JPH03180172A - パラチノースおよびトレハルロースの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はパラチノースおよびトレハルロースの製造法に
関する。更に詳しく記すと、本発明はクレブシェラ属に
属する微生物、特にクレブシエラ・プランティコーラ（
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ　）　Ｍ
Ｘ−１（微工研菌寄託１１１２３号）、クレブシエラ・
プランティコーラＭＸ−２（微工研菌寄託１１１２４号
）およびクレブシェラ・テリゲナ　ＡＴＣＣ３３２５７
を用いて、蔗糖からパラチノースおよびトレハルロース
を製造する方法に関する。

（従来の技術）　　　　　　　　　　。

パラチノースやトレハルロースは鼻輪原性甘味料として
現在広く使用されており、蔗糖に微生物由来のα−グル
コシルトランスフェラーゼを作用させて工業的に生産さ
れている。従来、蔗糖をパラチノースまたはトレハルロ
ースに変換する微生物としてはＰｒｏｔａｍｉｎｏｂａ
ｃｔｅｒ属、５ｅｒｒａｔｉａ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属の
菌株が知られている。例えば、ドイツ特許明細舎弟１，
０４９，８００号にはＰｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ
ｒｕｂｒｕｍ、　５ｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｉｃ
ａ等の微生物由来酵素により蔗糖をパラチノースに変換
する方法、特公昭５７−１０７２０号公報にはプロタミ
ノバクタ−属またはセラチア属を蔗糖溶液中で好気的条
件下で培養してパラチノースを製造する方法、特公昭６
〇−９７９７号公報には固定化酵素に５よるイソマルチ
ュロースの製造法においてＥｒｗｉｎｉａ属の微生物を
使用する方法が記載されている。

（発明が解決しようとする課題） 従来知られているこれらの微生物生産酵素によるパラチ
ノースの製造では、パラチノースとトレハルロースの生
成比率は６：１〜１ｏ：１程度である。

パラチノースは容易に結晶化するため、反応液を精製後
、濃縮し結晶化して製品とし、トレハルロースは結晶化
しないのでパラチノース結晶を回収した後の最終音に残
り、これを更に精製濃縮した液状製品のパラチノース・
シロップの主成分となる。しかし、上記の酵素反応にお
いては目的生産物のパラチノース、トレハルロース以外
に副生成物として単糖のグルコース、フルクトース、イ
ソマルトース、イソマルトース等が生成する。これらの
うち、単糖のグルコース、フルクトースの生成割合は反
応液中の糖組成の約５％存在する。これらの単糖類が共
存すると、製造工程中の濃縮など繰り返し行われる加熱
処理により製品は着色し、生産物回収工程において脱色
工程が欠かせないなど、目的生産物の生産効率や製造工
程上の問題があった。またこの方法により得られた製品
を甘味料として食品に添加する場合、パラチノースは水
に対する溶解性が低いため、最終製品中で晶出すること
がある。したがって、その含有量に制限を受けるのに対
し、溶解性の高いトレハルロースを主成分とするパラチ
ノースシロップではその問題がなく、その良質の甘味と
あいまって需要が高い。しかし、このような高い需要が
あるにかかわらず、従来の製造法ではトレハルロースの
含有量の少ないシロップしか得られなかった。上記の状
況からトレハルロースの生成比率が高く、かつ単糖の生
成が少ない酵素生産菌が望まれていた。

（課題を解決するための手段） 本発明者等は予てより単糖生成が少なく、トレハルロー
スの生産比率の高い生産菌の探索を行ってきたが、タイ
国ウドン県りムパワビー郡の製糖工場内で採集した土壌
から純粋分離したクレブシェラ属プランティコーラ（Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ　）に属す
る新規な微生物ＭＸ−１およびＭＸ−２が蔗糖から単糖
のグルコース、フルクトースを殆ど生成せずパラチノー
スおよびトレハルロースを効率的ニ生産し、トレハルロ
ースの生成比率も従来知られている菌体より高いこと、
さらにクレブシェラ属テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
　ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）　ＡＴＣＣ３３２５７も同様な
性質を有することを見出だし、本発明を完成したもので
ある。従来、クレブシェラ属によるパラチノースおよび
トレハルロースの製造法は知られていない。

次ぎに本発明の微生物クレブシェラ属プランティコ、−
ラＭＸ−１およびＭＸ−２の同定試験結果を示す。これ
ら２菌株について顕微鏡観察およびＡＰＩ２０Ｅキット
等による２３項目にわたる同定試験を実施し次に示す結
果を得た。

試験項目および結果 項目 １．０ＮＰＧテスト ２、フルギニン加水分解酵素 ３、リジン脱炭酸酵素 ４、オルニチン脱炭酸酵素 ５、クエン酸利用テスト ロ、硫化水素産生テスト ７、ウレアーゼ ８、トリプトファンデアミナーゼ ９、インドール １０、ＶＰテスト １１、ゼラチンの加水分解 １２、炭水化物の利用 グルコース マンニット イノジット ソルビット ラムノース ＭＸ−１ 十 ＋ スクロース　　　　　　　　　　＋　　　＋メリビオー
ス　　　　　　　　　＋　　　＋アミグダリン　　　　
　　　　＋　　　＋アラビノース　　　　　　　　　＋
　　　＋１３−オキシダーゼテスト １４、＊　１０°Ｃにおける成育　　　　　＋　　　＋
１５−メレジトース利用性テスト 本オキシダーゼテストはチトクロームオキシダーゼ試験
用濾紙を使用 １１０°Ｃにおける成育はＮｕｔｒｉｅｎｔ　ａｇａｒ
ｍｅｄｉｕｍ（Ｄｉｆｃｏ　）に供試菌株を接種し１０
’Ｃで培養傘メレジトース利用性テストはＢａｒｓｉｋ
ｏｗの培地に最終濃度１％になる様にメレジトースを添
加した培地を用いて、３７°Ｃで培養 光学顕微鏡観察の結果ＭＸ−１，ＭＸ−２は直径０．５
−１　ｌ１ｍ、長さ１−４１１ｍの真っ直ぐな非運動性
のダラム陰性桿菌である。これらの結果と上記試験結果
から本菌株の分類学上の位置をＢＥＲＧＥＹ’　ＳＭＡ
ＮＵＡＬ　ＯＦ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌｕｍｅ　１により照合した結果、
本菌株は通性嫌気性ダラム陰性桿菌のＫｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａに属するものと考えられた
。対照としてＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の菌株Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ　ＡＴＣＣ３３５３
１，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｔｅｒｒｉｇｅｎａ　ＡＴＣ
Ｃ３３２５７，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｕｅｍｏｎ
ｉａｅＩＦＯ１３５４１の３菌種について同様の試験を
行った結果、ＭＸ−１，ＭＸ−２がＫｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ　ＡＴＣＣ３３５３１と一致
し、かつ他の２菌種と異なることを確認した。しかし本
発明者等は上記の比較菌種のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐ
ｌａｎｔｉｃｏｌａ　ＡＴＣＣ３３５３１は蔗糖からパ
ラチノースを生成する能力がないが、ＭＸ−１およびＭ
Ｘ−２は蔗糖をパラチノースに変換することからＫｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａの新菌株と判断
し、本菌株をＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏ
ｌａ　ＭＸ−１およびＭＸ−２と命名した。これら新菌
株Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ　ＭＸ
　−１およびＭＸ−２は工業技術院微生物工業技術研究
所に「微生物寄託番号　微工研菌寄　第１１１２３号お
よび第１１１２４号」として寄託した。その後Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ属の公知菌株について広くパラチノース、
トレハルロースの生産能を検索したところＫｌｅｂｓｉ
ｅｌｌａ　ｔｅｒｒｉｇｅｎａ　ＡＴＣＣ３３２５７が
蔗糖をパラチノースに変換することをも見出だした。

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に属する菌種が蔗糖をパラチノ
ースに変換することは従来全く知られていないことであ
り、この属の菌株を使用することが本発明の重要な特徴
である。

以下に本発明に関わるパラチノースおよびトレハルロー
スの製造法について説明する。本菌の生産する、蔗糖を
パラチノースおよびトレハルロースに変換する酵素もプ
ロタミノバクタ−、セラチャ、およびエルウィニア菌な
どと同様にα−グルコシルトランスフェラーゼであると
考えられ、培地中に蔗糖、フルクトース、パラチノース
が存在することにより誘導的に生産され菌体付随的に存
在する。従って工業的には酵素生産培地で菌体を培養後
、菌体をそのまま固定化した固定化酵素を製造し、バイ
オリアクターに充填し、これに蔗糖溶液を連続的に通液
して反応させることによりパラチノース、トレハルロー
スを生成させ、反応液を脱塩・精製、濃縮後、目的生産
物を分離する。

培養は通常液体培地を用いて好気的に行う。酵素生産用
の培地組成は炭素源として蔗糖を用いるが、蔗糖の培地
中の量的割合として１〜１５％（ｗ／Ｖ）、特に好まし
くは５〜１３％（ｗ／ｖ）の範囲で添加使用する。窒素
源としては微生物が使用しうる酵母エキス、ペプトン、
麦芽エキス、コーンスチーブリカーなどが使用されるが
、酵母エキス、コーンスチープリカーなどが特に好まし
い。無機塩類としてはリン酸、マグネジ１ウム、カルシ
為つム、カリ１ウム、鉄などの塩類が使用される。さら
に必要により他の有機物、無機物が培地に添加される。

培養温度は菌体が成育する１５〜３８°Ｃで行われるが
、好ましくは約２５−３５°Ｃの範囲である。

また培地ｐＨは５．０〜７．０好ましくはｐＨ６，０〜
７．０の範囲で調整される。通常の培養槽を用いる培養
においては１　／　１０〜１　ｖｖｍ程度の通気と３０
〜４００　ｒｐｍ程度の撹拌を行う。培養時間は１０−
２４時間程度である。培養終了後培養液を冷却し、遠心
分離により沈殿部分を回収する。固定化酵素とする場合
は種々の方法が適用出来るが、−例として、これをアル
ギン酸ナトリ１ウムと混合して、塩化カルシ１ウム溶液
内に連子して粒状にゲル化させる。

この粒状化酵素をさらにポリエチレンイミン、ゲルター
ルアルデヒドで処理して固定化酵素とする。これをカラ
ムに充填し濃度２０〜６０％Ｗ／Ｗの蔗糖溶液を温度約
２５°ＣｐＨ５，５に調整して通液し反応チノースを遠
心分離して回収し製品とする。また難結晶性のトレハル
ロースはシロップとして回収し製品とする。このシロッ
プをＣａ型のイオン交換樹脂を用いた通常のクロマト分
離などにより分画すると高純度の製品を得ることも出来
る。

（効果） 新菌株ＭＸ−１，ＭＸ−２およびクレプシラ属テリゲナ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）ＡＴＣ
Ｃ３３２５７等のクレブシラ属のパラチノースおよびト
レハルロース生産菌はＰ、　ｒｕｂｒｕｍ菌等の従来菌
を使用した場合に比較し、単糖のフラクトース、グルコ
ースの生成量が約半分であり従って製造工程中の反応液
の加熱による着色が少なく清澄な反応液が得られるため
、清浄工程が簡略出来、また従来菌に比較しトレハルロ
ースの生成量が多く、パラチノースシロップの生産量を
増加出来るので、需要にマツチしたパラチノースおよび
パラチノースシロップの生産が可能となる。また、反応
液糖組成のパラチノースの割合が従来菌に比較して低い
ので反応液からのパラチノース晶出が避けられるので原
料の蔗糖溶液濃度を上昇させることが出来、工程中の微
生物汚染の回避並びに高濃度原料処理によるコストダウ
ンが可能となる。

実施例１ ［酵素生産］ 水に対し、仕上げ濃度が蔗糖５０　ｇ、　Ｃ，Ｓ、　Ｌ
　３０　ｇ。

酵母エキス５ｇ、燐酸二ナトリウム２ｇおよび塩化ナト
リウム３ｇ／ｅとなるように材料を溶解し、水酸化ナト
リ１ウム溶液でｐＨ６，５〜７．０に調整したものを培
地とした。殺菌条件はオートクレーブで温度１２０°Ｃ
で２０分間とした。５００ｍ１振とうフラスコに培地を
５０ｍ１入れ、Ｋ、　ｐｌａｎｔｉｃｏｌｌａ　ＭＸ−
１のスラントを接種して、２８°Ｃ１１４Ｏｒｐｍで２
４時間培養したものを種菌とした。

容量３．Ｏｅのファーメンタ−に培地２ｅを入れて殺菌
・冷却して温度２８°Ｃとした後、種菌を接種し、通気
速度１　／　４　ｖｖｍ、４００　ｒｐｍ撹拌下で約１
２時間培養した。培養中湿度は２８°Ｃ，ｐＨは約６．
０に保った。培養液のα−グルコシルトランスフェラー
ゼ活性は１５Ｕ／ｍｌであった。ＩＵはｐＨ５，５の２
０％蔗糖溶液中で２０６Ｃで反応させたとき、蔗糖の生
産物への転換の初速が１分間に１ｐモルとなる酵素量を
１単位（Ｕ）とした。

［酵素の固定化１ 培養液を５°Ｃに冷却し、２０，０００　Ｇ、　３０分
の遠心分離を行って、上清液を捨て沈殿部分を回収した
。

沈殿は４％アルギン酸ナトリウム溶液と１：１（ｗ／Ｗ
）の割合で混合し、滴下装置により孔径０．５　ｍｍの
ノズルから０．２５　Ｍ塩化カルシウム溶液内に滴下し
て粒土にゲル化させ２時間エージングした後、水洗し粒
状化酵素とした。次いでこの粒状化酵素を塩酸を加えて
ｐＨ５，５に調整した２％のポリエチレンイミン（ＰＥ
Ｉ）溶液と１：１（ｗ／ｗ）の割合で混合して５分間放
置し、直ちに濾過してＰＥＩを吸収した粒状化酵素を回
収し、続いて冷却して５°Ｃとした０、５％グルタルア
ルデヒド（ＧＡ）溶液中に投入して３０分間ゆるやかに
撹拌後、混合物を濾過し、充分に水洗して固定化酵素２
００ｇを製造した。本固定化酵素の特性を調査した結果
、活性は３３Ｕ／ｇであり、温度２５−５０°Ｃの酢酸
カルシウムバッファー溶液９０ｍ１に固定化酵素５ｇを
１８時間浸漬した耐熱性試験では４０°Ｃ以上では活性
が急激に低下した。ｐＨは５．０−６．０で活性が高く
、反応温度は２５−３５°Ｃの実験では温度が高い程パ
ラチノースの生成が多く、逆に温度が低くなるとトレハ
ルロースの生成量が増加し、グルコース、フルクト−中
の生成率が小さくなった。

［パラチノースおよびトレハルロースの製造］上記、Ｍ
Ｘ−１の固定化酵素を内径２５ｍｍ、長さ６００ｍｍの
カラムに充填し、固形分５０％（ｗ／ｖ）の蔗糖溶液を
温度２５°Ｃ１流速６０ｍ１／ｈ（ＳＶ＝０．３）で通
液し、カラムからの流出反応液の糖組成を調査した。

調査結果 反応液糖組成 フルクトース　　　　　　　　　　１．１％グルコース
　　　　　　　　　　　１．０スクロース　　　　　　
　　　　　１．３パラチノース（Ｐ）　　　　　　　　
６０．７トレハルロース（Ｔ）　　　　　　　３５．８
その他　　　　　　　　　　　　　０．１計　　　　　
　　　　　　　　　　１００％Ｐ／Ｔ比　　　　　　　
　　　　１．７上記反応液を濾過し、カチオン交換樹脂
塔、アニオン交換樹脂塔に通液して脱塩精製した後、真
空結晶缶に送り、温度４５−６０°Ｃで濃縮しつつシー
ドを加え煎糖し、白′下を助晶機に入れ冷却しつつ助晶
し遠心分離機で分蜜し、純度９９．５％のパラチノース
結晶を回収率５０％で得た。パラチノース結晶を回収後
のシロップの糖組成は以下に示す通りであった。

シロップ糖組成 フルクトース　　　　　　　　　　２．７％グルコース
　　　　　　　　　　　２．５スクロース　　　　　　
　　　　　１．３パラチノース（Ｐ　）　　　　　　　
　２４．０トレハルロース（Ｔ）６９．３ その他　　　　　　　　　　　　０．２以上の様にＭＸ
−１による反応液中の糖組成のパラチノースとトレハル
ロースの生成比率はＰ／Ｔ比が１．７とトレハルロース
が多く生威し、また単糖の生成も半減した。従ってパラ
チノース結晶を回収後ノシロップは従来のパラチノース
シロッフニ比較し単糖含有率は５．２％と少なく、殆ど
着色していす清澄であり、トレハルロースの含有率も高
い。

実施例２ 実施例１と同様の方法でに、　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ　
ＭＸ　−２を使用した場合のカラムがらの流出反応液お
よびシロップの糖組成は以下の通りであった。

反応液糖組成　　　　　　　　　シロップ糖組成フルク
トース　　　　１．１％　フルクトース　　　　　２．
４％グルコース　　　　　１．０ スクロース　　　　　０．５ パラチノース（Ｐ）　　６０．０ トレハルロース（Ｔ）　　３７．３ その他　　　　　　　０．１ 計　　　　　　　　１００％ Ｐ／Ｔ比　　　　　　１，６ 実施例３ に、　ｔｅｒｒｉｇｅｎａ　ＡＴＣＣ３３２５７を使用
して実施例１と同様の方法で製造した固定化酵素を使用
し、固形分４５％（ｗ／ｖ）の蔗糖溶液を温度２５°Ｃ
１流速６０ｍ１　／　ｈ　（ＳＶ　＝　０．３　）で通
液した場合のカラムがらの流出反応液の糖組成および反
応液からパラチノース結晶を約７０％の回収率で回収後
のシロップの糖組成は以下の通りであった。

２．２ ０．５ ２２．０ ７２．７ ０．２ グルコース スクロース パラチノース（Ｐ） トレハルロース（Ｔ） その他 反応液糖組成 フルクトース グルコース スクロース パラチノースＣＰ） トレハルロース（Ｔ） その他 計 ＰＩＴ比 １．１％ １．０ １．０ ７６．５ ２０．０ ０．４ １００％ ３．８ シロップ糖組成 フルクトース グルコース スクロース パラチノース（Ｐ） トレハルロース（Ｔ） その他 ４．４％ ４．０ １．６ ２４．０ ６４．７ １．３

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）パラチノースおよびトレハルロース生産能を有す
   るクレブシエ・プランティコーラＭＸ−１（微工研菌寄
   託１１１２３号）およびクレブシエラ・プランティコー
   ラＭＸ−２（微工研菌寄託１１１２４号）。
2. （２）クレブシエラ属に属する微生物の生産する、蔗糖
   をパラチノースおよびトレハルロースに転換する酸素を
   利用し、蔗糖からパラチノースおよびトレハルロースを
   生成することを特徴とする、パラチノースおよびトレハ
   ルロースの製造法。
3. （３）クレブシラ属に属する微生物はクレブシエラ・プ
   ランティコーラＭＸ−１（微工研菌寄託１１１２３号）
   、クレブシエラ・プランティコーラＭＸ−２（微工研菌
   寄託１１１２４号）およびクレブシエラ・テリゲナＡＴ
   ＣＣ３３２５７である、請求項２記載の方法。
4. （４）固定化酵素を利用する、請求項２記載の方法。