KR100512062B1 - L-리보오스 이소메라아제와 그 제조방법 및 용도 - Google Patents
L-리보오스 이소메라아제와 그 제조방법 및 용도 Download PDFInfo
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Abstract
L-리보오스, D-릭소오스, D-탈로오스, D-만노오스, L-알로오스 및 L-굴로오스 등의 알도오스류를 이성화하여 L-리불로오스, D-크실룰로오스, D-타가토오스, D-프룩토오스, L-프시코오스 및 L-소르보오스 등의 각기 상응한 케토오스류로 변환하는 L-리보오스 이소메라아제. 이 효소반응은 가역 평형 반응이다. L-리보오스 이소메라아제는 아시네토박터속(Acinetobacter屬)에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있다.
Description
본 발명은 L-리보오스 이소메라아제(L-ribose isomerase)와 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 L-리보오스를 L-리불로오스(L-ribulose)로 변환하거나 그 역으로 변환하는 L-리보오스 이소메라아제와 그 제조방법, L-리보오스 이소메라아제 산생능이 있는 미생물 및 L-리보오스 이소메라아제를 이용한 케토오스와 알도오스의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 생화학 공업이 발전 도중에 있고 소외되어 있던 희소한 당류(rare saccharide)들의 당 화학 분야에 대한 수요가 많다. 따라서 이들 희소한 당류들의 확립이 강하게 요망되고 있다. 이러한 희소한 당류들을 유기화학적인 방법으로 제조할 수 있겠으나, 그 제조조건은 일반적으로 가혹하며 소요의 제품의 수율은 비교적 낮다. 따라서 유기화학적 방법은 공업적 규모의 생산에 적합하지 않다. 희소한 당류의 제조를 위한 생화학적 방법으로서 효소에 의한 당변환법을 생각할 수 있으나 희소한 당으로서의 L-리보오스 또는 D-탈로오스에 작용하는 이소메라아제에 관해 보고된 바가 전혀 없고, 이들 희소한 당류의 제조방법이 획립되어 있지 않다.
L-리보오스 및 D-탈로오스 등의 희소한 당류의 공업적 규모의 제조방법이 강하게 요구되고 있다. 이 과제를 달성하기 위해 본 발명자들은 L-리보오스 이소메라아제에 관해 연구를 하여 이 효소를 산생하는 미생물을 철저히 검색하였다. 그 결과, 본 발명자들은 일본국의 카가와시의 키타군 소재의 미키마치의 토양으로부터 분리한 신규의 미생물 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) LR7C가 L-리보오스 이소메라아제를 산생함을 발견하였고, 또한 본 발명자들은 L-리보오스 이소메라아제는 기질인 알도오스 또는 케토오스에 작용할 경우 희소한 당류를 용이하게 산생함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 L-리보오스 이소메라아제와 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 L-리보오스를 L-리불로오스로 변환하거나 그 역으로 변환하는 L-리보오스 이소메라아제와 그 제조방법, L-리보오스 이소메라아제 산생능이 있는 미생물 및 L-리보오스 이소메라아제를 이용한 케토오스와 알도오스의 제조방법에 관한 것이다.
아래에 나오는 것은 아시네토박터속(屬)에 속하는 미생물, 즉 아시네토박터 칼코아세티쿠스 LR7C 균주(FERM BP-5335)의 확인결과이다.
아시네토박터 칼코아세티쿠스 LR7C 균주의 확인결과
A 세포형태
영양 육즙 한천중에서 27℃에서 배양시의 세포의 특징
통상적으로 1.0∼1.5 × 1.5∼2.5 ㎛의 단일 간균(得菌)으로 존재;
운동성 : 양성(회전운동 또는 진동운동)
무포자성 : 양성;
편모 : 양성;
그람 염색 : 음성;
B. 배양특성
(1) 영양육즙 한천평판에서 27℃에서 배양시 생성된 콜로니의 특징
형상 : 배양 2일후 직경 약 0.1∼1 mm의 원형 콜로니;
주연 : 전연;
융기 : 반구상;
광택 : 둔함;
표면 : 평활;
색 : 불투명, 담황색;
(2) 27℃에서 영양 육즙 한천 사면 배양시 생성된 콜로니의 특징
생육 : 양호;
형상 : 실 형상;
(3) 27℃에서 트립톤 대두 한천 사면 배양시 생성된 콜로니의 특징
생육 : 양호;
형상 : 실 형상;
(4) 27℃에서 영양 육즙 젤라틴 천자 배양시 젤라틴을 액화 않음.
C. 생리학적 특성
(1) 질산염 환원 : 양성;
(2) 폴리-β-히드록시 부티레이트 축적 : 음성;
(3) 메틸레드 시험 : 음성;
(4) VP 시험 : 음성;
(5) 인돌 생성 : 음성;
(6) 황화수소 생성 : 음성;
(7) 전분 가수분해 : 음성;
(8) 시트르산 이용 : 양성;
(9) 색소 생성 : 음성;
(10) 옥시다아제 : 음성;
(11) 카탈라아제 : 양성;
(12) 생육조건 : 온도 20∼37℃의 범위에서 생육;
(13) 산소에 대한 태도 : 호기성;
(14) D-글루코오스로부터 산의 생성 : 양성;
(15) 용혈반응 : 음성;
(16) β-크실로시다아제 : 음성;
(17) 탄소원 이용
글루타르산, 말론산, 페닐락트산, 아젤라산, D-말산, 에탄올, 2,3-부탄디올, 아콘니트산, D-리보오스, D-크실로오스, L-아라비노오스 및 D-글루코오스를 이용함;
(18) 질소원 이용
L-페닐 알라닌, L-히스티딘, L-아스파르트산, L-로이신, L-티로신, β-알라닌, L-아르기닌 및 L-오르니틴을 이용하나 히스타민을 이용않음;
(19) DNase : 양성;
(20) 3-케토락토오스 생성 : 음성;
(21) DNA의 구아닌(G) +시토신(C)의 몰% : 42%.
이들 균학적 성질에 근거하여 이 미생물을 문헌 [Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition (1994)]을 참조하여 공지의 미생물과 비교한 결과, 이 미생물은 아시네토박터속(Acinetobacter genus)에 속하는 신규의 미생물인 것으로 확인되었다. 본 발명자들은 이 미생물이 41℃에서는 생육하지 않고 용혈반응과 젤라틴 가수분해가 음성이며, 글루코오스로부터의 산 생성이 양성이고 탄소원과 질소원의 이용조건에 근거하여 아시네토박터 칼코아세티쿠스종의 일종인 미생물임을 확인하였다.
이들 결과로부터 본 발명자들은 이 미생물을 "아시네토박터 칼코아세티쿠스 LR7C"로 명명하여 1995년 12월 14일자로 일본국의 기탁기관(National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Ibaraki, Japan)에 기탁하였다. 이 미생물의 기탁은 동일자로 접수되어 수탁번호 FERM BP-5335로서 이 기탁관에서 유지되고 있다.
상기한 미생물외에도 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제를 산생할 수 있는 한, 아시네토박터속에 속하는 기타 균주와 그 변이주를 본 발명에서 적절히 사용할 수 있다. 상기 한 변이주들은 아시네토박터속에 속하는 미생물을 자외선 또는 γ선 등으로 물리적으로 처리하거나, 이들 미생물을 니트로소구아니딘으로 화학처리하거나, 또는 D-릭소오스(D-lyxose)를 함유한 영양배지중에서 이들 미생물을 계대(繼代) 배양하여 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제를 안정하게 생성시키고 효소 수득율을 증가시키는 방법에 의해 얻을 수 있다. 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제를 산생할 수 있는 것이면 어떠한 미생물이라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 이소메라아제를 코우드하는 유전자를 도입한 형질 전환체속에서 이소메라아제를 발현시킴으로써 L-리보오스 이소메라아제를 생성시킬 수 있다. 필요에 따라서는 단백질 공학기술을 이용하여 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 열적 안정성을 증대시키거나 pH 안정성의 범위를 확대시킬 수 있다. 상기한 미생물들이 생육할 수 있고 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제를 산생할 수 있는 한, 합성 또는 천연 영양배지 등의 영양배지를 본 발명에서 사용할 수 있다. 알도오스, 케토오스 및 당알코올 등의 탄소함유 물질 한가지 이상을 본 발명에서 탄소원으로 사용할 수 있다. 통상적으로 D-릭소오스를 배지의 탄소원으로서 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 질소원으로서는 암모늄염 및 질산염 등의 무기 질소함유 화합물 및 우레아, 코온 스티프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑스 및 육 엑스 등의 유기 질소함유 화합물을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 무기 성분으로서는 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염 등이 있다. 본 발명에서 사용되는 미생물을 통상적으로 온도 약 10∼40℃, 바람직하게는 약 20∼35℃에서 pH 약 5∼9, 바람직하게는 약 6∼8.5에서 호기적 조건하에서 배양한다.
미생물의 배양이 끝나면 배양액으로부터 본발명의 L-리보오스 이소메라아제를 회수한다. 효소는 주로 균체내에 존재하기 때문에 균체 자체를 효소제로 사용할 수 있다. 균체내 효소를 종래의 방법으로 균체로부터 추출하여 추출된 효소를 그대로 조효소(crude enzyme)로 사용하거나 종래의 방법으로 정제한 후에 사용한다. 예컨대 균질화 균체(homogenized cell)의 추출물을 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 분획법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법을 두가지 이상을 이용하여 정제함으로써 전기 영동적으로 단일의 단백질 밴드를 가진 효소제품을 얻을 수 있다.
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 활성은 다음과 같이 하여 구한다. 즉, 0.5 M 글리신-수산화 나트륨 완충액(pH 9.0) 0.05 ml, 0.05 M L-리보오스 0.05 ml 및 적당량의 효소액을 가하여 전체 용적이 0.5 ml가 되도록 하여 충분히 혼합한 용액을 30℃에서 배양하여 효소반응을 시킨 다음 생성된 L-리보오스의 양을 시스테인-카르바졸 방법에 의하여 정량한다. 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 활성 1 단위는 1분간에 L-리보오스 1 μmole을 생성하는 효소의 양으로 정의된다.
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제는, 기질로서 L-리보오스 외에 D-릭소오스, D-탈로오스, D-만노오스, L-알로오스 및 L-굴로오스 등의 알도오스류에도 작용하여 이들을 이성화함으로써 각기 상응한 케토오스를 생성한다.
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제를 최고 가능한 순도로 정제할 필요는 없다. 예를 들자면, L-리보오스 이소메라아제를 함유하는 미생물을 톨루엔으로 처리한 것을 그대로 공업적 규모의 당전이 반응에 적절히 사용할 수 있다. 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 미생물 및 부분정제 이소메라아제를 포괄법, 흡착법 및 공유결합법 등의 종래의 고정화 방법에 의하여 고정화할 수 있다. 고정화 효소를 희분식(batchwise)으로 하여 반복해서 사용하거나 칼럼에 충전한후 계속하여 사용할 수 있다.
이렇게 하여 수득한 반응 혼합물은 통상적으로 알도오스와 케토오스 모두를 함유한다. 일반적으로 이 혼합물을 여과조제, 여과막 및 정밀 여과막을 사용하는 여과법, 원심분리 등에 의한 불용물(不溶物)의 제거, 활성탄에 의한 탈색과 H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염 등의 두가지 이상의 기술을 조합하여 정제한 다음, 수득한 혼합물을 농축하여 시럽상 제품을 얻거나 건조하여 분말상 고형제품을 얻는다. 필요한 경우, 보다 고도의 결정화 단계를 채용할 수 있다. 예컨대 알칼리 금속형 및/또는 알칼리 토류 금속형의 양이온 교환수지 또는 아황산 수소형 및/또는 붕산형의 음이온 교환수지를 사용하는 분획법 및 실리카 겔을 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 고순도 당류를 얻는다, 수득한 당류가 결정화가 가능한 경우에는 이들 종래의 결정화 방법으로 결정제품으로 제조할 수도 있다. 예컨대 적당한 정제 방법에 의한 처리 또는 무처리의 상기한 반응 혼합물 또는 당액에 메탄올, 에탄올, 이소프로판올을 비롯한 저급 알킬 알코올 등의 통상적인 유기용매 1종 이상을 첨가하여 혼합하거나 농축 및/또는 비교적 저온에서 방치하거나, 이들 방법을 조합하여 상기한 당류의 과포화 용액을 얻은 다음, 이 용액을 결정화하여 결정을 분리함으로써 결정을 함유한 고형제품을 얻을 수 있다. 이들 당 제품을 화공시약으로 사용하거나 식품공업에 있어서 감미료 및 품질 개량제로 사용하거나 의약, 화학공업에 있어서 원료, 중간체로서 사용할 수 있다.
이들 당류중에서 L-리보오스의 광학 이성체인 D-리보오스는 세포증식과 깊은 관계를 가진 RNA의 필수성분이다. 따라서 L-리보오스 자체 또는 그 유도체를 핵산의 복제 억제제로서 사용할 수 있다. 이러한 억제제의 예로서는 항균제, 항바이러스제, 항AIDS제 및 항암제 등의 의약품을 포함한다. 상기한 바와 같이 L-리보오스는 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제를 사용함으로써 L-리불로오스로부터 용이하게 제조된다. L-리불로오스는 그 기원에 한정되지 않는다. 예컨대 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아세토박터(Acetobater)속에 속하는 미생물, 즉 글루코노박터 프라테우리이(Gluconobater frateurii)속 및 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti) 등의 미생물을 사용한 산화반응에 의해 L-리불로오스를 쉽사리 제조할 수 있다.
아래의 실험에 의해 본 발명을 상세히 설명한다.
실험 1 : 아시네토박터 칼코아세티쿠스 LR7C로부터 L-리보오스 이소메라아제의 제조
효모엑스 0.5 w/v%, 폴리펩톤 0.5 w/v%, 식염 0.5 w/v% 및 물로 된 액체 영양배지를 pH 7.0으로 조정하고, 2 리터를 취해 2.5 리터 용량의 자아 퍼멘터(jar fermenter)에 넣고 오토클레이브에서 120℃에서 20분간 멸균하여 냉각한 다음, 탄소원으로서 D-릭소오스를 함유한 영양배지중에서 4일간 배양한 아시네토박터 칼코아세티쿠스 LR7C(FERM BP-5335)의 종배양물을 접종한후 30℃에서 14시간 동안 통기교반 조건하에 배양하였다. 이 배지를 원심분리하여 배지 1 리터당 약 15 g의 습균체를 얻었다. 이 습균체를 종래의 방식으로 알루미나 분말과 함께 파쇄하고, 여기에 0.05 M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)을 혼합하여 소요의 효소를 추출한후 원심분리하여 총효소 활성이 2,870 단위이고 비활성이 단백질 1 mg당 1.73 단위인 조효소액으로서의 상청액을 200 ml 얻었다.
실험 2 : L-리보오스 이소메라아제 정제
실험 2-1 : 폴리에틸렌 글리콜 분획
실험 1의 조효소액을 얼음으로 급냉하고 여기에 0.01 M 염화망간을 가하여 30분간 방치한후 원심분리하여 불용물을 제거하였다. 수득한 상청액에 최종농도 15 w/v%되게 폴리에틸렌 글리콜 분말을 가하여 교반하면서 용해시킨 다음, 생성된 불용물을 이 혼합물을 원심분리하여 제거하였다. 수득한 상청액에 최종농도 25 w/v%되게 폴리에틸렌 글리콜을 가하여 교반하면서 용해시킨 다음 생성된 불용물을 원심분리하여 회수하였다.
실험 2-2 : 이온교환 크로마토그래피
실험 2-1의 침전물을 0.05 M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 용해하고 잔존하는 불용물을 원심분리하여 제거함으로써 상청액 13 ml을 얻은 다음, "DEAE-TOYOPEARL 650M"(일본국 Tosoh사 판매의 약알카리성 음이온 교환수지)의 칼럼에 공급하여 상기 교환수지에 소요의 효소를 흡착시킨 후 염화칼륨의 0 M로부터 0.5 M까지 증가하는 직선 기울기 용액으로 칼럼으로부터 효소를 용출시켜 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 획분들을 채취하였다.
실험 2-3 : 겔 여과 크로마토그래피
실험 2-2의 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 획분을 농축하고, 이 농축물을 "SEPHADE®G-150"(스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology사 판매의 비이드상 덱스트란 겔)의 칼럼에 공급하고 0.05 M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 용출시켜 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 획분들을 얻었다. 표 1에는 각 정제단계에서의 단백질량, 효소활성, 효소수율 및 효소 정제 배율(倍率)이 나와 있다.
표 1에 나온 "SEPHADEX®G-150"을 사용한 겔 여과 용출물로서 얻은 최종정제 효소에 대해 폴리아크릴아미드 겔 디스크 전기 영동법으로 순도를 조사한 결과, 이 효소는 단일의 단백질 밴드를 나타낼 정도로 정제되었음이 판명되었으므로 이 효소는 전기 영동적으로 극히 고순도의 효소임이 확인되었다.
실험 3 : L-리보오스 이소메라아제의 성질
실험 2의 방법으로 얻은 정제 L-리보오스 이소메라아제를 사용하여 그 물리화학적인 성질을 조사하였다.
실험 3-1 : 작용
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제 활성 측정방법에 따라 L-리보오스 또는 L-리불로오스에 작용시킬 경우 정제 L-리보오스 이소메라아제는 L-리보오스로부터 L-리불로오스를 생성하고, 또한 L-리불로오스로부터 L-리보오스를 생성하였다.
그 효소반응은 가역적인 평형반응이다.
실험 3-2 : 기질 특이성
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제 활성측정 방법에 따라 기질인 알도오스에 대한 정제 L-리보오스 이소메라아제 활성을 측정하였다. 표 2에는 L-리보오스에 대한 효소의 상대적인 활성을 100으로 했을때 알도오스에 대한 효소의 상대적인 활성이 나와 있다.
[표 2]
표 2의 결과로부터 명백한 바와 같이 L-리보오스 이소메라아제는 L-리보오스에 대하여 최고의 활성을 나타내었다. L-리보오스 이소메라아제는 D-릭소오스, D-탈로오스, D-만노오스, L-알로오스 및 L-굴로오스 등의 기타의 알도오스류에 작용하였다. 이들 효소반응은 가역반응이였고, 이 효소는 상기 알도오스류에 각기 대응한 기질인 L-리불로오스, D-크실룰로오스, D-타가토오스, D-프룩토오스, L-프시코오스 및 L-소르보오스 등에도 각각 작용하였다. 표 3에는 상기 기질로부터 생성된 케토오스류와 알도오스류의 이온교환 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 박층 크로마그래피 등으로 확인된 데이타가 나와 있다.
[표 3]
표 3의 결과로부터 명백한 바와 같이 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제는 알도오스류에 작용하여 이들을 각기 상응한 케토오스로 변환시키고, 또한 그 반대로 케토오스류에 작용하여 각기 상응한 알도오스로도 변환시킨다. 이들 효소 변환반응은 공통의 효소반응 양식을 가지고 있다. 화학식 1은 이 반응양식의 일예를 나타낸 것이다.
화학식 1 :
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 효소반응은 가역반응이다. 표 4는 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제 활성 측정시에 사용된 조건하에서 알도오스와 케토오스 사이의 가역 평형반응의 정량적인 관계의 결과를 나타낸 것이다.
[표 4]
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 미카엘리스 상수(Michaelis constant) Km 은 44 mM이었다.
실험 3-3 : 분자량
(1) 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)으로 약 25,000∼35,000 달톤,
(2) 겔 여과법으로 약 110,000∼130,000 달톤 ;
겔 여과법에 의한 분자량이 SDS-PAGE에 의한 분자량보다 약 4배나 많은 것은 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제가 4량체(tetramer)로 존재함을 뜻한다.
실험 3-4 : 등전점 (pI)
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제는 아가로오스 플레이트를 사용한 등전점 전기영동에서의 pH가 약 4.0∼5.5이다.
실험 3-5 : 활성 저해
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 활성은 L-아라비톨과 리비톨에 의해 약간 저해된다.
실험 3-6 : 최적온도
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 최적온도를 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제 활성 측정법에 따라 조사하였다. 도 1에 나온 바와 같이 pH 9.0에서 10분간 유지했을 때의 최적온도는 약 30℃이었다.
실험 3-7 : 최적 pH
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 최적 pH를 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제 활성 측정법에 따라 조사하였다. 도 2에 나온 바와 같이 30℃에서 10분간 유지 했을 때의 최적 pH는 약 8∼9이었다.
도 2에는 시트르산염 완충액(○), 베로날(Veronal)완충액(●) 및 글리신-수산화 나트륨 완충액(△) 을 사용한 시험결과가 각각 나와 있다.
실험 3-8 : 열적 안정성
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 열적 안정성을 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제 활성 측정법에 따라 조사하였다.
도 3에 나온 바와 같이 L-리보오스 이소메라아제는 pH 9.0에서 10분간 유지하였을 때 약 30℃까지 안정하였다.
실험 3-9 : pH 안정성
본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 pH 안정성을 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제 활성 측정법에 따라 조사하였다. 도 4에 나온 바와 같이 이 이소메라아제는 4℃에서 24시간 유지했을때 pH 약 7∼9에서 안정하였다. 도 4에는 시트르산염 완충액(○), 인산 완충액(●), Tris-HCl 완충액 (△) 및 글리신-수산화 나트륨(▲)을 사용한 시험결과가 나와 있다.
이들 데이타에 근거하여 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제의 최적 pH와 pH 안정성은 실질적으로 동일한데, 이것은 이 이소메라아제가 공업적 규모의 생산에 사용할 경우 유리한 특징을 가지고 있음을 뜻한다.
실험 3-10 : N말단 아미노산 서열
실험 2-3의 방법으로 제조한 정제 효소제품을 증류수에 대해 투석하고, 단백질 함유량에 대해 효소 약 80 ㎍을 N말단 아미노산 서열 분석용 샘플로 사용하였다. "PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A"(미합중국의 Applied Biosystems사 판매의 단백질 시
서)를 사용하여 N말단으로부터 5번째 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열을 분석하여 서열번호(SEQ ID NO) : 1에 나타내었다. 상기 샘플을 상세하게 분석한 결과, 이 효소는 N말단 부분 아미노산 서열로서 서열번호(SEQ ID NO) : 2의 아미노산 서열을 가지고 있었다.
아래에 나온 것은 본 발명의 바람직한 실시예이다.
실시예 1 : 알도오스로부터 케토오스의 제조
실험 2의 방법으로 제조한 정제 L-리보오스 이소메라아제를 사용하여 알도오스로부터 케토오스를 제조하였다. 알도오스로서는 L-리보오스, D-릭소오스, D-탈로오스, D-만노오스, L-알로오스 및 L-굴로오스를 사용하였다. 0.05 M 알도오스 용액 10 ml 을 pH 9로 유지하면서 여기에 정제 L-리보오스 이소메라아제를 50 단위 가한 다음 30℃에서 10시간 유지하였다.
이 반응 혼합물을 활성탄으로 처리하고 탈이온 처리한 후 양이온 교환수지 (Ca++)를 사용한 칼럼 크로마토그래피로 분획하였다. 수득한 획분을 소요의 생성물을 함유한 수득한 획분을 감압 농축하여 정제물을 얻었다. 고속액체 크로마토그래피와 박층 크로마토그래피로 분석한 결과, 원료인 알도오스와 생성물인 케토오스 사이의 관계가 표 3의 것과 실질적으로 동일하였음이 판명되었다.
실시예 2 : 케토오스로부터 알도오스의 제조
실험 2의 방법으로 제조한 정제 L-리보오스 이소메라아제를 사용하여 케토오스로부터 알토오스를 제조하였다. 케토오스로서는 L-리블로오스, D-크실룰오스, D-타가토오스, D-프룩토오스, L-프시코오스 및 L-소르보오스를 사용하였다. 0.05 M 케토오스 용액 10 ml 을 pH 9로 유지하면서 여기에 정제 L-리보오스 이소메라아제를 50 단위 가한 다음 30℃에서 10시간 유지하였다.
이 반응 혼합물을 활성탄으로 처리하고 탈이온 처리한 후 양이온 교환수지 (Na+형)를 사용한 칼럼 크로마토그래피로 분획하였다. 소요의 생성물을 함유한 수득한 획분을 감압 농축하여 정제물을 얻었다. 고속액체 크로마토그래피와 박층 크로마토그래피로 분석한 결과, 원료인 케토오스와 생성물인 알도오스 사이의 관계가 표 3의 것과 실질적으로 동일하였음이 판명되었다.
실시예 3 : L-리보오스의 제조
실험 2의 방법에 따라 정제 L-리보오스 이소메라아제 10 단위를 0.1 M L-리불로오스 25 ml에 가한 다음, 30℃에서 15시간 유지하여 L-리불로오스를 L-리보오스로 변환하였다.
이 반응 혼합물을 종래방법으로 활성탄으로 탈색하고 H형 및 CO3형 이온교환수지로 탈염, 정제한 다음, 40℃로 가열된 음이온 교환수지(아황산 수소형)를 사용한 칼럼 크로마토그래피로 분획하여 정제 L-리보오스를 얻었다. 원료인 L-리불로오스에 대한 정제 L-리보오스의 수율은 고형물 기준으로 약 60%이었다. 이 생성물을 음식물, 화장품, 의약품 및 이들 원료에 있어서 감미료, 품질 개량제, 보습제 및 핵산의 복제 억제제로서 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 4 : D-탈로오스의 제조
실험 2의 방법에 따라 정제 L-리보오스 이소메라아제 10 단위를 0.1 M D-타가토오스 50 ml에 가한 다음, 30℃에서 20 시간 유지하여 D-타가토오스를 D-탈로오스로 변환하였다.
이 반응 혼합물을 종래방법으로 활성탄으로 탈색하고 H형 및 CO3형 이온 교환수지로 탈염, 정제한 다음, 양이온 교환수지(Ca++형)를 사용한 칼럼 크로마토그래피로 분획한후, 소요의 생성물을 함유한 획분을 농축하여 D-탈로오스 결정을 얻었다. 원료인 D-타가토오스에 대한 D-탈로오스의 수율은 고형물 기준으로 약 10%이었다. 이 생성물을 음식물, 화장품, 의약품 및 이들 원료에 있어서 감미료, 품질 개량제 및 보습제로서 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 5 : 리비톨로부터 L-리보오스의 제조
트립톤 대두육즙 2 w/v%, 글리세롤 1 w/v% 및 탈염수로 된 영양 배지 100 ml씩을 취해 500 ml용량의 진탕 플라스크 10개에 넣고 이들 플라스크를 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리한 후 냉각하고, 백금이(platinum loop)를 사용하여 글루코노박터 프라테우리이(IFO 3254)의 종배양물을 접종한 다음, 진탕 조건하에 30℃에서 2일간 배양하였다. 배양 종료후 균체를 원심분리하여 채취하고, 5 w/v%리비톨 함유의 0.05 M Tris-HCl 완충액(pH 7.0) 100 ml와 습(濕)생균체(wet alive cell) 약 10 g을 혼합하였다. 이 혼합액 100 ml을 500 ml 용량의 진탕 플라스크중에 가하고 진탕조건하에서 30℃에서 20시간 유지하여 리비톨을 L-리불로오스로 변환하였다. 이어서 이 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고, 수득한 상청액을 종래방법으로 활성탄으로 탈색한후 "DIAION SKIB(H형)" 및 "DIAION WA30(OH형)" (이들은 모두 일본국의 Mitsubishi Chemical사의 양이온 교환수지임)으로 탈염하여 감압농축함으로써 농도 약 60 w/w%의 투명한 시럽을 얻었다. 이 시럽을 "DOWEX 50W-X4"(미합중국의 Dow Chemical사 판매의 Ca++형 양이온 교환수지)를 사용한 칼럼 크로마토그래피로 분획하여 L-리불로오스 고함유 획분을 얻은 다음, 농축하여 농도의 약 70 w/w% 시럽을 얻었다. "MCIGEL CK-08EC"(일본국의 Mitsubishi Chemical 사 판매의 Ca++형 겔) 충전 칼럼(8×300mm)을 사용하여 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석한 결과, 이 생성물중의 L-리불로오스 함유량은 고형물 기준으로 97 w/w%이상이었다. 원료인 리비톨에 대한 L-리불로오스의 수율은 고형물 기준으로 약 90%이었다.
수득한 L-리불로오스를 사용하여 다음과 같이 해서 L-리보오스를 제조하였다. 즉, 실험 1의 방법에 따라 미생물 배양액을 원심분리하여 습균체 약 50 g을 얻어 톨루엔으로 처리하였다. 수득한 균체에 2.5 w/v% 알긴산 나트륨 100 ml을 혼합하였다.
균체를 함유한 슬러리를 자석 교반기로 교반중인 0.1 M CaCl2용액에 적하하여 직경 약 2 ㎜의 겔을 형성하였다.
이들 겔을 여과하여 L-리보오스 이소메라아제 활성이 약 5,000 단위인 고정화 효소를 얻었다. 상기 방법으로 얻은 L-리불로오스 시럽을 약 1.0 M 농도의 용액으로 하기 위해 물로 희석한 다음 여기에 고정화 효소를 L-리불로오스 1 g당 약 50 단위 가하고 pH 8.5 및 10℃에서 15 시간 반응시켜 L-리불로오스를 L-리보오스로 변환시켰다. 고정화 효소를 여과하여 회수하고 여액을 실시예 3과 마찬가지로 탈색, 탈염 및 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획하여 L-리불로오스 고함유 획분을 제거하면서 L-리보오스 고함유 획분을 얻었다. L-리보오스 고함유 획분을 한데 모아 농축하고 교반하면서 씨결정을 가해 결정화하고 분리하여 L-리불로오스 고함유 획분을 제거하면서 L-리보오스 고함유 획분을 얻었다. L-리보오스 고함유 획분을 한데 모아 농축하고, 여기에 교반하면서 씨결정을 가해 L-리보오스를 결정화한 다음 이 혼합물을 분리하여 L-리보오스 결정을 함유하는 고형 제품을 얻었다. 실시예 5와 마찬가지로 HPLC 분석을 한 결과 이 제품의 순도는 약 98 w/w%이었고, 원료인 L-리불로오스에 대한 L-리보오스 결정의 수율은 고형물 기준으로 약 20%이었다. 이 결정을 음식물, 화장품, 의약품 및 이들의 원료에 있어서 감미료, 품질 개량제, 보습제 및 핵산의 복제 억제제로서 사용할 수 있다. 회수된 고정화 효소를 본 발명의 변환반응에서 반복해서 사용할 수 있다. 더욱이 반응 혼합물로부터 분획되어 제거된 L-리보오스 고함유 획분을 L-리보오스 결정의 수율을 증대시키기 위하여 L-리불로오스용 원료로서 유리하게 재사용할 수 있다.
실시예 6 : 리비톨로부터 L-리보오스의 제조
트립톤 대두 육즙 2 w/v%, 글리세롤 1 w/v% 및 물로 된 영양 액체 배지를 100 ml씩을 취하여 500 ml 용량의 진탕 플라스크 두개에 넣고 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리하였다. 이어서 이 플라스크를 냉각하고 여기에 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti)(IFO 3281)의 종배양물을 1 백금이씩 접종한 다음, 진탕조건하에 30℃에서 2일간 배양하여 종배양물을 얻었다. 폴리펩톤 1.1 w/v%, "HINUTE SMP"(일본국의 Fuji Oil사 판매의 식용 대두의 펩티드 용액) 0.2 w/v%, 인산 2수소 칼륨 1.68 w/v%, 글리세린 1 w/v% 및 물로 된 영양 배지 16.8 리터를 30 리터 용량의 자아 퍼멘터에 넣고 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리하여 30℃로 냉각하고 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 7.2로 조정하였다. 이 영양배지에 상기한 종배양물 1 v/v%을 접종하고 30℃에서 22 시간 동안 통기교반하면서 배양한 다음, 여기에 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리된 리비톨 20 kg 함유의 리비톨 수용액 3.2 리터를 혼합하고 통기교반하에 27 시간 동안 교반하여 리비톨을 L-리불로오스로 변환하였다. 이 반응 혼합물을 멤브레인 여과하여 여액을 얻고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 한 결과 이 여액중에는 L-리불로오스를 고형물 기준으로 97 w/v% 이상 함유하고 있었다.
수득한 L-리불로오스를 사용하여, L-리보오스를 다음과 같이 제조하였다. 아시네토박터 칼코아세티쿠스 LR7C (FERM BP-5335)의 종균을 탄소원으로서 D-릭소오스를 함유한 영양배지에 접종하고 30℃에서 4일간 진탕하면서 배양하였다. 이 배양물의 일부를 동일한 신선한 영양배지에 접종하여 2일간 배양하는 계대(繼代) 배양단계를 5회 반복하였다. 이들 계대 배양이 완료한 후 최종 배양물의 일부를 탄소원으로서 D-릭소오스를 함유한 영양 한천 평판의 표면에 접종하고 배양하여 균질의 콜로니를 얻었다. 효모 엑스 0.5 w/v%, 폴리펩톤 0.5 w/v%, 식염 0.5 w/v% 및 물로 된 영양배지를 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리한 영양배지중에 이들 콜로니중의 하나를 종균으로 하여 접종하고 진탕하면서 30℃에서 배양하여 종배양물을 얻었다. 위의 종배양물에 사용된 동일한 신선한 영양배지 15 리터를 30 리터 용량의 자아 퍼어멘터에 넣고 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리한후 30℃로 냉각하고, 여기에 종배양물 1 v/v%을 접종하고 30℃에서 20시간 통기교반하면서 배양하였다. 이어서 이 배양물을 원심분리하여 습균체를 얻고 톨루엔으로 처리한 것을 약 50 g 취하여 습균체 1 g당 1 ml의 체적의 50 mM 글리신 완충액 (pH 9.0)을 가함으로써 L-리보오스 이소메라아제를 128 단위/ml 함유하는 효소액 110 ml을 얻었다. 상기 방법으로 얻은 L-리불로오스 함유의 상기 여액을 수산화 나트륨 수용액을 가하여 pH 9.0으로 조정한후 여기에 염화 망간을 혼합하여 최종 농도를 0.5 mM로 하고, 효소액을 L-리불로오스 1 g당 약 5 단위 혼합하여 30℃에서 24 시간 배양하여 L-리불로오스 약 70%을 L-리보오스로 변환하였다.
수득한 반응 혼합물을 한외 여과기로 여과하고 탈염한후 감압농축하여 농도 약 85 w/w%의 시럽을 약 1.77 kg얻었다. 이 시럽에 에탄올을 가하여 L-리보오스를 결정화하고 이 결정을 분리한 다음 세척, 감압건조 및 분말화하여 고순도 L-리보오스 결정 약 600 g을 얻었다. 실시예 5에 기재된 바와 마찬가지로 HPLC 분석을 한 결과, L-리보오스 결정의 순도는 고형물 기준으로 약 99.9 w/w%이었다. 원료인 리비톨에 대한 L-리보오스 결정의 수율은 약 30%이었다. "GEIGERFLEX RAD-IIB" (일본국의 Rigaku사 판매의 CuKα를 사용하는 X선 회절 분석장치)에 의한 X선 회절분석 결과, 이 L-리보오스 결정의 회절각 (2θ)은 16.3°, 20.1°,21.3°,21.4°및 33.0°이었다. L-리보오스 결정을 음식물, 화장품, 의약품 및 이들의 원료에 있어서 감미료, 품질 개량제, 보습제 또는 핵산의 복제 억제제로서 사용할 수 있다.
이상으로부터 명백한 바와 같이 본 발명의 L-리보오스 이소메라아제는 L-리보오스, D-릭소오스, D-탈로오스, D-만노오스, L-알로오스 및 L-굴로오스에 작용하여 이들을 변환하거나 이성화하여 L-리불로오스, D-크실룰로오스, D-타가토오스, D-프룩토오스, L-프시코오스 및 L-소르보오스를 각각 생성한다. 이 효소반응은 가역 평형 반응이다. 따라서 L-리보오스 이소메라아제를 알도오스류와 케토오스류 사이의 이성화 변환 반응에 사용할 수 있다. L-리보오스 이소메라아제를 비교적 고농도로 정제한후에 그 기질에다 반드시 작용시킬 필요는 없고, L-리보오스 이소메라아제의 미정제물을 희소한 당류의 공업적 제조에 임의로 사용할 수 있다. 본 발명은 용이하게 얻을 수 없었던 희소한 당류를 용이하게 제조할 수 있도록 하므로 음식물, 화장품, 의약품 및 화학공업 분야에 미치는 영향이 클 것으로 기대된다. 따라서 본 발명의 공업적 의의는 헤아릴 수 없다 하겠다.
도 1은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 L-리보오스 이소메라아제의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프.
도 2는 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 L-리보오스 이소메라아제의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 그래프.
도 3은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 L-리보오스 이소메라아제의 열적 안정성을 나타내는 그래프.
도 4는 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 L-리보오스 이소메라아제의 pH 안정성을 나타내는 그래프.
도 5는 본 발명에 의해 얻어지는 고순도 L-리보오스의 결정에 대해 CuKα선을 사용한 분말 X선 회절법을 적용하여 얻은 X선 회절도.
Claims (16)
- L-리보오스를 이성화하여 L-리불로오스를 생성하고, 또한, 반대로 L-리불로오스를 이성화하여 L-리보오스를 생성하는, 아시네토박터속에 속하는 미생물로부터 수득되고 아래의 물리화학적 성질을 가진 L-리보오스 이소메라아제.(1) 분자량도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 25,000 ∼ 35,000 달톤이고 겔 여과법으로 110,000 ∼ 130,000 달톤 ;(2) 최적온도pH 9.0에서 10분간 유지했을 때 30℃;(3) 최적 pH30℃에서 10분간 유지 했을 때 pH 8 ∼ 9;(4) 열적 안정성pH 9.0에서 10분간 유지하였을 때 30℃의 온도까지 안정;(5) pH 안정성4℃에서 24시간 유지했을때 pH 7 ∼ 9에서 안정.(6) 아래의 서열번호 (SEQ ID NO) : 1의 부분 아미노산 서열을 가짐.서열번호 (SEQ ID NO) : 1 :Thr Arg Thr Ser Ile
- 청구항 1에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) LR7C (FERM BP-5335) 및 그 변이주에서 유래하는 L-리보오스 이소메라아제.
- L-리보오스 이소메라아제 산생능이 있는, 아시네토박터속에 속하는 미생물을 영양배지에서 배양하여 L-리보오스 이소메라아제를 생성시키고, 생성된 L-리보오스 이소메라아제를 배양액으로부터 채취하는 청구항 1의 L-리보오스 이소메라아제의 제조방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 미생물은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 LR7C (FERM BP-5335) 및 그 변이주인 제조방법.
- L-리보오스, D-릭소오스, D-탈로오스, D-만노오스, L-알로오스 및 L-굴로오스로 된 군으로부터 선택되는 1종의 알도오스에 청구항 1의 L-리보오스 이소메라아제를 접촉시켜 상기 알도오스에 각각 상응한 상기 케토오스를 각각 생성시키고, 생성된 케토오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 케토오스의 제조방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 L-리보오스 이소메라아제는 L-리보오스 이소메라아제 산생능이 있는 미생물을 톨루엔으로 처리하여 얻은 것들과 고정화 효소 형태의 것들로 된 군으로부터 선택되는 1종인 제조방법.
- 청구항 5에 있어서, 채취단계는 여과, 원심분리, 탈색, 탈염, 농축, 건조, 칼럼 크로마토그래피, 결정화 및 분리로 된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 기술인 제조방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 칼럼 크로마토그래피는 이온교환 수지를 사용하는 제조방법.
- L-리불로오스, D-크실룰로오스, D-타가토오스, D-프룩토오스, L-프시코오스 및 L-소르보오스로 된 군으로부터 선택되는 1종의 케토오스에 청구항 1의 L-리보오스 이소메라아제를 접촉시켜 L-리보오스, D-릭소오스, D-탈로오스, D-만노오스, L-알로오스 및 L-굴로오스로 된 군으로부터 선택되는 알도오스에 각각 상응한 1종의 알도오스를 생성시키고, 생성된 알도오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 알도오스의 제조방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 L-리보오스 이소메라아제는 L-리보오스 이소메라아제 산생능이 있는 미생물을 톨루엔으로 처리하여 얻은 것들과 고정화 효소 형태의 것들로 된 군으로부터 선택되는 1종인 제조방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 L-리불로오스는 글루코노박터(Gluconobacter)속과 아세토박터(Acetobacter)속의 것들로 된 군으로부터 선택되는 미생물을 사용하여 리비톨을 산화시켜 수득되는 제조방법.
- 청구항 9에 있어서, 채취단계는 여과, 원심분리, 탈색, 탈염, 농축, 건조, 칼럼 크로마토그래피, 결정화 및 분리로 된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 기술인 제조방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 칼럼 크로마토그래피는 이온교환 수지를 사용하는 제조방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 L-리보오스는 주회절각(2θ)으로서 16.3°, 20.1°, 21.3°, 21.4°및 33°을 나타내는 L-리보오스 결정인 제조방법.
- 청구항 1의 L-리보오스 이소메라아제를, L-리보오스, D-릭소오스, D-탈로오스, D-만노오스, L-알로오스 및 L-굴로오스로 된 군으로부터 선택되는 1종의 알도오스와 접촉시켜 상기 알도오스를 이성화하여 L-리불로오스, D-크실룰로오스, D-타가토오스, D-프룩토오스, L-프시코오스 및 L-소르보오스로 된 군으로부터 선택되는 각기 상응한 케토오스로 변환하거나, 또는 L-리불로오스, D-크실룰로오스, D-타가토오스, D-프룩토오스, L-프시코오스 및 L-소르보오스로 된 군으로부터 선택되는 케토오스와 접촉시켜 상기 케토오스를 이성화하여 L-리보오스, D-릭소오스, D-탈로오스, D-만노오스, L-알로오스 및 L-굴로오스로 된 군으로부터 선택되는 각기 상응한 알도오스로 변환하는 것을 특징으로 하는 알도오스와 케토오스 사이의 변환방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 L-리보오스 이소메라아제는 L-리보오스 이소메라아제 산생능이 있는 미생물을 톨루엔으로 처리하여 얻은 것들과 고정화 효소 형태의 것들로 된 군으로부터 선택되는 1종인 변환방법.
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