TW202313693A

TW202313693A - 一種cdc平臺抗體

Info

Publication number: TW202313693A
Application number: TW111132349A
Authority: TW
Inventors: 趙杰; 張學賽; 黃浩旻; 禎平朱
Original assignee: 大陸商三生國健藥業(上海)股份有限公司
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2022-08-26
Publication date: 2023-04-01
Also published as: TWI858383B; JP2024535710A; CN115724985A; WO2023025309A1; EP4393946A1; CN117715932A

Abstract

本發明涉及增強CDC反應的平臺技術。具體地，涉及具有抗原結合活性和CDC活性的抗體或其片段或融合蛋白，所述抗體或其片段或融合蛋白包含標靶預定抗原的結合功能域、和重鏈Fc區元件，所述重鏈Fc區元件：(1) 在Fc區位置309位上包含選自下組的胺基酸殘基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K，較佳地在Fc區位置345位上還包含R；和/或(2) 在C末端含有尾片(tail-piece)元件。本發明的抗體或其片段或融合蛋白透過第309位胺基酸的定點突變或者在C末端添加尾片元件，就可以顯著提高本發明抗體或其片段或融合蛋白的CDC性能，進而可以改善已有抗體或其片段或融合蛋白的療效，治療多種疾病。

Description

一種CDC平臺抗體

本發明涉及抗體領域，具體地，涉及一種補體依賴的細胞毒性(CDC)和/或抗體依賴細胞媒介的細胞毒作用(ADCC)平臺抗體。

補體(complement，C)是存在於正常人和動物血清與組織液中的一組經活化後具有酵素活性的蛋白質。早在19世紀末Bordet即證實，新鮮血液中含有一種不耐熱的成分，可輔助和補充特異性抗體，媒介免疫溶菌、溶血作用，故稱為補體。補體是由30餘種可溶性蛋白、膜結合性蛋白和補體受體組成的多分子系統，故稱為補體系統(complement system)。正常情況下，補體是血漿蛋白的組成成分。補體系統的各成分，以無活性的前驅物存在於血漿中。需要時，再在活化物如抗原-抗體複合物等的作用下，依次被活化，最終發揮作用。根據補體系統各成分的生物學功能，可將其分為補體固有成分、補體調控成分和補體受體。

補體固有成分可分為以下4類：1、典型活化途徑的C1、C2、C4；2、替代活化途徑的B因子、D因子和P因子；3、甘露聚醣結合凝集素(mannan binding lectin, MBL)活化途徑的MBL和絲胺酸蛋白酶；4、參與共同末端途徑的C3、C5、C6、C7、C8、C9。

補體活化過程依據其起始順序不同，可分為3條途徑：1、從C1q-C1r2-C1s2開始的典型途徑(classical pathway)，抗原-抗體複合物為主要活化物；2、從C3開始的替代途徑(alternative pathway)，其不依賴於抗體；3、透過甘露聚醣結合凝集素(MBL)醣基辨識的凝集素活化途徑(MBL pathway)。上述3條途徑具有共同的末端途徑，即膜攻擊複合物的形成及其溶解細胞反應。

補體的典型活化途徑(classical pathway)指主要由C1q與免疫複合體(immune complex)結合後，順序活化C1r、C1s、C4、C2、C3，形成C3轉化酶(C4b 2b)與C5轉化酶(C4b2b3b)的級聯酵素催化反應過程。它是抗體媒介的體液免疫反應的主要反應方式。

免疫複合體主要是與抗原結合的IgG、IgM分子。每個C1q分子必須與兩個以上免疫球蛋白分子的Fc段結合；游離的或可溶性抗體不能活化補體。參與典型途徑活化的補體成分依次為：C1、C4、C2和C3、C5～C9。

典型途徑活化過程分為3個主要階段：1、辨識階段；2、活化階段；3、膜攻擊階段(攻膜階段)。補體系統活化過程中，可產生多種生物活性物質，引起一系列生物學反應。補體的生物學反應有：1、增強吞噬作用，增強吞噬細胞的趨化性；2、增加血管的通透性；3、中和病毒；4、細胞溶解作用；5、免疫反應的調節作用等。

研究表明(參考文獻：Complement Is Activated by IgG Hexamers Assembled at the Cell Surface[J]. Science, 2014, 343(6176):1260-3.)，六聚體是結合C1q並啟動典型活化途徑的最有效的形式。Genmab基於此原理開發出HexaBody平臺(參考文獻：Jong R , Beurskens F J , Verploegen S , et al. A Novel Platform for the Potentiation of Therapeutic Antibodies Based on Antigen-Dependent Formation of IgG Hexamers at the Cell Surface[J]. PLOS Biology, 2016, 14(1):e1002344.)。該平臺技術特點是：透過誘導Fc特定位點突變(例如E345R)，增強Fc與Fc之間相互作用，可促進抗體在結合細胞表面抗原之後更易於形成六聚體。形成的六聚體可以有效增強免疫反應功能，特別是提高抗體的補體依賴的細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)。然而，現有技術中的方法尚難以令人滿意。

ADCC，是抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-medicated cytotoxicity)是指抗體的Fab區域與腫瘤細胞或其他標的細胞表面的抗原相結合，Fc區域透過與毒殺細胞(NK細胞、巨噬細胞等)表面的FcγR結合，媒介毒殺細胞直接毒殺標的細胞。其中NK細胞是抗體發揮ADCC作用的主要效應細胞，當抗體Fc區域與NK細胞表面的FcγR結合後會引起後者活化，活化的NK細胞會釋放穿孔素、顆粒酶等細胞毒物質引起標的細胞凋亡從而達到毒殺標的細胞的目的。可見，ADCC反應亦是相關抗體發揮生物學活性的主要機制之一。當前生物醫藥領域ADCC活性開發最多的抗體亞型為野生型的IgG1。

因此，本領域仍然需要開發具有良好CDC和/或ADCC活性的平臺抗體。

本發明的目的在於提供一種增強抗體或其片段或融合蛋白CDC活性的平臺，優選地為一種增強抗體或其片段或融合蛋白CDC和/或ADCC活性的平臺。

在本發明的第一方面，提供了一種具有抗原結合活性和CDC活性的抗體或其片段或融合蛋白，所述抗體或其片段或融合蛋白包含標靶預定抗原的結合功能域、和重鏈Fc區元件，所述重鏈Fc區元件： (1) 在Fc區位置309位上包含選自下組的胺基酸殘基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或 (2) 在C末端含有尾片(tail-piece)元件。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件與尾片(tail-piece)元件透過連接子連接。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件含有兩條重鏈Fc區，每條重鏈Fc區 (1) 在位置309位上各自獨立地包含選自下組的胺基酸殘基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或 (2) 在C末端含有尾片(tail-piece)元件。

在另一優選例中，其中每條重鏈Fc區在位置345位上還包含R。

在另一優選例中，所述的抗體或其片段或融合蛋白還具有ADCC活性。

在另一優選例中，所述標靶預定抗原的結合功能域結合選自下組的抗原分子：CD38、CD3、CD47、CD19、CD20、HER2、EGFR、CD123、Glypican-3、CD25、Trop-2、EpCAM、或其組合。

在另一優選例中，所述標靶預定抗原的結合功能域包含下組的結構域：VH、VL、Fab、F(ab') ₂、Fab'、scFv或VHH。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件的CH3結構域的C末端包含尾片(tail-piece)元件。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件來源於IgG。

在另一優選例中，所述IgG具有選自下組胺基酸序列：SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34。

在另一優選例中，所述IgG來源於哺乳動物，較佳地來源於鼠、食蟹猴或人，優選來源於人。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件包含來源於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2和/或CH3結構域。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件來源於人IgG1。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件包含來源於IgG1的CH2和CH3結構域。

在另一優選例中，所述抗體或其片段或融合蛋白為單特異性、雙特異性、三特異性或多特異性抗體或其片段或融合蛋白。

在另一優選例中，所述抗體或其片段或融合蛋白為二聚體、三聚體或多聚體。

在另一優選例中，所述多聚體為六聚體。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件在Fc區位置309位上包含選自下組的胺基酸殘基：F、C、W或Y。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件還包括其他位置的胺基酸取代。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件還包括：Fc區位置345位上的麩胺酸殘基被精胺酸殘基取代(E345R)。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件包括選自下組Fc區位置的胺基酸殘基取代： (1)L309W+E345R； (2)L309Y+E345R； (3)L309E+E345R； (4)L309F+E345R； (5)L309H+E345R； (6)L309C+E345R； (7)L309D+E345R； (8)L309N+E345R； (9)L309Q+E345R； (10)L309R+E345R； (11)L309S+E345R； (12)L309T+E345R；或 (13)L309K+E345R。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件包括Fc區位置具有L309W+E345R的胺基酸殘基取代。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件的胺基酸編號按照EU編號系統。

在另一優選例中，所述尾片元件來源於人IgM。

在另一優選例中，所述尾片元件中包含一個或多個胺基酸的突變。

在另一優選例中，所述尾片元件的序列如SEQ ID NO：7或8所示。

在另一優選例中，所述標靶預定抗原的結合功能域為結合CD38的結合功能域，其包含選自下組的重鏈可變區和輕鏈可變區： (1)重鏈可變區，其包含如下所示的3個互補決定區CDR： SEQ ID NO ：11所示的H-CDR1； SEQ ID NO ：12所示的H-CDR2； SEQ ID NO ：13所示的H-CDR3；和輕鏈可變區，其包含如下所示的3個互補決定區CDR： SEQ ID NO ：14所示的L-CDR1； SEQ ID NO ：15所示的L-CDR2； SEQ ID NO ：16所示的L-CDR3；或 (2)重鏈可變區，其包含如下所示的3個互補決定區CDR： SEQ ID NO ：35所示的H-CDR1； SEQ ID NO ：36所示的H-CDR2； SEQ ID NO ：37所示的H-CDR3；和輕鏈可變區，其包含如下所示的3個互補決定區CDR： SEQ ID NO ：38所示的L-CDR1； SEQ ID NO ：39所示的L-CDR2； SEQ ID NO ：40所示的L-CDR3。

在另一優選例中，所述抗體或其片段或融合蛋白選自下組： (a) 具有選自下組胺基酸序列抗體或其片段或融合蛋白：重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處具有W或Y突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL區；或重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處具有W或Y突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL區；或重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處具有W或Y突變，和345位置處具有R突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL區；或重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處具有W或Y突變，和345位置處具有R突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL區；或重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH區，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL區；或重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH區，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL區； (b) 將(a)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗原結合功能和所述CDC活性的由(a)衍生的多肽。

在另一優選例中，所述抗體或其片段或融合蛋白選自下組： (a) 具有選自下組胺基酸序列抗體或其片段或融合蛋白：重鏈，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處W或Y突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL區；或重鏈，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處W或Y突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL區；或重鏈，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處具有W或Y突變，和345位置處具有R突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL區；或重鏈，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處具有W或Y突變，和345位置處具有R突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL區；或重鏈，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH區，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL區；或重鏈，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH區，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL區； (b) 將(a)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗原結合功能和所述CDC活性的由(a)衍生的多肽。

在另一優選例中，所述抗體或其片段或融合蛋白選自下組： (a) 具有選自下組胺基酸序列抗體或其片段或融合蛋白：重鏈，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH區，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL區；或重鏈，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH區，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL區；或重鏈，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH區，和具有如SEQ ID NO：32所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL區；或重鏈，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH區，和具有如SEQ ID NO：32所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL區；或重鏈，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH區，和具有如SEQ ID NO：34所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL區；或重鏈，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH區，和具有如SEQ ID NO：34所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL區； (b) 將(a)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗原結合功能和所述CDC活性的由(a)衍生的多肽。

在本發明的第二方面，提供了一種提高抗體或其片段或融合蛋白的CDC的方法，其中，所述抗體或其片段或融合蛋白包含免疫球蛋白的Fc區和標靶預定抗原的結合功能域，所述方法包括： (S1a)將一個或多個胺基酸殘基中的突變引入到該抗體或其片段或融合蛋白中，所述突變包括將IgG重鏈的Fc區中的309位突變為選自下組的胺基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或 (S1b)在Fc區的C末端融合尾片(tail-piece)元件，所述尾片元件的序列如SEQ ID NO：7或8所示。

在另一優選例中，所述IgG重鏈的Fc區中的第309位L突變成選自下組的胺基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K。

在另一優選例中，所述方法還包括： (S2)比較突變後的抗體或其片段或融合蛋白與突變前的抗體或其片段或融合蛋白的CDC性能。

在另一優選例中，所述方法還包括提高抗體或其片段或融合蛋白的ADCC的活性。

在另一優選例中，所述(S1a)與(S1b)可以同時、先後或顛倒次序進行。

在另一優選例中，所述突變包括將IgG重鏈的Fc區中的309位突變為選自下組的胺基酸：W、Y。

在另一優選例中，在步驟(S1a)中，當所述抗體或其片段或融合蛋白中重鏈Fc區中的309位不為Y且不為W時，將其突變為Y或W。

在另一優選例中，在步驟(S1a)中，當所述抗體或其片段或融合蛋白中重鏈Fc區中的309位不為Y時，將其突變為Y。

在另一優選例中，在步驟(S1a)中，當所述抗體或其片段或融合蛋白中重鏈Fc區中的309位不為W時，將其突變為W。

在另一優選例中，在步驟(S1a)中，所述突變還包括：將IgG重鏈的Fc區中的345位突變為R。

在另一優選例中，在步驟(S1a)中，所述突變包括將IgG重鏈的Fc區中的309位L突變為選自下組的胺基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和將IgG重鏈的Fc區中的345位E突變為R。

在本發明的第三方面，提供了一種重鏈Fc區元件，所述重鏈Fc區元件： (1) 在Fc區位置309上包含選自下組的胺基酸殘基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或 (2) 在C末端含有尾片(tail-piece)元件。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件來源於IgG。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件來源於人IgG1。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件包含來源於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2和CH3結構域。

在另一優選例中，所述重鏈Fc區元件還包括在Fc區位置345位上的麩胺酸殘基被精胺酸殘基取代(E345R)。

在另一優選例中，所述尾片元件來源於人IgM。

在本發明的第四方面，提供了一種分離的核酸分子，所述的核酸分子編碼如本發明的第一方面中所述的抗體或其片段或融合蛋白，或如本發明的第三方面所述的重鏈Fc區元件。

在本發明的第五方面，提供了一種表現載體，所述的表現載體含有如本發明的第四方面所述的核酸分子。

在本發明的第六方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有如本發明的第五方面所述的表現載體。

在本發明的第七方面，提供了一種如本發明的第一方面中所述的抗體或其片段或融合蛋白或如本發明的第三方面所述的重鏈Fc區元件的製備方法，所述方法包含以下步驟： (a)在表現條件下，培養如本發明的第六方面所述的宿主細胞，從而表現所述的抗體或其片段或融合蛋白或所述的重鏈Fc區元件； (b)分離並純化(a)所述的抗體或其片段或融合蛋白或所述的重鏈Fc區元件。

在本發明的第八方面，提供了一種免疫偶聯物，所述免疫偶聯物包括： (a) 如本發明的第一方面所述的抗體或其片段或融合蛋白；和 (b) 選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核種、或酵素。

在本發明的第九方面，提供了一種藥物組成物，所述藥物組成物含有如本發明的第一方面中所述的抗體或其片段或融合蛋白或如本發明的第八方面所述的免疫偶聯物和藥學上可接受的載劑。

在本發明的第十方面，提供了一種如本發明的第一方面所述的抗體或其片段或融合蛋白、或如本發明的第八方面所述的免疫偶聯物、或如本發明的第九方面所述的藥物組成物在製備治療癌症或免疫相關疾病的藥物中的用途。

在另一優選例中，所述癌症選自下組：黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、多發性骨髓瘤及其它贅生性惡性疾病。

在另一優選例中，所述免疫相關疾病為自身免疫性疾病，優選為自體免疫性腎病(免疫性腎炎、自身免疫性腎病)、紅斑性狼瘡、系統性紅斑狼瘡(SLE)、舍格倫症候群(Sjogren’s Syndrome)、關節炎、類風濕性關節炎、哮喘、COPD、骨盆發炎性疾病、阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease)、發炎性腸道疾病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、佩羅尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛性疾病、腹膜炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、血管炎、手術粘連、中風、I型糖尿病、萊姆病(Lyme disease)、腦膜腦炎、自身免疫性葡萄膜炎、多發性硬化症、格林-巴利症候群(Guillain-Barr syndrome)、異位性皮膚炎、自身免疫性肝炎、僵直性脊椎炎、纖維化肺泡炎、格里夫氏症(Grave's disease)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、美尼爾氏病(Meniere'sdisease)、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、類肉瘤病、硬皮病、韋格納氏肉芽腫病(Wegener'sgranulomatosis)、其他自身免疫性障礙、胰腺炎、創傷(外科手術)、移植物抗宿主病、移植排斥、心臟疾病(包括缺血性疾病諸如心肌梗塞以及動脈粥狀硬化)、血管內凝血、骨質再吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、牙周炎和低氯血症、與缺乏胎兒-母體耐受性相關的不孕症、白斑症、重症肌無力(MG)、系統性硬化症、發炎性腸病、胃炎或IgG4相關疾病。

在另一優選例中，所述免疫相關疾病為自體免疫腎病，優選為免疫球蛋白A腎病(IgAN)、膜性腎病(MN)或具有腎臟意義的單株免疫球蛋白病(MGRS)、狼瘡性腎炎或紫癜性腎炎。

在本發明的第十一方面，提供了一種治療疾病的方法，包括步驟：給需要的對象施用本發明的第一方面所述的抗體或其片段或融合蛋白、如本發明的第九方面所述的藥物組成物或如本發明的第八方面所述的免疫偶聯物。

在另一優選例中，所述疾病包括：癌症或免疫相關疾病。

應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。

具體實施方式

本發明人經過廣泛而深入地研究，首次意外發現，改造抗體重鏈恆定區Fc的L309位(優選為L309位和E345位)和/或在抗體重鏈恆定區的Fc段融合人IgM的tail-piece，能夠顯著增強抗體的免疫反應功能，特別是提高抗體的補體依賴的細胞毒性(CDC)和抗體依賴細胞媒介的細胞毒作用(ADCC)。在此基礎上完成了本發明。術語

本發明中，術語“抗體(Antibody，縮寫Ab)”和“免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，縮寫IgG)”是有相同結構特徵的異四聚醣蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型(isotype)的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區，重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2、以及CH3構成。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區，輕鏈恆定區包括一個結構域CL；輕鏈的恆定區與重鏈恆定區的CH1結構域配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的反應功能，例如參與抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重鏈恆定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型；輕鏈恆定區包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗體的重鏈和輕鏈透過重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間的二硫鍵共價連接在一起，抗體的兩條重鏈透過樞紐區之間形成的多肽間二硫鍵共價連接在一起。本發明中，術語“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可將抗體裂解為兩個完全相同的Fab段和一個Fc段。Fab段由抗體的重鏈的VH和CH1以及輕鏈的VL和CL結構域組成。Fc段即可結晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗體的CH2和CH3結構域組成。Fc段無抗原結合活性，是抗體與反應分子或細胞相互作用的部位。本發明中，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分佈在整個抗體可變區中。它集中於重鏈可變區和輕鏈可變區中稱為互補決定區(complementarity-determining region，CDR)或高度變異區中的三個片段中。可變區中較守恆的部分稱為框架區(frame region，FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁(1991))。

如本文所用，術語“框架區”(FR)指插入CDR間的胺基酸序列，即指在單一物種中不同的免疫球蛋白間相對守恆的免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各具有四個FR，分別稱為FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相應地，輕鏈可變結構域可因此稱作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重鏈可變結構域可因此表示為(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)- (CDR3-H)-(FR4-H)。優選地，本發明的FR是人抗體FR或其衍生物，所述人抗體FR的衍生物與天然存在的人抗體FR基本相同，即序列同一性達到85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。

獲知CDR的胺基酸序列，本領域的技術人員可輕易確定框架區FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。

如本文所用，術語“人框架區”是與天然存在的人抗體的框架區基本相同的(約85%或更多，具體地90%、95%、97%、99%或100%)框架區。

如本文所用，“尾片(tail-piece)元件”、“TP元件”可以互換使用，均指來自IgM的tail-piece序列，優選來源於人IgM。本發明的TP元件可包含任何合適的胺基酸序列。所述TP元件可以是在天然存在的抗體中被發現的tail-piece，或者可選擇地，其可以是在長度和/或組成上與天然tail-piece相異的經修飾的tail-piece序列。所述的修飾可以是一個或多個胺基酸的突變，例如將IgM的tail-piece中的半胱胺酸突變成絲胺酸。

在本發明的一個具體實施例中，TP元件的序列如SEQ ID NO ：7或8所示。

應理解，可以將TP元件與重鏈Fc區的C末端直接融合。或者，可以在TP元件與重鏈Fc區之間提供短的連接子序列。

如本文所用，術語“連接子”是指Fc區和TP元件之間的短的連接子序列，優選為柔性連接子。合適的連接子實例包括單甘胺酸(Gly)、或絲胺酸(Ser)殘基，連接子中胺基酸殘基的標識和序列可隨著連接子中需要實現的次級結構要素的類型而變化。 抗體或其片段或融合蛋白

本發明的抗體或其片段或融合蛋白是一種具有抗原結合活性和CDC活性的抗體或其片段或融合蛋白，包含標靶預定抗原的結合功能域、和重鏈Fc區元件，所述重鏈Fc區元件含有兩條重鏈Fc區：每一條重鏈Fc區 (1) 在Fc區位置309位上包含選自下組的胺基酸殘基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或(2) 在C末端含有尾片(tail-piece)元件。如本文所用，“重鏈Fc區元件”含有兩條重鏈Fc區。若無特別地說明，本發明中的重鏈Fc區元件中的突變位點，是指重鏈Fc區元件中每一條重鏈Fc區上包含的突變位點。

應理解，本發明的抗體或其片段或融合蛋白的重鏈Fc區元件中第309位的特定CDC增強型突變可與其他提高抗體性能(如CDC、特異性、親和力等)的技術結合，例如與E345R突變結合。較佳地，本發明中的抗體或其片段或融合蛋白的重鏈Fc區元件中的每一條重鏈Fc區包含突變組合L309W+E345R時，具有意外的明顯增強CDC的作用；更佳地具有明顯增強CDC和ADCC活性的作用。

如本文所用，術語“CDC平臺抗體”、“本發明的抗體”、“本發明的抗體或其片段” “本發明的融合蛋白”“本發明的抗體或其片段或融合蛋白”可以互換使用，均指本發明第一方面所述的CDC功能增強的抗體或其片段或融合蛋白。應理解，所述術語還包括本發明抗體或其片段或融合蛋白的活性片段，所述活性片段既保留了抗原結合活性，還保留了第309位的特定突變和/或TP(tail-piece)元件。

在本說明書中，除非另外指定，否則將EU編號系統用於提及抗體結構域中的殘基。該系統最初由Edelman等於1969年設計，並詳細描述於如下文獻中：Kabat等，1987(Edelman等,1969; “The cova1ent structure of an entire γG immunoglobulin molecule,” PNAS Biochemistry第63卷pp78-85。Kabat等,1987; Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH,USA。)。當將位置編號和/或胺基酸殘基賦予特定抗體同種型時，其旨在適用於任何其它抗體同種型的相應的位置和/或胺基酸殘基，這是本領域技術人員己知的。例如在天然存在的人IgG1、IgG3和IgG4中的位置309上發現的野生型殘基是白胺酸殘基，在天然存在的IgG2中發現的野生型殘基是纈胺酸殘基。當提及來源於IgM或IgA的尾部的胺基酸殘基時，根據本領域的常規實踐，給出的位置編號是天然存在的IgM或IgA中的殘基的位置編號。如本文所用，“位置309位上的胺基酸殘基”是指在天然存在的人IgG1中的位置309上的殘基，“位置345位上的胺基酸殘基”是指在天然存在的人IgG1中的位置345上的殘基。

應理解，本發明還提供了一種建構CDC平臺抗體或其片段或融合蛋白的方法，即建構本發明抗體或其片段或融合蛋白的方法，所述方法如本發明第二方面所述。透過本發明的建構CDC平臺抗體或其片段或融合蛋白的方法，可以提高標靶預定抗原的抗體或其片段或融合蛋白的CDC活性，進一步顯著地提高融合蛋白的CDC和/或ADCC活性。

在本發明中，本發明的抗體或其片段或融合蛋白包含的標靶預定抗原的結合功能域可以標靶不同的抗原標的，所述標靶預定抗原的結合功能域結合可以選自下組的抗原分子：CD38、CD3、CD47、CD19、CD20、HER2、EGFR、CD123、Glypican-3、CD25、Trop-2、EpCAM、或其組合。

以CD38為例，優選地，本發明抗CD38抗體的序列如專利申請CN202010805420.2中所述，本領域技術人員也可以透過本領域熟知的技術對本發明抗原的結合功能域進行修飾或改造，例如添加、缺失和/或取代一個或幾個胺基酸殘基，從而進一步增加抗原的結合功能域的親和力或結構穩定性，並透過常規的測定方法獲得修飾或改造後的結果。

在本發明中，本發明抗體或其片段或融合蛋白還包括其守恆性變異體，指與本發明抗體或其片段或融合蛋白的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些守恆性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。表 A

最初的殘基	代表性的取代	優選的取代
Ala (A)	Val； Leu； Ile	Val
Arg (R)	Lys； Gln； Asn	Lys
Asn (N)	Gln； His； Lys； Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro； Ala	Ala
His (H)	Asn； Gln； Lys； Arg	Arg
Ile (I)	Leu； Val； Met； Ala； Phe	Leu
Leu (L)	Ile； Val； Met； Ala； Phe	Ile
Lys (K)	Arg； Gln； Asn	Arg
Met (M)	Leu； Phe； Ile	Leu
Phe (F)	Leu； Val； Ile； Ala； Tyr	Leu
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr； Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp； Phe； Thr； Ser	Phe
Val (V)	Ile； Leu； Met； Phe； Ala	Leu

本發明中，術語“抗”和“結合”是指兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。通常，抗體以小於大約10 ^-7M，例如小於大約10 ^-8M、10 ^-9M、10 ^-10M、10 ^-11M或更小的平衡解離常數(KD)結合該抗原。術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。例如，使用表面等離子體共振術(Surface Plasmon Resonance，縮寫SPR)在BIACORE儀中測定抗體與抗原的結合親和力或使用ELISA測定抗體與抗原結合的相對親和力。

本發明的抗體或其片段或融合蛋白可以單獨使用，也可與可檢測標記物(為診斷目的)、治療劑、或任何以上這些物質的組合結合或偶聯。 編碼核酸和表現載體

本發明還提供了編碼上述抗體或其片段或融合蛋白的多核苷酸分子。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發明中，術語“表現載體”是指攜帶表現匣用於表現特定目的蛋白或其他物質的載體，如質體、病毒載體(如腺病毒、逆轉錄病毒)、噬菌體、酵母質體或其他載體。例如包含適當的調控序列，例如啟動子、終止子、增強子等的本領域的常規表現載體，所述表現載體包括但並不限於：病毒載體(如腺病毒、逆轉錄病毒)、質體、噬菌體、酵母質體或其他載體。所述表現載體較佳地包括pDR1、pcDNA3.4(+)、pDHFR或pTT5。

一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後透過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。

本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表現蛋白質。

本發明中，術語“宿主細胞”為本領域常規的各種宿主細胞，只要能使載體穩定地自行複製，且所攜帶的多核苷酸分子可被有效表現即可。其中所述宿主細胞包括原核表現細胞和真核表現細胞，所述宿主細胞較佳地包括：COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、TG1、BL21(DE3)、293F或293E細胞。 藥物組成物

本發明還提供了一種組成物。優選地，所述的組成物是藥物組成物，它含有上述的抗體或其活性片段或融合蛋白，以及藥學上可接受的載劑。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載劑介質中，其中pH通常約為4-8，較佳地pH約為5-7，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組成物可以透過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射(如腹膜內)、顱內注射、或腔內注射。

本發明中，術語“藥物組成物”是指本發明的雙功能抗體或其片段或融合蛋白可以和藥學上可以接受的載劑一起組成藥物製劑組成物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明公開的雙功能抗體或其片段或融合蛋白的胺基酸核心序列的構形完整性，同時還保護蛋白質的多官能基防止其降解(包括但不限於凝聚、脫胺或氧化)。

本發明的藥物組成物含有安全有效量(如0.001-99wt%，較佳地0.01-90wt%，更佳地0.1-80wt%)的本發明上述的雙功能抗體或其片段或融合蛋白(或其偶聯物)以及藥學上可接受的載劑或賦形劑。這類載劑包括(但並不限於)：水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他佐劑的水溶液透過常規方法進行製備。藥物組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約10微克/千克體重-約50毫克/千克體重。此外，本發明的雙功能抗體或其片段或融合蛋白還可與其他治療劑一起使用。

使用藥物組成物時，是將安全有效量的雙功能抗體或其片段或融合蛋白、或其免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約10毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。

本發明中，術語“有效量”是指本發明的藥物組成物施用受試者後，在治療的個體中產生預期效果的量或劑量，該預期效果包括個體病症的改善。術語“受試者”包括但不限於哺乳動物，例如人、非人靈長類動物、大鼠和小鼠等。應用

本發明還提供了如本發明的第一方面所述的抗體或其片段或融合蛋白、或如本發明的第八方面所述的免疫偶聯物、或如本發明的第九方面所述的藥物組成物的用途，例如用於製備診斷製劑或製備藥物。

較佳地，所述的藥物是用於預防和/或治療癌症、或免疫相關疾病的藥物。

本發明中，所述癌症選自下組：黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、多發性骨髓瘤及其它贅生性惡性疾病。

在本發明的一個優選實施例中，所述的藥物是用於預防和/或治療與CD38表現或功能異常相關的疾病的藥物。

本發明中，所述與CD38表現或功能異常相關的疾病是本領域常規的與CD38表現或功能異常相關的疾病。較佳地，所述與CD38表現或功能異常相關的疾病為腫瘤/癌症、或免疫相關疾病。

較佳地，所述疾病優選為免疫相關疾病，例如自身免疫性疾病。更佳地，所述的藥物用於治療和/或預防自身抗體媒介的自身免疫疾病。進一步地，所述自身免疫性疾病包括自體免疫腎病(免疫性腎炎、自身免疫性腎病)、紅斑性狼瘡、系統性紅斑狼瘡(SLE)、格雷夫斯氏病(Graves'Disease)、重症肌無力(MG)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、自體免疫腎病(免疫性腎炎、自身免疫性腎病)、紅斑性狼瘡、系統性紅斑狼瘡(SLE)、舍格倫症候群(Sjogren’s Syndrome)、關節炎、類風濕性關節炎、哮喘、COPD、骨盆發炎性疾病、阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease)、發炎性腸道疾病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、佩羅尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛性疾病、腹膜炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、血管炎、手術粘連、中風、I型糖尿病、萊姆病(Lyme disease)、腦膜腦炎、自身免疫性葡萄膜炎、多發性硬化症、格林-巴利症候群(Guillain-Barr syndrome)、異位性皮膚炎、自身免疫性肝炎、僵直性脊椎炎、纖維化肺泡炎、格里夫氏症(Grave's disease)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、美尼爾氏病(Meniere'sdisease)、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、類肉瘤病、硬皮病、韋格納氏肉芽腫病(Wegener'sgranulomatosis)、其他自身免疫性障礙、胰腺炎、創傷(外科手術)、移植物抗宿主病、移植排斥、心臟疾病(包括缺血性疾病諸如心肌梗塞以及動脈粥狀硬化)、血管內凝血、骨質再吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、牙周炎和低氯血症、與缺乏胎兒-母體耐受性相關的不孕症、白斑症、重症肌無力(MG)、系統性硬化症、發炎性腸病、胃炎或IgG4相關疾病，優選由於漿細胞過度增殖、分泌過多自抗體和免疫球蛋白形成免疫複合物導致的免疫球蛋白A腎病(IgAN)、膜性腎病(MN)或具有腎臟意義的單株免疫球蛋白病(MGRS)、狼瘡性腎炎或紫癜性腎炎。

目前，針對IgAN、MN、MGRS這三種自體免疫腎病的治療仍有較大臨床需求未被滿足，尤其是特異性標靶治療手段嚴重匱乏，只有標靶CD20的利妥昔單抗被批准用於MN的治療，但因CD20僅在產生較少自身抗體的活化B細胞上表現，所以調查結果顯示，臨床上仍有高達40%的MN患者對抗CD20治療無效。而CD38則在漿細胞上高度表現，本發明中的特異性標靶CD38的抗體(例如50G12-L309W-E345R等)可透過ADCC、ADCP和CDC等反應引起漿細胞裂解和凋亡，以有效用於IgAN、MN、MGRS和多發性骨髓瘤(MM)的治療。 本發明的主要優點包括

(1)本發明提供了一種新的增強CDC和/或ADCC的技術。該技術有潛力將缺失或僅有有限的CDC和/或ADCC活性的抗體藥物轉化成為有CDC和/或ADCC增強型的抗體藥物。運用該技術，可以直接改造很多現成的作用於不同的標的/標的細胞的抗體。運用該技術，可以改善已有抗體的療效，治療多種疾病。

(2)透過第309位胺基酸的定點突變，就可以顯著提高本發明抗體或其片段或融合蛋白的CDC和/或ADCC性能。此外，本發明第309位的特定CDC和/或ADCC增強型突變可與其他提高抗體性能(如CDC、特異性、親和力等)的技術結合，例如與E345R突變結合。

下面結合具體實施例，進一步陳述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。 相關試劑耗材：

EZ-link NHS-LC-Biotin (Thermo Fisher Scientific，貨號21343)；Biotin CAPture Kit, Series S(Cytiva，貨號28920234)；HBS-EP+ pH7.4緩衝液(GE Healthcare，貨號BR-1006-69)；Daudi、Raji、Romas、NCI-H929細胞購自ATCC(American Type Culture Collection)，MOLP8細胞購自南京科佰生物有限公司；ADCC Bioassay效應細胞(蘇州瑞安生物科技有限公司，貨號RA-CK01)；Cell Titer-Glo Luminescent Assay (Promega，貨號G7570)；Normal Human Serum complement (Quidel Corporation，貨號A11)；Bio-Glo Luciferase Assay System(Promega，貨號G7940)； Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測套組(Yeasen, 貨號40302ES60)。

實施例中使用的蛋白表現和純化方法說明如下：將目的基因建構到表現載體pcDNA3.4中，利用PEI(Polyethylenimine)將建構好的表現載體或表現載體的組合轉入FreeStyle™ 293-F Cells細胞(後文簡稱HEK293F，購自Thermo Fisher Scientific)中以表現抗體或重組蛋白，HEK293F細胞在Free Style 293 Expression Medium(購自Thermo Fisher Scientific)中培養5天後收取細胞上清液，然後用Protein A親和層析純化抗體，用Ni-NTA親和層析純化重組蛋白。

以下實施例中使用的ELISA檢測方法說明如下：用相應的重組蛋白塗佈微量井培養盤，用含有1%牛血清白蛋白的PBST(PBST為含0.05% Tween-20的磷酸鹽緩衝液)封阻微量井培養盤。將待測抗體進行梯度稀釋，然後轉移到上述塗佈重組蛋白的微量井培養盤中，室溫培育半小時。洗滌培養盤後加入適當稀釋的HRP(Horseradish Peroxidase)標記的羊抗人抗體(Fc specific，購自Sigma)，室溫培育半小時。洗滌培養盤後每孔加入100 μL以TMB(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine)為受質的顯色液，室溫培育1～5 min。加50 μL終止液(2 M H ₂SO ₄)終止反應。孔盤讀取機(SpectraMax 190)讀取OD450。用GraphPad Prism7進行作圖和數據分析，並計算EC ₅₀/IC ₅₀。

以下實施例中使用的理化性質檢測方法說明如下： HPLC-SEC

抗體是高分子量蛋白質，具有高度複雜的二級和三級結構。由於轉譯後修飾、聚集和降解等變化，抗體在生物化學和生物物理特性方面是異質的。當透過分離技術分析三特異性抗體時，通常會觀察到變異體、聚集體和降解片段，它們的存在可能會損害安全性和有效性。在生產和存儲抗體的過程中容易出現聚集體、降解片段和不完整組裝的分子。本發明使用高效液相層析-粒徑篩析層析(High-performance liquid chromatography-size exclusion chromatography，HPLC-SEC)檢測樣品中上述雜質的含量。聚集體的分子量要大於單體，因此相應峰的保留時間較短；降解片段或不完整組裝分子的分子量要小於單體，因此相應峰的保留時間較長。HPLC-SEC所用層析儀為Dionex Ultimate 3000；流動相配製方法如下：取適量20 mM磷酸二氫鈉母液，用20 mM磷酸氫二鈉調節PH至6.8±0.1；進樣量：20 µg；層析管柱為TSK G3000SWXL，規格為7.8×300 mm 5μm；流速0.5 mL/min，洗提時間30 min；柱溫25℃，樣品室溫度10℃；檢測波長214 nm。 本發明的抗體序列： 表 1. 抗體序列

名稱	胺基酸序列	SEQ ID NO.
50G12-Hu-IgG1重鏈可變區	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNTYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYPGDGDITYNQKFKGRVTLTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYYYGGALDYWGQGTLVTVSS	1
50G12-Hu-IgG1輕鏈可變區	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASSSVSSSYLHWYQQKPGKAPKLWMYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCHRYHRSPWTFGQGTKVEIK	2
人IgG1重鏈恆定區	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	3
人Kappa輕鏈恆定區	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	4
50G12-Hu-IgG1重鏈	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNTYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYPGDGDITYNQKFKGRVTLTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYYYGGALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	5
50G12-Hu-IgG1輕鏈	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASSSVSSSYLHWYQQKPGKAPKLWMYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCHRYHRSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	6
IgM的tail-piece	PTLYNVSLVMSDTAGTCY	7
Pep-CS	PTLYNVSLVMSDTAGTSY	8
50G12-Hu-IgG1-Pep重鏈	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNTYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYPGDGDITYNQKFKGRVTLTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYYYGGALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY	9
50G12-Hu-IgG1-Pep-CS重鏈	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNTYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYPGDGDITYNQKFKGRVTLTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYYYGGALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPTLYNVSLVMSDTAGTSY	10
OKT10重鏈的H-CDR1	RSWMN	11
OKT10重鏈的H-CDR2	EINPDSSTINYTTSLKD	12
OKT10重鏈的H-CDR3	YGNWFPY	13
OKT10輕鏈的L-CDR1	KASQNVDTNVA	14
OKT10輕鏈的L-CDR2	SASYRYS	15
OKT10輕鏈的L-CDR3	QQYDSYPLT	16
OKT10重鏈框架區H-FR4	WGQGTLVTVSS	17
OKT10輕鏈框架區L-FR4	FGQGTKVEIK	18
OKT10重鏈可變區	EVKLQESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRSWMNWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTTSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMTKVRSEDTALYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSA	19
OKT10輕鏈可變區	DIVMTQSPKIMPTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLAEYFCQQYDSYPLTFGAGTKLDLK	20
OKT10人源化重鏈可變區	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRSWMNWVRQAPGKGLEWVSEINPDSSTINYTTSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSS	21
OKT10人源化輕鏈可變區	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDSYPLTFGQGTKVEIK	22
OKT10人源化重鏈	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRSWMNWVRQAPGKGLEWVSEINPDSSTINYTTSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	23
OKT10人源化輕鏈	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDSYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	24
OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS重鏈	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRSWMNWVRQAPGKGLEWVSEINPDSSTINYTTSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPTLYNVSLVMSDTAGTSY	25
Daratumumab重鏈可變區	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS	26
Daratumumab輕鏈可變區	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK	27
Isatuximab重鏈可變區	QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSVTVSS	28
Isatuximab輕鏈可變區	DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIK	29
食蟹猴CD38胞外端	LPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI	30
人IgG1-Pep-CS	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPTLYNVSLVMSDTAGTSY	31
IgG1-L309X	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV XHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*	32
50G12-Hu-IgG1-L309W-E345R	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNTYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYPGDGDITYNQKFKGRVTLTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYYYGGALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV W HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR R PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	33
IgG1-L309W-E345R	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVWHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	34
50G12重鏈的H-CDR1	TYWMQ	35
50G12重鏈的H-CDR2	AIYPGDGDITYNQKFKG	36
50G12重鏈的H-CDR3	EGYYYGGALDY	37
50G12輕鏈的L-CDR1	TASSSVSSSYLH	38
50G12輕鏈的L-CDR2	GTSNLAS	39
50G12輕鏈的L-CDR3	HRYHRSPWT	40

*其中，X=E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、K、W、Y。 實施例 1 抗人 CD38 單株抗體 (50G12) 的製備

50G12-Humanized(後文稱作50G12-Hu-IgG1)是抗CD38人源化單株抗體，其重鏈和輕鏈胺基酸序列來自於CN202010805420.2中的SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12(即本發明中的SEQ ID NO：5和6)。50G12-Hu-IgG1的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：1和2。50G12-Hu-IgG1的重鏈的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：35、36和37，50G12-Hu-IgG1的輕鏈的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：38、39和40。50G12-Hu-IgG1重鏈恆定區為人IgG1(胺基酸序列如SEQ ID NO：3)，輕鏈恆定區為人Kappa(胺基酸序列如SEQ ID NO：4)。在此，將50G12-Hu-IgG1重鏈和輕鏈的編碼基因分別命名為50G12-Hu-IgG1-HC和50G12-Hu-IgG1-LC。將50G12-Hu-IgG1-HC和50G12-Hu-IgG1-LC基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，兩種載體組合後表現並純化抗體，所得抗體命名為50G12-Hu-IgG1。 實施例 2 抗體重鏈恆定區 Fc 段的改造

根據文獻(Rowley T F, Peters S J, Aylott M, et al. Engineered hexavalent Fc proteins with enhanced Fc-gamma receptor avidity provide insights into immune-complex interactions[J]. Communications biology, 2018, 1(1): 1-12.)可知，人IgG1單株抗體在L309(Eu numbering scheme)突變成半胱胺酸(簡寫為C)並且在Fc末端融合人IgM的tail-piece之後會容易生成六聚化的抗體複合體。這表明，人IgG1 L309C突變和人IgM的tail-piece具有促進人IgG1形成六聚體的潛力。 1 、 Fc 段 309 位的定點突變

在此，本實施例對50G12-Hu-IgG1重鏈基因L309位進行了定點突變，將L309分別突變成(E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)，產生了一系列突變體，然後按照上述方法表現並純化抗體，所得抗體分別命名為50G12-Hu-IgG1-L309X(X表示E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)。

測定CDC的方法描述如下：Raji和Daudi細胞購自ATCC(American Type Culture Collection)，並按照ATCC推薦方法進行常規培養和繼代培養。在RPMI-1640(Gibco；貨號：11835-030)中加入人血清(澳賽爾斯；貨號：PB022-C)，使人血清終濃度為5%；用此培養基重新懸浮對數生長期的Raji/Daudi細胞，然後接種至96孔盤中(Corning；貨號：CLS3599)，每孔接種50 µL細胞懸浮液(含10萬個細胞)；將待測抗體進行梯度稀釋，然後加入上述接種細胞的96孔盤中，每孔50 µL；混勻之後，置於細胞二氧化碳細胞培養箱中培育2.5小時；在96孔盤中加入CCK-8(Dojindo，貨號：CK04)，每孔20 µL，繼續培育2小時；用SpectraMax 190(Molecular Devices)讀取96孔盤的OD450；用GraphPad Prism7進行數據分析和作圖，計算IC ₅₀。

CDC活性越強，細胞活力越低，OD450也越低。圖1和圖2結果均顯示，與母代抗體50G12-Hu-IgG1相比，50G12-Hu-IgG1-L309F/C/W/Y具有顯著增強的CDC。其中Isotype Control為與標的不相關的人IgG1單株抗體。 2 、 Fc 段末端的改造

在此，透過基因工程將IgM的tail-piece(胺基酸序列：PTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO：7)，該段短肽簡稱為Pep)的編碼序列連接到50G12-Hu-IgG1重鏈基因的末端，並將該重鏈基因命名為50G12-Hu-IgG1-Pep-HC (胺基酸序列如SEQ ID NO：9)。為避免表現過程中抗體分子之間形成二硫鍵，將兩條tail-piece中的半胱胺酸突變成絲胺酸(突變後tail-piece的胺基酸序列：PTLYNVSLVMSDTAGT SY(SEQ ID NO：8)，該段短肽簡稱為Pep-CS)，並將該重鏈基因命名為50G12-Hu-IgG1-Pep-CS-HC (胺基酸序列如SEQ ID NO：10)。將50G12-Hu-IgG1-Pep-HC和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS-HC基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，兩種載體分別與50G12-Hu-IgG1-LC基因組合後表現並純化抗體，所得抗體分別命名為50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS。

用上述方法檢測50G12-Hu-IgG1-L309F/C/W/Y、50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS的CDC。不同之處在於，此處使用CellTiter-Glo ^®Luminescent Cell Viability Assay(Promega，貨號：G7572，簡稱CTG)檢測細胞活力。在一些孔的細胞中加入Triton X-100(0.1%)以充分裂解細胞，該組細胞加入CTG後產生的訊號為基底值。沒有經過抗體處理的細胞在加入CTG後產生的訊號為最大值。CDC按照如下公式計算：細胞毒性(%)=(最大值-實驗值)/(最大值-基底值)×100。用GraphPad Prism7進行數據分析和作圖，如圖3所示。計算EC ₅₀，如表2所示。表2. 本發明抗體的CDC活性

抗體	Top	EC ₅₀(nM)
50G12-Hu-IgG1	11.37	NA
50G12-Hu-IgG1-L309F	63.65	4.087
50G12-Hu-IgG1-L309C	99.59	0.3727
50G12-Hu-IgG1-L309W	99.82	0.55
50G12-Hu-IgG1-L309Y	85.23	1.841
50G12-Hu-IgG1-Pep	100.7	0.3976
50G12-Hu-IgG1-Pep-CS	99.7	0.2315

CDC越強，EC ₅₀越小，Top(曲線高平臺的高度)越高。圖3和表2結果顯示，與母代抗體50G12-Hu-IgG1相比，50G12-Hu-IgG1-L309F/C/W/Y具有顯著增強的CDC活性，其中50G12-Hu-IgG1-L309F/Y的CDC弱於50G12-Hu-IgG1-L309C/W。50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS具有相近的CDC，並且它們的CDC與50G12-Hu-IgG1-L309C/W基本相當。50G12-Hu-IgG1-L309C/W、50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS的Top均大於99，這說明這些抗體在高濃度時，能夠充分裂解標的細胞。 實施例 3 抗體突變體的聚集體分析

用HPLC-SEC測定上述優選抗體突變體的純度。結果如下：表3. 本發明優選抗體突變體的純度

抗體	SEC主峰 (%)
50G12-Hu-IgG1	99.3
50G12-Hu-IgG1-L309F	99.5
50G12-Hu-IgG1-L309C	79.7
50G12-Hu-IgG1-L309W	99.4
50G12-Hu-IgG1-L309Y	98.6
50G12-Hu-IgG1-Pep	74.0
50G12-Hu-IgG1-Pep-CS	99.5

HPLC-SEC的測定結果顯示，50G12-Hu-IgG1-L309F/W/Y和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS的主峰比例均大於98%，這說明它們尺寸異質性小，具有較高的純度。此外，50G12-Hu-IgG1-L309C和50G12-Hu-IgG1-Pep的主峰比例分別為79.7%和74.0%，兩者純度低於80%，圖譜中顯示這兩種抗體中存在較多的聚集體。 實施例 4 抗人 CD38 單株抗體 OKT10 的改造 1 、 OKT10 人源化單株抗體的製備

OKT10是抗人CD38單株抗體，由小鼠雜交瘤產生。其重鏈可變區和輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NOs：19和20)來自NCBI GenBank(ABA42888.1和ABA42887.1)。

由上海生工生物工程有限公司合成編碼上述可變區的DNA。對OKT10的重鏈可變區和輕鏈可變區胺基酸序列進行分析，依據Kabat規則分別確定OKT10重鏈和輕鏈的抗原互補決定區和框架區。OKT10重鏈CDR的胺基酸序列為H-CDR1：RSWMN(SEQ ID NO：11)、H-CDR2：EINPDSSTINYTTSLKD(SEQ ID NO：12)和H-CDR3：YGNWFPY(SEQ ID NO：13)，輕鏈CDR的胺基酸序列為L-CDR1：KASQNVDTNVA(SEQ ID NO：14)、L-CDR2：SASYRYS(SEQ ID NO：15)和L-CDR3：QQYDSYPLT(SEQ ID NO：16)。

在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，將鼠源OKT10重鏈可變區與人IgG生殖系序列進行同源性比較，選擇IGHV3-48*01為重鏈CDR移植模板，將鼠源OKT10重鏈CDR移植入IGHV3-48*01框架區，並在H-CDR3之後加入WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：17)作為第四個框架區，獲得CDR移植重鏈可變區序列。同樣地，將鼠源OKT10輕鏈可變區與人IgG生殖系序列同源性比較，選擇IGKV1-16*01為輕鏈CDR移植模板，將鼠源OKT10輕鏈CDR移植入IGKV1-16*01的框架區，並在L-CDR3之後加入FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：18)作為第四個框架區，獲得CDR移植輕鏈可變區序列。在CDR移植可變區的基礎上，對一些框架區的胺基酸位點進行回復突變(回復突變就是將人源框架區的某些胺基酸突變成鼠源框架區同一位置的胺基酸，回復突變的位點一般對維持抗體的結構和/或親和力是至關重要的)。在進行回復突變時，將胺基酸序列進行Kabat編碼，位點的位置由Kabat碼指示。

優選的，對於CDR移植重鏈可變區，將第28位的T回復突變為D。對於CDR移植輕鏈可變區，將第36位的F回復突變為Y，第46位的S回復突變為A。

上述帶有回復突變位點的重鏈可變區和輕鏈可變區分別定義為OKT10人源化的重鏈可變區(胺基酸序列如SEQ ID NO：21)和輕鏈可變區(胺基酸序列如SEQ ID NO：22)。由上海生工生物工程有限公司合成編碼上述人源化的重鏈和輕鏈可變區的DNA。將合成的人源化重鏈可變區與人IgG1恆定區(胺基酸序列如SEQ ID NO：3)相連，獲得全長的人源化重鏈基因，命名為OKT10-Hu-HC (胺基酸序列如SEQ ID NO：23)；將人源化輕鏈可變區與人Kappa鏈恆定區(胺基酸序列如SEQ ID NO：4)相連，獲得全長的人源化輕鏈基因，命名為OKT10-Hu-LC (胺基酸序列如SEQ ID NO：24)。

將OKT10-Hu-HC和OKT10-Hu-LC基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，兩種載體組合後表現並純化抗體，所得抗體命名為OKT10-Hu-IgG1。 2 、 OKT10-Hu-IgG1 突變體的製備

在此，對OKT10-Hu-IgG1重鏈基因L309位進行了定點突變，分別突變成W或Y，突變基因再分別與OKT10-Hu-LC組合，表現並純化抗體，所得抗體分別命名為OKT10-Hu-IgG1-L309W和OKT10-Hu-IgG1-L309Y。在此，透過基因工程將Pep-CS的編碼序列連接到OKT10-Hu-IgG1重鏈基因的末端，並將該重鏈基因命名為OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS-HC (胺基酸序列如SEQ ID NO：25)，與OKT10-Hu-LC組合後按照上述方法表現並純化抗體，所得抗體命名為OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS。 3 、測定 OKT10-Hu-IgG1 突變體的 CDC

用上述實施例中描述的方法測定OKT10-Hu-IgG1及其突變體的CDC。如圖4所示。

圖4結果顯示，與母代抗體OKT10-Hu-IgG1相比，OKT10-Hu-IgG1-L309W、OKT10-Hu-IgG1-L309Y和OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS具有顯著增強的CDC活性，它們的EC ₅₀分別為0.5942 nM、5.902 nM和1.715 nM，它們的高平臺分別為99.85、69.84和99.43。OKT10-Hu-IgG1-L309W和OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS的Top均大於99，這說明這些抗體在高濃度時，能夠充分裂解標的細胞。上述結果表明，在三者之中，OKT10-Hu-IgG1-L309W的CDC最強。 4 、測定 OKT10-Hu-IgG1 對食蟹猴 CD38 的結合力

Daratumumab是一種已被批准上市的抗人CD38單株抗體，其重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NOs：26和27)來自《WHO Drug Information, Vol. 24, No. 1, 2010》。

Isatuximab是另一種已被批准上市的抗人CD38單株抗體，其重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NOs：28和29)來自《WHO Drug Information, Vol. 29, No. 3, 2015》。

由上海生工生物工程有限公司合成上述重鏈可變區和輕鏈可變區的DNA。將合成的Daratumumab重鏈可變區基因與人IgG1重鏈恆定區基因相連，獲得全長的重鏈基因；將Daratumumab輕鏈可變區基因與人Kappa鏈恆定區基因相連，獲得全長的輕鏈基因。用上述實施例中描述的方法表現並純化抗體，所得抗體命名為Daratumumab-IgG1(也稱作Daratumumab)。此外，用相似的實驗方法獲得抗體Isatuximab-IgG1。

食蟹猴CD38胺基酸序列(SEQ ID NO：30)來自https://www.uniprot.org/uniprot/Q5VAN0，由上海生工生物工程有限公司合成編碼食蟹猴CD38胞外段的DNA，在基因末端添加編碼多聚組胺酸的編碼序列，然後將重組基因建構到表現載體中。用上述實施例中描述的方法表現該重組蛋白，然後利用Ni-NTA親和層析管柱對培養上清液中的重組蛋白進行純化，所得重組蛋白命名為CD38-ECD-Cyno。

用CD38-ECD-Cyno塗佈微量井培養盤(10 ng/孔)，然後用ELISA測定50G12-Hu-IgG1、OKT10-Hu-IgG1、Daratumumab-IgG1和Isatuximab-IgG1對CD38-ECD-Cyno的結合能力。

圖5顯示，OKT10-Hu-IgG1能夠有效結合食蟹猴的CD38，EC ₅₀為0.1324 nM。50G12-Hu-IgG1、Daratumumab-IgG1和Isatuximab-IgG1均不能辨識食蟹猴CD38。 實施例 5 單株抗體 50G12-L309W-E345R 的製備

透過基因工程和分子選殖技術將50G12-Hu-IgG1重鏈恆定區的L309位定點突變成W，同時將E345位定點突變成R，並建構到pcDNA3.4表現載體中，得到的重鏈命名為50G12-Hu-IgG1-L309W-E345R，將上述重鏈與50G12-Hu-IgG1-LC共轉染轉染HEK-293F細胞表現5天，透過ProteinA親和層析管柱純化獲得的抗體命名為50G12-L309W-E345R。相同的方法獲得單點突變抗體50G12-L309W(也稱作50G12-Hu-IgG1-L309W)和50G12-E345R。 實施例 6 50G12-L309W-E345R 對人 CD38 親和力的測定

在此，透過Biacore 8K(購自GE Healthcare)測定50G12-L309W-E345R、50G12-Hu-IgG1、Daratumumab對人CD38蛋白的結合、解離常數。具體實施方法如下：

1) 根據EZ-Link NHS-Biotin Reagent說明書（購自Thermo Fisher Scientific，貨號21343）將人CD38蛋白biotin化，並命名為CD38-biotin；

2) CAP晶片偶聯：將50ug/mL Biotin CAPture Reagent 與 HBS-EP+ pH7.4 Buffer 1:1混合，運行參數：接觸時間60s，流速 2 μL/min。

3) 捕捉Biotin-CD38，運行參數如下： biotin-CD38濃度為 2μg/mL，接觸時間15 s，流速10 μL/min，再生接觸時間為30 s。

4) 利用HBS-EP+ pH7.4緩衝液稀釋各待測抗體，最高濃度為200nM，按照2倍稀釋至1.5625 nM及0濃度點，按照Biotin CAPture Kit說明書配製再生液，在Biacore 8K上按照如下參數進樣：結合時間180s，解離時間600s，流速30μL/min，再生接觸時間為30s，流速30μL/min。

5) 利用Biacore 8K Evaluation Software對數據進行分析，在 “Kinetics”模式下選擇“1：1 binding kinetics model”公式擬合，得出各抗體與CD38的親和力數據。

如表4所示，50G12-L309W-E345R、50G12-Hu-IgG1對CD38蛋白的親和力強於Daratumumab，具體表現為50G12-L309W-E345R、50G12-Hu-IgG1的解離常數kd優於Daratumumab，三個抗體的平衡解離常數KD分別為2.99×10 ^-9M，3.58×10 ^-9M和2.60×10 ^-8M。表4. 50G12-L309W-E345R對人CD38蛋白結合親和力

樣品	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
50G12-Hu-IgG1	1.71E+05	6.13E-04	3.58E-09
50G12-L309W-E345R	3.46E+05	1.03E-03	2.99E-09
Daratumumab	1.30E+05	3.37E-03	2.60E-08

實施例 7 50G12-L309W-E345R 的 CDC 活性測定

將處於對數生長期的人Burkitt's淋巴瘤細胞Daudi、Raji和Romas用DPBS清洗一次，用無血清無酚紅1640培養基調整細胞密度為2E5/mL，按照50μL/孔塗佈到白色96孔細胞培養盤中；用無血清無酚紅1640培養基稀釋抗體至所需濃度，之後按照3倍梯度連續稀釋12個濃度；向上述細胞培養盤中加入稀釋完成的藥品，50μL/孔，抗體終濃度為50nM，平行做兩個複孔，於37℃，5% CO ₂細胞培養箱培育30min；將Normal Human Serum complement按照20μL/孔，加到上述培養盤中，於37℃，5% CO ₂細胞細胞培養箱培育2h；將上述細胞培養盤置於室溫平衡15min，按照80μL/孔加入室溫平衡好的Cell Titer-Glo Luminescent Assay顯色劑，室溫培育8min後，透過ELISA讀取儀i3(購自Molecular Devices，型號 SPECTRA MAX i3)進行檢測收集數據，用GraphPad Prism9進行數據分析和作圖並計算IC ₅₀。

如圖6所示，50G12-L309W-E345R媒介的補體活化對Romas細胞的毒殺活性明顯優於未突變抗體50G12-Hu-IgG1和對照抗體Daratumumab，稍優於單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R。如表5所示，50G12-L309W-E345R媒介的補體作用對Romas細胞毒殺的IC ₅₀優於Daratumumab，約8倍；最大毒殺活性絕對數值(Bottom)優於Daratumumab，約為98倍；IC ₅₀優於50G12-L309W，約1.7倍；優於50G12-E345R約1.2倍。

如圖7所示，50G12-L309W-E345R媒介的補體活化對Daudi細胞的毒殺活性明顯優於單點突變抗體50G12-L309W、未突變抗體50G12-Hu-IgG1和對照抗體Daratumumab，稍優於單點突變抗體50G12-E345R。如表6所示，50G12-L309W-E345R媒介的補體作用對Daudi細胞毒殺的IC ₅₀優於Daratumumab，約19倍；最大毒殺活性絕對數值(Bottom)優於Daratumumab，約為25倍；IC ₅₀優於50G12-L309W，約3.2倍；IC ₅₀優於50G12-E345R，約1.4倍。

如圖8所示，50G12-L309W-E345R媒介的補體活化對Raji細胞的毒殺活性明顯優於單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R、未突變抗體50G12-Hu-IgG1、對照抗體Daratumumab，而且50G12-Hu-IgG1和Daratumumab在Raji細胞上幾乎沒有CDC活性，這可能與Raji細胞表面CD38表現水平相對偏低有關。如表7所示，50G12-L309W-E345R媒介的補體作用對Raji細胞毒殺的IC ₅₀優於50G12-E345R，約2倍；最大毒殺活性絕對數值(Bottom)優於50G12-E345R，約為2.4倍。

上述數據表明各抗體在不同細胞上所引起的CDC反應不同，這不僅與CD38在不同細胞的表現水平有關，也與各細胞上的補體調節蛋白CD55和CD59表現量有關(參考文獻：CD38 expression and complement inhibitors affect response and resistance to daratumumab therapy in myeloma [J]. Blood, 2016, 128(7):959-970.)；但有一點可以肯定的是在抗體重鏈恆定區同時引入L309W和E345R雙點突變可以有效增強抗體的媒介的CDC活性，並且引入所述雙點突變能賦予抗體出乎意料的優異活性，其優於任何一個隻引入L309W或E345R單點的突變或未引入突變點的抗體，而且這種CDC的增強反應在CD38表現水平相對偏低的腫瘤細胞上表現更為顯著。表5. 50G12-L309W-E345R媒介的補體活化對Romas細胞的毒殺活性

樣品	IC ₅₀(nM)	SD	Bottom
50G12-Hu-IgG1	0.459	0.162	33966
50G12-L309W	0.162	0.014	713.6
50G12- E345R	0.113	0.011	192.1
50G12-L309W-E345R	0.094	0.013	192.1
Daratumumab	0.755	0.002	18914

表6. 50G12-L309W-E345R媒介的補體活化對Daudi細胞的毒殺活性

樣品	IC ₅₀(nM)	SD	Bottom
50G12-Hu-IgG1	4.217	0.486	51424
50G12-L309W	0.575	0.048	1431
50G12-E345R	0.253	0.014	-1777
50G12-L309W-E345R	0.177	0.006	1486
Daratumumab	3.308	0.001	36749

表7. 50G12-L309W-E345R媒介的補體活化對Raji細胞的毒殺活性

樣品	IC ₅₀(nM)	SD	Bottom
50G12-Hu-IgG1	NA	NA	167616
50G12-L309W	NA	NA	147519
50G12-E345R	0.268	0.095	104778
50G12-L309W-E345R	0.129	0.007	42978
Daratumumab	NA	NA	173564

實施例 8 50G12-L309W-E345R 的 ADCC 活性測定

將處於對數生長期的人Burkitt's淋巴瘤細胞Daudi、Ramos、Raji、人骨髓瘤細胞NCI-H929、人多發性骨髓瘤細胞MOLP8用DPBS清洗一次細胞後用無血清1640培養基調整細胞密度為4.8E5/mL，按照25μL/孔塗佈到白色96孔細胞培養盤；用無血清1640培養基稀釋各抗體至所需濃度，之後按照3倍梯度連續稀釋10個濃度，將稀釋完成的各抗體，按照25μL/孔加入上述細胞培養盤，並於細胞培養箱培育45min；用DPBS清洗對數生長期的ADCC效應細胞一次，隨後用無血清1640培養基調整細胞密度至3E6/mL，按照25μL/孔，加到上述培養盤中，於37℃，5% CO ₂細胞培養箱培育6h；

提前將細胞培養盤置於室溫平衡15min左右，每孔加入60μL的Bio-glo顯色劑，室溫培育4min後，透過ELISA讀取儀i3進行檢測收集數據，用GraphPad Prism9進行數據分析和作圖並計算IC ₅₀。

如圖9所示，50G12-L309W-E345R媒介的ADCC反應對Daudi細胞的毒殺活性明顯優於未突變抗體50G12-Hu-IgG1、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R和對照抗體Daratumumab。如表8所示，50G12-L309W-E345R媒介的ADCC反應對Daudi細胞毒殺的IC ₅₀優於Daratumumab，約1.5倍；最大毒殺活性絕對數值(Top)優於Daratumumab，約為1.3倍；且IC ₅₀優於50G12-E345R，約2倍；IC ₅₀優於50G12-L309W，約1.7倍。表8. 50G12-L309W-E345R媒介的ADCC對Daudi細胞的毒殺活性

樣品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.219	0.114	1583
50G12-L309W	0.142	0.019	1818
50G12-E345R	0.166	0.089	2817
50G12-L309W-E345R	0.085	0.019	2653
Daratumumab	0.132	0.034	2062

如圖10所示，50G12-L309W-E345R媒介的ADCC反應對NCI-H929細胞的毒殺活性明顯優於未突變抗體50G12-Hu-IgG、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R和對照抗體Daratumumab。如表9所示，50G12-L309W-E345R媒介的ADCC反應對NCI-H929細胞毒殺的IC ₅₀優於Daratumumab，約1.5倍；最大毒殺活性絕對數值(Top)優於Daratumumab，約為1.9倍；且IC ₅₀優於50G12-E345R，約1.9倍；IC ₅₀優於50G12-L309W，約1.3倍。表9. 50G12-L309W-E345R媒介的ADCC對NCI-H929細胞的毒殺活性

樣品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.298	0.075	1195
50G12-L309W	0.154	0.014	1614
50G12-E345R	0.218	0.017	2850
50G12-L309W-E345R	0.115	0.034	2711
Daratumumab	0.172	0.125	1407

如圖11所示，50G12-L309W-E345R媒介的ADCC反應對Romas細胞的毒殺活性明顯優於未突變抗體50G12-Hu-IgG1、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R和對照抗體Daratumumab。如表10所示，50G12-L309W-E345R媒介的ADCC反應對Romas細胞毒殺的IC ₅₀優於Daratumumab，約2.7倍；最大毒殺活性絕對數值(Top)優於Daratumumab，約為1.2倍；且IC ₅₀優於50G12-E345R，約2.4倍；IC ₅₀優於50G12-L309W，約2倍。表10. 50G12-L309W-E345R媒介的ADCC對Romas細胞的毒殺活性

樣品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.095	0.019	3193
50G12-L309W	0.070	0.006	3244
50G12-E345R	0.080	0.005	3894
50G12-L309W-E345R	0.034	0.005	3868
Daratumumab	0.092	0.005	3201

如圖12所示，50G12-L309W-E345R媒介的ADCC反應對MOLP8細胞的毒殺活性明顯優於未突變抗體50G12-Hu-IgG1、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R和對照抗體Daratumumab。如表11所示，50G12-L309W-E345R媒介的ADCC反應對MOLP8細胞毒殺的IC ₅₀優於Daratumumab，約3.5倍；最大毒殺活性絕對數值(Top)優於Daratumumab，約為1.5倍；且IC ₅₀優於50G12-E345R，約3.3倍；IC ₅₀優於50G12-L309W，約2.5倍。表11. 50G12-L309W-E345R媒介的ADCC對MOLP8細胞的毒殺活性

樣品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.253	0.148	1583
50G12-L309W	0.197	0.021	1367
50G12-E345R	0.263	0.067	1953
50G12-L309W-E345R	0.079	0.017	2100
Daratumumab	0.281	0.037	1355

如圖13所示，50G12-L309W-E345R媒介的ADCC反應對Raji細胞的毒殺活性明顯優於未突變抗體50G12-Hu-IgG1、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R和對照抗體Daratumumab。如表12所示，50G12-L309W-E345R媒介的ADCC反應對Raji細胞毒殺的IC ₅₀優於Daratumumab，約9.2倍；最大毒殺活性絕對數值(Top)優於Daratumumab，約為1.3倍；且IC ₅₀優於50G12-E345R，約2.7倍；IC ₅₀優於50G12-L309W，約3倍。表12. 50G12-L309W-E345R媒介的ADCC對Raji細胞的毒殺活性

樣品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.279	0.063	2855
50G12-L309W	0.229	0.072	3175
50G12-E345R	0.200	0.020	4455
50G12-L309W-E345R	0.075	0.014	4850
Daratumumab	0.690	0.167	3725

上述數據表明在抗體重鏈恆定區同時引入L309W和E345R雙點突變可以有效增強抗體的媒介的ADCC活性，其活性優於任何一個只引入L309W或E345R單點的突變或未引入突變點的抗體，並且對於CDC反應不敏感的細胞NCI-H929(參考文獻：CD38 expression and complement inhibitors affect response and resistance to daratumumab therapy in myeloma [J]. Blood, 2016, 128(7):959-970.)，L309W和E345R雙點突變仍能體現出較優的ADCC增強反應。 實施例 9 50G12-L309W-E345R 誘導細胞凋亡作用

將處於對數生長期的人Burkitt's淋巴瘤細胞Daudi用含2%FBS的RPMI-1640培養基清洗一次，按照1E5/150μL/孔調整細胞密度，塗佈到96孔細胞培養盤；用含2% FBS的RPMI-1640培養基稀釋抗體至12nM，之後按照3倍梯度連續稀釋8個濃度，按照 50μL/孔，加入稀釋好的抗體至上述96孔細胞培養盤，抗體終濃度為3nM，於細胞培養箱培育24h；用預冷的PBS按照200μL/孔，400g，4℃離心5min清洗細胞兩次；用FITC標記的Annexin V凋亡檢測套組對凋亡細胞進行染色，即100μL 1×binding buffer重新懸浮細胞，1.5μL/孔加入FITC-Annexin V，輕輕混勻，避光室溫反應15min；加入100μL 1×binding buffer，混勻，在1h內透過流式細胞儀(購自Beckman，型號cytoflex)測定FITC通道的平均螢光強度並分析數據，計算染色細胞數目；用GraphPad Prism9進行數據分析和作圖，計算IC ₅₀。

如圖14所示，50G12-L309W-E345R誘導Daudi細胞的凋亡反應與未突變抗體50G12-Hu-IgG1相當，均明顯優於對照抗體Daratumumab，如表13所示，50G12-L309W-E345R誘導Daudi細胞凋亡的最大活性(Top)優於Daratumumab約2.1倍。表13.50G12-L309W-E345R誘導Daudi細胞凋亡反應

樣品	IC ₅₀(nM)	SD	Top
50G12-Hu-IgG1	0.270	0.055	19.98
50G12-L309W-E345R	0.382	0.055	21.62
Daratumumab	0.368	0.022	10.3

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。

圖1顯示了含有Fc段309位定點突變(L309 E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)的抗體對Raji細胞的CDC活性。

圖2顯示了含有Fc段309位定點突變(L309 E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)的抗體對Daudi細胞的CDC活性。

圖3顯示了含有Fc段309位定點突變(L309 F/C/W/Y)的抗體和Fc段末端改造(Pep及Pep-CS)的抗體對Daudi細胞的CDC活性。

圖4顯示了OKT10-Hu-IgG1及其突變體對Daudi細胞的CDC活性。

圖5顯示了50G12-Hu-IgG1、OKT10-Hu-IgG1、Daratumumab-IgG1和Isatuximab-IgG1抗體對食蟹猴CD38的結合能力。

圖6顯示了50G12-L309W-E345R、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R、未突變抗體50G12-Hu-IgG1和對照抗體Daratumumab媒介的補體活化對Romas細胞的毒殺活性。

圖7顯示了50G12-L309W-E345R、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R、未突變抗體50G12-Hu-IgG1和對照抗體Daratumumab媒介的補體活化對Daudi細胞的毒殺活性。

圖8顯示了50G12-L309W-E345R、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R、未突變抗體50G12-Hu-IgG1和對照抗體Daratumumab媒介的補體活化對Raji細胞的毒殺活性。

圖9顯示了50G12-L309W-E345R、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R、未突變抗體50G12-Hu-IgG1和對照抗體Daratumumab媒介的ADCC反應對Daudi細胞的毒殺活性。

圖10顯示了50G12-L309W-E345R、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R、未突變抗體50G12-Hu-IgG1和對照抗體Daratumumab媒介的ADCC反應對NCI-H929細胞的毒殺活性。

圖11顯示了50G12-L309W-E345R、未突變抗體50G12-Hu-IgG1、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R和對照抗體Daratumumab媒介的ADCC反應對Romas細胞的毒殺活性。

圖12顯示了50G12-L309W-E345R、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R、未突變抗體50G12-Hu-IgG1和對照抗體Daratumumab媒介的ADCC反應對MOLP8細胞的毒殺活性。

圖13顯示了50G12-L309W-E345R、單點突變抗體50G12-L309W、單點突變抗體50G12-E345R、未突變抗體50G12-Hu-IgG1、對照抗體Daratumumab媒介的ADCC反應對Raji細胞的毒殺活性。

圖14顯示了50G12-L309W-E345R、未突變抗體50G12-Hu-IgG1、對照抗體Daratumumab的誘導細胞凋亡作用。

Claims

一種具有抗原結合活性和CDC活性的抗體或其片段或融合蛋白，其特徵在於，所述抗體或其片段或融合蛋白包含標靶預定抗原的結合功能域、和重鏈Fc區元件，所述重鏈Fc區元件： (1) 在Fc區位置309位上包含選自下組的胺基酸殘基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或 (2) 在C末端含有尾片(tail-piece)元件。
如請求項1所述的抗體或其片段或融合蛋白，其特徵在於，所述的抗體或其片段或融合蛋白還具有ADCC活性。
如請求項1-2任一項所述的抗體或其片段或融合蛋白，其特徵在於，所述重鏈Fc區元件包括選自下組Fc區位置的胺基酸殘基取代： (1)L309W+E345R； (2)L309Y+E345R； (3)L309E+E345R； (4)L309F+E345R； (5)L309H+E345R； (6)L309C+E345R； (7)L309D+E345R； (8)L309N+E345R； (9)L309Q+E345R； (10)L309R+E345R； (11)L309S+E345R； (12)L309T+E345R；或 (13)L309K+E345R。
如請求項1-3任一項所述的抗體或其片段或融合蛋白，其特徵在於，所述標靶預定抗原的結合功能域結合選自下組的抗原分子：CD38、CD3、CD47、CD19、CD20、HER2、EGFR、CD123、Glypican-3、CD25、Trop-2、EpCAM、或其組合。
如請求項1-4任一項所述的抗體或其片段或融合蛋白，其特徵在於，所述重鏈Fc區元件來源於IgG，所述IgG具有選自下組胺基酸序列： SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34。
如請求項1-5任一項所述的抗體或其片段或融合蛋白，其特徵在於，所述抗體或其片段或融合蛋白選自下組： (a) 具有選自下組胺基酸序列抗體或其片段或融合蛋白：重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處具有W或Y突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL區；或重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處具有W或Y突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL區；或重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處具有W或Y突變，和345位置處具有R突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL區；或重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH區，和在根據EU編號人IgG1 309位置處具有W或Y突變，和345位置處具有R突變的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL區；或重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：35所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：36所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：37所示的H-CDR3的VH區，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：38所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：39所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：40所示的L-CDR3的VL區；或重鏈，其包含含有如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1、如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2和如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3的VH區，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重鏈恆定區；以及，輕鏈，包含含有如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1、如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2和如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3的VL區； (b) 將(a)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗原結合功能和所述CDC活性的由(a)衍生的多肽。
一種提高抗體或其片段或融合蛋白的CDC的方法，其中，所述抗體或其片段或融合蛋白包含免疫球蛋白的Fc區和標靶預定抗原的結合功能域，所述方法包括： (S1a)將一個或多個胺基酸殘基中的突變引入到該抗體或其片段或融合蛋白中，所述突變包括將IgG重鏈的Fc區中的309位突變為選自下組的胺基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或 (S1b)在Fc區的C末端融合尾片(tail-piece)元件，所述尾片元件的序列如SEQ ID NO：7或8所示。
如請求項7所述的方法，其特徵在於，在步驟(S1a)中，所述突變還包括：將IgG重鏈的Fc區中的345位突變為R。
一種重鏈Fc區元件，其特徵在於，所述重鏈Fc區元件： (1) 在Fc區位置309上包含選自下組的胺基酸殘基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K，較佳地，還包括將IgG重鏈的Fc區中的345位突變為R；和/或 (2) 在C末端含有尾片(tail-piece)元件。
一種分離的核酸分子，其特徵在於，所述的核酸分子編碼如請求項1-6中任一項所述的抗體或其片段或融合蛋白，或如請求項9所述的重鏈Fc區元件。
一種表現載體，其特徵在於，所述的表現載體含有如請求項10所述的核酸分子。
一種宿主細胞，其特徵在於，所述的宿主細胞含有如請求項11所述的表現載體。
如請求項1-6中任一項所述的抗體或其片段或融合蛋白或如請求項9所述的重鏈Fc區元件的製備方法，其特徵在於，所述方法包含以下步驟： (a)在表現條件下，培養如請求項12所述的宿主細胞，從而表現所述的抗體或其片段或融合蛋白或所述的重鏈Fc區元件； (b)分離並純化(a)所述的抗體或其片段或融合蛋白或所述的重鏈Fc區元件。
一種免疫偶聯物，其特徵在於，所述免疫偶聯物包括： (a) 如請求項1-6中任一項所述的抗體或其片段或融合蛋白；和 (b) 選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核種、或酵素。
一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物含有如請求項1-6中任一項中所述的抗體或其片段或融合蛋白或如請求項14所述的免疫偶聯物和藥學上可接受的載劑。
一種如請求項1-6中任一項所述的抗體或其片段或融合蛋白、或如請求項14所述的免疫偶聯物、或如請求項15所述的藥物組成物在製備治療癌症或免疫相關疾病的藥物中的用途。
如請求項16所述的用途，其特徵在於，所述癌症選自下組：黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、多發性骨髓瘤及其它贅生性惡性疾病。
如請求項16所述的用途，其特徵在於，所述免疫相關疾病為自身免疫性疾病，優選為自體免疫腎病(免疫性腎炎、自身免疫性腎病)、紅斑性狼瘡、系統性紅斑狼瘡(SLE)、舍格倫症候群(Sjogren’s Syndrome)、關節炎、類風濕性關節炎、哮喘、COPD、骨盆發炎性疾病、阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease)、發炎性腸道疾病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、佩羅尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛性疾病、腹膜炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、血管炎、手術粘連、中風、I型糖尿病、萊姆病(Lyme disease)、腦膜腦炎、自身免疫性葡萄膜炎、多發性硬化症、格林-巴利症候群(Guillain-Barr syndrome)、異位性皮膚炎、自身免疫性肝炎、僵直性脊椎炎、纖維化肺泡炎、格里夫氏症(Grave's disease)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、美尼爾氏病(Meniere'sdisease)、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、類肉瘤病、硬皮病、韋格納氏肉芽腫病(Wegener'sgranulomatosis)、其他自身免疫性障礙、胰腺炎、創傷(外科手術)、移植物抗宿主病、移植排斥、心臟疾病(包括缺血性疾病諸如心肌梗塞以及動脈粥狀硬化)、血管內凝血、骨質再吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、牙周炎和低氯血症、與缺乏胎兒-母體耐受性相關的不孕症、白斑症、重症肌無力(MG)、系統性硬化症、發炎性腸病、胃炎或IgG4相關疾病，優選為免疫球蛋白A腎病(IgAN)、膜性腎病(MN)、具有腎臟意義的單株免疫球蛋白病(MGRS)、狼瘡性腎炎或紫癜性腎炎。