DE60031999T2

DE60031999T2 - Stabilisierte flüssige polypeptid-haltige pharmazeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60031999T2
Application number: DE60031999T
Authority: DE
Inventors: Bao-Lu Emeryville CHEN; Maninder Emeryville HORA
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1999-10-04
Filing date: 2000-10-03
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2020-10-04
Also published as: ES2276698T3; PT1491208E; DE60044213D1; AU2006200141A1; NO20021567D0; IL149008A0; NZ529856A; EP1491208A1; BRPI0017437B8; HU0401975D0; CA2386228A1; IL149008A; HU227347B1; AU2006200141B2; CN1636592A; CZ20021186A3; HUP0203133A2; EP1220682A1; PL354987A1; US20060093598A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Herstellung von flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen, umfassend Interleukin-2 (IL-2) oder Varianten davon, die typischerweise in flüssigen pharmazeutischen Formulierungen instabil sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Jüngste Fortschritte in der Entwicklung der Gentechnik stellten eine breite Vielzahl von biologisch aktiven Polypeptiden in ausreichend großen Mengen zur Verwendung als Arzneimittel bereit. Polypeptide können jedoch die biologische Aktivität infolge von physikalischen Instabilitäten verlieren, einschließlich Denaturierung und Bildung von löslichen und unlöslichen Aggregaten, und einer Vielzahl von chemischen Instabilitäten, wie Hydrolyse, Oxidation und Deamidierung. Die Stabilität von Polypeptiden in flüssigen pharmazeutischen Formulierungen kann beispielsweise durch Faktoren beeinflußt werden, wie pH, Ionenstärke, Temperatur, wiederholte Gefrier-Tau-Kreisläufe und Aussetzen mechanischen Scherkräften, wie sie während des Verarbeitens auftreten. Aggregatbildung und Verlust der biologischen Aktivität können ebenso infolge von physikalischer Bewegung und Interaktionen von Polypeptidmolekülen in Lösung und an der Flüssigkeits-Luft-Grenzfläche innerhalb Speicherphiolen auftreten. Ferner können Konformationsänderungen in Polypeptiden, die an den Luft-Flüssigkeits- und Feststoff-Flüssigkeits-Grenzflächen adsorbiert sind, während Kompression-Extension der Grenzflächen, die aus der Bewegung während des Transports oder anderen resultiert, auftreten. Diese Bewegung ruft hervor, daß das Protein sich verwickelt, aggregiert, Teilchen bildet und schließlich mit anderen adsorbierten Proteinen ausfällt. Für einen allgemeinen Überblick der Stabilität von Proteinphar mazeutika siehe beispielsweise Manning et al. (1989) Pharm. Res. 6: 903–918, und Wang and Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42: S. 14.
Die Instabilität von Polypeptid-enthaltenden, flüssigen, pharmazeutischen Formulierungen veranlaßte das Verpacken dieser Formulierungen in lyophilisierter Form zusammen mit einem geeigneten flüssigen Medium zur Rekonstitution. Obwohl die Lyophilisierung die Lagerung und Stabilität der Zusammensetzung verbessert, zeigen viele Polypeptide verringerte Aktivität, entweder während der Lagerung in dem getrockneten Zustand (Pikal (1990) Biopharm. 27: 26–30) oder infolge von Aggregatbildung oder Verlust der katalytischen Aktivität bei der Rekonstitution als eine flüssige Formulierung (siehe beispielsweise Carpenter et al. (1991) Develop. Biol. Standard 74: 225–239; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169–1206; Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12–20; Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25: 459–470 und Roser (1991) Biopharm. 4: 47–53). EP0229016 offenbart flüssige IL-2-Zusammensetzungen, sie später gefriergetrocknet werden, wobei die Zusammensetzungen Arginin oder Lysin und Weinsäure oder Milchsäure umfassen und einen pH von 7 aufweisen. Jedoch wird das IL-2 einem extremen pH während der Herstellung der IL-2-Zusammensetzungen ausgesetzt, was zur Denaturierung des Polypeptids führen kann, wodurch seine biologische Aktivität beeinflußt wird. US 5,078,997 offenbart gefriergetrocknete und dann rekonstituierte, flüssige Zusammensetzungen von IL-2, umfassend Arginin und einen Citratpuffer. Während die Verwendung von Additiven die Stabilität von getrockneten Proteinen verbessert, weisen viele rehydratisierte Formulierungen weiter inakzeptable oder unerwünschte Mengen an inaktivem, aggregiertem Protein auf (siehe beispielsweise Townsend and DeLuca (1983) J. Pharm. Sci. 80: 63–66; Hora et al. (1992) Pharm. Res. 9: 33–36; Yoshiaka et al. (1993) Pharm. Res, 10: 687–691). Die Notwendigkeit für die Rekonstitution ist ebenso eine Unannehmlichkeit und bringt die Möglichkeit von inkorrekter Dosierung mit sich.
Während eine Vielzahl von flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert worden ist, um die biologische Aktivität von darin enthaltenden Polypetiden zu stabilisieren, erzeugt der Abbau von Polypeptiden in flüssigen Formulierungen weiter Probleme für praktische Ärzte. Folglich besteht der Bedarf an weiteren pharmazeuti schen Zusammensetzungen, umfassend physiologisch verträgliche Stabilisatoren, die die Stabilität von Polypeptidkomponenten fördern, wodurch ihre therapeutische Wirksamkeit erhalten bleibt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, umfassend ein IL-2-Polypeptid als eine therapeutisch wirksame Komponente. Das Verfahren der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert. Die Zusammensetzungen, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt werden, sind stabilisierte flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein IL-2-Polypeptid umfassen, deren Wirksamkeit als eine therapeutisch wirksame Komponente normalerweise während der Lagerung in flüssigen Formulierungen infolge von Aggregation des Polypeptids beeinträchtigt wird. Die stabilisierten flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen zusätzlich zu IL-2, das Aggregatbildung während der Lagerung in einer flüssigen Formulierung zeigt, eine Menge einer Aminosäurebase, die ausreichend ist, die Aggregatbildung des IL-2 während der Lagerung zu verringern, wo die Aminosäurebase eine Aminosäure oder eine Kombination aus Aminosäuren ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Arginin, Lysin, Asparaginsäure und Glutaminsäure. Die Zusammensetzungen umfassen außerdem ein Puffermittel, um den pH der flüssigen Zusammensetzung innerhalb eines akzeptablen Bereiches für die Stabilität des IL-2 zu halten, wo das Puffermittel eine Säure ist, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist.
Die Aminosäurebase dient zur Stabilisierung des IL-2 gegen die Aggregatbildung während der Lagerung der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung, während die Verwendung einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, als Puffermittel zu einer flüssigen Zusammensetzung mit einer Osmolarität führt, die nahezu isotonisch ist. Die flüssige pharmazeutische Zusammensetzung kann außerdem andere Stabilisatoren, insbesondere Methionin, ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, wie Polysorbat 80, und EDTA umfassen, um die Stabilität des Polypeptids weiter zu erhöhen. Diese flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen sollen stabilisiert werden, da die Zugabe der Aminosäurebase in Kombination mit einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, einer Säure in ihrer Salzform oder einem Gemisch aus einer Säure und ihrer Salzform zu Zusammensetzungen mit erhöhter Lagerstabilität in bezug auf die flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen führt, die in Abwesenheit der Kombination von diesen zwei Komponenten formuliert wurden.
Die Verfahren zum Erhöhen der Stabilität von IL-2 in einer flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung und zum Erhöhen der Lagerstabilität einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung werden ebenso bereitgestellt. Die Verfahren umfassen das Einführen einer Menge einer Aminosäurebase, die ausreichend ist, die Aggregatbildung des IL-2 während der Lagerung der Zusammensetzung zu verringern, und eines Puffermittels, wobei das Puffermittel eine Säure ist, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, in die flüssige pharmazeutische Zusammensetzung. Die Verfahren finden bei der Herstellung der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung Verwendung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt den Prozentsatz des restlichen löslichen IL-2 in Stabilitätsproben, gelagert bei 40°C, wie durch RP-HPLC analysiert. Die Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 270 mM Sorbitol oder Saccharose oder Mannitol.
2 zeigt den Prozentsatz des restlichen löslichen IL-2 in Stabilitätsproben, gelagert bei 50°C, wie durch RP-HPLC analysiert. Die Formulierungen enthielten 0,1 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 150 mM verschiedener Aminosäuren, wie in der Figur angegeben.
3 zeigt den Prozentsatz des restlichen löslichen IL-2 in Stabilitätsproben, gelagert bei 40°C, wie durch RP-HPLC analysiert. Die Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 50, 100 oder 270 mM Sorbitol.
4 zeigt den Prozentsatz des restlichen löslichen IL-2 in Stabilitätsproben, gelagert bei 50°C, wie durch RP-HPLC analysiert. Die Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 50, 100 oder 150 mM Arginin.
5 zeigt die Halbwertszeit (t_1/2, in Tagen) des restlichen löslichen IL-2, analysiert durch RP-HPLC als eine Funktion des pH bei 50°C. Die Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM Puffer (Glycin, Natriumacetat, Natriumcitrat, Natriumsuccinat, Natriumphosphat, Natriumborat) und 150 mM NaCl, 270 mM Sorbitol oder 150 mM Arginin.
6 zeigt das Ln-Ln-Diagramm der Halbwertszeit (t_1/2) gegen anfängliche Proteinkonzentration für Stabilitätsproben, gelagert bei 50°C. Die Formulierungen enthielten 0,1, 0,2 oder 0,5 mg/ml IL-2 in 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 150 mM L-Arginin.
7 zeigt den Prozentsatz des restlichen löslichen IL-2, wie durch RP-HPLC analysiert, in Proben, behandelt mit 1, 3 und 5 Gefrier-Tau-Kreisläufen von –70°C bis Umgebungstemperatur. Die Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6, 150 mM Arginin und 0 bis 0,1% Polysorbat 80.
8 zeigt den Prozentsatz des restlichen löslichen IL-2, wie durch RP-HPLC analysiert, in Proben, behandelt mit Versand von Emeryville, Californien, nach St. Louis, Missouri, und von St. Louis zurück nach Emeryville auf Eis. Zwei Formulierungen, enthaltend verschiedene Mengen von Polysorbat 80, wurden verwendet: eine Argininformulierung, enthaltend 0,2 mg/ml IL-2 in 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 150 mM Arginin; und eine NaCl-Formulierung, enthaltend 0,2 mg/ml IL-2 in 10 mM Natriumcitrat bei pH 6,5 und 200 mM NaCl.
9 zeigt die Halbwertszeit (t_1/2, in Tagen) des restlichen löslichen TFPI in vier Formulierungen, analysiert durch IEX-HPLC, als eine Funktion der Argininkonzentration bei 50°C. Alle Formulierungen enthielten 0,15 mg/ml TFPI und entweder L-Argininbase oder L-Arginin-HCl, gepuffert auf pH 5,5, mit entweder Zitronensäure oder 10 mM Zitronensäure und Natriumcitrat. Die spezifischen TFPI-Formulierungen enthielten: (a) 20–150 mM L-Arginin-HCl, 10 mM Zitronensäure und Natriumcitrat als Puffer; (b) 20–150 mM L-Argininbase, titriert mit Zitronensäure; (c) 100–300 mM L-Arginin-HCl, 10 mM Zitronensäure und Natriumcitrat als Puffer; (d) 100–300 mM L-Argininbase, titriert mit Zitronensäure.
10 zeigt die Halbwertszeit (t_1/2, in Tagen) des restlichen löslichen TFPI in vier Formulierungen, analysiert durch IEX-HPLC, als eine Funktion der Argininkonzentration bei 50°C. Alle Formulierungen enthielten 0,15 mg/ml TFPI und entweder L-Argininbase oder L-Arginin-HCl, gepuffert auf pH 5,5 mit entweder Bernsteinsäure oder 10 mM Bernsteinsäure und Natriumsuccinat. Die spezifischen TFPI-Formulierungen enthielten: (a) 20–150 mM L-Arginin-HCl, 10 mM Bernsteinsäure und Natriumsuccinat als Puffer; (b) 20–150 mM L-Argininbase, titriert mit Bernsteinsäure; (c) 100–300 mM L-Arginin-HCl, 10 mM Bernsteinsäure und Natriumsuccinat als Puffer und (d) 100–300 mM L-Argininbase, titriert mit Bernsteinsäure.
11 zeigt die Halbwertszeit (t_1/2, in Tagen) des restlichen löslichen TFPI in vier Formulierungen, analysiert durch IEX-HPLC, als eine Funktion der Argininkonzentration bei 50°C. Alle Formulierungen enthielten 0,15 mg/ml TFPI und L-Argininbase, titriert auf pH 5,5 mit entweder Bernsteinsäure oder Zitronensäure. Die spezifischen TFPI-Formulierungen enthielten: (a) 20–150 mM L-Argininbase, titriert mit Zitronensäure; (b) 20–150 mM L-Argininbase, titriert mit Bernsteinsäure; (c) 100–300 mM L-Argininbase, titriert mit Zitronensäure; (d) 100–300 mM L-Argininbase, titriert mit Bernsteinsäure.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung von flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen, umfassend ein IL-2-Polypeptid als eine therapeutisch wirksame Komponente, und auf Verfahren, die bei ihrer Herstellung nützlich sind, gerichtet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck „flüssig" in bezug auf pharmazeutische Zusammensetzungen oder Formulierungen den Ausdruck „wässerig" umfassen. Der Ausdruck „IL-2 Polypeptid", wie hierin verwendet umfaßt natürlich vorkommende (native), synthetische und rekombinante IL-2-Polypeptide und Proteine und biologisch aktive Varianten davon, wobei die Variante mindestens 70% Sequenzidentität mit dem Polypeptid aufweist, wie anderswo hierin qualifiziert. Unter „therapeutisch wirksame Komponente" ist das IL-2-Polypeptid zu verstehen, das speziell in die Zusammensetzung eingeführt wird, um eine gewünschte therapeutische Reaktion in bezug auf die Behandlung, Vorbeugung oder Diagnose einer Krankheit oder eines Zustandes bei einem Patienten hervorzubringen, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung an diesen Patienten verabreicht wird.
Stärker bevorzugt sind die Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, stabilisierte flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen, deren therapeutisch wirksame Komponenten ein IL-2-Polypeptid umfassen, das normalerweise Aggregatbildung während der Lagerung in flüssigen pharmazeutischen Formulierungen zeigt. Unter „Aggregatbildung" ist eine physikalische Interaktion zwischen den IL-2-Molekülen zu verstehen, die zur Bildung von Oligomeren, die löslich bleiben, oder großen sichtbaren Aggregaten, die aus der Lösung ausfallen, führen. Unter „während der Lagerung" ist zu verstehen, daß eine flüssige pharmazeutische Zusammensetzung oder Formulierung, die einmal hergestellt ist, nicht direkt an einen Patienten verabreicht wird. Direkt nach der Herstellung wird sie zur Lagerung, entweder in einer flüssigen Form, in einem gefrorenen Zustand oder in einer getrockneten Form zur späteren Rekonstitution zu einer flüssigen Form oder anderen Form, die zur Verabreichung an einen Patienten geeignet ist, verpackt. Unter „getrockneter Form" ist zu verstehen, daß die flüssige pharmazeutische Zusammensetzung oder Formulierung entweder durch Gefriertrocknen (d. h., Lyophilisierung; siehe beispielsweise Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48–59), Sprühtrocknen (siehe Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5. Aufl.; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), S. 491–676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169–1206 und Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12–20) oder Lufttrocknen (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25: 459–470; und Roser (1991) Biopharm. 4: 47–53) getrocknet wird. Aggregatbildung durch IL-2-Polypeptid während der Lagerung einer flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung kann die biologische Aktivität des IL-2 nachteilig beeinflussen, was zum Verlust der therapeutischen Wirksamkeit der pharmazeutischen Zusammensetzung führt. Außerdem kann die Aggregatbildung andere Probleme verursachen, wie Blockierung der Rohrleitung, Membranen oder Pumpen, wenn die IL-2-enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung unter Verwendung eines Infusionssystems verabreicht wird.
Die stabilisierten flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, umfassen außerdem eine Menge einer Aminosäurebase, die ausreichend ist, die Aggregatbildung durch das IL-2 Polypeptid während der Lagerung der Zusammensetzung zu verringern. Unter „Aminosäurebase" ist eine Aminosäure oder eine Kombination aus Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Arginin, Lysin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, zu verstehen, wo jede angegebene Aminosäure entweder in ihrer freien Basenform oder in ihrer Salzform vorliegt. Wo eine Kombination aus Aminosäuren verwendet wird, können alle der Aminosäuren in ihren freien Basenformen vorliegen, können alle in ihren Salzformen vorliegen oder können einige in ihren freien Basenformen vorliegen, während andere in ihren Salzformen vorliegen. Aminosäuren zur Verwendung bei der Herstellung der Zusammensetzungen sind die, die eine geladene Seitenkette tragen, wie Arginin, Lysin, Asparaginsäure und Glutaminsäure. Jedes Stereoisomer (d. h., L-, D- oder DL-Isomer) der speziellen Aminosäure oder Kombinationen von diesen Stereoisomeren können in den pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, vorliegen, so lange wie die spezielle Aminosäure entweder in ihrer freien Basenform oder ihrer Salzform vorliegt. Bevorzugt wird das L-Stereoisomer verwendet.
In Kombination mit der Aminosäurebase, wie hierin definiert, umfassen die stabilisierten flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, außerdem eine Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, um den Lösungs-pH zu halten. Eine solche Kombination stellt eine niedrigere Osmolarität der Lösung bereit, als wenn eine Säure und ihre Salzform als Puffermittel in Kombination mit einer Aminosäurebase verwendet werden, um eine stabilisierte pharmazeutische Zusammensetzung zu formulieren. Der Vorteil einer solchen Kombination ist, daß man eine höhere Konzentration des Stabilisators, die Aminosäurebase, in die pharmazeutische Zusammensetzung einführen kann, ohne die Isotonizität der Lösung zu überschreiten. Unter „einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist" ist zu verstehen, daß die Säure als das Puffermittel in der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung in Abwesenheit von jeder ihrer Salzformen vorliegt. Typischerweise, wenn ein Puffer, der eine Säure umfaßt, in einer flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, wird er unter Verwendung einer Salzform der Säure oder einer Kombination der Säure und einer Salzform der Säure hergestellt. Daher wird beispielsweise der Puffer unter Verwendung der Säure mit seinem Gegenion, wie Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Magnesium, hergestellt. Daher besteht ein Succinatpuffer im allgemeinen aus einem Salz von Bernsteinsäure, wie Natriumsuccinat, oder einem Gemisch aus Bernsteinsäure und Natriumsuccinat. Säuren, die zur Verwendung bei der Formulierung der stabilisierten flüssigen IL-2-Polypeptid-enthaltenden Zusammensetzungen geeignet sind, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, umfassen Bernsteinsäure, Zitronensäure, Phosphorsäure, Glutaminsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Essigsäure, Weinsäure und Asparaginsäure, stärker bevorzugt Bernsteinsäure und Zitronensäure, am stärksten bevorzugt Bernsteinsäure, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die flüssigen IL-2-Polypeptid-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, sind „stabilisierte" Zusammensetzungen. Unter „stabilisiert" ist zu verstehen, daß die flüssigen Zusammensetzungen erhöhte Lagerstabilität in bezug auf Zusammensetzungen aufweisen, die in Abwesenheit der Kombination von einer Aminosäurebase und einem Puffermittel, wie hierin offenbart, hergestellt werden. Diese erhöhte Lagerstabilität wird in der flüssigen Formulierung beobachtet, ob direkt in dieser Form zur späteren Verwendung gelagert, in einem gefrorenen Zustand gelagert und vor der Verwendung aufgetaut oder in einer getrockneten Form hergestellt, wie eine lyophilisierte, luftgetrocknete oder sprühgetrocknete Form zur späteren Rekonstitution in eine flüssige Form oder anderen Form vor der Verwendung. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen direkt in ihrer flüssigen Form gelagert, um den vollständigen Vorteil der bequemen erhöhten Lagerstabilität in der flüssigen Form, der leichten Verabreichung ohne Rekonstitution und die Fähigkeit, die Formulierung in vorgefüllte, fertige Spritzen oder als Mehrfachdosierungspräparate zuzuführen, wenn die Formulierung mit Bakteriostatika kompatibel ist, zu nutzen.
Die Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, beziehen sich auf die Entdeckung, daß die Zugabe der Aminosäure Arginin, Lysin, Asparagin säure oder Glutaminsäure in ihrer freien Basenform oder in ihrer Salzform in Kombination mit einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, zu einer flüssigen IL-2-Polypeptid-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung führt, die erhöhte Lagerstabilität in bezug auf eine flüssige IL-2-Polypeptid-enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung aufweist, die ohne die Kombination aus diesen zwei Komponenten hergestellt wird. Die erhöhte Lagerstabilität der Zusammensetzung wird durch den Einfluß der Aminosäure auf die Stabilität des therapeutisch aktiven IL-2-Polypeptids, stärker bevorzugt ihres Einflusses auf IL-2-Polypeptid-Aggregation während der Lagerung in flüssigen Formulierungen erreicht. Außerdem führt die Einführung einer Aminosäurebase, wie hierin definiert, und einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, innerhalb flüssiger IL-2-Polypeptid-enthaltender Formulierungen zu flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die nahezu isotonisch sind, ohne daß sie weitere Isotonisierungsmittel, wie Natriumchlorid, umfassen. Unter „nahezu isotonisch" ist zu verstehen, daß die flüssige Zusammensetzung eine Osmolarität von etwa 240 mmol/kg bis etwa 360 mmol/kg, bevorzugt etwa 240 bis etwa 340 mmol/kg, stärker bevorzugt etwa 250 bis etwa 330 mmol/kg, noch stärker bevorzugt etwa 260 bis etwa 320 mmol/kg, am stärksten bevorzugt etwa 270 bis etwa 310 mmol/kg aufweist.
Die Aminosäurebase, die in die stabilisierten flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, eingeführt wird, schützt das therapeutisch aktive IL-2-Polypeptid gegen Aggregation, wodurch die Stabilität des IL-2-Polypeptids während der Lagerung der Zusammensetzung erhöht wird. Unter „Erhöhung der Stabilität" ist zu verstehen, daß die Aggregatbildung durch das IL-2-Polypeptid während der Lagerung der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung in bezug auf die Aggregatbildung des IL-2-Polypeptids während der Lagerung in Abwesenheit dieses speziellen Stabilisators verringert wird. Die verringerte Aggregatbildung unter Zugabe von Aminosäurebase tritt in einer konzentrationsabhängigen Weise auf. Das heißt, zunehmende Konzentrationen von Aminosäurebase führen zu erhöhter Stabilität eines IL-2-Polypeptids in einer flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung, wenn das Polypeptid normalerweise Aggregatbildung während der Lagerung in einer flüssigen Formulierung in Abwesenheit der Aminosäurebase zeigt. Die Bestimmung der Menge einer speziellen Aminosäurebase, die zu einer flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung zugegeben werden soll, um die Aggregatbildung zu verringern, wodurch die IL-2-Polypeptidstabilität erhöht wird und daher die Lagerstabilität der Zusammensetzung erhöht wird, kann ohne weiteres ohne übermäßige Experimente unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann im allgemeinen bekannt sind, bestimmt werden.
Daher kann beispielsweise die Wirkung der speziellen Aminosäurebase auf IL-2-Polypeptid-Aggregation während der Lagerung in einer flüssigen Zusammensetzung ohne weiteres durch Messen der Veränderung in dem löslichen IL-2-Polypeptid in Lösung über die Zeit hinweg bestimmt werden. Die Menge an löslichem IL-2-Polypeptid in Lösung kann durch eine Vielzahl von analytischen Assays quantitativ bestimmt werden, die an die Detektion des Polypeptids von Interesse angepaßt sind. Diese Assays umfassen beispielsweise Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC), Größenausschluß-HPLC (SEC-HPLC) und UV-Extinktion, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Wo ein IL-2-Polypeptid von Interesse sowohl lösliche als auch nicht lösliche Aggregate während der Lagerung in flüssigen Formulierungen bildet, kann eine Kombination aus RP-HPLC und SEC-HPLC verwendet werden, um zwischen dem Teil des löslichen IL-2-Polypeptids, das als lösliche Aggregate vorliegt, und dem Teil, der in der nichtaggregierten, biologisch aktiven molekularen Form vorliegt, zu unterscheiden, wie in dem nachstehenden Beispiel 1 beschrieben.
Bei der Aggregation würde eine wirksame Menge an Aminosäurebase zur Einführung in eine IL-2-Polypeptid-enthaltende flüssige pharmazeutische Zusammensetzung, um die stabilisierte pharmazeutische Zusammensetzung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhalten, als eine Menge betrachtet, die zur verringerten Aggregatbildung über die Zeit hinweg und daher größerer Retention von löslichem IL-2-Polypeptid in Lösung in seiner nichtaggregierten, biologisch aktiven molekularen Form führt. Daher würde, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, eine wirksame Menge an Stabilisator zur Verwendung bei der Herstellung einer stabilisierten Zusammensetzung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Menge sein, die zu größerer Retention von IL-2 in seiner monomeren molekularen Form führt.
Die erhöhte Lagerstabilität der stabilisierten flüssigen IL-2-Polypeptid-enthaltenden Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, kann ebenso mit den inhibierenden Wirkungen der Aminosäurebase auf die Desamidierung von Glutamin- und/oder Asparaginresten innerhalb des therapeutisch aktiven Polypeptids während der Lagerung verbunden sein. Die Wirkung einer speziellen Aminosäurebase auf die Desamidierung von diesen Resten während der Lagerung in einer flüssigen Zusammensetzung kann ohne weiteres durch Beobachten der Menge von vorhandenem IL-2-Polypeptid in seiner desamidierten Form über die Zeit hinweg bestimmt werden. Verfahren zum Messen der molekularen Spezies, d. h., nativ oder desamidiert, eines speziellen IL-2-Polypeptids, das in der Lösungsphase vorliegt, sind im allgemeinen in der Technik bekannt. Diese Verfahren umfassen die chromatographische Trennung der molekularen Spezies und Identifikation unter Verwendung von Polypeptid-Molekulargewichtsstandards, wie mit RP-HPLC, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
Die Verwendung der Kombination einer Aminosäurebase, gepuffert durch eine Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, um die IL-2-Polypeptidstabilität innerhalb der stabilisierten flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, zu erhöhen, stellt Vorteile gegenüber beispielsweise der Verwendung einer Aminosäure in einem Bernsteinsäure/Natriumsuccinat-Puffersystem bereit. Diese neue Kombination erlaubt die Herstellung von nahezu isotonischen Formulierungen mit höheren Konzentrationen der stabilisierenden Aminosäure, als sie unter Verwendung eines Puffersystems erreicht werden können, das ein Gemisch aus einer Säure und ihrer Salzform ist. Die höhere Konzentration der stabilisierenden Aminosäure ermöglicht sogar stärkere Erhöhungen der Polypeptidstabilität und erhöht daher die Lagerstabilität der Formulierung.
Beispielsweise kann, wenn Bernsteinsäure verwendet wird, um die Argininbase zu puffern, die zu einer flüssigen Formulierung zugegeben werden soll, die das Protein Interleukin-2 (IL-2) umfaßt und einen pH aufweist, der für das Protein optimal ist (pH 5,8), die Konzentration von Arginin auf 230 mM erhöht werden, während die Isotonizität der Formulierung noch gehalten wird. Dies führt zu einer Dopplung der IL-2-Lagerdauer bei 50°C, die ein Maß für die Proteinstabilität ist. Obwohl eine ähnliche IL-2-Lagerdauer unter Verwendung derselben Argininkonzentration und Bernsteinsäure/Natriumsuccinat als Puffermittel verwendet werden kann, muß Arginin in seiner sauren Form zugegeben werden, um einen ähnlichen pH zu erreichen, und die resultierende Formulierung ist hypertonisch (siehe Beispiel 1, Tabelle 1).
Die Fähigkeit zur Verwendung höherer Konzentrationen einer Aminosäure als der primäre Stabilisator beseitigt die Notwendigkeit für traditionellere Polypeptidstabilisatoren, wie Rinderserumalbumin oder menschliches Serumalbumin, die aufgrund der potentiellen viralen Kontamination weniger wünschenswerte Stabilisatoren sind.
Außerdem ist die Isotonizität von flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen wünschenswert, da sie zu verringertem Schmerz bei der Verabreichung führt und mögliche hämolytische Wirkungen, die mit hypertonischen oder hypotonischen Zusammensetzungen verbunden sind, minimiert. Daher weisen die stabilisierten Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, nicht nur erhöhte Lagerstabilität auf, sondern ebenso den hinzukommenden Vorteil des wesentlich verringerten Schmerzes bei der Verabreichung im Vergleich zu Formulierungen unter Verwendung anderer traditioneller Puffersysteme, die aus einer Säure und einer Salzform der Säure bestehen. Beispielsweise zeigt die stabilisierte flüssige pharmazeutische Zusammensetzung, wenn sie injiziert wird, verringerten Schmerz, der mit Brennen und Stechen in bezug auf die Injektion von normaler Kochsalzlösung verbunden ist (siehe Beispiel 7).
Mit der Identifizierung der Vorteile der Herstellung flüssiger IL-2-Polypeptid-Zusammensetzungen gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren mit einer Aminosäurebase als der primäre Stabilisator und einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, als das Puffermittel, liegt es an der Fähigkeit des Fachmanns, ohne übermäßige Exprimente bevorzugte Konzentrationen von jeder dieser Komponenten zu bestimmen, die in eine flüssige pharmazeutische Zusammensetzung eingeführt werden sollen, welche ein therapeutisch aktives Polypeptid von Interesse umfaßt, das Aggregatbildung zeigt, wie hierin beschrieben, um die erhöhte IL-2-Polypeptidstabilität während der Lagerung der Zusammensetzung zu erreichen. Gemäß den Protokollen, die beispielsweise in dem nachstehenden Beispiel 1 offenbart sind, kann der Fachmann einen Bereich an gewünschten Konzentrationen der Aminosäurebase und der verschiedenen Puffersäuren zur Verwendung in den hierin beschriebenen flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen analysieren. Bevorzugt liegt die Menge an Aminosäurebase, eingeführt in die Zusammensetzung, innerhalb eines Konzentrationsbereiches von etwa 100 mM bis etwa 400 mM, bevorzugt etwa 130 mM bis etwa 375 mM, stärker bevorzugt etwa 150 mM bis etwa 350 mM, noch stärker bevorzugt etwa 175 mM bis etwa 325 mM, noch stärker bevorzugt etwa 180 mM bis etwa 300 mM, noch stärker bevorzugt etwa 190 mM bis etwa 280 mM, am stärksten bevorzugt etwa 200 mM bis etwa 260 mM, in Abhängigkeit des Proteins, das in der Zusammensetzung vorliegt. Obwohl das Puffermittel die Säure in ihrer Salzform oder ein Gemisch der Säure und ihrer Salzform sein kann, ist das Puffermittel bevorzugt die Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, aus den hierin offenbarten vorteilhaften Gründen. Die Säure, die als das Puffermittel verwendet wird, wird bevorzugt innerhalb eines Konzentrationsbereiches von etwa 40 mM bis etwa 250 mM, etwa 50 mM bis etwa 240 mM, etwa 60 mM bis etwa 230 mM, etwa 70 mM bis etwa 220 mM, stärker bevorzugt etwa 80 mM bis etwa 210 mM, am stärksten bevorzugt etwa 90 mM bis etwa 200 mM, in Abhängigkeit der Säure, die als Puffermittel verwendet wird, und des pH-Optimums für das IL-2-Polypeptid, das gegen Aggregatbildung stabilisiert wird, zugegeben.
In einer Ausführungsform ist die Aminosäurebase Argininbase, die bei einer Konzentration von etwa 230 mM vorliegt, und die Säure, die als das Puffermittel verwendet wird, ist Bernsteinsäure bei einer Konzentration von etwa 128 mM. Dies ermöglicht die Herstellung einer flüssigen Polypeptid-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Osmolarität, die nahezu isotonisch ist, und einem pH von etwa 5,8. In einer anderen Ausführungsform ist die Aminosäurebase Argininbase, die bei einer Konzentration von etwa 300 mM vorliegt, und die Säure, die als das Puffermittel verwendet wird, ist Zitronensäure bei einer Konzentration von etwa 120 mM. Dies ermöglicht die Herstellung einer flüssigen IL-2-Polypeptid-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Osmolarität, die nahezu isotonisch ist, und einem pH von etwa 5,5. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Aminosäurebase Argininbase, die bei einer Konzentration von etwa 200 mM bis etwa 300 mM vorliegt, und die Säure, die als das Puffermittel verwendet wird, ist Bernsteinsäure bei einer Konzentration von etwa 120 mM bis etwa 180 mM. Dies ermöglicht die Herstellung einer flüssigen Polypeptid-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer Osmolarität von etwa 256 mmol/kg bis etwa 363 mmol/kg und einem pH von etwa 5,5.
Daher umfaßt in einer anderen Ausführungsform der Erfindung die stabilisierte flüssige pharmazeutische Zusammensetzung Argininbase bei einer Konzentration von etwa 150 mM bis etwa 350 mM, und Bernsteinsäure bei einer Konzentration von etwa 80 mM bis etwa 190 mM. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Argininbase in der flüssigen pharmazeutischen IL-2-Zusammensetzung bei einer Konzentration von etwa 230 mM vor und Bernsteinsäure liegt bei einer Konzentration von etwa 128 mM vor. Diese bevorzugte IL-2-Zusammensetzung weist einen pH von etwa 5,8 und eine Osmolarität von etwa 250 mmol/kg bis etwa 330 mmol/kg auf. Die Konzentration von IL-2 oder einer Variante davon in diesen Zusammensetzungen beträgt etwa 0,01 mg/ml bis etwa 2,0 mg/ml, bevorzugt etwa 0,02 mg/ml bis etwa 1,0 mg/ml, stärker bevorzugt etwa 0,03 mg/ml bis etwa 0,8 mg/ml, am stärksten bevorzugt etwa 0,03 mg/ml bis etwa 0,5 mg/ml.
Wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt, beeinflußt der pH einer flüssigen IL-2-Polypeptid-enthaltenden pharmazeutischen Formulierung die Stabilität des darin enthaltenden Polypeptids, in erste Linie wirkt es sich auf die IL-2-Polypeptid-Aggregatbildung aus. Daher wird die Menge an Puffersäure, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, vorliegt, in Abhängigkeit des pH variieren, der für die Stabilität eines speziellen IL-2-Polypeptids von Interesse optimal ist. Die Bestimmung dieses pH-Optimums kann unter Verwendung von Verfahren, die im allgemeinen in der Technik verfügbar sind und weiterhin in den hierein beschriebenen Beispielen dargestellt sind, erreicht werden. Bevorzugte pH-Bereiche für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen betragen etwa pH 4,0 bis etwa pH 9,0, stärker bevorzugt etwa pH 5,0 bis etwa 6,5, in Abhängigkeit des Polypeptids. Daher beträgt in einer Ausführungsform der pH etwa 5,8.
Die stabilisierten pharmazeutischen Zusammensetzungen, die eine Aminosäurebase umfassen, gepuffert mit einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, können ebenso zusätzliche Stabilisatoren umfassen, die die Stabilität eines therapeutisch aktiven IL-2-Polypeptids darin weiter verbessern. Stabilisatoren von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung umfassen Methionin und EDTA, die das IL-2-Polypeptid gegen die Methioninoxidation schützen; und ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, das das IL-2-Polypeptid gegen die Aggregation schützt, das mit dem Gefrier-Tauen oder mechanischer Scherung verbunden ist, sind aber nicht darauf beschränkt.
In dieser Weise kann das Aminosäuremethionin zugegeben werden, um die Oxidation von Methioninresten zu Methioninsulfoxid zu inhibieren, wenn das IL-2-Polypeptid, das als das Therapeutikum fungiert, ein IL-2-Polypeptid ist, das mindestens einen Methioninrest umfaßt, der für diese Oxidation anfällig ist. Unter „inhibieren" ist die minimale Akkumulation der Methionin-oxidierten Spezies über die Zeit hinweg zu verstehen. Die inhibierende Methioninoxidation führt zu größerer Retention des IL-2-Polypeptids in seiner richtigen molekularen Form. Jedes Stereoisomer von Methionin (L-, D- oder DL-Isomer) oder Kombinationen davon können verwendet werden. Die Menge, die zugegeben werden soll, sollte eine Menge sein, die ausreichend ist, um die Oxidation der Methioninreste zu inhibieren, so daß die Menge an Methioninsulfoxid für Überwachungseinrichtungen akzeptabel ist. Typischerweise bedeutet dies, daß die Zusammensetzung nicht mehr als etwa 10% bis etwa 30% Methioninsulfoxid enthält. Im allgemeinen kann dies durch Zugeben von Methionin erreicht werden, so daß das Verhältnis von zugegebenem Methionin zu Methioninresten in Bereichen von etwa 1 : 1 bis etwa 1000 : 1, am stärksten bevorzugt 10 : 1 bis etwa 100 : 1 liegt.
Die bevorzugte Menge an Methionin, die zugegeben werden soll, kann ohne weiteres empirisch durch Herstellen der Zusammensetzung, die das IL-2-Polypeptid von Interesse mit unterschiedlichen Konzentrationen an Methionin umfaßt, und Bestimmen der relativen Wirkung auf die Bildung von oxidativen Spezies des Polypeptids unter Verwendung von beispielsweise chromatographischer Trennung der molekularen Spezies und Identifikation unter Verwendung von Polypeptid-Molekulargewichtsstandards, wie mit RP-HPLC, wie im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben, bestimmt werden. Diese Konzentration an Methionin, das die Inhibierung der Oxidation von Methioninresten maximiert, ohne nachteilige Wirkungen auf die Aminosäurebezogene Inhibierung der IL-2-Polypeptid-Aggregation zu haben, würde eine bevorzugte Menge an Methionin darstellen, die zu den Zusammensetzungen zugegeben werden soll, um die Polypeptidstabilität weiter zu verbessern.
IL-2-Polypeptid-Abbau aufgrund von Gefrier-Tauen oder mechanischer Scherung während des Verarbeitens der flüssigen Zusammensetzung gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann durch die Einführung von oberflächenaktiven Mitteln in die flüssigen IL-2-Polypeptid-enthaltenden Zusammensetzungen inhibiert werden, um die Oberflächenspannung an der Lösungs-Luft-Grenzfläche zu verringern. Typische eingesetzte oberflächenaktive Mittel sind nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, einschließlich Polyoxyethylensorbitolester, wie Polysorbat 80 (Tween 80) und Polysorbat 20 (Tween 20); Polyoxypropylen-Polyoxyethylenester, wie Pluronic F68; Polyoxyethylenalkohole, wie Brij 35; Simethicon; Polyethylenglykol, wie PEG400; Lysophosphatidylcholin und Polyoxyethylen-p-t-octylphenol, wie Triton X-100. Klassische Stabilisierung von Pharmazeutika durch oberflächenaktive Mittel oder Emulgatoren wird beispielsweise in Levine et al. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45 (3): 160–165, hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben. Ein bevorzugt eingesetztes oberflächenaktives Mittel in der Praxis der vorliegenden Erfindung ist Polysorbat 80.
Zusätzlich zu diesen oben offenbarten Mitteln können andere Stabilisatoren, wie Albumin, Ethylendiamintetressigsäure (EDTA) oder eines von ihren Salzen, wie Dinatrium-EDTA, zugegeben werden, um die Stabilität der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen weiter zu verbessern. Die Menge an Albumin kann bei Konzentrationen von etwa 1,0% Gew./Vol. oder weniger zugegeben werden. Das EDTA fungiert als ein Fänger für Metallionen, die bekanntermaßen viele Oxidationsreaktionen katalysieren, wodurch ein zusätzlicher Stabilisator bereitgestellt wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt die stabilisierte flüssige pharmazeutische Zusammensetzung IL-2 oder eine Variante davon, Argininbase bei einer Konzentration von etwa 150 mM bis etwa 350 mM, Bernsteinsäure bei einer Konzentration von etwa 80 mM bis etwa 190 mM, Methionin bei einer Konzentration von etwa 0,5 mM bis etwa 10 mM, EDTA bei etwa 0,1 bis etwa 5,0 mM und Polysorbat 80 bei etwa 0,001% bis etwa 0,2%. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Argininbase in dieser flüssigen pharmazeutischen IL-2-Zusammensetzung bei einer Konzentration von etwa 230 mM vor und Bernsteinsäure liegt bei einer Konzentration von etwa 128 mM vor. Diese bevorzugte IL-2-Zusammensetzung weist einen pH von etwa 5,8 und eine Osmolarität von etwa 250 mmol/kg bis etwa 330 mmol/kg auf. Die Konzentration von IL-2 oder einer Variante davon in diesen Zusammensetzungen beträgt etwa 0,01 mg/ml bis etwa 2,0 mg/ml, bevorzugt etwa 0,02 mg/ml bis etwa 1,0 mg/ml, stärker bevorzugt etwa 0,03 mg/ml bis etwa 0,8 mg/ml, am stärksten bevorzugt etwa 0,03 mg/ml bis etwa 0,5 mg/ml.
Wo wünschenswert, können Zucker oder Zuckeralkohole ebenso in die stabilisierten flüssigen IL-2-Polypeptid-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingeführt werden. Jeder Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide, oder wasserlösliche Glucane, einschließlich beispielsweise Fruchtzucker, Glukose, Mannose, Sorbose, Xylose, Maltose, Laktose, Saccharose, Dextran, Pullulan, Dextrin, Cyclodextrin, lösliche Stärke, Hydroxyethylstärke und Carboxymethylcellulose-Na, können verwendet werden. Saccharose ist das am stärksten bevorzugte Zuckeradditiv. Zuckeralkohol wird als ein C4-C8-Kohlenwasserstoff mit einer -OH-Gruppe definiert und umfaßt beispielsweise Mannitol, Sorbitol, Inositol, Galacititol, Dulcitol, Xylitol und Arabitolm, wobei Mannitol das am stärksten bevorzugte Zuckeralkoholadditiv ist. Die obengenannten Zucker oder Zuckeralkohole können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Es gibt keine festgelegte Grenze für die verwendete Menge, so lange wie der Zucker oder Zuckeralkohol in dem flüssigen Präparat löslich ist und sich nicht nachteilig auf die stabilisierenden Wirkungen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren erreicht werden, auswirkt. Bevorzugt liegt die Zucker- oder Zuckeralkoholkonzentration zwischen etwa 1,0% Gew./Vol. und etwa 15,0% Gew./Vol., stärker bevorzugt zwischen etwa 2,0% Gew./Vol. und etwa 10,0% Gew./Vol..
Die stabilisierten flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, können andere Verbindungen enthalten, die die Wirksamkeit erhöhen oder die wünschenswerten Qualitäten des IL-2-Polypeptids von Interesse fördern, das als eine therapeutisch aktive Komponente dient, so lange wie die primäre stabilisierende Wirkung, die mit der Aminosäurebase erreicht wird, nicht nachteilig beeinflußt wird. Die Zusammensetzung muß für die Verabreichung über die gewählte Art und Weise sicher sein, sie muß steril sein und muß ihre gewünschte therapeutische Aktivität behalten.
Zusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, werden durch Vormischen der Stabilisatoren und Puffermittel und jeglicher anderer Trägerstoffe vor der Einführung des Polypeptids von Interesse hergestellt. Jegliche zusätzliche Trägerstoffe, die zugegeben werden können, um die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weiter zu stabilisieren, dürfen die stabilisierenden Wirkungen des primären Stabilisators, d. h. einer Aminosäurebase, in Kombination mit dem Puffermittel, d. h. einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, nicht nachteilig beeinflussen, wie verwendet, um die neuen hierin offenbarten Zusammensetzungen zu erhalten. Nach der Zugabe einer bevorzugten Menge einer Aminosäurebase, um die verringerte Aggregatbildung eines IL-2-Polypeptids von Interesse zu erreichen, wird der pH der flüssigen Zusammensetzung unter Verwendung des Puffermittels, bevorzugt innerhalb eines hierin offenbarten Bereiches, stärker bevorzugt auf den pH, der für das IL-2-Polypeptid von Interesse optimal ist, eingestellt. Obwohl der pH nach der Zugabe des IL-2-Polypeptids von Interesse zu der Zusammensetzung eingestellt werden kann, wird er bevorzugt vor der Zugabe dieses Polypeptids eingestellt, da dies das Risiko der Denaturierung des IL-2-Polypeptids verringern kann. Geeignete mechanische Vorrichtungen werden dann zum Erreichen einer richtigen Mischung von Bestandteilen verwendet.
Die IL-2-Polypeptide, die in den stabilisierten flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, vorliegen, können nativ sein oder durch rekombinante Techniken erhalten werden, und können aus jeder Quelle sein, einschließlich Säugerquellen, wie z. B. Maus, Ratte, Kaninchen, Primat, Schwein und Mensch, vorausgesetzt, daß sie die hierin spezifizierten Kriterien erfüllen, das heißt, vorausgesetzt, daß sie Aggregate während der Lagerung in flüssigen Formulierungen bilden. Bevorzugt sind diese IL-2-Polypeptide von einer menschli chen Quelle abgeleitet, und sind stärker bevorzugt rekombinante, menschliche Proteine von mikrobiellen Wirten.
Biologisch aktive Varianten eines IL-2-Polypeptids von Interesse, das als eine therapeutisch aktive Komponente in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen dient, sind ebenso durch den Ausdruck „IL-2-Polypeptid", wie hierin verwendet, einbezogen. Diese Varianten sollten die gewünschte biologische Aktivität des nativen IL-2-Polypeptids erhalten, so daß die pharmazeutische Zusammensetzung, die das variante IL-2-Polypeptid umfaßt, dieselbe therapeutische Wirkung aufweist wie die pharmazeutische Zusammensetzung, die das native IL-2-Polypeptid umfaßt, wenn es an einen Patienten verabreicht wird. Das heißt, das variante IL-2-Polypeptid wird als eine therapeutisch aktive Komponente in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer ähnlichen Weise wie der dienen, die für das native IL-2-Polypeptid beobachtet wird. Verfahren sind in der Technik zum Bestimmen, ob ein variantes IL-2-Polypeptid die gewünschte biologische Aktivität behält und daher als eine therapeutisch aktive Komponente in der pharmazeutischen Zusammensetzung dient, verfügbar. Die biologische Aktivität kann unter Verwendung von Assays gemessen werden, die speziell für das Messen der Aktivität des nativen IL-2-Polypeptids oder Proteins konstruiert sind, einschließlich der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Assays. Außerdem können Antikörper, die gegen ein biologisch aktives natives IL-2-Polypeptid gerichtet sind, hinsichtlich ihrer Fähigkeit, an das variante IL-2-Polypeptid zu binden, getestet werden, wo effektives Binden indikativ für ein Polypeptid mit einer Konformation, ähnlich der des nativen IL-2-Polypeptids, ist.
Geeignete biologisch aktive Varianten eines nativen oder natürlich vorkommenden IL-2-Polypeptids von Interesse können Fragmente, Analoga und Derivate von dem Polypeptid sein. Unter „Fragment" ist ein Polypeptid zu verstehen, das nur aus einem Teil der intakten Polypeptidsequenz und -struktur besteht, und kann eine C-terminale Deletion oder N-terminale Deletion des nativen Polypeptids sein. Unter „Analogon" ist ein Analogon von entweder dem nativen Polypeptid oder einem Fragment des nativen Polypeptids zu verstehen, wo das Analogon eine native Polypeptidsequenz und -struktur mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen umfaßt. „Muteine", wie die hierin beschriebenen, und Peptide mit einem oder mehreren Peptoiden (Peptidimitatoren) werden ebenso von dem Ausdruck Analogon umfaßt (siehe internationale Veröffentlichung Nr. WO 91/04282). Unter „Derivat" ist jede geeignete Modifikation des nativen Polypeptids von Interesse, eines Fragments des nativen Polypeptids oder von seinen jeweiligen Analoga, wie Glycosylierung, Phosphorylierung oder andere Zugabe von fremden Einheiten zu verstehen, so lange wie die gewünschte biologische Aktivität des nativen Polypeptids erhalten bleibt. Verfahren zur Herstellung von Polypeptidfragmenten, -analoga und -derivaten sind in der Technik allgemein verfügbar.
Beispielsweise können Aminosäuresequenzvarianten des IL-2-Polypeptids durch Mutationen in der geklonten DNA-Sequenz, die das native Polypeptid von Interesse kodiert, hergestellt werden. Verfahren zur Mutagenese und Nukleotidsequenzalterationen sind in der Technik allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Walker and Gaastra, Hrsg. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488–492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154: 367–382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); US-Patent Nr. 4,873,192; und die hierin zitierten Dokumente; hierin aufgenommen durch Verweis. Eine Unterweisung für geeignete Aminosäuresubstitutionen, die die biologische Aktivität des Polypeptids von Interesse nicht beeinflussen, kann in dem Modell von Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.), hierin durch Verweis aufgenommen, gefunden werden. Konservative Substitutionen, wie Austauschen einer Aminosäure mit einer anderen mit ähnlichen Eigenschaften, können bevorzugt sein. Beispiele von konservativen Substitutionen umfassen Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln und Phe⇔Trp⇔Tyr, sind aber nicht darauf beschränkt.
Beim Konstruieren von Varianten des IL-2-Polypeptids werden Modifikationen vorgenommen, so daß die Varianten weiterhin die gewünschte Aktivität besitzen. Offensichtlich dürfen jegliche Mutationen, die in der DNA vorgenommen werden, welche das variante Polypeptid kodiert, die Sequenz nicht außerhalb des Leserahmens bringen und werden bevorzugt keine komplementären Bereiche erzeugen, die se kundäre mRNA-Struktur herstellen könnten; siehe EP-Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 75,444.
Biologisch aktive Varianten eines IL-2-Polypeptids werden mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt etwa 90% bis 95% oder mehr und am stärksten bevorzugt etwa 98% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz des Referenz-IL-2-Polypeptidmoleküls aufweisen, das als Grundlage für den Vergleich dient. Eine biologisch aktive Variante eines nativen IL-2-Polypeptids von Interesse kann sich von dem nativen Polypeptid durch weniger als 1–15 Aminosäuren, weniger als 1–10, wie 6–10, weniger als 5, weniger als 4, 3, 2 oder sogar 1 Aminosäurerest unterscheiden. Unter „Sequenzidentität" ist zu verstehen, daß dieselben Aminosäurereste innerhalb des varianten Polypeptids und dem Polypeptidmolekül gefunden werden, das als eine Referenz dient, wenn ein spezifiziertes, benachbartes Segment der Aminosäuresequenz der Variante ausgerichtet ist und mit der Aminosäuresequenz des Referenzmoleküls verglichen wird. Die prozentuale Sequenzidentität zwischen zwei Aminosäuresequenzen wird durch Bestimmen der Anzahl an Positionen, bei denen der identische Aminosäurerest in beiden Sequenzen auftritt, um die Anzahl an angepaßten Positionen zu erhalten, Teilen der Anzahl an angepaßten Positionen durch die Gesamtanzahl an Positionen in dem Segment im Vergleich zu dem Referenzmolekül und Multiplizieren des Ergebnisses durch 100, um den Prozentsatz an Sequenzidentität zu erhalten, berechnet.
Für die Zwecke der optimalen Ausrichtung der zwei Sequenzen kann das benachbarte Segment der Aminosäuresequenz der IL-2-Variante zusätzliche Aminosäurereste oder gelöschte Aminosäurereste in bezug auf die Aminosäuresequenz des Referenzmoleküls aufweisen. Das benachbarte Segment, das zum Vergleich mit der Referenzaminosäuresequenz verwendet wird, wird mindestens zwanzig (20) benachbarte Aminosäurereste aufweisen und kann aus 30, 40, 50, 100 oder mehr Resten bestehen. Korrekturen für erhöhte Sequenzidentität, verbunden mit dem Einschluß von Lücken in die Aminosäuresequenz der Variante, können durch Zuordnen von Gap-Penalties gemacht werden. Verfahren zur Sequenzausrichtung sind in der Technik für sowohl Aminosäuresequenzen als auch für die Nukleotidsequenzen, die Aminosäuresequenzen kodieren, allgemein bekannt.
Daher kann die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen irgendwelchen zwei Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erreicht werden. Ein bevorzugtes, nicht-einschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers and Miller (1988) CABIOS 4: 11–17. Ein solcher Algorithmus wird in dem ALIGN-Programm (Version 2.0) verwendet, welches Teil des GCG-Sequenzausrichtungs-Softwarepackets ist. Eine PAM120-Gewichtsresttabelle, eine Gap-Length-Penalty von 12 und eine Gap-Penalty von 4 können mit dem ALIGN-Programm im Vergleich zu Aminosäuresequenzen verwendet werden. Ein anderes bevorzugtes nicht-einschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus zur Verwendung im Vergleich zweier Sequenzen ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87: 2264, modifiziert wie in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877. Ein solcher Algorithmus wird in die NBLAST- und XBLAST-Programme von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 eingeführt. BLAST Nukleotidforschungen können mit dem NBLAST Programm, Punkte = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die zu einer Nukleotidsequenz homolog sind, welche das Polypeptid von Interesse kodiert. BLAST Proteinforschungen können mit dem XBLAST Programm, Punkte = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu dem Polypeptid von Interesse homolog sind. Um Lücken-Ausrichtungen für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 beschrieben. Alternativ kann PSI-Blast verwendet werden, um eine wiederholte Forschung durchzuführen, die entfernte Beziehungen zwischen den Molekülen detektiert; siehe Altschul et al. (1997) supra. Wenn BLAST, Gapped BLAST und PSI-Blast Programme verwendet werden, können die Standardparameter der jeweiligen Programme verwendet werden (z. B., XBLAST und NBLAST). Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Ebenso siehe ALIGN Programm (Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) und Programme in dem Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), beispielsweise das GAP Programm, wo Standardparameter der Programme verwendet werden.
Wenn der Prozentsatz der Aminosäuresequenzidentität berückichtigt wird, können sich einige Aminosäurerestpositionen infolge der konservativen Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, die die Eigenschaften der Proteinfunktion nicht beeinflussen. In diesen Beispielen kann die prozentuale Sequenzidentität aufwärts eingestellt werden, wodurch sie die Ähnlichkeit in konservativ substituierten Aminosäuren ausmachen. Diese Einstellungen sind in der Technik allgemein bekannt; siehe beispielsweise Myers and Miller (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11–17.
Die genaue chemische Struktur eines Polypeptids hängt von einer Vielzahl an Faktoren ab. Wenn ionisierbare Amino- und Carboxylgruppen in dem Molekül vorliegen, kann ein spezielles Polypeptid als ein saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. All diese Präparate, die ihre biologische Aktivität behalten, wenn sie in geeigneten Umweltbedingungen gehalten werden, sind in die Definition von Polypeptiden, wie hierin verwendet, einbezogen. Ferner kann die primäre Aminosäuresequenz des Polypeptids durch Derivatisierung unter Verwendung von Zuckereinheiten (Glycosylierung) oder durch andere ergänzende Moleküle, wie Lipide, Phosphat, Acetylgruppen und dergleichen, verstärkt werden. Sie kann ebenso durch die Konjugation mit Sacchariden verstärkt werden. Bestimmte Aspekte einer solchen Verstärkung werden durch post-translationale Processing-Systeme des erzeugenden Wirts erreicht; andere solche Modifikationen können in vitro eingeführt werden. Bei jedem Vorgang sind solche Modifikationen in die Definition von hierin verwendetem Polypeptid einbezogen, so lange wie die Aktivität des Polypeptids nicht zerstört wird. Es wird erwartet, daß diese Modifikationen quantitativ oder qualitativ die Aktivität beeinflussen können, entweder durch Verstärken oder Verringern der Aktivität des Polypeptids in den verschiedenen Assays. Ferner können einzelne Aminosäurereste in der Kette durch Oxidation, Reduktion oder andere Derivatisierung modifiziert werden, und das Polypeptid kann gespalten werden, wodurch Fragmente erhalten werden, die die Aktivität behalten. Diese Alterationen, die die Aktivität nicht zerstören, entfernen nicht die Polypeptidsequenz aus der Definition des Polypeptids von Interesse, wie hierin verwendet.
Die Technik stellt die wesentliche Anleitung bezüglich der Herstellung und Verwendung von Polypeptidvarianten bereit. Beim Herstellen der Polypeptidvarianten kann ein Fachmann ohne weiteres bestimmen, welche Modifikationen an dem nativen Proteinnukleotid oder Aminosäuresequenz zu einer Variante führen, die zur Verwendung als eine therapeutisch aktive Komponente einer pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, und deren Aggregatbildung durch die Gegenwart einer Aminosäurebase und einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, der Salzform der Säure oder einem Gemisch der Säure und ihrer Salzform, wie hierin beschrieben, verringert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Polypeptid, das als eine therapeutisch aktive Komponente in der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung, die gemäß der Erfindung hergestellt wird, vorliegt, Interleukin-2 (IL-2) oder eine Variante davon, bevorzugt rekombinantes IL-2. Interleukin-2 ist ein Lymphokin, das durch normale periphere Blutlymphozyten erzeugt wird, und liegt im Körper bei niedrigen Konzentrationen vor. Es induziert die Proliferation von Antigen- oder Mitogenstimulierten T-Zellen nach der Exponierung zu Pflanzenlectinen, Antigenen oder anderen Reizen. IL-2 wurde zuerst von Morgan et al. (1976) Science 193: 1007–1008 beschrieben und ursprünglich T-Zellen-Wachstumsfaktor aufgrund seiner Fähigkeit, die Proliferation von stimulierten T-Lymphozyten zu induzieren, genannt. Es ist ein Protein mit einem ausgewiesenen Molekulargewicht in dem Bereich von 13.000 bis 17.000 (Gillis and Watson (1980) J. Exp. Med. 159: 1709) und weist einen isoelektrischen Punkt in dem Bereich von 6 bis 8,5 auf. Es wird nun erkannt, daß zusätzlich zu seinen Wachstumsfaktoreigenschaften es verschiedene in vitro- und in vivo-Funktionen des Immunsystems moduliert. IL-2 ist eines von mehreren Lymphozytenerzeugten Messenger-Regulationsmolekülen, die zelluläre Interaktionen und Funktionen vermitteln. Es ist gezeigt worden, daß dieses natürlich vorkommende Lymphokin Antitumoraktivität gegen eine Vielzahl von Malignitäten entweder allein oder in Kombination mit Lymphokin-aktivierten Killer-(LAK)-Zellen oder Tumorinfiltrierten Lymphozyten besitzt (siehe beispielsweise, Rosenberg et al. (1987) N. Engl. J. Med. 316: 889–897; Rosenberg (1988) Ann. Surg. 208: 121–135; Topalian et al. (1988) J. Clin. Oncol. 6: 839–853; Rosenberg et al. (1988) N. Engl. J. Med. 319: 1676–1680 und Weber et al. (1992) J. Clin. Oncol. 10: 33–40). Obwohl die Antitumoraktivität von IL-2 am besten bei Patienten mit metastatischem Melanom und Grawitz-Tumor beschrieben worden ist, scheinen andere Krankheiten, besonders Lymphom, ebenso auf die Behandlung mit IL-2 zu reagieren.
Unter „rekombinantem IL-2" ist Interleukin-2 zu verstehen, das vergleichbare biologische Aktivität wie die native Sequenz IL-2 aufweist und durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt worden ist, wie beispielsweise von Taniguchi et al. (1983) Nature 302: 305–310 und Devos (1983) Nucleic Acids Research 11: 4307–4323 beschrieben, oder mutational verändertes IL-2, wie von Wang et al. (1984) Science 224: 1431–1433 beschrieben. Im allgemeinen wird die Genkodierung für IL-2 geklont und dann in transformierten Organismen exprimiert, bevorzugt einem Mikroorganismus, und am stärksten bevorzugt E. coli, wie hierin beschrieben. Der Wirtsorganismus exprimiert das fremde Gen zur Herstellung von IL-2 unter Expressionsbedingungen. Synthetisches rekombinantes IL-2 kann ebenso in Eukaryoten, wie Hefe oder menschlichen Zellen, hergestellt werden. Verfahren zum Wachsen, Ernten, Lösen oder Extrahieren des IL-2 von Zellen sind im wesentlichen in beispielsweise US-Patent Nr. 4,604,377; 4,738,927; 4,656,132; 4,569,790; 4,748,234; 4,530,787; 4,572,298 und 4,931,543 beschrieben; hierin durch Verweis in ihren Gesamtheiten aufgenommen.
Für Beispiele von varianten IL-2-Proteinen siehe europäische Patentanmeldung Nr. 136.489; europäische Patentanmeldung Nr. 83101035.0, eingereicht am 3. Februar 1983 (veröffentlicht am 19. Oktober 1983 unter der Veröffentlichung Nr. 91539); Europäische Patentanmeldung Nr. 82307036.2, eingereicht am 22. Dezember 1982 (veröffentlicht am 14. September 1983 unter der Nr. 88195); die rekombinanten IL-2-Muteine, beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr. 83306221.9, eingereicht am 13. Oktober 1983 (veröffentlicht am 30. Mai 1984 unter der Nr. 109748), welches das Äquivalent zu dem belgischen Patent Nr. 893,016 ist, zugehörig zu US-Patent Nr. 4,518,584; die Muteine, beschrieben in US-Patent Nr. 4,752,585 und WO 99/60128; und das IL-2-Mutein, verwendet in den Beispielen hierin und beschrieben in US-Patent Nr. 4,931,543; von denen alle hierin durch Verweis aufgenommen werden. Außerdem kann IL-2 mit Polyethylenglykol modifiziert werden, um verstärkte Löslichkeit und ein verändertes pharmakokinetisches Profil bereitzustellen (siehe US-Pat. Nr. 4,766,106, hierin durch Verweis in seiner Gesamtheit aufgenommen).
Eine pharmazeutisch wirksame Menge einer stabilisierten IL-2-Polypeptid-enthaltenden flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung, hergestellt gemäß der Erfindung, wird an einen Patienten verabreicht. Unter „pharmazeutisch wirksame Menge" ist eine Menge zu verstehen, die bei der Behandlung, Vorbeugung oder Diagnose einer Krankheit oder eines Zustandes nützlich ist. Typische Verabreichungswege umfassen orale Verabreichung und parenterale Verabreichung, einschließlich intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intraarterielle und intraperitoneale Injektion oder Infusion, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer solchen Ausführungsform erfolgt die Verabreichung durch Injektion, bevorzugt subkutane Injektion. Injizierbare Formen der Zusammensetzungen der Erfindung umfassen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die stabilisierte, flüssige pharmazeutische Zusammensetzung, die das Polypeptid von Interesse umfaßt, sollte in einer Einheitsdosierung formuliert werden und kann in einer injizierbaren oder infusionsfähigen Form, wie Lösung, Suspension oder Emulsion, vorliegen. Außerdem kann sie gefroren gelagert oder in getrockneter Form hergestellt werden, wie ein lyophilisiertes Pulver, das in der flüssigen Lösung, Suspension oder Emulsion vor der Verabreichung durch jedes der verschiedenen Verfahren, einschließlich orale oder parenterale Verabreichungswege, rekonstituiert werden kann. Bevorzugt wird sie als flüssige Formulierung gelagert, um den Vorteil der erhöhten Lagerstabilität zu nutzen, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren erreicht wurde, wie nachstehend dargestellt. Die stabilisierte pharmazeutische Zusammensetzung wird bevorzugt durch Membranfiltration sterilisiert und wird in Einheitsdosierungs- oder Mehrfachdosierungsbehältern, wie verschlossenen Phiolen oder Ampullen, gelagert. Zusätzliche Verfahren zum Formulieren einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die in der Technik allgemein bekannt sind, können verwendet werden, um die Lagerstabilität der hierin offenbarten flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen weiter zu verstärken, vorausgesetzt sie beeinflussen die vorteilhaften Wirkungen der bevorzugten Stabilisatoren und Puffermittel, die in den erfindungsgemäßen Verfahren offenbart sind, nicht negativ. Eine gründliche Erläute rung der Formulierung und Selektion von pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Stabilisatoren usw. kann in Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) (18. Aufl. Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania), hierin durch Verweis aufgenommen, gefunden werden.
Unter „Patient" ist jedes Lebewesen zu verstehen. Bevorzugt ist der Patient ein Säuger, am stärksten bevorzugt ist der Patient ein Mensch. Säuger von anderer besonderer Wichtigkeit als der Mensch umfassen Hunde, Katzen, Kühe, Pferde, Schafe und Schweine, sind aber nicht darauf beschränkt.
Wenn die Verabreichung für den Zweck der Behandlung erfolgt, kann die Verabreichung entweder ein prophylaktischer oder therapeutischer Zweck sein. Bei prophylaktischer Gabe wird die Substanz vor dem Auftreten irgendeines Symptoms zugeführt. Die prophylaktische Verabreichung der Substanz dient dazu, jegliches anschließende Symptom zu verhindern oder zu schwächen. Wenn therapeutisch bereitgestellt, wird die Substanz beim (oder kurz nach dem) Ausbruch eines Symptoms bereitgestellt. Die therapeutische Verabreichung der Substanz dient dazu, jedes tatsächliche Symptom zu schwächen.
Daher können beispielsweise Formulierungen, umfassend eine wirksame Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung, die native Sequenz IL-2 oder eine Variante davon umfaßt, für den Zweck der Behandlung, Vorbeugung und Diagnose einer Vielzahl von klinischen Indikationen verwendet werden, die auf die Therapie mit diesem Polypeptid reagieren. Biologisch aktive Varianten von nativer Sequenz IL-2, wie Muteine von IL-2, die die IL-2-Aktivität behalten, insbesondere das Mutein IL-2.sub.ser125 und andere Muteine, bei denen das Cystin an Stellung 125 durch eine andere Aminosäure ersetzt worden ist, können formuliert und in derselben Weise wie native Sequenz IL-2 verwendet werden. Folglich sind die Formulierungen der Erfindung, die native Sequenz IL-2 oder eine Variante davon umfassen, für die Diagnose, Vorbeugung und Behandlung (lokal oder systemisch) von bakteriellen, viralen, parasitischen, Protozoen- und Pilzinfektionen; zur Verstärkung der zellvermittelten Zytotoxizität; zur Stimulierung Lymphokin-aktivierter Killer-(LAK)-Zellen-aktivität; zum Vermitteln der Wiedergewinnung von Immunfunktion von Lymphozy ten; zur Verstärkung der Alloantigenreaktionsfähigkeit; zur Erleichterung der Wiedergewinnung von Immunfunktion bei erworbenen immundefizienten Zuständen; zur Rekonstitution von normaler Immunfunktion bei gealterten Menschen und Tieren; bei der Entwicklung von Diagnoseassays, wie die, die Enzymamplifikation, radioaktive Markierung, Radioabbildung und andere in der Technik bekannte Verfahren zur Überwachung von IL-2-Spiegeln in dem kranken Zustand, einsetzen; für die Beschleunigung des T-Zellenwachstums in vitro für therapeutische und diagnostische Zwecke; zum Blockieren von Rezeptorstellen für Lymphokine; und bei verschiedenen anderen therapeutischen, diagnostischen und Forschungsanwendungen nützlich. Die verschiedenen therapeutischen und diagnostischen Anwendungen von menschlichem IL-2 oder Varianten davon, wie IL-2-Muteine, sind untersucht und in Rosenberg et al. (1987) N. Engl. J. Med. 316: 889–897; Rosenberg (1988) Ann. Surg. 208: 121–135; Topalian et al. 1988) J. Clin. Oncol. 6: 839–853; Rosenberg et al. (1988) N. Engl. J. Med. 319: 1676–1680; Weber et al. (1992) J. Clin. Oncol. 10: 33–40; Grimm et al. (1982) Cell. Immunol. 70 (2): 248–259; Mazumder (1997) Cancer J. Sci. Am. 3 (Suppl. 1): S37–42; Mazumder and Rosenberg (1984) J. Exp. Med. 159(2): 495–507; und Mazumder et al. (1983) Cancer Immunol. Immunother. 15(1): 1–10 berichtet worden. Formulierungen der Erfindung, umfassend IL-2 oder eine Variante davon, können als das einzelne therapeutisch aktive Mittel verwendet werden oder können in Kombination mit anderen immunologisch relevanten B- oder T-Zellen oder anderen therapeutischen Mitteln verwendet werden. Beispiele von relevanten Zellen sind B- oder T-Zellen, natürliche Killerzellen, LAK-Zellen und dergleichen, und exemplarische therapeutische Reagenzien, die in Kombination mit IL-2 oder einer Variante davon verwendet werden können, sind die verschiedenen Interferone, speziell gamma-Interferon, B-Zellen-Wachstumsfaktor, IL-1 und Antikörper, beispielsweise anti-HER2- oder anti-CD20-Antikörper. Formulierungen der Erfindung, umfassend IL-2 oder eine Variante davon, können Menschen oder Tieren oral, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intravenös, intranasal oder durch pulmonale Abgabe, wie durch den Arzt als geeignet erachtet, verabreicht werden. Die Menge von IL-2 (entweder native Sequenz oder eine Variante davon, die die biologische IL-2-Aktivität erhält, wie hierin offenbarte Muteine), die verabreicht wird, kann zwischen etwa 0,1 und etwa 15 mlE/m² liegen. Für Indikationen, wie Grawitz-Tumor und metastatisches Melanom, kann das IL-2 oder die biologisch aktive Variante davon als eine hochdosierte intravenöse große Pille bei 300.000 bis 800.000 IE/kg/8 Stunden verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Erhöhen der Stabilität eines IL-2-Polypeptids in einer flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung bereit, wo das Polypeptid, welches als eine therapeutisch aktive Komponente dient, Aggregatbildung während der Lagerung in einer flüssigen Formulierung zeigt. Das Verfahren umfaßt das Einführen in die flüssige pharmazeutische Zusammensetzung einer Aminosäurebase in einer Menge, die ausreichend ist, die Aggregatbildung des IL-2-Polypeptids während der Lagerung der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung zu verringern, und einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, wo die Säure als ein Puffermittel dient, um den pH der flüssigen Zusammensetzung innerhalb eines akzeptablen Bereiches, wie hierin zuvor beschrieben, zu halten.
Eine Erhöhung der Stabilität eines IL-2-Polypeptids oder einer Variante davon durch Einführen einer Aminosäurebase oder einer Aminosäurebase plus einem oder mehreren zusätzlichen hierin beschriebenen Stabilisatoren in Kombination mit dem hierin offenbarten Puffermittel, d. h., einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, der Salzform der Säure oder einem Gemisch der Säure und ihrer Salzform, führt zu einer Erhöhung der Stabilität der flüssigen Polypeptid-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung während der Lagerung. Daher stellt die Erfindung ebenso ein Verfahren zum Erhöhen der Lagerstabilität einer flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung bereit, wenn diese Zusammensetzung ein IL-2-Polypeptid umfaßt, das Aggregate während der Lagerung in einer flüssigen Formulierung bildet. Unter „Erhöhung der Lagerstabilität" ist zu verstehen, daß die pharmazeutische Zusammensetzung größere Retention des IL-2-Polypeptids oder einer Variante davon in ihrer richtigen, nichtaggregierten, biologisch aktiven Konformation während der Lagerung und daher weniger Abnahme der therapeutischen Wirksamkeit als eine flüssige pharmazeutische Zusammensetzung, die in Abwesenheit einer Aminosäurebase oder einer Aminosäurebase plus einem oder mehreren der zusätzlichen hierin beschriebenen Stabilisatoren in Kombination mit dem hierin offenbarten Puffermittel hergestellt wird, zeigt.
Die Lagerstabilität einer IL-2-Polypeptid-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird, kann unter Verwendung von Standardverfahren, die in der Technik bekannt sind, analysiert werden. Typischerweise wird die Lagerstabilität solcher Zusammensetzungen unter Verwendung von Lagerstabilitätsprofilen analysiert. Diese Profile werden durch Überwachen von Veränderungen in der Menge an IL-2-Polypeptid, das in seiner nichtaggregierten, biologisch aktiven molekularen Form vorliegt, und seiner Wirksamkeit über die Zeit hinweg als Reaktion auf die Variable von Interesse, wie pH-Konzentration, Stabilisator, Konzentration an Stabilisator usw., wie in den nachstehenden Beispielen dargestellt, erhalten. Diese Stabilitätsprofile können bei mehreren Temperaturen, die für mögliche Lagerbedingungen repräsentativ sind, wie Gefriertemperatur, Kühltemperatur, Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur, wie bei 40 bis 50°C erzeugt werden. Die Lagerstabilität wird dann zwischen Profilen durch Bestimmen von beispielsweise der Halbwertszeit der nichtaggregierten, biologisch aktiven molekularen Form des IL-2-Polypeptids von Interesse verglichen. Unter „Halbwertszeit" ist die Zeit zu verstehen, die für eine 50%ige Verringerung der nicht-aggregierten, biologisch aktiven molekularen Form des IL-2-Polypeptids von Interesse benötigt wird. Zusammensetzungen, umfassend Argininbase und eine Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, hergestellt gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren, wird eine Halbwertszeit aufweisen, die mindestens etwa das zweifache bis etwa zehnfache größer, bevorzugt mindestens etwa das dreifache bis mindestens etwa zehnfache größer, stärker bevorzugt mindestens etwa das vierfache bis etwa zehnfache größer, am stärksten bevorzugt mindestens etwa das fünffache bis etwa zehnfache größer als die Halbwertszeit einer flüssigen Zusammensetzung ist, hergestellt in Abwesenheit einer Aminosäurebase oder einer Aminosäurebase plus einem oder mehreren zusätzlichen hierin beschriebenen Stabilisatoren in Kombination mit einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, der Salzform der Säure oder einem Gemisch der Säure und ihrer Salzform. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung mit erhöhter Lagerstabilität infolge der Herstellung gemäß der vorliegenden Erfindung als eine „stabilisierte" pharmazeutische Zusammensetzung betrachtet. Eine solche stabilisierte Zusammensetzung weist bevorzugt eine Gebrauchsfähigkeitsdauer von mindestens etwa 18 Monaten, stärker bevorzugt mindestens 20 Monaten, noch stärker be vorzugt mindestens etwa 22 Monaten, am stärksten bevorzugt mindestens etwa 24 Monaten auf, wenn sei bei 2 bis 8°C gelagert wird.
Die folgenden Beispiele werden zur Illustration und nicht zur Einschränkung dargestellt.
EXPERIMENTELLER TEIL
IL-2 ist ein wirksames Mitogen, das die T-Zellenproliferation stimuliert. Es weist breite therapeutische Anwendung als Behandlung für Krebsmetastasen, als ein Hilfsmittel für die Krebstherapie und als ein Bindemittel für Infektionskrankheiten auf.
Im Verlauf von verschiedenen klinischen Versuchen unter Verwendung der IL-2-Therapie ist realisiert worden, daß die Entwicklung einer stabilen flüssigen Formulierung für dieses Protein stark wünschenswert ist. Eine solche Formulierung würde vielseitiger sein als traditionelle lyophilisierte Formulierungen, wie sie in unterschiedlichen Stärken gemäß verschiedener Dosierungsregimes zugeführt werden könnten. Eine flüssige Formulierung würde ebenso günstiger zu verabreichen sein, wenn keine Rekonstitution notwendig sein würde. Eine solche Formulierung kann in vorgefüllten, fertigen Spritzen oder als Mehrfachdosierungspräparate, wenn sie mit Bakteriostatika kompatibel sind, zugeführt werden.
Es ist berichtet worden, daß sich IL-2 in flüssigen Formulierungen über mindestens drei Wege während der Lagerung abbaut: Aggregation, Methioninoxidation und Desamidierung (Kunitani et al. (1986) J. Chromatography 359: 391–401; Kenney et al. (1986) Lymphokine Res. 5: 523–527). Außerdem ist IL-2 anfällig für akute Schäden, die durch Gefrieren und mechanische Scherspannung verursacht werden. Deshalb muß sich die IL-2-Formulierungsentwicklung auf sowohl die akuten Schäden als auch auf chronischen Abbau richten.
Folglich ist eine neue stabile, monomere rhIL-2-Formulierung entwickelt worden. Bei dieser Formulierung liegen die Proteinmoleküle in Lösung in ihrer Monomerform, nicht in einer aggregierten Form vor. Daher liegen keine kovalenten oder hydrophoben Oligomere oder Aggregate von rhIL-2 vor. Die Formulierung enthält mehrere Stabilisatoren, am wichtigsten Arginin und Methionin, um das Protein gegen physikalische und chemische Schäden zu stabilisieren, wie Aggregation, Methioninoxidation und Desamidierung während der Langzeitlagerung. Außerdem ist ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, Polysorbat 80, in die Formulierung einbezogen worden, um das Protein vor akuten Schäden zu schützen, die durch Gefrier-Tauen und mechanische Scherspannung verursacht werden. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, erhöht die Zugabe der Stabilisatoren der Erfindung zu der rhIL-2-Formulierung ihre Lagerstabilität.
Das IL-2-Molekül, das in diesen Beispielen verwendet wird, ist das rekombinante menschliche IL-2-Mutein, Aldesleukin, wobei Cystein-125 durch Serin (Des-Alanyl-1, Serin-125-Human-Interleukin-2) ersetzt wird. Es wird von E. coli exprimiert, und anschließend durch Diafiltration und Kationenaustauschchromatographie gereinigt, wie in US-Patent Nr. 4,931,543 beschrieben. Die gereinigte Masse zur Entwicklungsverwendung betrug etwa 3 mg/ml IL-2 und wurde entweder in 10 mM Natriumcitrat bei pH 6, 200 bis 250 mM NaCl (der CM-Pool-Puffer) oder in einem Puffer, enthaltend 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 150 mM L-Arginin, formuliert.
Gewebefaktorweginhibitor (TFPI) ist ein anderes Protein, das den Abbau durch Aggregation während der Lagerung in einer flüssigen pharmazeutischen Formulierung zeigt (Chen et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88: 881–888). Das nachstehende Beispiel 8 ist auf flüssige Formulierungen, die die Wirksamkeit der Verwendung einer Säure in ihrer freien Basenform zeigen, um die Aggregatbildung zu verringern, und ein Puffersystem, das durch eine Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, zugeführt wird, gerichtet. Beispiel 8 wird nur zur Information bereitgestellt.
Die folgenden Protokolle wurden in den Beispielen verwendet, um die Wirkung eines speziellen Stabilisators auf IL-2- oder TFPI-Abbau und daher die Stabilität von diesem Protein währen der Lagerung in flüssigen Formulierungen zu bestimmen.
UV-Extinktionsmessung
UV-Extinktion von Proteinlösungen wurde unter Verwendung eines Hewlett Packard Diode Array Spektrometers (Modell 8452) gemessen. Das Instrument wurde mit dem entsprechenden Formulierungspuffer kalibriert. Die Extinktion bei 280 nm wurde unter Verwendung einer Quarzküvette mit 1,0 cm Weglänge aufgezeichnet. Der Extinktionskoeffizient von 0,70 (mg/ml)^–1 cm^–1 wurde verwendet, um die Extinktionsdaten in die IL-2-Konzentration in mg/ml umzuwandeln.
RP-HPLC
RP-HPLC wurde auf einem Waters 626 LC-System, ausgestattet mit einem 717 Autosampler (Waters Corporation, Milford, Maine) unter Verwendung einer Vydac 214BTP54-C₄-Säule und einer Vydac 214GCC54-Vorsäule (Separations Group, Hesparia, Kalifornien) durchgeführt. Die Säulen wurden anfangs mit einer mobilen Phase A (10% Acetonitril, 0,1% TFA) äquilibriert. Dann wurden 20 μg einer IL-2-Probe geladen und das Protein wurde unter Anwendung einer mobilen Phase B (100% Acetonitril, 0,1% TFA) von 0 bis 100% in 50 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert. Die hauptsächlich lösliche IL-2-Spezies wurde bei ungefähr 32 min eluiert und durch UV 214 nm unter Verwendung eines Waters-486-Detektors detektiert. Die Datenerfassung und -verarbeitung wurden auf einem Perkins-Elmer Turbochrom-System (PE Nelson, Cupertino, Kalifornien) durchgeführt.
Dieses RP-HPLC-Verfahren detektiert die hauptsächliche monomere IL-2-Spezies als Peak B, eine oxidative Methioninspezies (hauptsächlich oxidiertes Met¹⁰⁴) als Peak A, eine desamidierte Spezies (wahrscheinlich Asn⁸⁸) als Peak B' und andere unbekannte Spezies, die entweder eher oder später als diese Peaks eluieren.
SEC-HPLC
Größenausschluß-HPLC wurde auf einer TOSOHAAS G2000SWx1 Säule und einer TSK SWx1 Schutzsäule (TOSOHAAS, Montgomeryville, Pennsylvania) durchgeführt. Eine einzelne mobile Phase, enthaltend 10 mM Natriumphosphat bei pH 7 und 200 mM Ammoniumsulfat, wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min aufgebracht. Die Monomer-IL-2-Spezies wurde bei ungefähr 14 min eluiert und durch UV 214 nm unter Verwendung eines Waters-486-Detektors detektiert. Die Datenerfassung und -verarbeitung wurden auf einem Perkin Elmer Turbochrom-System durchgeführt.
Unter Verwendung eines nativen SEC-HPLC-Protokolls, speziell entwickelt, um IL-2 zu überwachen, eluierte das rhIL-2 hauptsächlich als eine einzelne Spezies, wahrscheinlich in der monomeren Form, da die Zugabe von Aggregationsdissoziationsmitteln, wie SDS, Harnstoff und DTT, die Elution dieser Spezies nicht beeinflußte.
IEX-HPLC
Ionenaustausch-HPLC (IEX-HPLC) wurde auf einer Pharmacia Mono-S HR5/5 Glassäule unter Verwendung eines Waters 626 LC-Systems mit einem 717-Heizer/Kühler-Autosampler durchgeführt, wie in Chen et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88: 881–888 beschrieben. Die Säule wurde mit 80% mobiler Phase A (70 : 30% V/V, 20 mM Natriumacetat : Acetonitril bei pH 5,4) und 20% mobiler Phase B (70 : 30 V/V, 20 mM Natriumacetat und 1 M Ammoniumchlorid : Acetonitril bei pH 5,4) äquilibriert. Nach der Injektion wurde rekombinantes menschliches (rh) TFPI durch Erhöhen der mobilen Phase B auf 85% in 21 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,7 ml/Minute eluiert. Das rhTFPI eluierte bei ungefähr 16,5 Minuten als ein einzelner Peak und wurde durch UV-Extinktion bei 280 nm mit einem Waters-486-Extinktionsdetektor detektiert. Die Datenerfassung und -verarbeitung wurden auf einem Perkin-Elmer Turbochrom-System durchgeführt. Die Proteinkonzentration wurde durch Integrieren der Peakfläche und dessen Vergleichen mit einer Standardkurve, die aus den Proben mit bekannten Konzentrationen erzeugt wurde, geschätzt.
SDS-PAGE
SDS-PAGE wurde gemäß dem Laemmli-Protokoll durchgeführt. Etwa 5 μg IL-2 wurden in jede Spur eines vorgegossenen 18% Norvex Tris-Glycingels geladen und Elektrophorese wurde bei 100 Volt durchgeführt. Proteinbanden wurden durch Coomassie-blau-Farbstoff eingefärbt und wurden durch einen Molecular Dynamics Densitometer, ausgestattet mit dem Imagequan-T-System, analysiert (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Kalifornien).
HT-2-Zellproliferation und MTT-Färbung für IL-2-Bioaktivität
Die Wirksamkeit von IL-2 wurde durch einen in vitro-Bioassay unter Verwendung von NT-2-Zellproliferation und MTT-Färbung bestimmt (Gillis et al. (1978) J. Immunology 120: 2027–2032; Watson (1979) J. Exp. Med. 150 (6): 1510). Kurz, 1 × 10⁴ Mäuse-HT-2-Zellen, die für das Wachstum IL-2-abhängig waren, wurden in jedes Loch der Gewebekulturplatte, die Standards, Kontrollen oder Proben enthielt, geladen. Nach 22 bis 26 h Inkubation bei 37°C wurde die MTT-Färbung zu den Löchern hinzugefügt und die Inkubation bei 37°C für 3 bis 4 h fortgesetzt. Dann wurden 20% SDS zum Entfärben über Nacht bei Raumtemperatur zugegeben. Die Extinktion der Löcher wurde bei 570 nm abgelesen und zu der IL-2-Bioaktivität, basierend auf den WHO International Standards, umgewandelt.
pH- und Osmolaritätsmessungen
Der Lösungs-pH der verschiedenen Formulierungen wurde durch einen pH-Messer von Orion gemessen (Modell 611, Orion Research Incorporated Laboratory Products Group, Boston, Massachusetts). Der pH-Messer wurde durch das Zwei-Puffer-Kalibrierungsverfahren, vorgeschlagen durch den Hersteller, unter Verwendung eines pH 4 Standards (Fisher Scientific, Cat. Nr. SB 101-500) und eines pH 7 Standards (Fisher Scientific, Cat. Nr. SB 107-500) kalibriert.
Die Lösungs-Osmolarität von diesen Formulierungen wurde durch einen Vapor Pressure Osmometer von Wescor gemessen (Modell 5500, Wescor Inc., Logan, Utah). Das Osmometer wurde durch zwei Standards kalibriert, geliefert vom Hersteller: 290 mmol/kg Standard (Wescor, Reorder Nr. OA-010) und 1.000 mmol/kg Standard (Wescor, Reorder Nr. OA-029).
Diese Protokolle wurden verwendet, um die Wirkungen von verschiedenen Stabilisatoren auf rhIL-2-Abbau über Proteinaggregation, Methioninoxidation und Desamidierung quantitativ zu bestimmen.
Beispiel 1: Wirkungen von verschiedenen Lösungsvermittlern auf die Proteinaggregation und Lagerstabilität von rhIL-2
Proteinaggregation ist der Hauptabbauweg für rhIL-2 in flüssigen Medien zwischen mild-sauren und alkalischen pH-Bedingungen. rhIL-2 in Lösungen, formuliert mit diesen pH-Bedingungen, wenn bei erhöhten Temperaturen gelagert, führt schnell zur Proteinaggregation, die zu sichtbarem Niederschlag führt. Das sichtbare ausgefällte Protein ist durch Filtration durch einen 0,2-μm-Filter entfernbar. Das restliche lösliche Protein in Lösung kann durch eine Vielzahl von Analyseassays, wie RP-HPLC, SEC- HPLC und UV-Extinktion, quantitativ bestimmt werden. Die Aggregation führt ebenso zu einer Verringerung der Bioaktivität, die durch den hierin beschriebenen in vitro-Bioassay bestimmt werden kann.
Unter Verwendung der hierin beschriebenen Analyseverfahren wurde die Lagerstabilität von rhIL-2 unter mehreren Bedingungen durch Beobachten der Veränderungen in der Menge an löslichem rhIL-2 als eine Funktion der Inkubationszeit bei erhöhten Temperaturen verfolgt.
1.A. Wirkungen von Zuckern und Aminosäuren
Die Wirkung von Zuckern auf rhIL-2-Lagerstabilität wurde für Sorbitol, Saccharose und Mannitol in Formulierungen, enthaltend 0,2 mg/ml rhIL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 270 mM von einem dieser Zucker, untersucht. Die Menge an löslichem rhIL-2, das in den Stabilitätsproben verblieb, wurde gegen die Inkubationszeit eingetragen, wie in 1 gezeigt. Die Kurven von Saccharose und Mannitol, die übereinander gelegt sind und ihre Wirkungen auf die IL-2-Lagerstabilität zeigen, sind ähnlich. Die Kurve für Sorbitol ist leicht höher als die anderen zwei Zucker, was darauf schließen läßt, daß Sorbitol eine leicht größere Stabilisierungswirkung als die anderen zwei Zucker besitzt.
Die Wirkung von Aminosäuren auf die Lagerstabilität wird in 2 gezeigt. Die Formulierungen enthielten 0,1 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 150 mM von einer der neun gewählten Aminosäuren. Wie in 2 gezeigt, ist der Stabilitätsrang Arg > Asp > Lys > Met > Asn > Leu = Ser = Pro = Gly.
Die stabilisierende Wirkung von Sorbitol und Arginin wurde in weiteren Studien bestätigt, was zeigte, daß die rhIL-2-Lagerstabilität in einer konzentrationsabhängigen Weise beeinflußt wurde. Daher wird die rhIL-2-Lagerstabilität verbessert, wenn die Sorbitolkonzentration von 50 mM auf 150 mM und schließlich auf 270 mM (3) erhöht wird. Ebenso erhöht sich die rhIL-2-Lagerstabilität mit Erhöhung der Konzentration an Arginin in der Formulierung (4).
1.B. Wirkung des Formulierungs-pH
Die pH-Lagerstabilitätsprofile von rhIL-2 in Formulierungen, enthaltend NaCl, Sorbitol und Arginin, wurden untersucht. Halbwertszeiten für das restliche lösliche IL-2 bei 50°C werden gegen den pH in 5 eingetragen. Die Halbwertszeit (t_1/2) wurde hier als die Zeit definiert, die für eine 50%ige Verringerung des löslichen Proteins in Stabilitätsproben notwendig ist. Größere Halbwertszeit gibt größere Lagerstabilität an.
Wie in 5 gezeigt, hängt das pH-Optimum zum Stabilisieren von rhIL-2 gegen die Proteinaggregation von dem Stabilisator ab, der in der Lösung vorliegt. Die maximale Lagerstabilität von rhIL-2 in NaCl wird bei pH 4 erreicht, wo rhIL-2 eine Halbwertszeit bei 50°C von ungefähr 23 Tagen aufweist. rhIL-2 in Sorbitolformulierungen zeigt erhöhte Stabilität, wenn sich der pH verringert, wobei die maximale Stabilität bei pH 5 auftritt, wo die Halbwertszeit bei 50°C etwa 26 Tage beträgt. Die größte Stabilität (d. h., längste Halbwertszeit) könnte mit Arginin als Stabilisator in einer Formulierung mit einem pH von etwa 6,0 erreicht werden, wo die Halbwertszeit des Proteins bei 50°C etwa 22 Tage betrug. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß Arginin ein bevorzugter Stabilisator in bezug auf Sorbitol oder NaCl ist, da der optimale pH für die Proteinstabilisierung bei einem stärker physiologisch akzeptablen pH auftritt.
1.C. Wirkung des Puffersystems
Es ist vollkommen üblich, ein 10-mM-Puffersystem in einer Formulierung zu verwenden, um einen genauen pH bereitzustellen und um eine bestimmte Menge an Pufferkapazität zu erhalten. Beispielsweise kann eine Formulierung mit pH 5,8 beispielsweise unter Verwendung von 10 mM eines Gemisches aus Bernsteinsäure und ihrer Salzform, wie Natriumsuccinat, erreicht werden. Wenn ein solches Puffersystem ausgewählt wird, können 150 mM Arginin-HCl, aber nicht 150 mM Argininbase, als der primäre Stabilisator in der Formulierung verwendet werden, da 150 mM Argininbase verbieten würde, daß der pH durch den 10 mM Puffer runter auf 5,8 eingestellt werden würde.
Jedoch verursacht Arginin-HCl eine höhere Osmolarität als Argininbase. Daher ist eine Formulierung, enthaltend 150 mM Arginin-HCl, eingestellt auf pH 5,8 mit 10 mM Bernsteinsäure und Natriumsuccinatpuffer, bereits nahe an Isotonizität, mit einer Osmolarität von etwa 253 mmol/kg und einer Halbwertszeit bei 50°C von etwa 8 Tagen (Tabelle 1). Eine noch höhere Konzentration von Arginin in der Formulierung ist wünschenswert, da sich die Lagerstabilität mit Zunahmen dieses Stabilisators erhöht. Wenn die Konzentration von Arginin auf 230 mM unter Zugabe von Arginin-HCl erhöht wird und der pH auf 5,8 mit 10 mM Bernsteinsäure und Natriumsuccinatpuffer eingestellt wird, wird die Halbwertszeit bei 50°C verdoppelt (etwa 17 Tage), aber dennoch ist die Lösung hypertonisch mit einer Osmolarität von etwa 372 mmol/kg.
Wenn Bernsteinsäure, die als das Puffersystem diente, um den Lösungs-pH auf 5,8 einzustellen, und Arginin als Argininbase vorlag, führte die Erhöhung der Konzentration der Argininbase auf 230 mM zu einer ähnlichen Verdopplung der Halbwertszeit bei 50°C, die sich auf etwa 16 Tage erhöhte. Jedoch wurde diese Erhöhung der Lagerstabilität erreicht, während die Lösung nahezu isotonisch gehalten wurde, wobei die Formulierung eine Osmolarität von etwa 271 mmol/kg (siehe Tabelle 1) aufwies. In dieser Weise konnten 230 mM Argininbase in der Formulierung verwendet werden, um die Lagerstabilität von rhIL-2 ohne Überschreitung der Isotonizität der Formulierung zu erhöhen.
Tabelle 1: Lösungsosmolarität und Lagerstabilität von rhIL-2-Formulierungen.
Die Lagerstabilität wird in Halbwertszeiten (t_1/2) für das restliche lösliche rhIL-2 gezeigt, gemessen durch RP-HPLC nach der Lagerung bei 50°C. Arginin-HCl-Formulierungen enthielten 0,5 mg/ml rhIL-2, 1 mM EDTA und 150 mM oder 230 mM L-Arginin-HCl und 10 mM Bernsteinsäure und Natriumsuccinat, um den pH auf 5,8 einzustellen. Argininbaseformulierungen enthielten 0,5 mg/ml rhIL-2, 1 mM EDTA und 150 mM oder 230 mM L-Argininbase und 81 mM oder 128 mM Bernsteinsäure, um den pH auf 5,8 einzustellen.
Diese zwei pH-Einstellungsverfahren wurden mit anderen Puffersystemen (Tabelle 2) untersucht. Wenn 150 mM Arginin-HCl in der Formulierung verwendet wurden und der pH auf 5,8 durch 10 mM einer Säure und ihres Natriumsalzes eingestellt wurde, waren alle Formulierungen unter isotonisch, was ungefähr 290 mmol/kg beträgt. Die Halbwertszeit bei 50°C für das rhIL-2 in diesen Formulierungen lag zwischen etwa 15 und etwa 20 Tagen. Wenn 230 mM Argininbase in der Formulierung verwendet wurden und der pH auf 5,8 unter Verwendung einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, als das Puffersystem titriert wurde, zeigten Formulierungen mit einem pH, der mit Zitronensäure oder Bernsteinsäure eingestellt wurde, Lösungsosmolaritäten noch unter isotonisch, während andere Formulierungen entweder leicht über isotonisch, wie in dem Fall von Phosphorsäure, waren, oder hypertonisch, wie in dem Fall von Glutamin- oder Essigsäure, waren. Jedoch wurde die Halbwertszeit bei 50°C für alle Formulierungen auf über 30 Tage erhöht. Daher konnte durch die Verwendung von Zitronensäure oder Bernsteinsäure, beide im wesentlichen frei von ihrer Salzformen, als das Puffersystem die Konzentration von Arginin auf 230 mM unter Verwendung von Argininbase erhöht werden, was zu einer erhöhten Lagerstabilität von rhIL-2 führte.
Tabelle 2: Lösungsosmolarität und Lagerstabilität von rhIL-2-Formulierungen.
Die Lagerstabilität wird in Halbwertszeiten (t_1/2) für restliches lösliches rhIL-2 gezeigt, gemessen durch RP-HPLC nach der Lagerung bei 50°C. Alle Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml rhIL-2, 5 mM Methionin, 1 mM Dinatrium-EDTA, 0,1% Polysorbat 80 und 150 mM L-Arginin-HCl mit einem pH, eingestellt auf 5,8 durch 10 mM einer Säure und ihres Natriumsalzes, oder 230 mM L-Argininbase mit einem pH, eingestellt auf 5,8 durch Titrieren mit einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist.
1.D. Wirkung der Proteinkonzentration
Die Wirkung der Proteinkonzentration auf die Lagerstabilität wurde in einer Formulierung, enthaltend 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 150 mM Arginin, untersucht. Wie in 6 gezeigt, bei der die Halbwertszeit bei 50°C für lösliches rhIL-2 gegen die anfängliche Proteinkonzentration eingetragen wurde, erhöht sich die rhIL-2-Lagerstabilität, wenn sich die Proteinkonzentration verringert. Diese Entdeckung ist eine Übereinstimmung mit der experimentellen Beobachtung, daß die Aggregation der Hauptabbauweg für rhIL-2 in flüssigen Formulierungen ist.
1.E. Wirkung des nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels Polysorbat 80
Die Wirkung von Polysorbat 80 (Tween 80 oder Tw 80) auf die rhIL-2-Lagerstabilität wurde in einer Formulierung getestet, enthaltend 0,5 mg/ml IL-2, 230 mM Argininbase, 128 mM Bernsteinsäure, um den pH auf 5,8 einzustellen, 1 mM EDTA und 0, 0,02 und 0,1% Polysorbat 80. Wie in Tabelle 3 gezeigt, zeigen beide Formulierungen, die Polysorbat 80 enthalten, eine Reduktion der Halbwertszeit von löslichem IL-2 bei 50°C von 16 Tagen bis etwa 9 Tage, wie durch RP-HPLC gemessen. Daher würde die Einführung von Polysorbat 80 in die Formulierung als ungünstig wahrgenommen werden, ausschließlich basierend auf seiner Wirkung auf die Proteinaggregation. Jedoch weist dieses Mittel eine stabilisierende Wirkung gegenüber akuter Proteinschädigung, die mit Gefrier-Tauen und mechanischer Scherung verbunden ist, auf, was während des Verarbeitens der flüssigen Formulierungen, die dieses Protein enthalten, vorteilhaft ist, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
Die Lagerstabilität der zwei Sorbitol-basierenden Formulierungen wurde ebenso untersucht. Obwohl ihre Halbwertszeiten durch RP-HPLC und Bioaktivität mit den Argininformulierungen verglichen wurden, waren die Halbwertszeiten, die aus SEC-HPLC geschätzt wurden, viel kleiner, was darauf schließen läßt, daß ein größerer Teil des rhIL-2-Proteins in diesen Formulierungen wahrscheinlich in löslichen aggregierten Formen vorliegt. Tabelle 3: Halbwertszeiten (t_1/2) oder restliches lösliches rhIL-2 (Peak B), gemessen durch RP-HPLC, SEC-HPLC und den in vitro-Bioassay in rhIL-2 Formulierungen, gelagert bei 50°C.

NaSuc: = Natriumsuccinat

In Tabelle 3 ist die Halbwertszeit für eine Argininbase-Bernsteinsäure-rhIL-2-Formulierung, wie durch das RP-HPLC-Verfahren bestimmt, etwas kleiner als die, die durch das SEC-HPLC-Verfahren bestimmt wurde, und ist viel kleiner als die, die durch das in vitro-Bioassay-Verfahren bestimmt wurde. Die Elution der Haupt-rhIL-2-Spezies auf SEC-HPLC wurde bewertet, um diese Unterschiede weiter zu untersuchen. Die Proben mit und ohne Behandlung von SDS, Harnstoff und DTT zeigten keine Veränderung der Elutionszeit für die Hauptspezies, was zeigt, daß das rhIL-2 in diesen Formulierungen als eine monomere Spezies vorlag. Jedoch kann das SEC-HPLC-Protokoll nicht in der Lage sein, andere monomere Spezies, beispielsweise die Peak-A-oxidative Methioninspezies, von der monomeren intakten Hauptspezies, der Peak-B-Spezies, zu unterscheiden. Deshalb würde ein kleiner Unterschied bei der Bestimmung der Halbwerstzeit erwartet werden.
Der in vitro-Bioassay, der verwendet wurde, um die Bioaktivität in den Daten, die in Tabelle 3 dargestellt sind, zu bestimmen, wurde mit 0,1% SDS in dem Assayverdünnungsmittel durchgeführt. Daher wurden vor der Anwendung der Proben auf die Gewebekulturplatte, um mit den Mäuse-HT-2-Zellen zu interagieren, die Proben mit dem Assayverdünnungsmittel verdünnt, enthaltend 0,1% SDS. Es war möglich, daß die Verdünnung mit SDS einige rhIL-2-Aggregate in diesen Proben zurück zu der monomeren Form aufspaltete, was zu einer Überschätzung der Bioaktivität einer gegebenen Formulierung führte. Deshalb wurden die Stabilitätsproben unter Verwendung von Assayverdünnungsmittel mit (+S) und ohne (–S) Zugabe von SDS analysiert. Die Proben wurden ebenso mit (+F) und ohne (–F) einer 0,2-μm-Filtrationsbehandlung analysiert, da die Filtration große Proteinaggregate, wie durch optische Untersuchung beurteilt, entfernen kann. Die Bioaktivitätswerte, gemessen für Proben mit diesen Behandlungen, werden in Tabelle 4 zusammen mit den Lagerstabilitätsergebnissen gezeigt, die unter Verwendung des RP-HPLC-Protokolls zum Vergleich erhalten wurden. Die Werte werden als ein Prozentsatz der Bioaktivitätswerte, die in ähnlichen Proben erhalten wurde, gelagert bei –70°C, dargestellt.
Im allgemeinen zeigen die Formulierungen, die mit SDS verdünnt und nicht vor dem Kontakt mit HT-2-Zellen filtriert wurden, höhere Bioaktivitätswerte als die Formulierungen, die ohne SDS in dem Assayverdünnungsmittel verdünnt und vor dem Durchlauf des Assays filtriert wurden. Unter diesen Bioaktivitätsergebnissen sind die, die unter Verwendung von Filtration und Verdünnung ohne SDS erhalten wurden, vollständig mit den RP-HPLC-Ergebnissen vergleichbar. Daher wird dieses Verfahren für die wahre Bioaktivitätsmessung für monomeres rhIL-2 empfohlen.
Tabelle 4: Vergleich von Ergebnissen zwischen RP-HPLC-Analyse für lösliches rhIL-2 und in vitro-Bioaktivitäts-Analyse für Stabilitätsproben, gelagert 2 Wochen bei 40°C oder 50°C.
Alle Ergebnisse werden als Prozentsätze von denen, die für ihre jeweiligen –70°C-Proben erhalten wurden, dargestellt. Die Formulierungen enthielten 0,5 mg/ml rhIL-2, 230 mM L-Argininbase, 128 mM Bernsteinsäure bei pH 5,8 und 1 mM EDTA mit (#1) und ohne (#2) 0,1% Polysorbat 80. Proben für den Bioassay wurden mit und ohne eine 0,22-μm-Filtration vor der Verdünnung unter Verwendung von Verdünnungsmitteln mit und ohne 0,1% SDS behandelt.

a „–F" für nicht-filtriert. „+F" für filtriert. „–S" für Verdünnungsmittel ohne SDS und „+S" für Verdünnungsmittel mit SDS.
b Dies ist das empfohlene Protokoll für monomeres IL-2.

1.F. Konservierungskompatibilität
Die Konservierungskompatibilität wurde hinsichtlich der Notwendigkeit zur Entwicklung einer Mehrfachdosierungsformulierung untersucht. Die Wirkung von Konservierungsmitteln auf die IL-2-Stabilität wurde in zwei beschleunigten Studien bewertet. Studie 1 screente Benzylalkohol, m-Cresol und Phenol in einer Formulierung, enthaltend 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 160 mM Arginin. Studie 2 screente Benzethoniumchlorid, Benzalkoniumchlorid, Methylparaben/Propylparaben und Chlorbutanol in einer Formulierung, enthaltend 0,2 mg/ml IL-2, 230 mM L-Argininbase, 128 mM Bernsteinsäure bei pH 5,8, 1 mM Dinatrium-EDTA, 0,1% Polysorbat 80. Die Halbwertszeiten für lösliches rhIL-2, gemessen durch RP-HPLC für diese Formulierungen, gelagert bei 40°C, werden in Tabelle 5 dargestellt.
Alle getesteten Konservierungsmittel verringerten die rhIL-2-Stabilität bei erhöhter Temperatur. In Studie 1 betrug die Halbwertszeit für das lösliche rhIL-2 etwa 74 Tage bei 40°C ohne jegliche Konservierungsmittel. Die Zugabe von Benzylalkohol oder m-Cresol oder Phenol verringerte die Halbwertszeit signifikant um das 5- bis 10fache. In Studie 2 waren die Wirkungen der Konservierungsmittel weniger intensiv. Die Halbwertszeit für das lösliche rhIL-2 verringerte sich weniger als die Hälft für Benzethoniumchlorid und verringerte sich mehr als das 2fache für andere Konservierungsmittel. Insgesamt weist Benzethoniumchlorid die geringste Reduktion der rhIL-2-Stabilität unter den getesteten Konservierungsmitteln auf.
Tabelle 5: Halbwertszeit (t_1/2) des löslichen rhIL-2 bei 40°C für Formulierungen, die Konservierungsmittel enthielten.
Studie 1: Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml rhIL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6, 150 mM L-Arginin und Konservierungsmittel. Studie 2: Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml rhIL-2, 230 mM L-Argininbase, 128 mM Bernsteinsäure bei pH 5,8, 1 mM Dinatrium-EDTA, 0,1% Polysorbat 80 und Konservierungsmittel.
Obwohl Konservierungsmittel eine ausgeprägte destabilisierende Wirkung auf rhIL-2 bei erhöhter Temperatur haben, wurden ihre Wirkungen auf die rhIL-2-Kurzzeitlager stabilität bei 4°C oder 25°C ebenso untersucht. Eine neue Studie wurde durchgeführt, um sechs Konservierungsmittel in einer selben Formulierung, enthaltend 0,2 mg/ml rhIL-2, 230 mM L-Argininbase, 128 mM Bernsteinsäure, 1 mM EDTA, 5 mM Methionin und 0,1% Polysorbat 80 bei pH 5,8, zu untersuchen. Tabelle 6 zeigt Ergebnisse der Menge an löslichem rhIL-2, das nach einem Jahr Lagerung erhalten wurde. Alle Formulierungen zeigen, wenn sie mit der Kontrolle verglichen werden, keinen signifikanten Verlust in dem Gehalt an löslichem rhIL-2 durch sowohl RP-HPLC als auch den in vitro-Bioassay mit Ausnahme der Formulierung, die 0,25% m-Cresol enthielt, die nachweislichen Verlust zeigte.
Tabelle 6. Einjährige Lagerstabilität von Konservierungsmittel-enthaltenden Formulierungen bei 4°C oder 25°C, dargestellt in Prozent des gesamten restlichen löslichen rhIL-2, wie durch RP-HPLC-integrierte Peakflächen und die in vitro-Bioaktivität gemessen.
Die Kontrollformulierung enthielt 0,2 mg/ml IL-2, 230 mM L-Argininbase, 128 mM Bernsteinsäure, 1 mM EDTA, 5 mM Methionin und 0,1% Polysorbat 80 bei pH 5,8.
Beispiel 2: Wirkungen von verschiedenen Faktoren auf Methioninoxidation und Lagerstabilität von rhIL-2
Methioninoxidation in IL-2 ist zuvor charakterisiert worden (Kunitani et al. (1986) J. Chromatography 359: 391–402; Sasaoki et al. (1989) Chem. Pharm. Bull. 37(8): 2160–2164). IL-2 weist vier Methioninreste an Reststellungen 23, 39, 36 und 104 auf der Polypeptidkette auf. Unter diesen ist Met¹⁰⁴ auf der Proteinoberfläche und ist meistens oxidativ. Die oxidative Methioninspezies kann als eine früher eluierende Spezies (Peak A) zu der Haupt-IL-2-Spezies (Peak B) aus dem RP-HPLC-Chromatogramm aufgespalten werden. Met²³ und Met³⁹ neigen weniger zur Oxidation, die nur unter extrem oxidativen Bedingungen stattfindet, wahrscheinlich aufgrund ihrer Existenz im Inneren des Proteinmoleküls. Die oxidative Spezies von diesen MET-Resten kann als frühere Spezies als das Met¹⁰⁴ auf RP-HPLC eluieren. Met⁴⁶ ist tief im Inneren des Proteinmoleküls versteckt und wird nicht leicht oxidiert, wenn sich das Protein vollständig auffaltet.
Die Untersuchung der Methioninoxidation in IL-2 konzentrierte sich auf die Oxidation von Met¹⁰⁴, da es der anfälligste Methioninrest für die Oxidation ist, und die Verhinderung seiner Oxidation wird ebenso die Oxidation anderer Methioninreste verbieten.
2.A. Wirkung des pH
Methioninoxidation wurde bei einem pH-Bereich von 3 bis 9 in Formulierungen untersucht, die 0,2 mg/ml IL-2, 150 mM NaCl und 10 mM verschiedene Pufferspezies enthielten. Die Methioninoxidation in diesen Formulierungen wurde durch Quantifizieren des Prozentsatzes der Peak-A-Spezies (d. h., die Met¹⁰⁴-oxidierte Spezies) in IL-2-Proben bei t = 0 und t = 3 Monaten untersucht. Wie in Tabelle 7 dargestellt, wird die Wirkung des pH nicht bei t = 0 notiert, außer in dem Puffer, der durch Citrat bei pH 6 gepuffert wurde. Im Vergleich mit anderen Proben, die 5% der Peak-A-Spezies aufweisen, zeigte die Citratprobe eine Erhöhung des Gehalts an Peak A auf 6%.
Bei t = 3 Monate wird der Gehalt an Peak A auf höhere pH-Bedingungen erhöht, was auf einen Base-katalysierten Mechanismus für die Methioninoxidation von Met¹⁰⁴ schließen läßt. Bei pH 6 ist Succinat ein besserer Puffer als Citrat beim Minimieren der Methioninoxidation, da niedrigere Werte an Peak A in der Succinatformulierung beobachtet werden.
Tabelle 7: RP-HPLC-Analyse der Methioninoxidation, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtmenge an löslichem IL-2 (Peak A + Peak B), das als die Methionin-oxidierte Peak-A-Spezies vorliegt (% Peak A an gesamtem löslichem IL-2) für pH 3 bis pH 9 Formulierungsproben bei t = 0 und 3 Monaten.
Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml IL-2, 150 mM NaCl und einen pH, eingestellt durch 10 mM verschiedener Pufferspezies.
2.B. Wirkungen von EDTA, Polysorbat 20, Polysorbat 80 und MgCl₂
Die Wirkungen eines Metallchelatbildners, zwei nicht-ionischer oberflächenaktiver Mittel und eines zweiwertigen Metallions auf die Methioninoxidation werden in Tabelle 8 dargestellt. Die Gegenwart von Polysorbat 20 oder Polysorbat 80 in den Formulierungen erhöht den Gehalt an oxidativer Methioninspezies bei sowohl t = 0 als auch t = 1 Monat. Im Gegensatz dazu verringern EDTA und MgCl₂ den Gehalt an oxidativer Methioninspezies nach 1 Monat Lagerung bei 40 und 50°C.
Tabelle 8: Prozentsatz der Gesamtmenge an löslichem IL-2 (Peak A + Peak B), das als die Methionin-oxidierte Peak-A-Spezies (% Peak A) in IL-2-Proben bei t = 0 und t = 1 Monat vorliegt
Die Kontrollprobe enthielt 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 150 mM Arginin.
2.C. Wirkung von Methionin
Die Zugabe von Methionin in Formulierungen, um die Methioninoxidation von IL-2 zu verhindern, wurde untersucht. Tabelle 9 zeigt die Veränderung im Peak A und der Gesamtmenge an löslichem IL-2 (Peak A + Peak B) für Formulierungen, enthaltend variierende Mengen an Methionin, nach 2 Wochen Lagerung bei 50°C. Das Erhöhen der Methioninkonzentration in den Formulierungen verringert den Gehalt an Peak A signifikant bei sowohl t = 0 als auch 2 Wochen, während die Menge an erhaltenem löslichem IL-2 nach 2 Wochen Lagerung nicht beeinflußt wird. Bei 5 mM Methionin wird eine 3fache Abnahme in Peak A bei t = 2 Wochen beobachtet. Daher führt die Zugabe von Methioninresten zu einer signifikanten Verringerung der Methioninoxidation des Proteins und weist wenig Wirkung auf die IL-2-Aggregation auf.
Tabelle 9: Veränderung im Peak A und im gesamten löslichen Protein in IL-2-Proben bei t = 0 und t = 2 Wochen bei 50°C.
Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml IL-2, 230 mM Arginin, 128 mM Bernsteinsäure bei pH 5,8, 1 mM EDTA, 0,1% Polysorbat 80 und 0 bis 10 mM Methionin.
Zusätzlich zu den Ergebnissen bei hoher Temperatur wurde der Gehalt an Methioninoxidation bei 4°C und 25°C nach 3 Monaten Lagerung für Formulierungen mit und ohne 5 mM Methionin ebenso aufgezeichnet. Wie in Tabelle 10 gezeigt, führte die Gegenwart von 5 mM Methionin in den Formulierungsergebnissen zu einer 3fachen Verringerung des Gehalts von Peak A bei sowohl 4°C als auch bei 25°C. Daher verhinderte die Zugabe von 5 mM Methionin effektiv die Oxidation von Met¹⁰⁴.
Tabelle 10: Gehalt an Methioninoxidation, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtmenge an löslichem IL-2 (Peak A + Peak B), das als die Methionin-oxidierte Peak-A-Spezies vorliegt (% Peak A an gesamtem löslichem IL-2) und Prozentsatz an restlichem löslichem IL-2 in Proben, gelagert für 3 Monate bei entweder 4°C oder bei 25°C.
Formulierungen enthielten 0,2 mg/ml IL-2, 230 mM Arginin, 128 mM Bernsteinsäure bei pH 5,8, 1 mM EDTA, 0,1% Polysorbat 80 und 0 oder 5 mM Methionin.
2.D. Wirkung der Sauerstoffentfernung durch Stickstoffspülung und Entgasung
Das Entfernen von Sauerstoff in IL-2-Probenphiolen zur Minimierung der Methioninoxidation wurde getestet. Luft im Kopfraum einer 3-cm³-Phiole mit 1 ml IL-2-Probenfüllung wurde mit Stickstoff gespült. Gelöster molekularer Sauerstoff wurde durch Vakuumentgasung entfernt. Tabelle 11 zeigt die Veränderung im Peak A und der Gesamtmenge an löslichem IL-2 (Peak A + Peak B) nach 1 Woche Lagerung bei 50°C für diese Proben. Die Stickstoffspülung allein verringerte den Prozentsatz der oxidativen Methioninspezies von 6,7% auf 6,2% leicht. Die Kombination von Lösungsentgasung und Stickstoffspülung des Kopfraums verringert weiter den Gehalt an Peak A um etwa einen Prozentpunkt. Andererseits bleibt der Prozentsatz der Gesamtmenge an löslichem IL-2 mit entweder der Stickstoffspülung oder -entgasung unverändert.
Tabelle 11: Veränderung der Gesamtmenge an löslichem IL-2 (Peak A + Peak B), das als die Methionin-oxidierte Peak-A-Spezies vorliegt (% Peak A) und im Prozentsatz der Gesamtmenge an restlichem löslichem IL-2 in Proben, abgezogen bei t = 0 und t = 1 Woche bei 50°C.
Formulierungen enthielten 0,3 mg/ml IL-2, 230 mM Arginin, 128 mM Bernsteinsäure, 1 mM EDTA und 0,1% Polysorbat 80.
2.E. Wirkung von Konservierungsmitteln
Die Wirkung von Konservierungsmitteln auf die Methioninoxidation wurde untersucht. Tabelle 12 zeigt die Veränderung im Peak A für Formulierungsproben mit und ohne eines der sechs Konservierungsmittel nach 6 und 12 Monaten Lagerung bei 4°C und bei 25°C. Alle Formulierungen, die Konservierungsmittel enthielten, zeigten einen ähnlichen Gehalt an Peak A wie die Kontrolle, was zeigt, daß die Konservierungsmittel keine nachweisbare Wirkung auf die Methioninoxidation aufweisen, außer in der Formulierung, die 0,25% m-Cresol enthielt, die eine signifikante Erhöhung des Peak-A-Gehalts zeigte.
Tabelle 12. Prozentsatz der Gesamtmenge an löslichem IL-2 (Peak A + Peak B), das als die Methionin-oxidierte Peak-A-Spezies (% Peak A) in verschiedenen Konservierungsmittel-enthaltenden Formulierungen vorliegt, gelagert bei 6 Monaten und 12 Monaten bei 4°C und 25°C.
Die Kontrollformulierung enthielt 0,2 mg/ml IL-2, 230 mM L-Argininbase, 128 mM Bernsteinsäure, 1 mM EDTA, 5 mM Methionin, 0,1% Polysorbat 80, bei einem pH von 5,8.
Beispiel 3: Wirkung von verschiedenen Faktoren auf die Desamidierung von IL-2
Die Desamidierung von IL-2 ist zuvor berichtet worden (Kunitani et al. (1986) J. Chromatography 359: 391–402). Es ist entdeckt worden, daß Asp⁸⁸ die primäre Stelle für die Desamidierung in IL-2 ist (Sasaoki et al. (1992) Chem. Pharm. Bull. 40(4): 976–980). Desamidierte Spezies kann durch RP-HPLC als ein Rückenschulterpeak (Peak B') zu der Hauptspezies (Peak B) nachgewiesen werden. IL-2-Desamidierung wurde in Formulierungen untersucht, die Arginin, NaCl und Sorbitol enthielten. Tabelle 13 zeigt, daß die desamidierte Spezies nur in Formulierungen, die Sorbitol und NaCl enthielten, aber nicht in Formulierungen, die Arginin enthielten, nach der Inkubation bei erhöhten Temperaturen für 2 Wochen nachgewiesen werden kann. Deshalb stabilisiert Arginin IL-2 gegen den Abbau durch Desamidierung.
Tabelle 13: Desamidierung, detektiert durch RP-HPLC von Peak-B'-Spezies in Formulierungen, enthaltend 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 150 mM Arginin, 150 mM NaCl oder 270 mM Sorbitol.
Beispiel 4: Wirkung von Gefrier-Tauen auf die IL-2-Stabilität
Gefrier-induzierte Proteinschädigung wird normalerweise durch drei Mechanismen verursacht: (1) das Protein ist konformationsinstabil bei kalten Temperaturen (Kaltdenaturierung); (2) das Protein ist anfällig für Denaturierung auf der Eiswassergrenzfläche; (3) das Protein wird geschädigt durch Veränderungen in der Salzkonzentration oder pH-Verschiebung beim Gefrieren.
In dem Fall von IL-2 wird der Proteinverlust während des Gefrier-Tauens wahrscheinlich durch Denaturierung und Aggregation auf der Eiswassergrenzfläche verursacht, da das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel Polysorbat 80 effektiv IL-2 vor Gefrier-Tau-Schädigung schützt. Wie in 7 gezeigt, verringert sich die Menge an löslichem IL-2 bei jedem Gefrier-Tau-Kreislauf in einer Formulierung, die 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6 und 150 mM Arginin enthielt. Die Zugabe von Polysorbat 80 in der Formulierung erhöht die IL-2-Stabilität gegen mehrfaches Gefrier-Tauen. Wenn die Konzentration von Polysorbat 80 0,05% und darüber erreicht, wird IL-2 vollständig vor Gefrier-Tau-Schädigung geschützt.
Beispiel 5: Wirkung von mechanischer Scherung auf IL-2-Stabilität
5.1. Wirkung von Polysorbat 80, EDTA, Proteinkonzentration und Füllvolumen.
Studien wurden durchgeführt, um den Scherspannungs-induzierten Verlust von löslichem IL-2 zu untersuchen. Zwei Typen an Scherspannungen wurden analysiert: Schütteln auf einer Orbital-Schüttelvorrichtung (VWR Scientific, Kat. Nr. 57018-754) und Verwirbeln auf einem Vortexer (Fisher Scientific, Model Genie 2, mit der Geschwindigkeitseinstellung bei 4). Verschiedene IL-2-Formulierungen wurden in 1 ml in 3-cm³-Phiolen gefüllt. Diese Phiolen wurden in einem Kühlschrank gelagert (Kontrollproben), auf einen Labortisch über Nacht gegeben (statische Proben), bei 200 U/min über Nacht geschüttelt (Schüttelproben) oder eine Minute verwirbelt (Verwirbelungsproben). Tabelle 14 zeigt Ergebnisse der Veränderung in der Menge an löslichem IL-2 für diese Proben.
Verglichen mit den gekühlten Kontrollproben zeigen sowohl die statischen Proben als auch die Schüttelproben keinen Verlust an IL-2. Daher ist IL-2 bei Umgebungstemperatur stabil und ist für die Schüttelbehandlung stabil. Wenn andererseits diese Formulierungen eine Minute dem Verwirbeln unterzogen wurden, wurden verschiedene Mengen an Verlusten detektiert. Formulierungen, enthaltend 0,1 bis 0,5 mg/ml IL-2 oder 1 und 5 mM EDTA oder niedrigere Konzentrationen an Polysorbat 80 (0,005 bis 0,05%) zeigen alle 25 bis 50% Verlust an löslichem IL-2. Deshalb war das Verwirbeln für eine Minute schädlicher als das Schütteln über Nacht für IL-2-Moleküle. Der Verlust von IL-2 konnte durch Erhöhen der Konzentration von Polysorbat 80 in der Formulierung auf gleich oder größer als 0,1% verhindert werden. Außerdem zeigen vollständig gefüllte Phiolen ohne hinterbliebene Luft im Kopfraum ebenso minimalen Verlust von löslichem IL-2 beim Verwirbeln von einer Minute, was zeigt, daß die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche der Hauptfaktor, der die Schädigung verursacht, war.
Tabelle 14: Veränderung der Menge an löslichem IL-2 für Proben, gelagert bei Umgebungstemperatur über Nacht (statisch), geschüttelt bei 200 U/min über Nacht (Schütteln) und verwirbelt für 1 min (Verwirbeln) im Vergleich zu denen, die bei 4°C gelagert werden.
Die Kontrollformulierung enthielt 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM Natriumsuccinat bei pH 6, und 150 mM Arginin. Die Formulierung wurde mit 1 ml in 3 cm³-Glasphiolen gefüllt, außer für die vollständig gefüllte Probe, die die Kontrollprobe aufwies, die vollständig bis an den Rand der 3 cm³-Phiolen gefüllt waren, wodurch keine Luft im Kopfraum hinterblieb. Lösliches IL-2 wurde durch RP-HPLC quantitativ bestimmt.
5.2 Wirkung von Arginin
Die Wirkung von Arginin auf die IL-2-Stabilität gegen Verwirbelungsschädigung wird in Tabelle 15 angegeben. Eine Erhöhung der Argininkonzentration von 150 mM auf 230 mM führte zu einer 3%igen Erhöhung der Menge an löslichem IL-2 von 65% auf 69% nach dem Unterziehen der Verwirbelung für eine Minute. Daher wies Arginin eine geringe Wirkung auf IL-2 gegen Scherschädigung auf, obwohl es zuvor eine große Stabilisierungswirkung auf IL-2 gegen den Abbau aufgrund der Aggregatbildung zeigte.
Die Wirkung von Polysorbat 80 in der 230 mM-Argininformulierung wurde getestet. Die Zugabe einer niedrigen Konzentration von Polysorbat 80 (0,02%) destabilisierte IL-2 und die Zugabe einer hohen Konzentration von Polysorbat 80 (0,1%) stabilisierte IL-2 gegen Verwirbelungsschädigung.
Tabelle 15: Prozent die an löslichem IL-2 in verschiedenen Formulierungen bei Verwirbelung von 1 min verbleiben, wie durch RP-HPLC analysiert
5.3. Versandstudie
Scherschäden an IL-2 während des Produktversandes wurden in einer realen Versandstudie untersucht. IL-2 wurde in einer Argininformulierung und einer NaCl-Formulierung hergestellt, beide mit variierenden Mengen an Polysorbat 80. Diese IL-2-Proben wurden auf Eis per Flug von Emeryville, Kalifornien, nach St. Louis, Missouri, und von St. Louis zurück nach Emeryville versandt. 8 zeigt RP-HPLC-Analyse der Menge an löslichem IL-2 in diesen Proben. Ohne die Gegenwart von Polysorbat 80 in der Formulierung wird ein etwa 10%iger Verlust von IL-2 in sowohl Arginin- als auch NaCl-formulierten Proben beobachtet. Die Stabilitätsunterschiede zwischen der Arginin- und der NaCl-Formulierung sind geringfügig, rund 1%. Mit der Gegenwart von Polysorbat 80 in der Formulierung wird der Verlust von IL-2 verringert. Bei 0,1% Polysorbat 80 wird kein Verlust beobachtet, was angibt, daß IL-2 vollständig bei dieser Konzentration an oberflächenaktivem Mittel geschützt wurde. Daher ist 0,1% Polysorbat 80 in der Formulierung effektiv, um akute Scherschädigung von IL-2 während des Versandes zu verhindern.
Schlußendlich kann Arginin als ein primärer Stabilisator in flüssigen pharmazeutischen IL-2-Formulierungen während der Langzeitlagerung dienen, um die IL-2-Aggregation und Desamidierung zu verringern. Um die Argininkonzentration in der Formulierung weiter zu erhöhen und daher eine größere IL-2-Stabilität zu verleihen, aber noch die Lösungsisotonizität zu behalten, wird Bernsteinsäure bevorzugt verwendet, um Argininbase auf pH 5,8 zu titrieren. Außerdem können Methionin und EDTA in der Formulierung einbezogen sein, um Methioninoxidation des Proteins zu verhindern. Schließlich kann ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, wie Polysorbat 80, in die Formulierung einbezogen werden, um die Schädigung von IL-2 durch Gefrier-Tauen und mechanische Scherung zu verhindern.
Beispiel 6: Konservierungsmittel-Wirksamkeits-Test
Mehrere Formulierungen, die antimikrobielle Konservierungsmittel enthielten, sind einem United States Pharmacopoeia (USP) Konservierungsmittel-Wirksamkeits-Test unterzogen worden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 16 dargestellt, die Kontrollprobe ohne Konservierungsmittel fiel durch den Test, während alle Formulierungen, die ein Konservierungsmittel enthielten, den Test bestanden.
Tabelle 16: USP-Konservierungsmittel-Wirksamkeits-Test für rhIL-2-Formulierungen.
Die Kontrollformulierung enthielt 0,1 mg/ml rhIL-2, 230 mM L-Argininbase, 128 mM Bernsteinsäure, 1 mM EDTA, 5 mM Methionin, 0,1% Polysorbat 80, bei einem pH von 5,8.
Beispiel 7: Schmerz-erzeugende Eigenschaften
Ein Rattenmodell, entwickelt an der University of Florida, College of Dentistry, OMSDS Division of Neuroscience, wurde verwendet, um die Schmerz-erzeugenden Eigenschaften zu analysieren, spezieller der brennende und stechende Schmerz, der durch die Formulierungen erzeugt wird. Das Modell basiert auf einem Assay des Stroms, der in Sinneszellen induziert wird, die Schmerzmeldungen tragen. Um den Assay durchzuführen, werden die Sinneszellen (Rattenspinalganglion) in einer Aufzeichnungskammer isoliert. Aufzeichnungen werden aus einzelnen Zellen vorge nommen, die vorausgewählt sind, basierend auf Schmerzkriterien (Schmerzinduzierend). Brennende Schmerz-, stechende Schmerz- und standardisierte Schmerzpunkte sind für die getestete Formulierung computerisiert. Ein brennender Schmerzpunkt wird durch die Reaktion auf die Testformulierung in bezug auf Capsaicin (500 nM) definiert. Capsaicin ist hinsichtlich seiner Fähigkeit, intensiven Schmerz bei Menschen zu erzeugen, allgemein bekannt (Cooper et al. (1986) Pain 24: 93–116). Ein stechender Schmerzpunkt wird als das Verhältnis des Stroms, der durch die Testformulierung erzeugt wird, zu dem, der durch eine Lösung erzeugt wird, gepuffert auf pH 5,0, ermittelt. Der standardisierte Schmerzpunkt bezieht sich auf die Formulierung in bezug auf normale Kochsalzlösung (0,9% NaCl, nicht-gepuffert), eine übliche parenteral Krankenhauspharmazie, die bekannt dafür ist, eine stechende Empfindung zu erzeugen.
Eine flüssige L-Argininbase-Bernsteinsäure-Formulierung ist der Schmerzanalyse über dieses Modell unterzogen worden. Ergebnisse von diesen zwei Testlösungen werden in Tabelle 17 gezeigt. Basierend auf den Punkten, berechnet für brennenden Schmerz, stechenden Schmerz und standardisierten Schmerz, zeigte die L-Arginin-Bernsteinsäure-Formulierung ausgezeichnete Eigenschaften im Vergleich zu normaler Kochsalzlösung. Es wurde ebenso beobachtet, daß sich der Teststrom während der Anwendung der Formulierung verringerte (zeitabhängige Verringerung), während er sich mit normaler Kochsalzlösung nicht verringerte. Dies zeigt, daß diese Formulierung besser toleriert wird als Kochsalzlösung, wie durch diesen Assay bewertet.
Tabelle 17: Brennende, stechende und standardisierte Schmerzpunkte für die flüssige Formulierung und 0,9% NaCl.
Die flüssige Formulierung enthielt 230 mM L-Argininbase, 128 mM Bernsteinsäure, 1 mM EDTA, 5 mM Methionin, 0,1% Polysorbat 80, bei einem pH von 5,8.
Beispiel 8: Stabilitätsstudie mit TFPI – nur zur Information bereitgestellt
Stabilitäts- und Löslichkeitsstudien von TFPI in verschiedenen Formulierungen haben gezeigt, daß L-Arginin ein Stabilisator (Daten nicht gezeigt) für TFPI ist und geladene Pufferspezies wie Citrationen eine tiefere Löslichkeitswirkung aufweist. In dieser Studie wurden die Wirkungen der L-Argininkonzentration und Puffersysteme auf die TFPI-Stabilität in verschiedenen Formulierungen untersucht. Insbesondere wurde der Einfluß des Puffersystems in Form einer Säure, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, gegen ein Gemisch aus einer Säure und ihrer Salzform, getestet, wie zuvor für IL-2-Formulierungen in den vorhergehenden Beispielen angegeben.
Materialien und Verfahren
Eine TFPI-Lösung wurde auf 0,6 mg/ml in 20 mM Natriumcitrat und 300 mM L-Arginin bei pH 5,5 formuliert. Diese Lösung wurde über Dialyse bei 4°C unter Verwendung der Spectral Por #7 Membranen (MWCO 3.500, ID# 132-110) zu verschiedenen L-Argininformulierungen, gepuffert auf pH 6,5 durch entweder Citrat- oder Succinatpuffersystem, pufferausgetauscht. Nach der Dialyse wurde die TFPI-Konzentration von jeder Lösung unter Verwendung von UV/Vis-Spektroskopie gemessen. Jede Lösung wurde dann runter auf 0,15 mg/ml unter Verwendung des entsprechenden Puffers verdünnt. Die hergestellten Lösungen wurden dann (1 ml jeweils) auf 3-cm³-Phiolen hinsichtlich der Stabilitätslagerung aliquotiert. Ausreichend Phiolen wurden zu diesem Zeitpunkt für T = 0 beiseite gestellt. Der Rest der Phiolen wurde in einen 50-°C-Inkubator für eine beschleunigte Stabilitätsstudie gegeben. Die Zeitpunkte wurden dann bei 3, 7, 14 und 30 Tagen genommen. Für die Analyse zu jedem Zeitpunkt wurden die Inhalte von jeder Phiole in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und dann bei 10K U/min für ungefähr 2 Minuten zentrifugiert. Der zentrifugierte Überstand der Proben wurde aus diesem Röhrchen für die Analyse unter Verwendung von IEX-HPLC entnommen (Beschreibung benötigt), das aus vorhergehenden Studien bekannt war, ein Stabilitäts-anzeigender Assay zu sein.
Ergebnisse und Erläuterung
TFPI wurde auf 0,15 mg/ml Endkonzentration in verschiedenen Formulierungen formuliert, enthaltend entweder L-Argininbase oder L-Arginin-HCl. L-Arginin-HCl-For mulierungen wurden auf pH 5,5 durch 10 mM Zitronensäure oder Bernsteinsäure in Kombination mit ihrem jeweiligen Konjugatnatriumsalz gepuffert. L-Argininbase-Formulierungen wurden auf pH 5,5 durch entweder Zitronensäure oder Bernsteinsäure titriert. Insgesamt wurden acht Studien durchgeführt, wie nachstehend aufgelistet:

1) 20–150 mM L-Arginin-HCl, gepuffert auf pH 5,5 durch 10 mM Zitronensäure und Natriumcitrat;
2) 20–150 mM L-Argininbase, titriert auf pH 5,5 durch Zitronensäure;
3) 100–300 mM L-Arginin-HCl, gepuffert auf pH 5,5 durch 10 mM Zitronensäure und Natriumcitrat;
4) 100–300 mM L-Argininbase, titriert auf pH 5,5 durch Zitronensäure;
5) 20–150 mM L-Arginin-HCl, gepuffert auf pH 5,5 durch 10 mM Bernsteinsäure und Natriumsuccinat;
6) 20–150 mM L-Argininbase, titriert auf pH 5,5 durch Bernsteinsäure;
7) 100–300 mM L-Arginin-HCl, gepuffert auf pH 5,5 durch 10 mM Bernsteinsäure und Natriumsuccinat und
8) 100–300 mM L-Argininbase, titriert auf pH 5,5 durch Bernsteinsäure.

Der Hauptabbauweg für TFPI wurde zuvor bestimmt und war Proteinaggregation/-ausfällung (Chen et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88: 881–888). Dem TFPI-Abbau kann die Beobachtung des restlichen löslichen Proteins in Stabilitätsproben folgen. TFPI-Lösungen, formuliert bei unterschiedlichen L-Argininkonzentrationen, wurden bei 50°C für eine beschleunigte Stabilitätsstudie gelagert. Die Proben wurden bei vorbestimmten Zeitintervallen genommen. Lösliches Protein in den Proben wurde von dem aggregierten/ausgefällten Protein durch Zentrifugation in einem Mikrozentrifugenröhrchen entfernt. Die Menge an löslichem Protein wurde durch das IEX-HPLC-Verfahren (Chen et al. (1999) J. Pharm. Sci. 88: 881–888) bestimmt. Die Daten wurden dann als eine Funktion der Lagerungszeit durch eine einfache exponentielle kinetische Gleichung angepaßt (Y = YoEXP(–k1t)), um die Halbwertszeit für das restliche lösliche Protein unter Verwendung der KaleidaGraph Graphiksoftware (Synergy Software, Reading Pennsylvania) zu berechnen.
Die Halbwertszeitwerte (t_1/2) für das restliche lösliche TFPI für die Formulierungen, gepuffert durch Citratzugabe oder Natriumcitrat, werden in Tabelle 18 gezeigt. Die für die Formulierungen, gepuffert durch Bernsteinsäure oder Natriumsuccinat, werden in Tabelle 19 gezeigt. Diese Daten zeigen, daß sich der Halbwertszeitwert mit zunehmender L-Argininkonzentration in diesen Formulierungen erhöht. Diese Daten werden ebenso in 9 und 10 für Citrat- bzw. Succinat-Puffersysteme eingetragen. Der Halbwertszeitwert wird als eine parabolische Kurve aufgezeichnet und erhöht sich als Funktion der Argininkonzentration. Dies ermöglicht, daß L-Arginin ein Stabilisator für TFPI ist.
Zwischen den zwei Puffersystemen scheint der Unterschied in der TFPI-Stabilität geringfügig zu sein. Obwohl das Citratpuffersystem mehr Variabilität zeigte (9), waren die zwei Halbwertszeit gg. Argininkonzentrationskurven für das Succinatpuffersystem im wesentlichen deckungsgleich (10). TFPI erreichte ähnliche Stabilität bei ähnlicher L-Argininkonzentration, ungeachtet welches der Puffersysteme für die pH-Einstellung verwendet wurde. 11 vergleicht ebenso die Halbwertszeit gg. Argininkonzentrationskurven zwischen dem Bernsteinsäurepuffersystem und dem Zitronensäuresystem. Diese Figur zeigt, daß es keinen Hauptunterschied in der TFPI-Stabilität gibt, so lange wie die Argininkonzentration in der Formulierung dieselbe bleibt. Diese Daten zeigen, daß die stabilisierende Wirkung hauptsächlich aus dem Beitrag von Arginin stammt.
Jedoch erlaubt die Säuretitration mit entweder Bernstein- oder Zitronensäure eine größere Konzentration an Arginin in der Formulierung (und daher erhöhte Stabilität) während der Aufrechterhaltung der Isotonizität. Daher haben beispielsweise beide Formulierungen 3-3 und 4-3 in Tabelle 18 300 mM L-Arginin in den Formulierungen und ihre Halbwertszeitwerte sind ähnlich. Jedoch verwendete die 3-3 Formulierung 10 mM Zitronensäure und Natriumcitrat, um 300 mM L-Arginin-HCl auf pH 5,5 zu puffern, und wies eine Lösungsosmolarität von 497 mOsm/kg auf. Dies ist eine hypertonische Formulierung und ist als injizierbare Formulierung nicht bevorzugt. Andererseits verwendete die 4-3 Formulierung 121 mM Zitronensäure in Kombination mit 300 mM L-Argininbase, um den pH auf 5,5 einzustellen, und wies eine Lösungsosmolarität von 295 mOsm/kg auf.
Diese Formulierung liegt sehr nah an einer isotonischen Lösung (290 mmol/kg), und ist daher eine stärker bevorzugte injizierbare Formulierung. Wenn ein konventioneller Weg zur pH-Einstellung verwendet wurde, beispielsweise mit 10 mM Zitronensäure und Natriumcitrat, konnte man nur leicht mehr als 150 mM L-Arginin zu der Formulierung ohne Überschreiten der Isotonizität hinzufügen. Die Halbwertszeit der 150-mM-L-Arginin-Formulierung (Code 1–6) beträgt 16 Tage im Vergleich zu 23 Tagen für die 300-mM-L-Arginin-Formulierung (Code 4–3). Deshalb stellt das Formulieren von TFPI mit einer Säurebase (d. h., Argininbase) als ein Stabilisator und ein Puffer, der eine Säure umfaßt, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist (d. h., Bernsteinsäure), ein wirksames Mittel bereit, mehr Stabilisator (d. h., Arginin) hinzuzufügen, um die stabilisierende Wirkung auf TFPI zu maximieren.
Schlußfolgerung
Dieses Beispiel zeigt, daß L-Arginin TFPI durch Verlängern seiner Lagerdauer stabilisiert. Unter Verwendung der Säuretitration kann man mehr Arginin zu der Formulierung hinzufügen, um die stabilisierende Wirkung ohne Überschreiten der Isotonizität zu maximieren, was für die injizierbaren Formulierungen bevorzugt ist.
Tabelle 18: Stabilitätsdaten für TFPI-Arginin-Citrat-Formulierungen mit pH 5,5.
Die Halbwertszeit (t_1/2) wurde durch Anpassen von 50°C Stabilitätsdaten unter Verwendung einer einfachen exponentiellen kinetischen Gleichung erhalten.
Tabelle 19: Stabilitätsdaten für TFPI-Arginin-Succinat-Formulierungen mit pH 5,5.
Die Halbwertszeit (t_1/2) wurde durch Anpassen von 50°C Stabilitätsdaten unter Verwendung einer einfachen exponentiellen kinetischen Gleichung erhalten.
Obwohl die vorhergehende Erfindung ausführlich mittels Illustration und der Beispiele für die Zwecke des besseren Verständnisses beschrieben worden ist, wird es offensichtlich sein, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der anhängenden Ansprüche praktiziert werden können.

Claims

Verfahren zum Herstellen einer flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid oder eine biologisch aktive Variante davon, wobei das Verfahren das Vereinigen des Polypeptids oder der Variante davon mit mindestens einer Aminosäurebase und einem Puffermittel, das eine Säure ist, die im wesentlichen frei von ihrer Salzform ist, umfaßt, wobei die Aminosäurebase mindestens eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Arginin, Lysin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, umfasst, wobei jede Aminosäure in freier Basenform oder in Salzform vorliegt, wobei die Zusammensetzung einen pH in einem Bereich von etwa pH 4,0 bis etwa pH 9,0 aufweist, das Polypeptid Interleukin-2 (IL-2) ist, und die Variante davon mindestens 70% Sequenzidentität mit dem Polypeptid aufweist, wobei der pH vor der Zugabe des Polypeptids eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure mindestens eine von den Aminosäuren Arginin in seiner freien Basenform und Lysin in seiner freien Basenform ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Säure aus der Gruppe, bestehend aus Essigsäure, Asparaginsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Phosphorsäure und Glutaminsäure, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Säure Bernsteinsäure ist und die Aminosäure Arginin in seiner freien Basenform ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei etwa 100 mM bis etwa 400 mM Arginin in seiner freien Basenform und etwa 80 mM bis etwa 190 mM Bernsteinsäure mit dem Polypeptid oder der Variante davon vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei etwa 150 mM bis etwa 350 mM Arginin in seiner freien Basenform mit dem IL-2 oder der Variante davon und der Bernsteinsäure vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei Arginin in seiner freien Basenform in einer Konzentration von etwa 230 mM und Bernsteinsäure in einer Konzentration von etwa 128 mM mit dem IL-2 oder der Variante davon vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Zusammensetzung einen pH von etwa 5,0 bis etwa 6,5 und eine Osmolarität von etwa 250 mmol/kg bis etwa 330 mmol/kg aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Säure Zitronensäure ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei etwa 175 mM bis etwa 400 mM Arginin in seiner freien Basenform und etwa 40 mM bis etwa 200 mM Zitronensäure mit dem Polypeptid oder der Variante davon vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ferner Methionin in einer Menge umfaßt, die ausreichend ist, um die Oxidation von mindestens einem Methioninrest in dem Polypeptid oder der Variante davon während der Lagerung der Zusammensetzung zu inhibieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ferner ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel in einer Menge umfaßt, die ausreichend ist, um die Aggregation des Polypeptids oder der Variante davon in Reaktion auf Gefrierauftauen oder mechanisches Scheren während der Lagerung der Zusammensetzung zu inhibieren.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das nichtionische grenzflächenaktive Mittel Polysorbat 80 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aminosäurebase Arginin in seiner freien Basenform in einer Konzentration von etwa 150 mM bis etwa 350 mM ist, und die Säure Bernsteinsäure in einer Konzentration von etwa 80 mM bis etwa 190 mM ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei etwa 230 mM Arginin in seiner freien Basenform und etwa 128 mM Bernsteinsäure mit dem IL-2 oder der Variante davon vereinigt werden, wobei die Zusammensetzung einen pH von etwa 5,0 bis etwa 6,5 und eine Osmolarität von etwa 250 mmol/kg bis etwa 330 mmol/kg aufweist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zusammensetzung eine Gebrauchsfähigkeitsdauer von mindestens etwa 18 Monaten aufweist, wenn bei 2–8°C gelagert.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zusammensetzung eine Gebrauchsfähigkeitsdauer von mindestens etwa 20 Monaten aufweist, wenn bei 2–8°C gelagert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Zusammensetzung ferner Methionin, welches in der Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 0,5 mM bis etwa 10 mM vorliegt, Polysorbat 80, welches in der Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 0,001% bis etwa 0,2% vorliegt, und etwa 0,1 bis etwa 5,0 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Dinatrium EDTA umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei das IL-2 oder die Variante davon in der Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 0,01 mg/ml bis etwa 2,0 mg/ml vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 6, 7 und 14 bis 19, wobei das IL-2 rekombinantes humanes IL-2 (rhIL-2) oder eine biologisch aktive Variante davon mit mindestens 70% Sequenzidentität mit humanen IL-2 ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Variante davon mindestens 80% Sequenzidentität mit humanen IL-2 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Variante davon mindestens 90% Sequenzidentität mit humanen IL-2 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Variante davon mindestens 95% Sequenzidentität mit humanen IL-2 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Variante Des-Alanyl-1, Serin-125-Human-Interleukin-2 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, welches ferner das Herstellen der Zusammensetzung in einer getrockneten Form umfasst, wobei die getrocknete Form aus der Gruppe, bestehend aus einer lyophilisierten Form und einer sprühgetrockneten Form, ausgewählt ist.