KR101744899B1 - 신규 항-tfpi 항체 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TFPI(Tissue factor pathway inhibitor)에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 숙주세포, 상기 항체의 제조방법 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 혈우병 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 TFPI에 특이적으로 결합하는 항체는 TFPI를 차단하여 혈액응고의 외인성 경로를 활성화시킬 수 있으므로, 항체 발생 혈우병 환자의 치료와 혈우병-A 또는 혈우병-B 환자의 혈액응고 질환 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 항-TFPI 항체 및 이를 포함하는 조성물{Novel Antibody Binding to TFPI, and Composition Comprising the Same}

본 발명은 TFPI(Tissue factor pathway inhibitor)에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 숙주세포, 상기 항체의 제조방법 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 혈우병 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

혈우병(Hemophilia A 및 B) 환자의 30% 가량이 치료에 사용되는 FVIII(Factor VIII, 인자 VIII) 또는 FIX(Factor IX, 인자 IX) 단백질에 대한 항체가 생성되어 치료 효과가 현저히 떨어지는 것으로 알려져 있다. 이에 대한 대안으로 활성화된 Factor VIIa 또는 aPCC(plama derived activated Prothrombin Complex Concentrate)를 투여하고 있다.

혈우병 환자들은 주 2회 이상 상기 재조합 단백질을 정맥주사로 투여하는 치료를 받고 있으나, 반복적인 투여로 인한 불편함이 꾸준히 제기되고 있다. 따라서, 반감기를 증대시켜 장시간 동안 작용 가능한(long acting) 재조합 단백질에 관한 연구가 활발히 진행 중이다.

혈우병 모델에 있어서 최근 TFPI(Tissue factor pathway inhibitor)에 대한 접근이 시도되고 있다. TFPI는 혈액응고에 있어서 외인성 경로(extrinsic pathway)에 관여하며, TF/FVIIa로 Factor X 활성화를 막아서 혈액응고를 차단하는 역할을 한다(도 1 참조). 따라서, TFPI에 대한 항체를 통해 TFPI를 저해하면 외인성 경로를 통해 출혈 시 혈액응고를 활성화할 수 있다.

TFPI는 세 개의 KPI(Kunitz-type domain, Kunitz domain)로 구성되어 있으며, KPI-2(Kunitz domain 2)의 경우 FXa와 직접 바인딩하여 FXa를 저해한다(도 2 참조). 이는 TF/FVIIa/FXa/TFPI의 복합체(complex)를 구성하여 결과적으로 FXa의 생산을 직접 저해하는 작용기전을 가진다는 의미이다.

TFPI의 항체는 i) FVIII, FIX 단백질에 대한 항체가 생성된 환자에게도 사용할 수 있으며, ii) 항체의 특성상 매우 긴 반감기(~2주)를 가지기 때문에 투여 횟수를 줄일 수 있다.

TFPI를 대상으로 하는 혈우병 치료제 개발은 대부분 연구 단계이거나, 초기 개발단계에 있다. 예를 들면, Novo Nordisk社의 인간화된 단클론 항체(Humanized mAb) mAb2021은 항-TFPI 단클론 항체로 인간화 항체(Humanized antibody)(IgG4)이며, 임상 1상 단계에 진입한 상태이다. 또한, Baxter社의 ARC19499는 TFPI를 표적으로 하는 PEGylated Aptamer로 전임상 단계에 있다. 그리고, Baxter & 3B Pharmaceuticals의 JBT2329는 Pegylated 항-인간 TFPI 20mer 펩티드로 전임상 단계에 있다.

새로운 혈우병 치료제에 대한 필요성은 지속적으로 제기되어 왔으며, FVIIa와 같은 bypassing agent 외에 다른 접근방법으로 치료제의 개발이 절실한 상황이며, TFPI 경로를 차단하는 약제의 접근이 바람직하다. 혈액응고 인자를 투여받는 혈우병 환자의 경우 상기 인자에 대한 저항성 환자가 다수 존재하여 신약이 필요하나, 항원-항체 복합체 클리어런스(Ag-Ab complex clearance)와 같은 의학적 문제 또한 고려해야 할 것이다.

이에, 본 발명자들은, TFPI에 특이적으로 결합하는 신규 항체를 제조하고자 예의 노력한 결과, 상기 항체를 사용할 경우, TFPI의 항응고성 기전을 차단하여 혈액응고의 외인성 경로를 활성화할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 TFPI에 특이적으로 결합하는 신규 항체, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 숙주세포, 이의 제조방법 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 TFPI를 차단하여 혈액응고의 외인성 경로를 활성화시킬 수 있는 항체 발생 혈우병 치료용 또는 혈우병-A 및 혈우병-B 환자의 혈액응고 질환 예방용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 39로 표시되는 TFPI(Tissue Factor Pathway Inhibitor)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명은 또한, TFPI에 대한 항체를 코딩하는 핵산; 상기 핵산을 함유하는 벡터; 및 상기 벡터가 도입되어 있는 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 항-TFPI 항체를 유효성분으로 포함하는 혈우병 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 TFPI에 특이적으로 결합하는 항체는 TFPI를 차단하여 혈액응고의 외인성 경로를 활성화시킬 수 있으므로, 항체 발생 혈우병 환자의 치료와 혈우병-A 또는 혈우병-B 환자의 혈액응고 질환 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 혈액응고의 외인성 경로(extrinsic pathway)와 TFPI를 도시한 것이다.
도 2는 TFPI의 간략한 단백질 구조 및 KPI 도메인의 역할을 나타낸 것이다.
도 3은 정제된 항-TFPI 항체 중 T417 및 T308 클론 항체를 단백질 전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 항-TFPI 항체 중 클론 T417과 인간화 항체인 클론 308의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 정제된 항-TFPI 항체 중 클론 308 돌연변이 항체인 308-2 및 302-4 클론 항체의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 정제된 항-TFPI 항체 중 클론 308 돌연변이 항체인 308-2 및 302-4 클론 항체의 IgG를 단백질 전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 동물 타입에 따른 TFPI KPI-2(Kunitz domain 2) 단백질을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 항-TFPI 항체의 친화도(Affinity)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 FXa 활성 측정 시험을 통한 항-TFPI 항체 중 카이메릭 항체의 효력을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 FXa 활성 측정 시험을 통한 항-TFPI 항체 중 인간화된 항체의 효력을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 FXa 활성 측정 시험을 통한 항-TFPI 항체 중 백 돌연변이(back mutation)된 항체의 효력을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 TF/FVIIa/FXa 복합체 시험을 통한 항-TFPI 항체 중 카이메릭 항체의 효력을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 TF/FVIIa/FXa 복합체 시험을 통한 항-TFPI 항체 중 인간화된 항체의 효력을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 14는 TF/FVIIa/FXa 복합체 시험을 통한 항-TFPI 항체 중 백 돌연변이(back mutation)된 항체의 효력을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 트롬빈(Thrombin) 생성량 측정 시험을 통한 항-TFPI 항체 중 카이메릭 및 인간화된 항체의 효력을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 트롬빈 생성량 측정 시험을 통한 항-TFPI 항체 중 백 돌연변이(back mutation)된 항체의 효력을 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 항-TFPI 항체 중 클론 308과 인간 TFPI K2 도메인 간의 예측 결합구조를 나타낸 것이다. 적색으로 표현된 분자는 인간 TFPI K2 도메인이고, 녹색으로 표현된 분자는 클론 308 항체를 나타낸 것이다.
도 18은 항-TFPI 항체 중 클론 308 중쇄가변영역과 인간 TFPI 항원 간의 예측 결합구조를 나타낸 것이다.
도 19는 항-TFPI 항체 중 클론 308 경쇄가변영역과 인간 TFPI 항원 간의 예측 결합구조를 나타낸 것이다.

TFPI(Tissue Factor Pathway Inhibitor)는 혈액응고에 있어서 외인성 경로(extrinsic pathway)에 관여하며, TF/FVIIa로 Factor X 활성화를 막아서 혈액응고를 차단하는 것으로 보고된 바 있어 혈우병 치료용 항체 또는 예방용 항체를 제작하고자 하였다. 특히, TFPI의 KPI-2를 차단하는 항체를 통해 혈액응고의 외인성 경로를 활성화시키는 것이 본 발명의 핵심이다. 타깃하는 항원부위는 TFPI의 KPI-2 도메인으로 이 부분은 사람-토끼-원숭이 간의 아미노산 서열이 90% 이상 일치하므로(표 10 및 도 7 참조), 동물 실험의 디자인이 용이하며, 혈액응고의 속도를 측정하는 간단한 모델을 도입할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조직 인자 경로 억제제" 또는 "TFPI(Tissue Factor Pathway Inhibitor)"는 세포에 의해 천연적으로 발현되는, 인간 TFPI의 임의의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, TFPI에 대한 본 발명의 항체의 결합은 혈액 응고 시간을 감소시킨다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 39로 표시되는 TFPI(tissue factor pathway inhibitor)에 특이적으로 결합하도록 구조적으로 특성화되어 분리된 인간 단클론 항체 클론 308, 클론 308-2 및 클론 308-4를 제조하였다. 각 항체의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR에 대한 아미노산 서열은 하기 표 5 및 표 7에 기재된 바와 같다. 하기 표 4 및 표 6에 기재된 바와 같이, 항-TFPI 항체는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 또는 이와 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는 정제된 항체인 클론 T417, 클론 T308, 클론 308, 클론 308-2 또는 클론 308-4의 재조합 인간 TFPI(Recombinant human TFPI)에 대한 정량적인 결합력을 Biacore T-200(GE Healthcare, 미국) 바이오센서를 이용하여 측정하였다(실시예 6). 그 결과, 표 13 및 도 8에 나타난 바와 같이, 상기 제조된 모든 클론 항체에서 다소 차이는 있으나 친화도를 보였으며, 특히 클론 308-2와 클론 308-4의 친화도는 클론 308에 비해 매우 우수한 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 39로 표시되는 TFPI(tissue factor pathway inhibitor)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 서열번호 5, 11 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 6, 12, 26 또는 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 7 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 서열번호 8 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 9 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 10 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1, 3, 21, 24 또는 25의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성, 바람직하게 90% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게 100%의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항체는 서열번호 2, 4 또는 22의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성, 바람직하게 90% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게 100%의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1, 3, 21, 24 또는 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2, 4 또는 22의 경쇄 가변 영역을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항체는 인간 단클론 항체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항체는 보존적 치환을 통해서 항체의 아미노산 서열이 치환될 수 있다. 여기서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 당업계에 규정되어 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 본 발명의 항체가 보존적 아미노산 치환을 갖고 여전히 활성을 보유할 수 있음이 예상된다.

핵산 및 폴리펩티드의 경우, 용어 "실질적 상동성"은 2종의 핵산 또는 2종의 폴리펩티드 또는 이것들의 지정된 서열이 최적으로 정렬 및 비교되는 경우에 적절한 뉴클레오티드 또는 아미노산 삽입 또는 결실을 가지면 뉴클레오티드 또는 아미노산의 적어도 약 80％, 통상적으로는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 적어도 약 85％, 바람직하게는 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％ 또는 95％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 96％, 97％, 98％, 99％, 99.1％, 99.2％, 99.3％, 99.4％ 또는 99.5％에서 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 절편이 선택적인 혼성화 조건하에 그 가닥의 상보체와 혼성화되는 경우, 핵산에 대한 실질적 상동성이 존재한다. 본 발명은 본원에서 언급된 특정 핵산 서열 및 아미노산 서열에 대해 실질적 상동성을 갖는 핵산 서열 및 폴리펩티드 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 예를 들어, 표 2, 표 5 및 표 7에 기술된 중쇄(V_H) CDR1, 2 및 3 서열과 경쇄(V_L) CDR1, 2 및 3 서열은 구조적으로 유사한 중쇄(V_H) 및 경쇄(V_L)　서열이 혼합되어 중쇄(V_H)/경쇄(V_L)　쌍의　CDR1, 2 및 3으로 배치되어 형성될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 여기서 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 단클론 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내(in vitro) 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발, 또는 생체 내(in vivo) 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "항체"는 특정 항원과 면역학적으로 반응성인 면역글로블린 분자로, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체(polyclonal antibody) 및 단클론 항체(단일클론 항체, monoclonal antibody) 항체와 전체 항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자(예를 들어, 양특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함할 수 있다.

전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2, scFv 및 Fv 등을 포함한다.

상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.

상기 Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고, 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 이의 가변영역을 코딩하는 DNA 및 경쇄 또는 이의 가변영역을 코딩하는 DNA를 주형으로 하고, 프라이머쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)법에 의해 증폭시키고, 펩티드 링커를 코딩하는 DNA와 양 말단이 각각 중쇄 또는 이의 가변영역 및 경쇄 또는 이의 가변영역과 연결되도록 하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭)을 통하여 제작할 수 있다.

면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

본 명세서에서 사용하는 단클론 항체(단일클론 항체, monoclonal antibody)는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미하고, 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 단클론 항체(단일클론 항체, monoclonal antibody)는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, i) 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다는 점, ii) 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는다는 점, 및 iii) 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 점에서 장점이다.

이를 고려하여, 본 발명에 따른 항체는 TFPI에 특이적으로 결합하는 단클론항체로 TFPI에 대한 우수한 친화도 및 특이도를 나타낼 수 있을 뿐 아니라, 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로, 항체 발생 혈우병(혈우병-A 또는 혈우병-B)과 같은 질병의 치료에 있어 적합하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 TFPI에 특이적으로 결합하는 항체, "클론 T417", "클론 T308", "클론 308", "클론 308-2" 또는 "클론 308-4"는 TFPI에 결합하여 TFPI의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 항체를 의미하며, 항-TFPI 항체와 혼용하여 사용할 수 있다. 여기서 클론 T417과 클론 T308은 생쥐에 재조합 인간 TFPI를 면역(immunization)한 다음 수득한 항체이고, 클론 308은 상기 클론 T417을 인간화(humanization)하여 제조한 항체이다. 또한, 클론 308-2와 클론 308-4는, 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 클론 308의 중쇄의 라이신(K: Lysine)을 글루타민(Q: Glutamine) 또는 글루탐산(E: Glutamate)으로 각각 돌연변이를 도입하여 제조한 항체이다.

상기 TFPI에 대한 항체의 K_D(평형 해리상수, equilibrium dissociation constant)는 예를 들어: (1) 클론 308의 경우, 5.5x10^-11M 이하, 바람직하게 5.25x10^-11M 이하, 더욱 바람직하게 5.0x10^-11M 이하일 수 있으며, (2) 클론 308-2의 경우, 3.63x10^-11M 이하, 바람직하게 3.465x10^-11M 이하, 더욱 바람직하게 3.3x10^-11M 이하일 수 있고, (3) 클론 308-4의 경우, 2.64x10^-11M 이하, 바람직하게 2.52x10^-11M 이하, 더욱 바람직하게 2.4x10^-11M 이하일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 인간 TFPI에 결합하는 생쥐(mouse)의 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)과 경쇄 가변 영역(light chain variable region)의 유전자를 파악한 다음, 중쇄 가변 영역 유전자는 인간 이뮤노글로불린 타입 4의 중쇄 불변 영역(IgG4 heavy chain constant region) 유전자와 연결하고, 경쇄 가변 영역 유전자는 인간 경쇄 불변 영역(light chain constant region)과 연결한 다음, 이들을 각각 동물세포용 단백질 발현 벡터에 삽입하여 벡터를 제작한 후 이들을 Expi293 세포주에 형질주입(transfection)하고 배양하여 항체를 생산한 다음 이를 프로테인 A(protein A)로 정제하여 항체를 제조하였다(실시예 1).

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 핵산은 세포, 세포 용해물(lysate) 중에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수도 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기 영동 및 당업계에 잘 알려진 기타의 것을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 기타 오염 물질, 예를 들어 다른 세포의 핵산 또는 단백질로부터 정제되어 나올 경우 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 되는" 것이다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 항체 또는 그의 항체 단편의 발현을 위하여, 부분적이거나 전장인 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술(예를 들어 PCR 증폭 또는 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있으며, DNA가 전사 및 번역 제어 서열에 "작동되도록 결합"되어 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "작동되도록 결합"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션된다는 것을 의미할 수 있다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현용 숙주세포와 상용성 있도록 선택된다. 항체의 경쇄 유전자 및 항체의 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입되거나, 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체는 표준 방법(예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 효소 부위의 라이게이션, 또는 제한 효소 부위가 전혀 존재하지 않을 경우 블런트(blunt) 말단 라이게이션)으로 발현 벡터 내로 삽입된다. 경우에 따라서, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주세포로부터의 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 프레임에 맞게 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 결합되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 면역글로불린 외 단백질 유래의 신호 펩티드)일 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 지닌다. "조절서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있다. 당업자는 형질전환시킬 숙주세포의 선택, 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 조절 서열을 달리 선택하여, 발현 벡터의 디자인이 달라질 수 있음을 인식할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다. 상기 핵산 또는 상기 벡터는 숙주세포에 형질주입 또는 트랜스펙션(transfection)된다. "형질주입" 또는 "트랜스펙션시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 포유류 세포에의 적용 가능성을 고려하여, 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 숙주세포에서 발현될 수 있다. 상기 항체의 발현에 적합한 포유류 숙주세포는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포(예를 들어 DHFR 선발 가능한 마커와 함께 사용되는 dhfr- CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 또는 SP2 세포 등을 예시할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항체의 제조방법에 관한 것이다. 상기 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주세포 내로 도입될 경우 항체는 숙주세포에서 항체가 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 더 바람직하게는 숙주세포가 배양되는 배양 배지 내로 항체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.

경우에 따라서, 발현된 항체는 숙주세포로부터 분리하여 균일하도록 정제할 수 있다. 상기 항체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 프로틴 A 컬럼, 프로틴 G 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 항-TFPI 항체의 효과를 평가하기 위해서 FXa 활성 측정 시험을 수행하였다(실시예 7). 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 항-TFPI 후보 항체 중 카이메릭 항체인 클론 T308과 클론 T417 항체에서 모두 항체 처리 농도 의존적으로 흡광도가 높아지는 것을 확인함으로써, 두 가지 항체 모두에서 항체 농도에 의존적으로 TFPI를 억제하는 효과가 상승하는 것을 확인하였다. 처리한 TFPI의 양이 10nM임을 감안하여 효과를 비교하였을 때, 클론 T308보다 클론 T417의 TFPI 억제력이 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 상기 시험을 통해 효과가 더 우수한 클론 T417을 이용하여 인간화 과정을 통해 클론 308를 획득하였다. 상기 클론 308 역시 농도 의존적으로 흡광도가 상승하는 결과를 보여주어 TFPI를 억제할 수 있었다.

또한, 도 11에 나타난 바와 같이, 클론 308의 효력을 높이기 위하여 백 돌연변이(back mutation)을 수행하였고, 클론 308-2와 클론 308-4를 획득하였다. 클론 308-2 및 클론 308-4에서 모두 농도 의존적으로 TFPI를 억제함을 알 수 있었다. 그리고 40nM 및 10nM 처리 샘플을 비교하면 클론 308 대비 클론 308-2 및 클론 308-4의 TFPI 억제력이 증가하였음을 알 수 있었다. 40nM 처리 구간에서 클론 308-2와 클론 308-4 각각 양성 대조군(mAb2021, anti-TFPI Ab) 대비 85%, 82%의 TFPI 억제력을 보여주었으나, 10nM 처리 구간에서는 클론 308-2가 72%, 클론 308-4가 78%로써 클론 308-4가 더 우수한 TFPI 억제 효과를 보여주었다. 또한, 77%의 TFPI 억제력을 보이는 클론 T417 카이메릭 항체와 비교 시에도 동등한 수준임을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 항-TFPI 항체의 효과를 평가하기 위해서 TF/FVIIa/FXa 복합체 시험을 수행하였다(실시예 8). 즉, TFPI가 항-TFPI 항체와 함께 또는 독립적으로 있는 상황에서 TF/FVIIa 복합체에 의해 FXa가 생성되고 억제되는 정도를 FXa 활성 정도로 평가하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 항-TFPI 후보 항체 중 카이메릭 항체인 클론 T308과 클론 T417 항체에서 항체 처리 농도 의존적으로 흡광도가 높아지는 것을 확인하여 두 가지 항체 모두 농도 의존적으로 TFPI를 억제하는 효과가 상승함을 확인하였다. 특히 클론 T308보다 클론 T417의 TFPI 억제력이 우수함을 알 수 있었다.

또한, 도 13에 나타난 바와 같이, 클론 T308보다 효과가 더 우수한 클론 T417 항체를 이용하여 인간화 과정을 통해 클론 308을 획득하였다. 클론 308 역시 농도 의존적으로 흡광도가 상승하는 결과를 보여주어 TFPI를 억제함을 알 수 있었다.

또한, 도 14에 나타난 바와 같이, 클론 308 인간화 항체의 효력을 높이기 위하여 백 돌연변이(back mutation)를 수행한 결과, 클론 308 대비 클론 308-2 또는 클론 308-4의 TFPI 억제력이 증가하였고, 25nM 처리 구간에서는 클론 308-2가 37.8%, 클론 308-4가 68.4%로써 클론 308-4가 더 우수한 TFPI 억제 효과를 보여주었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 FXa 활성 측정 시험 TF/FVIIa/FXa 복합체 시험을 통해 선별된 클론 308-2와 클론 308-4에 대하여 트롬빈(Thrombin) 생성량 측정 시험을 수행하였다(실시예 9). 그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 클론 T417 및 클론 308에서 모두 음성 대조군(항체 부재) 대비 트롬빈 생성 피크 및 총 생성량이 증가하였다. 2.5nM 처리 샘플에서 클론 T417과 클론 308은 음성 대조군(항체 부재) 대비 트롬빈 피크값이 각각 208%, 162%로 나타났고, 트롬빈 생성 능력을 나타내는 ETP값은 클론 T417과 클론 308에서 각각 131%, 122%로 나타났다. 따라서, 클론 T417이 클론 308 항체보다 더 효력이 좋음을 확인하였다.

또한, 도 16에 나타난 바와 같이, 클론 308-2 및 클론 308-4에서 모두 클론 308 항체 대비 트롬빈 생성 피크 및 총 생성량이 증가하였다. 특히, 2.5nM 처리 샘플에서 클론 308-2와 클론 308-4에서 모두 음성 대조군(항체 부재) 대비 트롬빈 피크값이 각각 183%, 191% 증가함을 보여주었고, ETP값은 클론 308-2, 클론 308-4에서 모두 126%로써 트롬빈 생성 능력이 향상됨을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 항체를 유효성분으로 포함하는 혈우병 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 치료 유효량의 항-TFPI 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. "제약상(약학적으로) 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다.

상기 담체는 환자를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 다른 담체는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 치료 유효량의 1종 이상의 항-TFPI 항체를 함유할 것이다.

제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.

항-TFPI 항체는 응고에 있어서의 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함을 치료하기 위한 치료 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 TFPI와 FXa의 상호작용을 차단하거나 TF/FVIIa 활성의 TFPI-의존적 억제를 방지하는데 사용될 수 있다. 추가로, 상기 항체는 또한 TF/FVIIa-구동된 FXa의 생성을 복구시켜서 FXa의 FVIII- 또는 FIX-의존적 증폭의 부족을 우회시키는데 사용될 수도 있다.

상기 항체는 지혈 장애, 예컨대 혈소판 감소증, 혈소판 장애 및 출혈 장애(예를 들어, 혈우병 A 및 혈우병 B)의 치료에서 치료 용도를 갖는다. 이러한 장애는 치료 유효량의 항-TFPI 항체를 이러한 장애의 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 치료될 수 있다. 상기 항체는 또한 외상 및 출혈성 졸중과 같은 적응증에서의 제어되지 않는 출혈의 치료에서 치료 용도를 갖는다. 따라서, 치료 유효량의 항-TFPI 항체를 출혈 시간을 단축시킬 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 출혈 시간을 단축시키는 방법을 제공한다.

상기 항체는 지혈 장애를 해결하기 위해 단일요법으로서 또는 다른 요법과 조합되어 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 1종 이상의 항체 및 혈액 응고 인자, 예컨대 TF(Tissue factor), FVII(Factor VII) 또는 FX(Factor X)의 공동 투여는 혈우병 치료에 유용하다고 여겨진다. 상기 항체 및 혈액응고인자의 동시 투여 또는 조합 요법은, 각각 별도로 제제화되거나 하나의 조성물 중에 함께 제제화된 2종의 치료 약물의 투여를 의미하고, 별도로 제제화된 경우에는 대략 동일한 시간에 또는 상이한 시간이지만 동일한 치료 기간에 걸쳐서 투여한다.

제약 조성물은 혈우병 A 또는 B로 고통받는 대상체에게 출혈 에피소드의 중증도에 따라 달라질 수 있거나 예방요법의 경우에는 환자의 혈액 응고 결핍의 중증도에 따라 달라질 수 있는 투여량 및 빈도로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편으로 제시되는 본 발명의 항체의 볼루스 투여는 0.0025 내지 100 mg/kg 체중, 0.025 내지 0.25 mg/kg, 0.010 내지 0.10 mg/kg 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg의 양일 수 있다. 연속 주입의 경우, Fab 단편으로 제시되는 본 발명의 항체는 0.001 내지 100 mg/kg 체중/분, 0.0125 내지 1.25 mg/kg/분, 0.010 내지 0.75 mg/kg/분, 0.010 내지 1.0 mg/kg/분 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg/분으로 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 2시간 내지 12시간, 6시간 내지 12시간, 2시간 내지 8시간, 또는 1시간 내지 2시간의 기간 동안 투여될 수 있다. 전장 항체(완전 불변 영역을 가짐)로 제시되는 본 발명의 항체를 투여하는 경우, 투여량은 약 1 내지 10 mg/kg 체중, 2 내지 8mg/kg, 또는 5 내지 6 mg/kg일 수 있다. 이러한 전장 항체는 전형적으로 30분 내지 35분의 기간 동안 지속되는 주입을 통해 투여한다. 투여 빈도는 상태의 중증도에 따라 달라진다. 빈도는 1주당 3회 내지 매 1주 또는 2주 마다 1회의 범위일 수 있다.

추가로, 조성물은 피하 주사를 통해 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 10 내지 100mg 투여량의 항-TFPI 항체가 매주, 격주 또는 매달 피하 주사를 통해 환자에게 투여할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료 유효량"은 생체 내 혈액 응고 시간을 효과적으로 증가시키거나 또는 필요한 환자에게 생체 내 측정가능한 이점을 야기하는데 요구되는, 항-TFPI 항체 또는 이러한 항체 및 TF(Tissue factor), FVII(Factor VII) 또는 FX(Factor X)의 조합물의 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 조성물의 성분 및 물리적 특징, 의도된 환자 집단, 개개의 환자의 고려사항 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 인자에 따라 달라질 것이고 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.　

본 발명의 약제학적 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경한다.　 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 쥐(rat), 생쥐(mouse), 가축, 인간 등을 포함하는 포유류 내로 전형적으로 허용된 경로, 예를 들면, 경구로, 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 항- TFPI 항체의 제조 방법

Factor X 활성을 저해하는 TFPI(Tissue Factor Pathway Inhibitor)에 대한 항체로, 혈액응고의 차단을 막을 수 있는 혈우병 치료용 항체 또는 예방용 항체를 제작하고자 하였다.

1-1: 항체의 선별

생쥐(mouse)에 재조합 인간 TFPI를 면역(immunization)한 다음 비장(spleen)을 적출하여 B 림프구를 추출하고, 이로부터 토탈 RNA(total RNA)를 분리한 다음 cDNA를 합성하였다. 상기 합성한 cDNA로부터 마우스의 다양한 항체 유전자들을 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 클로닝하였고, 이를 pComb3X phagemid에 삽입하여 다양한 서열의 항체 절편을 디스플레이하는 항체 라이브러리를 제작하였다. 항체 라이브러리로부터 인간 TFPI에 특이적으로 결합하는 항체를 찾기 위해 TFPI가 고정된 마그네틱 비드(magnetic bead)와 항체 라이브러리를 섞어 표적 항원에 결합하는 클론들을 분리하여 배양한 후, 효소면역측정법(ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay)을 통해 표적 항원(인간 TFPI)에 특이적으로 결합하는 클론들(T417 또는 T308 클론 세포)을 개별적으로 확인하고, 염기서열분석을 통해 항체 유전자 서열 및 이에 따른 아미노산 서열을 파악하였다.

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 인간 TFPI에 특이적으로 결합하는 클론 T417과 클론 T308을 선별할 수 있었고, 이들의 아미노산 서열을 확인하였다.

표 2는 표 1의 클론 항체의 CDR 아미노산 서열을 Kabat numbering 기준으로 표기한 것이다.

1-2: T417 및 T308 클론 항체의 IgG 유전자 클로닝

상기 T417과 T308 클론 세포로부터 T417과 T308 클론 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자가 함유된 pComb3X phagemid를 추출한 다음, 이를 주형(template)으로 Accupower Pfu PCR premix(Bioneer)를 이용하여 NotI이 포함된 순방향 프라이머(표 3: 서열번호 17)와 ApaI이 포함된 역방향 프라이머로(표 3: 서열번호 18) PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 10분간 노출 후 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 이후 분리된 유전자를 NotI, ApaI 제한효소로 37℃에서 12시간 이상 반응시킨 다음 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. 인간 이뮤노글로불린 타입 4의 중쇄 불변 영역(IgG4 heavy chain constant region) 유전자가 들어있는 pcIW 플라스미드 벡터도 같은 방법으로 절단하였으며 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S, New England BioLabs(NEB))를 사용하여, 상기 분리된 T417, T308 중쇄 가변 영역 유전자를 인간 중쇄 불변 영역이 들어있는 선형 pcIw 벡터의 Kpn I, ApaⅠ사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(Ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 단일 콜로니스(single colonies)를 골라 배양 후 플라스미드 미니 키트(Cat.No.27405, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 분리하였고, 이를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.

상기 T417과 T308 클론 세포로부터 T417과 T308 클론 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자가 함유된 pComb3X phagemid를 추출한 다음, 이를 주형(template)으로 T417과 T308 클론 항체의 가변 경쇄 영역을 Accupower Pfu PCR premix를 이용하여 NotI이 포함된 순방향 프라이머(표 3: 서열번호 19)와 KpnI이 포함된 역방향 프라이머(표 3: 서열번호 20)로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 10분간 노출 후 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 이후 분리된 유전자를 NotI, KpnI 제한효소로 37℃에서 12시간 이상 반응시킨 다음 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. pcIW 경쇄 영역 플라스미드 벡터도 같은 방법으로 절단하였으며 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S, New England BioLabs(NEB))를 사용하여, 상기 분리된 T417, T308 경쇄 가변 영역 유전자를 인간 경쇄 불변 영역이 들어있는 선형 pcIw 벡터의 Not I, Kpn I 사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(Ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 단일 콜로니스(single colonies)를 골라 배양 후 플라스미드 미니 키트(Cat.No.27405, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 분리하였고, 이를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.

1-3: T417 및 T308 클론 항체의 IgG 생산 및 정제

생쥐 면역반응으로 얻어진 항-TFPI 항체 T417, T308클론을 생산 및 정제 하기 위하여 형질주입(transfection) 하루 전에 Expi293F™ 세포를 2.5 X 10⁶세포/mL 농도로 접종하였다. 24시간 배양(37℃, 8% CO2, 125rpm)후 Expi293™ Expression 배지(Cat.No.A1435101, Gibco)를 첨가하여 세포수 2.5 X 10⁶세포/mL 농도(생존율(viability)≥95%)로 30mL를 준비하였다. 30μg의 DNA(pcIw-anti-TFPI heavy chain: 15μg, pcIw-anti-TFPI light chain: 15μg)를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiProTMSEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco)에 희석하여 상온에서 5분간 반응하였다. ExpiFectamineTM293 시약(Cat.No.A14524, Gibco) 80μL를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiProTMSEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco) 1.5mL에 섞어준 후 상온에서 5분 반응하였다. 5분간 반응 후 각각 희석한 DNA와 ExpiFectamineTM 293 시약 1.5mL을 잘 섞어서 상온에서 20~30분간 반응하였다. DNA와 ExpiFectamineTM 293 시약 혼합액 3mL을 Expi293F™ 세포에 처리하였다. 16~18시간 현탁배양 후(37℃, 8% CO2, 125rpm) ExpiFectamineTM 293 Enhancer1(Cat.No.A14524, Gibco) 150μL와 ExpiFectamineTM 293 Enhancer2(Cat.No.A14524, Gibco) 1.5mL을 첨가하여 5일간 현탁배양하였다. 배양이 끝나면 4000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포 파괴물(cell debris)를 제거한 후 상등액을 0.22μm 필터에 통과시켜 준비하였다. 각 30mL의 배양액 당 프로테인 A 레진(Protein A resin)인 MabSelect Xtra(Cat.No.17-5269-02, GE Healthcare)를 100μL씩 준비하여 1000rpm에서 2분간 원심분리하여 저장 용액을 제거하고, 프로테인 A 바인딩 버퍼(Cat.No.21007, Pierce) 400μL씩 3회 세척하였다. 상기 준비된 배양액에 프로테인 A 레진(protein A resin)을 넣고 실온에서 30분간 회전 반응하였다. Pierce spin column-snap cap(Cat.No.69725, Thermo)에 배양액과 레진(resin) 혼합물을 넣고 QIAvac 24 Plus(Cat.No.19413, QIAGEN) vacuum manifold를 사용하여 컬럼에 레진(resin)만을 남겼다. 프로테인 A 바인딩 버퍼 5mL을 넣어 레진(resin)을 세척한 후, 프로테인 A 용출 버퍼(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009, Pierce) 200μL을 넣고 재현탁(resuspension)하여 실온에서 2분간 반응한 후 1000rpm에서 1분 원심분리하여 용출하였다. 각 용출액(eluate)에는 1.5M Tris-HCl(pH 9.0) 2.5μL를 넣어 중화시켰다. 용출은 4~6회에 걸쳐 진행하며, 각 분획(fraction)은 Nanodrop 200C(Thermo scientific)를 사용하여 정량하였다. 단백질이 검출된 분획(fraction)들은 모아서 Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5mL(Cat.No.0089892, Pierce)을 사용하여 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 버퍼로 완충액을 교환해 준 다음, 환원 및 비환원 조건에서 단백질 전기영동(SDS-PAGE)를 수행하여 최종적으로 농도의 정량 및 항체의 상태를 검증하고, 4℃에 보관하였다

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 양호한 상태로 정제된 T417 및 T308 클론 항체를 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 상에서 확인하였다.

실시예 2: 안정한 뼈대에 CDR -접목( CDR - grafting )을 통한 인간화 항체 구축 방법

상기 T417과 T308 클론 항체에 대한 TFPI 항원(인간 TFPI 단백질 완전체(full-form)(Cat.No.TFPI-875H; Creative Biomart, 미국)의 정량적인 결합력을 평가한 결과, 클론 T417이 가장 우수한 효과를 나타내었다(도 8; 실시예 6 참조). 따라서, 클론 T417을 기반으로 인간화(humanization)를 진행하여 클론 308을 제조하고자 하였다.

생쥐로부터 유래한 클론 T417 항체를 인간화(humanization)하기 위하여 인간화 방법 중 가장 널리 쓰이는 방법인 CDR-접목(CDR-grafting)을 선택하였다. 우선 구조예측 사이트인 swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)에서 50개의 견본들 중 QMEAN, GMQE 및 상동성 값이 종합적으로 가장 높게 나온 견본을 통하여 클론 T417의 구조를 예측하였고, 상기 얻어진 구조 및 kabat과 chothia numbering을 이용하여 항원과 반응하는 CDR과 CDR 이외의 영역인 뼈대(골격)를 설정하였다. 그다음 igblast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 이용하여 가장 높은 상동성을 가지는 인간 뼈대를 검색하였다. 검색 후 얻어진 여러 개의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합 중 인간 생식세포 분석에서 가장 높은 형성율을 나타낸 VH3-21/VK2-30을 선택하였다(de Wildt RM et al ., J. Mol . Biol ., 285:895-901, 1999; mAbs , 5:3, 445-470). 이 후 뼈대 서열이지만 항체 안정성에 영향을 주지 않고, 인간 항체 서열에도 존재하는 클론 T417의 경쇄 가변 영역 K24, L36이 함유된 클론 T417 서열을 포함하고, kabat numbering으로는 CDR서열이지만 구조적으로 뼈대 서열인 중쇄 가변 영역 N35를 포함한 클론 T417의 인간화 항체인 클론 308을 제작하였다(Methods, 34:184-199, 2004; http://www.vbase2.org/)(도 4 및 표 4 참조).

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 클론 T417을 기반으로 인간화(humanization)를 진행하여 클론 308을 제조하였다.

표 5는 표 4의 클론 항체의 CDR 아미노산 서열을 Kabat numbering 기준으로 표기한 것이다.

실시예 3: 인 실리코 모델링( in silico modeling)을 통한 클론 308 돌연변이 항체의 디자인

실시예 2의 클론 308을 TFPI KPI-2(kunitz domain 2)와 인 실리코 모델링을 이용하여 결합구조를 예측하였고, 항원 바인딩을 향상시킬 수 있는 위치를 예측하였다(Heavy chain-52a, -64 및 light chain 27d)(도 5 및 표 6 참조) .

BioLuminate(Schrodinger, 미국) 모듈(module)인 호몰리지 모델링(homology modeling)을 이용하여 TFPI에 결합하는 클론 308의 항체의 구조를 생성하였다. 구조를 생성하기 위해서 주어진 클론 308의 서열을 이용하여 PDB DB(PDB Database)에서 주형 검색(template search)을 한 결과, 구조가 유사하고 composite score가 높은 구조인 3QOS(PDB number) 구조를 선택하였다. 3QOS와 308은 항원 특이적인 구조를 가지는 HV CDR H3 부분을 제외한 나머지 서열이 유사한 것을 확인할 수 있었으며 구조를 생성하기에 적절한 주형(template)임을 알 수 있었다. 총 5개의 클론 308 모델을 생성하여 각 구조를 3QOS의 구조와 비교하였으며 최종적으로 한 개의 가장 유사한 구조를 선택하였다. 선택된 모델은 HV CDR H3 부분을 제외한 나머지 구조가 유사하며, 단백질 간의 결합구조를 예측하는 프로그램인 PIPER를 사용하여 클론 308과 TFPI 구조의 상호작용(interaction)을 예측하였다(도 17: 녹색으로 표현된 분자는 308 클론 항체를, 적색으로 표현된 분자는 TFPI 항원을 나타냄). 이를 통하여 클론 308 항체의 예측되는 파라토프(paratope)와 이와 결합하는 인간 TFPI 항원의 예측되는 에피토프(epitope)를 확인할 수 있었다(표 8). 클론 308의 결합력을 높이기 위하여 예측 구조를 토대로 클론 308의 아미노산 서열에 돌연변이를 도입하였다. 즉 K64를 Q와 E로 바꾸어 TFPI의 R17과 이온결합을 유도하게 하였다.

그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 총 2개의 클론 308의 돌연변이체가 제작되었음을 DNA 시퀀싱을 통해서 확인하였다. 클론 308의 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역과 인간 TFPI 항원 간의 예측 결합구조는 도 18 및 19에 도시하였다.

표 7은 표 6의 클론 항체의 CDR 아미노산 서열을 Kabat numbering 기준으로 표기한 것이다.

표 8은 클론 308 항체의 예측 파라토프(paratope)와 이와 결합하는 인간 TFPI 항원의 예측 에피토프(epitope)를 표기한 것이다.

실시예 4: 클론 308 돌연변이 항체의 제조 방법

4-1: 클론 308 돌연변이 항체의 IgG 유전자 클로닝

합성한 308-2, 308-4 유전자(Bioneer, 한국)를 주형으로 각각 중쇄 가변 영역을 PrimeSTAR HS DNA 중합효소(Cat.No.R010B; Takara)를 사용하여 KpnI이 포함된 순방향 프라이머(표 9: 서열번호 28)와 ApaI이 포함된 역방향 프라이머(표 9: 서열번호 29)로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 98℃에서 2분간 노출 후 98℃에서 10초, 58℃에서 10초, 72℃에서 30초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 5분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트(Cat.No.28704l, QIAGEN)를 이용하여 각각 분리하였다. 이후 분리된 세 종류의 유전자를 KpnI과 ApaI 제한효소로 37℃에서 4시간 반응시켰다. 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. pCIW 플라스미드 벡터도 같은 방법으로 절단하였으며 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S, NEB)를 사용하여, 상기 분리된 유전자를 인간 중쇄 불변 영역이 들어있는 선형 pcIw 벡터의 Kpn I, ApaⅠ사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(Ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 단일 콜로니스(single colonies)를 골라 배양 후 플라스미드 미니 키트(Cat.No.27405, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 분리하였고, 이를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.

4-2: 클론 308 돌연변이 항체의 IgG 의 생산 및 정제

308 돌연변이 항체 308-2, 308-4 클론을 생산 및 정제하기 위하여 형질주입(transfection) 하루 전에 Expi293F™ 세포를 2.5 X 10⁶세포/mL 농도로 접종하였다. 24시간 배양(37℃, 8% CO₂, 125rpm)후 Expi293™ Expression 배지(Cat.No.A1435101, Gibco)를 첨가하여 세포수 2.5 X 10⁶세포/mL 농도(생존율(viability)≥95%)로 30mL를 준비하였다. 30μg의 DNA(pcIw-anti-TFPI heavy chain: 15μg, pcIw-anti-TFPI light chain: 15μg)를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro^TMSEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco)에 희석하여 상온에서 5분간 반응하였다. ExpiFectamine^TM293 시약(Cat.No.A14524, Gibco) 80μL를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro^TMSEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco) 1.5mL에 섞어준 후 상온에서 5분 반응하였다. 5분간 반응 후 각각 희석한 DNA와 ExpiFectamine^TM 293 시약 1.5mL을 잘 섞어서 상온에서 20~30분간 반응하였다. DNA와 ExpiFectamine^TM 293 시약 혼합액 3mL을 Expi293F™ 세포에 처리하였다. 16~18시간 현탁배양 후(37℃, 8% CO₂, 125rpm) ExpiFectamine^TM 293 Enhancer1(Cat.No.A14524, Gibco) 150μL와 ExpiFectamine^TM 293 Enhancer2(Cat.No.A14524, Gibco) 1.5mL을 첨가하여 5일간 현탁배양하였다. 배양이 끝나면 4000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포 파괴물(cell debris)를 제거한 후 상등액을 0.22μm 필터에 통과시켜 준비하였다. 각 30mL의 배양액 당 프로테인 A 레진(Protein A resin)인 MabSelect Xtra(Cat.No.17-5269-02, GE Healthcare)를 100μL씩 준비하여 1000rpm에서 2분간 원심분리하여 저장 용액을 제거하고, 프로테인 A 바인딩 버퍼(Cat.No.21007, Pierce) 400μL씩 3회 세척하였다. 상기 준비된 배양액에 프로테인 A 레진(protein A resin)을 넣고 실온에서 30분간 회전 반응하였다. Pierce spin column-snap cap(Cat.No.69725, Thermo)에 배양액과 레진(resin) 혼합물을 넣고 QIAvac 24 Plus(Cat.No.19413, QIAGEN) vacuum manifold를 사용하여 컬럼에 레진(resin)만을 남겼다. 프로테인 A 바인딩 버퍼 5mL을 넣어 레진(resin)을 세척한 후, 프로테인 A 용출 버퍼(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009, Pierce) 200μL을 넣고 재현탁(resuspension)하여 실온에서 2분간 반응한 후 1000rpm에서 1분 원심분리하여 용출하였다. 각 용출액(eluate)에는 1.5M Tris-HCl(pH 9.0) 2.5μL를 넣어 중화시켰다. 용출은 4~6회에 걸쳐 진행하며, 각 분획(fraction)은 Nanodrop 200C(Thermo scientific)를 사용하여 정량하였다. 단백질이 검출된 분획(fraction)들은 모아서 Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5mL(Cat.No.0089892, Pierce)을 사용하여 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 버퍼로 완충액을 교환해 준 다음, 환원 및 비환원 조건에서 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하여 최종적으로 농도의 정량 및 항체의 상태를 검증하고, 4℃에 보관하였다.

그 결과, 실시예 3의 예측을 기반으로 선정된 항원(인간 TFPI의 재조합 단백질)에 대한 항체의 바인딩을 향상시킬 수 있는 위치에 대해서 클론 308의 아미노산 서열 중 4곳에 돌연변이(mutation)를 각각 또는 조합으로 도입하여 총 18개 클론 항체를 제조하였고(도 5 및 표 4∼표 7: 308, 308-2 및 308-4 클론 항체의 아미노산 서열), 상기 항체들은 양호한 상태로 정제된 것을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 확인하였다(도 6). 이 중 클론 308-2와 클론 308-4는 클론 308의 중쇄 라이신(K: Lysine)이 글루타민(Q: Glutamine) 또는 글루탐산(E: Glutamate)으로 각각 도입된 돌연변이를 가진다.

표 4 및 표 6은 항-TFPI 클론 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

표 5 및 표 7은 표 4 및 표 6의 클론 항체의 CDR 아미노산 서열을 Kabat numbering 기준으로 표기한 것이다.

실시예 5: TFPI KPI -2 제조 방법

5-1: 인간 TFPI KPI -2( Kunitz domain 2), 토끼 KPI -2 및 생쥐 TFPI KPI -2 유전자 클로닝

pET22b 플라스미드 벡터에 인간 TFPI KPI-2(Kunitz domain 2), 토끼 TFPI KPI-2, 생쥐 TFPI KPI-2 유전자(표 10 참조)를 구축하기 위해서 제한효소 사이트 NcoI(Cat.No.R0193S, NEB)과 NotI(Cat.No.R0189S, NEB)을 도입하였으며, 유전자(GeneScript 합성)를 NcoI이 포함된 순방향 프라이머(표 11: 서열번호 33부터 35)와 NotI이 포함된 역방향 프라이머(표 11: 서열번호 36부터 38)로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 조건은 94℃에서 2분간 노출 후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 5분간 반응하였다. 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며, 이를 젤 적출 키트(Cat.No.28704, QIAGEN)를 이용하여 각각 분리하였다. 그다음, 분리된 세 종류의 유전자를 NcoI과 NotI 제한효소로 37℃에서 4시간 반응시켰다. 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. pET22b 플라스미드 벡터도 같은 방법으로 NcoI과 NotI으로 절단하였으며 아가로스 젤 상에서 분리하였다. 준비된 pET22b NcoI/NotI 벡터와 삽입체(insert)를 몰 농도 기준 1:3으로 섞은 후 T4 DNA ligase(Cat.No.M0202S; NEB)와 ligase 버퍼(Cat.No.B0202S; N EB)를 첨가하여 25℃에서 3시간 반응하였다. 라이게인션(Ligation) 반응물 5μL를 DH5α(chemical competent cell; Invitrogen)에 첨가한 후 10분가량 얼음에서 반응시켰다. 히트 쇼크(Heat shock)를 위해 42℃에 1분간 두었으며 세포회수를 위해 SOC 배지를 첨가하여 40분간 37℃에서 현탁배양하였다. 상기 50μL의 형질전환된 DH5α를 카베니실린(carbenicillin) 플레이트에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양하였다. 생성된 콜로니 중 6개를 골라 카베니실린이 포함된 LB 배지에 접종하였으며, 37℃, 220rpm에서 12시간 이상 현탁배양하였다. 플라스미드(plasmid)가 포함된 세포에서 플라스미드 미니 키트(plasmid mini kit, Cat.No.27405, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 분리하였고, 상기 분리된 플라스미드를 DNA 시퀀싱(DNA sequencing)을 통해 확인하였다.

하기 표 10은 동물 타입에 따른 TFPI KPI-2(Kunitz domain 2)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

하기 표 11은 실시예 5의 TFPI KPI-2(Kunitz domain 2) 유전자 클로닝에 사용된 프라이머이다.

5-2: 인간 TFPI KPI -2( Kunitz domain 2), 토끼 TFPI KPI -2 및 생쥐 TFPI KPI-2 단백질 생산 및 정제

TFPI 유전자 서열이 확인된 클론을 BL21(DE3) 박테리아(chemical competent cell; Cat.No.C2527I, NEB)에 형질전환하였다. 인간 TFPI KPI-2(Kunitz domain 2), 토끼 KPI-2, 생쥐 KPI-2 유전자를 각각 상기 박테리아에 첨가한 다음, 10분가량 얼음에서 반응시켰다. 히트 쇼크(Heat shock)로 42℃에서 1분간 두었으며 세포회수를 위해 SOC 배지를 첨가하여 40분간 37℃에서 현탁배양하였다. 50μL 형질전환된 박테리아를 카베니실린(carbenicillin) 플레이트에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양하였다. 생성된 콜로니 중 한 개를 카베니실린이 포함된 LB 배지에 접종하였으며 37℃, 220rpm에서 12시간 이상 현탁배양하였다. 다음날 상기 배양된 박테리아를 500ml SB-포도당 배지에 접종하였으며 37℃, 220rpm에서 2시간 현탁배양하였다. NanoDrop을 이용해 박테리아 배양액의 OD가 0.6이 되었을 때 IPTG를 0.1mM 농도로 첨가하여 인덕션(induction)하였다. 그다음, 25℃, 180rpm에서 12시간 이상 현탁배양하였다. 상기 박테리아는 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 회수하였고, 원형질막공간(periplasm) 영역의 발현된 단백질을 회수하기 위해 냉각해동을 3회 반복한 다음, 다시 원심분리하였다. 상등액을 0.22μm 필터를 이용하여 잔여물을 제거한 다음, 분리정제하였다. 정제 과정에는 Talon metal affinity resin(Cat.No.635501, Clonetech)을 이용하여 수행하였으며, 인산염 완충용액(phosphate buffer)으로 레진(resin)을 안정화시키고 필터한 배양액을 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 세척 과정은 10mM 이미다졸(imidazole)에서, 용리 과정은 250mM 이미다졸에서 실시하였다. 정제된 단백질은 NuPAGE 4~12% Bis-Tris 젤에서 전기영동한 다음, 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색을 통해 분리된 단백질을 확인하였다. 용리된 단백질은 vivaspin(Cat.No.28-9322-18, GE) 컬럼을 통해 PBS(Phosphate-Bufffered Saline) 버퍼로 완충액을 교체하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 양호한 상태로 정제된 동물 타입에 따른 TFPI KPI-2(Kunitz domain 2) 단백질을 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 상에서 확인하였다.

실시예 6: TFPI 항원에 대한 항- TFPI 항체의 정량적인 결합력 측정

정제된 항-TFPI 항체인 클론 T417, 클론 T308, 클론 308, 클론 308-2 또는 클론 308-4의 재조합 인간 TFPI(Recombinant human TFPI)에 대한 정량적인 결합력(친화도(Affinity))을 Biacore T-200(GE Healthcare, 미국) 바이오센서를 이용하여 측정하였다. HEK293 세포로부터 정제된 TFPI(Cat.No.TFPI-875H, Creative Biomart, 미국)를 아민-카르복실 반응을 이용하여 CM5칩(GE Healthcare, 미국)에 200 Rmax가 되도록 고정시킨 다음, HBS-EP 완충용액(10mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% surfactant P20)에 순차적으로 희석한 클론 T417, 클론 T308, 클론 308, 클론 308-2 또는 클론 308-4 항체를 0.078nM～10nM 농도 범위에서 결합(association) 120초, 해리(dissociation) 600초간 유속 30μL/분으로 흘려주었다(표 12). 10mM Glycine-HCl pH1.5를 30초 동안 유속 30μL/분으로 흘려줌으로써 TFPI에 결합된 항체의 해리를 유도하였다. Biacore T-200 evaluation software를 이용하여 친화도를 운동속도상수(K_on 및 K_off)와 평형해리상수(K_D)로 수득하였다.

그 결과, 표 13 및 도 8에 나타난 바와 같이, 상기 제조된 클론 308-2와 클론 308-4의 결합력(친화도)은 클론 308에 비해 매우 우수한 것으로 나타났다.

실시예 7: FXa 활성 측정

혈액응고는 내인성 경로(Intrinsic pathway)와 외인성 경로(Extrinsic pathway)로 유도되며, 두 경로는 공통적으로 FX(Factor X)를 활성화시키는 공통 경로(common pathway)를 통해 트롬빈(Thrombin)을 활성화시켜 최종적으로 피브린(Fibrin)을 형성하여 혈액 응고를 유도한다. 또한, TFPI는 Kunitz 1(K1, KPI-1), Kunitz 2(K2, KPI-2) 및 Kunitz 3(K3, KPI-3) 도메인이라고 불리는 3개의 도메인으로 구성되어 있다. K1 도메인은 FVIIa와 결합하며, K2 도메인은 FXa와 결합하는 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 TFPI와 혈액응고인자의 결합을 통해 혈액응고를 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 항-TFPI 후보 항체들의 혈액응고 과정 전반에 미치는 영향을 확인하기 위해 FXa 활성 정도를 평가하였다. 여러 인자(factor)의 영향을 최소화하기 위해 FXa, TFPI와 후보 항체만으로 시험계를 구성하고, 항-TFPI 후보 항체가 TFPI와 결합하면 FXa의 기능을 억제하지 못함에 따라 FXa 활성이 나타난다. 반면, 후보 항체가 TFPI와 효과적으로 결합하지 못하면 TFPI가 FXa와 결합하여 기능을 저해하므로 발색 정도가 감소하게 된다. 그러므로 TFPI에 의해 활성을 저해 받지 않는 FXa의 잔존 활성을 기질 분해 정도로 측정하게 된다. 이때 사용되는 기질은 FXa 특이적 기질인 S-2765이며, 기질은 분해되어 405nm에서 측정 가능한 발색(chromophoric) pNA를 발생시킨다. 상기 측정방법은 아미돌리틱 어쎄이(amidolytic assay)를 기반으로 한다.

각 FXa, TFPI, mAb2021 및 S-2765 용액을 하기 표 14를 참고하여 어쎄이 버퍼(20mM HEPES, 150mM NaCl, 1mg/mL BSA, 0.02% NaN₃, 5mM CaCl₂, pH7.4)에 희석한 용액을 1.5ml 튜브에 준비하였다.

양성 대조군(mAb2021, anti-TFPI Ab, Novo Nordisk) 또는 항-TFPI 후보 항체들을 40, 10, 2.5 또는 0.625nM이 되도록 각 웰(well)에 50μL씩 넣는다. 40nM의 TFPI 용액을 50μL씩 각 웰에 넣고 30분간 상온에서 놓아둔다. 표준 곡선을 얻기 위해 FXa 용액을 농도 별로 각 웰에 50μL씩 넣고, 2nM의 FXa 용액을 각 웰에 50μL씩 넣은 후 37℃에서 10분간 반응시킨다. 2mM의 S-2765 용액을 50μL씩 각 웰에 넣고, 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 마이크로플레이트 측정기(microplate reader)를 이용하여 405nm 파장에서 엔드포인트 모드(endpoint mode)로 결과 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 항-TFPI 후보 항체 중 카이메릭 항체인 클론 T308과 클론 T417 항체에서 모두 항체 처리 농도 의존적으로 흡광도가 높아지는 것을 확인함으로써, 두 가지 항체 모두에서 항체 농도에 의존적으로 TFPI를 억제하는 효과가 상승하는 것을 확인하였다. 클론 T308의 경우 양성 대조군(mAb2021, anti-TFPI Ab)인 TFPI가 처리되지 않은 샘플 대비 40nM 처리 샘플에서는 TFPI를 91% 억제하는 효과를 보여주었고, 10nM 처리 샘플은 약 64% 억제하는 효과를 보여주었다. 클론 T417의 경우 양성 대조군(mAb2021, anti-TFPI Ab) 샘플 대비 40nM 처리 샘플에서 TFPI를 89% 억제하는 효과를 보여주었고, 10nM 처리 샘플에서는 TFPI를 72% 억제하는 효과를 보여주었다. 처리한 TFPI의 양이 10nM임을 감안하여 효과를 비교하였을 때, 클론 T308보다 클론 T417의 TFPI 억제력이 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 상기 시험을 통해 효과가 더 우수한 클론 T417을 이용하여 인간화 과정을 통해 클론 308를 획득하였다. 상기 클론 308 역시 농도 의존적으로 흡광도가 상승하는 결과를 보여주어 TFPI를 억제할 수 있었다. 클론 308의 경우 양성 대조군(mAb2021, anti-TFPI Ab) 대비 40nM 처리 샘플에서 약 85.1%, 10nM 처리 샘플에서 약 58.2%의 TFPI 억제력을 나타내어 동일한 10nM 처리 샘플에서 78.4%의 억제력을 나타낸 클론 T417 대비 그 효과가 떨어짐을 알 수 있었다.

또한, 도 11에 나타난 바와 같이, 클론 308의 효력을 높이기 위하여 백 돌연변이(back mutation)을 수행하였고, 클론 308-2와 클론 308-4를 획득하였다. 클론 308-2 및 클론 308-4에서 모두 농도 의존적으로 TFPI를 억제함을 알 수 있었다. 그리고 40nM 및 10nM 처리 샘플을 비교하면 클론 308 대비 클론 308-2 및 클론 308-4의 TFPI 억제력이 증가하였음을 알 수 있었다. 40nM 처리 구간에서 클론 308-2와 클론 308-4 모두 양성 대조군(mAb2021, anti-TFPI Ab) 대비 85%, 82%의 TFPI 억제력을 보여주었으나, 10nM 처리 구간에서는 클론 308-2이 72%, 클론 308-4가 78%로써 클론 308-4가 더 우수한 TFPI 억제 효과를 보여주었다. 또한, 77%의 TFPI 억제 력을 보이는 클론 T417 카이메릭 항체와 비교 시에도 동등한 수준임을 확인하였다.

실시예 8: TF / FVIIa / FXa 복합체 측정

혈액 응고의 외인성 기전에서 가장 중요한 인자로는 TF(Tissue factor), FVII(Factor VII), FX(Factor X) 등을 언급할 수 있다. 외부 신호에 의해 TF와 FVIIa가 복합체를 이루면 FX을 FXa로 활성화시키게 된다. 그다음, FXa가 프로트롬빈(Prothrombin)을 트롬빈(Thrombin)으로 활성화시키고 이는 피브리노겐(Fibrinogen)을 피브린(Fibrin)으로 변형시켜 혈액 응고에 작용한다. 하지만, TFPI(Tissue factor pathway inhibitor)는 FXa에 바인딩하여 기능을 억제함으로써 혈액 응고 작용을 방해하는 역할을 한다. 상기 경로 과정에서의 항-TFPI 항체의 효과를 평가하기 위해서 TF/FVIIa/FXa 복합체 시험을 수행하였다. TFPI가 항-TFPI 항체와 함께 또는 독립적으로 있는 상황에서 TF/FVIIa 복합체에 의해 FXa가 생성되고 억제되는 정도를 FXa로 분해되는 기질(S2765)의 발색 정도를 통해 항-TFPI 항체의 효과를 확인하였다. 즉, 항-TFPI 항체가 TFPI를 억제하는 효과가 클수록 FXa의 생성이 많아지고 기질 분해량이 늘어 흡광도가 증가하게 된다.

1.5mL 튜브에 어쎄이 버퍼(20mM HEPES, 150mM NaCl, 1mg/mL BSA, 0.02% NaN₃, 5mM CaCl₂, pH 7.4)를 이용하여 TF(4500L/B, Sekisui diagnostics), FVIIa(Novo Nordisk, Novo Seven) 및 FX(PP008A, Hyphen biomed)을 표 15와 같은 농도가 되도록 혼합용액을 준비하였다.

혼합용액을 96 웰 플레이트(well plate)에 웰 당 70μL씩 분주하였다. 블랭크 웰(blank well)에는 어쎄이 버퍼 70μL를 분주하였다. 37℃에서 15분간 반응시킨 다음, TFPI를 각 웰에 50nM이 되도록 30μL씩 분주하였다. 단, 블랭크 웰과 양성 대조군 웰(항-TFPI 항체 및 TFPI 미처리 샘플)에는 어쎄이 버퍼를 30μL씩 분주하였다. 항-TFPI 항체를 12.5, 25, 50 및 100nM이 되도록 각 웰에 30μL씩 분주하였다. 블랭크 웰, 양성 대조군 웰(항-TFPI 항체 및 TFPI 미처리 샘플), 음성 대조군 웰(항-TFPI 항체 미처리 샘플)에는 어쎄이 버퍼를 30μL씩 분주한 다음, 37℃에서 15분간 반응시켰다. 모든 웰에 EDTA(E7889, Sigma-Aldrich)를 50mM이 되도록 20μL씩 분주하였다. 그다음, 모든 웰에 S2765(Chromogenix, S-2765)를 200μM이 되도록 50μL씩 넣어주고, 마이크로플레이트 측정기(Microplate reader)를 이용하여 37℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 항-TFPI 후보 항체 중 카이메릭 항체인 클론 T308과 클론 T417의 효력을 확인하였다. 두 가지 항체에서 항체 처리 농도 의존적으로 흡광도가 높아지는 것을 확인하여 두 가지 항체 모두 농도 의존적으로 TFPI를 억제하는 효과가 상승함을 확인하였다. 클론 T308의 경우 양성 대조군(항-TFPI 항체 및 TFPI 미처리 샘플) 대비 100nM 처리 샘플에서는 TFPI를 100% 억제하는 효과를 보여주었고, 50nM 처리 샘플은 약 87% 억제하는 효과를 보여주었다. 클론 T417의 경우 양성 대조군(항-TFPI 항체 및 TFPI 미처리 샘플) 대비 100nM 및 50nM 처리 샘플에서 TFPI를 100% 억제하는 효과를 나타내었다. 따라서, 클론 T308보다 클론 T417의 TFPI 억제력이 우수함을 알 수 있었다.

또한, 도 13에 나타난 바와 같이, 클론 T308보다 효과가 더 우수한 클론 T417 항체를 이용하여 인간화 과정을 통해 클론 308을 획득하였다. 클론 308 역시 농도 의존적으로 흡광도가 상승하는 결과를 보여주어 TFPI를 억제함을 알 수 있었다. 클론 308의 경우 양성 대조군(항-TFPI 항체 및 TFPI 미처리 샘플) 대비 100nM 처리 샘플에서 약 94.3%, 50nM 처리 샘플에서 약 54.2%의 TFPI 억제력을 보여주어 100%의 억제력을 보여주는 클론 T417 대비 그 효과가 떨어짐을 알 수 있었다.

또한, 도 14에 나타난 바와 같이, 클론 308 인간화 항체의 효력을 높이기 위하여 백 돌연변이(back mutation)를 수행하였고, 클론 308-2와 클론 308-4를 획득하였다. 클론 308-2 및 클론 308-4에서 모두 농도 의존적으로 TFPI를 억제함을 알 수 있었다. 또한, 50nM 처리 샘플을 비교하면 클론 308 대비 클론 308-2과 클론 308-4의 TFPI 억제력이 증가하였음을 알 수 있었다. 100nM과 50nM 처리 구간에서 클론 308-2과 클론 308-4에서 모두 양성 대조군(항-TFPI 항체 및 TFPI 미처리 샘플) 대비 100%의 TFPI 억제력을 보여주었고, 25nM 처리 구간에서는 클론 308-2이 37.8%, 클론 308-4이 68.4%로써 클론 308-4가 더 우수한 TFPI 억제 효과를 보여주었다. 그러나 상기 백 돌연변이된 항체들은 클론 T417 카이메릭 항체와 비교 시에는 TFPI 억제력이 떨어짐을 알 수 있었다.

실시예 9: 트롬빈 ( Thrombin ) 생성량 측정

혈액 응고 기전은 내인성 경로(Intrinsic pathway)와 외인성 경로(Extrinsic pathway)로 나뉜다. TF(Tissue factor)에 의한 외인성 경로의 가장 중요한 역할은 혈액 응고 기전에서 활성 피드백 역할로써 매우 중요한 트롬빈의 폭발적 생성이며 매우 빠르게 생성되는 것으로 알려져 있다. 이 기전에서 가장 중요한 인자로는 TF, FVII, FX 등을 언급할 수 있다. 외부 신호에 의해 TF와 FVIIa가 복합체를 이루면 FX을 FXa로 활성화시키게 된다. 그다음, FXa가 프로트롬빈(Prothrombin)을 트롬빈(Thrombin)으로 활성화시키고 이는 피브리노겐(Fibrinogen)을 피브린(Fibrin)으로 변형시켜 혈액 응고에 작용한다. 하지만, TFPI는 FXa에 바인딩하여 FXa의 기능을 억제함으로써 혈액 응고 작용을 방해하는 역할을 한다. 트롬빈 생성량 측정 시험은 혈장에 평가하고자 하는 시료를 처리한 후 활성제(PPP 시약, PPP-Reagent Low reagent)가 존재하는 상황에서, 생성되는 트롬빈이 형광기질(fluorogenic substrate)을 형광물질로 변환시킴으로 이를 기반으로 형광물질의 양으로 생성되는 트롬빈의 양을 검증하되, 캘리브레이터(Calibrator)라는 이미 알고 있는 트롬빈의 양으로 보정함으로써 실제 생성되는 양을 측정하는 방식이다.

예열된 96 웰 플레이트(round bottom immulon 2HB 96 well plate)에 샘플 로딩 웰에는 PPP시약 20μL, 캘리브레이터(Calibrator) 웰에는 calibrator 용액 20μL를 넣고, 항-TFPI 후보 항체를 미리 용해된 시료 희석액(FVIII-deficient plasma)으로 0.3125, 0.625, 1.25 또는 2.5nM 농도로 희석하여 준비한 다음, TFPI와 항-TFPI 후보 항체가 결합할 수 있도록 상온에서 10분간 처리하였다.

캘리브레이터(Calibrator)와 블랭크 웰에는 시료 희석액(FVIII-deficient plasma)을, 나머지 웰에는 희석된 검액을 80μL씩 각각 넣는다. Software 화면 하단부의 시작 버턴을 누르면 세척이 먼저 실행된다. 워터 배스(Water bath)에서 37℃로 가온시켜 놓은 증류수에 주입튜브(inlet tube)를 넣고, 배출 튜브(outlet tube)는 빈 용기에 넣어두어 세척을 실시한다. 세척이 끝나면 다음 버턴(next button)을 누르고 엠프티(empty) 과정을 거친다. 37℃로 가온시켜 놓은 FluCa 용액에 주입 튜브를 넣고 프리임(prime)하여 용액을 채운다. 배출 튜브를 디스펜서(dispenser)에 있는 M홀에 장착한 후 다음 버턴을 누르면 각 웰 마다 FluCa 용액이 자동으로 20μL씩 분주된 후 쉐이킹 과정을 거치고 분석이 시작된다.

그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 앞선 Fxa 활성 측정 시험 및 TF/FVIIa/FXa 복합체 시험을 통해 선별된 클론 T417 카이메릭 항체와 클론 308 인간화 항체를 이용하여 트롬빈 생성량 측정 시험을 수행하였다. 시료 희석액만 처리한 블랭크에 비해 2.5nM의 경우 클론 T417은 208%, 클론 308의 경우 162% 높은 트롬빈 피크(thrombin peak) 값을 나타내었다. 또한, 트롬빈의 총 생성량을 나타내는 ETP의 경우에도 음성 대조군(항체 부재) 대비 2.5nM 처리 샘플에서 클론 T417의 경우 131%, 클론 308의 경우 122%로 증가되는 양상을 보였다. 두 항체를 비교하면 클론 T417이 클론 308 항체보다 더 효력이 좋음을 확인하였다.

또한, 도 16에 나타난 바와 같이, 클론 308 인간화 항체의 효력을 높이기 위하여 백 돌연변이(back mutation)을 수행한 다음, FXa 활성 측정 시험 TF/FVIIa/FXa 복합체 시험을 통해 선별된 클론 308-2와 클론 308-4에 대하여 트롬빈 생성량 측정 시험을 수행하였다. 클론 308-2 및 클론 308-4에서 모두 농도 의존적으로 트롬빈 생성량을 증가시킴을 확인하였다. 2.5nM 처리 샘플을 비교하면 클론 308 항체 대비 트롬빈 생성 피크 및 총 생성량이 모두 증가하였음을 알 수 있었다. 2.5nM 처리 샘플에서 클론 308-2와 클론 308-4에서 모두 음성 대조군(항체 부재) 대비 피크값이 각각 183%, 191% 증가함을 보여주었고, ETP값은 클론 308-2, 클론 308-4에서 모두 126%로써 트롬빈 생성 능력이 향상됨을 알 수 있었다. 또한, 두 항체 모두 클론 308 항체보다 월등하며, 클론 T417 카이메릭 항체와 동등한 수준의 트롬빈 생성 능력을 보여 주었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Mogam Biotechnology Institute <120> Novel Antibody Binding to TFPI and Composition Comprising the <130> P14-B324 <160> 39 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone T417_mouse Variable heavy chain <400> 1 Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone T417_mouse Variable light chain <400> 2 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone T308_mouse Variable heavy chain <400> 3 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala 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Ser Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone T308_mouse Variable heavy chain CDR 3 <400> 13 Gln Val Tyr Gly Asn Tyr Glu Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone T308_mouse Variable light chain CDR 1 <400> 14 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone T308_mouse Variable light chain CDR 2 <400> 15 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone T308_mouse Variable light chain CDR 3 <400> 16 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr 1 5 <210> 17 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_T417VH-F <400> 17 gcggccgcca tgtatctggg tctgaactat gtctttatcg tgtttctgct gaatggtgtg 60 cagtctgagg tgcacctggt ggagtct 87 <210> 18 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_T417VH Apa-R <400> 18 nnnngggccc cttggtgctg gctgaggaga cggtgaccgt ggt 43 <210> 19 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_T417 VL-F <400> 19 gcggccgcca tggatagcca ggctcaggtg ctgatgctgc tgctgctgtg ggtgtcaggg 60 acttgcgggg acgttgtgat gacccagact ccact 95 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_VL-R <400> 20 nnnnggtacc agatttcaac tgctcatcag a 31 <210> 21 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 308_humanized Variable heavy chain <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 308_humanized Variable light chain <400> 22 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 308_humanized Variable heavy chain CDR 1 <400> 23 Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 308-2_humanized and mutated Variable heavy chain <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 308-4_humanized and mutated Variable heavy chain <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Asp Gly Asn Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 308-2_humanized and mutated Variable heavy chain CDR 2 <400> 26 Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Gln 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 308-4_humanized and mutated Variable heavy chain CDR 2 <400> 27 Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_VH Fo <400> 28 tgctgtgggt gagtggtacc tgtggggaag tgcagctcgt ggagagcggt 50 <210> 29 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_VH Re <400> 29 agtgggaaca cggagggccc cttggtgctg gcggatgaga cagtcacaag tgtccc 56 <210> 30 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human_TFPI Kunitz domain 2 <400> 30 Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly 1 5 10 15 Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg 20 25 30 Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly 50 55 <210> 31 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbit_TFPI Kunitz domain 2 <400> 31 Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly 1 5 10 15 Phe Met Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Ser Lys Gln Cys Glu Gln 20 25 30 Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Ser Asn Asn Phe Glu Thr Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Arg Asn Thr Cys Glu Asp Pro 50 55 <210> 32 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse_TFPI Kunitz domain 2 <400> 32 Arg Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Leu Cys Arg Gly 1 5 10 15 Tyr Met Lys Arg Tyr Leu Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Thr Leu 35 40 45 Asp Glu Cys Lys Lys Ile Cys Glu Asn Pro 50 55 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_HTK2 For <400> 33 ccatggaaac ccgacttttg cttcctgga 29 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_RTK2 For <400> 34 ccatggaaac ccgatttctg ctttctggag 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_MTK2 For <400> 35 ccatggagac ctgacttctg ctttctggag 30 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_HTK2 Re <400> 36 gcggccgcct agccgtcttc acagatgttc ttg 33 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_RTK2 Re <400> 37 gcggccgcct aggggtcctc acaggtgttg 30 <210> 38 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_MTK2 Re <400> 38 gcggccgcct aggggttctc acagattttc ttgcatt 37 <210> 39 <211> 304 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HUMAN Tissue factor pathway inhibitor <400> 39 Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu 20 25 30 Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys 35 40 45 Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys 50 55 60 Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu 65 70 75 80 Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser 85 90 95 Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile 100 105 110 Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu 115 120 125 Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn 130 135 140 Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly 145 150 155 160 Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu 165 170 175 Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn 180 185 190 Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu 195 200 205 Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly 210 215 220 Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly 225 230 235 240 Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn 245 250 255 Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile 260 265 270 Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys 275 280 285 Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met 290 295 300

Claims (11)

1. 서열번호 39로 표시되는 TFPI(Tissue Factor Pathway Inhibitor)에 특이적으로 결합하는 항체이고,
   다음의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역:
   서열번호 5, 11 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
   서열번호 6, 12, 26 또는 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
   서열번호 7 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및
   다음의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 항체:
   서열번호 8 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
   서열번호 9 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
   서열번호 10 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 서열번호 1, 3, 21, 24 또는 25의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유하는 특징으로 하는 항체.
   
5. 제1항에 있어서, 서열번호 2, 4 또는 22의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 함유하는 특징으로 하는 항체.
   
6. 제1항에 있어서, 서열번호 1, 3, 21, 24 또는 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2, 4 또는 22의 경쇄 가변 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 항체.
   
7. 제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산.
   
8. 제7항의 핵산을 포함하는 벡터.
   
9. 제8항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
   
10. 제9항의 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항체의 제조방법.
    
11. 제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체를 유효성분으로 포함하는 혈우병 치료용 약학 조성물.

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