CN101553504A - Aβ抗体胃肠外制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及淀粉样－β肽(Aβ)的抗体、抗体分子、抗体混合物和/或抗体分子混合物的稳定的胃肠外药物制剂及其制备方法。而且，也描述了相应的应用。

Description

Aβ抗体胃肠外制剂

本发明涉及淀粉样-β肽(Aβ)的抗体、抗体分子、抗体混合物和/或抗体分子混合物的稳定的胃肠外药物制剂及其制备方法。而且，也描述了相应的应用。

第一方面，本发明涉及一种稳定的胃肠外Aβ抗体药物制剂，其包含：

-约1-250mg/mL Aβ抗体；

-约0.001-1％至少一种表面活性剂；

-约1-100mM缓冲剂；

-任选地约10-500mM稳定剂和/或约5-500mM张度剂；

-pH约为4.0-7.0。

具体说，本发明涉及一种Aβ抗体制剂，其中包含的Aβ抗体(或其混合物)能够特异性结合淀粉样-β肽。特异性结合Aβ的抗体是本领域已知的。能够在本发明制剂中使用的Aβ抗体的具体例子已在公开的PCT专利申请WO03/070760中描述，尤其是在权利要求书中描述，该申请的内容被纳入本文作为参考。

淀粉样-β肽也称为“淀粉样β”、“Aβ”、“Aβ4”或“β-A4”以及具体在本发明的内容中被称为“Aβ”，它是与淀粉样形成疾病如阿尔茨海默病有关的胞外神经斑的主要成分，参见Selkoe(1994)，Ann.Rev.Cell Biol.10，373-403，Koo(1999)，PNAS第96卷，第9989-9990页，US 4,666,829或Glenner(1984)，BBRC 12，1131。淀粉样β源自“阿尔茨海默前体蛋白/β-淀粉样前体蛋白”(APP)。APP是整联的膜糖蛋白(参见Sisodia(1992)，PNAS第89卷，第6075页)，Aβ序列被血浆膜蛋白酶α-分泌酶内切蛋白酶水解(参见Sisodia(1992)，同上)。而且，进一步的分泌酶活性，尤其是β-分泌酶和γ-分泌酶活性会导致淀粉样-β(Aβ)的胞外释放，所述淀粉样-β包含39个氨基酸(Aβ39)、40个氨基酸(Aβ40)、42个氨基酸(Aβ42)或43个氨基酸(Aβ43)；参见Sinha(1999)，PNAS96，11094-1053；Price(1998)，Science 282，1078-1083；WO 00/72880或Hardy(1997)，TINS 20，154。

Aβ具有一些天然来源的形式，人形式被称为上文提及的Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43。最突出的形式，即Aβ42，具有以下氨基酸序列(从N-端开始)：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVVIA(SEQ ID NO：3)。在Aβ41、Aβ40、Aβ39中，分别缺失C-端氨基酸A、IA和VIA。在Aβ43-形式中，在上述序列的C-端包含额外的苏氨酸残基(SEQ IDNO：3)。

抗体分子作为蛋白类药物的成员，非常易于发生物理和化学降解，例如变性和聚集、脱酰胺、氧化和水解。蛋白稳定性受到蛋白质本身特征，例如氨基酸序列的影响，还受到外部因素，例如温度、溶剂pH、赋形剂、界面或剪切率的影响。因此，重要的是限定最佳制剂条件以在制造、储存和给药期间保护蛋白质免于降解反应。(Manning，M.C.，K.Patel等，(1989)，“蛋白药物稳定性(Stability of protein pharmaceuticals)”Pharm Res 6(11)：903-18.，Zheng，J.Y.和L.J.Janis(2005)，“pH、缓冲剂种类和储存温度对人源化单克隆抗体LA298的物理化学稳定性的影响(Influence of pH，buffer species，andstorage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonalantibody LA298”，Int_J_Pharm.)。

经皮下或肌内途径给予抗体时，由于常常需要高剂量且给药体积受限，这就要求最终制剂中高的蛋白浓度。(Shire，S.J.，Z.Shahrokh等，(2004)，高蛋白浓度制剂开发中的挑战(Challenges in the development of high proteinconcentration formulations)，J Pharm Sci 93(6)：1390-402.，Roskos，L.K.，C.G.Davis等，(2004)，治疗性单克隆抗体的临床药理学(The clinical pharmacologyof therapeutic monoclonal antibodies)，Drug Development Research 61(3)：108-120)。高浓度蛋白质的大规模制造可通过超滤方法，干燥方法，例如冷冻干燥或喷雾干燥，以及沉淀方法来实现。(Shire，S.J.，Z.Shahrokh等，(2004)，高蛋白浓度制剂开发中的挑战(Challenges in the development of high proteinconcentration formulations)，J Pharm Sci 93(6)：1390-402。)

Andya等(美国专利6,267,958，美国专利6,85,940)揭示了一种稳定的抗体冻干制剂，可用合适的稀释剂体积进行重建以实现所需的浓度。该制剂包含冻干保护剂、缓冲剂和表面活性剂。

Liu等(Liu，J.，M.D.Nguyen等(2005)，可逆自联合增加了水性溶液中浓缩单克隆抗体的粘度(Reversible self-association increases the viscosity of aconcentrated monoclonal antibody in aqueous solution)，J Pharm Sci 94(9)：1928-40.)测试了高浓度抗体制剂的粘度行为。测试了三种由相同IgG1框架构成的单克隆抗体在高蛋白浓度下的自联作用。这三种抗体未显示出一致的粘度-曲线，它们的自联行为存在显著性差异。

本发明的一个目的是提供一种Aβ抗体或这种抗体的混合物的制剂，通过用合适体积重建冻干制剂或者通过超滤方法去除溶剂而将所述制剂浓缩至所需的浓度。该制剂在制造、储存和给药期间显示出充分的稳定性。如Liu等所述，抗体显示不可预测的粘度-浓度曲线。(Liu，J.，M.D.Nguyen等(2005)，可逆自联合增加了水性溶液中浓缩单克隆抗体的粘度(Reversible self-association increases the viscosity of a concentrated monoclonal antibody inaqueous solution)，J Pharm Sci 94(9)：1928-40)。与专利US 6,267,958和US6,685,940相比，本发明制剂在储存期间提供相当于或优于Aβ人抗体的稳定性，并且其粘度适用于皮下或肌内给药途径。

本发明中使用的Aβ抗体的例子是免疫球蛋白分子，例如IgG分子。IgG的特征在于包括两条重链和两条轻链(如图1所示)，该分子包括两个抗原结合位点。所述抗原结合位点包括由部分重链(VH)和部分轻链(VL)构成的“可变区”。抗原结合位点通过VH区和VL区的并置形成。关于抗体分子或免疫球蛋白分子的一般信息也可参见普通的教科书，例如Abbas《细胞与分子免疫学》(“Cellular and Molecular Immunology”)，W.B.圣德斯公司(W.B.SoundersCompany)(2003)。

在一个实施方式中，本发明的胃肠外制剂包含Aβ抗体(或该抗体的混合物)，其中所述抗体重链的至少一个可变区具有N-糖基化。重链可变区(VH)中的糖基化天冬酰胺(Asn)可位于互补决定区2(CDR2区)上，所述糖基化天冬酰胺(Asn)可位于重链可变区(VH)的52位，如SEQ ID NO：1所示。

术语“单糖基化抗体”涉及在单个抗体分子的一个(V_H)-区中具有N-糖基化的一种抗体分子，也参见图1。术语“双-糖基化抗体”限定在重链的两个可变区上都存在N-糖基化的抗体分子(图1)。两个重链(V_H)区上缺少N-糖基化的抗体分子被称为“非糖基化抗体”(图1)。单糖基化抗体、双糖基化抗体和非糖基化抗体可包括相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。

单糖基化抗体和双糖基化抗体在这里称为“糖基化抗体同种型”。纯化的抗体分子的特征在于至少一个抗原结合位点在重链可变区(VH)中具有糖基化，是不含选自双糖基化抗体和非糖基化抗体的同种型或者其含量极低的单糖基化抗体，即“纯化的单糖基化抗体”。本发明内容中的双糖基化抗体不含选自单糖基化抗体和非糖基化抗体的同种型或者其含量极低，即“纯化的双糖基化抗体”。

本发明制剂可包含单糖基化或双糖基化或非糖基化抗体，或者特别限定的它们的混合物。本文提供的抗体混合物或抗体库可包含50％单糖基化和50％双糖基化抗体，如本文所述。但是，也考虑比率30/70到70/30。但本领域技术人员应明白本发明抗体混合物中也考虑其他的比率。例如，本发明内容中也可采用10/90或90/10、20/80或80/20以及40/60或60/40。本发明制剂中包含的抗体混合物的尤其有用的比率包括，上文限定的双糖基化和单糖基化抗体的比率从40/60到45/55。

术语“不含或者含量极低”表示完全不含其他(糖基化)同种型或者其他(糖基化)同种型的浓度最多为10％，例如最多5％，例如最多4％，例如最多3％，例如最多2％，例如最多1％，例如最多0.5％，例如最多0.3％，例如最多0.2％。

本文所用术语“抗体”与术语“抗体分子”同义，在本发明的内容中，包括抗体分子如完整的免疫球蛋白分子，例如IgM、IgD、IgE、IgA或IgG，如IgG1、IgG2、IgG2b、IgG3或IgG4以及这种疫球蛋白分子的一部分，如Fab-片段、Fab’-片段、F(ab)2-片段、嵌合F(ab)2或嵌合Fab’片段、嵌合Fab-片段或分离的VH-或CDR-区(所述分离的VH-或CDR-区整合或工程改造到相应的“框架”中)。因此，术语“抗体”也包括免疫球蛋白已知的同种型和修饰形式，如单链抗体或单链Fv片段(scAB/scFv)或双特异性抗体构建物，所述同种型和修饰形式的特征在于具有本文所限定的至少一个糖基化VH区。这种同种型或修饰形式的一个具体例子可以是VH-VL或VL-VH模式的sc(单链)抗体，其中所述VH具有本文所述的糖基化。也考虑双特异性scFv，例如VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL、VH-VL-VL-VH的模式。术语“抗体”还包括与至少一个抗原结合部分/肽，例如WO 00/24782所述肽抗体相连的具有抗体Fc区作为载体的双抗体和分子。由上述内容可知，本发明也涉及包含抗体/抗体分子“混合物”的Aβ抗体的胃肠外制剂。所述抗体的具体“混合物”如上所述，即针对Aβ的“单”和“双”糖基化抗体的混合物。

“抗体片段”也包括本身不能提供效应功能(ADCC/CDC)，但根据本发明能够在与适当的抗体恒定区组合后以一定方式发挥作用的那些片段。

可包括在本发明制剂中的Aβ抗体包括重组产生的Aβ抗体等。它们可以在哺乳动物细胞培养系统，例如CHO细胞中产生。所述哺乳动物细胞培养系统在制备Aβ抗体或糖基化的Aβ抗体/抗体分子中尤其有用，例如本文所限定的在可变区包括N-糖基化的Aβ抗体。可通过一系列色谱和过滤步骤进一步纯化抗体分子，例如以纯化特定糖基化抗体同种型，如下文所述。

本文所用术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”表示单一氨基酸组成的抗体分子的制剂。因此，术语“人单克隆抗体”表示具有单一结合特异性，具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个实施方式中，通过杂交瘤制备人单克隆抗体，杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获取的B细胞，其基因组包括融合至永生化细胞的人重链转基因和人轻链转基因。

术语“嵌合抗体”表示可变区(即结合区)来自一种来源或物种而恒定区的至少一部分源自另一种来源或物种的，通常通过重组DNA技术制备的单克隆抗体。尤其优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。这种鼠/人嵌合抗体是包括编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其他形式是原始抗体的类或亚类经修饰或改变的形式。这种“嵌合”抗体也称为“类转换抗体”。嵌合抗体的制备方法涉及本领域现已公知的常规重组DNA和基因转染技术。例如，参见Morrison，S.L.等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专利5,202,238和5,204,244。

术语“人源化抗体”表示框架或“互补决定区”(CDR)经修饰包括特异性不同于亲代免疫球蛋白的免疫球蛋白CDR的抗体。在一优选的实施方式中，将鼠CDR嫁接到人抗体的框架区内以制备“人源化抗体”。例如参见Riechmann，L.等，Nature 332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.等，Nature 314(1985)268-270。对于嵌合和双功能抗体，尤其优选的CDR对应于那些识别上述抗原的代表性序列。

本文所用术语“人抗体”表示包括源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。可变重链优选源自种系序列DP-50(GenBank LO6618)，可变轻链优选源自种系序列L6(GenBank X01668)。抗体的恒定区是人IgG1型的恒定区。这些区域可以是同种异型的，例如本文参考的Johnson，G.和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218和其中所述数据库，只要保留了本发明的ADCC诱导特性，优选CDC诱导特性即可使用。

本文所用术语“重组人抗体”表示包括所有通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，例如从宿主细胞，例如SP2-0、NS0或CHO细胞(如CHO K1)或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体，或是采用转染宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有重排的源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。本发明的重组人抗体已经过体内体细胞高度突变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列虽源自人种系VH和VL序列并与其相关，却不是体内人抗体种系库内天然存在的序列。

本文所用术语“结合”表示抗体与Aβ的结合亲和力约为10^-13到10^-8M(K_D)，优选约10^-13到10^-9M。

“恒定区”不直接参与抗体和抗原的结合，但参与效应功能(ADCC、补体结合和CDC)。本发明抗体的恒定区是IgG1型。具有这些特征的人恒定区在Kabat等，免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，公共卫生服务处(Public Health Service)，国家卫生部(National Institutes of Health)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD)，(1991)，和Brüggemann，M.等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love，T.W.等，Methods Enzymol.178(1989)515-527中详细描述。例子在WO 2005/005635的SEQ ID NO：5至8中示出。其他有用且优选的恒定区是从DSMZ或ATCC等保藏单位保藏的杂交瘤细胞系获取的抗体的恒定区。恒定区可提供补体结合。可变区和恒定区的组合提供了ADCC以及任选的CDC。

本文所述“可变区”(轻链(VL)可变区，重链(VH)可变区)表示直接参与抗体抗原结合的每一对轻链和重链。人轻链和重链可变区具有相同的一般结构，每个区域包括四个框架(FR)区，其序列广泛保守，它们由三个“超变区”(或互补决定区，CDR)连接。框架区采取β-片层构象，CDR可形成连接β-片层节结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持其三维结构，与另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。根据本发明，抗体重链和轻链CDR3区在抗体的结合特异性/亲和力中发挥尤其重要的作用，因而提供了本发明的另一个目的。

本文所用术语“超变区”或“抗体的抗原结合部分”表示抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架区”或“FR”是除了本文所限定的超变区残基之外的那些可变区区域。因此，抗体的轻链和重链从N-端到C-端包括区域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。具体说，重链的CDR3是对抗原结合作出最大贡献的区域。根据Kabat等，免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，公共卫生服务处，国家卫生部(NationalInstitutes of Health)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD)，(1991))的标准定义和/或那些来自“超变环”的残基确定CDR和FR区。

本发明制剂可包含“稳定剂”、“冻干保护剂”、“糖”、“氨基酸”、“多元醇”、“抗氧化剂”、“防腐剂”、“表面活性剂”、“缓冲剂”和/或“张度剂”。

术语“稳定剂”表示保护活性药物成分和/或制剂避免在制造、储存和应用期间发生化学和/或物理降解的药学上可接受的赋形剂。蛋白药物的化学和物理降解途径的综述参见Cleland，J.L.，M.F.Powell等(1993)，稳定的蛋白制剂的开发：对蛋白聚集、脱酰胺和氧化作用的研究(The development of stableprotein formulations：a close look at protein aggregation，deamidation，andoxidation)，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4)：307-77，Wang，W.(1999).液体蛋白药物的不稳定性、稳定化作用和制剂(Instability，stabilization，andformulation of liquid protein pharmaceuticals)，Int J Pharm 185(2)：129-88.，Wang，W.(2000)，固体蛋白药物的冻干与开发(Lyophilization and developmentof solid protein pharmaceuticals)，Int J Pharm 203(1-2)：1-60和Chi，E.Y.，S.Krishnan等，(2003)，蛋白质在水性溶液中的物理稳定性：非天然蛋白质聚集的机制和驱动力(Physical stability of proteins in aqueous solution：mechanism anddriving forces in nonnative protein aggregation)，Pharm Res 20(9)：1325-36。稳定剂包括但不限于：糖、氨基酸、多元醇、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂，环糊精如羟丙基-β-环糊精、磺基丁基乙基-β-环糊精、β-环糊精，聚乙二醇如PEG 3000、3350、4000、6000，白蛋白如人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)，盐如氯化钠、氯化镁、氯化钙，螯合剂如EDTA，如下文所定义。如上所述，制剂中稳定剂的含量约为10-500mM，优选约10-300mM，更优选约100-300mM。

术语“冻干保护剂”表示能够在冻干过程、后续的储存和重建期间保护不稳定的活性成分(例如蛋白质)对抗失稳条件的药学上可接受的赋形剂。冻干保护剂包括但不限于：糖、多元醇(例如糖醇)和氨基酸。优选的冻干保护剂可选自下组：糖如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖和棉子糖，神经氨酸和半乳糖胺，氨基糖如葡糖胺、N-甲基葡糖胺(“葡甲胺”)，多元醇(如甘露醇)和氨基酸(如精氨酸)。冻干保护剂通常的用量约为10-500mM，优选约10-300mM，更优选约100-300mM。

本文所用术语“糖”表示药学上可接受的碳水化合物，用量通常约为10-500mM，优选约10-300mM，更优选约100-300mM。合适的糖包括但不限于：海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺(称为“葡甲胺”)、半乳糖胺和神经氨酸。优选的糖是蔗糖和海藻糖，更优选蔗糖。

本文所用术语“氨基酸”在药学胃肠外制剂中表示在相对羧酸基团的α位置上具有氨基部分的药学上可接受的有机分子。氨基酸包括但不限于：精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸以及它们的组合。氨基酸通常的用量约为10-500mM，优选约10-300mM，更优选约100-300mM。

本文所用术语“多元醇”表示具有一个以上羟基的药学上可接受的醇。多元醇的用量约为10-500mM，优选约10-300mM，更优选约100-300mM。合适的多元醇包括但不限于：甘露醇、山梨醇、甘油、葡聚糖、丙三醇、阿拉伯醇、丙二醇、聚乙二醇以及它们的组合。

术语“抗氧化剂”表示能够防止活性药物成分的氧化的药学上可接受的赋形剂。抗氧化剂的用量约为1-100mM，优选约5-50mM，更优选约5-20mM。抗氧化剂包括但不限于：抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸、柠檬酸、EDTA以及它们的组合。

术语“防腐剂”表示能够防止制剂中微生物的生长的药学上可接受的赋形剂。例如，在多剂量制剂中加入防腐剂能够保护制剂对抗微生物污染。防腐剂通常的用量约为0.001-2％(w/v)。防腐剂包括但不限于：乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵以及它们的组合。

本文所用术语“表面活性剂”表示药学上可接受的表面活性剂。在本发明的制剂中，表面活性剂的量以重量/体积百分比(w/v％)表示。合适的药学上可接受的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚(苄泽)、烷基苯基聚氧乙烯醚(曲通-X(Triton-X))、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆、普流罗尼)和十二烷基硫酸钠(SDS)。优选的聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯20(以商品名吐温20^TM销售)和聚山梨酯80(以商品名吐温80^TM销售)。优选的聚乙烯-聚丙烯共聚物是以商品名普流罗尼

F68和泊洛沙姆188^TM销售的共聚物。优选的聚氧乙烯烷基醚是以商品名苄泽^TM销售的物质。优选的烷基酚聚氧乙烯醚是以商品名曲通-X销售的物质。如果使用聚山梨酯20(吐温20^TM)和聚山梨酯80(吐温80^TM)，它们通常的用量约为0.001-1％，优选约0.005-0.1％，更优选约0.01-0.04％w/v。

本文所用术语“缓冲剂”表示能使药物制剂的pH稳定的药学上可接受的赋形剂。合适的缓冲剂是本领域公知的，可参见文献所述。优选的药学上可接受的缓冲剂包括但不限于：组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。甚至更优选的缓冲剂包括L-组氨酸或L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的混合物，用本领域已知的酸或碱进行pH调整。上述组氨酸缓冲剂通常的用量约为1-100mM，优选约5-50mM，甚至更优选约10-20mM。可以不考虑所用缓冲剂，使用本领域已知的酸或碱，例如盐酸、醋酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、氢氧化钠和氢氧化钾将pH调节至约4.0-7.0的值，优选约5.0-6.0，甚至更优选约5.5。

本文所用术语“张度剂”表示药学上可接受的张度剂。张度剂用于调节制剂的张度。制剂可以是低渗、等渗或高渗的。等渗性一般涉及与人血清溶液有关的渗透压。本发明制剂可以是低渗、等渗或高渗的，但优选等渗。为清楚起见，再一次强调的是，等渗制剂是液体或由固体形式(例如由冻干形式)重建的液体，表示与比较的一些其他溶液(例如生理盐水和血清)具有相同张度的溶液。合适的等渗性试剂包括但不限于：氯化钠、氯化钾、甘油和选自氨基酸、糖、尤其是本文所限定的葡萄糖的任意组分以及它们的组合。张度剂的用量约为5-500mM。

本文所用术语“液体”与本发明制剂联用时表示在标准压力下和至少约2-8℃的温度下为液体的制剂。

本文所用术语“冻干”与本发明制剂联用时表示通过本领域已知的冷冻干燥方法制造的制剂。溶剂(例如水)的去除方法包括：冷冻然后真空升华，残余水在升高的温度下解吸。在药学领域，冻干物中残留水分通常约为0.1-5％(w/w)，以粉末或物理稳定的饼状物形式存在。冻干物的特征在于，加入重建介质后快速溶解。

本文所用术语“重建制剂”与本发明制剂联用时表示冻干并通过加入重建介质重新溶解的制剂。重建介质包括但不限于：注射用水(WFI)、注射用抑菌水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨酯20)、pH-缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲溶液)以及它们的组合。

本文所用术语“稳定制剂”与本发明制剂联用时表示在制造、储存和应用过程中保持其物理和化学完整性的制剂。可采用评价蛋白稳定性的各种分析技术，其综述参见Reubsaet，J.L.，J.H.Beijnen等，(1998)，“用于研究蛋白质和肽的降解的分析技术：化学不稳定性”(“Analytical techniques used to studythe degradation of proteins and peptides：chemical instability”)，J Pharm BiomedAnal 17(6-7)：955-78和Wang，W.(1999)，“液体蛋白药物的不稳定性、稳定化作用和制剂(Instability，stabilization，and formulation of liquid proteinpharmaceuticals)，Int J Pharm 185(2)：129-88。稳定性的评价包括在选定的气候条件下储存选定的时间，通过施加机械应力如以选定的振荡频率振荡选定的时间，通过用选定的光强度照射选定的时间，或者通过在选定的温度下重复冻融过程。

本文所用术语“药学上可接受的”与本发明制剂联用时表示符合药品的现有国际标准要求的制剂。药学上可接受的制剂包含通常认为对于预期施用途径和浓度范围而言是安全的赋形剂。此外，还应提供在制造、储存和应用期间足够的稳定性。具体说，用于胃肠外给药途径的制剂应满足与人血组成相匹配的等渗性和中性(euhydric)pH要求。

如上所述，一方面，本发明涉及一种稳定的胃肠外Aβ抗体药物制剂，其包含：

-约1-250mg/mL Aβ抗体；

-约0.001-1％至少一种表面活性剂；

-约1-100mM缓冲剂；

-任选地约10-500mM稳定剂和/或约5-500mM张度剂；

-pH约为4.0-7.0。

Aβ抗体浓度约为1-250mg/mL，优选约50-200mg/mL，更优选约150-200mg/mL。为清楚起见，要强调的是，本文所述的浓度是关于液体或由固体形式精确重建的液体的浓度。因此，本文所述冻干制剂可由冻干物重建，所得重建制剂包含本文所述浓度的各种成分。

然而，本发明技术人员应明白，本文所述稳定的冻干物也可采用一定量的重建介质进行重建，所得重建制剂的浓度更高或更低。例如，本文表2中所述“制剂A”的冻干物可以一定方式重建，所得重建制剂进一步稀释成包含(例如)20mg/mL Aβ抗体、5.3mM L-组氨酸、66.7mM蔗糖和0.011％聚山梨酯20的形式；参见表2的制剂R。

本发明制剂可以是液体形式、冻干形式或由冻干形式重建的液体形式。

在本发明制剂是冻干形式或由冻干形式重建的液体形式的情况下，本发明制剂可包含至少一种冻干保护剂作为稳定剂。

本发明制剂可通过静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)或者药学领域已知的任何其他胃肠外给药途径给药。本发明制剂优选通过皮下方式给药。

本发明制剂可通过本领域已知的方法进行制备，例如超滤-渗滤、透析、添加和混合、冻干、重建以及它们的组合。制备本发明制剂的例子如下所述。

在一个优选的实施方式中，本发明胃肠外药物制剂中包含的Aβ抗体可包括或具有SEQ ID NO：1所限定的可变区：

QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：1)

该序列也在下文中示出，CDR、CH-区、重链区以及两个N-糖基化位点(Asn 52和Asn 306)如下所示：

QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS

WVRQAPGKGLEWVS

RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKV

GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：1)

CDR1、2、3

下划线：CH1

铰链区

CH2

点划线：CH3

N-连接的糖基化位点

包含本文所述SEQ ID NO：1的示例性Aβ抗体也可包含轻链，所述轻链可包含或具有以下氨基酸序列：

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：2)

本文所用术语“Aβ抗体A”涉及包含SEQ ID NO：1限定的重链和SEQ IDNO：2中限定的轻链的示例性的Aβ抗体。

本文所用术语“单糖基化抗体”涉及在免疫球蛋白，例如IgG(如IgG1)的单个抗体分子的一个(VH)-区中具有N-糖基化的一种抗体分子。例如，所述“单糖基化形式”在一个重链可变区上，例如本文所述“Aβ抗体A”的天冬酰胺位置“Asn52”上具有糖基化。这种“单糖基化IgG1-形式或单糖基化同种型”也可以如本文所示，在Fc-部分中高度保守的糖基化位点，例如在本文所述“Aβ抗体A”的非可变Fc-部分中的天冬酰胺Asn306处具有糖基化。

术语“双-糖基化抗体”在本发明中的涵义包括在两个重链(VH)可变区上都存在本文限定的糖基化。同样，这种“双糖基化形式”在两条重链的可变区上，例如在本文所述“Aβ抗体A”的天冬酰胺Asn52位置上具有糖基化。这种“双糖基化IgG1-形式或双糖基化同种型”也可以如本文所示，在非可变/恒定Fc-部分中高度保守的糖基化位点，具体是在所述“Aβ抗体A”的位置306处具有糖基化。附图1显示了相应的抗体分子。

可变区，例如两个重链可变区(两个(VH)区)中缺乏翻译后修饰的抗体，在本发明的内容中被视作“非糖基化修饰”，在重链可变区中不含糖基化。然而，这种“非糖基化形式”也可在抗体恒定区(C-区)中，例如，最常见是在Fc-部分高度保守的糖基化位点上，具体是本文限定的非可变/恒定Fc-部分中的天冬酰胺(Asn)306上具有一个或多个糖基化，也参见SEQ ID NO：1。

本发明胃肠外药物制剂可包含上文限定的示例性的“Aβ抗体A“，如所附实施例中所示。因此，所述包含Aβ抗体A的胃肠外药物制剂可包括如上所述的单糖基化Aβ抗体A或双糖基化Aβ抗体A或非糖基化Aβ抗体A或它们的混合物。

重组表达的Aβ抗体分子的糖基化同种型的纯化可包括以下步骤：

(1)蛋白质A柱纯化；

(2)离子交换柱纯化，例如阳离子交换色谱，以及任选地

(3)大小排阻柱纯化。

纯化过程可进一步包括以下步骤，例如进一步浓缩步骤，例如渗滤或分析步骤，例如涉及分析柱。还考虑可行的是，重复某些特定步骤(例如，可进行两次离子交换色谱步骤)或者省去某些步骤(例如大小排阻色谱)。

蛋白质A是一类结合大多数IgG1同种型的Fc区的组特异性配基。它可通过金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的一些菌株合成，可由其分离并偶联于色谱珠。一些类型的凝胶制剂市售可得。可使用的蛋白质A柱的一个例子是MabSelect(商标)柱。理想地，用25mM Tris/HCl、25mM NaCl、5mMEDTA平衡柱子，将细胞培养物上清液加载到柱子上，用1M Tris/HCl pH 7,2洗柱，在pH 3.2用100mM乙酸洗脱抗体。

阳离子交换色谱法利用固定相中带正电基团与流动相样品之间的相互作用。如果采用弱的阳离子交换剂(例如CM Toyopearl 650

)，则进行以下色谱步骤：用pH 4的100mM乙酸预平衡之后，加载蛋白质A洗脱物，用pH 4的100mM乙酸洗涤，经250mM醋酸钠(pH 7.8-8.5)和500mM醋酸钠(pH 7.8-8.5)的施加步骤洗脱并分离抗体。第一步，通常洗脱双糖基化同种型组分和单糖基化同种型组分的混合物，第二步通常洗脱非糖基化同种型组分。

如果采用强的阳离子交换剂(例如SP Toyopearl 650)，抗体可通过盐步骤洗脱：用pH 5.0的50mM乙酸平衡柱之后，加载蛋白质A洗脱物，在第一洗脱步骤，用pH 4的50mM乙酸和210mM氯化钠进行洗脱。然后在第二洗脱步骤，使用50mM乙酸和350mM氯化钠。通过第一盐步骤，通常洗脱双糖基化同种型组分和单糖基化同种型组分的混合物，通过第二盐步骤通常洗脱非糖基化同种型组分。

此外，抗体也可通过盐梯度从强的阳离子交换柱(例如，SP-琼脂糖

)洗脱：预平衡之后，在pH4.5加载并洗涤柱，施加从50mM MES pH 5.8到50mM MES/1M氯化钠pH 5.8的盐梯度。此时，双糖基化同种型、单糖基化同种型和非糖基化同种型组分通常分别洗脱。然后收集双糖基化同种型组分和单糖基化同种型组分，得到产物库和/或所需的抗体混合物。

双和单糖基化抗体分子(例如免疫球蛋白)的混合物的进一步纯化可通过大小排阻色谱进行。有用的柱子的一个例子是Superdex 200

柱。运行的缓冲液的例子包括组氨酸/氯化钠，例如10mM组氨酸/125mM氯化钠/pH 6和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

流通模式的阴离子交换色谱后接浓缩/渗滤是可选的纯化步骤。Q琼脂糖

是阴离子交换步骤的树脂的一个例子。例如，SP色谱洗脱物可用37,5mMTris/HCl pH 7.9稀释三倍，并通过用25mM Tris/83mM醋酸钠预平衡的Q-琼脂糖柱。收集流出液，调节至pH5.5，例如用Hydrosart 30kD

膜超滤浓缩。然后，例如用10体积的20mM组氨酸/HCl pH 5.5渗滤浓缩物。

如上所述，抗体同种型也可在抗体分子的恒定/非可变部分，例如在IgG的Fc部分，例如在IgG1的Fc部分中具有一个或多个其它的糖基化。所述Fc部分中的糖基化涉及高度保守的糖基化，特征是例如根据本文限定的SEQ IDNO：1位于重链Asn306位置。

本发明制剂中包含的抗体的IgG-Fc区可以是由链间二硫键铰链区、糖基化CH2区域和非共价配对的CH3区域构成的同型二聚体，在CH2的天冬酰胺306(Asn306)处具有N-连接的寡糖。Asn306处糖基化寡糖是复合双触角型，可包含核心七糖结构和可变添加的外臂糖。

寡糖影响或决定Fc结构和功能(Jefferis(1998)Immunol Rev.163，50-76)。已经讨论了效应功能，包括特定特异性IgG-Fc/效应配基相互作用(Jefferis(2002)Immunol Lett.82(1-2)，57-65和Krapp(2003)J Mol Biol.325(5)，979-89)。这种保守的Fc-位置Asn-306对应于Kabat-体系中的“Asn-297”(Kabat(1991)，免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，公共卫生服务处，国家卫生部(NationalInstitutes of Health)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD))。

在某些实施方式中，本发明制剂是包含以下成分的液体或冻干制剂：

-约1-200mg/mL Aβ抗体；

-0.04％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM蔗糖，

-pH 5.5。

在另一个实施方式中，本发明制剂还包括含有以下成分的冻干制剂：

-75mg/mL Aβ抗体，

-0.04％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM蔗糖，

-pH 5.5，

或

-75mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM蔗糖，

-pH 5.5。

在又一个实施方式中，本发明制剂还包括含有以下成分的液体制剂：

-37.5mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-10mM L-组氨酸，

-125mM蔗糖，

-pH 5.5，

或

-37.5mg/mL Aβ抗体，

-0.01％吐温20w/v，

-10mM L-组氨酸，

-125mM蔗糖，

-pH 5.5。

在另一个实施方式中，本发明制剂也包括含有以下成分的冻干制剂：

-15mg/mL Aβ抗体，

-0.04％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM蔗糖，

-pH 5.5。

在另一个实施方式中，本发明制剂还包括含有以下成分的冻干制剂：

-20mg/mL Aβ抗体，

-0.011％吐温20w/v，

-5.3mM L-组氨酸，

-66.7mM蔗糖，

-pH 5.5。

在另一个实施方式中，本发明制剂还包括含有以下成分的液体制剂：

-7.5mg/mL Aβ抗体，

-0.04％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM蔗糖，

-pH 5.5，

或

-7.5mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-10mM L-组氨酸，

-125mM蔗糖，

-pH 5.5。

在另一个实施方式中，本发明制剂还包括含有以下成分的冻干制剂：

-75mg/mL Aβ抗体，

-0.04％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM海藻糖，

-pH 5.5，

或

-75mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM海藻糖，

-pH 5.5。

在另一个实施方式中，本发明制剂还包括含有以下成分的液体制剂：

-37.5mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-10mM L-组氨酸，

-125mM海藻糖，

-pH 5.5，

或

-37.5mg/mL Aβ抗体，

-0.01％吐温20w/v，

-10mM L-组氨酸，

-125mM海藻糖，

-pH 5.5。

在另一个实施方式中，本发明制剂还包括含有以下成分的液体制剂：

-75mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM海藻糖，

-pH 5.5，

或

-75mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM甘露醇，

-pH 5.5，

或

-75mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-140mM氯化钠，

-pH 5.5，

或

-150mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM海藻糖，

-pH 5.5，

或

-150mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM甘露醇，

-pH 5.5，

或

-150mg/mL Aβ抗体，

-0.02％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-140mM氯化钠，

-pH 5.5，

或

-10mg/mL Aβ抗体，

-0.01％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-140mM氯化钠，

-pH 5.5。

在另一个优选的实施方式中，本发明制剂还包括含有以下成分的液体制剂：

-10mg/mL Aβ抗体，

-0.01％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-140mM氯化钠，

-pH 5.5。

在另一个优选的实施方式中，本发明制剂还包括含有以下成分的冻干制剂：

-75mg/mL Aβ抗体，

-0.04％吐温20w/v，

-20mM L-组氨酸，

-250mM蔗糖，

-pH 5.5。

在另一个优选的实施方式中，本发明制剂还包括含有以下成分的冻干制剂：

-20mg/mL Aβ抗体，

-0.011％吐温20w/v，

-5.3mM L-组氨酸，

-66.7mM蔗糖，

-pH 5.5。

附图说明

图1：双、单和非糖基化抗体分子(免疫球蛋白)的示意图。

图2：开始后以及在5℃、25℃/60％相对湿度和40℃/75％相对湿度下孵育最长达6个月后Aβ抗体A制剂经大小排阻色谱确定的单体含量。抗体制剂经冷冻干燥并重建至标称浓度75mg/mL。

图3：开始后以及在5℃、25℃/60％相对湿度和40℃/75％相对湿度下孵育3个月后Aβ抗体A制剂经大小排阻色谱确定的单体含量。抗体制剂K、L和N配制成75mg/mL，而制剂O、P和Q配制成150mg/mL。

实施例

根据本发明用于皮下给药的液体和冻干药物产品制剂的开发过程如下：

液体制剂的制备

根据WO 03/070760所述制备并获得包含SEQ ID NO：1限定的重链和SEQ ID NO：2限定的轻链的Aβ抗体(在本发明内容中是“Aβ抗体A”)，在pH约5.5的20mM组氨酸缓冲液中超滤浓缩至约40-200mg/mL的浓度。然后用制剂缓冲液(含糖(分别是盐或多元醇)、表面活性剂和缓冲剂，pH约为5.5)稀释浓缩溶液，导致在最终总组成(例如10mM L-组氨酸、125mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5)中配制出约7.5mg/mL、37.5mg/mL、75mg/mL或150mg/mL的预期抗体浓度。

或者，用含有预期缓冲剂和糖组合物的渗滤缓冲液对Aβ抗体A进行缓冲剂-交换，并浓缩至等于或高于约37.5mg/mL的最终浓度的抗体浓度。渗滤操作完成后向抗体溶液中加入100-200倍母液形式的表面活性剂。用含有相同的赋形剂组成的制剂缓冲液将浓缩的抗体溶液调节至最终Aβ抗体A浓度约37.5mg/mL。

所有制剂经0.22μm低蛋白结合滤器过滤除菌并在氮气气氛下无菌填装到用ETFE(乙烯和四氟乙烯的共聚物)-涂覆的橡胶塞和梨形夹(alucrimp cap)密封的无菌的6mL玻璃管中。填装体积约为2.4mL。将这些制剂在不同的气候条件下储存不同的时间间隔，通过振荡(5℃，200分钟^-1的振荡频率，一周)和冻融应激方法施以刺激。通过以下分析方法在施加应激测试之前和之后分析样品：1)UV分光光度法，2)大小排阻色谱法(SEC)和3)浊度法来确定溶液的浊度。

冻干制剂和由所述冻干制剂重建的液体制剂的制备

根据上文液体制剂所述来制备约37.5mg/ml”Aβ抗体A”的溶液。本领域已知的任何冻干方法都包括的本发明的范围内。例如，本研究中采用的冻干过程包括将制剂从室温冷却至约5℃(预冷却)和在约1℃/分钟的屏极冷却速率下冷却至-40℃的冷冻步骤，然后在-40℃下保持约2小时的保持步骤。在约-25℃的屏极温度和约80微巴的室压力下进行第一干燥步骤，持续约62小时。接着，第二干燥步骤以0.2℃/分钟的斜率从-25℃变化至25℃，然后是保持步骤，即在约80微巴的室压力下25℃保持至少5小时(所应用的干燥方案如表1所示)。

冻干在Usifroid SMH-90 LN2冷冻干燥机(法国莫亥帕的优弗公司(Usifroid，Maurepas，France))中进行。根据KF法(Karl-Fischer method)测定，本研究中所有冻干饼的残留含水量约0.1-1.0％。将冻干样品在不同温度下孵育不同的时间间隔。

用注射用水(WFI)将冻干制剂重建至最终体积1.2mL，产生抗体浓度约75mg/mL、粘度小于3mPa·s的等渗制剂。冷冻干燥饼的重建时间约为2-4分钟。重建后立即，或者将重建液体样品在25℃孵育24小时之后，分析各重建样品。

样品通过以下方法进行分析：1)UV分光光度法，2)确定重建时间，3)大小排阻色谱法(SEC)和4)浊度法以确定溶液的浊度。

采用大小排阻色谱法(SEC)来检测制剂中的可溶性高分子量物质(聚集体)和低分子量水解产物(LMW)。该方法在配备Tosohaas TSK G3000 SWXL柱的默克日立(Merck Hitachi)7000HPLC装置上进行。采用0.2M K₂HPO₄/0.25MKCL，pH 7.0作为流动相，通过等度洗脱模式来分离完整的单体、聚集体和水解产物，并在280nm波长处检测。

用于检测蛋白质含量的UV分光光度法在Varian Cary Bio紫外分光光度计上以280nm进行。用20mM L-组氨酸，pH 5.5将净蛋白质样品稀释至约0.5mg/mL。根据方程1计算蛋白质浓度。

方程1：

以精密度±10％测定蛋白质浓度。根据320nm处光散射校正280nm处UV吸光度，再乘以稀释因子，稀释因子是通过净样品和稀释缓冲液的称重质量和密度确定的。该数值除以吸收杯路径长度和削光系数ε之积。

根据浊度法测定澄清度和乳光程度，以福尔马肼浊度单位(FormazinTurbidity Unit，FTU)表示。将净样品转移至11mm直径的透明玻璃管中并置于HACH 2100AN比浊计中。

表1：I型冷冻干燥循环

步骤	储存温度(℃)	升温速率(℃/分钟)	保持时间(分钟)	真空设定点(微巴)
					预冷却	5℃	0.0	60	-
冷冻	-40℃	1.0	150	-
					初级干燥	-25℃	0.5	3700	80
二级干燥	+25℃	0.2	300	80

表2本发明“Aβ抗体A”药物产品制剂的组成

(^*)考虑分析精确度和重建的轻微变化

(^*)考虑分析精确度和重建的轻微变化

序列表

<110>豪夫迈-罗氏有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)

<120>Aβ抗体胃肠外制剂

<130>M3327 PCT S3

<150>EP 06 02 5590.8

<151>2006-12-11

<160>3

<170>PatentIn 3.3版

<210>1

<211>456

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>抗体重链

<400>1

Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr

            100                 105                 110

Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

        115                 120                 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

    130                 135                 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145                 150                 155                 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

                165                 170                 175

His Thr Phe Pro Ala VaI Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

            180                 185                 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

        195                 200                 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

    210                 215                 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225                 230                 235                 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

                245                 250                 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

            260                 265                 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

        275                 280                 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

    290                 295                 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305                 310                 315                 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

                325                 330                 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

            340                 345                 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

        355                 360                 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

    370                 375                 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385                 390                 395                 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

                405                 410                 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

            420                 425                 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

        435                 440                 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

    450                 455

<210>2

<211>215

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>抗体轻链

<400>2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

            20                  25                  30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

        35                  40                  45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65                  70                  75                  80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro

                85                  90                  95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

            100                 105                 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

        115                 120                 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

    130                 135                 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145                 150                 155                 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

                165                 170                 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

            180                 185                 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

        195                 200                 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

    210                 215

<210>3

<211>42

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>Aβ

<400>3

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1               5                   10                  15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

            20                  25                  30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

        35                  40

Claims (41)

1.一种稳定的胃肠外Aβ抗体药物制剂，其包含：

约1-250mg/mL Aβ抗体；

约0.001-1％至少一种表面活性剂；

约1-100mM缓冲剂；

任选地约10-500mM稳定剂和/或约5-500mM张度剂；

pH约为4.0-7.0。

2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述制剂是液体制剂。

3.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述制剂是冻干制剂。

4.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述制剂是由冻干制剂重建的液体制剂。

5.如权利要求1-4中任一项所述的制剂，其特征在于，所述Aβ抗体浓度约为1-200mg/mL。

6.如权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述Aβ抗体浓度约为50-200mg/mL。

7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述Aβ抗体浓度约为150-200mg/mL。

8.如权利要求1-7中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂中稳定剂的含量约为10-300mg/mL。

9.如权利要求1-7中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂中稳定剂的含量约为100-300mg/mL。

10.如权利要求1-9中任一项所述的制剂，其特征在于，所述稳定剂选自下组：糖，氨基酸，多元醇，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂，环糊精，具体是羟丙基-β-环糊精、磺基丁基乙基-β-环糊精和β-环糊精，聚乙二醇，具体是PEG 3000、3350、4000和6000，白蛋白，人血清白蛋白(HSA)，牛血清白蛋白(BSA)，盐，具体是氯化钠、氯化镁、氯化钙，以及螯合剂，具体是EDTA。

11.如权利要求1-10中任一项所述的制剂，其特征在于，所述稳定剂是冻干保护剂。

12.如权利要求11所述的制剂，其特征在于，所述冻干保护剂选自下组：糖、氨基酸、多元醇和糖醇。

13.如权利要求12所述的制剂，其特征在于，所述冻干保护剂选自下组：海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺(“葡甲胺”)、半乳糖胺、神经氨酸和精氨酸。

14.如权利要求1-13中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂中表面活性剂的含量约为0.005-0.1％w/v。

15.如权利要求14所述的制剂，其特征在于，所述制剂中表面活性剂的含量约为0.01-0.04％w/v。

16.如权利要求1-15中任一项所述的制剂，其特征在于，所述表面活性剂选自下组：聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和十二烷基硫酸钠。

17.如权利要求16所述的制剂，其特征在于，所述表面活性剂选自下组：聚氧乙烯去水山梨糖醇单月桂酸酯和聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338、泊洛沙姆407、聚氧乙烯(23)十二烷基醚、聚氧乙烯(20)十六烷基醚、聚氧乙烯(10)油基醚和聚氧乙烯(20)油基醚、辛基酚乙氧基化物(octyl phenol ethoxylate)(7.5)、辛基酚乙氧基化物(9.5)和辛基酚乙氧基化物(102)。

18.如权利要求17所述的制剂，其特征在于，所述表面活性剂选自下组：聚氧乙烯去水山梨糖醇单月桂酸酯和聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。

19.如权利要求1-18中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂中缓冲剂的含量约为1-100mM。

20.如权利要求15所述的制剂，其特征在于，所述制剂中缓冲剂的含量约为5-50mM。

21.如权利要求20所述的制剂，其特征在于，所述制剂中缓冲剂的含量约为10-20mM。

22.如权利要求1-21中任一项所述的制剂，其特征在于，所述缓冲剂选自下组：组氨酸-缓冲剂、柠檬酸盐-缓冲剂、琥珀酸盐-缓冲剂、醋酸盐-缓冲剂和磷酸盐-缓冲剂。

23.如权利要求22所述的制剂，其特征在于，所述缓冲剂包括L-组氨酸或L-组氨酸与L-组氨酸盐酸盐的混合物。

24.如权利要求1-23中任一项所述的制剂，其特征在于，pH约为4.0-7.0。

25.如权利要求24所述的制剂，其特征在于，pH约为5.0-6.0。

26.如权利要求25所述的制剂，其特征在于，pH约为5.5。

27.如权利要求1-26中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂包含一种或多种张度剂。

28.如权利要求1-27中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂中张度剂的含量约为5-500mM。

29.如权利要求1-28中任一项所述的制剂，其特征在于，所述张度剂选自下组：氯化钠、氯化钾、甘油、氨基酸、糖以及它们的组合。

30.如权利要求1-29中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂可通过静脉内(iv)或皮下(sc)或任何其他胃肠外途径给药。

31.如权利要求2所述的液体制剂，其包含：

约1-200mg/mL Aβ抗体，

0.04％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM蔗糖，

pH 5.5；

或

37.5mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

10mM L-组氨酸，

125mM蔗糖，

pH 5.5；

或

37.5mg/mL Aβ抗体，

0.01％吐温20w/v，

10mM L-组氨酸，

125mM蔗糖，

pH 5.5；

或

7.5mg/mL Aβ抗体，

0.04％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM蔗糖，

pH 5.5；

或

7.5mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

10mM L-组氨酸，

125mM蔗糖，

pH 5.5；

或

37.5mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

10mM L-组氨酸，

125mM海藻糖，

pH 5.5；

或

37.5mg/mL Aβ抗体，

0.01％吐温20w/v，

10mM L-组氨酸，

125mM海藻糖，

pH 5.5；

或

75mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM海藻糖，

pH 5.5；

或

75mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM甘露醇，

pH 5.5；

或

75mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

140mM氯化钠，

pH 5.5；

或

150mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM海藻糖，

pH 5.5；

或

150mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM甘露醇，

pH 5.5；

或

150mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

140mM氯化钠，

pH 5.5；

或

10mg/mL Aβ抗体，

0.01％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

140mM氯化钠，

pH 5.5。

32.如权利要求3所述的冻干制剂，其包含：

约1-200mg/mL Aβ抗体；

0.04％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM蔗糖，

pH 5.5；

或

75mg/mL Aβ抗体，

0.04％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM蔗糖，

pH 5.5；

或

75mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM蔗糖，

pH 5.5；

或

15mg/mL Aβ抗体，

0.04％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM蔗糖，

pH 5.5；

或

75mg/mL Aβ抗体，

0.04％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM海藻糖，

pH 5.5；

或

75mg/mL Aβ抗体，

0.02％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM海藻糖，

pH 5.5；

或

20mg/mL Aβ抗体，

0.011％吐温20w/v，

5.3mM L-组氨酸，

66.7mM蔗糖，

pH 5.5。

33.如权利要求2或31所述的液体制剂，其包含：

10mg/mL Aβ抗体，

0.01％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

140mM氯化钠，

pH 5.5。

34.如权利要求3或32所述的冻干制剂，其包含：

75mg/mL Aβ抗体，

0.04％吐温20w/v，

20mM L-组氨酸，

250mM蔗糖，

pH 5.5。

35.如权利要求3或32所述的冻干制剂，其包含：

20mg/mL Aβ抗体，

0.011％吐温20w/v，

5.3mM L-组氨酸，

66.7mM蔗糖，

pH 5.5。

36.如权利要求1-35中任一项所述的制剂，其特征在于，所述Aβ抗体中至少一个抗原结合位点在重链可变区(V_H)中包括糖基化天冬酰胺(Asn)。

37.如权利要求1-36中任一项所述的制剂，其特征在于，所述Aβ抗体是以下成分的确定混合物：

(a)Aβ抗体，其中一个抗原结合位点在重链可变区(V_H)中包括糖基化天冬酰胺(Asn)，和

(b)Aβ抗体，其中两个抗原结合位点在重链可变区(V_H)中都包括糖基化天冬酰胺(Asn)，

该混合物不含抗原结合位点在重链可变区(V_H)中不包括糖基化天冬酰胺(Asn)的Aβ抗体或者这种Aβ抗体含量极低。

38.如权利要求36或37所述的制剂，其特征在于，所述重链可变区(V_H)中的糖基化天冬酰胺(Asn)是在重链(V_H)CDR-2区中的糖基化天冬酰胺(Asn)。

39.如权利要求1-38中任一项所述的制剂，其特征在于，所述Aβ抗体包含SEQ ID NO：1限定的重链和SEQ ID NO：2限定的轻链。

40.如权利要求1-39中任一项所述的制剂在制备可用于治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

41.如上所述的本发明。

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