JP6025570B2

JP6025570B2 - 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対する最適化されたモノクローナル抗体

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Publication number: JP6025570B2
Application number: JP2012556192A
Authority: JP
Inventors: ワン・ジュオジ; ジュンリアン・パン; ヨアンナ・グルドツィンスカ; クリスチャン・フォツマイアー; ヤン・テベ; イェルク・ビルケンフェルト; ニーナ・ヴォブスト; ジモーネ・ブリュックナー; ズザンネ・シュタイニヒ; ペーター・ショルツ
Original assignee: Bayer Healthcare LLC
Current assignee: Bayer Healthcare LLC
Priority date: 2010-03-01
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2031-03-01
Also published as: WO2011109452A1; NZ702494A; CN102939098A; KR101903931B1; US20120108796A1; PL3345615T3; ME03578B; MY174760A; ECSP19025350A; JP2019089807A; CL2017003218A1; EA032189B1; MX2012010198A; CN102939098B; KR101974980B1; RS59830B1; NZ602115A; US20120329996A1; CU20120126A7; CN105001335B

Description

組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に対する最適化されたモノクローナル抗体
ワン・ジュオジ、ジュンリアン・パン、ヨアンナ・グルドツィンスカ、クリスチャン・フォツマイアー、ヤン・テベ、イェルク・ビルケンフェルト、ニーナ・ヴォブスト、ジモーネ・ブリュックナー、ズザンネ・シュタイニヒ、ペーター・ショルツ。

配列表提出
本出願と関連する配列表をＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子形式において出願し、その全体を出典明示により本明細書に包含させる。

態様の分野
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合する単離されたモノクローナル抗体およびそれらのフラグメントを提供する。

背景
血液凝固は、血液が安定な血餅を形成し、出血を停止させるプロセスである。該プロセスは、血液中に循環している多くのプロ酵素およびプロ補因子（または「凝固因子」）と関連する。これらのプロ酵素およびプロ補因子は、いくつかの経路を介して相互作用し、それらを介して、連続して、または同時にのいずれかで、活性化形態に変換される。最後に、該プロセスは、第Ｖａ因子、イオン化カルシウムおよび血小板の存在下で活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）によるプロトロンビンのトロンビンへの活性化をもたらす。活性化トロンビンは、次に、血小板凝集を誘導し、フィブリノーゲンをフィブリンに変換し、次に活性化第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）により架橋され、血餅を形成する。

第Ｘ因子の活性化を引き起こすプロセスは、２つの別個の経路：接触活性化経路（以前は内因性経路として知られていた）および組織因子経路（以前は外因性経路として知られていた）により行われ得る。凝固カスケードが共通の経路に接続した等しく重要な２つの経路からなると以前に考えられていた。現在、血液凝固の開始のための主要な経路は組織因子経路であることが知られている。

第Ｘ因子は、活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）と一緒に組織因子（ＴＦ）により活性化され得る。第ＶＩＩａ因子およびその必須の補因子であるＴＦの複合体は、凝固カスケードの強力な開始剤である。

凝固の組織因子経路は、組織因子経路インヒビター（「ＴＦＰＩ」）によりネガティブコントロールされる。ＴＦＰＩは、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の天然のＦＸａ−依存性フィードバックインヒビターである。それは、多価Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼインヒビターのメンバーである。生理学的に、ＴＦＰＩは、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に結合し、ヘテロダイマー複合体を形成し、次にＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体と相互作用し、その活性を阻害し、したがって凝固の組織因子経路を停止させる。原則として、ＴＦＰＩ活性のブロックは、ＦＸａおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ活性を回復させ、したがって組織因子経路の作用期間を延長し、血友病ＡおよびＢにおける共通の欠陥であるＦＸａの産生を増幅させることができる。

実際に、いくつかの予備的実験証拠は、ＴＦＰＩに対する抗体によるＴＦＰＩ活性のブロックが長期凝固時間を正常化するか、または出血時間を短縮することが示されている。例えば、Ｎｏｒｄｆａｎｇらは、血友病血漿の長期希釈プロトロンビン時間が、ＴＦＰＩに対する抗体での血漿処置後、正常化されることを示した（Thromb. Haemost., 1991, 66(4): 464-467）。同様に、Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎらは、血友病Ａウサギモデルにおける出血時間が抗−ＴＦＰＩ抗体により有意に短縮されることを示した（Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995, 6: 388-394）。これらの試験は、抗−ＴＦＰＩ抗体によるＴＦＰＩの阻害が血友病ＡまたはＢの処置のために有用であり得ることを示す。ポリクローナル抗−ＴＦＰＩ抗体のみが、これらの試験において使用された。

ハイブリドーマ技術を使用して、組換えヒトＴＦＰＩ（ｒｈＴＦＰＩ）に対するモノクローナル抗体を製造し、同定した。Yangら Chin. Med. J., 1998, 111(8): 718-721参照。希釈プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン（ＡＰＴＴ）におけるモノクローナル抗体の効果を試験した。実験は、抗−ＴＦＰＩモノクローナル抗体が、第ＩＸ因子欠乏血漿の希釈トロンボプラスチン凝固時間を短縮することを示した。組織因子経路が生理学的凝固だけでなく血友病の出血においてもまた重要な役割を果たすことを示唆する（Yangら Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4): 297-300）。

したがって、ＴＦＰＩに対して特異的な抗体は、血液疾患および癌を処置するために必要である。

一般的に、ヒト疾患のための治療抗体は、マウス、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体を創造するために、遺伝子操作を使用して産生されている。マウスモノクローナル抗体は、短い血清半減期、ヒトエフェクター機能を引き起こすことができないこと、およびヒト抗マウス−抗体の生産のため、治療剤として限定された使用であることが示された（Brekke and Sandlie, “Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century,” Nature 2, 53, 52-62, Jan. 2003）。キメラ抗体は、ヒト抗−キメラ抗体応答を引き起こすことが示されている。ヒト化抗体はさらに、抗体のマウス成分を最小限にする。しかしながら、完全ヒト抗体は、マウス成分と関連する免疫原性を完全に回避する。したがって、遺伝的に操作されたモノクローナル抗体の他の形態と関連する免疫原性を回避するような完全ヒト抗体を開発する必要性が存在する。特に、マウス成分またはマウス起源を有する抗体が使用される場合、必要とされる頻繁な投与期間および長期の治療によって、抗−ＴＦＰＩモノクローナル抗体での血友病処置のために必要とされる慢性予防処置は、治療に対する免疫応答の発生の高い危険性を有する。例えば、血友病Ａに対する抗体治療は、患者の生存のために毎週の投与を必要とし得る。これは、免疫系に対する継続的な抗原投与である。したがって、血友病ならびに関連した凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損に対する抗体治療のための完全ヒト抗体の必要性が存在する。

治療抗体は、“Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity,” Nature 256, 495-497 (1975)においてＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより記載されているハイブリドーマ技術を介して作製されている。完全ヒト抗体はまた、組換え的に原核生物および真核生物において作製され得る。ハイブリドーマ生産よりむしろ宿主細胞における抗体の組換え生産が治療抗体のために好ましい。組換え生産は、より良い生産物の一貫性、期待できるより高い生産レベル、および動物由来のタンパク質の存在を最小限にするか、または除去するコントロールされた製造という利点を有する。これらの理由のため、組換え的に生産されたモノクローナル抗−ＴＦＰＩ抗体を有することが望ましい。

加えて、ＴＦＰＩが高親和性で活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に結合するため、有効な抗−ＴＦＰＩ抗体は同程度の親和性を有するべきである。したがって、ＴＦＰＩ／ＦＸａ結合と競合することができる結合親和性を有する抗−ＴＦＰＩ抗体を有することが望ましい。

概要
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に対するモノクローナル抗体を提供する。該抗体をコードする単離された核酸分子をさらに提供する。抗−ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含む医薬組成物ならびに凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損、例えば、血友病ＡおよびＢの処置方法もまた提供する。抗−ＴＦＰＩモノクローナル抗体を必要とする患者に投与することによる出血時間を短縮するための方法もまた提供する。本発明のヒトＴＦＰＩに結合するモノクローナル抗体を生産するための方法もまた提供する。

いくつかの態様において、提供されるＴＦＰＩに対するモノクローナル抗体は、例えば、増加した親和性または増加した機能活性を有するように最適化されている。

図１は、ｄＰＴアッセイを使用してヒト血友病Ａ血漿の凝固時間の短縮におけるさらなる効力を示す、単一のアミノ酸置換を有する選択された２Ａ８変異体を説明する棒グラフを示す。

図２は、抗−第ＶＩＩＩ因子抗体誘導ヒト血友病血液の凝固時間における選択された単一のアミノ酸変異抗−ＴＦＰＩ抗体の効果を示すグラフを示す。

図３は、４Ｂ７−Ｄ６２Ｒが、親４Ｂ７抗体と比較して、ヒト抗体誘導血友病Ａ血液の凝固時間の短縮においてはるかに良い効力を有し、２Ａ８内の単一のアミノ酸置換と比較して、より低い程度を有することを示すグラフを示す。

図４は、コントロールマウスＩｇＧ１（ＣＴＸＩｇＧ１）と比較して、親抗体２Ａ８および複数のアミノ酸置換を有する２Ａ８変異体（Ａ２００）で用量依存的に処置された血友病Ａマウスの生存を示す２つのグラフを示す。

図５は、２Ａ８変異体が用量依存的にヒト血友病Ｃ（ＦＸＩ−欠乏）血漿における凝固を増強し、その効果が組換えＦＶＩＩａに匹敵したことを示すグラフを示す。

詳細な説明
定義
本明細書において使用される「組織因子経路インヒビター」または「ＴＦＰＩ」なる用語は、細胞により天然に発現されるヒトＴＦＰＩのあらゆる変異体、アイソフォームおよび種ホモログを示す。本発明の好ましい態様において、ＴＦＰＩへの本発明の抗体の結合は血液凝固時間を減少させる。

本明細書において使用される「抗体」は、抗体全体およびあらゆる抗原結合フラグメント（すなわち「抗原結合部分」）またはそれらの一本鎖を示す。該用語は、天然であるか、または正常免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換え方法により形成される全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または特異的結合活性を保持する免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗体フラグメントを含む。構造にかかわらず、抗体フラグメントは、全長抗体により認識される抗原と同じ抗原に結合する。例えば、抗−ＴＦＰＩモノクローナル抗体フラグメントは、ＴＦＰＩのエピトープに結合する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより行うことができる。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Wardら (1989) Nature 341:544-546）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびカッパボディ（例えば、Illら Protein Eng 1997;10:949-57参照）；（ｖｉｉｉ）ラクダＩｇＧ；および（ｉｘ）ＩｇＮＡＲを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶ_ＬおよびＶ_Ｈは別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が対になって、一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Birdら (1988) Science 242:423-426;およびHustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照）を形成する単一のタンパク質鎖として作製されるようにすることができる合成リンカーによって結合させることができる。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」なる用語内に含まれることが意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に知られている慣用の技術を使用して得られ、該フラグメントはインタクトな抗体と同じ方法で有用性について分析される。

さらに、抗原結合フラグメントは、抗体模擬物に包含され得ることが考えられる。本明細書において使用される「抗体模擬物」または「模擬物」なる用語は、抗体と同様の結合を示すが、より小さい代替抗体または非抗体タンパク質であるタンパク質を意味する。このような抗体模擬物は、スカフォールドに含まれ得る。「スカフォールド」なる用語は、適合した機能および特性を有する新規産物の操作のためのポリペプチド基本骨格(platform)を示す。

本明細書において使用される「結合の阻害」および「結合のブロック」（例えば、ＴＦＰＩへのＴＦＰＩリガンドの結合の阻害／ブロック）なる用語は、互換的に使用され、部分的および完全阻害またはブロックの両方を含む。阻害およびブロックはまた、抗−ＴＦＰＩ抗体と接触していないＴＦＰＩと比較して、抗−ＴＦＰＩ抗体と接触しているとき、生理学的基質へのＴＦＰＩの結合親和性におけるあらゆる測定可能な減少、例えば、ＴＦＰＩと第Ｘａ因子との相互作用またはＴＦＰＩ−第Ｘａ因子複合体と組織因子、第ＶＩＩａ因子または組織因子／第ＶＩＩａ因子の複合体との相互作用を、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％ブロックすることを含むことを意図する。

本明細書において使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」なる用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有し、単一の結合特異性を示す抗体を示す。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異により導入される変異）を含み得る。

本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すことを意図する（例えば、ＴＦＰＩに結合する単離された抗体は、ＴＦＰＩ以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＴＦＰＩのエピトープ、アイソフォームまたは変異体に結合する単離された抗体は、例えば、他の種由来の他の関連抗原（例えば、ＴＦＰＩ種ホモログ）に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないこともある。

本明細書において使用される「特異的結合」は、予め決定された抗原に対する抗体結合を示す。一般的に、抗体は、少なくとも約１０^５Ｍ^−１の親和性で結合し、予め決定された抗原または密接に関連した抗原以外の不適切な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合に対する親和性よりも、高い、例えば少なくとも２倍高い親和性で予め決定された抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」なるフレーズは、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」なる用語と互換的に使用される。

本明細書において使用されるＩｇＧ抗体に対する「高親和性」なる用語は、少なくとも約１０^７Ｍ^−１、いくつかの態様において、少なくとも約１０^８Ｍ^−１、いくつかの態様において、少なくとも約１０^９Ｍ^−１、１０^１０Ｍ^−１、１０^１１Ｍ^−１またはそれ以上、例えば、最大１０^１３Ｍ^−１またはそれ以上の結合親和性を示す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、少なくとも約１．０×１０^７Ｍ^−１の結合親和性を示す。本明細書において使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を示す。

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、結合される抗原の三次元構造に相補的であるＮ−末端抗原結合表面を形成する抗体分子の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域内の３つの超可変領域の１つを示す。重鎖または軽鎖のＮ−末端から始めて、これらの相補性決定領域はそれぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と示される。ＣＤＲは抗原抗体結合に関与し、ＣＤＲ３は、抗原抗体結合に対して特異的なユニークな領域を含む。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれのＣＤＲ領域を含む６つのＣＤＲを含み得る。

本明細書において使用される「保存的置換」は、ポリペプチドの生物学的または生化学的機能の喪失をもたらさない同様の生化学的特性を有するアミノ酸の１つ以上のアミノ酸での置換を含むポリペプチドの修飾を示す。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。本発明の抗体は、保存的アミノ酸置換を有していてもよく、活性を保持しているものを想定する。

核酸およびポリペプチドにおいて、「実質的な相同性」なる用語は、２つの核酸または２つのポリペプチドまたはそれらの示された配列が、最適にアラインされ比較されたとき、適当なヌクレオチドまたはアミノ酸挿入または欠失を有し、少なくとも約８０％のヌクレオチドまたはアミノ酸、通常少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、さらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％または９９．５％のヌクレオチドまたはアミノ酸で同一であることを示す。あるいは、核酸に対する実質的な相同性は、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体にハイブリダイズするとき存在する。本発明は、本明細書において記載されている特定の核酸配列およびアミノ酸配列と実質的な相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列を含む。

２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数（すなわち、相同性％＝同一の位置の＃／全位置の＃×１００）である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズム、例えば、限定はしないが、ベクターＮＴＩ^ＴＭのＡｌｉｇｎＸ^ＴＭ（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を使用して成し遂げることができる。ＡｌｉｇｎＸ^ＴＭにおいて、複数のアラインメントのデフォルトパラメーターは、：ギャップオープンペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲：８；アラインメントディレイに関する同一性％：４０である。（http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.htmlでさらに詳細に見られる）。

グローバル配列アラインメントとしても示されるクエリー配列（本発明の配列）および対象配列間の最も良い全体の一致を決定するための別の方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓら（Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191）のアルゴリズムに基づくＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Thompsonら Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673-4680）を使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリーおよび対象配列は両方ともＤＮＡ配列である。該グローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。ペアワイズアラインメントを介して同一性パーセントを計算するためにＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは、マトリックス＝ＩＵＢ、ｋ−タプル＝１、トップダイアゴナル数＝５、ギャップペナルティ＝３、ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．１である。多数のアラインメントにおいて、以下のＣＬＵＳＴＡＬＷパラメーターが好ましい：ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲＝８；アラインメントディレイに関する同一性％＝４０。

核酸は、全細胞、細胞溶解物中に存在し得、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態において存在し得る。核酸は、天然環境と通常関連する他の細胞成分から精製されるとき、「単離」または「実質的に純粋」（に）されている。核酸を単離するために、標準技術、例えば以下のものが使用され得る：アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および他の当分野でよく知られているもの。

高親和性および機能活性に関して最適化されたモノクローナル抗体
いくつかの抗−ＴＦＰＩ抗体は、以前の試験において同定されており、２００９年８月４日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５２７０２（全ての目的のために出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。これらの抗−ＴＦＰＩ抗体はさらに、例えば、ＴＦＰＩに対する親和性およびブロッキング活性を改善することにより最適化され得る。このような最適化は、例えば、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＣＤＲに極めて接近した残基、すなわちＣＤＲに隣接した約３または４つの残基の部位飽和変異誘発を利用することにより行うことができる。

ＴＦＰＩに対する増加した、または高い親和性を有するモノクローナル抗体もまた提供する。いくつかの態様において、抗−ＴＦＰＩ抗体は、少なくとも約１０^７Ｍ^−１、いくつかの態様において、少なくとも約１０^８Ｍ^−１、いくつかの態様において、少なくとも約１０^９Ｍ^−１、１０^１０Ｍ^−１、１０^１１Ｍ^−１またはそれ以上、例えば、最大１０^１３Ｍ^−１またはそれ以上の結合親和性を有する。

２Ａ８および４Ｂ７として本明細書において示された２つの抗−ＴＦＰＩ親抗体のＣＤＲ中の、およびＣＤＲに隣接した部位飽和変異誘発を、親和性および機能活性に対して抗体を最適化するために利用した。同じ最適化が以前のＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５２７０２に記載されている任意の抗体において行われ得ることもまた考えられる。

いくつかの態様において、ＣＤＲの部位飽和変異誘発は抗−ＴＦＰＩ抗体について行われ得る。２Ａ８において、配列番号：１において示される重鎖におけるＣＤＲは、残基ＦＴＦＲＳＹＧＭＳ（残基２７から３５）、ＳＩＲＧＳＳＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（残基５０から６６）およびＫＹＲＹＷＦＤＹ（残基９９から１０６）に対応する。配列番号：２において示される２Ａ８軽鎖において、ＣＤＲは、残基ＳＧＤＮＬＲＮＹＹＡＨ（残基２３から３３）、ＹＹＤＮＮＲＰＳ（残基４８から５５）およびＱＳＷＤＤＧＶＰＶ（残基８８から９６）に対応する。４Ｂ７において、配列番号：３において示される重鎖におけるＣＤＲは、残基ＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＳ（残基２７から３７）、ＩＩＹＫＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＫＳ（残基５２から７０）およびＷＨＳＤＫＨＷＧＦＤＹ（残基１０２から１１２）に対応する。配列番号：４において示される４Ｂ７軽鎖において、ＣＤＲは、配列番号：４の残基ＲＳＳＱＳＬＶＦＳＤＧＮＴＹＬＮ（残基２４から３９）、ＫＧＳＮＲＡＳ（残基５５から６１）およびＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（残基９４から１０２）に対応する。修飾は個々に６つのＣＤＲのいずれかに作製されるか、または修飾の組合せで作製され得る。さらに、２つまたはそれ以上の修飾は、単一のＣＤＲにおいて作製され得る。他の態様において、修飾はまた、ＣＤＲに極めて接近して、例えば、それぞれのＣＤＲのいずれかの側の約３または４つの残基に導入され得る。

簡潔には、親抗体２Ａ８および４Ｂ７を最適化するために、例えば、親和性を改善するために単一および／または複数のアミノ酸修飾を導入し、分析した。第１に、単一のアミノ酸修飾をそれぞれの抗体の６つのＣＤＲまたはＣＤＲに隣接した位置に導入し、次にＴＦＰＩ−結合特性の分析を行った。ＴＦＰＩに対する結合シグナルを増加した修飾を、１つまたはそれ以上の他の修飾との組合せのために選択し、結合シグナルのさらなる増加について分析した。それぞれの分析後、選択された抗体変異体を、ＴＦＰＩに対する親和性およびＴＦＰＩ活性をブロックする活性および凝固時間を短縮する活性を測定するために使用した。したがって、いくつかの態様において、修飾されていない親抗体と比較してＴＦＰＩに対する増加した親和性を有するヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体を提供する。さらに、いくつかの態様において、修飾されていない親抗体と比較してＴＦＰＩの増加したブロッキング活性を有するヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、修飾されていない親抗体と比較して短縮された凝固時間を有するヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体を提供する。

いくつかの態様において、さらなるアミノ酸修飾が、生殖細胞系列配列との相違を減少させるために導入された。他の態様において、アミノ酸修飾が、大規模生産方法のための抗体生産を容易にするために導入された。

抗体は種特異的であり得、または多数の種と交差反応し得る。いくつかの態様において、抗体は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ブタ、イヌ、ネコまたは他の哺乳動物種のＴＦＰＩと特異的に反応するか、または交差反応し得る。

抗体は、種々のクラスの抗体のいずれか、例えば、限定はしないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体であり得る。

１つの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに対する単離された完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。

別の態様において、ヒト組織因子経路インヒビターのＫｕｎｉｔｚドメイン２に対する単離された完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。

２Ａ８変異体
したがって、いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号：１において示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み、該アミノ酸配列は１つ以上のアミノ酸修飾を含む抗体を提供する。いくつかの態様において、２Ａ８の重鎖の修飾は置換、挿入または欠失である。

いくつかの態様において、置換は２Ａ８の重鎖のＣＤＲに位置する。他の態様において、置換は２Ａ８の重鎖のＣＤＲの外側に位置する。

いくつかの態様において、２Ａ８の重鎖の置換は、Ｓ３１、Ｇ３３、Ｓ３５、Ｉ５１、Ｓ５４、Ｓ５５、Ｋ９９およびＦ１０４から選択される位置にある。いくつかの態様において、２Ａ８の重鎖の置換はまた、Ｑ１、Ｒ３０、Ｍ３４、Ｓ５０、Ｒ５２およびＳ５６から選択される位置を含み得る。例えば、置換はＱ１Ｅ、Ｒ３０Ｓ、Ｓ３１Ｐ、Ｓ３１Ｖ、Ｇ３３Ａ、Ｇ３３Ｋ、Ｇ３３Ｐ、Ｍ３４Ｉ、Ｍ３４Ｋ、Ｓ３５Ｌ、Ｓ３５Ｄ、Ｓ５０Ａ、Ｉ５１Ｄ、Ｉ５１Ｅ、Ｒ５２Ｓ、Ｓ５４Ｆ、Ｓ５４Ｄ、Ｓ５５Ａ、Ｓ５５Ｇ、Ｓ５５Ｒ、Ｓ５６Ｇ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９ＬおよびＦ１０４Ｙから選択され得る。さらに、いくつかの態様において、抗体はＱ１Ｅ、Ｒ３０Ｓ、Ｓ３１Ｐ、Ｓ３１Ｖ、Ｇ３３Ａ、Ｇ３３Ｋ、Ｇ３３Ｐ、Ｍ３４Ｉ、Ｍ３４Ｋ，Ｓ３５Ｌ、Ｓ３５Ｄ、Ｓ５０Ａ、Ｉ５１Ｄ、Ｉ５１Ｅ、Ｒ５２Ｓ、Ｓ５４Ｆ、Ｓ５４Ｄ、Ｓ５５Ａ、Ｓ５５Ｇ、Ｓ５５Ｒ、Ｓ５６Ｇ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９ＬおよびＦ１０４Ｙから選択される２つ以上の置換を含み得る。

いくつかの態様において、２Ａ８の重鎖は、配列番号：１に対して、Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｖ；Ｇ３３Ｐ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３５Ｌ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｇ３３Ｐ＋Ｓ３５Ｄ；Ｓ３５Ｄ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｋ９９Ｖ；Ｇ３３Ｐ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５４Ｆ；Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３１Ｖ＋Ｇ３３Ｐ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３５Ｄ＋Ｉ５１Ｅ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３１Ｖ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｅ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｄ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ；Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５４Ｆ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｌ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｖ；およびＳ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｌ＋Ｉ５１Ｅ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｖの置換を有する。

いくつかの態様において、２Ａ８の重鎖は、配列番号：１に対して、Ｇ３３Ａ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｇ３３Ｐ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５４Ｆ；Ｇ３３Ｐ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｌ；Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｌ；Ｍ３４Ｉ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｍ３４Ｋ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｑ１Ｅ＋Ｒ３０Ｓ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｇ＋Ｓ５６Ｇ＋Ｋ９９Ｌ；Ｑ１Ｅ＋Ｒ３０Ｓ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｓ５６Ｇ＋Ｋ９９Ｌ；Ｑ１Ｅ＋Ｓ３１Ｖ＋Ｓ５０Ａ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｓ５６Ｇ＋Ｋ９９Ｖ；Ｑ１Ｅ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｒ３０Ｓ＋Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｖ；Ｒ３０Ｓ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３１Ｖ＋Ｇ３３Ａ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｇ３３Ｐ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｇ３３Ｐ＋Ｓ３５Ｄ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｒ５２Ｓ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｓ５６Ｇ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｉ５１Ｅ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｄ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５４Ｆ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｌ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ３５Ｌ＋Ｉ５１Ｅ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ５０Ａ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３１Ｖ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｉ５１Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｖ；Ｓ３５Ｄ＋Ｉ５１Ｅ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｒ５２Ｓ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｒ５２Ｓ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５０Ａ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５０Ａ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｇ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５５Ｒ＋Ｓ５６Ｇ＋Ｋ９９Ｌ；Ｓ３５Ｄ＋Ｓ５６Ｇ＋Ｋ９９Ｌ；およびＳ３５Ｌ＋Ｓ５４Ｆ＋Ｋ９９Ｖの置換を有する。

いくつかの態様において、２Ａ８の重鎖は１つ以上の欠失を有する。いくつかの態様において、欠失は２Ａ８の重鎖のＣＤＲに位置する。他の態様において、欠失は２Ａ８の重鎖のＣＤＲの外側に位置する。いくつかの態様において、例えば、欠失はＩ５１、Ｓ５６およびＳ５７から選択される位置にある。

さらに、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号：２において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、該アミノ酸配列は１つ以上のアミノ酸修飾を含む抗体を提供する。いくつかの態様において、修飾は置換、挿入または欠失である。

いくつかの態様において、置換は２Ａ８の軽鎖のＣＤＲに位置する。他の態様において、置換は２Ａ８の軽鎖のＣＤＲの外側に位置する。

いくつかの態様において、２Ａ８の軽鎖の置換は、Ａ３２、Ｙ４８、Ｎ５１、Ｎ５２、Ｐ５４、Ｄ９１、Ｄ９２およびＶ９６から選択される位置にある。いくつかの態様において、２Ａ８の軽鎖の置換はまた、Ｄ１、Ｉ２、Ａ１３、Ｓ２１、Ｎ２６、Ｒ２８、Ｎ２９、Ｈ３３、Ｙ４９、Ｇ５６、Ｅ８０、Ｓ８９、Ｇ９３、Ｖ９４およびＰ９５から選択される位置を含み得る。例えば、置換はＤ１Ｓ、Ｉ２Ｙ、Ａ１３Ｓ、Ｓ２１Ｔ、Ｎ２６Ａ、Ｒ２８Ｐ、Ｎ２９Ｋ、Ａ３２Ｎ、Ｈ３３Ｙ、Ｙ４８Ｆ、Ｙ４９Ｒ、Ｎ５１Ｓ、Ｎ５１Ｖ、Ｎ５２Ｇ、Ｐ５４Ｌ，Ｇ５６Ｄ、Ｅ８０Ｍ、Ｓ８９Ａ、Ｄ９１Ｌ、Ｄ９１Ｒ、Ｄ９１Ｗ、Ｄ９１Ｋ、Ｄ９２Ｓ、Ｄ９２Ｔ、Ｇ９３Ｓ、Ｖ９４Ｔ、Ｐ９５Ｖ、Ｐ９５Ａ、Ｖ９６Ｇ、Ｖ９６ＭおよびＶ９６Ｗから選択され得る。さらに、いくつかの態様において、抗体はＤ１Ｓ、Ｉ２Ｙ、Ａ１３Ｓ、Ｓ２１Ｔ、Ｎ２６Ａ、Ｒ２８Ｐ、Ｎ２９Ｋ、Ａ３２Ｎ、Ｈ３３Ｙ、Ｙ４８Ｆ、Ｙ４９Ｒ、Ｎ５１Ｓ、Ｎ５１Ｖ、Ｎ５２Ｇ、Ｐ５４Ｌ、Ｇ５６Ｄ、Ｅ８０Ｍ、Ｓ８９Ａ、Ｄ９１Ｌ、Ｄ９１Ｒ、Ｄ９１Ｗ、Ｄ９１Ｋ、Ｄ９２Ｓ、Ｄ９２Ｔ、Ｇ９３Ｓ、Ｖ９４Ｔ、Ｐ９５Ｖ、Ｐ９５Ａ、Ｖ９６Ｇ、Ｖ９６ＭおよびＶ９６Ｗから選択される２つ以上の置換を含み得る。

いくつかの態様において、２Ａ８の軽鎖は、配列番号：２に対して、Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５２Ｇ；Ｙ４８Ｆ＋Ｄ９１Ｋ；Ｙ４８Ｆ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｄ９１Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５２Ｇ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｖ９６Ｗ；Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９６Ｗ；Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｇ５６Ｄ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｌ；およびＮ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｋの置換を有する。

いくつかの態様において、２Ａ８の軽鎖は、配列番号：２に対して、Ａ１３Ｓ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｄ１Ｓ＋Ｉ２Ｙ＋Ａ１３Ｓ＋Ｓ２１Ｔ＋Ｒ２８Ｐ＋Ｎ２９Ｋ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｅ８０Ｍ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｄ９２Ｓ＋Ｖ９４Ｔ＋Ｖ９６Ｗ；Ｄ１Ｓ＋Ｉ２Ｙ＋Ａ１３Ｓ＋Ｓ２１Ｔ＋Ｒ２８Ｐ＋Ｎ２９Ｋ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｓ＋Ｅ８０Ｍ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｄ９２Ｓ＋Ｖ９４Ｔ＋Ｖ９６Ｗ；Ｄ１Ｓ＋Ｉ２Ｙ＋Ａ１３Ｓ＋Ｓ２１Ｔ＋Ｒ２８Ｐ＋Ｎ２９Ｋ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｅ８０Ｍ＋Ｄ９１Ｗ；Ｄ１Ｓ＋Ｉ２Ｙ＋Ａ１３Ｓ＋Ｓ２１Ｔ＋Ｒ２８Ｐ＋Ｎ２９Ｋ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｅ８０Ｍ＋Ｓ８９Ａ＋Ｄ９１Ｗ＋Ｄ９２Ｓ＋Ｇ９３Ｓ＋Ｖ９４Ｔ；Ｄ１Ｓ＋Ｉ２Ｙ＋Ａ１３Ｓ＋Ｓ２１Ｔ＋Ｒ２８Ｐ＋Ｎ２９Ｋ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｙ４９Ｒ＋Ｎ５１Ｓ＋Ｅ８０Ｍ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｄ９２Ｓ＋Ｖ９４Ｔ＋Ｖ９６Ｗ；Ｄ１Ｓ＋Ｉ２Ｙ＋Ａ１３Ｓ＋Ｓ２１Ｔ＋Ｒ２８Ｐ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｅ８０Ｍ＋Ｄ９１Ｗ；Ｄ１Ｓ＋Ｉ２Ｙ＋Ａ１３Ｓ＋Ｓ２１Ｔ＋Ｒ２８Ｐ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｅ８０Ｍ＋Ｓ８９Ａ＋Ｄ９１Ｗ＋Ｄ９２Ｓ＋Ｇ９３Ｓ＋Ｖ９４Ｔ；Ｄ１Ｓ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９６Ｗ；Ｈ３３Ｙ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｉ２Ｙ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｎ２６Ａ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｎ２９Ｋ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｋ；Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｒ２８Ｐ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｓ２１Ｔ＋Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｄ９１Ｋ；Ｙ４８Ｆ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｄ９２Ｓ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｇ９３Ｓ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｐ９５Ｖ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９４Ｔ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｄ９１Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｓ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｌ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ＋Ｄ９２Ｓ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ＋Ｇ９３Ｓ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ＋Ｐ９５Ｖ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｄ９１Ｗ＋Ｖ９４Ｔ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｅ８０Ｍ＋Ｄ９１Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｇ５６Ｄ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｓ８９Ａ＋Ｄ９１Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｓ８９Ａ＋Ｄ９１Ｗ＋Ｄ９２Ｓ＋Ｇ９３Ｓ＋Ｖ９４Ｔ＋Ｐ９５Ａ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５１Ｖ＋Ｖ９６Ｗ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５２Ｇ；Ｙ４８Ｆ＋Ｎ５２Ｇ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９６Ｗ；およびＹ４８Ｆ＋Ｓ８９Ａ＋Ｄ９１Ｌ＋Ｖ９６Ｗの置換を有する。

ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、ａ）１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：１において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：２において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体もまた提供する。作製することができる修飾の例は、上記に提供される。

いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：５、６、７、８、９、１０および１１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：５、６、７、８、９、１０および１１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：５において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：１２．において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：６において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：１３において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：７において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：１４において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：８において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：１５において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：９において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：１６において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：１０において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：１７において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：１１において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：１８において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

４Ｂ７変異体
ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：３において示されるアミノ酸配列を含む抗体もまた提供する。いくつかの態様において、４Ｂ７の重鎖の修飾は置換、挿入または欠失である。

いくつかの態様において、置換は４Ｂ７の重鎖のＣＤＲに位置する。他の態様において、置換は４Ｂ７の重鎖のＣＤＲの外側に位置する。

いくつかの態様において、４Ｂ７の重鎖の置換は、Ｓ３０、Ｎ３２、Ｓ５７、Ｋ５８、Ｎ６１、Ｄ６２、Ｈ１０３、Ｈ１０７、Ｇ１０９およびＹ１１２から選択される位置にある。いくつかの態様において、４Ｂ７の重鎖の置換はまた、Ｑ１、Ｓ３７、Ｇ４４、Ｉ５３およびＫ５５から選択される位置を含み得る。例えば、置換はＱ１Ｅ、Ｓ３０Ｒ、Ｎ３２Ｄ、Ｎ３２Ｅ、Ｓ３３Ｇ、Ｓ３７Ｎ、Ｇ４４Ｓ、Ｉ５３Ｔ、Ｋ５５Ｙ、Ｓ５７Ｋ、Ｓ５７Ｒ、Ｋ５８Ｍ、Ｎ６１Ｇ、Ｎ６１Ｔ、Ｄ６２Ｉ、Ｄ６２Ｒ、Ｄ６２Ｑ、Ｄ６２Ｌ、Ｄ６２Ｓ、Ｄ６２Ｖ、Ｄ６２Ｎ、Ｄ６２Ｋ、Ｈ１０３Ｄ、Ｈ１０３Ｇ、Ｈ１０７Ｍ、Ｇ１０９ＡおよびＹ１１２Ｄから選択され得る。さらに、いくつかの態様において、抗体はＱ１Ｅ、Ｓ３０Ｒ、Ｎ３２Ｄ、Ｎ３２Ｅ、Ｓ３３Ｇ、Ｓ３７Ｎ、Ｇ４４Ｓ、Ｉ５３Ｔ、Ｋ５５Ｙ、Ｓ５７Ｋ、Ｓ５７Ｒ、Ｋ５８Ｍ、Ｎ６１Ｇ、Ｎ６１Ｔ、Ｄ６２Ｉ、Ｄ６２Ｒ、Ｄ６２Ｑ、Ｄ６２Ｌ、Ｄ６２Ｓ、Ｄ６２Ｖ、Ｄ６２Ｎ、Ｄ６２Ｋ、Ｈ１０３Ｄ、Ｈ１０３Ｇ、Ｈ１０７Ｍ、Ｇ１０９ＡおよびＹ１１２Ｄから選択される２つ以上の置換を含み得る。

いくつかの態様において、４Ｂ７の重鎖は、配列番号：３に対して、Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｑ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｈ１０３Ｄ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｄ６２Ｑ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｄ６２Ｒ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｑ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｈ１０７Ｍ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｓ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｄ６２Ｑ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｈ１０３Ｄ；Ｄ６２Ｓ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｓ３０Ｒ＋Ｓ５７Ｋ；Ｎ６１Ｇ＋Ｄ６２Ｖ；およびＫ５８Ｍ＋Ｄ６２Ｎの置換を有する。いくつかの態様において、４Ｂ７の重鎖は、配列番号：３に対して、Ｄ６２Ｑ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｄ６２Ｑ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｄ６２Ｒ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｄ６２Ｓ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｋ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｑ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｑ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｈ１０３Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｈ１０３Ｄ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｈ１０７Ｍ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｓ＋Ｈ１０７Ｍ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｇ４４Ｓ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｉ５３Ｔ＋Ｄ６２Ｑ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｉ５３Ｔ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｋ５５Ｙ＋Ｄ６２Ｑ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｋ５５Ｙ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｓ３７Ｎ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｑ１Ｅ＋Ｎ３２Ｄ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｑ１Ｅ＋Ｎ３２Ｄ＋Ｇ４４Ｓ＋Ｋ５５Ｙ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｎ３２Ｄ＋Ｇ４４Ｓ＋Ｋ５５Ｙ＋Ｄ６２Ｒ＋Ｙ１１２Ｄ；Ｓ３０Ｒ＋Ｓ５７Ｋ；Ｎ６１Ｇ＋Ｄ６２Ｖ；およびＫ５８Ｍ＋Ｄ６２Ｎの置換を有する。

さらに、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：４において示されるアミノ酸配列を含む抗体を提供する。いくつかの態様において、４Ｂ７の軽鎖の修飾は置換、挿入または欠失から選択される。

いくつかの態様において、置換は４Ｂ７の軽鎖のＣＤＲに位置する。他の態様において、置換は４Ｂ７の軽鎖のＣＤＲの外側に位置する。

いくつかの態様において、４Ｂ７の軽鎖の置換は、Ｆ３１、Ｓ３２、Ｄ３３、Ｎ３５、Ｙ３７、Ｙ５４、Ｇ５６、Ｓ５７、Ｓ６１およびＤ９７から選択される位置にある。いくつかの態様において、４Ｂ７の軽鎖の置換はまた、Ｍ４、Ｖ３０、Ｔ３６、Ｎ３９、Ｌ４２、Ｋ４４、Ｑ５０、Ｌ５１、Ｋ５５、Ａ６０およびＳ９８から選択される位置を含み得る。例えば、置換はＭ４Ｉ、Ｍ４Ｌ、Ｖ３０Ｌ、Ｆ３１Ｉ、Ｆ３１Ｍ、Ｆ３１Ｙ、Ｆ３１Ｈ、Ｓ３２Ｌ、Ｓ３２Ｒ、Ｓ３２Ｙ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３Ｒ、Ｎ３５Ｉ、Ｎ３５Ｌ、Ｎ３５Ｔ、Ｎ３５Ｖ、Ｔ３６Ｎ、Ｙ３７Ｆ、Ｎ３９Ｄ、Ｌ４２Ｑ、Ｋ４４Ｒ、Ｑ５０Ｒ、Ｌ５１Ｒ、Ｙ５４Ｆ、Ｋ５５Ｌ、Ｇ５６Ｄ、Ｇ５６Ａ、Ｇ５６Ｖ、Ｓ５７Ｙ、Ａ６０Ｄ、Ｓ６１Ｃ、Ｄ９７Ｍ、Ｄ９７ＴおよびＳ９８Ｈから選択され得る。さらに、いくつかの態様において、抗体はＭ４Ｉ、Ｍ４Ｌ、Ｖ３０Ｌ、Ｆ３１Ｉ、Ｆ３１Ｍ、Ｆ３１Ｙ、Ｓ３２Ｌ、Ｓ３２Ｒ、Ｓ３２Ｙ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３Ｒ、Ｎ３５Ｉ、Ｎ３５Ｌ、Ｎ３５Ｔ、Ｎ３５Ｖ、Ｔ３６Ｎ、Ｙ３７Ｆ、Ｎ３９Ｄ、Ｌ４２Ｑ、Ｋ４４Ｒ、Ｑ５０Ｒ、Ｙ５４Ｆ、Ｋ５５Ｌ、Ｇ５６Ｄ、Ｇ５６Ａ、Ｇ５６Ｖ、Ｓ５７Ｙ、Ａ６０Ｄ、Ｓ６１Ｃ、Ｄ９７Ｍ、Ｄ９７ＴおよびＳ９８Ｈから選択される２つ以上の置換を含み得る。

いくつかの態様において、４Ｂ７の軽鎖は、配列番号：４に対して、Ｓ３２Ｒ＋Ｎ３５Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｎ３５Ｔ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｔ；Ｎ３５Ｔ＋Ｄ９７Ｔ；Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｔ＋Ｙ３７Ｆ；Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｒ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｌ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｆ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｒ；Ｓ３２Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｔ＋Ｙ３７Ｆ；Ｎ３５Ｖ＋Ｇ５６Ｄ；Ｎ３５Ｌ＋Ｇ５６Ａ；およびＤ３３Ｆ＋Ｙ５４Ｆの置換を有する。

いくつかの態様において、４Ｂ７の軽鎖は、配列番号：４に対して、Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｔ＋Ｙ３７Ｆ；Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｔ；Ｆ３１Ｈ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｋ４４Ｒ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｌ４２Ｑ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｓ９８Ｈ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｔ３６Ｎ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｒ；Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｉ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｉ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｉ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｆ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｔ＋Ｙ３７Ｆ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｒ；Ｆ３１Ｍ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｌ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｆ３１Ｍ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｔ；Ｆ３１Ｙ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｍ４Ｉ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｍ４Ｌ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｎ３５Ｔ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ａ６０Ｄ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ＋Ｓ９８Ｈ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｇ５６Ｖ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｋ４４Ｒ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｋ５５Ｌ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｌ４２Ｑ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｌ５１Ｒ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｎ３９Ｄ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｑ５０Ｒ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｔ３６Ｎ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｒ＋Ｎ３５Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｎ３５Ｉ；Ｓ３２Ｒ＋Ｎ３５Ｔ；Ｓ３２Ｒ＋Ｎ３５Ｔ＋Ｄ９７Ｔ；Ｖ３０Ｌ＋Ｆ３１Ｉ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ；Ｖ３０Ｌ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｄ９７Ｔ；Ｖ３０Ｌ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｄ３３Ｆ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｔ３６Ｎ＋Ｄ９７Ｔ；Ｖ３０Ｌ＋Ｓ３２Ｒ＋Ｎ３５Ｉ＋Ｔ３６Ｎ；Ｎ３５Ｖ＋Ｇ５６Ｄ；Ｎ３５Ｌ＋Ｇ５６Ａ；およびＤ３３Ｆ＋Ｙ５４Ｆの置換を有する。

ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、ａ）１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：３において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：４において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体もまた提供する。作製することができる修飾の例は上記に提供される。

いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２６から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２６から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：１９において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：２７において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：２０において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：２８において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：２１において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：２９において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：２２において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：３０において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：２３において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：３１において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：２４において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：３２において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：２５において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：３３において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体は、ａ）配列番号：２６において示されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：３４において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

２Ａ８／４Ｂ７変異体組合せ
ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体が２Ａ８および４Ｂ７の重鎖および軽鎖の組合せを含み得ることもまた意図される。

したがって、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、ａ）１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：１において示されるアミノ酸配列を含む２Ａ８の重鎖；およびｂ）１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：４において示されるアミノ酸配列を含む４Ｂ７の軽鎖を含む抗体を提供する。作製することができる修飾の例は上記に提供される。

ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、ａ）１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：３において示されるアミノ酸配列を含む４Ｂ７の重鎖；およびｂ）１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：２において示されるアミノ酸配列を含む２Ａ８の軽鎖を含む抗体もまた提供する。作製することができる修飾の例は上記に提供される。

いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、ａ）配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖；およびｂ）配列番号：１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

核酸、ベクターおよび宿主細胞
任意の上記のモノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子もまた提供する。

したがって、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する抗体であって、１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：１において示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体をコードする単離された核酸分子を提供する。このような修飾の例は上記されている。

ヒト組織因子経路インヒビターに結合する抗体であって、１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：２において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体をコードする単離された核酸分子もまた提供する。このような修飾の例は上記されている。

ヒト組織因子経路インヒビターに結合する抗体であって、１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：３において示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体をコードする単離された核酸分子もまた提供する。このような修飾の例は上記されている。

ヒト組織因子経路インヒビターに結合する抗体であって、１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号：４において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体をコードする単離された核酸分子もまた提供する。このような修飾の例は上記されている。

さらに、任意の上記のモノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子を含むベクターおよびこのようなベクターを含む宿主細胞もまた提供する。

ＴＦＰＩに対する抗体を製造する方法
モノクローナル抗体は、本発明の態様のモノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞において発現させることにより組換え的に生産され得る。発現ベクターの手助けで、該ヌクレオチド配列を含む核酸を、生産のために適当な宿主細胞にトランスフェクトし、発現させ得る。したがって、
（ａ）本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸分子を宿主細胞にトラスフェクトすること、
（ｂ）宿主細胞を培養し、宿主細胞において該モノクローナル抗体を発現すること、および所望により
（ｃ）生産されたモノクローナル抗体を単離し、精製すること
を含む、ヒトＴＦＰＩと結合するモノクローナル抗体を生産するための方法であって、該核酸分子は本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を含む方法もまた提供する。

１つの例において、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、標準分子生物学技術により得られる部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳コントロール配列に作動可能に連結されるように、発現ベクターに挿入される。この文脈において、「作動可能に連結される」なる用語は、ベクター内の転写および翻訳コントロール配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味することが意図される。発現ベクターおよび発現コントロール配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されるか、またはより一般的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入され得る。抗体遺伝子は、標準方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクターにおける相補的制限酵素認識部位のライゲーション、または制限酵素認識部位が存在しないとき、平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。本明細書に記載されている抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、Ｖ_Ｈセグメントがベクター内でＣ_Ｈセグメントに作動可能に連結され、Ｖ_Ｌセグメントがベクター内でＣ_Ｌセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターに挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を創造するために使用することができる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫タンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。

抗体鎖コード遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現をコントロールする調節配列を有する。「調節配列」なる用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳をコントロールするプロモーター、エンハンサーおよび他の発現コントロールエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列の例は、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指向するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列、例えば、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターが使用され得る。

抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子を有し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７号、参照）。例えば、一般的に、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞において薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を与える。選択可能なマーカー遺伝子の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅でのｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のための）およびネオ遺伝子（Ｇ４１８選択のための）を含む。

軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技術により宿主細胞にトランスフェクトされる。種々の形態の「トランスフェクション」なる用語は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のために一般的に使用される多種多様の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含むことを意図する。原核生物または真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることが理論的に可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体を集合させ分泌しやすいため、真核細胞、より好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。

組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載されているＤＨＦＲ選択可能なマーカーを使用するUrlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＫＢ１１細胞およびＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されたとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現または宿主細胞が培養される培養培地への抗体の分泌を可能にする十分な期間、宿主細胞を培養することにより生産される。抗体は、標準タンパク質精製方法、例えば、限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび遠心分離を使用して、培養培地から回収することができる。

インタクトな抗体を発現させるための部分的抗体配列の使用
抗体は、６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基を介して主に標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間でより異なっている。ＣＤＲ配列が非常に抗体抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上にグラフトされた特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることができる（例えば、Riechmann, L.ら 1998, Nature 332:323-327; Jones, P.ら 1986, Nature 321:522-525;およびQueen, C.ら 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033参照）。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベースから得ることができる。これらの生殖細胞系列配列は、Ｂ細胞成熟中のＶ（Ｄ）Ｊ連結により形成される完全に集合された可変遺伝子を含まないため、成熟抗体遺伝子配列と異なる。起源の抗体と同様の結合特性を有するインタクトな組換え抗体を再創造するために、特定の抗体の全ＤＮＡ配列を得る必要はない（ＷＯ９９／４５９６２参照）。ＣＤＲ領域にわたる部分的な重鎖および軽鎖配列が、一般的に、この目的のために十分である。部分的な配列は、生殖細胞系列可変および連結遺伝子セグメントが組換え抗体可変遺伝子に寄与することを決定するために使用される。次に、生殖細胞系列配列は、可変領域の欠損部分を満たすために使用される。重鎖および軽鎖リーダー配列は、タンパク質成熟中に開裂され、最終抗体の特性に起因しない。この理由のため、発現構築物のために対応する生殖細胞系列リーダー配列を使用することが必要である。欠損配列を加えるため、クローンｃＤＮＡ配列は、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅により合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。あるいは、全可変領域は、短い重複オリゴヌクレオチドのセットとして合成され、ＰＣＲ増幅により組み合わせられ、完全に合成可変領域クローンを創造することができる。このプロセスは、特定の制限酵素認識部位の除去または包含、または特定のコドンの最適化のようなある利点を有する。

重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列は、天然配列と同一のアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を創造するために、合成オリゴヌクレオチドの重複セットを設計するために使用される。合成重鎖および軽鎖配列は、天然配列と異なり得る。例えば、繰り返されたヌクレオチド塩基からなる列が、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を容易にするため中断され；最適な翻訳開始部位が、Ｋｏｚａｋのルール（Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870）にしたがって組み込まれ；制限酵素認識部位が、翻訳開始部位の上流または下流に操作される。

重鎖および軽鎖可変領域両方において、最適化されたコードおよび対応する非コード鎖配列は、対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ中間点で３０−５０ヌクレオチド断片に分解される。したがって、それぞれの鎖において、オリゴヌクレオチドは、１５０−４００ヌクレオチドのセグメントにわたる重複二本鎖セットに集合され得る。次に、プールは、１５０−４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を生産するために鋳型として使用される。一般的に、単一の可変領域オリゴヌクレオチドセットは、別々に増幅され、２つの重複ＰＣＲ産物を産生する２つのプールに分解される。次に、これらの重複産物をＰＣＲ増幅により組み合わせて、完全可変領域を形成する。また、発現ベクター構築物中に容易にクローニングすることができるフラグメントを産生するために、ＰＣＲ増幅において重鎖または軽鎖定常領域の重複フラグメントを含むことが望ましいことがある。

次に、再構築された重鎖および軽鎖可変領域をクローン化されたプロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳、ポリアデニル化および転写終止配列と組み合わせ、発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖発現構築物は、単一のベクター中に組み合わせられ、次に両方の鎖を発現する宿主細胞を形成するように融合される宿主細胞に共トランスフェクトされるか、連続トランスフェクトされるか、または別々ににトランスフェクトされ得る。

したがって、別の局面において、ヒト抗−ＴＦＰＩ抗体の構造的特徴は、ＴＦＰＩへの結合の機能を保持する構造的に関連したヒト抗−ＴＦＰＩ抗体を創造するために使用される。さらに具体的に、本発明のモノクローナル抗体の具体的に同定された重鎖および軽鎖領域の１つまたはそれ以上ＣＤＲは、本発明のさらに組換え的に操作されたヒト抗−ＴＦＰＩ抗体を創造するために、既知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組換え的に組み合わされ得る。

医薬組成物
治療有効量の抗−ＴＦＰＩモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物もまた提供する。「薬学的に許容される担体」は、調製物を製剤化または安定化させるための手助けとなり、患者に有意な有害毒物学的効果を引き起こさない活性成分に加えられ得る物質である。このような担体の例は当業者によく知られており、水、糖、例えば、マルトースまたはスクロース、アルブミン、塩、例えば、塩化ナトリウムなどを含む。他の担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinにおいて記載されている。このような組成物は、治療有効量の少なくとも１つの抗−ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含む。

薬学的に許容される担体は、滅菌の水溶液または分散媒体および滅菌の注射可能な溶液または分散媒体の即時調製物のための滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で知られている。該組成物は、好ましくは非経口注射のために製剤化される。該組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の高薬物濃度に適当な規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。いくつかの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含む。

滅菌の注射可能な溶液は、必要なとき、上記成分の１つまたは組合せを有する適当な溶媒中に必要な量の活性化合物を含み、次に精密濾過で滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散媒体は、基本的な分散媒体および上記成分からの必要な他の成分を含む滅菌のビヒクルに活性化合物を組み込むことにより調製される。滅菌の注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製のいくつかの方法は、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）であり、予め滅菌ろ過処理した溶液から、活性成分プラス任意の付加的な所望の成分の粉末が得られる。

医薬的使用
モノクローナル抗体は、凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するための治療目的のために使用することができる。例えば、上記態様におけるモノクローナル抗体は、ＴＦＰＩとＦＸａとの相互作用をブロックするか、またはＴＦ／ＦＶＩＩａ活性のＴＦＰＩ依存性阻害を防止するために使用され得る。さらに、モノクローナル抗体はまた、ＦＸａのＴＦ／ＦＶＩＩａ−駆動産生を回復させ、ＦＸａのＦＶＩＩＩ−もしくはＦＩＸ−依存性増幅の欠乏を迂回させるために使用され得る。

モノクローナル抗体は、止血の障害、例えば、血小板減少症、血小板障害および出血性障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂおよび血友病Ｃ）の処置における治療的使用を有する。このような障害は、治療有効量の抗−ＴＦＰＩモノクローナル抗体を必要とする患者に投与することにより処置され得る。モノクローナル抗体はまた、適応症におけるコントロールされていない出血、例えば、外傷および出血性脳卒中の処置において治療的使用を有する。したがって、治療有効量の本発明の抗−ＴＦＰＩモノクローナル抗体を必要とする患者に投与することを含む出血時間を短縮するための方法もまた提供する。

抗体は、単剤療法または止血障害に対する他の治療と組み合わせて使用することができる。例えば、１つまたはそれ以上の本発明の抗体と凝固因子、例えば、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子との共投与は、血友病を処置するために有用であると考えられる。１つの態様において、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合する第１の量のモノクローナル抗体および（ｂ）第２の量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与することを含む凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するための方法であって、該第１および第２の量は合わせて、該欠乏または欠損を処置するために有効である方法を提供する。別の態様において、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合する第１の量のモノクローナル抗体および（ｂ）第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の第２の量を投与することを含む凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するための方法であって、該第１および第２の量は合わせて、該欠乏または欠損を処置するために有効であり、さらに、第ＶＩＩ因子は共投与されない方法を提供する。本発明はまた、治療有効量の本発明のモノクローナル抗体および第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の組合せを含む医薬組成物であって、第ＶＩＩ因子を含まない組成物を含む。「第ＶＩＩ因子」は、第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子を含む。これらの組合せ治療は、凝固因子の必要な注入頻度を減少させる可能性がある。共投与または併用療法は、それぞれ別々に製剤化された、または１つの組成物中で共に製剤化された２つの治療薬物の投与を意味し、別々に製剤化されたとき、ほぼ同時で、または同じ治療期間にわたってであるが異なる時間で投与される。

いくつかの態様において、本明細書に記載されている１つまたはそれ以上の抗体は、止血障害に対し組合せて使用することができる。例えば、２つまたはそれ以上の本明細書に記載されている抗体の共投与は、血友病または他の止血障害を処置するために有用であると考えられる。

医薬組成物は、出血症状の重症度により変化し得る、または予防治療の場合、患者の凝固欠乏の重症度により変化し得る用量および頻度で、血友病ＡまたはＢに罹患している対象に非経口的に投与され得る。

組成物は、ボーラスとして、または連続的な注入により必要とする患者に投与され得る。例えば、Ｆａｂフラグメントとして存在する本願発明の抗体のボーラス投与は、０．００２５から１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５から０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０から０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１０−０．５０ｍｇ／ｋｇの量であり得る。連続的な注入のために、Ｆａｂフラグメントとして存在する本願発明の抗体は、０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５から１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から１．０ｍｇ／ｋｇ／分または０．１０−０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で１−２４時間、１−１２時間、２−１２時間、６−１２時間、２−８時間または１−２時間、投与され得る。全長抗体（完全定常領域を有する）として存在する本願発明の抗体の投与のための投与量は、約１−１０ｍｇ／ｋｇ体重、２−８ｍｇ／ｋｇまたは５−６ｍｇ／ｋｇであり得る。このような全長抗体は、一般的に３０分から３時間の期間に延長され注入により投与される。投与の頻度は状態の重症度に依存する。頻度は、週に３回から２週間から６月毎に１回の範囲であり得る。

さらに、組成物は、皮下注射を介して患者に投与され得る。例えば、１０から１００ｍｇの用量の抗−ＴＦＰＩ抗体を、１週間毎、２週間毎または１月毎に皮下注射を介して患者に投与することができる。

本明細書において使用される「治療有効量」は、抗−ＴＦＰＩモノクローナル抗体、または、このような抗体およびインビボで凝固時間を有効に増加させるか、またはさもなければ必要とする患者にインビボで測定可能な利益を与えるために必要である第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の組合せの量を意味する。正確な量は、限定はしないが、治療組成物の成分および物理的特性、意図される患者集団、個々の患者の検討などを含む多数の因子に依存し、当業者により容易に決定することができる。

実施例１．クローニング、発現および抗体発現レベルの定量化
重鎖のＣ−末端にｃ−ｍｙｃ−タグおよびヘキサ−ヒスチジンタグを有する野生型Ｆａｂｓ２Ａ８および４Ｂ７の重鎖および軽鎖を、ｐＥＴ２８ａ細菌発現ベクター（Novagen/Merck Chemicals Ltd., Nottingham, UK）にサブクローニングし、Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany）を形質転換した。あるいは、他の細菌発現ベクター（例えば、pQE vector system, Qiagen GmbH, Hilden, Germany）および株（例えば、DH5α, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany）を使用することができる。変異体を、標準オリゴベースの部位特異的変異誘発により産生し、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。特に、相補性決定領域内または周囲のアミノ酸残基を、重鎖および／または軽鎖内で修飾した。

競合物として野生型または変異体抗体を使用可能にするため、重鎖のＣ−末端に位置するエピトープ−タグを、標準ＰＣＲベースの技術を使用して除去するか、または置換した。特に、４Ｂ７において、分析された全ての変異体に対してｃ−ｍｙｃ−タグをヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグに交換した。対照的に、競合物として使用された４Ｂ７野生型または変異体は、ｃ−ｍｙｃ−タグを有した。２Ａ８の場合、ｃ−ｍｙｃ−エピトープタグをＨＡ−タグにより置き換えるか、または欠失させ、Ｃ−末端で６×ヒスチジンエピトープタグだけを提示する変異体とした。

発現のために、変異体をＢＬ２１ｓｔａｒＤＥ３大腸菌株（Invitrogen, C6010-03）に形質転換し、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地に植菌し、一晩培養し、３７℃で１８時間インキュベートした。発現培養物を、一晩培養物をカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を有する新鮮なＬＢ培地中に１：２０で植菌することにより産生した。６時間後、１ｍＭのイソプロピル−ｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Roth, 2316.5）を加え、抗体発現を誘導し、培養物をさらに１８時間３０℃でインキュベートした。あるいは、一晩培養物を、自動誘導培地Overnight Express TB培地（Merck, 71491）中に１：２０で植菌し、２４時間３０℃でインキュベートした。

発現レベルの定量化のために、ＥＬＩＳＡアプローチを使用した。簡潔には、ＭＴＰプレート（Nunc maxisorp black, 460518）を、コーティングバッファー（Candor Bioscience GmbH, 121500）で希釈されたＦａｂ−特異的抗体（Sigma, I5260）と共に一晩４℃でインキュベートし、ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水：１３７ｍＭのＮａＣｌ、Ｍｅｒｃｋ１．０６４０４．５０００；２．７ｍＭのＫＣｌ、Ｍｅｒｃｋ１．０４９３６．１０００；１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、Ｍｅｒｃｋ１．０６５８６．２５００、１．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、Ｍｅｒｃｋ１．０４８７１．５０００；０．０５％のＴｗｅｅｎ２０ＡｃｒｏｓＯｒｇａｎｉｃｓ、２３３３６００１０を含む）で洗浄し、ＰＢＳＴ中の２％のミルクで室温で１時間ブロックし、再び洗浄した。培養物をＰＢＳ中の０．２５％のスキムミルク（Fluka analytical, 70166）で希釈し、ＭＴＰプレートに室温で１時間結合させた。ＰＢＳＴで洗浄後、捕獲された抗体をＨＲＰ−結合抗−Ｆａｂ抗体（Sigma, A0293）と共にインキュベートし、該プレートを１０μＭのamplex red substrate（Invitrogen, A12222）と共に暗所で室温で１０から３０分間インキュベートし、次に蛍光測定することにより検出した。野生型の精製された抗体（２Ａ８または４Ｂ７）と比較した濃度を決定後、発現レベルを標準化した。

実施例２．産生された抗体変異体の活性および種間交差反応性の決定
ヒトまたはマウスＴＦＰＩ（それぞれAmerican Diagnostica, 4900BおよびR&D Systems, 2975-P1）に対する変異された抗体変異体の活性を決定するために、平衡または競合ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを使用した。簡潔には、ＭＴＰプレート（Mesoscale Discovery, L21XA-4またはNunc maxisorp black, 460518のいずれか）を、それぞれリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはコーティングバッファー（Candor Bioscience GmbH, 121500）で希釈された０．０４−２μｇ／ｍｌのヒトまたはマウスＴＦＰＩのいずれかでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、プレートを室温で１時間ＰＢＳＴ中の３％のウシ血清アルブミン（Sigma, A4503）でブロックし、洗浄工程を繰り返した。抗体の結合のために、それぞれの抗体発現レベルに標準化された１０−２５μｌの培養上清（他に示されていないとき）を、ＲＴで１時間プレートに加え、次にＰＢＳＴで洗浄した。次に、結合した野生型および変異体をエピトープタグ特異的抗体により検出したか、または競合工程を加えた。競合のために、５０−３００ｎＭの競合物または遊離抗体を加え、室温で２０分から２４時間インキュベートした。洗浄後、残った変異体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（２Ａ８変異体に対してＢｉｏｍｏｌ、ａｎｔｉ−ｃ−ｍｙｃＡ１９０−１０５Ｐおよび４Ｂ７変異体に対して抗−ＨＡＡ１９０−１０８Ｐ）と結合しているエピトープタグ特異的抗体で、または電気化学発光検出（Mesoscale Discovery, R91AN-1）のために製造業者の指示にしたがって予めスルホ−ＮＨＳ試薬で標識された抗−ｍｙｃ（Sigma, C3956）もしくは抗−ＨＡ抗体（Sigma, H6908）により検出した。ｍａｘｉｓｏｒｐプレートにおけるシグナル検出のために、１０μＭのａｍｐｌｅｘｒｅｄ基質（Invitrogen, A12222）を加え、暗所で室温で１０から３０分間インキュベートし、次に蛍光測定した。ＭＳＤプレートにおける検出のために、ＭＳＤリードバッファーＴをＨ_２Ｏ（Mesoscale Discovery, R92TC-1）で２×に希釈し、プレートに加え、電気化学発光シグナルを、ＭｅｓｏｓｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｅｃｔｏｒＩｍａｇｅｒ６０００を使用して、６２０ｎｍで検出した。

実施例３．単一および複数のアミノ酸置換
２Ａ８の重鎖または軽鎖に導入された単一のアミノ酸置換のいくつかの例を表１に提供する。変異体の発現レベルを、定量化ＥＬＩＳＡにおいてクアドロプル(quadruple)で分析した。それぞれの発現レベルに対する標準化後、ヒトおよびマウスＴＦＰＩにおいて競合ＥＬＩＳＡにおいてクアドロプルで分析し、変異体対野生型（ｗｔ）比を決定した。誤差は、標準偏差からの誤差伝搬により計算した。
表１．２Ａ８内の単一のアミノ酸置換の分析

２Ａ８ＴＦＰＩ抗体内の組合せたアミノ酸置換のいくつかの例を表２に提供する。すべての組合せが表２において提供されていないが、ＴＦＰＩ抗体が提供される修飾のあらゆる組合せを含み得ることが考えられる。変異体の発現レベルを、定量化ＥＬＩＳＡにおいてクアドロプルで分析した。他に示されていないとき、変異体をそれぞれの発現レベルに対して標準化し、ヒトおよびマウスＴＦＰＩにおいて競合ＥＬＩＳＡにおいてクアドロプルで分析し、次に変異体対参照（ＨＣ＿Ｋ９９Ｌ）比を計算した。変異体能力を標準化なしで分析した場合、値を「＃」でマークしており、アッセイシグナルを発現レベルで割ることにより、変異体対参照比を発現レベルに対して標準化した。異なる参照を競合ＥＬＩＳＡにおいて使用し、変異体を標準化なしで分析した場合、値は「＊」でマークされている。これらの変異体において、表に記載されている値は、比変異体／代替参照と代替参照／ＨＣ＿Ｋ９９Ｌを掛けることにより計算した。誤差は、標準偏差からの誤差伝搬により計算した。
表２．２Ａ８内の複数のアミノ酸置換の例

４Ｂ７の重鎖および／または軽鎖に導入された単一のおよび／または二重のアミノ酸置換のいくつかの例を表３に提供する。変異体の発現レベルを、定量化ＥＬＩＳＡにおいてクアドロプルで分析した。それぞれの発現レベルに対する標準化後、ヒトＴＦＰＩにおいて競合ＥＬＩＳＡおよびマウスＴＦＰＩにおいて平衡ＥＬＩＳＡにおいてクアドロプルで分析し、変異体対野生型比を決定した。誤差は、標準偏差からの誤差伝搬により計算した。
表３．４Ｂ７内の単一のおよび二重のアミノ酸置換の分析

４Ｂ７ＴＦＰＩ抗体内のアミノ酸置換の組合せのいくつかの例を表４に提供する。すべての組合せが表４において提供されていないが、ＴＦＰＩ抗体が提供される修飾のあらゆる組合せを含み得ることが考えられる。変異体の発現レベルを、定量化ＥＬＩＳＡにおいてクアドロプルで分析した。他に示されていないとき、変異体をそれぞれの発現レベルに対して標準化し、ヒトおよびマウスＴＦＰＩにおいて競合ＥＬＩＳＡにおいてクアドロプルで分析し、次に変異体対参照（ＨＣ＿Ｄ６２Ｒ）比を計算した。異なる参照を使用し、変異体を標準化なしで分析した場合、値は「＊」でマークされている。これらの変異体において、表に記載されている値は、比変異体／代替参照と代替参照／ＨＣ＿Ｄ６２Ｒを掛けることにより計算した。誤差は、標準偏差からの誤差伝搬により計算した。ｎｂ：結合が、使用されたアッセイ条件下で検出されなかった。
表４．４Ｂ７内の複数のアミノ酸置換の例

実施例４．抗体の精製
細胞を４℃で３０分９０００ｒｐｍでの遠心分離により回収し、−２０℃で貯蔵した。上清をバッファーＡ（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールｐＨ８．０）でバッファー交換し、濃縮し、２段階精製処理を使用して精製した。簡潔には、１００ｍｌの濃縮された上清を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Qiagen, 1018142）に負荷し、５×カラム容量のバッファーＡ、次に５×カラム容量の４．３％のバッファーＢ（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾールｐＨ８．０）で１回洗浄し、７容量のバッファーＢで溶離した。画分を合わせ、ＰＢＳ中で透析した。第２の精製工程において、Ｎｉ−ＮＴＡ精製抗体を軽鎖特異的親和性マトリックス、すなわち２Ａ８および４Ｂ７に対してそれぞれｃａｐｔｕｒｅｓｅｌｅｃｔラムダまたはカッパ（それぞれ、ＢＡＣ０８４９．０１０およびＢＡＣ０８３３．１０）と共にインキュベートした。４℃で一晩インキュベーション後、マトリックスをカラムに負荷し、５容量のＰＢＳ、５容量の５００ｍＭのアルギニン、１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１００ｍＭのＮａＣｌｐＨ６．０および再び５容量のＰＢＳで洗浄した。抗体を６容量の１００ｍＭのグリシンｐＨ３．０、次に３容量の１００ｍＭのグリシンｐＨ２．０で溶離し、全容量の１／１０の１ＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５で溶出物を中和した。最後に、溶出物を４℃で一晩ＰＢＳ中で透析した。精製された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により分析した。

実施例５．表面プラズモン共鳴（Biacore）を使用するＴＦＰＩへの抗体結合の親和性を測定する
ヒトまたはマウスＴＦＰＩのいずれかを分析のために表面上に固定した。ＣＭ５−チップおよびアミンカップリングキット（GE HealthCare）を、製造業者からの指示にしたがって、リガンドの固定化のために使用した。固定化されたＴＦＰＩの量は約７０ＲＵであり、１００ＲＵのＲＭａｘを産生することができる抗体の量に合わせた。親および親和性成熟抗−ＴＦＰＩ抗体を移動相においた。親和性決定を少なくとも５つの異なる濃度（０．１、０．４、１．６、６．４および２５ｎＭ）の精製された抗体で行った。

ＣＤＲ領域において単一の変異を含む抗体変異体を分析することにより、本発明者らは、Ｅｌｉｓａ結合アッセイにおいてより高いシグナルを有する多数のクローンを同定した。選択されたクローンを精製し、ヒトまたはマウスＴＦＰＩに対するそれらの親和性をＢｉａｃｏｒｅを使用して分析した。表５および表６に示されるとおり、これらのクローンは、ＴＦＰＩに対して、親抗体２Ａ８または４Ｂ７よりもより高い親和性を有する。いくつかの２Ａ８変異体が親抗体２Ａ８よりもよりゆっくりな結合速度（ｋａ）を有するが、全てのこれらの変異体は、２Ａ８よりもずっとゆっくりな解離速度（ｋｄ）を有する。全体としては、これらの単一の変異は、ヒトＴＦＰＩにおいて１．４７倍から７．２２倍、およびマウスＴＦＰＩにおいて１．７１倍から７．２０倍の範囲で２Ａ８の親和性を増加する。本発明者らが４Ｂ７変異体を分析したとき、重鎖ＣＤＲ２ドメインにおけるＤ６２Ｒ変異は、シグナルを有意に増加させた。このクローンを親和性測定のために選択した。表５および表６に示されるとおり、この単一の変異は、ヒトＴＦＰＩに対する４Ｂ７の親和性を１１．１ｎＭから５８．２ｐＭに増加させ、１９１倍改善する。４Ｂ７ＨｃＤ６２Ｒのゆっくりな解離速度（ｋｄ）は、主に、４Ｂ７の８．４０×１０^−３／ｓから４Ｂ７ＨｃＤ６２Ｒの１．６５×１０^−４への親和性改善に寄与し、約５０倍改善する。同様に、この変異は、マウスＴＦＰＩに対する４Ｂ７の親和性を５８．６ｎＭから４２７ｐＭに増加させ、１３７倍改善する。
表５．ヒトＴＦＰＩにおける選択された２Ａ８または４Ｂ７変異体（単一の変異）の親和性

表６．マウスＴＦＰＩにおける選択された２Ａ８および４Ｂ７変異体（単一の変異）の親和性

次に、２Ａ８および４Ｂ７内の複数の変異の結合親和性を研究した。表７（ａ）および表８（ａ）に示されるとおり、ＣＤＲドメインにおいて複数の変異を含む２Ａ８の変異体は、ヒトＴＦＰＩおよびマウスＴＦＰＩ結合の両方において単一変異４Ｂ７よりもより高い親和性を有する。例えば、２Ａ８−２００は、ヒトＴＦＰＩ結合において２Ａ８よりも５３．７倍より高い親和性およびマウスＴＦＰＩ結合において５５．４倍より高い親和性を有する。表７（ｂ）および表８（ｂ）に示されるとおり、ＣＤＲドメインにおいて複数の変異を含む４Ｂ７の変異体は、ヒトＴＦＰＩおよびマウスＴＦＰＩ結合の両方において単一変異４Ｂ７よりもより高い親和性を有する。表７および８において提供される親２Ａ８および４Ｂ７配列からのこれらの変異体もまた、配列表に提供されている。配列番号：５−１１は、表７および８に記載の２Ａ８の重鎖変異体に対応する。配列番号：１２−１８は、２Ａ８の軽鎖変異体に対応する。配列番号：１９−２６は、表７および８に記載の４Ｂ７の重鎖変異体に対応する。配列番号：２７−３４は、４Ｂ７の軽鎖変異体に対応する。
表７（ａ）．ヒトＴＦＰＩにおける選択された２Ａ８変異体（複数の変異）の親和性

表７（ｂ）．ヒトＴＦＰＩにおける選択された４Ｂ７変異体（複数の変異）の親和性

表８（ａ）．マウスＴＦＰＩにおける選択された２Ａ８変異体（複数の変異）の親和性

表８（ｂ）．マウスＴＦＰＩにおける選択された４Ｂ７変異体（複数の変異）の親和性

実施例６．親和性改善抗体はＦＸａ活性の回復におけるさらなる効力を示した
親和性改善抗−ＴＦＰＩ抗体がまた、ＴＦＰＩタンパク質の阻害効果をブロックすることによるＦＸａ活性の回復の効果を改善するか否かを決定するため、本発明者らはＦＸａ回復アッセイを行った。このアッセイにおいて、種々の示された量の個々の親和性改善抗体（３０μＬ）を、５０μｌの全反応混合物中の固定された量のヒト、マウスまたはラット組換えＴＦＰＩ（２０μＬ、６．６ｎＭ）と室温で３０分インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌのＦＸａ（３．３９ｎＭ）を反応混合物に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、２０μｌのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＦＸａ基質を反応混合物に加えた。１２分のインキュベーション後、それぞれのウェルの吸光度をプレートリーダー（Molecular Device）を使用して４０５ｎｍで読んだ。それぞれの実験において、既知の量のＴＦＰＩにより阻害される同じ量のＦＸａ（３．３９ｎＭ）の直線標準曲線を得た。１００％回復したＦＸａ活性をＴＦＰＩを加えないＦＸａ活性として定義し、０％活性をＴＦＰＩタンパク質（６．６ｎＭ）の存在下でのＦＸａ活性として定義した。したがって、最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）をそれぞれの個々の抗−ＴＦＰＩ抗体に対して計算し、これらのいくつかを表９に提供した。最大半量有効濃度（ＥＣ５０）もまた、選択された２Ａ８の第２回の(second-round)変異体に対して計算し、表１０に提供した。
表９．親抗体２Ａ８および４Ｂ７のそれぞれと比較した、ＦＸａ回復アッセイを使用する単一のアミノ酸置換を有する選択された抗−ＴＦＰＩ抗体のＩＣ５０および効力改善

表１０．親２Ａ８と比較した、複数のアミノ酸置換を有する選択された抗−ＴＦＰＩ抗体のＥＣ５０および改善倍数

実施例７．親和性改善抗体はｄＰＴアッセイにおいて凝固時間の短縮においてさらなる効力を示した
これらの親和性改善抗体がまた、凝固時間の短縮において効力を改善するか否かを確認するために、ｄＰＴを実施して、ヒト血友病Ａ血漿を使用して凝固時間における選択された親和性成熟抗体の効果を決定する。ｄＰＴアッセイは、本質的にＷｅｌｓｃｈら（Thrombosis Res., 1991, 64(2): 213-222）に記載されているとおりに行う。簡潔には、ヒト血友病Ａ血漿（George King Biomedical）を、血漿を０．１容量のコントロールバッファー（ネガティブコントロールとして）または示された抗−ＴＦＰＩ抗体と混合することにより調製する。２５℃で３０分インキュベーション後、それぞれの調製された血漿サンプル（１００μＬ）をトロンボプラスチンの供給源として１００μｌの適当に希釈された（１：５００希釈）Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ（Biometieux）および１００μｌの２５ｍＭの塩化カルシウムと合わせる。凝固時間は、塩化カルシウムを加えた直後に、フィブロメーターＳＴＡ４（Stago）を使用して決定する。

実施例８．親和性改善抗体は抗−第ＶＩＩＩ因子抗体−誘導ヒト血友病Ａ血液を使用して全血凝固時間の短縮においてさらなる効力を示した
親和性改善抗体が、凝固時間の短縮においてさらなる効力を示すか否かを確認するために、本発明者らは、インヒビターを有する血友病Ａ患者由来の血液を模倣するヒトＦＶＩＩＩ−中和抗体−誘導血友病Ａ血液における凝固時間に対するこれらの抗体の効果を試験するためにＲＯＴＥＭシステムを使用した。ＲＯＴＥＭシステム（Pentapharm GmbH）は、４チャネル器械、コンピューター、血漿標準、アクチベーターならびに使い捨てカップおよびピンを含む。ＲＯＴＥＭ止血システムのトロンボエラストグラフィーパラメーターは、血液凝固が開始する反応時間（データ回収の開始後に２ｍｍの振幅を得るために必要な時間）を反映する凝固時間（ＣＴ）；凝固伝播を反映する血餅形成時間（ＣＦＴ）およびアルファ角、ならびに血餅堅固を反映する最大振幅および最大弾性率を含む。ＲＯＴＥＭアッセイにおいて、ＦＶＩＩＩ活性がＦＶＩＩＩに対するポリクローナル抗体の添加により中和された３００μｌの新鮮に採血されたクエン酸全血を、親抗−ＴＦＰＩ抗体と比較して、親和性改善抗−ＴＦＰＩ抗体の効果を試験するために使用した。製造業者の指示にしたがって、全ての成分を再構成し、混合し、それぞれのシステムに必要な期間、データを回収した。簡潔には、２０μｌのＣａＣｌ_２（２００ｍｍｏｌ）を有するＲＯＴＥＭカップに、３００μｌの血液または血漿を自動ピペットで吸引／分配することによりサンプル混合し、サンプルの混合直後に、データ回収を開始した。データは、コンピューター制御（ソフトウェアバージョン２．９６）ＲＯＴＥＭシステムを使用して２時間で回収した。

血液凝固時間の短縮における親和性改善抗−ＴＦＰＩ抗体の効果の検出におけるＲＯＴＥＭアッセイの典型的な結果は、図２および３において示される。図２は、ヒト抗体−誘導血友病血液の凝固時間において、選択された第１回の(first-round)親和性−成熟抗−ＴＦＰＩ抗体の効果を示す。非常に親和性改善された抗体である２Ａ８−９および２Ａ８−１７は、ヒト抗体−誘導血友病Ａ血液において凝固時間の短縮において非常に良い効力を示し、ＴＦＰＩに対する結合親和性が改善しなかった２Ａ８−１０は、親２Ａ８抗体と比較して、同様の凝固効力を維持した。

実施例９．親和性改善抗体は血友病Ａマウスの尾静脈切断のモデルにおいてより良い生存率を示す
親和性改善抗体が出血マウスにおいて予防効果におけるさらなる効力があるか否かを決定するために、血友病Ａマウスの尾静脈切断モデルを使用した。損傷２４時間前に、マウスに尾静脈注入を介して種々の示された量の親抗−ＴＦＰＩ抗体２Ａ８または種々の示された量のＡ２００を投与した。投与２４時間後に、（直径における）先端から２．７ｍｍで左尾静脈を切断した。生存を、切断後２４時間にわたって観察した。生存率は、組換えＦＶＩＩＩ（１０ＩＵ／ｋｇから３０ＩＵ／ｋｇ）を与えたとき、用量依存的であることが証明された。

図４は、選択された親和性改善抗体Ａ２００が、コントロールマウスＩｇＧ１（ＣＴＸＩｇＧ１）と比較して、血友病Ａマウスの生存を用量依存的に有意に延長し、親抗体２Ａ８よりもそれぞれ同量でより良い生存率を示すことを示す

実施例１０．親和性改善抗体は、ヒト血友病Ｃ（ＦＸＩ−欠乏）血漿を使用して増強した凝固を示した
さらに、ＲＯＴＥＭアッセイを、血友病Ｃ患者を模倣するヒト第ＸＩ因子欠乏（ＦＸＩ−欠乏）血漿において凝固時間に対する抗体の効果を試験するために利用した。血漿凝固時間の短縮における親和性改善抗−ＴＦＰＩ抗体の効果の検出におけるこのＲＯＴＥＭアッセイの結果は、図５において示される。図５は、２Ａ８変異体である２Ａ８−２００が、ヒト血友病Ｃ血漿における凝固を用量依存的に増強し、その効果が組換えＦＶＩＩａに匹敵することを示す。

本発明は、特定の態様および実施例に関して記載しているが、種々の修飾および変化が行われ得ること、均等物が本発明の精神および範囲から逸脱することなく置き換えられ得ることを理解すべきである。したがって、明細書および実施例は、限定的意味よりもむしろ説明的意味であると考えるべきである。さらに、本明細書において言及されている全ての文献、参考書、特許出願および特許は、出典明示によりそれらの全体を本明細書に包含させる。

Claims

ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナルＩｇＧ抗体であって、
（ａ）（ｉ）ＦＴＦＸ _１ＳＹＧＭＸ _２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域であって、ここでＸ _１は、ＲまたはＳであり、Ｘ _２は、ＳまたはＤであり、但し、Ｘ _１がＲであり且つＸ _２がＳである場合を除く；
（ｉｉ）ＳＩＲＧＳＸ _３Ｘ _４ＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧからなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域であって、ここで、Ｘ _３は、ＳまたはＲであり、Ｘ _４は、ＳまたはＧであり、但し、Ｘ _３がＳであり且つＸ _４がＳである場合を除く；および
（ｉｉｉ）ＬＹＲＹＷＦＤＹからなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域
を含むヒト重鎖、および
（ｂ）（ｉ）ＳＧＤＮＬＸ _５Ｘ _６ＹＹＡＨからなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域であって、ここで、Ｘ _５は、ＲまたはＰであり、Ｘ _６は、ＮまたはＫであり、但し、Ｘ _５がＲであり且つＸ _６がＮである場合を除く；
（ｉｉ）Ｘ _７ＹＤＸ _８ＮＲＰＳからなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域であって、ここで、Ｘ _７は、ＹまたはＦであり、Ｘ _８は、ＮまたはＶであり、但し、Ｘ _７がＹであり且つＸ _８がＮである場合を除く；および
（ｉｉｉ）ＱＸ _９ＷＸ _１０Ｘ _１１Ｘ _１２Ｘ _１３ＰＶからなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域であって、Ｘ _９は、ＳまたはＡであり、Ｘ _１０は、ＤまたはＷであり、Ｘ _１１は、ＤまたはＳであり、Ｘ _１２は、ＧまたはＳであり、そしてＸ _１３は、ＶまたはＴであり、但し、Ｘ _９がＳであり、Ｘ _１０がＤであり、Ｘ _１１がＤであり、Ｘ _１２がＧであり、そしてＸ _１３がＶである場合を除く；
を含むヒト軽鎖
を含む、抗体。
（ａ）ヒト重鎖が配列番号：１０を含み；
（ｂ）ヒト軽鎖が配列番号：１７を含む
請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナルＩｇＧ抗体。
（ａ）ヒト重鎖が配列番号：７を含み；
（ｂ）ヒト軽鎖が配列番号：１４を含む
請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナルＩｇＧ抗体。
Ｋｕｎｉｔｚ２ドメインを含むヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の領域に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナルＩｇＧ抗体であって、
（ａ）（ｉ）ＤＳＶＳＳＤＳＡＡＷＳからなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）ＩＩＹＸ _１４ＲＳＫＷＹＮＸ _１５ＹＡＶＳＶＫＳからなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域であって、Ｘ _１４は、ＫまたはＹであり、Ｘ _１５は、ＤまたはＲであり、但し、Ｘ _１４がＫでありＸ _１５がＤである場合を除く；および
（ｉｉｉ）ＷＨＳＤＫＨＷＧＦＤＤからなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域；
を含むヒト重鎖、および
（ｂ）（ｉ）ＲＳＳＱＳＬＶＦＸ _１６ＤＧＸ _１７ＴＹＬＮからなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域であって、ここで、Ｘ _１６は、ＳまたはＲであり、Ｘ _１７は、ＮまたはＩであり、但し、Ｘ _１６がＳでありＸ _１７がＮである場合を除く；
（ｉｉ）ＫＧＳＮＲＡＳのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および
（ｉｉｉ）ＴＦＰＩに特異的に結合し、ＱＱＹＤＳＹＰＬＴからなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域
を含むヒト軽鎖
を含む、抗体。
配列番号：３に対してＧ４４Ｓの置換をさらに含む、請求項４に記載の抗体。
配列番号：１に対してＱ１Ｅの置換をさらに含む、請求項１に記載の抗体。
配列番号：２に対してＤ１Ｓ、Ｉ２Ｙ、Ａ１３ＳまたはＥ８０Ｍの置換またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１に記載の抗体。
（ａ）ヒト重鎖が配列番号：２５を含み；
（ｂ）ヒト軽鎖が配列番号：３３を含む
請求項４に記載の単離されたヒトモノクローナルＩｇＧ抗体。
（ａ）ヒト重鎖が配列番号：２６を含み；
（ｂ）ヒト軽鎖が配列番号：３４を含む
請求項４に記載の単離されたヒトモノクローナルＩｇＧ抗体。
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のＫｕｎｉｔｚ２ドメインの少なくとも一部に結合する、請求項１から４のいずれかに記載の抗体。
治療有効量の請求項１から１０のいずれかに記載のモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。