JPS5811838B2 - シンコウセイブツシツ ｂｎ−１６５ ブツシツノ セイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシュードモナス属のバクテリアであるＢＮ−１
６５物質生産菌を培養し、培養物から新抗生物質ＢＮ−
１６５物質を分離採取することからなるＢＮ−１６５物
質の製造法に関するものである。

本発明者らはシュードモナス属に属する特定菌株の培養
物中にダラム陽性の細菌に対し強力な発育阻止作用を示
す物質の存在することを見出し、培養物中から有効成分
を採取して、これをＢＮ−１６５物質と命名し本発明を
完成した。

本発明の方法で使用されるシュードモナス属の菌株とし
てはその培養物中に採取するに十分な量のＢＮ−１６５
物質の生産能を有するものが用いられる。

このような菌株の例としては、本発明者らによって土壌
から新たに分離されたシュードモナスｓｐ、ＢＮ−１６
５株（菌株番号ＢＮ−１６５株）がある。

このＢＮ−１６５株は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第３１４３号（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、３１
４３）として保管されている。

ＢＮ−１６５株の菌学的性状は以下に示すとおりである
。

（ａ）形態的性質 肉汁寒天上で培養した細胞は０．４〜０．６×１．５〜
２．５ミクロンの桿菌であり、極毛性の鞭毛で運動する
。

胞子は作らず、多形性も示さない。

ダラム染色性は陰性である。（ｂ）培養的性質 ■ 肉汁寒天培養：菌体は淡い茶黄色を呈し、クリーム
様に盛りあがって増殖する。

顕著な粘稠性および遊走性は認められず、 拡散性色素の生成も認められない。

■ 肉汁液体培養：培地全体が濁り特に液面付近の濁り
が強い。

■ 肉汁ゼラチン穿刺培養二袋状に液化される。

■ ミルク培養：ゆっくり液化が進行し微酸性を呈す。

（ｃ）生理的性質 ■ 硝酸塩の還元：陰性 ■ 脱窒反応：陰性 ■ ＭＲテスト：陰性 ■ ｖｐテスト：陰性 ■ インドールの生産：陰性 ■ 硫化水素の生成：鉛糖紙を黒変する ■ デンプンの加水分解：陰性 ■ クエン酸の利用：陽性 ■ 無機窒素源の利用：アンモニウム塩を唯一の窒素源
として利用できる。

］ 色素の生成：キングＡＢ培地での顕著な合素生成は
認められない。

■ オキシダーゼ二弱く陽性 ］ うさぎ血液寒天二緑変する。

］ リジン脱炭酸反応：陽性 ０ 栄養要求性：ビタミン類、アミノ酸類の栄養要求は
ない。

］ Ｏ−Ｆテスト（ヒユーレイフラン法）：パラフィン
シールの有無にかかわらず糖か らガスや酸の生成は認められない。

］ 嫌気的条件下の増殖は認められない。

■ 糖の利用性（窒素源としてアンモニウム塩のみを使
用） １）クルコース、マルトースヲ唯一の炭素源として利用
できる。

１１）グリセリン、ガラクトース、シュークロース、マ
ンニットを利用できない。

以上の菌学的性質を有するＢＮ−１６５株をバージニー
ズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリ
オロジー第８版（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
−ｏｇｙ ８ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ）（１９７４）と比較
し以下の結論を得た。

ダラム陰性の桿菌で胞子を作らず、極毛によって運動す
るという形態的性質を有し、絶対好気性であることから
、この菌株はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）属に所属すると同定できる。

ＢＮ−１６５物質生産菌を培養してＢＮ−１６５物質を
生産蓄積させるには、通常の微生物の発酵に用いられる
各種の培地が用いられる。

すなわち炭素源としてはグルコース、デキストリン、水
あめ等の炭水化物が、才だ窒素源としてはペプトン。

肉エキス、粉末ブイヨン、コースステイブリカー。

大豆粕、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等が用い
られる。

また、食塩や炭酸カルシウム等の無機塩を併用すること
もあり、必要により消泡剤を添加することもある。

培養方法としては振盪培養法、深部通気攪拌培養法等の
液体培地を使用する方法が適当である。

培養温度は２０〜３５℃の範囲で選択され、培養日数は
１〜３日が適当である。

ＢＮ−１６５物質は主として培養液内に蓄積さされる。

ＢＮ−１６５物質の検定に当っては、次の方法が用いら
れる。

検定用培養基としては、ペナツセイアガ−（共栄製薬製
）を用いる。

検定菌としてはスタヒロコツカスアウレウス２０９Ｐを
用いる。

ＢＮ−１６５物質（純品）はこれを用いた検定において
８ｍｃｇ／ｍｌ〜２０００ｍｃｇ／ｍｌにおいて濃度の
対数と阻止円径との関係は直線関係を示し、それぞれ１
０〜２４ｍｍ、の阻止円を示す（ペーパーディスク法）
。

ＢＮ−１６５物質は後記する理化学性状を有するので、
その性状に従って抽出、精製することが可能であり、以
下に示す方法が効率的である。

即ち有効成分を含む培養液を酸性（ｐＨ２〜３）濾過し
固形分を除去後、Ｐ液をｐＨ５〜６に調整し、ｎ−ブタ
ノールで有効成分を抽出する。

このｎ−ブタノール層を活性炭で脱色し、ｎ−ブタノー
ル層を濃縮乾固してＢＮ−１６５物質の粗製品を得る。

さらに精製するにはシリカゲル、アルミナ、フロリシー
ル等の吸着剤やゲル濾過剤を使用したクロマトグラフィ
ー向流分配操作あるいは沈澱法等を適宜組みあわせ、精
製し無色粉末を得る。

かくして得られたＢＮ−１６５物質を各種の溶剤での薄
層クロマトグラフィーに付したところ、いずれも単一の
スポットを与え、この粉末がＢＮ−１６５物質の純品で
あることを示している。

ＢＮ−１６５物質の理化学性状は以下に示したとおりで
、塩酸塩として測定したものである。

（１）元素分析値：Ｃ４７，５８％、Ｈ７，１９％、Ｎ
１３．８０％、Ｃ１７，６９％、０ ２３．７４％（差）で、これら以外 の元素は含有していない。

（２）分子量：セファデックスＬＨ−２０（ファルマシ
ア社製）によるゲル濾過の結果、 １０００〜１２００と推定される。

後記するアミノ酸分析の結果もほぼ これを支持している。

（３）融点：２１５℃付近より褐変しはじめ２３５℃付
近で発泡分解する。

（５）紫外線吸収スペクトル：第１図に示したとおりで
ある。

（６）赤外線吸収スペクトル：第２図に示したとおりで
ある。

（７）溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノールに
よく溶け、水にやや溶けるが、 クロロホルム、アセトン、酢酸エチ ル、エチルエーテルにはほとんど溶 けない。

（８）呈色反応：陽性を示すもの、板目、ビウレット、
陰性を示すもの、塩化第２鉄、 フェージング、ニンヒドリン （９）塩基性、酸性、中性の区別二Ｐ紙電気泳動の結果
、弱塩基性物質の挙動を示す。

（１０）物質の色：無色粉末 （１１）アミノ酸組成：封管中６規定塩酸で１１０℃２
４時間分解しアミノ酸分析計で分 析した結果、グリシン、ロイシン、 インロイシン、セリン、スレオニン。

アルギニンおよび未知アミノ酸が１ 種、合計７種類のアミノ酸が検出さ れ、その含有比はｌ：３：１：１： １：１：１である。

（１２）シリカゲル薄層クロマトグラフィーのＲ４直：
酢酸エチル−酢酸−水（６０：１７：１７） ０．６
３ｎブタノール−酢酸−水（２：１：１） ０．２
４８Ｎ−１６５物質の各種微生物に対する最小発育阻止
濃度は第１表に示したとおりであり、グラム陽性細菌に
強力な阻止作用を示す。

また本物質の急性毒性はマウスを用いた試験で腹腔内投
与で１００ｍｇ／ｋｇ、経口投与で１０００ｍｇ／ｋｇ
でそれぞれ金側生存した。

ＢＮ−１６５物質は前記した如く、７種類のアミノ酸か
ら成るペグタイド抗生物質である。

シュードモナス属が生産するペグタイド抗生物質として
は、コミリン（Ｃｏｍｉｒｉｎ）ビスコシン（Ｖｉ−ｓ
ｃｏｓｉｎ）サイホシンＡＢなどが知られているが、本
物質はこれらとは構成アミノ酸が異る。

また、ンユードモナス属以外のバクテリアあるいは放線
菌が生産するペグタイド抗生物質は多数知られているが
、いずれも本物質とは異る。

以上の結果からＢＮ−１６５物質は新抗生物質であると
判定した。

以下に本発明の実施例を示すが、本発明においてはここ
に例示しなかった多くの変形あるいは修飾手段を用いう
ろことはもちろんである。

実施例 １ ５０〇ｍｌ容坂ロフラスコ２０本に粉末ブイヨン２％を
含有する液体培地を１００−ずつ分注して綿栓を施し、
１２０℃、１０分加圧滅菌しシュードモナスｓｐ、ＢＮ
−１６５株（ＦＥＲＭ−Ｎｏ、３１４３）の斜面培養よ
り一白金耳ずつ植菌した。

３２℃２日間振盪培養してＢＮ−１６５物質１２０ｍｃ
ｇ／ｍｌを含有する培養液１．８１を得た。

この培養液をｐＨ３に調整後濾過し、Ｆ液を力性ソーダ
で中和しアンバーライトＸＡＤ−２（ロームアンドバー
ス社）２００ｍｌの塔を通過させると有効成分は樹脂に
吸着せず通過する。

この通過液に１ｇのｎブタノールを加え振盪すると有効
成分はｎブタノール層に移行し、このｎブタノール層を
減圧濃縮乾固するとＢＮ−１６５物質の粗粉末１８０ｍ
９が得られた。

この粉末をｎブタノールに溶解し、予めｎブタノールで
充填したシリカゲルの塔にかけｎブタノールで展開し活
性区分を減圧濃縮乾固し微黄色の粉末８０ｍｇを得た。

この粉末をさらにメタノールに溶解しセファデックスＬ
Ｈ−２０（ファルマシア社）を予めメタノールで膨潤さ
せたカラムにかけメタノールで展開し、活性区分を減圧
濃縮乾固し純度約８０％のＢＮ−１６５物質の粉末２８
〜を得た。

実施例 ２ ペプトン０．５％、クルコース１％、塩化アンモニウム
０．２％、炭酸カルシウム０．４％、食塩０，３％消消
泡用シリコ抽油０．０３を含む培養基１５１を３０／容
培養槽に仕込んで１２０℃１０分殺菌し冷却後あらかじ
め同培地にて２本の坂ロフラスコで１日前培養したシュ
ードモナスｓｐ、ＢＮ−１６５株（ＦＥＲＩＶＩ−Ｐ
Ｎｏ、３１４３）の種を無菌的に培養槽に植菌した。

３０℃にて２日間通気攪拌培養（通気量１５ｊ／分）、
攪拌数２００ｒｐ■）し、１５０ｍｃｇ／ｍｇの培養液
１３１を得た。

培養液を塩酸でｐＨ２，５に調整後、濾過助剤を用いて
濾過し力性ソーダでＦ液のｐＨを５．５にもどし、Ｓｌ
ずつのｎブタノールでＰ液から有効成分の抽出を２回行
ない、抽出液を合併し、予めｎブタノールで充填したク
ロマト用活性炭素（和光紬薬）の塔を通過させ、さらに
この塔をメタノールで洗い活性区分を減圧濃縮乾固し、
やや油状の粗製品１ｏｙを得た。

これを再び２００ｍＡのブタノールに溶解し、ｐＨ２の
緩衝液２００ｍ／ずつで１０回抽出し、活性区分の緩衝
液のｐＨを５に調整し、有効成分をｎブタノールで抽出
し、減圧濃縮乾固し黄色粉末２，５Ｖを得た。

この粉末をメタノールに溶解し、予めメタノールで充填
したフロリシール（和光紬薬）の塔にかけこの塔をメタ
ノールで洗浄後塩酸でｐＨ２に調整したメタノールで有
効成分を溶出させ活性区分を減圧濃縮乾固しＢＮ−１６
５物質の白色粉末４００ｍｇを得た。

この粉末をメタノールに溶解し、予めメタノールで充填
した酸性アルミナの塔にかけ、メタノール−水−１規定
塩酸（２：１：０．３）で有効成分を溶出させ、活性区
分を減圧濃縮しＢＮ−１６５物質の純品１５０／ｍｇを
得た。

実施例 ３ ペプトン０．７５％、クルコース１．０％、塩化アンモ
ニウム０．３％、炭酸カルシウム０．４％、食塩０．３
％、消泡用シリコン油０．０１％を含有する培養基２０
０１を３００ｇ容培養槽に仕込み、１２０℃、１０分殺
菌し冷却後あらかじめ実施例２の培養基にて１日前培養
したシュードモナスｓｐ、ＢＮ−１６５株（ＦＥＲＭ−
Ｐ扁３１４３）の種１０／を無画部に培養槽に植菌した
。

２８℃にて２４時間通気攪拌培養（通気量２００１／分
攪拌数１１１１０５ｒｐし８０ｍｃｇ／ｍｌの培養液１
８０ｊを得た。

培養液をｐＨ２，８に調整し、濾過助剤を用いてフィル
タープレスで沢過後、Ｐ液に５０ｋｇの硫酸アンモニウ
ムを加え、さらにＰＨ６に調整し、ｎブタノール１００
ｇずつで２回にわたり有効成分を抽出し、ｎブタノール
層を合併し減圧下で２０１に濃縮し生じた不純物の沈澱
を除去した。

このｎブタノール層に活性炭３００グを投入し、攪拌後
活性炭をＦ別し、さらに活性炭をメタノールＩＯＪで洗
浄し、前のｎブタノール層とこのメタノール層を合併し
減圧濃縮乾固し、褐色の粉末７４１を得た。

この粉末をメタノール５００−に溶解し不溶の不純物を
瀘去し予めメタノールで充填したフロリシール８００ｍ
１の塔にかけ塩酸酸性メタノール（ｐＨ２）で有効成分
を溶出し、活性区分を減圧濃縮し有効成分の白色沈澱を
生ぜしめ、これを涙取してＢＮ−１６５物質の純品７０
０ｍｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はＢＮ−１６５物質の紫外線吸収スペクトルであ
り、ＢＮ−１６５物質をメタノールに１Ｏ０１００Ｏ／
ｍｌの濃度に溶解し測定したものである。 第２図はＢＮ−１６５物質の赤外線吸収スペクトルであ
り臭化カリウム錠として測定したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シュードモナス属に属するＢＮ−１６５物質生産菌
   を培養してＢＮ−１６５物質を蓄積させ、これを採取す
   ることを特徴とする新抗生物質ＢＮ−１６５物質の製造
   法。