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JP7094963B2 - Ｈｓｄ１７ｂ１３バリアントおよびその使用 - Google Patents

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JP7094963B2
JP7094963B2 JP2019539270A JP2019539270A JP7094963B2 JP 7094963 B2 JP7094963 B2 JP 7094963B2 JP 2019539270 A JP2019539270 A JP 2019539270A JP 2019539270 A JP2019539270 A JP 2019539270A JP 7094963 B2 JP7094963 B2 JP 7094963B2
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ノウラ エス． アブール－フスン，
オムリ ゴッテスマン，
アレクサンダー リー，
シーピン チェン，
ユーロン シン，
エヴァンゲロス ペファニス，
スザンヌ ハートフォード，
ジェスパー グロマダ，
フレデリック イー． デューイ，
アリス バラス，
アラン シュルダイナー，
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１月２３日に出願された米国出願第６２／４４９，３３５号、２０１７年３月１７日に出願された米国出願第６２／４７２，９７２号、および２０１７年１１月６日に出願された米国出願第６２／５８１，９１８号の利益を主張し、これらの文献それぞれの全体が、全ての目的のために参照によって本明細書において援用される。
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイル５０７２４２ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載された配列表は５０７キロバイトであり、２０１８年１月１９日に作成され、これにより参照により組み込まれる。
背景
慢性肝疾患および肝硬変は、米国における罹患率および死亡率の主な原因であり、２０１４年には３８，１７０件の死亡（全死亡の１．５％）の原因となった（Kochanekら（２０１６年）Natl Vital Stat Rep、６５巻：１～１２２頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。米国における肝硬変の最も一般的な病因は、アルコール性肝疾患、慢性Ｃ型肝炎、および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であり、合わせて、２００４年から２０１３年の間に肝移植を待つ患者の約８０％を占めた（Wongら（２０１５年）Gastroenterology、１４８巻：５４７～５５５頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。米国におけるＮＡＦＬＤの推定有病率は１９～４６パーセントの間であり（Browningら（２００４年）Hepatology、４０巻：１３８７～１３９５頁；Lazoら（２０１３年）Am J Epidemiol、１７８巻：３８～４５頁；およびWilliamsら（２０１１年）Gastroenterology、１４０巻：１２４～１３１頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、おそらく、その主な危険因子である肥満症の率の上昇と併せて（Cohenら（２０１１年）Science、３３２巻：１５１９～１５２３頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、経時的に上昇している（Younossiら（２０１１年）Clin Gastroenterol Hepatol、９巻：５２４～５３０頁 ｅ１；ｑｕｉｚ ｅ６０（２０１１年）、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｃ型肝炎の処置は著しく進歩しているが（Morganら（２０１３年）Ann Intern Med、１５８巻：３２９～３３７頁およびvan der Meerら（２０１２年）JAMA、３０８巻：２５８４～２５９３頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、現在のところアルコール性または非アルコール性肝疾患および肝硬変に対する証拠に基づく処置は存在しない。
以前のゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、限られた数の、慢性肝疾患に関連する遺伝子およびバリアントが同定されている。現在までに最もしっかりと検証された遺伝的関連は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３遺伝子（ＰＮＰＬＡ３ ｐ．Ｉｌｅ１４８Ｍｅｔ、ｒｓ７３８４０９）における共通のミスセンスバリアントに関するものであり、これは、最初に非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）のリスクの上昇に関連することが見出され（Romeoら（２００８年）Nat. Genet.、４０巻：１４６１～１４６５頁およびSpeliotesら（２０１１年）PLoS Genet.、７巻：ｅ１００１３２４頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、続いて、疾患の重症度（Rotmanら（２０１０年）Hepatology、５２巻：８９４～９０３頁およびSookoianら（２００９年）J. Lipid Res.、５０巻：２１１１～２１１６頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）および進行（Trepoら（２０１６年）J. Hepatol. doi:10.1016/j.jhep.2016.03.011、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に関連することが見出された。膜貫通６スーパーファミリーメンバー２（ＴＭ６ＳＦ２）遺伝子の変化によりＮＡＦＬＤのリスクの上昇が付与されることも示されている（Kozlitinaら（２０１４年）Nat. Genet.、４６巻：３５２～３５６頁；Liuら（２０１４年）Nat. Commun. ５巻：４３０９頁；およびSookoianら（２０１５年）Hepatology、６１巻：５１５～５２５頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの２種のタンパク質の正常な機能は十分には理解されていないにもかかわらず、どちらも、肝細胞の脂質代謝に関与することが提唱されてきた。ＰＮＰＬＡ３およびＴＭ６ＳＦ２のバリアントが肝疾患のリスクの上昇にどのように寄与するかはまだ解明されていない。ＧＷＡＳにより、臨床的に頻繁に測定される肝細胞傷害および肝臓脂肪蓄積の定量的マーカーである血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）に関連する遺伝因子もいくつか同定された（Chambersら（２０１１年）Nat. Genet.、４３巻：１３１～１１３８頁およびYuanら（２００８年）Am. J. Hum. Genet.、８３巻：５２０～５２８頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。現在まで、慢性肝疾患に対する保護的遺伝子バリアントは記載されていない。心血管疾患のリスクを低下させるＰＣＳＫ９の機能喪失型バリアントなどの他の状況での保護的遺伝子バリアントの発見が、新しいクラスの治療薬を開発するための促進要因になっている。
慢性肝疾患の発症および進行の基礎をなす遺伝因子に関する知見により、リスク層別化を改善し、新規の治療戦略の土台をもたらすことができた。肝疾患に関するリスク層別化を改善し、新規の治療法を生じさせるためには、基礎をなす遺伝因子のよりよい理解が必要である。
Kochanekら（２０１６年）Natl Vital Stat Rep、６５巻：１～１２２頁 Wongら（２０１５年）Gastroenterology、１４８巻：５４７～５５５頁 Browningら（２００４年）Hepatology、４０巻：１３８７～１３９５頁 Lazoら（２０１３年）Am J Epidemiol、１７８巻：３８～４５頁 Williamsら（２０１１年）Gastroenterology、１４０巻：１２４～１３１頁 Cohenら（２０１１年）Science、３３２巻：１５１９～１５２３頁 Younossiら（２０１１年）Clin Gastroenterol Hepatol、９巻：５２４～５３０頁 Morganら（２０１３年）Ann Intern Med、１５８巻：３２９～３３７頁 van der Meerら（２０１２年）JAMA、３０８巻：２５８４～２５９３頁 Romeoら（２００８年）Nat. Genet.、４０巻：１４６１～１４６５頁 Speliotesら（２０１１年）PLoS Genet.、７巻：ｅ１００１３２４頁 Rotmanら（２０１０年）Hepatology、５２巻：８９４～９０３頁 Sookoianら（２００９年）J. Lipid Res.、５０巻：２１１１～２１１６頁 Trepoら（２０１６年）J. Hepatol. doi:10.1016/j.jhep.2016.03.011 Kozlitinaら（２０１４年）Nat. Genet.、４６巻：３５２～３５６頁 Liuら（２０１４年）Nat. Commun. ５巻：４３０９頁 Sookoianら（２０１５年）Hepatology、６１巻：５１５～５２５頁 Chambersら（２０１１年）Nat. Genet.、４３巻：１３１～１１３８頁 Yuanら（２００８年）Am. J. Hum. Genet.、８３巻：５２０～５２８頁
概要
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子、バリアントＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物、およびバリアントＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質アイソフォームに関する方法および組成物が提供される。
一態様では、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子由来の突然変異体残基を含む単離された核酸が提供される。そのような単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含み得、配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間にチミンが挿入されている。必要に応じて必要に応じて、連続したヌクレオチドは、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位を含む配列番号２の対応する配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。必要に応じて必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子である。必要に応じて必要に応じて、単離された核酸は、配列番号２の少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも６０００個、少なくとも７０００個、少なくとも８０００個、少なくとも９０００個、少なくとも１００００個、少なくとも１１０００個、少なくとも１２０００個、少なくとも１３０００個、少なくとも１４０００個、少なくとも１５０００個、少なくとも１６０００個、少なくとも１７０００個、少なくとも１８０００個、または少なくとも１９０００個連続したヌクレオチドを含む。
一部のそのような単離された核酸は、遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子を含む。必要に応じて必要に応じて、欠失したセグメントは、１つまたは複数のイントロン配列を含む。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のイントロン６に対応するイントロンをさらに含む。必要に応じて、イントロンは、配列番号２のイントロン６である。
別の態様では、異なるＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡ転写産物またはｃＤＮＡに対応する単離された核酸が提供される。一部のそのような単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含み、ここで、連続した核酸は、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）、配列番号１０（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｇ）、および配列番号１１（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントを含む。必要に応じて、連続したヌクレオチドは、配列番号１１（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）には存在しない、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントをさらに含み、連続したヌクレオチドは、配列番号１０（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｇ）には存在しない、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントをさらに含む。必要に応じて、連続したヌクレオチドは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）には存在しない、配列番号１１（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントをさらに含む。必要に応じて、連続したヌクレオチドは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）には存在しない、配列番号１０（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｇ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントをさらに含む。
一部のそのような単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含み、ここで、連続したヌクレオチドは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号８（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｅ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントを含む。必要に応じて、連続したヌクレオチドは、配列番号１１（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）には存在しない、配列番号８（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｅ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントをさらに含む。
一部そのような単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含み、ここで、連続したヌクレオチドは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号９（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｆ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントを含む。
一部のそのような単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含み、ここで、連続したヌクレオチドは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号６（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントを含む。
必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質は、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質である。必要に応じて、単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、または少なくとも２０００個連続したヌクレオチドを含む。
一部のそのような単離された核酸は、配列番号６、７、８、９、１０、または１１に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含み、それぞれ配列番号１４、１５、１６、１７、１８、または１９に記載の配列を含むＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨ）をコードする。
上記の核酸のいずれかでは、連続したヌクレオチドは、必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の少なくとも２つの異なるエクソンに由来する配列を、イントロンの介在を伴わずに含み得る。
別の態様では、上記の単離された核酸のいずれかによってコードされるタンパク質が提供される。
別の態様では、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子由来の突然変異体残基とハイブリダイズするか、またはそれに近づく単離された核酸が提供される。そのような単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むまたはその位置から１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内であるセグメントでハイブリダイズする少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含み得る。必要に応じて、セグメントは、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の対応する配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。必要に応じて、セグメントは、配列番号２の少なくとも２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、または２０００個連続したヌクレオチドを含む。必要に応じて、セグメントは、配列番号２の１２６６６位または配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子である。必要に応じて、単離された核酸は、最大で約３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチドまでの長さである。必要に応じて、単離された核酸は、異種核酸と連結しているか、または異種標識を含む。必要に応じて、異種標識は蛍光標識である。
別の態様では、異なるＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡ転写産物またはｃＤＮＡとハイブリダイズする単離された核酸が提供される。一部のそのような単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズし、ここで、連続したヌクレオチドは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）、配列番号１０（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｇ）、および配列番号１１（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントを含む。
一部のそのような単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズし、ここで、連続したヌクレオチドは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号８（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｅ）および配列番号１１（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるセグメントを含む。
一部のそのような単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズし、ここで、連続したヌクレオチドは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号９（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｆ）内のセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるセグメントを含む。
一部のそのような単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズし、ここで、連続したヌクレオチドは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号６（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ）に存在するセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるセグメントを含む。
必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質は、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質である。必要に応じて、単離された核酸は、最大で約３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチドまでの長さである。必要に応じて、単離された核酸は、異種核酸と連結しているか、または異種標識を含む。必要に応じて、異種標識は蛍光標識である。
必要に応じて、上記の単離された核酸のいずれかは、ＤＮＡを含む。必要に応じて、上記の単離された核酸のいずれかは、ＲＮＡを含む。必要に応じて、上記の単離された核酸のいずれかは、アンチセンスＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、または低分子干渉ＲＮＡである。必要に応じて、上記の単離された核酸のいずれかは、非天然ヌクレオチドを含み得る。
別の態様では、上記の単離された核酸のいずれかおよび異種核酸配列を含むベクターおよび外因性ドナー配列が提供される。
別の態様では、上記の単離された核酸のいずれか、ベクター、または外因性ドナー配列の、対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントを検出する方法、対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨの存在を検出する方法、対象の慢性肝疾患の発症のさせやすさを決定する方法、対象を脂肪性肝疾患と診断する方法、または細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変する方法、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するための方法における使用が提供される。
別の態様では、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが提供される。そのようなガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に結合させるかまたはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するようにＣａｓ酵素を方向付けるのに有効であり得、ここで、ガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列とハイブリダイズするＤＮＡ標的化セグメントを含む。すなわち、そのようなガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に結合させるかまたはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するようにＣａｓ酵素を方向付けるのに有効であり得、ここで、ガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含む。そのようなガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に結合させるかまたはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するようにＣａｓ酵素を方向付けるのに有効であり得、ここで、ガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接しているＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含む。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２２６～２３９および２６４～２６８のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号１６２９～１６４２および１６４８～１６５２のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡは、配列番号７０６～７１９；９３６～９４９；１１６６～１１７９、１３９６～１４０９、７２５～７２９、９５５～９５９、１１８５～１１８９、および１４１５～１４１９のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２２６～２３９または配列番号２３０および２３１から選択される。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２２６～２３０および２６４～２６８から選択される。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６に対応する領域内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６および／またはエクソン７に対応する領域内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置から約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含む。
そのようなガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に結合させるかまたはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するようにＣａｓ酵素を方向付けるのに有効であり得、ここで、ガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むかまたはそれに近接しているＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含む。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２０～８１および２５９～２６３のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号１４２３～１４８４および１６４３～１６４７のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡは、配列番号５００～５６１、７３０～７９１、９６０～１０２１、１１９０～１２５１、７２０～７２４、９５０～９５４、１１８０～１１８４、および１４１０～１４１４のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２０～８１および２５９～２６３から選択される。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２１～２３、３３、および３５から選択される。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号３３および３５から選択される。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン１に対応する領域内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、開始コドンから約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内である。
そのようなガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に結合させるかまたはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するようにＣａｓ酵素を方向付けるのに有効であり得、ここで、ガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の終止コドンを含むかまたはそれに近接しているＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含む。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号８２～２２５のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号１４８５～１６２８のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡは、配列番号５６２～７０５、７９２～９３５、１０２２～１１６５、および１２５２～１３９５のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号８２～２２５から選択される。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン７に対応する領域内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、終止コドンから約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内である。
必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子である。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、配列番号２を含む。
一部のそのようなガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントを含むクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。必要に応じて、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが互いにハイブリダイズする別々の分子であるモジュラーガイドＲＮＡである。必要に応じて、ｃｒＲＮＡは、配列番号１４２１に記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号１４２２に記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡとリンカーを介して融合している単一ガイドＲＮＡである。必要に応じて、単一ガイドＲＮＡは、配列番号１４２０および２５６～２５８のいずれか１つに記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
別の態様では、本明細書に開示されるＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物内の配列とハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡが提供される。一部のそのようなアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）内の配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減し得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）には存在しない、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）に存在する配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン７内の配列またはエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする。一部のそのようなアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）内の配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄの発現を低減し得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）に存在する配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）のエクソン７内の配列またはエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする。
別の態様では、上記のガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡが提供される。別の態様では、上記のガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡおよび異種核酸を含むベクターが提供される。別の態様では、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変する方法または細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するための方法における、上記のガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｓｈＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターのいずれかの使用が提供される。
別の態様では、上記の単離された核酸のいずれか、上記のガイドＲＮＡのいずれか、上記の単離されたポリペプチドのいずれか、上記のアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｓｈＲＮＡのいずれか、上記のベクターのいずれか、または上記の外因性ドナー配列のいずれかを含む組成物が提供される。必要に応じて、組成物は、上記のガイドＲＮＡのいずれかおよびＣａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質を含む。必要に応じて、そのような組成物は、単離されたポリペプチド、ガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、単離された核酸、ベクター、または外因性ドナー配列の安定性を増大させる担体を含む。必要に応じて、担体は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート（ｌｉｐｉｄ ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、または脂質微小管（ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）を含む。
上記の単離された核酸のいずれか、上記のガイドＲＮＡのいずれか、上記のアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｓｈＲＮＡのいずれか、上記の単離されたポリペプチドのいずれか、または上記のベクターのいずれかを含む細胞も提供される。必要に応じて、細胞は、ヒト細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、またはラット細胞である。必要に応じて、上記の細胞のいずれかは、肝細胞または多能性細胞である。
細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変する方法または細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するための方法における上記のガイドＲＮＡのいずれかの使用も提供される。細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するための方法における上記のアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡのいずれかの使用も提供される。
細胞を改変するか、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変するか、またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更する方法も提供される。一部のそのような方法は、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変するためのものであり、細胞のゲノムを、（ａ）Ｃａｓタンパク質；および（ｂ）Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするガイドＲＮＡであって、ガイドＲＮＡ標的配列が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、ガイドＲＮＡと接触させるステップを含み、Ｃａｓタンパク質が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断する。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２２６～２３９および２６４～２６８のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号１６２９～１６４２および１６４８～１６５２のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡは、配列番号７０６～７１９；９３６～９４９；１１６６～１１７９、１３９６～１４０９、７２５～７２９、９５５～９５９、１１８５～１１８９、および１４１５～１４１９のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２２６～２３９から選択されるか、または、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２３０および２３１から選択される。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２２６～２３９および２６４～２６８から選択されるか、または配列番号２６４～２６８から選択される。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６に対応する領域内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６および／またはエクソン７に対応する領域内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置から約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含む。
一部のそのような方法は、ゲノムを、配列番号２の１２６６６位に対応する位置の５’側の標的配列とハイブリダイズする５’相同アームおよび配列番号２の１２６６６位に対応する位置の３’側の標的配列とハイブリダイズする３’相同アームを含む外因性ドナー配列と接触させるステップをさらに含み、外因性ドナー配列がＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられる。必要に応じて、外因性ドナー配列は、５’相同アームと３’相同アームに挟まれた核酸挿入物をさらに含む。必要に応じて、核酸挿入物はチミンを含み、外因性ドナー配列がＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられると、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間にチミンが挿入される。必要に応じて、外因性ドナー配列は、約５０ヌクレオチド～約１ｋｂの長さまたは約８０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドの長さである。必要に応じて、外因性ドナー配列は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。
一部のそのような方法は、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変するためのものであり、細胞のゲノムを、（ａ）Ｃａｓタンパク質；および（ｂ）Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第１のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする第１のガイドＲＮＡであって、第１のガイドＲＮＡ標的配列が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むか、または開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号２０～８１から選択されるか、または配列番号２０～８１および２５９～２６３から選択される第１のガイドＲＮＡと接触させるステップを含み、Ｃａｓタンパク質が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するか、またはその発現を変更する。必要に応じて、第１のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２０～８１および２５９～２６３のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、第１のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２０～４１のいずれか１つ、配列番号２１～２３、３３、および３５のいずれか１つ、または配列番号３３および３５のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、第１のガイドＲＮＡは、配列番号１４２３～１４８４および１６４３～１６４７のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、第１のガイドＲＮＡは、配列番号１４４７～１４６８のいずれか１つ、配列番号１４４８～１４５０、１４６０、および１４６２のいずれか１つ；または配列番号１４６０および１４６２のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、第１のガイドＲＮＡは、配列番号５００～５６１、７３０～７９１、９６０～１０２１、１１９０～１２５１、７２０～７２４、９５０～９５４、１１８０～１１８４、および１４１０～１４１４のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、第１のガイドＲＮＡは、配列番号５２４～５４５、７５４～７７５、９８４～１００５、および１２１４～１２３５のいずれか１つ、または配列番号２９５～２９７、５２５～５２７、７５５～７５７、９８５～９８７、１２１５～１２１７、３０７、３０９、５３７、５３９、７６７、７６９、９９７、９９９、１２２７、および１２２９のいずれか１つ、または配列番号３０７、３０９、５３７、５３９、７６７、７６９、９９７、９９９、１２２７、および１２２９のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、第１のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２０～４１から選択されるか、配列番号２１～２３、３３、および３５から選択されるか、または配列番号３３および３５から選択される。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓタンパク質である。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、転写活性化ドメインと融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質または転写リプレッサードメインと融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質である。
一部のそのような方法は、細胞のゲノムを、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする第２のガイドＲＮＡであって、第２のガイドＲＮＡ標的配列がＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の終止コドンを含むか、または終止コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号８２～２２５から選択される第２のガイドＲＮＡと接触させるステップをさらに含み、ここで、細胞は、第１のガイドＲＮＡ標的配列と第２のガイドＲＮＡ標的配列との間に欠失を含むように改変されている。必要に応じて、第２のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号８２～２２５のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、第２のガイドＲＮＡは、配列番号１４８５～１６２８のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、第２のガイドＲＮＡは、配列番号５６２～７０５、７９２～９３５、１０２２～１１６５、および１２５２～１３９５のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
一部のそのような方法は、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を低減するか、または細胞内の特定のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物（例えば、転写産物Ａもしくは転写産物Ｄ）の発現を低減するためのものである。一部のそのような方法は、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を低減するためのものであり、細胞のゲノムを、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン７内の配列とハイブリダイズし、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡと接触させるステップを含む。一部のそのような方法は、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を低減するためのものであり、細胞のゲノムを、本明細書に開示されるＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物内の配列とハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡと接触させるステップを含む。一部のそのような方法では、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）内の配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減し得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）には存在しない、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）に存在する配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン７内の配列またはエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする。一部のそのような方法では、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）内の配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄの発現を低減し得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）に存在する配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）のエクソン７内の配列またはエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする。
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変するか、またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するための上記の方法のいずれかでは、方法は、細胞に発現ベクターを導入するステップをさらに含み得、発現ベクターは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む。必要に応じて、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、ヒト遺伝子である。必要に応じて、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子である。必要に応じて、欠失したセグメントは、１つまたは複数のイントロン配列を含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子は、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のイントロン６に対応するイントロンを含む。
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変するか、またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するための上記の方法のいずれかでは、方法は、細胞に発現ベクターを導入するステップをさらに含み得、発現ベクターは、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸は、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変するか、またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するための上記の方法のいずれかでは、方法は、細胞にＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を導入するステップをさらに含み得る。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片は、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
一部のそのような方法は、細胞を改変するためのものであり、細胞に発現ベクターを導入するステップを含み、ここで、発現ベクターは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む。必要に応じて、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、ヒト遺伝子である。必要に応じて、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子である。必要に応じて、欠失したセグメントは、１つまたは複数のイントロン配列を含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子は、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のイントロン６に対応するイントロンを含む。
一部のそのような方法は、細胞を改変するためのものであり、細胞に発現ベクターを導入するステップを含み、ここで、発現ベクターは、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸は、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
一部のそのような方法は、細胞を改変するためのものであり、細胞にＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を導入するステップを含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片は、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
細胞を改変するか、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変するか、またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更する上記の方法のいずれかでは、細胞は、ヒト細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、またはラット細胞であってよい。細胞はいずれも、多能性細胞または分化細胞であってよい。細胞はいずれも、肝細胞であってよい。細胞を改変するか、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変するか、またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更する上記の方法のいずれかでは、方法または細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるものであってもｉｎ ｖｉｖｏにおけるものであってもよい。上記の方法のいずれかに使用されるガイドＲＮＡは、互いにハイブリダイズする別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含むモジュラーガイドＲＮＡであってもよく、ｃｒＲＮＡ部分がｔｒａｃｒＲＮＡ部分と融合した（例えば、リンカーによって）単一ガイドＲＮＡであってもよい。
別の態様では、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法が提供される。別の態様では、アルコール性または非アルコール性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法が提供される。そのような対象は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではない対象またはホモ接合体ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではない対象であってよい。一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、対象に、（ａ）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸；（ｂ）ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸であって、ガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、ガイドＲＮＡ標的配列が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸；および（ｃ）配列番号２の１２６６６位に対応する位置の５’側の標的配列とハイブリダイズする５’相同アーム、配列番号２の１２６６６位に対応する位置の３’側の標的配列とハイブリダイズする３’相同アーム、および５’相同アームと３’相同アームに挟まれたチミンを含む核酸挿入物を含む外因性ドナー配列を導入するステップを含み、Ｃａｓタンパク質が、対象の肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断し、外因性ドナー配列が、肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられ、外因性ドナー配列がＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられると、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間にチミンが挿入される、方法を含む。
必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２２６～２３９から選択されるか、または、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２３０および２３１から選択される。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２２６～２３９および２６４～２６８から選択される。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６に対応する領域内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６および／またはエクソン７に対応する領域内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置から約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内である。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含む。
必要に応じて、外因性ドナー配列は、約５０ヌクレオチド～約１ｋｂの長さである。必要に応じて、外因性ドナー配列は、約８０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドの長さである。必要に応じて、外因性ドナー配列は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。
一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、対象に、（ａ）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸；（ｂ）第１のガイドＲＮＡまたは第１のガイドＲＮＡをコードする核酸であって、第１のガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第１のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、第１のガイドＲＮＡ標的配列が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むか、または開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号２０～８１から選択されるかまたは配列番号２０～８１および２５９～２６３から選択される、第１のガイドＲＮＡまたは第１のガイドＲＮＡをコードする核酸；および（ｃ）組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む発現ベクターを導入するステップを含み、Ｃａｓタンパク質が、対象の肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するか、またはその発現を変更し、発現ベクターが、対象の肝細胞内で組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現する、方法を含む。一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、対象に、（ａ）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸；（ｂ）第１のガイドＲＮＡまたは第１のガイドＲＮＡをコードする核酸であって、第１のガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第１のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、第１のガイドＲＮＡ標的配列が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むか、または開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号２０～８１から選択されるかまたは配列番号２０～８１および２５９～２６３から選択される、第１のガイドＲＮＡまたは第１のガイドＲＮＡをコードする核酸；および必要に応じて（ｃ）組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む発現ベクターを導入するステップを含み、Ｃａｓタンパク質が、対象の肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するか、またはその発現を変更し、発現ベクターが、対象の肝細胞内で組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現する、方法を含む。
必要に応じて、第１のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２０～４１から選択されるか、配列番号２１～２３、３３、および３５から選択されるか、または配列番号３３および３５から選択される。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓタンパク質である。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、転写リプレッサードメインと融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質である。
そのような方法は、対象に第２のガイドＲＮＡを導入するステップをさらに含み得、ここで、第２のガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、第２のガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の終止コドンを含むか、または終止コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号８２～２２５から選択され、Ｃａｓタンパク質は、肝細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を第１のガイドＲＮＡ標的配列内および第２のガイドＲＮＡ標的配列内の両方で切断し、肝細胞は、第１のガイドＲＮＡ標的配列と第２のガイドＲＮＡ標的配列との間に欠失を含むように改変されている。
必要に応じて、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子である。必要に応じて、欠失したセグメントは、１つまたは複数のイントロン配列を含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子は、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のイントロン６に対応するイントロンを含む。
上記の治療または予防方法のいずれかでは、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。上記の治療または予防方法のいずれかでは、対象は、ヒトであり得る。上記の治療または予防方法のいずれかでは、慢性肝疾患は、脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患（alcoholic liver fatty liver disease）、肝硬変、または肝細胞癌であり得る。同様に、上記の方法のいずれかでは、治療または予防方法は、アルコール性肝疾患または非アルコール性肝疾患である肝疾患に対するものであり得る。
一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、対象に、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン７内の配列またはエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズし、対象の肝細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを導入するステップを含む方法を含む。一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、対象に、本明細書に開示されるＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物内の配列とハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを導入するステップを含む方法を含む。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）内の配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減し得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）には存在しない、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）に存在する配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン７内の配列またはエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする。
必要に応じて、そのような方法は、対象に発現ベクターを導入するステップをさらに含み、発現ベクターは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含み、発現ベクターが、対象の肝細胞内で組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現する。
必要に応じて、そのような方法は、対象に発現ベクターを導入するステップをさらに含み、発現ベクターは、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を含み、発現ベクターが、対象の肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を発現する。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸は、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
必要に応じて、そのような方法は、対象にメッセンジャーＲＮＡを導入するステップをさらに含み、メッセンジャーＲＮＡが、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードし、ｍＲＮＡが、対象の肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質を発現する。必要に応じて、メッセンジャーＲＮＡから逆転写された相補ＤＮＡは、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
必要に応じて、そのような方法は、対象にＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を導入するステップをさらに含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片は、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、対象に発現ベクターを導入するステップを含み、発現ベクターが、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含み、発現ベクターが、対象の肝細胞内で組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現する、方法を含む。
上記の方法のいずれかでは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、ヒト遺伝子であり得る。上記の方法のいずれかでは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であってよい。上記の方法のいずれかでは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子であり得る。必要に応じて、欠失したセグメントは、１つまたは複数のイントロン配列を含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子は、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のイントロン６に対応するイントロンを含む。
一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、対象に発現ベクターを導入するステップを含み、発現ベクターが、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を含み、発現ベクターが、対象の肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を発現する、方法を含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸は、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、対象にメッセンジャーＲＮＡを導入するステップを含み、メッセンジャーＲＮＡが、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードし、ｍＲＮＡが、対象の肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質を発現する、方法を含む。必要に応じて、メッセンジャーＲＮＡから逆転写された相補ＤＮＡは、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、対象の肝臓にＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を導入するステップを含む方法を含む。必要に応じて、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片は、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
上記の方法のいずれかでは、対象は、ヒトであり得る。上記の方法のいずれかでは、慢性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変、または肝細胞癌であり得る。同様に、上記の方法のいずれかでは、治療または予防方法は、アルコール性肝疾患または非アルコール性肝疾患である肝疾患に対するものであり得る。上記の方法のいずれかでは、対象に導入するステップは、流体力学的送達、ウイルス媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または静脈内注入を含み得る。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に結合させるかまたはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するようにＣａｓ酵素を方向付けるのに有効なガイドＲＮＡであって、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含む、ガイドＲＮＡ。
（項目２）
前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、項目１に記載のガイドＲＮＡ。
（項目３）
（ａ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２２６～２３９および２６４～２６８のいずれか１つを含み、かつ／または
（ｂ）前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号１６２９～１６４２および１６４８～１６５２のいずれか１つを含み、かつ／または
（ｃ）前記ガイドＲＮＡが、配列番号７０６～７１９；９３６～９４９；１１６６～１１７９、１３９６～１４０９、７２５～７２９、９５５～９５９、１１８５～１１８９、および１４１５～１４１９のいずれか１つを含む、項目２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目４）
（ａ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６および／またはエクソン７に対応する領域内であり、かつ／または
（ｂ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置から約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内であり、必要に応じて、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含む、項目２または３に記載のガイドＲＮＡ。
（項目５）
前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むかまたはそれに近接している、項目１に記載のガイドＲＮＡ。
（項目６）
（ａ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０～８１および２５９～２６３のいずれか１つを含み、かつ／または
（ｂ）前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号１４２３～１４８４および１６４３～１６４７のいずれか１つを含み、かつ／または
（ｃ）前記ガイドＲＮＡが、配列番号５００～５６１、７３０～７９１、９６０～１０２１、１１９０～１２５１、７２０～７２４、９５０～９５４、１１８０～１１８４、および１４１０～１４１４のいずれか１つを含む、項目５に記載のガイドＲＮＡ。
（項目７）
（ａ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン１に対応する領域内であり、かつ／または
（ｂ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記開始コドンから約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内である、項目５または６に記載のガイドＲＮＡ。
（項目８）
前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の終止コドンを含むかまたはそれに近接している、項目１に記載のガイドＲＮＡ。
（項目９）
（ａ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号８２～２２５のいずれか１つを含み、かつ／または
（ｂ）前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号１４８５～１６２８のいずれか１つを含み、かつ／または
（ｃ）前記ガイドＲＮＡが、配列番号５６２～７０５、７９２～９３５、１０２２～１１６５、および１２５２～１３９５のいずれか１つを含む、項目８に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１０）
（ａ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン７に対応する領域内であり、かつ／または
（ｂ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、終止コドンから約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内である、項目８または９に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１１）
前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子またはマウスＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子であり、必要に応じて、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が、前記ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子であり、配列番号２を含む、項目１から１０までのいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１２）
前記ＤＮＡ標的化セグメントを含むクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、項目１から１１までのいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３）
前記ｃｒＲＮＡおよび前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、互いにハイブリダイズする別々の分子であるモジュラーガイドＲＮＡであり、必要に応じて、前記ｃｒＲＮＡが、配列番号１４２１に記載の配列を含み、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号１４２２に記載の配列を含む、項目１２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１４）
前記ｃｒＲＮＡが前記ｔｒａｃｒＲＮＡとリンカーを介して融合している単一ガイドＲＮＡであり、必要に応じて、配列番号１４２０および２５６～２５８のいずれか１つに記載の配列を含む、項目１２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１５）
細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変する方法、または細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するための方法における、項目１から１４までのいずれか一項に記載のガイドＲＮＡの使用。
（項目１６）
項目１から１４までのいずれか一項に記載のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む単離された核酸。
（項目１７）
配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）内の配列とハイブリダイズし、細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ。
（項目１８）
（ａ）配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）には存在しない、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）に存在する配列とハイブリダイズし、かつ／または
（ｂ）配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする、項目１７に記載のアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ。
（項目１９）
細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するための方法における、項目１７または１８に記載のアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡの使用。
（項目２０）
項目１７または１８に記載のアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを含む単離された核酸。
（項目２１）
項目１６または２０に記載の単離された核酸および異種核酸を含むベクター。
（項目２２）
項目１から１４までのいずれか一項に記載のガイドＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡの安定性を増大させる担体を含む組成物であって、必要に応じて、Ｃａｓタンパク質をさらに含み、必要に応じて、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、組成物。
（項目２３）
項目１７または１８に記載のアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡと、前記アンチセンスＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、または前記ｓｈＲＮＡの安定性を増大させる担体とを含む組成物。
（項目２４）
項目１から１４までのいずれか一項に記載のガイドＲＮＡを含む細胞。
（項目２５）
項目１７または１８に記載のアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを含む細胞。
（項目２６）
ヒト細胞であり、必要に応じて、肝細胞である、項目２４または２５に記載の細胞。
（項目２７）
齧歯類細胞、マウス細胞、またはラット細胞であり、必要に応じて、多能性細胞または肝細胞である、項目２４または２５に記載の細胞。
（項目２８）
細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変する方法であって、前記細胞のゲノムを、
（ａ）Ｃａｓタンパク質；および
（ｂ）前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするガイドＲＮＡであって、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、ガイドＲＮＡ
と接触させるステップを含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断する、方法。
（項目２９）
（ａ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２２６～２３９および２６４～２６８のいずれか１つを含み、かつ／または
（ｂ）前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号１６２９～１６４２および１６４８～１６５２のいずれか１つを含み、かつ／または
（ｃ）前記ガイドＲＮＡが、配列番号７０６～７１９；９３６～９４９；１１６６～１１７９、１３９６～１４０９、７２５～７２９、９５５～９５９、１１８５～１１８９、および１４１５～１４１９のいずれか１つを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
（ａ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６および／またはエクソン７に対応する領域内であり、かつ／または
（ｂ）前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置から約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内であり、必要に応じて、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含む、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ゲノムを、配列番号２の１２６６６位に対応する位置の５’側の標的配列とハイブリダイズする５’相同アームおよび配列番号２の１２６６６位に対応する位置の３’側の標的配列とハイブリダイズする３’相同アームを含む外因性ドナー配列と接触させるステップをさらに含み、前記外因性ドナー配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられる、項目２８から３０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記外因性ドナー配列が、前記５’相同アームと前記３’相同アームとに挟まれた核酸挿入物をさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記核酸挿入物がチミンを含み、前記外因性ドナー配列が前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられると、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に前記チミンが挿入される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
（ａ）前記外因性ドナー配列が、約５０ヌクレオチド～約１ｋｂの長さであり、必要に応じて、前記外因性ドナー配列が、約８０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドの長さであり、かつ／または
（ｂ）前記外因性ドナー配列が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、項目３１から３３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変する方法であって、前記細胞のゲノムを、
（ａ）Ｃａｓタンパク質；および
（ｂ）前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第１のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする第１のガイドＲＮＡであって、前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むか、または前記開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内である、第１のガイドＲＮＡ
と接触させるステップを含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するかまたは前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更する、方法。
（項目３６）
（ａ）前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０～８１および２５９～２６３のいずれか１つを含み、必要に応じて、前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０～４１のいずれか１つ、配列番号２１～２３、３３、および３５のいずれか１つ、または配列番号３３および３５のいずれか１つを含み、かつ／または
（ｂ）前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号１４２３～１４８４および１６４３～１６４７のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含み、必要に応じて、前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号１４４７～１４６８のいずれか１つ、配列番号１４４８～１４５０、１４６０、および１４６２のいずれか１つ；または配列番号１４６０および１４６２のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含み、かつ／または
（ｃ）前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号５００～５６１、７３０～７９１、９６０～１０２１、１１９０～１２５１、７２０～７２４、９５０～９５４、１１８０～１１８４、および１４１０～１４１４のいずれか１つを含み、必要に応じて、前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号５２４～５４５、７５４～７７５、９８４～１００５、および１２１４～１２３５のいずれか１つ、または配列番号２９５～２９７、５２５～５２７、７５５～７５７、９８５～９８７、１２１５～１２１７、３０７、３０９、５３７、５３９、７６７、７６９、９９７、９９９、１２２７、および１２２９のいずれか１つ、または配列番号３０７、３０９、５３７、５３９、７６７、７６９、９９７、９９９、１２２７、および１２２９のいずれか１つを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ－活性Ｃａｓタンパク質である；または
（ｂ）前記Ｃａｓタンパク質が、転写活性化ドメインまたは転写リプレッサードメインと融合したヌクレアーゼ－不活性Ｃａｓタンパク質である、項目３５または３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記細胞のゲノムを、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする第２のガイドＲＮＡと接触させるステップをさらに含み、前記第２のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の終止コドンを含むか、または前記終止コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であり、前記細胞が、前記第１のガイドＲＮＡ標的配列と前記第２のガイドＲＮＡ標的配列との間に欠失を含むように改変されている、項目３５から３７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
（ａ）前記第２のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号８２～２２５のいずれか１つを含み、かつ／または
（ｂ）前記第２のガイドＲＮＡが、配列番号１４８５～１６２８のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含み、かつ／または
（ｃ）前記第２のガイドＲＮＡが、配列番号５６２～７０５、７９２～９３５、１０２２～１１６５、および１２５２～１３９５のいずれか１つを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を低減するための方法であって、前記細胞のゲノムを、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）内の配列とハイブリダイズし、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡと接触させるステップを含む、方法。
（項目４１）
前記アンチセンスＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、または前記ｓｈＲＮＡが、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）には存在しない配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）に存在する配列とハイブリダイズし、必要に応じて、前記アンチセンスＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、または前記ｓｈＲＮＡが、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞に発現ベクターを導入するステップをさらに含み、前記発現ベクターが、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含み、必要に応じて、前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子がヒト遺伝子である、項目３５から４１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が、前記遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子であり、必要に応じて、前記欠失したセグメントが、１つまたは複数のイントロン配列を含み、必要に応じて、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子が、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のイントロン６に対応するイントロンを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記細胞に発現ベクターを導入するステップをさらに含み、前記発現ベクターが、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を含み、必要に応じて、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする前記核酸が、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である、項目３５から４１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記細胞にＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を導入するステップをさらに含み、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片が、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である、項目３５から４１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目２８から４５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
細胞を改変するための方法であって、前記細胞に発現ベクターを導入するステップを含み、前記発現ベクターが、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含み、必要に応じて、前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子がヒト遺伝子である、方法。
（項目４８）
前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が、前記遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子であり、必要に応じて、前記欠失したセグメントが、１つまたは複数のイントロン配列を含み、必要に応じて、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子が、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のイントロン６に対応するイントロンを含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
細胞を改変するための方法であって、前記細胞に発現ベクターを導入するステップを含み、前記発現ベクターが、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を含み、必要に応じて、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする前記核酸が、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である、方法。
（項目５０）
細胞を改変するための方法であって、前記細胞にＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を導入するステップを含み、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片が、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である、方法。
（項目５１）
前記細胞が、齧歯類細胞、マウス細胞、またはラット細胞であり、必要に応じて、前記細胞が、多能性細胞または肝細胞である、項目２８から５０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記細胞が、ヒト細胞であり、必要に応じて、前記細胞が、肝細胞である、項目２８から５０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにある、項目２８から５２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象に、
（ａ）Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸；
（ｂ）ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、前記ガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；および
（ｃ）配列番号２の１２６６６位に対応する位置の５’側の標的配列とハイブリダイズする５’相同アーム、配列番号２の１２６６６位に対応する位置の３’側の標的配列とハイブリダイズする３’相同アーム、および前記５’相同アームと前記３’相同アームに挟まれたチミンを含む核酸挿入物を含む外因性ドナー配列
を導入するステップを含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記対象の肝細胞内で前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断し、前記外因性ドナー配列が、前記肝細胞内で前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられ、前記外因性ドナー配列が前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられると、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に前記チミンが挿入される、方法。
（項目５５）
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象に、
（ａ）Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸；
（ｂ）第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードする核酸であって、前記第１のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第１のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むか、または前記開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号２０～８１から選択される、第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードする核酸；および
（ｃ）組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む発現ベクター
を導入するステップを含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記対象の肝細胞内で前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断するか、またはその発現を変更し、前記発現ベクターが、前記対象の前記肝細胞内で前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現する、方法。
（項目５６）
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象に、前記対象の肝細胞内で配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）内の配列とハイブリダイズし、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを導入するステップを含む、方法。
（項目５７）
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象に発現ベクターを導入するステップを含み、前記発現ベクターが、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含み、前記発現ベクターが、前記対象の肝細胞内で前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現する、方法。
（項目５８）
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象に発現ベクターを導入するステップを含み、前記発現ベクターが、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を含み、前記発現ベクターが、前記対象の肝細胞内で前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする前記核酸を発現する、方法。
（項目５９）
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象にメッセンジャーＲＮＡを導入するステップを含み、前記メッセンジャーＲＮＡが、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードし、前記ｍＲＮＡが、前記対象の肝細胞内で前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質を発現する、方法。
（項目６０）
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、前記対象の肝臓にＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を導入するステップを含み、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片が、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である、方法。
図１Ａおよび１Ｂは、ＧＨＳディスカバリーコホートにおける単一ヌクレオチドバリアントと、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；図１Ａ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ；図１Ｂ）レベル中央値との関連のマンハッタンプロット（左側）および分位点－分位点プロット（右側）を示す。図１Ａは、Ｐ＜１．０×１０－７でＡＬＴレベル（Ｎ＝４１，４１４）と有意に関連する１６個の遺伝子中に３１個のバリアントが存在していたことを示す。図１Ｂは、Ｐ＜１．０×１０－７でＡＳＴレベル（Ｎ＝４０，７５３）と有意に関連する１０個の遺伝子中に１２個のバリアントが存在していたことを示す。全ての有意な関連は、表２に示される。３つの別々の欧州祖先コホートの再現メタ分析においてＡＬＴまたはＡＳＴと依然として有意に関連していた、ＨＳＤ１７Ｂ１３を含む、９個の遺伝子（本明細書ではその遺伝子名で示される）中に１３個のバリアントが存在していた（表３）。エクソームワイド分位点－分位点プロットおよびゲノム対照ラムダ値によって示されるように、関連試験は良好に較正された（図１Ａおよび図１Ｂ）。 図１Ａおよび１Ｂは、ＧＨＳディスカバリーコホートにおける単一ヌクレオチドバリアントと、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；図１Ａ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ；図１Ｂ）レベル中央値との関連のマンハッタンプロット（左側）および分位点－分位点プロット（右側）を示す。図１Ａは、Ｐ＜１．０×１０－７でＡＬＴレベル（Ｎ＝４１，４１４）と有意に関連する１６個の遺伝子中に３１個のバリアントが存在していたことを示す。図１Ｂは、Ｐ＜１．０×１０－７でＡＳＴレベル（Ｎ＝４０，７５３）と有意に関連する１０個の遺伝子中に１２個のバリアントが存在していたことを示す。全ての有意な関連は、表２に示される。３つの別々の欧州祖先コホートの再現メタ分析においてＡＬＴまたはＡＳＴと依然として有意に関連していた、ＨＳＤ１７Ｂ１３を含む、９個の遺伝子（本明細書ではその遺伝子名で示される）中に１３個のバリアントが存在していた（表３）。エクソームワイド分位点－分位点プロットおよびゲノム対照ラムダ値によって示されるように、関連試験は良好に較正された（図１Ａおよび図１Ｂ）。
図２Ａおよび２Ｂは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡが、ディスカバリーコホートにおけるアルコール性および非アルコール性肝疾患表現型のリスクの低下（図２Ａ）、ならびに肥満外科手術コホートにおける単純脂肪肝から脂肪性肝炎および線維症への進行リスクの低下（図２Ｂ）と関連することを示す。オッズ比を、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先の主成分について調整して、ロジスティック回帰を使用して算出した。ヘテロ接合体（Ｈｅｔ ＯＲ）およびホモ接合体（Ｈｏｍ ＯＲ）保因者に関する遺伝子型オッズ比も示される。図２ＡにおけるＧＨＳディスカバリーコホートにおいては、ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントは、対立遺伝子用量依存的様式で、非アルコール性およびアルコール性肝疾患、肝硬変、ならびに肝細胞癌のリスクの有意な低下と関連していた。図２ＢにおけるＧＨＳ肥満外科手術コホートにおいては、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７は、ヘテロ接合体およびホモ接合体ＴＡ保因者において、それぞれ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の１３％および５２％低いオッズ、ならびに線維症の１３％および６１％低いオッズと関連していた。 図２Ａおよび２Ｂは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡが、ディスカバリーコホートにおけるアルコール性および非アルコール性肝疾患表現型のリスクの低下（図２Ａ）、ならびに肥満外科手術コホートにおける単純脂肪肝から脂肪性肝炎および線維症への進行リスクの低下（図２Ｂ）と関連することを示す。オッズ比を、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先の主成分について調整して、ロジスティック回帰を使用して算出した。ヘテロ接合体（Ｈｅｔ ＯＲ）およびホモ接合体（Ｈｏｍ ＯＲ）保因者に関する遺伝子型オッズ比も示される。図２ＡにおけるＧＨＳディスカバリーコホートにおいては、ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントは、対立遺伝子用量依存的様式で、非アルコール性およびアルコール性肝疾患、肝硬変、ならびに肝細胞癌のリスクの有意な低下と関連していた。図２ＢにおけるＧＨＳ肥満外科手術コホートにおいては、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７は、ヘテロ接合体およびホモ接合体ＴＡ保因者において、それぞれ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の１３％および５２％低いオッズ、ならびに線維症の１３％および６１％低いオッズと関連していた。
図３Ａ～３Ｄは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７スプライスバリアントのホモ接合体参照（Ｔ／Ｔ）、ヘテロ接合体（Ｔ／ＴＡ）、およびホモ接合体代替物（ＴＡ／ＴＡ）保因者における４つのＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物（Ａ～Ｄ）の発現を示す。各転写産物は、対応する遺伝子モデルと共に例示される。遺伝子モデルにおけるコード領域は、縞模様の囲みで示され、非翻訳領域は、黒色の囲みで示される。図３Ａは、転写産物Ａの表示および転写産物Ａに関する発現データを示す。図３Ｂは、転写産物Ｂの表示および転写産物Ｂに関する発現データを示す。転写産物Ｂにおいて、エクソン２はスキップされている。図３Ｃは、転写産物Ｃの表示および転写産物Ｃに関する発現データを示す。転写産物Ｃにおいて、エクソン６はスキップされている。図３Ｄは、転写産物Ｄの表示および転写産物Ｄに関する発現データを示す。転写産物Ｄ中の星印は、タンパク質の早期トランケーションをもたらす、エクソン６の３’末端でのｒｓ７２６１３５６７からのＧの挿入を示す。転写産物Ｄは、ＨＳＤ１７Ｂ１３スプライスバリアントのホモ接合体保因者における優勢な転写産物になる。遺伝子発現は、ＦＰＫＭ単位（マッピングされたリード１００万あたりの転写産物キロベースあたりの断片数）で示される。図３Ｂおよび図３Ｃにおける差込み図は、拡大表示を示す。
図４は、ヒト肝臓のＲＮＡ－Ｓｅｑ研究が、６個の新規ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物（転写産物Ｃ～Ｈ）を含む、８個のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物を示すことを示す。転写産物の発現は、ＦＰＫＭ単位（マッピングされたリード１００万あたりの転写産物キロベースあたりの断片数）で示される。転写産物の構造を、図面の右側に提供する。
図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、ＡＬＴおよびＡＳＴに関するＧＨＳディスカバリーコホートにおけるＨＳＤ１７Ｂ１３のローカスズームプロット（ＨＳＤ１７Ｂ１３周辺の領域における領域関連プロット）を示す。領域間での有意な組換えは観察されなかった。菱形は、ｒｓ７２６１３５６７スプライスバリアントを示す。それぞれの丸印は、そのバリアントとｒｓ７２６１３５６７との間の連鎖不均衡（ＤｉｓｃｏｖＥＨＲコホートにおいて算出されたｒ２）を示す丸印の色と共に単一ヌクレオチドのバリアントを示す。線は、ＨａｐＭａｐにおける推定組換え率を示す。下パネルは、遺伝子座中の各遺伝子の相対位置および転写される鎖を示す。ＡＬＴまたはＡＳＴと、近隣遺伝子ＨＳＤ１７Ｂ１１中のコードまたはスプライス領域バリアントとの有意な関連は存在しなかった（ＡＬＴおよびＡＳＴに関する、最も有意なＰ値は、それぞれ、１．４×１０－１および４．３×１０－２である）。 図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、ＡＬＴおよびＡＳＴに関するＧＨＳディスカバリーコホートにおけるＨＳＤ１７Ｂ１３のローカスズームプロット（ＨＳＤ１７Ｂ１３周辺の領域における領域関連プロット）を示す。領域間での有意な組換えは観察されなかった。菱形は、ｒｓ７２６１３５６７スプライスバリアントを示す。それぞれの丸印は、そのバリアントとｒｓ７２６１３５６７との間の連鎖不均衡（ＤｉｓｃｏｖＥＨＲコホートにおいて算出されたｒ２）を示す丸印の色と共に単一ヌクレオチドのバリアントを示す。線は、ＨａｐＭａｐにおける推定組換え率を示す。下パネルは、遺伝子座中の各遺伝子の相対位置および転写される鎖を示す。ＡＬＴまたはＡＳＴと、近隣遺伝子ＨＳＤ１７Ｂ１１中のコードまたはスプライス領域バリアントとの有意な関連は存在しなかった（ＡＬＴおよびＡＳＴに関する、最も有意なＰ値は、それぞれ、１．４×１０－１および４．３×１０－２である）。
図６Ａ～６Ｄは、ＨＳＤ１７Ｂ１３スプライスバリアントのホモ接合体参照（Ｔ／Ｔ）、ヘテロ接合体（Ｔ／ＴＡ）、およびホモ接合体代替物（ＴＡ／ＴＡ）保因者における４つのさらなる新規ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物（Ｅ～Ｈ）のｍＲＮＡ発現を示す。各転写産物は、対応する遺伝子モデルと共に例示される。遺伝子モデルにおけるコード領域は、縞模様の囲みで示され、非翻訳領域は、黒色の囲みで示される。図６Ａおよび６Ｄは、転写産物ＥおよびＨがエクソン３と４との間にさらなるエクソンを含有することを示す。図６Ｂは、転写産物Ｆがエクソン６からイントロン６までのリードスルーを含むことを示す。図６Ｃは、転写産物Ｇにおいて、エクソン２がスキップされていることを示す。転写産物ＧおよびＨにおける星印（それぞれ、図６Ｃおよび６Ｄ）は、タンパク質の早期トランケーションをもたらす、エクソン６の３’末端でのｒｓ７２６１３５６７からのＧの挿入を示す。転写産物は、ボックスプロットに示されるように、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子型に従って示差的に発現される。ｍＲＮＡ発現は、ＦＰＫＭ単位（マッピングされたリード１００万あたりの転写産物キロベースあたりの断片数）で示される。
図７Ａ～７Ｂは、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質アイソフォームＡ～Ｈのタンパク質配列アラインメントを示す。 図７Ａ～７Ｂは、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質アイソフォームＡ～Ｈのタンパク質配列アラインメントを示す。
図８は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡが、アルコール性および非アルコール性肝疾患表現型のリスクの低下と関連することを示す。具体的には、図８は、Ｄａｌｌａｓ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｕｄｙにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７が、対立遺伝子用量依存的様式で、任意の肝疾患のより低いオッズと関連していたことを示す。同様の対立遺伝子用量依存的効果は、肝疾患サブタイプにわたって観察された。オッズ比を、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および自己報告された民族性について調整して、ロジスティック回帰を使用して算出した。
図９は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７が、単純脂肪肝から脂肪性肝炎および線維症への進行リスクの低下と関連することを示す。具体的には、それは、ＧＨＳ肥満外科手術コホートに由来する肝臓生検を有する２，３９１人の個体におけるＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７遺伝子型による組織病理学的に特徴付けられた肝疾患の有病率を示す。正常な肝臓の有病率は、遺伝子型によって異ならないと考えられた（割合における傾向に関するカイ二乗検定によるＰ＝０．５）が、それぞれのＴＡ対立遺伝子に関して、ＮＡＳＨの有病率は減少し（Ｐ＝１．６×１０－４）、単純脂肪肝の有病率は増大した（Ｐ＝１．１×１０－３）。
図１０Ａ～１０Ｅは、新規ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の発現、細胞内局在化、および酵素活性を示す。図１０Ａは、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤを過剰発現するＨｅｐＧ２細胞に由来するウェスタンブロットを示し、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄが、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａと比較して低い分子量を有するトランケートされたタンパク質に翻訳されたことを示す。図１０Ｂは、新鮮な凍結ヒト肝臓およびＨＥＫ２９３細胞試料に由来するＨＳＤ１７Ｂ１３ウェスタンブロットを示す。ヒト肝臓試料は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７スプライスバリアントのホモ接合体参照（Ｔ／Ｔ）、ヘテロ接合体（Ｔ／ＴＡ）、およびホモ接合体代替物（ＴＡ／ＴＡ）保因者に由来するものである。細胞試料は、非タグ付きＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に由来するものである。ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＩｓｏＡよりも低い分子量を有するトランケートされたタンパク質ＩｓｏＤに翻訳された。図１０Ｃは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＩｓｏＤタンパク質レベルが、ヒト肝臓（左）と細胞（右）試料の両方に由来するＩｓｏＡタンパク質レベルよりも低かったことを示す。アクチンに対して正規化されたタンパク質レベルを、棒カラムで示す；＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。図１０Ｄは、１７－ベータエストラジオール（エストラジオール）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、および１３－ヒドロキシオクタデカジエン酸（１３（Ｓ）－ＨＯＤＥ）に対するＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡおよびＤの酵素活性を示す。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤは、アイソフォームＡに関する対応する値の１０％未満の酵素活性を示す。図１０Ｅは、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤが、ＨＥＫ２９３細胞中で過剰発現された場合、培養培地中で測定された場合にエストラジオール（基質）のエストロン（生成物）への変換をあまり示さなかったが、過剰発現されたＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡがロバストな変換を示したことを示す。 図１０Ａ～１０Ｅは、新規ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の発現、細胞内局在化、および酵素活性を示す。図１０Ａは、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤを過剰発現するＨｅｐＧ２細胞に由来するウェスタンブロットを示し、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄが、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａと比較して低い分子量を有するトランケートされたタンパク質に翻訳されたことを示す。図１０Ｂは、新鮮な凍結ヒト肝臓およびＨＥＫ２９３細胞試料に由来するＨＳＤ１７Ｂ１３ウェスタンブロットを示す。ヒト肝臓試料は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７スプライスバリアントのホモ接合体参照（Ｔ／Ｔ）、ヘテロ接合体（Ｔ／ＴＡ）、およびホモ接合体代替物（ＴＡ／ＴＡ）保因者に由来するものである。細胞試料は、非タグ付きＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に由来するものである。ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＩｓｏＡよりも低い分子量を有するトランケートされたタンパク質ＩｓｏＤに翻訳された。図１０Ｃは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＩｓｏＤタンパク質レベルが、ヒト肝臓（左）と細胞（右）試料の両方に由来するＩｓｏＡタンパク質レベルよりも低かったことを示す。アクチンに対して正規化されたタンパク質レベルを、棒カラムで示す；＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。図１０Ｄは、１７－ベータエストラジオール（エストラジオール）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、および１３－ヒドロキシオクタデカジエン酸（１３（Ｓ）－ＨＯＤＥ）に対するＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡおよびＤの酵素活性を示す。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤは、アイソフォームＡに関する対応する値の１０％未満の酵素活性を示す。図１０Ｅは、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤが、ＨＥＫ２９３細胞中で過剰発現された場合、培養培地中で測定された場合にエストラジオール（基質）のエストロン（生成物）への変換をあまり示さなかったが、過剰発現されたＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡがロバストな変換を示したことを示す。
図１１Ａ～１１Ｃは、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤタンパク質がより低い分子量を有し、ＨＥＫ２９３細胞中で過剰発現された場合、不安定であることを示す。図１１Ａは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＩｓｏＤ ＲＮＡレベルがＩｓｏＡ ＲＮＡレベルよりも高かったことを示す、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ（ＩｓｏＡ）およびＤ（ＩｓｏＤ）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に由来するＨＳＤ１７Ｂ１３のＲＴ－ＰＣＲを示す。図１１Ｂは、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄが、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａと比較して低い分子量を有するトランケートされたタンパク質に翻訳されたことを示す、同じ細胞株に由来するウェスタンブロットを示す。図１１Ｃは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＩｓｏＤタンパク質レベルがＩｓｏＡタンパク質レベルよりも低かったが、ＲＮＡレベルは高かったことを示す。ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質レベルを、アクチンに対して正規化した；＊Ｐ＜０．０５。
図１２は、ＨｅｐＧ２安定細胞株に由来する単離された脂肪滴（ＬＤ）に対するＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡおよびアイソフォームＤの類似する局在化パターンを示す。ＡＤＲＰおよびＴＩＰ４７を、脂肪滴マーカーとして使用した。ＬＡＭＰ１、カルレティキュリン、およびＣＯＸ ＩＶを、それぞれ、リソソーム、小胞体、およびミトコンドリア区画のためのマーカーとして使用した。ＧＡＰＤＨを細胞質マーカーとして含有させ、アクチンを細胞骨格マーカーとして使用した。この実験を、ＨｅｐＧ２細胞中で２回反復し、上記は両方の泳動の代表である。ＰＮＳ＝後核画分；ＴＭ＝総膜。
図１３Ａ～１３Ｄは、オレイン酸が、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡまたはＤを過剰発現するＨｅｐＧ２細胞中のトリグリセリド含量を増加させたことを示す。図１３Ａは、高濃度のオレイン酸による処理が、対照（ＧＦＰを過剰発現する細胞）ならびにＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤ細胞株において同程度までトリグリセリド（ＴＧ）含量を増加させたことを示す。図１３Ｂは、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤのＲＮＡレベルが細胞株において類似していたことを示す。ＲＮＡレベルを、マッピングされたリード１００万あたりの転写産物キロベースあたりのリード数（ＲＰＫＭ）で示す。図１３Ｃは、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤを過剰発現するＨｅｐＧ２細胞に由来するウェスタンブロットを示す。ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄは、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａと比較して低い分子量を有するトランケートされたタンパク質に翻訳された。図１３Ｄは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＩｓｏＤタンパク質レベルが、ＩｓｏＡタンパク質レベルよりも低かったことを示す。タンパク質レベルを、アクチンに対して正規化した；＊＊Ｐ＜０．０１。
図１４は、精製された組換えＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質を使用したエストラジオールに関するＫｍおよびＶｍａｘ値を示す。ＫｍおよびＶｍａｘの決定のために、０．２μＭ～２００μＭの１７β－エストラジ－ルの用量範囲および５分～１８０分の時点と共に、５００μＭのＮＡＤ＋および２２８ｎＭのＨＳＤ１７Ｂ１３を用いてアッセイを実行した。次いで、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－ＭｅｎｔｅｎモデルおよびＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して、ＶｍａｘおよびＫｍを決定した。
図１５は、ハイブリッド野生型マウス（７５％のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ、２５％の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ）から単離された初代肝細胞における次世代配列決定（ＮＧＳ）によって決定されたマウスＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子座でのゲノム編集率（％）（溶解した細胞のプールに由来するＰＣＲ反応中の配列リードの総数にわたる、Ｃａｓ９誘導性ＤＮＡ切断のいずれかの側での２０塩基対のウィンドウ内で観察された挿入または欠失の総数）を示す。試験した試料は、Ｃａｓ９と、マウスＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子座を標的化するように設計されたガイドＲＮＡとを含有するリボ核タンパク質複合体で処理された肝細胞を含んでいた。
図１６は、マウスＨｓｄ１７ｂ１３をＣａｓ９－ｒｅａｄｙマウスに標的化するように設計されたｓｇＲＮＡ発現カセットを含有するＡＡＶ８の注射の３週後にマウス肝臓から単離された試料中での次世代配列決定（ＮＧＳ）によって決定されたマウスＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子座でのゲノム編集率（％）（溶解した細胞のプールに由来するＰＣＲ反応中の配列リードの総数にわたって観察された挿入または欠失の総数）を示す。いかなるＣａｓ９も発現しない野生型マウスに、全てのｓｇＲＮＡ発現カセットを含有するＡＡＶ８を注射したものを陰性対照として使用した。
図１７Ａおよび１７Ｂは、マウスＨｓｄ１７ｂ１３を標的化するように設計されたガイドＲＮＡ発現カセットを担持するＡＡＶ８で処置されたＣａｓ９－ｒｅａｄｙマウスに由来する肝臓試料中でのＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、それぞれ、マウスＨｓｄ１７ｂ１３および非標的ＨＳＤファミリーメンバーに関する相対ｍＲＮＡ発現を示す。いかなるＣａｓ９も発現しない野生型マウスに、全てのガイドＲＮＡのためのガイドＲＮＡ発現カセットを担持するＡＡＶ８を注射したものを陰性対照として使用した。
定義
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、コードアミノ酸および非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含めた、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を含む。この用語は、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの、修飾されたポリマーも含む。
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言える。「Ｎ末端」という用語は、遊離のアミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端とする、タンパク質またはポリペプチドの出発点に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を末端とする、アミノ酸の鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終了点に関する。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその類似体もしくは修飾バージョンを含めた、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを含む。これらの用語は、プリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにポリマーを含む。
核酸は、モノヌクレオチドが、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその近くの３’酸素にリン酸ジエステル連結によって一方向に付着するように反応してオリゴヌクレオチドが生じるので、「５’末端」および「３’末端」を有すると言える。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と連結していなければ、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と連結していなければ、「３’末端」と称される。核酸配列も、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にあったとしても、５’および３’末端を有すると言われ得る。直鎖状または環状ＤＮＡ分子のいずれでも、別個のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’側にあると称される。
「野生型」という用語は、正常な状態または状況（突然変異体、疾患にかかっている、変更された状態または状況などとは対照的に）において見出される構造および／または活性を有する実体を包含する。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、多数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
タンパク質および核酸に関して「単離された」という用語は、タンパク質およびポリヌクレオチドの実質的に純粋な調製物に至るまで、およびそれを含めた、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて通常存在し得る他の細菌性、ウイルス性、または細胞性構成成分に関して比較的精製されたタンパク質および核酸を含む。「単離された」という用語は、天然に存在する対応物を有さない、化学的に合成された、したがって、他のタンパク質もしくは核酸が実質的に混入していない、または、天然では付随する他の大多数の細胞性構成成分（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、もしくは細胞性構成成分）から分離もしくは精製されたタンパク質および核酸も含む。
「外因性」分子または配列は、通常は細胞内にその形態では存在しない分子または配列を含む。通常存在するとは、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して存在することを含む。外因性分子または配列は、例えば、細胞内の対応する内因性配列の突然変異バージョンを含み得る、または細胞内の内因性配列に対応するが、形態が異なる（すなわち、染色体内にない）配列を含み得る。対照的に、内因性分子または配列は、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞内にその形態で通常存在する分子または配列を含む。
「異種」という用語は、核酸またはタンパク質に関して使用される場合、その核酸またはタンパク質が、天然には一緒に存在しない少なくとも２つの部分を含むことを示す。同様に、「異種」という用語は、タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結したプロモーターに関して使用される場合、そのプロモーターおよびタンパク質をコードする核酸が、天然には一緒に存在しない（すなわち、天然には作動可能に連結していない）ことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸の一部分またはタンパク質の一部分に関連して使用される場合、その核酸またはタンパク質が、天然では同じ互いとの関係（例えば、接合している）では見出されない２つまたはそれよりも多くの部分配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連しては見出されない、別の核酸分子内にあるかまたはそれに付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、天然ではコード配列と関連しては見出されない配列に挟まれたコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、天然では他のペプチド分子と関連しては見出されない、別のペプチド分子内にあるかまたはそれに付着したアミノ酸のセグメント（例えば、融合タンパク質、またはタグを有するタンパク質）である。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌もしくは局在化配列を含み得る。
「標識」という用語は、標的化合物に付着させた場合に直接的または間接的に検出可能な（例えば、そのスペクトル性質、コンフォメーション、または活性に起因して）化学的部分またはタンパク質を指す。標識は、直接検出可能なもの（フルオロフォア）であっても間接的に検出可能なもの（ハプテン、酵素、またはフルオロフォアクエンチャー）であってもよい。そのような標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能であり得る。そのような標識としては、例えば、放射線計測デバイスを用いて測定することができる放射標識；分光光度計を用いて視覚的に観察または測定することができる顔料、色素または他の色素原；スピンラベル分析機器を用いて測定することができるスピンラベル；および、出力シグナルを適切な分子付加物の励起によって生じさせ、色素によって吸収される光を用いた励起によって可視化することができる、または標準の蛍光光度計もしくはイメージングシステムを用いて測定することができる蛍光標識（フルオロフォア）が挙げられる。標識はまた、例えば、出力シグナルをシグナル化合物の化学修飾によって生じさせる化学発光物質；金属含有物質；または、無色の基質からの呈色生成物の形成などの、酵素に依存したシグナルの二次的生成が生じる、酵素であってもよい。「標識」という用語は、コンジュゲート分子に、その後基質と一緒に添加した際に、検出可能なシグナルの生成にコンジュゲート分子が使用されるように選択的に結合させることができる「タグ」またはハプテンも指し得る。例えば、ビオチンをタグとして使用し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のアビジンまたはストレプトアビジンコンジュゲートを使用してタグと結合させ、次いで、熱量測定基質（例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））または蛍光発生基質を使用してＨＲＰの存在を検出することができる。「標識」という用語は、例えば、精製を容易にするために使用することができるタグも指し得る。そのようなタグの非限定的な例としては、ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧまたは３×ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓまたはポリヒスチジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、エピトープタグ、または免疫グロブリンのＦｃ部分が挙げられる。多数の標識が公知であり、それらとして、例えば、粒子、フルオロフォア、ハプテン、酵素およびそれらの熱量測定基質、蛍光発生基質および化学発光基質ならびに他の標識が挙げられる。
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組合せの多重性によって示される通り、コドンの縮重を活用し、一般に、特定の宿主細胞における発現の増強のために、ネイティブなアミノ酸配列を維持しながらネイティブな配列の少なくとも１つのコドンを宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の宿主細胞を含めた所与の原核細胞または真核細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。コドン使用表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に利用可能である。これらの表は、いくつかのやり方で適合させることができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるNakamuraら（２０００年）Nucleic Acids Research ２８巻：２９２頁を参照されたい。特定の宿主において発現させるための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
「遺伝子座」という用語は、遺伝子（もしくは意味のある配列）の特定の場所、ＤＮＡ配列、ポリペプチドをコードする配列、または生物体のゲノムの染色体上の位置を指す。例えば、「ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子座」は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の特定の場所、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＤＮＡ配列、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードする配列、またはそのような配列が存在すると同定された生物体のゲノムの染色体上のＨＳＤ１７Ｂ１３の位置を指し得る。「ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／もしくは３’ＵＴＲ、またはこれらの組合せを含めた、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の制御エレメントを含み得る。
「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする、染色体内のＤＮＡ配列を指し、１つまたは複数の非コードイントロンに遮られたコード領域ならびに５’および３’末端の両方でコード領域に隣接して位置する配列を含み、したがって、遺伝子は、全長ｍＲＮＡ（５’および３’非翻訳配列を含む）に対応する。「遺伝子」という用語は、制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合性部位）、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位、サイレンサー、絶縁配列（ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびマトリックス付着領域を含めた他の非コード配列も含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域の近く（例えば、１０ｋｂ以内）または遠位部位にあり得、遺伝子の転写および翻訳レベルまたは率に影響を及ぼす。「遺伝子」という用語は、「ミニ遺伝子」も包含する。
「ミニ遺伝子」という用語は、遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する天然に存在する生殖細胞系列遺伝子に対して欠失しているが、少なくとも１つのイントロンは残っている遺伝子を指す。欠失したセグメントは、イントロン配列であり得る。例えば、欠失したセグメントは、少なくとも約５００塩基対～数キロベースのイントロン配列であり得る。一般には、必須の制御エレメントを包含しないイントロン配列が欠失していてよい。ミニ遺伝子を含む遺伝子セグメントは、生殖細胞系列遺伝子に存在するのと同じ直線的順序で配置されるが、必ずしもそうではない。一部の所望の制御エレメント（例えば、エンハンサー、サイレンサー）は、比較的位置非感受性であり得、したがって、制御エレメントは、ミニ遺伝子において対応する生殖細胞系列遺伝子とは違うように配置されていたとしても正確に機能する。例えば、エンハンサーは、プロモーターからの異なる距離、異なる方向、および／または異なる直線的順序で位置し得る。例えば、生殖細胞系列立体配置においてプロモーターの３’側に位置するエンハンサーが、ミニ遺伝子ではプロモーターの５’側に位置し得る。同様に、一部の遺伝子は、ＲＮＡレベルで選択的にスプライシングされるエクソンを有し得る。したがって、ミニ遺伝子は、対応する生殖細胞系列遺伝子よりも少ないエクソンおよび／または直線的順序が異なるエクソンを有し得、それでもなお、機能的な遺伝子産物をコードする。遺伝子産物をコードするｃＤＮＡを使用してミニ遺伝子を構築することもできる（例えば、ハイブリッドｃＤＮＡ－ゲノム融合物）。
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアント形態を指す。一部の遺伝子は、染色体の同じ位置または遺伝子座に位置する種々の異なる形態を有する。二倍体の生物体は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子が存在する場合にはホモ接合体と記載され、２つの対立遺伝子が異なる場合にはヘテロ接合体と記載される。
「バリアント」または「遺伝子バリアント」という用語は、集団内に最も広く行きわたっている配列とは異なる（例えば、１ヌクレオチドが異なる）ヌクレオチド配列を指す。例えば、ヌクレオチド配列の一部の変化または置換により、コドンが変更され、したがって、異なるアミノ酸がコードされ、その結果、遺伝子バリアントポリペプチドが生じる。「バリアント」という用語は、集団内に最も広く行きわたっている配列と、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない位置で配列が異なる遺伝子も指し得る（すなわち、保存的変化）。遺伝子バリアントは、リスクに関連する場合もあり、保護に関連する場合もあり、中性の場合もある。
「プロモーター」は、ＤＮＡの制御領域であり、通常、特定のポリヌクレオチド配列に対して妥当な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることができるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターは、転写開始率に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書に開示される細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、多能性細胞、分化細胞、またはこれらの組合せ）の１つまたは複数において活性であってよい。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生制御型プロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であってよい。プロモーターの例は、例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる。
誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的制御型プロモーターおよび物理的制御型プロモーターが挙げられる。化学的制御型プロモーターとしては、例えば、アルコール制御型プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン制御型プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ－Ｏｎプロモーター、もしくはｔｅｔ－Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド制御型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、もしくはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属制御型プロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的制御型プロモーターとしては、例えば、温度制御型プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）および光制御型プロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。
組織特異的プロモーターは、例えば、神経特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋肉細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であってよい。
発生制御型プロモーターとしては、例えば、発生の胚形成期の間にのみ、または成体細胞においてのみ活性であるプロモーターが挙げられる。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結した」とは、２つまたはそれよりも多くの構成成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）が、どちらの構成成分も正常に機能し、構成成分の少なくとも１つが他の構成成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得る可能性が許容されるように近位にあることを含む。例えば、プロモーターがコード配列の転写のレベルを１つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答して調節する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している可能性がある。作動可能な連結は、互いと連続しているまたはトランスに作用する配列を含み得る（例えば、制御配列は、コード配列の転写を調節するための距離で作用し得る）。
「プライマー」という用語は、ポリヌクレオチドと相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれると、相補鎖に沿ったポリヌクレオチド合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。そのような条件は、４つの異なるヌクレオチド三リン酸またはヌクレオシド類似体ならびにＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素などの１つまたは複数の重合用作用剤が、妥当な緩衝剤（補助因子であるか、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換基を含む）中、適切な温度で存在することを含む。配列特異的なプライマーの伸長としては、例えば、ＰＣＲの方法、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写を挙げることができる。プライマーは、ポリメラーゼの代わりの作用剤の存在下で伸長産物の合成を刺激するのに十分長くなければならない。典型的なプライマーは、標的配列と実質的に相補的な少なくとも約５ヌクレオチドの長さの配列であるが、より長いプライマーが好ましい。一般には、プライマーは、約１５～３０ヌクレオチドの長さであるが、より長いプライマーを使用することもできる。プライマー配列は、鋳型または標的配列に対して正確に相補的である必要はないが、鋳型または標的配列とハイブリダイズするのに十分相補的でなければならない。「プライマー対」という用語は、増幅されるＤＮＡ配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流プライマー、および増幅される配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’下流プライマーを含むプライマーのセットを意味する。プライマー対は、標的ポリヌクレオチドを増幅させる（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅方法によって）ために使用することができる。「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントを増幅させるために使用される技法である（それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号を参照されたい）。
「プローブ」という用語は、構造が異なる標的分子間を検出可能に区別することができる分子を指す。検出は、使用されるプローブの型および標的分子の型に応じて様々な異なるやり方で実現することができる。したがって、例えば、検出は、標的分子の活性レベルの識別に基づくものであってよいが、特異的結合の検出に基づくものであることが好ましい。そのような特異的結合の例としては、抗体結合および核酸プローブハイブリダイゼーションが挙げられる。したがって、プローブとして、例えば、酵素基質、抗体および抗体断片、ならびに核酸ハイブリダイゼーションプローブを挙げることができる。例えば、プローブは、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、酵素などの従来の検出可能な標識またはレポーター分子に付着させた単離されたポリヌクレオチドであってよい。そのようなプローブは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントまたは特定のＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡ転写産物を含むポリヌクレオチドなどの標的ポリヌクレオチド鎖と相補的である。デオキシリボ核酸プローブは、ＨＳＤ１７Ｂ１３－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ特異的プライマーもしくはＨＳＤ１７Ｂ１３－ｒｓ７２６１３５６７特異的プライマー、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたオリゴヌクレオチドプローブ、または細菌人工染色体、フォスミド、もしくはコスミドライブラリーから得られたＤＮＡを使用してＰＣＲによって生成したものを含んでよい。プローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列の存在を特異的に検出することが可能なポリアミドおよび他のプローブ材料も含む。核酸プローブに関しては、検出試薬として、例えば、放射標識されたプローブ、酵素標識されたプローブ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ）、親和性標識されたプローブ（例えば、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジン）、および蛍光標識されたプローブ（例えば、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＭＧＢ、フルオレセイン、ローダミン、およびテキサスレッド）を挙げることができる。本明細書に記載の核酸プローブは、周知の確立されたキット形式の１つに容易に組み入れることができる。
「アンチセンスＲＮＡ」という用語は、細胞において転写されるメッセンジャーＲＮＡ鎖と相補的な一本鎖ＲＮＡを指す。
「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する、一般には二本鎖のＲＮＡ分子を指す。これらの分子は、長さが変動し得（一般に、１８～３０塩基対）、アンチセンス鎖内のそれらの標的ｍＲＮＡに対して種々の程度の相補性を含有する。ｓｉＲＮＡの全てではないが一部は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端に、対合していない突出した塩基を有する。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、２つの別々の鎖の２重鎖、ならびに２重鎖領域を含むヘアピン構造を形成し得る一本鎖を包含する。二本鎖構造は、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド未満の長さであり得る。例えば、二本鎖構造は、約２１～２３ヌクレオチドの長さ、約１９～２５ヌクレオチドの長さ、または約１９～２３ヌクレオチドの長さであり得る。
「低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」という用語は、自己ハイブリダイズしてヘアピン構造になり、プロセシングの際にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導することが可能な一本鎖のＲＮＡ塩基を指す。これらの分子は、長さが変動し得る（一般に、約５０～９０ヌクレオチドの長さ、または一部の場合では、例えば、マイクロＲＮＡに適合させたｓｈＲＮＡに関しては２５０ヌクレオチドを超えるまでの長さである）。ｓｈＲＮＡ分子は細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡを形成し、今度はそれにより遺伝子発現がノックダウンされ得る。ｓｈＲＮＡは、ベクターに組み入れることができる。「ｓｈＲＮＡ」という用語は、それから低分子ヘアピンＲＮＡ分子を転写することができるＤＮＡ分子も指す。
核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖内のヌクレオチド配列が、その核酸塩基群の配向に起因して、対向する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡ内の相補的な塩基は一般にはＡとＴおよびＣとＧである。ＲＮＡでは、相補的な塩基は一般にはＣとＧおよびＵとＡである。相補性は、完全なものまたは実質的／十分なものであり得る。２つの核酸間の完全な相補性とは、２つの核酸が、２重鎖内のあらゆる塩基が相補的な塩基とワトソン・クリック対形成によって結合した２重鎖を形成できることを意味する。「実質的な」または「十分な」相補性とは、一方の鎖内の配列が対向する鎖内の配列と徹底的におよび／または完全に相補的ではないが、ハイブリダイゼーション条件のセット（例えば、塩濃度および温度）の下で２つの鎖上の塩基間に十分な結合が生じて安定なハイブリッド複合体が形成されることを意味する。そのような条件は、ハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するためのシーケンスおよび標準の数学的算出を使用することにより、または常套的な方法を使用することによってＴｍを経験的に決定することにより、予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖の間で形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる）温度を含む。Ｔｍを下回る温度ではハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるが、Ｔｍを上回る温度ではハイブリダイゼーション複合体内の鎖の融解または分離が有利である。Ｔｍは、水性１Ｍ ＮａＣｌ溶液中のＧ＋Ｃ含有量が分かっている核酸に関しては、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することによって推定することができるが、他の公知のＴｍコンピュータ計算では、核酸の構造特性を考慮に入れる。
「ハイブリダイゼーション条件」は、１つの核酸鎖が第２の核酸鎖と相補鎖相互作用および水素結合によって結合してハイブリダイゼーション複合体が生じる累積的環境を含む。そのような条件は、核酸を含有する水性または有機溶液の化学成分およびそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、ならびに混合物の温度を含む。インキュベート時間の長さまたは反応チャンバーの寸法などの他の因子が環境に寄与し得る。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、１．９０～１．９１頁、９．４７～９．５１頁、１１．４７～１１．５７頁（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.、１９８９年）を参照されたい。
ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補配列を含有することが必要であるが、塩基間にミスマッチがある可能性がある。２つの核酸間のハイブリダイゼーションのための妥当な条件は、周知の変数である核酸の長さおよび相補の度合いに依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補の度合いが大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値が大きい。短い相補性のひと続き（例えば、３５ヌクレオチドもしくはそれ未満、３０ヌクレオチドもしくはそれ未満、２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、２２ヌクレオチドもしくはそれ未満、２０ヌクレオチドもしくはそれ未満、または１８ヌクレオチドもしくはそれ未満にわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置が重要になる（Sambrookら、上記、１１．７～１１．８頁を参照されたい）。一般には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小長としては、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、および少なくとも約３０ヌクレオチドが挙げられる。さらに、相補領域の長さおよび相補の度合いなどの因子に応じて、必要に応じて温度および洗浄溶液の塩濃度を調整することができる。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸のポリヌクレオチド配列と１００％相補的である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、介在するか、または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように１つまたは複数のセグメントを超えてハイブリダイズし得る（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが標的領域と相補的であり、したがって、それと特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡは、９０％の相補性になる。この例では、残りの非相補性ヌクレオチドは、密集していても相補的なヌクレオチドが散在していてもよく、互いとまたは相補的なヌクレオチドと連続している必要はない。
核酸内の核酸配列の特定のひと続き間のパーセント相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒ ＢＬＡＳＴプログラム（Altschulら（１９９０年）J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３～４１０頁；ZhangおよびMadden（１９９７年）Genome Res.、７巻：６４９～６５６頁）を使用して、または、SmithおよびWaterman（Adv. Appl. Math.、１９８１年、２巻、４８２～４８９頁）のアルゴリズムを使用する、デフォルト設定を使用したＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することにより、常套的に決定することができる。
本明細書において提示される方法および組成物では、種々の異なる構成成分を使用する。説明全体を通して、一部の構成成分は、活性なバリアントおよび断片を有し得る。そのような構成成分としては、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡが挙げられる。これらの構成成分のそれぞれについての生物活性は本明細書の他の箇所に記載されている。
「配列同一性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関しては、２つの配列内の、指定の比較ウインドウにわたって最大の対応でアラインメントした場合に同じである残基に言及する。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一でない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なっており、その場合、アミノ酸残基は、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的性質は変化しない。配列が保存的置換によって異なる場合、パーセント配列同一性を上向きに調整して置換の保存的性質を補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言える。この調整を行う方法は周知である。一般には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それにより、パーセンテージ配列同一性を増大させることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸にはスコア１を付し、非保存的置換にはスコアゼロを付す場合、保存的置換には、ゼロと１との間のスコアを付す。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行される通り算出される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較ウインドウにわたって比較することによって決定される値を含み、ここで、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。パーセンテージは、両方の配列内に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。別段の指定がない限り（例えば、短い方の配列は連結した異種配列を含む）、比較ウインドウは、比較される２つの配列の短い方の全長である。
別段の指定のない限り、配列同一性／類似性値は、ＧＡＰバージョン１０を以下のパラメーターを使用して得られる値を含む：ギャップ重みづけ５０および長さ重みづけ３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を使用したヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性；ギャップ重みづけ８および長さ重みづけ２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用したアミノ酸配列についての％同一性および％類似性；またはその任意の等価のプログラム。「等価のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生じた対応するアラインメントと比較して同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生じさせる任意の配列比較プログラムを含む。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列内に通常存在するアミノ酸の、サイズ、電荷、または極性が同様の異なるアミノ酸による置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基による別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、１つの極性（親水性）残基による別の極性（親水性）残基の置換、例えば、アルギニンとリシンとの間の置換、グルタミンとアスパラギンとの間の置換、またはグリシンとセリンとの間の置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基による別の塩基性残基の置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基による別の酸性残基の置換が保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基によるシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンなどの極性（親水性）残基の置換および／または極性残基による非極性残基の置換が挙げられる。典型的なアミノ酸カテゴリー化を以下に要約する。
Figure 0007094963000001
プライマーまたはガイドＲＮＡなどの主題の核酸は、参照核酸内の指定のヌクレオチド位から約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内の近接している位置とハイブリダイズするもしくはそれを標的とするか、またはそれを含む。
「生体試料」という用語は、核酸またはタンパク質が回収可能である、対象内のまたは対象から入手可能な生物材料の試料を指す。生体試料という用語は、細胞またはそれらの後代などの、試料を処理することによって得られる任意の材料も包含し得る。生体試料の処理は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、固定、干渉する構成成分の不活化などの１つまたは複数を伴い得る。一部の実施形態では、生体試料は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどの核酸を含む。一部の実施形態では、生体試料は、タンパク質を含む。対象は、例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、齧歯類、マウス、またはラットを含めた任意の生物体であってよい。生体試料は、対象由来の任意の細胞、組織、または生体液に由来してよい。試料は、任意の臨床的に関連する組織、例えば、骨髄試料、腫瘍生検材料、穿刺吸引材料、または、血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、嚢胞液、もしくは尿などの体液試料を含み得る。一部の場合では、試料は、頬スワブを含む。本明細書に開示される方法において使用される試料は、アッセイ形式、検出方法の性質、および試料として使用される組織、細胞、または抽出物に基づいて変動する。
「対照試料」という用語は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントを有さない、好ましくは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の野生型対立遺伝子に関してホモ接合体である対象から得られた試料を指す。そのような試料は、生体試料と同時に得ることもでき、異なる時に得ることもできる。生体試料および対照試料はどちらも同じ組織または体液から得ることができる。
「相同な」配列（例えば、核酸配列）は、既知の参照配列と同一であるかまたは実質的に同様である配列を含み、したがって、相同な配列は、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。相同な配列としては、例えば、オルソロガス配列およびパラロガス配列を挙げることができる。相同な遺伝子は、例えば、一般には共通祖先のＤＮＡ配列から種分化事象（オルソロガス遺伝子）または遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを通じて伝わる。「オルソロガス」遺伝子は、共通祖先の遺伝子から種分化によって進化した異なる種の遺伝子を含む。オルソログは、一般には進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子は、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子を含む。パラログは進化の過程で新しい機能を進化させ得る。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的な環境、および人工的な環境（例えば、試験管）内で起こるプロセスまたは反応を包含する。「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、天然の環境（例えば、細胞または生物体または体、例えば、生物体内または体内の細胞）および天然の環境内で起こるプロセスまたは反応を包含する。「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、個体の体から取り出された細胞およびそのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を包含する。
１つまたは複数の記載されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分と組み合わせて含有し得る。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句は、特許請求の範囲が、請求項に記載されている指定の要素ならびに特許請求された発明の基本および新規の特性（複数可）に実質的に影響を及ぼさない要素を包含するものと解釈されるべきであることを意味する。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、本発明の請求項において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。
「任意選択の」または「必要に応じて」とは、その後に記載されている事象または状況が生じる場合と生じない場合があること、ならびに、当該説明が、事象または状況が生じる例および事象または状況が生じない例を含むことを意味する。
値の範囲の明示は、範囲内のまたは範囲を規定する全ての整数、および範囲内の整数によって規定される全ての部分範囲を含む。
文脈からそうでないことが明らかでない限り、「約」という用語は、記載値の標準の測定の誤差限界（例えば、ＳＥＭ）の範囲内の値を包含する。
「および／または」という用語は、関連する列挙されている項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能性のある組合せ、ならびに代替（「または」）として解釈される場合には組合せがないことを指し、それを包含する。
「または（ｏｒ）」という用語は、特定の一覧のうちの任意の１メンバーを指し、その一覧のメンバーの任意の組合せも含む。
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形の冠詞は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「１つの（ａ）Ｃａｓ９タンパク質」または「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）Ｃａｓ９タンパク質」という用語は、それらの混合物を含めた複数のＣａｓ９タンパク質を含み得る。
統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５であることを意味する。
詳細な説明
Ｉ．概要
アラニンおよびアスパラギン酸トランスアミナーゼレベルの低下；非アルコール性およびアルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変、および肝細胞癌を含めた慢性肝疾患のリスクの低下；ならびに単純な脂肪症からより臨床的に進行した段階の慢性肝疾患への進行の低減に関連することが発見されたＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントが本明細書において提示される。以前に同定されていない、バリアントに関連するＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の転写産物も本明細書において提示される。
ＨＳＤ１７Ｂ１３のバリアントに関連する単離された核酸およびタンパク質、ならびにこれらの核酸およびタンパク質を含む細胞が本明細書において提示される。ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子または核酸を発現するためのヌクレアーゼ作用剤、外因性ドナー配列、転写活性化因子、転写リプレッサー、および発現ベクターの任意の組合せの使用を通じて細胞を改変するための方法も提供される。慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある対象を処置するための治療および予防方法も提供される。
ＩＩ．ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアント
ＨＳＤ１７Ｂ１３のバリアントに関連する単離された核酸およびタンパク質（水酸化ステロイド１７－ベータデヒドロゲナーゼ１３、１７－ベータ－水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ１３、１７β－水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ－１３、１７β－ＨＳＤ１３、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ９、ＳＣＤＲ９、ＨＭＦＮ０３７６、ＮＩＩＬ４９７、およびＳＤＲ１６Ｃ３としても公知）が本明細書において提示される。ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、およそ１９ｋｂの長さであり、ゲノム内の４ｑ２２．１に位置する７つのエクソンおよび６つのイントロンを含む。例示的なヒトＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質配列には、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ７Ｚ５Ｐ４（配列番号２４０および２４１；それぞれＱ７Ｚ５Ｐ４－１およびＱ７Ｚ５Ｐ４－２）およびＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ番号ＮＰ＿８３５２３６およびＮＰ＿００１１２９７０２（それぞれ配列番号２４２および２４３）が割り当てられる。例示的なヒトＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡには、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ番号ＮＭ＿１７８１３５およびＮＭ＿００１１３６２３０（それぞれ配列番号２４４および２４５）が割り当てられる。
特に、イントロン６内のドナースプライス部位に隣接してアデニンが挿入されたスプライスＨＳＤ１７Ｂ１３のバリアント（ｒｓ７２６１３５６７）が本明細書において提示される。アデニンは、染色体のフォワード（プラス）鎖における挿入物であり、これは、染色体のリバース（マイナス）鎖に挿入されるチミンに対応する。ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は逆方向に転写されるので、このヌクレオチド挿入は、配列番号１として提示される例示的な野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子配列に対して配列番号２として提示される例示的なＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント配列へのチミンの挿入として反映される。したがって、この挿入は、本明細書では、配列番号１の１２６６５位と１２６６６位との間または配列番号２の１２６６６位へのチミンの挿入と称される。
野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を有する対象では２つのｍＲＮＡ転写産物（ＡおよびＢ；それぞれ配列番号４および５）が発現されることが以前に同定された。転写産物ＡはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の７つのエクソンを全て含むが、転写産物Ｂではエクソン２がスキップされている。転写産物Ａは、野生型対象において優位の転写産物である。しかし、発現される６種の追加的な以前に同定されていないＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物（Ｃ～Ｈ、それぞれ配列番号６～１１）が本明細書において提示される。これらの転写産物を図４に示す。転写産物Ｃでは、転写産物Ａと比較してエクソン６がスキップされている。転写産物Ｄでは、エクソン６の３’にグアニンが挿入されており、その結果、転写産物Ａと比較してエクソン７におけるフレームシフトおよびエクソン７の中途短縮が生じている。転写産物Ｅでは、転写産物Ａと比較してエクソン３と４との間に追加的なエクソンが存在する。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント保因者においてのみ発現される転写産物Ｆでは、転写産物Ａと比較してエクソン６からイントロン６へのリードスルーが存在する。転写産物Ｇでは、エクソン２がスキップされており、また、エクソン６の３’にグアニンが挿入されており、その結果、転写産物Ａと比較してエクソン７におけるフレームシフトおよびエクソン７の中途短縮が生じている。転写産物Ｈでは、エクソン３と４との間に追加的なエクソンが存在し、かつ、エクソン６の３’にグアニンが挿入されており、その結果、転写産物Ａと比較してエクソン７におけるフレームシフトおよびエクソン７の中途短縮が生じている。転写産物Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＨは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント保因者において優位であり、転写産物ＤはＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者において最も豊富な転写産物である。低レベルで発現する１種の追加的な以前に同定されていないＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物（Ｆ’、配列番号２４６）も本明細書において提示される。転写産物Ｆと同様に、転写産物Ｆ’も転写産物Ａと比較してエクソン６からイントロン６へのリードスルーを含むが、転写産物Ｆとは対照的に、このリードスルーは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子に存在するチミンの挿入を含まない。各転写産物についてのＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のエクソンのヌクレオチド位を以下に提示する。
Figure 0007094963000002
Figure 0007094963000003
本明細書の他の箇所でより詳細に説明されている通り、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントは、アラニンおよびアスパラギン酸トランスアミナーゼレベルの低下、ならびに非アルコール性およびアルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変、および肝細胞癌を含めた慢性肝疾患のリスクの低下に関連する。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントはまた、単純な脂肪症からより臨床的に進行した段階の慢性肝疾患への進行の低減にも関連する。
Ａ．核酸
ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントおよびバリアントＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物に関連する単離された核酸が本明細書に開示される。本明細書に開示される核酸のいずれかとストリンジェントなまたは中等度の条件でハイブリダイズする単離された核酸も開示される。そのような核酸は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントタンパク質を発現させるのに、または、それぞれが本明細書の他の箇所に詳しく記載されているプライマー、プローブ、外因性ドナー配列、ガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡとして有用であり得る。
開示されるポリヌクレオチドと相互作用することが可能な機能的核酸も開示される。機能的核酸は、標的分子への結合または特定の反応の触媒などの特定の機能を有する核酸分子である。機能的核酸の例としては、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部ガイド配列が挙げられる。機能的核酸分子は、エフェクター、阻害剤、モジュレーター、および標的分子が有する特異的活性の刺激物質としての機能を果たし得るか、または、機能的核酸分子は、任意の他の分子とは独立した新規の活性を有し得る。
アンチセンス分子は、標的核酸分子と規範的または非規範的塩基対合のいずれかを通じて相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子の相互作用は、標的分子の、例えばＲＮａｓｅＨ媒介性ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解による破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写または複製などの標的分子に対して通常なされるプロセシング機能を妨害するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。最も利用しやすい標的分子の領域を見つけることによってアンチセンス効率を最適化するための多数の方法が存在する。例示的な方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択実験ならびにＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用したＤＮＡ改変試験である。アンチセンス分子は、一般に、標的分子に１０－６未満もしくはそれと等しい解離定数（ｋｄ）、１０－８未満もしくはそれと等しい解離定数（ｋｄ）、１０－１０未満もしくはそれと等しい解離定数（ｋｄ）、または１０－１２未満もしくはそれと等しい解離定数（ｋｄ）で結合する。アンチセンス分子の設計および使用を補助する方法および技法の代表的な試料は、以下の非限定的な米国特許の一覧において見出すことができる：米国特許第５，１３５，９１７号；同第５，２９４，５３３号；同第５，６２７，１５８号；同第５，６４１，７５４号；同第５，６９１，３１７号；同第５，７８０，６０７号；同第５，７８６，１３８号；同第５，８４９，９０３号；同第５，８５６，１０３号；同第５，９１９，７７２号；同第５，９５５，５９０号；同第５，９９０，０８８号；同第５，９９４，３２０号；同第５，９９８，６０２号；同第６，００５，０９５号；同第６，００７，９９５号；同第６，０１３，５２２号；同第６，０１７，８９８号；同第６，０１８，０４２号；同第６，０２５，１９８号；同第６，０３３，９１０号；同第６，０４０，２９６号；同第６，０４６，００４号；同第６，０４６，３１９号；および同第６，０５７，４３７号、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。アンチセンス分子の例としては、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられ、これらは、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されている。
本明細書に開示される単離された核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含み得る。単離された核酸はまた、例えばベクター内で異種核酸配列と、または異種標識と連結または融合することもできる。例えば、本明細書に開示される単離された核酸は、単離された核酸および異種核酸配列を含むベクターまたは外因性ドナー配列内にあってよい。単離された核酸はまた、蛍光標識などの異種標識と連結または融合することもできる。標識の他の例は、本明細書の他の箇所で開示される。
開示される核酸分子は、例えば、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体もしくはヌクレオチド置換体などの非天然もしくは修飾ヌクレオチドで構成されてよい。そのようなヌクレオチドは、修飾塩基、糖もしくはリン酸基を含有するヌクレオチド、またはその構造内に非天然部分が組み入れられたヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドの例としては、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、アミノ化ヌクレオチド、脱アミノ化ヌクレオチド、アルキル化ヌクレオチド、ベンジル化ヌクレオチドおよびフルオロフォアで標識されたヌクレオチドが挙げられる。
本明細書に開示される核酸分子は、１つまたは複数のヌクレオチド類似体または置換を含み得る。ヌクレオチド類似体は、塩基部分、糖部分、またはリン酸部分のいずれかに、ある型の修飾を含有するヌクレオチドである。塩基部分に対する修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕの天然および合成的修飾ならびに異なるプリンまたはピリミジン塩基、例えば、プソイドウリジン、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、および２－アミノアデニン－９－イルを含む。修飾塩基としては、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが挙げられる。追加的な塩基修飾は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号；Englischら（１９９１年）Angewandte Chemie、International Edition、３０巻：６１３頁；およびSanghvi, Y. S.、第１５章、Antisense Research and Applications、２８９～３０２頁、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、CRC Press、１９９３年において見出すことができる。２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、および５－メチルシトシンを含めた５置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリンなどのある特定のヌクレオチド類似体では、２重鎖形成の安定性が増大し得る。多くの場合、塩基修飾は、２重鎖安定性の増大などの独特の性質を実現するために、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルなどの糖修飾と組み合わせることができる。塩基修飾の範囲を詳述および記載している米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；および同第５，６８１，９４１号などの多数の米国特許が存在する。これらのそれぞれは、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレオチド類似体は、糖部分の修飾も含み得る。糖部分に対する修飾としては、例えば、リボースおよびデオキシリボースに対する天然修飾ならびに合成的修飾を挙げることができる。糖修飾としては、例えば、２’位における以下の修飾が挙げられる：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な２’糖修飾としては、例えば、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ ＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＯＮＨ２、および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２も挙げられ、ここで、ｎおよびｍは１から約１０までである。
２’位における他の修飾としては、例えば、Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換基が挙げられる。糖の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’連結オリゴヌクレオチドの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位にも同様の修飾を行うことができる。修飾糖は、ＣＨ２およびＳなどの、架橋環酸素に修飾を含有する糖も含み得る。ヌクレオチド糖類似体は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示している多数の米国特許、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号が存在する。
ヌクレオチド類似体は、リン酸部分において修飾されていてもよい。修飾リン酸部分としては、例えば、２つのヌクレオチド間の連結が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含めたホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェートを含有するように修飾されたリン酸部分が挙げられる。これらの、２つのヌクレオチド間のリン酸または修飾リン酸連結は、３’－５’連結または２’－５’連結によるものであってよく、連結は、３’－５’から５’－３’へまたは２’－５’から５’－２’への方向性の逆転を含有してよい。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が、修飾リン酸を含有するヌクレオチドの作出および使用の仕方を教示しており、それらとして、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号が挙げられる。
ヌクレオチド置換体は、ヌクレオチドと同様の機能的性質を有するがリン酸部分を含有しない分子、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ヌクレオチド置換体は、核酸をワトソン・クリックまたはフーグスティーン様式で認識するが、リン酸部分以外の部分を通じて連結する分子を含む。ヌクレオチド置換体は、妥当な標的核酸と相互作用した場合、二重らせん型構造に従うことができる。
ヌクレオチド置換体はまた、リン酸部分または糖部分が置き換えられたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体も含む。ヌクレオチド置換体は、標準のリン原子を含有しない場合がある。リン酸に対する置換体は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結であり得る。これらとしては、モルホリノ連結（一部ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他のものを有するものが挙げられる。多数の米国特許が、これらの型のリン酸置換えの作出および使用の仕方を開示しており、それらとして、これだけに限定されないが、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が挙げられる。
ヌクレオチド置換体では、ヌクレオチドの糖部分およびリン酸部分の両方を、例えば、アミド型連結（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置き換えることができることも理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号はＰＮＡ分子の作出および使用の仕方を教示しており、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるNielsenら（１９９１年）Science、２５４巻：１４９７～１５００頁も参照されたい。
例えば、細胞内取り込みを増強するために、他の型の分子（コンジュゲート）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に連結することも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に連結することができる。そのようなコンジュゲートとしては、例えば、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Letsingerら（１９８９年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８６巻：６５５３～６５５６頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、コール酸（Manoharanら（１９９４年）Bioorg. Med. Chem. Let.、４巻：１０５３～１０６０頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオールなどのチオエーテル（Manoharanら（１９９２年）Ann. N.Y. Acad. Sci.、６６０巻：３０６～３０９頁；Manoharanら（１９９３年）Bioorg. Med. Chem. Let.、３巻：２７６５～２７７０頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、チオコレステロール（Oberhauserら（１９９２年）Nucl. Acids Res.、２０巻：５３３～５３８頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Saison-Behmoarasら（１９９１年）EMBO J.、１０巻：１１１１～１１１８頁；Kabanovら（１９９０年）FEBS Lett.、２５９巻：３２７～３３０頁；Svinarchukら（１９９３年）Biochimie、７５巻：４９～５４頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネートなどのリン脂質（Manoharanら（１９９５年）Tetrahedron Lett.、３６巻：３６５１～３６５４頁；Sheaら（１９９０年）Nucl. Acids Res.、１８巻：３７７７～３７８３頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharanら（１９９５年）Nucleosides & Nucleotides、１４巻：９６９～９７３頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、またはアダマンタン酢酸（Manoharanら（１９９５年）Tetrahedron Lett.、３６巻：３６５１～３６５４頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、パルミチル部分（Mishraら（１９９５年）Biochim. Biophys. Acta、１２６４巻：２２９～２３７頁）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Crookeら（１９９６年）J. Pharmacol. Exp. Ther.、２７７巻：９２３～９３７頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。多数の米国特許が、そのようなコンジュゲートの調製を教示しており、それらとして、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号が挙げられる。
本明細書に開示される単離された核酸は、天然に存在するＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子またはｍＲＮＡ転写産物のヌクレオチド配列を含む場合もあり、天然に存在しない配列を含む場合もある。一例では、天然に存在しない配列は、天然に存在しない配列と、同義の突然変異またはコードされるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質に影響を及ぼさない突然変異に起因して異なり得る。例えば、配列は、同義の突然変異またはコードされるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質に影響を及ぼさない突然変異を除いて同一であり得る。同義の突然変異または置換とは、もたらされるアミノ酸配列が改変されないような、タンパク質をコードする遺伝子のエクソン内の１つのヌクレオチドでの別のヌクレオチドの置換である。これは、いくつかのアミノ酸が１つよりも多くの３塩基対コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重が原因で可能性が生じる。同義の置換は、例えば、コドン最適化のプロセスで使用される。
本明細書に開示される核酸によってコードされるタンパク質ならびに本明細書に開示される単離された核酸またはタンパク質および単離された核酸またはタンパク質の安定性を増大させる（例えば、所与の保管条件下（例えば、－２０℃、４℃、もしくは周囲温度）で分解生成物が閾値未満、例えば出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満に留まる期間を延長させる；またはｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性を増大させる）担体を含む組成物も本明細書に開示される。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、および脂質微小管（ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）が挙げられる。
（１）ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの突然変異体残基を含む核酸
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含み、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントと最適にアラインメントした場合、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント（配列番号２）の１２６６６位に対応する位置にチミンを有する（または１２６６６位および１２６６７位に対応する位置にチミンを有する）単離された核酸が本明細書に開示される。すなわち、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含み、野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と最適にアラインメントした場合、野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子（配列番号１）の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む単離された核酸が本明細書に開示される。そのような単離された核酸は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアント転写産物およびタンパク質を発現させるのに、または外因性ドナー配列として有用であり得る。そのような単離された核酸は、例えば、ガイドＲＮＡ、プライマー、およびプローブとしても有用であり得る。
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、任意の生物体に由来するＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子であってよい。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子または非ヒト哺乳動物、齧歯類、マウス、またはラットなどの別の生物体に由来するオルソログであってよい。
集団内の遺伝子配列は、一塩基多型などの多型に起因して変動し得ることが理解される。本明細書において提示される例は、単に例示的な配列である。他の配列も可能である。一例として、少なくとも１５個連続したヌクレオチドは、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位または１２６６６位および１２６６７位を含むＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント（配列番号２）の対応する配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であってよい。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号２の１２６６６位または１２６６６位および１２６６７位を含む、配列番号２の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含む。別の例として、少なくとも１５個連続したヌクレオチドは、配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位および１２６６６位を含む野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子（配列番号１）の対応する配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり得、ここで、配列番号１の１２６６５位に対応する位置と１２６６６位に対応する位置との間にチミンが存在する。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号１の１２６６５位および１２６６６位を含む、配列番号１の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含み、ここで、配列番号１の１２６６５位に対応する位置と１２６６６位に対応する位置との間にチミンが存在する。
単離された核酸は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の少なくとも２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、または１０００個連続したヌクレオチドを含み得る。あるいは、単離された核酸は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の少なくとも１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、１１０００個、１２０００個、１３０００個、１４０００個、１５０００個、１６０００個、１７０００個、１８０００個、または１９０００個連続したヌクレオチドを含み得る。
一部の場合では、単離された核酸は、遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子を含み得る。一例として、欠失したセグメントは、１つまたは複数のイントロン配列を含む。そのようなＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ由来のエクソン１～７に対応するエクソン、および配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のイントロン６に対応するイントロンを含み得る。一例として、ＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子は、配列番号２由来のエクソン１～７およびイントロン６を含み得る。ミニ遺伝子は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されている。
（２）ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの突然変異体残基に隣接するかまたはそれを含む配列とハイブリダイズする核酸
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントと最適にアラインメントした場合、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント（配列番号２）の１２６６６位または１２６６６位および１２６６７位に対応する位置を含むかまたはそれから１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内であるセグメントでＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子）とハイブリダイズする少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含む単離された核酸も本明細書に開示される。そのような単離された核酸は、例えば、ガイドＲＮＡ、プライマー、プローブ、または外因性ドナー配列として有用であり得る。
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、任意の生物体に由来するＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子であってよい。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子であっても非ヒト哺乳動物、マウス、またはラットなどの別の生物体由来のオルソログであってもよい。
一例として、少なくとも１５個連続したヌクレオチドは、配列番号２と最適にアラインメントした場合、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント（配列番号２）の対応する配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のセグメントまたはＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子とハイブリダイズし得る。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号２の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズし得る。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位もしくは１２６６６位および１２６６７位または配列番号２の１２６６６位もしくは１２６６６位および１２６６７位に対応する位置を含むセグメントとハイブリダイズする。
単離された核酸がハイブリダイズし得るセグメントは、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の少なくとも２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、７５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、または１０００個連続したヌクレオチドを含み得る。あるいは、単離された核酸は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の少なくとも１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、１１０００個、１２０００個、１３０００個、１４０００個、１５０００個、１６０００個、１７０００個、１８０００個、または１９０００個連続したヌクレオチドを含み得る。あるいは、単離された核酸がハイブリダイズし得るセグメントは、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の最大２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、７５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、または１０００個連続したヌクレオチドであり得る。例えば、セグメントは、約１５～１００ヌクレオチドの長さ、または約１５～３５ヌクレオチドの長さであり得る。
（３）ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントによって生じるｃＤＮＡおよびバリアント転写産物
転写産物Ａ～Ｈのいずれか１つと最適にアラインメントした場合、転写産物Ａ～Ｈ（それぞれ配列番号４～１１）、特に転写産物Ｃ～Ｈのいずれか１つに対応するｍＲＮＡ転写産物またはｃＤＮＡの全部または一部に対応する核酸も提供される。集団内の遺伝子配列およびそのような遺伝子から転写されるｍＲＮＡ配列は、一塩基多型などの多型に起因して変動し得ることが理解される。各転写産物について本明細書において提示される配列は、単に例示的な配列である。他の配列も可能である。具体的な非限定的な例を以下に提示する。そのような単離された核酸は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアント転写産物およびタンパク質を発現させるのに有用であり得る。
単離された核酸は、任意の長さであってよい。例えば、単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、または２０００個連続したヌクレオチドを含み得る。一部の場合では、単離された核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする連続したヌクレオチドを含み、連続したヌクレオチドは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の少なくとも２つの異なるエクソンに由来する配列（例えば、イントロンの介在を伴わず、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の少なくとも１つのエクソンとエクソンとの境界にまたがる）を含む。
ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ（配列番号７）、転写産物Ｇ（配列番号１０）、および転写産物Ｈ（配列番号１１）は、エクソン６の３’末端にグアニンの挿入を含み、その結果、転写産物Ａと比較してエクソン７のフレームシフトおよびエクソン７によってコードされるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の領域の中途短縮が生じている。したがって、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ、Ｇ、およびＨ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸が本明細書において提示される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み、連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）のセグメントが、それぞれ配列番号７、１０、または１１と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）、配列番号１０（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｇ）、または配列番号１１（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり、かつ、セグメントが、配列番号７のエクソン６の３’末端の残基８７８に対応する残基にグアニンを含む（すなわち、転写産物Ａと比べて、エクソン７の出発点のグアニンに加えて、エクソン６の３’末端にグアニンが挿入されている）か、配列番号１０のエクソン６の３’末端の残基７７０に対応する残基にグアニンを含む（すなわち、転写産物Ｂと比べて、エクソン７の出発点のグアニンに加えて、エクソン６の３’末端にグアニンが挿入されている）か、または配列番号１１のエクソン６の３’末端の残基９５０に対応する残基にグアニンを含む（すなわち、転写産物Ｅと比べて、エクソン７の出発点のグアニンに加えて、エクソン６の３’末端にグアニンが挿入されている）、単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、エクソン６および７のそれぞれに、グアニンの挿入がＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、エクソン７の出発点のグアニン、転写産物Ｆにおけるイントロン６へのリードスルー、または転写産物Ｃにおけるエクソン６の欠失）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドを含むであろうことが理解される。
一例として、単離された核酸は、エクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列番号７の少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み得、必要に応じて、配列番号７のエクソン６および７を含み、必要に応じて、配列番号７の配列全体を含む。
必要に応じて、単離された核酸は、転写産物Ｇ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントをさらに含み、単離された核酸は、転写産物Ｈ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントをさらに含む。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、そのような単離された核酸は、転写産物Ｈと区別されるように、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）のエクソン３と４との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）のセグメントを含み得る。同様に、そのような単離された核酸は、転写産物Ｇと区別されるように、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）のエクソン２内の領域、配列番号７のエクソン１とエクソン２との境界にまたがる領域、または配列番号７のエクソン２とエクソン３との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）のセグメントを含み得る。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号７に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、配列番号１５に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）を含むＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする。転写産物Ｄと同様に、転写産物Ｈ（配列番号１１）は、転写産物Ａと比較して、エクソン６の３’にグアニンの挿入を含む。転写産物Ｈは、転写産物Ａおよび転写産物Ｄと比較して、エクソン３と４との間に追加的なエクソン（エクソン３’）をさらに含む。したがって、上記に関して記載されている通り、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ、Ｇ、およびＨ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントを含むが、転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｈ（またはその断片またはホモログ）のセグメント（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）をさらに含む、単離された核酸が本明細書において提示される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）のセグメントが、配列番号１１と最適にアラインメントした場合、配列番号１１（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）のエクソン３’内の領域、配列番号１１のエクソン３とエクソン３’との境界にまたがる領域、または配列番号１１のエクソン３’とエクソン４との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、転写産物Ｄについて記載されている単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、エクソン３および３’のそれぞれまたはエクソン３’および４のそれぞれに、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、エクソン３と４との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドを含むであろうことが理解される。例えば、エクソン３’の領域は、エクソン３’全体を含み得る。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号１１に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、配列番号１９に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＨ）を含むＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする。
一例として、単離された核酸は、エクソン３’内の領域、エクソン３とエクソン３’との境界にまたがる領域、またはエクソン３’とエクソン４との境界にまたがる領域を含む配列番号１１の少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み得、必要に応じて、配列番号１１のエクソン３’全体を含み、必要に応じて、配列番号１１の配列全体を含む。
転写産物Ｄと同様に、転写産物Ｇ（配列番号１０）は、転写産物Ａと比較して、エクソン６の３’にグアニンの挿入を含む。しかし、さらに、転写産物Ｇでは、転写産物Ａおよび転写産物Ｄと比較してエクソン２が欠けている（すなわち、転写産物Ｇは、転写産物ＡおよびＤには存在しないエクソン１とエクソン３との境界を含む）。したがって、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ、Ｇ、およびＨ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントを含むが、転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｇ（またはその断片またはホモログ）由来のセグメント（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）をさらに含む、上記の単離された核酸が本明細書において提示される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）のセグメントが、配列番号１０と最適にアラインメントした場合、配列番号１０（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｇ）のエクソン１とエクソン３との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、転写産物Ｄについて記載されている単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、エクソン１および３のそれぞれに、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、エクソン１と２との境界またはエクソン２と３との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドを含むであろうことが理解される。例えば、領域は、配列番号１０のエクソン１および３の全体を含み得る。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号１０に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｇ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、配列番号１８に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＧ）を含むＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする。
一例として、単離された核酸は、エクソン１とエクソン３との境界にまたがる領域を含む配列番号１０の少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み得、必要に応じて、配列番号１０のエクソン１および３を含み、必要に応じて、配列番号１０の配列全体を含む。
転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｅ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸も本明細書において提示される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。転写産物Ｅ（配列番号８）は、転写産物Ａと比較して、エクソン３と４との間に追加的なエクソンを含む。したがって、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み、連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）のセグメントが、配列番号８と最適にアラインメントした場合、配列番号８（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｅ）のエクソン３’内の領域、配列番号８のエクソン３とエクソン３’との境界にまたがる領域、または配列番号８のエクソン３’とエクソン４との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、エクソン３および３’のそれぞれまたはエクソン３’および４のそれぞれに、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、エクソン３と４との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドを含むであろうことが理解される。例えば、エクソン３’の領域は、エクソン３’全体を含み得る。必要に応じて、単離された核酸は、転写産物Ｈ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｅ（またはその断片またはホモログ）由来のセグメント（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）をさらに含む。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）のセグメントが、配列番号８と最適にアラインメントした場合、配列番号８（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｅ）のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、上記の単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、エクソン６および７のそれぞれに、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（特に、転写産物Ｈのエクソン６の３’末端の追加的なグアニン）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドを含むであろうことが理解される。例えば、領域は、配列番号８のエクソン６および７の全体を含み得る。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号８に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｅ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、配列番号１６に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＥ）を含むＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする。
一例として、単離された核酸は、エクソン３’内の領域、エクソン３とエクソン３’との境界にまたがる領域、またはエクソン３’とエクソン４との境界にまたがる領域を含む配列番号８の少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み得、必要に応じて、配列番号８のエクソン３’全体を含み、必要に応じて、配列番号８の配列全体を含む。
転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｆ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸も本明細書において提示される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。転写産物Ｆ（配列番号９）は、転写産物Ａと比較して、エクソン６からイントロン６へのリードスルーを含み、リードスルーは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子に存在するチミンの挿入を含む。したがって、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み、連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）のセグメントが、配列番号９と最適にアラインメントした場合、配列番号９（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｆ）のイントロン６へのリードスルー内の領域または配列番号９のイントロン６へのリードスルーと残りのエクソン６との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、リードスルーに、リードスルーがＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、他のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物のエクソン６と７との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドを含むであろうことが理解される。必要に応じて、連続したヌクレオチドは、転写産物Ｆ’（配列番号２４６）には存在しない、転写産物Ｆに存在する配列（すなわち、チミンの挿入）を含む。転写産物Ｆ’はまた、転写産物Ａと比較して、エクソン６からイントロン６へのリードスルーも含むが、リードスルーは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子に存在するチミンの挿入を含まない。例えば、領域は、配列番号９のイントロン６へのリードスルー全体であり得る。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号９に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｆ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、配列番号１７（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＦ）に記載の配列を含むＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする。
一例として、単離された核酸は、イントロン６へのリードスルー内の領域またはイントロン６へのリードスルーと残りのエクソン６との境界にまたがる領域を含む配列番号９の少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み得、必要に応じて、イントロン６へのリードスルー全体を含み、必要に応じて、配列番号９の配列全体を含む。
転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｆ’（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸も本明細書において提示される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。転写産物Ｆ’（配列番号２４６）は、転写産物Ａと比較して、エクソン６からイントロン６へのリードスルーを含み、リードスルーは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子に存在するチミンの挿入を含まない。したがって、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み、連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）のセグメントが、配列番号２４６と最適にアラインメントした場合、配列番号２４６（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｆ’）のイントロン６へのリードスルー内の領域または配列番号２４６のイントロン６へのリードスルーと残りのエクソン６との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、リードスルーに、リードスルーがＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、他のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物のエクソン６と７との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドを含むであろうことが理解される。必要に応じて、連続したヌクレオチドは、転写産物Ｆ（配列番号９）には存在しない、転写産物Ｆ’に存在する配列を含む。転写産物Ｆのリードスルーは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子に存在するチミンの挿入を含むが、転写産物Ｆ’のリードスルーはそれを含まない。例えば、領域は、配列番号２４６のイントロン６へのリードスルー全体であり得る。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号２４６に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｆ’）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、配列番号２４７に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＦ’）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする。
一例として、単離された核酸は、イントロン６へのリードスルー内の領域またはイントロン６へのリードスルーと残りのエクソン６との境界にまたがる領域を含む配列番号２４６の少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み得、必要に応じて、イントロン６へのリードスルー全体を含み、必要に応じて、配列番号２４６の配列全体を含む。
転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｃ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸も本明細書において提示される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。転写産物Ｃ（配列番号６）では、転写産物Ａと比較して、エクソン６が欠けている（すなわち、転写産物Ｃは、転写産物Ａには存在しないエクソン５とエクソン７との境界を含む）。したがって、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の全部または一部をコードする少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み、連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）のセグメントが、配列番号６と最適にアラインメントした場合、配列番号６（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ）のエクソン５とエクソン７との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、エクソン５および７のそれぞれに、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、他のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物のエクソン５と６との境界またはエクソン６と７との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドを含むであろうことが理解される。例えば、領域は、配列番号６のエクソン５および７の全体を含み得る。必要に応じて、単離された核酸は、配列番号６に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、配列番号１４に記載の配列（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ）を含むＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする。
一例として、単離された核酸は、エクソン５とエクソン７との境界にまたがる領域を含む配列番号６の少なくとも１５個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０個連続したヌクレオチド）を含み得、必要に応じて、配列番号６のエクソン５および７の全体を含み、必要に応じて、配列番号６の配列全体を含む。
（４）ｃＤＮＡおよびバリアントＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物とハイブリダイズする核酸
転写産物Ａ～Ｈのいずれか１つと最適にアラインメントした場合、転写産物Ａ～Ｈ（それぞれ配列番号４～１１）、特に転写産物Ｃ～Ｈのいずれか１つに対応するｍＲＮＡ転写産物またはｃＤＮＡのセグメントとハイブリダイズする核酸も提供される。具体的な非限定的な例を以下に提示する。そのような単離された核酸は、例えば、プライマー、プローブ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡとして有用であり得る。
単離された核酸がハイブリダイズし得るセグメントは、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含み得る。単離された核酸がハイブリダイズし得るセグメントは、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、７５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、または２０００個連続したヌクレオチドを含み得る。あるいは、単離された核酸がハイブリダイズし得るセグメントは、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の最大２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、７５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、または１０００個連続したヌクレオチドであり得る。例えば、セグメントは、約１５～１００ヌクレオチドの長さ、または約１５～３５ヌクレオチドの長さであり得る。
ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ（配列番号７）、転写産物Ｇ（配列番号１０）、および転写産物Ｈ（配列番号１１）は、エクソン６の３’末端にグアニンの挿入を含み、その結果、転写産物Ａと比較してエクソン７におけるフレームシフトおよびエクソン７の中途短縮が生じている。したがって、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ、Ｇ、およびＨ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸が本明細書において提示される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸であって、連続したヌクレオチドが、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含み、セグメントが、配列番号７のエクソン６の３’末端の残基８７８に対応する残基にグアニンを含む（すなわち、転写産物Ａと比べて、エクソン７の出発点のグアニンに加えて、エクソン６の３’末端にグアニンが挿入されている）、単離された核酸が本明細書において提示される。あるいは、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドであるセグメントとハイブリダイズする単離された核酸であって、連続したヌクレオチドが、配列番号１０と最適にアラインメントした場合、配列番号１０（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｇ）のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含み、セグメントが、配列番号１０のエクソン６の３’末端の残基７７０に対応する残基にグアニンを含む（すなわち、転写産物Ｂと比べて、エクソン７の出発点のグアニンに加えて、エクソン６の３’末端にグアニンが挿入されている）、単離された核酸が本明細書において提示される。あるいは、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸であって、連続したヌクレオチドが、配列番号１１と最適にアラインメントした場合、配列番号１１（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含み、セグメントが、配列番号１１のエクソン６の３’末端の残基９５０に対応する残基にグアニンを含む（すなわち、転写産物Ｅと比べて、エクソン７の出発点のグアニンに加えて、エクソン６の３’末端にグアニンが挿入されている）、単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、エクソン６および７のそれぞれの、グアニンの挿入がＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、転写産物Ｆにおけるイントロン６へのリードスルーまたは転写産物Ｃにおけるエクソン６の欠失）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されようことが理解される。
一例として、セグメントは、配列番号７のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる（すなわち、配列番号７の残基８７８のグアニンを含む）領域を含み得る。別の例として、セグメントは、配列番号１０のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる（すなわち、配列番号１０の残基７７０のグアニンを含む）領域を含み得る。別の例として、セグメントは、配列番号１１のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる（すなわち、配列番号１１の残基９５０のグアニンを含む）領域を含み得る。
必要に応じて、単離された核酸は、転写産物Ｇ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、１５個連続したヌクレオチド）をさらに含み、単離された核酸は、転写産物Ｈ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントとハイブリダイズする領域をさらに含む。そのようなセグメントは、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、転写産物Ｈ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）は、転写産物Ｈと区別されるように、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）のエクソン３と４との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であってよい。同様に、転写産物Ｇ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）は、転写産物Ｇと区別されるように、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）のエクソン２内の領域、配列番号７のエクソン１とエクソン２との境界にまたがる領域、または配列番号７のエクソン２とエクソン３との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であってよい。
転写産物Ｄと同様に、転写産物Ｈ（配列番号１１）は、転写産物Ａと比較して、エクソン６の３’末端にグアニンの挿入を含む。転写産物Ｈは、転写産物Ａおよび転写産物Ｄと比較して、エクソン３と４との間に追加的なエクソンをさらに含む。したがって、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ、Ｇ、およびＨ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントとハイブリダイズする領域を含むが、転写産物Ｈ（またはその断片またはホモログ）には存在するが転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）には存在しないセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）をさらに含む、上記の単離された核酸が本明細書において提示される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、セグメントは、配列番号１１と最適にアラインメントした場合、配列番号１１（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｈ）のエクソン３’内の領域（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）、配列番号１１のエクソン３とエクソン３’との境界にまたがる領域、または配列番号１１のエクソン３’とエクソン４との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であってよい。そのような核酸は、エクソン３および３’のそれぞれまたはエクソン３’および４のそれぞれの、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、エクソン３と４との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されようことが理解される。
一例として、セグメントは、エクソン３’内にあるか、エクソン３とエクソン３’との境界にまたがるか、またはエクソン３’とエクソン４との境界にまたがる、配列番号１１の領域を含み得る。
転写産物Ｄと同様に、転写産物Ｇ（配列番号１０）は、転写産物Ａと比較して、エクソン６の３’末端にグアニンの挿入を含む。しかし、さらに、転写産物Ｇでは、転写産物Ａおよび転写産物Ｄと比較してエクソン２が欠けている（すなわち、転写産物Ｇは、転写産物ＡおよびＤには存在しないエクソン１とエクソン３との境界を含む）。したがって、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ、Ｇ、およびＨ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントとハイブリダイズする領域を含むが、転写産物Ｇ（またはその断片またはホモログ）には存在するが転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）には存在しないセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）をさらに含む、上記の単離された核酸が本明細書において提示される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、セグメントは、配列番号１０と最適にアラインメントした場合、配列番号１０（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｇ）のエクソン１とエクソン３との境界にまたがる領域（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であってよい。そのような核酸は、エクソン１および３のそれぞれの、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、エクソン１と２との境界またはエクソン２と３との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されようことが理解される。
一例として、セグメントは、エクソン１とエクソン３との境界にまたがる配列番号１０の領域を含み得る。
転写産物Ｅ（またはその断片またはホモログ）には存在するが、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸のセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸も提供される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。転写産物Ｅ（配列番号８）は、転写産物Ａと比較して、エクソン３と４との間に追加的なエクソンを含む。したがって、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸であって、連続したヌクレオチドが、配列番号８と最適にアラインメントした場合、配列番号８（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｅ）のエクソン３’内の領域（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）、配列番号８のエクソン３とエクソン３’との境界にまたがる領域、または配列番号８のエクソン３’とエクソン４との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメントを含む、単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、エクソン３および３’のそれぞれまたはエクソン３’および４のそれぞれの、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、エクソン３と４との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されようことが理解される。
一例として、セグメントは、エクソン３’内にあるか、配列番号８のエクソン３とエクソン３’との境界にまたがるか、またはエクソン３’とエクソン４との境界にまたがる、配列番号８の領域を含み得る。
必要に応じて、単離された核酸は、転写産物Ｈ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｅ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、１５個連続したヌクレオチド）をさらに含む。そのようなセグメントは、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、転写産物Ｈ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｅ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）は、転写産物Ｇと区別されるように、配列番号８と最適にアラインメントした場合、配列番号８（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｅ）のエクソン６と７との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であってよい。そのような核酸は、エクソン６および７のそれぞれの、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（特に、転写産物Ｈのエクソン６の３’末端の追加的なグアニン）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されようことが理解される。
転写産物Ｆ（またはその断片またはホモログ）には存在するが、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸のセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸も提供される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。転写産物Ｆ（配列番号９）は、転写産物Ａと比較して、エクソン６からイントロン６へのリードスルーを含む。したがって、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸であって、連続したヌクレオチドが、配列番号９と最適にアラインメントした場合、配列番号９（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｆ）のイントロン６へのリードスルー内の領域または配列番号９のイントロン６へのリードスルーと残りのエクソン６との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、リードスルー内の、リードスルーがＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、他のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物のエクソン６と７との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されようことが理解される。必要に応じて、連続したヌクレオチドは、転写産物Ｆ’（配列番号２４６）には存在しない、転写産物Ｆに存在する配列（すなわち、チミンの挿入）を含む。転写産物Ｆ’はまた、転写産物Ａと比較して、エクソン６からイントロン６へのリードスルーも含むが、リードスルーは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子に存在するチミンの挿入を含まない。
一例として、セグメントは、イントロン６へのリードスルー内にあるか、またはイントロン６へのリードスルーと残りのエクソン６との境界にまたがる、配列番号９の領域を含み得る。
転写産物Ｆ’（またはその断片またはホモログ）には存在するが、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸のセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸も提供される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。転写産物Ｆ’（配列番号２４６）は、転写産物Ａと比較して、エクソン６からイントロン６へのリードスルーを含む。したがって、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸であって、連続したヌクレオチドが、配列番号２４６と最適にアラインメントした場合、配列番号２４６（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｆ’）のイントロン６へのリードスルー内の領域または配列番号２４６のイントロン６へのリードスルーと残りのエクソン６との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む、単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、リードスルー内の、リードスルーがＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、他のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物のエクソン６と７との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されようことが理解される。必要に応じて、連続したヌクレオチドは、転写産物Ｆ（配列番号９）には存在しない、転写産物Ｆ’に存在する配列を含む。転写産物Ｆのリードスルーは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子に存在するチミンの挿入を含むが、転写産物Ｆ’のリードスルーはそれを含まない。
一例として、セグメントは、イントロン６へのリードスルー内にあるか、またはイントロン６へのリードスルーと残りのエクソン６との境界にまたがる、配列番号２４６の領域を含み得る。
転写産物Ｃ（またはその断片またはホモログ）には存在するが、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸のセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む単離された核酸も提供される。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。転写産物Ｃ（配列番号６）では、転写産物Ａと比較して、エクソン６が欠けている（すなわち、転写産物Ｃは、転写産物Ａには存在しないエクソン５とエクソン７との境界を含む）。したがって、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸であって、連続したヌクレオチドが、配列番号６と最適にアラインメントした場合、配列番号６（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ）のエクソン５とエクソン７との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む、単離された核酸が本明細書において提示される。そのような核酸は、エクソン５および７の、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、他のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物のエクソン５と６との境界またはエクソン６と７との境界）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されようことが理解される。
一例として、セグメントは、エクソン５とエクソン７との境界にまたがる、配列番号６由来の領域を含み得る。
ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）であって、連続したヌクレオチドが、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ（配列番号７）の領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む、単離された核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）も本明細書において提示される。単離された核酸は、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含み得る。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ（配列番号７）は、エクソン６の３’末端におけるグアニンの挿入を含み、その結果、転写産物Ａ（配列番号４）と比較してエクソン７におけるフレームシフトおよびエクソン７の中途短縮が生じている。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸であって、連続したヌクレオチドが、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む、単離された核酸が本明細書において提示される。セグメントは、配列番号７のエクソン６の３’末端の残基８７８に対応する残基にグアニンを含み得る（すなわち、転写産物Ａと比べて、エクソン７の出発点のグアニンに加えて、エクソン６の３’末端にグアニンが挿入されている）。そのような核酸は、エクソン６および７のそれぞれの、グアニンの挿入がＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の他の特徴（例えば、転写産物Ｆにおけるイントロン６へのリードスルーまたは転写産物Ｃにおけるエクソン６の欠失）と区別されるのに十分な数のヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されようことが理解される。
ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）であって、連続したヌクレオチドが、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ（配列番号４）の領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む、単離された核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）も本明細書において提示される。単離された核酸は、転写産物Ｄ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、転写産物Ａ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントとハイブリダイズする領域（例えば、少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含み得る。そのような領域は、転写産物の配列を比較することによって容易に同定することができる。ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ（配列番号７）は、エクソン６の３’末端におけるグアニンの挿入を含み、その結果、転写産物Ａ（配列番号４）と比較してエクソン７におけるフレームシフトおよびエクソン７の中途短縮が生じている。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の少なくとも１５個連続したヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸であって、連続したヌクレオチドが、配列番号４と最適にアラインメントした場合、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるセグメント（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド、少なくとも１０個連続したヌクレオチドまたは少なくとも１５個連続したヌクレオチド）を含む、単離された核酸が本明細書において提示される。
（５）ベクター
本明細書に開示される核酸のいずれかおよび異種核酸を含むベクターも提供される。ベクターは、核酸を運搬することが可能なウイルスまたは非ウイルスベクターであってよい。一部の場合では、ベクターは、プラスミド（例えば、追加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡ）であってよい。一部の場合では、ベクターは、ウイルスベクターであってよく、追加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内にライゲーションすることができる。一部の場合では、ベクターは、それが導入された宿主細胞において自律的に複製することができる（例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他の場合では、ベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結した遺伝子の発現を方向付けることができる。そのようなベクターは、「組換え発現ベクター」または「発現ベクター」と称され得る。そのようなベクターはまた、本明細書の他の箇所で開示される標的化ベクター（すなわち、外因性ドナー配列）の場合もある。
一部の場合では、開示される遺伝子バリアントをコードする核酸を発現ベクターに遺伝子が転写および翻訳調節配列などの必要な発現調節配列に作動可能に連結するように挿入することにより、開示される遺伝子バリアントによってコードされるタンパク質を発現させる。発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどを挙げることができる。一部の例では、開示される遺伝子バリアントを含む核酸をベクター内にベクター内の転写および翻訳調節配列が遺伝子バリアントの転写および翻訳を制御するというそれらの意図された機能を果たすようにライゲーションすることができる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。開示される遺伝子バリアントを含む核酸配列は、別々のベクターに挿入することもでき、同じ発現ベクターに挿入することもできる。開示される遺伝子バリアントを含む核酸配列は、標準の方法（例えば、開示される遺伝子バリアントを含む核酸の相補的な制限部位とベクターのライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入することができる。
開示される遺伝子バリアントを含む核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞における遺伝子バリアントの発現を調節する制御配列を有し得る。制御配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選出、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得る。哺乳動物宿主細胞での発現のために好ましい制御配列としては、例えば、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を方向付けるウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス、（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーならびにネイティブな免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなどの強力な哺乳動物プロモーターを挙げることができる。ウイルス制御エレメント、およびその配列に関するさらなる説明は、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１６８，０６２号；同第４，５１０，２４５号；および同第４，９６８，６１５号に提示されている。ポリペプチドを細菌細胞または真菌細胞（例えば、酵母細胞）において発現させる方法も周知である。
開示される遺伝子バリアントを含む核酸配列および制御配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）および選択性マーカー遺伝子などの追加的な配列を有し得る。選択性マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にすることができる（例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；および同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、選択性マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与することができる。例示的な選択性マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ－宿主細胞においてメトトレキサート選択／増幅を用いて使用するため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）、およびグルタミン酸シンテターゼ（ＧＳ）遺伝子が挙げられる。
Ｂ．タンパク質
単離されたＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質およびその断片、特に、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントによって生じるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質およびその断片が本明細書に開示される。
本明細書に開示される単離されたタンパク質は、天然に存在するＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質のアミノ酸配列を含む場合もあり、天然に存在しない配列を含む場合もある。一例では、天然に存在しない配列は、天然に存在しない配列と、保存的アミノ酸置換に起因して異なり得る。例えば、配列は、保存的アミノ酸置換を除いて同一であり得る。
本明細書に開示される単離されたタンパク質は、異種ポリペプチドまたは異種分子または標識と連結または融合することができ、その多数の例は、本明細書の他の箇所で開示される。例えば、タンパク質を、安定性の増大または低減をもたらす異種ポリペプチドと融合することができる。融合したドメインまたは異種ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。融合パートナーは、例えば、Ｔヘルパーエピトープの提供を補助し得るか（免疫学的融合パートナー）、またはタンパク質をネイティブな組換えタンパク質よりも高い収率で発現させるのに役立ち得る（発現エンハンサー）。ある特定の融合パートナーは、免疫および発現の両方を増強する融合パートナーである。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解性が増大するように、またはポリペプチドを所望の細胞内区画にターゲティングすることが可能になるように選択することができる。さらに別の融合パートナーとして、ポリペプチドの精製を容易にするアフィニティータグが挙げられる。
融合タンパク質は、異種分子と直接融合することもでき、ペプチドリンカーなどのリンカーを介して異種分子と連結することもできる。適切なペプチドリンカー配列は、例えば、以下の因子に基づいて選択することができる：（１）柔軟な広がったコンフォメーションをとることができること；（２）第１および第２のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造をとることができないこと；および（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電残基がないこと。例えば、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有し得る。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の中性付近のアミノ酸もリンカー配列に使用することができる。リンカーとして有用に使用することができるアミノ酸配列としては、それぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Marateaら（１９８５年）Gene、４０巻：３９～４６頁；Murphyら（１９８６年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８３巻：８２５８～８２６２頁；米国特許第４，９３５，２３３号；および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものが挙げられる。リンカー配列は、一般に、例えば、１～約５０アミノ酸の長さであってよい。リンカー配列は、一般に、第１および第２のポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、立体的干渉を防止するために使用することができる非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合には必要ない。
タンパク質を細胞透過性ドメインに作動可能に連結することもできる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来してよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。細胞透過性ドメインは、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはタンパク質内の任意の場所に位置し得る。
タンパク質を蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの追跡または精製をしやすくするための異種ポリペプチドに作動可能に連結することもできる。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
本明細書の単離されたタンパク質は、非天然または修飾アミノ酸またはペプチド類似体も含み得る。例えば、天然に存在するアミノ酸とは異なる機能的置換基を有するＤ－アミノ酸またはアミノ酸が多数存在する。天然に存在するペプチドの逆の立体異性体、ならびにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に選択されたアミノ酸を負荷し、例えばアンバーコドンを利用する遺伝子構築物を工学的に作出して、類似体アミノ酸をペプチド鎖に部位特異的に挿入することによってポリペプチド鎖に容易に組み入れることができる（Thorsonら（１９９１年）Methods Molec. Biol.、７７巻：４３～７３頁；Zoller（１９９２年）Current Opinion in Biotechnology、３巻：３４８～３５４頁；Ibba、（１９９５年）Biotechnology & Genetic Engineering Reviews、１３巻：１９７～２１６頁；Cahillら（１９８９年）TIBS、１４巻（１０号）：４００～４０３頁；Benner（１９９３年）TIB Tech、１２巻：１５８～１６３頁；ならびにIbbaおよびHennecke（１９９４年）Biotechnology、１２巻：６７８～６８２頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
ペプチドと似ているが、天然のペプチド連結によって接続されていない分子を作出することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体の連結は、ＣＨ２ＮＨ－－、－－ＣＨ２Ｓ－－、－－ＣＨ２－－－－、－－ＣＨ＝ＣＨ－－（シスおよびトランス）、－－ＣＯＣＨ２－－、－－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－－、および－－ＣＨＨ２ＳＯ－－を含み得る（例えば、それぞれがあらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSpatola, A.F.、Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins、B. Weinstein編、Marcel Dekker、New York、２６７頁（１９８３年）；Spatola, A. F.、Vega Data（１９８３年３月）、１巻、３号、Peptide Backbone Modifications (general review)；Morley（１９９４年）Trends Pharm Sci、１５巻（１２号）：４６３～４６８頁；Hudsonら（１９７９年）Int J Pept Prot Res、１４巻：１７７～１８５頁；Spatolaら（１９８６年）Life Sci、３８巻：１２４３～１２４９頁；Hann（１９８２年）Chem. Soc Perkin Trans.、Ｉ ３０７～３１４頁；Almquistら（１９８０年）J. Med. Chem.、２３巻：１３９２～１３９８頁；Jennings－Whiteら（１９８２年）Tetrahedron Lett ２３巻：２５３３頁）；Szelkeら、欧州出願ＥＰ４５６６５ＣＡ（１９８２年）：９７巻：３９４０５頁（１９８２年）；Holladayら（１９８３年）Tetrahedron. Lett、２４巻：４４０１～４４０４頁；およびHruby（１９８２年）Life Sci、３１巻：１８９～１９９頁を参照されたい）。例えば、ｂ－アラニン、アミノ酪酸など、ペプチド類似体は、結合原子間に１つよりも多くの原子を有し得る。
アミノ酸類似体およびペプチド類似体は、多くの場合、より経済的な産生、より大きな化学的安定性、増強された薬理学的性質（半減期、吸収、効力、有効性など）、変更された特異性（例えば、広域スペクトルの生物活性）、低減した抗原性、およびその他の望ましい特性などの増強されたまたは望ましい特性を有する。
Ｄ－アミノ酸はペプチダーゼなどによって認識されないので、Ｄ－アミノ酸を使用してより安定なペプチドを生成することができる。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の同じ型のＤ－アミノ酸での系統的置換（例えば、Ｌ－リシンの代わりにＤ－リシン）を使用してより安定なペプチドを生成することができる。システイン残基を使用して、２つまたはそれよりも多くのペプチドを環化または付着し合わせることができる。これは、ペプチドを特定のコンフォメーションに制約するのに有益であり得る（例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるRizoおよびGierasch（１９９２年）Ann. Rev. Biochem.、６１巻：３８７頁を参照されたい）。
本明細書に開示されるタンパク質のいずれかをコードする核酸も本明細書に開示される。これは、特定のポリペプチド配列に関連する全ての縮重配列（すなわち、１つの特定のポリペプチド配列をコードする配列を有する全ての核酸ならびにタンパク質配列の開示されるバリアントおよび誘導体をコードする縮重核酸を含めた全ての核酸）を含む。したがって、特定の核酸配列それぞれを本明細書に記載することはできないが、ありとあらゆる配列が開示されるポリペプチド配列を通して実際に本明細書に開示され、記載される。
本明細書に開示される単離されたポリペプチドまたはタンパク質、および単離されたポリペプチドの安定性を増大させる担体を含む組成物も本明細書に開示される。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、および脂質微小管が挙げられる。
（１）ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質および断片
単離されたＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質およびその断片、特に、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントによって生じるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質およびその断片、または特に、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ’、Ｇ、およびＨが本明細書に開示される。そのようなタンパク質としては、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ’、Ｇ、もしくＨまたはその断片の少なくとも５個、６個、８個、１０個、１２個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、または３００個連続したアミノ酸を含む単離されたポリペプチドを挙げることができる。集団内の遺伝子配列およびそのような遺伝子によってコードされるタンパク質は、一塩基多型などの多型に起因して変動し得ることが理解される。各ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームについて本明細書において提示される配列は、単に例示的な配列である。他の配列も可能である。例えば、単離されたポリペプチドは、それぞれアイソフォームＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ’、Ｇ、またはＨと最適にアラインメントした場合、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ’、Ｇ、またはＨと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列（例えば、連続したアミノ酸の配列）を含む。必要に応じて、単離されたポリペプチドは、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ’、Ｇ、またはＨと同一である配列を含む。
一例として、単離されたポリペプチドは、アイソフォームＡ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＤ、Ｇ、およびＨ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも８個連続したアミノ酸）を含み得る。そのような領域は、アイソフォームの配列を比較することによって容易に同定することができる。アイソフォームＤ、Ｇ、およびＨにおいてエクソン７によってコードされる領域は、アイソフォームＡにおいてエクソン７によってコードされる領域と比較してフレームシフトし、短縮されている。したがって、そのような単離されたポリペプチドは、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の少なくとも５個、６個、８個、１０個、１２個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、または２００個連続したアミノ酸（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）を含み得、ここで、連続したアミノ酸（例えば、少なくとも３個連続したアミノ酸、少なくとも５個連続したアミノ酸、少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）のセグメントは、単離されたポリペプチドをそれぞれ配列番号１５、１８、または１９と最適にアラインメントした場合、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）、配列番号１８（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＧ）、または配列番号１９（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＨ）におけるエクソン７によってコードされる領域の少なくとも一部分を含むセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
そのような単離されたポリペプチドは、アイソフォームＧ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＤ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントをさらに含み得、アイソフォームＨ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＤ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントをさらに含み得る。そのような領域は、アイソフォームの配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、そのような単離されたポリペプチドは、アイソフォームＨと区別されるように、配列番号１５と最適にアラインメントした場合、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）のエクソン３によってコードされる領域とエクソン４によってコードされる領域との境界にまたがるセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、連続したアミノ酸（例えば、少なくとも３個連続したアミノ酸、少なくとも５個連続したアミノ酸、少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）のセグメントを含み得る。同様に、そのような単離されたポリペプチドは、アイソフォームＧと区別されるように、配列番号１５と最適にアラインメントした場合、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）のエクソン２によってコードされる領域内のセグメント、配列番号１５のエクソン１によってコードされる領域とエクソン２によってコードされる領域との境界にまたがるセグメント、または配列番号１５のエクソン２によってコードされる領域とエクソン３によってコードされる領域との境界にまたがるセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、連続したアミノ酸（例えば、少なくとも３個連続したアミノ酸、少なくとも５個連続したアミノ酸、少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）のセグメントを含み得る。
アイソフォームＤと同様に、アイソフォームＨにおいてエクソン７によってコードされる領域（配列番号１９）は、アイソフォームＡと比較してフレームシフトし、短縮されている。しかし、さらに、アイソフォームＨは、アイソフォームＡおよびＤと比較して、エクソン３と４との間の追加的なエクソン（エクソン３’）によってコードされる領域を含む。したがって、そのような単離されたポリペプチドは上記の通りであり得、アイソフォームＡ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＤ、Ｇ、およびＨ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントを含むが、アイソフォームＤ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＨ（またはその断片またはホモログ）に由来するセグメント（例えば、少なくとも８個連続したアミノ酸）をさらに含む。そのような領域は、アイソフォームの配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、そのような単離されたポリペプチドは、単離されたポリペプチドを配列番号１９と最適にアラインメントした場合、配列番号１９（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＨ）のエクソン３’によってコードされる領域の少なくとも一部分を含むセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である連続したアミノ酸（例えば、少なくとも３個連続したアミノ酸、少なくとも５個連続したアミノ酸、少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）のセグメントをさらに含み得る。
アイソフォームＤと同様に、アイソフォームＧにおいてエクソン７によってコードされる領域（配列番号１８）は、アイソフォームＡと比較してフレームシフトし、短縮されている。しかし、さらに、アイソフォームＧは、アイソフォームＡおよびＤと比較して、エクソン２によってコードされる領域が欠けており、したがって、イソフォームＡおよびＤには存在しないエクソン１とエクソン３との境界を含む。したがって、そのような単離されたポリペプチドは、上記の通りであり得、アイソフォームＡ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＤ、Ｇ、およびＨ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメントを含むが、アイソフォームＤ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＧ（またはその断片またはホモログ）に由来するセグメント（例えば、少なくとも８個連続したアミノ酸）をさらに含む。そのような領域は、アイソフォームの配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、そのような単離されたポリペプチドは、単離されたポリペプチドを配列番号１８と最適にアラインメントした場合、配列番号１８（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＧ）のエクソン１によってコードされる領域とエクソン３によってコードされる領域との境界にまたがるセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である連続したアミノ酸（例えば、少なくとも３個連続したアミノ酸、少なくとも５個連続したアミノ酸、少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）のセグメントをさらに含み得る。
アイソフォームＡ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＥ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも８個連続したアミノ酸）を含む単離されたポリペプチドも本明細書において提示される。アイソフォームＥは、アイソフォームＡには存在しない、エクソン３と４との間の追加的なエクソン（エクソン３’）によってコードされる領域を含む。そのような領域は、アイソフォームの配列を比較することによって容易に同定することができる。したがって、単離されたポリペプチドは、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の少なくとも５個、６個、８個、１０個、１２個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、または２００個連続したアミノ酸（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）を含み得、ここで、連続したアミノ酸（例えば、少なくとも３個連続したアミノ酸、少なくとも５個連続したアミノ酸、少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）のセグメントは、単離されたポリペプチドをそれぞれ配列番号１６または１９と最適にアラインメントした場合、配列番号１６（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＥ）または配列番号１９（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＨ）のエクソン３’によってコードされる領域の少なくとも一部分を含むセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。必要に応じて、そのような単離されたポリペプチドは、アイソフォームＨ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＥ（またはその断片またはホモログ）に由来するセグメント（例えば、少なくとも８個連続したアミノ酸）をさらに含み得る。そのような領域は、アイソフォームの配列を比較することによって容易に同定することができる。例えば、そのような単離されたポリペプチドは、単離されたポリペプチドを配列番号１６と最適にアラインメントした場合、配列番号１６（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＥ）のエクソン６によってコードされる領域とエクソン７によってコードされる領域との境界にまたがるセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である連続したアミノ酸（例えば、少なくとも３個連続したアミノ酸、少なくとも５個連続したアミノ酸、少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）のセグメントをさらに含み得る。
アイソフォームＡ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＦ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも８個連続したアミノ酸）を含む単離されたポリペプチドも提供される。アイソフォームＦは、アイソフォームＡには存在しない、エクソン６からイントロン６へのリードスルーによってコードされる領域を含む。そのような領域は、アイソフォームの配列を比較することによって容易に同定することができる。したがって、単離されたポリペプチドは、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の少なくとも５個、６個、８個、１０個、１２個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、または２００個連続したアミノ酸（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）を含み得、ここで、連続したアミノ酸（例えば、少なくとも３個連続したアミノ酸、少なくとも５個連続したアミノ酸、少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）のセグメントは、単離されたポリペプチドを配列番号１７と最適にアラインメントした場合、配列番号１７（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＦ）のイントロン６へのリードスルーによってコードされる領域の少なくとも一部分を含むセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
アイソフォームＡ（またはその断片またはホモログ）には存在しない、アイソフォームＣ（またはその断片またはホモログ）に存在するセグメント（例えば、少なくとも８個連続したアミノ酸）を含む単離されたポリペプチドも提供される。アイソフォームＣは、アイソフォームＡと比較して、エクソン６によってコードされる領域が欠けており、アイソフォームＡには存在しないエクソン５とエクソン７との境界を含む。そのような領域は、アイソフォームの配列を比較することによって容易に同定することができる。したがって、単離されたポリペプチドは、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の少なくとも５個、６個、８個、１０個、１２個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、または２００個連続したアミノ酸（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）を含み得、ここで、連続したアミノ酸（例えば、少なくとも３個連続したアミノ酸、少なくとも５個連続したアミノ酸、少なくとも８個連続したアミノ酸、少なくとも１０個連続したアミノ酸、または少なくとも１５個連続したアミノ酸）のセグメントは、単離されたポリペプチドを配列番号１４と最適にアラインメントした場合、配列番号１４（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ）のエクソン５によってコードされる領域とエクソン７によってコードされる領域との境界にまたがるセグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
本明細書に開示される単離されたポリペプチドはいずれも、異種分子または異種標識に連結することができる。そのような異種分子または標識の例は、本明細書の他の箇所で開示される。例えば、異種分子は、免疫グロブリンＦｃドメイン、本明細書の他の箇所で開示されるペプチドタグ、ポリ（エチレングリコール）、ポリシアル酸、またはグリコール酸であってよい。
（２）ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質または断片を作製する方法
本明細書に開示されるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片のいずれかを作製する方法も開示される。そのようなＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片は、任意の適切な方法で作製することができる。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を、そのようなＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片をコードする核酸（例えば、組換え発現ベクター）を含む宿主細胞から作製することができる。そのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片をコードする核酸（例えば、組換え発現ベクター）を含む宿主細胞を培養し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を作製するステップを含み得る。核酸を宿主細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができ、核酸が発現する条件下で培養を行うことができる。そのような方法は、発現したＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を回収するステップをさらに含み得る。回収するステップは、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を精製することをさらに含み得る。
タンパク質発現のための適切な系の例としては、細菌細胞発現系（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、酵母細胞発現系（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス媒介性タンパク質発現）、および哺乳動物細胞発現系が挙げられる。
ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸またはその断片の例は、本明細書の他の箇所でより詳細に開示される。必要に応じて、そのような核酸を宿主細胞における発現のためにコドン最適化する。必要に応じて、そのような核酸を宿主細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結する。プロモーターは、異種プロモーター（すなわち、天然に存在するＨＳＤ１７Ｂ１３プロモーターではないプロモーター）であってよい。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに適したプロモーターの例としては、アラビノース、ｌａｃ、ｔａｃ、およびＴ７プロモーターが挙げられる。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓに適したプロモーターの例としては、Ｐ１７０およびナイシンプロモーターが挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに適したプロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）もしくはエノラーゼ（ＥＮＯ）プロモーターなどの構成的プロモーターまたはＰＨＯ、ＣＵＰ１、ＧＡＬ１、およびＧ１０などの誘導性プロモーターが挙げられる。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに適したプロモーターの例としては、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ Ｉ）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）プロモーター、およびグルタチオン依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤＩ）プロモーターが挙げられる。バキュロウイルス媒介性系に適したプロモーターの例は後期ウイルス強力ポリヘドリンプロモーターである。
必要に応じて、核酸は、タンパク質の精製を容易にするために、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片とインフレームでタグをさらにコードする。タグの例は、本明細書の他の箇所で開示される。そのようなタグは、例えば、パートナーリガンド（例えば、樹脂上に固定化されたもの）に結合することができ、その結果、タグが付されたタンパク質を他の全てのタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質）から単離することができる。アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、発現されるタンパク質の純度を改善するために使用することができる方法の例である。
他の方法を使用してＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を作製することもできる。例えば、２つまたはそれより多いペプチドまたはポリペプチドをタンパク質化学の技法によって連結することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドをＦｍｏｃ（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボノイル）化学のいずれかを使用して化学的に合成することができる。そのようなペプチドまたはポリペプチドは標準の化学反応によって合成することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切り離さなくてもよいし、一方、ペプチドまたはタンパク質の他方の断片を合成し、その後、樹脂から切り離すことにより、他方の断片上の機能的にブロッキングされた末端基を露出させてもよい。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片を、それらの、それぞれカルボキシル末端およびアミノ末端においてペプチド結合を介して共有結合により接合することができる。（Grant GA（１９９２年）Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co.、N.Y.（１９９２年）；ならびにBodansky MおよびTrost B.編（１９９３年）Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc.、NY、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドを本明細書に記載の通りｉｎ ｖｉｖｏで独立に合成することができる。単離されたら、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを同様のペプチド縮合反応によって連結してペプチドまたはその断片を形成することができる。
例えば、クローニングされたまたは合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチド断片を接合してより大きなペプチド断片、ポリペプチド、または総タンパク質ドメインを作製することが可能になる（Abrahmsen Lら（１９９１年）Biochemistry ３０巻：４１５１頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、合成ペプチドのネイティブな化学的ライゲーションを利用して、短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築することができる。この方法は、二段階化学反応からなり得る（Dawsonら（１９９４年）Science、２６６巻：７７６～７７９頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。第１のステップは、最初の共有結合生成物としてチオエステル連結した中間体が生じる、保護されていない合成ペプチド－－チオエステルとアミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する別の保護されていないペプチドセグメントの化学選択的反応であり得る。反応条件を変化させなければ、この中間体は自発的に迅速な分子内反応を受けて、ライゲーショ部位にネイティブなペプチド結合が形成される（Baggioliniら（１９９２年）FEBS Lett、３０７巻：９７～１０１頁；Clark-Lewisら（１９９４年）J Biol Chem 、２６９巻：１６０７５頁；Clark-Lewisら（１９９１年）Biochemistry、３０巻：３１２８頁；およびRajarathnamら（１９９４年）Biochemistry、３３巻：６６２３～６６３０頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
あるいは、保護されていないペプチドセグメントを化学的に連結することができ、その場合、化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成される結合は天然でない（非ペプチド）結合である（Schnolzerら（１９９２年）Science、２５６巻：２２１頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この技法は、タンパク質ドメインの類似体ならびに大量の比較的純粋な、完全な生物活性を有するタンパク質を合成するために使用されている（deLisle Milton RCら、Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press、New York、２５７～２６７頁（１９９２年）、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
Ｃ．細胞
本明細書に開示される核酸およびタンパク質のいずれかを含む細胞（例えば、組換え宿主細胞）も本明細書において提示される。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにあってよい。核酸をプロモーターおよび他の制御配列に連結し、したがって、それらを発現させて、コードされるタンパク質を作製することができる。任意の細胞型が提供される。
細胞は、例えば、全能性細胞または多能性細胞（例えば、齧歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）であってよい。全能性細胞は、任意の細胞型を生じさせ得る未分化細胞を含み、多能性細胞は、１種よりも多くの分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であってよい。ＥＳ細胞は、胚に導入されると発生中の胚の任意の組織に寄与することが可能な胚由来全能性または多能性細胞を含む。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から引き出すことができ、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のいずれの細胞にも分化させることができる。
細胞はまた、初代体細胞であってもよく、初代体細胞ではない細胞であってもよい。体細胞は、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞を含み得る。細胞はまた、初代細胞であってもよい。初代細胞は、生物体、器官、または組織から直接単離された細胞または細胞培養物を含む。初代細胞は、形質転換されておらず不死でもない細胞を含む。初代細胞は、以前に組織培養物中で継代されていないかまたは以前に組織培養物中で継代されているが、組織培養物中で無制限に継代することはできない、生物体、器官、または組織から得られる任意の細胞を含む。そのような細胞は、従来の技法によって単離することができ、例えば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、単球、単核細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、および平滑筋細胞を含む。例えば、初代細胞は、結合組織、筋組織、神経系組織、または上皮組織に由来してよい。
そのような細胞は、通常無制限には増殖しないが、突然変異または変更に起因して、正常な細胞の老化を逃れ、その代わりに分裂し続け得る細胞も含む。そのような突然変異または変更は、天然に起こり得るか、または意図的に誘導され得る。不死化細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、およびマウス胚線維芽細胞（例えば、３Ｔ３細胞）が挙げられる。多数の型の不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞は、組換え遺伝子またはタンパク質の培養または発現のために一般に使用される細胞を含む。
細胞はまた、肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）などの分化細胞であってもよい。
細胞は、任意の供給源に由来してよい。例えば、細胞は、真核細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌（例えば、酵母）細胞であってよい。そのような細胞は、魚類細胞または鳥類細胞であってもよく、そのような細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞またはラット細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、畜産動物（例えば、雌ウシ、雄の仔牛などのウシ種；ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが挙げられる。家畜動物および農業動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語はヒトを排除する。
マウス細胞に関しては、マウスは、例えば、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ系統、１２９系統およびＣ５７ＢＬ／６系統のミックス、ＢＡＬＢ／ｃ系統およびＣ５７ＢＬ／６系統のミックス、１２９系統およびＢＡＬＢ／ｃ系統のミックス、ならびにＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、および１２９系統のミックスを含めた任意の系統であってよい。例えば、マウスは、少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来してよい（例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％ＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するか、または約２５％、約５０％、約７５％、もしく約１００％ＢＡＬＢ／ｃ系統に由来する）。一例では、マウスは、５０％ＢＡＬＢ／ｃ、２５％Ｃ５７ＢＬ／６、および２５％１２９を含む系統である。あるいは、マウスは、ＢＡＬＢ／ｃを除外した系統または系統の組合せを含む。
１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Festingら（１９９９年）Mammalian Genome、１０巻（８号）：８３６頁を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ，Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。マウス細胞はまた、上述の１２９系統および上述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックス（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）に由来してよい。同様に、マウス細胞は、上述の１２９系統のミックスまたは上述のＢＬ／６系統のミックス（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）に由来してよい。
ラット細胞に関しては、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒ Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統を含めた任意のラット系統であってよい。ラットはまた、上記の２種またはそれよりも多くの系統のミックスに由来する系統に由来してもよい。例えば、ラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来してよい。ＡＣＩラット系統は、黒色アグーチを有し、腹部および足が白色であり、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた種々の供給源から入手可能である。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた種々の供給源から入手可能である。一部の場合では、ラットは、近交系ラット系統に由来する。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１を参照されたい。
ＩＩＩ．ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を改変または変更する方法
ヌクレアーゼ作用剤、外因性ドナー配列、転写活性化因子、転写リプレッサー、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡなどのアンチセンス分子、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片、およびＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子または核酸を発現するための発現ベクターの任意の組合せを使用することによって細胞を改変するための種々の方法が提供される。当該方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて行うことができる。ヌクレアーゼ作用剤、外因性ドナー配列、転写活性化因子、転写リプレッサー、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡなどのアンチセンス分子、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片、ならびに発現ベクターを細胞に任意の形態で本明細書の他の箇所に記載の任意の手段によって導入することができ、また、全部または一部を任意の組合せで同時にまたは逐次的に導入することができる。一部の方法は、細胞内の内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を変更するステップのみを伴う。一部の方法は、転写活性化因子またはリプレッサーを使用することによってか、またはアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡなどのアンチセンス分子を使用することによって内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するステップのみを伴う。一部の方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子もしくは核酸またはその断片を細胞に導入するステップのみを伴う。一部の方法は、細胞にＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片を導入するステップのみを伴う（例えば、本明細書に開示されるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質もしくはその断片のいずれか１つもしくはそれらの任意の組合せ、または本明細書に開示されるＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡ～Ｈもしくはその断片のいずれか１つもしくはそれらの任意の組合せ）。例えば、そのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＨ（もしくはその断片）の１つもしくは複数を細胞に導入するステップ、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ（もしくはその断片）を細胞に導入するステップを伴い得る。あるいは、そのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡ、Ｂ、およびＥもしくはアイソフォームＡ、Ｂ、Ｅ、およびＦ’（もしくはその断片）の１つもしくは複数を細胞に導入するステップ、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡ（もしくはその断片）を細胞に導入するステップを伴い得る。他の方法は、細胞内の内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を変更するステップと、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質もしくはその断片またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子もしくは核酸またはその断片を細胞に導入するステップの両方を伴い得る。さらに他の方法は、細胞内の内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更するステップと、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質もしくはその断片またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子もしくは核酸またはその断片を細胞に導入するステップの両方を伴い得る。
Ａ．ＨＳＤ１７Ｂ１３核酸を改変する方法
ヌクレアーゼ作用剤および／または外因性ドナー配列を使用することによって細胞（例えば、多能性細胞または肝細胞などの分化細胞）内のゲノム内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変するための種々の方法が提供される。当該方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて行うことができる。ヌクレアーゼ作用剤を、単独で使用することもでき、外因性ドナー配列と組み合わせて使用することもできる。あるいは、外因性ドナー配列を単独で使用することもでき、ヌクレアーゼ作用剤と組み合わせて使用することもできる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存的ＤＮＡ修復経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え（ＨＲ）によって起こる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKasparekおよびHumphrey（２０１１年）Seminars in Cell & Dev. Biol.、２２巻：８８６～８９７頁を参照されたい。ＮＨＥＪは、切断末端を互いとまたは外因性配列と、相同な鋳型を必要とせずに直接ライゲーションすることによる核酸の二本鎖切断の修復を含む。連続していない配列のＮＨＥＪによるライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位付近に欠失、挿入、または転座をもたらし得る。
外因性ドナー配列によって媒介される標的核酸（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子）の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み得る。例えば、ＮＨＥＪは、切断末端と外因性ドナー配列の末端の直接ライゲーションによる外因性ドナー配列の標的化組込みももたらし得る（すなわち、ＮＨＥＪに基づく捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介性標的化組込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用可能でない場合（例えば、非分裂細胞、初代細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復が不十分に行われる細胞において）に外因性ドナー配列を挿入するために好ましい可能性がある。さらに、相同組換え修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域（Ｃａｓ媒介性切断によって創出される突出部を越える）に関する知見は必要なく、これは、ゲノム配列に関する知見が限られているゲノムを有する生物体への標的化挿入を試みる場合に有益であり得る。組込みは、外因性ドナー配列と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションによって、または、切断されるゲノム配列においてＣａｓタンパク質によって生成されるものと適合する突出部に挟まれた外因性ドナー配列を使用した粘着末端（すなわち、５’または３’突出部を有する）のライゲーションによって進行し得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびMarescaら（２０１３年）Genome Res.、２３巻（３号）：５３９～５４６頁を参照されたい。平滑末端をライゲーションする場合、断片接合に必要なマイクロホモロジーの生成領域に標的および／またはドナー切除が必要な場合があり、これにより、標的配列に望ましくない変更が生じる可能性がある。
修復は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）によっても起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断が生じた分子）を修復するための鋳型として「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移行を導く核酸修復の形態を含む。いかなる特定の理論にも制約されることなく、そのような移行には、切断された標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または、標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される、合成に依存する鎖アニーリング、および／または関連するプロセスが伴い得る。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wangら（２０１３年）Cell、１５３巻：９１０～９１８頁；Mandalosら（２０１２年）PLOS ONE、７巻：ｅ４５７６８：１～９頁；およびWangら（２０１３年）Nat Biotechnol.、３１巻：５３０～５３２頁を参照されたい。
ゲノム内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対する標的化遺伝子改変は、細胞を、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列とハイブリダイズする５’相同アームおよびＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列とハイブリダイズする３’相同アームを含む外因性ドナー配列と接触させることによって生じさせることができる。外因性ドナー配列を標的ゲノム遺伝子座と組換えて、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対する標的化遺伝子改変を生じさせることができる。一例として、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、５’相同アームを、配列番号２の１２６６６位に対応する位置の５’側の標的配列とハイブリダイズさせることができ、３’相同アームを、配列番号２の１２６６６位に対応する位置の３’側の標的配列とハイブリダイズさせることができる。そのような方法により、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む（または逆の鎖の対応する位置にアデニンが挿入された）ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をもたらすことができる。別の例として、５’および３’相同アームを、それぞれ、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１のエクソン６を挟む位置に対応する位置にある５’および３’標的配列とハイブリダイズさせることができる。そのような方法により、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１のエクソン６に対応する配列が欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をもたらすことができる。別の例として、５’および３’相同アームを、それぞれ、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１のエクソン２を挟む位置に対応する位置にある５’および３’標的配列とハイブリダイズさせることができる。そのような方法により、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１のエクソン２に対応する配列が欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をもたらすことができる。別の例として、５’および３’相同アームを、それぞれ、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１のエクソン６／イントロン６の境界に対応する位置にある５’および３’標的配列とハイブリダイズさせることができる。別の例として、５’および３’相同アームを、それぞれ、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１のエクソン６およびエクソン７に対応する位置にある５’および３’標的配列とハイブリダイズさせることができる。そのような方法により、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む（または逆の鎖の対応する位置にアデニンが挿入された）ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をもたらすことができる。別の例として、５’および３’相同アームを、それぞれ、配列番号１のイントロン６のドナースプライス部位に対応する領域（すなわち、配列番号１のイントロン６の５’末端にある領域）を挟むかまたはその領域内にある位置に対応する位置にある５’および３’標的配列とハイブリダイズさせることができる。そのような方法により、例えば、イントロン６内のドナースプライス部位が破壊されたＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をもたらすことができる。外因性ドナー配列の例は、本明細書の他の箇所で開示される。
ゲノム内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対する標的化遺伝子改変は、細胞を、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座にある標的配列における１つまたは複数のニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ作用剤と接触させることによって生じさせることもできる。そのような方法により、例えば、配列番号１のイントロン６内のドナースプライス部位に対応する領域（すなわち、配列番号１のイントロン６の５’末端にある領域）が破壊されたＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をもたらすことができる。当該方法において使用することができるヌクレアーゼ作用剤の例および変化は、本明細書の他の箇所に記載されている。
例えば、ゲノム内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対する標的化遺伝子改変は、細胞または細胞のゲノムを、Ｃａｓタンパク質およびＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のガイドＲＮＡ認識配列とハイブリダイズする１つまたは複数のガイドＲＮＡと接触させることによって生じさせることができる。すなわち、ゲノム内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対する標的化遺伝子改変は、細胞または細胞のゲノムを、Ｃａｓタンパク質およびＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡと接触させることによって生じさせることができる。例えば、そのような方法は、細胞を、Ｃａｓタンパク質およびＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするガイドＲＮＡと接触させるステップを含み得る。一例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６に対応する領域内である。一例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６および／またはエクソン７（例えば、エクソン６および／もしくはイントロン６、またはエクソン６および／もしくはエクソン７）に対応する領域内である。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している場合がある。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置から約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内の場合がある。さらに別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンまたはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の終止コドンを含むかまたはそれに近接している場合がある。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、開始コドンまたは終止コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内の場合がある。Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡが複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡ標的配列を切断する。Ｃａｓタンパク質による切断は、二本鎖切断または一本鎖切断を創出することができる（例えば、Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである場合）。そのような方法により、例えば、配列番号１のイントロン６内のドナースプライス部位に対応する領域（すなわち、配列番号１のイントロン６の５’末端にある領域）が破壊されているか、開始コドンが破壊されているか、終止コドンが破壊されているか、またはコード配列が欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をもたらすことができる。当該方法において使用することができるＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡの例および変化は、本明細書の他の箇所に記載されている。
一部の方法では、２種またはそれよりも多くのヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。例えば、それぞれが、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／もしくはイントロン６、またはエクソン６および／もしくはエクソン７に対応する、または、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかもしくはそれに近接している（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置から約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内である）領域内のヌクレアーゼ標的配列を標的とする２種のヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。例えば、それぞれが、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６および／またはエクソン７に対応する領域内のヌクレアーゼ標的配列を標的とする２種のヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。別の例として、それぞれが、開始コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列を標的とする２種またはそれよりも多くのヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。別の例として、１種が、開始コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列を標的とし、１種が、終止コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列を標的とする２種のヌクレアーゼ作用剤を使用することができ、ヌクレアーゼ作用剤による切断は、２つのヌクレアーゼ標的配列間のコード領域の欠失をもたらすことができる。さらに別の例として、１種または複数種（例えば、２種）が、開始コドンを含むかまたはそれに近接している配列を標的とし、１種または複数種（例えば、２種）が、終止コドンを含むかまたはそれに近接している配列を標的とする、３種またはそれよりも多くのヌクレアーゼ作用剤を使用することができ、ヌクレアーゼ作用剤による切断は、開始コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列と終止コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列との間のコード領域の欠失をもたらすことができる。
必要に応じて、細胞を、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の追加的なガイドＲＮＡ標的配列を標的とする１つまたは複数の追加的なガイドＲＮＡとさらに接触させることができる。細胞を１つまたは複数の追加的なガイドＲＮＡ（例えば、第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする第２のガイドＲＮＡ）と接触させることにより、Ｃａｓタンパク質による切断は２カ所またはそれよりも多くの二本鎖切断または２カ所またはそれよりも多くの一本鎖切断を創出することができる（例えば、Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである場合）。
必要に応じて、細胞を、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の標的ゲノム遺伝子座と組換えられて標的化遺伝子改変を生じさせる１つまたは複数の外因性ドナー配列とさらに接触させることができる。当該方法において使用することができる外因性ドナー配列の例および変化は、本明細書の他の箇所で開示される。
Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ（複数可）、および外因性ドナー配列（複数可）を細胞に任意の形態で本明細書の他の箇所に記載の任意の手段によって導入することができ、Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ（複数可）、および外因性ドナー配列（複数可）の全部または一部を任意の組合せで同時にまたは逐次的に導入することができる。
一部のそのような方法では、外因性ドナー配列による標的核酸（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子）の修復は、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって起こる。相同組換え修復は、Ｃａｓタンパク質がＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖切断を創出する場合か、Ｃａｓタンパク質が、標的核酸のＤＮＡの１つの鎖を切断して一本鎖切断を創出するニッカーゼである場合か、またはＣａｓニッカーゼを使用して、２つのオフセットニックによって形成される二本鎖切断を創出する場合に起こり得る。そのような方法では、外因性ドナー配列は、５’および３’標的配列に対応する５’および３’相同アームを含む。ガイドＲＮＡ標的配列（複数可）または切断部位（複数可）は、５’標的配列に隣接していてもよく、３’標的配列に隣接していてもよく、５’標的配列および３’標的配列の両方に隣接していてもよく、５’標的配列にも３’標的配列にも隣接していなくてもよい。必要に応じて、外因性ドナー配列は、５’および３’相同アームに挟まれた核酸挿入物をさらに含んでよく、核酸挿入物は、５’標的配列と３’標的配列との間に挿入される。核酸挿入物が存在しない場合、外因性ドナー配列は、５’標的配列と３’標的配列との間のゲノム配列を欠失させるように機能する。外因性ドナー配列の例は、本明細書の他の箇所で開示される。
あるいは、外因性ドナー配列によって媒介されるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介性ライゲーションによって行うことができる。そのような方法では、外因性ドナー配列の少なくとも１つの末端は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のＣａｓ媒介性切断によって創出される少なくとも１つの突出部と相補的な短い一本鎖領域を含む。外因性ドナー配列内の相補末端は、核酸挿入物を挟んでいてよい。例えば、外因性ドナー配列の各末端は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のＣａｓ媒介性切断によって創出される突出部と相補的な短い一本鎖領域を含んでよく、外因性ドナー配列内のこれらの相補的な領域は、核酸挿入物を挟んでいてよい。
Ｃａｓ媒介性切断によって創出された二本鎖切断の平滑末端を切除することによって突出部（すなわち、付着末端）を創出することができる。そのような切除により、断片接合に必要なマイクロホモロジー領域が生じ得るが、これはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に望ましくないまたは調節できない変更を創出する可能性がある。あるいは、そのような突出部は、対のＣａｓニッカーゼを使用することによって創出させることができる。例えば、細胞をＤＮＡの逆の鎖を切断する第１および第２のニッカーゼと接触させることができ、それによって、２重ニッキングを通じてゲノムを改変する。これは、細胞を、第１のＣａｓタンパク質ニッカーゼ、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする第１のガイドＲＮＡ、第２のＣａｓタンパク質ニッカーゼ、およびＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする第２のガイドＲＮＡと接触させることによって実現することができる。第１のＣａｓタンパク質と第１のガイドＲＮＡが第１の複合体を形成し、第２のＣａｓタンパク質と第２のガイドＲＮＡが第２の複合体を形成する。第１のＣａｓタンパク質ニッカーゼが第１のガイドＲＮＡ標的配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖を切断し、第２のＣａｓタンパク質ニッカーゼが第２のガイドＲＮＡ標的配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖を切断し、必要に応じて、外因性ドナー配列がＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の標的ゲノム遺伝子座と組換えられて、標的化遺伝子改変が生じる。
第１のニッカーゼは、ゲノムＤＮＡの第１の鎖（すなわち、相補鎖）を切断することができ、第２のニッカーゼは、ゲノムＤＮＡの第２の鎖（すなわち、非相補的な鎖）を切断することができる。第１および第２のニッカーゼは、例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメイン（例えば、本明細書の他の箇所に記載のＤ１０Ａ突然変異）内の触媒残基を突然変異させること、またはＣａｓ９のＨＮＨドメイン内の触媒残基を突然変異させることによって（例えば、本明細書の他の箇所に記載のＨ８４０Ａ突然変異）創出することができる。そのような方法では、２重ニッキングを使用して、付着末端（すなわち、突出部）を有する二本鎖切断を創出することができる。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列を、切断部位が創出され、その結果、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第１および第２のニッカーゼによって創出されるニックにより二本鎖切断が創出されるように配置することができる。第１および第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的配列内のニックがオフセットされると、突出部が創出される。オフセットウインドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐであるかまたはそれよりも大きい場合がある。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ranら（２０１３年）Cell、１５４巻：１３８０～１３８９頁；Maliら（２０１３年）Nat. Biotech.、３１巻：８３３～８３８頁；およびShenら（２０１４年）Nat. Methods、１１巻：３９９～４０４頁を参照されたい。
（１）標的化遺伝子改変の型
本明細書に記載の方法を使用して標的化遺伝子改変の種々の型を導入することができる。そのような標的化改変としては、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、点突然変異、またはこれらの組合せを挙げることができる。例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、７個、８個、９個、１０個またはそれよりも多くのヌクレオチドを変化させて（例えば、欠失させるか、挿入するか、または置換する）、標的化ゲノム改変を形成することができる。欠失、挿入、または置換は、本明細書の他の箇所で開示される通り、任意のサイズのものであってよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wangら（２０１３年）Cell、１５３巻：９１０～９１８頁；Mandalosら（２０１２年）PLOS ONE ７巻：ｅ４５７６８：１～９頁；およびWangら（２０１３年）Nat Biotechnol.、３１巻：５３０～５３２頁を参照されたい。
そのような標的化遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座の破壊をもたらすことができる。破壊は、制御エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）の変更、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、短縮突然変異、ヌル突然変異、または少数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失（例えば、フレームシフト突然変異を引き起こす）を含み得、対立遺伝子の不活化（すなわち、機能喪失）または喪失をもたらし得る。例えば、標的化改変は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンの破壊を含み得、したがって、開始コドンはもはや機能的でない。
特定の例では、標的化改変は、第１のガイドＲＮＡ標的配列と第２のガイドＲＮＡ標的配列またはＣａｓ切断部位との間の欠失を含み得る。外因性ドナー配列（例えば、修復鋳型または標的化ベクター）を使用する場合、改変は、第１のガイドＲＮＡ標的配列と第２のガイドＲＮＡ標的配列またはＣａｓ切断部位との間の欠失ならびに５’標的配列と３’標的配列との間への核酸挿入物の挿入を含み得る。
あるいは、外因性ドナー配列を単独でまたはヌクレアーゼ作用剤と組み合わせて使用する場合、改変は、第１の相同染色体と第２の相同染色体の対における５’標的配列と３’標的配列との間の欠失ならびに５’標的配列と３’標的配列との間への核酸挿入物の挿入を含み得、それにより、ホモ接合体が改変されたゲノムがもたらされる。あるいは、外因性ドナー配列が核酸挿入物を伴わずに５’および３’相同アームを含む場合、改変は、５’標的配列と３’標的配列との間の欠失を含み得る。
第１のガイドＲＮＡ標的配列と第２のガイドＲＮＡ標的配列との間の欠失または５’標的配列と３’標的配列との間の欠失は、欠失した核酸が第１のヌクレアーゼ切断部位と第２のヌクレアーゼ切断部位との間の核酸配列のみからなるか、または５’標的配列と３’標的配列との間の核酸配列のみからなり、したがって改変されたゲノム標的遺伝子座には追加的な欠失または挿入が存在しない、厳密な欠失であり得る。第１のガイドＲＮＡ標的配列と第２のガイドＲＮＡ標的配列との間の欠失はまた、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による厳密でない修復と一致して、第１および第２のヌクレアーゼ切断部位を越えて広がる、厳密でない欠失の場合もあり、その結果、改変されたゲノム遺伝子座に追加的な欠失および／または挿入がもたらされる。例えば、欠失は、第１および第２のＣａｓタンパク質切断部位を約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約４ｂｐ、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、またはそれよりも大きく越えて広がり得る。同様に、改変されたゲノム遺伝子座は、ＮＨＥＪによる厳密でない修復と一致して、約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約４ｂｐ、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、またはそれよりも大きな挿入などの追加的な挿入を含む場合がある。
標的化遺伝子改変は、例えば、二対立遺伝子改変または単一対立遺伝子改変であり得る。二対立遺伝子改変は、対応する相同染色体上（例えば、二倍体細胞において）の同じ遺伝子座に対して同じ改変がなされる事象、または対応する相同染色体上の同じ遺伝子座に対して異なる改変がなされる事象を含む。一部の方法では、標的化遺伝子改変は、単一対立遺伝子改変である。単一対立遺伝子改変は、一方の対立遺伝子のみに改変がなされる（すなわち、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の２つの相同染色体うちの一方のみに対する改変）事象を含む。相同染色体は、同じ遺伝子座に同じ遺伝子を有するが、場合により異なる対立遺伝子を有する染色体（例えば、減数分裂の間に対合する染色体）を含む。対立遺伝子という用語は、遺伝子配列の１つまたは複数の代替形態のいずれかを含む。二倍体細胞または生物体では、所与の配列の２つの対立遺伝子は、一般には、相同染色体の対の対応する遺伝子座を占有する。
単一対立遺伝子突然変異により、標的化ＨＳＤ１７Ｂ１３改変についてヘテロ接合体である細胞をもたらすことができる。ヘテロ接合体は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）の一方のみが標的化改変を有する状況を含む。
二対立遺伝子改変により、標的化改変についてホモ接合体をもたらすことができる。ホモ接合体は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）の両方が標的化改変を有する状況を含む。あるいは、二対立遺伝子改変により、標的化改変についてヘテロ接合体（例えば、ヘミ接合体）の化合物をもたらすことができる。化合物ヘテロ接合体は、標的遺伝子座の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対立遺伝子）の両方が改変されているが、異なるように改変されている（例えば、一方の対立遺伝子における標的化改変および他方の対立遺伝子の不活化または破壊）状況を含む。例えば、標的化改変を伴わない対立遺伝子では、Ｃａｓタンパク質によって創出された二本鎖切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介性ＤＮＡ修復によって修復されている可能性があり、それにより、核酸配列の挿入または欠失を含む突然変異体対立遺伝子が生成し、それにより、そのゲノム遺伝子座の破壊が引き起こされる。例えば、二対立遺伝子改変により、細胞が標的化改変を有する一方の対立遺伝子と、発現することができない別の対立遺伝子とを有する場合、化合物ヘテロ接合体がもたらされ得る。化合物ヘテロ接合体はヘミ接合体を含む。ヘミ接合体は、標的遺伝子座の一方の対立遺伝子のみ（すなわち、２つの相同染色体のうちの一方の対立遺伝子）が存在する状況を含む。例えば、二対立遺伝子改変により、標的化改変が一方の対立遺伝子において生じ、対応する他方の対立遺伝子の喪失または欠失が伴う場合、標的化改変についてヘミ接合体がもたらされ得る。
（２）標的化遺伝子改変を有する細胞の同定
本明細書に開示される方法は、改変されたＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を有する細胞を同定するステップをさらに含み得る。種々の方法を使用して、欠失または挿入などの標的化遺伝子改変を有する細胞を同定することができる。そのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に標的化遺伝子改変を有する１つの細胞を同定するステップを含み得る。スクリーニングを行って、改変されたゲノム遺伝子座を有するそのような細胞を同定することができる。
スクリーニングステップは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含み得る（例えば、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）および／または対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイ）。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲによって行うことができる。リアルタイムＰＣＲでは、標的ゲノム遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的化参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅した配列を認識する蛍光プローブを含み得る。対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニング論理をひっくり返し、突然変異が方向付けられたネイティブな遺伝子座のコピーの数を数量化する。正確に標的された細胞クローンでは、ＬＯＡアッセイにより２つのネイティブな対立遺伝子（ＸまたはＹ染色体上にない遺伝子）のうちの一方が検出され、他方の対立遺伝子は標的化改変によって破壊されている。同じ原理を対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイとして逆に適用して、挿入された標的化ベクターのコピー数を数量化することができる。例えば、ＧＯＡおよびＬＯＡアッセイを組み合わせて使用することにより、正確に標的されたヘテロ接合体クローンが、１コピーのネイティブな標的遺伝子を喪失し、１コピーの薬物耐性遺伝子または他の挿入されたマーカーを獲得していることを明らかにする。
例として、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を対立遺伝子数量化の方法として使用することができるが、ゼロコピー、１コピー、および２コピーの標的遺伝子の間の差異またはゼロコピー、１コピー、および２コピーの核酸挿入物の間の差異を確実に区別することができる任意の方法を使用してＭＯＡアッセイを展開することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ試料中のＤＮＡ鋳型のコピーの数を、特に、参照遺伝子と比較することによって数量化するために、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用することができる（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６，５９６，５４１を参照されたい）。参照遺伝子を同じゲノムＤＮＡ内で標的遺伝子（複数可）または遺伝子座（複数可）として定量化する。したがって、２回のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）増幅（それぞれ、そのそれぞれのプローブを用いる）を実施する。一方のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブにより参照遺伝子の「Ｃｔ」（閾値サイクル数）を決定し、他方のプローブにより上首尾の標的化によって置き換えられる、標的化される遺伝子（複数可）または遺伝子座（複数可）の領域のＣｔを決定する（すなわち、ＬＯＡアッセイ）。Ｃｔは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブのそれぞれに対する出発ＤＮＡの量を反映する数量であり、すなわち、あまり豊富でない配列には、閾値サイクル数に達するまでにより多くのＰＣＲのサイクルが必要になる。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のための鋳型配列のコピーの数が半分に減少すると、約１Ｃｔ単位の増大が生じる。標的遺伝子（複数可）または遺伝子座（複数可）の一方の対立遺伝子が相同組換えによって置き換えられている細胞におけるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応では、標的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応に関しては１Ｃｔの増大が生じ、参照遺伝子に関しては非標的化細胞由来のＤＮＡと比較してＣｔの増大は伴わない。ＧＯＡアッセイに関しては、別のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを使用して、上首尾の標的化によって標的化される遺伝子（複数可）または遺伝子座（複数可）と置き換えられた核酸挿入物のＣｔを決定することができる。
適切な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されたプローブ（複数可）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。長距離ＰＣＲ、サザンブロット法、またはサンガー配列決定などの、標的化改変についてスクリーニングするための従来のアッセイを使用することもできる。そのようなアッセイは、一般には、挿入された標的化ベクターと標的とされるゲノム遺伝子座との間の連関に関する証拠を得るために使用される。例えば、長距離ＰＣＲアッセイに関しては、一方のプライマーが、挿入されたＤＮＡ内の配列を認識することができ、他方が、標的化ベクターの相同アームの末端を越える標的ゲノム遺伝子座配列を認識する。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）をスクリーニングに使用することもできる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「大規模並列処理配列決定」または「ハイスループットな配列決定」とも称され得る。本明細書に開示される方法では、標的化された細胞を選択マーカーを使用してスクリーニングする必要はない。例えば、選択カセットを使用せずに、本明細書に記載のＭＯＡおよびＮＧＳアッセイに依拠することができる。
Ｂ．ＨＳＤ１７Ｂ１３核酸の発現を変更する方法
ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の発現を変更するための種々の方法が提供される。一部の方法では、本明細書の他の箇所でさらに詳細に記載されている通り、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の破壊を引き起こすためのヌクレアーゼ作用剤を用いた切断によって発現を変更する。一部の方法では、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインと融合または連結したＤＮＡ結合タンパク質を使用することによって発現を変更する。一部の方法では、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉組成物を使用することによって発現を変更する。
一例では、細胞または細胞内のゲノムを、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座にある標的配列における１つまたは複数のニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ作用剤またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸と接触させることにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を改変することができる。そのような切断は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の発現の破壊をもたらすことができる。例えば、ヌクレアーゼ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むかまたはそれに近接している場合がある。例えば、標的配列は、開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内の場合があり、ヌクレアーゼ作用剤による切断は、開始コドンを破壊することができる。別の例として、それぞれが、開始コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列を標的とする２種またはそれよりも多くのヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。別の例として、１種が、開始コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列を標的とし、１種が、終止コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列を標的とする２種のヌクレアーゼ作用剤を使用することができ、ヌクレアーゼ作用剤による切断は、２つのヌクレアーゼ標的配列間のコード領域の欠失をもたらすことができる。さらに別の例として、１種または複数種（例えば、２種）が、開始コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列を標的とし、１種または複数種（例えば、２種）が、終止コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列を標的とする、３種またはそれよりも多くのヌクレアーゼ作用剤を使用することができ、ヌクレアーゼ作用剤による切断は、開始コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列と終止コドンを含むかまたはそれに近接しているヌクレアーゼ標的配列との間のコード領域の欠失をもたらすことができる。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸の改変の他の例は、本明細書の他の箇所で開示される。
別の例では、細胞または細胞内のゲノムを、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座に結合するＤＮＡ結合タンパク質と接触させることにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を改変することができる。ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、転写活性化ドメインまたは転写リプレッサードメインと融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質であってよい。ＤＮＡ結合タンパク質の他の例としては、転写活性化ドメインもしくは転写リプレッサードメインと融合したジンクフィンガータンパク質、または転写活性化ドメインもしくは転写リプレッサードメインと融合した転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質が挙げられる。そのようなタンパク質の例は、本明細書の他の箇所で開示される。例えば、一部の方法では、野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子またはｒｓ７２６１３５６７バリアントではないＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を低減するため（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物またはアイソフォームＡの発現を低減するため）に転写リプレッサーを使用することができる。同様に、一部の方法では、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子の発現を増大させるため（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物またはアイソフォームＤの発現を増大させるため）に転写活性化因子を使用することができる。
ＤＮＡ結合タンパク質の標的配列（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列）は、発現を変更するのに適したＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸内の任意の場所にあってよい。一例として、標的配列は、エンハンサーまたはプロモーターなどの制御エレメント内にある場合もあり、制御エレメントの近傍にある場合もある。例えば、標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むかまたはそれに近接している場合がある。例えば、標的配列は、開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内の場合がある。
別の例では、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を変更するために、アンチセンス分子を使用することができる。アンチセンス分子の例としては、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。そのようなアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、ｍＲＮＡの任意の領域を標的とするように設計することができる。例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、本明細書に開示されるＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の１つもしくは複数に独特の領域、または本明細書に開示されるＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の１つもしくは複数に共通する領域を標的とするように設計することができる。ｃＤＮＡおよびバリアントＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物とハイブリダイズする核酸の例は、本明細書の他の箇所でより詳細に開示される。例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）内の配列とハイブリダイズし得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減し得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）には存在しない、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）に存在する配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン７内の配列またはエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする。
別の例として、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）内の配列とハイブリダイズし得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄの発現を低減し得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）には存在しない、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）に存在する配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）のエクソン７内の配列またはエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする。
Ｃ．核酸およびタンパク質の細胞への導入
本明細書に開示される核酸およびタンパク質は、任意の手段によって細胞に導入することができる。「導入すること」は、核酸またはタンパク質を、当該配列が細胞の内部に進入するように細胞にもたらすことを含む。導入は、任意の手段によって実現することができ、構成成分の１つまたは複数（例えば、構成成分のうちの２つ、または構成成分の全て）を任意の組合せで同時にまたは逐次的に細胞に導入することができる。例えば、外因性ドナー配列をヌクレアーゼ作用剤の導入前に導入することもでき、ヌクレアーゼ作用剤の導入後に導入することもできる（例えば、外因性ドナー配列をヌクレアーゼ作用剤の導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、もしくは７２時間前、または約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、もしくは７２時間後に投与することができる）。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０２４０２６３およびＵＳ２０１５／０１１０７６２を参照されたい。細胞のゲノムをヌクレアーゼ作用剤または外因性ドナー配列と接触させることは、１つもしくは複数のヌクレアーゼ作用剤もしくはヌクレアーゼ作用剤をコードする核酸（例えば、１つもしくは複数のＣａｓタンパク質もしくは１つもしくは複数のＣａｓタンパク質をコードする核酸、および１つもしくは複数のガイドＲＮＡもしくは１つもしくは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸（すなわち、１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡおよび１つもしくは複数のｔｒａｃｒＲＮＡ））ならびに／または１つもしくは複数の外因性ドナー配列を細胞に導入することを含み得る。細胞のゲノムを接触させること（すなわち、細胞を接触させること）は、上記の構成成分のうちの１つのみ、構成成分のうちの１つもしくは複数、または全ての構成成分を細胞に導入することを含み得る。
ヌクレアーゼ作用剤は、タンパク質の形態で、または、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））もしくはＤＮＡなどの、ヌクレアーゼ作用剤をコードする核酸の形態で細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入する場合、ＤＮＡを、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなＤＮＡは、１つまたは複数の発現構築物中にあってよい。
例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で、またはＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））もしくはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で細胞に導入することができる。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態でまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入する場合、Ｃａｓタンパク質および／またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなＤＮＡは、１つまたは複数の発現構築物中にあってよい。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の構成成分であってよい。あるいは、それらは２つまたはそれよりも多くの核酸分子中の任意の組合せで分けることができる（すなわち、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡ、１つまたは複数のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡが別々の核酸分子の構成成分であってよい）。
一部の方法では、ヌクレアーゼ作用剤（例えば、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡならびに／または外因性ドナー配列をコードするＤＮＡをＤＮＡミニサークルによって細胞に導入することができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１８２７００を参照されたい。ＤＮＡミニサークルは、ウイルスによらない遺伝子移入のために使用することができる高次コイルＤＮＡ分子であり、複製開始点も抗生物質選択マーカーも有さない。したがって、ＤＮＡミニサークルは、一般には、プラスミドベクターよりもサイズが小さい。これらのＤＮＡは細菌ＤＮＡを欠き、したがって、細菌ＤＮＡにおいて見られる非メチル化ＣｐＧモチーフを欠く。
本明細書において提示される方法は、核酸またはタンパク質が少なくとも１つの細胞の内部に進入しさえすれば、核酸またはタンパク質を細胞に導入するための特定の方法に依存しない。核酸およびタンパク質を種々の細胞型に導入するための方法は公知であり、それらとして、例えば、安定トランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法、およびウイルス媒介性方法が挙げられる。
トランスフェクションプロトコールならびに核酸またはタンパク質を細胞に導入するためのプロトコールは変動し得る。非限定的なトランスフェクション方法として、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Grahamら（１９７３年）Virology、５２巻（２号）：４５６～６７頁、Bacchettiら（１９７７年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、７４巻（４号）：１５９０～４頁、およびKriegler, M（１９９１年）、Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York： W. H. Freeman and Company、９６～９７頁）；デンドリマー；またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する、化学に基づくトランスフェクション方法が挙げられる。非化学的方法として、エレクトロポレーション、ソノポレーション、および光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子に基づくトランスフェクションとして、遺伝子銃の使用、または磁石補助トランスフェクションが挙げられる（Bertram（２００６年）Current Pharmaceutical Biotechnology、７巻、２７７～２８頁）。ウイルスによる方法をトランスフェクションのために使用することもできる。
核酸またはタンパク質の細胞への導入は、エレクトロポレーションによって、細胞質内注射によって、ウイルス感染によって、アデノウイルスによって、アデノ随伴ウイルスによって、レンチウイルスによって、レトロウイルスによって、トランスフェクションによって、脂質媒介性トランスフェクションによって、またはヌクレオフェクションによって媒介することもできる。ヌクレオフェクションは、核酸基体を細胞質だけでなく核膜を通って、および核内にも送達することを可能にする、改善されたエレクトロポレーション技術である。さらに、本明細書に開示される方法におけるヌクレオフェクションの使用は、一般には、通常のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常のエレクトロポレーションでは７百万個であるのと比較してたった約２百万個）。一例では、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用してヌクレオフェクションを実施する。
核酸またはタンパク質の細胞への導入は、微量注射によって実現することもできる。ｍＲＮＡの微量注射は、細胞質内へのものであることが好ましいが（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するため）、タンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡをコードするＤＮＡの微量注射は核内へのものであることが好ましい。あるいは、微量注射は、核内および細胞質内の両方への注射によって行うことができる：まず針を核内に導入し、第１の量を注射し、針を細胞から取り出しながら第２の量を細胞質に注射することができる。ヌクレアーゼ作用剤タンパク質を細胞質内に注射する場合、タンパク質は、核／前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含むことが好ましい。微量注射を実行するための方法は周知である。例えば、Nagyら（Nagy A、Gertsenstein M、Vintersten K、Behringer R.、２００３年、Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor、New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press）；Meyerら（２０１０年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１０７巻：１５０２２～１５０２６頁およびMeyerら（２０１２年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１０９巻：９３５４～９３５９頁を参照されたい。
核酸またはタンパク質を細胞に導入するための他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子媒介性送達、エキソソーム媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、細胞透過性ペプチド媒介性送達、または埋め込み型デバイス媒介性送達を挙げることができる。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞を改変するために核酸またはタンパク質を対象に投与する方法は、本明細書の他の箇所で開示される。
核酸およびタンパク質の細胞への導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって実現することもできる。流体力学的送達は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞内ＤＮＡ送達のためのほぼ完全な方法として出現した。実質細胞への遺伝子送達のためには、必須のＤＮＡ配列のみを、選択された血管を介して注射し、現行のウイルスおよび合成ベクターに付随する安全性の懸念を排除する必要がある。血流中に注射されると、ＤＮＡは血液が到達可能な種々の組織中の細胞に到達することが可能である。流体力学的送達では、大きく膜不浸透性の化合物が実質細胞に進入することを妨げる内皮および細胞膜の物理的関門を克服するために大きな体積の溶液を循環中の非圧縮性血液中に急速注射することによって生じる力を使用する。この方法は、ＤＮＡ送達に加えて、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＮＡ、タンパク質、および他の小さな化合物の効率的な細胞内送達に有用である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bonamassaら（２０１１年）Pharm. Res.、２８巻（４号）：６９４～７０１頁を参照されたい。
核酸またはタンパク質を細胞に導入するための他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子媒介性送達、エキソソーム媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、細胞透過性ペプチド媒介性送達、または埋め込み型デバイス媒介性送達を挙げることができる。特定の例として、核酸またはタンパク質をポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管などの担体に入れて細胞に導入することができる。
核酸またはタンパク質の細胞への導入は、１回またはある期間にわたって多数回実施することができる。例えば、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、導入を実施することができる。
一部の場合では、方法および組成物に使用される細胞は、それらのゲノムにＤＮＡ構築物が安定に組み入れられている。そのような場合では、接触させることは、細胞に、そのゲノムにすでに安定に組み入れられている構築物をもたらすことを含み得る。例えば、本明細書に開示される方法において使用される細胞は、そのゲノムに安定に組み入れられた既存のＣａｓをコードする遺伝子を有し得る（すなわち、Ｃａｓの用意ができた細胞）。「安定に組み入れられた」または「安定に導入された」または「安定に組み込まれた」とは、ポリヌクレオチドを細胞に、ヌクレオチド配列が細胞のゲノム内に組み込まれ、その後代に遺伝することが可能になるように導入することを含む。ＤＮＡ構築物または標的ゲノム組込み系の種々の構成成分を安定に組み入れるために任意のプロトコールを使用することができる。
Ｄ．ヌクレアーゼ作用剤およびＤＮＡ結合タンパク質
所望の標的配列内にニックもしくは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ作用剤または所望の標的配列に結合する任意のＤＮＡ結合タンパク質を本明細書に開示される方法および組成物に使用することができる。ヌクレアーゼ作用剤が所望の標的配列内にニックまたは二本鎖切断を誘導する限りは、天然に存在するまたはネイティブなヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。同様に、ＤＮＡ結合タンパク質が所望の標的配列に結合する限りは、天然に存在するまたはネイティブなＤＮＡ結合タンパク質を使用することができる。あるいは、改変されたまたは工学的に操作されたヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質を使用することができる。「工学的に操作されたヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質」は、ネイティブな形態から、所望の標的配列を特異的に認識するように工学的に操作された（改変または誘導された）ヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質を含む。したがって、工学的に操作されたヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質は、ネイティブな、天然に存在するヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質に由来してもよく、人工的に創出または合成することもできる。工学的に操作されたヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質は標的配列を認識することができ、例えば、標的配列は、ネイティブな（工学的に操作されていないまたは改変されていない）ヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質によって認識されていた配列ではない。ヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質の改変は、タンパク質切断作用剤の１アミノ酸または核酸切断作用剤の１ヌクレオチドの小ささであり得る。標的配列または他のＤＮＡにニックまたは二本鎖切断を生じさせることは、本明細書では、標的配列または他のＤＮＡを「カットすること」または「切断すること」と称され得る。
ヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質（すなわち、工学的に操作されたヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質）の活性なバリアントおよび断片も提供される。そのような活性なバリアントは、ネイティブなヌクレアーゼ作用剤またはＤＮＡ結合タンパク質に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きな配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の標的配列でカットする能力を保持し、したがって、ニックもしくは二本鎖切断誘導活性を保持するかまたは所望の標的配列に結合する能力を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ作用剤のいずれかを、ネイティブなエンドヌクレアーゼ配列から改変することができ、ネイティブなヌクレアーゼ作用剤によっては認識されない標的配列を認識し、そこでニックまたは二本鎖切断を誘導するように設計することができる。したがって、一部の工学的に操作されたヌクレアーゼは、対応するネイティブなヌクレアーゼ作用剤標的配列とは異なる標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導するための特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断誘導活性についてのアッセイは公知であり、一般に、標的配列を含有するＤＮＡ基質に対するエンドヌクレアーゼの全体的な活性および特異性を測定する。
「ヌクレアーゼ作用剤の標的配列」という用語は、ヌクレアーゼ作用剤によってニックまたは二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列を包含する。同様に、「ＤＮＡ結合タンパク質の標的配列」という用語は、ＤＮＡ結合タンパク質が結合するＤＮＡ配列を包含する。標的配列は、細胞に対して内因性（またはネイティブ）の場合もあり、標的配列は細胞に対して外因性の場合もある。細胞に対して外因性である標的配列は、細胞のゲノムに天然には存在しない。標的配列はまた、標的遺伝子座に位置付けられることが望ましい目的のポリヌクレオチドに対して外因性の場合もある。一部の場合では、標的配列は宿主細胞のゲノムに１回しか存在しない。
例示される標的配列の活性なバリアントおよび断片も提供される。そのような活性なバリアントは、所与の標的配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きな配列同一性を含み得、活性なバリアントは、生物活性を保持し、したがって、ヌクレアーゼ作用剤によって配列特異的に認識され、切断されることが可能である。ヌクレアーゼ作用剤による標的配列の二本鎖切断を測定するためのアッセイは公知である（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイ、Frendeweyら（２０１０年）Methods in Enzymology、４７６巻：２９５～３０７頁、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
標的配列の長さは、変動し得、例えば、ジンクフィンガータンパク質もしくはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対に対しては約３０～３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮに対して約１５～１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に対しては約３６ｂｐ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに対しては約２０ｂｐである標的配列を含む。
ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤の標的配列は、標的ゲノム遺伝子座またはその付近の任意の場所に位置付けることができる。標的配列は、遺伝子（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子）のコード領域内、または遺伝子の発現に影響を及ぼす制御領域内に位置し得る。ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤の標的配列は、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、制御領域、またはタンパク質をコードしていない任意の領域内に位置し得る。
本明細書に開示される種々の方法および組成物において使用することができるＤＮＡ結合タンパク質の１つの型は、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）である。ＴＡＬＥは、例えば、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写リプレッサードメインと融合または連結することができる。そのようなドメインの例は、下でＣａｓタンパク質に関して記載されており、例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／１４５１２１においても見出すことができる。対応して、本明細書に開示される種々の方法および組成物において使用することができるヌクレアーゼ作用剤の１つの型は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノム内の特定の標的配列において二本鎖切断を生じさせるために使用することができる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、ネイティブなまたは工学的に操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能的部分を、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合することによって創出される。独特のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、潜在的にあらゆる所与のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように工学的に操作し、したがって、所望の標的配列において二本鎖切断を生じさせるために使用することができる。それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０７９４３０；Morbitzerら（２０１０年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１０７巻（５０号）：２１６１７～２１６２２頁；ScholzeおよびBoch（２０１０年）Virulence、１巻：４２８～４３２頁；Christianら（２０１０年）Genetics、１８６巻：７５７～７６１頁；Liら（２０１１年）Nucleic Acids Res.、３９巻（１号）：３５９～３７２頁；およびMillerら（２０１１年）Nature Biotechnology、２９巻：１４３～１４８頁を参照されたい。
適切なＴＡＬヌクレアーゼの例、および適切なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２３９３１５Ａ１、ＵＳ２０１１／０２６９２３４Ａ１、ＵＳ２０１１／０１４５９４０Ａ１、ＵＳ２００３／０２３２４１０Ａ１、ＵＳ２００５／０２０８４８９Ａ１、ＵＳ２００５／００２６１５７Ａ１、ＵＳ２００５／００６４４７４Ａ１、ＵＳ２００６／０１８８９８７Ａ１、およびＵＳ２００６／００６３２３１Ａ１に開示されている。種々の実施形態では、例えば、目的のゲノム遺伝子座の標的核酸配列またはその付近をカットするＴＡＬエフェクターヌクレアーゼを工学的に作製し、ここで、標的核酸配列は、外因性ドナー配列によって改変される配列またはその付近にある。本明細書において提示される種々の方法および組成物と共に使用するのに適したＴＡＬヌクレアーゼとしては、本明細書の他の箇所に記載の外因性ドナー配列によって改変される標的核酸配列またはその付近に結合するように特異的に設計されたものが挙げられる。
一部のＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの単量体それぞれが、２つの超可変残基を介して一塩基対を認識する３３～３５個のＴＡＬリピートを含む。一部のＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ作用剤は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結したＴＡＬリピートに基づくＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ作用剤は、第１のＴＡＬリピートに基づくＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートに基づくＤＮＡ結合ドメインを含み、ここで、第１および第２のＴＡＬリピートに基づくＤＮＡ結合ドメインのそれぞれがＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、第１および第２のＴＡＬリピートに基づくＤＮＡ結合ドメインが、様々な長さの（１２～２０ｂｐ）スペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖内の２つの連続した標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットが二量体を形成して、標的配列において二本鎖切断を生じさせる活性ヌクレアーゼが創出される。
ＤＮＡ結合タンパク質の別の例は、ジンクフィンガータンパク質である。そのようなジンクフィンガータンパク質は、例えば、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写リプレッサードメインと連結または融合することができる。そのようなドメインの例は、下でＣａｓタンパク質に関して記載されており、例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／１４５１２１においても見出すことができる。対応して、本明細書に開示される種々の方法および組成物において使用することができるヌクレアーゼ作用剤の別の例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一部のＺＦＮでは、ＺＦＮの単量体それぞれが３つまたはそれよりも多くのジンクフィンガーに基づくＤＮＡ結合ドメインを含み、ジンクフィンガーに基づくＤＮＡ結合ドメインそれぞれが、３ｂｐのサブサイトに結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結したジンクフィンガーに基づくＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ作用剤は、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含み得、ここで、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮのそれぞれがＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結しており、第１および第２のＺＦＮが、約５～７ｂｐのスペーサーによって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖内の２つの連続した標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットが二量体を形成して、二本鎖切断を生じさせる活性ヌクレアーゼが創出される。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００６／０２４６５６７；ＵＳ２００８／０１８２３３２；ＵＳ２００２／００８１６１４；ＵＳ２００３／００２１７７６；ＷＯ２００２／０５７３０８Ａ２；ＵＳ２０１３／０１２３４８４；ＵＳ２０１０／０２９１０４８；ＷＯ２０１１／０１７２９３Ａ２；およびGajら（２０１３年）Trends in Biotechnology、３１巻（７号）：３９７～４０５頁を参照されたい。
本明細書に記載の方法および組成物に使用するための他の適切なＤＮＡ結合タンパク質およびヌクレアーゼ作用剤としては、本明細書の他の箇所に記載されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が挙げられる。
ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤は、任意の公知の手段によって細胞に導入することができる。ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードするポリペプチドを細胞に直接導入することができる。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する場合、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤を細胞内で一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードするポリヌクレオチドを発現カセットに含有させ、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなプロモーターは、本明細書の他の箇所でさらに詳細に論じられている。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤を、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入することができる。
ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードするポリヌクレオチドを細胞のゲノム内に安定に組み込み、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードするポリヌクレオチドを標的化ベクター内または挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターとは別のベクターもしくはプラスミド内に入れることができる。
ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤を、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードするポリヌクレオチドの導入によって細胞にもたらす場合、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードするそのようなポリヌクレオチドを、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ作用剤をコードするポリヌクレオチドを、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞または任意の他の目的の宿主細胞を含めた目的の所与の原核細胞または真核細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。
Ｅ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系
本明細書に開示される方法では、クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成成分を利用して細胞内のゲノムを改変することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、転写産物およびＣａｓ遺伝子の発現に関与する、またはＣａｓ遺伝子の活性を方向付ける他のエレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型系であり得る。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｖ型系（例えば、Ｖ－Ａ亜型またはＶ－Ｂ亜型）であり得る。本明細書に開示される方法および組成物では、核酸の部位特異的切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによってＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用することができる。
本明細書に開示される方法において使用されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、天然に存在しないものであり得る。「天然に存在しない」系は、それらの天然に存在する状態から変更もしくは突然変異させたか、自然には天然に付随する少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないか、または、天然には付随しない少なくとも１つの他の構成成分が付随する系の１つまたは複数の構成成分などの、人間の手の関与を示す任意のものを含む。例えば、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、天然には一緒に存在しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質、天然には存在しないＣａｓタンパク質、または天然には存在しないｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用することができる。
（１）Ｃａｓタンパク質およびＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド
Ｃａｓタンパク質は、一般に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、下でより詳細に記載されている）と相互作用し得る少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体形成ドメイン、および他のドメインも含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む核酸切断に対する触媒活性を有する。切断により、平滑末端または付着末端が生じ得、これは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般には平滑切断生成物を創出させる。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は５ヌクレオチド５’突出部を有する切断生成物を生じさせることができ、切断は非標的化鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後ろおよび標的化鎖の２３番目の塩基の後ろで起こる。Ｃａｓタンパク質は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に二本鎖切断（例えば、平滑末端を伴う二本鎖切断）を創出させるのに十分な切断活性を有してもよく、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子において一本鎖切断を創出するニッカーゼであってもよい。
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそのホモログまたは改変バージョンが挙げられる。
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し、一般には、保存的アーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、またはＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーのさらなる例は、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられる）は例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられる）は別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の特有のアルギニンリッチクラスターに対する対応物と一緒に、Ｃａｓ９の対応するドメインと相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかし、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠き、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列では連続しており、それとは対照的に、Ｃａｓ９ではＨＮＨドメインを含む長い挿入物を含有する。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるZetscheら（２０１５年）Cell、１６３巻（３号）：７５９～７７１頁を参照されたい。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ． ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ｑ７Ｑ２に割り当てられる）は例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、天然に存在するもの）、改変Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは改変Ｃａｓタンパク質の断片であってよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して活性なバリアントまたは断片であってもよい。触媒活性に関して活性なバリアントまたは断片は、野生型または改変Ｃａｓタンパク質またはその一部に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きな配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の切断部位をカットする能力を保持し、したがって、ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性についてのアッセイは公知であり、一般に、切断部位を含有するＤＮＡ基質に対するＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
Ｃａｓタンパク質を、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つまたは複数が増大または低減するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質を、安定性などの、タンパク質の任意の他の活性または性質が変化するように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを改変するか、欠失させるか、または不活化することもでき、Ｃａｓタンパク質を、タンパク質の機能に必須ではないドメインを取り除くため、またはＣａｓタンパク質の活性を最適化する（例えば、増強するか、または低下させる）ために短縮することもできる。
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配置にある標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインも含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは、それぞれ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖をカットして、ＤＮＡにおける二本鎖切断を生じさせることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるJinekら（２０１２年）Science、３３７巻：８１６～８２１頁を参照されたい。
ヌクレアーゼドメインの１つまたは複数を欠失させるかまたは突然変異させ、その結果、もはや機能的でなくなるかまたは低下したヌクレアーゼ活性を有するようにすることができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼドメインの１つを欠失させるかまたは突然変異させる場合、得られるＣａｓ９タンパク質は、ニッカーゼと称することができ、二本鎖ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ標的配列に一本鎖切断を生じさせることができるが、二本鎖切断を生じさせることはできない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断できるが、両方は切断できない）。ヌクレアーゼドメインの両方を欠失させるかまたは突然変異させる場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下している（例えば、ヌクレアーゼヌルもしくはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、または触媒として機能しないＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位におけるアスパラギン酸からアラニンへの）突然変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位においてヒスチジンからアラニンへ）またはＨ８４０Ａ（アミノ酸８４０位においてヒスチジンからアラニンへ）により、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の他の例としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９に対応する突然変異が挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSapranauskasら（２０１１年）Nucleic Acids Research、３９巻：９２７５～９２８２頁およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたい。そのような突然変異は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介性突然変異誘発、または全遺伝子合成などの方法を使用して生じさせることができる。ニッカーゼを創出させる他の突然変異の例は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８において見出すことができる。
Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓタンパク質またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を異種ポリペプチドに作動可能に連結して融合タンパク質とすることもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質を切断ドメイン、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写リプレッサードメインと融合することができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。転写活性化ドメインの例としては、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体）、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、ならびにＮＦＡＴ（活性化されたＴ細胞の核因子）活性化ドメインが挙げられる。他の例として、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、ＳＰ１、ＡＰ－２、ＣＴＦ１、Ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１、ＰｖＡＬＦ、ＥＲＦ－２、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、ＡＲＦ－６、ＡＲＦ－７、ＡＲＦ－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、ＴＲＡＢ１ＰＣ４、およびＨＳＦ１の活性化ドメインが挙げられる。例えば、それぞれがあらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１６／０２３７４５６、ＥＰ３０４５５３７、およびＷＯ２０１１／１４５１２１を参照されたい。一部の場合では、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１と対合したｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質を含む転写活性化系を使用することができる。そのような系では、ガイドＲＮＡを、二量体を形成したＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質と結合するように設計されたｓｇＲＮＡテトラループおよびステムループ２に付加されたアプタマー配列を用いて設計することができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKonermannら（２０１５年）Nature、５１７巻（７５３６号）：５８３～５８８頁を参照されたい。転写リプレッサードメインの例としては、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ΙκΒリプレッサー、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。他の例として、Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＧ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｒｂ、ＲＯＭ２に由来する転写リプレッサードメインが挙げられる。例えば、それぞれがあらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる、ＥＰ３０４５５３７およびＷＯ２０１１／１４５１２１を参照されたい。Ｃａｓタンパク質を、安定性の増大または低減をもたらす異種ポリペプチドと融合することもできる。融合したドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
一例として、Ｃａｓタンパク質を、細胞内局在化をもたらす異種ポリペプチドと融合することができる。そのような異種ポリペプチドとしては、例えば、核へのターゲティングのためのＳＶ４０ ＮＬＳなどの１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへのターゲティングのためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを挙げることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるLangeら（２００７年）J. Biol. Chem.、２８２巻：５１０１～５１０５頁を参照されたい。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸のひと続きを含んでよく、また、一分配列であっても二分配列であってもよい。
Ｃａｓタンパク質を細胞透過性ドメインと作動可能に連結することもできる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来してよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質を蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの追跡または精製をしやすくするための異種ポリペプチドに作動可能に連結することもできる。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質を外因性ドナー配列または標識された核酸に係留することもできる。そのような係留（すなわち、物理的連結）は、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用によって実現することができ、係留は直接的であってもよく（例えば、直接融合またはタンパク質上のシステインもしくはリシン残基の修飾またはインテイン修飾によって実現することができる化学的なコンジュゲーションによる）、ストレプトアビジンまたはアプタマーなどの１つまたは複数の介在するリンカーまたはアダプター分子を通じて実現することもできる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Pierceら（２００５年）Mini Rev. Med. Chem.、５巻（１号）：４１～５５頁；Duckworthら（２００７年）Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、４６巻（４６号）：８８１９～８８２２頁；SchaefferおよびDixon（２００９年）Australian J. Chem.、６２巻（１０号）：１３２８～１３３２頁；Goodmanら（２００９年）Chembiochem.、１０巻（９号）：１５５１～１５５７頁；ならびにKhatwaniら（２０１２年）Bioorg. Med. Chem.、２０巻（１４号）：４５３２～４５３９頁を参照されたい。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有結合性戦略としては、ビオチン－ストレプトアビジン法およびニッケル－ヒスチジン法が挙げられる。共有結合性タンパク質－核酸コンジュゲートを、適切に官能性をもたせた核酸およびタンパク質を多種多様な化学を使用して接続することによって合成することができる。これらの化学の一部は、オリゴヌクレオチドをタンパク質表面上のアミノ酸残基に直接付着させることを伴い（例えば、リシンアミンまたはシステインチオール）、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質を核酸に共有結合により付着させるための方法としては、例えば、オリゴヌクレオチドとタンパク質のリシンまたはシステイン残基の化学的架橋、発現タンパク質ライゲーション、化学酵素法、および光アプタマーの使用を挙げることができる。外因性ドナー配列または標識された核酸をＣａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、または内部の領域に係留することができる。外因性ドナー配列または標識された核酸をＣａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留することが好ましい。同様に、Ｃａｓタンパク質を外因性ドナー配列または標識された核酸の５’末端、３’末端、または内部の領域に係留することができる。すなわち、外因性ドナー配列または標識された核酸を任意の配向および極性で係留することができる。Ｃａｓタンパク質を外因性ドナー配列または標識された核酸の５’末端または３’末端に係留することが好ましい。
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態でもたらすことができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態でもたらすことができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質を、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態でもたらすことができる。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、特定の細胞または生物体におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に導入する場合、Ｃａｓタンパク質は、細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞のゲノムに安定に組み込み、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、目的の遺伝子または他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を導くことができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移行させることができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸挿入物を含む標的化ベクターおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に入れることができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸挿入物を含む標的化ベクターとは別の、かつ／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクターまたはプラスミド内に入れることができる。発現構築物に使用することができるプロモーターは、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体の１つまたは複数において活性なプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。必要に応じて、プロモーターは、Ｃａｓタンパク質の一方向の発現およびガイドＲＮＡの他方向の発現の両方を駆動する双方向プロモーターであってよい。そのような双方向プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスを含有する完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター；ならびに（２）ＰＳＥおよびＤＳＥの５’末端と逆配向で融合したＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターからなり得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスと隣接しており、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを創出することによってプロモーターを双方向性にすることができる。例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子およびガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させるために双方向プロモーターを使用することにより、送達を容易にするための緻密な発現カセットの生成が可能になる。
（２）ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子）内の特定の場所にターゲティングするＲＮＡ分子である。特に、Ｃａｓ酵素を、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子座またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に結合するか、またはそれを切断するように方向付けるのに有効なガイドＲＮＡが本明細書に開示される。１つの例示的なガイドＲＮＡは、Ｃａｓ酵素を、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に結合するか、またはそれを切断するように方向付けるのに有効なガイドＲＮＡであって、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列とハイブリダイズする（すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列を標的とする）ＤＮＡ標的化セグメントを含む、ガイドＲＮＡである。ガイドＲＮＡ標的配列を標的とするとは、非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補物である相補鎖配列とハイブリダイズすることを意味する。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置から約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内の場合がある。他の例示的なガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６に対応する領域内である、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含む。他の例示的なガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／またはイントロン６および／またはエクソン７に対応する領域内である、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含む。他の例示的なガイドＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むかもしくはそれに近接しているまたはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の終止コドンを含むかもしくはそれに近接している、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列とハイブリダイズする（すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列を標的とする）ＤＮＡ標的化セグメントを含む。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、開始コドンから約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは１，０００ヌクレオチドの範囲内、または終止コドンから約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは１，０００ヌクレオチドの範囲内の場合がある。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１または２と最適にアラインメントした場合、配列番号１または２のエクソン１に対応する領域の範囲内の場合がある。同様に、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１または２と最適にアラインメントした場合、配列番号１または２のエクソン７に対応する領域の範囲内の場合がある。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、任意の生物体に由来するＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子であってよい。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子または非ヒト哺乳動物、齧歯類、マウス、またはラットなどの別の生物体に由来するオルソログであってよい。
ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の５’末端のガイドＲＮＡ標的配列の例は、配列番号２０～８１に記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、下記の表に記載されている。配列番号２０～８１に対応するガイドＲＮＡ ＤＮＡ標的化セグメントの例は、下記の表に記載されており、チミンの代わりにウラシルである以外は配列番号２０～８１と同一である。ガイドＲＮＡ ＤＮＡ標的化セグメントは、下記の表に記載のＤＮＡ標的化セグメント配列のいずれかを含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）に隣接するガイドＲＮＡ標的配列の例は、配列番号２０～４１に記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、下記の表に記載されている。ＴＳＳに隣接する例示的なガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２１～２３、３３、および３５を含む。配列番号３３および３５は、ＴＳＳに最も近い。ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の５’末端のガイドＲＮＡ標的配列に対応する例示的なｃｒＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ（足場バージョン１、２、３、または４を含む）は、下記の表に記載の配列のいずれかを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
Figure 0007094963000004
ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の３’末端のガイドＲＮＡ標的配列の例は、配列番号８２～２２５に記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、下記の表に記載されている。配列番号８２～２２５に対応するガイドＲＮＡ ＤＮＡ標的化セグメントの例は、それぞれ、チミンの代わりにウラシルである以外は配列番号８２～２２５と同一である配列番号１４８５～１６２８に記載されている。ガイドＲＮＡ ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号１４８５～１６２８に記載の配列のいずれかを含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の３’末端のガイドＲＮＡ標的配列に対応する例示的なｃｒＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ（足場バージョン１、２、３、または４を含む）は、下記の表に記載の配列のいずれかを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
Figure 0007094963000005
Figure 0007094963000006
Figure 0007094963000007
配列番号２の１２６６６位に対応する位置に近接しているガイドＲＮＡ標的配列の例は、配列番号２２６～２３９に記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、下記の表に記載されている。配列番号２２６～２３９に対応するガイドＲＮＡ ＤＮＡ標的化セグメントの例は、それぞれ、チミンの代わりにウラシルである以外は配列番号２２６～２３９と同一である配列番号１６２９～１６４２に記載されている。ガイドＲＮＡ ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号１６２９～１６４２に記載の配列のいずれかを含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。配列番号２の１２６６６位に対応する位置に近接している例示的なガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２３０および２３１を含む。配列番号２の１２６６６位に対応する位置に近接しているガイドＲＮＡ標的配列に対応する例示的なｃｒＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ（足場バージョン１、２、３、または４を含む）は、下記の表に記載の配列のいずれかを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
Figure 0007094963000008
マウスＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置に近接しているマウスＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列の例は、実施例４における表１２に記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。マウスＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子の５’末端のガイドＲＮＡ標的配列の例は、実施例４における表１２に記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。それらのガイドＲＮＡ標的配列に対応するガイドＲＮＡ ＤＮＡ標的化セグメントの例も実施例４における表１２に記載されている。ガイドＲＮＡ ＤＮＡ標的化セグメントは、これらの配列のいずれかを含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。実施例４における表１２のガイドＲＮＡ標的配列に対応する例示的なｃｒＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ（足場バージョン１、２、３、または４を含む）は、実施例４における表１２に記載のｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列のいずれかを含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。
ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」を含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ内のヌクレオチドの連続したひと続きなどの、分子の区画または領域を含む。Ｃａｓ９に対するものなどの一部のｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子：「活性化因子－ＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「標的化因子－ＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一のＲＮＡポリヌクレオチド）であり、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ，」または「ｓｇＲＮＡ」とも称され得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい。Ｃａｓ９に関しては、例えば、単一ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと融合したｃｒＲＮＡ（例えば、リンカーを介して）を含み得る。Ｃｐｆ１に関しては、例えば、標的配列への結合および／または標的配列の切断を実現するためにはｃｒＲＮＡのみが必要である。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、２重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「標的化因子－ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「活性化因子－ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）およびｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ ２重鎖の片方を形成するヌクレオチドのひと続き（すなわち、ｃｒＲＮＡ尾部）の両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’側）に位置するｃｒＲＮＡ尾部の例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号１４２１）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれかを配列番号１４２１の５’末端に接合してｃｒＲＮＡを形成することができる。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子－ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ ２重鎖のあとの半分を形成するヌクレオチドのひと続きを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのひと続きは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのひと続きと相補的であり、ハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ ２重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言うことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号１４２２）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要な系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡがｇＲＮＡになることができる。ｃｒＲＮＡは、逆の鎖（すなわち、相補鎖）とハイブリダイズすることにより、ガイドＲＮＡ標的配列を標的とする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントをさらにもたらす。細胞内での改変に使用する場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子を使用する種に特異的になるように設計することができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Maliら（２０１３年）Science、３３９巻：８２３～８２６頁；Jinekら（２０１２年）Science、３３７巻：８１６～８２１頁；Hwangら（２０１３年）Nat. Biotechnol.、３１巻：２２７～２２９頁；Jiangら（２０１３年）Nat. Biotechnol.、３１巻：２３３～２３９頁；およびCongら（２０１３年）Science、３３９巻：８１９～８２３頁を参照されたい。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ内の配列と相補的なヌクレオチド配列（すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列と逆の鎖上のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖）を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子）と配列特異的にハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）によって相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、変動させることができ、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の場所を決定する。主題のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列とハイブリダイズするように改変することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物体に応じて異なるが、多くの場合、２１～４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）に挟まれた２１～７２ヌクレオチドの長さの標的化セグメントを含有する（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合では、ＤＲは３６ヌクレオチドの長さであり、標的化セグメントは３０ヌクレオチドの長さである。３’側に位置するＤＲが対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、ハイブリダイズし、それが今度はＣａｓタンパク質に結合する。
ＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、または少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約８０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで、または約１２ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドまでの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで（例えば、約１７ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドまで、または約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド）であってよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６から２０ヌクレオチドの間の長さまたは１７から２０ヌクレオチドの間の長さである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１から２３ヌクレオチドの間の長さである。Ｃｐｆ１に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチドの長さまたは少なくとも１８ヌクレオチドの長さである。
ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）および様々な長さであってよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、一次転写産物またはプロセシングされた形態を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部としてかまたは２分子ｇＲＮＡの一部としての別々の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約２６ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約３２ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約４５ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約４８ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約５４ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約６３ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約６７ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約８５ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチド）の全部または一部を含み得るか、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドバージョンが挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deltchevaら（２０１１年）Nature、４７１巻：６０２～６０７頁；ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５バージョンに見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、最大＋ｎヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，６９７，３５９を参照されたい。
ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖との間のパーセント相補性は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖との間のパーセント相補性は、約２０個連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。例として、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖との間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の５’末端では１４個連続したヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたっては０％の低さである。そのような場合では、ＤＮＡ標的化配列は、１４ヌクレオチドの長さとみなすことができる。別の例として、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖との間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の５’末端では７個連続したヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたっては０％の低さである。そのような場合では、ＤＮＡ標的化配列は、７ヌクレオチドの長さとみなすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化配列内の少なくとも１７ヌクレオチドが標的ＤＮＡと相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化配列は２０ヌクレオチドの長さであり得、ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とのミスマッチを１つ、２つ、または３つ含み得る。ミスマッチはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接しないこと（例えば、ミスマッチはＤＮＡ標的化配列の５’末端にあるか、またはミスマッチはＰＡＭ配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９塩基対離れている）ことが好ましい。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いと相補的な２つのヌクレオチドのひと続きを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的なヌクレオチドはハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ ２重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。主題のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に方向付ける。
単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよび足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を有する。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、５’ＤＮＡ標的化セグメントおよび３’足場配列を有する。例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１；配列番号１４２０）；ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２；配列番号２５６）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３；配列番号２５７）；およびＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４；配列番号２５８）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡ標的配列のいずれか（例えば、配列番号２０～２３９および２５９～２６８）を標的とするガイドＲＮＡとしては、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端上の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のいずれかと融合したガイドＲＮＡの５’末端上のＤＮＡ標的化セグメントを挙げることができる。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれかを配列番号１４２０、２５６、２５７、または２５８のいずれか１つの５’末端と接合して、単一のガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。本明細書の他の箇所で開示されるガイドＲＮＡバージョン１、２、３、および４は、それぞれ足場バージョン１、２、３、および４と接合したＤＮＡ標的化セグメントを指す。
ガイドＲＮＡは、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；細胞内標的化；蛍光標識を用いた追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす改変または配列を含み得る。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の制御ならびに／またはタンパク質および／もしくはタンパク質複合体による接近可能性の制御を可能にするため）；安定性調節配列；ｄｓＲＮＡ ２重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にターゲティングする改変または配列；追跡をもたらす改変または配列（例えば、蛍光分子との直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分とのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素などを含めたＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位をもたらす改変または配列；およびこれらの組合せが挙げられる。改変の他の例としては、工学的に操作されたステムループ２重鎖構造、工学的に操作されたバルジ領域、ステムループ２重鎖構造の工学的に操作されたヘアピン３’、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたい。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される２重鎖内の対合していないヌクレオチドの領域であり得る。バルジは、２重鎖の片側に対合していない５’－ＸＸＸＹ－３’（配列中、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは逆の鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであり得る）、および、他方の側の２重鎖に対合していないヌクレオチド領域を含み得る。
一部の場合では、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１と対合したｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質を含む転写活性化系を使用することができる。そのような系では、ガイドＲＮＡを、二量体を形成したＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質に結合するように設計されたｓｇＲＮＡテトラループおよびステムループ２に付加されたアプタマー配列を用いて設計することができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKonermannら（２０１５年）Nature、５１７巻（７５３６号）：５８３～５８８頁を参照されたい。
ガイドＲＮＡは、任意の形態でもたらすことができる。例えば、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、２つの分子（別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）としてかまたは１つの分子（ｓｇＲＮＡ）としてのいずれかでもたらすことができ、必要に応じて、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態でもたらすことができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる（例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい）。ガイドＲＮＡは、化学合成によって調製することもできる。
ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態でもたらすこともできる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）をコードしていてもよく、別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしていてもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子としてもたらすこともでき、それぞれｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子としてもたらすこともできる。
ｇＲＮＡをＤＮＡの形態でもたらす場合、ｇＲＮＡを細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞のゲノムに安定に組み込み、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、異種核酸を含むベクターであってよい。ベクターは、外因性ドナー配列をさらに含んでよく、かつ／または、ベクターは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含んでよい。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、外因性ドナー配列を含むベクターおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別のベクターまたはプラスミド内に入れることができる。そのような発現構築物に使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであってもよい。適切なプロモーターの特定の例としては、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
本明細書に開示される１つまたは複数のガイドＲＮＡ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くのガイドＲＮＡ）、および単離された核酸またはタンパク質の安定性を増大させる（例えば、所与の保管条件下で（例えば、－，２０℃、４℃、または周囲温度）、分解生成物が閾値未満、例えば出発核酸またはタンパク質の０．５重量％未満に留まる期間を延長させる；またはｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性を増大させる）担体を含む組成物も本明細書に開示される。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、および脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。そのような組成物は、本明細書の他の箇所で開示される通り、１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれよりも多く）の外因性ドナー配列および／または１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれよりも多く）の標的化ベクターおよび／または１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれよりも多く）の発現ベクターをさらに含み得る。
（３）ガイドＲＮＡ認識配列およびガイドＲＮＡ標的配列
「ガイドＲＮＡ認識配列」という用語は、結合のための十分な条件が存在すればｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子）に存在する核酸配列を包含する。ガイドＲＮＡ認識配列という用語は、本明細書で使用される場合、標的二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（すなわち、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する非相補鎖上の対応する配列）を包含する。「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、本明細書で使用される場合、具体的には、ＰＡＭに隣接する非相補鎖上（すなわち、ＰＡＭの上流または５’側）の配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列に対応する非相補鎖上の配列を指す。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと等しいが、ウラシルの代わりにチミンである。一例として、Ｃａｓ９酵素に対するガイドＲＮＡ標的配列は、５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭに隣接する非相補鎖上の配列を指すことになる。ガイドＲＮＡ認識配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計された配列を含み、ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化配列のハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、下でより詳細に記載されているＣａｓタンパク質の切断部位も含む。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含み得る。
標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡによって標的化することができる（すなわち、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡが結合することができる、またはＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡがハイブリダイズすることができる、またはＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡが相補的であり得る）。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件としては、細胞において通常存在する生理的条件が挙げられる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）が公知である（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるMolecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版（Sambrookら、Harbor Laboratory Press、２００１年）を参照されたい）。Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡと相補的であり、それとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と称することができ、「相補鎖」と相補的な（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡとは相補的でない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「鋳型鎖」と称することができる。
Ｃａｓタンパク質は、核酸を、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列の内部または外部の部位で切断し得る。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質により一本鎖切断または二本鎖切断が生じる、核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体（ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したｇＲＮＡを含む）の形成により、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列内またはその付近（例えば、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれよりも多くの塩基対の範囲内）での一方または両方の鎖の切断がもたらされ得る。切断部位が、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する核酸配列の外部にある場合、切断部位はなお「ガイドＲＮＡ認識配列」またはガイドＲＮＡ標的配列内にあるとみなされる。切断部位は、核酸の一方の鎖上のみにあってもよく、両方の鎖上にあってもよい。切断部位は、核酸の両方の鎖上の同じ位置にあってもよく（平滑末端が生じる）、各鎖上の異なる部位にあってもよい（付着末端（すなわち、突出部）が生じる）。付着末端は、例えば、それぞれが異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生じさせる２つのＣａｓタンパク質を使用し、それにより、二本鎖切断を生じさせることによって生じさせることができる。例えば、第１のニッカーゼにより、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を創出することができ、第２のニッカーゼにより、ｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を創出することができ、その結果、突出部配列が創出される。一部の場合では、第１の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、第２の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対離れている。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および／または切断は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフの両方によって決定される場所で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする鎖と逆の非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列の３’末端にＰＡＭが隣接し得る。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列の５’末端にＰＡＭが隣接し得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の約１～約１０または約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）上流または下流であり得る。一部の場合では（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９または密接に関連するＣａｓ９を使用する場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－Ｎ１ＧＧ－３’（配列中、Ｎ１は任意のＤＮＡヌクレオチドである）であり得、標的ＤＮＡの非相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列のすぐ３’側（すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列のすぐ３’側）である。したがって、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－ＣＣＮ２－３’（配列中、Ｎ２は任意のＤＮＡヌクレオチドである）になり、標的ＤＮＡの相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列のすぐ５’側である。一部のそのような場合では、Ｎ１とＮ２は相補的であり得、Ｎ１－Ｎ２塩基対は任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝Ｔ、およびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合では、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲ（配列中、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、ＲはＧまたはＡであり得る）であり得る。一部の場合では（例えば、ＦｎＣｐｆ１に関して）、ＰＡＭ配列は、５’末端の上流であり得、配列５’－ＴＴＮ－３’を有し得る。
ガイドＲＮＡ標的配列またはＰＡＭ配列に加えてガイドＲＮＡ標的配列の例を以下に提示する。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり得る。そのようなガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列の例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号２４８）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号２４９）である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたい。５’末端のグアニンにより、細胞におけるＲＮＡポリメラーゼによる転写を容易にすることができる。ガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列の他の例としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を容易にするための、５’末端の２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号２５０）を挙げることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい。他のガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列は、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号２４８～２５０の４～２２ヌクレオチドの長さを有し得る。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２４８～２５０の１４から２０ヌクレオチドの間の長さを有し得る。
ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列の場合もあり、非コード配列（例えば、制御配列）の場合もあり、両方を含む場合もある。
一例として、ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のエクソン６および／もしくはイントロン６、エクソン６および／もしくはエクソン７、またはエクソン６および／もしくはイントロン６および／もしくはエクソン７に対応する領域の範囲内の場合がある。別の例として、ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかまたはそれに近接している場合がある。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置から約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５ヌクレオチドの範囲内の場合がある。さらに別の例として、ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンまたはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の終止コドンを含むかまたはそれに近接している場合がある。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、開始コドンまたは終止コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内の場合がある。そのようなガイドＲＮＡ標的配列およびそのようなガイドＲＮＡ標的配列を標的とするガイドＲＮＡの例は、本明細書の他の箇所で開示される。
Ｆ．外因性ドナー配列または標的化ベクター
本明細書に開示される方法および組成物では、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の切断を伴わずに、またはヌクレアーゼ作用剤を用いたＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の切断後に、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を改変するために外因性ドナー配列（例えば、標的化ベクターまたは修復鋳型）を利用することができる。外因性ドナー配列は、標的配列との部位特異的組換えを可能にするために必要なエレメントを含む任意の核酸またはベクターを指す。外因性ドナー配列をヌクレアーゼ作用剤と組み合わせて使用することにより、相同組換え修復を促進することによってＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内でのより厳密な改変をもたらすことができる。
そのような方法では、ヌクレアーゼ作用剤によりＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が切断されて一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断が創出され、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介性ライゲーションまたは相同組換え修復事象によって外因性ドナー配列がＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられる。必要に応じて、外因性ドナー配列を用いた修復によりヌクレアーゼ切断部位が除去または破壊され、その結果、標的化された対立遺伝子がヌクレアーゼ作用剤によって再度標的化されることができなくなる。
外因性ドナー配列は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖形態であっても環状形態であってもよいデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。例えば、外因性ドナー配列は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるYoshimiら（２０１６年）Nat. Commun.、７巻：１０４３１頁を参照されたい。例示的な外因性ドナー配列は、約５０ヌクレオチド～約５ｋｂの長さであるか、約５０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さであるか、または約５０～約１，０００ヌクレオチドの長さである。他の例示的な外因性ドナー配列は、約４０～約２００ヌクレオチドの長さである。例えば、外因性ドナー配列は、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約１６０～約１７０、約１７０～約１８０、約１８０～約１９０、または約１９０～約２００ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー配列は、約５０～約１００、約１００～約２００、約２００～約３００、約３００～約４００、約４００～約５００、約５００～約６００、約６００～約７００、約７００～約８００、約８００～約９００、または約９００～約１，０００ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー配列は、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約４．５ｋｂ、または約４．５ｋｂ～約５ｋｂの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー配列は、例えば、５ｋｂ以下、４．５ｋｂ以下、４ｋｂ以下、３．５ｋｂ以下、３ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、２ｋｂ以下、１．５ｋｂ以下、１ｋｂ以下、９００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、７００ヌクレオチド以下、６００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、または５０ヌクレオチド以下の長さであってよい。
一実施例では、外因性ドナー配列は、約８０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドの間の長さ（例えば、約１２０ヌクレオチドの長さ）のｓｓＯＤＮである。別の例では、外因性ドナー配列は、約８０ヌクレオチドから約３ｋｂの間の長さのｓｓＯＤＮである。そのようなｓｓＯＤＮは、例えば、それぞれが約４０ヌクレオチドから約６０ヌクレオチドの間の長さである相同アームを有してよい。そのようなｓｓＯＤＮはまた、例えば、それぞれが約３０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの長さである相同アームを有してもよい。相同アームは、対称的であってもよく（例えば、それぞれが４０ヌクレオチド、またはそれぞれが６０ヌクレオチドの長さである）、非対称的であってもよい（例えば、３６ヌクレオチドの長さの相同アームが１つと９１ヌクレオチドの長さの相同アームが１つ）。
外因性ドナー配列は、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；蛍光標識を用いた追跡または検出；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす改変または配列を含み得る。外因性ドナー配列は、１つまたは複数の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはこれらの組合せを含み得る。例えば、外因性ドナー配列は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識などの、１つまたは複数の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質または他のフルオロフォアまたは色素）を含み得る。例示的な蛍光標識としては、フルオレセイン（例えば、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ））、テキサスレッド、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、およびＣｙ７などのフルオロフォアが挙げられる。オリゴヌクレオチドの標識のために広範囲の蛍光色素が商業的に入手可能である（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。そのような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）を、例えば、外因性ドナー配列の末端と適合する突出末端を有する切断されたＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に直接組み込まれた外因性ドナー配列を検出するために使用することができる。標識またはタグは、外因性ドナー配列の５’末端、３’末端、または内部にあってよい。例えば、外因性ドナー配列の５’末端にＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＩＲ７００フルオロフォア（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）をコンジュゲートすることができる。
外因性ドナー配列はまた、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に組み込まれるＤＮＡのセグメントを含む核酸挿入物も含み得る。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子への核酸挿入物の組込みにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子における目的の核酸配列の付加、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子における目的の核酸配列の欠失、またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子における目的の核酸配列の置換え（すなわち、欠失および挿入）をもたらすことができる。一部の外因性ドナー配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子におけるいかなる対応する欠失も伴わずにＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に核酸挿入物が挿入されるように設計される。他の外因性ドナー配列は、核酸挿入物のいかなる対応する挿入も伴わずにＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子において目的の核酸配列が欠失するように設計される。さらに他の外因性ドナー配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子において目的の核酸配列が欠失し、それが核酸挿入物で置き換えられるように設計される。
核酸挿入または欠失および／もしくは置換えを受けるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の対応する核酸は種々の長さであってよい。例示的な核酸挿入または欠失および／もしくは置換えを受けるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の対応する核酸は、約１ヌクレオチド～約５ｋｂの長さまたは約１ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチドの長さである。例えば、核酸挿入または欠失および／もしくは置換えを受けるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の対応する核酸は、約１～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約１６０～約１７０、約１７０～約１８０、約１８０～約１９０、または約１９０～約２００ヌクレオチドの長さであってよい。同様に、核酸挿入または欠失および／もしくは置換えを受けるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の対応する核酸は、約１～約１００、約１００～約２００、約２００～約３００、約３００～約４００、約４００～約５００、約５００～約６００、約６００～約７００、約７００～約８００、約８００～約９００、または約９００～約１，０００ヌクレオチドの長さであってよい。同様に、核酸挿入または欠失および／もしくは置換えを受けるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の対応する核酸は、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約４．５ｋｂ、または約４．５ｋｂ～約５ｋｂの長さであってよい。
核酸挿入物は、ゲノムＤＮＡまたは任意の他の型のＤＮＡを含み得る。例えば、核酸挿入物は、ｃＤＮＡを含み得る。
核酸挿入物は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の全部または一部（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の特定のモチーフまたは領域をコードする遺伝子の一部）と相同な配列を含み得る。例えば、核酸挿入物は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子における置換えの標的とされる配列と比較して１つもしくは複数の点突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれよりも多く）または１つもしくは複数のヌクレオチド挿入もしくは欠失を含む配列を含み得る。
核酸挿入または欠失および／もしくは置換えを受けるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の対応する核酸は、エクソンなどのコード領域；イントロン、非翻訳領域、もしくは制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、もしくは転写リプレッサー結合エレメント）などの非コード領域；またはこれらの任意の組合せであってよい。
核酸挿入物はまた、条件付き対立遺伝子も含み得る。条件付き対立遺伝子は、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されている多機能性対立遺伝子であってよい。例えば、条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向の発動配列；（ｂ）センスまたはアンチセンス配向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）；（ｃ）アンチセンス配向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）；ならびに（ｄ）リバース配向の反転モジュールによる条件付け（ＣＯＩＮ、エクソン分裂性イントロンおよび反転性遺伝子トラップ様モジュールを利用する）を含み得る。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。条件付き対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼに曝露すると、組換えられて、（ｉ）発動配列およびＤＳＣを欠き、かつ（ｉｉ）センス配向のＮＳＩおよびアンチセンス配向のＣＯＩＮを含有する条件付き対立遺伝子を形成する、組換え可能単位をさらに含み得る。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。
核酸挿入物はまた、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドも含み得る。あるいは、核酸挿入物は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを欠き得る。選択マーカーを選択カセットに含有させることができる。必要に応じて、選択カセットは、自己消去カセットであってよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，８５１およびＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照されたい。例として、自己消去カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結したＣｒｅｉ遺伝子（イントロンで分離された、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソン含む）およびヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結したネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。例示的な選択マーカーとして、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）、またはこれらの組合せが挙げられる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを、標的化される細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書の他の箇所に記載されている。
核酸挿入物はまた、レポーター遺伝子も含み得る。例示的なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびアルカリホスファターゼをコードするものが挙げられる。そのようなレポーター遺伝子を、標的とされる細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書の他の箇所に記載されている。
核酸挿入物はまた、１つまたは複数の発現カセットまたは欠失カセットも含み得る。所与のカセットは、目的のヌクレオチド配列、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、およびレポーター遺伝子のうちの１つまたは複数を、発現に影響を及ぼす種々の制御構成成分と一緒に含み得る。含めることができる選択性マーカーおよびレポーター遺伝子の例は、本明細書の他の箇所で詳細に論じられている。
核酸挿入物は、部位特異的組換え標的配列に挟まれた核酸を含み得る。あるいは、核酸挿入物は、１つまたは複数の部位特異的組換え標的配列を含み得る。核酸挿入物全体がそのような部位特異的組換え標的配列に挟まれていてもよいが、核酸挿入物内の任意の領域または個々の目的のポリヌクレオチドがそのような部位に挟まれていてもよい。核酸挿入物または核酸挿入物内の任意の目的のポリヌクレオチドを挟むことができる部位特異的組換え標的配列としては、例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、またはこれらの組合せを挙げることができる。一例では、核酸挿入物に含有される、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドおよび／またはレポーター遺伝子が部位特異的組換え部位に挟まれている。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子への核酸挿入物の組込み後、部位特異的組換え部位間の配列を切り出すことができる。必要に応じて、それぞれが部位特異的組換え部位を含む核酸挿入物を有する２つの外因性ドナー配列を使用することができる。外因性ドナー配列を、目的の核酸を挟む５’および３’領域にターゲティングすることができる。２つの核酸挿入物の標的ゲノム遺伝子座への組込み後、２つの挿入された部位特異的組換え部位間の目的の核酸を切り出すことができる。
核酸挿入物はまた、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型エンドヌクレアーゼを含めた制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）の１つまたは複数の制限部位も含み得る。Ｉ型およびＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的な認識配列を認識するが、一般には、切断部位（認識配列）から数百塩基対離れることがあるヌクレアーゼ結合部位由来の種々の位置で切断する。ＩＩ型系では、制限活性はいかなるメチラーゼ活性からも独立しており、切断は、一般には結合部位内または結合部位付近の特定の部位で起こる。大多数のＩＩ型酵素はパリンドローム配列をカットするが、ＩＩ型ａ酵素は、非パリンドローム認識配列を認識し、認識配列の外部を切断し、ＩＩ型ｂ酵素は、配列を２度カットし、どちらの部位も認識配列の外側にあり、また、ＩＩ型ｓ酵素は、非対称認識配列を認識し、認識配列から約１～２０ヌクレオチドの定義された距離で片側を切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化されたＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ウェブページｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ；Robertsら、（２００３年）Nucleic Acids Res.、３１巻：４１８～４２０頁；Robertsら、（２００３年）Nucleic Acids Res.、３１巻：１８０５～１８１２頁；およびBelfortら（２００２年）、Mobile DNA II、７６１～７８３頁、Craigieら編、（ASM Press、Washington、DC））においてさらに記載され、分類されている。
（１）非相同末端結合媒介性挿入のためのドナー配列
一部の外因性ドナー配列は、標的ゲノム遺伝子座における（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子における）ヌクレアーゼ媒介性またはＣａｓタンパク質媒介性切断によって創出される１つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を５’末端および／または３’末端に有する。これらの突出部は、５’および３’相同アームとも称され得る。例えば、一部の外因性ドナー配列は、標的ゲノム遺伝子座の５’および／または３’標的配列におけるＣａｓタンパク質媒介性切断によって創出される１つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を５’末端および／または３’末端に有する。一部のそのような外因性ドナー配列は、相補的な領域を５’末端のみに有するかまたは３’末端のみに有する。例えば、一部のそのような外因性ドナー配列は、相補的な領域を、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列において創出される突出部に相補的な５’末端のみに有するかまたは標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列において創出される突出部に相補的な３’末端のみに有する。他のそのような外因性ドナー配列は、相補的な領域を５’および３’末端の両方に有する。例えば、他のそのような外因性ドナー配列は、相補的な領域を５’および３’末端の両方に有し、これらは、例えば、それぞれ標的ゲノム遺伝子座におけるＣａｓ媒介性切断によって生じる第１および第２の突出部に相補的である。例えば、外因性ドナー配列が二本鎖である場合、一本鎖の相補的な領域を、ドナー配列の上鎖の５’末端およびドナー配列の下鎖の５’末端から伸長させ、それにより、各末端に５’突出部を創出することができる。あるいは、一本鎖の相補的な領域をドナー配列の上鎖の３’末端および鋳型の下鎖の３’末端から伸長させ、それにより、３’突出部を創出することができる。
相補的な領域は、外因性ドナー配列とＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子との間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さであってよい。例示的な相補的な領域は、約１～約５ヌクレオチドの長さ、約１～約２５ヌクレオチドの長さ、または約５～約１５０ヌクレオチドの長さである。例えば、相補的な領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、相補的な領域は、約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０ヌクレオチドの長さであってよい、またはそれより長くてよい。
そのような相補的な領域は、ニッカーゼの２つの対によって創出される突出部と相補的であってよい。ＤＮＡの逆の鎖を切断して第１の二本鎖切断を創出する第１および第２のニッカーゼ、ならびにＤＮＡの逆の鎖を切断して第２の二本鎖切断を創出する第３および第４のニッカーゼを使用することにより、付着末端を有する２つの二本鎖切断を創出することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡ標的配列にニックを入れることができる。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列を、第１の切断部位が創出され、その結果、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第１および第２のニッカーゼによって創出されるニックにより二本鎖切断が創出される（すなわち、第１の切断部位が第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内にニックを含む）ように位置付けることができる。同様に、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列を、第２の切断部位が創出され、その結果、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第３および第４のニッカーゼによって創出されるニックにより二本鎖切断が創出される（すなわち、第２の切断部位が第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内にニックを含む）ように位置付けることができる。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列ならびに／または第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックにより、突出部を創出するニックをオフセットすることができることが好ましい。オフセットウインドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐであるかまたはそれよりも大きくてよい。それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ranら（２０１３年）Cell、１５４巻：１３８０～１３８９頁；Maliら（２０１３年）Nat. Biotech.、３１巻：８３３～８３８頁；およびShenら（２０１４年）Nat. Methods、１１巻：３９９～４０４頁を参照されたい。そのような場合では、二本鎖外因性ドナー配列は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによってならびに第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによって創出される突出部に相補的である一本鎖の相補的な領域を有するように設計することができる。次いで、そのような外因性ドナー配列を非相同末端結合媒介性ライゲーションによって挿入することができる。
（２）相同組換え修復によって挿入するためのドナー配列
一部の外因性ドナー配列（すなわち、標的化ベクター）は、相同アームを含む。外因性ドナー配列が核酸挿入物も含む場合、相同アームにより核酸挿入物が挟まれていてよい。参照しやすくするために、本明細書では、相同アームを５’および３’（すなわち、上流および下流の）相同アームと称する。この用語法は、外因性ドナー配列内の核酸挿入物に対する相同アームの相対的な位置に関する。５’および３’相同アームは、本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と称されるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の領域に対応する。
相同アームおよび標的配列は、当該２つの領域が互いに対して相同組換え反応の基質としての機能を果たすのに十分なレベルの配列同一性を共有する場合、互いに「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるかまたは配列同一性を共有するＤＮＡ配列を包含する。所与の標的配列と外因性ドナー配列に見出される対応する相同アームとの間の配列同一性は、相同組換えが起こるのを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性ドナー配列（またはその断片）の相同アームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってよい。さらに、相同アームと対応する標的配列との間の対応する相同領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであってよい。例示的な相同アームは、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂの長さであるか、約２５ヌクレオチド～約１．５ｋｂの長さであるか、または約２５～約５００ヌクレオチドの長さである。例えば、所与の相同アーム（もしくは相同アームのそれぞれ）および／または対応する標的配列は、相同アームがＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、約２５～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１５０、約１５０～約２００、約２００～約２５０、約２５０～約３００、約３００～約３５０、約３５０～約４００、約４００～約４５０、または約４５０～約５００ヌクレオチドの長さの対応する相同領域を含み得る。あるいは、所与の相同アーム（もしくは各相同アーム）および／または対応する標的配列は、約０．５ｋｂ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、または約２ｋｂ～約２．５ｋｂの長さの対応する相同領域を含み得る。例えば、相同アームはそれぞれ約７５０ヌクレオチドの長さであってよい。相同アームは対称的であってもよく（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）、非対称的であってもよい（一方が他方よりも長い）。
相同アームは、細胞に対してネイティブな遺伝子座（例えば、標的化遺伝子座）に対応し得る。あるいは、例えば、相同アームは、例えば、導入遺伝子、発現カセット、またはＤＮＡの異種もしくは外因性領域を含めた、細胞のゲノムに組み込まれた異種または外因性ＤＮＡのセグメントの領域に対応し得る。あるいは、標的化ベクターの相同アームは、妥当な宿主細胞に含有される酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、または任意の他の工学的に操作された領域の領域に対応し得る。なおさらに、標的化ベクターの相同アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、もしくはＰ１ファージライブラリーの領域に対応し得るもしくはそれに由来し得る、または合成ＤＮＡに由来し得る。
ヌクレアーゼ作用剤を外因性ドナー配列と組み合わせて使用する場合、５’および３’標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位における一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断の際の標的配列と相同アームとの間の相同組換え事象の発生が促進されるように、ヌクレアーゼ切断部位に対して十分に近傍に位置することが好ましい。「ヌクレアーゼ切断部位」という用語は、ヌクレアーゼ作用剤（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質）によってニックまたは二本鎖切断が創出されるＤＮＡ配列を包含する。外因性ドナー配列の５’および３’相同アームに対応するＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位における一本鎖切断または二本鎖切断の際の５’および３’標的配列と相同アームとの間の相同組換え事象の発生が促進されるような距離にあれば、ヌクレアーゼ切断部位に対して「十分に近傍に位置する」。したがって、外因性ドナー配列の５’および／または３’相同アームに対応する標的配列は、例えば、所与のヌクレアーゼ切断部位から少なくとも１ヌクレオチドの範囲内または所与のヌクレアーゼ切断部位から少なくとも１０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチドの範囲内であり得る。例として、ヌクレアーゼ切断部位は、標的配列の少なくとも一方または両方のすぐ隣にあり得る。
外因性ドナー配列の相同アームに対応する標的配列とヌクレアーゼ切断部位の空間的関係は変動し得る。例えば、標的配列がヌクレアーゼ切断部位の５’側に位置する場合もあり、標的配列がヌクレアーゼ切断部位の３’側に位置する場合もあり、標的配列がヌクレアーゼ切断部位を挟んでいる場合もある。
ＩＶ．治療的および予防的適用
内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を改変または変更するための本明細書に開示される方法を使用した、慢性肝疾患を有するかまたはそのリスクがある対象における当該疾患の治療方法および処置または予防方法も提供される。内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を改変または変更するための本明細書に開示される方法を使用した、アルコール性肝疾患または非アルコール性肝疾患などの肝疾患を有するかまたはそのリスクがある対象における当該疾患の治療方法および処置または予防方法も提供される。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡ転写産物の発現を低減するための方法を使用するか、または、対象にＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする組換え核酸を提供するか、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードするｍＲＮＡを提供するかもしくはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質を提供するための方法を使用した、慢性肝疾患を有するかまたはそのリスクがある対象における当該疾患の治療方法および処置または予防方法も提供される。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡ転写産物の発現を低減するための方法を使用するか、または、対象にＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする組換え核酸を提供するか、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードするｍＲＮＡを提供するかもしくはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質を提供するための方法を使用した、アルコール性肝疾患または非アルコール性肝疾患などの肝疾患を有するかまたはそのリスクがある対象における当該疾患の治療方法および処置または予防方法も提供される。方法は、１つまたは複数の核酸またはタンパク質を対象に、対象の肝臓に、または対象の細胞（例えば、肝細胞）に（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて）導入するステップを含み得る。
慢性肝疾患は、６カ月間にわたって続く肝臓の疾患を含み、それらとして、例えば、線維症および肝硬変に至る可能性がある、肝実質の進行性の破壊および再生を伴う肝臓の疾患を挙げることができる。慢性肝疾患は、アルコール性肝疾患または非アルコール性肝疾患であり得る。慢性肝疾患に包含される肝臓病態としては、例えば、炎症（例えば、慢性肝炎）、肝硬変、および肝細胞癌を挙げることができる。慢性肝疾患の型は、本明細書の他の箇所で開示され、それらとして、例えば、脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変、および肝細胞癌が挙げられる。慢性肝疾患の症状および徴候は公知であり、それらとして、例えば、肝腫大、疲労、右上腹部の疼痛、腹部膨満（腹水）、皮膚の表面の真下の血管の肥大、男性の乳房肥大、脾腫、手掌紅斑、ならびに皮膚および眼の黄変（黄疸）を挙げることができる。慢性肝疾患に関する検査は、血液検査、肝臓のイメージング、および肝臓の生検を伴い得る。個体は、対象が、その危険因子を有する個体の疾患発症のリスクが危険因子を有さない個体よりも統計的に有意に大きくなる、少なくとも１つの公知の危険因子（例えば、疾患を引き起こす突然変異などの遺伝因子）を有する場合、慢性肝疾患のリスクが高い。慢性肝疾患の危険因子も周知であり、それらとして、例えば、過剰なアルコールの使用、肥満症、高コレステロール、高レベルの血中トリグリセリド、多嚢胞性卵巣症候群、睡眠時無呼吸、２型糖尿病、不活性甲状腺（甲状腺機能低下症）、不活性下垂体（下垂体機能低下症）、および血中脂質の上昇を含めたメタボリックシンドロームを挙げることができる。
「対象」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象（例えば、ネコ科の動物、イヌ科の動物、齧歯類、マウス、もしくはラット）または非哺乳動物対象（例えば、家禽）を包含する。そのような対象は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではない（または単にＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントのヘテロ接合体保因者である）対象、および慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象（例えば、ヒト）であり得る。ゲノムＤＮＡを含む生体試料中のＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの存在を検出するため、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡを含む生体試料中のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ’、Ｇ、およびＨのいずれか１つもしくは組合せ、特にＤの存在もしくはレベルを検出するため、またはタンパク質を含む生体試料中のＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質アイソフォームＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ’、Ｇ、またはＨのいずれか１つもしくは組合せ、特にＤの存在もしくはレベルを検出するための種々の方法が可能である。ゲノムＤＮＡ内の配列の存在を検出するため、および特定のｍＲＮＡ転写産物またはタンパク質アイソフォームの存在を検出するための方法は周知である。集団内の遺伝子配列、およびｍＲＮＡ、およびそのような遺伝子によってコードされるタンパク質は、一塩基多型などの多型に起因して変動し得ることが理解される。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝について、ならびに各ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物およびＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームについて本明細書において提示される配列は、単に、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子について、ならびに各ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物およびＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームについての例示的な配列である。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子について、ならびに各ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物およびＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームについての他の配列も可能である。
例えば、細胞内でまたはヒト対象などの対象においてＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントを検出するための方法は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む対象由来の生体試料を得るステップ、ならびに、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子および配列番号２を最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応するＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の位置がチミンに占有されていること、またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子および配列番号１を最適にアラインメントした場合、１２６６５位に対応する位置および１２６６６位に対応する位置の間にチミンが挿入されていることを決定するアッセイを生体試料に対して実施するステップを含み得る。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子および配列番号２を最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応するＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の位置がチミンに占有されていることを決定することとは、配列番号１の１２６６５位および１２６６６位に対応する位置に隣接する位置において十分な数のヌクレオチドの同一性が決定されること、配列番号１の１２６６５位に対応する位置と１２６６６位に対応する位置との間にチミンが挿入されていると決定することが可能であることを意味することが理解される。そのようなアッセイは、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子および配列番号２（または配列番号１）を最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位（または配列番号１の１２６６５位および１２６６６位）および１つまたは複数の周囲の位置（例えば、配列番号２の１２６６６位または配列番号１の１２６６５位および１２６６６位の片側または両側に隣接する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０カ所の位置）に対応するＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の位置の同一性を決定することを含み得る。そのような方法におけるアッセイは、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子および配列番号２を最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位または１２６６６位および１２６６７位に対応する位置を含むＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の一部を配列決定することを含み得る。同様に、アッセイは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子および配列番号１を最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位および１２６６６位に対応する位置を含むＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の一部を配列決定することを含み得る。あるいは、そのような方法におけるアッセイは、生体試料を、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントに特異的にハイブリダイズし、対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３配列にはハイブリダイズしない（例えば、ストリンジェントな条件下で）プライマーまたはプローブと接触させること、およびハイブリダイゼーションが起こったかどうかを決定することを含み得る。
そのような方法は、ゲノム編集または遺伝子治療を含み得る。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントではない内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントに関連する変化（すなわち、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間のチミンの挿入または逆の鎖上の対応する位置におけるアデニンの挿入）を含むように改変することができる。別の例として、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントではない内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をノックアウトまたは不活化することができる。同様に、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントではない内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をノックアウトまたは不活化することができ、かつ、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントに関連する改変を含むＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子（例えば、改変を含む完全なＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントまたはミニ遺伝子）を導入し、発現させることができる。同様に、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントではない内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をノックアウトまたは不活化することができ、かつ、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＨ（またはその断片）のいずれか１つまたはそれらの任意の組合せをコードする組換えＤＮＡを導入し、発現させることができるか、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＨ（またはその断片）のいずれか１つまたはそれらの任意の組合せをコードするｍＲＮＡを導入し、発現させることができるか（例えば、細胞内タンパク質補充療法）、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＨ（またはその断片）のいずれか１つまたはそれらの任意の組合せを導入することができる（例えば、タンパク質補充療法）。特定の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォーム（またはコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）の組合せは、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤを含む組合せ（例えば、Ｄ、ＤＣ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＤＣＦ、ＤＣＧ、ＤＣＨ、ＤＦＧ、ＤＦＨ、ＤＧＨ、ＤＣＦＧ、ＤＣＦＨ、ＤＣＧＨ、ＤＦＧＨ、またはＤＣＦＧＨ）である。
他のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントではない内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子をノックアウトまたは不活化せずに、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントに関連する改変を含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子（例えば、改変を含む完全なＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントもしくはミニ遺伝子）を導入し、発現させるステップ、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＨもしくはその断片のいずれか１つもしくはそれらの任意の組合せをコードする組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入し、発現させるステップ、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＨまたはその断片のいずれか１つもしくはそれらの任意の組合せをコードする１つもしくは複数のｍＲＮＡを導入し、発現させるステップ（例えば、細胞内タンパク質補充療法）、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＨもしくはその断片のいずれか１つもしくはそれらの任意の組合せを導入するステップ（例えば、タンパク質補充療法）を含み得る。特定の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォーム（またはコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）の組合せは、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤを含む組合せ（例えば、Ｄ、ＤＣ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＤＣＦ、ＤＣＧ、ＤＣＨ、ＤＦＧ、ＤＦＨ、ＤＧＨ、ＤＣＦＧ、ＤＣＦＨ、ＤＣＧＨ、ＤＦＧＨ、またはＤＣＦＧＨ）である。必要に応じて、そのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者（例えば、転写産物Ａ、Ｂ、Ｅ、およびＦ’）において発現が低減するＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物を、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡの使用による発現の低減のために標的化する方法と組み合わせて行うこともできる。特定の実施形態では、発現の低減のために標的化されるＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物は、転写産物Ａを含む組合せ（例えば、Ａ、ＡＢ、ＡＥ、ＡＦ’、ＡＢＥ、ＡＢＦ’、ＡＥＦ’、またはＡＢＥＦ’）である。
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子またはミニ遺伝子またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＨまたはその断片のいずれか１つまたはそれらの任意の組合せをコードするＤＮＡは、ゲノムを改変しない発現ベクターの形態で導入し、発現させることができるか、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子座にゲノム的に組み込まれるように標的化ベクターの形態で導入することができるか、またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子座以外の遺伝子座、例えばセーフハーバー遺伝子座にゲノム的に組み込まれるように導入することができる。ゲノム的に組み込まれるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、ＨＳＤ１７Ｂ１３プロモーターまたは組込み部位の内因性プロモーターなどの別のプロモーターに作動可能に連結することができる。セーフハーバー遺伝子座は、目的の組織全てにおいて遺伝子の構造または発現に悪影響を及ぼすことなく導入遺伝子を安定にかつ確実に発現させることができる、染色体上の部位である。セーフハーバー遺伝子座は、例えば、以下の特性の１つまたは複数または全てを有し得る：（１）任意の遺伝子の５’末端からの距離が５０ｋｂよりも大きい；任意のがん関連遺伝子からの距離が３００ｋｂよりも大きい；任意のマイクロＲＮＡからの距離が３００ｋｂよりも大きい；遺伝子転写単位の外側であり、超保存領域の外側である。適切なセーフハーバー遺伝子座の例としては、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子遺伝子座、およびマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトオルソログが挙げられる。
導入し、発現させることができるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質アイソフォームまたはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質アイソフォームをコードする核酸の組合せとしては、例えば、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＣＤ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＨ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＦＧ、ＦＨ、ＧＨ、ＣＤＦ、ＣＤＧ、ＣＤＨ、ＣＦＧ、ＣＦＨ、ＣＧＨ、ＤＦＧ、ＤＦＨ、ＤＧＨ、ＦＧＨ、ＣＤＦＧ、ＣＤＦＨ、ＣＦＧＨ、ＤＦＧＨ、およびＣＤＦＧＨが挙げられる。特定の方法では、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤまたはアイソフォームＤをコードする核酸（単独で、または他のアイソフォームと組み合わせて）を導入するかまたは発現させる。これらのアイソフォームおよび転写産物のそれぞれの例示的な配列は本明細書の他の箇所に提示される。しかし、集団内の遺伝子配列、そのような遺伝子から転写されるｍＲＮＡ配列、およびそのようなｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質は、一塩基多型などの多型に起因して変動し得ることが理解される。各転写産物について本明細書において提示される配列およびアイソフォームは、単に例示的な配列である。他の配列も可能である。
アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡによる低減のために発現を標的化することができるＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の組合せとしては、例えば、Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ’、ＡＢ、ＡＥ、ＡＦ’、ＢＥ、ＢＦ’、ＡＢＥ、ＡＢＦ’、ＡＥＦ’、ＢＥＦ’、およびＡＢＥＦ’が挙げられる。特定の方法では、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ（単独で、または他の転写産物と組み合わせて）を標的化する。例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）内の配列とハイブリダイズし得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）には存在しない、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）に存在する配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン７内の配列またはエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする。
例えば、一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく（または単にＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントのヘテロ接合体保因者であり）、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、（ａ）ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のヌクレアーゼ標的配列に結合するヌクレアーゼ作用剤（またはコードする核酸）であって、ヌクレアーゼ標的配列が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２の１２６６６位に対応する位置を含むかまたはその位置に近接している、ヌクレアーゼ作用剤（またはコードする核酸）；ならびに（ｂ）配列番号２の１２６６６位に対応する位置の５’側の標的配列とハイブリダイズする５’相同アーム、配列番号２の１２６６６位に対応する位置の３’側の標的配列とハイブリダイズする３’相同アーム、および５’相同アームと３’相同アームに挟まれたチミンを含む核酸挿入物を含む外因性ドナー配列を対象に導入するかまたは対象の肝細胞に導入するステップを含む方法を含む。ヌクレアーゼ作用剤が対象の肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断することができ、外因性ドナー配列が肝細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられることが可能であり、外因性ドナー配列がＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられると、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間にチミンが挿入される。そのような方法において使用することができるヌクレアーゼ作用剤（例えば、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡ）の例は、本明細書の他の箇所で開示される。適切なガイドＲＮＡおよびガイドＲＮＡ標的配列の例は、本明細書の他の箇所で開示される。そのような方法において使用することができる外因性ドナー配列の例は、本明細書の他の箇所で開示される。
別の例として、一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく（または単にＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントのヘテロ接合体保因者であり）、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、配列番号２の１２６６６位に対応する位置の５’側の標的配列とハイブリダイズする５’相同アーム、配列番号２の１２６６６位に対応する位置の３’側の標的配列とハイブリダイズする３’相同アーム、および５’相同アームと３’相同アームに挟まれたチミンを含む核酸挿入物を含む外因性ドナー配列を対象に導入するかまたは対象の肝細胞に導入するステップを含む方法を含む。外因性ドナー配列が肝細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられることが可能であり、外因性ドナー配列がＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられると、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間にチミンが挿入される。そのような方法において使用することができる外因性ドナー配列の例は、本明細書の他の箇所で開示される。
一部のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく（または単にＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントのヘテロ接合体保因者であり）、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、（ａ）ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のヌクレアーゼ標的配列に結合するヌクレアーゼ作用剤（またはコードする核酸）であって、ヌクレアーゼ標的配列が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むか、または開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号２０～８１から選択される、ヌクレアーゼ作用剤（またはコードする核酸）を対象に導入するかまたは対象の肝細胞に導入するステップを含む方法を含む。ヌクレアーゼ作用剤が対象の肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断し、その発現を破壊することができる。一部そのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく（または単にＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントのヘテロ接合体保因者であり）、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、（ａ）ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のヌクレアーゼ標的配列に結合するヌクレアーゼ作用剤（またはコードする核酸）であって、ヌクレアーゼ標的配列が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むか、または開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号２０～８１から選択される、ヌクレアーゼ作用剤（またはコードする核酸）；および（ｂ）組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む発現ベクターを対象に導入するかまたは対象の肝細胞に導入するステップを含む方法を含む。発現ベクターは、ゲノム的に組み込まれないものであってよい。あるいは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む標的化ベクター（すなわち、外因性ドナー配列）を導入することができる。ヌクレアーゼ作用剤が対象の肝細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を切断し、その発現を破壊することができ、発現ベクターが対象の肝細胞内で組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現することができる。あるいは、ゲノム的に組み込まれた組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が対象の肝細胞内で発現することができる。そのような方法において使用することができるヌクレアーゼ作用剤（例えば、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡ）の例は、本明細書の他の箇所で開示される。適切なガイドＲＮＡおよびガイドＲＮＡ標的配列の例は、本明細書の他の箇所で開示される。ステップ（ｂ）は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含み、かつ／または、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、発現ベクターまたは標的化ベクターを導入することを含んでもよい。同様に、ステップ（ｂ）は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードし、かつ／または、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である相補ＤＮＡ（またはその一部）を有するｍＲＮＡを導入することを含んでもよい。同様に、ステップ（ｂ）は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むタンパク質を導入することを含んでもよい。特定の方法では、転写産物はＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ（例えば、配列番号７）であり得るか、またはアイソフォームはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ（例えば、配列番号１５）であり得る。他の特定の方法では、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せ、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せをコードする発現ベクターもしくは標的化ベクター、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せをコードするｍＲＮＡを導入することができる（例えば、Ｄ、ＤＣ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＤＣＦ、ＤＣＧ、ＤＣＨ、ＤＦＧ、ＤＦＨ、ＤＧＨ、ＤＣＦＧ、ＤＣＦＨ、ＤＣＧＨ、ＤＦＧＨ、またはＤＣＦＧＨ）。
一部のそのような方法では、第２のヌクレアーゼ作用剤も対象または対象の肝細胞に導入し、ここで、第２のヌクレアーゼ作用剤は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第２のヌクレアーゼ標的配列に結合し、第２のヌクレアーゼ標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の終止コドンを含むか、または終止コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号８２～２２５から選択され、ヌクレアーゼ作用剤は、肝細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を第１のヌクレアーゼ標的配列内および第２のヌクレアーゼ標的配列内の両方で切断し、肝細胞が、第１のヌクレアーゼ標的配列と第２のヌクレアーゼ標的配列との間に欠失を含むように改変される。例えば、第２のヌクレアーゼ作用剤は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡであり得る。終止コドンの近傍にある適切なガイドＲＮＡおよびガイドＲＮＡ標的配列は、本明細書の他の箇所で開示される。
そのような方法はまた、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく（または単にＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントのヘテロ接合体保因者であり）、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、（ａ）ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のＤＮＡ結合タンパク質標的配列に結合するＤＮＡ結合タンパク質（またはコードする核酸）であって、ＤＮＡ結合タンパク質標的配列が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むか、または開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号２０～８１から選択される、ＤＮＡ結合タンパク質（またはコードする核酸）を対象に導入するかまたは対象の肝細胞に導入するステップを含む方法も含み得る。ＤＮＡ結合タンパク質は、対象の肝細胞内でのＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更（例えば、低減）することができる。そのような方法はまた、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく（または単にＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントのヘテロ接合体保因者であり）、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、（ａ）ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のＤＮＡ結合タンパク質標的配列に結合するＤＮＡ結合タンパク質（またはコードする核酸）であって、ＤＮＡ結合タンパク質標的配列が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むか、または開始コドンから約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチドの範囲内であるか、または配列番号２０～８１から選択される、ＤＮＡ結合タンパク質（またはコードする核酸）；および（ｂ）組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む発現ベクターを対象に導入するかまたは対象の肝細胞に導入するステップを含む方法も含み得る。発現ベクターは、ゲノム的に組み込まれないものであってよい。あるいは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む標的化ベクター（すなわち、外因性ドナー配列）を導入することができる。ＤＮＡ結合タンパク質が対象の肝細胞内でのＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更（例えば、低減）することができ、発現ベクターが対象の肝細胞内で組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現することができる。あるいは、ゲノム的に組み込まれた組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が対象の肝細胞内で発現することができる。そのような方法における使用に適したＤＮＡ結合タンパク質の例は、本明細書の他の箇所で開示される。そのようなＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡ）は、転写リプレッサードメインと融合するかまたは作動可能に連結することができる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質は、転写リプレッサードメインと融合した、触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質であり得る。そのような転写リプレッサードメインと融合したＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子またはｒｓ７２６１３５６７バリアントではないＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を低減するために（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物またはアイソフォームＡの発現を低減するために）使用することができる。適切なガイドＲＮＡおよびガイドＲＮＡ標的配列の例は、本明細書の他の箇所で開示される。ステップ（ｂ）は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含み、かつ／または、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、発現ベクターまたは標的化ベクターを導入することを含んでもよい。同様に、ステップ（ｂ）は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードし、かつ／または、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である相補ＤＮＡ（またはその一部）を有するｍＲＮＡを導入することを含んでもよい。同様に、ステップ（ｂ）は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むタンパク質を導入することを含んでもよい。特定の方法では、転写産物はＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ（例えば、配列番号７）であり得るか、またはアイソフォームはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ（例えば、配列番号１５）であり得る。他の特定の方法では、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せ、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せをコードする発現ベクターもしくは標的化ベクター、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せをコードするｍＲＮＡを導入することができる（例えば、Ｄ、ＤＣ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＤＣＦ、ＤＣＧ、ＤＣＨ、ＤＦＧ、ＤＦＨ、ＤＧＨ、ＤＣＦＧ、ＤＣＦＨ、ＤＣＧＨ、ＤＦＧＨ、またはＤＣＦＧＨ）。
そのような方法はまた、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく（または単にＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントのヘテロ接合体保因者であり）、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ、Ｂ、Ｅ、およびＦ’のうちの１つまたは複数（特にＡ）の領域内の、必要に応じて、１つまたは複数のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＨ（特にＤ）には存在しない配列とハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを対象に導入するかまたは対象の肝細胞に導入するステップを含む方法も含み得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）内の配列とハイブリダイズし、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減し得る。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）には存在しない、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）に存在する配列とハイブリダイズする。必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン７内の配列またはエクソン６とエクソン７との境界にまたがる配列とハイブリダイズする。例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、エクソン７の領域内または配列番号４（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ）のエクソン６とエクソン７との境界にまたがる領域内の配列とハイブリダイズし、対象の肝細胞内でのＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａの発現を低減し得る。必要に応じて、そのような方法は、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む発現ベクターを対象に導入するステップをさらに含み得る。発現ベクターは、ゲノム的に組み込まれないものであってよい。あるいは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む標的化ベクター（すなわち、外因性ドナー配列）を導入することができる。発現ベクターを使用する方法では、発現ベクターが対象の肝細胞内で組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現することができる。あるいは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子がゲノム的に組み込まれる方法では、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が対象の肝細胞内で発現することができる。そのような方法は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含み、かつ／または、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、発現ベクターまたは標的化ベクターを導入するステップを含んでもよい。同様に、そのような方法は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードし、かつ／または、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である相補ＤＮＡ（またはその一部）を有するｍＲＮＡを導入するステップを含んでもよい。同様に、そのような方法は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むタンパク質を導入するステップを含んでもよい。特定の方法では、転写産物はＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ（例えば、配列番号７）であり得るか、またはアイソフォームはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ（例えば、配列番号１５）であり得る。他の特定の方法では、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せ、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せをコードする発現ベクターもしくは標的化ベクター、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せをコードするｍＲＮＡを導入することができる（例えば、Ｄ、ＤＣ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＤＣＦ、ＤＣＧ、ＤＣＨ、ＤＦＧ、ＤＦＨ、ＤＧＨ、ＤＣＦＧ、ＤＣＦＨ、ＤＣＧＨ、ＤＦＧＨ、またはＤＣＦＧＨ）。
他のそのような方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保因者ではなく（または単にＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントのヘテロ接合体保因者であり）、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象を処置する方法であって、発現ベクターを対象に導入するかまたは対象の肝細胞に導入するステップを含み、発現ベクターが、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含み、発現ベクターが、対象の肝細胞内で組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現する、方法を含み得る。発現ベクターは、ゲノム的に組み込まれないものであってよい。あるいは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む標的化ベクター（すなわち、外因性ドナー配列）を導入することができる。発現ベクターを使用する方法では、発現ベクターが対象の肝細胞内で組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現することができる。あるいは、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子がゲノム的に組み込まれる方法では、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が対象の肝細胞内で発現することができる。そのような方法は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含み、かつ／または、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、発現ベクターまたは標的化ベクターを導入するステップを含んでもよい。同様に、そのような方法は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードし、かつ／または、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である相補ＤＮＡ（またはその一部）を有するｍＲＮＡを導入するステップを含んでもよい。同様に、そのような方法は、代わりに、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨまたはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むタンパク質を導入するステップを含んでもよい。特定の方法では、転写産物はＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ（例えば、配列番号７）であり得るか、またはアイソフォームはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ（例えば、配列番号１５）であり得る。他の特定の方法では、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せ、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せをコードする発現ベクターもしくは標的化ベクター、またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの組合せをコードするｍＲＮＡを導入することができる（例えば、Ｄ、ＤＣ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＤＣＦ、ＤＣＧ、ＤＣＨ、ＤＦＧ、ＤＦＨ、ＤＧＨ、ＤＣＦＧ、ＤＣＦＨ、ＤＣＧＨ、ＤＦＧＨ、またはＤＣＦＧＨ）。
上記の方法のいずれかにおいて使用するための適切な発現ベクターおよび組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、本明細書の他の箇所で開示される。例えば、組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、完全なｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子であってもよく、遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子であってもよい。例として、欠失したセグメントは、１つまたは複数のイントロン配列を含み得、ミニ遺伝子は、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のイントロン６に対応するイントロンを含み得る。完全なｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子の例は、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるものである。
一部のそのような方法は、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象において細胞（例えば、肝細胞）を改変する方法を含む。そのような方法では、ヌクレアーゼ作用剤および／または外因性ドナー配列および／または組換え発現ベクターを、細胞に、処置される慢性肝疾患の発症を遅延させる、重症度を低下させる、さらなる悪化を阻害する、および／または少なくとも１つの徴候もしくは症状を好転させる投与量、投与経路および投与の頻度を意味する有効なレジームで投与することにより導入することができる。「症状」という用語は、対象によって知覚される疾患の主観的証拠を指し、「徴候」は、医師によって観察される疾患の客観的証拠を指す。対象が疾患にすでに罹患している場合、レジームは、治療的に有効なレジームと称され得る。対象の疾患のリスクが一般集団と比べて上昇しているがまだ症状が出ていない場合、レジームは、予防的に有効なレジームと称され得る。一部の例では、治療的または予防的有効性は、個々の患者において歴史的対照または同じ対象における過去の経験と比べて観察することができる。他の場合では、治療的または予防的有効性は、前臨床または臨床試験において、処置された対象の集団と無処置の対象の対照集団を比べて実証することができる。
送達は、本明細書の他の箇所で開示される任意の適切な方法であってよい。例えば、ヌクレアーゼ作用剤または外因性ドナー配列または組換え発現ベクターを、ベクター送達、ウイルスによる送達、粒子媒介性送達、ナノ粒子媒介性送達、リポソーム媒介性送達、エキソソーム媒介性送達、脂質媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、細胞透過性ペプチド媒介性送達、または埋め込み型デバイス媒介性送達によって送達することができる。一部の特定の例として、流体力学的送達、ウイルス媒介性送達、および脂質ナノ粒子媒介性送達が挙げられる。
投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含めた任意の適切な経路によるものであってよい。例えばタンパク質補充療法のために多くの場合使用される具体例は、静脈内注入である。投与の頻度および投与量の数は、他の因子の中でも、ヌクレアーゼ作用剤または外因性ドナー配列または組換え発現ベクターの半減期、対象の状態、および投与経路に依存し得る。投与するための医薬組成物は、無菌かつ実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与用の投与量）で提供することができる。医薬組成物は、１つまたは複数の生理的かつ薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択される投与経路に依存する。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または助剤が製剤の他の成分に適合し、そのレシピエントに対して実質的に有害でないことを意味する。
他のそのような方法は、慢性肝疾患を有するかまたはそれを発症しやすい対象由来の細胞におけるｅｘ ｖｉｖｏ方法を含む。次いで、標的化遺伝子改変を有する細胞を対象に移植し戻すことができる。
本明細書に開示される治療または予防方法はいずれも、より臨床的に進行した段階の慢性肝疾患への進行（例えば、単純な脂肪症から、より臨床的に進行した段階の慢性肝疾患への進行、または単純な脂肪症から脂肪性肝炎、線維症、肝硬変、および肝細胞癌の１つまたは複数への進行）に付随する１つまたは複数の症状が防止または緩和されるように調整された治療薬を投与するステップをさらに含み得る。例えば、そのような処置は、炎症を防止もしくは低減することまたは線維症を防止もしくは低減することに焦点を当てることができる。開発中のそのような治療薬の例を以下に提示する。
Figure 0007094963000009
上文または下で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各項目が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されるのと同じ程度に、あらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる。違う時間に受託番号に異なるバージョンの配列が関連付けられている場合、本出願の有効な出願日において受託番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、受託番号に関して実際の出願日または優先出願の出願日の早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り本出願の有効な出願日時点で直近に公開されたバージョンを意味する。特に他の指示がなければ、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明を明瞭さおよび理解のために図表および例によって少し詳細に記載してきたが、ある特定の変化および改変を添付の特許請求の範囲内で実施することができることが明らかになろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に列挙されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）３’末端まで進む標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいかなる言及にも相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）カルボキシ末端まで進む標準の慣習に従う。
Figure 0007094963000010
Figure 0007094963000011
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（実施例１）
１７ベータ－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１３バリアントは慢性肝疾患に対して保護する
慢性肝疾患および肝硬変は、米国における疾病率死亡率の主因である（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kochanekら（２０１６年）Natl Vital Stat Rep ６５巻：１～１２２頁）。肝硬変の最も一般的な病因は、アルコール性肝疾患、慢性Ｃ型肝炎、および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であると共に、肝移植を待っている患者の約８０％を占める（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wongら（２０１５年）Gastroenterology １４８巻：５４７～５５５頁）。注目すべきことに、米国におけるＮＡＦＬＤの推定有病率は、１９～４６パーセントであり（それぞれ、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Browningら（２００４年）Hepatology ４０巻：１３８７～１３９５頁；Lazoら（２０１３年）Am J Epidemiol １７８巻：３８～４５頁；およびWilliamsら（２０１１年）Gastroenterology １４０巻：１２４～１３１頁）、おそらく肥満症の率の増大と関連して、時間と共に上昇している（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Younossiら（２０１１年）Clin Gastroenterol Hepatol ９巻：５２４～５３０ｅ１頁；ｑｕｉｚ ｅ６０（２０１１年））。今まで、ＮＡＦＬＤの進行および転帰における個体間変動に関しては依然として非常に不安定である；基礎となる遺伝的因子の知識は、リスク階層化を改善し、新規治療戦略のための基礎を提供することができる。ここで、本発明者らは、ＨＳＤ１７Ｂ１３（ヒドロキシステロイド－１７－ベータデヒドロゲナーゼ１３をコードする）におけるスプライスバリアントの保因者は、アルコール性および非アルコール性肝疾患のリスクが低く、ＮＡＦＬＤ進行のリスクが低いことを示す。ＤｉｓｃｏｖＥＨＲ研究における４６，５４４人の欧州祖先参加者に由来する電子カルテにリンクされた全エクソーム配列データの関連研究は、アラニントランスアミナーゼおよびアスパラギン酸トランスアミナーゼレベルの低下と関連するＨＳＤ１７Ｂ１３（ｒｓ７２６１３５６７）中のスプライスバリアントの同定をもたらした；これらの知見を、１２，５２８人の個体を含む３つの別々のコホートにおいて再現した。ディスカバリーコホートにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントは、アルコール性および非アルコール性肝疾患、肝硬変、および肝細胞癌のリスクの低下と関連していた。肥満外科手術コホートにおいては、バリアントは、脂肪症を有する個体における組織病理学的脂肪性肝炎のリスクの低下と関連していた。肥満外科手術コホートに由来するヒト肝臓試料のＲＮＡ配列決定により、スプライスバリアントのホモ接合体保因者が、トランケートされたＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームをコードする新規転写産物を主に発現することが示された。これらの知見は、肝疾患進行の促進におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の役割、ならびに脂肪性肝炎および肝硬変のための治療標的としてのその可能性に新しい光明を投じるものである。
以前のゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、限られた数の、慢性肝疾患に関連する遺伝子およびバリアントが同定されている。現在までに最もしっかりと検証された遺伝的関連は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３遺伝子（ＰＮＰＬＡ３ ｐ．Ｉｌｅ１４８Ｍｅｔ、ｒｓ７３８４０９）における共通のミスセンスバリアントに関するものであり、これは、最初に非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）のリスクの上昇に関連することが見出され（Romeoら（２００８年）Nat Genet、４０巻：１４６１～１４６５頁およびSpeliotesら（２０１１年）PLoS Genet、７巻：ｅ１００１３２４頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、続いて、疾患の重症度（Rotmanら（２０１０年）Hepatology、５２巻：８９４～９０３頁およびSookoianら（２００９年）J Lipid Res、５０巻：２１１１～２１１６頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）および進行（Trepoら（２０１６年）J Hepatol doi:10.1016/j.jhep.2016.03.011、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に関連することが見出された。膜貫通６スーパーファミリーメンバー２（ＴＭ６ＳＦ２）遺伝子の変化によりＮＡＦＬＤのリスクの上昇が付与されることも示されている（Kozlitinaら（２０１４年）Nat Genet、４６巻：３５２～３５６頁、Liuら（２０１４年）Nat Commun ５巻：４３０９頁；およびSookoianら（２０１５年）Hepatology、６１巻：５１５～５２５頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの２種のタンパク質の正常な機能は十分には理解されていないにもかかわらず、どちらも、肝細胞の脂質代謝に関与することが提唱されてきた。ＰＮＰＬＡ３およびＴＭ６ＳＦ２のバリアントが肝疾患のリスクの上昇にどのように寄与するかはまだ解明されていない。ＧＷＡＳにより、臨床的に頻繁に測定される肝細胞傷害および肝臓脂肪蓄積の定量的マーカーである血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）に関連する遺伝因子もいくつか同定された（Chambersら（２０１１年）Nat Genet、４３巻：１１３１～１１３８頁およびYuanら（２００８年）Am J Hum Genet、８３巻：５２０～５２８頁、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。現在まで、慢性肝疾患に対する保護的遺伝子バリアントは記載されていない。心血管疾患のリスクを低下させるＰＣＳＫ９の機能喪失型バリアントなどの他の状況での保護的遺伝子バリアントの発見が、新しいクラスの治療薬を開発するための促進要因になっている。
Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＣｅｎｔｅｒとＧｅｉｓｉｎｇｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＨＳ）とのＤｉｓｃｏｖＥＨＲ共同研究は、エクソーム配列決定を、非特定化された電子カルテ（ＥＨＲ）データに繋いで、遺伝子発見および精密医療を可能にする（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deweyら（２０１６年）Science ３５４巻（６３１９頁）doi:10.1126/science.aaf6814）。ＤｉｓｃｏｖＥＨＲコホートは、肝臓生検標本を有する肥満外科手術患者を含む、ＧＨＳ統合医療システムにわたる一次および特殊医療コホートから募集した患者を含む（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gordenら（２０１３年）Hum Hered ７５巻：３４～４３頁）。この研究では、本発明者らは、包括的機能ゲノミクス手法に着手して、ＤｉｓｃｏｖＥＨＲコホートに由来する欧州子孫の４９，１８８人の個体における慢性肝疾患および肝硬変と関連する量的形質、疾患診断、および組織病理学的表現型への、エクソーム配列変化の寄与を評価すると共に、欧州祖先の９，８８３人の個体の全エクソーム配列決定を使用するフォローアップ研究を行った。
ＥＨＲ由来表現型に関連付けられた全エクソーム配列データを使用して、本発明者らは、ＤｉｓｃｏｖＥＨＲコホートに由来する欧州子孫の４６，５４４人の個体（「ＧＨＳディスカバリーコホート」）における血清ＡＬＴおよびＡＳＴ測定値の関連研究を最初に実行した。このコホートの臨床的特徴は、表１Ａに記載される。ＥＨＲに文書化されたトランスアミナーゼ測定値を有する個体は４１，９０８人であった（ＡＬＴとＡＳＴ測定値の両方を有する４０，５６１人の個体を含む）。本発明者らは、線形混合モデル（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Yangら（２０１１年）Am J Hum Genet ８８巻：７６～８２頁）を使用して、ｌｏｇ１０変換されたＡＬＴおよびＡＳＴレベル中央値（性別、年齢、年齢２、体格指数（ＢＭＩ）および祖先の最初の４つの主成分について調整されたもの）と、０．１％より高いマイナー対立遺伝子頻度を有する５０２，２１９個の二対立遺伝子単一バリアントとの関連を検出した。Ｐ＜１．０×１０－７のエクソームワイド有意性閾値を使用して、本発明者らは、ＡＬＴとＡＳＴの両方と関連する７個の遺伝子中の８個のバリアントを含む、ＡＬＴまたはＡＳＴと有意に関連する１９個の遺伝子中の３５個のバリアントを同定した（図１および表２）。
Figure 0007094963000013
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これらの関連を再現するために、本発明者らは、３つの別々の欧州祖先コホート：ＤｉｓｃｏｖＥＨＲに由来する２，６４４人の肥満外科手術患者（「ＧＨＳ肥満外科手術コホート」）、Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙに由来する１，３５７人の個体、およびＰｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋに由来する８，５２６人の個体における全エクソーム配列決定により確認された３５個のＡＳＴまたはＡＬＴ関連バリアントを分析した（表１Ａ）。再現コホートのメタ分析において、９個の遺伝子中の１３個のバリアントが、ＡＬＴまたはＡＳＴと有意に関連していた（ｐ＜１．４３×１０－３のボンフェローニ有意性閾値）（表３）。これらのものは、ＰＮＰＬＡ３ ｐ．Ｉｌｅ１４８Ｍｅｔ（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Romeoら（２００８年）Nat Genet ４０巻：１４６１～１４６５頁）、ＴＭ６ＳＦ２ ｐ．Ｇｌｕ１６７Ｌｙｓ（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kozlitinaら（２０１４年）Nat Genet ４６巻：３５２～３５６頁）、およびＳＥＲＰＩＮＡ１ ｐ．Ｇｌｕ３６６Ｌｙｓ（アルファ－１－抗トリプシン欠損と関連するＺ対立遺伝子）（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brantlyら（１９８８年）Am J Med ８４巻：１３～３１頁）、ＳＡＭＭ５０、およびＥＲＬＩＮ１などの、以前に報告された肝疾患関連遺伝子およびバリアントを含んでいた。ＳＥＲＰＩＮＡ１は、アルファ－１－抗トリプシンをコードし、その機能的欠損は、遺伝性肝疾患を引き起こすことが公知である；ＳＡＭＭ５０との関連は、ＰＮＰＬＡ３における変化との連鎖不均衡により媒介される可能性があり、ＥＲＬＩＮ１は肝臓脂肪沈着に関与していた。それぞれ、ＡＬＴおよびＡＳＴをコードする遺伝子であるＧＰＴおよびＧＯＴ１におけるいくつかのバリアントは、ＡＬＴまたはＡＳＴレベルと有意に関連していたが、肝疾患と関連するとは以前に報告されていなかった。ＳＬＣ３９Ａ１２は、トランスアミナーゼまたは肝疾患と以前は関連付けられていなかった。メタ分析はまた、ＡＬＴ（ベータ（ＳＥ）－０．００９（０．００１）；Ｐ＝４．１６×１０－１２）およびＡＳＴ（ベータ（ＳＥ）－０．００５（０．００１）；Ｐ＝６．２４×１０－１０）レベルの低下と、１７－ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼファミリーの特徴付けられていないメンバーであるヒドロキシステロイド１７－ベータデヒドロゲナーゼ１３をコードする遺伝子であるＨＳＤ１７Ｂ１３におけるスプライスバリアントとの間の本発明者らのディスカバリーコホートにおける新しい関連を再現した。このバリアント、ｒｓ７２６１３５６７は、ドナースプライス部位に隣接するＡヌクレオチドの挿入に対応する（ＴＡ対立遺伝子）。これらの関連に関する再現メタ分析のＰ値は、それぞれ、ＡＬＴおよびＡＳＴについて、３．８５×１０－５および９．３８×１０－５であり、結合メタ分析のＰ値は、１．１７×１０－１５および６．８２×１０－１３であった（表３）。以前のＧＷＡＳは、ＡＬＴレベルと関連するものとして４ｑ２２での近隣遺伝子座（ｒｓ６８３４３１４）を同定した（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら（２０１１年）Nat Genet ４３巻：１１３１～１１３８頁）；本発明者らの知る限り、ｒｓ７２６１３５６７との関連を記載する以前の研究はない。
Figure 0007094963000017
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ＨＳＤ１７Ｂ１３は、同じ遺伝子ファミリーのメンバーであるＨＳＤ１７Ｂ１１の３０ｋｂ上流にあり、両遺伝子は、欧州人では単一の大きいハプロタイプブロック内にある。本発明者らは、ディスカバリーコホート（図５Ａおよび５Ｂ；最も有意なディスカバリーＰ値は、ＡＬＴについては１．３６×１０－１であり、ＡＳＴについては４．３２×１０－２である）またはディスカバリーコホートおよび３つの再現コホートの結合メタ分析（最も有意なＰ値は、それぞれ、ＡＬＴおよびＡＳＴについて、６．２５×１０－３および１．１７×１０－５である）において、ＨＳＤ１７Ｂ１１におけるコードまたはスプライスバリアントと、トランスアミナーゼレベルとのいかなる関連も観察しなかった。さらに、ｒｓ７２６１３５６７と、ＨＳＤ１７Ｂ１１におけるバリアントとの連鎖不均衡は、本発明者らのディスカバリー群を大まかに含む欧州系米国人、およびまた、Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙに提示されたヒスパニック系およびアフリカ系米国人を含む、全ての祖先群にわたって中程度であった（全ての祖先群におけるＨＳＤ１７Ｂ１１中の全ての確認されたバリアントに関してｒ２＜０．４；データは示さない）。まとめると、これらの知見は、ＨＳＤ１７Ｂ１３が、トランスアミナーゼレベルと十中八九、機能的に関連するゲノム領域中の遺伝子であることを示唆する。
次に、本発明者らは、ＡＬＴまたはＡＳＴレベルと関連するバリアントが慢性肝疾患とも関連するかどうかを確立しようとした。ディスカバリーコホートにおいて、本発明者らは、ＥＨＲ診断コードを使用して、アルコール性および非アルコール性（非ウイルス性）肝疾患、ならびに以下の疾患後遺症：アルコール性肝硬変、非アルコール性肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）の症例を広く定義した。一般対照群（「肝疾患なし」）を、いかなる型の肝疾患に関する診断コードも有しない個体と定義した（表１）。本発明者らは、試験した１３のバリアントおよび２つの広い慢性肝疾患カテゴリー（アルコール性および非アルコール性）を占めるＰ＜０．０５／２４（Ｐ＜２．０８×１０－３）のボンフェローニ有意性閾値を使用して、慢性肝疾患との関連についてディスカバリーおよび再現コホートに由来する１２個のトランスアミナーゼ関連バリアントを試験した（表４）。全体として、本発明者らは、５個の遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ１３、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＰＮＰＬＡ３、およびＳＡＭＭ５０）中の６個のバリアントと、慢性肝疾患表現型との有意な関連を見出した。ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＰＮＰＬＡ３、およびＳＡＭＭ５０の関連は、以前に報告された関連を確認する。ＧＰＴ、ＧＯＴ１、ＥＲＬＩＮ１、およびＳＬＣ３９Ａ１２におけるバリアントは、いかなる肝疾患表現型とも有意に関連しなかった。本明細書で報告される肝疾患とのＨＳＤ１７Ｂ１３の関連は新規であり、潜在的に保護的な遺伝子バリアントが初めて記載される。
Figure 0007094963000021
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７の変異（ＴＡ）対立遺伝子は、評価された慢性肝疾患表現型のいずれかを有する参加者と比較して、対照においてより高頻度で観察された（図２Ａおよび表５）。年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先に関する調整の後、本発明者らは、ＴＡ対立遺伝子あたり、３８％低いアルコール性肝疾患のオッズ（オッズ比［ＯＲ］０．６２；９５％信頼区間［ＣＩ］０．４８～０．８１、Ｐ＝１．８×１０－４）および１６％低い非アルコール性（非ウイルス性）肝疾患のオッズ（ＯＲ ０．８４、９５％ＣＩ ０．７８～０．９１、Ｐ＝１．３×１０－５）を観察した。肝硬変を有する症例に限定した場合、ＴＡ対立遺伝子は、４４％低いアルコール性肝硬変のオッズ（ＯＲ ０．５６、９５％ＣＩ ０．４１～０．７８、Ｐ＝３．４×１０－４）および２６％低い非アルコール性肝硬変のオッズ（ＯＲ ０．７４、９５％ＣＩ ０．６２～０．８８、Ｐ＝４．５×１０－４）と関連していた。ＴＡ対立遺伝子は、対立遺伝子あたり３３％低いＨＣＣのオッズ（ＯＲ ０．６７、９５％ＣＩ ０．４５～１．００、Ｐ＝４．７×１０－２）と名目上関連していた。非調整遺伝子型ＯＲは、コドミナント効果を示唆した；例えば、アルコール性肝硬変について、ＯＲは、ヘテロ接合体Ｔ／ＴＡ保因者については０．５９（９５％ＣＩ ０．４０～０．８６）であり、ホモ接合体ＴＡ／ＴＡ保因者については０．２６（９５％ＣＩ ０．０８～０．８２）であり、非アルコール性肝硬変について、ＯＲは、ヘテロ接合体保因者については０．７５（９５％ＣＩ ０．６１～０．９３）であり、ホモ接合体保因者については０．５５（９５％ＣＩ ０．３４～０．９１）であった。
かくして、ディスカバリーコホートにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７の変異（ＴＡ）対立遺伝子は、一貫した対立遺伝子用量依存的様式で、評価された全てのＥＨＲ由来慢性肝疾患表現型のより低いオッズと関連していた（図２Ａ）：アルコール性肝疾患の全カテゴリー、ヘテロ接合体オッズ比（ＯＲｈｅｔ）［９５％信頼区間］０．５８［０．４２～０．７９］、ホモ接合体ＯＲ（ＯＲｈｏｍ）０．４６［０．２３～０．９４］、対立遺伝子ＯＲ（ＯＲａｌｌｅｌｉｃ）０．６２［０．４８～０．８１］、Ｐ＝１．８２×１０－４；非アルコール性肝疾患の全カテゴリー、ＯＲｈｅｔ０．８４［０．７６～０．９２］、ＯＲｈｏｍ０．７３［０．５９～０．８９］、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ０．８４［０．７８～０．９１］、Ｐ＝１．３１×１０－５。ＴＡ対立遺伝子はまた、最も進行した形態のこれらの慢性肝疾患（ＥＨＲ由来診断コードによって定義される）、すなわち、アルコール性および非アルコール性肝硬変ならびにＨＣＣのより低いオッズとも関連していた。ＴＡ対立遺伝子は、それぞれ、ヘテロ接合体およびホモ接合体のアルコール性肝硬変の４２％および７３％低いオッズ（ＯＲｈｅｔ０．５９［０．４０～０．８６］、ＯＲｈｏｍ０．２６［０．０８～０．８２］、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ０．５６［０．４１～０．７８］、Ｐ＝３．３５×１０－４）、それぞれ、ヘテロ接合体およびホモ接合体の非アルコール性肝硬変の２６％および４９％低いオッズ（ＯＲｈｅｔ０．７５［０．６１～０．９３］、ＯＲｈｏｍ０．５５［０．３４～０．９１］、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ０．７４［０．６２～０．８８］、Ｐ＝４．４８×１０－４）と関連していた。ＴＡ対立遺伝子はまた、ＨＣＣのより低いオッズとも名目上関連していた。
次に、本発明者らは、アフリカ系米国人、欧州系米国人、ならびにヒスパニック系米国人の成人および小児を含む、多民族Ｄａｌｌａｓ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｕｄｙ（ＤＬＳ）およびＤａｌｌａｓ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｕｄｙ（ＤＰＬＳ）において、これらの知見を確認し、拡張しようとした（表１Ｂ）。ＤＬＳでは、ＴＡ対立遺伝子は、対立遺伝子用量依存的様式で任意の肝疾患のより低いオッズと関連していた（ＯＲｈｅｔ ０．７４［０．５７～０．９７］、ＯＲｈｏｍ ０．４１［０．２１～０．８３］、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．７０［０．５～０．８８］、Ｐ＝１．７７×１０－３、図８）。同様の対立遺伝子用量依存的効果は、進行した、肝硬変型のアルコール性（ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．７２［０．５３～０．９９］、Ｐ＝４．３７×１０－２）および非アルコール性（ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．６５［０．４０～１．０７］、Ｐ＝８．９６×１０－２）肝疾患との保護的関連を含む、ＥＨＲ由来肝疾患サブタイプにわたって観察された。自己報告された民族性によってグループ分けされた個体のサブセット分析において、肝疾患との関連は、特に、このサブ集団における高率の肝疾患のため、ヒスパニック系米国人において依然として有意であった（ｎ＝３２６の症例および７２２の対照、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．５１［０．３５～０．７４］、Ｐ＝３．９８×１０－４）；統計的有意性を達成しなかった、同様の数的傾向は、ＤＬＳのアフリカ系米国人（ｎ＝３３の症例および２，２９１の対照、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．７４［０．２５～２．４７］、Ｐ＝０．６７）および欧州系米国人（ｎ＝１５８の症例および１，２６６の対照、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．８７［０．６５～１．１５］、Ｐ＝０．３２）サブセットにおいても指摘された。ヒスパニック系米国人の小児肝疾患患者および肥満対照の別々の研究であるＤＰＬＳにおいては（表１Ｂ）、ＴＡ対立遺伝子は、肝疾患のより低いオッズとも関連していた（ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．５９［０．３６～０．９７］、Ｐ＝３．６×１０－２）。かくして、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ対立遺伝子は、３つの独立した集団における成人および小児における、肝硬変を含む複数の形態の慢性肝疾患のオッズの低下と関連していた。
ＮＡＦＬＤは、有意な炎症の証拠がない脂肪肝（組織病理学検査では「単純脂肪肝」と指定される）から、より臨床的に影響のある徴候（小葉炎症、肝細胞肥大化、および／または線維症の組織病理学的証拠がある、「非アルコール性脂肪性肝炎」（ＮＡＳＨ）と指定される）までの広範囲の疾患を記述するものである。ＨＳＤ１７Ｂ１３ＴＡ対立遺伝子と、組織学的に定義されたＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨとの関係を理解するために、本発明者らは、ＧＨＳ肥満外科手術コホートに由来する肝臓生検試料を有する２，３９１人の全エクソーム配列決定された個体においてｒｓ７２６１３５６７の関連の試験を実施した。これらの個体のうち、脂肪症、脂肪性肝炎、または線維症の証拠がない（「正常」）のは５５５人（２３％）であり、単純脂肪肝を有するのは８３０人（３５％）であり、ＮＡＳＨ（すなわち、小葉の炎症、肝細胞肥大化、または線維症の証拠）を有するのは１００６人（４２％）であった。ＨＳＤ１７Ｂ１３ＴＡ対立遺伝子は、正常な肝臓と比較して、単純脂肪肝（ＯＲ １．１１、９５％ＣＩ ０．９４～１．３２、Ｐ＝０．２１）またはＮＡＳＨ（ＯＲ ０．８６、９５％ＣＩ ０．７２～１．０２、Ｐ＝０．０９）と有意に関連しなかった（図２Ｂおよび表５）。遺伝子型によって正常な肝臓、単純脂肪肝、およびＮＡＳＨの有病率を比較した場合、それぞれのＴＡ対立遺伝子に関して、正常な肝臓の有病率は、遺伝子型では異ならないと考えられる（それぞれ、Ｔ／Ｔ、Ｔ／ＴＡ、およびＴＡ／ＴＡ保因者について、２３％、２４％、および２３％、割合における傾向に関するカイ二乗検定によるＰ＝０．５）が、ＮＡＳＨの有病率は低下し（それぞれ、Ｔ／Ｔ、Ｔ／ＴＡ、およびＴＡ／ＴＡ保因者について、４５％、４０％、および３１％、Ｐ＝１．６×１０－４）、単純脂肪肝の有病率は増加する（それぞれ、Ｔ／Ｔ、Ｔ／ＴＡ、およびＴＡ／ＴＡ保因者について、３３％、３５％、および４７％、Ｐ＝１．１×１０－３）ことが観察された（図９）。脂肪症を有する個体のうち、ＴＡ対立遺伝子は、対立遺伝子用量依存的様式で、単純脂肪肝と比較して、統計的に有意に低いＮＡＳＨのオッズと関連していた。単純脂肪肝の背景として、ＴＡ対立遺伝子は、２３％低いＮＡＳＨのオッズと関連していた（ＯＲ ０．７７、９５％ＣＩ ０．６６～０．９０、Ｐ＝６．５×１０－４）が、ＮＡＦＬＤの、ＮＡＳＨおよび線維症のより進行した段階への進行を媒介する際のＨＳＤ１７Ｂ１３の役割を示唆している。遺伝子型関連の結果は、コドミナント効果と一致していた；ＮＡＳＨ対単純脂肪肝の比較において、ＯＲは、ヘテロ接合体Ｔ／ＴＡ保因者については０．８４（９５％ＣＩ ０．６９～１．０２）であり、ホモ接合体ＴＡ／ＴＡ保因者については０．４８（９５％ＣＩ ０．３４～０．６８）であった。
Figure 0007094963000022
本発明者らは次に、ＨＳＤ１７Ｂ１３ＴＡ対立遺伝子が、この遺伝子の公知の転写産物および新規転写産物の発現にどのように影響するかを理解しようとした。本発明者らは、ＲＮＡ配列決定を使用して、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７スプライスバリアントの２２のホモ接合体参照（Ｔ／Ｔ）、３０のヘテロ接合体（Ｔ／ＴＡ）、および１７のホモ接合体代替物（ＴＡ／ＴＡ）保因者に由来する組織学的に正常な肝臓試料中でＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡ発現を評価した（図３）。２つの公知のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＢに加えて、２つの新規転写産物が同定された：エクソン６を欠く転写産物Ｃ、および早期タンパク質トランケーションをもたらす、エクソン６の３’末端でのＧヌクレオチドの挿入を特徴とする転写産物Ｄ。新規転写産物を、ＲＴ－ＰＣＲによって検証し、Ｄ転写産物をロングリードｃＤＮＡ配列決定によってさらに検証した。これらの転写産物の発現レベルは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７遺伝子型によって変化した；転写産物ＡおよびＢのレベルは低下したが、転写産物ＣおよびＤのレベルは、Ｔ／ＴＡヘテロ接合体およびＴＡ／ＴＡホモ接合体において対立遺伝子用量依存的様式で増加した（図３）。３００アミノ酸のタンパク質をコードする転写産物Ａは、Ｔ／Ｔホモ接合体中のＴ／Ｔにおいて優勢な転写産物であった（図３Ａ）が、早期にトランケートされるタンパク質をコードする転写産物Ｄは、ＴＡ／ＴＡホモ接合体において優勢な転写産物であった（図３Ｄ）。これらの発現パターンは、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの発現を決定する際のＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７の機能的役割を示唆する。非常に低い発現レベルを示す４つのさらなる転写産物（Ｅ～Ｈ）も同定された（図６Ａ～６Ｄ）。全ての同定されたＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームのタンパク質配列アラインメントを、図７Ａ～７Ｂに示す。
ＨＳＤ１７Ｂ１３は、ヒト肝細胞中の脂肪滴関連タンパク質として以前に記載された（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Suら（２０１４年）Proc Natl Acad Sci USA １１１巻：１１４３７～１１４４２頁）。本発明者らは、ＨＳＤ１７Ｂ１３の公知および新規のアイソフォームＡ～Ｄを発現するレンチウイルスを安定に形質導入された無期限ヒト肝臓細胞株（ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞）中でタンパク質アイソフォームの発現および局在化を評価した。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡは、未処理の細胞およびオレイン酸で処理された細胞中の脂肪滴に局在化した。アイソフォームＡは、ＢＯＤＩＰＹ標識された脂肪滴を取り囲む膜上で主に検出され、脂肪滴コートタンパク質であるペリリピン（ＰＬＩＮ）と共に局在化した。同様の細胞内局在化は、脂肪滴表面でＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤについても観察された；しかしながら、脂肪滴はオレイン酸処理後により大きいように見えた。対照的に、アイソフォームＢとＣは、小胞体マーカーであるカルネキシンと共に局在化した。
まとめると、ＤｉｓｃｏｖＥＨＲ研究集団に由来する４９，１８８人の個体に由来するＥＨＲおよび肝臓生検データと関連付けられたエクソーム配列データを使用して、ならびにＡＬＴおよびＡＳＴ測定値を有する９，８８３人のさらなる個体に由来するエクソーム配列データのフォローアップ研究において、本発明者らは、ＨＳＤ１７Ｂ１３におけるスプライスバリアント、トランスアミナーゼレベル、および慢性肝疾患表現型の間の新しい関連を発見した。本発明者らの研究では、ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントは、非アルコール性およびアルコール性肝疾患、ならびに肝硬変のリスクを低下させた。これは、本発明者らの知る限り、慢性肝疾患表現型との保護的関連を示すエクソンバリアントの初めての報告である。ＨＳＤ１７Ｂ１３ＴＡ対立遺伝子は、単純脂肪肝と関連していなかったが、脂肪症を有する個体における組織病理学的脂肪性肝炎のリスクを低下させ、これは、慢性肝疾患のより臨床的に進行した段階への進行におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の役割を示唆している。ＥＨＲ診断コードならびに肝疾患の組織病理学的定義を使用して特徴付けられた、いくつかの異なる肝疾患カテゴリーにわたる４つの独立コホート（ＧＨＳディスカバリー、ＧＨＳ肥満外科手術、ＤＬＳ、およびＤＰＬＳ）における保護的関連の一貫性は、関連の驚くべき対立遺伝子用量依存性と一緒になって、報告されたＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントが、慢性肝疾患のより臨床的に進行した段階への進行から保護するという見解を支持する。観察された対立遺伝子用量依存性はまた、ＨＳＤ１７Ｂ１３機能のより大規模な調節が、疾患のリスクおよび進行に対するより大規模な効果をもたらし得ることを示している。
他の１７ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼファミリーメンバーは、性ステロイドおよび脂肪酸代謝に関与することが公知である（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、MoellerおよびAdamski（２００９年）Mol Cell Endocrinol ３０１巻：７～１９頁）が、ＨＳＤ１７Ｂ１３の機能に関して公知であることはわずかである。ＨＳＤ１７Ｂ１３は、主に肝臓中で発現され（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Liuら（２００７年）Acta Biochim Pol ５４巻：２１３～２１８頁）、そこでそれは脂肪性肝疾患の発症におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の役割と一致して、脂肪滴に局在化する（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Suら（２０１４年）Proc Natl Acad Sci USA １１１巻：１１４３７～１１４４２頁）。本発明者らのデータは、ＨＳＤ１７Ｂ１３の過剰発現が、マウス肝臓における脂質生成を増加させ、培養肝細胞中の脂肪滴の数およびサイズを増加させたという最近の知見（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Suら（２０１４年）Proc Natl Acad Sci USA １１１巻：１１４３７～１１４４２頁）と一致している。２つの以前の研究もまた、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の肝臓発現が、脂肪肝を有する患者において増加していることを示した（それぞれ、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Suら（２０１４年）Proc Natl Acad Sci USA １１１巻：１１４３７～１１４４２頁およびKampfら（２０１４年）FASEB J ２８巻：２９０１～２９１４頁）。肝疾患の高いリスクと関連すると報告されているバリアントを含む２個の遺伝子－ＰＮＰＬＡ３およびＴＭ６ＳＦ２もまた、肝細胞の脂質代謝における生理学的役割を有する。本発明者らが本明細書で記載するＨＳＤ１７Ｂ１３におけるバリアントは、肝疾患のための初めての保護的バリアントであり、他の領域における新しい治療薬への道を案内してきた遺伝子バリアントと同様、慢性肝疾患を標的とする新しい治療戦略への手段を提供することができる。
全体として、本発明者らのデータは、新規治療薬としてのＨＳＤ１７Ｂ１３が、ヒトにおける慢性肝疾患のリスクを低減させることを標的とすることを支持する。重要なことに、本発明者らのデータは、ＨＳＤ１７Ｂ１３の標的化が、ＮＡＦＬＤから、有意な疾病率および死亡率と関連し、現在は有効な処置がない、後期段階のＮＡＳＨ、線維症、および肝硬変への進行を低減させることができたことを示している。
方法
研究の参加者。ヒト遺伝学研究を、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒと、Ｇｅｉｓｉｎｇｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＨＳ）とのＤｉｓｃｏｖＥＨＲ共同研究の一部として行った。研究は、ＧＨＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって認可された。２つのＤｉｓｃｏｖＥＨＲ研究集団（ディスカバリーコホートおよび肥満外科手術コホート）は、ＭＹＣＯＤＥ（登録商標）Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｆ ＧＨＳに由来する１８歳以上の年齢の最初の５０，７２６人の同意した参加者が起源であった（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deweyら（２０１６年）Science ３５４巻（６３１９頁）doi:10.1126/science.aaf6814）。ＧＨＳディスカバリーコホートは、肥満外科手術コホートに募集された全ての人を除く、２００７年～２０１６年に外来初期診療および専門クリニックから募集した４６，５４４人の欧州系の個体からなっていた。ＧＨＳ肥満外科手術コホートは、肥満外科手術を勧められた２，６４４人の欧州系の個体からなっていた。
再現研究は、Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙに由来する１，３５７人の欧州系の個体およびＰｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋに由来する８，５２７人の欧州系の個体を含んでいた。Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙは、３０～６５歳のＤａｌｌａｓ Ｃｏｕｎｔｙの居住者の確率ベース集団のコホート研究である（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Victorら（２００４年）Am J Cardiol ９３巻：１４７３～１４８０頁）。Ｐｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍから募集され、生体標本の保存、ＥＨＲデータへのアクセス、および再接触への承諾について同意した参加者を含む。
慢性肝疾患との関連の再現研究は、Ｄａｌｌａｓ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｕｄｙ（ＤＬＳ）に由来する５１７人の個体およびＤａｌｌａｓ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｕｄｙ（ＤＰＬＳ）に由来する４４７人の個体を含んでいた。ＤＬＳは、非ウイルス病因の肝疾患を有する患者の生体バンクである。募集は２０１５年１月に始まって、現在進行中である。参加者を、ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ａｎｄ Ｐａｒｋｌａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄａｌｌａｓの肝臓クリニックから募集した。生体バンクは、ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって認可された。参加者は、インフォームドコンセント文書を提供した。参加者は、民族／人種背景、病歴、ライフスタイル因子、ならびに肝疾患および他の疾患の家族歴に関する問診票を完了した。さらなる臨床情報を、訓練された技術者によってカルテから抽出した。本発明者らは、本研究の時点で利用可能なＤＮＡを有する全てのアフリカ系米国人、欧州系米国人、およびヒスパニック系米国人の患者を含有させた（ｎ＝５１７）。ＤＰＬＳは、ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ａｎｄ Ｐａｒｋｌａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄａｌｌａｓの小児肝臓クリニックから、およびＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄａｌｌａｓの肥満クリニックから募集した子供の生体バンクである。生体バンクは、ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって認可された。参加者の法的保護者は、インフォームドコンセント文書を提供した。臨床情報を、訓練された技術者によってカルテから抽出した。９５％を超える患者がヒスパニック系米国人であったため、本発明者らは、本研究においてヒスパニック系米国人の患者および対照のみを含有させた（ｎ＝２０３人の患者および２４４人の対照）。
試料の調製および配列決定。試料の調製および全エクソーム配列決定を、以前に記載されたように（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deweyら（２０１６年）Science ３５４巻（６３１９頁）doi:10.1126/science.aaf6814）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒで実施した。簡単に述べると、エクソームの捕捉を、製造業者の推奨プロトコール（Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ）に従ってＮｉｍｂｌｅＧｅｎプローブを使用して実施した。捕捉されたＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって定量した。多重化された試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｖ４ ＨｉＳｅｑ ２５００上での７５ｂｐのペアエンド配列決定を使用して、試料の９６％において８５％を超える標的塩基の２０倍を超えるハプロイドリード深さ（標的塩基の約８０倍の平均ハプロイドリード深さ）を提供するのに十分なカバレッジ深さまで配列決定した。それぞれのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ ２５００実行に由来する生の配列データを、配列リードアラインメントおよびバリアントの同定のために、ＤＮＡｎｅｘｕｓプラットフォーム（Reidら（２０１４年）BMC Bioinformatics １５巻、３０頁 doi:10.1186/1471-2105-15-30）にアップロードした。簡単に述べると、生の配列データを、ＢＣＬファイルから、試料特異的ＦＡＳＴＱファイルに変換し、ＢＷＡ－ｍｅｍを含むヒト参照ビルドＧＲＣｈ３７．ｐ１３とアラインメントした（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、LiおよびDurbin（２００９年）Bioinformatics ２５巻：１７５４～１７６０頁）。単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）および挿入／欠失（インデル）配列バリアントを、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、McKennaら（２０１０年）Genome Res ２０巻：１２９７～１３０３頁）を使用して同定した。
Ｄａｌｌａｓ Ｌｉｖｅｒ ＳｔｕｄｙおよびＰｅｄｉａｔｒｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｕｄｙにおけるｒｓ７２６１３５６７の標的ジェノタイピング。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７を、Ｄａｌｌａｓ Ｌｉｖｅｒ ＳｔｕｄｙおよびＤａｌｌａｓ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｌｉｖｅｒ ＳｔｕｄｙにおいてＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイによって、ならびにＤａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙにおいてエクソーム配列決定によってジェノタイピングした。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）コールを、各遺伝子型を有する５人の個体のＳａｎｇｅｒ配列決定によって検証した。
ディスカバリーコホートにおける臨床測定値および慢性肝疾患の定義。ＡＬＴおよびＡＳＴに関する臨床検査値を、ＧＨＳディスカバリーコホートおよび肥満外科手術コホートに由来する参加者のＥＨＲから抽出した。ＡＬＴおよびＡＳＴの中央値を、２つまたはそれよりも多い測定値を有する全ての参加者について算出し、ｌｏｇ１０変換して、関連分析の前に分布を正規化した。
国際疾病分類、第９版（ＩＣＤ－９）の疾患コードを、ＥＨＲから抽出し、非ウイルス性、非アルコール性（ＩＣＤ－９ ５７１．４０、５７１．４１、５７１．４９、５７１．５、５７１．８、５７１．９）またはアルコール性（ＩＣＤ－９ ５７１．０、５７１．１、５７１．２、５７１．３）肝疾患症例定義のための臨床疾患カテゴリーに折り畳んだ。単一の診断コードに基づくさらなる症例定義は、アルコール性肝硬変（ＩＣＤ－９ ５７１．２）、非アルコール性肝硬変（ＩＣＤ－９ ５７１．５）、およびＨＣＣ（ＩＣＤ－９ １５５．０）を含んでいた。これらの症例定義のために、肝疾患を含まない共通対照群を、症例基準がないか、または任意の型の肝疾患を示す単一エンカウンターもしくは問題一覧診断コードがない参加者と定義した。
肥満外科手術コホートにおける肝臓組織病理学的表現型の定義。ＧＨＳ肥満外科手術コホートは、欧州子孫の２，６４４人の個体と共に、これらの個体の２，３９１人から入手可能な術中肝臓生検標本からなっていた。肝臓生検標本を、日常的な組織学的分析のためにホルマリン固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、以前に記載のように、線維症の評価のためにマッソンのトリクロム染色を行った（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gerhardら（２０１１年）Patient Saf Surg ５巻、１頁、doi:10.1186/1754-9493-5-1）。以前に確立された基準を使用する肝臓病理学者によって、組織学的診断を決定した（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bruntら（１９９９年）Am J Gastroenterol ９４巻：２４６７～２４７４頁）。組織学的診断を使用して、以下の表現型：１）正常：脂肪症、ＮＡＳＨまたは線維症の証拠なし；２）単純脂肪症：ＮＡＳＨまたは線維症の証拠がない脂肪症（等級に関係なく）；３）ＮＡＳＨ／線維症：小葉炎症もしくは肝細胞肥大の任意の存在（等級に関係なく）、または線維症の任意の存在（ステージに関係なく）；４）線維症：線維症の任意の存在（ステージに関係なく）を定義した。
肝臓酵素のエクソームワイド関連分析。ＧＨＳディスカバリーコホートにおいて、本発明者らは、トランスアミナーゼレベルとの関連について、１％未満の欠測データ率、１．０×１０－６より大きいハーディー－ワインベルク平衡ｐ値、および０．１％を超えるマイナー対立遺伝子頻度を示す５０２，２１９の二対立遺伝子バリアントを試験した。ｌｏｇ１０変換されたＡＬＴおよびＡＳＴ中央値を、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先の最初の４つの主成分について調整した。研究参加者間の関連性を説明するために、本発明者らはまた、無作為効果共変量として遺伝的関連性マトリックスを適合させる。主成分と遺伝的関連性マトリックスとの両方を、近似連鎖平衡中の、０．１％を超えるマイナー対立遺伝子頻度を有する３９，８５８の非ＭＨＣマーカーから構築した。本発明者らは、ＧＣＴＡパッケージに実装された線形混合モデル（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Yangら（２０１１年）Am J Hum Genet ８８巻：７６～８２頁）を使用して、残存形質と単一ヌクレオチドバリアントとの関連について試験した。試験は、エクソームワイド分位点－分位点プロットおよびゲノム対照ラムダ値によって示されたように、良好に較正された（図１）。
肝臓酵素関連の再現メタ分析。本発明者らは、３つの別々の欧州祖先コホート：ＧＨＳ肥満外科手術コホート、Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ、およびＰｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋ（上記）におけるＧＨＳディスカバリーコホートにおいて関連を再現しようと試みた。ＧＨＳ肥満外科手術コホートにおける、およびＰｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋに由来するＡＬＴおよびＡＳＴ測定値を、ｌｏｇ１０変換し、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先の最初に４つの主成分について調整した。Ｐｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋに由来するＡＬＴおよびＡＳＴ測定値を、ｌｏｇ１０変換し、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先の最初に４つの主成分について調整した。遺伝的関連性マトリックスを、無作為効果共変量として含有させ、分析を、ＧＣＴＡにおける線形混合モデルを使用して実施した。Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ ｓｔｕｄｙにおいて、ｌｏｇ１０変換されたＡＬＴおよびＡＳＴ測定値を、年齢、年齢２、性別、および祖先の最初の１０の主成分について調整し、分析を、ＰＬＩＮＫに実装された線形回帰を使用して実施した。３つの再現コホートに関する要約統計量を、ＭＥＴＡＬ（再現メタ分析）（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Willerら（２０１０年）Bioinformatics ２６巻：２１９０～２１９１頁）を使用してメタ分析した。ディスカバリーコホートおよび３つの再現コホートに関する要約統計量を、同様にメタ分析した（結合メタ分析）。
慢性肝疾患表現型に関する関連分析。本発明者らは、上記のように、ＧＨＳディスカバリーコホートから定義されたバイナリー肝疾患表現型との関連について、肝臓酵素ＥｘＷＡＳに由来する９つの有意かつ再現された単一ヌクレオチドバリアントを分析した。本発明者らは、試験した１３個のバリアントおよび２つの広い慢性肝疾患カテゴリー（アルコール性および非アルコール性）を説明するために、Ｐ＜０．０５／２６（Ｐ＜１．９２×１０－３）のボンフェローニの有意性閾値を使用した。ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントを、上記のように、ＧＨＳ肥満外科手術コホートに由来する組織病理学的に定義された肝臓表現型との関連についてさらに試験した。オッズ比を、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先の最初の４つの主成分について調整した後、ロジスティック回帰のＦｉｒｔｈの罰則付き尤度法を使用して見積もった。調整されていない遺伝子型オッズ比も、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７について見積もった。
ＤＬＳにおける肝疾患のオッズ比を、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および自己報告された民族性について調整された、ロジスティック回帰によって見積もった。利用可能なｒｓ７２６１３５６７遺伝子型を有するＤａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙに由来する参加者を、正常対照（ｎ＝４，２７９）として使用した。ＤＰＬＳにおけるオッズ比を、ロジスティック回帰によって見積もった。
ソフトウェア。遺伝子関連分析を、ＧＣＴＡソフトウェア、バージョン１．２５．０（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Yangら（２０１１年）Am J Hum Genet ８８巻：７６～８２頁）、およびＰＬＩＮＫ、バージョン１．９．０を使用して実施した。分位点－分位点およびマンハッタンプロットを、Ｒソフトウェア、バージョン３．２．１（Ｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を使用して実施した。領域関連プロットを、ＬｏｃｕｓＺｏｏｍを使用して生成した（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Pruimら（２０１０年）Bioinformatics ２６巻：２３３６～２３３７頁）。
ＲＮＡ配列決定研究。Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ Ｎａｎｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒチップ上で総ＲＮＡを泳動することによって、ＲＮＡの品質および濃度を評価した；全試料は、８より大きいＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）を有していた。ポリアデニル化されたＲＮＡ転写産物を、オリゴ（ｄＴ）２５ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる２ラウンドの富化を使用して単離した。ＲＮＡｃｌｅａｎＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて試料を精製および濃縮し、約１４０塩基対まで熱断片化した。ランダムヘキサマーを使用するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて第１鎖合成を完了した；第２鎖合成中にｄＴＴＰをｄＵＴＰと置き換えた。ウラシルＤＮＡ－グリコシラーゼステップを追加したエクソームに関して上記された本発明者らの標準的なＤＮＡライブラリー調製法に従って、試料をプロセッシングして、鎖特異的配列決定ライブラリーを生成した。試料をプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｖ４ ＨｉＳｅｑ ２５００上での７５ｂｐのペアエンド配列決定を使用して配列決定した。
新規ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の同定。２つのミスマッチを許容するＡＲＲＡＹＳＴＵＤＩＯ（登録商標）ソフトウェア（ＯＭＩＣＳＯＦＴ（登録商標）、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して、リードをＨｕｍａｎ．Ｂ３８にマッピングした。２つの手法を使用して、新規ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物を同定した。新規エクソン結合部を、Ｇｅｎｃｏｄｅ ｖ２４に基づいて発見した。Ｄｅ ｎｏｖｏ転写産物アセンブリを、デフォルト設定でＴｒｉｎｉｔｙ（ｖ２．２．０）を使用して実行した。カスタム遺伝子モデルを構築して、ＨＳＤ１７Ｂ１３の新規転写産物を組み込み、転写産物の量を、カスタム遺伝子モデルとのリードアライメントによって見積もった。全ての同定されたＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームのタンパク質配列アラインメントを、図７Ａおよび７Ｂに示す。
新規転写産物のＲＴ－ＰＣＲ検証。ヒト肝臓試料に由来する総ＲＮＡ上でのＲＴ－ＰＣＲを、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）と共に使用して実施した。それぞれ５０ｕＬのＲＴ－ＰＣＲ反応物は、１×反応ミックス、５００ｎＭのそれぞれのフォワードおよびリバースプライマー（ＰＳＴ５１６：ＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣ（配列番号２５１）およびＰＳＴ５１７：ＡＴＣＡＴＧＣＡＴＡＣＡＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号２５２））、１μＬのＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ、および７５ｎｇのＲＮＡを含有していた。サイクリング条件は、４５℃で３０ｍｉｎの１サイクル；９４℃で２ｍｉｎの１サイクル；９４℃で２０ｓ、５３℃で３０ｓ、および７２℃で９０ｓの４０サイクル；７２℃で５ｍｉｎの１サイクル；次いで、１０℃で保持であった。生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、プライマーＤＥ００２（ＡＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＣＣＴＴＧＧ（配列番号２５３））を使用する直接Ｓａｎｇｅｒ配列決定のために提出した。ＢおよびＣ転写産物を同定するために、ＲＴ－ＰＣＲ生成物を、ＳＹＢＲ ＧＯＬＤＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色された２％アガロースゲル上で泳動し、予想分子量のバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した後、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いるクローニングにかけた。ＴＯＰＯクローンの配列決定を、Ｍ１３ＦおよびＭ１３Ｒ配列決定プライマーを使用して実施した。配列分析を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＤＮＡ分析ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。
新規転写産物のＰａｃＢｉｏ検証。完全長ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物を、最初のエクソン（ＧＣＡＡＡＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣ（配列番号２５４））および最後のエクソン（ＴＣＴＴＧＡＴＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＴＴ（配列番号２５５））中の遺伝子特異的プライマーを使用する、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙを含むＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５０ｎｇの総ＲＮＡから直接増幅させて、約２．２ｋｂのアンプリコン（最大予測サイズの転写産物）を生成した。アンプリコンを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で検証した。ＰａｃＢｉｏ互換性バーコードアダプターを、アンプリコンにライゲートし、ＰａｃＢｉｏ ＰＢビーズ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて清浄化した。ライブラリーを等量でプールし、ＰａｃＢｉｏ ＲＳＩＩプラットフォーム上で１８０ｍｉｎ、１個のＳＭＲＴセル上で配列決定した。データを、ＰａｃＢｉｏソフトウェアｓｍｒｔａｎａｌｙｓｉｓ ｖ２．３ ｔｏｏｌ ｌａｂｅｌｚｍｗを使用して脱多重化した後、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴｏｏｌｓＡｍｐｌｉｃｏｎＡｎａｌｙｓｉｓを用いて分析した。得られるアンプリコンを、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＲｅｆＳｅｑ遺伝子と比較して、アイソフォームおよび遺伝子型状態を決定した。
ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの細胞内局在化。ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＥａｇｌｅの最少必須培地中で培養した。ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを、Ｍｙｃ－ＤＤＫ骨格レンチウイルス構築物中にサブクローニングし、レンチウイルスを生成した。ＨｅｐＧ２細胞に、様々なＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物を担持するレンチウイルスを感染させた。それぞれのＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物を発現する安定な細胞株を、完全培養培地中で２週間、１～３ｍｇ／ｍｌのゲネチシンＧ－４１８硫酸塩を用いて選択した。選択されたＨｅｐＧ２細胞を、２００μＭのオレイン酸で一晩、処理したか、または処理せず、次いで、固定した。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームを、マウス抗Ｍｙｃ抗体で標識した。脂肪滴を、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ色素（Ｓｉｇｍａ）で標識した。脂質コートタンパク質および小胞体を、それぞれ、ウサギ抗ＰＬＩＮ抗体（Ｓｉｇｍａ）およびウサギ抗カルネキシン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で標識した。免疫蛍光のための二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ウサギＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）であった。
（実施例２）
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡおよびＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質発現に対するｒｓ７２６１３５６７：ＴＡの効果
遺伝子の公知および新規の転写産物の発現に対するＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ対立遺伝子の効果を検査した。ＲＮＡ配列決定を使用して、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７スプライスバリアントの２２のＴ／Ｔホモ接合体、３０のＴ／ＴＡヘテロ接合体、および１７のＴＡ／ＴＡホモ接合体保因者に由来する組織学的に正常な肝臓試料中でのＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡ発現を評価した。２つの公知のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＢに加えて、２つの新規転写産物が同定された：エクソン６を欠く転写産物Ｃ、およびタンパク質の早期トランケーションをもたらすと予測される、エクソン６の３’末端にグアニンヌクレオチドの挿入を含有する転写産物Ｄ。これらの転写産物を、ＲＴ－ＰＣＲおよびＳａｎｇｅｒ配列決定によって検証した（データは示さない）。また、転写産物Ｄを、ロングリードｃＤＮＡ配列決定を使用して検証した。これらの転写産物の発現レベルは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７遺伝子型によって変化した；それぞれのＴＡ対立遺伝子について、転写産物Ａのレベルは減少したが、転写産物Ｄのレベルは対立遺伝子用量依存的様式で増加した（図３Ａ、３Ｄおよび１０Ｂを参照されたい）。完全長３００アミノ酸タンパク質をコードする転写産物Ａは、Ｔ／Ｔホモ接合体における優勢な転写産物であったが、早期にトランケートされたタンパク質をコードする転写産物Ｄは、ＴＡ／ＴＡホモ接合体における優勢な転写産物であった。ヒト肝臓生検組織において、トランケートされたアイソフォームＤタンパク質は、ヘテロ接合体およびＴＡ／ＴＡホモ接合体に最小限に存在し、アイソフォームＡタンパク質の存在量は、対立遺伝子用量依存的様式で減少した（図１０Ｂおよび１０Ｃを参照されたい）。これらのデータは、ヒト肝臓における発現が実質的に減少したトランケートされた形態のタンパク質の合成をもたらす、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７選択的ｍＲＮＡスプライシングと一致している。
図１０Ａ～１０Ｅを参照すると、新規ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の発現、細胞内局在化、および酵素活性が示される。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７スプライスバリアントのホモ接合体参照（Ｔ／Ｔ）、ヘテロ接合体（Ｔ／ＴＡ）、およびホモ接合体代替物（ＴＡ／ＴＡ）保因者におけるＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤの発現を、図３Ａおよび３Ｄに示す。遺伝子モデルにおけるコード領域は、縞模様の囲みで示され、非翻訳領域は、黒色の囲みで示される。転写産物Ｄ中の星印は、タンパク質の早期トランケーションをもたらす、エクソン６の３’末端でのｒｓ７２６１３５６７に由来するＧの挿入を示す。ｍＲＮＡ発現は、ＦＰＫＭ単位（マッピングされたリード１００万あたりの転写産物キロベースあたりの断片数）で表示される。ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤを過剰発現するＨｅｐＧ２細胞に由来するウェスタンブロットは、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄが、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａと比較して低い分子量を有するトランケートされたタンパク質に翻訳されたことを示す（図１０Ａを参照されたい）。同様の結果が、新鮮な凍結されたヒト肝臓およびＨＥＫ２９３細胞試料に由来するＨＳＤ１７Ｂ１３のウェスタンブロットについても観察された（図１０Ｂを参照されたい）。ヒト肝臓試料は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７スプライスバリアントのホモ接合体参照（Ｔ／Ｔ）、ヘテロ接合体（Ｔ／ＴＡ）、およびホモ接合体代替物（ＴＡ／ＴＡ）保因者に由来するものであった。細胞試料は、非タグ付きＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に由来するものであった。ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＩｓｏＡよりも低い分子量を有するトランケートされたタンパク質ＩｓｏＤに翻訳された。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＩｓｏＤタンパク質レベルは、ヒト肝臓（左）と細胞（右）試料の両方に由来するＩｓｏＡタンパク質レベルよりも低かった（図１０Ｃを参照されたい）。アクチンに対して正規化されたタンパク質レベルを、図１０Ｃ中の棒カラムに示す；＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡとＤは両方とも、脂肪滴を示すＢＯＤＩＰＹおよびＨＳＤ１７Ｂ１３局在化を示す抗Ｍｙｃで標識されたＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡまたはＤを安定に過剰発現するＨｅｐＧ２中の脂肪滴膜上に局在化された（データは示さない）。１７－ベータエストラジオール（エストラジオール）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、および１３－ヒドロキシオクタデカジエン酸（１３（Ｓ）－ＨＯＤＥ）に対するＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡおよびＤの酵素活性も評価した（図１０Ｄを参照されたい）。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤは、アイソフォームＡに関する対応する値の１０％未満の酵素活性を示した。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤは、ＨＥＫ２９３細胞中で過剰発現された場合、培養培地中で測定された場合にエストラジオール（基質）のエストロン（生成物）への変換をあまり示さなかったが、過剰発現されたＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡは、ロバストな変換を示した（図１０Ｅを参照されたい）。
ＨＳＤ１７Ｂ１３は、主に肝臓中で発現され（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Liuら、Acta Biochim. Pol.、２００７年、５４巻、２１３～８頁）、そこでそれは、脂肪性肝疾患の発症における役割と一致して、脂肪滴に局在化する（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Suら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、２０１４年、１１１巻、１１４３７～４２頁）。ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現およびその局在化を、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤを発現するレンチウイルスを安定に形質導入した不死化ヒト肝臓細胞株において評価した。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡは、ＢＯＤＩＰＹで標識された脂肪滴を取り囲む膜上で主に検出された（データは示さない）。同様の細胞内局在化が、脂肪滴表面でＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤについても観察された（図１０Ｄを参照されたい）。
ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡに起因するＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の早期トランケーションの機能的結果を理解するために、アイソフォームＡおよびＤの酵素活性を、組換えタンパク質を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。３００を超える推定基質を検査し、そのうち、エストラジオール、ロイコトリエンＢ４、および１３－ヒドロキシオクタデカジエン酸は、ＨＳＤ１７Ｂ１３によって酵素的に変換され、ヒドロキシルのケトン基への酸化をもたらした。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤは、３つの基質に向かう大きく低下した活性を示した（図１０Ｄを参照されたい）。
ＧＦＰ対照と比較して、ＨＳＤ１７Ｂ１３－転写産物Ａを過剰発現する細胞は、細胞培養培地中のより低濃度のエストラジオールならびにより高濃度のエストロンを有していたが、これは、エストラジオールに対する酵素活性を示唆している（図１０Ｅを参照されたい）。ＨＳＤ１７Ｂ１３－転写産物Ｄを過剰発現する細胞は、エストロン／エストラジオールのＧＦＰ対照細胞に対する同様の比を有していたが、これは、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄが有意な機能喪失を有することを示唆している。質量分析により、消費されたエストラジオールと比較してエストロンの低い蓄積の原因となる、エストロンのヒドロキシエストロンおよび他の生成物への急速な変換が示された。
大規模エクソーム配列決定により、ＨＳＤ１７Ｂ１３中のスプライスバリアントと、血清トランスアミナーゼレベルの低下との新しい関連、ならびに進行した肝硬変型の肝疾患およびＨＣＣを含む、非アルコール型とアルコール型の肝疾患のリスクの低下との新しい関連が同定された。本発明者らの知る限り、これは、肝疾患との保護的関連を有するタンパク質を変化させるバリアントの初めての報告である。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ対立遺伝子は、単純脂肪肝と関連していなかったが、ＮＡＳＨへの進行のリスクを低下させた。いくつかの異なる肝疾患カテゴリーおよび民族性にわたる４つの独立したコホート（ＤｉｓｃｏｖＥＨＲ、ＤｉｓｃｏｖＥＨＲにおける独立した肥満外科手術コホート、ＤＬＳ、およびＤＰＬＳ）における用量依存的保護的関連の一貫性は、報告されたＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントが、慢性肝疾患のより臨床的に進行した段階への進行から保護するという見解を支持する。観察された対立遺伝子用量依存性はまた、ＨＳＤ１７Ｂ１３機能のより大規模な調節が、疾患のリスクおよび進行に対するより大規模な効果をもたらし得ることを示している。
本明細書に記載の関連性の知見は、ＢＭＩが上昇した欧州系およびヒスパニック系米国人における観察に主に基づくものであった。ＨＳＤ１７Ｂ１３は、ＨＳＤ１７Ｂ１３との高い配列類似性を有するが、より広い組織分布を有する同じ遺伝子ファミリーのメンバーであるＨＳＤ１７Ｂ１１とごく近い。全体として、本明細書で提示されるデータは、ＨＳＤ１７Ｂ１３がヒトにおける脂肪性肝疾患の防止および処置のための潜在的な治療標的であるという立場を支持する。本明細書で提示されるデータは、ＨＳＤ１７Ｂ１３の標的化が、脂肪症から、有意な疾病率および死亡率と関連し、現在、有効な処置が存在しない後期段階のＮＡＳＨ、線維症、および肝硬変への肝疾患の進行を低減させることができることを示している。
（実施例３）
１７ベータ－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１３バリアントは慢性肝疾患に対して保護する
慢性肝疾患に寄与する遺伝的因子を同定するために、本発明者らは、ＤｉｓｃｏｖＥＨＲヒト遺伝学研究における４６，５４４人の参加者に由来するエクソーム配列データおよび電子カルテを利用した。本発明者らは、慢性肝疾患と関連し得る候補を指名するために、肝損傷の確立されたバイオマーカー（血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ））と関連する遺伝子バリアントを同定した。続いて、３つのさらなるコホート（１２，５２７人の個体）において再現する候補バリアントを、ＤｉｓｃｏｖＥＨＲおよび２つの独立したコホート（合計３７，８９２人の個体）における慢性肝疾患の臨床診断との関連について評価した。本発明者らはまた、独立した肥満外科手術コホート（ｎ＝２，３９１のヒト肝臓試料）における肝疾患の組織病理学的重症度との関連を検査した。
肝臓脂肪滴タンパク質１７－ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１３をコードする、ＨＳＤ１７Ｂ１３におけるスプライスバリアント（ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ）は、ＡＬＴ（Ｐ＝４．２×１０－１２）およびＡＳＴ（Ｐ＝６．２×１０－１０）レベルの低下と再現的に関連していた。ＤｉｓｃｏｖＥＨＲにおいて、このバリアントは、対立遺伝子用量依存的様式で、アルコール性および非アルコール性肝疾患のリスクの低下（それぞれのｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ対立遺伝子について、それぞれ、３８％、９５％信頼区間（ＣＩ）１９％～５２％；および１６％、９５％ＣＩ９％～２２％）ならびに肝硬変のリスクの低下（それぞれのｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ対立遺伝子について、それぞれ、アルコール性および非アルコール性肝硬変について４４％、９５％ＣＩ ２２～５９％；および２６％、９５％ＣＩ １２％～３８％）と関連していた；関連は、２つの独立したコホートにおいて確認された。ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の組織学的特徴の重症度の低下（脂肪性肝疾患を有する個体のうち、それぞれのｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ対立遺伝子について、２３％の低下、９５％ＣＩ １０％～３４％）と関連していた。ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡは、ステロイド基質に対する酵素活性が低下した不安定でトランケートされたタンパク質をもたらす。
ＨＳＤ１７Ｂ１３における機能喪失バリアントは、アルコール性および非アルコール性肝疾患のリスクの低下、ならびに脂肪症からＮＡＳＨへの進行と関連していた。
研究設計および参加者
ヒト遺伝学研究を、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＣｅｎｔｅｒとＧｅｉｓｉｎｇｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＨＳ）とのＤｉｓｃｏｖＥＨＲ共同研究の一部として行った。２つのＤｉｓｃｏｖＥＨＲ研究集団（ディスカバリーコホートと肥満外科手術コホート）は、ＭｙＣｏｄｅ（登録商標）Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｆ ＧＨＳに由来する１８歳以上の年齢の最初の５０，７２６人の同意した参加者が起源であった。ＧＨＳディスカバリーコホートは、肥満外科手術コホートに募集された全ての人を除く、２００７年～２０１６年に外来初期診療および専門クリニックから募集した４６，５４４人の欧州系の個体からなっていた。ＧＨＳ肥満外科手術コホートは、肥満外科手術を勧められた２，６４４人の欧州系の個体からなっていた。
肝臓トランスアミナーゼとの関連の再現研究は、Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙに由来する１，３５７人の欧州系の個体およびＰｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋに由来する８，５２７人の欧州系の個体を含んでいた。Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙは、３０～６５歳のＤａｌｌａｓ Ｃｏｕｎｔｙの居住者の確率ベース集団のコホート研究である（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Victorら、Am. J. Cardiol.、２００４年、９３巻：１４７３～１４８０頁）。Ｐｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍから募集され、生体標本の保存、ＥＨＲデータへのアクセス、および再接触への承諾について同意した参加者を含む。
慢性肝疾患との関連の再現研究は、Ｄａｌｌａｓ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｕｄｙ（ＤＬＳ）に由来する５１７人の個体およびＤａｌｌａｓ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｕｄｙ（ＤＰＬＳ）に由来する４４７人の個体を含んでいた。ＤＬＳは、非ウイルス病因の肝疾患を有する患者の生体バンクである。募集は２０１５年１月に始まって、現在進行中である。参加者を、ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ａｎｄ Ｐａｒｋｌａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄａｌｌａｓの肝臓クリニックから募集した。参加者は、民族／人種背景、病歴、ライフスタイル因子、ならびに肝疾患および他の疾患の家族歴に関する問診票を完了した。さらなる臨床情報を、訓練された技術者によってカルテから抽出した。本発明者らは、Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙに由来する対照と共に、本研究の時点で利用可能なＤＮＡを有する全てのアフリカ系米国人、欧州系米国人、およびヒスパニック系米国人の患者を含有させた（ｎ＝５１７）。ＤＰＬＳは、ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ａｎｄ Ｐａｒｋｌａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄａｌｌａｓの小児肝臓クリニックから、およびＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄａｌｌａｓの肥満クリニックから募集したヒスパニック系の子供の生体バンクである。臨床情報を、訓練された技術者によってカルテから抽出した。９５％を超える患者がヒスパニック系米国人であったため、本発明者らは、本研究においてヒスパニック系米国人の患者および対照のみを含有させた（ｎ＝２０５人の患者および２３４人の対照）。
ディスカバリーコホートにおける臨床測定値および慢性肝疾患の定義
ＡＬＴおよびＡＳＴの臨床検査測定値を、ＧＨＳディスカバリーコホートおよび肥満外科手術コホートに由来する参加者のＥＨＲから抽出した。ＡＬＴおよびＡＳＴの中央値を、２つまたはそれより多い測定値を有する全ての参加者について算出し、ｌｏｇ１０変換して、関連分析の前に分布を正規化した。
国際疾病分類、第９版（ＩＣＤ－９）の疾患診断コードを、ＥＨＲから抽出し、非ウイルス性、非アルコール性（ＩＣＤ－９ ５７１．４０、５７１．４１、５７１．４９、５７１．５、５７１．８、５７１．９）またはアルコール性（ＩＣＤ－９ ５７１．０、５７１．１、５７１．２、５７１．３）肝疾患症例定義のための臨床疾患カテゴリーに折り畳んだ。単一の診断コードに基づくさらなる症例定義は、アルコール性肝硬変（ＩＣＤ－９ ５７１．２）、非アルコール性肝硬変（ＩＣＤ－９ ５７１．５）、およびＨＣＣ（ＩＣＤ－９ １５５．０）を含んでいた。これらの症例定義のために、肝疾患を含まない共通対照群（「肝疾患なし」）を、症例基準がないか、または任意の型の肝疾患を示す単一エンカウンターもしくは問題一覧診断コードがない参加者と定義した。
肥満外科手術コホートにおける肝臓組織病理学的表現型の定義
ＧＨＳ肥満外科手術コホートは、欧州子孫の２，６４４人の個体からなっていた。肝臓のくさび状生検を、これらの個体の２，３９１人から肥満外科手術中に取得した。生検を、肝圧排または胃に対する外科手術の前に肝鎌状間膜の左に１０ｃｍ、一貫して得た。生検を切片に分割し、一次切片を肝臓組織学的分析のために臨床病理学者に送達し（日常的な組織学的分析のために１０％中性緩衝化ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、線維症の評価のためにマッソンのトリクロムで染色した）、残りの切片を研究生体バンク内に保存した（ＲＮＡｌａｔｅｒおよび／または液体窒素中で凍結した）。肝臓の組織学的分析を、経験のある病理学者によって行い、続いて、以下のように、ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋスコアリングシステム（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kleinerら、Hepatology、２００５年、４１巻、１３１３～２１頁）を使用して第２の経験のある病理学者によって再検討した：脂肪症等級０（５％未満の実質性病変）、１（５～３３％未満）、２（３４～６６％未満）、および３（６７％を超える）；小葉炎症等級０（病巣なし）、等級１（軽度、２００×視野あたり２個未満の病巣）、等級２（中等度、２００×視野あたり２～４個の病巣）、等級３（重度、２００×視野あたり４個を超える病巣）；線維症ステージ０（なし）、ステージ１（類洞周囲または門脈周囲の線維症）、ステージ２（類洞周囲および門脈周囲の線維症）、ステージ３（架橋線維症）、およびステージ４（肝硬変）。これらの組織学的診断を使用して、以下の表現型：１）正常：脂肪症、ＮＡＳＨまたは線維症の証拠なし；２）単純脂肪肝：ＮＡＳＨまたは線維症の証拠がない脂肪症（等級に関係なく）；３）ＮＡＳＨ：小葉炎症もしくは肝細胞肥大の任意の存在（等級に関係なく）、または線維症の任意の存在（ステージに関係なく）；４）線維症：線維症の任意の存在（ステージに関係なく）を定義した。
試料の調製、配列決定、およびジェノタイピング
ＤｉｓｃｏｖＥＨＲ研究、Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ、およびＰｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋにおける参加者のためのＤＮＡ試料調製および全エクソーム配列決定を、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓで実施した（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deweyら、Science In Press、２０１６年）。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７を、Ｄａｌｌａｓ Ｌｉｖｅｒ ＳｔｕｄｙおよびＤａｌｌａｓ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｌｉｖｅｒ ＳｔｕｄｙにおいてＴａｑｍａｎアッセイによってジェノタイピングした（および各遺伝子型の５人の個体においてＳａｎｇｅｒ配列決定によって検証した）。
特に、エクソーム捕捉を、製造業者の推奨プロトコール（Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ）に従ってＮｉｍｂｌｅＧｅｎプローブを使用して実施した。捕捉されたＤＮＡを、ＰＣＲ増幅し、ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって定量した。多重化された試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｖ４ ＨｉＳｅｑ ２５００上での７５ｂｐのペアエンド配列決定を使用して、試料の９６％において８５％を超える標的塩基の２０倍を超えるハプロイドリード深さ（標的塩基の約８０倍の平均ハプロイドリード深さ）を提供するのに十分なカバレッジ深さまで配列決定した。それぞれのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ ２５００実行に由来する生の配列データを、配列リードアラインメントおよびバリアントの同定のために、ＤＮＡｎｅｘｕｓプラットフォーム（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Reidら、BMC Bioinformatics、２０１４年、１５巻、３０頁）にアップロードした。簡単に述べると、生の配列データを、ＢＣＬファイルから、試料特異的ＦＡＳＴＱファイルに変換し、ＢＷＡ－ｍｅｍを含むヒト参照ビルドＧＲＣｈ３７．ｐ１３とアラインメントした（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Liら、Bioinformatics、２００９年、２５巻、１７５４～６０頁）。単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）および挿入／欠失（インデル）配列バリアントを、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、McKennaら、Genome Res.、２０１０年、２０巻、１２９７～３０３頁）を使用して同定した。
肝臓酵素および慢性肝疾患表現型のエクソームワイド関連分析
本発明者らは、線形混合モデルを使用して、トランスアミナーゼレベルとの関連について、１％未満の欠測データ率、１．０×１０－６より大きいハーディー－ワインベルク平衡Ｐ値、および０．１％を超えるマイナー対立遺伝子頻度を示す５０２，２１９の二対立遺伝子バリアントを試験した。ＧＨＳディスカバリーコホートにおけるトランスアミナーゼとのエクソームワイドな有意な関連を有するバリアントについて（ｐ＜１×１０－７）、本発明者らは、上記の欧州祖先再現研究において、関連分析およびメタ分析を実施した。本発明者らは、再現された関連を定義するために試験したバリアント数によって決定されたボンフェローニの有意性閾値を使用した。ディスカバリー研究および再現研究のメタ分析も実施した。本文中で報告される全てのＰ値は、対立遺伝子モデルに対応する。
本発明者らは続いて、慢性肝疾患表現型との関連についてトランスアミナーゼ関連単一ヌクレオチドバリアントを試験した。本発明者らは、関連の有意性を決定するために試験したバリアントおよび広い慢性肝疾患カテゴリーの数によって決定されるボンフェローニの有意性閾値を使用した。本発明者らはさらに、ＧＨＳ肥満外科手術コホートに由来する組織病理学的に定義された肝臓表現型との関連について再現された新規バリアントを試験した。本発明者らはまた、４０５の量的臨床測定値および３，１６８の臨床診断を用いて、再現された新規バリアントの関連のフェノムワイド研究を実施した。
特に、本発明者らは、トランスアミナーゼレベルとの関連について、１％未満の欠測データ率、１．０×１０－６より大きいハーディー－ワインベルク平衡ｐ値、および０．１％を超えるマイナー対立遺伝子頻度を示す５０２，２１９の二対立遺伝子バリアントを試験した。ｌｏｇ１０変換されたＡＬＴおよびＡＳＴ中央値を、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先の最初の４つの主成分について調整した。研究参加者間の関連性を説明するために、本発明者らはまた、無作為効果共変量として遺伝的関連性マトリックスを適合させる。主成分と遺伝的関連性マトリックスとの両方を、近似連鎖平衡中の、０．１％を超えるマイナー対立遺伝子頻度を有する３９，８５８の非ＭＨＣマーカーから構築した。本発明者らは、ＧＣＴＡパッケージに実装された線形混合モデル（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Yangら、Am J. Hum. Genet.、２０１１年、８８巻、７６～８２頁）を使用して、残存形質と単一ヌクレオチドバリアントとの関連について試験した。本文中で報告される全てのＰ値は、対立遺伝子モデルに対応する。
本発明者らは、３つの別々の欧州祖先コホート：ＧＨＳ肥満外科手術コホート、Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ、およびＰｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋ（上記のもの）におけるＧＨＳディスカバリーコホートにおいて関連を再現することを試みた。ＧＨＳ肥満外科手術コホートおよびＰｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋに由来するＡＬＴおよびＡＳＴ測定値を、ｌｏｇ１０変換し、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先の最初の４つの主成分について調整した。遺伝的関連性マトリックスを、無作為効果共変量として含有させ、分析をＧＣＴＡにおける線形混合モデルを使用して実施した。Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙでは、ｌｏｇ１０変換されたＡＬＴおよびＡＳＴ測定値を、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先の最初の１０の主成分について調整し、分析を、ＰＬＩＮＫに実装された線形回帰を使用して実施した。３つの再現コホートに関する要約統計量を、ＭＥＴＡＬ（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Willerら、Bioinformatics、２０１０年、２６巻、２１９０～１頁）を使用してメタ分析した（再現メタ分析）。ディスカバリーコホートおよび３つの再現コホートに関する要約統計量を、同様にメタ分析した（結合メタ分析）。
慢性肝疾患表現型に関する関連分析
本発明者らは、上記のように、ＧＨＳディスカバリーコホートから定義された慢性肝疾患表現型との関連について、肝臓酵素ＥｘＷＡＳに由来する１３の有意かつ再現された単一ヌクレオチドバリアントを分析した。本発明者らは、試験した１３個のバリアントおよび２つの広い慢性肝疾患カテゴリー（アルコール性および非アルコール性）を説明するために、Ｐ＜０．０５／２６（Ｐ＜１．９２×１０－３）のボンフェローニの有意性閾値を使用した。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントを、上記のように、ＧＨＳ肥満外科手術コホートに由来する組織病理学的に定義された肝臓表現型との関連についてさらに試験した。オッズ比を、年齢、年齢２、性別、ＢＭＩ、および祖先の最初の４つの主成分について調整した後、ロジスティック回帰のＦｉｒｔｈの罰則付き尤度法を使用して見積もった。遺伝子型オッズ比を、同じ共変量を使用してＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７について見積もった。
ＤＬＳにおける肝疾患のオッズ比を、年齢、年齢２、性別、体格指数、および自己報告された民族について調整された、ロジスティック回帰によって見積もった。利用可能なｒｓ７２６１３５６７遺伝子型を有するＤａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙに由来する参加者を、正常対照（ｎ＝４，２７９）として使用した。ＤＰＬＳにおけるオッズ比を、ロジスティック回帰によって見積もった。
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７のフェノムワイド関連研究
本発明者らは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７と、４０５の量的ＥＨＲ由来身体計測値、バイタルサイン、検査値、心電図、心エコー図、および骨密度測定値、ならびにまた、３，１６８のＥＨＲ由来臨床診断との関連のフェノムワイド研究を実施した。連続外来患者測定値を有する個体に関する検査中央値を、個体内中央値に由来する３を超える標準偏差であったおそらく偽の値の除去後に算出した；最大値と最小値も算出した。次いで、本発明者らは、年齢、年齢２、性別、および祖先の最初の１０の主成分について調整した後、全ての検査形質について残存形質を算出し、関連分析の前に適切な変換を適用した。ＩＣＤ－９に基づく診断コードを、Ｄｅｎｎｙら（それぞれ、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Dennyら、Nature Biotechnology、２０１３年、３１巻、１１０２～１０頁およびDennyら、Bioinformatics、２０１０年、２６巻、１２０５～１０頁）によって提唱された改変型のグループ分けを使用して、階層的臨床疾患群および対応する対照に折り畳んだ。ＩＣＤ－９に基づく診断には、以下の１つまたは複数：診断コードの問題リスト登録または別のカレンダー日に２つの別々の臨床エンカウンターについて入れられたエンカウンター診断コードが必要であった。
変換された量的臨床測定値残存物との関連の分析を、線形回帰を使用して実施し、臨床診断との関連の分析を、年齢、年齢２、性別、および最初の４つの主成分について調整されたロジスティック回帰を使用して実施した。対立遺伝子を、加法（参照対立遺伝子ホモ接合体については０、ヘテロ接合体については１、および代替対立遺伝子ホモ接合体については２）および後退モデル（参照対立遺伝子ホモ接合体およびヘテロ接合体については０、代替対立遺伝子ホモ接合体については１）の両方を使用してコード化した。
ソフトウェア
遺伝子関連分析を、ＧＣＴＡソフトウェア、バージョン１．２５．０７およびＰＬＩＮＫ、バージョン１．９．０を使用して実施した。分位点－分位点およびマンハッタンプロットを、Ｒソフトウェア、バージョン３．２．１（Ｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を使用して生成した。領域関連プロットを、ＬｏｃｕｓＺｏｏｍを使用して生成した（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Pruimら、Bioinformatics、２０１０年、２６巻、２３３６～７頁）。
ＲＮＡ配列決定研究
Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ Ｎａｎｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒチップ上で総ＲＮＡを泳動することによって、ＲＮＡの品質および濃度を評価した；全試料は、８より大きいＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）を有していた。ポリアデニル化されたＲＮＡ転写産物を、オリゴ（ｄＴ）２５ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる２ラウンドの富化を使用して単離した。ＲＮＡｃｌｅａｎＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて試料を精製および濃縮し、約１４０塩基対まで熱断片化した。ランダムヘキサマーを使用するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて第１鎖合成を完了した；第２鎖合成中にｄＴＴＰをｄＵＴＰと置き換えた。ウラシルＤＮＡ－グリコシラーゼステップを追加したエクソームに関して上記された本発明者らの標準的なＤＮＡライブラリー調製法に従って、試料をプロセッシングして、鎖特異的配列決定ライブラリーを生成した。
新規ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物の同定および検証
２つのミスマッチを許容するＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏ（登録商標）ソフトウェア（ＯｍｉｃＳｏｆｔ（登録商標）、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して、リードをＨｕｍａｎ．Ｂ３８にマッピングした。２つの手法を使用して、新規ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物を同定した。新規エクソン結合部を、ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏを使用してＧｅｎｃｏｄｅ ｖ２４に基づいて発見した。Ｄｅ ｎｏｖｏ転写産物アセンブリを、デフォルト設定でＴｒｉｎｉｔｙ（ｖ２．２．０）を使用して実行した。カスタム遺伝子モデルを構築して、ＨＳＤ１７Ｂ１３の新規転写産物を組み込み、転写産物の量を、カスタム遺伝子モデルとのリードアライメントによって見積もった。全ての同定されたＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームのタンパク質配列アラインメントを、図７Ａおよび７Ｂに示す。ヒト肝臓試料に由来する総ＲＮＡ上でのＲＴ－ＰＣＲを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共に使用して実施した。それぞれ５０μＬのＲＴ－ＰＣＲ反応物は、１×反応ミックス、５００ｎＭのそれぞれのフォワードおよびリバースプライマー（ＰＳＴ５１６：ＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣ（配列番号２５１）およびＰＳＴ５１７：ＡＴＣＡＴＧＣＡＴＡＣＡＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号２５２））、１μＬのＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ、および７５ｎｇのＲＮＡを含有していた。サイクリング条件は、４５℃で３０分の１サイクル；９４℃で２分の１サイクル；９４℃で２０秒、５３℃で３０秒、および７２℃で９０秒の４０サイクル；７２℃で５分の１サイクル；次いで、１０℃で保持であった。生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、プライマーＤＥ００２（ＡＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＣＣＴＴＧＧ（配列番号２５３））を使用する直接Ｓａｎｇｅｒ配列決定のために提出した。ＢおよびＣ転写産物を同定するために、ＲＴ－ＰＣＲ生成物を、ＳＹＢＲ ＧｏｌｄＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色された２％アガロースゲル上で泳動し、予想分子量のバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した後、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いるクローニングにかけた。ＴＯＰＯクローンの配列決定を、Ｍ１３ＦおよびＭ１３Ｒ配列決定プライマーを使用して実施した。配列分析を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＤＮＡ分析ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。完全長ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物を、最初のエクソン（ＧＣＡＡＡＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣ（配列番号２５４））および最後のエクソン（ＴＣＴＴＧＡＴＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＴＴ（配列番号２５５））中の遺伝子特異的プライマーを使用する、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙを含むＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５０ｎｇの総ＲＮＡから直接増幅させて、約２．２ｋｂのアンプリコン（最大予測サイズの転写産物）を生成した。アンプリコンを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で検証した。ＰａｃＢｉｏ互換性バーコードアダプターを、アンプリコンにライゲートし、ＰａｃＢｉｏ ＰＢビーズ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて清浄化した。ライブラリーを等量でプールし、ＰａｃＢｉｏ ＲＳＩＩプラットフォーム上で１８０分間、１個のＳＭＲＴセル上で配列決定した。データを、ＰａｃＢｉｏソフトウェアｓｍｒｔａｎａｌｙｓｉｓ ｖ２．３ ｔｏｏｌ ｌａｂｅｌｚｍｗを使用して脱多重化した後、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴｏｏｌｓＡｍｐｌｉｃｏｎＡｎａｌｙｓｉｓを用いて分析した。得られるアンプリコンを、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＲｅｆＳｅｑ遺伝子と比較して、アイソフォームおよび遺伝子型状態を決定した。
ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームの細胞内局在化
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＥａｇｌｅの最少必須培地中で培養した。ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＤを、Ｍｙｃ－ＤＤＫ骨格レンチウイルス構築物中にサブクローニングし、レンチウイルスを生成した。ＨｅｐＧ２細胞に、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物を担持するレンチウイルスを感染させた。それぞれのＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物を発現する安定な細胞株を、完全培養培地中で２週間、１～３ｍｇ／ｍｌのゲネチシンＧ－４１８硫酸塩を用いて選択した。固定後、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームを、マウス抗Ｍｙｃ抗体を用いて検出した。脂肪滴を、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ色素（Ｓｉｇｍａ）で標識した。免疫蛍光のための二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ウサギＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）であった。
ヒト肝臓組織生検試料および安定細胞株中でのＨＳＤ１７１Ｂ３タンパク質発現の定量化
ヒト肝臓および細胞ペレット試料を、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤の混合物（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の存在下で、氷冷１×ＲＩＰＡ溶解緩衝液（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中でホモジェナイズした。上清を収集し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してタンパク質濃度のために使用した。ヒト組織および細胞溶解物を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にロードし、分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を添加した１×ＴＢＳ中の５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ミルクで１時間ブロックした。膜を、ＨＳＤ１７Ｂ１３（１：２００、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）およびＢ－アクチン（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対して４℃で一晩、抗体と共にインキュベートした。結合した抗体を、ＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ抗体（１：１０，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して検出し、化学発光試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して増強した。バンド強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して定量した。
リアルタイム半定量的ＰＣＲ
ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して細胞から抽出した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成し、イントロン－スパニングプライマーに基づく半定量的ＰＣＲのために使用した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、転写産物の発現レベルを測定した。ＨＳＤ１７Ｂ１３とＴＢＰのプライマーは、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から注文されたものであった。相対的遺伝子発現を、ΔΔＣｔ法を用いて分析し、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化された発現の倍数変化（ΔＣｔ）を提供した。
脂肪滴の単離およびウェスタンブロッティングによる特徴付け
脂肪滴を、以前に報告されたように（それぞれ、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brasaemle DL、Wolins NE.、Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation、Current protocols in cell biology ２００６年；第３章：ユニット３ １５およびDingら、Nature Protocols、２０１３年、８巻、４３～５１頁）、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ（ＩｓｏＡ）または転写産物Ｄ（ＩｓｏＤ）を安定に発現するＨｅｐＧ２細胞から調製した。簡単に述べると、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ＩｓｏＡ、ＩｓｏＤを安定に発現するＨｅｐＧ２細胞、または親細胞株を、１ｍＭのオレイン酸と共に一晩インキュベートした。脂質負荷の後、細胞を掻き取り、１×Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加した低張性溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、５０バールで８分間、キャビテーションによって溶解した。溶解物を１０００ｇ／４℃で１０分間遠心分離し、核除去後上清（ＰＮＳ）を、２ｍＬの最終容量および２０％の濃度まで超遠心分離管中でスクロースと混合した。次いで、１．５ｍＬの５％スクロースおよび別の１．５ｍＬの低張性溶解緩衝液を、溶解物の上に載せた。管を、１８２，０００ｇ／４℃で４０分間遠心分離し、脂肪滴（ＬＤ）層を新しい管に移した。管中の残存容量を吸引し、ペレット（総膜、ＴＭ）を０．５ｍＬの低張性溶解緩衝液中に再懸濁した。ＰＮＳ、ＬＤ、およびＴＭ画分を、１×ラジオイムノ沈降（ＲＩＰＡ）緩衝液（ＥＭＤ）＋ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）およびβ－メルカプトエタノールと混合し、３７℃で３時間、超音波処理した。ＴＭ溶解物を、２．５倍希釈して、ＰＮＳに対して正規化した。溶解物を、４～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏｒａｄ）上で泳動し、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、低蛍光ＰＶＤＦ膜上に移し、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＴＢＳ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液中で１時間ブロックした。膜を、以下の抗体：α－ＨＳＤ１７Ｂ１３（Ａｂｇｅｎｔ、カタログ番号ＡＰ５７２９ａ １：５００）；ＬＤマーカー：α－ＡＤＲＰ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１５２－９４－１－ＡＰ、１：２５００）；ＬＤマーカー：α－ＴＩＰ４７（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１０６９４ １：２０００）；リソソームマーカー：α－ＬＡＭＰ１（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢＰ２－２５１８３、１：１０００）；細胞質マーカー：α－ＧＡＰＤＨ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、６０００４－１－Ｉｇ、１：２０００）；小胞体マーカー：α－カルレティキュリン（Ａｂｃａｍ、ａｂ９２５１６、１：１０００）；ミトコンドリアマーカー：α－ＣＯＸ ＩＶ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３３９８５、１：５００）；細胞骨格マーカー：α－アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ａ５４４１、１：４０００）と共に一晩インキュベートした。次の日、膜を、Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水＋０．１％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、それぞれ、１：５，０００および１：１０，０００の希釈率のＩＲＤｙｅ（登録商標）α－ウサギ（８００ＣＷ）およびα－マウス（６８０ＲＤ）二次抗体（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を含有するブロッキング緩衝液と共に、室温で１時間インキュベートした。ゲルをＴＢＳＴで再度洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙを使用して画像化した。
細胞内トリグリセリド含量の定量化
安定細胞に由来するトリグリセリド（ＴＧ）含量を、ＴＧ定量化キット（Ａｂｃａｍ）を使用して決定した。このアッセイでは、ＴＧは、遊離脂肪酸およびグリセロールに変換される。次いで、グリセロールは酸化されて、定量される生成物を生成する（λ＝５７０ｎｍでの分光測光）。
精製された組換えＨＳＤ１７Ｂ１３に対するステロイドおよび生物活性脂質ライブラリーの基質スクリーニング
反応を、５００μＭのＮＡＤ＋、５μＭの生物活性脂質または５０μＭのステロイド（全て５％ＤＭＳＯ中での最終濃度）、および１００ｎｇの組換えヒトＨＳＤ１７Ｂ１３を含有する４０μＬの最終容量のアッセイ緩衝液（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中で実施した。反応物を、２３℃で３時間インキュベートした後、等量のＮＡＤＨ－Ｇｌｏ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。２３℃で１時間インキュベートした後、相対的光単位（ＲＬＵ）を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で測定した。生のＲＬＵ値を、以下の式：対照のパーセント（ＰＯＣ）＝１００×（試料（ＲＬＵ）－陰性ＣＴＲＬ平均）／（陽性ＣＴＲＬ平均－陰性ＣＴＲＬ平均）を使用して、陰性対照（５％ＤＭＳＯ）の減算後の対照（５０μＭエストラジオール）のパーセントとして正規化した。
ＨＳＤ１７Ｂ１３酵素活性のｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞での特徴付け
組換えヒトＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質を、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａまたは転写産物Ｄを担持するプラスミドＤＮＡで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）から精製した。ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントは、Ｃ末端に１０×Ｈｉｓタグを含有し、Ｎｉ２＋親和性精製を使用して可溶性画分から精製した。酵素活性を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ－Ｇｌｏ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＮＡＤＨ産生の測定によって決定した。反応を、最終容量１００μＬ中の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＮＡＤ＋、７５μＭの基質（Ｓｉｇｍａ）および５００ｎｇの精製された酵素中、２５℃で３時間実施した。インキュベーション後、２０μＬの反応物を、２０μＬのルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、室温で１時間インキュベートし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。
ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ａ、転写産物Ｄまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、対照）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して、細胞に基づくアッセイにおいてエストラジオールに対するＨＳＤ１７Ｂ１３の活性を精査した。エストラジオール（１μＭ）をそれぞれの細胞型に供給した。４８時間後、培地を収集し、エストラジオールおよびその変換された生成物であるエストロンの濃度を同定し、ＬＣ－ＭＳによって定量した。
エクソンバリアントと、アスパラギン酸およびアラニンアミノトランスフェラーゼとの関連
本発明者らは、ＤｉｓｃｏｖＥＨＲ研究に由来する欧州子孫の４６，５４４人の個体（「ＧＨＳディスカバリーコホート」；表６における基本人口統計）における血清ＡＬＴまたはＡＳＴレベルとの関連について、５０２，２１９の二対立遺伝子単一遺伝子バリアントを試験した。１９個の遺伝子中の合計３５個のバリアントが、Ｐ＜１．０×１０－７でＡＬＴまたはＡＳＴと関連することが見出された（図１Ａおよび１Ｂ、ならびに表７）。本発明者らは、欧州祖先の個体の３つのコホート：１）ＤｉｓｃｏｖＥＨＲに由来する肥満外科手術患者（ｎ＝２，６４４）（「ＧＨＳ肥満外科手術コホート」）；２）Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙに由来する１，３５７人の個体；および３）Ｐｅｎｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋに由来する８，５２６人の個体において再現研究を実施した。再現コホートのメタ分析において、９個の遺伝子中の１３個のバリアントが、ＡＬＴまたはＡＳＴの血清レベルと有意に関連していた（試験した３５のバリアントについて、Ｐ＜１．４３×１０－３のボンフェローニの有意性閾値、表８）。これらのものは、ＰＮＰＬＡ３７、ＴＭ６ＳＦ２１１、ＳＥＲＰＩＮＡ１２２、ＳＡＭＭ５０２３、およびＥＲＬＩＮ１２４などの、トランスアミナーゼレベルの上昇と関連すると以前に報告されたバリアントを含んでいた。ＳＥＲＰＩＮＡ１は、アルファ－１－抗トリプシンをコードし、その機能的欠損は、肝疾患を引き起こす；ＳＡＭＭ５０との関連は、ＰＮＰＬＡ３中の変化との連鎖不均衡によって媒介され、ＥＲＬＩＮ１は肝臓の脂肪沈着に関与している。本発明者らはまた、肝疾患と関連すると以前には報告されなかったバリアントも同定した。これらのものは、それぞれ、ＡＬＴおよびＡＳＴをコードする遺伝子であるＧＰＴおよびＧＯＴ１、ならびに溶質運搬ファミリー３９メンバー１２をコードするＳＬＣ３９Ａ１２中にいくつかのバリアントを含んでいた。
本発明者らはまた、１７－ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼファミリーの特徴付けられていないメンバーであるヒドロキシステロイド１７－ベータデヒドロゲナーゼ１３をコードする遺伝子であるＨＳＤ１７Ｂ１３におけるバリアントと、ＡＬＴ（ディスカバリーＰ＝４．２×１０－１２、再現Ｐ＝１．７×１０－４）およびＡＳＴ（ディスカバリーＰ＝６．２×１０－１０、再現Ｐ＝１．７×１０－４、表８）のレベルの低下との再現可能な関連を同定した。関連するバリアントであるｒｓ７２６１３５６７は、エクソン６（ＴＡ対立遺伝子）のドナースプライス部位に隣接するアデニンの挿入であり、ＧＨＳディスカバリーコホートにおいて２６．０％の対立遺伝子頻度を有していた。以前に、Ｃｈａｍｂｅｒｓらは、ＡＬＴレベルと関連する４ｑ２２（ｒｓ６８３４３１４）に隣接遺伝子座を同定した（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、Nat. Genet.、２０１１年、４３巻、１１３１～１１３８頁、doi:10.1038/ng.970）；ｒｓ７２６１３５６７は、これまで、トランスアミナーゼレベルと関連するとは報告されていなかった。ＨＳＤ１７Ｂ１３は、同じ遺伝子ファミリーの別のメンバーであるＨＳＤ１７Ｂ１１の３０ｋｂ上流にある。本発明者らは、ＨＳＤ１７Ｂ１１におけるコードまたはスプライスバリアントと、ディスカバリーコホートにおけるトランスアミナーゼレベル（図５Ａおよび５Ｂ）またはディスカバリーコホートおよび３つの再現コホートの結合メタ分析におけるトランスアミナーゼレベルとのエクソームワイドな有意な関連を観察しなかった。さらに、ｒｓ７２６１３５６７と、ＨＳＤ１７Ｂ１１におけるバリアントとの連鎖不均衡は、全ての祖先群にわたって中程度であった（全ての祖先群におけるＨＳＤ１７Ｂ１１における全ての確認されたバリアントに関してｒ２＜０．４）。まとめると、これらの知見は、トランスアミナーゼレベルと機能的に関連する可能性が最も高いゲノム領域中の遺伝子として、ＨＳＤ１７Ｂ１３を示唆する。
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エクソンバリアントと、慢性肝疾患の臨床診断との関連
次に、本発明者らは、ディスカバリーコホートおよび再現コホートにおいて見出された９個の遺伝子中の１３個のトランスアミナーゼ関連バリアントと、アルコール性および非アルコール性（非ウイルス性）肝疾患を含む慢性肝疾患、ならびに最も進行した形態の慢性肝疾患：アルコール性肝硬変、非アルコール性肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）との関係を分析した。試験した１３個のバリアントに関するＰ＜１．９２×１０－３のボンフェローニの有意性閾値を使用して、本発明者らは、５個の遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ１３、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＰＮＰＬＡ３、およびＳＡＭＭ５０）における６個のバリアントと、慢性肝疾患表現型との間の有意な関連を見出した（表９）。ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＰＮＰＬＡ３、およびＳＡＭＭ５０の関連は、以前に報告された関連を確認するものである。ディスカバリーコホートにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡは、対立遺伝子用量依存的様式で、アルコール性と非アルコール性肝疾患の両方のＥＨＲ由来カテゴリーのより低いオッズと関連していた（図２Ａ）：アルコール性肝疾患の全カテゴリー、ヘテロ接合体オッズ比（ＯＲｈｅｔ）（９５％信頼区間）０．５８（０．４２～０．８０）、ホモ接合体ＯＲ（ＯＲｈｏｍ）０．４７（０．２３～０．９７）、対立遺伝子ＯＲ（ＯＲａｌｌｅｌｉｃ）０．６２（０．４８～０．８１）、Ｐ＝１．８×１０－４；非アルコール性肝疾患の全カテゴリー、ＯＲｈｅｔ０．８３（０．７５～０．９２）、ＯＲｈｏｍ０．７０（０．５７～０．８７）、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ０．８４（０．７８～０．９１）、Ｐ＝１．３×１０－５。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡはまた、アルコール性および非アルコール性肝硬変のより低いオッズとも関連し、ヘテロ接合体およびホモ接合体について、それぞれ、アルコール性肝硬変の４２％および７３％低いオッズ（ＯＲｈｅｔ ０．５８（０．３９～０．８６）、ＯＲｈｏｍ ０．２７（０．０９～０．８５）、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．５６（０．４１～０．７８）、Ｐ＝３．４×１０－４）であり、ヘテロ接合体およびホモ接合体について、それぞれ、非アルコール性肝硬変の２６％および４９％低いオッズ（ＯＲｈｅｔ ０．７４（０．６０～０．９３）、ＯＲｈｏｍ ０．５１（０．３１～０．８５）、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．７４（０．６２～０．８８）、Ｐ＝４．５×１０－４）であった。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡはまた、ＨＣＣのより低いオッズと名目上関連していた。
本発明者らは、多民族のＤａｌｌａｓ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｕｄｙ（ＤＬＳ）およびＤａｌｌａｓ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｕｄｙ（ＤＰＬＳ、表１０）におけるこれらの知見を確認し、拡張しようとした。ＤＬＳにおいて、ＴＡ対立遺伝子は、対立遺伝子用量依存的様式で任意の肝疾患のより低いオッズと関連していた（ＯＲｈｅｔ ０．７４（０．５７～０．９７）、ＯＲｈｏｍ ０．４１（０．２１～０．８３）、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．７０（０．５～０．８８）、Ｐ＝１．８×１０－３、図８）。同様の効果は、進行した、肝硬変型のアルコール性（ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．７２（０．５３～０．９９）、Ｐ＝４．４×１０－２）および非アルコール性（ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．６５（０．４０～１．０７）、Ｐ＝９．０×１０－２）肝疾患との保護的関連を含む、ＥＨＲ由来肝疾患サブタイプにわたって観察された。自己報告された民族によってグループ分けされた個体のサブセット分析において、肝疾患との関連は、ヒスパニック系米国人において有意であった（ｎ＝３２６の症例および７２２の対照、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．５１（０．３５～０．７４）、Ｐ＝４．０×１０－４）；統計的有意性を達成しなかった、同様の数的傾向は、ＤＬＳのアフリカ系米国人（ｎ＝３３の症例および２，２９１の対照、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．７４（０．２５～２．４７）、Ｐ＝０．６７）および欧州系米国人（ｎ＝１５８の症例および１，２６６の対照、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．８７（０．６５～１．１５）、Ｐ＝０．３２）のサブセットにおいても見られた。ヒスパニック系米国人の小児肝疾患患者および肥満対照の別の研究である、ＤＰＬＳにおいては、ＴＡ対立遺伝子はまた、肝疾患のより低いオッズと関連していた（ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．６１（０．３７～０．９９）、Ｐ＝４．６×１０－２）。かくして、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡは、３つの独立した集団中の成人および小児において、肝硬変を含む複数の形態の慢性肝疾患のオッズの低下と関連していた。
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ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡと肝臓病理との関連
ＮＡＦＬＤは、有意な炎症の証拠がない肝臓脂肪蓄積（単純脂肪肝）から、より臨床的に影響のあるＮＡＳＨまでの疾患スペクトラムを記載する。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡと、ＥＨＲ由来肝疾患診断コードとの関連を確認するために、および脂肪症からＮＡＳＨへの組織病理学的進行とのその関連をさらに理解するために、本発明者らは、ＧＨＳ肥満外科手術コホートにおける関連の試験を実施した。肥満外科手術の時点で肝臓生検によって評価された全エクソーム配列決定された２，３９１人の個体のこのコホートにおいて、合計５５５人（２３％）の個体が脂肪症、脂肪性肝炎、または線維症の証拠がなく（「正常」）、８３０人（３５％）が単純脂肪肝を有し、１００６人（４２％）がＮＡＳＨを有していた。遺伝子型によって正常な肝臓、単純脂肪肝、およびＮＡＳＨの有病率を比較する場合、それぞれのＴＡ対立遺伝子に関して、正常な肝臓の有病率は遺伝子型によって異ならないと考えられる（Ｔ／Ｔ、Ｔ／ＴＡ、およびＴＡ／ＴＡ保因者について、それぞれ、２３％、２４％、および２３％、割合における傾向に関するカイ二乗検定によるＰ＝０．５）が、ＮＡＳＨの有病率は減少し（Ｔ／Ｔ、Ｔ／ＴＡ、およびＴＡ／ＴＡ保因者について、それぞれ、４５％、４０％、および３１％、Ｐ＝１．６×１０－４）、単純脂肪肝の有病率は増加する（Ｔ／Ｔ、Ｔ／ＴＡ、およびＴＡ／ＴＡ保因者について、それぞれ、３３％、３５％、および４７％、Ｐ＝１．１×１０－３）ことが観察された（図９）。脂肪症を有する個体のうち、ＴＡ対立遺伝子は、対立遺伝子用量依存的様式で、単純脂肪肝と比較して、ＮＡＳＨと線維症の両方の統計的に有意に低いオッズと関連していた（ＮＡＳＨについては、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．７７（０．６６～０．９０）、Ｐ＝６．５×１０－４；線維症については、ＯＲａｌｌｅｌｉｃ ０．７４（０．６２～０．８８）、Ｐ＝４．１５×１０－４；図２Ｂ）。要するに、これらのデータは、単純脂肪肝から、より進行した段階のＮＡＳＨおよび線維症へのＮＡＦＬＤの進行を媒介する際のＨＳＤ１７Ｂ１３の役割を示唆する。
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡと、臨床量的形質および診断との関連
ＨＳＤ１７Ｂ１３スプライスバリアントの臨床結果をより包括的に検査するために、本発明者らは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡと、４０５の量的ＥＨＲ由来身体計測値、バイタルサイン、検査値、心電図、心エコー図、および骨密度測定値、ならびにまた、３，１６８のＥＨＲ由来臨床診断との関連のフェノムワイド研究を実施した。それぞれ、量的臨床測定値および臨床診断との関連に関する１．２３×１０－４および１．５８×１０－５のボンフェローニの有意性閾値を使用して、本発明者らは、肝臓トランスアミナーゼとの関連に加えて、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ対立遺伝子と、より高い血小板数との統計的に有意な関連を同定した（表１１）。慢性肝疾患以外の臨床診断との統計的に有意な関連はなかった（ＯＲ（９５％ＣＩ）＝０．８８（０．８４～０．９３）；Ｐ＝９．１４×１０－６；ＡＡＦ＝０．２６３；Ｎ合計症例数＝４０３１、Ｔ／Ｔ＝２３３１、Ｔ／ＴＡ＝１４４９、ＴＡ／ＴＡ＝２５１；Ｎ合計対照数＝３５７０１、Ｔ／Ｔ＝１９２３８、Ｔ／ＴＡ＝１３９８４、ＴＡ／ＴＡ＝２４７９）。
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ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡおよびＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質発現に対するＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡの効果
本発明者らは次に、遺伝子の公知および新規の転写産物の発現に対するＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ対立遺伝子の効果を検査した。本発明者らは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７スプライスバリアントの２２のＴ／Ｔホモ接合体、３０のＴ／ＴＡヘテロ接合体、および１７のＴＡ／ＴＡホモ接合体保因者に由来する組織学的に正常な肝臓試料におけるＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡ発現を評価するために、ＲＮＡ配列決定を使用した。２つの公知のＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡおよびＢに加えて、２つの新規転写産物が同定された：エクソン６を欠く転写産物Ｃ、およびタンパク質の早期トランケーションをもたらすと予測される、エクソン６の３’末端にグアニンヌクレオチドの挿入を含有する転写産物Ｄ。４つのさらなる転写産物（Ｅ～Ｈ）は、非常に低レベルで発現された（図３Ａ～３Ｄおよび６Ａ～６Ｄ）。転写産物を、ＲＴ－ＰＣＲおよびＳａｎｇｅｒ配列決定によって検証した。また、転写産物Ｄを、ロングリードｃＤＮＡ配列決定を使用して検証した。全ての同定されたＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォーム（Ａ～Ｈ）のタンパク質配列アラインメントを、図７Ａおよび７Ｂに示す。これらの転写産物の発現レベルは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７遺伝子型に応じて変化した：それぞれのＴＡ対立遺伝子について、対立遺伝子用量依存的様式で、転写産物ＡおよびＢのレベルは減少したが、転写産物ＣおよびＤのレベルは増加した（図３Ａ～３Ｄ）。完全長３００アミノ酸タンパク質をコードする転写産物Ａは、Ｔ／Ｔホモ接合体における優勢な転写産物であったが、早期にトランケートされるタンパク質をコードする転写産物Ｄは、ＴＡ／ＴＡホモ接合体における優勢な転写産物であった。ヒト肝臓生検組織中で、トランケートされたアイソフォームＤタンパク質は、ヘテロ接合体およびＴＡ／ＴＡホモ接合体中に最小限に存在し、アイソフォームＡタンパク質の存在量は、対立遺伝子用量依存的様式で減少した（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。ＨＥＫ２９３細胞中でのアイソフォームＡおよびＤの異種発現は、ｍＲＮＡ発現と比較してアイソフォームＤの存在量の減少を示したが、これは、アイソフォームＡと比較した場合、アイソフォームＤの不安定性を示唆している（図１１Ａ～１１Ｃ）。これらのデータは、ヒト肝臓における発現の実質的な減少と共に、トランケート型のタンパク質の合成をもたらす、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７の選択的ｍＲＮＡスプライシングと一致している。
ヒト肝臓細胞中でのＨＳＤ１７Ｂ１３の発現
ＨＳＤ１７Ｂ１３は、主に肝臓中で発現され（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Liuら、Acta Biochim. Pol.、２００７年、５４巻、２１３～２１８頁）、そこでそれは脂肪性肝疾患の発症における役割と一致して、脂肪滴に局在化する（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Suら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、２０１４年、１１１巻、１１４３７～１１４４２頁、doi:10.1073/pnas.1410741111）。本発明者らは、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物ＡまたはＤを発現するレンチウイルスを安定に形質導入した不死化ヒト肝臓細胞株におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現およびその局在化を評価した。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡは、ＢＯＤＩＰＹで標識された脂肪滴を取り囲む膜上で主に検出された（データは示さない）。同様の細胞内局在化が、脂肪滴表面でＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤについても観察された（データは示さない、および図１２）。細胞内トリグリセリド含量の差異は、ＧＦＰ対照またはＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡまたはＤを過剰発現する細胞株のオレイン酸処理について観察されなかった（図１３Ａ～１３Ｄ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞モデルにおけるＨＳＤ１７Ｂ１３活性に対するｒｓ７２６１３５６７：ＴＡの効果
ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡに起因するＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の早期トランケーションの機能的結果を理解するために、本発明者らは、組換えタンパク質およびコファクターとしてのニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアイソフォームＡおよびＤの酵素活性を評価した。本発明者らは、２６５のユニークな推定基質を試験し、ステロイド基質およびＨＳ１７Ｂ１３の酵素基質としての生物活性脂質（例えば、ロイコトリエンＢ４）を同定した。本発明者らは、ヒドロキシルのケトン基への酸化をもたらす、エストラジオールの酵素的変換に対するＨＳＤ１７Ｂ１３の酵素活性のその後の特徴付けに焦点を当てた（図１４中のＶｍａｘおよびＫｍ値）。ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤは、ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡと比較した場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（図１０Ｄ）および細胞に基づく酵素変換アッセイ（図１０Ｅ）でエストラジオールに向かう大きく低下した活性を示した。
大規模エクソーム配列決定をＥＨＲ由来臨床表現型と関連させることにより、本発明者らは、ＨＳＤ１７Ｂ１３におけるスプライスバリアントと、血清トランスアミナーゼレベルの低下、ならびに非アルコール型およびアルコール型の肝疾患のリスクの低下との新規関連を同定した。これらの関連は、４つの独立したコホートにおいて、また、進行した肝硬変型の肝疾患およびＨＣＣを含む、いくつかの異なる肝疾患カテゴリーにわたって、一貫して観察された。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ対立遺伝子は、単純脂肪肝とは関連しなかったが、ＮＡＳＨおよび線維症のリスクの低下と関連していたが、このバリアント対立遺伝子が、より臨床的に進行した段階の慢性肝疾患への進行から保護することを示唆している。フェノムワイド関連研究において、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡは、慢性肝疾患以外の臨床診断または測定値と有意に関連せず、臨床測定値（肝臓トランスアミナーゼおよび血小板数）と関連していたが、バリアント対立遺伝子の臨床効果が慢性肝疾患に特異的であり得ることを示唆している。
他のヒドロキシステロイド１７－ベータデヒドロゲナーゼファミリーメンバーは、性ステロイドおよび脂肪酸代謝に関与する（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Moeller、Mol. Cell. Endocrinol.、２００９年、３０１巻、７～１９頁、doi:10.1016/j.mce.2008.10.040）が、ＨＳＤ１７Ｂ１３の機能に関し公知であることはわずかである。ＨＳＤ１７Ｂ１３の過剰発現は、マウス肝臓における脂質生成を増加させ、培養肝細胞中の脂肪滴の数およびサイズを増加させることが以前に示された（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Suら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、２０１４年、１１１巻、１１４３７～１１４４２頁、doi:10.1073/pnas.1410741111）。２つの以前の研究もまた、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の肝臓発現が、脂肪肝を有する患者において増加することを示した（それぞれ、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Suら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、２０１４年、１１１巻、１１４３７～１１４４２頁、doi:10.1073/pnas.1410741111およびKampfら、FASEB J.、２０１４年、２８巻、２９０１～２９１４頁、doi:10.1096/fj.14-250555）。本発明者らのデータは、両方のＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームが、脂肪滴膜上で発現されるが、細胞内中性脂肪含量をモジュレートするとは考えられないことを示唆し、この知見は、ヒトにおけるＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡと、単純脂肪肝との関連の欠如を反映する。ＨＳＤ１７Ｂ１３の生理学的基質は公知ではないが、酵素的研究は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ対立遺伝子によってコードされるＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームがエストラジオールに対して触媒的に欠陥があることを示している。この時点で、試験した基質のいずれかが肝疾患にとって重要であるかどうかは明らかではないが、ＨＳＤ１７Ｂ１３が脂質媒介性炎症に以前は関与していたいくつかの生物活性脂質種（例えば、ロイコトリエンＢ４）に対する酵素活性を有することは興味深い（あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Liら、Nature Medicine、２０１５年、２１巻、２３９～２４７頁、doi:10.1038/nm.3800）。
このＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントは、他の領域における新しい治療薬への道を案内してきた遺伝子バリアントと同様、慢性肝疾患を標的とする新しい治療戦略への手段を提供することができる。本発明者らのデータは、ＨＳＤ１７Ｂ１３が、脂肪症から、有意な疾病率および死亡率と関連し、現在は有効な処置がない、後期段階のＮＡＳＨ、線維症、および肝硬変への肝疾患の進行をモジュレートすることを示している。
（実施例４）
ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したマウスＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子座の改変
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用してＨｓｄ１７ｂ１３を標的化するための概念実証として、マウスＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子座のエクソン１領域またはエクソン６／７領域のいずれかを標的とするマウスＨｓｄ１７ｂ１３ガイドＲＮＡを試験した。ガイドＲＮＡ標的配列を、表１２に提供する。配列番号２５９～２６８に対応するガイドＲＮＡ ＤＮＡ標的化セグメントは、それぞれ、配列番号１６４３～１６５２に記載され、チミンの代わりにウラシルを含むことを除いて、配列番号２５９～２６８と同一である。マウスＨｓｄ１７ｂ１３（ヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ１３）のＮＣＢＩ遺伝子ＩＤは、２４３１６８（配列番号２６９）である。マウスゲノム遺伝子座は、第５染色体、ＮＣ＿００００７１．６（１０３９５５４４２．．１０３９７７３８８、補体）上にある。
Figure 0007094963000035
ガイドＲＮＡを、ハイブリッド野生型マウス（７５％Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ２５％１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ）から単離された初代マウス肝細胞中、ｅｘ ｖｉｖｏで最初に試験した。マウス由来肝臓を、１×ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有する５０ｍＬの肝臓かん流培地、次いで、５０ｍＬの肝臓消化培地（ＨＢＳＳ、１００ｍＭ ＣａＣｌ２、５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、コラゲナーゼ）でかん流した。一度、肝臓が消化されたと考えられたら、それらを、１×ＰｅｎＳｔｒｅｐおよびＬ－グルタミンを含有する洗浄培地中に入れる。肝臓を引き裂いて、穏やかな振とうにより肝臓から肝細胞を遊離させた。一度、細胞が遊離したら、それらを７０μｍのメッシュフィルターの中に通し、４℃で４分間、５０ｇでスピンした。ペレットを、洗浄緩衝液で２回洗浄した。次いで、ペレットを２０ｍＬの３８～４０％Ｐｅｒｃｏｌｌ中に再懸濁し、４℃で１０ｍｉｎ、２００ｇでスピンした。ペレットを２回洗浄し、プレーティング培地（ウィリアムＥ培地、１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ、１×Ｌ－グルタミン、５％ＦＢＳ）中に再懸濁した。細胞を、２４ウェルのコラーゲン被覆組織培養プレート中に、ウェルあたり３００，０００個の細胞でプレーティングした。細胞を６～１８ｈ結合させた後、プレーティング培地を、ＦＢＳを含まない培地と交換した。使用した試薬を、表１３に示す。
Figure 0007094963000036
Ｃａｓ９およびマウスＨｓｄ１７ｂ１３ ｇＲＮＡを含有するリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を、新鮮に単離された初代マウス肝細胞に添加した。初代マウス肝細胞中でのｅｘ ｖｉｖｏ実験のために、別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを有するモジュラーガイドＲＮＡを使用した。ｃｒＲＮＡの配列番号を表１２に記載し、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列を配列番号１４２２に記載する。それぞれのＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を使用して２ｎＭの最終濃度でトランスフェクトした。４８ｈ後、ＤＮＡ溶解物を細胞から調製し、次世代配列決定を、試験したそれぞれのガイドＲＮＡについて実施して、予測される切断部位にわたる挿入／欠失（インデル）頻度を決定した。
図１５は、エクソン１領域を標的とする５つのガイドＲＮＡのそれぞれおよびエクソン６／７領域を標的とする５つのガイドＲＮＡのそれぞれを含む、初代マウス肝細胞中のそれぞれのガイドＲＮＡを用いたマウスＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子中での編集レベル（インデルを含むリード％）を示す。編集効率は、次世代配列決定によって決定される、溶解した細胞のプールに由来するＰＣＲ反応中の配列リードの総数にわたって観察される挿入または欠失の総数を指す。ほぼ全てのガイドＲＮＡが、少なくとも２０％の編集効率を示した。
次に、５つのマウスＨｓｄ１７ｂ１３ガイドＲＮＡを、ゲノム的に組み込まれたＣａｓ９遺伝子を有するマウス（Ｃａｓ９－ｒｅａｄｙマウス）においてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、キメラ単一ガイドＲＮＡを使用した。それぞれのガイドＲＮＡに関するＤＮＡ標的化配列は、チミンを置き換えるウラシルを含む、表１２に記載のガイドＲＮＡ標的配列と等価である。それぞれの単一ガイドＲＮＡは、配列番号１４２０に記載のｇＲＮＡ足場の上流（５’側）にＤＮＡ－標的配列を含んでいた。ｓｇＲＮＡの配列番号を、表１２に記載する（ｓｇＲＮＡ ｖ１のカラム）。異なるガイドＲＮＡ足場を使用する他のｓｇＲＮＡ変化は、表１２に含まれるが、試験しなかった。それぞれのガイドＲＮＡについて、１群あたり３匹の雄のＣａｓ９－ｒｅａｄｙマウスに投与した。ガイドＲＮＡを、尾静脈注射によってｓｇＲＮＡ発現カセットを担持するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ８）により導入した（１００μＬのＰＢＳ中、マウスあたり１Ｅ１１）。Ｃａｓ９を発現しない野生型マウスに、陰性対照として５つ全部のガイドＲＮＡを投与した。注射の３週間後、動物を安楽死させ、肝臓および他の組織と共に血清を収穫した。組織をＤＮＡ溶解物にプロセッシングした後、ＮＧＳ配列決定によって分析した。
図１６に示されるように、ＮＧＳ配列決定は、５つ全部のガイドＲＮＡについて肝臓における有意な編集を示した（それぞれについて、少なくとも２０％の編集率）。編集効率は、溶解した細胞のプールに由来するＰＣＲ反応中の配列リードの総数にわたって観察された挿入または欠失の総数を指す。他の組織では、最小レベルまたは統計的に有意でないレベルの遺伝子編集が観察された（データは示さない）。
肝臓酵素ＡＬＴ、ＡＳＴ、トリグリセリド、総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）、およびアルブミンに関する血清化学分析により、様々な処置群間の差がわずかであることが示された（データは示さない）。
等質量の肝臓由来ＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲによって評価することにより、Ｈｓｄ１７ｂ１３発現を評価した。ｑＰＣＲ反応にカウントされないように、ゲノムＤＮＡは分解された。ＲＮＡを逆転写した後、Ｃａｓ９に特異的なアッセイを使用して、Ｃａｓ９転写産物を検出した。それぞれ個々のＨｓｄ１７ｂ１３ガイドＲＮＡは、Ｈｓｄ１７ｂ１３ ｍＲＮＡ発現の少なくとも５０％の除去を示した。図１７Ａを参照されたい。対照的に、非標的ＨＳＤファミリーメンバーの発現においては、有意な減少は観察されなかった。図１７Ｂを参照されたい。

Claims (53)

  1. 細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を改変または変更するための組合せ物であって、
    （ａ）Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸；および
    （ｂ）第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、前記第１のガイドＲＮＡが、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分および第１のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分を含み、前記第１のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成し、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第１のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むかまたはそれに近接する、第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を含み、前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記第１のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子において標的化遺伝子改変を生成するか、または前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記第１のガイドＲＮＡ標的配列に結合し、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を変更し；
    前記組合せ物が、前記細胞に導入され、前記組合せ物が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の機能喪失をもたらす、
    組合せ物。
  2. 前記Ｃａｓ９タンパク質がヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９タンパク質であり、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを有さない、請求項１に記載の組合せ物。
  3. （ａ）前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０～８１および２５９～２６３のいずれか１つを含み、かつ／または
    （ｂ）前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号１４２３～１４８４および１６４３～１６４７のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含み、かつ／または
    （ｃ）前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号５００～５６１、７３０～７９１、９６０～１０２１、１１９０～１２５１、７２０～７２４、９５０～９５４、１１８０～１１８４、および１４１０～１４１４のいずれか１つを含む、
    請求項１または２に記載の組合せ物。
  4. 前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１または２と最適にアラインメントした場合、配列番号１または２のエクソン１に対応する領域内にある、請求項１から３までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  5. 前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の前記開始コドンの１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド内にあるか、または前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の前記開始コドンを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  6. 第２のガイドＲＮＡまたは前記第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡをさらに含み、
    前記第２のガイドＲＮＡが、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分および第２のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分を含み、
    前記第２のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成し、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、かつ
    前記第２のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の開始コドンを含むかまたはそれに近接する、
    請求項１から５までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  7. 前記第２のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の前記開始コドンの１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド内にあるか、または前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の前記開始コドンを含む、請求項６に記載の組合せ物。
  8. 前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の前記開始コドンの破壊をもたらす、請求項１から７までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  9. 第２のガイドＲＮＡまたは前記第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡをさらに含み、
    前記第２のガイドＲＮＡが、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分および第２のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分を含み、
    前記第２のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成し、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、
    前記第２のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の終止コドンを含むかまたはそれに近接する、かつ
    前記細胞が、前記第１のガイドＲＮＡ標的配列と前記第２のガイドＲＮＡ標的配列との間にＨＳＤ１７Ｂ１３コード領域の欠失を含むように改変される、
    請求項１から５までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  10. （ａ）前記第２のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号８８～２２５のいずれか１つを含み、かつ／または
    （ｂ）前記第２のガイドＲＮＡが、配列番号１４８５～１６２８のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含み、かつ／または
    （ｃ）前記第２のガイドＲＮＡが、配列番号５６２～７０５、７９２～９３５、１０２２～１１６５および１２５２～１３９５のいずれか１つを含む、
    請求項９に記載の組合せ物。
  11. 前記第２のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１または２と最適にアラインメントした場合、配列番号１または２のエクソン７に対応する領域内にある、請求項９または１０に記載の組合せ物。
  12. 前記第２のガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の前記終止コドンの１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド内にあるか、または前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の前記終止コドンを含む、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  13. 前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の前記コード配列が欠失される、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  14. 前記標的化遺伝子改変が、非相同末端結合による切断された第１のガイドＲＮＡ標的配列の修復によって生成される、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  15. 前記組合せ物が、発現ベクターと組み合わせて前記細胞に導入されることを特徴とし、前記発現ベクターが、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に挿入されたチミンを含む組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  16. 前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子がヒト遺伝子である、請求項１５に記載の組合せ物。
  17. 前記組換えＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が、前記遺伝子の１つまたは複数の非必須セグメントが対応する野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して欠失しているＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子であり、前記欠失したセグメントが、１つまたは複数のイントロン配列を含み、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３ミニ遺伝子が、配列番号２と最適にアラインメントした場合、配列番号２のイントロン６に対応するイントロンを含む、請求項１５または１６に記載の組合せ物。
  18. 前記組合せ物が、発現ベクターと組み合わせて前記細胞に導入されることを特徴とし、前記発現ベクターが、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする核酸を含み、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質が、配列番号１２（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡ）と同一でない、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  19. 前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする前記核酸が、配列番号７と最適にアラインメントした場合、配列番号７（ＨＳＤ１７Ｂ１３転写産物Ｄ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である、請求項１８に記載の組合せ物。
  20. 前記組合せ物が、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片と組み合わせて前記細胞に導入されることを特徴とし、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質またはその断片が、配列番号１５（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＤ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であり、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質が、配列番号１２（ＨＳＤ１７Ｂ１３アイソフォームＡ）と同一でない、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  21. 前記組合せ物が、外因性ドナー配列と組み合わせて前記細胞に導入されることを特徴とし、前記外因性ドナー配列を、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座と組換えて、標的化遺伝子改変を生じさせる、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  22. 前記外因性ドナー配列による前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の修復が、非相同末端結合媒介性挿入を介して生じる、請求項２１に記載の組合せ物。
  23. 前記外因性ドナー配列による前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の修復が、相同組換え修復を介して生じる、請求項２１に記載の組合せ物。
  24. 前記外因性ドナー配列が、配列番号２の１２６６６位に対応する位置の５’側の標的配列とハイブリダイズする５’相同アーム、および配列番号２の１２６６６位に対応する位置の３’側の標的配列とハイブリダイズする３’相同アームを含み、前記外因性ドナー配列が、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられる、請求項２３に記載の組合せ物。
  25. 前記外因性ドナー配列が、５’相同アームと３’相同アームに挟まれた核酸挿入物をさらに含む、請求項２４に記載の組合せ物。
  26. 前記核酸挿入物がチミンを含み、前記外因性ドナー配列がＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子と組換えられると、前記ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を配列番号１と最適にアラインメントした場合、配列番号１の１２６６５位に対応するヌクレオチドと１２６６６位に対応するヌクレオチドとの間に前記チミンが挿入される、請求項２５に記載の組合せ物。
  27. 前記外因性ドナー配列が、５０ヌクレオチド～１ｋｂの長さである、請求項２１から２６までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  28. 前記外因性ドナー配列が、８０ヌクレオチド～２００ヌクレオチドの長さである、請求項２７に記載の組合せ物。
  29. 前記外因性ドナー配列が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、請求項２１から２８までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  30. 前記第１のガイドＲＮＡが、前記第１のｃｒＲＮＡ部分が前記第１のｔｒａｃｒＲＮＡ部分に連結している単一分子ガイドＲＮＡである、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  31. 前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号１４２０、２５６、２５７または２５８に記載の配列を含む、請求項３０に記載の組合せ物。
  32. 前記第１のｃｒＲＮＡ部分および前記第１のｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、別々のＲＮＡ分子である、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  33. 前記第１のｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１４２１に記載の配列を含み、かつ／または前記第１のｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１４２２に記載の配列を含む、請求項３２に記載の組合せ物。
  34. 前記第１のガイドＲＮＡが、改変または制御された安定性をもたらす改変を含む、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  35. 前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記核酸を含み、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記核酸がＤＮＡを含む、請求項１から３４までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  36. 前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記核酸を含み、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記核酸がＲＮＡを含む、請求項１から３４までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  37. ＲＮＡの形態で前記第１のガイドＲＮＡを含む、請求項１から３６までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  38. 前記第１のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む、請求項１から３６までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  39. 脂質ナノ粒子中にある、請求項１から３８までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  40. アデノ随伴ウイルスベクター中にある、請求項１から３９までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  41. 前記細胞が、マウス細胞、ラット細胞またはヒト細胞である、請求項１から４０までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  42. 前記細胞が、ヒト肝臓細胞、マウス肝臓細胞、ラット肝臓細胞、マウス多能性細胞またはラット多能性細胞である、請求項４１に記載の組合せ物。
  43. 前記細胞がヒト肝臓細胞である、請求項４２に記載の組合せ物。
  44. 前記細胞がヒト細胞であり、
    （ａ）前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０～８１のいずれか１つを含み、かつ／または
    （ｂ）前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号１４２３～１４８４のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含み、かつ／または
    （ｃ）前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号５００～５６１、７３０～７９１、９６０～１０２１および１１９０～１２５１のいずれか１つを含む、
    請求項１から４３までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  45. （ａ）前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０～４１のいずれか１つ、配列番号２１～２３、３３および３５のいずれか１つ、または配列番号３３および３５のいずれか１つを含み、かつ／または
    （ｂ）前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号１４４７～１４６８のいずれか１つ、配列番号１４４８～１４５０、１４６０および１４６２のいずれか１つ、または配列番号１４６０および１４６２のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含み、かつ／または
    （ｃ）前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号５２４～５４５、７５４～７７５、９８４～１００５および１２１４～１２３５のいずれか１つ、配列番号２９５～２９７、５２５～５２７、７５５～７５７、９８５～９８７、１２１５～１２１７、３０７、３０９、５３７、５３９、７６７、７６９、９９７、９９９、１２２７および１２２９のいずれか１つ、または配列番号３０７、３０９、５３７、５３９、７６７、７６９、９９７、９９９、１２２７および１２２９のいずれか１つを含む、
    請求項４４に記載の組合せ物。
  46. 前記細胞がマウス細胞であり、
    （ａ）前記第１のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２５９～２６３のいずれか１つを含み、かつ／または
    （ｂ）前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号１６４３～１６４７のいずれか１つを含むＤＮＡ標的化セグメントを含み、かつ／または
    （ｃ）前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号７２０～７２４、９５０～９５４、１１８０～１１８４および１４１０～１４１４のいずれか１つを含む、
    請求項１から４２までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  47. 前記細胞がｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏである、請求項１から４６までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  48. 前記細胞がｉｎ ｖｉｖｏである、請求項４７に記載の組合せ物。
  49. 前記細胞が肝臓細胞であり、前記組合せ物がｉｎ ｖｉｖｏで肝臓に導入される、請求項４８に記載の組合せ物。
  50. 前記細胞が、慢性肝疾患を有するか、またはそのリスクがある対象における肝臓細胞であり、前記組合せ物が、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を改変または変更することにより前記対象を治療するためのものである、請求項１から４９までのいずれか一項に記載の組合せ物。
  51. 前記慢性肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変、または肝細胞癌である、請求項５０に記載の組合せ物。
  52. 前記対象が、脂肪性肝炎、線維症、肝硬変および／または肝細胞癌を有するか、またはそのリスクがある、請求項５０または５１に記載の組合せ物。
  53. 前記対象がヒト対象である、請求項５０から５２までのいずれか一項に記載の組合せ物。
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