JP2009120512A - 関節軟骨再生促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 骨粗しょう症、変形性関節症などの種々の症状を予防ないし治療するのに有効な構造を有するジペプチドを有効成分とする関節軟骨再生促進剤を提供する。
【解決手段】 本発明にかかる関節軟骨再生促進剤は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するジペプチドを有効成分とする、ことを特徴とする。
【選択図】 なし

Description

本発明は、関節軟骨再生促進剤に関する。詳しくは、関節軟骨の再生を促進することにより、骨粗しょう症や変形性関節炎などの症状を予防ないし治療するための関節軟骨再生促進剤に関する。

関節軟骨は血管系が存在せず、血管が存在する骨組織と比較すると、その修復や再生が困難である。これは、特に関節（摺動部）軟骨細胞および肋軟骨組織において顕著である。関節軟骨の修復や再生が充分でないと、関節軟骨を支える骨組織が疎となり（骨粗しょう症）、関節部の機能に支障をきたす結果、変形性関節炎（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を発症する。
従来、上記のような症状を予防ないし治療するための方法としては、関節局所への高分子ヒアルロン酸の注入が一般的であったが、最近では、予防ないし治療に有効な成分としてコラーゲンペプチド、グルコサミン塩を含み、ｐＨが２〜５である関節強化飲料（特許文献１参照）、コラーゲン成分またはゼラチン成分をコラゲナーゼ酵素を用いて分解して得られる、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのトリペプチドを有効成分とする慢性関節リウマチまたは変形関節症の改善剤（特許文献２参照）、コラーゲンおよびコラーゲンペプチドから選ばれた少なくとも１種と、アミノ糖と、ムコ多糖類およびウロン酸から選ばれた少なくとも１種を含有することを特徴とする経口関節障害治療剤または機能性食品（特許文献３参照）なども知られている。
特開２００２−１２５６３８号公報 特開２００２−２５５８４７号公報 特開２００３−４８８５０号公報

コラーゲンペプチドが、関節軟骨に関する上記骨粗しょう症や変形性関節炎などの症状の予防ないし治療に有効であるということは、上記従来技術からも示唆されることであり、また、動物実験などでも支持されているが、コラーゲンペプチドは様々なペプチド構造体の混合物であり、コラーゲンペプチド中の如何なる構造を有するペプチドが前記症状の予防ないし治療に関与しているか、などの実体については明らかでなかった。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、関節軟骨の再生が不充分であることに起因する骨粗しょう症、変形性関節症などの種々の症状を予防ないし治療するのに有効な構造を有するペプチドを有効成分とする、関節軟骨再生促進剤を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、関節軟骨の再生を促進することができ、前記骨粗しょう症、変形性関節症などの予防ないし治療に有効であるペプチドが、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有することを見出し、それを確認して、本発明を完成した。
すなわち、本発明にかかる関節軟骨再生促進剤は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するジペプチドを有効成分とする、ことを特徴とする。

本発明によれば、関節軟骨の再生に有効である具体的なジペプチドが特定されているので、単にコラーゲンペプチドを用いていただけの従来のものと比べて、有効に関節軟骨の再生を行うことができる。

以下、本発明にかかる関節軟骨再生促進剤について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
〔ジペプチド〕
本発明にかかる関節軟骨再生促進剤は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するジペプチドを有効成分とする。
Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するジペプチドは、プロリン単位および／またはヒドロキシプロリン単位が化学修飾されていても良く、特に、ヒドロキシプロリン単位については、カルボキシル基と水酸基のいずれか、または、両方が化学修飾されていても良い。

以上、本発明においては、「Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するジペプチド」とは、化学修飾したものも化学修飾していないものも含む。
なお、以下では、簡単のために、「Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するジペプチド」を「本発明にかかるジペプチド」と称する場合がある。
Ｐｒｏ−Ｈｙｐが化学修飾されている場合、弱酸性から中性で溶解可能にでき、後述する他の有効成分との相溶性向上なども期待できる。具体的には、プロリン残基のα−アミノ基については、ポリペプチジル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、脱アミノ化、ベンゾイル化、アルキルスルホニル化、アリルスルホニル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、カルバミル化、フェニルカルバミル化、チオール化などの化学修飾、ヒドロキシプロリン残基のα−カルボキシル基については、エステル化、アミド化などの化学修飾、ヒドロキシプロリン残基の水酸基については、Ｏ−アセチル化などの化学修飾が挙げられる。後述する他の有効成分の種類などに応じて、適切な化学修飾を選択すれば良い。

前記本発明にかかるジペプチドは、関節軟骨再生促進剤全量に対し、０．００１重量部以上の割合で配合することが好ましい。より好ましくは０．０１重量部以上の割合で配合される。０．００１重量部未満では本願発明の効果が充分に発現されないおそれがある。
さらに、本発明にかかる関節軟骨再生促進剤を関節局部への注入用として用いる場合、本発明にかかるジペプチドの含量が１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましい。
前記Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、例えば、後述するように、コラーゲン、ゼラチンを２段階に分けて酵素処理するか、アミノ酸から合成することにより得ることができ、化学修飾については、後述するような公知の手段が挙げられる。ただし、本発明にかかるジペプチドは、これらの方法以外の方法で得ても良く、例えば、下記２段階酵素処理法に代えて、１次酵素処理を省略した方法や、１次酵素処理および２次酵素処理を同時に行う方法であっても良いのである。

＜コラーゲンまたはゼラチンの２段階酵素処理＞
コラーゲンまたはゼラチンを一般的な方法で１次酵素処理した後に、２次酵素処理としてアミノペプチダーゼＰおよび／またはプロリダーゼ活性を有する酵素で反応させる２段階酵素処理によって、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを含むコラーゲンペプチドを得ることができる。
この２段階酵素処理によれば、１次酵素処理によって、経口免疫寛容メカニズムを介した骨・軟骨組織の炎症緩和に有用な比較的分子量の大きなペプチドが生成し、２次酵素処理によって、さらに、グリシン残基とプロリン残基間のペプチド結合（グリシンのアミノ基とプロリンのカルボキシル基に由来するペプチド結合）が切断されてＰｒｏ−Ｈｙｐが生成する。

前記コラーゲンとしては、特に限定するわけではないが、例えば、牛や豚などの哺乳動物由来のコラーゲンやサメや鯛などの魚類由来のコラーゲンが挙げられ、これらは、前記哺乳動物の骨、皮部分や前記魚類の骨、皮、鱗部分などから得ることができる。具体的には、前記骨、皮、鱗などに脱脂・脱灰処理、抽出処理などの従来公知の処理を施せば良い。
前記ゼラチンは、前記コラーゲンを熱水抽出などの従来公知の方法で処理することにより得ることができる。
前記コラーゲン、ゼラチンの２段階酵素処理で用いる酵素としては、特に限定されないが、得られた関節軟骨再生促進剤を特定保健用食品として用いる場合などを考慮すると、病原性微生物由来の酵素以外の酵素を用いることが好ましい。

１次酵素処理の処理条件としては、例えば、コラーゲンまたはゼラチン１００重量部に対して酵素０．１〜５重量部用い、３０〜６５℃で１〜７２時間処理することができる。
上記コラーゲンまたはゼラチンの１次酵素処理により得られるコラーゲンペプチドの平均分子量は、好ましくは２００〜２０００、より好ましくは２５０〜１８００である。平均分子量が前記範囲にあれば、分子量の比較的大きなペプチドが充分に生成しているといえる。
１次酵素処理後に、必要に応じて酵素を失活させても良いが、この場合の失活温度としては、例えば、７０〜１００℃である。

前記１次酵素処理に用いる酵素としては、コラーゲンまたはゼラチンのペプチド結合を切断することが可能な酵素であれば、特に限定されないが、通常、タンパク質分解酵素あるいはプロテアーゼと呼ばれる酵素が用いられる。具体的には、例えば、コラゲナーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、メタルプロテアーゼなどが挙げられ、これらを単独で、あるいは複数組み合わせて用いることができる。前記チオールプロテアーゼとしては、植物由来のキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシン、動物由来のカテプシン、カルシウム依存性プロテアーゼなどが知られている。また、前記セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、カテプシンＤなどが、前記酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、キモシンなどが知られている。

さらに、２次酵素処理では、例えば、酵素として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属など由来のプロリダーゼ活性を有するプロテアーゼを用いた酵素反応がなされる。この反応により、１次酵素処理物には含まれていなかったＰｒｏ−Ｈｙｐが生成する。
２次酵素処理の処理条件としては、例えば、１次酵素処理物１００重量部に対して酵素０．１〜５重量部用い、３０〜６５℃で１〜７２時間処理することができる。
上記２次酵素処理により得られるコラーゲンペプチドの平均分子量は、好ましくは２００〜１５００、より好ましくは２５０〜９００である。この２次酵素処理は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの生成を主たる目的としており、１次酵素処理により得られるコラーゲンペプチドのうち、比較的大きなペプチドが過剰に加水分解されてしまわないように、前記平均分子量の範囲となるように２次酵素処理することが好ましい。

２次酵素処理後に酵素を失活させる必要があるが、失活温度としては、例えば、７０〜１００℃である。
前記２段階酵素処理により得られた加水分解物、もしくは、前記２段階酵素処理および発酵により得られた発酵生成物は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ以外のアミノ酸やペプチド成分も含む混合物であるので、Ｐｒｏ−Ｈｙｐもしくはその塩を得る場合には、必要に応じて、分画・精製を行うようにしても良い。分画・精製の方法としては、特に制限はなく、例えば、限外濾過や、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィーや、これらを組み合わせた方法などのような従来公知の方法にすれば良い。具体的には、例えば、以下のようにして分画・精製することができる。すなわち、まず、前記加水分解物あるいは発酵生産物の約２ｇ／１０ｍＬをイオン交換カラム（例えば、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）やＳＰトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）など）に２回に分けて負荷して、蒸留水で溶出されるボイドボリューム画分を回収する。次いで、回収した画分を前記イオン交換カラムとは逆のイオン交換基を有するカラム（例えば、ＳＰトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）やＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）など）に負荷して、蒸留水で溶出されるボイドボリューム画分を回収する。次に、この画分をゲル濾過カラム（例えば、セファデックスＬＨ−２０カラム（ファルマシア社製）など）に負荷し、３０％メタノール水溶液で溶出して化学合成品であるＰｒｏ−Ｈｙｐが溶出する位置に相当する画分を回収する。本画分については、逆相カラム（例えば、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８ ３００Åカラム（ウォーターズ社製）など）を装填した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、０．１％トリフルオロ酢酸を含む３２％以下のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配により分画する。そして、回収したＰｒｏ−Ｈｙｐ画分を減圧乾固することにより、高純度のＰｒｏ−Ｈｙｐを得ることができる。

＜アミノ酸からの合成＞
アミノ酸からＰｒｏ−Ｈｙｐを合成することができる。
Ｐｒｏ−Ｈｙｐの合成法としては、一般的に、（１）固相合成法と（２）液相合成法（例えば、特開２００３−１８３２９８号公報参照）があり、前者の場合は、さらに（Ａ）Ｆｍｏｃ法と（Ｂ）Ｂｏｃ法の方法が知られているが、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、いずれの方法で合成してもよい。
固相法を一例として、以下に詳しく説明する。
ヒドロキシプロリンを担体ポリスチレンに固定し、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基あるいはＢｏｃ基を使用する公知の固相合成法により合成することができる。すなわち、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いた脱水反応によってＦｍｏｃ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ）基でアミノ基を保護したヒドロキシプロリンにプロリンを結合（ペプチド結合）させた後、固相を溶媒でよく洗い、残ったプロリンなどを除去する。この後、固相に結合しているヒドロキシプロリン残基の保護基を除去（脱保護）することにより、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを合成することができる。

＜化学修飾＞
Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、化学修飾が施されているものであっても良い。化学修飾の具体的手段や処理条件は、通常のペプチドの化学修飾技術が適用される。
プロリン残基のα−アミノ基の化学修飾について、例えば、ポリペプチジル化はＮ−カルボン酸無水物などとの反応により、スクシニル化あるいはマレイル化はｐＨ８付近で無水コハク酸あるいは無水マレイン酸などと反応させることにより、アセチル化は中性付近でＮ−ヒドロキシスクシンイミドアセテートなどと反応させることにより、脱アミノ化は亜硝酸などを作用させることにより、ベンゾイル化は塩化ベンゾイルまたは無水安息香酸などを作用させることにより、アルキルスルホニル化あるいはアリルスルホニル化はベンゼンスルホニルクロライド、ｐ−トルエンスルホニルクロライド、メタンスルホニルクロライドなどと反応させることにより、ジニトロフェニル化あるいはトリニトロフェニル化は２，４−ジニトロフルオロベンゼン、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸などを作用させることにより、カルバミル化あるいはフェニルカルバミル化はシアン酸などを作用させることにより、チオール化はＮ−アセチルホモシスティンチオラクトン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、チオパラコン酸、Ｓ−アセチルチオイタマル酸無水物などを作用させることにより、行うことができる。

ヒドロキシプロリン残基のα−カルボキシル基の化学修飾について、例えば、エステル化はメタノールへの懸濁後に乾燥塩化水素ガスを通気することなどにより、アミド化はカルボジイミドなどを作用させることにより、行うことができる。
ヒドロキシプロリン残基の水酸基の化学修飾については、例えば、Ｏ−アセチル化は水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることなどにより、行うことができる。
化学修飾のその他の具体例として、特公昭６２−４４５２２号公報や特公平５−７９０４６号公報等に記載の化学修飾技術が適用できる。
〔関節軟骨再生促進剤〕
本発明にかかる関節軟骨再生促進剤は、上記本発明にかかるジペプチドを生理食塩水などで希釈したものであっても良く、充分に本発明の効果を得られるのであるが、前記本発明にかかるジペプチド以外に、本発明の効果を害しない範囲で、適宜他の有効成分や製剤用の成分を含有させても良い。

前記他の有効成分としては、グルコサミンおよび／またはその塩、コンドロイチン硫酸などが挙げられ、これらを１種または２種以上組み合わせて用いることができる。中でも、グルコサミンおよび／またはその塩は、本発明にかかるジペプチドによる関節軟骨再生促進効果を向上させる働きがあるため好ましい。
また、前記他の有効成分として、本発明にかかるジペプチド以外のペプチドやアミノ酸を含んでいても良く、例えば、比較的分子量の大きなペプチドは、慢性リウマチ性関節炎などに対して、経口免疫寛容メカニズムによる骨・軟骨組織の炎症を緩和するという効果を奏するので有用である。

さらに、前記他の有効成分として、骨塩の沈着促進の目的で、カルシウムや糖転移ヘスペリジンなどを用いることができ、コラーゲンの合成・沈着促進などの目的でビタミンＣなどを用いることもできる。
前記他の有効成分の配合量としては、関節軟骨再生促進剤全量に対して、０．１〜２０重量部で用いることが好ましく、０．５〜２０重量部の割合で用いることがより好ましい。特に、グルコサミンおよび／またはその塩の配合量を、関節軟骨再生促進剤全量に対して、５〜１５重量部とすることが好ましい。５重量部未満では本発明にかかるジペプチドの関節軟骨再生促進効果を向上させる効果が充分に発揮されないおそれがあり、１５重量部を超えると尿や糞中に排出され、過剰摂取となるおそれがある。

製剤化のための成分としては、例えば、結晶性セルロースなどの賦形剤などを用いることができ、その形態などに応じて適切な量を設定すれば良い。
本発明にかかる関節軟骨再生促進剤の使用形態としては、例えば、経口投与により摂取したり、関節局所へ注入したり、といった形態が挙げられる。
経口投与の場合には、本発明にかかるジペプチドと前記他の有効成分や製剤用の成分を混合したものを、従来公知の方法により、打錠成型によって錠剤としたり、その他、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などの任意の形態に調製することもできる。

関節局所への注入の場合には、本発明にかかるジペプチドを生理食塩水などで希釈したものを用いるが、必要に応じて、さらに、前記他の有効成分を用いても良く、その濃度としては、上述の如く、本発明にかかるジペプチドの含量を１ｍｍｏｌ／Ｌ以上とすることが好ましい。
本発明にかかる関節軟骨再生促進剤は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するジペプチドによって、関節軟骨再生促進効果を発現する。アミノ酸、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ以外の構造を有するジペプチド、Ｐｒｏ−Ｈｙｐに他のアミノ酸が結合したトリペプチド以上のペプチドでは、前記本発明にかかるジペプチドのような関節軟骨再生促進効果は発現されない。

以上のことは、後述する実施例中の性能評価試験において、具体的に立証されている。

以下に、本発明にかかるジペプチドの性能評価試験と、該ジペプチドを有効成分とする関節軟骨再生促進剤の配合例によって、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下では、便宜上、「重量部」を単に「部」と、「リットル」を単に「Ｌ」と記すことがある。また、「重量％」を「％」と記すことがある。
〔性能評価試験〕
本発明にかかるジペプチドの性能評価試験を以下に示す。
まず、性能評価試験に用いたコラーゲンペプチドについて説明する。コラーゲンペプチドは、本発明にかかるジペプチドを含む２種の豚皮由来のコラーゲンペプチド（以下では、それぞれを、「ＰＣ」、「ＰＣ−ＣＡ」と略記する。）、本発明にかかるジペプチドを含む魚鱗由来のコラーゲンペプチド（以下では、「ＦＣ」と略記する。）と、比較のために、本発明にかかるジペプチドを含まない２種の豚皮由来のコラーゲンペプチド（以下では、それぞれを、「ＰＣ−Ｃｏｎｔ」、「ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ」と略記する。）を準備した。

＜ＰＣ＞
豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の温水４ｋｇに溶解させ、６０℃に温度調整した後、１次酵素反応として、黄色コウジカビ由来プロテアーゼ１０ｇを添加し、ｐＨ５．０〜６．０、温度４５〜５５℃で１２０分間保持することにより酵素加水分解処理を行った。次いで、２次酵素反応として、これにアミノペプチダーゼＰおよびプロリダーゼ活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ抽出酵素を終濃度０．５％で添加し、これを可溶化したのち、５０℃で６時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間１００℃に加熱処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＰＣを得た。

このＰＣを、薄層クロマトグラフィーに供した。すなわち、薄膜クロマトグラフィープレート（商品名「ＣｅｌｌｕｌｏｓｅＦ」、メルク社製）に、水に可溶化したＰＣを、１０μｇ滴下したのち、溶媒（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２）で展開した。このプレートを風乾してイサチン・酢酸亜鉛試薬を噴霧したのち、青色のスポットによってＮ末端がＰｒｏであるペプチドの存在を確認するとともに、上記で得られたＰＣの青色スポットのＲｆ値（［スポット原点から発色スポットまでの距離］÷［スポット原点から溶媒フロントまでの距離］）が、同一プレートにスポットした内部マーカーであるＰｒｏ−Ｈｙｐの各青色スポットのＲｆ値と一致すること、すなわち、このＰＣがＰｒｏ−Ｈｙｐを含むことを確認した。

＜ＦＣ＞
魚鱗由来ゼラチンを用いたこと以外は、前記ＰＣの製造と同様の操作により、ＦＣを得た。
また、このＦＣを前記ＰＣと同様に薄膜クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの存在が確認された。
＜ＰＣ−ＣＡ＞
豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４Ｌに加温しながら溶解させたのち、４０℃に冷却し、１次酵素反応として、１ｇのコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｎ−２）を添加後、ｐＨ７．０〜７．８、４０℃で２４時間保持することにより酵素分解処理を行った。次いで２次酵素反応として、この反応液にアミノペプチダーゼＰおよびプロリダーゼ活性を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ抽出酵素を終濃度０．２５％で添加、ｐＨ４．０、５０℃で６時間反応させた。反応後、この反応液を１０分間１００℃に加温処理し、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いてろ過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理を施した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥し、ＰＣ−ＣＡを得た。

前記乾燥重量２ｇのＰＣ−ＣＡを１０ｍＬの水に溶解させたものを、カラム（「ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ」、東ソー社製；１６×６５０ｍｍ）に２回に分けて負荷して、蒸留水で溶出されるボイドボリューム画分を回収した。次いで、回収した画分をカラム（「ＳＰトヨパール６５０Ｍ」、東ソー社製；１６×６５０ｍｍ）に負荷し、蒸留水で溶出されるボイドボリューム画分を回収した。次に、この画分をカラム（「セファデックスＬＨ−２０」、ファルマシア社製；２６×９００ｍｍ）に負荷し、３０％メタノール水溶液で溶出した。９ｍＬ／フラクションで分画し、化学合成品であるＰｒｏ−Ｈｙｐが溶出する位置に相当する画分を回収した。得られた画分をカラム（「μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８ ３００Å」、ウォーターズ社製；３．９×１５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで、０．１％トリフルオロ酢酸を含む０〜３２％以下のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配溶出（流速１ｍＬ／ｍｉｎ、０〜３２％の勾配を１８分間で行う）により分画し、化学合成品であるＰｒｏ−Ｈｙｐが溶出する位置に相当する保持時間に溶出されるピーク部分を分取した。そして、分取液を減圧乾固することにより、白色粉末を得た。得られた白色粉末の構造を、エドマン法によるタンパク質構造解析装置（「プロテインシークエンサー４９１型」、アプライドバイオシステムズ社製）により解析したところ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの存在が確認された。

＜ＰＣ−Ｃｏｎｔ＞
前記したＰＣの製造における１次酵素反応のみを行って、ＰＣ−Ｃｏｎｔを得た。
すなわち、豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の温水４ｋｇに溶解させ、６０℃に温度調整した後、黄色コウジカビ由来プロテアーゼ１０ｇを添加し、ｐＨ５．０〜６．０、温度４５〜５５℃で１２０分保持することにより酵素加水分解処理を行った。次いで、酵素加水分解処理で得られた溶液を８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、その後、６０℃に冷却し、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いて濾過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理を施した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥することにより、粉末化したＰＣ−Ｃｏｎｔを得た。

このＰＣ−ＣｏｎｔをＰＣと同様に薄膜クロマトグラフィーにより分析したところ、青色のスポットが確認されず、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの存在は確認されなかった。
＜ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ＞
前記したＰＣ−ＣＡの製造における１次酵素反応のみを行って、ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔを得た。
すなわち、豚皮コラーゲンの熱変性物であるゼラチン（Ｉ型コラーゲン）１ｋｇを７５℃の２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４Ｌに加温しながら溶解させ４０℃に冷却した後、１ｇのコラゲナーゼ（新田ゼラチン社製、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｎ−２）を添加後、ｐＨ７．０〜７．８、４０℃で２４時間保持することにより酵素分解処理を行った。次いで、酵素加水分解処理で得られた溶液を８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、その後、活性炭と濾過助剤（珪藻土）とを用いてろ過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理を施した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥することにより、粉末化したＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔを得た。

このＰＣ−ＣＡ−ＣｏｎｔをＰＣと同様に薄膜クロマトグラフィーにより分析したところ、青色のスポットが確認されず、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの存在は確認されなかった。
＜評価試験１＞
前記ＰＣ（ＰＣ群）、ＦＣ（ＦＣ群）およびＰＣ−ＣＡ（ＰＣ−ＣＡ群）を用い、各コラーゲンペプチドを前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５培養液に終濃度０．１％となるように添加し、培養から５日後に肥大化軟骨および石灰化のマーカー酵素であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の各抑制活性を調べた。比較のために、ペプチド無添加（Ｎ群）のときのＡＬＰ抑制活性、終濃度０．１％のペプトン（Ｐｅ群）を用いたときのＡＬＰ抑制活性、前記ＰＣ−Ｃｏｎｔ（ＰＣ−Ｃｏｎｔ群）、ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ（ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ群）を用いたときのＡＬＰ抑制活性も調べた。結果を表１に示す。

＜評価試験２＞
固相法により合成したジペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ（ピー・エッチ・ジャパン社製）（［Ｐｒｏ−Ｈｙｐ］群）を用い、添加量を２．５ｍＭとし、比較として、ペプチド無添加（Ｎ群）、遊離アミノ酸であるグリシン（Ｇｌｙ群）、プロリン（Ｐｒｏ群）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ群）、プロリンとヒドロキシプロリンの遊離アミノ酸混合物（［Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ］群）、グリシンとプロリンとヒドロキシプロリンの遊離アミノ酸混合物（［Ｇｌｙ＋Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ］群）と、固相法により合成したトリペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（ピー・エッチ・ジャパン社製）（［Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ］群）を用いたこと以外は、評価試験１と同様にして、ＡＬＰの抑制活性を調べた。結果を表２に示す。

＜評価試験３＞
１０週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、表３に示す組成で各々飼料を経口摂取させた。この試験においては、表３中、コラーゲンペプチド添加群として、前記ＰＣ（ＰＣ群）、ＦＣ（ＦＣ群）およびＰＣ−ＣＡ（ＰＣ−ＣＡ群）を用いるとともに、比較として、前記ＰＣ−Ｃｏｎｔ（ＰＣ−Ｃｏｎｔ群）、ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ（ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔ群）を用いた。マウスを３週間後に屠殺したのち、各群の大腿骨・脛骨関節部の非脱灰ヘマトキシリン染色切片から、マトリクス構造評価および細胞状態を評価し、関節腔の幅を測定した。

結果を表４、６に示す。表４に示す値（病理学的スコアー）は、表５に示す基準で各マウスの関節軟骨のマトリクス構造および細胞状態を評価し、それらの値を平均した値である。

さらに、前記Ｎ群、Ｃ群およびＰＣ群について、ＣＴ装置（Ｘ線ＣＴラシータ、ＡＬＯＫＡ社製）による骨計測を行った。結果を表７に示す。

＜評価試験４＞
１０週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、上記表３に示す組成で各々飼料を経口摂取させた。この試験においては、表３中、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ添加群として、化学合成試薬であるジペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ（ＢＡＣＨＥＭ社製）（［Ｐｒｏ−Ｈｙｐ］群）を用いた。マウスを３週間後に屠殺し、各群の大腿骨・脛骨関節部のμＣＴ（卓上型マイクロＣＴスキャナ ＳＫＹＳＣＡＮ１１７２、ＳＫＹＳＣＡＮ社製）像から関節腔の幅を測定し、非脱灰ヘマトキシリン染色切片からマトリクス構造評価および細胞状態を評価した。また、比較のために、表３中の（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ）添加群として、プロリンとヒドロキシプロリンの遊離アミノ酸混合物を用いた遊離アミノ酸混合物添加群（［Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ］群）を用いて、同様の操作、評価を行った。

結果を表８に示す。

＜評価試験５＞
固相法により合成したジペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ（ピー・エッチ・ジャパン社製）（［Ｐｒｏ−Ｈｙｐ］群）を、終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように生理食塩水に可溶化したのち、濾過滅菌した。この溶液０．５ｍｌを、１０週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに上記表３の組成で飼料を３週間与えたＣ群に対して、その左大腿骨・脛骨関節腔に注射した。１週間後に屠殺し、左右の大腿骨−脛骨関節腔部の非脱灰マイヤーヘマトキシリン染色切片を作成し、病理評価した。同様にして、注射した後、３週間後に屠殺した場合についても、左右の大腿骨−脛骨関節腔部の非脱灰マイヤーヘマトキシリン染色切片を作成し、前記評価試験４でのＮ群の病理切片と比較して病理評価した。

結果を表９に示す。

＜性能評価試験の結果の考察＞
本発明にかかるジペプチドを含むＦＣ、ＰＣ、ＰＣ−ＣＡは、本発明にかかるジペプチドを含まないＰＣ−Ｃｏｎｔ、ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔよりも、優れた関節軟骨再生促進効果を発現していることが、上記評価試験１、３の結果（表１、４および６）から分かる。
また、評価試験２、４では、合成ジペプチドであるＰｒｏ−Ｈｙｐ単独での優れた関節軟骨再生促進効果が示されており、他方、プロリン、ヒドロキシプロリン、グリシンやそれらの混合物およびＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙでは関節軟骨再生促進効果は認められない（表２、８）。

評価試験５においても、合成ジペプチドであるＰｒｏ−Ｈｙｐ単独での優れた関節軟骨再生促進効果が示されている（表９）。
〔実施例１〜３〕
表１０に示す配合で、各材料を混合し、賦形剤としての結晶性セルロースを、表１０に記載の配合全体に対して１０部の割合で用いて、常法により打錠成形することにより、経口用として用いうる、実施例１〜３にかかる関節軟骨再生促進剤を得た。なお、表１０におけるＰｒｏ−Ｈｙｐは性能評価試験で使用したＢＡＣＨＥＭ社製の合成ジペプチドであり、ＰＣ、ＰＣ−Ｃｏｎｔ、ＰＣ−ＣＡ−Ｃｏｎｔは性能評価試験で使用したコラーゲンペプチドである。

〔実施例４〕
性能評価試験で使用したコラーゲンペプチドであるＰＣをチュアブルタイプのタブレットに用いた場合の配合例を記載するが、本発明は、これに限定されるものではない。
下記配合成分を混合し、打錠成型器を用いて、一粒０．８ｇのチュアブルタイプのタブレットを調製した。このチュアブルタイプのタブレットは、全量を１００重量％としたとき、約４．５重量％のＰｒｏ−Ｈｙｐを有効成分として含有するものであった。

ＰＣ ５０．０ｋｇ
アスコルビン酸 １０．０ｋｇ
ミクロカルマグＳ（エスケーフーヅ社製） ４．６ｋｇ
マビット（林原社製） １９．０ｋｇ
結晶セルロース １０．０ｋｇ
乳化剤 ３．２ｋｇ
アスパルテーム ０．５ｋｇ
発酵乳パウダー １．４ｋｇ
粉末香料 １．０ｋｇ
クエン酸 ０．３ｋｇ

なお、アミノ酸配列が既知の豚皮由来のＩ型コラーゲン（重量（Ｘ）ｇ）に含まれるＰｒｏ−Ｈｙｐの配列の和（Ｙ）をカウントし、下記式より該Ｉ型コラーゲン全体中の理論含有量を求めたところ、９．０重量％であった。

［（Ｐｒｏ−Ｈｙｐの数（Ｙ））×（Ｐｒｏ−Ｈｙｐの重量（分子量））］／（全配列の重量（Ｘ））

以上のことから、前記ＰＣは、理論的に、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを最大９．０重量％含むものである。
下記実施例５〜８も、本実施例４と同様に、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを最大９．０重量％含む前記ＰＣを各種用途に用いた場合の配合例である。

〔実施例５〕
下記配合成分を混合して、１００〜１４０ｍＬのお湯に溶解させて飲用する粉末コンソメスープ（１袋６．０ｇ）を調製した。この粉末コンソメスープは、全量を１００重量％としたとき、約３．２重量％のＰｒｏ−Ｈｙｐを有効成分として含有するものであった。

ＰＣ ３５．０ｋｇ
チキンエキスパウダー ２５．０ｋｇ
食塩 １８．０ｋｇ
ブドウ糖 ７．７ｋｇ
乳酸カルシウム ７．０ｋｇ
グルタミン酸ナトリウム ４．０ｋｇ
オニオンエキスパウダー １．０ｋｇ
ＨＶＰ １．０ｋｇ
ビーフフレーバー ０．５ｋｇ
５’−リボヌクレオチド２ナトリウム ０．５ｋｇ
ホワイトペッパー ０．２ｋｇ
ターメリック ０．１ｋｇ

〔実施例６〕
下記配合成分を混合して、１００〜１５０ｍＬの水に溶解させて飲用する粉末ジュース（１袋１３．０ｇ）を調製した。この粉末ジュースは、全量を１００重量％としたとき、約３．６重量％のＰｒｏ−Ｈｙｐを有効成分として含有するものであった。

ＰＣ ４０．４ｋｇ
アスコルビン酸ナトリウム １．２ｋｇ
エリスリトール ５２．０ｋｇ
アセスルファムＫ ０．１ｋｇ
アスパルテーム ０．１ｋｇ
クエン酸ナトリウム ０．８ｋｇ
クエン酸（結晶） ４．６ｋｇ
マスカットフレーバー ０．８ｋｇ

〔実施例７〕
下記配合成分に従い、精製水に他の配合成分を溶解し、ｐＨ３．５、Ｂ’×９．０％に調製したのち、１１０℃で３０秒加熱殺菌処理を施し、１０℃に冷却してから紙パックに無菌充填して、清涼飲料水（１パック１２５ｍＬ）を調製した。この清涼飲料水は、全量を１００重量％としたとき、約０．２重量％のＰｒｏ−Ｈｙｐを有効成分として含有するものであった。

ＰＣ ２．５ｋｇ
ビタミンミックスＤＮ（ＢＡＳＦジャパン社製）０．１ｋｇ
エリスリトール ５．５ｋｇ
アセスルファムＫ ０．０１５ｋｇ
アスパルテーム ０．００５ｋｇ
クエン酸 約０．６ｋｇ
フルーツミックスフレーバー ０．１６Ｌ
ライチフレーバー ０．０４Ｌ
精製水 残量（合計が１００．０ｋｇになるように設定）

〔実施例８〕
まず、下記配合成分のうちの精製水（Ｂ）にＰＣおよびゼラチンを浸漬して３０分間膨潤させたのち、８０℃達温３０分間加熱して完全に溶解させ、ゼラチン溶液とした。次に、下記配合成分のうちの精製水（Ａ）にミルクオリゴ糖、粉末麦芽還元糖、エリスリトール、および難消化性デキストリンを溶解させ、煮詰めた後、アスパルテーム、前記ゼラチン溶液、予め精製水（Ａ）の一部に溶解させたクエン酸（結晶）、ペパーミントフレーバー、ミントフレーバー、レモンフレーバー、およびベニバナ黄色素を添加し、Ｂ’×７９〜８１％に調製したのち脱泡し、スターチモールドに充填して室温で２４時間乾燥させ、グミゼリー（１粒４ｇ）を調製した。このグミゼリーは、全量を１００重量％としたとき、約０．４５重量％のＰｒｏ−Ｈｙｐを有効成分として含有するものであった。

ＰＣ ５．０ｋｇ
ミルクオリゴ糖 ４１．０ｋｇ
粉末麦芽還元糖 ３１．０ｋｇ
エリスリトール ５．０ｋｇ
難消化性デキストリン ５．０ｋｇ
アスパルテーム ０．０５ｋｇ
ゼラチン（ＡＰＨ２５０、新田ゼラチン社製） ７．０ｋｇ
クエン酸（結晶） １．２ｋｇ
ペパーミントフレーバー ０．６Ｌ
ミントフレーバー ０．２Ｌ
レモンフレーバー ０．７Ｌ
ベニバナ黄色素 適量
精製水（Ａ） ２０．０Ｌ
精製水（Ｂ） １８．０Ｌ

〔実施例９〕
表１０に示す実施例１の配合において、ＰＣ−Ｃｏｎｔ、カルシウムおよびビタミンＣを用いなかったこと以外は同様の配合で各材料を混合し、これを生理食塩水で５ｍｍｏｌ／Ｌに希釈することにより、関節局所への注入用として用いうる、実施例９にかかる関節軟骨再生促進剤を得た。

本発明にかかる関節軟骨再生促進剤は、例えば、骨粗しょう症や変形性関節炎などの症状を予防ないし治療するための健康食品、医薬品などとして好適に使用することができる。

Claims (4)

1. Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するジペプチドを有効成分とする、関節軟骨再生促進剤。
2. 有効成分としてグルコサミンおよび／またはその塩も含む、請求項１に記載の関節軟骨再生促進剤。
3. 経口用である、請求項１または２に記載の関節軟骨再生促進剤。
4. 関節局所への注入用である、請求項１または２に記載の関節軟骨再生促進剤。