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CN107428838B - 结合tfpi的新型抗体以及包含所述抗体的组合物 - Google Patents

结合tfpi的新型抗体以及包含所述抗体的组合物 Download PDF

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CN107428838B CN201580078235.5A CN201580078235A CN107428838B CN 107428838 B CN107428838 B CN 107428838B CN 201580078235 A CN201580078235 A CN 201580078235A CN 107428838 B CN107428838 B CN 107428838B
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Abstract

本发明涉及一种特异性结合组织因子通道抑制剂(TFPI)的抗体，一种编码所述抗体的核酸，一种包含所述核酸的载体，一种使用所述载体转化的宿主细胞，一种用于生产所述抗体的方法，以及一种用于治疗血友病的药物组合物，其包含所述抗体作为活性成分。本发明所述的特异性结合TFPI的抗体，可通过抑制TFPI激活外源性凝血途径。因此，本发明所述的抗体可以有效用于治疗抗体诱导的血友病患者和预防A型血友病或B型血友病患者的凝血疾病。

Description

结合TFPI的新型抗体以及包含所述抗体的组合物
技术领域
本发明涉及一种特异性结合组织因子通道抑制剂(TFPI)的抗体，编码所述抗体的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，用于生产所述抗体的方法，以及用于治疗血友病的药物组合物，其包含所述抗体作为活性成分。
背景技术
已知，在大约30％的A型和B型血友病患者中，对用于治疗的FVIII(VIII因子)或FIX(IX因子)蛋白生成抗体，从而显著降低所述蛋白的治疗效果。作为蛋白质的替代物，已经施用活化的VIIa因子或aPCC(血浆来源的活化的凝血素复合物浓缩物(plasma-derivedactivated prothrombin complex concentrate))。
将上述重组蛋白通过每周两次或多次静脉内注射施用于血友病患者，但是持续存在由重复施用重组蛋白引起的不便的问题。因此，积极地进行了对具有增加的半衰期的长效重组蛋白的研究。
在血友病模型中，近来尝试了一种针对TFPI(组织因子通道抑制剂)的方法。TFPI牵涉在外源性凝血途径中，并且通过使用TF/FVIIa防止X因子激活来抑制凝血的功能(见图1)。因此，当TFPI被抗TFPI抗体抑制时，出血过程中的凝血可以通过外源性途径激活。
TFPI由三个KPI结构域(Kunitz型结构域或Kunitz结构域)组成，并且KPI-2(Kunitz结构域2)通过直接结合FXa来抑制FXa(见图2)。这意味着KPI-2形成TF/FVIIa/FXa/TFPI复合物，导致直接抑制FXa的生成。
抗TFPI抗体可以用于已经生成了对抗FVIII或FIX蛋白的抗体的患者。此外，抗TFPI抗体具有极长的半衰期(大约2周)，并且因此可以减少其施用次数。
针对TFPI的血友病治疗剂主要处于研究阶段或初始开发阶段。例如，由NovoNordisk开发的人源化单克隆抗体(mAb)mAb2021是人源化抗体(IgG4)，其为抗TFPI单克隆抗体，并处于1期临床阶段。此外，由Baxter开发的ARC19499是靶向TFPI的聚乙二醇化适体(aptamer)，并处于临床前阶段。此外，由Baxter和3B Pharmaceuticals开发的JBT2329是聚乙二醇化抗人TFPI 20肽，并处于临床前阶段。
不断提出对治疗血友病新药的需要，并且对开发不同于绕过剂(bypassingagent)如FVIIa方法的治疗剂存在迫切需要。尤其，优选抑制TFPI通道的药物的方法。在使用凝血因子给药的血友病患者中，存在对所述因子具有抗性的许多患者，并且因此需要一种新型药物。然而，应该考虑如抗原(Ag)-抗体(Ab)复合物清除率的医学问题。
因此，本发明的发明人做出大量的努力，开发了特异性结合TFPI的新型抗体，并且因此，发现抗体的用途可通过抑制TFPI的抗凝机制来激活外源性凝血途径，从而完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供特异性结合TFPI的新抗体，编码所述抗体的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，用于生产所述抗体的方法，以及用于治疗抗体诱导的血友病或预防A型血友病和B型血友病患者的凝血疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述抗体作为活性成分并且能够抑制TFPI从而激活外源性凝血途径。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了特异性结合由SEQ ID NO:39表示的TFPI(组织因子通道抑制剂)的抗体。
本发明还提供了：编码抗TFPI抗体的核酸；含有所述核酸的载体；和具有其中引入所述载体的细胞。
本发明还提供了用于治疗血友病的药物组合物，其包含抗TFPI抗体作为活性成分。
附图说明
图1显示凝血和TFPI的外源性途径。
图2显示TFPI的蛋白质结构示意图和KPI结构域的功能。
图3显示纯化的抗TFPI抗体中T417和T308克隆抗体蛋白质电泳(SDS-PAGE)的结果。
图4显示抗TFPI抗体中克隆T417和人源化抗体克隆308的氨基酸序列。
图5显示抗TFPI抗体中作为克隆308抗体突变体的308-2和302-4克隆抗体的氨基酸序列。
图6显示抗TFPI抗体中作为克隆308抗体突变体的308-2和302-4克隆抗体IgG的蛋白质电泳(SDS-PAGE)结果。
图7显示根据动物的种类TFPI KPI-2(Kunitz结构域2)蛋白的蛋白质电泳(SDS-PAGE)结果。
图8图示了抗TFPI抗体的亲和力。
图9图示了通过FXa活性测定评估抗TFPI抗体中嵌合抗体作用的结果。
图10图示了通过FXa活性测定评估抗TFPI抗体中人源化抗体作用的结果。
图11图示了通过FXa活性测定评估抗TFPI抗体中回复突变抗体作用的结果。
图12图示了通过TF/FVIIa/Fxa复合物测定评估抗TFPI抗体中嵌合抗体作用的结果。
图13图示了通过TF/FVIIa/Fxa复合物测定评估抗TFPI抗体中人源化抗体作用的结果。
图14图示了通过TF/FVIIa/Fxa复合物测定评估抗TFPI抗体中回复突变抗体(back-mutated antibodies)作用的结果。
图15图示了通过凝血酶生成测定评估抗TFPI抗体中人源化抗体作用的结果。
图16图示了通过凝血酶生成测定评估抗TFPI抗体中回复突变抗体作用的结果。
图17显示抗TFPI抗体中的克隆308和人TFPI K2结构域之间的预期结合。由红色表示的分子表示人TFPI K2结构域，和由绿色表示的分子表示克隆308抗体。
图18显示抗TFPI抗体中的克隆308的重链可变区和人TFPI抗原之间的预期结合。
图19显示抗TFPI抗体中的克隆308的轻链可变区和人TFPI抗原之间的预期结合。
图20至28显示通过Fxa活性测定评估亲和力成熟的抗TFPI抗体作用的结果。
图29至33显示通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟的抗TFPI抗体作用的结果。
图34显示通过凝血酶生成测定评估亲和力成熟的抗TFPI抗体作用的结果。
具体实施方式
据报道TFPI(组织因子通道抑制剂)牵涉在外源性凝血途径中，并通过使用TF/FVIIa防止X因子激活来抑制凝血。因此，本发明的发明人已经尝试构建用于治疗或预防血友病的抗体。具体地，本发明的主题是通过抑制TFPI的KPI-2的抗体来激活外源性凝血途径。通过抗体靶向的抗原区是TFPI的KPI-2结构域，其在人、兔和猴之间具有90％以上相同的氨基酸序列。因此，当使用TFPI的KPI-2结构域时，容易设计动物研究，并且可以引入用于测量凝血速率的简单模型。
如本文所使用的术语“组织因子通道抑制剂”或“TFPI”指通过细胞自然表达地人TFPI的变体、同种型和物种同源物。在本发明的优选实施方式中，本发明的抗体与TFPI的结合减少凝血时间。
在本发明的实例中，制备了“克隆308”、“克隆308-2”和“克隆308-4”，其是分离人单克隆抗体，具有特异性结合由SEQ ID NO:39表示的TFPI(组织因子通道抑制剂)的结构特征。各抗体的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列示于下表5和7。如下表4和6所示，抗TFPI抗体可包含重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列以及与其同源的序列。
在本发明的另一个实例中，纯化的抗体克隆T417、克隆T308、克隆308、克隆308-2或克隆308-4对重组人TFPI的定量亲和力使用Biacore T-200生物传感器(美国GEHEALTHCARE制造)测量(实施例6)。因此，如表13和图8所示，所有制备的克隆抗体亲和力彼此有些不同。尤其，显示出克隆308-2和克隆308-4的亲和力远高于克隆308。
因此，一方面，本发明涉及特异性结合由SEQ ID NO:39表示的TFPI(组织因子通道抑制剂)的抗体。
在本发明中，抗体可含有包含以下的重链可变区：重链CDR1，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:5、11或23；重链CDR2，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:6、12、26或27；以及重链CDR3，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:7或13。
在本发明中，抗体可含有包含以下的轻链可变区：轻链CDR1，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:8或14；轻链CDR2，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:9或15；以及轻链CDR3，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:10或16。
在本发明中，抗体可含有包含与以下氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选100％同源性的序列的重链可变区：SEQ ID NO:1、3、21、24或25，并且抗体可含有包含与以下氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选100％同源性的序列的轻链可变区：SEQ ID NO:2、4或22。
在本发明中，抗体可含有包含以下氨基酸序列的重链可变区：SEQ ID NO:1、3、21、24或25，和含有以下氨基酸序列的轻链可变区：SEQ ID NO:2、4或22。抗体可以是人单克隆抗体，但不限于此。
在本发明的实例中，制备了“克隆1001”、“克隆1015”、“克隆1021”、“克隆1023”、“克隆1024”、“克隆1104”、“克隆1123”、“克隆1202”、“克隆1208”、“克隆1214”、“克隆1216”、“克隆1223”、“克隆1224”、“克隆1232”、“克隆1234”、“克隆1238”、“克隆1243”、“克隆1248”、“克隆3007”、“克隆3016”、“克隆3024”、“克隆3115”、“克隆3120”、“克隆3131”、“克隆3203”、“克隆3241”、“克隆4011”、“克隆4017”、“克隆4034”、“克隆4041”、“克隆4141”、“克隆4146”、“克隆4206”、“克隆4208”、“克隆4278”、“克隆4287”、“克隆1”、“克隆2”、“克隆3”、“克隆4”、“克隆5”、“克隆6”、“克隆7”、“克隆8”、“克隆9”、“克隆10”、“克隆11”、“克隆12”、“克隆13”、“克隆14”、“克隆15”、“克隆16”、“克隆17”、“克隆18”、“克隆19”、“克隆20”、“克隆21”、“克隆22”、“克隆23”、“克隆A24”、“克隆A25”、“克隆A52”、“克隆A63”、“克隆A67”、“克隆A71”和“克隆A74”，其为分离的单克隆抗体，具有特异性结合由SEQ ID NO:39表示的TFPI(组织因子通道抑制剂)的结构特征。各抗体的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列示于下表20和23。如表下19和22所示，抗TFPI抗体可包含重链可变区和轻链可变区的序列以及与其同源的序列。
在本发明的另一个实例中，作为纯化的抗体的克隆12、克隆1023、克隆1202和克隆3241对重组人TFPI的定量结合亲和力使用Biacore T-200生物传感器(美国GEHEALTHCARE)测量(实施例13)。因此，如下表24所示，所有制备的克隆抗体显示彼此有些不同的亲和力。
因此，一方面，本发明涉及特异性结合由SEQ ID NO:39表示的TFPI(组织因子通道抑制剂)的抗体。
在本发明中，抗体可含有包含以下的重链可变区：重链CDR1，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NOs:149、157、163、172、181、182、183、188、201或203；重链CDR2，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:150、155、159、162、165、166、167、168、173、184、186、187或202；以及重链CDR3，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:151、156、170、174、175或185。
在本发明中，抗体可含有包含以下的轻链可变区：轻链CDR1，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:152、158、160、169、171、176、177或178；轻链CDR2，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:153，以及轻链CDR3，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:154、161、164、179或180。
在本发明中，抗体可含有包含与以下氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选100％同源性的序列的重链可变区：SEQ ID NO:95、97、98、99、100、102、104、105、107、109、110、112、113、114、115、117、118、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、138、141、142、143、144、145、146、148、195、197、198、199或200，并且抗体可含有包含与以下氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选100％同源性的序列的轻链可变区：SEQ ID NO:96、101、103、106、108、111、116、122、130、139、140、147或196。
在本发明中，抗体可含有包含以下序列的重链可变区：SEQ ID NO:95、97、98、99、100、102、104、105、107、109、110、112、113、114、115、117、118、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、138、141、142、143、144、145、146、148、195、197、198、199或200，和含有以下氨基酸序列的轻链可变区：SEQ ID NO:96、101、103、106、108、111、116、122、130、139、140、147或196。
抗体的氨基酸序列可以由保守置换替代。如本文所使用的术语“保守置换(conservative substitution)”是指修饰涉及一个或多个氨基酸被具有类似生物化学性质的氨基酸置换的多肽，这不会导致多肽的生物或生物化学功能丧失。“保守氨基酸置换”是用具有类似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基。本发明所属领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)，以及具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。可以设想本发明的抗体可具有保守氨基酸置换并且仍然保持活性。
对于核酸和多肽，术语“基本同源(substantial homology)”表示两种核酸或两种多肽，或它们的指定序列，当与适当的核苷酸或氨基酸插入或缺失进行最佳比对和比较时，核苷酸或氨基酸的至少约80％，通常至少约85％，优选至少约90％、91％、92％、93％、94％或95％，更优选核苷酸或氨基酸的至少约96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％或99.5％是相同的。或者，当片段将在选择性杂交条件下，与链的互补物杂交时，存在核酸的基本同源。还包括的是与本文所述的具体核酸序列和氨基酸序列具有基本同源性的核酸序列和多肽序列。
如下表2、5和7所示，在根据本发明的抗体中，重链(VH)CDR1、CDR2和CDR3序列和轻链(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列可由形成CDR1、CDR2和CDR3的结构类似的重链(VH)和轻链(VL)序列的混合物构成，其各自由重链(VH)/轻链(VL)对组成。
如下表20和23所示，在本发明的抗体中，重链(VH)CDR1、CDR2和CDR3序列和轻链(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列可以由形成CDR1、CDR2和CDR3的结构类似的重链(VH)和轻链(VL)序列的混合物构成，其各自由重链(VH)/轻链(VL)对组成。
如本文所使用的术语“抗体”或“抗体组成”指制备单一分子组成的抗体分子。单克隆抗体组成显示对具体表位(epitope)的结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”指显示具有源自人胚系免疫球蛋白序列可变区和恒定区的单一结合特异性的抗体。本发明的人抗体可包括没有通过人胚系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
如本文所使用的术语“抗体”指蛋白质分子，其包含与具体抗原具有免疫反应的免疫球蛋白分子，并且其用作特异性识别抗原的受体。该术语可包括所有多克隆抗体，单克隆抗体、全长抗体和抗体片段。此外，该术语可包括嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、二价或双特异性分子(例如，双特异性抗体)、双抗体、三抗体和四抗体。
全长抗体具有两个全长轻链和两个全长重链，其中，各轻链通过二硫键连接重链。全长抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG，并且IgG的亚类包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。术语“抗体片段”指具有抗原结合功能的片段，并且意欲包括Fab、Fab’、F(ab′)2、scFv和Fv。
Fab包含轻链可变区和重链可变区、轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)，并且具有抗原结合位点。Fab’与Fab的差异在于其在重链CH1结构域的C末端具有包含一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。F(ab′)2抗体通过Fab’铰链区的半胱氨酸残基之间的二硫键形成。
Fv(可变片段)指仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。dsFv具有重链可变区和轻链可变区彼此通过二硫键连接的结构，并且scFV通常具有重链可变区和轻链可变区彼此通过肽接头共价连接的结构。这些抗体片段可以使用蛋白酶获得(例如，Fab片段可以通过使用木瓜蛋白酶消化全长抗体而获得，并且F(ab′)2片段可以通过使用胃蛋白酶消化全长抗体而获得)。优选地，这些抗体片段可以通过基因重组技术产生(例如，使用编码抗体重链或其可变区的DNA和编码轻链或其可变区的DNA作为模板连同引物对一起通过PRC(聚合酶链式反应)进行扩增，以及使用引物对的组合使得编码多肽接头的DNA与重链或其可变区和轻链或其可变区连接而进行扩增)。
免疫球蛋白具有重链和轻链，并且各重链和轻链含有恒定区和可变区(该区还被称为结构域)。轻链和重链可变区含有四个框架区和三个超变区，还被称为“互补决定区”(以下称为“CDR”)。CDR主要发挥结合抗原表位的作用。各链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始顺序编号，并且通常也由具体CDR所在的链识别。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”指从基本相同的抗体群体获得的具有单一分子组成的抗体分子。该单克隆抗体可显示针对具体表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”指来源于包括互补决定区和框架区的人免疫球蛋白的分子，其中，抗体的全长氨基酸序列由人免疫球蛋白的氨基酸序列组成。人抗体通常用于治疗人类疾病，并且具有以下优点。第一，人抗体可更容易地与人免疫系统相互影响，使得目标细胞可以更有效地通过例如互补依赖性毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的毒性(ADCC)而破坏。第二，人免疫系统不会将抗体识别为外源抗体。第三，甚至当抗体以较低频率少量施用时，其在人循环系统中的半衰期类似于天然存在的抗体的半衰期。
因此，根据本发明的抗体是特异性结合TFPI并且对TFPI显示高亲和力和特异性的抗体。此外，由于本发明的抗体是人源的，其显示低的免疫原性，并且因此有效用于治疗疾病，如抗体诱导的血友病(A型血友病或B型血友病)。
如本文所使用的术语“克隆T417”、“克隆T308”、“克隆308”、“克隆308-2”或“克隆308-4”，其特异性结合TFPI，是指结合TFPI的抗体，这产生了对TFPI抑制的生物活性。该术语可以与术语“抗TFPI抗体”互换使用。在此，克隆T417和克隆T308是一种抗体，其是在使用重组人TFPI免疫小鼠后分离的抗体，并且克隆308是一种通过人源化克隆T417而制备的抗体。此外，克隆308-2和克隆308-4是如图5所示通过使用谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)使克隆308重链的赖氨酸(K)突变而制备的抗体。
抗TFPI抗体的平衡解离常数(KD)可以例如如下。克隆308的KD可以是5.5x10-11M或更低，优选5.25x10-11M或更低，更优选5.0x10-12M或更低；克隆308-2的KD可以是3.63x10-11M或更低，优选3.465x10-11M或更低，更优选3.3x10-11M或更低；克隆308-4的KD可以是2.64x10-11M或更低，优选2.52x10-11M或更低，更优选2.4x10-11M或更低。
如本文所使用的术语“克隆1001”、“克隆1015”、“克隆1021”、“克隆1023”、“克隆1024”、“克隆1104”、“克隆1123”、“克隆1202”、“克隆1208”、“克隆1214”、“克隆1216”、“克隆1223”、“克隆1224”、“克隆1232”、“克隆1234”、“克隆1238”、“克隆1243”、“克隆1248”、“克隆3007”、“克隆3016”、“克隆3024”、“克隆3115”、“克隆3120”、“克隆3131”、“克隆3203”、“克隆3241”、“克隆4011”、“克隆4017”、“克隆4034”、“克隆4041”、“克隆4141”、“克隆4146”、“克隆4206”、“克隆4208”、“克隆4278”、“克隆4287”、“克隆1”、“克隆2”、“克隆3”、“克隆4”、“克隆5”、“克隆6”、“克隆7”、“克隆8”、“克隆9”、“克隆10”、“克隆11”、“克隆12”、“克隆13”、“克隆14”、“克隆15”、“克隆16”、“克隆17”、“克隆18”、“克隆19”、“克隆20”、“克隆21”、“克隆22”、“克隆23”、“克隆A24”、“克隆A25”、“克隆A52”、“克隆A63”、“克隆A67”、“克隆A71”或“克隆A74”，其特异性结合TFPI，是指结合TFPI的抗体，这产生了对TFPI抑制的生物活性。该术语可与术语“抗TFPI抗体”互换使用。
此外，如本文所使用的术语“克隆T417”、“克隆T308”、“克隆308”、“克隆308-2”或“克隆308-4”，其特异性结合TFPI，是指结合TFPI导致抑制TFPI生物活性的抗体。该术语可以与“抗TFPI抗体”互换使用。在此，克隆T417和克隆T308是抗体，是在使用重组人TFPI免疫小鼠后分离的抗体，并且克隆308是通过人源化克隆T417的而制备的抗体。此外，克隆308-2和克隆308-4是如图5所示通过使用谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)使克隆308重链的赖氨酸(K)突变而制备的抗体。
抗TFPI抗体的平衡解离常数(KD)可以例如如下。克隆12的KD可以是9.009x10-12M或更低，优选8.59x10-12M或更低，更优选8.19x10-12M或更低；克隆1023的KD可以是3.31x10-11M或更低，优选3.16x10-11M或更低，更优选3.01x10-11M或更低；克隆1202的KD可以是10.42x10-12M或更低，优选9.94x10-12M或更低，更优选9.47x10-12M或更低；以及克隆3241的KD可以是8.14x10-11M或更低，优选7.77x10-11M或更低，更优选7.4x10-11M或更低。
在本发明的另一个实例中，检查结合人TFPI的重链可变区基因和轻链可变区基因，然后将重链可变区基因连接到人IgG4重链恒定区，并且将轻链可变区基因连接到人轻链恒定区。然后，将这些基因的每个插入到动物细胞的蛋白质表达载体中从而构建载体。将所构建的载体转染到Expi293细胞系中，然后将其培养以产生抗体。所产生的抗体使用蛋白质A纯化(实施例1)。
在本发明的另一个实例中，检查结合人TFPI的重链可变区基因和轻链可变区基因，然后将重链可变区基因连接到IgG4重链恒定区，并且将轻链可变区基因连接到人轻链恒定区。然后，将这些基因的每个插入到动物细胞的蛋白质表达载体中从而构建载体。将所构建的载体转染到Expi293细胞系中，然后将其培养以产生抗体。所产生的抗体使用蛋白质A纯化(实施例11和12)。
因此，在另一方面，本发明涉及编码抗体的核酸。用于本发明的核酸可以存在于细胞裂解物中，或者以部分纯化或基本纯净的形式存在。当通过包括碱性/SDS处理、CsCl条带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域中熟知的标准技术从其他细胞成分或其他污染物，例如其他核酸或蛋白质，中纯化出来时，核酸是“分离的”或“呈现基本纯净的”。本发明的核酸可以是，例如DNA或RNA，并且可包含或不包含内含子序列。
在又一方面，本发明涉及包含核苷酸的载体。为了表达其抗体或抗体片段，编码部分或全长轻链和重链的DNA可以通过标准分子生物学技术获得(例如，使用表达感兴趣的抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)，并且可以将DNA插入到表达载体中使其可操作地连接到转录和翻译控制序列。
如本文所使用的术语“可操作地连接”意欲指将抗体基因连接到载体使得转录和翻译控制序列提供其调控抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列与所使用的表达宿主细胞相容。抗体重链基因和抗体轻链基因可以被插入到单独的载体中，或两种基因被插入到相同表达载体中。抗体基因通过标准方法(例如，在抗体基因片段和载体上连接互补的限制性位点，或如果限制性位点不存在则平端连接)插入到表达载体中。在一些情况下，重组表达载体可编码信号肽，其促进从宿主细胞分泌的抗体链。抗体链基因可以在载体中克隆，使得信号肽框内连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽，或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。此外，重组表达载体携带在宿主细胞中控制抗体链基因表达的调节序列。术语“调节序列”意欲包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)，其控制抗体链基因的转录和翻译。本领域的技术人员将理解的是，包含选择调控序列的表达载体的设计，可取决于这样的因素，如选择要转化的宿主细胞、所需蛋白质表达水平等。
在另一方面，本发明涉及包含核酸或载体的宿主细胞。核酸或载体被转染到宿主细胞中。转染可使用各种通常用于将外源核酸(DNA或RNA)引入原核细胞或真核细胞中的技术，例如电泳、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染或脂质体转染而进行。根据本发明的抗体鉴于其适用于哺乳动物细胞，可以在真核细胞，优选哺乳动物宿主细胞中表达。用于表达抗体的哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(其包括连同例如DHFR可选标记一起使用的dhfr-CHO细胞)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。
在另一方面，本发明涉及用于生成抗体的方法，其包括培养宿主细胞以表达抗体。当编码抗体基因的重组表达载体被引入到哺乳动物细胞时，抗体基因可以通过培养宿主细胞一段时间以便抗体在宿主细胞中表达，优选培养宿主细胞一段时间以便在培养宿主细胞过程中将抗体分泌到培养基中而产生。
在一些情况下，所表达的抗体可以从宿主细胞中分离并纯化。抗体的分离和纯化可以通过用于蛋白质的传统分离/纯化方法(例如，色谱法)而进行。色谱法的实例包括包含蛋白质A柱和蛋白质G柱的亲和色谱法，离子交换色谱法和疏水色谱法。除了所述色谱法之外，可以使用过滤、超滤、盐析、透析等的组合来分离和纯化抗体。
在本发明的另一个实例中，进行FXa活性测定以评估抗TFPI抗体的作用(实施例7)。因此，如图9所示，发现在抗TFPI抗体候选物中作为嵌合抗体的克隆T308和克隆T417中，吸光度以浓度依赖性方式增加，表示两种抗体的TFPI抑制作用以抗体浓度依赖性方式增加。当在10nM的TFPI浓度下比较作用时，可见克隆T417的TFPI抑制活性好于克隆T308。
此外，如图10所示，克隆308使用在上述测定中确定具有更好作用的克隆T417，通过人源化过程而获得。克隆308还显示出吸光度的浓度依赖性增加，这表示它可以抑制TFPI。
此外，如图11所示，进行回复突变以增加克隆308的作用，并且获得克隆308-2和克隆308-4。可见克隆308-2和克隆308-4两者以浓度依赖性方式抑制TFPI。并且，当比较使用40nM和10nM处理的样本时，可见与克隆308比较，克隆308-2和克隆308-4的TFPI抑制活性增加。在40nM的浓度，与阳性对照(mAb2021或抗TFPI Ab)比较，克隆308-2和克隆308-4分别显示85％和82％的TFPI抑制活性，但是在10nM的浓度，克隆308-2显示出72％的TFPI抑制活性，并且克隆308-4显示出78％的TFPI抑制活性，这好于克隆308-2的TFPI抑制活性。此外，发现克隆抗体显示与克隆T417嵌合抗体相似的TFPI抑制活性，克隆T417嵌合抗体显示出77％的TFPI抑制活性。
在本发明的另一个实例中，进行TF/FVIIa/Fxa复合物测定以评估抗TFPI抗体的作用(实施例8)。具体地，在TFPI与抗TFPI抗体一同存在或独立于抗TFPI抗体存在的情况下，基于FXa活性评估了通过TF/FVIIa复合物生成Fxa和抑制Fxa的程度。
因此，如图12所示，克隆T308和克隆T417抗体是抗TFPI抗体候选物中显示出吸光度的浓度依赖性增加的嵌合抗体，这表明两种抗体的TFPI抑制作用以浓度依赖性方式增加。尤其，可见克隆T417的TFPI抑制活性好于克隆T308。
此外，如图13所示，克隆308使用具有比克隆T308更好效果的克隆T417抗体通过人源化过程获得。可见克隆308也显示出吸光度的浓度依赖性增加，这表明它抑制TFPI。
此外，如图14所示，进行回复突变以增加克隆308人源化抗体的效果。因此，与克隆308比较，克隆308-2和克隆308-4的TFPI抑制活性增加。在25nM的浓度，克隆308-2显示出37.8％的TFPI抑制活性，并且克隆308-4显示出68.4％的TFPI抑制活性，高于克隆308-2的TFPI抑制活性。
在本发明的另一个实例中，进行通过FXa活性测定和TF/FVIIa/Fxa复合物测定而选择的克隆308-2和克隆308-4的凝血酶生成测定(实施例9)。因此，如图15所示，与阴性对照组(没有抗体)比较，克隆T417和克隆308两者均显示出凝血酶生成峰值和凝血酶生成的增加。在使用2.5nM处理的样本中，与阴性对照组(没有抗体)比较，克隆T417和克隆308分别显示出208％和162％的凝血酶峰值，并且表示凝血酶生成的ETP值在克隆T417中为131％，在克隆308中为122％。因此，发现克隆T417具有比克隆308抗体更好的效果。
此外，如图16所示，与克隆308抗体比较，克隆308-2和克隆308-4显示出凝血酶生成峰值和总凝血酶生成的增加。尤其，在使用2.5nM处理的样本中，与阴性对照组(没有抗体)比较，克隆308-2和克隆308-4两者分别显示出凝血酶峰值增加183％和191％，并且ETP值在克隆308-2和克隆308-4两者中均为126％，这表明克隆抗体具有增加的生成凝血酶的能力。
在本发明的另一个实例中，进行FXa活性测定以评估抗TFPI抗体的作用(实施例14)。因此，如图20至28所示，证实了抗TFPI抗体候选物中亲和力成熟抗体的作用。发现抗体显示出吸光度以抗体浓度依赖性方式增加，这表明抗体的TFPI抑制效果以抗体浓度依赖性方式增加。
在本发明的另一个实例中，进行TF/FVIIa/Fxa复合物测定以评估抗TFPI抗体的作用(实施例15)。具体地，TF/FVIIa复合物的FXa生成和抑制程度在TFPI与抗TFPI抗体一同存在或独立于抗TFPI抗体存在的情况下基于FXa活性评估。因此，如图29至33和表27至36所示，证实了抗TFPI抗体MG1113候选物中亲和力成熟抗体的作用。发现抗体显示出吸光度以抗体浓度依赖性方式增加，这表明候选抗体的TFPI抑制作用以抗体浓度依赖性方式增加。
在本发明的另一个实例中，进行通过FXa活性测定而选择的抗TFPI抗体的凝血酶生成测定(实施例16)。因此，如图34所示，对于通过FXa活性测定和TF/FVIIa/Fxa复合物测定而选择的亲和力成熟抗体候选物中的第1023号抗体，凝血酶比较测定使用T417嵌合抗体进行。在2.5nM，与仅使用样本稀释液处理的空白比较，T417抗体显示出凝血酶峰值增加大约335％，并且与空白比较，第1023抗体显示凝血酶峰值增加大约401％。此外，在ETP表示凝血酶总生成的情况下，T417抗体在2.5nM的浓度与阴性对照组(没有抗体)比较，显示出ETP增加大约293％，并且与阴性对照组比较，第1023号抗体显示出ETP增加大约309％。两种抗体之间的比较表示从亲和力成熟获得的第1023号抗体具有比T417抗体更好的效果。
在进一步的方面，本发明涉及用于治疗血友病的药物组合物，其包含抗TFPI抗体作为活性成分。
本发明还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的抗TFPI抗体以及药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指可以加入到活性成分中帮助配制制剂或稳定制剂并且对患者不造成重大不良毒理效应的物质。
如本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不损害生物活性并且以施用的化合物为特征而不刺激生物体的载体或稀释剂。无菌和可生物相容的载体被用作配制成液体溶液的组合物中药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是生理盐水、无菌水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇或它们两种或多种的混合物。此外，如需要，本发明的组合物可包含其他传统添加剂，其包括抗氧化剂、缓冲剂和细菌抑制剂。此外，本发明的组合物可以可以借助稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂配制成可注射的形式、例如水溶液、悬浮液或乳液。此外，根据本发明的组合物可以配制成丸剂、胶囊、颗粒或片剂。其他载体在文献[Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin)]中描述。该组合物可含有治疗有效量的至少一种抗TFPI抗体。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这种介质和试剂用于药物活性物质是本领域中已知的。组合物优选配制成肠胃外注射。组合物可以配置为固体、溶液、微乳剂、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)的溶剂或分散体介质，以及它们适合的混合物。在一些情况下，组合物可含有等渗剂，例如，糖、多元醇、山梨醇或氯化钠。如需要，无菌可注射溶液可以通过所需量的活性化合物在合适的溶剂中与上面列举的成分中的一种或组合进行制备，接着过滤灭菌。通常，分散体通过将活性化合物并入无菌载体中而制备，所述无菌载体含有碱性分散介质和来自上面列举的那些所需的其他成分。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分的粉末加上任何另外的所需成分。
抗TFPI抗体可以用作治疗目的，用于治疗遗传和获得性缺陷或凝血缺陷。例如，抗体可用来阻止TFPI和FXa之间的相互影响，或防止TFPI依赖的TF/FVIIa活性抑制。此外，人单克隆抗体还可以用来恢复TF/FVIIa驱动的FXa生成，以避开FVIII或FIX依赖的FXa扩增不足。
抗体在治疗止血障碍，如血小板减少、血小板疾病和出血性疾病(例如血友病A和血友病B)方面具有治疗用途。所述疾病可以通过向有需要的患者施用治疗有效量的抗TFPI抗体治疗。抗体在治疗如创伤和出血性中风等适应症的不受控制的出血方面也具有治疗用途。因此本发明还提供了一种用于缩短出血时间的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的抗TFPI抗体。
抗体可以用作单一疗法或与其他疗法组合使用以解决止血障碍。例如，认为共同施用本发明的一种或多种抗体与凝血因子，如TF(组织因子)、FVII(VII因子)或FX(X因子)，对治疗血友病有用。通过抗体与凝血因子的共同施用或联合治疗是指两种治疗药物的施用，每种治疗药物单独配制或一起配制在一种组合物中，并且当单独配制时，大致相同或不同时间施用，但在相同的治疗期间。
可以将药物组合物胃肠外给药至患有血友病A或B的受试者，给药剂量和频率可以随出血发作的严重程度而变化，或者在预防性治疗的情况下可以随患者凝血缺陷的严重程度而变化。组合物可以作为单次快速注射或通过连续输注向需要的受试者施用。例如，作为Fab片段存在的本发明抗体的单次快速施用的量可以是0.0025至100mg/kg体重、0.025至0.25mg/kg、0.010至0.10mg/kg或0.10-0.50mg/kg。对于连续输注，作为Fab片段存在的本发明抗体可以以0.001至100mg/kg体重/分钟、0.0125至1.25mg/kg/min、0.010至0.75mg/kg/min、0.010至1.0mg/kg/min或0.10-0.50mg/kg/min施用1-24小时、1-12小时、2-12小时、6-12小时、2-8小时或1-2小时。对于施用作为全长抗体(具有完整恒定区)存在的本发明抗体，剂量可以是大约1-10mg/kg体重、2-8mg/kg或5-6mg/kg。这种全长抗体通常将通过灌注延长30分钟至35分钟来施用。施用的频率将取决于疾病的严重程度。频率可以从每周三次到每一周或两周一次。
此外，组合物可以通过皮下注射向患者施用。例如，10至100mg抗TFPI抗体的剂量可以每周一次、每两周一次或每月一次通过皮下注射向患者施用。
如本文所使用的“治疗有效量”指抗TFPI抗体变异体的量或所述抗体和TF(组织因子)、FVII(VII因子)或FX(X因子)组合的量，其是有效增加体内凝血时间所必须的，或者另外在有需要的患者体内产生可测量的益处。精确的量将取决于许多因素，其包括但不限于，治疗组合物的成分和物理特性、预期患者群体、个别患者考虑等，并且可以容易地通过本领域技术人员确定。当彻底考虑这些因素时，重要的是使用足够实现最高效果而不导致副作用的最小量，并且该剂量可以容易地通过本领域的技术人员确定。
本发明的药物组合物的剂量可根据各种因素改变，其包括患者的健康状况和体重、疾病的严重程度、药物的种类和施用的途径及时间。组合物可以通过任一通常可接受的途径，例如口服、直肠、静脉内、皮下、子宫内或脑血管内，以每日单次剂量或多次剂量向哺乳动物，包括大鼠、小鼠、家畜人等，施用。
实施例
以下，将参考实施例进一步详细描述本发明。将对本领域的技术人员显而易见的是这些实施例仅是说明目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：制备抗TFPI抗体
作为抑制X因子活性的抗TFPI抗体(组织因子通道抑制剂)，制备可防止凝血抑制的抗体，其可用于治疗或预防血友病。
1-1：抗体的选择
使用重组人TFPI免疫小鼠，并且从小鼠中切除脾脏。从脾脏中提取B淋巴细胞，由此分离全部RNA，然后合成至cDNA中。从合成的cDNA中，通过PCR(聚合酶链式反应)克隆各种小鼠抗体基因，并且插入到pComb3X噬菌粒中，从而构建显示具有各种序列的抗体片段的抗体文库。为了从抗体文库中选择人TFPI特异性抗体，将TFPI固定的磁珠和抗体文库彼此混合，分离并培养结合于目标抗原的克隆。然后，特异性结合于目标抗原(人TFPI)的克隆(T417或T308克隆细胞)通过ELISA(酶联免疫测定)单独选择，并且抗体基因的氨基酸序列通过测序鉴定。
因此，如下表1所示，可以选择特异性结合于人TFPI的克隆T417和克隆T308，并且鉴定其氨基酸序列。
下表2是基于Kabat编号系统鉴定的表1克隆抗体的CDR氨基酸序列。
表1
Figure GDA0002681087030000171
表2
Figure GDA0002681087030000172
Figure GDA0002681087030000181
1-2：克隆T417和T308克隆抗体的IgG基因
从T417和T308克隆细胞中，提取含有编码T417和T308克隆抗体的重链可变区的基因的pComb3X噬菌粒。使用各提取的pComb3X噬菌粒作为模板，使用Accupower Pfu PCR预混料(Bioneer)与含有NotI的正向引物(表3；SEQ ID NO:17)和含有ApaI的反向引物(表3；SEQID NO:18)一起进行PCR。PCR在以下条件下进行：94℃10分钟；然后30个循环，每个循环由94℃15秒、56℃30秒和72℃90秒组成；然后72℃10分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒分离。然后，各分离的基因在37℃使用NotI和ApaI限制性内切酶处理12小时以上。使用限制性内切酶处理的基因在1％琼脂糖凝胶上分离。含有IgG4重链恒定区基因的pcIW质粒载体也以相同方式消化并在琼脂糖凝胶上分离。使用T4 DNA连接酶(Cat.No.M0203S,New England BioLabs(NEB))，将各分离的T417和T308重链可变区基因连接到含有人重链恒定区的线性pcIw载体的KpnI和ApaI位点中。将连接产物转化到XL1-Blue细菌(电穿孔-感受态细胞；Cat.No.200228,Stratagene)中，并且将细菌细胞接种在含有羧苄青霉素(carbenicillin)的LB平板(Cat.No.LN004CA,NaraeBiotech)上，然后在37℃培养12小时以上。然后，从平板选择单一菌落并培养，并且使用质粒迷你试剂盒(Cat.No.27405,QIAGEN)由此分离质粒并通过DNA测区鉴定。
从T417和T308克隆细胞中提取含有编码T417和T308克隆抗体轻链可变区的基因的pComb3X噬菌粒。使用各提取的pComb3X噬菌粒作为模板，使用Accupower Pfu PCR预混料与含有NotI的正向引物(表3；SEQ ID NO:19)和含有KpnI的反向引物(表3；SEQ ID NO:20)一起进行PCR。PCR在以下条件下进行：94℃10分钟；然后30个循环，每个循环由94℃15秒、56℃30秒和72℃90秒组成；然后72℃10分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒分离。然后，各分离的基因在37℃使用NotI和KpnI限制性内切酶处理12小时以上。使用限制性内切酶处理的基因在1％琼脂糖凝胶上分离。pcIW质粒载体也以相同方式消化并在琼脂糖凝胶上分离。使用T4 DNA连接酶(Cat.No.M0203S,New England BioLabs(NEB))，将各分离的T417和T308轻链可变区基因连接到含有人重链恒定区的线性pcIw载体的KpnI和KpnI位点中。将连接产物转化到XL1-Blue细菌(电穿孔-感受态细胞；Cat.No.200228,Stratagene)中，并且将细菌细胞接种在含有羧苄青霉素的LB平板(Cat.No.LN004CA,NaraeBiotech)上，然后在37℃培养12小时以上。然后，从平板选择单一菌落并培养，并且使用质粒迷你试剂盒由此分离质粒(Cat.No.27405,QIAGEN)并通过DNA测区鉴定。
表3
Figure GDA0002681087030000191
1-3：抗TFPI T417、T308克隆抗体突变体IgG的生成和纯化
为了生成和纯化通过小鼠免疫获得的抗TFPI克隆T417和T308克隆，将Expi293FTM细胞在转染前一天以2.5X 106个细胞/mL的浓度接种。培养(37℃,8％CO2,125rpm)24小时后，加入Expi293TM表达培养基(Cat.No.A1435101,Gibco)以2.5X 106个细胞/mL的浓度制备30mL的细胞(生存力≥95％)。将30μg DNA(pcIw抗TFPI重链:15μg,pcIw抗TFPI轻链:15μg)在OptiProTMSEM培养基(Cat.No.12309019,Gibco)中稀释成总体积1.5mL并且在室温培养5分钟。培养5分钟后，1.5mL稀释的DNA和1.5mL ExpiFectamineTM 293试剂彼此很好的混合并在室温培养20-30分钟。将Expi293FTM细胞使用3mL DNA和ExpiFectamineTM 293试剂的混合物处理。悬浮培养(37℃,8％CO2,125rpm)16-18小时后，将150μL ExpiFectamineTM 293增强剂1(Cat.No.A14524,Gibco)和1.5mL ExpiFectamineTM 293增强剂2(Cat.No.A14524,Gibco)加入细胞，然后悬浮培养5天。完成培养后，将细胞以4000rpm离心20分钟以移除细胞碎片，并且使上清液通过0.22μm过滤器。每30mL培养基制备100μL蛋白质A树脂MabSelectXtra(Cat.No.17-5269-02,通用医疗)，以1000rpm离心2分钟以移除保存溶液，并且洗涤三次，每次洗涤使用400μL蛋白质A结合缓冲液(Cat.No.21007,Pierce)。将蛋白质A树脂加入到所制备的培养基中，然后在室温旋转培养30分钟。将培养基和树脂的混合物加入到皮尔斯离心管-密封盖(Pierce spin column-snap cap)(Cat.No.69725,Thermo)，并且使用QIAvac24Plus(Cat.No.19413,QIAGEN)真空歧管提取，仅使树脂留在管中。树脂使用5mL蛋白质A结合缓冲液洗涤，然后在200μL蛋白质A洗提缓冲液(Cat.No.21009,Pierce)中重悬，之后在室温培养2分钟并通过以1000rpm离心1分钟洗提。洗脱物通过加入2.5μL 1.5MTris-HCl(pH 9.0)中和。洗提进行4-6次，各级分使用Nanodrop 200C(Thermo Scientific)定量。收集具有其中检测出的蛋白质的级分，并且在Zeba离心脱盐柱中用使用5mL 7K MWCO(Cat.No.0089892,Pierce)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液代替缓冲液。然后，在还原和非还原条件下进行蛋白质的电泳(SDS-PAGE)以最终定量抗体的浓度并确认抗体的状态，并且将抗体存储在4℃。
因此，如图3所示，蛋白质电泳(SDS-PAGE)表示T417和T308克隆抗体以良好的状态被纯化。
实施例2：通过CDR移植到稳定框架构建人源化抗体
当评估TFPI抗原(全长人TFPI蛋白)(Cat.No.TFPI-875H；Creative Biomart,美国)对T417和T308克隆抗体的定量结合亲和力时，克隆T417抗体显示出最好的效果(见图8和实施例6)。因此，对克隆T417进行人源化以克隆308。
为了人源化小鼠来源的克隆T417抗体，选择最广泛用于人源化的CDR移植。具体地，克隆T417的结构在从结构预测网站，即Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)中获得的50个样本中通过显示最高QMEAN、GMQE和同源性值的样本来预测，并且使用Kabat和Chothia编号方案鉴定除了CDR之外结合抗原和框架的CDR。然后，使用IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)搜索具有最高同源性的人类框架。从通过搜索获得的一些重链可变区和轻链可变区的一些组合中，选择在人胚系细胞分析中显示最高形成速率的VH3-21/VK2-30(de Wildt RM et al.,J.Mol.Biol.,285:895-901,1999；mAbs,5:3,445-470)。然后，构建克隆308，即克隆T417的人源化抗体，其包含：克隆T417的轻链可变区K24，其为框架序列但是不影响抗体稳定性，并且还存在于人类抗体序列中；以及重链可变区N35，其为基于Kabat编号方案鉴别的CDR序列，但是在结构术语中是框架序列(Methods,34:184-199,2004；http://www.vbase2.org/)(见图4和下表4)。
因此，如图4所示，克隆308通过人源化克隆T417来构建。
下表5是基于Kabat编号系统鉴定的表4克隆抗体的CDR氨基酸序列。
表4
Figure GDA0002681087030000211
表5
Figure GDA0002681087030000212
实施例3：通过计算机建模(in Silico Modeling)绘制克隆308抗体
实施例2中构建的克隆308和TFPI KPI-2(Kunitz结构域2)之间的结合通过计算机建模来预测，并且预测可以改善结合抗原的位置(重链-52a、重链-64和轻链27d)(见图5和下表6)。
使用同源建模，即BioLuminate模块(Schrodinger,美国)，生成结合TFPI的克隆308抗体的结构。为了产生所述结构，使用克隆308的序列通过PDB数据库进行模板搜索。因此，选择具有类似结构和高组合分数的3QOS(PDB编号)结构。可见除了具有抗原特异性结构的HV CDR H3区之外，3QOS和克隆308序列相似，并且3QOS和克隆308序列是适合于产生所述结构的模板。生产全部克隆308模型并与3QOS的结构比较，并且最终选择最相似的结构。除了HV CDR H3之外，所选择的模型结构相似，并且克隆308和TFPI结构之间的相互影响使用蛋白-蛋白结合预测程序预测(见图17，其中由绿色表示的分子表示308克隆抗体，并且由红色表示的分子表示TFPI抗原)。因此，可以鉴定与其结合的克隆308抗体的预期互补位和人TFPI抗体的预期表位(表8)。基于预期结合结构，突变被引入到克隆308的氨基酸序列中，以便增加克隆308的亲和力。换言之，K64使用Q和E代替以诱导与TFPI的R17离子键合。
因此，如下表6所示，DNA序列表示构建了总共两种克隆308突变体。克隆308的重链可变区或轻链可变区和人TFPI抗原之间的预期结合示于图18和19。
下表7显示基于Kabat编号系统鉴别的表6克隆抗体的CDR氨基酸序列。
下表8显示克隆308抗体的预期互补位和与其结合的人TFPI抗原的预期表位。
表6
Figure GDA0002681087030000221
表7
Figure GDA0002681087030000222
表8
Figure GDA0002681087030000231
实施例4：克隆308抗体突变体的制备
4-1:对克隆308抗体突变体的IgG基因进行克隆
使用各合成的308-2和308-4基因(Bioneer,韩国)作为模板，重链可变区使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Cat.No.R010B；Takara)与含有KpnI的正向引物(表9；SEQ IDNO:28)和含有ApaI的反向引物(表9；SEQ ID NO:29)一起进行PCR。PCR在以下条件下进行：98℃2分钟；然后30个循环，每个循环由98℃10秒、58℃10秒和72℃30秒组成；然后72℃5分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(Cat.No.28704l,QIAGEN)分离。然后，各分离的基因在37℃使用NotI和ApaI酶处理4小时然后在1％的琼脂糖凝胶上分离。pcIW质粒载体也以相同方式消化并在琼脂糖凝胶上分离。使用T4 DNA连接酶(Cat.No.M0203S,NEB)，将分离的基因连接到线性pcIw载体的KpnI和ApaI中。将连接产物转化到XL1-Blue细菌(电穿孔-感受态细胞；Cat.No.200228,Stratagene)中，并且将细菌细胞接种在含有羧苄青霉素的LB平板(Cat.No.LN004CA,NaraeBiotech)上，并且在37℃培养12小时以上，并从平板选择单一菌落并培养。然后，使用质粒迷你试剂盒(Cat.No.27405,QIAGEN)从细胞中分离质粒并通过DNA测区鉴定。
表9
Figure GDA0002681087030000232
Figure GDA0002681087030000241
4-2：克隆308抗体突变体IgG的生成和纯化
为了产生和纯化308-2和308-4克隆，即克隆308-2和308-4抗体突变体，将Expi293FTM细胞在转染前一天以2.5X 106个细胞/mL的浓度接种。培养(37℃,8％CO2,125rpm)24小时后，加入Expi293TM表达培养基(Cat.No.A1435101,Gibco)以2.5X 106个细胞/mL的浓度制备30mL的细胞(生存力≥95％)。将30μg DNA(pcIw抗TFPI重链:15μg,pcIw抗TFPI轻链:15μg)在OptiProTMSEM培养基(Cat.No.12309019,Gibco)中稀释成总体积1.5mL，并且在室温培养5分钟。将80μL ExpiFectamineTM293试剂(Cat.No.A14524,Gibco)加入到1.5mL OptiProTMSEM培养基中(Cat.No.12309019,Gibco)至总体积1.5mL，然后在室温培养5分钟。培养5分钟后，1.5mL稀释的DNA和1.5mL ExpiFectamineTM 293试剂彼此很好的混合并在室温培养20-30分钟。将Expi293FTM细胞使用3mL DNA和ExpiFectamineTM 293试剂的混合物处理。悬浮培养(37℃,8％CO2,125rpm)16-18小时后，将150μL ExpiFectamineTM 293增强剂1(Cat.No.A14524,Gibco)和1.5mL ExpiFectamineTM 293增强剂2(Cat.No.A14524,Gibco)加入细胞，然后悬浮培养5天。完成培养后，将细胞以4000rpm离心20分钟以移除细胞碎片，并且使上清液通过0.22μm过滤器。每30mL培养基制备100μL蛋白质A树脂MabSelectXtra(Cat.No.17-5269-02,通用医疗)，以1000rpm离心2分钟以移除保存溶液，并且洗涤三次，每次洗涤使用400μL蛋白质A结合缓冲液(Cat.No.21007,Pierce)。将蛋白质A树脂加入到所制备的培养基中，然后在室温旋转培养30分钟。将培养基和树脂的混合物加入到皮尔斯离心管-密封盖(Pierce spin column-snap cap)(Cat.No.69725,Thermo)，并且使用QIAvac 24Plus(Cat.No.19413,QIAGEN)真空歧管提取，仅使树脂留在管中。树脂使用5mL蛋白质A结合缓冲液洗涤，然后在200μL蛋白质A洗提缓冲液(Cat.No.21009,Pierce)中重悬，之后在室温培养2分钟并通过以1000rpm离心1分钟洗提。洗脱物通过加入2.5μL 1.5MTris-HCl(pH 9.0)中和。洗提进行4-6次，各级分使用Nanodrop 200C(Thermo Scientific)定量。收集具有其中检测出的蛋白质的级分，并且在Zeba离心脱盐柱中用使用5mL 7K MWCO(Cat.No.0089892,Pierce)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液代替缓冲液。然后，在还原和非还原条件下进行蛋白质的电泳(SDS-PAGE)以最终定量抗体的浓度并证明抗体的状态，并且将抗体存储在4℃。
因此，总共18种克隆抗体通过将一个或多个突变引入到克隆308氨基酸序列的四个位置而制备，这可增强抗体与抗原(人重组TFPI蛋白)的结合并且基于实施例3的预测进行选择(图5和表4-7；308、308-2和308-4克隆抗体的氨基酸序列)。蛋白质电泳(SDS-PAGE)表示抗体以良好的状态被纯化(图6)。在这些抗体中，克隆308-2和克隆308-4具有引入到克隆308的重链赖氨酸(K)中的谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)突变。
表4和6显示抗TFPI克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列。
表5和7显示基于Kabat编号系统鉴定的表4和6克隆抗体的CDR氨基酸序列。
实施例5：制备TFPI KPI-2
5-1：克隆人TFPI KPI-2(Kunitz结构域2)、兔KPI-2和小鼠TFPI KPI-2基因
为了构建人TFPI KPI-2(Kunitz结构域2)、兔TFPI KPI-2和小鼠TFPI KPI-2基因(见表10)，将限制性内切酶位点NcoI(Cat.No.R0193S,NEB)和NotI(Cat.No.R0189S,NEB)引入到pET22b质粒载体中。各基因(通过GeneScript合成)使用含有NcoI的正向引物(表11；SEQ ID NOs:33～35)和含有NotI的反向引物(表11；SEQ ID NOs:36～38)进行PCR。PCR在以下条件下进行：94℃2分钟；然后30个循环，每个循环由94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒组成；然后72℃5分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(Cat.No.28704,QIAGEN)分离。然后，三种分离的基因在37℃使用NotI和ApaI限制性内切酶处理4小时。处理的基因在1％的琼脂糖凝胶上分离。pET22b质粒载体也以相同方式使用NcoI和NotI消化并在琼脂糖凝胶上分离。制备的pET22b NcoI/NotI载体和插入物以1:3的摩尔比混合，然后向其中加入T4 DNA连接酶(Cat.No.M0202S；NEB)和连接酶缓冲液(Cat.No.B0202S；N EB)，然后在25℃培养3小时。将5μL连接产物加入到DH5α(化学感受态细胞；Invitrogen)并在冰上培养10分钟。为了热休克，细胞在42℃培养1分钟，并且为了细胞恢复，细胞在37℃在SOC培养基中悬浮培养40分钟。50μL转化的DH5α细胞接种在羧苄青霉素平板上，并且在37℃培养12小时以上。选择6种生产的克隆，并在37℃以220rpm悬浮培养12小时以上。使用质粒迷你试剂盒(Cat.No.27405,QIAGEN)从含有质粒的细胞中分离质粒。所分离的质粒通过DNA测区鉴定。
下表10显示每种动物类型的TFPI KPI-2(Kunitz结构域2)的氨基酸序列。
表10
Figure GDA0002681087030000261
下表11显示用于实施例5的TFPI KPI-2(Kunitz结构域2)基因克隆的引物。
表11
Figure GDA0002681087030000262
5-2：人TFPI KPI-2(Kunitz结构域2)、兔TFPI KPI-2和小鼠TFPI KPI-2蛋白质的 生成和纯化
将鉴定的TFPI基因序列的克隆转化到BL21(DE3)细菌(化学感受态细胞；Cat.No.C2527I,NEB)中。将各人TFPI KPI-2(Kunitz结构域2)、兔TFPI KPI-2和小鼠TFPIKPI-2基因加入到细菌细胞中，然后将其在冰上培养10分钟。为了热休克，将细胞在42℃培养1分钟，并且为了细胞恢复，将细胞在37℃在SOC中悬浮培养40分钟。将50转化的细菌细胞接种在羧苄青霉素平板上并且在37℃培养12小时以上。将生产的克隆之一接种在含有羧苄青霉素的LB培养基中，并在37℃在220rpm悬浮培养12小时以上。次日，将培养的细菌细胞接种在500ml SB-葡萄糖培养基中，并在37℃在220rpm悬浮培养2小时。当细菌培养基的OD达到0.6时，使用NanoDrop加入0.1mM IPTG进行诱导。然后，将细胞在25℃在180rpm悬浮培养12小时以上。细菌细胞通过以6000rpm离心20分钟而恢复，并且将冷冻和解冻重复三次以恢复周质区的蛋白质表达，然后离心。将上清液通过0.22μm过滤器以移除细胞碎片，然后离心。纯化过程使用Talon金属亲和性树脂(Cat.No.635501,Clonetech)进行，并且所述树脂使用磷酸盐缓冲液稳定，并且使用过滤的培养基在4℃培养12小时以上。洗涤过程使用10mM咪唑进行，并且洗提过程使用250mM咪唑进行。纯化的蛋白质在NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶上电泳，然后分离的蛋白质通过考马斯蓝染色可视化。洗提的蛋白质通过Vivaspin(Cat.No.28-9322-18,GE)柱过滤，并且缓冲液使用PBS(磷酸盐缓冲的盐溶液)缓冲液替代。
因此，如图7所示，蛋白质电泳(SDS-PAGE)表示每种动物类型的TFPI KPI-2(Kunitz结构域2)蛋白质在良好状态中纯化。
实施例6：测量抗TFPI抗体对TFPI抗原的定量亲和力
使用Biacore T-200(通用医疗,美国)生物传感器测量作为纯化的抗TFPI抗体的克隆T417、克隆T308、克隆308、克隆308-2或克隆308-4对重组人TFPI的定量亲和力。从HEK293细胞中纯化的TFPI(Cat.No.TFPI-875H,Creative Biomart,美国)通过胺羧基反应固定在CM5芯片(通用医疗,美国)上至200的Rmax，然后在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES,pH7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20)中连续稀释的克隆T417、克隆T308、克隆308、克隆308-2或克隆308-4抗体以0.078-10nM的浓度以30μL/min流速在芯片上运行120秒来结合，并运行600秒来解离(表12)。10mM的甘氨酸-HCl(pH 1.5)以30μL/min的流速运行30秒，从而诱导与TFPI结合的抗体解离。动力学速率常数(结合速率常数(Kon)和解离速率常数(Koff))和平衡解离常数(KD)方面的亲和力使用Biacore T-200评估软件评估。
因此，如下表13和图8所示，显示出所制备的克隆308-2和克隆308-4抗体的亲和力高于克隆308的亲和力。
表12
Figure GDA0002681087030000271
Figure GDA0002681087030000281
表13
K<sub>on</sub> K<sub>off</sub> K<sub>D</sub>
T417 5.3×10<sup>6</sup> 3.5×10<sup>-5</sup> 6.7×10<sup>-12</sup>
T308 4.4×10<sup>6</sup> 4.2×10<sup>-5</sup> 9.4×10<sup>-12</sup>
308 3.5×10<sup>6</sup> 1.7×10<sup>-4</sup> 5.0×10<sup>-11</sup>
308-2 3.0×10<sup>6</sup> 9.9×10<sup>-5</sup> 3.3×10<sup>-11</sup>
308-4 3.5×10<sup>6</sup> 8.2×10<sup>-5</sup> 2.4×10<sup>-11</sup>
实施例7：测量Fxa活性
凝血通过内源性途径和外源性途径诱导，并且两种途径通过激活X因子的共同途径而激活凝血酶，从而形成纤维蛋白以诱导凝血。此外，TFPI由Kunitz 1(K1)、Kunitz 2(K2)和Kunitz 3(K3)结构域组成。已知K1结构域与FVIIa结合，并且K2结构域与FXa结合。已知凝血通过TFPI和血液凝固因子之间的结合而抑制。因此，为了确定抗TFPI候选抗体对凝血过程的作用，评估FXa活性。测定系统仅由FXa、TFPI和候选抗体组成，以便最小化一些因子的影响。当候选抗体与TFPI结合时，其不抑制FXa的功能，并且因此FXa活性出现。然而，当候选抗体与TFPI没有有效结合时，TFPI结合FXa从而抑制FXa的活性，并且因此颜色发展的程度降低。因此，没有通过TFPI抑制的FXa的剩余活性通过底物降解的程度测量。本文所使用的底物是FXa特异性底物S-2765，并且降解底物以生成在405nm可测量的发色pNA。该测量方法基于酰胺分解检测法。
各FXa、TFPI、mAb2021和S-2765参考下表14使用测定缓冲液(20mM HEPES、150mMNaCl、1mg/mL BSA、0.02％NaN3、5mM CaCl2、pH7.4)稀释，并分配在1.5ml管中。
表14
Figure GDA0002681087030000282
Figure GDA0002681087030000291
将50μL的各阳性对照(mAb2021,抗TFPI Ab,Novo Nordisk)和抗TFPI候选抗体加入到各孔中至40、10、2.5或0.625nM的浓度。将50μL的40nM TFPI溶液加入到各孔中，并且使其在室温静置30分钟。为了获得标准曲线，将50μL的FXa溶液以不同浓度加入到各孔中，并且将50μL的2mM FXa溶液加入到各孔中，并且在37℃培养10分钟。将50μL的2mM S-2765溶液加入到各孔中，并且在37℃培养30分钟。然后，在405nm波长下各孔的吸光度通过端点模式中的酶标仪(microplate reader)读取。
因此，如图9所示，在抗TFPI候选抗体中作为嵌合抗体的克隆T308和克隆T417两者均显示出吸光度抗体浓度依赖性方式增加，其表示两种抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。与作为阳性对照(mAb2021,抗TFPI Ab)的没有使用TFPI处理的样本比较，克隆T308在使用40nM处理样本中抑制TFPI的作用为91％，并且在使用10nM处理样本中抑制TFPI的作用为89％。与作为阳性对照(mAb2021,抗TFPI Ab)的没有使用TFPI处理的样本比较，克隆T417显示在用40nM处理的样本中抑制TFPI的作用为89％，并且在使用10nM处理样本中抑制TFPI的作用为72％。当效果在10nM的TFPI浓度下比较时，可见克隆T417比克隆T308具有更好的TFPI抑制活性。
此外，如图10所示，克隆308通过在上述测定中确定具有更好效果的克隆T417的人源化而获得。克隆308还显示吸光度以浓度依赖性方式增加，其表示它可以抑制TFPI。与阳性对照(mAb2021,抗TFPI Ab)比较，克隆308显示出在使用40nM处理的样本中TFPI抑制活性为大约85.1％，并且在使用10nM处理的样本中TFPI抑制活性为大约58.2％，表示其对在用10nM处理的样品中显示TFPI抑制活性为78.4％的克隆T417具有较差的作用。
此外，如图11所示，进行回复突变以增加克隆308的作用，并且获得克隆308-2和克隆308-4。可见克隆308-2和克隆308-4两者以浓度依赖性方式抑制TFPI。并且，在使用40nM和10nM处理的样本中，可见克隆308-2和克隆308-4的TFPI抑制活性与克隆308比较增加。在40nM的浓度，与阳性对照(mAb2021,抗TFPI Ab)比较，克隆308-2和克隆308-4显示出TFPI抑制活性分别为85％和82％，但是在10nM的浓度，克隆308-2显示出TFPI抑制活性为72％，并且克隆308-4显示出TFPI抑制活性为78％，其高于克隆308-2的TFPI抑制活性。此外，这些抗体与表达TFPI抑制活性为77％的克隆T417嵌合抗体相当。
实施例8：测量TF/FVIIa/FXa复合物
凝血外源性途径中最重要的因子包括TF(组织因子)、FVII(VII因子)、FX(X因子)等。当TF和FVIIa通过外部信号形成复合物时，FX被活化为FXa。然后，FXa将凝血素活化为凝血酶，然后其将纤维蛋白原剪切为起凝血作用的纤维蛋白。然而，TFPI(组织因子通道抑制剂)通过结合FXa抑制FXa的功能，从而干扰凝血。为了评估上述途径中抗TFPI抗体MG1113的作用，进行TF/FVIIa/FXa复合物测定。在TFPI与抗TFPI抗体MG1113一同存在或独立于抗TFPI抗体存在的情况下，通过TF/FVIIa复合物产生和抑制FXa的程度基于由FXa降解的底物的颜色发展程度测量，从而评估抗TFPI抗体MG1113的作用。换言之，由于抗TFPI抗体MG1113的TFPI抑制效果增加，FXa的产生增加，并且降解的底物的量增加，导致吸光度增加。
在1.5mL管中，TF(4500L/B,Sekisui diagnostics)、FVIIa(Novo Nordisk,NovoSeven)和FX(PP008A,Hyphen biomed)使用测定缓冲液(20mM HEPES、150mM NaCl、1mg/mLBSA、0.02％NaN3、5mM CaCl2、pH 7.4)稀释至下表15所示的浓度，从而制备混合物溶液。
表15
物质 TF FVIIa FX
浓度 6ng/mL 800nM 30nM
将70μL混合物溶液加入到96孔板的各孔中。向空白孔，加入70μL的测定缓冲液。将各孔在37℃培养15分钟，然后将30μL的TFPI加入到各孔至50nM的浓度。然而，将30μL的测定缓冲液加入到各空白孔和阳性对照孔(样本不使用抗TFPI抗体或TFPI处理)中。将30μL的抗TFPI抗体加入到各孔中至12.5、25、50和100nM的浓度。向各空白孔、阳性对照孔(样本不使用抗TFPI抗体或TFPI处理)和阴性对照孔(样本不使用抗TFPI抗体处理)，加入30μL的测定缓冲液，然后在37℃培养15分钟。将20μL的EDTA(E7889,Sigma-Aldrich)加入到各孔中至50mM的浓度。然后，将50μL的S2765加入到各孔中至200μM的浓度，然后在37℃培养10分钟。然后使用酶标仪测量在405nm的各孔吸光度。
因此，如图12所示，确认在抗TFPI候选抗体中作为嵌合抗体的克隆T308和克隆T417。显示出两种抗体都显示吸光度以抗体浓度依赖性方式增加，表示两种抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。与阳性对照(样本不使用抗TFPI抗体或TFPI处理)比较，克隆T308显示出在使用100nM处理的样本中抑制TFPI效果为100％，并且在使用50nM处理的样本中抑制TFPI效果为大约87％。与阳性对照(样本不使用抗TFPI抗体或TFPI处理)比较，克隆T417显示出使用100nM和50nM处理的样本中抑制TFPI效果为100％。因此，可见克隆T417的TFPI抑制活性高于克隆T308的TFPI抑制活性。
此外，如图13所示，克隆308通过具有比克隆T308更好效果的克隆T417的人源化而获得。克隆308还显示吸光度以浓度依赖性方式增加，表示它抑制TFPI。与阳性对照(样本不使用抗TFPI抗体或TFPI处理)比较，克隆308显示出在使用100nM处理的样本中TFPI抑制活性为大约94.3％，并且在使用50nM处理的样本中TFPI抑制活性为大约54.2％，表示克隆308比显示TFPI抑制活性为100％的克隆T417的作用差。
此外，如图14所示，进行回复突变以增加人源化克隆308抗体的作用，并且获得克隆308-2和克隆308-4。可见克隆308-2和克隆308-4两者以浓度依赖性方式抑制TFPI。此外，在使用50nM处理的样本中，可见克隆308-2和克隆308-4的TFPI抑制活性与克隆308比较增加。在100nM和50nM的浓度，与阳性对照(样本不使用抗TFPI抗体或TFPI处理)比较，克隆308-2和克隆308-4均显示出TFPI抑制活性为100％。在25nM的浓度，克隆308-2显示出TFPI抑制活性为37.8％，并且克隆308-4显示出TFPI抑制活性为68.4％，其高于克隆308-2的TFPI抑制活性。然而，可见回复突变抗体的TFPI抑制活性比克隆T417嵌合抗体的TFPI抑制活性低。
实施例9：测量凝血酶生成
凝血机制被分为内源性途径和外源性途径。已知外源性途径中的TF(组织因子)的功能是凝血机制中的活性反馈功能，并且是产生非常快的凝血酶的爆炸性生产。在该凝血机制中最重要的因子包括TF(组织因子)、FVII(VII因子)、FX(X因子)等。当TF和FVIIa通过外部信号形成复合物时，FX被活化为FXa。然后，FXa将凝血素活化为凝血酶，然后其将纤维蛋白原剪切为起凝血作用的纤维蛋白。然而，TFPI(组织因子通道抑制剂)通过结合FXa抑制FXa的功能，从而干扰凝血。凝血酶生成测定包括：使用要评估的试验样本处理血浆；然后，基于在低PPP试剂的存在下产生的凝血酶将荧光底物转化为荧光产物时产生的荧光产物的量；以及使用凝血酶校准仪的已知量校准凝血酶的检查量，从而测量凝血酶的实际生成量。
将20μL的低PPP试剂溶液加入到预热的96孔板(圆底Immulon 2HB 96孔板)的样本加载孔中，并且将20μL的校准溶液加入到该板的校准孔中。将抗FVIII候选抗体在预溶解样本稀释液(FVIII缺乏的血浆)中以0.3125、0.625、1.25或2.5nM的浓度稀释，然后在室温培养10分钟使其可结合FVIII。
将80μL的各样本稀释液加入到各校准和空白孔中，并且将80μL稀释的抗体溶液加入到各剩余孔中。按下软件屏幕底部的开始按钮以执行洗涤。洗涤在进口管置于37℃水浴中的蒸馏水中且出口管置于空容器中的情况下进行。完成洗涤后，按下下一个按钮以执行一个空的过程。进口管置于加热到37℃的FluCa溶液中，并且实现使用所述溶液填充管子。出口管安装在分配器中的M孔中，然后按下下一个按钮以将20μL的FluCa溶液自动分配到各孔中，之后进行摇动过程并且开始分析。
因此，如图15所示，凝血酶生成测定使用通过上述Fxa活性测定和TF/FVIIa/FXa复合物测定选择的克隆T417嵌合抗体和人源化克隆308抗体进行。在2.5nM，与仅使用样本稀释液处理的空白比较，克隆T417显示出凝血酶峰值增加208％，并且与空白比较，克隆308显示出凝血酶峰值增加162％。在ETP表示凝血酶总生成量的情况下，在使用2.5nM处理的样本中，与阴性对照(没有抗体)比较，克隆T417显示出ETP增加131％，并且克隆308显示出ETP增加122％。当比较两种抗体时，显示出克隆T417具有比克隆308抗体更好的作用。
此外，如图16所示，对于在进行回复突变后通过Fxa活性测定和TF/FVIIa/FXa复合物测定选择的克隆308-2和克隆308-4，为了增加人源化克隆308抗体的作用，进行凝血酶生成测定。显示克隆308-2和克隆308-4两者均显示出凝血酶生成以浓度依赖性方式增加。当比较使用2.5nM处理的样本时，可见克隆308-2和克隆308-4与克隆308抗体比较显示出凝血酶峰值和总凝血酶生成增加。在使用2.5nM处理的样本中，与阴性对照(没有抗体)比较，克隆308-2和克隆308-4显示出凝血酶峰值分别增加183％和191％，并且ETP值在克隆308-2和克隆308-4两者中均为126％，表明克隆308-2和克隆308-4具有增加的生成凝血酶的能力。此外，两种抗体产生凝血酶的能力比克隆308抗体产生凝血酶的能力好，并且与克隆T417嵌合抗体产生凝血酶的能力相当。
实施例10：预测抗TFPI抗体308-4克隆和Kunitz结构域-2之间的结合
作为抑制X因子活性的抗TFPI(组织因子通道抑制剂)抗体，构建可防止抑制凝血的用于治疗或预防血友病的抗体
凝血通过内源性途径和外源性途径而诱导，并且两种途径通过活化X因子的共同途径来活化凝血酶，从而形成纤维蛋白以诱导凝血。此外，TFPI由Kunitz 1(K1)、Kunitz 2(K2)和Kunitz 3(K3)结构域组成。已知K1结构域与FVIIa结合，并且K2结构域与FXa结合。
如在韩国专利申请第10-2015-0026555号，发明名称为“新型抗TFPI抗体以及包含所述抗体的组合物”，中描述的，制备了作为抗TFPI抗体的308-4克隆。可见308-4克隆具有2.64x10-11M或更低，优选2.52x10-11M或更低，更优选2.4x10-11M或更低的KD。
在本发明中，尝试通过亲和力成熟的308-4克隆制备对TFPI具有较高亲和力的抗体。
为了预测抗TFPI抗体308-4克隆和Kunitz结构域-2之间的结合，使用308-4克隆的氨基酸序列在Igblast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行同源搜索。因此，发现3QOS(PDB号码)结构相似。基于3QOS，308-4克隆的结构使用作为BioLuminate模块(Schrodinger,德国)的同源建模绘制。所绘制的结构使用蛋白质-蛋白质结合预测程序PIPER进行Kunitz结构域-2的对接模拟以获得结合预测数据。为了从获得的结合结构中选择互补位，分析308-4克隆和Kunitz结构域-2之间的相互作用，并且选择产生共价键的308-4克隆的氨基酸(表16)。所选互补位使用bioluminate模块进行亲和力成熟以计算各互补位的结合能值并预测通过使用其他氨基酸取代而改变的结合能值。因此，选择具有稳定结合能值的氨基酸并且在引物设计中反映(表17)。
下表16显示所选抗TFPI抗体308-4克隆的氨基酸，其被确定在308-4克隆和Kunitz结构域-2之间的相互作用中产生非共价键。
下表17显示所选表16的氨基酸，其通过亲和力成熟被确定具有互补位的稳定结合能值。
表16
可变区 所选氨基酸(基于kabat)
重链 S31,T52a,Y56,E64,N98
轻链 S31a,T92,H93
表17
可变区 所选氨基酸
VH_S31 H,K,R,T,Y,I,L
VH_T52a F,Y,L,H,K,R,I
VH_Y56 H,R,K
VH_E64 Q,D,H
VH_N98 F,H,K,Q,R,Y
VL_S31a I,L,N,Q,R,F,K,T,V
VL_T92 F,Y,I,N
VL_H93 Y,L,I,Q,N,K
实施例11：使用酵母展示scFv文库通过308-4的亲和力成熟制备新型抗体
11-1：构建酵母展示scFv文库
为了将突变引入酵母文库，三个重链可变区片段和两个轻链可变区片段经过聚合物链式反应(PCR)。具体地，对于重链可变区片段1的PCR，抗TFPI308-4克隆的重链可变区基因序列与正向引物(表18；SEQ ID NO:40)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:41至48)一同用作模板；对于重链可变区片段2的PCR，抗TFPI 308-4克隆的重链可变区基因序列与正向引物(表18；SEQ ID NO:49)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:50至61)一同用作模板；以及对于重链可变区片段3的PCR，抗TFPI 308-4克隆的重链可变区基因序列与正向引物(表18；SEQ IDNO:62)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:63至69)一同用作模板。各片段的PCR使用AccuPowerPfu PCR PreMix(CAT.No.K-2015,Bioneer)进行。PCR在以下条件下进行：95℃2分钟；然后30个循环，每个循环由95℃30秒、55℃30秒和72℃60秒组成；然后72℃10分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(QIAquick凝胶回收试剂盒,CAT.No.28706,QIAGEN)分离。对于轻链可变区片段1的PCR，抗TFPI 308-4克隆的轻链可变区基因序列与正向引物(表18；SEQ ID NO:72)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:73至82)一同用作模板；以及对于轻链可变区片段2的PCR，抗TFPI 308-4克隆的轻链可变区基因序列与正向引物(表18；SEQ ID NO:83)和反向引物(表18；SEQ IDNOs:84至87)一同用作模板。各片段的PCR在以下条件下使用AccuPower Pfu PCR PreMix(Bioneer)进行：95℃2分钟；然后30个循环，每个循环由95℃30秒、55℃30秒和72℃60秒组成；然后72℃10分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(QIAquick凝胶回收试剂盒,QIAGEN)分离。
将所得重链可变区片段基因调整为1:1:1的摩尔比，并且在PCR中与正向引物(表18；SEQ ID NO:70)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:71)一同用作模板。片段基因的PCR在以下条件下使用Takara primer star PCR premix(CAT.NO.R040B,Takara)进行：95℃2分钟；然后20个循环，每个循环由95℃10秒、55℃20秒和72℃30秒组成；然后72℃5分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(QIAquick凝胶回收试剂盒,QIAGEN)分离，从而获得重链可变区基因。
将所得轻链可变区片段基因调整为1:1的摩尔比，并且在PCR中与正向引物(表18；SEQ ID NO:91)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:92)一同用作模板。片段基因的PCR在以下条件下使用Takara primer star PCR premix(CAT.NO.R040B,Takara)进行：95℃2分钟；然后20个循环，每个循环由95℃10秒、55℃30秒和72℃40秒组成；然后72℃5分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(QIAquick凝胶回收试剂盒,QIAGEN)分离，从而获得轻链可变区基因。
将所得重链和轻链可变区基因调整为1:1的摩尔比，并且在PCR中与正向引物(表18；SEQ ID NO:93)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:94)一同用作模板。基因的PCR在以下条件下使用Takara primer star PCR premix(Takara)进行：95℃2分钟；然后20个循环，每个循环由95℃10秒、55℃20秒和72℃30秒组成；然后72℃5分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(QIAquick凝胶回收试剂盒,QIAGEN)分离，从而构建308-4亲和力成熟scFv文库基因。200ng构建的文库基因与1μg施用限制性内切酶NheI(CAT.No.R0131L,NEB)和BamHI(CAT.No.R0136L,NEB)处理的pCTCON基因混合，并且将混合物转化到酵母中(EBY100电感受态细胞)。将所转化的酵母细胞悬浮在100mL YPD培养基中，并在30℃在200rpm震荡培养1小时。将所培养的酵母接种至1L SD培养基中，并且在30℃在200rpm培养12小时以上，之后将其离心以移除上清液，并且在酵母存储缓冲液中重悬，并保存在-70℃。为了确定文库的大小，在转化后1小时收集100μl培养基，通过连续稀释法在SD板上接种，在30℃培养12小时以上，然后经过菌落计数。
下表18显示用于构建酵母展示scFv文库的引物。
表18
Figure GDA0002681087030000361
Figure GDA0002681087030000371
Figure GDA0002681087030000381
Figure GDA0002681087030000391
11-2：抗体选择
将在实施例11-1中构建的文库酵母细胞接种在SD培养基中，并且在30℃在200rpm培养12小时以上，然后将培养基使用SG培养基替代，并将细胞在25℃在200rpm培养12小时以在酵母表面表达抗体。然后，将通过离心收集的酵母细胞使用PBSM(含有3％BSA的PBS)缓冲液洗涤，在1mL PBSM缓冲液中重悬，并且在室温与生物素结合的重组人TFPI蛋白一同培养1小时。与重组人TFPI蛋白一同培养的酵母细胞使用PBSM洗涤，然后使用链霉亲和素微球(CAT.NO.130-048-101,Miltenyi biotech)在冰上培养15分钟。然后，将细胞使用PBSM缓冲液洗涤一次，在PBSM缓冲液中重悬，然后通过MACS柱(CAT.NO.130-042-901,Milternyibiotech)以分离TFPI蛋白结合的酵母细胞。将所分离的酵母细胞接种在SD培养基中并且培养48小时以上，并重复上述程序两次，从而选择抗体。
11-3：通过FACS制备单个克隆
从酵母展示文库中收集最终扩增的单克隆，然后在30℃在SD培养基中以200rpm培养12小时。然后，培养基使用SG培养基替代，并将细胞在25℃在200rpm培养12小时以上，从而在酵母表面表达抗体。然后，通过离心回收的酵母细胞使用PBSF(含有1％BSA的PBS)缓冲液洗涤，在50μlPBSM缓冲液中重悬，然后在室温与生物素结合的重组人TFPI蛋白和抗c-myc小鼠抗体(CAT.No.M4439,Sigma)一同培养30分钟。将所培养的细胞使用PBSF洗涤，在50μlPBSM缓冲液中重悬，然后在光屏蔽条件下与FITC结合的抗小鼠抗体(CAT.No.F0257,Sigma)和PE结合的链霉素亲和素在冰上培养15分钟。然后，将细胞使用PBSM缓冲液洗涤，在500μlPBSM缓冲液中重悬，然后通过FACS选择在FITC和PE波长范围内显示高值的克隆，从而获得单个克隆。
因此，如下表19所示，可以选择特异性结合人TFPI的克隆，并且分析其氨基酸序列。在韩国专利申请第10-2015-0026555中表述的抗体中，用于本发明的抗体描述为“2015-26555_(在先申请的SEQ ID NO)”。
下表20显示表19的克隆抗体的CDR氨基酸序列，基于Kabat编号系统。
表19
Figure GDA0002681087030000401
Figure GDA0002681087030000411
Figure GDA0002681087030000421
Figure GDA0002681087030000431
Figure GDA0002681087030000441
Figure GDA0002681087030000451
Figure GDA0002681087030000461
Figure GDA0002681087030000471
Figure GDA0002681087030000481
Figure GDA0002681087030000491
Figure GDA0002681087030000501
Figure GDA0002681087030000511
表20
Figure GDA0002681087030000512
Figure GDA0002681087030000521
Figure GDA0002681087030000531
Figure GDA0002681087030000541
Figure GDA0002681087030000551
Figure GDA0002681087030000561
Figure GDA0002681087030000571
11-4：克隆作为通过酵母展示获得的抗TFPI抗体的克隆308-4抗体突变体的IgG基 因
作为实施例11-2和11-3中获得的抗TFPI抗体的308-4抗体突变体的轻链可变区基因，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(CAT.NO.R040B,Takara)与含有KpnI的正向引物(表21；SEQ ID NO:189)和反向引物(表21；SEQ ID NO:190)一同进行PCR。此外，人抗体的κ轻链恒定区使用正向引物(表21；SEQ ID NO:191)和反向引物(表21；SEQ ID NO:192)进行PCR。PCR在以下条件下进行：94℃10分钟；然后30个循环，每个循环由94℃15秒、56℃30秒和72℃90秒组成；然后72℃10分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒分离。然后，轻链可变区和轻链恒定区彼此以1:1的比例混合，并且混合物在以下条件下使用正向引物(表20；SEQ ID NO:189)和反向引物(表20；SEQ ID NO:192)进行重叠PCR：94℃10分钟；然后30个循环，每个循环由94℃15秒、56℃30秒和72℃90秒组成；然后72℃10分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒分离。所分离的基因在37℃使用KpnI(CAT.NO.R0142L,NEB)和HindIII(CAT.NO.R0104L,NEB)限制性内切酶处理12小时，然后在1％的琼脂糖凝胶上分离。pcIW质粒载体以相同方式消化并且在琼脂糖凝胶上分离。使用T4DNA连接酶(Cat.No.M0203S,NEB)，将所分离的轻链区基因连接到线性pcIW载体中的NotI和HindIII位点。将连接产物转化到XL1-Blue细菌(电穿孔-感受态细胞；Cat.No.200228,Stratagene)中，并且将细菌细胞接种在含有羧苄青霉素的LB板(Cat.No.LN004CA,NaraeBiotech)上并在37℃培养12小时以上，并且从板中选择单克隆并培养。然后，质粒使用质粒迷你试剂盒(Cat.No.27405,QIAGEN)从细胞中分离，并通过DNA测序鉴定。
重链可变区使用308-4抗体突变体的重链可变区基因作为模板，与PrimeSTAR HSDNA聚合酶(Takara)以及含有KpnI的正向引物(表21；SEQ ID NO:193)和含有ApaI的反向引物(表21；SEQ ID NO:194)一同进行PCR。PCR在以下条件下进行：98℃2分钟；然后30个循环，每个循环由98℃10秒、58℃10秒和72℃30秒组成；然后72℃5分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒分离。然后，三种分离的基因在37℃使用KpnI和ApaI限制性内切酶处理4小时。使用限制性内切酶处理的基因在1％琼脂糖凝胶上分离。pcIW质粒载体也以相同方式消化并且在琼脂糖凝胶上分离。使用T4 DNA连接酶，将所分离的基因连接到含有人重链恒定区的线性pcIW载体中的KpnI(CAT.NO.R0142L,NEB)和ApaI(CAT.NO.R0114L,NEB)位点。将连接产物转化到XL1-Blue细菌(电穿孔-感受态细胞；Stratagene)中，并且将细菌细胞接种在含有羧苄青霉素的LB板(Cat.No.LN004CA,NaraeBiotech)上并在37℃培养12小时以上，并且从板中选择单克隆并培养。然后，质粒使用质粒迷你试剂盒(Cat.No.27405,QIAGEN)从细胞中分离，并进行所分离质粒的DNA测序。
下表21显示用于克隆308-4抗体突变体的IgG基因克隆的引物，所述308-4抗体突变体为通过酵母展示获得的抗TFPI抗体。
表21
Figure GDA0002681087030000581
Figure GDA0002681087030000591
11-5：抗TFPI 308-4克隆抗体突变体IgG的生成和纯化
为了生成和纯化在实施例11-4中克隆的抗TFPI克隆抗体突变体，将Expi293FTM细胞在转染前一天以2.5X 106个细胞/mL的浓度接种。培养24小时后(37℃,8％CO2,125rpm)，加入Expi293TM表达培养基(Cat.No.A1435101,Gibco)以2.5X 106个细胞/mL的浓度制备30mL的细胞(生存力≥95％)。将30μg DNA(pcIw抗TFPI重链:15μg,pcIw抗TFPI轻链:15μg)在OptiProTMSEM培养基(Cat.No.12309019,Gibco)中稀释成总体积1.5mL并且在室温培养5分钟。将80μL ExpiFectamineTM293试剂(Cat.No.A14524,Gibco)加入到1.5mLOptiProTMSEM培养基中(Cat.No.12309019,Gibco)至总体积1.5mL，然后在室温培养5分钟。培养5分钟后，1.5mL稀释的DNA和1.5mL ExpiFectamineTM 293试剂彼此很好的混合并在室温培养20-30分钟。将Expi293FTM细胞使用3mL DNA和ExpiFectamineTM 293试剂的混合物处理。悬浮培养(37℃,8％CO2,125rpm)16-18小时后，将150μL ExpiFectamineTM 293增强剂1(Cat.No.A14524,Gibco)和1.5mL ExpiFectamineTM 293增强剂2(Cat.No.A14524,Gibco)加入细胞，然后悬浮培养5天。完成培养后，将细胞以4000rpm离心20分钟以移除细胞碎片，并且使上清液通过0.22μm过滤器。每30mL培养基制备100μL蛋白质A树脂MabSelect Xtra(Cat.No.17-5269-02,通用医疗)，以1000rpm离心2分钟以移除保存溶液，并且洗涤三次，每次洗涤使用400μL蛋白质A结合缓冲液(Cat.No.21007,Pierce)。将蛋白质A树脂加入到所制备的培养基中，然后在室温旋转培养30分钟。将培养基和树脂的混合物加入到皮尔斯离心管-密封盖(Pierce spin column-snap cap)(Cat.No.69725,Thermo)，并且使用QIAvac24Plus(Cat.No.19413,QIAGEN)真空歧管提取，仅使树脂留在管中。树脂使用5mL蛋白质A结合缓冲液洗涤，然后在200μL蛋白质A洗提缓冲液(Cat.No.21009,Pierce)中重悬，之后在室温培养2分钟并通过以1000rpm离心1分钟洗提。洗脱物通过加入2.5μL 1.5M Tris-HCl(pH9.0)中和。洗提进行4-6次，并且各级分使用Nanodrop 200C(Thermo Scientific)定量。收集具有其中检测出的蛋白质的级分，并且在Zeba离心脱盐柱中用使用5mL 7K MWCO(Cat.No.0089892,Pierce)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液代替缓冲液。然后，在还原和非还原条件下进行蛋白质的电泳(SDS-PAGE)以最终定量抗体的浓度并证明抗体的状态，并且将抗体存储在4℃。
因此，蛋白质电泳(SDS-PAGE)表示抗TFPI 308-4克隆抗体以良好的状态被纯化。
实施例12：使用噬菌体展示Fab文库制备抗TFPI308-4克隆亲和力成熟的抗体
12-1：构建噬菌体展示Fab文库
为了构建Fab文库，构建重链可变区文库，然后构建轻链可变区文库。具体地，对于重链可变区片段1的PCR，抗TFPI 308-4克隆的重链可变区基因序列与正向引物(表18；SEQID NO:40)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:41至48)一同用作模板；对于重链可变区片段2的PCR，抗TFPI 308-4克隆的重链可变区基因序列与正向引物(表18；SEQ ID NO:49)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:50至61)一同用作模板；以及对于重链可变区片段2的PCR，抗TFPI308-4克隆的重链可变区基因序列与正向引物(表18；SEQ ID NO:62)和反向引物(表18；SEQID NOs:63至69)一同用作模板。各片段的PCR在以下条件下使用AccuPower Pfu PCRPreMix(CAT.No.K-2015,Bioneer)进行：95℃2分钟；然后30个循环，每个循环由95℃30秒、55℃30秒和72℃60秒组成；然后72℃10分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(QIAquick凝胶回收试剂盒,QIAGEN)分离。将分离的重链可变区片段基因调整为1:1:1的摩尔比，并且在PCR中与正向引物(表18；SEQ ID NO:70)和反向引物(表18；SEQ ID NO:71)一同用作模板。所扩增基因的PCR在以下条件下使用Takara primer star PCR premix(Takara)进行：95℃2分钟；然后30个循环，每个循环由95℃10秒、55℃20秒和72℃30秒组成；然后72℃5分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(QIAquick凝胶回收试剂盒,QIAGEN)分离，从而获得重链可变区基因。所得基因在37℃使用XhoI(CAT.No.R0146L,NEB)和ApaI(Cat.No.R0114L,NEB)限制性内切酶处理4小时。将基因在1％琼脂糖凝胶上分离。使用T4 DNA连接酶(Cat.No.M0203S,NEB)，将分离的基因连接到含有308-4轻链可变-恒定区的线性pcIw载体的XhoI和ApaI中。将连接产物转化到XL1-Blue细菌(电穿孔-感受态细胞；Cat.No.200228,Stratagene)中，然后将细菌细胞在37℃以220rpm在300ml的LB培养基中培养1小时，然后使用150μL羧苄青霉素和300μL四环素处理，然后在37℃以220rpm悬浮培养12小时以上。然后，构建的重链可变区文库质粒使用Midi prep试剂盒(CAT.No.12143,QIAGEN)分离。为了确定文库的大小，在转化后1小时收集100μl培养基，并且通过连续稀释法接种在含有羧苄青霉素的LB板(Cat.No.LN004CA,NaraeBiotech)上，之后在37℃培养12小时以上，然后经过菌落计数。
对于轻链可变区片段1的PCR，抗TFPI 308-4克隆的轻链可变区基因序列与正向引物(表18；SEQ ID NO:72)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:73至82)一同用作模板；以及对于轻链可变区片段2的PCR，抗TFPI 308-4克隆的轻链可变区基因序列与正向引物(表18；SEQID NO:83)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:84至87)一同用作模板。各片段的PCR在以下条件下使用AccuPower Pfu PCR PreMix(Bioneer)进行：95℃2分钟；然后30个循环，每个循环由95℃30秒、55℃30秒和72℃60秒组成；然后72℃10分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(QIAquick凝胶回收试剂盒,QIAGEN)分离。将轻链可变区片段基因调节到1:1的摩尔比，并且在PCR中与正向引物(表18；SEQ ID NO:91)和反向引物(表18；SEQ ID NOs:92)一同用作模板。所扩增基因的PCR在以下条件下使用Takara primer star PCR premix(Takara)进行：95℃2分钟；然后20个循环，每个循环由95℃10秒、55℃30秒和72℃40秒组成；然后72℃5分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒(QIAquick凝胶回收试剂盒,QIAGEN)分离，从而获得轻链可变区基因。所得基因在37℃使用NruI(CAT.No.R0192L,NEB)和XbaI(Cat.No.R0145L,NEB)限制性内切酶处理4小时。使用限制性内切酶处理的基因在1％琼脂糖凝胶上分离。使用T4 DNA连接酶(Cat.No.M0203S,NEB)，将分离的基因连接到含有308-4重链可变区文库的线性pComb3x文库的NruI和XbaI位点。将连接产物转化到XL1-Blue细菌(电穿孔-感受态细胞；Cat.No.200228,Stratagene)中，然后细菌细胞在37℃以220rpm在300ml的LB培养基中培养1小时，然后使用150μL羧苄青霉素和300μL四环素处理，然后在37℃以220rpm震荡培养1小时。然后，下拨使用4.5mL(1011pfu)的VCSM13辅助噬菌体处理，然后在37℃以220rpm震荡培养1小时。然后细胞使用300μL卡那微素(kanamycin)和300μL羧苄青霉素处理并且在37℃以220rpm培养过夜。次日，培养的细胞以4000rpm离心20分钟，并且将上清液转移到新鲜的容器中。为了沉淀噬菌体，将5X PEG/NaCl以1X加入到上清液中，然后使其在冰上静置30分钟以上。沉淀的噬菌体以8000rpm离心30分钟。丢弃上清液，并且沉淀的噬菌体在10mL的PBS中重悬。为了移除细胞随便，悬浮在10mLPBS中的噬菌体以14,000rpm离心10分钟，并且将上清液分离并存储在4℃。为了确定文库的大小，在转化后1小时收集100μl培养基，并且通过连续稀释法接种在含有羧苄青霉素的LB板(NaraeBiotech)上，之后在37℃培养12小时以上，然后经过菌落计数。
12-2：选择抗TFPI抗体突变体
将1mL人重组蛋白TFPI以1μg/Ml的浓度加入到固相聚苯乙烯管(Cat.No.444202,Nunc)中，并且将管在4℃使用蛋白包被12小时以上，并且使用5mL 0.05％PBST洗涤三次。TFPI包被的Immuno管在室温使用5mL1％BSA/PBS封闭2小时。将封闭缓冲液从Immuno管中移除，然后，该管使用噬菌体文库处理，并在室温培养2小时。然后，该管使用5mL PBST洗涤4次。Immuno管使用1mL甘氨酸(pH 2.0)洗提缓冲液处理，并在室温培养10分钟，并且上清液的洗脱的噬菌体通过加入100μl 1.5M Tris-Cl(pH8.8)中和。10mL培养大约2小时的XLI-Blue电穿孔-感受态细胞(OD600＝0.8-1.0)，使用中性的噬菌体处理。在室温感染30分钟后，将10mL SB,20μl四环素(50mg/mL)和0μl羧苄青霉素(100mg/mL)加入到10mL感染的XLI-Blue电穿孔-感受态细胞中，然后在37℃以200rpm将其震荡培养1小时。然后，细胞使用1mLVCSM13辅助噬菌体(>1011pfu/mL)处理，并且在37℃以200rpm震荡培养1小时。培养1小时后，细胞使用80mL SB、100μl卡那微素和100μl羧苄青霉素处理，并且在37℃以200rpm培养过夜。培养12小时以上的文库以4000rpm离心15分钟以分离上清液，并且将5X PEG/NaCl缓冲液以1X加入到上清液中，然后使其在冰上静置30分钟。上清液通过以8000rpm离心30分钟移除。将沉淀重悬于2mL 1％BSA/PBS中，然后以12000rpm离心10分钟，并且上清液被收集并用于下一次淘洗。将上述程序重复4次。
12-3：通过ELISA制备抗TFPI单个克隆抗体
将单克隆从最终扩增的文库中收集，然后在37℃以220rpm在1.5mL SB/羧苄青霉素中培养，直到达到大约0.8-1.0的OD600，然后在30℃以200rpm使用1mM IPTG培养12小时。然后，将细胞以5500rpm离心5分钟，并且将上清液加入到TFPI抗原包被的ELISA板中，在室温培养2小时，然后使用PBST(1XPBS,0.05％tween 20)洗涤4次。然后，将使用1％BSA/1XPBS的HRP/抗hFab-HRP缀合物(CAT.No.A0293,Sigma)的1:5000稀释加入细胞，之后将细胞在室温培养1小时，并且使用PBST(1XPBS,0.05％tween 20)洗涤4次。然后，细胞使用TMB溶液处理5-10分钟，并且将TMB终止液加入细胞。然后，在450nm波长的吸光度使用TECAN sunrise测量，并且将具有高O.D的克隆选作单个克隆。
因此，如下表22所示，可以选择特异性结合人TFPI的克隆，并且分析其氨基酸序列。在韩国专利申请第10-2015-0026555中描述的抗体中，用于本发明的抗体被描述为‘2015-26555_(在先申请的SEQ ID NO)’。
下表23显示表22的克隆抗体的CDR氨基酸序列，基于Kabat编号系统鉴定。
表22
Figure GDA0002681087030000631
Figure GDA0002681087030000641
表23
Figure GDA0002681087030000642
Figure GDA0002681087030000651
12-4：克隆抗TFPI 308-4克隆抗体突变体的IgG基因
使用所得抗TFPI 308-4克隆抗体突变体轻链可变区基因作为模板，PCR使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Takara)与含有KpnI的正向引物(表21；SEQ ID NO:189)和反向引物(表21；SEQ ID NO:190)一起进行。此外，使用人抗体κ轻链恒定区作为模板，PCR使用正向引物(表21；SEQ ID NO:191)和反向引物(表21；SEQ ID NO:192)进行。PCR在以下条件下进行：94℃10分钟；然后30个循环，每个循环由94℃15秒、56℃30秒和72℃90秒组成；然后72℃10分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒分离。然后，轻链可变区基因和轻链恒定区基因彼此以1:1的比例混合，并且混合物在以下条件下使用正向引物(表20；SEQ ID NO:189)和反向引物(表20；SEQ IDNO:192)进行重叠PCR：94℃10分钟；然后30个循环，每个循环由94℃15秒、56℃30秒和72℃90秒组成；然后72℃10分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒分离。所分离的基因在37℃使用KpnI(CAT.NO.R0142L,NEB)和HindIII(CAT.NO.R0104L,NEB)限制性内切酶处理12小时以上，然后在1％的琼脂糖凝胶上分离。pcIW质粒载体以相同方式消化并且在琼脂糖凝胶上分离。使用T4 DNA连接酶(Cat.No.M0203S,NEB)，将所分离的轻链区基因连接到线性pcIW载体中的NotI和HindIII位点。将连接产物转化到XL1-Blue细菌(电穿孔-感受态细胞；Stratagene,Cat.No.200228)中，并且将细菌细胞接种在含有羧苄青霉素的LB板(Cat.No.LN004CA,NaraeBiotech)上并在37℃培养12小时以上，并且从板中选择单克隆并培养。然后，质粒使用质粒迷你试剂盒(Cat.No.27405,QIAGEN)从细胞中分离，并通过DNA测序鉴定。
重链可变区使用308-4抗体突变体的重链可变区基因作为模板，与PrimeSTAR HSDNA聚合酶(Takara)以及含有KpnI的正向引物(表21；SEQ ID NO:193)和含有ApaI的反向引物(表21；SEQ ID NO:194)一同进行PCR。PCR在以下条件下进行：98℃2分钟；然后30个循环，每个循环由98℃10秒、58℃10秒和72℃30秒组成；然后72℃5分钟。扩增的基因在1％的琼脂糖凝胶上电泳以确认具有预期大小的DNA条带，并且使用凝胶回收试剂盒分离。然后，三种分离的基因在37℃使用KpnI和ApaI限制性内切酶处理4小时。使用限制性内切酶处理的基因在1％琼脂糖凝胶上分离。pCIW质粒载体也以相同方式消化并且在琼脂糖凝胶上分离。使用T4 DNA连接酶，将所分离的基因连接到含有人重链恒定区的线性pcIW载体中的KpnI(CAT.NO.R0142L,NEB)和ApaI(CAT.NO.R0114L,NEB)位点。将连接产物转化到XL1-Blue细菌(电穿孔-感受态细胞；Stratagene,Cat.No.200228)中，并且将细菌细胞接种在含有羧苄青霉素的LB板(Cat.No.LN004CA,NaraeBiotech)上并在37℃培养12小时以上，并且从板中选择单克隆并培养。然后，质粒使用质粒迷你试剂盒(Cat.No.27405,QIAGEN)从细胞中分离，并通过DNA测序分析。
12-5：抗TFPI 308-4可用抗体突变体IgG的生成和纯化
为了生成和纯化在实施例12-4中克隆的抗TFPI克隆抗体突变体，将Expi293FTM细胞在转染前一天以2.5X 106个细胞/mL的浓度接种。培养24小时后(37℃,8％CO2,125rpm)，加入Expi293TM表达培养基(Cat.No.A1435101,Gibco)以2.5X 106个细胞/mL的浓度制备30mL的细胞(生存力≥95％)。将30μg DNA(pcIw抗TFPI重链:15μg,pcIw抗TFPI轻链:15μg)在OptiProTMSEM培养基(Cat.No.12309019,Gibco)中稀释成总体积1.5mL，并且在室温培养5分钟。将80μL ExpiFectamineTM293试剂(Cat.No.A14524,Gibco)加入到1.5mLOptiProTMSEM培养基中(Cat.No.12309019,Gibco)至总体积1.5mL，然后在室温培养5分钟。培养5分钟后，1.5mL稀释的DNA和1.5mL ExpiFectamineTM 293试剂彼此很好的混合并在室温培养20-30分钟。将Expi293FTM细胞使用3mL DNA和ExpiFectamineTM 293试剂的混合物处理。悬浮培养(37℃,8％CO2,125rpm)16-18小时后，将150μL ExpiFectamineTM 293增强剂1(Cat.No.A14524,Gibco)和1.5mL ExpiFectamineTM 293增强剂2(Cat.No.A14524,Gibco)加入细胞，然后悬浮培养5天。完成培养后，将细胞以4000rpm离心20分钟以移除细胞碎片，并且使上清液通过0.22μm过滤器。每30mL培养基制备100μL蛋白质A树脂MabSelect Xtra(Cat.No.17-5269-02,通用医疗)，以1000rpm离心2分钟以移除保存溶液，并且洗涤三次，每次洗涤使用400μL蛋白质A结合缓冲液(Cat.No.21007,Pierce)。将蛋白质A树脂加入到所制备的培养基中，然后在室温旋转培养30分钟。将培养基和树脂的混合物加入皮尔斯离心管-密封盖(Pierce spin column-snap cap)(Cat.No.69725,Thermo)，并且使用QIAvac24Plus(Cat.No.19413,QIAGEN)真空歧管提取，仅使树脂留在管中。树脂使用5mL蛋白质A结合缓冲液洗涤，然后在200μL蛋白质A洗提缓冲液(Cat.No.21009,Pierce)中重悬，之后在室温培养2分钟并通过以1000rpm离心1分钟洗提。洗脱物通过加入2.5μL 1.5M Tris-HCl(pH9.0)中和。洗提进行4-6次，并且各级分使用Nanodrop 200C(Thermo Scientific)定量。收集具有其中检测出的蛋白质的级分，并且在Zeba离心脱盐柱中用使用5mL 7K MWCO(Cat.No.0089892,Pierce)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液代替缓冲液。然后，在还原和非还原条件下进行蛋白质的电泳(SDS-PAGE)以最终定量抗体的浓度并证明抗体的状态，并且将抗体存储在4℃。
因此，蛋白质电泳(SDS-PAGE)表示抗TFPI 308-4克隆抗体以良好的状态被纯化。
实施例13：测量308-4抗体突变体对TFPI抗原的定量亲和力
使用Biacore T-200(通用医疗)生物传感器测量作为实施例11和12中纯化的抗TFPI抗体的308-4克隆重链可变区抗体突变体12、1023、1202、3241对人重组TFPI的定量亲和力。具体地，通过胺羧基反应固定在CM5芯片(CAT.No.BR-1005-30,通用医疗)上至200的Rmax，然后将各纯化的12、1023、1202和3241克隆与固定的蛋白质A结合。然后，在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES(pH7.4),150mM NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20)中连续稀释的重组人TFPI以0.078-10nM的浓度以30μL/min流速在芯片上运行120秒来结合，并运行3600秒来解离。与抗体相关的TFPI的解离通过以30μL/min的流速运行10mM的甘氨酸-HCl(pH1.5)30秒而诱导。动力学速率常数(结合速率常数(Kon)和解离速率常数(Koff))和平衡解离常数(KD)方面的亲和力使用Biacore T-200评估软件评估，并且结果示于下表24。
下表24显示出速率常数(结合速率常数(Kon)和解离速率常数(Koff))和平衡解离常数(KD)方面的抗TFPI抗体对于重组人TFPI蛋白的亲和力。
表24
Figure GDA0002681087030000681
实施例14：测量Fxa活性
凝血通过内源性途径和外源性途径诱导，并且两种途径通过激活X因子的共同途径而激活凝血酶，从而形成纤维蛋白以诱导凝血。此外，TFPI由Kunitz 1(K1)、Kunitz 2(K2)和Kunitz 3(K3)结构域组成。已知K1结构域与FVIIa结合，并且K2结构域与FXa结合。已知凝血通过TFPI和血液凝固因子之间的结合而抑制。因此，为了确定在凝血过程中MG1113(抗-TFPI抗体)的作用，评估FXa活性。
测定系统仅由FXa、TFPI和候选抗体组成，以便最小化一些因子的影响。当候选抗体与TFPI结合时，其不抑制FXa的功能，并且因此FXa活性出现。然而，当候选抗体与TFPI没有有效结合时，TFPI结合FXa从而抑制FXa的功能，并且因此颜色发展的程度降低。因此，没有通过TFPI抑制的FXa的剩余活性通过底物降解的程度测量。本文所使用的底物是FXa特异性底物S-2765，并且降解底物以生成在405nm可测量的发色pNA。该测量方法基于酰胺分解检测法。
各FXa、TFPI、mAb2021和S-2765参考下表25使用测定缓冲液(20mM HEPES,150mMNaCl,1mg/mL BSA,0.02％NaN3,5mM CaCl2,pH7.4)稀释，并分配在1.5ml管中。
表25
物质 稀释前浓度(nM) 工作浓度(nM) 其他
FXa 2nM 0.5nM
TFPI 40nM 10nM
S-2765 2mM 0.5mM
标准曲线 10nM 0.02,0.1,0.5,2.5nM FXa
mAb2021 160nM 2.5,5,10,20nM 阳性对照
将50μL的各阳性对照mAb2021抗体(抗TFPI Ab,Novo Nordisk)和候选抗体以20、10、5或2.5nM的浓度加入到各孔中。将50μL的40nM TFPI溶液加入到各孔中，并且使其在室温静置30分钟。为了获得标准曲线，将50μL的FXa溶液以不同浓度加入到各孔中，并且将50μL的2mM FXa溶液加入到各孔中，并且在37℃培养10分钟。将50μL的2mM S-2765溶液加入到各孔中，并且在37℃培养30分钟。然后，在405nm波长下各孔的吸光度通过端点模式中的酶标仪读取。
因此，如图20所示，分析在抗TFPI MG1113候选抗体中作为亲和力成熟抗体的第1015、1021、1023、3007、3016和3024号抗体的作用。显示所有抗体显示出吸光度抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。在这些抗体中，与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第1015号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约83％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约71％。此外，与阳性对照样本比较，第1023号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约86％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约84％。当效果在10nM的TFPI浓度下比较时，可见第1023号抗体比第1015号抗体具有更好的TFPI抑制活性。
此外，如图21所示，分析在抗TFPI MG1113候选抗体中作为亲和力成熟抗体的第3036、3115、3120、3131、4017和4141号抗体的作用。显示所有抗体显示出吸光度抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。在这些抗体中，与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第4017号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约90％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约70％。
此外，如图22所示，分析在抗TFPI MG1113候选抗体中作为亲和力成熟抗体的第1001、1024、1104和1123号抗体的作用。显示所有抗体显示出吸光度抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。在这些抗体中，与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第1123号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约88％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约69％。
此外，如图23所示，分析在抗TFPI MG1113候选抗体中作为亲和力成熟抗体的A24、A25、A51、A52、A63和A67抗体的作用。显示所有抗体显示出吸光度抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。在这些抗体中，与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，A67抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约79％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约67％。
此外，如图24所示，分析在抗TFPI MG1113候选抗体中作为亲和力成熟抗体的第3203、3241、4206和4208号抗体的作用。显示所有抗体显示出吸光度抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。在这些抗体中，与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第3241号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约82％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约83％。
此外，如图25所示，分析在抗TFPI MG1113候选抗体中作为亲和力成熟抗体的第1、2、3、7、8和10号抗体的作用。显示所有抗体显示出吸光度抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。在这些抗体中，与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第2号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约76％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约79％。与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第3号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约81％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约70％。与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第8号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约80％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约69％。
此外，如图26所示，分析在抗TFPI MG1113候选抗体中作为亲和力成熟抗体的第1214、1216、1224、1234、1238和4287号抗体的作用。显示所有抗体显示出吸光度抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。在这些抗体中，与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第1214号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约77％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约63％。
此外，如图27所示，分析在抗TFPI MG1113候选抗体中作为亲和力成熟抗体的第16、19、20、21和23号抗体的作用。显示所有抗体显示出吸光度抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。在这些抗体中，与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第16号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约55％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约34％。
此外，如图28所示，分析在抗TFPI MG1113候选抗体中作为亲和力成熟抗体的第11、12、13和1202号抗体的作用。显示所有抗体显示出吸光度抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。在这些抗体中，与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第11号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约89％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约81％。与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第12号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约82％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约82％。与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第13号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约85％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约76％。与未使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第1202号抗体显示出在使用20nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约87％，并且在使用10nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约82％。
实施例15：测量TF/FVIIa/FX复合物
凝血外源途径中最重要的因子包括TF(组织因子)、FVII(VII因子)、FX(X因子)等。当TF和FVIIa通过外部信号形成复合物时，FX被活化为FXa。然后，FXa将凝血素活化为凝血酶，然后其将纤维蛋白原转化为起凝血作用的纤维蛋白。然而，TFPI(组织因子通道抑制剂)通过结合FXa抑制FXa的功能，从而干扰凝血。为了评估上述途径中抗TFPI抗体的作用，进行TF/FVIIa/FXa复合物测定。在TFPI与抗TFPI抗体一同存在或独立于抗TFPI抗体存在的情况下，通过TF/FVIIa复合物生产和抑制FXa的程度基于由FXa降解的底物的颜色发展程度测量，从而评估抗TFPI抗体的作用。换言之，由于抗TFPI抗体的TFPI抑制效果增加，FXa的生产增加，并且降解的底物的量增加，导致吸光度增加。
在1.5mL管中，TF(4500L/B,Sekisui diagnostics)、FVIIa(Novo Nordisk,NovoSeven)和FX(PP008A,Hyphen biomed)使用测定缓冲液(20mM HEPES、150mM NaCl、1mg/mLBSA、0.02％NaN3、5mM CaCl2、pH 7.4)稀释至下表26所示的浓度，从而制备混合物溶液。
表26
物质 TF FVIIa FX
浓度 0.6ng/mL 1nM 17nM-->5nM
将70μL混合物溶液加入到96孔板的各孔中。向空白孔，加入70μL的测定缓冲液。将各孔在37℃培养15分钟，然后将30μL TFPI加入到各孔至50nM的浓度。然而，将30μL的测定缓冲液加入到各空白孔和阳性对照孔(不使用抗TFPI抗体MG1113和TFPI处理的样本)中。将30μL的抗TFPI抗体MG1113加入到各孔中至12.5、25、50和100nM的浓度。向各空白孔、阳性对照孔(不使用抗TFPI抗体和TFPI处理的样本)和阴性对照孔(不使用抗TFPI抗体MG1113处理的样本)，加入30μL的测定缓冲液，然后在37℃培养15分钟。将20μL的EDTA(E7889,Sigma-Aldrich)加入到各孔中至50mM的浓度。然后，将50μL的S2765(Chromogenix,S-2765)加入到各孔中至200μM的浓度，然后在37℃培养10分钟。然后使用酶标仪测量在405nm各孔的吸光度。
下表27显示了通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟的抗TFPI MG1113抗体效果获得的数值结果。
表27
Figure GDA0002681087030000721
Figure GDA0002681087030000731
下表28显示了通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟的抗TFPI MG1113抗体效果获得的数值结果。
表28
Figure GDA0002681087030000732
因此，如图29以及上表27和28所示，确认了在抗TFPI MG1113候选抗体中作为亲和力成熟的第1015、1023和4017号抗体的作用。显示了所有候选抗体显示出吸光度以抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制交过以浓度依赖性方式增加。与没有使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第1015号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为100％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约29.3％。与阳性对照样本比较，第1023号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为100％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约86.5％。与阳性对照样本比较，第4017号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为100％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约33.4％。因此，发现第1023号抗体具有高的抑制TFPI的能力。
下表29显示了通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟的抗TFPI MG1113抗体效果获得的数值结果。
表29
Figure GDA0002681087030000733
Figure GDA0002681087030000741
下表30显示了通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟的抗TFPI MG1113抗体效果获得的数值结果。
表30
Figure GDA0002681087030000742
此外，如图30以及上表29和30所示，评估确定在上述测定中具有最高效果的第1023号抗体，与另一个亲和力成熟的抗体第1123号抗体和A67抗体。显示了所有抗体显示出吸光度以抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。与没有使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第1023号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为94.8％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约96.6％。与阳性对照样本比较，第1123号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为80.7％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约28.5％。与阳性对照样本比较，A67抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为93.7％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约95.8％。因此，发现第1023号抗体和A67抗体在抑制TFPI的能力方面彼此相似。
下表31显示了通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟抗TFPI MG1113抗体的作用获得的数值结果。
表31
Figure GDA0002681087030000743
Figure GDA0002681087030000751
下表32显示了通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟的抗TFPIMG1113抗体效果获得的数值结果。
表32
Figure GDA0002681087030000752
此外，如图31以及上表31和32所示，评估确定在上述测定中具有最高效果的第1023号抗体、A67抗体、以及另外的亲和力成熟的抗体第3203号抗体和第3241号抗体。显示了所有抗体显示出吸光度以抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。与没有使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第1023号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为100％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约99.8％。与阳性对照样本比较，A67抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为100％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约99.2％。与阳性对照样本比较，第3203号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为100％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约46.3％。与阳性对照样本比较，第3241号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为100％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约99.6％。因此，发现第1023号抗体、A67抗体和第3241号抗体在抑制TFPI的能力方面彼此相似。
下表33显示了通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟的抗TFPI MG1113抗体效果获得的数值结果。
表33
Figure GDA0002681087030000753
Figure GDA0002681087030000761
下表34显示了通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟的抗TFPI MG1113抗体效果获得的数值结果。
表34
Figure GDA0002681087030000762
此外，如图32以及上表33和34所示，将用于治疗的FX的浓度从17nM变为5nM以降低反应速率从而增加分析候选抗体效果的分辨率。评估通过上述测定选择的第1023号抗体，以及另外的亲和力成熟的抗体第2、3和8号抗体。观察到候选抗体显示了吸光度以抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。显示了所有抗体显示出吸光度以抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。与没有使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第1023号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为80.5％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约26.6％。与阳性对照样本比较，第2号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约99.9％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约51.4％。与阳性对照样本比较，第3号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约91.8％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约61.5％。与阳性对照样本比较，第8号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约83.2％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约48.3％。
下表35显示了通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟的抗TFPI MG1113抗体效果获得的数值结果。
表35
Figure GDA0002681087030000771
下表36显示了通过TF/FVIIa/FX复合物测定评估亲和力成熟的抗TFPI MG1113抗体效果获得的数值结果。
表36
Figure GDA0002681087030000772
如图33以及上表35和36所示，评估第1023号抗体以及第12、13和1202号抗体是另外的亲和力成熟的抗体。观察到候选抗体显示了吸光度以抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。显示了所有抗体显示出吸光度以抗体浓度依赖性方式增加，其表示抗体的TFPI抑制效果以浓度依赖性方式增加。与没有使用TFPI处理的阳性对照样本比较，第1023号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为80.3％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约43.7％。与阳性对照样本比较，第12号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约94.6％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约57.7％。与阳性对照样本比较，第13号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约96.5％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约62.2％。与阳性对照样本比较，第1202号抗体显示了在使用50nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约99.4％，并且在使用25nM处理的样本中抑制TFPI的作用为大约60.0％。
实施例16：测量凝血酶生成
凝血机制被分为内源性途径和外源性途径。已知外源性途径中TF(组织因子)的功能是凝血机制中的激活反馈功能，并且是产生非常快的凝血酶的爆炸性生产。在该凝血机制中最重要的因子包括TF(组织因子)、FVII(VII因子)、FX(X因子)等。当TF和FVIIa通过外部信号形成复合物时，FX被活化为FXa。然后，FXa将凝血素活化为凝血酶，然后其将纤维蛋白原剪切为起凝血作用的纤维蛋白。然而，TFPI(组织因子通道抑制剂)通过结合FXa抑制FXa的功能，从而干扰凝血。凝血酶生成测定包括：使用要评估的试验样本处理血浆；然后，基于在PPP试剂的存在下产生的凝血酶将荧光底物转化为荧光产物时产生的荧光产物的量；以及使用凝血酶校准仪的已知量校准凝血酶的检查量，从而测量凝血酶的实际生成量。
将20μL的低PPP试剂溶液加入到预热的96孔板(圆底Immulon 2HB 96孔板)的样本加载孔中，并且将20μL的校准溶液加入到该板的校准孔中。将抗TFPI候选抗体在预溶解样本稀释液(FVIII缺乏的血浆)中以0.3125、0.625、1.25或2.5nM的浓度稀释，然后在室温培养10分钟使其可以结合FVIII。
将80μL的各样本稀释液(FVIII缺乏的血浆)加入到各校准和空白孔中，并且将80μL稀释的抗体溶液加入到各剩余孔中。按下软件屏幕底部的开始按钮以执行洗涤。洗涤在进口管置于37℃水浴中的蒸馏水且出口管置于空容器的情况下进行。完成洗涤后，按下下一个按钮以执行一个空的过程。将进口管置于加热到37℃的FluCa溶液中，并且准备好使用所述溶液填充管子。出口管安装在分配器中的M孔中，然后按下下一个按钮以将20μL的FluCa溶液自动分配到各孔中，之后进行摇动过程并且开始分析。
因此，如图34所示，对于通过上述Fxa活性测定和TF/FVIIa/FXa复合物测定选择的亲和力成熟的抗体中的第1023抗体，使用克隆T417嵌合抗体进行凝血酶生成比较测定。在2.5nM的浓度，与仅使用样本稀释液处理的空白比较，T417抗体显示出凝血酶峰值增加大约401％，并且第1023号抗体显示出凝血酶峰值增加大约401％。在ETP表示凝血酶总生成量的情况下，在使用2.5nM处理的样本中，与阴性对照组(没有抗体)比较，T417抗体显示出ETP增加大约293％，并且第1023号抗体显示出ETP增加大约309％。当比较两种抗体时，显示出通过亲和力成熟获得的第1023号具有比T417抗体更好的作用。
工业实用性
如上所述，特异性结合TFPI的本发明的抗体，可通过抑制TFPI激活外源性凝血途径。因此，本发明的抗体可以有效地用于治疗抗体诱导的血友病患者和预防A型血友病或B型血友病患者的凝血疾病。
尽管已经参考具体特征详细描述了本发明，将对本领域技术人员显而易见的是，本说明书仅针对优选的实施方式，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将通过所附权利要求及其等同物来限定。
序列表文本格式
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序列表
<110> 财团法人牧岩生命科学研究所
<120> 结合TFPI的新型抗体以及包含所述抗体的组合物
<130> PF-B1943
<140> PCT/KR2015/014370
<141> 2015-12-29
<150> 10-2015-0026555
<151> 2015-02-25
<150> 10-2015-0135761
<151> 2015-09-24
<160> 204
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆T417_小鼠可变重链
<400> 1
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆T417_小鼠可变轻链
<400> 2
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 克隆T308_小鼠可变重链
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
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<220>
<223> 克隆T308_小鼠可变轻链
<400> 4
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
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Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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1 5
<210> 17
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_T417VH-F
<400> 17
gcggccgcca tgtatctggg tctgaactat gtctttatcg tgtttctgct gaatggtgtg 60
cagtctgagg tgcacctggt ggagtct 87
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_T417VH Apa-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> n为a或g或c
<400> 18
nnnngggccc cttggtgctg gctgaggaga cggtgaccgt ggt 43
<210> 19
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_T417 VL-F
<400> 19
gcggccgcca tggatagcca ggctcaggtg ctgatgctgc tgctgctgtg ggtgtcaggg 60
acttgcgggg acgttgtgat gacccagact ccact 95
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_VL-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> n为a或g或c
<400> 20
nnnnggtacc agatttcaac tgctcatcag a 31
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆308_人源化可变重链
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆308_人源化可变轻链
<400> 22
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆308_人源化可变重链 CDR 1
<400> 23
Ser Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 24
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆308-2_人源化突变的可变重链
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆308-4_人源化突变的可变重链
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆308-2_人源化突变的可变重链 CDR 2
<400> 26
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆308-4_人源化突变的可变重链 CDR 2
<400> 27
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_VH Fo
<400> 28
tgctgtgggt gagtggtacc tgtggggaag tgcagctcgt ggagagcggt 50
<210> 29
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_VH Re
<400> 29
agtgggaaca cggagggccc cttggtgctg gcggatgaga cagtcacaag tgtccc 56
<210> 30
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人_TFPI Kunitz结构域2
<400> 30
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly
1 5 10 15
Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg
20 25 30
Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu
35 40 45
Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
50 55
<210> 31
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔_TFPI Kunitz结构域2
<400> 31
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly
1 5 10 15
Phe Met Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Ser Lys Gln Cys Glu Gln
20 25 30
Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Ser Asn Asn Phe Glu Thr Leu
35 40 45
Glu Glu Cys Arg Asn Thr Cys Glu Asp Pro
50 55
<210> 32
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠_TFPI Kunitz结构域2
<400> 32
Arg Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Leu Cys Arg Gly
1 5 10 15
Tyr Met Lys Arg Tyr Leu Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg
20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Cys Lys Lys Ile Cys Glu Asn Pro
50 55
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_HTK2 For
<400> 33
ccatggaaac ccgacttttg cttcctgga 29
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_RTK2 For
<400> 34
ccatggaaac ccgatttctg ctttctggag 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_MTK2 For
<400> 35
ccatggagac ctgacttctg ctttctggag 30
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_HTK2 Re
<400> 36
gcggccgcct agccgtcttc acagatgttc ttg 33
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_RTK2 Re
<400> 37
gcggccgcct aggggtcctc acaggtgttg 30
<210> 38
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物_MTK2 Re
<400> 38
gcggccgcct aggggttctc acagattttc ttgcatt 37
<210> 39
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人组织因子通道抑制剂
<400> 39
Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu
20 25 30
Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys
35 40 45
Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys
50 55 60
Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu
65 70 75 80
Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser
85 90 95
Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile
100 105 110
Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu
115 120 125
Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn
130 135 140
Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly
145 150 155 160
Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu
165 170 175
Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn
180 185 190
Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu
195 200 205
Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly
210 215 220
Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly
225 230 235 240
Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn
245 250 255
Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile
260 265 270
Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys
275 280 285
Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met
290 295 300
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR1 Fo
<400> 40
gaagtccagc tggtggagtc tggaggt 27
<210> 41
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR1 Re_S
<400> 41
cggggcctga cgaacccagt tcatggcata gctgctgaag gtgaagccgc tcgctgc 57
<210> 42
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR1 Re_H
<400> 42
cggggcctga cgaacccagt tcatggcata atggctgaag gtgaagccgc tcgctgc 57
<210> 43
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR1 Re_K
<400> 43
cggggcctga cgaacccagt tcatggcata tttgctgaag gtgaagccgc tcgctgc 57
<210> 44
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR1 Re_R
<400> 44
cggggcctga cgaacccagt tcatggcata tctgctgaag gtgaagccgc tcgctgc 57
<210> 45
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR1 Re_T
<400> 45
cggggcctga cgaacccagt tcatggcata agtgctgaag gtgaagccgc tcgctgc 57
<210> 46
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR1 Re_Y
<400> 46
cggggcctga cgaacccagt tcatggcata atagctgaag gtgaagccgc tcgctgc 57
<210> 47
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR1 Re_I
<400> 47
cggggcctga cgaacccagt tcatggcata aatgctgaag gtgaagccgc tcgctgc 57
<210> 48
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR1 Re_L
<400> 48
cggggcctga cgaacccagt tcatggcata aaggctgaag gtgaagccgc tcgctgc 57
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Fo
<400> 49
tatgccatga actgggttcg tcaggcc 27
<210> 50
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_T-YH-EQDH
<400> 50
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccttg aacgctatcg gcgtagtagg tgtttgaccc 60
accggttgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 51
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_T-RK-EQDH
<400> 51
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccttg aacgctatcg gcgtagtagg ttyttgaccc 60
accggttgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 52
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_FYLH-YH-EQDH
<400> 52
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccttg aacgctatcg gcgtagtagg tgtttgaccc 60
acctwrtgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 53
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_FYLH-RK-EQDH
<400> 53
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccttg aacgctatcg gcgtagtagg ttyttgaccc 60
acctwrtgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 54
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_KRI-YH-EQDH
<400> 54
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccttg aacgctatcg gcgtagtagg tgtttgaccc 60
accthttgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 55
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_KRI-RK-EQDH
<400> 55
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccttg aacgctatcg gcgtagtagg ttyttgaccc 60
accthttgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 56
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_T-YH-EQDH_#2
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> a或g或c
<400> 56
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccnts aacgctatcg gcgtagtagg tatrtgaccc 60
accggttgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 57
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_T-RK-EQDH_#2
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> a或g或 c
<400> 57
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccnts aacgctatcg gcgtagtagg ttyttgaccc 60
accggttgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 58
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_FYLH-YH-EQDH_#2
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> a或g或c
<400> 58
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccnts aacgctatcg gcgtagtagg tatrtgaccc 60
acctwrtgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 59
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_FYLH-RK-EQDH_#2
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> a或g或c
<400> 59
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccnts aacgctatcg gcgtagtagg ttyttgaccc 60
acctwrtgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 60
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_KRI-YH-EQDH_#2
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> a或g或c
<400> 60
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccnts aacgctatcg gcgtagtagg tatrtgaccc 60
accthttgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 61
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR2 Re_KRI-RK-EQDH_#2
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> a或g或c
<400> 61
gttatcgcgg gaaatggtga agcgcccnts aacgctatcg gcgtagtagg ttyttgaccc 60
accthttgtg atggtgctga cccattccaa gcc 93
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR3 Fo
<400> 62
gggcgcttca ccatttcccg cgataac 27
<210> 63
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR3 Re_N
<400> 63
gccctggccc caataatcca tcagaaaatt gccatcctgg cgcgcgcaat aatataccgc 60
<210> 64
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR3 Re_F
<400> 64
gccctggccc caataatcca tcagaaaaaa gccatcctgg cgcgcgcaat aatataccgc 60
<210> 65
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR3 Re_H
<400> 65
gccctggccc caataatcca tcagaaaatg gccatcctgg cgcgcgcaat aatataccgc 60
<210> 66
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR3 Re_K
<400> 66
gccctggccc caataatcca tcagaaattt gccatcctgg cgcgcgcaat aatataccgc 60
<210> 67
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR3 Re_Q
<400> 67
gccctggccc caataatcca tcagaaattg gccatcctgg cgcgcgcaat aatataccgc 60
<210> 68
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR3 Re_R
<400> 68
gccctggccc caataatcca tcagaaatct gccatcctgg cgcgcgcaat aatataccgc 60
<210> 69
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH FR3 Re_Y
<400> 69
gccctggccc caataatcca tcagaaaata gccatcctgg cgcgcgcaat aatataccgc 60
<210> 70
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 最终 Fo
<400> 70
ggttctggtg gtggtggttc tgctagcgac gtggtgatga cacagacgcc gctg 54
<210> 71
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 最终 Re
<400> 71
ggagctcaca gtcaccagcg tgccctggcc ccaataatcc atcagaaa 48
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Fo
<400> 72
gacgtggtga tgacacagac gccgctg 27
<210> 73
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Re_S
<400> 73
gagccaattc agatacgtct tgccgtcgga gtccagcagc gactggcttg atttgca 57
<210> 74
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Re_I
<400> 74
gagccaattc agatacgtct tgccgtcaat gtccagcagc gactggcttg atttgca 57
<210> 75
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Re_L
<400> 75
gagccaattc agatacgtct tgccgtcaag gtccagcagc gactggcttg atttgca 57
<210> 76
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Re_N
<400> 76
gagccaattc agatacgtct tgccgtcagc gtccagcagc gactggcttg atttgca 57
<210> 77
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Re_Q
<400> 77
gagccaattc agatacgtct tgccgtcttg gtccagcagc gactggcttg atttgca 57
<210> 78
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Re_R
<400> 78
gagccaattc agatacgtct tgccgtctct gtccagcagc gactggcttg atttgca 57
<210> 79
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Re_F
<400> 79
gagccaattc agatacgtct tgccgtcaaa gtccagcagc gactggcttg atttgca 57
<210> 80
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Re_K
<400> 80
gagccaattc agatacgtct tgccgtcttt gtccagcagc gactggcttg atttgca 57
<210> 81
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Re_T
<400> 81
gagccaattc agatacgtct tgccgtcagt gtccagcagc gactggcttg atttgca 57
<210> 82
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR1 Re_V
<400> 82
gagccaattc agatacgtct tgccgtcaac gtccagcagc gactggcttg atttgca 57
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR2 Fo
<400> 83
gacggcaaga cgtatctgaa ttggctccag 30
<210> 84
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR2 Re_T-YH
<400> 84
gcgtttaatt tcaaccttag tgccttggcc gaacgtaaac ggaaagtrgg tgccctgcca 60
gcaatagtag acgcc 75
<210> 85
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR2 Re_T-LIHQNK
<400> 85
gcgtttaatt tcaaccttag tgccttggcc gaacgtaaac ggaaawwkgg tgccctgcca 60
gcaatagtag acgcc 75
<210> 86
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR2 Re_FYIN-YH
<400> 86
gcgtttaatt tcaaccttag tgccttggcc gaacgtaaac ggaaagtraw wgccctgcca 60
gcaatagtag acgcc 75
<210> 87
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL FR2 Re_FYIN-LIHQNK
<400> 87
gcgtttaatt tcaaccttag tgccttggcc gaacgtaaac ggaaawwkaw wgccctgcca 60
gcaatagtag acgcc 75
<210> 88
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL 最终 Re
<400> 88
gcgtttaatt tcaaccttag tgccttggcc gaacgtaaa 39
<210> 89
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL 最终 Fo SfiI
<400> 89
cgtggcccag gcggccgacg tggtgatgac acagacgccg ctg 43
<210> 90
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL 最终 Fo NruI
<400> 90
ctatcgcgat tgcagtggca ctggctggtt tcg 33
<210> 91
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL Overlapping Fo
<400> 91
ggcacgctgg tgactgtgag ctccggaggc ggcggaagtg gcggaggagg cagcggcgga 60
ggcgggagtg acgtggtgat gacacagacg ccgctg 96
<210> 92
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL 最终 Re
<400> 92
gtcctcttca gaaataagct tttgttcgga tccgcgttta atttcaacct tagtgccttg 60
gccgaacgta aa 72
<210> 93
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 同源重组
<400> 93
gctctgcagg ctagtggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct 60
gctagc 66
<210> 94
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL同源重组
<400> 94
ttgttatcag atctcgagct attacaagtc ctcttcagaa ataagctttt gttcggatcc 60
<210> 95
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1001_可变重链
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1001_可变轻链
<400> 96
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ile
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 97
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1015_可变重链
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1021_可变重链
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly His Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 99
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1023_可变重链
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 100
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1024_可变重链
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 101
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1024_可变轻链
<400> 101
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Leu
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 102
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1104_可变重链
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 103
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1104_可变轻链
<400> 103
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Val
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 104
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1123_可变重链
<400> 104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly His Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 105
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1202_可变重链
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Lys Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 106
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1208_可变轻链
<400> 106
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Val
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 107
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1216_可变重链
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly His Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1216_可变轻链
<400> 108
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ile
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 109
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1223_可变重链
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly His Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 110
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1234_可变重链
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 111
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1234_可变轻链
<400> 111
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ile
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 112
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1243_可变重链
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
His Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly His Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 113
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1248_可变重链
<400> 113
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly His Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 114
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3007_可变重链
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Leu Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3016_可变重链
<400> 115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 116
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3016_可变轻链
<400> 116
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 117
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3024_可变重链
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 118
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3120_可变重链
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 119
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3131_可变重链
<400> 119
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Gln Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 120
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3203_可变重链
<400> 120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 121
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4011_可变重链
<400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 122
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4011_可变轻链
<400> 122
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 123
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4017_可变重链
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 124
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4034_可变重链
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 125
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4041_可变重链
<400> 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
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100 105 110
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<210> 126
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4141_可变重链
<400> 126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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<210> 127
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4146_可变重链
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4206_可变重链
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4208_可变重链
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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100 105 110
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4208_可变轻链
<400> 130
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100 105 110
Arg
<210> 131
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4278_可变重链
<400> 131
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Leu Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gln Tyr Leu Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 132
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4287_可变重链
<400> 132
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 133
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4_可变重链
<400> 133
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 134
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆6_可变重链
<400> 134
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 135
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆9_可变重链
<400> 135
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 136
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆11_可变重链
<400> 136
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 137
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆12_可变重链
<400> 137
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly His Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 138
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆13_可变重链
<400> 138
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 139
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆14_可变轻链
<400> 139
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Pro Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 140
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆15_可变轻链
<400> 140
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Pro Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Phe Tyr Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 141
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆16_可变重链
<400> 141
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 142
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆17_可变重链
<400> 142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 143
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆18_可变重链
<400> 143
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 144
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆19_可变重链
<400> 144
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Lys Lys Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Glu Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 145
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆20_可变重链
<400> 145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Lys Lys Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Glu Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 146
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆21_可变重链
<400> 146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Lys Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 147
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆22_可变轻链
<400> 147
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Pro Ser Leu Leu Asp Val
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 148
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆23_可变重链
<400> 148
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly His Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1001_可变重链 CDR 1
<400> 149
Ser Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 150
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1001_可变重链 CDR 2
<400> 150
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Asp
1 5 10 15
Gly
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1001_可变重链 CDR 3
<400> 151
Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr
1 5
<210> 152
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1001_可变轻链 CDR 1
<400> 152
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 153
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1001_可变轻链 CDR 2
<400> 153
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 154
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1001_可变轻链 CDR 3
<400> 154
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe
1 5
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1015_可变重链 CDR 2
<400> 155
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1021_可变重链 CDR 3
<400> 156
Gln Asp Gly His Phe Leu Met Asp Tyr
1 5
<210> 157
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1024_可变重链 CDR 1
<400> 157
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 158
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1024_可变轻链 CDR 1
<400> 158
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 159
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1104_可变重链 CDR 2
<400> 159
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 160
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1104_可变轻链 CDR 1
<400> 160
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Val Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 161
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1208_可变轻链 CDR 3
<400> 161
Trp Gln Gly Thr Tyr Leu Pro Phe
1 5
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1214_可变重链 CDR 2
<400> 162
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1216_可变重链 CDR 1
<400> 163
His Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1216_可变轻链 CDR 3
<400> 164
Trp Gln Gly Thr His Leu Pro Phe
1 5
<210> 165
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1234_可变重链 CDR 2
<400> 165
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 166
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1243_可变重链 CDR 2
<400> 166
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val His
1 5 10 15
Gly
<210> 167
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1248_可变重链 CDR 2
<400> 167
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Asp
1 5 10 15
Gly
<210> 168
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3007_可变重链 CDR 2
<400> 168
Thr Ile Thr Leu Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 169
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3016_可变轻链 CDR 1
<400> 169
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3120_可变重链 CDR 3
<400> 170
Gln Asp Gly Tyr Phe Leu Met Asp Tyr
1 5
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3131_可变重链 CDR 3
<400> 171
Gln Asp Gly Gln Phe Leu Met Asp Tyr
1 5
<210> 172
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4278_可变重链 CDR 1
<400> 172
Lys Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 173
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4278_可变重链 CDR 2
<400> 173
Thr Ile Thr Leu Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Asp
1 5 10 15
Gly
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4278_可变重链 CDR 3
<400> 174
Gln Tyr Leu Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆4287_可变重链 CDR 3
<400> 175
Gln His Pro Tyr Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 176
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆1_可变轻链 CDR 1
<400> 176
Lys Ser Ser Pro Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 177
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆2_可变轻链 CDR 1
<400> 177
Lys Ser Ser Pro Ser Leu Leu Asp Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 178
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆3_可变轻链 CDR 1
<400> 178
Lys Ser Ser Pro Ser Leu Leu Asp Val Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 179
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆14_可变轻链 CDR 3
<400> 179
Trp Gln Gly Thr Tyr Phe Pro Phe
1 5
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆15_可变轻链 CDR 3
<400> 180
Trp Gln Gly Phe Tyr Phe Pro Phe
1 5
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆16_可变重链 CDR 1
<400> 181
His Tyr Ala Met Thr
1 5
<210> 182
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆17_可变重链 CDR 1
<400> 182
Ser Tyr Ala Met Thr
1 5
<210> 183
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆19_可变重链 CDR 1
<400> 183
Gln Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 184
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆19_可变重链 CDR 2
<400> 184
Thr Ile Thr Lys Lys Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Asp
1 5 10 15
Gly
<210> 185
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆19_可变重链 CDR 3
<400> 185
Gln Asp Gly Glu Phe Leu Met Asp Tyr
1 5
<210> 186
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆20_可变重链 CDR 2
<400> 186
Thr Ile Lys Lys Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Asp
1 5 10 15
Gly
<210> 187
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆21_可变重链 CDR 2
<400> 187
Thr Ile Thr Lys Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Asp
1 5 10 15
Gly
<210> 188
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆23_可变重链 CDR 1
<400> 188
His Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 189
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH Fo
<400> 189
tgctgtgggt gagtggtacc tgtggggaag tccagctggt ggagtctgga ggt 53
<210> 190
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH Re
<400> 190
agtgggaaca cggagggccc cttggtgctg gcggagctca cagtcaccag cgtgcc 56
<210> 191
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL Fo
<400> 191
tgctgtgggt gagtggtacc tgtggggacg tggtgatgac acagacgccg ctg 53
<210> 192
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL Re_CL overlap
<400> 192
gatgaacaca gaaggggcag ccaccgtgcg tttaatttca accttagtgc cttggccgaa 60
cgtaaa 66
<210> 193
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ck Fo
<400> 193
acggtggctg ccccttctgt gttcatc 27
<210> 194
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ck Re
<400> 194
gattggatcc aagcttacta gcactcaccc ctgttgaaag actta 45
<210> 195
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆A24_可变重链
<400> 195
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 196
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆A25_可变轻链
<400> 196
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 197
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆A52_可变重链
<400> 197
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 198
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆A63_可变重链
<400> 198
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 199
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆A71_可变重链
<400> 199
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
His Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 200
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆A74_可变重链
<400> 200
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 201
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆A25_可变轻链 CDR 1
<400> 201
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 202
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆A71_可变重链 CDR 2
<400> 202
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val His
1 5 10 15
Gly
<210> 203
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆A74_可变重链 CDR 1
<400> 203
Ser Tyr Ala Met His
1 5
<210> 204
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆A24_可变重链 CDR 2
<400> 204
Thr Ile Thr Thr Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu
1 5 10 15
Gly

Claims (9)

1.特异性结合TFPI(组织因子通道抑制剂)的抗体，其中所述组织因子通道抑制剂由SEQ ID NO: 39表示， 其中所述抗体含有氨基酸序列为SEQ ID NO: 149所示的重链CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO: 150所示的重链CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO: 151所示的重链CDR3；以及氨基酸序列为SEQ ID NO: 152所示的轻链CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO: 153所示的轻链CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO: 154所示的轻链CDR3。
2.权利要求1的抗体，其中，所述抗体含有氨基酸序列为SEQ ID NO: 95、99或105所示的重链可变区。
3.权利要求1的抗体，其中，所述抗体含有氨基酸序列为SEQ ID NO: 96所示的轻链可变区。
4.权利要求1的抗体，其中，所述抗体含有氨基酸序列为SEQ ID NO: 95、99或105所示的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID NO: 96所示的轻链可变区。
5.编码权利要求1至4中任一项的抗体的核酸。
6.包含权利要求5的核酸的载体。
7.包含权利要求6的载体的宿主细胞。
8.用于生成权利要求1至4中任一项的抗体的方法，其包括培养权利要求7的宿主细胞以表达所述抗体。
9.用于治疗血友病的药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1至4中任一项的抗体。
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