイスク法） BN−227物質の抽出、精製に当つては、後記す
る本物質の理化学的性状を考慮して行なうが、以
下に示す方法が効率的である。すなわち、有効成
分を含む培養液から固形分を去し、ダイヤイオ
ンHP−20等の吸着剤に吸着させ、有効成分を50
％アセトン水で溶出させ、アセトンを溜去後、酢
酸エチル、ｎブタノール等の有機溶剤で有効成分
を抽出し濃縮乾固してBN−227物質の粗製物を得
る。さらに精製するには、向流分配法、沈でん
法、セフアデツクスLH−20等を用いるゲル過
クロマトグラフイー、シリカゲル、アルミナ、フ
ロリジル、セルロース等を用いるクロマトグラフ
イー等を適宜組合せ使用し、BN−227物質の白色
板状結晶を得る。 かくして得られたBN−227物質の結晶を各種の
溶剤系でのシリカゲル薄層クロマトグラフイーに
付したところ、いずれの系においても単一のスポ
ツトを示し、この結晶がBN−227物質の純品であ
ることを示している。 本BN−227物質の理化学的性状は、以下に示し
たとおりである。 (1) 元素分析値：炭素53.79％、水素5.84％、窒
素8.73％、酸素31.64％（差） (2) 分子量：155（質量分析による） (3) 分子式：元素分析値および分子量より
C₇H₉NO₃の式が得られる。 (4) 化学構造式： (5) 融点：115℃ (6) 紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定
したスペクトルは第１図に示したとおりであ
る。 (7) 赤外線吸収スペクトル：臭化カリウム錠とし
て測定したスペクトルは第２図に示したとおり
である。 (8) 溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノー
ルに良く溶け、ベンゼン、アセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルムにわずかに溶けるが、石油エ
ーテル、水には溶けない。 (9) 比旋光度：〔α〕^２２ _Ｄ＝０（Ｃ＝１、メタノー
ル） (10) 呈色反応：塩化第二鉄、過マンガン酸カリウ
ムに陽性、ニンヒドリン、坂口、ビウレツト反
応に陰性を示す。 (11) 物質の色、形状：白色板状結晶。 (12) シリカゲル薄層クロマトグラフイーでのRf
値 クロロホルム−メタノール（９：１）0.40 ベンゼン−エタノール（４：１）0.47 ベンゼン−アセトン（３：２）0.08 本BN−227物質の各種微生物に対する最小発育
阻止濃度は、第１表に示したとおりであり、医
薬、農畜薬あるいは、それらへの変換中間体とし
て用いられる。また、本物質の急性急性毒性は、
マウスを用い、腹腔内投与法により試験した結
果、100mg／Kgでは全例生存した。

【表】

【表】 本BN−227物質は、前記した如くC₇H₉NO₃で示
される分子式を有しており、公知の抗生物質中
に、この式に一致する物質はない。また、天然
物、化学的な合成物質の中で、上記の式を有する
物質は多数知られているが、BN−227物質の理化
学的性状、生物学的性状に一致する物質はない。
従つて、本BN−227物質は新規物質であると判定
した。 次にBN−227物質の製造法の実施例を示すが、
本発明はこれらに限定されず、ここに示さなかつ
た多くの変形あるいは修飾手段を用いうることは
もちろんである。 実施例 １ 500ml容坂口フラスコ10本にグリセリン２％、
小麦胚芽1.5％、大豆粕1.5％、NH₄Cl 0.3％、
K₂HPO₄0.05％、CaCO₃0.2％を含有する液体培地
を100mlずつ分注し綿栓を施し120℃で10分間加圧
滅菌して、シユードモナス・エス・ピーBN−227
株（微工研菌寄第4357号）のスラントより１白金
耳ずつ植菌する。28℃で72時間振盪培養を行な
い、1000mcg／mlの培養液800mlを得た。この培
養液を遠心分離機にかけ、菌体を除去し、上澄液
をダイヤイオンHP−20（三菱化成）80mlを充填
した塔を通過させ有効成分を吸着させる。この塔
を水洗後50％アセトン水で有効成分を溶出させ
る。活性区分を集め減圧下で濃縮し１規定塩酸を
加えてPH2.0とし、同容量の酢酸エチルで２回抽
出する。抽出液を合併し、水洗後、芒硝を加えて
脱水し減圧下で濃縮乾固し、BN−227物質の褐色
油状物210mgを得た。この油状物をメタノール２
mlに溶解し、予めメタノールで平衡化したセフア
デツクスLH−20（フアルマシア社）の塔（1.5cm
×90cm）にかけ、メタノールで展開し、活性区分
を集め減圧下に濃縮、乾固しBN−227物質の微黄
色粉末40mgを得た。 実施例 ２ グリセリン２％、小麦胚芽1.5％、大豆粕1.5
％、NH₄Cl 0.3％、K₂HPO₄0.05％、CaCO₃0.2％
を含む培養基20を30容ジヤーフアーメンター
２基に仕込み、120℃で15分間殺菌し冷却後、あ
らかじめ坂口フラスコ１本に同培地で20時間前培
養しておいたシユードモナス・エス・ピーBN−
227株（微工研菌寄第4357号）を接種し28℃で、
通気量20／分、撹拌数200rpmで40時間培養し
2000mcg／mlの培養液35を得た。培養液を過
後、液にダイヤイオンHP−20を３加え30分
間撹拌し有効成分を樹脂に吸着させる。ダイヤイ
オンHP−20を水洗後、塔に充填し50％アセトン
水で有効成分を溶出させ、活性区分10を合併し
減圧下で４まで濃縮し１規定塩酸でPH2.0と
し、ｎ−ブタノール４ずつで２回有効成分を抽
出し、水洗後減圧下で濃縮、乾固しBN−227物質
の粉製物９ｇを得た。 実施例 ３ 実施例２で得られた組製物５ｇをメタノールに
溶解し、メタノールで平衡化したセフアデツクス
LH−20の塔（３cm×90cm）にかけ同溶剤で展開
し、活性区分を減圧濃縮しシラツプ状とする。さ
らに、再度セフアデツクスLH−20によるクロマ
トグラフイーを行ない、活性区分を減圧下に濃
縮、乾固しアセトン約10mlを加え加温して溶解さ
せ、放冷し析出したBN−227物質の板状結晶1.2
ｇを取した。

【図面の簡単な説明】

第１図はBN−227物質の紫外部吸収スペクトル
であり、本物質を0.1規定塩酸−メタノール、(イ)
0.1規定カ性ソーダ−メタノール(ロ)にそれぞれ
10mcg／mlの濃度に溶解し測定したものである。
第２図は、BN−227物質の赤外部吸収スペクトル
であり、本物質を臭化カリウムに混合し錠剤にし
て測定したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の特性を有する新抗生物質BN−227物
   質。炭素53.79％、水素5.84％、窒素8.73％、酸素
   31.64％（差）で、質量分析により分子量は155で
   C₇H₉NO₃の分子式を有し、融点は115℃であり、
   メタノール中での紫外部吸収スペクトルは第１図
   に、臭化カリウム錠での赤外部吸収スペクトルは
   第２図に示され、塩化第二鉄反応で陽性を示し、
   ニンヒドリン、坂口反応で陰性を示し、次の構造
   式を有する物質。 ２ シユードモナス属に属するBN−227物質生産
   菌を培地に培養し、得られた培養物からBN−227
   物質を採取することを特徴とする新抗生物質BN
   −227物質の製造法。