JPH06125776A - Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 遊離のケトースに作用するケトース・エピ
メラーゼとその製造方法並びに用途の確立を目的とす
る。 【栂成】 Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼと
その製造方法並びに該酵素を利用して、Ｄ−ケトヘキソ
ースの３位をエピマー化し、対応するＤ−ケトヘキソー
スを製造し、また、Ｄ−またはＬ−ケトペントースの３
位をエピマー化し、対応するＤ−ケトペントースを製造
することを主な構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｄ−ケトヘキソース・
３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途に関する。

【０００２】

【従来技術】エピメラーゼは、エンザイム・ノメンクレ
イチャー（ＥｎｚｙｍｅＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）
（アメリカ合衆国、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉ
ｎｃ．１９９２年）によると、各種の糖質に作用するエ
ピメラーゼが知られている。しかしながら、これまでに
知られているエピメラーゼは、例えば、リブロースリン
酸塩・３−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．１）やＵ
ＤＰ−グルコース・４−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．
３．２）などのように主としてリン酸化された糖質やＵ
ＤＰなどと結合した糖質に作用するものであり、遊離の
中性の糖質を製造する工業用途には、使えないものであ
った。一方、遊離の糖質に作用するエピメラーゼについ
ては、アルドースに作用する二例、即ち、アルドース・
１−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．３）およびセロ
ビオース・エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．１１）が
知られているのみである。前者は、アルドースの１位の
α、βアノマー間のエピマー化を触媒し、後者は、同様
に、セロビオースのα、βアノマー間を触媒する酵素で
ある。遊離のケトースに作用するエピメラーゼは期待さ
れるものの、未だその存在は知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】遊離のケトースに作用
するケトース・エピメラーゼとその製造方法並びに用途
の確立が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、ケトヘキ
トース間、またはケトペントース間を、遊離の糖質のま
まで容易にエピマー化しうるエピメラーゼに着目して、
鋭意探索を続けてきた。その結果、新規なＤ−ケトヘキ
ソース・３−エピメラーゼを見出し、その製造方法を確
立するとともに、該酵素を利用したＤ−ケトヘキソー
ス、Ｄ−またはＬ−ケトペントースの変換方法並びに変
換されたケトースの製造方法、更には、変換されたケト
ースを含有する甘味料の製造方法を確立して本発明を完
成した。即ち、本発明のＤ−ケトヘキソース・３−エピ
メラーゼは、Ｄ−ケトヘキソースの３位をエピマー化
し、対応するＤ−ケトヘキソースを生成する活性を有す
る新規酵素であって、下記の理化学的性質を示す。

【０００５】（１）作用および基質特異性 Ｄ−ケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応するＤ
−ケトヘキソースを生成する。Ｄ−またはＬ−ケトペン
トースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−
ケトペントースを生成する。

【０００６】（２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 ｐＨ７乃至１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５乃至１０で安
定。

【０００７】（３）至適温度および熱安定性 ６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。

【０００８】（４）紫外線吸収スペクトル ２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。

【０００９】本発明のＤ−ケトヘキソース・３−エピメ
ラーゼは、通常、Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラー
ゼ産生能を有する微生物を培養してＤ−ケトヘキソース
・３−エピメラーゼを生成させればよい。

【００１０】微生物としては、例えば、シュードモナス
属に属する細菌が適しており、具体的には、特開平３−
２６６９９６号公報で開示されているシュードモナス・
チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）およ
びその変異種などが有利に利用できる。

【００１１】培養方法は、常法に従って、炭素源、窒素
源、無機塩、ビタミンなどを含有する栄養培地に１乃至
５日間程度培養、望ましくは、液体培地に通気撹拌など
により好気的条件下で培養し、得られる菌体、または培
養液上清などの培養物からＤ−ケトヘキソース・３−エ
ピメラーゼを採取すればよい。通常、培養物を粗Ｄ−ケ
トヘキソース・３−エピメラーゼとして利用することが
できる。必要ならば、培養物を濾過、遠心分離、塩析、
透析、濃縮、凍結乾燥など公知の方法で部分精製して採
取し、利用することができる。更に高度の精製を必要と
する場合には、例えば、イオン交換体への吸着、溶出、
ゲル濾過、等電点分画、電気泳動、高速液体クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、更に
は、モノクローナル抗体への吸着、溶出などを組合せて
最高純度に高めて利用することも随意である。

【００１２】また、本発明の変換反応において、すなわ
ち、Ｄ−ケトヘキソース、Ｄ−ケトペントース、Ｌ−ケ
トペントースから選ばれる１種以上のケトースを含有す
る溶液に作用させて、該ケトースの３位をエピマー化
し、対応するＤ−ケトヘキソース、Ｄ−ケトペントース
およびＬ−ケトペントースなどを生成する変換反応にお
いて、本発明のＤ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼ
を公知の方法により固定化して、反応に繰り返し利用す
ることも、連続反応に利用することも有利に実施でき
る。

【００１３】この変換反応は、通常、次の条件で行なわ
れる。基質濃度は１乃至６０ｗ／ｖ％、望ましくは、約
５乃至５０ｗ／ｖ％、反応温度は１０乃至７０℃、望ま
しくは、約３０乃至６０℃、反応ｐＨは５乃至１０、望
ましくは、約７乃至１０、酵素活性は基質グラム当り１
単位以上、望ましくは、５０乃至５，０００単位の範囲
から選ばれる。反応時間は、適宜選択できるが、経済性
との関係で、バッチ反応の場合には、通常、５乃至５０
時間の範囲が選ばれる。

【００１４】このようにして変換させた反応溶液には、
原料のケトースと新たに生成したケトースとを含有して
おり、これをそのまま甘味料、保湿剤、結晶析出防止
剤、照り付与剤などとして利用することも有利に実施で
きる。通常、反応溶液は、常法に従い、活性炭を用いて
脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン変換樹脂を用いて脱
塩、濃縮して、シラップ状製品を得る。

【００１５】必要ならば、更に、この濃縮液を、例え
ば、アルカリ金属型またはアルカリ土類金属型強酸性カ
チオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーによ
り、新たに生成したケトースと原料ケトースとを分離精
製し、新たに生成したケトース高含有画分を濃縮し、シ
ラップ状製品を得ることも、更に、結晶化しうるケトー
スの場合には、晶出させて、結晶状製品を得ることも有
利に実施できる。また、この分離された原料のケトース
を、再度、変換反応の原料に用いることも有利に実施で
きる。

【００１６】このようにして得られたケトースは、甘味
料として好適であり、飲食物、飼料、餌料、歯みがき、
口中香錠、舌下錠、内服薬など経口摂取物の甘味付け、
嗜好性向上などに有利に利用できる。また、醗酵用炭素
源、試薬、化学品・医薬品の原料、中間体などとしても
有利に利用できる。

【００１７】以下、本発明の２〜３の実施例を述べる。

【００１８】

【実施例１】硫酸アンモニウム０．２ｗ／ｖ％、リン酸
一カリウム０．２４ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．５
６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０１ｗ／ｖ
％、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、Ｄ−グルコース１ｗ／
ｖ％および脱イオン水からなる培養液をジャーファーメ
ンターにとり１２０℃、２０分間滅菌した後、シュード
モナス・チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３
６）の種培養液１ｖ／ｖ％を無菌的に添加し、通気撹拌
しながら３０℃で４０時間培養した。得られた培養液８
０Ｌから遠心分離して菌体を集め、これを活性アルミナ
を用いて摩砕し５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）にて酵素を抽出した。

【００１９】この粗酵素液を塩化マンガン存在下でポリ
エチレングリコール６０００（以下ＰＥＧと略す。）を
用いた分画沈澱法を繰り返して精製した。即ち０．１Ｍ
塩化マンガン存在下でＰＥＧ５ｗ／ｖ％と１８ｗ／ｖ％
との間に生ずる沈澱を同一緩衝液に溶解した。このＰＥ
Ｇ分画を２回繰り返して精製した。次いで５０℃で２０
分間の熱処理を行ない変性した蛋白質を遠心分離により
除去したのち、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍに吸着さ
せ塩化カリによって溶出することにより精製した。限外
濾過（濾過膜は東洋濾紙ＵＫ−１０を使用）により脱
塩、濃縮した後、セファデックスＧ１５０（スウェーデ
ン国、ファルマシア社製）を用いたゲル濾過法により更
に精製した。活性画分を濃縮し、更にアンフォライン
（スウェーデン国、ＬＫＢ社製）を用いる焦点電気泳動
法により精製した。

【００２０】本酵素の活性測定は次のように行った。即
ち、反応液組成は、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）１００μｌ、４０ｍＭ Ｄ−タガトースを５０
μｌおよび酵素液５０μｌとした。反応は３０℃で６０
分間反応を行ない、生成物であるＤ−ソルボースをＨＰ
ＬＣにより測定した。酵素活性１単位は１分間に１μｍ
ｏｌのＤ−タガトースをエピマー化し、Ｄ−ソルボース
を生成する酵素量とした。

【００２１】この精製過程を表１にまとめた。

【００２２】

【表１】

【００２３】表１の結果から明らかなように、この精製
過程によって、比活性は約２９０倍に向上し、この時の
活性回収率は約２％であった。この精製酵素を用いて調
べたところ、本発明のＤ−ケトヘキソース・３−エピメ
ラーゼの理化学的性質は、次の通りである。

【００２４】（１）作用および基質特異性 Ｄ−およびＬ−ケトヘキトース８種の内、Ｄ−ケトヘキ
トース４種（Ｄ−タガトース、Ｄ−ソルボース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−プシコース）の全てに作用し、それぞ
れの３位をエピマー化し、対応するＤ−ケトヘキトース
に変換する。また、Ｄ−およびＬ−ケトペントース４種
（Ｄ−およびＬ−キシルロース、Ｄ−およびＬ−リブロ
ース）の全てに作用し、それぞれの３位をエピマー化
し、対応するＤ−またはＬ−ケトペントースに変換す
る。

【００２５】本酵素は、Ｄ−タガトースとＤ−ソルボー
スとの間の変換反応を最も強く触媒し、Ｄ−フラクトー
スとＤ−プシコースとの変換反応は、Ｄ−タガトースと
Ｄ−ソルボースとの間の約３０乃至４０％の活性を示
し、更に、Ｄ−またはＬ−ケトペントース間の変換反応
は、Ｄ−タガトースとＤ−ソルボースとの間の数％の活
性を示す。これら反応は、可逆反応であり、平衡反応で
ある。また、これら反応には、補酵素や金属イオンを要
求しない。

【００２６】（２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 至適ｐＨは、活性測定方法に準じて測定した。至適ｐＨ
の結果を、図１に示す。図１において符合−□−は、５
０ｍＭ クエン酸塩緩衝液を、符合−▲黒四角▼−は、
５０ｍＭ マレイン酸塩緩衝液を、符合−○−は、５０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液を、符合−●−は、５０ｍ
Ｍ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液を示す。図１から明らか
なように、ｐＨ７乃至１０が至適ｐＨである。

【００２７】また、ｐＨ安定性は、各種ｐＨで酵素を３
０℃、６０分間保った後の活性を測定した。結果は、図
２に示す。図２から明らかなように、ｐＨ５乃至１０が
安定である。

【００２８】（３）至適温度および熱安定性 至適温度は、活性測定方法に準じて測定した。結果は、
図３に示すように、６０℃付近が至適温度である。熱安
定性は、各種温度で酵素を５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．５）中に１０分間保った後の活性を測定
した。結果は、図４に示すように、５０℃以下では安定
である。

【００２９】（４）紫外線吸収スペクトル ２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。

【００３０】（５）分子量 分子量は、セファデックスＧ１５０を充填したカラム
（１．２×１００ｃｍ）を用い、２５ｍＭ トリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を溶出液とし、流速０．１５
ｍｌ／分の条件下でのゲル濾過クロマトグラフィーによ
り求めた。結果は、図５に示す。図５において、符合Ａ
は分子量６７，０００のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を、符合Ｂは分子量４５，０００の卵白アルブミンを、
符合Ｃは本酵素を、符合Ｄは分子量２５，０００のキモ
トリプシノーゲンＡを、符合Ｅは分子量１２，５００チ
トクロームＣを示す。図５から明らかなように、分子量
が既知の各種蛋白質（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）で作成した標準
曲線から、本酵素（Ｃ）の分子量は４１，０００±３，
０００である。

【００３１】（６）等電点 アンフォライン（スウェーデン国、ＬＫＢ社製）を用い
る焦点電気泳動法により求めたところ、ｐＨ４．３±
０．２である。

【００３２】（７）ポリアクリルアミドゲル電気泳動 本酵素のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果は、図
６に示す。図６において、符合Ｉは泳動開始点を、符合
ＩＩは本酵素を、符合ＩＩＩはブロムフェノール・ブル
ーを示す。図６から明らかなように、本酵素は、単一バ
ンドを示す。

【００３３】

【実施例２】 Ｄ−タガトースとＤ−ソルボースとの間
の変換反応 Ｄ−タガトースの５ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ７．５）に、
実施例１の方法でＰＥＧ分画２回目まで部分精製した酵
素液を、Ｄ−タガトース グラム当り５００単位の割合
で加え、４０℃、３０時間反応した。反応後、反応液を
常法に従って、活性炭を用いて脱色し、次いで、ダイヤ
イオンＳＫ１Ｂ（Ｈ型、三菱化成工業株式会社製造の商
品名）およびダイヤイオンＷＡ３０（ＯＨ型、三菱化成
工業株式会社製造の商品名）を用いて脱塩し、減圧濃縮
してＤ−タガトースとＤ−ソルボースとを含む濃度約６
０％の透明なシラップを得た。次いで、ダウエックス５
０Ｗ−Ｘ４（塩型強酸性カチオン交換樹脂、ダウケミカ
ル社製造の商品名）を用いるカラムクロマトグラフィー
により分離精製し、更に、濃縮し、晶出、分離して結晶
Ｄ−ソルボースを収率約５５％で得た。本品の理化学的
性質を調べたところ、融 外線吸収スペクトル（本品を図７に、標準物質としての
試薬Ｄ−ソルボースを図８に示した。）は、いずれも標
準のＤ−ソルボースのそれとよく一致している。これら
の結果から、本酵素によりＤ−タガトースから変換、生
成した糖質はＤ−ソルボースであると判断される。本品
は、甘味料、醗酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の原
料や中間体などとして有利に利用できる。また、本酵素
反応が可逆的な反応であることから、原料としてＤ−ソ
ルボースを用いることにより、Ｄ−タガトースを製品と
して採取することも容易である。

【００３４】

【実施例３】 Ｄ−フラクトースとＤ−プシコースとの
間の変換反応 Ｄ−フラクトースの１０ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ７．５）
に、実施例１の方法でＤＥＡＥ−トヨパール工程まで部
分精製した酵素液を、Ｄ−フラクトースグラム当り１，
５００単位の割合で加え、４５℃、３０時間反応させ
た。反応後、反応液を実施例２と同様に、脱色、脱塩
し、減圧濃縮してＤ−プシコースを含む透明なシラップ
を得た。本シラップを実施例２と同様に塩型強酸性カチ
オン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにか
け、分離精製し、濃縮してシラップ状のＤ−プシコース
を固形物当り収率約２５％で得た。本品の理化学的性質
は、標準のＤ−プシコースのそれとよく一致した。本品
は、甘味料、醗酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の原
料・中間体などとして有利に利用できる。また、本酵素
反応が可逆的な反応であることから、原料としてＤ−プ
シコースを用いることにより、Ｄ−フラクトースを製品
として採取することも容易である。

【００３５】

【実施例４】 Ｄ−フラクトースとＤ−プシコースとの
間の変換反応 Ｄ−フラクトースの１０ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ７．０）
に、実施例１の方法でＰＥＧ分画２回目まで部分精製し
た酵素液を、Ｄ−フラクトース グラム当り１，０００
単位の割合で加え、５０℃、３０時間反応させた。反応
後、反応液を実施例２と同様に、脱色、脱塩し、減圧濃
縮してＤ−フラクトースとＤ−プシコースとを含有する
透明なシラップを、固形物当り収率約９０％で得た。本
品は、上品な高甘味度甘味料として好適であり、各種飲
食物の甘味付け剤としてのみならず、保湿剤、結晶析出
防止剤、照り付与剤などとして有利に利用できる。

【００３６】

【実施例５】 Ｄ−キシロースとＤ−リブロースとの間
の変換反応 Ｄ−キシルロースの１ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ７．５）
に、実施例１の方法でＤＥＡＥ−トヨパール工程まで部
分精製した酵素液をＤ−キシルロース グラム当り３，
０００単位の割合で加え、３５℃、５０時間反応させ
た。反応後、反応液を実施例２と同様に、脱色、脱塩
し、減圧濃縮してＤ−リブロースを含む透明なシラップ
を得た。本シラップを実施例２と同様に塩型強酸性カチ
オン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーによ
り、分離精製し、濃縮してシラップ状のＤ−リブロース
を固形物当り収率約２０％で得た。本品の理化学的性質
は、標準のＤ−リブロースのそれとよく一致した。本品
は、甘味料、醗酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の原
料、中間体などとして有利に利用できる。また、本酵素
反応が可逆的な反応であることから、原料としてＤ−リ
ブロースを用いることにより、Ｄ−キシルロースを製品
として採取することも容易である。

【００３７】

【実施例６】 Ｌ−キシルロースとＬ−リブロースとの
間の変換反応 実施例１の方法でＤＥＡＥ−トヨパール工程まで部分精
製した酵素液を１ｗ／ｖ％Ｌ−キシルロース水溶液（ｐ
Ｈ７．５）に対し、Ｌ−キシルロース グラム当り３，
０００単位の割合で加え、３５℃、５０時間反応した。
反応後、反応液を実施例２と同様に、脱色、脱塩し、減
圧濃縮してＬ−リブロースを含む透明なシラップを得
た。本シラップを実施例２と同様に塩型強酸性カチオン
交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、分
離精製し、濃縮してシラップ状のＬ−リブロースを固形
物当り収率約２０％で得た。本品の理化学的性質は、標
準のＬ−リブロースのそれとよく一致した。本品は、甘
味料、醗酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の原料およ
び中間体などとして有利に利用できる。また、本酵素反
応が可逆的な反応であることから、原料としてＬ−リブ
ロースを用いることにより、Ｌ−キシルロースを製品と
して採取することも容易である。

【００３８】

【発明の効果】本発明のＤ−ケトヘキソース・３−エピ
メラーゼは、遊離のＤ−ケトヘキソース、Ｄ−またはＬ
−ケトペントースに作用させて、これらケトースの３位
をエピマー化し、対応するＤ−ケトヘキソース、Ｄ−ま
たはＬ−ケトペントースを容易に生成する。この反応
は、従来、製造困難であった各種ケトースの大量生産の
道を拓くものである。従って、本発明のＤ−ケトヘキソ
ース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途の確
立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧
品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、至適ｐＨを示す図である。

【図２】図２は、ｐＨ安定性を示す図である。

【図３】図３は、至適温度を示す図である。

【図４】図４は、熱安定性を示す図である。

【図５】図５は、本酵素の分子量を示す図である。

【図６】図６は、本酵素のポリアクリルアミドゲル電気
泳動を示す図である。

【図７】図７は、本発明により、Ｄ−タガトースから製
造したＤ−ソルボースの赤外線吸収スペクトルを示す図
である。

【図８】図８は、標準のＤ−ソルボースの赤外線吸収ス
ペクトルを示す図である。

【符合の説明】

Ａ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） Ｂ 卵白アルブミン Ｃ 本酵素（Ｄ−ケトヘキソース・３エピメラーゼ） Ｄ キモトリプシノーゲンＡ Ｅ チトクロームＣ Ｉ 泳動開始点 ＩＩ 本酵素（Ｄ−ケトヘキソース・３エピメラー
ゼ） ＩＩＩ ブロムフェノール・ブルー

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年１２月１５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【書類名】 明細書

【発明の名称】 Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラー
ゼとその製造方法並びに用途

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｄ−ケトヘキソース・
３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途に関する。

【０００２】

【従来技術】エピメラーゼは、エンザイム・ノメンクレ
イチャー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）
（アメリカ合衆国、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉ
ｎｃ．１９９２年）によると、各種の糖質に作用するこ
とが知られている。しかしながら、これまでに知られて
いるエピメラーゼは、例えば、リブロースリン酸塩・３
−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．１）やＵＤＰ−グ
ルコース・４−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．２）
などのように主としてリン酸化された糖質やＵＤＰなど
と結合した糖質に作用するものであり、遊離の中性の糖
質を製造する工業用途には、使えないものであった。一
方、遊離の糖質に作用するエピメラーゼについては、ア
ルドースに作用する二例、即ち、アルドース・１−エピ
メラーゼ（ＥＣ ５．１．３．３）およびセロピオース
・エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．１１）が知られて
いるのみである。前者は、アルドースの１位のα、βア
ノマー間のエピマー化を触媒し、後者は、同様に、セロ
ビオースのα、βアノマー間を触媒する酵素である。遊
離のケトースに作用するエピメラーゼは期待されるもの
の、未だその存在は知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】遊離のケトースに作用
するケトース・エピメラーゼとその製造方法並びに用途
の確立が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、ケトヘキ
トース間、またはケトペントース間を、遊離の糖質のま
まで容易にエピマー化しうるエピメラーゼに着目して、
本酵素の検索を鋭意続けてきた。その結果、新規なＤ−
ケトヘキソース・３−エピメラーゼを見出し、その製造
方法を確立するとともに、該酵素を利用したＤ−ケトヘ
キソース、Ｄ−またはＬ−ケトペントースの変換方法並
びに変換されたケトースの製造方法、更には、変換され
たケトースを含有する甘味料の製造方法を確立して本発
明を完成した。即ち、本発明のＤ−ケトヘキソース・３
−エピメラーゼは、Ｄ−ケトヘキソースの３位をエピマ
ー化し、対応するＤ−ケトヘキソースを生成する活性を
有する新規酵素であって、下記の理化学的性質を示す。

【０００５】（１） 作用および基質特異性 Ｄ−ケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応するＤ
−ケトヘキソースを生成する。Ｄ−またはＬ−ケトペン
トースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−
ケトペントースを生成する。

【０００６】（２） 至適ｐＨおよびｐＨ安定性 ｐＨ７乃至１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５乃至１０で安
定。

【０００７】（３） 至適温度および熱安定性 ６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。

【０００８】（４） 紫外線吸収スペクトル ２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。

【０００９】本発明のＤ−ケトヘキソース・３−エピメ
ラーゼは、通常、Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラー
ゼ産生能を有する微生物を培養してＤ−ケトヘキソース
・３−エピメラーゼを生成させればよい。

【００１０】微生物としては、例えば、シュードモナス
属に属する細菌が適しており、具体的には、特開平３−
２６６９９６号公報で開示されているシュードモナス・
チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）およ
びその変異種などが有利に利用できる。

【００１１】培養方法は、常法に従って、炭素源、窒素
源、無機塩、ビタミンなどを含有する栄養培地に１乃至
５日間程度培養、望ましくは、液体培地に通気撹拌など
により好気的条件下で培養し、得られる菌体、または培
養液上清などの培養物からＤ−ケトヘキソース・３−エ
ピメラーゼを採取すればよい。通常、培養物を粗Ｄ−ケ
トヘキソース・３−エピメラーゼとして利用することが
できる。必要ならば、培養物を濾過、遠心分離、塩析、
透析、濃縮、凍結乾燥など公知の方法で部分精製して採
取し、利用することができる。更に高度の精製を必要と
する場合には、例えば、イオン交換体への吸着・溶出、
ゲル濾過、等電点分画、電気泳動、高速液体クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、更に
は、モノクローナル抗体への吸着・溶出などを組合せて
最高純度に高めて利用することも随意である。

【００１２】また、本発明の変換反応、すなわち、Ｄ−
ケトヘキソース、Ｄ−ケトペントース、Ｌ−ケトペント
ースから選ばれる１種以上のケトースから、該ケトース
の３位をエピマー化し、対応するＤ−ケトヘキソース、
Ｄ−ケトペントースおよびＬ−ケトペントースなどを生
成する変換反応において、本発明のＤ−ケトヘキソース
・３−エピメラーゼを公知の方法により固定化して、反
応に繰り返し利用することも、連続反応に利用すること
も有利に実施できる。

【００１３】この変換反応は、通常、次の条件で行なわ
れる。基質漬度は１乃至６０ｗ／ｖ％、望ましくは、約
５乃至５０ｗ／ｖ％、反応温度は１０乃至７０℃、望ま
しくは、約３０乃至６０℃、反応ｐＨは５乃至１０、望
ましくは、約７乃至１０、酵素活性は基質グラム当り１
単位以上、望ましくは、５０乃至５，０００単位の範囲
から選ばれる。反応時間は、適宜選択できるが、経済性
との関係で、バッチ反応の場合には、通常、５乃至５０
時間の範囲が選ばれる。

【００１４】このようにして変換させた反応溶液には、
原料のケトースと新たに生成したケトースとを含有して
おり、これをそのまま甘味料、保湿剤、結晶析出防止
剤、照り付与剤などとして利用することも有利に実施で
きる。通常、反応溶液は、常法に従い、活性炭を用いて
脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン変換樹脂を用いて脱
塩、濃縮して、シラップ状製品を得る。

【００１５】必要ならば、更に、この濃縮液を、例え
ば、アルカリ金属型またはアルカリ土類金属型強酸性カ
チオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーによ
り、新たに生成したケトースと原料ケトースとを分離精
製し、新たに生成したケトース高含有画分を濃縮し、シ
ラップ状製品を得ることも、更に、結晶化しうるケトー
スの場合には、晶出させて、結晶状製品を得ることも有
利に実施できる。また、この分離された原料のケトース
を、再度、変換反応の原料に用いることも有利に実施で
きる。

【００１６】このようにして得られたケトースは、甘味
料として好適であり、飲食物、飼料、餌料、歯みがき、
口中香錠、舌下錠、内服薬など経口摂取物の甘味付け、
嗜好性向上などに有利に利用できる。また、醗酵用炭素
源、試薬、化学品・医薬品の原料、中間体などとしても
有利に利用できる。

【００１７】以下、本発明の２〜３の実施例を述べる。

【００１８】

【実施例１】硫酸アンモニウム０．２ｗ／ｖ％、リン酸
−カリウム０．２４ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．５
６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０１ｗ／ｖ
％、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、Ｄ−グルコース１ｗ／
ｖ％および脱イオン水からなる培養液をジャーファーメ
ンターにとり１２０℃、２０分間滅菌した後、シュード
モナス・チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３
６）の種培養液１ｖ／ｖ％を無菌的に添加し、通気撹拌
しながら３０℃で４０時間培養した。得られた培養液８
０ｌから遠心分離して菌体を集め、これを活性アルミナ
を用いて摩砕し５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）にて酵素を抽出した。

【００１９】この粗酵素液を塩化マンガン存在下でポリ
エチレングリコール６０００（以下ＰＥＧと略す。）を
用いた分画沈澱法を繰り返して精製した。即ち０．１Ｍ
塩化マンガン存在下でＰＥＧ５ｗ／ｖ％と１８ｗ／ｖ％
との間に生ずる沈澱を同一緩衝液に溶解した。このＰＥ
Ｇ分画を２回繰り返して精製した。次いで５０℃で２０
分間の熱処理を行ない変性した蛋白質を遠心分離により
除去したのち、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍに吸着さ
せ塩化カリによって溶出することにより精製した。限外
濾過（濾過膜は東洋濾紙ＵＫ−１０を使用）により脱
塩、濃縮した後、セファデックスＧ１５０（スウェーデ
ン国、ファルマシア社製）を用いたゲル濾過法により更
に精製した。活性画分を濃縮し、更にアンフォライン
（スウェーデン国、ＬＫＢ社製）を用いる焦点電気泳動
法により精製した。

【００２０】本酵素の活性測定は次のように行った。即
ち、反応液組成は、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）１００μｌ、４０ｍＭ Ｄ−タガトースを５０
μｌおよび酵素液５０μｌとした。反応は３０℃で６０
分間反応を行ない、生成物であるＤ−ソルボースをＨＰ
ＬＣにより測定した。酵素活性１単位は１分間に１μｍ
ｏｌのＤ−タガトースをエピマー化し、Ｄ−ソルボース
を生成する酵素量とした。

【００２１】この精製過程を表１にまとめた。

【００２２】

【表１】

【００２３】表１の結果から明らかなように、この精製
過程によって、比活性は約２９０倍に向上し、この時の
活性回収率は約２％であった。この精製酵素を用いて調
べたところ、本発明のＤ−ケトヘキソース・３−エピメ
ラーゼの理化学的性質は、次の通りである。

【００２４】（１） 作用および基質特異性 Ｄ−およびＬ−ケトヘキトース８種の内、Ｄ−ケトヘキ
トース４種（Ｄ−タガトース、Ｄ−ソルボース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−プシコース）の全てに作用し、それぞ
れの３位をエピマー化し、対応するＤ−ケトヘキトース
に変換する。また、Ｄ−およびＬ−ケトペントース４種
（Ｄ−およびＬ−キシルロース、Ｄ−およびＬ−リブロ
ース）の全てに作用し、それぞれの３位をエピマー化
し、対応するＤ−またはＬ−ケトペントースに変換す
る。

【００２５】本酵素は、Ｄ−タガトースとＤ−ソルボー
スとの間の変換反応を最も強く触媒し、Ｄ−フラクトー
スとＤ−プシコースとの変換反応は、Ｄ−タガトースと
Ｄ−ソルボースとの間の約３０乃至４０％の活性を示
し、更に、Ｄ−またはＬ−ケトペントース間の変換反応
は、Ｄ−タガトースとＤ−ソルボースとの間の数％の活
性を示す。これら反応は、可逆反応であり、平衡反応で
ある。また、これら反応には、補酵素や金属イオンを要
求しない。

【００２６】（２） 至適ｐＨおよびｐＨ安定性 至適ｐＨは、活性測定方法に準じて測定した。至適ｐＨ
の結果を、図１に示す。図１において符号−□−は、５
０ｍＭクエン酸塩緩衝液を、符号−▲黒四角▼−は、５
０ｍＭ マレイン酸塩緩衝液を、符号−○−は、５０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液を、符号−●−は、５０ｍＭ
グリシン−ＮａＯＨ緩衝液を示す。図１から明らかなよ
うに、ｐＨ７乃至１０が至適ｐＨである。

【００２７】また、ｐＨ安定性は、各種ｐＨで酵素を３
０℃、６０分間保った後の活性を測定して調べた。結果
は、図２に示す。図２から明らかなように、ｐＨ５乃至
１０が安定である。

【００２８】（３） 至適温度および熱安定性 至適温度は、活性測定方法に準じて測定した。結果は、
図３に示すように、６０℃付近が至適温度である。熱安
定性は、各種温度で酵素を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ７．５）中に１０分間保った後の活性を測定し
て調べた。結果は、図４に示すように、５０℃以下では
安定である。

【００２９】（４） 紫外線吸収スペクトル ２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。

【００３０】（５） 分子量 分子量は、セファデックスＧ１５０を充填したカラム
（１．２×１００ｃｍ）を用い、２５ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を溶出液とし、流速０．１５ｍ
ｌ／分の条件下でのゲル濾過クロマトグラフィーにより
求めた。結果は、図５に示す。図５において、符号Ａは
分子量６７，０００のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を、符号Ｂは分子量４５，０００の卵白アルブミンを、
符号Ｃは本酵素を、符号Ｄは分子量２５，０００のキモ
トリプシノーゲンＡを、符号Ｅは分子量１２，５００の
チトクロームＣを示す。図５から明らかなように、分子
量が既知の各種蛋白質（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）で作成した標
準曲線から、本酵素（Ｃ）の分子量は４１，０００±
３，０００である。

【００３１】（６） 等電点 アンフォライン（スウェーデン国、ＬＫＢ社製）を用い
る焦点電気泳動法により求めたところ、ｐＨ４．３±
０．２である。

【００３２】（７） ポリアクリルアミドゲル電気泳動 本酵素のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果は、図
６に示す。図６において、符号Ｉは泳動開始点を、符号
ＩＩは本酵素を、符号ＩＩＩはプロムフェノール・ブル
ーを示す。図６から明らかなように、本酵素は、単一バ
ンドを示す。

【００３３】

【実施例２ Ｄ−タガトースとＤ−ソルボースとの間の
変換反応】Ｄ−タガトースの５ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ
７．５）に、実施例１の方法でＰＥＧ分画２回目まで部
分精製した酵素液を、Ｄ−タガトースグラム当り５００
単位の割合で加え、４０℃、３０時間反応した。反応
後、反応液を常法に従って、活性炭を用いて脱色し、次
いで、ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ型、三菱化成工業株式
会社製造の商品名）およびダイヤイオンＷＡ３０（ＯＨ
型、三菱化成工業株式会社製造の商品名）を用いて脱塩
し、減圧濃縮してＤ−タガトースとＤ−ソルボースとを
含む濃度約６０％の透明なシラップを得た。次いで、ダ
ウエックス５０Ｗ−Ｘ４（塩型強酸性カチオン交換樹
脂、ダウケミカル社製造の商品名）を用いるカラムクロ
マトグラフィーにより分離精製し、更に、濃縮し、晶
出、分離して結晶Ｄ−ソルボースを収率約５５％で得
た。本品の理化学的性質を調べたところ、 赤外線吸収スペクトル（本品を図７に、標準物質として
の試薬Ｄ−ソルボースを図８に示した。）は、いずれも
標準のＤ−ソルボースのそれとよく一致している。これ
らの結果から、本酵素によりＤ−タガトースから変換、
生成した糖質はＤ−ソルボースであると判断される。本
品は、甘味料、醗酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の
原料や中間体などとして有利に利用できる。また、本酵
素反応が可逆的な反応であることから、原料としてＤ−
ソルボースを用いることにより、Ｄ−タガトースを製品
として採取することも容易である。

【００３４】

【実施例３ Ｄ−フラクトースとＤ−プシコースとの間
の変換反応】Ｄ−フラクトースの１０ｗ／ｖ％水溶液
（ｐＨ７．５）に、実施例１の方法でＤＥＡＥ−トヨパ
ール工程まで部分精製した酵素液を、Ｄ−フラクトース
グラム当り１，５００単位の割合で加え、４５℃、３０
時間反応させた。反応後、反応液を実施例２と同様に、
脱色、脱塩し、減圧濃縮してＤ−プシコースを含む透明
なシラップを得た。本シラップを実施例２と同様に塩型
強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフ
ィーにかけ、分離精製し、濃縮してシラップ状のＤ−プ
シコースを固形物当り収率約２５％で得た。本品の理化
学的性質は、標準のＤ−プシコースのそれとよく一致し
た。本品は、甘味料、酸酵用炭素源、試薬、化学品・医
薬品の原料・中間体などとして有利に利用できる。ま
た、本酵素反応が可逆的な反応であることから、原料と
してＤ−プシコースを用いることにより、Ｄ−フラクト
ースを製品として採取することも容易である。

【００３５】

【実施例４ Ｄ−フラクトースとＤ−プシコースとの間
の変換反応】Ｄ−フラクトースの１０ｗ／ｖ％水溶液
（ｐＨ７．０）に、実施例１の方法でＰＥＧ分画２回目
まで部分精製した酵素液を、Ｄ−フラクトースグラム当
り１，０００単位の割合で加え、５０℃、３０時間反応
させた。反応後、反応液を実施例２と同様に、脱色、脱
塩し、減圧濃縮してＤ−フラクトースとＤ−プシコース
とを含有する透明なシラップを、固形物当り収率約９０
％で得た。本品は、上品な高甘味度甘味料として好適で
あり、各種飲食物の甘味付け剤としてのみならず、保湿
剤、結晶析出防止剤、照り付与剤などとして有利に利用
できる。

【００３６】

【実施例５ Ｄ−キシロースとＤ−リプロースとの間の
変換反応】Ｄ−キシルロースの１ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ
７．５）に、実施例１の方法でＤＥＡＥ−トヨパール工
程まで部分精製した酵素液をＤ−キシルロースグラム当
り３，０００単位の割合で加え、３５℃、５０時間反応
させた。反応後、反応液を実施例２と同様に、脱色、脱
塩し、減圧濃縮してＤ−リブロースを含む透明なシラッ
プを得た。本シラップを実施例２と同様に塩型強酸性カ
チオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーによ
り、分離精製し、濃縮してシラップ状のＤ−リブロース
を固形物当り取率約２０％で得た。本品の理化学的性質
は、標準のＤ−リブロースのそれとよく一致した。本品
は、甘味料、醗酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の原
料、中間体などとして有利に利用できる。また、本酵素
反応が可逆的な反応であることから、原料としてＤ−リ
ブロースを用いることにより、Ｄ−キシルロースを製品
として採取することも容易である。

【００３７】

【実施例６ Ｌ−キシルロースとＬ−リブロースとの間
の変換反応】実施例１の方法でＤＥＡＥ−トヨパール工
程まで部分精製した酵素液を１ｗ／ｖ％Ｌ−キシルロー
ス水溶液（ｐＨ７．５）に対し、Ｌ−キシルロースグラ
ム当り３，０００単位の割合で加え、３５℃、５０時間
反応した。反応後、反応液を実施例２と同様に、脱色、
脱塩し、減圧濃縮してＬ−リブロースを含む透明なシラ
ップを得た。本シラップを実施例２と同様に塩型強酸性
カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーに
より、分離精製し、濃縮してシラップ状のＬ−リブロー
スを固形物当り収率約２０％で得た。本品の理化学的性
質は、標準のＬ−リブロースのそれとよく一致した。本
品は、甘味料、醗酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の
原料および中間体などとして有利に利用できる。また、
本酵素反応が可逆的な反応であることから、原料として
Ｌ−リブロースを用いることにより、Ｌ−キシルロース
を製品として採取することも容易である。

【００３８】

【発明の効果】本発明のＤ−ケトヘキソース・３−エピ
メラーゼは、遊離のＤ−ケトヘキソース、Ｄ−またはＬ
−ケトペントースに作用させて、これらケトースの３位
をエピマー化し、対応するＤ−ケトヘキソース、Ｄ−ま
たはＬ−ケトペントースを容易に生成する。この反応
は、従来、製造困難であった各種ケトースの大量生産の
道を拓くものである。従って、本発明のＤ−ケトヘキソ
ース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途の確
立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧
品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、至適ｐＨを示す図である。

【図２】図２は、ｐＨ安定性を示す図である。

【図３】図３は、至適温度を示す図である。

【図４】図４は、熱安定性を示す図である。

【図５】図５は、本酵素の分子量を示す図である。

【図６】図６は、本酵素のポリアクリルアミドゲル電気
泳動の写真である。

【図７】図７は、本発明により、Ｄ−タガトースから製
造したＤ−ソルボースの赤外線吸収スペクトルを示す図
である。

【図８】図８は、標準のＤ−ソルボースの赤外線吸収ス
ペクトルを示す図である。

【符号の説明】 Ａ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） Ｂ 卵白アルブミン Ｃ 本酵素（Ｄ−ケトヘキソース・３エピメラーゼ） Ｄ キモトリプシノーゲンＡ Ｅ チトクロームＣ Ｉ 泳動開始点 ＩＩ 本酵素（Ｄ−ケトヘキソース・３エピメラー
ゼ） ＩＩＩ ブロムフェノール・ブルー

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｄ−ケトヘキソースの３位をエピマー化
   し、対応するＤ−ケトヘキソースを生成する活性を有す
   るＤ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼ。
2. 【請求項２】 次の理化学的性質を有するＤ−ケトヘキ
   ソース・３−エピメラーゼ。 （１）作用および基質特異性 Ｄ−ケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応するＤ
   −ケトヘキソースを生成する。Ｄ−またはＬ−ケトペン
   トースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−
   ケトペントースを生成する。 （２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 ｐＨ７乃至１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５乃至１０で安
   定。 （３）至適温度および熱安定性 ６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。 （４）紫外線吸収スペクトル ２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。
3. 【請求項３】 シュードモナス属に属するＤ−ケトヘキ
   ソース・３−エピメラーゼ産生能を有する細菌を、栄養
   培地で培養してＤ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼ
   を生成せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−ケ
   トヘキソース・３−エピメラーゼの製造方法。
4. 【請求項４】 Ｄ−ケトヘキソース、Ｄ−ケトペントー
   スおよびＬ−ケトペントースから選ばれる１種以上のケ
   トースを含有する溶液に、Ｄ−ケトヘキソース・３−エ
   ピメラーゼを作用させて、該ケトースの３位をエピマー
   化することを特徴とするケトースの変換方法。
5. 【請求項５】 Ｄ−ケトヘキソース、Ｄ−ケトペントー
   スおよびＬ−ケトペントースから選ばれる１種以上のケ
   トースを含有する溶液に、Ｄ−ケトヘキソース・３−エ
   ピメラーゼを作用させて該ケトースの３位をエピマー化
   し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とするケトースの製造方法。
6. 【請求項６】 ケトースを採取する方法が、塩型強酸性
   カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーに
   より分離精製されたケトースを採取する方法であること
   を特徴とする請求項５記載のケトースの製造方法。
7. 【請求項７】 Ｄ−ケトヘキトース、Ｄ−ケトペントー
   スおよびＬ−ケトペントースから選ばれる１種以上のケ
   トースを含有する溶液に、Ｄ−ケトヘキソース・３−エ
   ピメラーゼを作用させて該ケトースの３位をエピマー化
   し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とするケトース含有甘味料の製造方法。