JP5612131B2 - 糖尿病の治療または予防剤 - Google Patents

Description

本発明は、糖尿病の治療または予防剤に関する。より詳しくは、コラーゲンを２段階で酵素処理することで得られるペプチドを含有する糖尿病の治療または予防剤に関する。

糖尿病は、血糖値が病的に高い状態である疾患であり、膵臓のβ細胞が何らかの理由で破壊されてインスリンが枯渇することで生じる１型糖尿病と、血中にインスリンが存在するものの血糖値の調整ができない２型糖尿病に分けられる。インスリンは、骨格筋でグルコースの取り込みを促進し、肝臓で糖新生を抑制し、またグリコーゲンの合成を促進することで、血糖値を調整している。グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、下部小腸および大腸に存在するＬ細胞から血管内に分泌され、膵臓β細胞上のＧＬＰ−１受容体に結合して、インスリン分泌を促進する。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）は、標的となるタンパク質のＮ末第２位のアラニンまたはプロリンを認識して、２アミノ酸を切断することで、同タンパク質を不活性化する。分泌されたＧＬＰ−１は、ＤＰＰＩＶで不活性化され、門脈を経由して肝臓から体循環には１０〜１５％しか回らない（非特許文献１）。従って、ＤＰＰＩＶを阻害することによって、またはＧＬＰ−１分泌を促進することによって、インスリン分泌が促進され、血糖値が低下することになるため、最近、糖尿病の治療または予防剤として、ＤＰＰＩＶ阻害剤およびＧＬＰ−１分泌促進剤が注目されている。

ＤＰＰＩＶ阻害剤としては、シタグリプチン等の種々の合成医薬品が知られている。しかし、これらは、糖尿病の治療を第一に考えて、高い薬効を追求したものであるために、低血糖症等の副作用がある。そこで、飲食用素材を分解して得られるペプチドが検討されている。これらのペプチドは、合成医薬品ほどはＤＰＰＩＶ阻害活性が優れてはいないが、人体に対する安全性が担保されており、日常的に服用しても副作用が生じないという点で、極めて有用である。

ＤＰＰＩＶ阻害活性を有する、飲食用素材の分解物を含有する混合物については、例えば、以下の特許文献に記載されている。
特許文献１には、コラーゲンを含む飲食用素材を由来とする調製物が記載されている。しかし、実施例記載のコラーゲンペプチド混合物が、いかなる酵素または加水分解条件でコラーゲンを分解して調製されたかが記載されておらず、また、当該コラーゲンペプチド混合物にどのようなペプチドが含まれているかについては、何ら記載されていない。
特許文献２には、コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼ等で処理して、さらにプロテアーゼで処理して得られる分解物の混合物がＤＰＰＩＶ阻害活性を有することが記載されている。しかし、当該プロテアーゼには、本発明の２段階目の酵素処理で用いる酵素が有するアミノペプチダーゼＮ活性またはプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有するものではない。また、前記プロテアーゼ分解物の混合物には、どのようなペプチドが含まれているか等については、記載されていない。

他方、ＤＰＰＩＶ阻害活性を有するペプチドについて、以下の文献に記載されている。
特許文献３には、チーズの水溶性画分に含まれる２４個のペプチドがＤＰＰＩＶ阻害活性を有することが記載されている。しかし、当該ペプチドは、１つを除いて、アミノ酸５つ以上を含む長いペプチドである。特許文献４には、コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼ等で処理して得られるペプチドである、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−（Ｇｌｙ−Ｚ−Ｗ）ｎ（ｎは０〜４の整数、ＸはＰｒｏまたはＬｅｕ、Ｙ、ＺおよびＷはそれぞれ独立して同一または異なる任意のアミノ酸（Ｇｌｙを除く））等が、ＤＰＰＩＶ阻害活性を有することが記載されている。しかし、当該ペプチドは、１つを除いて、アミノ酸５つ以上を含む長いペプチドである。非特許文献２には、プロリンを含有するジペプチド、トリペプチドがＤＰＰＩＶ阻害活性を有することが記載されており、特にＮ末端側に疎水性アミノ酸を含有するジペプチドが高い活性を有することが報告されている。
上記のペプチドは、腸管吸収性が乏しいとの問題を有していた。

ＧＬＰ−１分泌促進活性を有する、飲食用素材の分解物を含有する混合物については、例えば、以下の文献に記載されている。
特許文献５には、大豆タンパク質のパパイン分解物の混合物が記載されている。非特許文献３には、卵タンパク質の加水分解物の混合物がＧＬＰ−１分泌促進活性を有するが、その他のタンパク質の加水分解物の混合物はＧＬＰ−１分泌促進活性を示さなかったことが記載されている。非特許文献４には、ホエーおよびカゼインの加水分解物の混合物が記載されている。非特許文献５および６には、とうもろこし由来のゼインの加水分解物の混合物が、ＧＬＰ−１分泌促進活性とＤＰＰＩＶ阻害活性とを有しており、当該混合物にはＧＬＰ−１分泌促進活性を有するペプチドとＤＰＰＩＶ阻害活性を有するペプチドとが含まれていると予想されることが記載されている。
しかし、これらの混合物にどのようなペプチドが含まれているかについては、何ら記載されていない。また、これら文献にはコラーゲンを飲食用素材として用いることは記載されていない。

特開２０１０−１３４２３号公報 特開２００９−２８４７９８号公報 特開２００７−３９４２４号公報 ＷＯ２００８／０６６０７０号公報 特開２０１０−１３８１４３号公報

実験医学，Vol. 29，No. 5, (増刊), p. 820-835, 2011 太田徹他，「ＤＰＰＩＶ阻害プロリン含有ペプチドの検索および合成の検討」，第５７回 日本食品科学工学会要旨，2010年9月2日，２Ｅａ６ Mol. Nutr. Food Res., 2011, 55, 476-484 Eur. J. Nutr., (2004) 43: 127-139 化学と生物，Vol. 49, No. 1, p. 11-13, 2011 Endocrinology, July 2010, 151(7): 3095-3104

本発明が解決しようとする課題は、副作用が少なく、安全性が高く、腸管での吸収や細胞内への移行が容易な、ペプチドを含有する糖尿病の治療または予防剤を提供することにある。また、かかるペプチドを多量に含有するコラーゲンペプチド混合物、およびそのコラーゲンペプチド混合物の製造方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行ったところ、コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理することで得られるコラーゲンペプチド混合物およびそれに含まれるペプチドが、意外にも、ＤＰＰＩＶ阻害活性および／またはＧＬＰ−１分泌促進活性を有することを見出した。かかるペプチドは、従来知られていたペプチドとは異なって、ほとんどのものがＨｙｐを含んでおり、またジペプチドまたはトリペプチドという低分子であるために、腸管での吸収や細胞内への移行が容易であることも見出した。さらには、特殊な酵素の組合せによる２段階の酵素処理を用いる上記製造方法によって、かかるペプチドを多量に含有するコラーゲンペプチド混合物を製造できることも見出した。以上の知見に基づいて、本発明者らは、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
〔１〕 Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、その化学修飾体およびその薬学上許容される塩から選択される３種以上を含有する、コラーゲンペプチド混合物。
〔２〕 Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−ＨｙｐおよびＬｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを含有する、〔１〕記載のコラーゲンペプチド混合物。
〔３〕 〔１〕または〔２〕記載のコラーゲンペプチド混合物を含有する、糖尿病の治療または予防剤。
〔４〕 〔１〕または〔２〕記載のコラーゲンペプチド混合物を含有する、ＤＰＰＩＶ阻害剤。
〔５〕 〔１〕または〔２〕記載のコラーゲンペプチド混合物を含有する、ＧＬＰ−１分泌促進剤。

〔６〕 Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_５、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＡｌａ−Ｈｙｐからなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドもしくはその化学修飾体またはそれらの薬学上許容される塩を含有する、糖尿病の治療または予防剤。
〔７〕 Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−ＨｙｐおよびＳｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドもしくはその化学修飾体またはそれらの薬学上許容される塩を含有する、ＤＰＰＩＶ阻害剤。
〔８〕 Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_５、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＡｌａ−Ｈｙｐからなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドもしくはその化学修飾体またはそれらの薬学上許容される塩を含有する、ＧＬＰ−１分泌促進剤。
〔９〕 Ｇｌｕ−ＨｙｐおよびＧｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる群から選ばれるペプチドもしくはその化学修飾体、またはそれらの薬学上許容される塩。

〔１０〕 コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理することによる、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_５、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＡｌａ−Ｈｙｐからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドを含有するコラーゲンペプチド混合物の製造方法であって、
１次酵素処理で用いる酵素が、コラゲナーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼおよびメタルプロテアーゼからなる群から選択され、
２次酵素処理で用いる酵素が、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、またはアミノペプチダーゼＮ活性およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を併有する酵素であるか、またはアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の組合せである、製造方法。

〔１１〕 糖尿病を治療または予防するための、〔１〕または〔２〕記載のコラーゲンペプチド混合物。
〔１２〕 糖尿病を治療または予防するための、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_５、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＡｌａ−Ｈｙｐからなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドもしくはその化学修飾体またはそれらの薬学上許容される塩。
〔１１〕 ＤＰＰＩＶを阻害するための、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−ＨｙｐおよびＳｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドもしくはその化学修飾体またはそれらの薬学上許容される塩。
〔１２〕 ＧＬＰ−１の分泌を促進するための、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_５、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＡｌａ−Ｈｙｐからなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドもしくはその化学修飾体、またはそれらの薬学上許容される塩。

〔１３〕 〔１〕または〔２〕記載のコラーゲンペプチド混合物を、それを必要とする対象（好ましくは患者）に投与することを含む、糖尿病を治療または予防する方法。
〔１４〕 Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_５、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＡｌａ−Ｈｙｐからなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドもしくはその化学修飾体またはそれらの薬学上許容される塩を、それを必要とする対象（好ましくは患者）に投与することを含む、糖尿病を治療または予防する方法。
〔１５〕 Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−ＨｙｐおよびＳｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドもしくはその化学修飾体またはそれらの薬学上許容される塩を、それを必要とする対象（好ましくは患者）に投与することを含む、ＤＰＰＩＶの阻害方法。
〔１６〕 Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_５、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＡｌａ−Ｈｙｐからなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドもしくはその化学修飾体またはそれらの薬学上許容される塩を、それを必要とする対象（好ましくは患者）に投与することを含む、ＧＬＰ−１の分泌を促進する方法。

本発明で用いられる上記のペプチドを、単に「特定のペプチド」ということがある。また、上記ペプチド分子を構成する各アミノ酸単位を表す３文字表記を一文字表記で表すことがある。具体的には、Ｌｅｕ＝Ｌ、Ｈｙｐ＝Ｏ、Ｇｌｙ＝Ｇ、Ｐｒｏ＝Ｐ、Ａｌａ＝Ａ、Ｇｌｕ＝Ｅ、Ｉｌｅ＝Ｉ、Ｓｅｒ＝Ｓ、Ｆ＝Ｐｈｅと略記することがある。

本発明の糖尿病の治療または予防剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤およびＧＬＰ−１分泌促進剤は、副作用が無く、安全性が高く、さらには、消化酵素に対する耐性、腸管での体内への吸収および細胞内への移行が容易であるため、経口投与にも適している。また、本発明のコラーゲンペプチド混合物の製造方法によれば、前記特定のペプチドを多量に含有するコラーゲンペプチド混合物を効果的かつ確実に得ることができる。

以下、本発明にかかる糖尿病の治療または予防剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ＧＬＰ−１分泌促進剤およびコラーゲンペプチド混合物の製造方法等について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。

１．コラーゲンペプチド混合物および特定のペプチド
本発明のコラーゲンペプチド混合物は、ＥＯＧ、ＥＯ、ＬＯＧ、ＰＡ、ＳＯ、ＡＯＧ、その化学修飾体およびその薬学上許容される塩から選択される３種以上を含有する、コラーゲンペプチド混合物である。本コラーゲンペプチド混合物に含まれるペプチド３種以上には、好ましくは、ＥＯＧ、ＥＯ、ＬＯＧのいずれかが含まれ、さらに好ましくは、ＥＯＧ、ＬＯＧのいずれかが含まれ、特に好ましくは、ＬＯＧが含まれる。ＥＯＧ、ＥＯ、ＬＯＧ、ＰＡ、ＳＯ、ＡＯＧ、その化学修飾体およびその薬学上許容される塩から選択される３種以上の重量の合計は、好ましくは、コラーゲンペプチド混合物に対して２重量％以上であり、より好ましくは３重量％以上であり、さらに好ましくは４重量％以上である。

本発明に用いられる特定のペプチドは、ＥＯＧ、ＥＯ、ＬＯＧ、ＰＡ、ＳＯ、ＡＯＧ、ＰＯＧ、ＬＯ、ＩＯ、ＳＯＧ、ＧＰＯ、（ＰＯＧ）_５、ＰＯ、ＯＧ、ＰＧ、ＰＰおよびＡＯからなる群から選ばれる。ＥＯＧ、ＥＯ、ＬＯＧ、ＰＡ、ＳＯ、ＡＯＧ、ＰＯＧ、ＬＯ、ＩＯおよびＳＯＧはＤＰＰＩＶ阻害活性を有しており、ＥＯＧ、ＥＯ、ＬＯＧ、ＰＡ、ＳＯ、ＡＯＧ、ＧＰＯ、（ＰＯＧ）_５、ＰＯ、ＯＧ、ＰＧ、ＰＰおよびＡＯはＧＬＰ−１分泌促進活性を有している。ＥＯＧ、ＥＯ、ＬＯＧ、ＰＡ、ＳＯおよびＡＯＧは、ＤＰＰＩＶ阻害活性およびＧＬＰ−１分泌促進活性を共に有していることから、好ましいペプチドである。より好ましいペプチドとしては、ＥＯＧ、ＥＯ、ＬＯＧが挙げられ、さらに好ましいペプチドとして、ＥＯＧ、ＬＯＧが挙げられ、特に好ましいペプチドとして、ＬＯＧが挙げられる。

特定のペプチドは、例えば、後述する、アミノ酸からの合成方法、およびコラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法により調製することができる。ただし、これらの方法以外の方法で調製しても良く、例えば、下記２段階酵素処理法に代えて、１次酵素処理を省略した方法や、１次酵素処理および２次酵素処理を同時に行う方法であっても良い。

＜アミノ酸からの合成方法＞
アミノ酸から特定のペプチドを合成することができる。アミノ酸からの合成方法としては、一般的に、（１）固相合成法と（２）液相合成法（例えば、特開２００３−１８３２９８号公報参照）があり、前者の場合は、さらに（Ａ）Ｆｍｏｃ法と（Ｂ）Ｂｏｃ法が知られているが、特定のペプチドは、いずれの方法で合成してもよい。
固相法を一例として、以下に詳しく説明する。プロリンを担体ポリスチレンに固定し、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基あるいはＢｏｃ基を使用する公知の固相合成法により合成することができる。すなわち、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いた脱水反応によってＦｍｏｃ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ）基でアミノ基を保護したプロリンにヒドロキシプロリンを結合（ペプチド結合）させた後、固相を溶媒でよく洗い、残ったヒドロキシプロリンなどを除去する。この後、固相に結合しているプロリンの保護基を除去（脱保護）することにより、ＰＯを合成することができる。続いて、同様の方法で、このＰＯのヒドロキシプロリンのアミノ基にグリシンを結合（ペプチド結合）させることで、ＰＯＧを得ることができる。このようにして、アミノ酸を順次結合していくことで、目的のペプチドを合成することができる。

＜化学修飾＞
特定のペプチドは、構成アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基が化学修飾されていても良く、ヒドロキシプロリンについては、水酸基が化学修飾されていても良い。その化学修飾によって、弱酸性から中性で溶解性を向上させ、他のＤＰＰＩＶ阻害剤との相溶性向上等を図ることができる。具体的には、ヒドロキシプロリンの水酸基については、Ｏ−アセチル化などの化学修飾、グリシンのα−カルボキシル基については、エステル化、アミド化などの化学修飾、プロリンのα−アミノ基については、ポリペプチジル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、脱アミノ化、ベンゾイル化、アルキルスルホニル化、アリルスルホニル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、カルバミル化、フェニルカルバミル化、チオール化などの化学修飾が挙げられる。他のＤＰＰＩＶ阻害剤の種類などに応じて、適切な化学修飾を選択すれば良い。また、エチレンジアミン化、スペルミン化などを行うことで、特定のペプチドを塩基性にすることもできる。

特定のペプチドの化学修飾の具体的手段や処理条件は、通常のペプチドの化学修飾技術が適用される。ヒドロキシプロリンの水酸基の化学修飾については、例えば、Ｏ−アセチル化は水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることなどにより、行うことができる。グリシンのα−カルボキシル基の化学修飾について、例えば、エステル化はメタノールへの懸濁後に乾燥塩化水素ガスを通気することなどにより、アミド化はカルボジイミドなどを作用させることにより、行うことができる。化学修飾のその他の具体例として、特公昭６２−４４５２２号公報や特公平５−７９０４６号公報等に記載の化学修飾技術が適用できる。

＜薬学上許容される塩＞
薬学上許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられる。常法に従って、特定のペプチドを薬学上許容される塩にすることができる。

２．コラーゲンペプチド混合物の製造方法
コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法によって、コラーゲンペプチド混合物を製造することができる。また、調製したコラーゲンペプチド混合物をさらに精製することで、特定のペプチドを製造することもできる。
この酵素処理する方法は、具体的には、コラーゲンまたはゼラチンを一般的な方法で１次酵素処理した後に、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、もしくはアミノペプチダーゼＮ活性およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を併有する酵素、またはアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の組合せを用いる２次酵素処理を行うという、２段階酵素処理によって、上記特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物を得ることができる。

原料のコラーゲンとしては、特に限定するわけではないが、例えば、牛、豚などの哺乳動物由来のコラーゲン、サメ、鯛などの魚類由来のコラーゲン等が挙げられる。これらは、前記哺乳動物の骨、皮部分、前記魚類の骨、皮、鱗部分などから得ることができる。具体的には、前記骨、皮、鱗などに脱脂・脱灰処理、抽出処理などの従来公知の処理を施せば良い。また、原料のゼラチンは、前記コラーゲンを熱水抽出などの従来公知の方法で処理することにより得ることができる。

＜１次酵素処理＞
１次酵素処理で用いる酵素としては、コラーゲンまたはゼラチンのペプチド結合を切断することが可能な酵素であれば、特に限定されないが、通常、タンパク質分解酵素あるいはプロテアーゼと呼ばれる酵素が用いられる。具体的には、例えば、コラゲナーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、メタルプロテアーゼなどが挙げられ、これらを単独で、あるいは複数組み合わせて用いることができる。前記チオールプロテアーゼとしては、植物由来のキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシン、動物由来のカテプシン、カルシウム依存性プロテアーゼなどが知られている。また、前記セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、カテプシンＤなどが、前記酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、キモトリプシンなどが知られている。なお、使用する酵素としては、調製するコラーゲンペプチド混合物および特定のペプチドを医薬または特定保健用食品等に利用することを考慮すると、病原性微生物由来の酵素以外の酵素を用いることが好ましい。

１次酵素処理の処理条件としては、例えば、コラーゲンまたはゼラチン１００重量部に対して酵素０．１〜５重量部用い、３０〜６５℃で１〜７２時間処理することができる。上記コラーゲンまたはゼラチンの１次酵素処理により得られるコラーゲンペプチド混合物の平均分子量は、好ましくは５００〜２０００、より好ましくは５００〜１８００である。平均分子量が前記範囲にあれば、分子量の比較的大きなペプチドが充分に生成しているといえる。１次酵素処理後に、必要に応じて酵素を失活させても良いが、この場合の失活温度としては、例えば、７０〜１００℃である。

＜２次酵素処理＞
２次酵素処理で用いる酵素としては、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、またはアミノペプチダーゼＮ活性およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を併有する酵素であるか、またはアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の組合せが挙げられる。ここで、「アミノペプチダーゼＮ活性」は、基本的に、ペプチド鎖のＮ末端からアミノ酸を遊離させる働きを有するペプチダーゼであり、Ｎ末端から２番目にプロリンあるいはヒドロキシプロリン以外のアミノ酸が存在する場合に作用する。また、「プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性」は、Ｎ末端から３番目がプロリンあるいはヒドロキシプロリンである基質からＮ末端３残基を遊離するペプチダーゼのことである。なお、使用する酵素としては、調製するコラーゲンペプチド混合物および特定のペプチドを医薬または特定保健用食品等に利用することを考慮すると、病原性微生物由来の酵素以外の酵素を用いることが好ましい。具体的には、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素としては、例えばアミノペプチダーゼＮ（ＥＣ３．４．１１．２；Yoshimoto, T., et al., Agric. Biol. Chem., 52: 217-225 (1988)等）が挙げられる。また、プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素としては、例えばプロリルトリぺプチジルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．−；Banbula, A., et al., J.Biol. Chem., 274: 9246-9252, (1999)等）を挙げることができる。

２次酵素処理では、上に述べた酵素、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素を用いた酵素反応がなされる。この反応により、１次酵素処理物には含まれていなかった特定のペプチドが生成する。
２次酵素処理の処理条件としては、例えば、１次酵素処理物１００重量部に対して酵素０．０１〜５重量部用い、３０〜６５℃で１〜７２時間処理することができる。上記２次酵素処理により得られるコラーゲンペプチド混合物の平均分子量は、好ましくは５００〜１８００、より好ましくは５００〜１５００である。この２次酵素処理は、特定構造のペプチド分子の生成を主たる目的としており、１次酵素処理により得られるコラーゲンペプチド混合物のうち、比較的大きなペプチドが過剰に加水分解されてしまわないように、前記平均分子量の範囲となるように２次酵素処理することが好ましい。２次酵素処理後に酵素を失活させる必要があるが、失活温度としては、例えば、７０〜１００℃である。

さらに、２次酵素処理に用いる酵素として、副生成物の分解などの目的、原料となるコラーゲンの種類、１次酵素処理に用いる酵素の種類に応じて、上記アミノペプチダーゼＮ活性やプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性の他に、異なる活性を併有する酵素を用いたり、あるいは、異なる活性を有する酵素を併用したりすることができる。
そのような他の活性として、例えば、プロリダーゼ活性やヒドロキシプロリダーゼ活性などのジペプチダーゼ活性を作用させることにより副生するジペプチドを分解したりすることができる。また、アミノペプチダーゼＮ活性は、基本的にＮ末端側のアミノ酸を１つずつ遊離するものであるので、原料となるコラーゲンの種類や１次酵素処理に用いる酵素の種類によっては、１次酵素処理での分解が不十分で、２次酵素処理に必要な時間が長くなる場合がある。そこで、例えば、プロリンのカルボキシル基側を加水分解するエンドペプチダーゼであるプロリルオリゴペプチダーゼ活性などの他の活性を作用させることにより、不要部位をオリゴペプチドなどの塊として切断除去することで、２次酵素処理をより効率的に行うことができる。

＜２段階での酵素処理＞
この２段階酵素処理について詳しく説明すると、まず、１次酵素処理によって、経口免疫寛容メカニズムを介した骨・軟骨組織の炎症緩和に有用な比較的分子量の大きなペプチド、例えば、［Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ｘ_２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ］（Ｘ_１およびＸ_２≠Ｈｙｐ）が生成する。
続く２次酵素処理において、上記［Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ｘ_２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ］にアミノペプチダーゼＮ活性が作用することにより、Ｃ末端のプロリンが遊離して［Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ｘ_２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ］が得られ、あるいは、さらに、Ｎ末端のＸ_１が遊離して、［Ｇｌｙ−Ｘ_２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ］が得られる。
さらに、上記［Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ｘ_２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ］にアミノペプチダーゼＮ活性が作用して、グリシンとＸ_２間のペプチド結合が切断されることで、特定のペプチド［Ｘ_２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ］（Ｘ_２＝Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｕ，ＳｅｒまたはＡｌａ）が得られる。
また、上記［Ｇｌｙ−Ｘ_２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ］にプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性が作用して、ヒドロキシプロリンとグリシン間のペプチド結合が切断されて［Ｇｌｙ−Ｘ_２−Ｈｙｐ］となり、次に、アミノペプチダーゼＮ活性が作用することにより、グリシンとＸ_２間のペプチド結合が切断されることで、特定のペプチド［Ｘ_２−Ｈｙｐ］（Ｘ_２＝Ｌｅｕ，Ｇｌｕ，ＩｌｅまたはＳｅｒ）が得られる。
このように、アミノペプチダーゼＮ活性とプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性との両方を作用させれば、本発明の特定のペプチドのうち、腸管吸収性の優れたジペプチドを効率的に得ることができ、好ましい。

特許文献２で用いられている酵素、例えばプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇには、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素またはプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素が含まれていない。そこで、特許文献２の実施例１（ＨＡＣＰ-０１−Ｎ）と同条件でペプチド混合物（ＣＰＴ−Ｃｏｎｔ）を調製し、ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ解析法で分析したが、その混合物にはＧＰＯ以外は特定のペプチドが含まれていなかった（参照、比較例２）。

＜コラーゲンペプチド混合物の精製＞
前記２段階酵素処理、および必要に応じて追加される発酵によって、コラーゲンペプチド混合物を調製することができる。ただし、同コラーゲンペプチド混合物には、特定のペプチド以外のアミノ酸およびペプチドが含まれているため、必要に応じて、従来公知の方法で精製することもできる。精製方法としては、例えば、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィー等が挙げられる。

同コラーゲンペプチド混合物を、分画・精製を行うことで、特定のペプチドを得ることができる。分画・精製の方法としては、特に制限はなく、例えば、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィー、これらを組み合わせた方法などのような従来公知の方法が挙げられる。具体的には、例えば、以下のようにして分画・精製することができる。すなわち、まず、前記コラーゲンペプチド混合物の約２ｇ／１０ｍＬをイオン交換カラム（例えば、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）やＳＰトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）など）に２回に分けて負荷して、蒸留水で溶出されるボイドボリューム画分を回収する。次いで、回収した画分を前記イオン交換カラムとは逆のイオン交換基を有するカラム（例えば、ＳＰトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）やＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）など）に負荷して、蒸留水で溶出されるボイドボリューム画分を回収する。次に、この画分をゲル濾過カラム（例えば、セファデックスＬＨ−２０カラム（ファルマシア社製）など）に負荷し、３０％メタノール水溶液で溶出して化学合成品である特定のペプチドが溶出する位置に相当する画分を回収する。本画分については、逆相カラム（例えば、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８ ３００Åカラム（ウォーターズ社製）など）を装填した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、０．１％トリフルオロ酢酸を含む３２％以下のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配により分画する。そして、回収した特定のペプチド画分を減圧乾固することにより、特定のペプチドを高純度で得ることができる。

３．糖尿病の治療または予防剤
本発明にかかるコラーゲンペプチド混合物および特定のペプチド等は、ＤＰＰＩＶ阻害活性および／またはＧＬＰ−１分泌促進活性を有しており、糖尿病の治療または予防剤として用いることができる。ここで、糖尿病の治療または予防剤とは、糖尿病の治療および／または予防に用いる薬剤を意味する。
コラーゲンペプチド混合物および特定のペプチド等を含有する糖尿病の治療または予防剤は、経口的に又は非経口的に種々の形態の製剤で投与することができる。その形態としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、粉剤、液剤、注射剤、経皮剤、坐剤、点鼻剤及び吸入剤等が挙げられ、好ましくは経口的に投与する錠剤、顆粒剤、カプセル剤等、非経口的に投与する注射剤、経皮剤等が挙げられる。コラーゲンペプチド混合物および特定のペプチド等の投与量は、患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路等によって異なる。成人１日当たり、経口投与の場合は、例えば、約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１〜５００ｍｇ、より好ましくは約１０〜２００ｍｇが挙げられる。注射剤の場合は、例えば、約０．０１〜２００ｍｇ、好ましくは約０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは約１〜５０ｍｇが挙げられる。その他の形態の製剤は、これらの投与量を参考にして適宜決めることができる。これら製剤は、１日１〜数回に分けて投与するか、または１〜数日に１回投与することができる。なお、経口投与の場合は、食前に投与することで血糖値を正常範囲内で抑えることが可能である。特定のペプチド、特にＨｙｐを含有するペプチドは、消化酵素に対する耐性が高いために、アミノ酸への分解がほとんど起こらず、また腸管から血液に迅速に吸収され、あるいは腸管から腸管表面細胞もしくはＬ細胞に直接吸収されるため、経口投与による摂取が好適である。

経口投与製剤のための医薬担体としては、例えば、賦形剤（結晶性セルロース、乳糖、砂糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン等）、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドン等）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（バレイショデンプン等）及び湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）等の慣用のものを挙げることができる。経口投与製剤は、コラーゲンペプチド混合物または特定のペプチド等と上記医薬担体とを混合したものを、従来公知の方法により、打錠成型によって錠剤としたり、その他、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などの任意の形態に調製することもできる。この場合、製剤全量に対し、前記特定のペプチドを、０．００１重量部以上の割合で配合することが好ましい。より好ましくは０．０１重量部以上の割合で配合する。０．００１重量部未満では本発明の効果が充分に発現されないおそれがある。
非経口投与する場合には、例えば、注射用蒸留水、生理的食塩水、ブドウ糖水溶液等を用いて注射剤や点滴剤として、あるいは坐剤等として製剤化することができる。静脈に注入する場合には、コラーゲンペプチド混合物または特定のペプチド等を生理食塩水などで希釈したものを用いるが、その濃度としては、上述の如く、特定構造のペプチド分子の含量を０．１ｍｏｌ／Ｌ以上とすることが好ましい。また、前記特定のペプチドの含量が１０μｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましい。

＜他の有効成分＞
本発明のコラーゲンペプチド混合物および特定のペプチド等を含有する糖尿病の治療または予防剤は、本発明の効果を害しない範囲で、適宜、他の有効成分と組み合わせることができる。他の有効成分としては、例えば、他の糖尿病治療剤（インスリン製剤、スルホニルウレア剤、ビグアナイド系薬剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン抵抗性改善剤、インスリン分泌促進剤、ＧＬＰ−１アナログ等）等が挙げられる。その場合、配合剤として用いてもよく、あるいは併用で用いてもよい。

４．ＤＰＰＩＶ阻害剤／ＧＬＰ−１分泌促進剤
本発明のＤＰＰＩＶ阻害剤は、上記の通り、糖尿病の治療または予防剤として使用される。それに加えて、本ＤＰＰＩＶ阻害剤は、さらに、例えば、発作、虚血、パーキンソン病、片頭痛等の中枢神経系疾患、関節炎、慢性関節リウマチ等の免疫および自己免疫疾患、腫瘍等の治療および予防に用いることができる（特表２００４−５３４８３６号公報、および「ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の関節炎発症抑制効果」，田中澄子ら著，炎症，Vol. 18，No. 3, 1998年5月）。
本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、上記の通り、糖尿病の治療または予防剤として使用される。それに加えて、本ＧＬＰ−１分泌促進剤は、さらに、肺におけるサーファクタント分泌促進作用、心臓における心筋保護作用および心機能改善作用、脳における神経細胞保護作用、記憶脳の増加作用および食欲抑制作用、消化管における胃排泄低下作用、腎臓におけるナトリウム調節作用等を有する。そこで、これらの作用が必要な疾患、例えば、肥満、神経変性症状（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、多発性硬化症、脳の損傷、脊髄損傷および末梢神経障害等）等の治療および予防のために、用いることができる（非特許文献１および特開２０１０−９０１２９号公報）。

以下に、本発明の糖尿病の治療または予防剤に含まれるコラーゲンペプチド混合物および特定のペプチド等について、その性能評価試験とその配合例とによって、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下では、便宜上、「重量部」を単に「部」と、「重量％」を「％」と記すことがある。

〔特定のペプチドの準備〕
後述する性能評価試験および配合例に用いる特定のペプチドは、前述の固相法により合成した。
すなわち、まず、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）１０部を用いた脱水反応によってＦｍｏｃ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ）基でアミノ基を保護したプロリン４５部にアラニン４５部を結合（ペプチド結合）させた後、固相を溶媒（エチルアルコール）でよく洗い、残ったプロリンなどを除去した。その後、固相に結合しているプロリンの保護基をトリフルオロ酢酸の温浸により除去（脱保護）することにより、ＰＡを合成した。
上記ペプチド分子の合成には、Ｌｉｂｅｒｔｙペプチド合成システム（ＣＥＭ社製）を使用した。
同様にして、ＬＯ、ＥＯ、ＩＯ、ＳＯ、ＬＯＧ、ＰＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧ、ＡＯＧ、ＡＯ、ＧＰＯ、（ＰＯＧ）_５、ＰＯ、ＯＧ、ＰＧおよびＰＰを合成した。以下に詳しく記すように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、ＥＯおよびＥＯＧの［ｍ／ｚ］を測定した結果、ＥＯは２６１．１＞１３２．０であり、ＥＯＧは３１８．１＞２２５．０であった。

〔他のペプチドの準備〕
後述する性能評価試験および配合例に用いる比較用の他のペプチドとして、ＰＡＧ、ＦＯおよびＩＯＧの各ペプチドを、上記特定のペプチドと同様に、固相法により合成した。

〔実施例１：特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物の準備１〕
後述する性能評価試験および配合例に用いる特定のペプチドを含有する豚皮由来のコラーゲンペプチド混合物（ＣＰＴ−ＰＵ）は、以下に示す方法に従って得た。
すなわち、豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の温水４Ｌに溶解させ、６０℃に温度調節した後、１次反応として、黄色コウジカビ由来プロテアーゼ１０ｇを添加し、ｐＨ５．０〜６．０、温度４５〜５５℃で３時間保持することにより酵素加水分解処理を行った。次いで、２次酵素反応として、これにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のアミノペプチダーゼＮ（ＥＣ３．４．１１．２）およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．−）を各７．５ｇ添加し、これを可溶化した後、５０℃で５時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、豚皮由来のコラーゲンペプチド混合物（ＣＰＴ−ＰＵ）を得た。

このＣＰＴ−ＰＵを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。すなわち、ＴＬＣプレート（商品名「Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆ」，メルク社製）に、水に可溶化したＣＰＴ−ＰＵを、１０μｇ滴下し（スポット原点）乾燥させた後、溶媒（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２）で展開した。イサチン−Ｚｎ発色液を噴霧し、青色スポットの発色Ｒｆ値が同一プレートでの合成ペプチドＰＯＧのＲｆ値と一致することを確認することにより、このＣＰＴ−ＰＵがこのペプチドを含むことを確認した。
上記ＣＰＴ−ＰＵについて、さらに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ただし、このＣＰＴ−ＰＵにはペプチドが多種含まれていて解析が困難であったため、同サンプルを、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８カートリッジカラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）により逆相クロマト分画分取したのち、凍結乾燥したサンプルを２０μＬのＭＱ水で溶解し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行うようにした。
上記解析から、このＣＰＴ−ＰＵがペプチドＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧ、ＡＯＧ、ＰＡをも含むことを確認した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量解析から、前記ＣＰＴ−ＰＵは、ＰＡを４％、ＡＯＧ、ＰＯＧを各々２％、ＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧを各々１．５％含むものであることが分かった。

ここで、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量解析は、以下のようにして行った。
ＨＰＬＣ装置として「ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ ＳＩ−２」（資生堂社製）を用いた。この装置は、カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ＰＦＰ ２．１×１５０ｍｍ，５μｍを装着している。移動相：（Ａ）０．２％ギ酸および２ｍＭ酢酸アンモニウム含有水溶液、（Ｂ）メタノールとして、グラジエント設定し、注入量：１μｌ、カラム温度：４０℃でリニアグラジエントをかけた。これに連結したＭＳ／ＭＳ（タンデム型質量分析：ＴＳＱ Ｖａｎｔａｇｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）装置を次の条件で使用した。すなわち、イオン化法（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＥＳＩ）を用いて、ＳＲＭ条件を次のとおりとした（以下、［ｍ／ｚ］で表示する）：ＬＯＧは３０２．２＞１８９．４；ＰＯＧは２８６．１＞１８９．３；ＰＡは１８７．１＞７０．３；ＥＯは２６１．１＞１３２．０；ＬＯは２４５．１＞１３２．３；ＩＯは２４５．２＞１３２．１；ＥＯＧは３１８．１＞２２５．４；ＳＯＧは２７６．１＞１８９．４；ＳＯは２１９．１＞１３２．２；ＡＯＧは２６０．１＞１８９．４。

〔実施例２：特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物の準備２〕
後述する性能評価試験および配合例に用いる特定のペプチドを含有する魚鱗由来のコラーゲンペプチド混合物（ＣＰＴ−Ｐ−Ｈ）は、魚鱗由来ゼラチンを用いたこと以外は、前記ＣＰＴ−ＰＵの製造と同様の操作により得た。
このＣＰＴ−Ｐ−Ｈを前記ＣＰＴ−ＰＵの場合と同様にＴＬＣにより分析したところ、ペプチドＰＯＧの存在が確認された。
さらに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析から、このＣＰＴ−Ｐ−ＨがペプチドＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧ、ＡＯＧ、ＰＡをも含むことを確認した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量解析から、前記ＣＰＴ−Ｐ−Ｈは、ＰＡを２．５％、ＳＯＧ、ＬＯＧ、ＡＯＧを各々２％、ＰＯＧを１．５％、ＥＯＧを１％含むものであることが分かった。

〔実施例３：特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物の準備３〕
後述する性能評価試験および配合例に用いる特定のペプチドを含有する豚皮由来のコラーゲンペプチド混合物（ＣＰＴ−Ｐ−２０）は、以下に示す方法に従って得た。
すなわち、豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４Ｌに加温しながら溶解させたのち、４０℃に冷却し、１次酵素反応として、１ｇのコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｎ２）を添加後、ｐＨ７．０〜７．８、４０℃で２４時間保持することにより酵素分解処理を行った。次いで２次酵素反応として、この反応液にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のアミノペプチダーゼＮ（ＥＣ３．４．１１．２）およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．−）を各１０ｇ添加し、これを可溶化した後、ｐＨ４．０、５０℃で５時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間、１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＣＰＴ−Ｐ−２０を得た。
このＣＰＴ−Ｐ−２０を前記ＣＰＴ−ＰＵの場合と同様にＴＬＣにより分析したところ、ペプチドＰＯＧの存在が確認された。
さらに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析から、このＣＰＴ−Ｐ−２０がペプチドＰＡ、ＬＯＧ、ＡＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧ、ＥＯ、ＬＯ、ＩＯ、ＳＯをも含むことを確認した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量解析から、前記ＣＰＴ−Ｐ−２０は、ＰＡを３％、ＬＯＧを２．５％、ＥＯＧを２％、ＡＯＧを１％、ＰＯＧ、ＳＯＧ、ＥＯ、ＬＯ、ＩＯ、ＳＯを各々０．５％含むものであることが分かった。

〔実施例４：特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物の準備４〕
後述する性能評価試験および配合例に用いる特定のペプチドを含有する豚皮由来のコラーゲンペプチド混合物（ＣＰＴ−Ｐ−２２）は、以下に示す方法に従って得た。
すなわち、豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４Ｌに加温しながら溶解させたのち、４０℃に冷却し、１次酵素反応として、１ｇのコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｎ２）を添加後、ｐＨ７．０〜７．８、４０℃で２４時間保持することにより酵素分解処理を行った。次いで２次酵素反応として、この反応液にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のアミノペプチダーゼＮ（ＥＣ３．４．１１．２）およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．−）を各１０ｇ添加し、これを可溶化した後、ｐＨ４．０、５０℃で３時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＣＰＴ−Ｐ−２２を得た。
このＣＰＴ−Ｐ−２２を前記ＣＰＴ−ＰＵの場合と同様にＴＬＣにより分析したところ、ペプチドＰＯＧの存在が確認された。
さらに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析から、このＣＰＴ−Ｐ−２２がペプチドＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧ、ＡＯＧ、ＥＯ、ＬＯ、ＩＯ、ＰＡをも含むことを確認した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量解析から、前記ＣＰＴ−Ｐ−２２は、ＰＡを３％、ＬＯＧを２．５％、ＰＯＧ、ＡＯＧ、ＥＯＧを各々１％、ＳＯＧ、ＥＯ、ＬＯ、ＩＯを各々０．５％含むものであることが分かった。

〔実施例５：特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物の準備５〕
後述する性能評価試験および配合例に用いる特定のペプチドを含有する豚皮由来のコラーゲンペプチド混合物（ＣＰＴ−Ｐ−２５）は、以下に示す方法に従って得た。
すなわち、豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４Ｌに加温しながら溶解させたのち、４０℃に冷却し、１次酵素反応として、１ｇのコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｎ２）を添加後、ｐＨ７．０〜７．８、４０℃で２４時間保持することにより酵素分解処理を行った。次いで２次酵素反応として、この反応液にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のアミノペプチダーゼＮ（ＥＣ３．４．１１．２）およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．−）を各７．５ｇ添加し、これを可溶化した後、ｐＨ４．０、５０℃で３時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＣＰＴ−Ｐ−２５を得た。
このＣＰＴ−Ｐ−２５を前記ＣＰＴ−ＰＵの場合と同様にＴＬＣにより分析したところ、ペプチドＰＯＧの存在が確認された。
さらに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析から、このＣＰＴ−Ｐ−２５がペプチドＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧ、ＡＯＧ、ＥＯ、ＬＯ、ＰＡをも含むことを確認した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量解析から、前記ＣＰＴ−Ｐ−２５は、ＰＯＧを４％、ＰＡを２．５％、ＬＯＧを１％、ＡＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧ、ＥＯ、ＬＯを各々０．５％含むものであることが分かった。

〔実施例６：特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物の準備６〕
魚鱗由来のコラーゲンペプチド（ＣＰＴ−ＰＰ）は、１次反応としてキウイフルーツ由来のアクチニダイン（ＥＣ３．４．２２．１４）２０ｇを用いた以外は、実施例２のＣＰＴ−Ｐ−Ｕの製造と同様の操作により得た。
このＣＰＴ−ＰＰを前記ＣＰＴ−ＰＵの場合と同様にＴＬＣにより分析したところ、ペプチドＰＯＧの存在が確認された。
さらに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析から、このＣＰＴ−ＰＰがペプチドＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧ、ＡＯＧ、ＥＯ、ＰＡをも含むことを確認した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量解析から、前記ＣＰＴ−ＰＰは、ＰＡを５％、ＬＯＧを２％、ＡＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧ、ＥＯを各々１．５％、ＰＯＧを０．５％含むものであることが分かった。

〔比較例１：特定のペプチドを含まないコラーゲンペプチド混合物の準備〕
後述する性能評価試験および配合例に用いる、ＧＰＯ以外に特定のペプチドのいずれも含有しない比較用のコラーゲンペプチド混合物（ＣＰＴ−ＪＢ）は、以下に示す方法に従って得た。
すなわち、豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４Ｌに加温しながら溶解させたのち、４０℃に冷却し、１次酵素反応として、１ｇのコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製，Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｎ２）を添加後、ｐＨ７．０〜７．８、４０℃で１８時間保持することにより酵素分解処理を行った。次いで、酵素加水分解処理で得られた溶液を１０分間１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＣＰＴ−ＪＢを得た。
また、このＣＰＴ−ＪＢを前記ＣＰＴ−ＰＵの場合と同様にＴＬＣにより分析し、さらに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を行ったが、ＧＰＯ以外に特定のペプチドのいずれの存在も確認できなかった。

〔比較例２：特定のペプチドを含まないコラーゲンペプチド混合物の準備〕
後述する性能評価試験および配合例に用いる特定のペプチドのいずれも含有しない比較用のコラーゲンペプチド混合物（ＣＰＴ−Ｃｏｎｔ）は、以下に示す方法に従って得た。
すなわち、コラーゲンペプチドＨＡＣＰ−０１（ゼライス社製、コラゲナーゼ分解物）１０ｇとプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）０．１ｇを水に溶解し、５５℃で１時間加熱し酵素処理した後、８０℃で３０分間加熱処理して酵素を失活させた。この酵素処理溶液を凍結乾燥し、ＣＰＴ−Ｃｏｎｔを得た。
また、このＣＰＴ−Ｃｏｎｔを前記ＣＰＴ−ＰＵの場合と同様にＴＬＣにより分析し、さらに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を行ったが、特定のペプチドのいずれの存在も確認できなかった。

〔性能評価試験〕
上記各ペプチドおよびコラーゲンペプチド混合物を用いて行った各性能評価試験の詳細を以下に示す。
＜評価試験１：ＤＰＰＩＶ阻害活性＞
ＤＰＰＩＶ阻害活性を、ＤＰＰＩＶ阻害活性測定キット「ＤＰＰＩＶ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ−ＡＫ−４９９」（バイオモル社製）を用いて測定した。ペプチドサンプル基質としては、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−７−アミノ−４−メチルクマリン「Ｐ１８９−９０９０ ＡＭＣ基質」（バイオモル社製）を用い、酵素としては、ＤＰＰＩＶ「Ｅ４３４−９０９０ ＤＰＰＩＶ酵素；ヒト組み替え体」（バイオモル社製）を用いた。
阻害活性は、ＤＰＰＩＶ活性を５０％阻害するときの濃度で評価した。この値が低いものほど阻害活性が高く、少量で効率的にＤＰＰＩＶ活性を阻害するものである。
ペプチドについての結果を表１に、コラーゲンペプチド混合物についての結果を表２に示す。

＜評価試験２：ＧＬＰ−１分泌促進活性＞
ヒト由来腸管Ｌ細胞（ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞：ＡＴＣＣ製）を用いて、ＦＢＳを１０％含むＲＰＩＭ培地（ＡＴＣＣ社製）にて、５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ×２００μｌ（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）でＰｒｅ−ｃｏａｔｅｄ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎ ｐｌａｔｅ（９６ｗｅｌｌｓ ｐｌａｔｅ）に播種し、２日培養した。プレートに細胞が接着していることを確認後、培地を試験培地（１４６ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＣａＣｌ_２，１ｍＭ ＭｇＳＯ_４，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５．６ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に置き換え、サンプルを各終濃度５ｍＭになるように添加した。１時間後の培養上清をＰＢＳにて３０倍希釈し、ＧＬＰ−１ ＥＬＩＳＡキット（レビス製）にてプロトコールに従って試験した。
サンプル無添加（Ｂｌａｎｋ）のＧＬＰ−１分泌を１００％とし、サンプル５ｍＭ添加区のＧＬＰ−１分泌促進率を算出した。
ペプチドについての結果を表３に、コラーゲンペプチド混合物についての結果を表４に示す。

（ｎ＝４）ＢｌａｎｋのＧＬＰ−１濃度は742±231pg/ml。

（ｎ＝４）ＢｌａｎｋのＧＬＰ−１濃度は742±231pg/ml。

＜評価試験３：腸管吸収性＞
ウィスター系雄ラット（１７０ｇ）を一晩絶食させて実験に供した。検体試料には、上記各ペプチドを各２１５ｎｍｏｌ／１０ｍＬ用い、胃内投与した。
試験方法としては、ラットの心臓と門脈にカニューレを装着して１方向性灌流を行った。灌流液としては、ＮａＣｌ ９．０ｇ、５．７５％ＫＣｌ ８ｍＬ、１０．５５％ＫＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＬ、１９％ＭｇＳＯ_４ ２ｍＬ、ＮａＨＣＯ_３ ２．７３ｇ、グルコース３．４３ｇ、水１２５５ｍＬからなるクレブス−リンガー重炭酸液（ＫＲＢ液，ｐＨ７．４）に、前記ＫＲＢ液５００ｍＬに対して牛血清アルブミン１０ｇ、デキサメタゾン（０．１２３ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ、ノルアドレナリン（０．０２４ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを加えたものを用いた。
門脈から採取された灌流試料溶液５．０ｍＬに３０％スルフォサリチル酸を０．５ｍＬ加え、激しく撹拌し、冷蔵庫で一晩放置した。この試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、除タンパク質を行った。遠心上澄液について、その０．５ｍＬ中のヒドロキシプロリン量を比色定量することにより、遊離型Ｈｙｐ量を得た。
さらに、前記遠心上澄液３．０ｍＬをネジ口試験管に秤取し、これに当量の濃塩酸を加え、１１０℃で２４時間加水分解した。エバポレーターで濃縮乾固し、塩酸を除去し、５ｍＬの蒸留水に溶解し、飽和水酸化リチウム溶液を数滴加えてｐＨ５〜７に調整し、１０ｍＬに定容した。この溶液２ｍＬについて、ヒドロキシプロリン量を比色定量することにより、総Ｈｙｐ量を得た。加水分解後の総Ｈｙｐ量から、加水分解前の遊離型Ｈｙｐ量を差し引いて得られる値がペプチド態Ｈｙｐ量となる。このペプチド態Ｈｙｐ量から、検体試料の各ペプチドがラット門脈灌流液中に吸収された定量値をまず確認した。

上記ヒドロキシプロリン量の比色定量は、Ｆｉｒｓｃｈｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈｉｌｌ法により行い、具体的には、以下のようにして行った。
すなわち、試料溶液２ｍＬに２−プロパノール２ｍＬを加え、十分に撹拌した。ここに酸化剤であるクロラミンＴ液０．５ｍＬを加えて正確に４分間放置した後、氷冷した。ここにｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液５ｍＬを加えて、十分に撹拌した後、沸騰水浴中で正確に２分間加熱した。その後、直ちに氷冷し、１時間放置した後、波長５７５ｎｍで比色定量した。
なお、クロラミンＴ液は、クロラミンＴ（５ｇ）を蒸留水５０ｍＬに溶解調整し、冷蔵保存しておき、使用直前に酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１：４に希釈して用いた。また、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液（エーリッヒ溶液）は、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド粉末２０ｇに濃塩酸２２ｍＬを加えて沸騰水中で加熱溶解し、直ちに氷水中にて冷却し、２−プロパノール１２２ｍＬを加えて撹拌溶解し調製した。
つぎに、ラット門脈灌流液中に回収されたペプチド、すなわち、腸管吸収された上記各ペプチドの同定、定量を下記によるＨＰＬＣ分析および質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて行った。

（ＨＰＬＣ分析）
灌流液中のペプチドの分析を逆相ＨＰＬＣ分析により行った。ＨＰＬＣ装置としては、送液ポンプ、デガッサ、オートサンプラ、カラムオープン、紫外部分光光度計、プリンター、システムコントローラーから構成される日本分光社製のＬＣＳＳ−９０５システムを用いた。逆相カラムは、Ｎｏｖａ Ｐａｋ Ｃ１８（３．９×１５０ｍｍ）を用いた。
０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル−水系のリニアグラディエント移動層を用い、試料注入量は７０μＬ、流速は１ｍＬ／ｍｉｎであった。

（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析）
ＨＰＬＣ装置としてはＵ９８０ＨＰＬＣ（日本分光社製）を用い、この装置はＯＤＳ（Ｃ１８）カラム（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８，２×２５０ｍｍ，Ｋａｎｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ Ｌｔｄ社製）を装着している。移動相溶媒としては、０．２％蟻酸含有アセトニトリル−水系とし、リニアグラディエントにより４０分間で０％から４０％アセトニトリルまで濃度を上昇させ、１００％アセトニトリルで１０分間洗浄を行った。試料注入量は１０μＬであり、カラム温度は４０℃であった。
ＭＳ分析は、４チャンネルのＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ法によるＱｕａｔｔｒｏ ＬＣ質量分光光度計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）によるＭＳ／ＭＳ方式で行った。すなわち、ＨＰＬＣからの溶出液を［Ｍ＋Ｈ］^＋であるｍ／ｚとそのフラグメントイオン種のｍ／ｚでモニターした。このとき、［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚとしては、ＬＯＧは３０２．２＞１８９．４；ＰＯＧは２８６．１＞１８９．３；ＰＡは１８７．１＞７０．３；ＥＯは２６１．１＞２４３．４；ＬＯは２４５．１＞１３２．３；ＩＯは２４５．２＞１３２．１；ＥＯＧは３１８．１＞２２５．４；ＳＯＧは２７６．１＞１８９．４；ＳＯは２１９．１＞１３２．２；ＡＯＧは２６０．１＞１８９．４を、それぞれ用いてモニターした。
灌流液を最終濃度３％のスルフォサリチル酸処理し、除タンパク質を行った。上清液を凍結乾燥し、乾燥粉末１０ｍｇを蒸留水に溶解し、陽イオン交換樹脂カラム処理し、アンモニア溶出画分を得た。この画分の溶媒を除去し、蒸留水に溶解し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析した。
結果は、表５に示すとおりであった。

＜評価試験４：グルコース負荷試験による耐糖能評価＞
６週齢雄ｏｂ／ｏｂマウス（日本エスエルシー）を通常飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母）を７日間給餌して順化させ実験に供した。同マウスを一晩（１６時間）絶食させた後、各コラーゲンペプチド（０．８５ｇ／ｋｇ）またはカゼイン（０．８５ｇ／ｋｇ、ＤＭＶ社、オランダ）を経口投与し、３０分後にグルコース（２ｇ／ｋｇ）を経口投与して、耐糖能に及ぼす効果をグルコース負荷試験（２ｇ／ｋｇ）を実施した。０，１５，３０，６０および１２０分後、血中グルコース測定装置（グルテストエースＲ、三和化学研究所社製）を用いて血糖値を測定し、ＡＵＣ_{０−１２０ ｍｉｎ}を算出して、評価を行った。
結果は、表６に示すとおりであった。

＊：カゼインに比較して有意差あり（Ｐ＜０．０５）。

＜性能評価試験の結果の考察＞
上記の通り、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_５、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＡｌａ−Ｈｙｐは、ＤＰＰＩＶ阻害活性を有している。特に、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−ＨｙｐおよびＳｅｒ−Ｈｙｐ−ＧｌｙのＤＰＰＩＶ阻害活性は高い。また、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_５、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＡｌａ−Ｈｙｐは、ＧＬＰ−１分泌促進活性を有している。さらに、これらのペプチドは、消化酵素に対する耐性が高いために、アミノ酸への分解がほとんど起こらず、また腸管から血液に迅速に吸収され、あるいは腸管から腸管表面細胞もしくはＬ細胞に直接吸収されるため、経口投与によって優れた効果を示す。

〔配合例〕
上記特定のペプチドを用いて、本発明にかかる製剤を得た。それらの配合例を以下に示す。

＜実施例７〜１２＞
表７に示す配合で、各材料を混合し、賦形剤としての結晶性セルロースを、表７に記載の配合全体に対して１０部の割合で用いて、常法により打錠成形することにより、経口用として用いうる、実施例７〜１２にかかる製剤を得た。

＜実施例１３＞
上記ＣＰＴ−ＰＵを用いてチュアブルタイプのタブレットを製造した。
具体的には、下記配合成分を混合し、打錠成型器を用いて、一粒０．８ｇのチュアブルタイプのタブレットを調製した。このチュアブルタイプのタブレットは、全量を１００％としたとき、ＰＯＧを１％、ＰＡを２％、ＡＯＧを１％、ＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧを各々０．７５％含むものであった。
ＣＰＴ−ＰＵ ５０．０ｋｇ
アスコルビン酸 １０．０ｋｇ
ミクロカルマグＳ（エスケーフーヅ社製） ４．６ｋｇ
マビット（林原社製） １９．０ｋｇ
結晶セルロース １０．０ｋｇ
乳化剤 ３．２ｋｇ
アスパルテーム ０．５ｋｇ
発酵乳パウダー １．４ｋｇ
粉末香料 １．０ｋｇ
クエン酸 ０．３ｋｇ

＜実施例１４＞
上記ＣＰＴ−ＰＵを用い、下記配合成分を混合して、１００〜１４０ｍＬのお湯に溶解させて飲用する粉末コンソメスープ（１袋６．０ｇ）を調製した。この粉末コンソメスープは、全量を１００％としたとき、ＰＯＧを０．７％、ＰＡを１．４％、ＡＯＧを０．７％、ＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧを各々０．６％含むものであった。
ＣＰＴ−ＰＵ ３５．０ｋｇ
チキンエキスパウダー ２５．０ｋｇ
食塩 １８．０ｋｇ
ブドウ糖 ７．７ｋｇ
乳酸カルシウム ７．０ｋｇ
グルタミン酸ナトリウム ４．０ｋｇ
オニオンエキスパウダー １．０ｋｇ
ＨＶＰ １．０ｋｇ
ビーフフレーバー ０．５ｋｇ
５’−リボヌクレオチド２ナトリウム ０．５ｋｇ
ホワイトペッパー ０．２ｋｇ
ターメリック ０．１ｋｇ

＜実施例１５＞
上記ＣＰＴ−ＰＵを用い、下記配合成分を混合して、１００〜１５０ｍＬの水に溶解させて飲用する粉末ジュース（１袋１３．０ｇ）を調製した。この粉末ジュースは、全量を１００％としたとき、ＰＯＧを０．８％、ＰＡを１．６％、ＡＯＧを０．８％、ＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧを各々０．６％含むものであった。
ＣＰＴ−ＰＵ ４０．４ｋｇ
アスコルビン酸ナトリウム １．２ｋｇ
エリスリトール ５２．０ｋｇ
アセスルファムＫ ０．１ｋｇ
アスパルテーム ０．１ｋｇ
クエン酸ナトリウム ０．８ｋｇ
クエン酸（結晶） ４．６ｋｇ
マスカットフレーバー ０．８ｋｇ

＜実施例１６＞
上記ＣＰＴ−ＰＵを用い、下記配合成分に従い、精製水に他の配合成分を溶解し、ｐＨ３．５、Ｂ’×９．０％に調製したのち、１１０℃で３０秒加熱殺菌処理を施し、１０℃に冷却してから紙パックに無菌充填して、清涼飲料水（１パック１２５ｍＬ）を調製した。この清涼飲料水は、全量を１００％としたとき、ＰＯＧを０．０５％、ＰＡを０．１％、ＡＯＧを０．０５％、ＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧを各々０．０４％含むものであった。
ＣＰＴ−ＰＵ ２．５ｋｇ
ビタミンミックスＤＮ（ＢＡＳＦジャパン社製）０．１ｋｇ
エリスリトール ５．５ｋｇ
アセスルファムＫ ０．０１５ｋｇ
アスパルテーム ０．００５ｋｇ
クエン酸 約０．６ｋｇ
フルーツミックスフレーバー ０．１６Ｌ
ライチフレーバー ０．０４Ｌ
精製水 残量（合計が１００．０ｋｇになるように設定）

＜実施例１７＞
まず、下記配合成分のうちの精製水（Ｂ）に上記ＣＰＴ−ＰＵおよびゼラチンを浸漬して３０分間膨潤させたのち、８０℃で３０分間加熱して完全に溶解させ、ゼラチン溶液とした。次に、下記配合成分のうちの精製水（Ａ）にミルクオリゴ糖、粉末麦芽還元糖、エリスリトール、および難消化性デキストリンを溶解させ、煮詰めた後、アスパルテーム、前記ゼラチン溶液、予め精製水（Ａ）の一部に溶解させたクエン酸（結晶）、ペパーミントフレーバー、ミントフレーバー、レモンフレーバー、およびベニバナ黄色素を添加し、Ｂ’×７９〜８１％に調製したのち脱泡し、スターチモールドに充填して室温で２４時間乾燥させ、グミゼリー（１粒４ｇ）を調製した。このグミゼリーは、全量を１００％としたとき、ＰＯＧを０．１％、ＰＡを０．２％、ＡＯＧを０．１％、ＬＯＧ、ＥＯＧ、ＳＯＧを各々０．０８％含むものであった。
ＣＰＴ−ＰＵ ５．０ｋｇ
ミルクオリゴ糖 ４１．０ｋｇ
粉末麦芽還元糖 ３１．０ｋｇ
エリスリトール ５．０ｋｇ
難消化性デキストリン ５．０ｋｇ
アスパルテーム ０．０５ｋｇ
ゼラチン（ＡＰＨ２５０、新田ゼラチン社製） ７．０ｋｇ
クエン酸（結晶） １．２ｋｇ
ペパーミントフレーバー ０．６Ｌ
ミントフレーバー ０．２Ｌ
レモンフレーバー ０．７Ｌ
ベニバナ黄色素 適量
精製水（Ａ） ２０．０Ｌ
精製水（Ｂ） １８．０Ｌ

＜実施例１８＞
実施例６の製剤を用いて、滅菌済みの生理的食塩水でＬＯＧが２．５ｍＭの濃度となるよう可溶化することにより、静脈への注入用液剤を得た。

本発明によって、糖尿病の治療または予防剤が提供される。また、糖尿病の治療または予防剤として使用しうるコラーゲンペプチド混合物、およびその製造方法が提供される。

Claims (5)

1. Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、およびその薬学上許容される塩から選択される３種以上を含有するコラーゲンペプチド混合物を含有する、糖尿病の治療または予防剤。
2. Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−ＨｙｐおよびＬｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを含有する、請求項１記載の糖尿病の治療または予防剤。
3. Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−ＨｙｐおよびＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙから選ばれる少なくとも１種のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、糖尿病の治療または予防剤。
4. Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−ＨｙｐおよびＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙから選ばれる少なくとも１種のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、ジペプチジルペプチダーゼＩＶを阻害するための医薬。
5. Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−ＨｙｐおよびＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙから選ばれる少なくとも１種のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、グルカゴン様ペプチド−１の分泌を促進するための医薬。