JP2021097626A - 低分子コラーゲンペプチド組成物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 皮膚バリア機能改善効果を有する低分子コラーゲンペプチド組成物及びその製造法を提供する。【解決手段】 コラーゲン原料を１種以上の微生物由来のエンドペプチダーゼを用いて分解後、更に１種以上の微生物由来のアミノペプチターゼを用いて分解する工程を含む、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ又はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで示されるペプチドを７０質量％以上含有し、分子量が６００以下のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、低分子コラーゲンペプチド組成物及びその製造方法に関する。

角層は、肌の最も外側にあり、皮膚の内側からの水分の蒸散を防ぐ機能と、外界から皮膚への物質の侵入を防ぐ機能をつかさどっている。乾燥や紫外線等の外的要因や加齢・ストレス等の内的要因の影響を受けて斯かる角層機能が低下すると、乾燥や肌荒れ等のトラブルにつながる。角層機能には、ターンオーバー（皮膚の代謝）、角質細胞間脂質又は天然保湿因子が関与しており、特に水分保持機能が低下している皮膚は、ターンオーバーに乱れが生じている、又は角質細胞間脂質や天然保湿因子が減少している状態と言われている。

コラーゲンペプチドは、コラーゲンを酵素等で処理して低分子化したものであり、美肌効果や変形性関節症改善効果等、生体において様々な作用を有すると云われている。例えば、Ｐｒｏ−ＨｙｐやＨｙｐ−Ｇｌｙは、皮膚、骨及び軟骨の細胞に対して生理活性を示すことが報告されている(非特許文献１)。

コラーゲンを酵素分解する方法は様々報告されており（例えば、特許文献１〜４）、通常、得られるコラーゲンペプチドの分子量は数万程度のものが多いが、特許文献４には、微生物由来のコラゲナーゼ酵素を用いて、（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ（ｎ＝１〜３）であるペプチドを７０％以上含有し、分子量が１，０００以下のコラーゲン分解物が得られることが開示されている。しかしながら、特許文献４では取得されたコラーゲン分解物に含まれるペプチドは具体的に明らかにされていない。

特開２００３−２８４５８６号公報 特開２００４−５７１９６号公報 特開２００６−８９号公報 特許第３１４６２５１号公報

重村 & 佐藤, 2008; Nakatani et al, 2009; Ohara et al., 2010; Ohara et al, 2010

本発明は、皮膚バリア機能改善効果を有する低分子コラーゲンペプチド組成物及びその製造法を提供することに関する。

本発明者らは、上記課題に鑑み、検討したところ、細菌由来のエンドプロテアーゼとアミノペプチターゼを組み合わせてコラーゲン原料を分解することにより、特定のジペプチドやトリペプチドを多く含む分子量が６００以下の低分子コラーゲンペプチド組成物を製造することができ、斯かるペプチド組成物を用いることにより紫外線により低下した皮膚バリア機能を改善できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）〜８）に係るものである。
１）コラーゲン原料を一種以上の微生物由来のエンドペプチダーゼを用いて分解後、更に一種以上の微生物由来のアミノペプチターゼを用いて分解する工程を含む、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ又はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで示されるペプチドを７０質量％以上含有し、分子量が６００以下のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
２）エンドペプチダーゼとしてバチルス属細菌由来のプロテアーゼを用い、アミノペプチターゼとしてアスペルギルス属真菌由来のペプチターゼ及びストレプトマイセス属細菌由来のペプチダーゼを用いる１）の方法。
３）バチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼがバチルス・リケニフォルミス由来のアルカリプロテアーゼであり、アスペルギルス属真菌由来のペプチダーゼ及びストレプトマイセス属細菌由来のペプチダーゼがそれぞれアスペルギルス・オリゼー由来のペプチダーゼ及びストレプトマイセス・グリセウス由来のペプチダーゼである２）の方法。
４）エンドペプチダーゼをゼラチン抽出物１００質量部に対して０．５〜５質量部、アミノペプチターゼをゼラチン抽出物１００質量部に対して０．０５〜２質量部使用する、１）〜３）のいずれかの方法。
５）コラーゲン原料が魚類の鱗である、１）〜４）のいずれかの方法。
６）１）〜５）のいずれかの方法により製造されるコラーゲンペプチド組成物であって、Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドを７０質量％以上含有し、分子量が６００以下のペプチド組成物。
７）１）〜５）のいずれかの方法により製造される１種以上のコラーゲンペプチド組成物を有効成分とする、皮膚バリア機能改善剤。
８）Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドを７０質量％以上含有し、分子量が６００以下のペプチド組成物と、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで示されるペプチドを７０質量％以上含有し、分子量が６００以下のペプチド組成物を組み合わせて用いる７）の皮膚バリア機能改善剤。

本発明によれば、コラーゲン原料から、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ又はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで示されるペプチドを７０質量％以上含有する低分子コラーゲンペプチド組成物を効率よく製造することができる。斯かるペプチド組成物は、皮膚バリア機能改善剤として、皮膚バリア機能低下による荒れ肌や敏感肌を予防又は改善するために使用できる。

コラーゲンペプチド組成物のゲルクロマトグラフィーパターン。 紫外線照射マウスの作製及び試験物質の投与プロトコール。 コラーゲンペプチド組成物の皮膚水分量低下に対する効果。 コラーゲンペプチド組成物の経表皮水分蒸散量上昇に対する効果。 コラーゲンペプチド組成物のマウスの背部皮膚像。 紫外線照射マウスの作製及び試験物質（混合）の投与プロトコール。 コラーゲンペプチド組成物（混合）の皮膚水分量低下に対する効果。 コラーゲンペプチド組成物（混合）の経表皮水分蒸散量上昇に対する効果。 コラーゲンペプチド組成物のマウスの背部皮膚像。

本発明において、「コラーゲンペプチド組成物」とは、コラーゲン原料中のコラーゲンを低分子化して得られるペプチドの混合物を意味する。

本発明で使用するコラーゲン原料としては、ウシ、ブタ、鳥、魚等の動物の皮膚、骨、鱗等のコラーゲンを含む組織から採取したものが挙げられる。具体的には、動物の骨、皮、鱗等をアルカリ処理や酸処理することにより得られるコラーゲン抽出物、更に熱処理することにより得られるゼラチン抽出物を使用することができる。また、原料からコラーゲンを抽出することなく、牛皮や豚皮等の動物性皮原料から脱毛処理や油脂層除去処理を行ったもの、あるいは牛や豚をはじめとした動物性の腱や軟骨等を細断あるいは適当な方法で破砕したもの等をそのまま使用することもできる。

このうち、本発明のコラーゲンペプチドを得るための好適なコラーゲン原料としてはゼラチン抽出物が挙げられ、より好ましくは、魚類、例えばティラピア、アカマツダイ、南洋クロダイ、イトヨリダイ、スズキ、鯉、草魚、雷魚等の鱗を酸により脱灰処理した後、熱処理して得られるゼラチン抽出物が挙げられる。

本発明において、コラーゲン原料の分解は、微生物由来のエンドペプチダーゼを用いて分解後、更に微生物由来のアミノペプチターゼを用いることにより行われる。

本発明において用いられるエンドペプチダーゼとしては、アルカリプロテアーゼであるのが好ましく、またセリンプロテアーゼであるのが好ましい。
本発明のエンドペプチダーゼとしては、例えばバチルス（Bacillus）属細菌由来のプロテアーゼが好適に挙げられる。

バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・クラウジー（Bacillus clausii）、バチルス・インターミディウス（Bacillus intermedius）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、及びバチルス・サーモプロテオリティカス（Bacillus thermoproteolyticus）が挙げられるが、このうちバチルス・リケニフォルミスが好ましい。

バチルス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼとしては、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＰ４８６０（別名：アルカラーゼ、スブチリシン Ａ）、ＤＳＭ社のマキシプロＢＡＰ等が挙げられる。

本発明の「アミノペプチターゼ」としては、コラーゲンペプチド中のペプチド結合を加水分解できるエキソアミノペプチダーゼが挙げられ、この中でもＨｙｐのＮ末端側で切断されたペプチドを遊離させるペプチダーゼが好ましい。

アミノペプチダーゼとしては、アスペルギルス（Aspergillus）属真菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌、リゾプス（Rhizopus）属細菌等に由来するアミノペプチダーゼが挙げられ、好ましくはアスペルギルス属真菌、ストレプトマイセス属細菌由来のアミノペプチダーゼであり、アスペルギルス属真菌、ストレプトマイセス属細菌由来のアミノペプチダーゼを組み合わせて用いるのがより好ましい。

アスペルギルス属真菌としては、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）が挙げられる。
アスペルギルス属真菌由来のアミノペプチダーゼとしては、好ましくはアスペルギルス・オリゼー由来のペプチダーゼが挙げられ、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＰ６１１０（別名：Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）、天野エンザイム社のプロテアックス等が挙げられる。

ストレプトマイセス属細菌としては、例えば、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Streptomyces violaceoruber）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコラ（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）等が挙げられる。
ストレプトマイセス属細菌由来のアミノペプチダーゼとしては、好ましくはストレプトマイセス・グリセウス由来のペプチダーゼが挙げられ、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＰ５１４７（別名：アクチナーゼＥ）等が挙げられる。

斯かる微生物由来のプロテアーゼは、当該酵素を産生する微生物を培養することにより製造できるが、これらの酵素遺伝子を遺伝子工学的にベクター等に組み込んで、大腸菌や酵母等の微生物により産生させたものであってもよい。

本発明において、エンドペプチダーゼの使用量は、例えば、コラーゲン又はゼラチン抽出物１００質量部に対して、好ましくは０．５〜５質量部、より好ましくは１〜５質量部、より好ましくは１〜３質量部用いることが挙げられ、アミノペプチダーゼの使用量は、好ましくは０．０５〜２質量部、より好ましくは０.１〜３質量部、より好ましくは０．１〜２質量部用いることが挙げられる。

エンドペプチダーゼとアミノペプチダーゼの使用比率は、質量比で１：０．０１〜１：３であるのが好ましく、１：０．０３〜１：２であるのがより好ましい。

Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドを７０質量％以上含有するペプチド組成物を製造する場合、一態様として、コラーゲン又はゼラチン抽出物１００質量部に対して、エンドペプチダーゼを０．５〜２質量部、好ましくは１〜２質量部用い、アミノペプチダーゼを、０．６〜２質量部、より好ましくは１〜２質量部用いることが挙げられる。

また、別の一態様として、コラーゲン又はゼラチン抽出物１００質量部に対して、エンドペプチダーゼを３〜５質量部、好ましくは３〜４質量部用い、アミノペプチダーゼを、０．０５〜０．５質量部、より好ましくは０．０５〜０．１質量部用いることが挙げられる。

また、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで示されるペプチドを７０質量％以上含有するペプチド組成物を製造する場合、一態様として、コラーゲン又はゼラチン抽出物１００質量部に対して、エンドペプチダーゼを０．５〜２質量部、好ましくは１〜２質量部用い、アミノペプチダーゼを、０．０５〜０．５質量部、より好ましくは０．１〜０．２質量部用いることが挙げられる。

アミノペプチダーゼは、アスペルギルス属真菌及びストレプトマイセス属細菌由来のアミノペプチダーゼを組み合わせて用いるのがより好ましいが、この場合は、アスペルギルス属真菌由来ペプチダーゼとストレプトマイセス属細菌由来ペプチダーゼの使用比率は、質量比で１：０.０１〜１：３であるのが好ましく、１：０．０５〜１：２であるのがより好ましい。

酵素処理は、至適ｐＨ，至適温度条件下で行われるが、処理時間は使用する原料の水分含量や、原料片の大きさ、原料の容量と処理液の比率等から適切な条件を設定すればよい。例えば、エンドペプチダーゼによる処理は、４０〜７０℃、好ましくは４５〜６０℃で、ｐＨ６〜８で、１〜５時間処理するのが好ましい。
また、アミノペプチダーゼによる処理は、３０〜６０℃、好ましくは３５〜５０℃、ｐＨ５〜８で、５〜１０時間処理するのが好ましい。

酵素処理後には、加熱により酵素失活処理が行われる。加熱温度としては、例えば、７０〜１００℃である。

失活工程の後、得られた粗コラーゲンペプチド組成物は適宜精製処理を行うことができる。精製処理には、例えば、活性炭や珪藻土ろ過等を用いて不純物を除去することが好ましい。珪藻土等のろ過助剤を使用して、コラーゲンペプチド溶液と残渣とを分離することができる。また、塩濃度を低下させる必要がある場合には、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂又はそれらの両方を用いて、脱イオン処理を行う。得られた溶液は適切な乾燥方法、例えばスプレードライヤーを用いて容易に粉末化することができる。

斯くして得られた本発明のコラーゲンペプチド組成物は、分子量が６００以下である。好ましくは、分子量は１００〜６００であり、より好ましくは３００〜６００であり、より好ましくは５００〜６００である。
分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー等の当業者に公知の手段及び公知の方法を用いて測定することができるが、本明細書において、「分子量」という場合には、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて分析した際の最大ピークのリテンションタイムから求められる重量平均分子量を意味する。

また、本発明のコラーゲンペプチド組成物は、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ又はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａを７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上含有するペプチド組成物であり、通常一般のコラーゲンと称するものとは区別される。またジペプチドＨｙｐ−ＧｌｙやトリペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａとも区別されるものである。
尚、ペプチドの含有量の測定は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により実施することができる。当業者であればその条件設定は容易に行うことができる。

後記実施例に示すように、本発明のコラーゲンペプチド組成物は、紫外線照射マウスにおける皮膚（角層）水分量の低下及び経表皮水分蒸散量（transepidermal water loss；ＴＥＷＬ値）の上昇を抑制し、皮膚バリア機能を改善する。また、本発明のコラーゲンペプチド組成物は、ペプチド組成の異なる２種のコラーゲンペプチド組成物（Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドを７０質量％以上含有するペプチド組成物とＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで示されるペプチドを７０質量％以上含有するペプチド組成物）を組み合わせて用いることにより、より効果的に皮膚バリア機能改善効果が発揮される。

従って、本発明のコラーゲンペプチド組成物は、皮膚バリア機能改善剤となり得、皮膚バリア機能低下による荒れ肌や敏感肌を予防又は改善するために使用することができる。
ここで、「使用」は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。

本発明において、「皮膚バリア機能改善」とは、皮膚の内側からの水分の蒸散を防ぐ機能及び外界から皮膚への物質の侵入を防ぐ機能（皮膚バリア機能）を改善すること意味する。ここで、「改善」には、皮膚バリア機能の低下、破壊又は崩壊を抑制すること、及び強化することが包含される。皮膚バリア機能が改善されることにより、皮膚バリア機能低下による荒れ肌や敏感肌を予防又は抑制することができる。

本発明の皮膚バリア機能改善剤は、それ自体、皮膚バリア機能を改善するための医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品であってもよく、或いは当該医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
当該食品には、皮膚バリア機能の改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した機能性表示食品、特定保健用食品、サプリメント等が包含される。

上記医薬品又は医薬部外品は、その投与形態は任意であり、経口投与、非経口投与の何れでもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形製剤、ならびにエリキシル、シロップ及び懸濁液のような液体製剤が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、外用、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、貼付等の各製剤が挙げられる。好ましくは、当該医薬品又は医薬部外品は、皮膚外用剤の形態であるのが好ましく、具体的には、軟膏、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の形態が挙げられる。

また、上記化粧品の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアジェル、ヘアクリーム、トリートメント、ヘアスプレー、エアゾルムース、シャンプー、リンス等、化粧品に使用され得る任意の形態が挙げられる。

上記医薬品、医薬部外品若しくは化粧品に係る製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、本発明のコラーゲンペプチド組成物を、製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等と共に混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、本発明のコラーゲンペプチド組成物の他、それぞれ医薬品、医薬部外品、化粧品等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗菌剤、清涼剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。

上記食品の形態は、固形、半固形又は液状（例えば飲料）であり得る。該食品としては、例えば、飲料、菓子、パン等の各種飲食品、ならびにそれらの原料が挙げられる。あるいは、該食品は、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、液剤、シロップ等の経口投与製剤の形態を有するサプリメントであってもよい。

当該食品は、本発明のコラーゲンペプチド組成物を、任意の食品材料、もしくは他の有効成分、又は食品に許容される添加物（例えば溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、酸味料、甘味料、苦味料、ｐＨ調整剤、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、固着剤、分散剤、流動性改善剤、湿潤剤、香科、調味料、風味調整剤、等）等と適宜組み合わせて、定法に従って調製することができる。

医薬品、医薬部外品若、化粧品若しくは食品に係る製剤組成物中のコラーゲンペプチド組成物の含有量は、好ましくは０．１〜４０質量％、より好ましくは１〜２０質量％、さらに好ましくは１〜１０質量％である。

上記製剤組成物によるコラーゲンペプチド組成物の投与量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、例えば、好ましくは１〜２０ｇ、より好ましくは３〜１５ｇ、さらに好ましくは５〜１０ｇである。

また、当該製剤組成物は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明を何ら制限するものではない。

製造例１ コラーゲンペプチド組成物Ａの製造
ティラピア鱗５００ｇをｐＨ４に酸で調整し、７０℃−５Ｌの湯を添加し、６５℃に加温したまま７時間撹拌し、ゼラチン抽出を行った。上記操作で得られたゼラチン濃度は１０質量％であった。

得られたゼラチン溶液を５０℃に加温し、ｐＨを８に調整後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のプロテアーゼ（Ｐ４８６０ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をゼラチン１００質量部に対して１質量部添加した。液温を５０℃に保持したまま２.５時間反応させた。

次に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来（Ｐ５１４７ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のプロテアーゼ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（Ｐ６１１０ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）由来のプロテアーゼを総量でゼラチン１００質量部に対して２質量部添加し、液温を４０℃に保持したまま１０時間反応させた。所定時間経過した液を８０℃に加熱し、酵素失活させ、ペプチド組成物Ａを得た。

製造例２ コラーゲンペプチド組成物Ｂの製造
ティラピア鱗５００ｇをｐＨ４に酸で調整し、７０℃−５Ｌの湯を添加し、６５℃に加温したまま７時間撹拌し、ゼラチン抽出を行った。上記操作で得られたゼラチン濃度は １０質量％であった。

当該ゼラチン溶液を５０℃に加温し、ｐＨを８に調整後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のプロテアーゼ（Ｐ４８６０ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をゼラチン１００容量に対して３質量部添加した。液温を５０℃に保持したまま２０時間反応させた。

次にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のプロテアーゼ（Ｐ５１４７ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のプロテアーゼ（Ｐ６１１０ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を総量でゼラチン１００質量部に対して０．１容量添加し、液温を４０℃に保持したまま５時間反応させた。所定時間経過した液を８０℃に加熱し、酵素失活させ、ペプチド組成物Ｂを得た。

製造例３ コラーゲンペプチド組成物Ｃの製造
ティラピア鱗５００ｇをｐＨ４に酸で調整し、７０℃−５Ｌの湯を添加し、６５℃に加温したまま７時間撹拌を行い、ゼラチン抽出を行った。上記操作で得られたゼラチン濃度は１０質量％であった。

当該ゼラチン溶液を５０℃に加温し、ｐＨを８に調整後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のプロテアーゼ（Ｐ４８６０ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をゼラチン１００質量部に対して１質量部添加した。液温を５０℃に保持したまま２．５時間反応させた。

次に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のプロテアーゼ（Ｐ５１４７ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のプロテアーゼ（Ｐ６１１０ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をゼラチン１００質量部に対して総量で０．１５質量部添加し、液温を４０℃に保持したまま７．５時間反応させた。所定時間経過した液を８０℃に加熱し、酵素失活させ、ペプチド組成物Ｃを得た。

比較製造例１ コラーゲンペプチド組成物Ｄの製造
ティラピア鱗５００ｇをｐＨ４に酸で調整し、７０℃−５Ｌの湯を添加し、６５℃に加温したまま７時間撹拌を行い、ゼラチン抽出を行った。上記操作で得られたゼラチン濃度は１０質量％であった。
当該ゼラチン溶液を５０℃に加温し、ｐＨを８に調整後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のプロテアーゼ（Ｐ４８６０ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をゼラチン１００質量部に対して０．４質量部添加した。液温を５０℃に保持したまま１時間反応させた。所定時間経過した液を８０℃に加熱し、酵素失活させ、ペプチド組成物Ｄを得た。

試験例１ 分子量の測定
製造例１〜３で得られたペプチド組成物Ａ〜Ｃ、比較製造例１で得られたペプチド組成物Ｄの分子量分布をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定した。

（１）試料及びスタンダードの調製法
被験物質を、１０ｍｇ／ｍＬになるように、０．５Ｎ尿素含有 ０．０５Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ ７．０に溶解させた後、０．４５μｍのフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いてろ過を行った。分子量スタンダードには、ＰＥＧ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用し、分子量１０６、１９４、４２０、６１０、１０１０、１４８０、４０４０、７８３０のスタンダードをそれぞれ５ｍｇ／ｍＬで０．５Ｎ尿素含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）に溶解し、サンプルと同様にフィルターろ過を行ったものを使用した。

（２）ＨＰＬＣ分析法
使用したカラムは、Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＦ−３１０ ＨＱ及びＡｓａｈｉｐａｋ ＧＦ５１０ ＨＱ（Ｓｈｏｄｅｘ社製）を連結して使用した。検出はＵＶ（紫外可視分光２１５ｎｍ）及びＲＩ（示差屈折）の二種類の検出器で行った。流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラムオーブン４０℃で行った。

（３）結果
図１にゲルクロマトグラフィーの結果を示した。分子量の測定方法は、日本ゼラチン・コラーゲン工業組合で規定される方法に準拠している。分子量の大きい順に溶出時間が遅くなっている。分子量１０００以下の加水分解コラーゲンの第一ピークの溶出時間は、３７分と同一であった（青い線）。ペプチド組成物Ｂは、溶出時間３７分及び４０分のピークを示した。後半のピークの方が大きい特徴があった。ペプチド組成物Ｃは、３８分にそれほど大きくない第二ピークが認められた。ペプチド組成物Ａは、ペプチド組成物Ｃに比べて第二ピークが大きく、第一ピークと同じ大きさであった。

各ペプチド組成物の重量平均分子量は、以下の通りである。
ペプチド組成物Ａ：ＭＷ６００
ペプチド組成物Ｂ：ＭＷ５００
ペプチド組成物Ｃ：ＭＷ６００
ペプチド組成物Ｄ：ＭＷ５０００

試験例２ アミノ酸分析
（１）製造例１〜３で得られたペプチド組成物Ａ〜Ｃ、比較製造例１で得られたペプチド組成物Ｄを封入試験管中で６Ｎ塩酸、１１０℃、１８時間、加水分解を行った。開封後、超純粋で希釈し、遠心濃縮機で濃縮、超純水で洗浄、濃縮を繰り返し、最終的に乾固させた。メタノール、トリエチルアミン、超純水を７：２：１の割合で混合した溶液を１０μＬずつ真空乾固した試料に加え、真空乾固した。そして、１０μＬの溶液を加えた後に１０分間の真空乾固を行う事を３回繰り返しＨＰＬＣ用溶媒で溶解したものを分析試料とした。

アミノ酸の分析は、ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ， カラムＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ ＱＡ（内径４．６ｍｍ， 長さ１５ｃｍ）、流速１ｍＬ／ｍｉｎ； 検出ＵＶ２５４ｎｍ； カラムオーブン４０℃で行った。

（２）結果
表１に各ペプチド組成物のアミノ酸組成を示した。

試験例３ ペプチド組成分析
製造例１〜３で得られたペプチド組成物Ａ〜Ｃについて、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法（液体クロマトグラフィータンデム質量分析法）を用いてペプチドの同定及び定量を行った。各ペプチドの存在比率（％）を表２に示す。

ペプチド組成物Ａ及びＢでは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙが７０％以上含まれ、ペプチド組成物Ｃでは、９０％近くＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａが含まれていた。

試験例３ 皮膚バリア機能改善効果
（１）紫外線照射マウスの作製法及びペプチド組成物投与による皮膚状態の測定
Ｈｏｓ：ＨＲ−１系マウス雄６週齢を三協ラボサービスより購入した。動物は、１２時間明暗周期、温度２４±２℃の準ＳＰＦ環境下の動物飼育室にて飼育した。湿度は、５０±１０％になるように管理した。飼料には、一般飼育用固形飼料（ラボＭＲストック、日本農産工業製）を用い、自由摂取・自由飲水のもと、群ごとに１つのケージで群飼いとした。５日間の予備飼育後に皮膚水分量及び体重を基に、偏りがないように群分けを行い、本試験を開始した。１日１回、被験物質の経口投与を行った。試料の投与量は、２００ｍｇ／Ｋｇ体重とした。照射用紫外線ランプには、ｌｕｍｐＧＬ２０ＳＥ（ＳＡＮＫＹＯ ＤＥＮＫＩ社製）を用いた。デルマレイＵＶメーター２（村中医療器株式会社製）を使用し、照射強度を約１．０ｍＷ／ｃｍ^２に合わせた。縦９ｃｍ×横５ｃｍ×高さ４ｃｍ×１０連の個別ケージにマウスを入れ、週３回、１〜４分間紫外線照射を行った。各ケージの位置による照射強度の違いを緩和させるため、毎回位置のローテーションを行った。マウス皮膚に紅斑が起こらない量の紫外線を照射する必要があるため、照射時間を、初めは１分とし、徐々に長くすることで炎症を抑制しながら皺及び皮膚ダメージを形成させた。各ケージによって紫外線の強度が異なるため、ローテーションで照射を行った。

皮膚（角層）水分量及び経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）は、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ＣＭ８２５ 及びｅｗａｍｅｔｅｒ ＴＭ３００（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍＢＨ社製）を用いて測定した。
組織標本の作製は、ホルマリンで固定した後、パラフィン包埋し、組織片を切り出し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。表皮厚は、皮膚組織標本の全視野を観察し、代表的な部位の写真をＯＬＹＭＰＵＳ ＣＡＭＥＤＩＡ ＤＩＧＩＴＡＬ ＣＡＭＥＲＡ Ｃ−３０４０ ＺＯＯＭで撮影した。ＨＥ標本の写真を用いて、基底層から顆粒層最上部までの距離を、フリーソフト「ものさしｐｉｘ」で測定した。１匹あたり３視野の撮影を行い、１枚あたり１０箇所の測定を行い、その平均値を算出した。同様にミクロメーターを撮影した値を用いて実際の値を求め、その個体の表皮厚とした。

（２）統計処理方法
エクセル統計ソフトＳｔａｔｃｅｌ ３のＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定により統計処理を行った。

（３）結果
紫外線照射と同時にペプチド組成物Ａ〜Ｄをヘアレスマウスに投与し（図２）、背部皮膚の水分量及び経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を経時的に測定した。その結果を図３及び図４に示した。投与３週目で、紫外線照射によりコントロールの皮膚水分量が減少するのに対し、ペプチド組成物Ａ〜Ｃの投与により改善している。６週目でペプチド組成物Ａ及びＢの投与により皮膚水分量がより改善していた。
経表皮水分蒸散量は、６週目では、ペプチド組成物Ａ〜Ｃの投与によりＴＥＷＬが有意に改善した（図４）。

図５に加水分解コラーゲンを投与した紫外線照射ヘアレスマウスの背部皮膚組織像を示した。紫外線暴露により基底膜上の上皮細胞の過剰増殖ならびに死細胞が確認できる。ペプチド組成物Ａ〜Ｃの投与により、表皮細胞の過剰増殖が抑制され、死細胞も減少しているのが観察できる。また、表皮の肥厚抑制も認められた。

試験例４ ペプチド組成物混合物投与による皮膚バリア機能改善効果
試験例３で、６周目で優れた効果が認められた分子量５００程度のペプチド組成物Ｂとペプチド組成物Ｃを混合した場合の効果について検討した。
本実験では、ペプチド組成物を投与しながら紫外線照射を行った。投与したペプチド組成物は、ペプチド組成物Ｃ：ペプチド組成物Ｂが２：１，１：１，１：２である（図６）。

図７に皮膚水分量、図８にＴＥＷＬの結果を示した。
いずれの混合物の投与でも皮膚水分量は、改善していた。ペプチド組成物Ｃに比べ、いずれの週でも皮膚水分量が高値を示していた。ＴＥＷＬについては、統計的な有意差は認められないが、ペプチド組成物Ｃ：ペプチド組成物Ｂが２：１の場合、低値を示していた。

図９にペプチド組成物を投与した紫外線照射ヘアレスマウスの背部皮膚の組織像を示した。紫外線暴露により基底膜上の表皮細胞の過剰増殖や死細胞が観察できる。これに対し、ペプチド組成物投与により、表皮細胞の重層が抑制されているように観察できる。

Claims (8)

1. コラーゲン原料を１種以上の微生物由来のエンドペプチダーゼを用いて分解後、更に１種以上の微生物由来のアミノペプチターゼを用いて分解する工程を含む、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ又はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで示されるペプチドを７０質量％以上含有し、分子量が６００以下のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
2. エンドペプチダーゼとしてバチルス属細菌由来のプロテアーゼを用い、アミノペプチターゼとしてアスペルギルス属真菌由来のプチターゼ及びストレプトマイセス属細菌由来のペプチダーゼを用いる請求項１記載の方法。
3. バチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼがバチルス・リケニフォルミス由来のアルカリプロテアーゼであり、アスペルギルス属真菌由来のペプチダーゼ及びストレプトマイセス属細菌由来のペプチダーゼがそれぞれアスペルギルス・オリゼー由来のペプチダーゼ及びストレプトマイセス・グリセウス由来のペプチダーゼである請求項２記載の方法。
4. エンドペプチダーゼをゼラチン抽出物１００質量部に対して０．５〜５質量部、アミノペプチターゼをゼラチン抽出物１００質量部に対して０．０５〜２質量部使用する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. コラーゲン原料が魚類の鱗である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 請求項１〜５のいずれか１項記載の方法により製造されるコラーゲンペプチド組成物であって、Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドを７０質量％以上含有し、分子量が６００以下のペプチド組成物。
7. 請求項１〜５のいずれか１項記載の方法により製造されるコラーゲンペプチド組成物を有効成分とする、皮膚バリア機能改善剤。
8. Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドを７０質量％以上含有し、分子量が６００以下のペプチド組成物と、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで示されるペプチドを７０質量％以上含有し、分子量が６００以下のペプチド組成物を組み合わせて用いる請求項７記載の皮膚バリア機能改善剤。

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