JP2000506384A

JP2000506384A - ＲＮａｓｅＬアクチベーター及びＲＳＶ感染の治療に有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JP2000506384A
Application number: JP9529569A
Authority: JP
Inventors: トレンス，ポール，エフ．; シルバーマン，ロバート，エイチ．; シリノ，ニック，エム．; リー，クイイン; シャオ，ウェイ
Original assignee: National Institutes of Health NIH
Current assignee: National Institutes of Health NIH
Priority date: 1996-02-15
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2000-05-30
Also published as: AU708535B2; CN1215994A; EP1007655A4; AU2129897A; EP1007655A1; US5998602A; CA2246503A1; WO1997029757A1

Abstract

(57)【要約】本発明は呼吸器合胞体ウイルスの感染を治療するための化合物及び方法に関する。この化合物は、RSVアンチゲノム鎖（mＲＮＡ鎖）の通常は一本鎖である部分に相補的なアンチセンス部分、リンカー及び遍在性非特異的RNaseであるＲＮＡ分解酵素Ｌのオリゴヌクレオチドアクチベーターを含む。この方法は、活性化されたＲＮＡ分解酵素Ｌとアンチセンス分子との複合体を形成することを包含する。本出願は、RSVアンチゲノム鎖のどの部分が通常は一本鎖であるのかを決定する方法を教示する。本出願は、RSVゲノムの残基8281−8299の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが本発明の実施に特に有用であり、かつ従来の選り抜きの薬物であるリバビリンで得るられる結果より優れたin vitroでの結果を提供することを教示する。

Description

【発明の詳細な説明】 RNase L アクチベーター及びRSV感染の治療に有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド本出願は、1996年２月15日に出願された米国仮出願60／011,725号の利益を請求する。 1．発明の分野本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスである呼吸器合胞体ウイルス（Respirat ory Syneytial Virus）に感染したヒトの治療に有用な化合物、及びそれらの使用方法に関する。特には、本発明は、RSVのアンチゲノム鎖のある部分に相補的であるオリゴヌクレオチドと共有結合的に連結するRNase Lのアクチベーターとの複合体（以下、“アクチベーター−アンチセンス複合体”）に関する。より具体的には、本発明は、通常は自己ハイブリダイズ性二次構造を持たないRSVアンチゲノム鎖の一部に結合するようにオリゴヌクレオチドが選択されるアクチベーターアンチセンス複合体に関する。 2．発明の背景呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、Paramyxoviridae属Pneumovirus亜科の非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、全世界で毎年100万人を超える死者を出しているである蔓延したヒト病原体である（McIntosh及びChanock 1990）。重い症例の大部分は発展途上国の子供であるが、米国においては毎年300,000件の入院事例が存在するものと見積もられている（Zisson，1993）。また、呼吸器ウイルス感染によって引き起こされる肺炎による子供の死亡のうち、62％が RSVによるものであると考えられる（Heilman，1994）。RSVに対する唯一の認められている治療はエアロゾル化したリバビリン（１−b−D−リボフラノシル−1,2，3− トリアゾール−3−カルボキサミド）である。リバビリンは吸入されるエアロゾルとして投与される。リバビリン治療には、臨床使用における最小効力、患者の周囲にテントが必要であること、換気装置を詰まらせる可能性、及び動物モデルにおける催奇形性（Heilman，1994）を含む幾つかの制限、ならびにかなりの副作用を有し、かつコストが高い。 RSVはマクロファージ及び上皮系統を含む幾つかの肺胞細胞型において複製する（Panuskaら，1992、Midullaら，1993）。したがって、リバビリンはエアロゾルの吸入によりRSVに感染した個体に投与される。Taberら，1983，Pediatrics 7 2:613-18;Hallら，1983,N．Eng．J．Med．308:1443-7；Englundら，1994，J．Pe diatrics 125:635-41。アクチベーター−アンチセンス複合体（そこでは“2−5A：AS”と呼ばれる）は先に記載されている（Torrenceら，1993、TorrenceらによるWO94／09129号）。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、例えば、HIVの複製の阻害（Zamecnikら，1986；Goodchildら，1988；Letsingerら，1989；Balottaら，1993を参照）、R SV感染の阻害（KilkuskieらによるWO95／22553号）に抗ウイルス剤として用いられてはいるが、アクチベーター−アンチヤンス複合体を抗ウイルス治療としてうまく用いた例は報告されていない。生理学的には、RNase Lは高等脊椎動物の細胞における制限的ウイルス複製においてインターフェロン系の一部として機能する（Silverman，1994に概説されている）。細胞のインターフェロン処置は、ATPから5’−ミリン酸化2’，5’− 結合オリゴアデニレート（2’，5’A）を生じる二本鎖ＲＮＡ（dsＲＮＡ）依存性酵素である2−5Aシンセターゼをコードする遺伝子を活性化する。この2’，5 ’ＡはRNase Lに結合してそれを活性化し、その結果細胞性及びウイルス性ＲＮＡの一般的な開裂を生じ；それにより特定のピコルナウイルスの複製を制限する（Chebathら，1987；Rysieckiら，1989；及びHasselら，1994）。 RNase Lはウイルス性ＲＮＡの開裂に特異的ではない。例えば、インターフェロン処理された脳心筋炎ウイルス感染細胞において、RNase LはリボソームＲＮＡの分解を生じる（Wreschnerら，1981）。アクチベーター−アンチセンスアプローチにより、RNase Lは非特異的ヌクレアーゼからmＲＮＡ標的を選択的に開裂する非常に特異的なエンドリボヌクレアーゼに変換される。これはDaudi細胞、ヒトリンパ芽球状細胞系に由来する無細胞系において実証されており、そこでは改変HIV-1 vif mＲＮＡがアクチベーター−アンチセンス複合体による開裂の標的とされた（Torrenceら，1993）。続いて、精製ＲＮＡSELが、アクチベーター −アンチセンス複合体により、非標的mＲＮＡの存在下においてタンパク質キナーゼPKRをコードするmＲＮＡ標的を選択的に開裂するのに向けられている（Mara nら，1994）。さらに、HeLa細胞において、PKR mＲＮＡ内の配列に向けられたアクチベーター−アンチセンス複合体を用いることによりPKR mＲＮＡ及び酵素活性の消失が生じ（Maranら，1994）、その結果転写因子NF−kBのdsＲＮＡ媒介活性が消失した。より最近では、アクチベーター−アンチセンス複合体によるRNas e Lの活性化によりPKR mＲＮＡの酵素的分解（約７秒^-1のK_CAL）が生じることが示された（Maitraら，1995）。 3．発明の概要本発明は、RSVによる感染の治療に有用な複合体を提供する。この複合体の必須成分は、RSVの株のアンチゲノムＲＮＡ鎖、すなわちゲノム合成の鋳型鎖、の約10〜約30ヌクレオチドの間に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びRNaseのアクチベーターである（以下、“アクチベーター−アンチセンス複合体”）。アクチベーター−アンチセンス複合体のエレメントは、好ましくは、リンカーによって共有結合的に連結する。別の態様においては、本発明は、１つもしくは２つの活性化されたRNase L分子と、RSVのアンチゲノムＲＮＡ鎖の約10〜30ヌクレオチドに相補的な少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドとを含む非共有結合的に連結する複合体（以下、“酵素−アンチセンス複合体”）からなる。さらに別の態様においては、本発明は、少なくとも10−30ヌクレオチド、好ましくは15−25ヌクレオチド、より好ましくは18もしくは19ヌクレオチドの配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる。本発明のアクチベーター−アンチセンス複合体は、坦体又は透過剤を用いることなく、細胞膜を横切って移送される。このアクチベーター−アンチセンス複合体が一度内部移行すると、酵素−アンチセンス複合体の形成が起こり、これがアンチセンス標的ＲＮＡの破壊を生じる。RSV感染を治療するため、このアンチセンス複合体を、リバビリンの投与に用いられるものと同じ方法であるエアロゾルの吸引により投与することができる。したがって、リバビリン及び本発明のアンチセンス複合体は通常の医薬組成物において投与することが可能である。 4．図面の簡単な説明図１：1−1：10。呼吸器合胞体ウイルスA2株の配列。位置は5’→3’方向に番号がふられている。図2A−3H：3。RSVアンチゲノムＲＮＡの一部の二次構造のMFOLD計算の曲線プロット出力。位置は5’→3’順に番号がふられている。図2A。RSVアンチゲノムＲＮＡの残基7900−8800の曲線プロット。図2B：1−2B：3。RSVアンチゲノムＲＮＡの残基1−1124の３つの別の曲線プロット。図2C：1−2C：3。RSVの残基1100 −2400の３つの別の曲線プロット。図2D：1−2D：3。RSVアンチゲノムＲＮＡの残基2200−3300の３つの別の曲線プロット。図2E：1−2E：2。RSVアンチゲノムＲＮＡの残基3100−4300の３つの別の曲線プロット。図2F：1−2F：3。RSVの残基4200−5599の３つの別の曲線プロット。図2G：1−2G：3。RSVアンチゲノムＲＮＡの残基5600−6999の３つの別の曲線プロット。図2H：1−2H：3。RSVアンチゲノムＲＮＡの残基6600−7999の３つの別の曲線プロット。図3。spA₄−抗RSV3’−3’T／（8281−8299）とspA₂−抗RSV3’−3’T／（828 1−8299）との抗−RSV活性の比較。 5．発明の詳細な説明本発明は、その態様の１つにおいて、RNase Lのアクチベーターと、RSVの鋳型ＲＮＡ鎖に結合することが可能であり、及び／又はRSVタンパク質のmＲＮＡに結合することが可能であるオリゴヌクレオチド（“RSVアンチセンスオリゴヌクレオチド”）との共有結合的に連結した複合体からなる。別の態様において、本発明は、活性化されたRNase LとRSVアンチセンスオリゴヌクレオチドとの非共有結合的に連結した複合体からなる。好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常は一本鎖であるRSVアンチゲノムの所定の部分に相補的である。アクチベーターは、リンカーを介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’又は5’末端のいずれかに結合する。態様の１つにおいては、ブロッカーがアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端に結合し、リンカーがアンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端に結合する。別の態様においては、リンカーがアンチセンスオリゴヌクレオチドの3 ’末端に結合し、リンカー及びブロッカーの両者の役割を果たす。アンチセンスオリゴヌクレオチドは約15ないし約20ヌクレオチドの長さであり、好ましくは18 又は19ヌクレオチドの長さである。当業者であれば、高GC含量のオリゴヌクレオチドが低GC含量のものよりも短い可能性があることを理解するであろう。本発明によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的であるRSVの特定の株のアンチゲノムの部分は、そのRSV株の配列及びMFOLDのような二次構造決定アルゴリズムから決定することができる。RSVアンチゲノムの適切な部分は、通常は一本鎖構造であるもの、例えば、ＲＮＡの基部及びループ二次構造のループを形成するものである。 RSVはマイナス鎖ウイルスであるため、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチゲノムＲＮＡだけではなくウイルス性タンパク質の翻訳を指令するmＲＮＡにも相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間ホスホジエステル結合は、相補的ＲＮＡとワトソン−クリック（Watson-Crick）塩基対を形成するのに適合するいかなる結合であってもよい。これらには、非限定的な例として、ホスホジエステル、ホスホロチオジエステル、メチルホスホノジエステル及びメチルホスホノチオジエステルが含まれ、これらは投与後の分解に対する高い耐性をもたらす。アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは2’−デオキシヌクレオチドまたは2’O−メチルヌクレオチドであり得る。 5．1．アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列の決定 RSV A株の配列が図1：1−1：10に5’→3’方向に示されている。本発明をA2株を指向するオリゴヌクレオチドによって例証するが、本発明は既知のゲノム配列を有するRSVの他のいかなる株を用いても実施することができる。RSVアンチゲノムＲＮＡの配列は一般的な技術によりそれらから誘導することができる。RS Vは複数の遺伝子を有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、すなわち、このビリオンはコーディング鎖の相補物を含む。宿主細胞に侵入すると、そのゲノムが転写されてウイルス性タンパク質をコードする様々なmＲＮＡを生じ、また相補的ＲＮＡ全体、RSVアンチゲノムも生じて、そこから子孫ウイルスのゲノム鎖が転写される。本発明によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、アクチベーター−アンチセンス複合体がRSVアンチゲノム又は、その代わりにmＲＮＡに結合し、それによりそれらの触媒的破壊を生じるように選択される。本明細書中で用いられる場合、“アンチゲノム鎖”、“RSVアンチゲノム”及び“RSV mＲＮＡ”という用語は同義語である。したがって、本発明の一態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドがRSVアンチゲノムの一部に相補的であり、かつそれと結合するように、すなわち、アクチベーター−アンチセンス複合体がそのアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的なRSVアンチゲノムの一部を標的として活性化RNase Lを向かわせるように選択される。一本鎖ＲＮＡ分子はそのポリマーが自己ハイブリダイズにより“折り畳み返る（folds back）”領域を有する。これらの自己ハイブリダイズする二重ＲＮＡの領域（“ 基部”）は一本鎖“ループ”及び“バブル”により分離される。このため、RSV アンチゲノムの全ての部分が等しい親和性でアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する結合に感受性であるわけではなく、したがって、RSVアンチゲノムの全ての部分がアクチベーター−アンチセンス複合体の標的として適するわけではない。本発明の目的上、ＲＮＡのどの部分が基部にあり、どれがループ又はバブルにあるのかは、（例えば、インディアナ州ブルーミントンのインディアナ大学生物学部門バイオコンピューティング研究室による）パブリックドメインの“FoldＲＮＡ”又は“MFOLD”のようなコンピュータモデリングプログラムによって決定される。このようなプログラムは全ての可能性のある立体配座を体系的に評価し、熱力学的に最も好ましい、すなわち最低の“自由エネルギー”を有する立体配座を決定する。定型的に、最適立体配座の5％又は10％以内の自由エネルギーを有する立体配座も決定される。最も頻繁には、これらのほぼ最適の立体配座は互いに密接に関連し、例えば、小バブルの位置が１つもしくは２つのヌクレオチドだけ異なることがある。本明細書中で用いられるＲＮＡ鎖は、それが最低自由エネルギー又は最低自由エネルギーに相当する自由エネルギーを有する立体配座の一本鎖である場合に“通常は一本鎖”であると言われる。これらのプログラムによって実施されるアルゴリズムはZukerら，1989，SCIEN CE 244:48に記述されている。Zukerのアルゴリズムによる、ポリヌクレオチドの最低自由エネルギー状態を算出するのに必要な工程の数は、そのポリヌクレオチドの長さの立方に比例する。現時点では、全RSVアンチゲノムの長さ（≒15KB）のポリヌクレオチドの算出は困難であるものの、2KBのポリヌクレオチドの立体配座は日常的に算出することができる。しかしながら、ポリヌクレオチドの分子間ハイブリダイゼーションの速度論のため、ポリヌクレオチドの大きく分離された部分の間でのハイブリダイゼーションに関わる立体配座が実際に生じることは、例えモデリングプログラムがそれらが最低自由エネルギー状態を生じることを示すとしても、ありそうもない。したがって、全RSVアンチゲノムの熱力学的に最も安定な立体配座を算出することによっては実用的な目的は得られない。むしろ、本発明の目的上は、RSVアンチゲノムの立体配座は長さが約1−2KBの断片を用いて算出することができる。RSVアンチゲノムの特定の部分の推定立体配座がモデルとされるヌクレオチド断片の長さ又は境界に依存する場合、長さが１KBを上回るより短い断片のモデリングプログラム、及びその部分がその中央に最も近く位置する断片が“通常に”生じる立体配座であると考えられる。アンチセンスゲノムのどの部分が標的として適しているのかを選択する上で、幾つかの重要な考慮すべき事項がある。 1．RNase Lは一本鎖配列上でのみ活性であり、二本鎖配列上では活性ではないため、選択されたＲＮＡ標的配列の近くに非塩基対形成ヌクレオチド又は塩基対の形成が最小限のヌクレオチドの有意の伸長が存在することが重要である。 2．RNase LはUNp配列の後ろでの開裂を選択するため、開裂が生じ得る一本鎖領域はウリジンを含むことが好ましい。これは、アクチベーター−アンチセンス複合体が他のヌクレオチドを開裂させることができるため、好ましくはあるが本質的ではない。 3．開裂はＲＮＡ標的配列の5’側で生じるため、このようなウリジン含有一本鎖領域は標的配列の5’側にあることが好ましい。 4．アクチベーター−アンチセンス複合体のアンチセンスドメインはＲＮＡ標的配列と二重らせん複合体を形成しなければならないため、そのような標的とされる配列は標的ＲＮＡの一本鎖領域又は一本鎖が優勢である領域に位置することが好ましい。これは、そのような複合体形成が平衡プロセスであり、このプロセスの会合定数の大きさが特定の標的配列内の二次構造の程度及び安定に従って減少することを考慮した結果である。 5．上記（4）に示される理由から、もっともらしく思われるＲＮＡ二次構造の群を作成するのにZukerのMFOLDアルゴリズムが用いられる。このプログラムを用いて、エネルギーがわずかに異なるだけの一組の構造を作成することができる。典型的には、この折り畳みプログラムは0.1Kcal／モルの増分で異なる複数の二次構造を作成し、したがって、それらはエネルギー的に非常に類似する。 6．上記（1−5）を考慮することがＲＮＡ標的における最も好ましい標的配列の探索につながる。この標的は、理想的には、少なくとも16、好ましくは少なくとも21ヌクレオチドのＲＮＡの上流の領域に加えて、アンチセンス結合部位として役立つ配列全体を通して一本鎖であるべきである。このため、理想的な状況においては、好ましい標的部位はアンチセンスドメインの長さ（例えば、18）に加えて16、すなわち、34ヌクレオチドの長さであるべきである。したがって、探索は、潜在的な標的ＲＮＡ内の領域内で、少なくとも34ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも45ヌクレオチドの長さの一本鎖領域についてなされる。 7．アクチベーター−アンチセンス複合体の設計におけるさらなる優先度の１つはアンチセンスオリゴヌクレオチドの組成に関連する。アクチベーター−アンチセンス複合体は触媒的に作動するため、その複合体が標的ＲＮＡ中の相補的配列から解離するのに必要な機構が存在しなければならない。したがって、GC塩基対の割合が大きい二重鎖はdA−rU又はdT−rA対合の割合が大きいものよりも解離が困難であることが予想される。この考慮も好ましい設計上の考慮点である。図2AはmＲＮＡの残基7900−8800、すなわちアンチゲノム鎖のモデリングの結果を示す。また、図2Aは、以下の実施例において試験されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの位置の表示も含む。図2B：1−2H：3は、それぞれ、１ないし7999 、1100ないし2400及び2200ないし3300のRSVアンチゲノム残基セグメントのモデリングの別の結果を示す。事実上等価のエネルギーを有する、各領域の２つもしくは３つの異なるモデルが示される。これらのプロットは、例えば、本発明の好ましい態様が、３つの全てのモデルにおいて一本鎖である残基2490−2530、示されるモデルの少なくとも２つにおいて一本鎖である残基617−663、3212−3247及び5240−5288、並びに３つのモデルの１つにおいて一本鎖である残基718−772を標的とすることを示す。作成されたモデルの群の全てが僅かに1.1Kcal／モルだけ異なり、したがって、モデルの各々がRSVアンチゲノムによって想定され得る立体配座を表すことを忘れてはならない。 5．2 アクチベーターの構造アクチベーターの構造の例は特許公開WO94／09129号の10、45及び46−51頁に記述されており、これは引用することにより本明細書中に組み込まれる。簡単に述べると、このアクチベーターは、2’−5’ホスホジエステル結合によって連結し、遊離5’一、二もしくは三リン酸塩又はチオリン酸塩を有する、少なくとも３つのリボアデニレート残基を含み得る。5’チオリン酸−テトラアデニレートアクチベーター（sp5’A2’（p5’A2’）₃−O−）が好ましいアクチベーターである。他のアクチベーターには、p5’A2’（p5’A2’）₂−O−、sp5’A2’（p5 ’A2’）₂−O−、及びp5’A2’（p5’A2’）₃−O−が含まれる。ホスホジエステルに加えて、アデニンヌクレオチド間のホスホロチオエート及びホスホロジチオエート結合を用いることができる。これらの結合を用いることにより分解を減少させることができるが、活性も減少する。Beigelmann，L.ら， 1995，Nucleic Acid Research 23:3989-94。5’−チオリン酸塩を用いることにより、活性及び安定性が大きく改善される。当業者であれば、そのRNase L アクチベーターとしての活性を変更することなく、他のヌクレオチドを2’−5’ トリ−もしくはテトラ−アデニレートの3’ヒドロキシル又は2’ヒドロキシルに結合させることができることを理解する。したがって、これらの態様も“RNase Lのアクチベーター”という用語の範囲に含まれる。さらに、当業者は、第2のヌクレオチド（5’→3’に数えて）にアデニン以外の塩基、例えばイノシン、を含むオリゴヌクレオチドをも用いることができることを認めるであろう。また、当業者は、RNase Lの非ヌクレオチドアクチベーターを本発明において用いることが可能であり、それがヌクレオチドアクチベーターの等価物であることも認める。ここで用いられる場合、“2−5A”という用語はRNase Lのあらゆるヌクレオチドアクチベーターを指し、“RNase Lのアクチベーター”という用語は2−5Aを含むRNase Lのあらゆるアクチベーターを指す。2’，5’Ａという用語は、特に2’ ，5’連結オリゴアデニレートを指す。 5．3 アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスの技術分野において現在公知の、又は開発されることになるあらゆる構造を有することができる。これらにはホスホジエステル、ホスホロチオジエステル、メチルホスホノジエステル及びメチルホスホノチオジエステルが含まれ、これらは投与後の分解に対する増大した耐性を付与する。アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは2’−デオキシヌクレオチドまたは2’O−メチルヌクレオチドでありうる。修飾及び未修飾オリゴヌクレオチドの調製は当該技術分野において公知である（Agrawalら（1992）Trends Biotechnol．10:152-158；オリゴヌクレオチド及び類似体のためのプロトコル、合成及び特性（Protocols for Oligonucleotides a nd Analogs，Synthesis and Properties(Agrawal編)，Humana Press，トトワ，ニュージャージー(1993)，第20章におけるAgrawalで概説）。例えば、ヌクレオチドは当該技術分野において認められる技術、例えば、ホスホミデート、H−ホスホネート化学、又はメチルホスホミデート化学を用いて共有結合的に連結させることができる（例えば、Uhlmanら（1990）Chem．Rev．90:543-584；Agrawalら（1987）Tetrahedron．Lett．28:(31):3539-3542；Caruthersら（198 7）Meth．Enzymol．154:287-313；米国特許5,149,798号を参照）。オリゴマーホスホロチオエート類似体は、当該分野において公知の方法、例えば、メトキシホスホミデート（例えば、Agrawalら（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）85: 7079-7083を参照）又はH−ホスホネート（例えば、Froehler（1986）Tetrahedro n Lett．27:5575-5578を参照）化学を用いて調製することができる。Bergotら（ J．Chromatog．（1992）559:35-42）に記述される合成方法を用いることもできる。 5．4 リンカーの構造 RNase Lのアクチベーターとアンチセンスオリゴヌクレオチドとを共有結合的に接続し、かつそのアクチベーターがRNaseを活性化するのを妨げないあらゆるリンカーを用いることができる。好ましい態様においては、リンカーは2−5Aアクチベーターの3’もしくは2’末端に結合する。さらに好ましい態様においては、リンカーは2−5Aアクチベーターの3’もしくは2’末端及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの5’もしくは3’末端に接続するビス−1，4−ブタンジオールホスホジエステルからなる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端への結合は合成の便宜のために選択される。当業者であれば、内部2’ヒドロキシル又は塩基対の形成に重要ではないヌクレオチド塩基の部分への結合が本発明の代わりの態様であることを理解する。 5．5 アクチベーター−アンチセンス複合体の使用本発明のアクチベーター−アンチセンス複合体は、そのアクチベーター−アンチセンス複合体を被験者の気管支、気管支梢及び肺胞の上皮に送達するのに有効なあらゆる経路により、RSVに感染する被験者に投与することができる。態様の1 つにおいては、アクチベーター−アンチセンス複合体は、リバビリンの送達について当該技術分野において公知の技術に従い、吸引されるエアロゾルを用いることにより送達される。本発明のさらなる態様においては、リバビリンと本発明のアクチベーター−アンチセンス複合体との混合物を通常の医薬坦体に含めて投与することができる。別の態様においては、アクチベーター−アンチセンス複合体を非経口的に、例えば、静脈内注入により投与することができる。静脈内投与により送達する場合、アクチベーター−アンチセンス複合体の用量は、その血清濃度が以下に説明されるin vitro例において抗ウイルス活性が見られる濃度、例えば、約10μMのspA₄ −抗RSV3’−3’T／（8281−8299）の濃度に近づくように、薬理学者に公知の日常的な方法により決定することができる。エアロゾル投与により送達される場合、その用量は、肺における組織濃度がin vitro例において抗ウイルス活性が見られる濃度に近づくように選択されるべきである。実施例 6．材料及び方法配列の取り決め。RSV文献の実施、RSVゲノム（ビリオンＲＮＡ）の位置１は3 ’末端であり；RSVアンチゲノム（mＲＮＡ）の位置１は5’末端である。したがって、例えば、抗RSV／（8490−8509）とラベルが付されたアンチセンスオリゴヌクレオチドはRSVゲノムの残基8509ないし8490の配列（5’→3’）を有し、RSV アンチゲノムの8490−8509に相補的である。しかしながら、図1：1−1：10のRSV A2株のゲノムの配列は通常の5’から3’の順であることに注意されたい。以下、活性因子が2’，5’Ａであるアクチベーター−アンチセンス複合体を“2−5A アンチセンスキメラ”と呼ぶ。 2−5Aアンチセンスキメラの合成及び生成合成されたオリゴヌクレオチドの構造型この研究のため、以下の包括的オリゴヌクレオチド型を調製した。 I． p5’A2’p（5’A2’p）₃-［O（CH₂）₄Op］2−5’dN3’p（5’dN3’p）ａ5 ’dN II． A2’p（5’A2’p）₃-［O（CH₂）₄Op］₂−5’dN3’p（5’dN3’p）_a5’dNI II． dN3’p(5’dN3’p）_a5’dN IV． p5’A2’p（5’A2’p）₃-［O（CH₂）₄Op］₂−5’dN3’p（5’dN3’p）_m5 ’dN3’p−3’pdN5’ V． sp5’A2’p（5’A2’p）₃−［O（CH₂）₄Op］₂−5’dN3’p（5’dN3’p）_m5 ’dN3’p−3’pdN5’ VI． A2’p（5’A2’p）₃−［O（CH₂）₄Op］₂−5’dN3’p（5’dN3’p）_m5’dN 3’p−3’pdN5’ VII． sp5’A2’p（5’A2’p）₃−［O（CH₂）₄Op］₂−5’dN3’p（5’dN3’p）_m 5’dN VIII． p5’A2’p（5’A2’p）₃−［O（CH₂）₄Op］₂−3’dN5’（p3’dN5’）_m p3’dN 以下の手順は、上記クラスI−VIIIにおける2−5A−アンチセンスキメラオリゴヌクレオチドの合成に用いられたものを説明するものである。一般には、これらはLesiakら，1993で開発された合成方法に従う。用いられる試薬及び薬品 1．以下の固相支持体上で合成を開始させるためのもの： dA−3’−1caa−CPG（500Å） 5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン−3 ’−1caa−CPG dC-3’1caa−CPG（500Å） 5’−O−ジメトキシトリチル−N4−ベンゾイル−2’−デオキシシチジン−3’ −1caa−CPG dG-3’1caa−CPG（500Å） 5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−デオキシグアノシン −3’−1caa−CPG dT−3’−1caa-CPG（500Å） 5’−O−ジメトキシトリチルチミジン−3’−1caa−CPG これらの固相支持体は、通常の3’→5’ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドの合成に用いた。全部が１μmoleサイズであった。これらのDMT保護ヌクレオチドはスクシニル基を介してコントロールド・ポア・ガラス（CPG）に結合されており、長鎖アルキルアミン（1caa）リンカーはアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）（カリフォルニア州フォスターシティ）の市販製品である。これらの支持体は包括的オリゴヌクレオチド型I，II、III、及びVIIの合成において用いた。 dA-5’−1caa−CPG（500Å） 3’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン−5 ’−1caa−CPG dC−5’1caa-CPG（500Å） 3’−O-ジメトキシトリチル−N4−ベンゾイル−2’−デオキシシチジン−5’ −1caa−CPG dG-5’1caa-CPG（500Å） 3’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−デオキシグアノシン −5’−1caa−CPG dT−5’−1caa−CPG（500Å） 3’−O−ジメトキシトリチルチミジン−5’−1caa−CPG これらの固相支持体はグレン・リサーチ（Glen Research）（バージニア州スターリング）から入手し、方向性が逆転した5’→3’ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドの合成に用いた。全ては１μモルのサイズであった。これらの支持体は包括的オリゴヌクレオチド型IV，V、VI、及びVIIの合成に用いた。 2．ＤＮＡアンチセンス鎖の伸長正常な3’→5’ホスホジエステル結合オリゴヌクレオチドのため、合計で500m gの下記ホスホラミダイト（アプライド・バイオシステムズ）の各々を指示される量の無水アセトニトリルに溶解して0.1Mホスホラミダイト溶液を作製した： 5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン−3’ −（2−シアノエチル−N，N−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（5.6mL） 5’−O−ジメトキシトリチル−N4−ベンゾイル−2’−デオキシシチジン−3’（ 2−シアノエチル−N，N−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（5.9mL） 5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−デオキグアノシン−3’ −（2−シアノエチル−N，N−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（5.8mL） 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−デオキシチミジン−3’−（2−シアノエチル−N，N−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（6.6mL）前述のものは包括的オリゴヌクレオチド型I、II、III、V、V、VI、及びVIIの調製において用いた。方向性が逆転した全てのＤＮＡホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドを合成するため、下記ホスホラミダイトをグレン・リサーチ（バージニア州スターリング）から得た。 3’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン−5’ −（2−シアノエチル−N，N−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（5.6mL） 3’−O−ジメトキシトリチル−N4−ベンゾイル−2’−デオキシシチジン−5’（ 2−シアノエチル−N，N−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（5.9mL） 3’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリル−2’−デオキグアノシン−5’ −（2−シアノエチル−N，N−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（5.8mL） 3’−O−ジメトキシトリチル−2’−デオキシチミジン−5’−（2−シアノエチル−N，N−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（6.6mL）上記中間体は包括的オリゴヌクレオチド型VIIIの合成に用いた。 3．キメラドメインを接続するためのリンカーリンカーである（2−シアノエチル−N，N−ジイソプロピル）−［4−0−（4,4 −ジメトキシトリチル）ブチル］ホスホラミダイトを先に記載された手順（Lesi akら，1993）に修飾を加えたものより合成し、100mgのリンカーを1.7mLの無水アセトニトリルに溶解することにより0.1M溶液を作製した。 4．キメラの2’，5’−オリゴアデニレートドメインの合成のためのもの。 5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−3’−O−t−ブチルジメチルシリルアデノシン−2’−N，N−ジイソプロピルシアノエチルホスホラミダイト（ケムジーンズ社（ChemGenes Corp.）、マサチューセッツ州ウォルタム、カタログ番号ANP5681）。500mgのモノマーを5.0mLの無水アセトニトリルに溶解することにより0.1M溶液を作製した。 5．キメラの2’，5’−オリゴアデニレートの5’−末端用のリン酸化試薬。 2−［2−（4，4’−ジメトキシトリチル）エチルスルホニル］エチル−（2− シアノエチル）−（N，N−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト（グレン・リサーチ、バージニア州スターリング、カタログ番号10−1900−90）を無水テトラゾール／アセトニトリル（ABI）中0.2Mの濃度で半自動合成に用いた。 6．他の試薬他のＤＮＡ合成試薬は全てアプライド・バイオシステムズ社から入手したものであり、それらには希釈剤（アセトニトリル）、活性化剤溶液（テトラゾール／アセトニトリル）、キャップ形成溶液（A：無水酢酸溶液及びB：N−メチルイミダゾール溶液）、脱ブロッキング試薬（トクロロ酢酸溶液）、酸化剤（ヨウ素溶液）、及び二硫化テトラエチルチウラム（tetraehylthiuram disulfide）イオウ化試薬が含まれる。テトラヒドロフラン（アルドリッチ（Aldrich）、ウィスコンシン州ミルウォーキー）中のフッ化テトラブチルアンモニウムを、（2’，5’）−オリゴリボアデニレートドメインの3’−ヒドロキシルの保護に用いたt−ブチルジメチルシリル基の脱ブロックに用いた。 7．合成手順 2’，5’−オリゴアデニレート／アンチセンスキメラを改変した自動又は半自動手順により合成した。全ての薬品を、使用前にP₂O₅で真空中において一晩乾燥させた。１μモルデオキシヌクレオシド−1caa−CPGカラムを用いた。コア（2’，5’）−オリゴアデニレート／アンチセンスキメラは完全な2’，5 ’A−アンチセンスキメラから5’−末端一リン酸基を差し引いたものを指し、合成の目的で定義される３つの領域：アンチセンス領域、リンカー領域、及び（2’，5’）−オリゴアデニレート領域を有する。2’，5’A−アンチセンスキメラは表１に掲載される自動法により合成した。 1μモルの規模の標準合成サイクルを用いた。このサイクルを、各々の異なる領域のカップリング時間（モノマーのカップリング）を変更することにより改変した。モノマー／アセトニトリル溶液を、汚染を回避するために二重変更手順により、ＤＮＡ合成機に導入した。各領域を合成した後、アルゴンにより少なくとも３分間カラムを完全に乾燥させ、トリチルモードの合成サイクル及び配列を記述されるオリゴヌクレオチドの次の領域の合成に合わせて編集した。 5’一リン酸基を含まないコア2’，5’A−アンチセンスキメラを調製するため、表１における最終工程を省略した。5’一リン酸で終止するキメラの半自動調製のため、コアオリゴヌクレオチドをトリチル基を付けて合成し、そのカラムを乾燥させてＤＮＡ合成機から取り出した。5’−末端リン酸化を、表２に示される手順に従い、手で行った。切断および脱保護 1. 濃縮水酸化アンモニウム/エタノール（3:1 v/v）を用い、室温で２時間かけてオリゴヌクレオチドをCPG支持体から切断した。 2. 粗オリゴヌクレオチドの水酸化アンモニウム/エタノール溶液を３mLのバイアルに入れて密栓した。この溶液を55℃で８時間インキュベーションして塩基の保護基を外した。 3. 得られたオリゴヌクレオチドの水酸化アンモニウム/エタノール溶液をガラス管に移して氷浴で完全に冷却した。次いでこの溶液をspeedvac濃縮器中で蒸発乾固して、フッ化テトラブチルアンモニウム（2mL、1.0M）のTHF溶液を加え、全混合物を少なくとも１分間ボルテックスした。この反応混合物を室温で少なくとも10時間インキュベーションした。等量の0.1 M TEAA（酢酸テトラエチルアンモニウム）緩衝液（pH7.0）を加えて混合し、半量になるまで蒸発させてTHFを除く。残渣をHPLCにより精製した。オリゴヌクレオチドの精製 1. ポリスチレン逆相イオン対クロマトグラフィ（PRP-IPC）法（Swiderski， et al.，1994の変法）オリゴヌクレオチドを約4〜5mLの水に溶解して澄明な溶液を作る（必要なら遠心分離を行う）。得られた澄明な溶液を直接 PRP-1 HPLCカラム（300ｘ７mm）に注入した。こうして反応混合物の脱塩および精製を同時におこなった。溶媒Ａ:10mM燐酸テトラブチルアンモニウム（TBAP）、水中でpH 7.5 溶媒Ｂ:10mM TBAP、アセトニトリル/水(8:2v/v)中でpH7.5 溶媒Ａ中溶媒Ｂの5〜90%中凸型勾配（convex gradient）を用い、 1.5 mL/min の流量で、試料を溶出した。所望のオリゴを含むフラクションをプールし、約1〜2mLになるまで蒸発させた。以下の方法によって、オリゴ-TBAイオン対をそのナトリウム塩に変換した。ダウエックス(Dowex)50Wイオン交換湿潤樹脂（Na⁺型）１mLをオリゴヌクレオチド水溶液に添加した。得られた溶液を冷室で少なくとも30分間攪拌した。溶液をポリプレプ(Poly-Prep)クロマトグラフィのカラム（Bio-Rad，Cat．#731-1550 ）に通して樹脂を除いた。オリゴヌクレオチドが樹脂に残らなくなるまで、該樹脂を過剰の水で洗浄した。あるいは、ダウエックスで処理する前に、オリゴヌクレオチドを以下の手順に従って、C-18 Sep-Pakカートリッジに通した。 a. 上記C-18カートリッジを10mLのメタノールおよび10mLの水で予備洗浄した。 b. オリゴ溶液をカートリッジに入れた。 c. カートリッジを水20mLで洗浄してカラムから塩を除いた。 d. オリゴヌクレオチドを50%メタノール水10mLで溶出した。 e. 脱塩したオリゴヌクレオチドは、紫外分光光度計により検出し、オリゴヌクレオチド含有フラクシヨンを合わせて濃縮した。（2',5'）−オリゴアデニル酸/アンチセンスキメラ類の透析 HPLCおよびイオン交換による精製後、オリゴヌクレオチド（ナトリウム塩）を透析して小さな分子および過剰の塩を除いた。透析は4℃で行った。該オリゴヌクレオチドを、初めは0.02MのNaClに対して4〜6時間、次いで水に対して48時間透析した。HPLCによる精製後、オリゴヌクレオチドをC-18Sep-Pakカートリッジで脱塩すれば、透析時間は6〜10時間にまで短縮することができる。オリゴアデニル酸/アンチセンスキメラ類の後処理透析後、上記オリゴヌクレオチドは0.22μのmillex-GVフィルターユニット（M i11ipore，Cat．No．SLGVO25LS）に通して安定化する。得られた溶液は、紫外/ 可視光分光光度計を用いて、O.D.（光学濃度）A260として定量した。（2',5'）−オリゴアデニル酸/アンチセンスキメラ類のヌクレオチド組成分析 1. ヌクレオチド組成分析キメラオリゴヌクレオチドのヌクレオチド組成は、蛇毒ホスホジエステラーゼ（Crotallus durissus）（Pharmacia，cat#27，0821-01）の酵素分解によって分析した。精製したオリゴヌクレオチド（0.2 A260 O.D.U.）は50mMトリス/塩酸、pH8.0 、0.5mM塩化マグネシウム、pH8.0中で蛇毒ホスホジエステラーゼ（0.15単位）とインキュベーションする。100μLの混合物を37℃で少なくとも３時間インキュベーションした。オリゴヌクレオチド構造タイプIV（セクション6）のような3'-3' -dNを含むキメラオリゴヌクレオチドの場合、インキュベーション時間は10時間に延長した。消化後、溶液をMicrocon-10（Amicon社、製品番号42406）で処理した。100 μLの試料溶液を添加する前に、まず水でMicrocon-10を遠心濯ぎする。遠心時間は通常45分であった。得られた澄明な溶液をHPLC分析に使用した。ベックマンのUltrasphere C-18 ODSカラム（0.46x25cm）を使用する逆相HPLC によって、加水分解物のアリコート（5〜10μL）を分析した。分解生成物の分離は以下の条件で行った。2%B液で20分間一定に、直線濃度勾配2〜50%B液で15分間、そして10分間一定に保った。その際の溶媒Ａは100mM燐酸アンモニウム、pH5.5 であり、溶媒Ｂはメタノール/水（1:1 v/v）である。流速は0.5mL/分であった。標準マーカーであるdCMP、TMP、dGMP、AMPおよびdAMP（AldrichChem．社）を使用して加水分解生成物の保持時間および溶出順序を比較した。オリゴヌクレオチドの酵素的加水分解によって得られたピークは、典型的に、9.7分（dCMP）、27. 3分（TMP）、29.6分（dGMP）、31.7分（AMP）、39.5分（Alinker)および41.2分（dAMP）の保持時間を示した。保持時間は、カラム、移動相のpH値およびカラムの平衡時間によって変える。積分されたピーク面積は、各ヌクレオチドの相対的容量を与える。100mM燐酸アンモニウム、pH5.5中260nmで測定した吸光係数、761 0（dCMP）、8158（TMP）、9969（dGMP）、12342（AMPおよびAlinker）および143 61（dAMP）を分析に使用した。オリゴヌクレオチドの純度確認（2',5'）−オリゴアデニル酸/アンチセンスキメラ類の純度を、HPLCまたはゲル毛細管電気泳動（GCE）でチェックした。純度は、260nmで検出されたピーク面積の積分によって得られた。 1. ゲル毛細管電気泳動（GCE）法オリゴヌクレオチド純度の測定は、MICRO-GEL 100（Applied Biosystems Inc. ）ゲルを詰めた毛細管（内径50μM、有効長さ27cm、流す緩衝液、75mMトリス燐酸（pH7.6）、10%メタノール）を使用するアプライド・バイオシステムズの270A -HT毛細管電気泳動機器で行われた。検出は260nmにおいて行った。以下の条件で、（2',5'）−オリゴアデニル酸/アンチセンスキメラ類の典型的な電気泳動像が得られた。試料濃度は約0.1 O.D./mL、電動注入(electrokinetci njection)は-5kvにおいて2sであった。電圧は-14mA（19mA）で、操作温度は30℃ であった。この条件下、（2',5'）-オリゴアデニル酸/アンチセンスキメラは、そのコア類縁体よりも約１分早い溶出時間を示した。 2. ダイオネックス（Dionex）PA-100イオン交換HPLC法オリゴヌクレオチドの純度は、ダイオネックス・イオン交換HPLCによっても測定することができた。通常、ダイオネックスPA-100イオン交換カラムは、（2',5 '）-オリゴアデニル酸/アンチセンスキメラを分析するその他のHPLCクロマトグラフィ法に比べ、より高い分解能とより良好なピーク形を与えることができた。（2',5'）-オリゴアデニル酸/アンチセンスキメラの典型的なクロマトグラムは以下の条件で得られた。ダイオネックスPA-100（４ｘ250mm）カラム（Dionex ，cat#43010）。溶媒Ａは、25mMトリス/HClおよび0.5%アセトニトリル（pH7.0）、溶媒Ｂは25mMトリス/HCl、0.5%アセトニトリルおよび１Ｍ塩化アンモニウム（ pH7.0）であった。流速１mL/minで、30分間はＡ中10〜70%Ｂの直線濃度勾配で溶出し、10分間は一定に保った。検出は260nmで行った。細胞培養、RSV増殖および感染ならびにウイルスカ価のアッセイ 10%（v/v）胎児ウシ血清（FBS）、2mM L-グルタミン、1X最小必須培地（MEM）アミノ酸溶液、1X MEM非必須アミノ酸溶液、100U/mlのぺニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび0.25μg/mlのアンフォテリシンＢ（試薬はすべてGibc o BRL，Bethesda，MD）を補充したMEM（培養培地）で、ヒト気管表皮細胞株9HTE （Gruenert et al.，1988）およびCV-1細胞（ATCC，Rockville，MD．CCI#70）RS V感染に対する感受性が高いミドリザル腎臓細胞株を培養した。CV-1細胞中でRSV 株A₂（ATCCNo．VR1302）を増殖させた。CV-1単層を感染多重度（M.O.I.）0.2で感染させ、5%CO₂および95%O₂下37℃で、2%のFBS、IXのペニシリン/ストレプトマイシン（PS）を含有するMEM中46時間培養した。次いで細胞をMEMで２回洗浄した後、2%のFBS、1XのPS、50mMのHEPES（pH7.5）および100mM Mg(SO₄)₂を含有するM EMで覆った。２時間37℃に保った後、細胞を掻き取って前記のように（Panuska et al.，1995）音波処理した。音波処理した細胞のアリコート（各１ml）を20分以内にエタノール/ドライアイスで瞬間冷凍した。次いでその内のアリコート数個を解凍し、前記したように（Cirinoet al. ，1993）CV-１細胞でプラークアッセイにより力価の定量を行った。この方法で得られたウイルスのレンジは、2〜7x10⁶プラーク形成単位（pfu）/mlであった。 RSV感染前および感染後の、オリゴヌクレオチド、インターフェロンαおよびリバビリンによる9HTE細胞の処理 9HTE細胞の感染は、前記したとおりに（Merolla et al.，1994）行った。簡単に説明すると、コンフルエントな単層を、2%FBS含有MEMで希釈したRSVに、5%CO₂ および95%O₂下37℃で２時間曝露した。曝露後、細胞を無血清MEM培地で２回洗浄し、次いで新鮮培養培地（10％FBS含有）を加えた。オリゴヌクレオチドを、感染４時間前（t_-4）に添加するか、または、感染直後（t₊₂）およびt₊₁₄、さらに t₊₂₆後に添加した。感染36時間後、プラークアッセイをするため細胞を集めて、前記したように（Cirino et al.，1993）ウイルスの力価を定量した。細胞を２回洗浄して残留しているアンチセンスを除いた後、2%FBSおよび 1X PS含有MEM中に掻き取った。氷上で9HTE細胞を20秒間音波処理した後、感染ウイルス粒子を定量するため、抽出物をCV-1のコンフルエントな単層に対して連続希釈し継代培養を行った。CV-1を２時間、音波処理した9HTEに曝露した後、MEMで１回洗浄し、2 %FBS、200U/mlのペニシリン、200μg/mlのストレプトマイシン、0.5μg/mlのアンフォテリシンＢおよび0.4%のアガロースを含有するイーグルの最小必須培地（ EMEM、BioWhittaker，Walkersville，MD）でオーバーレイした。５日後、細胞を１時間10%ホルマリンで固定し、アガロースプラグを除いて、10%ホルマリンに溶解した0.2%のクリスタルバイオレットを２分間加えた。次いでCV-1を水洗して過剰の染料を除き、顕微鏡下で融合細胞（プラーク）の数を定量した。いくつかの実験（データ示さず）では、感染後、インターフェロンα（Scheri ng，Intron A，インターフェロンα-2B、10⁵U/ml）またはリバビリン（ICN Ph armaceuticals，Costa Mesa，CA，100μg/ml）も添加した。インターフェロンα は、キメラアンチセンスを加えた時、すなわち、t₊₂、t₊₁₄およびt₊₂₆の段階で、最終濃度が50U/mlとなるように加えた。一方、インビボで40日の半減期をもつリバビリンは、t₊₂の段階だけで最終濃度が10^-13Ｍとなるように加えた。逆転写酵素と組み合わせたボリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）感染8時間後（M.0.I．=10）、メーカー（Tel-Test，Inc．Freindswood，TX）記載通りのRNAzol処理によって、RNAを２ｘ10⁵の9HTE細胞から採取した。8時間後にRNAを単離してRSV複製を一サイクルだけに制限した。単離されたRNA（〜1μ g）を、下記表に挙げた100ピコモルの適当な下流（-）プライマーまたは100ピコモルのランダムヘキサマー（グリセロアルデヒド-３-燐酸デヒドロゲナーゼ用、 GAPDH，mRNAのみ）とインキュベーションする。RNAおよびプライマーは、10分間 70℃に加熱した後、氷上で５分間急激に冷却した。最終反応量30ml中には以下のものを含有する。dNTP各300μM、200U SuperScript逆転写酵素（Gibco BRL，Bet hesda，MD）、50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl,3mM MgCl₂および10mM DTT。逆転写は37℃で１時間進行させた。 PCR反応は、40mM Tris-HCl(pH8.4)、100mM KCl，2mM MgCl₂、dNTP各600μMおよび適当なプライマー対を100pmolesずつ含有する25μｌの低緩衝液を入れた50 μlのHot-Startチューブ（Molecular Bio-Products，San Diego，CA）を用いて行った。 Hot-Start上部緩衝液の25μlは、５U TaqDNAポリメラーゼ（Gibco BRL）およびRT反応によるcDNAの1/10を含有する。92℃で１分間、上記アニーリング温度で 1.5分間、そして72℃で２分間のPCR反応を30サイクル行った。RT/P CR混合物のアリコートを1%アガロース/TBEゲルで分析した。実施例8. 結果 2-5Aアンチセンスは予め感染させたヒト気管表皮細胞におけるRSV複製を阻害する。 RSV複製阻止能力をもつ2-5Aアンチセンスキメラを開発するため、まず、ウイルスRNAポリメラーゼ（RSV L）mRNAのオリゴヌクレオチド結合部位を選択した。この部位はRSV複製に不可欠な小数のメッセージ（a low abundance message）をコードしている。最初に合成し評価したキメラはpA₄-アンチRSV/(8490-8509)であった。キメラオリゴヌクレオチドのアンチセンスドメインの結合部位は、Lタンパク質の翻訳開始コドンをスパンするRSVゲノムのヌクレオチド8490-8509の転写生成物に対する部位であり、また、アンチゲノム鎖（ゲノム産生用鋳型）のヌクレオチド8490-8509に対する部位である。有効な処理として機能させるためには、候補薬剤が診断後のウイルス複製を阻害する能力を持っていなければならない。従って、RSV感染４時間前（感染前/感染後処理）かまたは、感染２時間後（感染後処理）に開始する処理によって、2-5Aアンチセンスキメラの抗RSV効果をヒト気管表皮細胞で測定した。感染後処理では、pA₄-アンチRSV/(8490-8509)を、最終濃度が10μMになるよう、t₊₂、t₊₁₄およびt₊₂₆（数字は感染時t₀に対する時間を表す）の段階で加えた。感染前処理では、pA₄-アンチRSV/(8490-8509)を、最終濃度が10μMになるよう、t₊₂、t₊₁₄およびt₊₂₆段階のほか、さらにt_-4およびt₀段階でも加えた。対照およびオリゴヌクレオチドで処理した9HTE細胞から得られたウイルスは、CV-1細胞に感染させた後ウイルスプラークを数えることによって測定した（材料および方法の項参照）。pA₄-アンチRSV/(8490-8509)による9HTE細胞の感染後処理は、感染前・感染後処理と同程度に有効であることがわかった。両方ともRSV複製を約70％阻害するという結果が得られた。これらの実験に基づき、以下の実験はすべて、感染後処理だけで行われた。さらに、これらの実験は、予防的手段に比べた場合と同じくらい能動的感染の治療にもこれら化合物を適用できる可能性があることを示している。ウイルスのＬポリメラーゼmRNA翻訳開始部位に対する2-5Aアンチセンスおよび対照キメラオリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性最初の一連のオリゴヌクレオチド類は、種々の対照および細胞培養での酵素的減衰に対してキメラを安定化するよう設計された付加的変更を含んでいた（表３）。これらオリゴヌクレオチド類の抗ウイルス効果を比較するため、9HTE細胞を RSVに感染させた後、オリゴヌクレオチドを３種類の濃度（3.3、6.6および9.9μ M）で３回（t₊₂、t₊₁₄およびt₊₂₆時間）処理した。36時間後にウイルスを採取した。A₄-アンチRSV3-3'C/(8490-8509)の5'-燐酸だけがないキメラアンチセンスは、RNase L（Maran et al.，1994）を活性化する能力を欠如しており、これを対照として使用した。この誘導体は、最小の抗RSV活性を示したにすぎない（5'-燐酸誘導体であるpA₄-アンチRSV3'-3'C/(8490-8509)による64.8%の阻害に比べ、9. 9μM/処理における阻害は28.3%）。キメラの3'末端を安定化するため、これらの末端をマスクした。１つの誘導体であるpA₄-3'アンチRSV5'/(8490-8509)では、該キメラの2-5A部分は、オリゴヌクレオチドの5'末端に連結する代わりに、アンチセンスの3'末端に連結させた。このようにして、アンチセンスの3'末端を、リンカー（G.L.，W.X.およびP.F.T.、未発表情報）に付けることにより、エキソヌクレアーゼによる分解から保護する。この類縁体は、試験した最高濃度（9.9μM ）において69%のウイルス産生阻害を示した（表３）。別のキメラであるpA₄-アンチRSV3-3'C/(8490-8509)は、その3'末端のデオキシヌクレオチドが3'-3'ホスホジエステル鎖によって最後から二番目のデオキシヌクレオチドに連結しており、それによって3'エキソヌクレアーゼによる分解（G.L.，W.X.およびP.F.T.、未発表情報）を遅らせている。この化合物は、同じ濃度（38.8%阻害）で試験した、標準未改変キメラpA₄-アンチRSV3'-3'C/(8490-8509)に比べると、6.6μM（64. 3%阻害）において、抗ウイルス活性を1.6倍に高めた。あるいは、5'-チオ燐酸を用いてキメラの2-5Aドメインをホスファターゼに対して安定化した。2-5Aおよび 2-5Aアンチセンスのチオ燐酸化誘導体は、標準の5'-燐酸化2-5Aおよび2-5Aアンチセンスに比べると、RNase Lを完全に活性化できることが既に分かっている（X iao et al.，1994およびMaran et al.，1994）。spA₄-アンチRSV/(8490-8509)は、6.6および9.9μMの処理温度で、それぞれ、ウイルスの増殖を71%および94%阻害することによって、抗RSV効果を実質的に増加した（表３）。実施例9. 標的の選択 RNAの二次構造のコンピューター分析に基づく有効性の高い2-5Aアンチセンスキメラの選択 RSVmRNAの二次構造についてコンピューターで補助する分析を行い、一本鎖領域をオリゴヌクレオチド結合部位として同定した。積み重ねおよびループ不安定化エネルギーの発表値に基づくRNA分子の最小自由エネルギーの二次構造探索プログラムMFOLDを使って、ウイルスのエンベロープ蛋白質をコードするM2遺伝子の3'部分およびＬ遺伝子の5'領域を含む、RSVアンチゲノム鎖である、ヌクレオチド7900〜9079の二次構造をコンピューター予測した。MF0LDは、マイケル・ザカーのプログラムである（Michael Zuker，1989）。ザカーのプログラムで使われたエネルギーは最初にサルサー（Salser，1977）によって記述され、現在はターナーおよびその同僚（Freier et al.，1986）によって定義されている。その分析によれば、8250〜8299の位置に大きなループがあることがわかった。このループは、未知機能の90コドンオープンリーディングフレーム中、主要M2オープンリーディングフレームの下流（3'）に存在する。該ループの配列に相補的な下記３つのキメラ化合物、spA₄-アンチRSV3'-3'A/(8251-8270)、spA₄-アンチRSV3'-3 'T/(8261-8279)およびspA₄-アンチRSV3-3'T/(8281-8299)を合成した。さらに、３個のオリゴヌクレオチドをRNAの他の領域に合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、バルジ（ふくらみ）のある小さいヘアピン構造、すなわち、spA₄-アンチRSV3-3'A/(8530-8547)、spA₄-アンチRSV3'-3'C/(8561-8578）およびspA₄-アンチRSV3-3'G/(8599-8618)をそれぞれ含んでいる。3.3μMの濃度で感染9HTE細胞に加えると、大きいループに関する３個のオリゴヌクレオチドは抗ウイルス活性の最高値を示した（78〜91%阻害）（表４）。これら３個のオリゴヌクレオチドは、前記の2-5Aアンチセンス分子（3.3μMで3〜16.5%の阻害、表３参照）に比べ、非常に実質的な改良された抗RSV活性を示した。最大の抗RSV効果をもつキメラは、spA₄-アンチRSV3'-3'T/(8281-8299)であった。このキメラは、6.6および9.9μMの投与量で、それぞれ、97%および99.6 %のRSV複製阻害を示した。バルジなspA₄-アンチRSV3'-3'A/(8530-8547)をもつRN A領域に関するオリゴヌクレオチドは、3.3μMではほとんど抗ウイルス活性を示さなかった（表４）。ヘアピンの小さいループに関する2-5Aアンチセンス分子である、spA₄-アンチRSV3'-3'C/(8561-8578)およびspA₄-アンチRSV3'-3'G/(8599-8 618)は、3.3μMの濃度で、中程度のRSV複製能威力、すなわち、57%および43%を示した。図３は、spA₄-アンチRSV3'-3'T/(8281-8299)とspA₂-アンチRSV3'-3'T/(8281-8 299)との比較を示す。テトラアデニル酸だけが、RNase Lのアクチベーターであり、従って、spA₂-に連結したオリゴヌクレオチドに比べ、spA₄-に連結したオリゴヌクレオチドのさらに高い効力は、本発明の保護効果におけるRNase活性の役割を確立するものである。実施例10. 結果の生化学分析 RSV感染9HTE細胞の2-5Aアンチセンスキメラ処理後の抗ウイルス活性とRNAレベルとの相関 RSV RNAレベルが抗ウイルス活性と相関しているかどうかを調べるため、spA₄- アンチRSV3'-3'T/(8281-8299)またはspA₄-アンチRSV3'-3'A/(8530-8547)処理および未処理のRSV感染および未感染の9HTE細胞から単離したRNAについて、RT-PCR 分析を行った。RSV（ヌクレオチド7879〜8465）のM2 RNA配列をcDNAに転換してP CRにより増幅した（材料および方法）。RSV感染細胞から得られたM2 RNAは、はっきりと目に見えるRT-PCR DNA生成物を産生した。これに対し、spA₄-アンチRSV 3'-3'T/(8281-8299)処理したRSV感染細胞からは、M2 RNAは検出されなかった。R SV L mRNAおよびアンチゲノムRNAに対するキメラの対応配列、spA₄-アンチRSV3' -3'T/(8530-8547)は、M2 RNAレベルにほとんど影響を与えなかった（17%阻害）。従って、ウイルスM2 RNAレベルは、spA₄-アンチRSV3'-3'T/(8281-8299)処理した9HTE細胞で劇的に減少した。一方、RSV L mRNAに対する相対的に不活性な対照キメラ、spA₄-アンチRSV3'-3'T/(8530-8547)で処理した細胞は、M2 RNAレベルに何らの影響も与えなかった。GAPDH転写生成物のレベルは、これらRNA製剤のすべてに類似していた。特定のRSV mRNA標的のロスを示す以上の結果は、RNase Lの係わり合いと一致する。実施例11. その他のアクチベーター-アンチセンス複合体 RSVアンチゲノム鎖の5'末端の二次構造は、内部部分よりもさらに容易に分解することができる。従って、アンチゲノム鎖の二次構造のモデリングに大きなループがないにも拘わらず、以下のアクチベーター-アンチセンス複合体を使用して本発明を実施することができる。 spA₄-アンチRSV3'-3'T/(1-19): sp5'A2'(p5'A2')₃-[(Bu)p]₂-(5'ttg （配列番号７） tac gca ttt ttt cgc g3'-3't5') spA₄-アンチRSV3'-3'T/(51-69): sp5'A2'(p5'A2')₃-[(Bu)p]₂-(5'gta （配列番号８） ctt atc aaa ttc tta t3'-3't5') RSVゲノムの3'末端には、ヌクレオチド約50個のブロックがある。これは、3' −近位遺伝子の転写生成物をコードする蛋白質には含まれないが、転写されると「リーダーRNA」と呼ばれている小さいRNA種が得られる。該ゲノムの正確な3'末端は、RNA転写機構の入口部位であること、そしてリーダー-鋳型-NP-遺伝子境界においてプリンに富む配列で終結する前記リーダーRNAの合成は、残りのゲノムによる転写酵素の進行に必須の前兆であることが証明されている。さらに、ゲノムの3'末端が複製・転写RNA合成の開始点である以上、この部位は、二種類のRNA 合成間に決定的な切り替えが生じる部位になる。最終的に、RSVゲノムの3'末端は、2-5A-依存RNaseによる分解をより受けやすい、ウリジル酸残基に富むことになる。ゲノム鎖3'末端のこれらの機能は、ゲノム鎖の他の場所に比べ、より簡単に失わせることができる。従って、ゲノム鎖に結合する、以下のアクチベーター- アンチセンス複合体を使用して、本発明を実施することができる。 spA₄-アンチRSVGe3'-3'T/(1-18): sp5'A2'(p5'A2')₃-[(Bu)p]₂-(5'acg （胚列番号９） cga aaa aat gcg tac3'-3't5') spA₄-アンチRSVGe3'T/(84-101): sp5'A2'(p5'A2')₃-[(Bu)p]₂-(5'ctc （配列番号１０） cct tgg tta gag atg3'-3't5') spA₄-アンチRSVGe3'T/(369-386): sp5'A2'(p5'A2')₃-[(Bu)p]₂-(5'gaa （胚列番号１１） atg atg gaa tta aca3'-3't5') 実施例12. spA₄-アンチRSV3'-3'T/(8281-8299)の比較データ spA₄-アンチRSV3'-3'T/(8281-8299)処理および慣用のリバビリン処理の効果は、各成分のRSV阻害濃度および細胞毒性濃度を測定することによって比較することができる。ヒト喉頭癌細胞株HEp-2およびネズミ腎臓細胞株MA-104の培養菌を樹立してM.O.I．=0.005で感染させた。培養物は毎日２回与えた。リバビリンかまたはspA₄-アンチRSV3'-3'T/(8281-8299)いずれかによる処理は、感染と同時に開始し、４日間継続した。次いで処理を止め、５日目の結果を評価する。RSV感染の効果は、（1）EC₅₀、すなわち、感染の観察可能な細胞変性効果が50%減少する濃度として、および（2）EC₉₀、すなわち、ウイルス産生が90%減少する濃度として報告された。細胞毒性濃度IC₅₀は、細胞数の50%減少が起こった濃度として表した。治療効果は、IC₅₀/EC₅₀の比である選択指数（selectivity index；SIと略）で評価する。結果を表５および表６に示す。表５は、HEp-2細胞において、spA₄-アンチRSV3 '-3'T/(8281-8299)が0.3μMのEC₅₀を持っており、リバビリンが4μＭのEC₅₀を持っていることを示す。IC₅₀はそれぞれ、〉10μMおよび41μMであった。従って、 spA₄-アンチRSV3'−3'T/(8281-8299)は、リバビリンよりも３倍高いSIを持っている。表６は、MA-104細胞に関する同様の結果を示す。spA₄-アンチRSV3'-3'T/(8281 -8299)およびリバビリンのSIは、それぞれ、>500および約200であることがわかった。参考文献： Beigelman，L.，Matulic-Adamic，J.，et al.，「2-5Aのホスホロジチオン酸塩アナログの合成と生物活性」、Nucleic Acid Research，23：3989-94 Balotta，C．Lusso，P.，Crowley，R．Gallo，R.C.，Franchini，G．1993．「vp r遺伝子標的アンチセンスホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドは原発性ヒトマクロファージにおけるヒト免疫不全ウイルス１型複製を阻害する」、J．Virology，67:4409-4414 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Claims

【特許請求の範囲】 1． a）第１末端にヒドロキシル部分を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは呼吸器合胞体ウイルスの特定の株のアンチゲノムＲＮＡ鎖の 15ないし 20ヌクレオチドと相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド、 b）該第１末端に結合するリンカー、及び c）該リンカーに結合するRNase Lのオリゴヌクレオチドアクチベーター、から本質的になるポリヌクレオチドを含む組成物。 2．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、通常は一本鎖である前記アンチゲノムＲＮＡ鎖の少なくとも 15 の連続するヌクレオチドに相補的である、請求項１記載の組成物。 3．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、通常は一本鎖である前記アンチゲノムＲＮＡ鎖のある特定領域の一部に相補的であり、該領域が 34 を上回るヌクレオチドを有する、請求項１記載の組成物。 4．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、正常は一本鎖である前記アンチゲノムＲＮＡ鎖のある特定領域の一部分に相補的であり、該領域が 45 を上回るヌクレオチドを有する、請求項１記載の組成物。 5．前記オリゴヌクレオチドアクチベーターがsp5’A2’（p5’A2’）₂−O−、 sp5’A2’（p5’A2’）₃-O−、p5’A2’（p5’A2’）₂-O−、及びp5’A2’（p5 ’A2’）₃-O−からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。 6．前記第１末端が5’末端であり、かつ前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端ヒドロキシルが−p3’N5’ヌクレオチド、p−O−アルキルアミン、p− O−ヒドロキシアルキルアミン、sp−O−アルキルアミン、sp−O−ヒドロキシアルキルアミン、エチル及びメチルからなる群より選択されるブロッカーによってブロックされている、請求項１記載の組成物。 7．前記第１末端が3’末端である、請求項１記載の組成物。 8．前記呼吸器合胞体ウイルス株がA2株であり、かつ前記アンチゲノムの一部が5’→3’方向に番号がふられた残基617−663又は残基718−772である、請求項１記載の組成物。 9．前記呼吸器合胞体ウイルス株がA2株であり、かつ前記アンチゲノムの一部が5’→3’方向に番号がふられた残基2490ないし2530である、請求項１記載の組成物。 10．前記呼吸器合胞体ウイルス株がA2株であり、かつ前記アンチゲノムの一部分が5’→3’方向に番号がふられた残基8251ないし8299である、請求項１記載の組成物。 11．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、5’→3’方向に番号がふられた残基8251−8270、8261−8279及び8281−8299からなる群より選択される、請求項 10記載の組成物。 12．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート、メチルホスホネート及びメチルホスホノチオエートからなる群より選択される１以上のホスホ部分を含む、請求項１記載の組成物。 13．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが１以上の2’O−メチルヌクレオチドを含む、請求項１記載の組成物。 14．有効濃度の請求項１記載のポリヌクレオチド及び薬学的に許容し得る坦体を含む組成物。 15．薬学的に許容し得るエアロゾル化可能な坦体を含む請求項14記載の組成物。 16．呼吸器合胞体ウイルスに感染した被験者において有効量の複合体を形成する工程を包含する治療方法であって、該複合体が、 a）その配列が呼吸器合胞体ウイルスのある特定株のアンチゲノムＲＮＡ鎖の通常は一本鎖である部分の15ないし20ヌクレオチドに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び b）活性化されたRNase L、を含む治療方法。 17．吸器合胞体ウイルスに感染した被験者に有効量の組成物を投与する工程を包含する治療方法であって、該組成物が、 a）第１末端にヒドロキシル基を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは呼吸器合胞体ウイルスの特定株のアンチゲノムＲＮＡ鎖の正常に一本鎖である部分の約15ないし20ヌクレオチドと相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド、 b）該第１末端に結合するリンカー、 c）該リンカーに結合するRNase Lのオリゴヌクレオチドアクチベーター、及び d）薬学的に許容し得るエアロゾル化可能な坦体、から本質的になるポリヌクレオチドを含む方法。 18． 15ないし20個の5’−3’−連結ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む化合物であって、該オリゴヌクレオチドが5’→3’方向に番号がふられたRSV A2株ゲノムの残基617−663、残基718−772、残基2490−2530、残基32 12−3247、残基5240−5288、及び残基8251−8299からなる群より選択されるRSV アンチゲノムＲＮＡ鎖の一部に相補的である化合物。 19．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが18又は19個の5’−3’−連結ヌクレオチドである、請求項18記載の化合物。