CN117715932A

CN117715932A - 一种cdc平台抗体

Info

Publication number: CN117715932A
Application number: CN202280052774.1A
Authority: CN
Inventors: 赵杰; 张学赛; 黄浩旻; 朱祯平
Original assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Current assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2022-08-26
Publication date: 2024-03-15
Also published as: TWI858383B; TW202313693A; JP2024535710A; CN115724985A; WO2023025309A1; EP4393946A1

Abstract

一种增强CDC效应的平台技术。具体地，涉及一种具有抗原结合活性和CDC活性的抗体或其片段或融合蛋白，所述抗体或其片段或融合蛋白包含靶向预定抗原的结合功能域、和重链Fc区元件，所述重链Fc区元件：(1)在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K，较佳地在Fc区位置345位上还包含R；和/或(2)在C末端含有尾片(tail‑piece)元件。所述抗体或其片段或融合蛋白通过第309位氨基酸的定点突变或者在C末端原加尾片元件，可以显著提高本发明抗体或其片段或融合蛋白的CDC性能，进而可以改善已有抗体或其片段或融合蛋白的疗效，治疗多种疾病。

Description

一种CDC平台抗体

技术领域

本发明涉及抗体领域，具体地，涉及一种补体依赖的细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)平台抗体。

背景技术

补体(complement，C)是存在于正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质。早在19世纪末Bordet即证实，新鲜血液中含有一种不耐热的成分，可辅助和补充特异性抗体，介导免疫溶菌、溶血作用，故称为补体。补体是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统，故称为补体系统(complement system)。正常情况下，补体是血浆蛋白的组成成分。补体系统的各成分，以无活性的前体存在于血浆中。需要时，再在激活物如抗原-抗体复合物等的作用下，依次被激活，最终发挥作用。根据补体系统各成分的生物学功能，可将其分为补体固有成分、补体调控成分和补体受体。

补体固有成分可分为以下4类：1、经典激活途径的C1、C2、C4；2、旁路激活途径的B因子、D因子和P因子；3、甘露聚糖结合凝集素(mannan binding lectin,MBL)激活途径的MBL和丝氨酸蛋白酶；4、参与共同末端通路的C3、C5、C6、C7、C8、C9。

补体激活过程依据其起始顺序不同，可分为3条途径：1、从C1q-C1r2-C1s2开始的经典途径(classical pathway)，抗原-抗体复合物为主要激活物；2、从C3开始的旁路途径(alternative pathway)，其不依赖于抗体；3、通过甘露聚糖结合凝集素(MBL)糖基识别的凝集素激活途径(MBL pathway)。上述3条途径具有共同的末端通路，即膜攻击复合物的形成及其溶解细胞效应。

补体的经典激活途径(classical pathway)指主要由C1q与免疫复合体(immune complex)结合后，顺序活化C1r、C1s、C4、C2、C3，形成C3转化酶(C4b 2b)与C5转化酶(C4b2b3b)的级联酶促反应过程。它是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式。

免疫复合体主要是与抗原结合的IgG、IgM分子。每个C1q分子必须与两个以上免疫球蛋白分子的Fc段结合；游离的或可溶性抗体不能激活补体。参与经典途径活化的补体成分依次为：C1、C4、C2和C3、C5～C9。

经典途径活化过程分为3个主要阶段：1、识别阶段；2、活化阶段；3、膜攻击阶段(攻膜阶段)。补体系统激活过程中，可产生多种生物活性物质，引起一系列生物学效应。补体的生物学效应有：1、增强吞噬作用，增强吞噬细胞的趋化性；2、增加血管的通透性；3、中和病毒；4、细胞溶解作用；5、免疫反应的调节作用等。

研究表明(参考文献：Complement Is Activated by IgG Hexamers Assembled at the Cell Surface[J].Science,2014,343(6176):1260-3.)，六聚体是结合C1q并启动经典激活途径的最有效的形式。Genmab基于此原理开发出HexaBody平台(参考文献：Jong R,Beurskens F J,Verploegen S,et al.A Novel Platform for the Potentiation of Therapeutic Antibodies Based on Antigen-Dependent Formation of IgG Hexamers at the Cell Surface[J].PLOS Biology,2016,14(1):e1002344.)。该平台技术特点是：通过诱导Fc特定位点突变(例如E345R)，增强Fc与Fc之间相互作用，可促进抗体在结合细胞表面抗原之后更易于形成六聚体。形成的六聚体可以有效增强免疫效应功能，特别是提高抗体的补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)。然而，现有技术中的方法尚难以令人满意。

ADCC，是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-medicated cytotoxicity)是指抗体的Fab区域与肿瘤细胞或其他靶细胞表面的抗原相结合，Fc区域通过与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞等)表面的FcγR结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。其中NK细胞是抗体发挥ADCC作用的主要效应细胞，当抗体Fc区域与NK细胞表面的FcγR结合后会引起后者活化，活化的NK细胞会释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质引起靶细胞凋亡从而达到杀伤靶细胞的目的。可见，ADCC效应亦是相关抗体发挥生物学活性的主要机制之一。当前生物医药领域ADCC活性开发最多的抗体亚型为野生型的IgG1。

因此，本领域仍然需要开发具有良好CDC和/或ADCC活性的平台抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强抗体或其片段或融合蛋白CDC活性的平台，优选地为一种增强抗体或其片段或融合蛋白CDC和/或ADCC活性的平台。

在本发明的第一方面，提供了一种具有抗原结合活性和CDC活性的抗体或其片段或融合蛋白，所述抗体或其片段或融合蛋白包含靶向预定抗原的结合功能域、和重链Fc区元件，所述重链Fc区元件：

(1)在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或

(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件与尾片(tail-piece)元件通过接头连接。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件含有两条重链Fc区，每条重链Fc区(1)在位置309位上各自独立地包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或

(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。

在另一优选例中，其中每条重链Fc区在位置345位上还包含R。

在另一优选例中，所述的抗体或其片段或融合蛋白还具有ADCC活性。

在另一优选例中，所述靶向预定抗原的结合功能域结合选自下组的抗原分子：CD38、CD3、CD47、CD19、CD20、HER2、EGFR、CD123、Glypican-3、CD25、Trop-2、EpCAM、或其组合。

在另一优选例中，所述靶向预定抗原的结合功能域包含下组的结构域：VH、VL、Fab、F(ab') ₂、Fab'、scFv或VHH。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件的CH3结构域的C末端包含尾片(tail-piece)元件。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件来源于IgG。

在另一优选例中，所述IgG具有选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34。

在另一优选例中，所述IgG来源于哺乳动物，较佳地来源于鼠、食蟹猴或人，优选来源于人。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件包含来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2和/或CH3结构域。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件来源于人IgG1。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域。

在另一优选例中，所述抗体或其片段或融合蛋白为单特异性、双特异性、三特异性或多特异性抗体或其片段或融合蛋白。

在另一优选例中，所述抗体或其片段或融合蛋白为二聚体、三聚体或多聚体。

在另一优选例中，所述多聚体为六聚体。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：F、C、W或Y。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件还包括其他位置的氨基酸取代。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件还包括：Fc区位置345位上的谷氨酸残基被精氨酸残基取代(E345R)。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件包括选自下组Fc区位置的氨基酸残基取代：

(1)L309W+E345R；

(2)L309Y+E345R；

(3)L309E+E345R；

(4)L309F+E345R；

(5)L309H+E345R；

(6)L309C+E345R；

(7)L309D+E345R；

(8)L309N+E345R；

(9)L309Q+E345R；

(10)L309R+E345R；

(11)L309S+E345R；

(12)L309T+E345R；或

(13)L309K+E345R。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件包括Fc区位置具有L309W+E345R的氨基酸残基取代。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件的氨基酸编号按照EU编号系统。

在另一优选例中，所述尾片元件来源于人IgM。

在另一优选例中，所述尾片元件中包含一个或多个氨基酸的突变。

在另一优选例中，所述尾片元件的序列如SEQ ID NO：7或8所示。

在另一优选例中，所述靶向预定抗原的结合功能域为结合CD38的结合功能域，其包含选自下组的重链可变区和轻链可变区：

(1)重链可变区，其包含如下所示的3个互补决定区CDR：

SEQ ID NO：11所示的H-CDR1；

SEQ ID NO：12所示的H-CDR2；

SEQ ID NO：13所示的H-CDR3；和

轻链可变区，其包含如下所示的3个互补决定区CDR：

SEQ ID NO：14所示的L-CDR1；

SEQ ID NO：15所示的L-CDR2；

SEQ ID NO：16所示的L-CDR3；或

(2)重链可变区，其包含如下所示的3个互补决定区CDR：

SEQ ID NO：35所示的H-CDR1；

SEQ ID NO：36所示的H-CDR2；

SEQ ID NO：37所示的H-CDR3；和

轻链可变区，其包含如下所示的3个互补决定区CDR：

SEQ ID NO：38所示的L-CDR1；

SEQ ID NO：39所示的L-CDR2；

SEQ ID NO：40所示的L-CDR3。

在另一优选例中，所述抗体或其片段或融合蛋白选自下组：

(a)具有选自下组氨基酸序列抗体或其片段或融合蛋白：

重链，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处具有W或Y突变的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL区；或

重链，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的 H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处具有W或Y突变的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL区；或

重链，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处具有W或Y突变，和345位置处具有R突变的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL区；或

重链，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处具有W或Y突变，和345位置处具有R突变的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL区；或

重链，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH区，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL区；或

重链，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH区，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL区；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗原结合功能和所述CDC活性的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述抗体或其片段或融合蛋白选自下组：

(a)具有选自下组氨基酸序列抗体或其片段或融合蛋白：

重链，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处W或Y突变的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL区；或

重链，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处W或Y突变的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL区；或

重链，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处具有W或Y突变，和345位置处具有R突变的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL区；或

重链，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309 位置处具有W或Y突变，和345位置处具有R突变的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL区；或

重链，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH区，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL区；或

重链，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH区，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL区；

在另一优选例中，所述抗体或其片段或融合蛋白选自下组：

(a)具有选自下组氨基酸序列抗体或其片段或融合蛋白：

重链，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH区，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL区；或

重链，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH区，和具有如SEQ ID NO：32所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL区；或

重链，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH区，和具有如SEQ ID NO：32所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL区；或

重链，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH区，和具有如SEQ ID NO：34所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL区；或

重链，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH区，和具有如SEQ ID NO：34所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL区；

在本发明的第二方面，提供了一种提高抗体或其片段或融合蛋白的CDC的方法，其中，所述抗体或其片段或融合蛋白包含免疫球蛋白的Fc区和靶向预定抗原的结合功能域，所述方法包括：

(S1a)将一个或多个氨基酸残基中的突变引入到该抗体或其片段或融合蛋白中，所述突变包括将IgG重链的Fc区中的309位突变为选自下组的氨基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或

(S1b)在Fc区的C末端融合尾片(tail-piece)元件，所述尾片元件的序列如SEQ ID NO：7或8所示。

在另一优选例中，所述IgG重链的Fc区中的第309位L突变成选自下组的氨基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(S2)比较突变后的抗体或其片段或融合蛋白与突变前的抗体或其片段或融合蛋白的CDC性能。

在另一优选例中，所述方法还包括提高抗体或其片段或融合蛋白的ADCC的活性。

在另一优选例中，所述(S1a)与(S1b)可以同时、先后或颠倒次序进行。

在另一优选例中，所述突变包括将IgG重链的Fc区中的309位突变为选自下组的氨基酸：W、Y。

在另一优选例中，在步骤(S1a)中，当所述抗体或其片段或融合蛋白中重链Fc区中的309位不为Y且不为W时，将其突变为Y或W。

在另一优选例中，在步骤(S1a)中，当所述抗体或其片段或融合蛋白中重链Fc区中的309位不为Y时，将其突变为Y。

在另一优选例中，在步骤(S1a)中，当所述抗体或其片段或融合蛋白中重链Fc区中的309位不为W时，将其突变为W。

在另一优选例中，在步骤(S1a)中，所述突变还包括：将IgG重链的Fc区中的345位突变为R。

在另一优选例中，在步骤(S1a)中，所述突变包括将IgG重链的Fc区中的309位L突变为选自下组的氨基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和

将IgG重链的Fc区中的345位E突变为R。

在本发明的第三方面，提供了一种重链Fc区元件，所述重链Fc区元件：

(1)在Fc区位置309上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或

(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件来源于IgG。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件来源于人IgG1。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件包含来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2和CH3结构域。

在另一优选例中，所述重链Fc区元件还包括在Fc区位置345位上的谷氨酸残基被精氨酸残基取代(E345R)。

(1)L309W+E345R；

(2)L309Y+E345R；

(3)L309E+E345R；

(4)L309F+E345R；

(5)L309H+E345R；

(6)L309C+E345R；

(7)L309D+E345R；

(8)L309N+E345R；

(9)L309Q+E345R；

(10)L309R+E345R；

(11)L309S+E345R；

(12)L309T+E345R；或

(13)L309K+E345R。

在另一优选例中，所述尾片元件来源于人IgM。

在本发明的第四方面，提供了一种分离的核酸分子，所述的核酸分子编码如本发明的第一方面中所述的抗体或其片段或融合蛋白，或如本发明的第三方面所述的重链Fc区元件。

在本发明的第五方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有如本发明的第四方面所述的核酸分子。

在本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明的第五方面所述的表达载体。

在本发明的第七方面，提供了一种如本发明的第一方面中所述的抗体或其片段或融合蛋白或如本发明的第三方面所述的重链Fc区元件的制备方法，所述方法包含以下步骤：

(a)在表达条件下，培养如本发明的第六方面所述的宿主细胞，从而表达所述的抗体或其片段或融合蛋白或所述的重链Fc区元件；

(b)分离并纯化(a)所述的抗体或其片段或融合蛋白或所述的重链Fc区元件。

在本发明的第八方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：

(a)如本发明的第一方面所述的抗体或其片段或融合蛋白；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如本发明的第一方面中所述的抗体或其片段或融合蛋白或如本发明的第八方面所述的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

在本发明的第十方面，提供了一种如本发明的第一方面所述的抗体或其片段或融合蛋白、或如本发明的第八方面所述的免疫偶联物、或如本发明的第九方面所述的药物组合物在制备治疗癌症或免疫相关疾病的药物中的用途。

在另一优选例中，所述癌症选自下组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤及其它赘生性恶性疾病。

在另一优选例中，所述免疫相关疾病为自身免疫性疾病，优选为自免性肾病(免疫性肾炎、自身免疫性肾病)、狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)、舍格伦综合征(Sjogren’s Syndrome)、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、COPD、骨盆炎性疾病、阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)、炎性肠道疾病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛性疾病、腹膜炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病(Lyme disease)、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征(Guillain-Barr syndrome)、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、强直性脊柱炎、纤维化肺泡炎、格里夫氏症(Grave's disease)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、美尼尔氏病(Meniere'sdisease)、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、肉样瘤病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、其他自身免疫性障碍、胰腺炎、创伤(外科手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏疾病(包括缺血性疾病诸如心肌梗塞以及动脉粥样硬化)、血管内凝血、骨质再吸收、骨质疏松症、骨关节炎、牙周炎和低氯血症、与缺乏胎儿-母体耐受性相关的不孕症、白癜风、重症肌无力(MG)、系统性硬化症、炎性肠病、胃炎或IgG4相关疾病。

在另一优选例中，所述免疫相关疾病为自免性肾病，优选为免疫球蛋白A肾病(IgAN)、膜性肾病(MN)或具有肾脏意义的单克隆免疫球蛋白病(MGRS)、狼疮性肾炎或紫癜性肾炎。

在本发明的第十一方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明的第一方面所述的抗体或其片段或融合蛋白、如本发明的第九方面所述的药物组合物或如本发明的第八方面所述的免疫偶联物。

在另一优选例中，所述疾病包括：癌症或免疫相关疾病。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了含有Fc段309位定点突变(L309E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)的抗体对Raji细胞的CDC活性。

图2显示了含有Fc段309位定点突变(L309E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)的抗体对Daudi细胞的CDC活性。

图3显示了含有Fc段309位定点突变(L309F/C/W/Y)的抗体和Fc段末端改造(Pep及Pep-CS)的抗体对Daudi细胞的CDC活性。

图4显示了OKT10-Hu-IgG1及其突变体对Daudi细胞的CDC活性。

图5显示了50G12-Hu-IgG1、OKT10-Hu-IgG1、Daratumumab-IgG1和Isatuximab-IgG1抗体对食蟹猴CD38的结合能力。

图6显示了50G12-L309W-E345R、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R、未突变抗体50G12-Hu-IgG1和对照抗体Daratumumab介导的补体激活对Daudi细胞的杀伤活性。

图7显示了50G12-L309W-E345R、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R、未突变抗体50G12-Hu-IgG1和对照抗体Daratumumab介导的补体激活对Romas细胞的杀伤活性。

图8显示了50G12-L309W-E345R、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R、未突变抗体50G12-Hu-IgG1和对照抗体Daratumumab介导的补体激活对Raji细胞的杀伤活性。

图9显示了50G12-L309W-E345R、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R、未突变抗体50G12-Hu-IgG1和对照抗体Daratumumab介导的ADCC效应对Daudi细胞的杀伤活性。

图10显示了50G12-L309W-E345R、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R、未突变抗体50G12-Hu-IgG1和对照抗体Daratumumab介导的ADCC效应对NCI-H929细胞的杀伤活性。

图11显示了50G12-L309W-E345R、未突变抗体50G12-Hu-IgG1、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R和对照抗体Daratumumab介导的ADCC效应对Romas细胞的杀伤活性。

图12显示了50G12-L309W-E345R、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R、未突变抗体50G12-Hu-IgG1和对照抗体Daratumumab介导的ADCC效应对MOLP8细胞的杀伤活性。

图13显示了50G12-L309W-E345R、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R、未突变抗体50G12-Hu-IgG1、对照抗体Daratumumab介导的ADCC效应对Raji细胞的杀伤活性。

图14显示了50G12-L309W-E345R、未突变抗体50G12-Hu-IgG1、对照抗体Daratumumab的诱导细胞凋亡作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现，改造抗体重链恒定区Fc的L309位(优选为L309位和E345位)和/或在抗体重链恒定区的Fc段融合人IgM的tail-piece，能够显著增强抗体的免疫效应功能，特别是提高抗体的补体依赖的细胞毒性(CDC)和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在此基础上完成了本发明。

术语

本发明中，术语“抗体(Antibody，缩写Ab)”和“免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，缩写IgG)”是有相同结构特征的异四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型(isotype)的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是恒定区，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区，轻链恒定区包括一个结构域CL；轻链的恒定区与重链恒定区的CH1结构域配对，轻链的可变区与重链的可变区配对。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重链恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型；轻链恒定区包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗体的重链和轻链通过重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间的二硫键共价连接在一起，抗体的两条重链通过铰链区之间形成的多肽间二硫键共价连接在一起。本发明中，术语“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可将抗体裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段。Fab段由抗体的重链的VH和CH1以及轻链的VL和CL结构域组成。Fc段即可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗体的CH2和CH3结构域组成。Fc段无抗原结合活性，是抗体与效应分子或细胞相互作用的部位。本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于重链可变区和轻链可变区中称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(frame region，FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。

如本文所用，术语“框架区”(FR)指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。

如本文所用，术语“人框架区”是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。

如本文所用，“尾片(tail-piece)元件”、“TP元件”可以互换使用，均指来自IgM的tail-piece序列，优选来源于人IgM。本发明的TP元件可包含任何合适的氨基酸序列。所述TP元件可以是在天然存在的抗体中被发现的tail-piece，或者可选择地，其可以是在长度和/或组成上与天然tail-piece相异的经修饰的tail-piece序列。所述的修饰可以是一个或多个氨基酸的突变，例如将IgM的tail-piece中的半胱氨酸突变成丝氨酸。

在本发明的一个具体实施例中，TP元件的序列如SEQ ID NO：7或8所示。

应理解，可以将TP元件与重链Fc区的C末端直接融合。或者，可以在TP元件与重链Fc区之间提供短的接头序列。

如本文所用，术语“接头”是指Fc区和TP元件之间的短的接头序列，优选为柔性接头。合适的接头实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基，接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。

抗体或其片段或融合蛋白

本发明的抗体或其片段或融合蛋白是一种具有抗原结合活性和CDC活性的抗体或其片段或融合蛋白，包含靶向预定抗原的结合功能域、和重链Fc区元件，所述重链Fc区元件含有两条重链Fc区：每一条重链Fc区(1)在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。如本文所用，“重链Fc区元件”含有两条重链Fc区。若无特别地说明，本发明中的重链Fc区元件中的突变位点，是指重链Fc区元件中每一条重链Fc区上包含的突变位点。

应理解，本发明的抗体或其片段或融合蛋白的重链Fc区元件中第309位的特定CDC增强型突变可与其他提高抗体性能(如CDC、特异性、亲和力等)的技术结合，例如与E345R突变结合。较佳地，本发明中的抗体或其片段或融合蛋白的重链Fc区元件中的每一条重链Fc区包含突变组合L309W+E345R时，具有意外的明显增强CDC的作用；更佳地具有明显增强CDC和ADCC活性的作用。

如本文所用，术语“CDC平台抗体”、“本发明的抗体”、“本发明的抗体或其片段”“本发明的融合蛋白”“本发明的抗体或其片段或融合蛋白”可以互换使用，均指本发明第一方面所述的CDC功能增强的抗体或其片段或融合蛋白。应理解，所述术语还包括本发明抗体或其片段或融合蛋白的活性片段，所述活性片段既保留了抗原结合活性，还保留了第309位的特定突变和/或TP(tail-piece)元件。

在本说明书中，除非另外指定，否则将EU编号系统用于提及抗体结构域中的残基。该系统最初由Edelman等于1969年设计，并详细描述于如下文献中：Kabat等，1987(Edelman等,1969；“The cova1ent structure of an entireγG immunoglobulin molecule,”PNAS Biochemistry第63卷pp78-85。Kabat等,1987；Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA。)。当将位置编号和/或氨基酸残基赋予特定抗体同种型时，其旨在适用于任何其它抗体同种型的相应的位置和/或氨基酸残基，这是本领域技术人员己知的。例如在天然存在的人IgG1、IgG3和IgG4中的位置309上发现的野生型残基是亮氨酸残基，在天然存在的IgG2中发现的野生型残基是缬氨酸残基。当提及来源于IgM或IgA的尾部的氨基酸残基时，根据本领域的常规实践，给出的位置编号是天然存在的IgM或IgA中的残基的位置编号。如本文所用，“位置309位上的氨基酸残基”是指在天然存在的人IgG1中的位置309上的残基，“位置345位上的氨基酸残基”是指在天然存在的人IgG1中的位置345上的残基。

应理解，本发明还提供了一种构建CDC平台抗体或其片段或融合蛋白的方法，即构建本发明抗体或其片段或融合蛋白的方法，所述方法如本发明第二方面所述。通过本发明的构建CDC平台抗体或其片段或融合蛋白的方法，可以提高靶向预定抗原的抗体或其片段或融合蛋白的CDC活性，进一步显著地提高融合蛋白的CDC和/或ADCC活性。

在本发明中，本发明的抗体或其片段或融合蛋白包含的靶向预定抗原的结合功能域可以靶向不同的抗原靶点，所述靶向预定抗原的结合功能域结合可以选自下组的抗原分子：CD38、CD3、CD47、CD19、CD20、HER2、EGFR、CD123、Glypican-3、 CD25、Trop-2、EpCAM、或其组合。

以CD38为例，优选地，本发明抗CD38抗体的序列如专利申请CN202010805420.2中所述，本领域技术人员也可以通过本领域熟知的技术对本发明抗原的结合功能域进行修饰或改造，例如添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基，从而进一步增加抗原的结合功能域的亲和力或结构稳定性，并通过常规的测定方法获得修饰或改造后的结果。

在本发明中，本发明抗体或其片段或融合蛋白还包括其保守性变异体，指与本发明抗体或其片段或融合蛋白的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明中，术语“抗”和“结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10 ^-7M，例如小于大约10 ^-8M、10 ^-9M、10 ^-10M、10 ^-11M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(Surface Plasmon Resonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。

本发明的抗体或其片段或融合蛋白可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

编码核酸和表达载体

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明中，术语“表达载体”是指携带表达盒用于表达特定目的蛋白或其他物质的载体，如质粒、病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒)、噬菌体、酵母质粒或其他载体。例如包含适当的调控序列，例如启动子、终止子、增强子等的本领域的常规表达载体，所述表达载体包括但并不限于：病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒)、质粒、噬菌体、酵母质粒或其他载体。所述表达载体较佳地包括pDR1、pcDNA3.4(+)、pDHFR或pTT5。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本发明中，术语“宿主细胞”为本领域常规的各种宿主细胞，只要能使载体稳定地自行复制，且所携带的多核苷酸分子可被有效表达即可。其中所述宿主细胞包括原核表达细胞和真核表达细胞，所述宿主细胞较佳地包括：COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、TG1、BL21(DE3)、293F或293E细胞。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为4-8，较佳地pH约为5-7，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射、或腔内注射。

本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的双功能抗体或其片段或融合蛋白可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双功能抗体或其片段或融合蛋白的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的双功能抗体或其片段或融合蛋白(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的双功能抗体或其片段或融合蛋白还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的双功能抗体或其片段或融合蛋白、或其免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明中，术语“有效量”是指本发明的药物组合物施用受试者后，在治疗的个体中产生预期效果的量或剂量，该预期效果包括个体病症的改善。术语“受试者”包括但不限于哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、大鼠和小鼠等。

应用

本发明还提供了如本发明的第一方面所述的抗体或其片段或融合蛋白、或如本发明的第八方面所述的免疫偶联物、或如本发明的第九方面所述的药物组合物的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。

较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗癌症、或免疫相关疾病的药物。

本发明中，所述癌症选自下组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤及其它赘生性恶性疾病。

在本发明的一个优选实施例中，所述的药物是用于预防和/或治疗与CD38表达或功能异常相关的疾病的药物。

本发明中，所述与CD38表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与CD38表达或功能异常相关的疾病。较佳地，所述与CD38表达或功能异常相关的疾病为肿瘤/癌症、或免疫相关疾病。

较佳地，所述疾病优选为免疫相关疾病，例如自身免疫性疾病。更佳地，所述的药物用于治疗和/或预防自身抗体介导的自身免疫疾病。进一步地，所述自身免疫性疾病包括自免性肾病(免疫性肾炎、自身免疫性肾病)、狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)、格雷夫斯氏病(Graves'Disease)、重症肌无力(MG)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)自免性肾病(免疫性肾炎、自身免疫性肾病)、狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)、舍格伦综合征(Sjogren’s Syndrome)、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、COPD、骨盆炎性疾病、阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)、炎性肠道疾病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛性疾病、腹膜炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病(Lyme disease)、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征(Guillain-Barr syndrome)、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、强直性脊柱炎、纤维化肺泡炎、格里夫氏症(Grave's disease)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、美尼尔氏病(Meniere'sdisease)、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、肉样瘤病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、其他自身免疫性障碍、胰腺炎、创伤(外科手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏疾病(包括缺血性疾病诸如心肌梗塞以及动脉粥样硬化)、血管内凝血、骨质再吸收、骨质疏松症、骨关节炎、牙周炎和低氯血症、与缺乏胎儿-母体耐受性相关的不孕症、白癜风、重症肌无力(MG)、系统性硬化症、炎性肠病、胃炎或IgG4相关疾病，优选由于浆细胞过度增殖、分泌过多自抗体和免疫球蛋白形成免疫复合物导致的免疫球蛋白A肾病(IgAN)、膜性肾病(MN)或具有肾脏意义的单克隆免疫球蛋白病(MGRS)、狼疮性肾炎或紫癜性肾炎。

目前，针对IgAN、MN、MGRS这三种自免性肾病的治疗仍有较大临床需求未被满足，尤其是特异性靶向治疗手段严重匮乏，只有靶向CD20的利妥昔单抗被批准用于MN的治疗，但因CD20仅在产生较少自身抗体的活化B细胞上表达，所以调查结果显示，临床上仍有高达40％的MN患者对抗CD20治疗无效。而CD38则在浆细胞上高度表达，本发明中的特异性靶向CD38的抗体(例如50G12-L309W-E345R等)可通过ADCC、ADCP和CDC等效应引起浆细胞裂解和凋亡，以有效用于IgAN、MN、MGRS和多发性骨髓瘤(MM)的治疗。

本发明的主要优点包括

(1)本发明提供了一种新的增强CDC和/或ADCC的技术。该技术有潜力将缺失或仅有有限的CDC和/或ADCC活性的抗体药物转化成为有CDC和/或ADCC增强型的抗体药物。运用该技术，可以直接改造很多现成的作用于不同的靶点/靶细胞的抗体。运用该技术，可以改善已有抗体的疗效，治疗多种疾病。

(2)通过第309位氨基酸的定点突变，就可以显著提高本发明抗体或其片段或融合蛋白的CDC和/或ADCC性能。此外，本发明第309位的特定CDC和/或ADCC增强型突变可与其他提高抗体性能(如CDC、特异性、亲和力等)的技术结合，例如与E345R突变结合。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

相关试剂耗材：

EZ-link NHS-LC-Biotin(Thermo Fisher Scientific，货号21343)；Biotin CAPture Kit,Series S(Cytiva，货号28920234)；HBS-EP+pH7.4缓冲液(GE Healthcare，货号BR-1006-69)；Daudi、Raji、Romas、NCI-H929细胞购自ATCC(American Type Culture Collection)，MOLP8细胞购自南京科佰生物有限公司；ADCC Bioassay效应细胞(苏州瑞安生物科技有限公司，货号RA-CK01)；Cell Titer-Glo Luminescent Assay(Promega，货号G7570)；Normal Human Serum complement(Quidel Corporation，货号A11)；Bio-Glo Luciferase Assay System(Promega，货号G7940)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(Yeasen,货号40302ES60)。

实施例中使用的蛋白表达和纯化方法说明如下：

将目的基因构建到表达载体pcDNA3.4中，利用PEI(Polyethylenimine)将构建好的表达载体或表达载体的组合转入FreeStyle ^TM293-F Cells细胞(后文简称HEK293F，购自Thermo Fisher Scientific)中以表达抗体或重组蛋白，HEK293F细胞在Free Style 293Expression Medium(购自Thermo Fisher Scientific)中培养5天后收取细胞上清，然后用Protein A亲和层析纯化抗体，用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白。

以下实施例中使用的ELISA检测方法说明如下：

用相应的重组蛋白包被微孔板，用含有1％牛血清白蛋白的PBST(PBST为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)封闭微孔板。将待测抗体进行梯度稀释，然后转移到上述包被重组蛋白的微孔板中，室温孵育半小时。洗板后加入适当稀释的HRP(Horseradish Peroxidase)标记的羊抗人抗体(Fc specific，购自Sigma)，室温孵育半小时。洗板后每孔加入100μL以TMB(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine)为底物的显色液，室温孵育1～5min。加50μL终止液(2M H ₂SO ₄)终止反应。读板机(SpectraMax 190)读取OD450。用GraphPad Prism7进行作图和数据分析，并计算EC ₅₀/IC ₅₀。

以下实施例中使用的理化性质检测方法说明如下：

HPLC-SEC

抗体是高分子量蛋白质，具有高度复杂的二级和三级结构。由于翻译后修饰、聚集和降解等变化，抗体在生物化学和生物物理特性方面是异质的。当通过分离技术分析三特异性抗体时，通常会观察到变体、聚集体和降解片段，它们的存在可能会损害安全性和有效性。在生产和存储抗体的过程中容易出现聚集体、降解片段和不完整组装的分子。本发明使用高效液相色谱-尺寸排阻色谱(High-performance liquid chromatography-size exclusion chromatography，HPLC-SEC)检测样品中上述杂质的含量。聚集体的分子量要大于单体，因此相应峰的保留时间较短；降解片段或不完整组装分子的分子量要小于单体，因此相应峰的保留时间较长。HPLC-SEC所用色谱仪为Dionex Ultimate 3000；流动相配制方法如下：取适量20mM磷酸二氢钠母液，用20mM磷酸氢二钠调节PH至6.8±0.1；进样量：20μg；色谱柱为TSK G3000SWXL，规格为7.8×300mm 5μm；流速0.5mL/min，洗脱时间30min；柱温25℃，样品室温度10℃；检测波长214nm。

本发明的抗体序列：

表1.抗体序列

*其中，X＝E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、K、W、Y。

实施例1抗人CD38单克隆抗体(50G12)的制备

50G12-Humanized(后文称作50G12-Hu-IgG1)是抗CD38人源化单克隆抗体，其重链和轻链氨基酸序列来自于CN202010805420.2中的SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12(即本发明中的SEQ ID NO：5和6)。50G12-Hu-IgG1的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和2。50G12-Hu-IgG1的重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：35、36和37，50G12-Hu-IgG1的轻链的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：38、39和40。50G12-Hu-IgG1重链恒定区为人IgG1(氨基酸序列如SEQ ID NO：3)，轻链恒定区为人Kappa(氨基酸序列如SEQ ID NO：4)。在此，将50G12-Hu-IgG1重链和轻链的编码基因分别命名为50G12-Hu-IgG1-HC和50G12-Hu-IgG1-LC。将50G12-Hu-IgG1-HC和50G12-Hu-IgG1-LC基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，两种载体组合后表达并纯化抗体，所得抗体命名为50G12-Hu-IgG1。

实施例2抗体重链恒定区Fc段的改造

根据文献(Rowley T F,Peters S J,Aylott M,et al.Engineered hexavalent Fc proteins with enhanced Fc-gamma receptor avidity provide insights into immune-complex interactions[J].Communications biology,2018,1(1):1-12.)可知，人IgG1单克隆抗体在L309(Eu numbering scheme)突变成半胱氨酸(简写为C)并且在Fc末端融合人IgM的tail-piece之后会容易生成六聚化的抗体复合体。这表明，人IgG1 L309C突变和人IgM的tail-piece具有促进人IgG1形成六聚体的潜力。

1、Fc段309位的定点突变

在此，本实施例对50G12-Hu-IgG1重链基因L309位进行了定点突变，将L309分别突变成(E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)，产生了一系列突变体，然后按照上述方法表达并纯化抗体，所得抗体分别命名为50G12-Hu-IgG1-L309X(X表示E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)。

测定CDC的方法描述如下：Raji和Daudi细胞购自ATCC(American Type Culture Collection)，并按照ATCC推荐方法进行常规培养和传代。在RPMI-1640(Gibco；货号：11835-030)中加入人血清(澳赛尔斯；货号：PB022-C)，使人血清终浓度为5％；用此培养基重悬对数生长期的Raji/Daudi细胞，然后接种至96孔板中(Corning；货号：CLS3599)，每孔接种50μL细胞悬液(含10万个细胞)；将待测抗体进行梯度稀释，然后加入上述接种细胞的96孔板中，每孔50μL；混匀之后，置于细胞二氧化碳细胞培养箱中孵育2.5小时；在96孔板中加入CCK-8(Dojindo，货号：CK04)，每孔20μL，继续孵育2小时；用SpectraMax 190(Molecular Devices)读取96孔板的OD450；用GraphPad Prism7进行数据分析和作图，计算IC ₅₀。

CDC活性越强，细胞活力越低，OD450也越低。图1和图2结果均显示，与母本抗体50G12-Hu-IgG1相比，50G12-Hu-IgG1-L309F/C/W/Y具有显著增强的CDC。其中Isotype Control为与靶点不相关的人IgG1单克隆抗体。

2、Fc段末端的改造

在此，通过基因工程将IgM的tail-piece(氨基酸序列：PTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO：7)，该段短肽简称为Pep)的编码序列连接到50G12-Hu-IgG1重链基因的末端，并将该重链基因命名为50G12-Hu-IgG1-Pep-HC(氨基酸序列如SEQ ID NO：9)。为避免表达过程中抗体分子之间形成二硫键，将两条tail-piece中的半胱氨酸突变成丝氨酸(突变后tail-piece的氨基酸序列：PTLYNVSLVMSDTAGT SY(SEQ ID NO：8)，该段短肽简称为Pep-CS)，并将该重链基因命名为50G12-Hu-IgG1-Pep-CS-HC(氨基酸序列如SEQ ID NO：10)。将50G12-Hu-IgG1-Pep-HC和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS-HC基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，两种载体分别与50G12-Hu-IgG1-LC基因组合后表达并纯化抗体，所得抗体分别命名为50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS。

用上述方法检测50G12-Hu-IgG1-L309F/C/W/Y、50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS的CDC。不同之处在于，此处使用 Luminescent Cell Viability Assay(Promega，货号：G7572，简称CTG)检测细胞活力。在一些孔的细胞中加入Triton X-100(0.1％)以充分裂解细胞，该组细胞加入CTG后产生的信号为基底值。没有经过抗体处理的细胞在加入CTG后产生的信号为最大值。CDC按照如下公式计算：细胞毒性(％)＝(最大值-实验值)/(最大值-基底值)×100。用GraphPad Prism7进行数据分析和作图，如图3所示。计算EC ₅₀，如表2所示。

表2.本发明抗体的CDC活性

CDC越强，EC ₅₀越小，Top(曲线高平台的高度)越高。图3和表2结果显示，与母本抗体50G12-Hu-IgG1相比，50G12-Hu-IgG1-L309F/C/W/Y具有显著增强的CDC活性，其中50G12-Hu-IgG1-L309F/Y的CDC弱于50G12-Hu-IgG1-L309C/W。

50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS具有相近的CDC，并且它们的CDC与50G12-Hu-IgG1-L309C/W基本相当。50G12-Hu-IgG1-L309C/W、50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS的Top均大于99，这说明这些抗体在高浓度时，能够充分裂解靶细胞。

实施例3抗体突变体的聚集体分析

用HPLC-SEC测定上述优选抗体突变体的纯度。结果如下：

表3.本发明优选抗体突变体的纯度

HPLC-SEC的测定结果显示，50G12-Hu-IgG1-L309F/W/Y和

50G12-Hu-IgG1-Pep-CS的主峰比例均大于98％，这说明它们尺寸异质性小，具有较高的纯度。此外，50G12-Hu-IgG1-L309C和50G12-Hu-IgG1-Pep的主峰比例分别为79.7％和74.0％，两者纯度低于80％，图谱中显示这两种抗体中存在较多的聚集体。

实施例4抗人CD38单克隆抗体OKT10的改造

1、OKT10人源化单克隆抗体的制备

OKT10是抗人CD38单克隆抗体，由小鼠杂交瘤产生。其重链可变区和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NOs：19和20)来自NCBI GenBank(ABA42888.1和ABA42887.1)。

由上海生工生物工程有限公司合成编码上述可变区的DNA。对OKT10的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列进行分析，依据Kabat规则分别确定OKT10重链和轻链的抗原互补决定区和框架区。OKT10重链CDR的氨基酸序列为H-CDR1：RSWMN(SEQ ID NO：11)、H-CDR2：EINPDSSTINYTTSLKD(SEQ ID NO：12)和H-CDR3：YGNWFPY(SEQ ID NO：13)，轻链CDR的氨基酸序列为L-CDR1：KASQNVDTNVA(SEQ ID NO：14)、L-CDR2：SASYRYS(SEQ ID NO：15)和L-CDR3：QQYDSYPLT(SEQ ID NO：16)。

在 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，将鼠源OKT10重链可变区与人IgG胚系序列进行同源性比较，选择IGHV3-48*01为重链CDR移植模板，将鼠源OKT10重链CDR移植入IGHV3-48*01骨架区，并在H-CDR3之后加入WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：17)作为第四个框架区，获得CDR移植重链可变区序列。同样地，将鼠源OKT10轻链可变区与人IgG胚系序列同源性比较，选择IGKV1-16*01为轻链CDR移植模板，将鼠源OKT10轻链CDR移植入IGKV1-16*01的骨架区，并在L-CDR3之后加入FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：18)作为第四个框架区，获得CDR移植轻链可变区序列。在CDR移植可变区的基础上，对一些框架区的氨基酸位点进行回复突变(回复突变就是将人源框架区的某些氨基酸突变成鼠源框架区同一位置的氨基酸，回复突变的位点一般对维持抗体的结构和/或亲和力是至关重要的)。在进行回复突变时，将氨基酸序列进行Kabat编码，位点的位置由Kabat码指示。

优选的，对于CDR移植重链可变区，将第28位的T回复突变为D。对于CDR移植轻链可变区，将第36位的F回复突变为Y，第46位的S回复突变为A。

上述带有回复突变位点的重链可变区和轻链可变区分别定义为OKT10人源化的重链可变区(氨基酸序列如SEQ ID NO：21)和轻链可变区(氨基酸序列如SEQ ID NO：22)。由上海生工生物工程有限公司合成编码上述人源化的重链和轻链可变区的DNA。将合成的人源化重链可变区与人IgG1恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO：3)相连，获得全长的人源化重链基因，命名为OKT10-Hu-HC(氨基酸序列如SEQ ID NO：23)；将人源化轻链可变区与人Kappa链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO：4)相连，获得全长的人源化轻链基因，命名为OKT10-Hu-LC(氨基酸序列如SEQ ID NO：24)。

将OKT10-Hu-HC和OKT10-Hu-LC基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，两种载体组合后表达并纯化抗体，所得抗体命名为OKT10-Hu-IgG1。

2、OKT10-Hu-IgG1突变体的制备

在此，对OKT10-Hu-IgG1重链基因L309位进行了定点突变，分别突变成W或Y，突变基因再分别与OKT10-Hu-LC组合，表达并纯化抗体，所得抗体分别命名为OKT10-Hu-IgG1-L309W和OKT10-Hu-IgG1-L309Y。在此，通过基因工程将Pep-CS的编码序列连接到OKT10-Hu-IgG1重链基因的末端，并将该重链基因命名为OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS-HC(氨基酸序列如SEQ ID NO：25)，与OKT10-Hu-LC组合后按照上述方法表达并纯化抗体，所得抗体命名为OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS。

3、测定OKT10-Hu-IgG1突变体的CDC

用上述实施例中描述的方法测定OKT10-Hu-IgG1及其突变体的CDC。如图4所示。

图4结果显示，与母本抗体OKT10-Hu-IgG1相比，OKT10-Hu-IgG1-L309W、OKT10-Hu-IgG1-L309Y和OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS具有显著增强的CDC活性，它们的EC ₅₀分别为0.5942nM、5.902nM和1.715nM，它们的高平台分别为99.85、69.84和99.43。OKT10-Hu-IgG1-L309W和OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS的Top均大于99，这说明这些抗体在高浓度时，能够充分裂解靶细胞。上述结果表明，在三者之中，OKT10-Hu-IgG1-L309W的CDC最强。

4、测定OKT10-Hu-IgG1对食蟹猴CD38的结合力

Daratumumab是一种已被批准上市的抗人CD38单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NOs：26和27)来自《WHO Drug Information,Vol.24,No.1,2010》。

Isatuximab是另一种已被批准上市的抗人CD38单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NOs：28和29)来自《WHO Drug Information,Vol.29,No.3,2015》。

由上海生工生物工程有限公司合成上述重链可变区和轻链可变区的DNA。将合成的Daratumumab重链可变区基因与人IgG1重链恒定区基因相连，获得全长的重链基因；将Daratumumab轻链可变区基因与人Kappa链恒定区基因相连，获得全长的轻链基因。用上述实施例中描述的方法表达并纯化抗体，所得抗体命名为Daratumumab-IgG1(也称作Daratumumab)。此外，用相似的实验方法获得抗体Isatuximab-IgG1。

食蟹猴CD38氨基酸序列(SEQ ID NO：30)来自https://www.uniprot.org/uniprot/Q5VAN0，由上海生工生物工程有限公司合成编码食蟹猴CD38胞外段的DNA，在基因末端添加编码多聚组氨酸的编码序列，然后将重组基因构建到表达载体中。用上述实施例中描述的方法表达该重组蛋白，然后利用Ni-NTA亲和层析柱对培养上清中的重组蛋白进行纯化，所得重组蛋白命名为 CD38-ECD-Cyno。

用CD38-ECD-Cyno包被微孔板(10ng/孔)，然后用ELISA测定50G12-Hu-IgG1、OKT10-Hu-IgG1、Daratumumab-IgG1和Isatuximab-IgG1对CD38-ECD-Cyno的结合能力。

图5显示，OKT10-Hu-IgG1能够有效结合食蟹猴的CD38，EC ₅₀为0.1324nM。50G12-Hu-IgG1、Daratumumab-IgG1和Isatuximab-IgG1均不能识别食蟹猴CD38。

实施例5单克隆抗体50G12-L309W-E345R的制备

通过基因工程和分子克隆技术将50G12-Hu-IgG1重链恒定区的L309位定点突变成W，同时将E345位定点突变成R，并构建到pcDNA3.4表达载体中，得到的重链命名为50G12-Hu-IgG1-L309W-E345R，将上述重链与50G12-Hu-IgG1-LC共转染转染HEK-293F细胞表达5天，通过ProteinA亲和层析柱纯化获得的抗体命名为50G12-L309W-E345R。相同的方法获得单点突变抗体50G12-L309W(也称作50G12-Hu-IgG1-L309W)和50G12-E345R。

实施例6 50G12-L309W-E345R对人CD38亲和力的测定

在此，通过Biacore 8K(购自GE Healthcare)测定50G12-L309W-E345R、50G12-Hu-IgG1、Daratumumab对人CD38蛋白的结合、解离常数。具体实施方法如下：

1)根据EZ-Link NHS-Biotin Reagent说明书(购自Thermo Fisher Scientific，货号21343)将人CD38蛋白biotin化，并命名为CD38-biotin；

2)CAP芯片偶联：将50ug/mL Biotin CAPture Reagent与HBS-EP+pH7.4 Buffer1:1混合，运行参数：接触时间60s，流速2μL/min。

3)捕获Biotin-CD38，运行参数如下：biotin-CD38浓度为2μg/mL，接触时间15s，流速10μL/min，再生接触时间为30s。

4)利用HBS-EP+pH7.4缓冲液稀释各待测抗体，最高浓度为200nM，按照2倍稀释至1.5625nM及0浓度点，按照Biotin CAPture Kit说明书配制再生液，在Biacore 8K上按照如下参数进样：结合时间180s，解离时间600s，流速30μL/min，再生接触时间为30s，流速30μL/min。

5)利用Biacore 8K Evaluation Software对数据进行分析，在“Kinetics”模式下选择“1：1binding kinetics model”公式拟合，得出各抗体与CD38的亲和力数据。

如表4所示，50G12-L309W-E345R、50G12-Hu-IgG1对CD38蛋白的亲和力强于Daratumumab，具体表现为50G12-L309W-E345R、50G12-Hu-IgG1的解离常数kd优于Daratumumab，三个抗体的平衡解离常数KD分别为2.99×10 ^-9M，3.58×10 ^-9M和2.60×10 ^-8M。

表4. 50G12-L309W-E345R对人CD38蛋白结合亲和力

样品	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
50G12-Hu-IgG1	1.71E+05	6.13E-04	3.58E-09
50G12-L309W-E345R	3.46E+05	1.03E-03	2.99E-09
Daratumumab	1.30E+05	3.37E-03	2.60E-08

实施例7 50G12-L309W-E345R的CDC活性测定

将处于对数生长期的人Burkitt's淋巴瘤细胞Daudi、Raji和Romas用DPBS清洗一次，用无血清无酚红1640培养基调整细胞密度为2E5/mL，按照50μL/孔铺到白色96孔细胞培养板中；用无血清无酚红1640培养基稀释抗体至所需浓度，之后按照3倍梯度连续稀释12个浓度；向上述细胞培养板中加入稀释完成的药品，50μL/孔，抗体终浓度为50nM，平行做两个复孔，于37℃，5％CO ₂细胞培养箱孵育30min；将Normal Human Serum complement按照20μL/孔，加到上述培养板中，于37℃，5％CO ₂细胞细胞培养箱孵育2h；将上述细胞培养板置于室温平衡15min，按照80μL/孔加入室温平衡好的Cell Titer-Glo Luminescent Assay显色剂，室温孵育8min后，通过酶标仪i3(购自Molecular Devices，型号SPECTRA MAX i3)进行检测收集数据，用GraphPad Prism9进行数据分析和作图并计算IC ₅₀。

如图6所示，50G12-L309W-E345R介导的补体激活对Romas细胞的杀伤活性明显优于未突变抗体50G12-Hu-IgG1和对照抗体Daratumumab，稍优于单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R。如表5所示，50G12-L309W-E345R介导的补体作用对Romas细胞杀伤的IC ₅₀优于Daratumumab，约8倍；最大杀伤活性绝对数值(Bottom)优于Daratumumab，约为98倍；IC ₅₀优于50G12-L309W，约1.7倍；优于50G12-E345R约1.2倍。

如图7所示，50G12-L309W-E345R介导的补体激活对Daudi细胞的杀伤活性明显优于单点突变抗体50G12-L309W、未突变抗体50G12-Hu-IgG1和对照抗体Daratumumab，稍优于单点突变抗体50G12-E345R。如表6所示，50G12-L309W-E345R介导的补体作用对Daudi细胞杀伤的IC ₅₀优于Daratumumab，约19倍；最大杀伤活性绝对数值(Bottom)优于Daratumumab，约为25倍；IC ₅₀优于50G12-L309W，约3.2倍；IC ₅₀优于50G12-E345R，约1.4倍。

如图8所示，50G12-L309W-E345R介导的补体激活对Raji细胞的杀伤活性明显优于单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R、未突变抗体50G12-Hu-IgG1、对照抗体Daratumumab，而且50G12-Hu-IgG1和Daratumumab在Raji细胞上几乎没有CDC活性，这可能与Raji细胞表面CD38表达水平相对偏低有关。如表7所示，50G12-L309W-E345R介导的补体作用对Raji细胞杀伤的IC ₅₀优于50G12-E345R，约2倍；最大杀伤活性绝对数值(Bottom)优于50G12-E345R，约为2.4倍。

上述数据表明各抗体在不同细胞上所引起的CDC效应不同，这不仅与CD38在不同细胞的表达水平有关，也与各细胞上的补体调节蛋白CD55和CD59表达量有关(参考文献：CD38expression and complement inhibitors affect response and resistance to daratumumab therapy in myeloma[J].Blood,2016,128(7):959-970.)；但有一点可以肯定的是在抗体重链恒定区同时引入L309W和E345R双点突变可以有效增强抗体的介导的CDC活性，并且引入所述双点突变能赋予抗体出乎意料的优异活性，其优于任何一个只引入L309W或E345R单点的突变或未引入突变点的抗体，而且这种CDC的增强效应在CD38表达水平相对偏低的肿瘤细胞上表现更为显著。

表5. 50G12-L309W-E345R介导的补体激活对Romas细胞的杀伤活性

样品	IC ₅₀(nM)	SD	Bottom
50G12-Hu-IgG1	0.459	0.162	33966
50G12-L309W	0.162	0.014	713.6
50G12-E345R	0.113	0.011	192.1
50G12-L309W-E345R	0.094	0.013	192.1
Daratumumab	0.755	0.002	18914

表6. 50G12-L309W-E345R介导的补体激活对Daudi细胞的杀伤活性

样品	IC ₅₀(nM)	SD	Bottom
50G12-Hu-IgG1	4.217	0.486	51424
50G12-L309W	0.575	0.048	1431
50G12-E345R	0.253	0.014	-1777
50G12-L309W-E345R	0.177	0.006	1486
Daratumumab	3.308	0.001	36749

表7. 50G12-L309W-E345R介导的补体激活对Raji细胞的杀伤活性

样品	IC ₅₀(nM)	SD	Bottom
50G12-Hu-IgG1	NA	NA	167616
50G12-L309W	NA	NA	147519
50G12-E345R	0.268	0.095	104778
50G12-L309W-E345R	0.129	0.007	42978
Daratumumab	NA	NA	173564

实施例8 50G12-L309W-E345R的ADCC活性测定

将处于对数生长期的人Burkitt's淋巴瘤细胞Daudi、Ramos、Raji、人骨髓瘤细胞NCI-H929、人多发性骨髓瘤细胞MOLP8用DPBS清洗一次细胞后用无血清1640培养基调整细胞密度为4.8E5/mL，按照25μL/孔铺到白色96孔细胞培养板；用无血清1640培养基稀释各抗体至所需浓度，之后按照3倍梯度连续稀释10个浓度，将稀释完成的各抗体，按照25μL/孔加入上述细胞培养板，并于细胞培养箱孵育45min；用DPBS清洗对数生长期的ADCC效应细胞一次，随后用无血清1640培养基调整细胞密度至3E6/mL，按照25μL/孔，加到上述培养板中，于37℃，5％CO ₂细胞培养箱孵育6h；

提前将细胞培养板置于室温平衡15min左右，每孔加入60μL的Bio-glo显色剂，室温孵育4min后，通过酶标仪i3进行检测收集数据，用GraphPad Prism9进行数据分析和作图并计算IC ₅₀。

如图9所示，50G12-L309W-E345R介导的ADCC效应对Daudi细胞的杀伤活性明显优于未突变抗体50G12-Hu-IgG1、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R和对照抗体Daratumumab。如表8所示，50G12-L309W-E345R介导的ADCC效应对Daudi细胞杀伤的IC ₅₀优于Daratumumab，约1.5倍；最大杀伤活性绝对数值(Top)优于Daratumumab，约为1.3倍；且IC ₅₀优于50G12-E345R，约2倍；IC ₅₀优于50G12-L309W，约1.7倍。

表8. 50G12-L309W-E345R介导的ADCC对Daudi细胞的杀伤活性

样品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.219	0.114	1583
50G12-L309W	0.142	0.019	1818
50G12-E345R	0.166	0.089	2817
50G12-L309W-E345R	0.085	0.019	2653
Daratumumab	0.132	0.034	2062

如图10所示，50G12-L309W-E345R介导的ADCC效应对NCI-H929细胞的杀伤活性明显优于未突变抗体50G12-Hu-IgG、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R和对照抗体Daratumumab。如表9所示，50G12-L309W-E345R介导的ADCC效应对NCI-H929细胞杀伤的IC ₅₀优于Daratumumab，约1.5倍；最大杀伤活性绝对数值(Top)优于Daratumumab，约为1.9倍；且IC ₅₀优于50G12-E345R，约1.9倍；IC ₅₀优于50G12-L309W，约1.3倍。

表9. 50G12-L309W-E345R介导的ADCC对NCI-H929细胞的杀伤活性

样品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.298	0.075	1195
50G12-L309W	0.154	0.014	1614
50G12-E345R	0.218	0.017	2850
50G12-L309W-E345R	0.115	0.034	2711
Daratumumab	0.172	0.125	1407

如图11所示，50G12-L309W-E345R介导的ADCC效应对Romas细胞的杀伤活性明显优于未突变抗体50G12-Hu-IgG1、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体 50G12-E345R和对照抗体Daratumumab。如表10所示，50G12-L309W-E345R介导的ADCC效应对Romas细胞杀伤的IC ₅₀优于Daratumumab，约2.7倍；最大杀伤活性绝对数值(Top)优于Daratumumab，约为1.2倍；且IC ₅₀优于50G12-E345R，约2.4倍；IC ₅₀优于50G12-L309W，约2倍。

表10. 50G12-L309W-E345R介导的ADCC对Romas细胞的杀伤活性

样品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.095	0.019	3193
50G12-L309W	0.070	0.006	3244
50G12-E345R	0.080	0.005	3894
50G12-L309W-E345R	0.034	0.005	3868
Daratumumab	0.092	0.005	3201

如图12所示，50G12-L309W-E345R介导的ADCC效应对MOLP8细胞的杀伤活性明显优于未突变抗体50G12-Hu-IgG1、、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R和对照抗体Daratumumab。如表11所示，50G12-L309W-E345R介导的ADCC效应对MOLP8细胞杀伤的IC ₅₀优于Daratumumab，约3.5倍；最大杀伤活性绝对数值(Top)优于Daratumumab，约为1.5倍；且IC ₅₀优于50G12-E345R，约3.3倍；IC ₅₀优于50G12-L309W，约2.5倍。

表11. 50G12-L309W-E345R介导的ADCC对MOLP8细胞的杀伤活性

样品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.253	0.148	1583
50G12-L309W	0.197	0.021	1367
50G12-E345R	0.263	0.067	1953
50G12-L309W-E345R	0.079	0.017	2100
Daratumumab	0.281	0.037	1355

如图13所示，50G12-L309W-E345R介导的ADCC效应对Raji细胞的杀伤活性明显优于未突变抗体50G12-Hu-IgG1、单点突变抗体50G12-L309W、单点突变抗体50G12-E345R和对照抗体Daratumumab。如表12所示，50G12-L309W-E345R介导的ADCC效应对Raji细胞杀伤的IC ₅₀优于Daratumumab，约9.2倍；最大杀伤活性绝对数值(Top)优于Daratumumab，约为1.3倍；且IC ₅₀优于50G12-E345R，约2.7倍；IC ₅₀优于50G12-L309W，约3倍。

表12. 50G12-L309W-E345R介导的ADCC对Raji细胞的杀伤活性

上述数据表明在抗体重链恒定区同时引入L309W和E345R双点突变可以有效增强抗体的介导的ADCC活性，其活性优于任何一个只引入L309W或E345R单点的突变或未引入突变点的抗体，并且对于CDC效应不敏感的细胞NCI-H929(参考文献：CD38expression and complement inhibitors affect response and resistance to daratumumab therapy in myeloma[J].Blood,2016,128(7):959-970.)，L309W和E345R双点突变仍能体现出较优的ADCC增强效应。

实施例9 50G12-L309W-E345R诱导细胞凋亡作用

将处于对数生长期的人Burkitt's淋巴瘤细胞Daudi用含2％FBS的RPMI-1640培养基清洗一次，按照1E5/150μL/孔调整细胞密度，铺到96孔细胞培养板；用含2％FBS的RPMI-1640培养基稀释抗体至12nM，之后按照3倍梯度连续稀释8个浓度，按照50μL/孔，加入稀释好的抗体至上述96孔细胞培养板，抗体终浓度为3nM，于细胞培养箱孵育24h；用预冷的PBS按照200μL/孔，400g，4℃离心5min清洗细胞两次；用FITC标记的Annexin V凋亡检测试剂盒对凋亡细胞进行染色，即100μL 1×binding buffer重悬细胞，1.5μL/孔加入FITC-Annexin V，轻轻混匀，避光室温反应15min；加入100μL 1×binding buffer，混匀，在1h内通过流式细胞仪(购自Beckman，型号cytoflex)测定FITC通道的平均荧光强度并分析数据，计算染色细胞数目；用GraphPad Prism9进行数据分析和作图，计算IC ₅₀。

如图14所示，50G12-L309W-E345R诱导Daudi细胞的凋亡效应与未突变抗体50G12-Hu-IgG1相当，均明显优于对照抗体Daratumumab，如表13所示，50G12-L309W-E345R诱导Daudi细胞凋亡的最大活性(Top)优于Daratumumab约2.1倍。

表13. 50G12-L309W-E345R诱导Daudi细胞凋亡效应

样品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.270	0.055	19.98
50G12-L309W-E345R	0.382	0.055	21.62
Daratumumab	0.368	0.022	10.3

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

一种具有抗原结合活性和CDC活性的抗体或其片段或融合蛋白，其特征在于，所述抗体或其片段或融合蛋白包含靶向预定抗原的结合功能域、和重链Fc区元件，所述重链Fc区元件：

(1)在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或

(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。
如权利要求1所述的抗体或其片段或融合蛋白，其特征在于，所述的抗体或其片段或融合蛋白还具有ADCC活性。
如权利要求1-2任一项所述的抗体或其片段或融合蛋白，其特征在于，所述重链Fc区元件包括选自下组Fc区位置的氨基酸残基取代：

(1)L309W+E345R；

(2)L309Y+E345R；

(3)L309E+E345R；

(4)L309F+E345R；

(5)L309H+E345R；

(6)L309C+E345R；

(7)L309D+E345R；

(8)L309N+E345R；

(9)L309Q+E345R；

(10)L309R+E345R；

(11)L309S+E345R；

(12)L309T+E345R；或

(13)L309K+E345R。
如权利要求1-3任一项所述的抗体或其片段或融合蛋白，其特征在于，所述靶向预定抗原的结合功能域结合选自下组的抗原分子：CD38、CD3、CD47、CD19、CD20、HER2、EGFR、CD123、Glypican-3、CD25、Trop-2、EpCAM、或其组合。
如权利要求1-4任一项所述的抗体或其片段或融合蛋白，其特征在于，所述重链Fc区元件来源于IgG，所述IgG具有选自下组氨基酸序列：

SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34。
如权利要求1-5任一项所述的抗体或其片段或融合蛋白，其特征在于，所述抗体或其片段或融合蛋白选自下组：

(a)具有选自下组氨基酸序列抗体或其片段或融合蛋白：

重链，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处具有W或Y突变的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL区；或

重链，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处具有W或Y突变的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL区；或

重链，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处具有W或Y突变，和345位置处具有R突变的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL区；或

重链，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH区，和在根据EU编号人IgG1 309位置处具有W或Y突变，和345位置处具有R突变的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL区；或

重链，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH区，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL区；或

重链，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH区，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL区；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗原结合功能和所述CDC活性的由(a)衍生的多肽。
一种提高抗体或其片段或融合蛋白的CDC的方法，其中，所述抗体或其片段或融合蛋白包含免疫球蛋白的Fc区和靶向预定抗原的结合功能域，所述方法包括：

(S1a)将一个或多个氨基酸残基中的突变引入到该抗体或其片段或融合蛋白中，所述突变包括将IgG重链的Fc区中的309位突变为选自下组的氨基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或

(S1b)在Fc区的C末端融合尾片(tail-piece)元件，所述尾片元件的序列如SEQ ID NO：7或8所示。
如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(S1a)中，所述突变还包括：将IgG重链的Fc区中的345位突变为R。
一种重链Fc区元件，其特征在于，所述重链Fc区元件：

(1)在Fc区位置309上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K，较佳地，还包括将IgG重链的Fc区中的345位突变为R；和/或

(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。
一种分离的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其片段或融合蛋白，或如权利要求9所述的重链Fc区元件。
一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有如权利要求10所述的核酸分子。
一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求11所述的表达载体。
如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其片段或融合蛋白或如权利要求9所述的重链Fc区元件的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

(a)在表达条件下，培养如权利要求12所述的宿主细胞，从而表达所述的抗体或其片段或融合蛋白或所述的重链Fc区元件；

(b)分离并纯化(a)所述的抗体或其片段或融合蛋白或所述的重链Fc区元件。
一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：

(a)如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其片段或融合蛋白；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1-6中任一项中所述的抗体或其片段或融合蛋白或如权利要求14所述的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其片段或融合蛋白、或如权利要求14所述的免疫偶联物、或如权利要求15所述的药物组合物在制备治疗癌症或免疫相关疾病的药物中的用途。
如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述癌症选自下组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤及其它赘生性恶性疾病。
如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述免疫相关疾病为自身免疫性疾病，优选为自免性肾病(免疫性肾炎、自身免疫性肾病)、狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)、舍格伦综合征(Sjogren’s Syndrome)、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、COPD、骨盆炎性疾病、阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)、炎性肠道疾病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛性疾病、腹膜炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病(Lyme disease)、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化症、格林-巴利综合征(Guillain-Barr syndrome)、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、强直性脊柱炎、纤维化肺泡炎、格里夫氏症(Grave's disease)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、美尼尔氏病(Meniere'sdisease)、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、肉样瘤病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、其他自身免疫性障碍、胰腺炎、创伤(外科手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏疾病(包括缺血性疾病诸如心肌梗塞以及动脉粥样硬化)、血管内凝血、骨质再吸收、骨质疏松症、骨关节炎、牙周炎和低氯血症、与缺乏胎儿-母体耐受性相关的不孕症、白癜风、重症肌无力(MG)、系统性硬化症、炎性肠病、胃炎或IgG4相关疾病，优选为免疫球蛋白A肾病(IgAN)、膜性肾病(MN)、具有肾脏意义的单克隆免疫球蛋白病(MGRS)、狼疮性肾炎或紫癜性肾炎。