JP4090688B2 - マンナナーゼおよびプロテアーゼを含んだ洗剤組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の分野】
本発明は、マンナナーゼおよびプロテアーゼを含んだ洗剤組成物に関する。
【０００２】
【発明の背景】
洗剤製品の性能は、汚れを除去する能力、および洗浄で物体上への汚れまたは汚れの分解産物の再付着を防止する能力を含めた、いくつかのファクターにより判断される。したがって、洗剤組成物は、現在では、ある特別なニーズを満たす活性成分を複雑な組合せで含有している。特に、現行の洗剤処方物は、クリーニングおよび布帛ケア効果を発揮する洗剤酵素を通常含有している。
【０００３】
食物および化粧品のしみ／汚れは大部分の消費者関連しみ／汚れを代表しており、増粘剤／安定剤のような食品添加物もよく含んでいる。実際に、親水コロイドガムおよび乳化剤は常用されている食品添加物である。“ガム”という用語は工業的に有用な多糖類（長鎖ポリマー）またはそれらの誘導体のグループを表しており、熱または冷水中で水和して粘稠な溶液、分散液またはゲルを形成する。ガムは天然および改質品として分類される。天然ガムには、海草抽出物、植物滲出物、種子または根からのガム、および微生物発酵により得られるガムがある。改質（半合成）ガムには、セルロースおよびデンプン誘導体、およびある合成ガム、例えば低メトキシルペクチン、プロピレングリコールアルギネート、およびカルボキシメチルおよびヒドロプロピルグアーガムがある（Gums in Encyclopedia Chemical Technology 4^thEd.,Vol.12,pp.842-862,J.Baird,Kelco division of Merck ）。R.L.Whistler and J.N.BeMiller によるCarbohydrate Chemistry for Food Scientists (Eagan Press - 1997),Chap.4,pp.63-89 およびP.Laslo によるDirect Food Additives in Fruit Processing,Bioprinciples and Applications,Vol.1,Chapter II,pp.313-325(1996) Technomie publishing も参照。これらガムのうち一部、例えばグアーガム（Ｅ４１２）、ローカストビーン（イナゴマメ）（Ｅ４１０）は、多くの食品分野に単独でまたは組合せて広く用いられている（Gums in ECT 4^thEd.,Vol.12,pp.842-862,J.Baird,Kelco division of Merck）。
【０００４】
これらの食物および化粧品しみに用いられているグアーガムは、マメ科植物Cyamopsis tetragonoloba の種子内乳から得られる。双子葉植物種子から抽出されたグアーガム（グアランとも称される）は１‐４，ｂ‐Ｄ‐マンノピラノシル単位主鎖から構成されており、ドレッシングおよび冷凍製品および化粧品で増粘剤として用いられている（H.-D.Belitz,Food Chemistry,pp.243,English version of the second edition,Springer-verlag,1987,ISBN 0-387-15043-9 (US)）＆（Carbohydrate Chemistry for Food Scientists,R.L.Wilstler,eagan press,1997,ISBN 0-913250-92-9 ）＆（Industrial Gum,second editions,R.L.Whistler,pp.308,Academic Press,1973,ISBN 0-12-74-6252-x）。イナゴマメガム（キャロブ・ビーン(carob bean)ガムまたはSt Jon's breadとも称される）も食品産業で用いられており、地中海地方で栽培されている常緑植物の種子から抽出される。イナゴマメガムはそれより少数のＤ‐ガラクトシル側鎖ということのみでグアーガムの構造とはおそらく異なっており、同様の１‐４，ｂ‐Ｄ‐マンノピラノシル主鎖を有している。マメ科植物種子では、水溶性ガラクトマンナンが主要な貯蔵炭水化物であって、一部の場合には全乾燥重量の２０％以内を占めている。ガラクトマンナンはマンノース残基のＯ‐６にα‐ガラクトースを連結させており、それはマンノース残基のＯ‐２およびＯ‐３で様々な程度にアセチル化させることもできる。
【０００５】
プロテアーゼ酵素は、食器、硬質表面からタンパク質食物残渣の除去を行えるか、またはタンパク質汚れおよび洗濯適用で典型的にみられる他の汚れでクリーニング性能を発揮することが、洗剤組成物でずっと認められてきた。
【０００６】
しかしながら、特に再三の洗浄／着用により衣類で典型的にみられる表面上のしみに対して、優れたクリーニング性能を発揮する、洗剤組成物を処方する必要性が継続している。この目的は、マンナナーゼおよびプロテアーゼを含んだ洗剤組成物を処方することにより満たされた。
【０００７】
これらの酵素組成物は、特に再三の洗浄／着用により衣類で典型的にみられる表面上のしみに対して、混合酵素系の相乗効果のおかげで優れたクリーニング、即ち優れたしみ抜き性を発揮することが、意外にもわかった。
【０００８】
本発明の洗剤組成物の性能は、選択された界面活性剤、ビルダーおよび／またはブリーチ系の追加により高められることが、更にわかった。
【０００９】
マンナナーゼはいくつかのBacillus生物で同定された。例えば、Talbot et al.,Appl.Environ.Microbiol.,vol.56,No.11,pp.3505-3510 (1990)は、１６２ｋＤ ａのＭＷおよび５．５〜７．５の至適ｐＨを有したダイマー形をとる、Bacillus stearothermophilus 由来のβ‐マンナナーゼについて記載している。Mendoza et al.,World J.Microbiol.Biotech.,Vol.10,No.5,pp.551-555 (1994) は、３８ｋＤａのＭＷ、ｐＨ５．０／５５℃で至適活性および４．８のｐｌを有したBacillus subtilisis 由来のβ‐マンナナーゼについて記載している。Ｊ０３０４７０６は、ゲルロ過により測定すると３７＋／−３ｋＤａのＭＷ、８〜１０の至適ｐＨおよび５．３〜５．４のｐｌを有したBacillus sp.由来のβ‐マンナナーゼについて開示している。Ｊ６３０５６２８９はアルカリ性で熱安定性なβ‐マンナナーゼの産生について記載しており、これは例えばマンナンのβ‐１，４‐Ｄ‐マンノピラノシド結合を加水分解して、マンノオリゴ糖を産生する。Ｊ６３０３６７７４は、アルカリ性ｐＨでβ‐マンナナーゼおよびβ‐マンノシダーゼを産生するBacillus微生物ＦＥＲＭ Ｐ‐８８５６に関する。Bacillus amyloliquefaciensからの精製マンナナーゼと、パルプおよび紙の漂白に有用なその調製方法は、ＷＯ９７／１１１６４で開示されている。ＷＯ９１／１８９７４は、極度のｐＨおよび温度で活性なグルカナーゼ、キシラナーゼまたはマンナナーゼのようなヘミセルラーゼ、およびその産生法について記載している。ＷＯ９４／２５５７６は、Aspergillus aculeatus ＣＢＳ１０１．４３由来のマンナナーゼ活性を示す酵素について記載しており、これは植物または藻類細胞壁物質の分解または改質が望まれる様々な目的で用いられる。ＷＯ９３／２４６２２はリグノセルロースパルプを漂白するための、Trichoderma reesieから単離されたマンナナーゼについて開示している。
【００１０】
しかしながら、洗剤組成物で優れたクリーニング性能向けの、マンナナーゼおよびプロテアーゼの相乗的組合せは、以前に認識されていなかった。
【００１１】
【発明の要旨】
本発明は、優れたクリーニング性能を発揮する、マンナナーゼおよびプロテアーゼを含んでなる洗剤組成物に関する。
【００１２】
【発明の具体的な説明】
本発明の洗剤組成物の必須要素はマンナナーゼ酵素である。マンナナーゼは、食品添加物として用いられるグアーガムのような親水コロイドガムを含有したしみに対して、有意のしみ抜き効果を発揮する。本発明の第二の必須要素はプロテアーゼ酵素である。プロテアーゼはタンパク質性の汚れを除去することが知られている。
【００１３】
理論に拘束されることなく、カカオ食品しみ、チョコプディングしみおよび／または化粧品しみのようなタンパク質含有しみは、親水コロイドガムのような添加物も含有することがあると考えられている。これらの親水コロイドガムは、例えばグアーガムまたはイナゴマメガムである。このようなしみが存在するとき、プロテアーゼの使用は有意のクリーニング性能効果を十分に発揮させる上で効率的でないことがわかった。同様に、マンナナーゼの単独使用も有意の性能効果を発揮させる上で十分でない。実際に、食品組成物中におけるタンパク質および親水コロイドガム双方のミックスは非常に粘稠であって、酵素作用をうけにくいと考えられている。
【００１４】
特に、洗濯洗剤分野において、しみの付着がピローケース、キッチンタオルおよびＴシャツのような使用品で生じることは周知である。このようなしみは、皮膚からの付着性タンパク質物質の存在、並びにしみを付けた布帛表面上に存在する親水コロイドガム、ヘミセルロースおよび誘導物質の存在のせいで、除去することが難しいと考えられている。これらの親水コロイドガム、ヘミセルロースおよび誘導物質は、布帛またはしみから生じることもある。タンパク質および親水コロイドガム双方のミックスは非常に粘稠であって、布帛上に付着するため、酵素作用をうけにくいと考えられている。
【００１５】
マンナナーゼと、プロテアーゼ、特にズブチリシン洗濯プロテアーゼとの組合せは、有意なクリーニング性能効果を発揮することが、意外にもわかった。
加えて、マンナナーゼ酵素とプロテアーゼ酵素との併用は、食器およびいずれか他のキッチン硬質表面のような硬質表面上で、特に食物および化粧品しみに対して、優れたクリーニングを行える。
【００１６】
更に、コットン布帛はセルロース繊維内にマンノース部分を含むことがあると知られている。これらのマンノース部分はコットン布帛に体汚れのような他のしみを付けることがある。マンナナーゼおよびプロテアーゼ酵素の併用は、これらの体汚れに対しても、特に低温で有意のクリーニング性を発揮することが、意外にもわかった。
【００１７】
マンナナーゼ酵素
本発明の洗剤組成物の必須要素はマンナナーゼ酵素である。
下記３種のマンナン分解酵素が本発明に包含される：ＥＣ3.2.1.25：β‐マンノシダーゼ、ＥＣ3.2.1.78：エンド‐１，４‐β‐マンノシダーゼ（以下“マンナナーゼ”と称される）およびＥＣ3.2.1.100 ：１，４‐β‐マンノビオシダーゼ（ＩＵＰＡＣ Classification - Enzyme nomenclature,1992,ISBN 0-12-227165-3,Academic Press）。
【００１８】
更に好ましくは、本発明の洗剤組成物は、マンナナーゼと称されるβ‐１，４‐マンノシダーゼ（ＥＣ3.2.1.78）を含んでいる。“マンナナーゼ”および“ガラクトマンナナーゼ”という用語は、公にはマンナン エンド‐１，４‐β‐マンノシダーゼと称され、β‐マンナナーゼおよびエンド‐１，４‐マンナナーゼという別称を有して、次の反応：マンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナンおよびガラクトグルコマンナンにおける１，４‐β‐Ｄ‐マンノシド結合のランダム加水分解を触媒するとして当業界に従い定義された、マンナナーゼ酵素を表している。
【００１９】
特に、マンナナーゼ（ＥＣ3.2.1.78）はマンナンを分解するポリサッカラーゼのグループを構成しており、マンノース単位を有したポリオース鎖を開裂しうる、即ちマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナンおよびガラクトグルコマンナンのグルコシド結合を開裂しうる酵素を表している。マンナンはβ‐１，４‐結合マンノースから構成される主鎖を有した多糖であり、グルコマンナンは主鎖または多少規則的に交互にβ‐１，４‐結合マンノースおよびグルコースを有した多糖であり、ガラクトマンナンおよびガラクトグルコマンナンはα‐１，６‐結合ガラクトース側鎖を有したマンナンおよびグルコマンナンである。これらの化合物はアセチル化してもよい。
【００２０】
ガラクトマンナンおよびガラクトグルコマンナンの分解はガラクトース側鎖の全体的または部分的な除去により促進される。更に、アセチル化されたマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナンおよびガラクトグルコマンナンの分解は、全体的または部分的な脱アセチル化により促進される。アセチル基はアルカリまたはマンナンアセチルエステラーゼにより除去できる。マンナナーゼから、あるいはマンナナーゼとα‐ガラクトシダーゼおよび／またはマンナンアセチルエステラーゼとの組合せにより放出されたオリゴマーは、β‐マンノシダーゼおよび／またはβ‐グルコシダーゼにより遊離マルトースを放出させるために、更に分解させることができる。
【００２１】
マンナナーゼがいくつかのBacillus生物で同定された。例えば、Talbot et al.,Appl.Environ.Microbiol.,Vol.56,No.11,pp.3505-3510 (1990)は、１６２ｋＤ ａの分子量および５．５〜７．５の至適ｐＨを有したダイマー形で、Bacillus stearothermophilus 由来のβ‐マンナナーゼについて記載している。Mendoza et al.,World J.Microbiol.Biotech.,Vol.10,No.5,pp.551-555 (1994) は、３８ｋＤａの分子量、ｐＨ５．０および５５℃で至適活性、および４．８のｐｌを有した、Bacillus subtilis 由来のβ‐マンナナーゼについて記載している。ＪＰ‐０３０４７０６は、ゲルロ過により測定すると３７３ｋＤａの分子量、８〜１０の至適ｐＨおよび５．３〜５．４のｐｌを有した、Bacillus sp.由来のβ‐マンナナーゼについて開示している。ＪＰ‐６３０５６２８９はアルカリ性で熱安定性なβ‐マンナナーゼの産生について記載しており、これは例えばマンナンのβ‐１，４‐Ｄ‐マンノピラノシド結合を加水分解して、マンノオリゴ糖を産生する。ＪＰ‐６３０３６７７４は、アルカリ性ｐＨでβ‐マンナナーゼおよびβ‐マンノシダーゼを産生するBacillus微生物ＦＥＲＭ Ｐ‐８８５６に関する。ＪＰ‐０８０５１９７５は、好アルカリ性Bacillus sp.ＡＭ‐００１からのアルカリ性β‐マンナナーゼについて開示している。パルプおよび紙の漂白に有用なBacillus amyloliquefaciensからの精製マンナナーゼ、およびその調製方法は、ＷＯ９７／１１１６４で開示されている。ＷＯ９１／１８９７４は、極度のｐＨおよび温度で活性なグルカナーゼ、キシラナーゼまたはマンナナーゼのようなヘミセルラーゼについて記載している。ＷＯ９４／２５５７６は、マンナナーゼ活性を示す、Aspergillus aculeatus ＣＢＳ１０１．４３由来の酵素について開示しており、これは植物または藻類細胞壁物質の分解または改質に有用なことがある。ＷＯ９３／２４６２２は、リグノセルロースパルプを漂白するために有用な、Trichoderma reseeiから単離されたマンナナーゼについて開示している。マンナン含有ヘミセルロースを分解しうるヘミセルラーゼはＷＯ９１／１８９７４で記載されており、Bacillus amyloliquefaciensからの精製マンナナーゼはＷＯ９７／１１１６４で記載されている。
【００２２】
詳しくは、このマンナナーゼ酵素は下記のようなアルカリ性マンナナーゼ、最も好ましくは細菌源に由来したマンナナーゼである。特に、本発明の洗剤組成物は、Bacillus agaradherens および／またはBacillus subtilisis 株１６８、遺伝子ｙｇｈｔ由来のマンナナーゼから選択されるアルカリ性マンナナーゼを含んでいる。
“アルカリ性マンナナーゼ酵素”という用語は、７〜１２、好ましくは７．５〜１０．５の所定ｐＨで、その最大活性の少くとも１０％、好ましくは少くとも２５％、更に好ましくは少くとも４０％の酵素活性を有する酵素を含めた意味である。
【００２３】
最も好ましくは、本発明の洗剤組成物はBacillus agaradherens 由来のアルカリ性マンナナーゼを含んでいる。そのマンナナーゼは
ｉ）Bacillus agaradherens ＮＣＩＭＢ４０４８２により産生されるポリペプチド
ii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の３２‐３４３位で示されたようなアミノ酸配列を含んだポリペプチド、または
iii)上記ポリペプチドと少くとも７０％相同的であるか、あるいは１つまたはいくつかのアミノ酸の置換、欠失または付加により上記ポリペプチドから誘導されたか、あるいは精製形で上記ポリペプチドに対するポリクローナル抗体と免疫反応性である、ｉ）またはii）で規定されたポリペプチドのアナログである。
【００２４】
本発明は
（ａ）マンナナーゼ活性を有して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド９７‐ヌクレオチド１０２９で示されたようなヌクレオチドの配列を含んだポリペプチドについてコードしているポリヌクレオチド分子；
（ｂ）（ａ）の種ホモログ；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２でアミノ酸残基３２‐アミノ酸残基３４３のアミノ酸配列と少くとも７０％同一である、マンナナーゼ活性を有したポリペプチドについてコードしているポリヌクレオチド分子；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）と相補的な分子；および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の縮重ヌクレオチド配列
からなる群より選択される、マンナナーゼ活性を有した単離ポリペプチドにも関する。
【００２５】
本発明のマンナナーゼについてコードするポリヌクレオチド分子（ＤＮＡ配列）を含んだプラスミドｐＳＪ１６７８はEscherichia coliの株中に組み込まれて、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Web 1b,D-38124 Braunschweig,Federal Republic of Germany に、特許出願のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、１９９８年５月１８日付で寄託番号ＤＳＭ１２１８０として本発明者らにより寄託された。
【００２６】
第二の最も好ましい酵素はBacillus subtilisis 株１６８由来のマンナナーゼであり、そのマンナナーゼは
ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されたＤＮＡ配列のコード部分またはその配列のアナログによりコードされている、および／または
ii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されたようなアミノ酸配列を含んだポリペプチド、または
iii)上記ポリペプチドと少くとも７０％相同的であるか、１つまたはいくつかのアミノ酸の置換、欠失または付加により上記ポリペプチドから誘導されたか、あるいは精製形で上記ポリペプチドに対するポリクローナル抗体と免疫反応性である、ii）で規定されたポリペプチドのアナログである。
【００２７】
本発明は
（ａ）マンナナーゼ活性を有して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されたようなヌクレオチドの配列を含んだポリペプチドについてコードしているポリヌクレオチド分子；
（ｂ）（ａ）の種ホモログ；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列と少くとも７０％同一である、マンナナーゼ活性を有したポリペプチドについてコードしているポリヌクレオチド分子；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）と相補的な分子；および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の縮重ヌクレオチド配列
からなる群より選択される、マンナナーゼ活性を有した単離ポリペプチドにも関する。
【００２８】
定義
更に詳しく本発明を説明する前に、下記の用語が最初に定義される：
“オルトログ”(ortholog)（または“種ホモログ”）という用語は、異なる種の類似ポリペプチドまたはタンパク質と相同性を有した、ある種から得られるポリペプチドまたはタンパク質を示している。
“パラログ”(paralog) という用語は、同種の別なポリペプチドまたはタンパク質と相同性を有した、所定の種から得られるポリペプチドまたはタンパク質を示している。
【００２９】
“発現ベクター”という用語は、その転写に関与する追加セグメントと作動可能に連結された、目的のポリペプチドについてコードするセグメントを含んだ、線状または環状のＤＮＡ分子を示している。このような追加セグメントにはプロモーターおよびターミネーター配列があり、１以上の複製起点、１以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを場合により含むこともある。発現ベクターはプラスミドまたはウイルスＤＮＡから通常誘導されるか、あるいは双方の要素を含んでいてもよい。本発明の発現ベクターは組換えＤＮＡ操作にうまく付せるいかなる発現ベクターであってもよく、ベクターの選択はそのベクターが導入される宿主細胞によく依存する。そのため、ベクターは自律複製ベクター、即ち余分な染色体部分として存在するベクター（その複製は染色体複製と独立している）、即ちプラスミドであってもよい。一方、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに宿主細胞ゲノム中に組み込まれて、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
ポリペプチドまたはタンパク質の発現に関連して本明細書で用いられる“組換え発現された”または“組換えで発現された”という用語は、当業界の標準定義に従い定義される。タンパク質の組換え発現は、すぐ上で記載されたように発現ベクターを用いることにより通常行われる。
【００３０】
“単離された”という用語は、ポリヌクレオチド分子にあてはめたときには、そのポリヌクレオチドがその自然遺伝子環境から取り出されて、他の外来または望んでいないコード配列を含まずに、遺伝子工学処理されたタンパク質産生系内での使用に適した形をとっていることを示している。このような単離分子はそれらの自然環境から離されたものであり、ｃＤＮＡおよびゲノムクローンがある。本発明の単離ＤＮＡ分子はそれらが通常伴う他の遺伝子を含んでいないが、プロモーターおよびターミネーターのような天然５′および３′非翻訳領域を含んでいてもよい。随伴領域として何があるかは当業者に明らかであろう（例えば、Dynan and Tijan,Nature,316,774-78,1985参照）。
【００３１】
“単離ポリヌクレオチド”という用語は、“クローン化ポリヌクレオチド”と別称することもある。タンパク質／ポリペプチドにあてはめたときには、“単離された”という用語は、そのタンパク質がその自然環境以外の状況下でみられることを示している。好ましい形態において、単離されたタンパク質は他のタンパク質、特に他の相同的タンパク質（即ち、“相同的不純物”（下記参照））を実質的に含んでいない。４０％以上の純粋形、更に好ましくは６０％以上の純粋形でタンパク質を供することが好ましい。更に一層好ましくは、高度に純粋な形で、即ちＳＤＳ‐ＰＡＧＥで調べると、純度８０％以上、更に好ましくは純度９５％以上、更に一層好ましくは純度９９％以上でタンパク質を供することが好ましい。
“単離タンパク質／ポリペプチド”という用語は、“精製タンパク質／ポリペプチド”と別称することもある。
“相同的不純物”という用語は、本発明のポリペプチドが元々得られた相同的細胞に由来した不純物（例えば、本発明のポリペプチド以外のポリペプチド）を意味している。
【００３２】
特定の微生物源に関連して本明細書で用いられている“から得られた”という用語は、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドが特定の供給源によりまたはその供給源の遺伝子が挿入された細胞により産生されていることを意味している。
“作動可能に連結された”という用語は、ＤＮＡセグメントに関するとき、そのセグメントが意図した目的に沿い機能するように配列され、例えば転写がプロモーターで始まり、コードセグメントからターミネーターへと進むことを示している。
【００３３】
“ポリヌクレオチド”という用語は、５′から３′末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを示している。ポリヌクレオチドにはＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然源から単離されるか、インビトロで合成されるか、または天然および合成分子の組合せから作製される。
“ポリヌクレオチド分子の相補体”という用語は、対照配列と比較して相補的な塩基配列および逆の配向を有したポリヌクレオチド分子を示している。例えば、配列５′ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３′は５′ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３′と相補性である。
“縮重ヌクレオチド配列”という用語は、（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチド分子と比較して）１以上の縮重コドンを含んだヌクレオチドの配列を示している。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを有していながら、同様のアミノ酸残基をコードしている（即ち、ＧＡＵおよびＧＡＣトリプレットは各々Ａｓｐをコードしている）。
【００３４】
“プロモーター”という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始に関与するＤＮＡ配列を有した遺伝子の部分を示している。プロモーター配列は、通常、但し必ずではないが、遺伝子の５′非コード領域でみられる。
“分泌シグナル配列”という用語は、もっと大きなポリペプチドの要素として、それが合成される細胞の分泌経路を介して、その大きなポリペプチドを指図するポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を示している。大きなペプチドは、分泌経路を経た移行中に分泌ペプチドを取除くように通常開裂される。
【００３５】
他の関連配列を得るために本発明の配列を用いる方法
本発明のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチド配列に関して本明細書で開示された配列情報は、他の相同的なマンナナーゼを同定するための手段として用いることができる。例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、様々な微生物源の、特に異なるBacillus種の他の相同的なマンナナーゼをコードする配列を増幅させるために用いることができる。
【００３６】
活性試験用のアッセイ
マンナナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、当業界で知られる標準試験操作に従い、例えば０．２％ＡＺＣＬガラクトマンナン（キャロブ）、即ち３グラム当たりＵＳ＄１１０．００でMegazyme社からCat No.1-AZGMAとして市販されているエンド‐１，４‐β‐Ｄ‐マンナナーゼのアッセイ向け基質（Megazyme's Internet address: http://www.megazyme.com/Purchase/index.html）を含有した、寒天プレートに設けられた４ｍｍ径ホールに、試験すべき溶液を入れて、マンナナーゼ活性について試験される。
【００３７】
ポリヌクレオチド
本発明の単離ポリヌクレオチドは、少くとも中度の厳密な条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１またはそれと相補的な配列の類似サイズ領域とハイブリッド形成する。
特に、本発明のポリヌクレオチドは、少くとも中度の厳密な条件下で、但し好ましくは以下で詳細に記載されたような高度に厳密な条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の９７‐１０２９位で示された全配列を含んだ変性二本鎖ＤＮＡプローブ、または少くとも約１００塩基対の長さを有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のサブ配列を含んだプローブとハイブリッド形成する。ヌクレオチドプローブと相同的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列との中度または高度の厳密な条件下におけるハイブリッド形成を調べるために適した実験条件は、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Sambrook et al.,1989）中で１０分間にわたる、ハイブリッド形成させるＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡを含有したフィルターの前浸漬、５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液（Sambrook et al.,1989）、０．５％ＳＤＳおよび変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ１００μg/ml（Sambrook et al.,1989）の溶液中におけるフィルターのプレハイブリッド形成、その後濃度１０ng/ml のランダムプライム化（Feinberg,A.P.and Vogelstein,B.(1983) Anal.Biochem.132:6-13）、³²Ｐ‐ｄＣＴＰ標識（１×１０９cpm/μｇ以上の比活性）プローブを含有した同溶液中約４５℃で１２時間にわたるハイブリッド形成からなる。次いで、そのフィルターは、少くとも６０℃（中度の厳密さ）、更に好ましくは少くとも６５℃（中度／高度の厳密さ）、更に一層好ましくは少くとも７０℃（高度の厳密さ）更になお一層好ましくは少くとも７５℃（非常に高度の厳密さ）において、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間にわたり２回洗浄する。
オリゴヌクレオチドプローブがこれらの条件下でハイブリッド形成する分子は、ｘ線フィルムを用いて検出される。
【００３８】
前記のように、本発明の単離ポリヌクレオチドにはＤＮＡおよびＲＮＡがある。ＤＮＡおよびＲＮＡを単離するための方法は当業界で周知である。目的の遺伝子をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、当業界で公知の方法により、Gene Bank またはＤＮＡライブラリーでクローニングすることができる。
次いで、本発明のマンナナーゼ活性を有したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばハイブリッド形成またはＰＣＲにより同定および単離される。
本発明は、異なる細菌株からの対応ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（オルトログまたはパラログ）も更に提供する。Bacillus種を含めたグラム陽性の好アルカリ性株からのマンナナーゼポリペプチドが特に関心をもたれる。
【００３９】
本発明のマンナナーゼ活性を有したポリペプチドの種ホモログは、慣用的なクローニング技術と共に、本発明により提供される情報および組成物を用いて、クローニングすることができる。例えば、本発明のＤＮＡ配列は、そのタンパク質を発現する細胞タイプから得られた染色体ＤＮＡを用いてクローニングしうる。適切なＤＮＡ源は、本明細書で開示された配列からデザインされるプローブでノーザンブロットをプローブすることにより同定できる。次いで、ライブラリーが陽性細胞系の染色体ＤＮＡから作製される。次いで、マンナナーゼ活性を有したポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡ配列は、様々な方法により、例えば、本明細書および請求の範囲で開示された配列からデザインされるプローブ、または開示された配列に基づく１組以上の縮重プローブとのプロービングにより単離することができる。本発明のＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ鎖反応またはＰＣＲ （Mullis、ＵＳ特許４，６８３，２０２）を用い、本明細書で開示された配列からデザインされたプライマーを利用してクローニングしてもよい。追加の方法として、ＤＮＡライブラリーが宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用でき、目的のＤＮＡの発現は、B.agaradherens,NCIMB 40482からクローニングされ、物質および方法の箇所と例１とで記載されたように発現および精製されたマンナナーゼに対する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）で、またはマンナナーゼ活性を有したポリペプチドに関する活性試験により検出することができる。
【００４０】
Escherichia coli ＤＳＭ１２１８０に存在するプラスミドｐＳＪ１６７８中にクローニングされたＤＮＡ配列および／または本発明のアナログＤＮＡ配列のマンナナーゼコード部分は、マンナン分解活性を有する酵素を産生する細菌種Bacillus agaradherens の株、好ましくはＮＣＩＭＢ ４０４８２株、または本明細書で記載されたような他のもしくは関連生物からクローニングしてもよい。
一方、類似配列は Escherichia coli ＤＳＭ１２１８０（添付されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と同一であると考えられる）中に存在するプラスミドから得られるＤＮＡ配列、例えばそのサブ配列に基づき、および／または、ＤＮＡ配列によりコードされたマンナナーゼの他のアミノ酸配列を生じないが、酵素の産生向け宿主生物のコドン使用に相当するヌクレオチド置換の導入により、または異なるアミノ酸配列（即ち、本発明のマンナン分解酵素の変種）を生じるヌクレオチド置換の導入により構築してもよい。
【００４１】
ポリペプチド
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸Ｎｏ．３２‐３４３の配列は成熟マンナナーゼ配列である。
本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドと実質上相同的なマンナナーゼポリペプチドおよびその種ホモログ（パラログまたはオルトログ）も提供する。“実質上相同的な”という用語は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸Ｎｏ．３２‐３４３で示された配列と７０％、好ましくは少くとも８０％、更に好ましくは少くとも８５％、更に一層好ましくは少くとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらのオルトログまたはパラログを表すために、ここでは用いられている。このようなポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸Ｎｏ．３２‐３４３で示された配列またはそのオルトログもしくはパラログと、更に好ましくは少くとも９５％、最も好ましくは９８％以上同一である。配列同一性％は、参考のためその全体で本明細書に組み込まれる、Needleman,S.B. and Wunsch,C.D.(1970),Journal of Molecular Biology,48,443-453で開示されたように、ＧＣＧプログラムパッケージで供給されるＧＡＰのような当業界で知られるコンピュータープログラム（Program Manual for the Wisconsin Pachage,Version 8,August 1994,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711）により常法で調べられる。ＧＡＰはポリペプチド配列比較のために下記設定：３．０のＧＡＰクリエーション・ペナルティ(creation penalty)および０．１のＧＡＰエクステンション・ペナルティ(extension penalty) で用いる。
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、ＤＮＡ配列比較のために下記設定：５．０のＧＡＰクリエーション・ペナルティおよび０．３のＧＡＰエクステンション・ペナルティでＧＡＰを用いて、同様の方法により調べられる。
【００４２】
本発明の酵素調製は、微生物から、好ましくは細菌、古細菌（archea）または真菌から、特にBacillus、好ましくは、Bacillus agaradherens 種、およびすべての種が整列１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づきBacillus agaradherens と好ましくは少くとも９５％、更に一層好ましくは少くとも９８％相同的である高度に関連したBacillus種からなる群より選択される好アルカリ性Bacillus株に属する細菌のような細菌から行うことが好ましい。
実質上相同的なタンパク質およびポリペプチドは、１以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有するとして特徴づけられる。これらの変化は性質上小さなものであることが好ましく、即ちタンパク質またはポリペプチドの折りたたみまたは活性に有意な影響を与えない保存的なアミノ酸置換（表２参照）および他の置換；典型的には１〜約３０アミノ酸の小さな欠失；アミノ末端メチオニン残基、約２０〜２５残基以内の小さなリンカーペプチドのような小さなアミノ‐またはカルボキシル‐末端伸長、またはポリヒスチジン部分、プロテインＡのような精製（親和性標識）を促す小さな伸長である（Nilsson et al.,EMBO J.,4:1075,1985；Nilsson et al.,Methods Enzymol.,198:3,1991；一般的にFord et al.,Protein Expression and Purification 2:95-107,1991 参照；参考のため本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡコード親和性標識は市販業者（例えば、Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ ；New England Biolabs,Beverly,MA）から入手できる。
しかしながら、上記変化は性質上小さなものであることがたとえ好ましいといっても、このような変化は、本発明のマンナナーゼポリペプチドへの、アミノ‐またはカルボキシル‐末端双方の伸長として３００アミノ酸以内またはそれ以上の大きなポリペプチドの融合のように、性質上大きなものであってもよい。
【００４３】

【００４４】
２０種の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸（例えば４‐ヒドロキシプロリン、６‐Ｎ‐メチルリジン、２‐アミノイソ酪酸、イソバリンおよびα‐メチルセリン）も本発明によるポリペプチドのアミノ酸残基の代わりに用いてよい。限定数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、および非天然アミノ酸もアミノ酸残基の代わりに用いてよい。“非天然アミノ酸”は、タンパク質合成後に修飾されたか、および／または標準アミノ酸の場合とは異なる化学構造を側鎖に有している。非天然アミノ酸は化学合成されるか、または好ましくは市販されており、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３‐および４‐メチルプロリン、および３，３‐ジメチルプロリンがある。
【００４５】
本発明のマンナナーゼポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（Cunningham and Wells,Science,244:1081-1085,1989 ）のような、当業界で知られる操作に従い同定することができる。後者の技術では、単一のアラニン変異が分子のあらゆる残基で導入され、得られた変異分子は分子の活性にとり重要なアミノ酸残基を同定するために生物学的活性（即ち、マンナナーゼ活性）について試験される。Hilton et al.,J.Biol.Chem.,271:4699-4708,1996 も参照。酵素の活性部位または他の生物学 的相互作用も、推定の接触部位アミノ酸の変異と共に、核磁気共鳴、結晶学的手法、電子回折または光親和性標識のような技術でわかるような構造の物理的分析により調べることができる。例えば、de Vos et al,Science,255:306-312,1992 ；Smith et al.,J.Mol.Biol.,224:899-904,1992 ；Wlodaver et al.,FEBS Lett.,309:59-64,1992 参照。必須アミノ酸の同定は、本発明によるポリペプチドと関連したポリペプチドとの相同性の分析から推論することもできる。
【００４６】
多数のアミノ酸置換は、Reidhaar-Olson and Sauer (Science,241:53-57,1988)、Bowie and Sauer (Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:2152-2156,1989)、ＷＯ９５／１７４１３またはＷＯ９５／２２６２５により開示されたような、突然変異誘発、組換えおよび／または再編成(shuffling) 、その後関連スクリーニング操作の公知方法を用いて、実施および試験することができる。簡単に言えば、これらの著者らは、ポリペプチドで２以上の位置を同時にランダム化するか、または異なる変異の組換え／再編成（ＷＯ９５／１７４１３、ＷＯ９５／２２６２５）を行い、その後で機能性ポリペプチドについて選択し、次いで変異したポリペプチドを配列決定して、各位置で許容しうる置換の範囲を調べる方法について開示している。使える他の方法には、ファージディスプレー（例えば、Lowman et al.,Biochem.30:10832-10837,1991 ；LadnerらのＵＳ特許第５，２２３，４０９号；Huse, ＷＩＰＯ公開ＷＯ９２／０６２０４）および領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al.,Gene,46:145,1986；Ner et al.,DNA,7:127,1988 ）がある。
【００４７】
上記のような突然変異誘発／再編成方法は、宿主細胞でクローン化された突然変異ポリペプチドの活性を検出するために、高処理量自動スクリーニング方法と組み合わせることができる。活性ポリペプチドについてコードする突然変異したＤＮＡ分子は宿主細胞から回収して、現行装置を用いて迅速に配列決定しうる。これらの方法は目的のポリペプチドで個別アミノ酸残基の重要度の迅速な決定を行え、未知構造のポリペプチドに適用することもできる。
上記方法を用いて、当業者は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基３２‐３４３と実質的に相同的であって、野生型タンパク質のマンナナーゼ活性を留めた、様々なポリペプチドを同定および／または作製することができる。
【００４８】
タンパク質産生
全鎖長タンパク質、その断片および融合タンパク質を含めた本発明のタンパク質およびポリペプチドは、慣用的な技術に従い遺伝子工学処理宿主細胞で産生させることができる。適切な宿主細胞は、外来ＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトさせて、培養で増殖させうる細胞タイプであって、細菌、真菌細胞および培養されたそれより高等の真核細胞がある。細菌細胞、特にグラム陽性生物の培養細胞が好ましい。例えばBacillus subtilis 、Bacillus lentus 、Bacillus brevis 、Bacillus stearothermophilus 、Bacillus alkalophilus 、Bacillus amyloliquefacience 、Bacillus coagulans、Bacillus circulans、Bacillus lautus 、Bacillus thuringiensis、Bacillus licheniformisおよびBacillus agaradherens 、特にBacillus agaradherens からなる群のBacillus属のグラム陽性細胞が特に好ましい。
【００４９】
クローン化ＤＮＡ分子を操作して、外来ＤＮＡを様々な宿主細胞中に導入するための技術は、Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989 ；Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,NY,1987；"Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria",Sonensheim et al.,1993,American Society for Microbiology,Washington D.C.で開示されており、これらは参考のため本明細書に組み込まれる。
一般的に、本発明のマンナナーゼについてコードするＤＮＡ配列は、発現ベクター内における転写プロモーターおよびターミネーターを通常含めて、その発現に必要な他の遺伝要素と、作動可能に連結されている。ベクターは１以上の選択マーカーおよび１以上の複製起点も通常含んでいるが、当業者は、ある系では、選択マーカーが別なベクターで供されて、外来ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノム中への組込みにより行われることもわかるであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクターおよび他の要素の選択は、当業者のレベル内における通常のデザインの問題である。多くのこのような要素は文献で記載されており、市販元から入手することができる。
【００５０】
宿主細胞の分泌経路にポリペプチドを向かわせるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）が発現ベクターに形成される。分泌シグナル配列はそのポリペプチドのものでもよく、あるいは他の分泌タンパク質から誘導したり、またはデノボ合成してもよい。多数の適切な分泌シグナル配列が当業界で知られており、適切な分泌シグナル配列、特にBacillus宿主細胞での分泌に関する詳しい記載については、"Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria",Sonensheim et al.,1993,American Society for Microbiology,Washington D.C. およびCutting,S.M.(eds.)"Molecular Biological Methods for Bacillus",John Wiley and Sons,1990が参考にされる。分泌シグナル配列は正しい読み枠でＤＮＡ配列に結合される。分泌シグナル配列は目的のポリペプチドについてコードするＤＮＡ配列の５′側に通常位置するが、あるシグナル配列は目的のＤＮＡ配列で他の箇所に位置してもよい（例えば、Welch et al., ＵＳ特許第５，０３７，７４３号；Holland らのＵＳ特許第５，１４３，８３０号参照）。
【００５１】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖に必要な栄養素および他の成分を含有した培地で、慣用的な操作に従い培養される。規定培地および複合培地を含めた様々な適切な培地が当業界で知られており、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを通常含有している。培地は、必要であれば、成長因子または血清のような成分も含有してよい。増殖培地は、例えば、薬物選択または必須栄養素の欠乏により、外部から加えられたＤＮＡを含有する細胞について通常選択するが、これは発現ベクター上におかれた選択マーカーにより補われるか、または宿主細胞中にコトランスフェクトされる。
【００５２】
タンパク質単離
発現された組換えポリペプチドが分泌されたとき、そのポリペプチドは増殖培地から精製してもよい。好ましくは、発現宿主細胞はポリペプチドの精製前に培地から（例えば遠心により）除去される。
発現された組換えポリペプチドが宿主細胞から分泌されないとき、宿主細胞は好ましくは壊されて、ポリペプチドが水性“抽出物”中に放出されるが、これはこのような精製技術の第一段階である。好ましくは、発現宿主細胞は（例えば遠心により）細胞破壊前に培地から集められる。
細胞破壊は、慣用的な技術により、例えばリゾチーム消化よるか、または細胞を高圧に曝すことにより行える。このような細胞破壊技術の詳しい記載については（Robert K.Scobes,Protein Purification,Second edition,Springer-Verlag）参照。
【００５３】
発現された組換えポリペプチド（またはキメラポリペプチド）が分泌されても、またはそうでなくても、それは分別および／または慣用的な精製法および培地を用いて精製することができる。
硫酸アンモニウム沈降および酸またはカオトロープ(chaotrope)抽出は、サンプルの分別に用いてもよい。例示の精製ステップには、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣおよび逆相高性能液体クロマトグラフィーがある。適切な陰イオン交換媒体には、誘導デキストリン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカなどがある。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥおよびＱ誘導体が好ましく、ＤＥＡＥ Fast-Flow Sepharose (Pharmacia,Piscataway,NJ)が特に好ましい。例示のクロマトグラフィー媒体には、フェニル、ブチルまたはオクチル基で誘導された媒体、例えばPhenyl-Sepharose FF (Pharmacia)、Toyopearl butyl 650 (Toso Haas,Montgomeryville,PA)、Octyl-Sepharose (Pharmacia)など；またはポリアクリル樹脂、例えばAmberchrom CG 71 (Toso Haas)などがある。適切な固体支持体には、ガラスビーズ、シリカベース樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂などがあり、これらはそれらが用いられる条件下で不溶性である。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基および／または炭水化物部分によりタンパク質の結合を行える反応基で修飾してもよい。カップリング化学の例には、臭化シアン活性化、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジン活性化と、カルボジイミドカップリング化学向けにカルボキシルおよびアミノ誘導体とがある。これらと他の固体媒体は周知であって、当業界で広く用いられており、市販元から入手できる。
具体的な方法の選択は通常のデザインの問題であり、選択された支持体の性質により部分的には決められる。例えば、Affinity Chromatography: Principles & Methods,Pharmacia LKB Biotechnology,Uppsala,Sweden,1988 参照。
【００５４】
本発明のポリペプチドまたはその断片は化学合成で作製してもよい。本発明のポリペプチドは、モノマーまたはマルチマーでも、グルコシル化または非グルコシル化、ペギル化(pegylated) または非ペギル化されていてもよく、開始のメチオニンアミノ酸残基を含んでいても、またはそうでなくてもよい。
【００５５】
本明細書で開示された配列情報に基づくと、本発明のマンナナーゼをコードして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されたＤＮＡ配列、少くとも９７位〜１０２９位のＤＮＡ配列を含んだ全鎖長ＤＮＡ配列がクローニングされる。
クローニングは、下記のような当業界で知られる標準操作により行われる：
■Bacillus株、特に株B.agaradherens,NCIMB 40482からゲノムライブラリーを調製し；
■このようなライブラリーを適切な基質プレート上におき；
■ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に基づくプローブを用いた標準ハイブリッド形成技術により、本発明のポリヌクレオチド配列を含むクローンを同定するか、または
■ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１からの配列情報に基づくプライマーを用いた逆ＰＣＲ戦法により、上記Bacillus agaradherens,NCIMB 40482 ゲノムライブラリーからクローンを同定する。逆ＰＣＲに関する詳細については、M.J.McPherson et al.("PCR A practical approach" Information Press Ltd,Oxford England) が参考にされる。
【００５６】
本明細書で開示された配列情報（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に基づくと、関連微生物からのゲノムライブラリー、特にBacillusの好アルカリ性種のようなBacillus属の他の株からのゲノムライブラリーを用いた類似戦法により、本発明の相同的マンナナーゼをコードする相同的ポリヌクレオチド配列を単離することが、当業者にとって通常の作業である。
一方、本発明のマンナンまたはガラクトマンナン分解酵素をコードするＤＮＡは、 Escherichia coli ＤＳＭ１２１８０に存在するプラスミドから得られるＤＮＡ配列に基づき作製された合成オリゴヌクレオチドプローブの使用により、適切な供給源、例えば上記生物のいずれからもうまくクローニングされる。
【００５７】
したがって、本発明のポリヌクレオチド分子は Escherichia coli ＤＳＭ１２１８０から単離してもよく、上記のようなクローニングにより得られるプラスミドは寄託されている。しかも、本発明は株 Escherichia coli ＤＳＭ１２１８０の単離された実質的に純粋な生物学的培養物にも関する。
本関係において、“酵素調製物”という用語は、単一種の微生物からおそらく単離および精製される慣用的な酵素発酵産物（このような調製物はいくつかの異なる酵素活性を通常含んでいる）；単成分酵素、好ましくは慣用的な組換え技術を用いて細菌または真菌種から誘導される酵素（その酵素は発酵させてから、おそらく別々に単離および精製されており、異なる種、好ましくは真菌または細菌種に由来している）の混合物；組換えマンナナーゼの発現向け宿主細胞として働く微生物の発酵産物（但し、その微生物は、微生物の天然発酵産物である他の酵素、例えばペクチン分解酵素、プロテアーゼまたはセルラーゼを同時に産生する）、即ち対応する天然微生物により通常産生される酵素複合体を意味している。
【００５８】
本発明の酵素調製物を産生する方法では、マンナナーゼをその酵素の産生を行える条件下で産生しうる微生物、例えば野生型株を培養して、培養物からその酵素を回収する。培養は慣用的な発酵技術を用いて行われ、例えば、マンナナーゼ酵素の産生を誘導する増殖培地で十分な通気を確保するために撹拌しながらシェイクフラスコまたは醗酵槽で培養する。増殖培地は、ペプトン、酵母エキスまたはカザミノ酸のような慣用的なＮ源、デキストロースまたはスクロースのような少量の慣用的なＣ源、およびグアーガムまたはイナゴマメガムのような誘導物質を含有していてもよい。回収は慣用的な技術、例えば遠心またはロ過によるバイオマスおよび上澄の分離、上澄の回収、または目的の酵素が細胞内にあるならば細胞の破壊、おそらくその後でＥＰ０４０６３１４で記載されたような精製またはＷＯ９７／１５６６０で記載されたような結晶化を用いて行える。
【００５９】
免疫交差反応性
免疫交差反応性を調べる上で用いられるポリクローナル抗体は、精製されたマンナナーゼ酵素の使用により作製してもよい。更に詳しくは、本発明のマンナナーゼに対する抗血清は、N.Axelsen et al.in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,Blackwell Scientific Publications,1973,Chapter 23またはA.Johnstone and R.Thorpe,Immunochemistry in Practice,Blackwell Scientific Publications,1982 （更に詳しくは p.27-31）で記載された操作に従いウサギ（または他の齧歯類）を免疫することで作製される。精製免疫グロブリンは、例えば塩沈降（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、その後透析および例えばＤＥＡＥ‐Sephadexでのイオン交換クロマトグラフィーにより、抗血清から得られる。タンパク質の免疫化学的な特徴づけは、オクタロニー二重拡散分析（O.Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D.M.Weir,Ed.),Blackwell Scientific Publications,1967,pp.655-706）、交差免疫電気泳動 (N.Axelsen et al., 前掲,Chapters 3 and 4)またはロケット免疫電気泳動（N.Axelsen et al.,Chapter 2）により行える。
【００６０】
本発明の酵素または酵素調製物を産生する有用な細菌の例は、好ましくはBacillus/Lactobacillus細分類からのグラム陽性菌、好ましくはBacillus属からの株、更に好ましくはBacillus agaradherens の株、特に株Bacillus agaradherens,NCIMB 40482 である。
本発明には、上記された性質を有して、相同的な不純物を含まずに、慣用的な組換え技術を用いて産生される、単離マンナナーゼを含んでいる。
【００６１】
マンナナーゼの触媒活性（ＭａｎＵ）の測定
比色アッセイ：基質：ｐＨ１０．０の０．１Ｍグリシン緩衝液中におけるキャロブからの０．２％ＡＺＣＬ‐ガラクトマンナン（Megazyme,Australia）。アッセイは、撹拌しながら、４０℃の温度コントロール下において、サーモミキサー上１．５ｍｌEppendorf ミクロ管で行われる。酵素０．０５ｍｌと共に２０分間にわたる基質０．７５０ｍｌのインキュベートを、１５０００ｒｐｍで４分間の遠心により停止させる。上澄の色を１ｃｍキュベット中６００ｎｍで測定する。１ＭａｎＵ（マンナナーゼ単位）は１ｃｍで０．２４ａｂｓを示す。
【００６２】
Bacillus agaradherens マンナナーゼ NCIMB 40482 の獲得株
Bacillus agaradherens NCIMB 40482 はマンナナーゼ酵素コードＤＮＡ配列を含んでいる。
E.coli株： E.coli ＳＪ２の細胞（Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.R.,Sjoholm,C.(1990),Bacillus brevis からの細胞外酵素、α‐アセ ト乳酸デカルボキシラーゼをコードするａｌｄＢのクローニング,J.Bacteriol.,172,4315-4321 ）を用意して、供給業者により記載されているように、BIO-RAD のGene Pulser ^TMエレクトロポレーター(electroporator)を用いて、エレクトロポレーション(electroporation) により形質転換させた。
B.subtilis ＰＬ２３０６：この株は、既知のBacillus subtilis セルラーゼ遺伝子の転写単位において壊された破壊ａｐｒおよびｎｐｒ遺伝子を有する B.subtilis ＤＮ１８８５（Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.R.,Sjoholm,C.(1990),Bacillus brevis からの細胞外酵素、α‐アセト乳酸デカル ボキシラーゼをコードするａｌｄＢのクローニング,J.Bacteriol.,172,4315-4321 ）であって、セルラーゼ陰性細胞になっている。破壊は本質的には（Eds.A.L.Sonenshein,J.A.Hoch and Richard Losick (1993),Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria,American Society for microbiology,p.618）で記載されたように行った。
コンピテント細胞を用意して、Yasbin,R.E.,Wilson,G.A.and Young,F.E.(1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells,J.Bacteriol.,121,296-304 で記載されたように形質転換した。
【００６３】
プラスミド
ｐＳＪ１６７８（参考のためその全体で本明細書に組み込まれるＷＯ９４／１９４５４で詳細に記載されている）
ｐＭＯＬ９４４：このプラスミドは、Bacillus subtilis でプラスミドを増殖させうる要素、カナマイシン耐性遺伝子を本質的に含んで、B.licheniformis ＡＴＣＣ１４５８０のａｍｙＬ遺伝子からクローニングされた強いプロモーターおよびシグナルペプチドを有したｐＵＢ１１０誘導体である。シグナルペプチドは、そのシグナルペプチドと融合させて、タンパク質の成熟部分をコードするＤＮＡをクローニングさせる上で、それを便利にさせるＳａｃII部位を含んでいる。これは、細胞の外側に向かうプレタンパク質の発現につながる。
プラスミドは、以下で簡単に記載された慣用的な遺伝子工学技術により構築された。
【００６４】
ｐＭＯＬ９４４の構築
ｐＵＢ１１０プラスミド（McKenzie,T,et al.,1986,Plasmid,15:93-103）を独特な制限酵素Ｎｃｉｌで切断した。プラスミドｐＤＮ１９８１（P.L.Jorgensen et al.,1990,Gene,96,p.37-41 ）でコードされたａｍｙＬプロモーターから増幅されたＰＣＲ断片をＮｃｉｌで切断し、Ｎｃｉｌ切断ｐＵＢ１１０に挿入して、プラスミドｐＳＪ２６２４を得た。
【００６５】
用いられた２つのＰＣＲプライマーは下記配列を有している：
＃ＬＷＮ５４９４ ５′‐ＧＴＣＧＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣ‐３′
＃ＬＷＮ５４９５ ５′‐ＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴ‐３′
【００６６】
プライマー＃ＬＷＮ５４９４はＮｏｔＩ部位をプラスミドに挿入する。
次いで、プラスミドｐＳＪ２６２４をＳａｃＩおよびＮｏｔＩで切断し、ｐＤＮ１９８１でコードされたａｍｙＬプロモーターで増幅された新しいＰＣＲ断片をＳａｃＩおよびＮｏｔＩで切断し、このＤＮＡ断片をＳａｃＩ‐ＮｏｔＩ切断ｐＳＪ２６２４に挿入して、プラスミドｐＳＪ２６７０を得た。
【００６７】
このクローニングは、同様のプロモーターと、但し反対方向で、最初のａｍｙＬプロモータークローニングに置き換わる。ＰＣＲ増幅に用いられる２種のプライマーは下記配列を有している：
＃ＬＷＮ５９３８ ５′‐ＧＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴ‐３′
＃ＬＷＮ５９３９ ５′‐ＧＴＣＧＧＡＧＣＴＣＴＡＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣ‐３′
【００６８】
プラスミドｐＳＪ２６７０を制限酵素ＰｓｔＩおよびＢｃｌＩで切断し、（参考のためその全体で本明細書に組み込まれる、ＷＯ９５／２６３９７として公開された国際特許出願で開示されている）アルカリ性アミラーゼＳＰ７２２をコードするクローン化ＤＮＡ配列から増幅されたＰＣＲ断片をＰｓｔＩおよびＢｃｌＩで切断し、挿入して、プラスミドｐＭＯＬ９４４を得た。ＰＣＲ増幅に用いられる２種のプライマーは下記配列を有している：
＃ＬＷＮ７８６４ ５′‐ＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣＡＣＧＡＣＴＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣ‐３′
＃ＬＷＮ７９０１ ５′‐ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡＴＧＧＧＡＣＡＡＡＴＧＧＧ‐３′
プライマー＃ＬＷＮ７９０１はＳａｃII部位をプラスミドに挿入する。
【００６９】
Bacillus agaradherens からのマンナナーゼ遺伝子のクローニング
ゲノムＤＮＡ調製：
株Bacillus agaradherens NCIMB 40482 をＷＯ９４／０１５３２で記載されたように液体培地で増殖させた。３０℃、３００ｒｐｍで１６時間のインキュベート後に細胞を集め、ゲノムＤＮＡをPitcher et al.(Pitcher,D.G.,Saunders,N.A.,Owen,R.J.(1989),チオシアン酸グアニジウムによる細菌ゲノムＤＮＡの迅速な 抽出,Lett.Appl.Microbiol.,8,151-156)で記載された方法により単離した。
【００７０】
ゲノムライブラリー構築：
ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に切断し、０．７％アガロースゲルで電気泳動によりサイズ分別した。大きさ２および７ｋｂの断片をＤＥＡＥ‐セルロース紙上で電気泳動により単離した（Dretzen,G.,Bellard,M.,Sassone-Corsi,P.,Chambon,P.(1981),アガロースおよびアクリルアミドゲルからのＤＮＡ断片の回収のために信頼しうる方法,Anal.Biochem.,112,295-298）。
単離されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ切断ｐＳＪ１６７８プラスミドＤＮＡに連結させ、連結混合物を用いて、 E.coli ＳＪ２を形質転換させた。
【００７１】
陽性クローンの同定：
上記のように構築されたE.coliのＤＮＡライブラリーを、０．２％ＡＺＣＬ‐ガラクトマンナン（Magazyme）および９μg/mlクロラムフェニコールを含有したＬＢ寒天プレート上でスクリーニングし、３７℃で一夜インキュベートした。マンナナーゼ活性を表すクローンは、青色拡散ハローとして出現した。これらクローンの１つからのプラスミドＤＮＡを一夜培養ブロス（２５０ｒｐｍで振盪しながら、９μg/mlクロラムフェニコール含有ＴＹ中３７℃でインキュベートされた細胞）１ｍｌでQiagenプラスミドスピンプレプ(spin preps)により単離した。
このクローン（ＭＢ５２５）をクローン化Ｓａｕ３Ａ ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列決定で更に特徴づけた。ＤＮＡ配列決定は、Ｔａｑデオキシ末端サイクル配列決定キット（Perkin-Elmer,USA）、蛍光標識ターミネーターおよびプライマーとして適切なオリゴヌクレオチドを用いて、プライマーウォーキング(primerwalking) により行った。
配列データの分析はDevereux et al.(1984) Nucleic Acids Res.,12,387-395 に従い行った。マンナナーゼをコードする配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されている。誘導されたタンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されている。
【００７２】
B.subtilis におけるマンナナーゼのサブクローニングおよび発現：
本発明のマンナナーゼコードＤＮＡ配列を、下記２種のオリゴヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅させた：
マンナナーゼ．上．ＳａｃII
５′‐ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＧＧＣ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＴＴ ＧＡＴ ＧＧ‐３′
マンナナーゼ．下．ＮｏｔＩ
５′‐ＧＡＣ ＧＡＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＧ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＡＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＴＴ ＴＴＣ Ｇ‐３′
制限部位ＳａｃIIおよびＮｏｔIIは下線部分である。
【００７３】
前記されたようなB.agaradherens NCIMB 40482から単離された染色体ＤＮＡを、製造業者の指示に従い Amplitaq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）を用いて、ＰＣＲ反応で鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位の AmpliTaq ポリメラーゼ（Perkin Elmer,Cetus,USA）および１００pmolの各プライマーを含有したＰＣＲ緩衝液（ｐＨ８．３の１０ｍＭ Tris-ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％(w/v) ゼラチン）中で始めた。
ＰＣＲ反応はＤＮＡサーマル・サイクラー（Landgraf,Germany）を用いて行った。９４℃で１分間のインキュベート１回、その後９４℃で３０秒間にわたる変性のサイクルプロフィールを用いて行われるＰＣＲサイクル３０回、６０℃で１分間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長。増幅産物の一部５μＬを０．７％アガロースゲル（NuSieve,ＦＭＣ）で電気泳動により分析した。大きさ１．４ｋｂのＤＮＡ断片の出現は、遺伝子セグメントの適正な増幅を示していた。
【００７４】
ＰＣＲ断片のサブクローニング
前記のように得られたＰＣＲ産物の一部４５μＬを、製造業者の指示に従い、 QlAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen,USA）を用いて精製した。精製ＤＮＡをｐＨ８．５の１０ｍＭ Tris-ＨＣｌ ５０μＬで溶離させた。
ｐＭＯＬ９４４ ５μｇおよび精製ＰＣＲ断片２５μＬをＳａｃIIおよびＮｏｔＩで切断し、０．８％低ゲル化温度アガロース（SeaPlaque GTG,ＦＭＣ）ゲルで電気泳動し、関連断片をゲルから切出して、製造業者の指示に従い QlAquick ゲル抽出キット（Quigen,USA）を用いて精製した。次いで、単離されたＰＣＲ ＤＮＡ断片を、ＳａｃII‐ＮｏｔＩ切断および精製されたｐＭＯＬ９４４に連結させた。連結は、０．５μｇの各ＤＮＡ断片、１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼおよびＴ４リガーゼ緩衝液(Boehringer Mannheim,Germany) を用いて、１６℃で一夜かけて行った。
連結混合物を用いて、コンピテント B.subtilis ＰＬ２３０６を形質転換させた。形質転換細胞をＬＢＰＧ‐１０μg/mlカナマイシンプレート上においた。３７℃で１８時間のインキュベート後に、コロニーがプレート上でみられた。いくつかのクローンを、一夜培養ブロスからプラスミドＤＮＡを単離することにより分析した。
１つのこのような陽性クローンを上記のように寒天プレート上に数回にわたり再度線状に塗り、このクローンをＭＢ５９４と命名した。クローンＭＢ５９４を３７℃でＴＹ‐１０μg/mlカナマイシン中において一夜増殖させ、翌日に細胞１ｍｌを用いて、 B.subtilis プラスミド調製について製造業者の勧めに従い、Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106でその細胞からプラスミドを単離した。このＤＮＡはＤＮＡ配列決定してみると、マンナナーゼの成熟部分に相当するＤＮＡ配列、即ち添付ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の９４‐１４０４位を示した。求められた成熟タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列によりコードされるマンナナーゼの３′末端が、ＰＣＲで用いられた下方プライマーのデザインのために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されたものに変わったことは、明らかであろう。得られたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されており、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＣ末端（ＳＨＨＶＲＥＩＧＶＱＦＳＡＡＤＮＳＳＧＱＴＡＬＹＶＤＮＶＴＬＲ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＣ末端（ＩＩＭＬＧＫ）に変わることが明らかである。
【００７５】
培地：
ＴＹ（Ausubel,F.M.et al.(eds.),"Current protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,1995で記載されたとおり）
ＬＢ寒天（Ausubel,F.M.et al.(eds.),"Current protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,1995で記載されたとおり）
ＬＢＰＧは０．５％グルコースおよび０．０５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．０で補充されたＬＢ寒天（上記参照）である。
ＢＰＸ培地はＥＰ０５０６７８０（ＷＯ９１／０９１２９）で記載されている。
【００７６】
Bacillus agaradherens 由来マンナナーゼの発現、精製および特徴づけ
物質および方法の箇所で前記されたように得られたクローンＭＢ５９４を、３７℃、３００ｒｐｍで、２個の５００ｍｌバッフル付きシェイクフラスコ中において、カナマイシン１０μg/ml含有の２５×２００ｍｌ ＢＰＸ培地で増殖させた。
クローンＭＢ５９４（バッチ＃９８１３）のシェイクフラスコ培養液６５００ｍｌを集め、ｐＨを５．５に調整した。陽イオン剤（Ｃ５２１）１４６ｍｌおよび陰イオン剤（Ａ１３０）２９２ｍｌを凝集のため撹拌中に加えた。凝集物質は６℃で２０分間にわたり９０００ｒｐｍでSorval RC 3B遠心機を用いて遠心により分離させた。上澄をWhatman ガラスフィルターＧＦ／Ｄを用いて清澄化させ、最後にカットオフ１０ｋＤａのfiltron で遠心した。
この濃縮物７５０ｍｌは水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．５に調整した。透明な溶液を、ｐＨ７．５の５０mmol Ｔｒｉｓで平衡化された９００ｍｌ Ｑ‐Sepharose カラムを用いて、陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。マンナナーゼ活性を伴う画分は塩化ナトリウム勾配を用いて溶離させた。
純粋な酵素は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで分子量３８ｋＤａの単一バンドを示した。マンナナーゼ酵素のアミノ酸配列、即ち翻訳ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されている。
【００７７】
動力学定数の測定：
基質：イナゴマメガム（キャロブ）および還元糖分析（ＰＨＢＡＨ）、Sigma 製のイナゴマメガム（Ｇ‐０７５３）
異なる濃度のイナゴマメガムおよび４０℃、ｐＨ１０で２０分間にわたるインキュベートを用いた動力学的測定では、
Ｋｃａｔ：４６７／sec
Ｋｍ：０．０８ｇ／Ｌ
ＭＷ：３８ｋＤａ
ｐｌ（等電点）：４．２を示した。
マンナナーゼの至適温度は６０℃であることがわかった。ｐＨ活性プロフィールとして、ｐＨ８〜１０の最大活性を示した。ＤＳＣ示差走査熱量測定ではＴｒｉｓ緩衝液中ｐＨ７．５で融点として７７℃を示し、この酵素が非常に熱安定性であることを示した。
基質としてキャロブからの０．２％ＡＺＣＬ‐ガラクトマンナンおよび４０℃で前記のようなインキュベートを用いた洗剤適合性では、慣用的な液体洗剤と優れた適合性、および慣用的な粉末洗剤と良好な適合性を示している。
【００７８】
Bacillus subtilis マンナナーゼ１６８の獲得
Bacillus subtilis β‐マンナナーゼを下記のように特徴づけて精製した：Bacillus subtilis ゲノムを既知のBacillus種β‐マンナナーゼ遺伝子配列との相同性について調べた（Mendoza et al.,Biochemica et Biophysica Acta,1243:552-554,1995）。産物が不明のｙｄｈＴのコード領域は既知の Bacillus β‐マンナナーゼと５８％類似性を示した。下記のオリゴヌクレオチド：５′‐ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＡＴ ＡＣＴ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＣＴ ＧＴＧ‐３′および５′‐ＧＡＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＧＧ ＡＴＴ ＣＡＣ ＴＣＡ ＡＣＧ ＡＴＴ ＧＧＣ Ｇ‐３′をデザインして、推定β‐マンナナーゼの成熟部分についてコードする配列を増幅させた。Bacillus subtilis 株１Ａ９５からの全ゲノムＤＮＡを鋳型として用い、前記プライマーを用いてｙｄｈＴ成熟領域を増幅させた。ＰＣＲは、 AMPLITAQ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer,Applied Biosystems,Foster City,ＣＡ）入りの GENE-AMP ＰＣＲキットを用いて行う。９５℃で５分間にわたる最初の溶融期間に続いて、２５サイクルの下記プログラム：９５℃で１分間の溶融、５５℃で２分間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長を行った。最終サイクルの後に、反応は完全な伸長まで７２℃で１０分間維持した。ＰＣＲ産物は QlAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen,Chatsworth,ＣＡ）を用いて精製した。
【００７９】
Bacillus subtilis 株１Ａ９５から増幅されたｙｄｈＴ成熟領域を下記のように（既に記載された）発現ベクターｐＰＧ１５２４中に挿入した。増幅された１０２８ｂｐ断片をＭｆｅＩおよびＢａｍＨＩで切断した。発現ベクターｐＰＧ１５２７をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した。制限産物は QlAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen,Chatsworth,ＣＡ）を用いて精製した。２つの断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて（１３時間、１６℃で）連結させて、コンピテント E.coli 株ＤＨ５‐αを形質転換させるために用いた。アンピシリン耐性コロニーをＤＮＡ作製のために培養した。次いでＤＮＡを制限分析により特徴づけた。プラスミドｐＰＧ３２００はｙｄｈＴ遺伝子の成熟領域を含んでいる。次いでプラスミドｐＰＧ３２００を用いて、コンピテントBacillus subtilis 株ＰＧ６３２（Saunders et al.,1992）を形質転換させた。
【００８０】
７つのカナマイシン耐性Bacillus subtilis コロニーおよび１つのＰＧ６３２コントロールクローンを取出して、２５％マルトリン１ｍｌ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２１２０μＬおよび５０mg/ml カナマイシン２０μＬで補充された２０／２０／５培地（２０ｇ／Ｌトリプトン、２０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）２０ｍｌ中で増殖させた。クローンを、タンパク質の発現のために、２５０ｒｐｍおよび３７℃で振盪しながら、２５０ｍｌバッフル付きフラスコ中で一夜増殖させた。細胞を１４，０００ｒｐｍで１５分間にかけて沈降させた。各上澄１μＬを５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）９９μＬで希釈した。この希釈液１μＬを、製造業者の指示に従い、エンド‐１，４‐β‐マンナナーゼ Beta-Mannazyme Tabs（Megazyme,Ireland）を用いてアッセイした。吸光度はBeckman DU640 分光光度計において５９０ｎｍで読んだ。クローン７は１．６７の最大吸光度を示した。ＰＧ６３２コントロールは５９０ｎｍで吸光度を示さなかった。
【００８１】
上澄を１０〜２０％ Tris-グリシンゲル（Novex,San Diego,Ｃａ）でＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分析して、３８ｋＤａの予想タンパク質サイズを確認した。サンプルは次のように調製した。ｙｄｈＴクローン７の５００μＬサンプルおよびＰＧ６３２上澄を１００％トリクロロ酢酸(Sigma) ５５．５μＬで沈降させ、５％トリクロロ酢酸１００μＬで洗浄し、 Tris-グリシンＳＤＳサンプル緩衝液(Novex) ５０μＬに再懸濁して、５分間煮沸した。各サンプル１μＬを３０ｍＡで９０分間にわたりゲル上で電気泳動に付した。大きなバンドのタンパク質は、ｙｄｈＴクローン７の場合に、３８ｋＤａでランすることが観察された。
Bacillus subtilis ｙｄｈＴクローン７の１０Ｌ発酵をB.Braun Biostat C 醗酵槽で行った。発酵条件は次のとおりであった。細胞を２０／２０／５に似た富培地において３７℃で１８時間増殖させた。発酵ランの最後に細胞を除去し、接線フローロ過システムを用いて上澄を１Ｌに濃縮した。濃縮上澄中におけるβ‐マンナナーゼの最終収量は、３ｇ／Ｌであることがわかった。
【００８２】
発酵上澄からのβ‐マンナナーゼの精製は次のように行った：上澄５００ｍｌを１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。次いで、遠心された上澄を、 Spectrapor １２，０００〜１４，０００ｍｏｌ．ｗｔ．カットオフ膜（Spectrum）において、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）４Ｌで２回交換して、４℃で一夜透析した。透析された上澄を１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。２００ｍｌ Ｑ Sepharose fast flow(Pharmacia) 陰イオン交換カラムを２０℃で１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）１Ｌで平衡化し、上澄３００ｍｌをカラムにのせた。２１０ｍｌ（サンプルＡ）および１７５ｍｌ（サンプルＢ）の２つのフロースルー(flow through)フラクションを集めた。２つのフラクションを前記のようにアッセイし、但しサンプルは５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）１９９μＬで希釈したところ、それらは各々０．３８および０．５２の吸光度を示した。各サンプル２μＬを Tris-グリシンＳＤＳサンプル緩衝液(Novex，ＣＡ) ８μＬに加えて、５分間煮沸した。得られたサンプルを１０〜２０％ Tris-グリシンゲル（Novex,Ｃａ）において３０ｍＡで９０分間電気泳動に付した。３８ｋＤａに相当する主要バンドは各サンプルに存在しており、全タンパク質の９５％以上を占めていた。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce）を、標準として牛血清アルブミンを用いて、製造業者の指示に従い両サンプルで行った。サンプルＡおよびＢは各々１．３mg/ml および１．６mg/ml のβ‐マンナナーゼを含有していた。タンパク質の同定は、イオンスプレー質量スペクトル測定およびアミノ末端アミノ酸配列分析により行った。
【００８３】
精製されたβ‐マンナナーゼサンプルは、次のように酵素活性を特徴づけるために用いた。すべてのアッセイでは、はじめの方で記載されたように、エンド‐１，４‐β‐マンナナーゼ Beta-Mannazyme Tabs（Megazyme,Ireland）を用いた。ｐＨ範囲３．０〜９．０での活性は５０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液中で調べ、ｐＨ９．５での活性測定は５０ｍＭ ＣＡＰＳＯ(Sigma) 中で調べ、ｐＨ１０．０〜１１．０範囲では５０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液を用いた。Bacillus subtilis β‐マンナナーゼの至適ｐＨはｐＨ６．０〜６．５であることがわかった。温度活性プロフィールは５０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中で調べた。酵素は４０〜４５℃で至適活性を示した。Bacillus subtilis β‐マンナナーゼは１５℃未満および８０℃以上で有意な活性を留めていた。β‐１，４‐ガラクトマンナンに対する比活性は、製造業者の指示に従いエンド‐１，４‐β‐マンナナーゼ Beta-Mannazyme Tabs（Megazyme,Ireland）を用いると、１６０，０００μmol/min ・mg β‐マンナナーゼであることがわかった。Bacillus subtilis β‐マンナナーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６で示されている。
【００８４】
マンナナーゼは、組成物の好ましくは０．０００１〜２重量％、更に好ましくは０．０００５〜０．１％、最も好ましくは０．００１〜０．０２％の純粋酵素レベルで、本発明の組成物中に配合される。
【００８５】
本発明の酵素は、触媒ドメインを含んだ酵素コアに加えて、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）も含んでおり、その酵素のセルロース結合ドメインおよび酵素コア（触媒活性ドメイン）は作動可能に連結されている。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）はコードされた酵素の内在性部分として存在していても、または他の起源のＣＢＤが酵素中に導入されて、酵素ハイブリッドを形成していてもよい。この関係において、“セルロース結合ドメイン”という用語は、Peter Tomme et al."Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" in "Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates",John N.Saddler and Michael H.Penner (Eds.),ACS Symposium Series,No.618,1996で定義されたように理解される。この定義では１２０以上のセルロース結合ドメインを１０ファミリー（Ｉ〜Ｘ）に分類しており、ＣＢＤがセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼおよびキチナーゼのような様々な酵素でみられることを明らかにしている。ＣＢＤは非加水分解性多糖結合タンパク質として藻類、例えば紅藻Porphyra purpurea でもみられる；Tomme et al.前掲参照。しかしながら、ほとんどのＣＢＤはセルラーゼおよびキシラナーゼからであり、ＣＢＤはタンパク質のＮおよびＣ末端でみられるか、または内部にある。酵素ハイブリッドは当業界で知られており（例えば、ＷＯ９０／００６０９およびＥＯ９５／１６７８２参照）、マンナナーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列にリンカーでまたはそれなしで連結されたセルロース結合ドメインについてコードするＤＮＡの断片を少くとも含んだＤＮＡ構築物を宿主細胞中に組み込み、その宿主細胞を増殖させて、融合遺伝子を発現させることにより作製してもよい。酵素ハイブリッドは下記式により記載される：
ＣＢＤ‐ＭＲ‐Ｘ
上記式中ＣＢＤは少くともセルロース結合ドメインに相当するアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端領域である；ＭＲは中間領域（リンカー）であって、結合であるか、または好ましくは約２〜約１００炭素原子、更に好ましくは２〜４０炭素原子の短い連結基であるか、あるいは好ましくは約２〜約１００アミノ酸、更に好ましくは２〜４０アミノ酸である；Ｘは本発明の酵素のＮ末端およびＣ末端領域である。
【００８６】
上記酵素は、植物、動物、細菌、真菌および酵母起源のように、いかなる適切な起源であってもよい。起源は更に中温性でもまたは好極限性（好冷性、好栄養性、好熱性、好圧性、好アルカリ性、好酸性、好塩性など）でもよい。精製または非精製形のこれら酵素も用いてよい。現在では、本発明のクリーニング組成物で性能効力を最大にさせるため、タンパク質／遺伝子工学技術により野生型酵素を修飾することが慣例的である。例えば、変種はこのような組成物の常用成分に対する酵素の適合性が増すようにデザインされる。一方、酵素変種の至適ｐＨ、ブリーチまたはキラント安定性、触媒活性などが特定のクリーニング用途と合うように調整されるよう、変種をデザインしてもよい。
【００８７】
特に、ブリーチ安定性の面では酸化されやすいアミノ酸について、および界面活性剤適合性の面では表面電荷について、注意が払われるべきである。このような酵素の等電点は一部の荷電アミノ酸の置換により修正してもよく、例えば等電点の増加はアニオン性界面活性剤との適合性を改善する上で役立つ。酵素の安定性は、例えば追加の塩橋を形成させ、金属結合部位を補強してキラント安定性を増すことにより、更に高められる。
【００８８】
プロテアーゼ
本発明の洗剤組成物の第二必須要素はプロテアーゼ酵素である。
適切なプロテアーゼは、ＩＵＰＡＣ分類ＥＣ3.4.-.- からのプロテアーゼ、好ましくはＩＵＰＡＣ分類ＥＣ3.4.21.-からのエンド‐セリンプロテアーゼ、更に好ましくはＩＵＰＡＣ分類ＥＣ3.4.21.62 からのズブチリシンプロテアーゼである。これらのＥＣ3.4.21.62 はプロテアーゼは、B.subtilisおよびB.licheniformis の特定株から得られるズブチリシン（ズブチリシンＢＰＮおよびＢＰＮ′）である。１つの適切なプロテアーゼはBacillus株から得られ、８〜１２のｐＨ範囲で最大活性を有し、デンマークのNovo Industries A/S により開発されて、ESPERASE^R として販売されており、以下"Novo"と称される。この酵素および類似酵素の製法はNovoのＧＢ１，２４３，７８４で記載されている。他の適切なプロテアーゼには、NovoのALCALASE^R 、 DURAZYM^R およびSAVINASE^R 、並びにGist-Brocades のMAXATASE^R 、 MAXACAL^R 、 PROPERASE^R および MAXAPEM^R （タンパク質工学処理Maxacal ）がある。タンパク質分解酵素には、修飾細菌セリンプロテアーゼ、例えば１９８７年４月２８日付で出願された欧州特許出願第８７／３０３７６１．８号明細書（特に第１７、２４および９８頁）に記載されて、以下“プロテアーゼＢ”と称されるものと、以下“プロテアーゼＡ”と称される修飾細菌セリンタンパク質分解酵素に関する１９８６年１０月２９日付で公開されたVenegas の欧州特許出願第１９９，４０４号明細書に記載されたものがある。リジンが２７位でアルギニンから置き換わり、チロシンが１０４位でバリンから置き換わり、セリンが１２３位でアスパラギンから置き換わり、アラニンが２７４位でトレオニンから置き換わった、Bacillus由来のアルカリセリンプロテアーゼの変種である、以下“プロテアーゼＣ”と称されるプロテアーゼが適切である。プロテアーゼＣは、１９９１年５月１６日付で公開されたＷＯ９１／０６６３７に対応するＥＰ９０９１５９５８：４で記載されている。特にプロテアーゼＣの遺伝子修飾変種も本発明に含まれる。
【００８９】
“プロテアーゼＤ”と称される好ましいプロテアーゼは、天然でみられないアミノ酸配列を有したカルボニルヒドロラーゼ変種であり、ＷＯ９５／１０５９１、および１９９４年１０月１３日付で出願されたC.Ghosh らのＵＳＳＮ０８／３２２，６７７の“プロテアーゼ酵素を含有した漂白組成物”と題する特許出願で記載されたような、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンのナンバリングに従い、好ましくは＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４からなる群より選択されるものに相当する１以上のアミノ酸残基位置と組合せて、＋７６位に相当する位置において、上記カルボニルヒドロラーゼで複数のアミノ酸残基の代わりに異なるアミノ酸を用いることにより、前駆体カルボニルヒドロラーゼから誘導される。次の残基：＋３３、＋６２、＋６７、＋７６、＋１００、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２８、＋１２９、＋１３０、＋１３２、＋１３５、＋１５６、＋１５８、＋１６４、＋１６６、＋１６７、＋１７０、＋２０９、＋２１５、＋２１７、＋２１８および＋２２２のうち１以上と共に＋２１０位に相当する前駆体酵素上で置き換えられた複数のアミノ酸残基の置換により誘導されたアミノ酸配列を有する、ＷＯ９５／１０５９１で記載されたプロテアーゼのカルボニルヒドロラーゼ変種も適切であるが、ここでナンバリングされた位置はBacillus amyloliquefaciens由来の天然ズブチリシンまたは他のカルボニルヒドロラーゼもしくはズブチリシン、例えばBacillus lentus ズブチリシンの相当アミノ酸残基に対応している（１９９７年６月４日付で出願された同時係属特許出願ＵＳＳＮ６０／０４８，５５０）。
【００９０】
特許出願ＥＰ２５１４４６およびＷＯ９１／０６６３７で記載されたプロテアーゼ、ＷＯ９１／０２７９２で記載されたプロテアーゼＢＬＡＰ^R 、およびＷＯ９５／２３２２１で記載されたそれらの変種も、本発明に適している。NovoのＷＯ９３／１８１４０Ａで記載されたBacillus sp.NCIMB 40338 からの高ｐＨプロテアーゼも参照。プロテアーゼ、１種以上の他の酵素および可逆性プロテアーゼインヒビターを含有した酵素洗剤は、NovoのＷＯ９２／０３５２９Ａで記載されている。所望であれば、減少した吸着性および向上した加水分解性を有するプロテアーゼが、Procter & GambleのＷＯ９５／０７７９１で記載されたように入手できる。本発明に適した洗剤向けの組換えトリプシン様プロテアーゼは、NovoのＷＯ９４／２５５８３で記載されている。他の適切なプロテアーゼは、UnileverのＥＰ５１６２００で記載されている。
タンパク質分解酵素は、組成物の０．０００１〜２重量％、好ましくは０．００１〜０．２％、更に好ましくは０．００５〜０．１％の純粋酵素レベルで、本発明の洗剤組成物中に配合される。
【００９１】
洗剤成分
本発明の洗剤組成物は、少くとも１種の追加洗剤成分を含有していなければならない。これら追加成分の性質そのもの、およびその配合レベルは、組成物の物理的形態、およびそれが用いられるクリーニング操作の性質に依存する。
本発明の洗剤組成物は、好ましくは、選択された界面活性剤、他の酵素、ビルダーおよび／またはブリーチ系から選択される洗剤成分を更に含んでいる。
本発明による洗剤組成物には、液体、ペースト、ゲル、固形石鹸、錠剤、スプレー、フォーム、粉末または顆粒がある。顆粒組成物は“コンパクト”形態でもよく、液体組成物は“濃縮”形態でもよい。
【００９２】
好ましい態様において、本発明は、マンナナーゼおよびプロテアーゼを含んだ洗剤組成物に関する（例１〜１６）。第二の態様では、本発明は皿洗いまたは家庭洗剤組成物に関する（例１７〜２２）。
【００９３】
本発明の組成物は、例えば、手および機械皿洗い組成物、手および機械洗濯洗剤組成物、例えば洗濯添加組成物、および汚れた布帛の浸漬および／または前処理向けに適した組成物、すすぎ添加布帛柔軟剤組成物、および一般的な家庭内硬質表面クリーニング操作向けの組成物として処方される。
【００９４】
手皿洗い法で使用の組成物として処方されるとき、本発明の組成物は、好ましくは、界面活性剤と、好ましくは有機ポリマー化合物、起泡増強剤、II族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープおよび追加酵素から選択される他の洗剤化合物とを含有している。
洗濯機洗浄法で使用に適した組成物として処方されるとき、本発明の組成物は、好ましくは、界面活性剤およびビルダー化合物の双方と、好ましくは有機ポリマー化合物、漂白剤、追加酵素、起泡抑制剤、分散剤、ライムソープ分散剤、汚れ懸濁および再付着防止剤、および腐食抑制剤から選択される１種以上の洗剤成分とを更に含有している。洗濯組成物は追加洗剤成分として柔軟剤も含有することができる。マンナナーゼおよびプロテアーゼを含有したこのような組成物は、洗濯洗剤組成物として処方されたとき、布帛クリーニング、しみ抜きおよび白さ維持を発揮することができる。
本発明の組成物は、固形または液体形態で、洗剤添加製品としても使用できる。このような添加製品は慣用的な洗剤組成物の性能を補強または増強するためにあり、クリーニングプロセスのどの段階で加えてもよい。
【００９５】
必要であれば、本洗剤組成物の密度は、２０℃で測定された組成物で、４００〜１２００ｇ／Ｌ、好ましくは５００〜９５０ｇ／Ｌである。
本組成物の“コンパクト”形態は、密度、および組成面では無機フィラー塩の量で最もよく反映される；無機フィラー塩は粉末形態をとる洗剤組成物の慣用成分である；慣用的な洗剤組成物では、フィラー塩は実質量、典型的には全組成物の１７〜３５重量％で存在する。コンパクト組成物において、フィラー塩は全組成物の１５重量％を超えない、好ましくは組成物の１０％を超えない、最も好ましくは５％を超えない量で存在する。本組成物で意味されるような無機フィラー塩は、サルフェートおよびクロリドのアルカリおよびアルカリ土類金属塩から選択される。好ましいフィラー塩は硫酸ナトリウムである。
【００９６】
本発明による液体洗剤組成物は“濃縮形態”でもよく、このような場合に、本発明による液体洗剤組成物は慣用的な液体洗剤と比較して少量の水を含有している。典型的には、濃縮液体洗剤の水分は、好ましくは洗剤組成物の４０重量％未満、更に好ましくは３０％未満、最も好ましくは２０％未満である。
本発明で使用に適した洗剤化合物は、下記化合物からなる群より選択される。
【００９７】
界面活性剤系
本発明による洗剤組成物は、界面活性剤がノニオン性および／またはアニオン性および／またはカチオン性および／または両性および／または双極性および／または半極性界面活性剤から選択できる、界面活性剤系を通常含んでいる。好ましくは、本発明の洗剤組成物は、ノニオン性、アニオン性および／またはカチオン性界面活性剤を含む。
ノニオン性、アニオン性界面活性剤および／またはカチオン性界面活性剤を更に含んだ本発明の洗剤組成物は、優れたしみ抜き性を発揮することが、意外にもわかった。
理論に拘束されることなく、酵素加水分解は小さな粒子を生じさせて、粒状汚れに集中することが知られたノニオン性界面活性剤により容易に除去させやすくしていると考えられる。好ましいノニオン性界面活性剤はアルキルエトキシレートＡＥ３〜ＡＥ７である。布帛直接性のカチオン性界面活性剤と混合酵素の酵素加水分解との組合せも、改善された性能を発揮していると考えられる。
界面活性剤は、典型的には０．１〜６０重量％のレベルで存在する。更に好ましい配合レベルは、本発明による洗剤組成物の１〜３５重量％、最も好ましくは１〜３０重量％である。
界面活性剤は、好ましくは、組成物中に存在する酵素成分と適合するように処方される。液体またはゲル組成物では、界面活性剤は、最も好ましくは、これらの組成物中において酵素の安定性を促進するか、または少くともそれを分解しないように処方される。
【００９８】
ノニオン性界面活性剤
アルキルフェノールのポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリブチレンオキシド縮合物は本発明の界面活性剤系のノニオン性界面活性剤として使用に適しており、ポリエチレンオキシド縮合物が好ましい。これらの化合物には、直鎖または分岐鎖配置で炭素原子約６〜約１４、好ましくは炭素原子約８〜約１４のアルキル基を有するアルキルフェノールと、アルキレンオキシドとの縮合産物がある。好ましい態様において、エチレンオキシドは、アルキルフェノール１モル当たり約２〜約２５モル、更に好ましくは約３〜約１５モルのエチレンオキシドに相当する量で存在する。このタイプの市販ノニオン性界面活性剤には、ＧＡＦ Corporationから販売されているIgepal^TMＣＯ‐６３０、すべてRohm & Haas Company から販売されているTriton^TMＸ‐４５、Ｘ‐１１４、Ｘ‐１００およびＸ‐１０２がある。これらの界面活性剤はアルキルフェノールアルコキシレート（例えば、アルキルフェノールエトキシレート）と通常称される。
【００９９】
一級および二級脂肪族アルコールと約１〜約２５モルのエチレンオキシドとの縮合産物が、本発明のノニオン性界面活性剤系のノニオン性界面活性剤として使用に適している。脂肪族アルコールのアルキル鎖は直鎖または分岐、一級または二級であり、通常約８〜約２２の炭素原子を有している。炭素原子約８〜約２０、更に好ましくは炭素原子約１０〜約１８のアルキル基を有するアルコールと、アルコール１モル当たり約２〜約１０モルのエチレンオキシドとの縮合産物が好ましい。アルコール１モル当たり約２〜約７モルのエチレンオキシド、最も好ましくは２〜５モルのエチレンオキシドが上記の縮合産物中に存在する。このタイプの市販ノニオン性界面活性剤の例には、双方ともUnion Carbide Corporation から販売されているTergitol^TM15-S-9（Ｃ₁₁‐Ｃ₁₅直鎖アルコールとエチレンオキシド９モルとの縮合産物）、Tergitol^TM24-L-6 NMW（Ｃ₁₂‐Ｃ₁₄一級アルコールとエチレンオキシド６モルとの、狭い分子量分布の縮合産物）；Shell Chemical Companyから販売されているNeodol^TM45-9（Ｃ₁₄‐Ｃ₁₅直鎖アルコールとエチレンオキシド９モルとの縮合産物）、Neodol^TM23-3（Ｃ₁₂‐Ｃ₁₃直鎖アルコールとエチレンオキシド３．０モルとの縮合産物）、Neodol^TM45-7（Ｃ₁₄‐Ｃ₁₅直鎖アルコールとエチレンオキシド７モルとの縮合産物）、Neodol^TM45-5（Ｃ₁₄‐Ｃ₁₅直鎖アルコールとエチレンオキシド５モルとの縮合産物）；The Procter & Gamble Companyから販売されているKyro^TMＥＯＢ（Ｃ₁₃‐Ｃ₁₅アルコールとエチレンオキシド９モルとの縮合産物）；Hoechst から販売されているGenapol LA O3OまたはO50 （Ｃ₁₂‐Ｃ₁₄アルコールとエチレンオキシド３または５モルとの縮合産物）がある。これらの産物におけるＨＬＢの好ましい範囲は８〜１１、最も好ましくは８〜１０である。
【０１００】
本発明の界面活性剤系のノニオン性界面活性剤として、約６〜約３０の炭素原子、好ましくは約１０〜約１６の炭素原子をもつ疎水基と、約１．３〜約１０、好ましくは約１．３〜約３、最も好ましくは約１．３〜約２．７の糖単位をもつ多糖、例えばポリグリコシドの親水基とを有する、１９８６年１月２１日付で発行されたLlenado のＵＳ特許第４，５６５，６４７号明細書で開示されたアルキル多糖も有用である。５または６つの炭素原子を有する還元糖も使用でき、例えばグルコース、ガラクトースおよびガラクトシル部分がグルコシル部分の代わりに使用できる（場合により、疎水基が２、３、４位などに結合されて、グルコシドまたはガラクトシドの代わりにグルコースまたはガラクトースを与える）。例えば、追加糖単位の１つの位置と先の糖単位の２、３、４および／または６位との間に、糖間結合が存在していてもよい。
【０１０１】
好ましいアルキルポリグリコシドは下記式を有している：
Ｒ^２Ｏ（Ｃ_ｎＨ_2nＯ）_ｔ（グリコシル）_ｘ
上記式中Ｒ^２はアルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニルおよびそれらの混合物からなる群より選択される（アルキル基は約１０〜約１８、好ましくは約１２〜約１４の炭素原子を有する）；ｎは２または３、好ましくは２である；ｔは０〜約１０、好ましくは０である；ｘは約１．３〜約１０、好ましくは約１．３〜約３、最も好ましくは約１．３〜約２．７である。グリコシルは、好ましくはグルコースから誘導される。これらの化合物を製造するためには、アルコールまたはアルキルポリエトキシアルコールを最初に形成させ、その後グルコースまたはグルコース源と反応させてグルコシド（１位に結合）を形成させる。追加グリコシル単位も、それらの１位と先のグリコシル単位の２、３、４および／または６位、好ましくは主に２位との間で結合させてよい。
【０１０２】
プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成された疎水性ベースとエチレンオキシドとの縮合産物も、本発明の追加ノニオン性界面活性剤系として使用に適している。これら化合物の疎水性部分は好ましくは約１５００〜約１８００の分子量を有し、非水溶性を示す。この疎水性部分へのポリオキシエチレン部分の付加は全体的に分子の水溶性を増す傾向があり、産物の液性はポリオキシエチレン含有率が縮合産物の全重量の約５０％のところまでに留められるが、これは約４０モル以内のエチレンオキシドとの縮合に相当する。このタイプの化合物の例には、ＢＡＳＦから販売されている、ある種の市販Plurafac^TMLF404 およびPluronic^TM界面活性剤がある。
【０１０３】
本発明のノニオン性界面活性剤系のノニオン性界面活性剤として、プロピレンオキシドとエチレンジアミンとの反応から得られる産物と、エチレンオキシドとの縮合産物も、使用に適している。これら産物の疎水性部分はエチレンジアミンおよび過剰プロピレンオキシドの反応産物からなり、通常約２５００〜約３０００の分子量を有する。この疎水性部分は、縮合産物が約４０〜約８０重量％のポリオキシエチレンを含んで、約５０００〜約１１，０００の分子量を有する程度まで、エチレンオキシドと縮合される。このタイプのノニオン性界面活性剤の例には、ＢＡＳＦから販売されている、ある種の市販Tetronic^TM化合物がある。
【０１０４】
本発明の界面活性剤系のノニオン性界面活性剤として、アルキルフェノールのポリエチレンオキシド縮合物、一級および二級脂肪族アルコールと約１〜約２５モルのエチレンオキシドとの縮合産物、アルキル多糖、およびそれらの混合物が、使用上好ましい。３〜１５のエトキシ基を有するＣ_８‐Ｃ₁₄アルキルフェノールエトキシレート、２〜１０のエトキシ基を有するＣ_８‐Ｃ₁₈アルコールエトキシレート（好ましくはＣ₁₀平均）、およびそれらの混合物が最も好ましい。
【０１０５】
高度に好ましいノニオン性界面活性剤は、下記式のポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤である：
【化１】

上記式中Ｒ^１はＨであるか、あるいはＲ^１はＣ_1-4 ヒドロカルビル、２‐ヒドロキシエチル、２‐ヒドロキシプロピルまたはそれらの混合物であり、Ｒ^２はＣ_5-31ヒドロカルビルであり、Ｚは直鎖ヒドロカルビル鎖とその鎖に直接結合された少くとも３つのヒドロキシルとを有するポリヒドロキシヒドロカルビル、またはそのアルコキシル化誘導体である。好ましくは、Ｒ^１はメチルであり、Ｒ^２は直鎖Ｃ_11-15 アルキルまたはＣ_16-18 アルキルまたはアルケニル鎖、例えばココナツアルキル、またはそれらの混合物であり、Ｚは還元アミノ化反応でグルコース、フルクトース、マルトース、ラクトースのような還元糖から誘導される。
【０１０６】
アニオン性界面活性剤
本発明の目的にとり好ましいアニオン性界面活性剤は、アルキルエステルサルフェートおよび直鎖アルキルベンゼン界面活性剤である。用いられる適切なアニオン性界面活性剤は、"The Journal of the American Oil Chemists Society",52 (1975),pp.323-329 に従い気体ＳＯ_３でスルホン化されたＣ_８‐Ｃ₂₀カルボン酸（即ち、脂肪酸）の直鎖エステルを含めた、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、アルキルエステルスルホネート界面活性剤である。適切な出発物質には、獣脂、パーム油などから誘導されるような天然脂肪物質がある。
【０１０７】
特に洗濯適用向けに好ましいアルキルエステルスルホネート界面活性剤には、下記構造式のアルキルエステルスルホネート界面活性剤がある：
【化２】

上記式中Ｒ^３はＣ_８‐Ｃ₂₀ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、またはそれらの組合せであり、Ｒ^４はＣ_１‐Ｃ_６ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、またはそれらの組合せであり、Ｍはアルキルエステルスルホネートと水溶性塩を形成するカチオンである。適切な塩形成カチオンには、ナトリウム、カリウムおよびリチウムのような金属、置換または非置換アンモニウムカチオン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミンがある。好ましくは、Ｒ^３はＣ₁₀‐Ｃ₁₆アルキルであり、Ｒ^４はメチル、エチルまたはイソプロピルである。Ｒ^３がＣ₁₀‐Ｃ₁₆アルキルであるメチルエステルスルホネートが特に好ましい。
【０１０８】
他の適切なアニオン性界面活性剤には、式ＲＯＳＯ_３Ｍの水溶性塩または酸であるアルキルサルフェート界面活性剤があり、ここでＲは好ましくはＣ₁₀‐Ｃ₂₄ヒドロカルビル、好ましくはＣ₁₀‐Ｃ₂₀アルキル部分を有するアルキルまたはヒドロキシアルキル、更に好ましくはＣ₁₂‐Ｃ₁₈アルキルまたはヒドロキシアルキルであり、ＭはＨまたはカチオン、例えばアルカリ金属カチオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム）、アンモニウムまたは置換アンモニウム（例えば、メチル‐、ジメチル‐およびトリメチル‐アンモニウムカチオン、およびテトラメチルアンモニウムおよびジメチルピペリジニウムカチオンのような四級アンモニウムカチオン、およびエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミンのようなアルキルアミンから誘導される四級アンモニウムカチオン、およびそれらの混合物など）である。典型的には、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₆アルキル鎖は低い洗浄温度（例えば約５０℃以下）で好ましく、Ｃ₁₆‐Ｃ₁₈アルキル鎖は高い洗浄温度（例えば約５０℃以上）で好ましい。
【０１０９】
洗浄目的に有用な他のアニオン性界面活性剤も、本発明の洗剤組成物中に含有させることができる。これらには、石鹸の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよび置換アンモニウム塩、例えばモノ、ジおよびトリエタノールアミン塩を含む）、Ｃ_８‐Ｃ₂₂一級または二級アルカンスルホネート、Ｃ_８‐Ｃ₂₄オレフィンスルホネート、例えば英国特許明細書第１，０８２，１７９号明細書で記載されたように、アルカリ土類金属シトレートの熱分解産物のスルホン化により製造されるスルホン化ポリカルボン酸、Ｃ_８‐Ｃ₂₄アルキルポリグリコールエーテルサルフェート（１０モル以内のエチレンオキシドを含む）；アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールサルフェート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルサルフェート、パラフィンスルホネート、アルキルホスフェート、アシルイセチオネートのようなイセチオネート、Ｎ‐アシルタウレート、アルキルサクシナメートおよびスルホサクシネート、スルホサクシネートのモノエステル（特に飽和および不飽和Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈モノエステル）およびスルホサクシネートのジエステル （特に飽和および不飽和Ｃ_６‐Ｃ₁₂ジエステル）、アシルサルコシネート、アルキルポリグルコシドのサルフェートのようなアルキル多糖のサルフェート（ノニオン性非サルフェート化合物は以下で記載されている）、分岐一級アルキルサルフェート、および式ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｋ‐ＣＨ_２ＣＯＯ⁻Ｍ^＋（ＲはＣ_８‐Ｃ₂₂アルキルであり、ｋは１〜１０の整数であり、Ｍは可溶性塩形成カチオンである）のようなアルキルポリエトキシカルボキシレートがある。トール油中に存在するか、またはそれから誘導される、ロジン、水素添加ロジン、樹脂酸および水素添加樹脂酸のような、樹脂酸および水素添加樹脂酸も適切である。
【０１１０】
別な例は、"Surface Active Agents and Detergents" (Vol.I and II,Schwartz,Perry and Berch)で記載されている。様々なこのような界面活性剤は、１９７５年１２月３０日付で発行されたLaughlinらのＵＳ特許第３，９２９，６７８号明細書の第２３欄５８行目〜第２９欄２３行目でも一般的に開示されている（参考のため本明細書に組み込まれる）。
【０１１１】
本組成物中に含有されるとき、本発明の洗剤組成物は典型的には約１〜約４０重量％、好ましくは約３〜約２０％のこのようなアニオン性界面活性剤を含んでいる。
【０１１２】
高度に好ましいアニオン性界面活性剤には、式ＲＯ（Ａ）_ｍＳＯ_３Ｍの水溶性塩または酸であるアルキルアルコキシル化サルフェート界面活性剤があり、ここでＲは非置換Ｃ₁₀‐Ｃ₂₄アルキルまたはＣ₁₀‐Ｃ₂₄アルキル部分を有するヒドロキシアルキル基、好ましくはＣ₁₂‐Ｃ₂₀アルキルまたはヒドロキシアルキル、更に好ましくはＣ₁₂‐Ｃ₁₈アルキルまたはヒドロキシアルキルであり、Ａはエトキシまたはプロポキシ単位であり、ｍはゼロより大きく、典型的には約０．５〜約６、更に好ましくは約０．５〜約３であり、ＭはＨまたはカチオン、例えば金属カチオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム等）、アンモニウムまたは置換アンモニウムカチオンである。アルキルエトキシル化サルフェートおよびアルキルプロポキシル化サルフェートが本発明では考えられる。置換アンモニウムカチオンの具体例には、メチル、ジメチル、トリメチル‐アンモニウムカチオン、並びにテトラメチルアンモニウムおよびジメチルピペリジニウムカチオンのような四級アンモニウムカチオン、並びにエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミンのようなアルキルアミンから誘導されるもの、それらの混合物などがある。例示の界面活性剤は、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（１．０）サルフェート（Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈Ｅ（１．０）Ｍ）、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（２．２５）サルフェート（Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈Ｅ（２．２５）Ｍ）、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（３．０）サルフェート（Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈Ｅ（３．０）Ｍ）およびＣ₁₂‐Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（４．０）サルフェート（Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈Ｅ（４．０）Ｍ）であり、Ｍは便宜上ナトリウムおよびカリウムから選択される。
【０１１３】
カチオン性界面活性剤
本発明の洗剤組成物で使用に適したカチオン性洗浄界面活性剤は、１つの長鎖ヒドロカルビル基を有するものである。このようなカチオン性界面活性剤の例には、アンモニウム界面活性剤、例えばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲナイド、および下記式を有する界面活性剤がある：
〔Ｒ^２（ＯＲ^３）_ｙ〕〔Ｒ^４（ＯＲ^３）_ｙ〕_２Ｒ^５Ｎ^＋Ｘ⁻
上記式中Ｒ^２はアルキル鎖中に約８〜約１８の炭素原子を有するアルキルまたはアルキルベンジル基である；各Ｒ^３は‐ＣＨ_２ＣＨ_２‐、‐ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）‐、‐ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_２ＯＨ）‐、‐ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２‐およびそれらの混合物からなる群より選択される；各Ｒ^４はＣ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_１‐Ｃ_４ヒドロキシアルキル、２つのＲ^４基を連結して形成されたベンジル環構造、‐ＣＨ_２ＣＨＯＨ‐ＣＨＯＨＣＯＲ^６ＣＨＯＨＣＨ_２ＯＨ（Ｒ^６は約１０００以下の分子量を有するヘキソースまたはヘキソースポリマーである）、およびｙが０でないとき水素からなる群より選択される；Ｒ^５はＲ^４と同様であるか、またはＲ^２＋Ｒ^５の炭素原子の総数が約１８以下となるアルキル鎖である；各ｙは０〜約１０であって、ｙ値の合計は０〜約１５である；Ｘはいずれか適合しうるアニオンである。
【０１１４】
本発明に適した四級アンモニウム界面活性剤は下記式（Ｉ）を有している：
【化３】

上記式中Ｒ_１は短鎖長アルキル（Ｃ_６‐Ｃ₁₀）または下記式（II）のアルキルアミドアルキルである：
【化４】

（ｙは２〜４、好ましくは３である）；
上記式中Ｒ_２はＨまたはＣ_１‐Ｃ_３アルキルである；
上記式中ｘは０〜４、好ましくは０〜２、最も好ましくは０である；
上記式中Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５は同一であるかまたは異なっており、短鎖アルキル（Ｃ_１‐Ｃ_３）または下記式III のアルコキシル化アルキルである；
【化５】

（Ｒ^６はＣ_１‐Ｃ_４であり、ｚは１または２である）
上記式中Ｘ⁻は対イオン、好ましくはハライド、例えばクロリドまたはメチル硫酸である。
【０１１５】
好ましい四級アンモニウム界面活性剤は、Ｒ_１がＣ_８、Ｃ₁₀またはそれらの混合物、ｘ＝０、Ｒ_３、Ｒ_４＝ＣＨ_３およびＲ_５＝ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨである、式Ｉで定義されたようなものである。
【０１１６】
高度に好ましいカチオン性界面活性剤は、下記式を有した、本組成物で有用な水溶性四級アンモニウム化合物である：
Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｒ_４Ｎ^＋Ｘ⁻ （ｉ）
上記式中Ｒ_１はＣ_８‐Ｃ₁₆アルキルであり、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４の各々は独立してＣ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_１‐Ｃ_４ヒドロキシアルキル、ベンジルおよび‐ （Ｃ_２Ｈ₄₀）_ｘＨ（ｘは２〜５の値を有する）であり、Ｘはアニオンである。Ｒ_２、Ｒ_３またはＲ_４のうち１以下はベンジルでなければならない。
Ｒ_１にとり好ましいアルキル鎖長はＣ₁₂‐Ｃ₁₅であり、特にそのアルキル基はココナツまたはパーム核脂肪から誘導される鎖長の混合物であるか、あるいはオレフィンビルドアップまたはオキソアルコール合成により合成で誘導される。Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４にとり好ましい基はメチルおよびヒドロキシエチル基であり、アニオンＸはハライド、メト硫酸、酢酸およびリン酸イオンから選択される。
【０１１７】
本発明で使用に適した式（ｉ）の四級アンモニウム化合物の例は以下である：
ココナツトリメチルアンモニウムクロリドまたはブロミド
ココナツメチルジヒドロキシエチルアンモニウムクロリドまたはブロミド
デシルトリエチルアンモニウムクロリド
デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリドまたはブロミド
Ｃ_12-15 ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリドまたはブロミド
ココナツジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリドまたはブロミド
ミリスチルトリメチルアンモニウムメチルサルフェート
ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロリドまたはブロミド
ラウリルジメチル（エテノキシ）_４アンモニウムクロリドまたはブロミド
コリンエステル（Ｒ_１がＣＨ_２‐ＣＨ_２‐Ｏ‐Ｃ（＝Ｏ）‐Ｃ_12-14 アルキルであり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４がメチルである、式（ｉ）の化合物）
ジアルキルイミダゾリン（式（ｉ）の化合物）
【０１１８】
本発明で有用な他のカチオン性界面活性剤は、１９８０年１０月１４日付で発行されたCambreのＵＳ特許第４，２２８，０４４号および欧州特許出願ＥＰ第０００，２２４号明細書にも記載されている。
【０１１９】
典型的なカチオン性布帛柔軟化成分には非水溶性四級アンモニウム布帛柔軟化活性剤またはそれらに相当するアミン前駆体があり、ジ長鎖アルキルアンモニウムクロリドまたはメチルサルフェートが最も常用されている。
これらの中で好ましいカチオン性柔軟剤には以下がある：
１）ジタロージメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＤＭＡＣ）
２）ジ水素添加タロージメチルアンモニウムクロリド
３）ジ水素添加タロージメチルアンモニウムメチルサルフェート
４）ジステアリルジメチルアンモニウムクロリド
５）ジオレイルジメチルアンモニウムクロリド
６）ジパルミチルヒドロキシエチルメチルアンモニウムクロリド
７）ステアリルベンジルジメチルアンモニウムクロリド
８）タロートリメチルアンモニウムクロリド
９）水素添加タロートリメチルアンモニウムクロリド
１０）Ｃ_12-14 アルキルヒドロキシエチルジメチルアンモニウムクロリド
１１）Ｃ_12-18 アルキルジヒドロキシエチルメチルアンモニウムクロリド
１２）ジ（ステアロイルオキシエチル）ジメチルアンモニウムクロリド
（ＤＳＯＥＤＭＡＣ）
１３）ジ（タローオキシエチル）ジメチルアンモニウムクロリド
１４）ジタローイミダゾリニウムメチルサルフェート
１５）１‐（２‐タローイルアミドエチル）‐２‐タローイルイミダゾリニウム
メチルサルフェート
【０１２０】
生分解性四級アンモニウム化合物が、伝統的に用いられているジ長鎖アルキルアンモニウムクロリドおよびメチルサルフェートの代わりとして提供されている。このような四級アンモニウム化合物は、カルボキシ基のような官能基を介在させた長鎖アルキル（アルケニル）基を有している。上記物質およびそれらを含有した布帛柔軟化組成物は、ＥＰ‐Ａ‐０，０４０，５６２およびＥＰ‐Ａ‐０，２３９，９１０のような多数の文献で開示されている。
【０１２１】
四級アンモニウム化合物およびそのアミン前駆体は、下記式（Ｉ）または（II）を有している：
【化６】

上記式中Ｑは‐Ｏ‐Ｃ（Ｏ）‐、‐Ｃ（Ｏ）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐Ｃ（Ｏ）‐Ｏ‐、
‐ＮＲ^４‐Ｃ（Ｏ）‐、‐Ｃ（Ｏ）‐ＮＲ^４‐から選択される；
Ｒ^１は（ＣＨ_２）_ｎ‐Ｑ‐Ｔ^２またはＴ^３である；
Ｒ^２は（ＣＨ_２）_ｍ‐Ｑ‐Ｔ^４またはＴ^５、あるいはＲ^３である；
Ｒ^３はＣ_１‐Ｃ_４アルキル、Ｃ_１‐Ｃ_４ヒドロキシアルキルまたはＨである；
Ｒ^４はＨ、Ｃ_１‐Ｃ_４アルキルまたはＣ_１‐Ｃ_４ヒドロキシアルキルである；
Ｔ^１、Ｔ^２、Ｔ^３、Ｔ^４、Ｔ^５は独立してＣ₁₁‐Ｃ₂₂アルキルまたはアルケニルである；
ｎおよびｍは１〜４の整数である；および
Ｘ⁻は柔軟剤適合性アニオンである。柔軟剤適合性アニオンの非制限例にはクロリドまたはメチルサルフェートがある。
【０１２２】
アルキルまたはアルケニル鎖Ｔ^１、Ｔ^２、Ｔ^３、Ｔ^４、Ｔ^５は、少くとも１１の炭素原子、好ましくは少くとも１６の炭素原子を有していなければならない。その鎖は直鎖でもまたは分岐でもよい。獣脂は長鎖アルキルおよびアルケニル物質の便利で安価な供給源である。Ｔ^１、Ｔ^２、Ｔ^３、Ｔ^４、Ｔ^５が獣脂に典型的な長鎖物質の混合物を表している化合物が特に好ましい。
【０１２３】
本水性布帛柔軟化組成物で使用に適した四級アンモニウム化合物の具体例には：
１）Ｎ，Ｎ‐ジ（タローイルオキシエチル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム クロリド
２）Ｎ，Ｎ‐ジ（タローイルオキシエチル）‐Ｎ‐メチル，Ｎ‐（２‐ヒドロ キシエチル）アンモニウムメチルサルフェート
３）Ｎ，Ｎ‐ジ（２‐タローイルオキシ‐２‐オキソエチル）‐Ｎ，Ｎ‐ ジメチルアンモニウムクロリド
４）Ｎ，Ｎ‐ジ（２‐タローイルオキシエチルカルボニルオキシエチル）‐ Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウムクロリド
５）Ｎ‐（２‐タローイルオキシ‐２‐エチル）‐Ｎ‐（２‐タローイルオキシ ‐２‐オキソエチル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウムクロリド
６）Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリ（タローイルオキシエチル）‐Ｎ‐メチルアンモニウム クロリド
７）Ｎ‐（２‐タローイルオキシ‐２‐オキソエチル）‐Ｎ‐（タローイル‐ Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウムクロリド）
８）１，２‐ジタローイルオキシ‐３‐トリメチルアンモニオプロパンクロリドおよび上記物質の混合物がある。
【０１２４】
本組成物中に含有されるとき、本発明の洗剤組成物は典型的には０．２〜約２５重量％、好ましくは約１〜約８％のこのようなカチオン性界面活性剤を含む。
【０１２５】
漂白剤
漂白剤、特にブリーチアクチベーター漂白系を更に含んだ本発明の洗剤組成物は、向上した食品しみ／汚れ除去性、黒ずみクリーニング性および白さ維持を発揮することが、意外にもわかった。理論に拘束されることなく、組合せ酵素の加水分解に起因して小さくなった発色原粒子は、特に低温で、ブリーチ活性化漂白系により更に攻撃されやすくなると考えられている。
これらの漂白剤には、過酸化水素、ＰＢ１、ＰＢ４、および粒径４００〜８００ミクロンのペルカーボネートがある。これらの漂白剤成分には、１種以上の酸素漂白剤、および選択された漂白剤に応じて１種以上のブリーチアクチベーターを含めることができる。存在するとき、酸素漂白化合物は典型的には約１〜約２５％のレベルで存在する。
本発明で使用の漂白剤成分は、当業界で知られている酸素ブリーチおよびその他を含めて、洗剤組成物に有用ないかなる漂白剤であってもよい。本発明に適した漂白剤は、活性化または非活性化漂白剤である。
【０１２６】
使える酸素漂白剤の１カテゴリーには、ポリカルボン酸漂白剤およびその塩を含む。このクラスの剤の適切な例には、マグネシウムモノペルオキシフタレート六水和物、ｍ‐クロロ過安息香酸のマグネシウム塩、４‐ノニルアミノ‐４‐オキソペルオキシ酪酸およびジペルオキシドデカン二酸がある。このような漂白剤は、ＵＳ特許第４，４８３，７８１号、ＵＳ特許出願第７４０，４４６号、欧州特許出願第０，１３３，３５４号およびＵＳ特許第４，４１２，９３４号明細書で開示されている。高度に好ましい漂白剤には、ＵＳ特許第４，６３４，５５１号明細書で記載されたような６‐ノニルアミノ‐６‐オキソペルオキシカプロン酸もある。
【０１２７】
使える漂白剤のもう１つのカテゴリーにはハロゲン漂白剤がある。次亜ハロゲン酸漂白剤の例には、例えばトリクロロイソシアヌル酸、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウムおよびカリウム、Ｎ‐クロロおよびＮ‐ブロモアルカンスルホンアミドがある。このような物質は、通常最終製品の０．５〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％で加えられる。
【０１２８】
過酸化水素放出剤は、ペルヒドロライズ(perhydrolyze)されて過酸を活性漂白種として形成して、改善された漂白効果を発揮する、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ、ＵＳ４，４１２，９３４に記載）、３，５‐トリメチルヘキサノールオキシベンゼンスルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ、ＥＰ１２０，５９１に記載）、ペンタアセチルグルコース（ＰＡＧ）またはＮ‐ノナノイル‐６‐アミノカプロン酸のフェノールスルホネートエステル（ＮＡＣＡ‐ＯＢＳ、ＷＯ９４／２８１０６に記載）のようなブリーチアクチベーターと組合せて使える。同時係属欧州特許出願第９１８７０２０７．７号明細書で開示されたようなアシル化シトレートエステル、並びにProcter & Gambleの同時係属特許出願ＵＳＳＮ第６０／０２２，７８６号（１９９６年７月３０日付で出願）および第６０／０２８，１２２号（１９９６年１０月１５日付で出願）明細書で開示されたような下記式の非対称非環式イミドブリーチアクチベーターも適切なアクチベーターである：
【化７】

上記式中Ｒ_１はＣ_７‐Ｃ₁₃直鎖または分岐鎖飽和または不飽和アルキル基であり、Ｒ_２はＣ_１‐Ｃ_８直鎖または分岐鎖飽和または不飽和アルキル基であり、Ｒ_３はＣ_１‐Ｃ_４直鎖または分岐鎖飽和または不飽和アルキル基である。
【０１２９】
本発明による洗剤組成物で使用向けの、ブリーチアクチベーターおよびペルオキシゲン漂白化合物からなる漂白系、およびペルオキシ酸を含めた、有用な漂白剤は、我々の同時係属出願ＵＳＳＮ０８／１３６，６２６、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７８２３、ＷＯ９５／２７７７２、ＷＯ９５／２７７７３、ＷＯ９５／２７７７４およびＷＯ９５／２７７７５で記載されている。
【０１３０】
過酸化水素も、洗浄および／またはすすぎプロセスの始めにまたは最中に過酸化水素を発生しうる酵素系（即ち、酵素およびその基質）を加えることで、存在させてもよい。このような酵素系は、１９９１年１０月９日付で出願されたＥＰ特許出願９１２０２６５５．６で開示されている。
【０１３１】
ブリーチ組成物で使用の含金属触媒には、含コバルト触媒、例えばペンタアミン酢酸コバルト(III) 塩、および含マンガン触媒、例えばＥＰＡ５４９２７１、ＥＰＡ５４９２７２、ＥＰＡ４５８３９７、ＵＳ５，２４６，６２１、ＥＰＡ４５８３９８、ＵＳ５，１９４，４１６およびＵＳ５，１１４，６１１で記載されたものがある。ペルオキシ化合物、含マンガンブリーチ触媒およびキレート化剤を含めた漂白組成物は、特許出願第９４８７０２０６．３号明細書で記載されている。
【０１３２】
酸素漂白剤以外の漂白剤も当業界で知られており、本発明で利用しうる。特に興味ある非酸素漂白剤の１タイプには、スルホン化亜鉛および／またはアルミニウムフタロシアニンのような光活性化漂白剤がある。これらの物質は洗浄プロセス中に基材に付着することができる。日光下に衣類を架けて乾燥させるような、酸素の存在下における光照射時で、スルホン化亜鉛フタロシアニンは活性化され、その結果基材が漂白される。好ましい亜鉛フタロシアニンおよび光活性化漂白プロセスは、ＵＳ特許第４，０３３，７１８号明細書で記載されている。典型的には、洗剤組成物は約０．０２５〜約１．２５重量％のスルホン化亜鉛フタロシアニンを含有する。
【０１３３】
ビルダー系
本発明の洗剤組成物は、好ましくはビルダー、更に好ましくはゼオライト、ナトリウム積層シリケートおよび／またはトリポリリン酸ナトリウムを含む。ビルダーを更に含んだ本発明の洗剤組成物は向上したクリーニング性を発揮することが、意外にもわかった。理論に拘束されることなく、親水コロイドガム含有しみ上のカルシウム付着は酵素加水分解を制限していると考えられている。したがって、ビルダーの使用は捕捉されたカルシウムを除去すると考えられ、本発明の組合せ酵素の作用にとり好ましい。
【０１３４】
アルミノシリケート物質、シリケート、ポリカルボキシレート、アルキルまたはアルケニルコハク酸、および脂肪酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミンペンタメチレン酢酸のような物質、金属イオン封鎖剤、例えばアミノポリホスホネート、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸およびジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸を含めて、いかなる慣用的なビルダー系も本発明で使用に適している。リン酸ビルダーも本発明に用いてよい。
【０１３５】
適切なビルダーには、無機イオン交換物質、通常無機の水和したアルミノシリケート物質、更に具体的には水和合成ゼオライト、例えば水和ゼオライトＡ、Ｘ、Ｂ、ＨＳまたはＭＡＰがある。
もう１つの適切な無機ビルダー物質は、積層シリケート、例えばＳＫＳ‐６ （Hoechst)である。ＳＫＳ‐６はケイ酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓｉ_２Ｏ_５）からなる結晶積層シリケートである。
【０１３６】
１つのカルボキシ基を有する適切なポリカルボキシレートには、ベルギー特許第８３１，３６８号、第８２１，３６９号および第８２１，３７０号明細書で開示されたような、乳酸、グリコール酸およびそれらのエーテル誘導体がある。２つのカルボキシ基を有するポリカルボキシレートには、コハク酸、マロン酸、 （エチレンジオキシ）二酢酸、マレイン酸、ジグリコール酸、酒石酸、タルトロン酸およびフマル酸の水溶性塩、並びにドイツ特許公開第２，４４６，６８６号、第２，４４６，６８７号およびＵＳ特許第３，９３５，２５７号明細書で記載されたエーテルカルボキシレート、およびベルギー特許第８４０，６２３号明細書で記載されたスルフィニルカルボキシレートがある。３つのカルボキシ基を有するポリカルボキシレートには、特に水溶性シトレート、アコニトレートおよびシトラコネート、並びに英国特許第１，３７９，２４１号明細書で記載されたカルボキシメチルオキシサクシネート、オランダ出願第７２０５８７３号明細書で記載されたラクトキシサクシネートのようなサクシネート誘導体、および英国特許第１，３８７，４４７号明細書で記載された２‐オキサ‐１，１，３‐プロパントリカルボキシレートのようなオキシポリカルボキシレート物質がある。
【０１３７】
４つのカルボキシ基を有するポリカルボキシレートには、英国特許第１，２６１，８２９号明細書で開示されたオキシジサクシネート、１，１，２，２‐エタンテトラカルボキシレート、１，１，３，３‐プロパンテトラカルボキシレートおよび１，１，２，３‐プロパンテトラカルボキシレートがある。スルホ置換基を有するポリカルボキシレートには、英国特許第１，３９８，４２１号、第１，３９８，４２２号およびＵＳ特許第３，９３６，４４８号明細書で開示されたスルホサクシネート誘導体、および英国特許第１，０８２，１７９号明細書で記載されたスルホン化熱分解シトレートがあり、ホスホン置換基を有するポリカルボキシレートは英国特許第１，４３９，０００号明細書で開示されている。
【０１３８】
脂環式およびヘテロ環式ポリカルボキシレートには、シクロペンタン‐シス，シス，シス‐テトラカルボキシレート、シクロペンタジエニドペンタカルボキシレート、２，３，４，５‐テトラヒドロフラン‐シス，シス，シス‐テトラカルボキシレート、２，５‐テトラヒドロフラン‐シス‐ジカルボキシレート、２，２，５，５‐テトラヒドロフラン‐テトラカルボキシレート、１，２，３，４，５，６‐ヘキサン‐ヘキサカルボキシレート、並びにソルビトール、マンニトールおよびキシリトールのような多価アルコールのカルボキシメチル誘導体がある。芳香族ポリカルボキシレートには、メリット酸、ピロメリット酸、および英国特許第１，４２５，３４３号明細書で開示されたフタル酸誘導体がある。
上記の中で好ましいポリカルボキシレートは、１分子当たり３以内のカルボキシ基を有したヒドロキシカルボキシレート、更に詳しくはシトレートである。
【０１３９】
本組成物で使用上好ましいビルダー系には、ゼオライトＡのような非水溶性アルミノシリケートビルダーまたは積層シリケート（ＳＫＳ‐６）と、クエン酸のような水溶性カルボキシレートキレート化剤との混合物がある。他の好ましいビルダー系には、ゼオライトＡのような非水溶性アルミノシリケートビルダーと、クエン酸のような水溶性カルボキシレートキレート化剤との混合物がある。本発明の液体洗剤組成物で使用上好ましいビルダー系は、石鹸およびポリカルボキシレートである。
【０１４０】
顆粒組成物で使用上ビルダー系の一部を形成できる他のビルダー物質には、炭酸、重炭酸、ケイ酸アルカリ金属のような無機物質、並びに有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネートおよびアミノポリカルボキシレートのような有機物質がある。
他の適切な水溶性有機塩はホモもしくはコポリマー酸またはそれらの塩であり、その場合にポリカルボン酸は２以下の炭素原子で互いに離された少くとも２つのカルボキシル基を有している。このタイプのポリマーはＧＢ‐Ａ‐１，５９６，７５６で開示されている。このような塩の例は、ＭＷ２０００〜５０００のポリアクリレート、およびそれらと無水マレイン酸とのコポリマーであり、このようなコポリマーは２０，０００〜７０，０００、特に約４０，０００の分子量を有する。
【０１４１】
洗浄ビルダー塩は、通常組成物の５〜８０重量％、好ましくは１０〜７０重量％、最も一般的には３０〜６０重量％の量で含有される。
【０１４２】
他の界面活性剤系
本発明の洗剤組成物は、カチオン性、両性、双極性および半極性界面活性剤、並びに既に前記されたもの以外のノニオン性および／またはアニオン性界面活性剤も含有してよい。
【０１４３】
両性界面活性剤も本発明の洗剤組成物で使用に適している。これらの界面活性剤は、二級または三級アミンの脂肪族誘導体、あるいはヘテロ環式二級および三級アミンの脂肪族誘導体として広く記載することができ、ここで脂肪族基は直鎖でもまたは分岐鎖であってもよい。脂肪族置換基の１つは少くとも約８つの炭素原子、典型的には約８〜約１８の炭素原子を有し、少くとも１つはアニオン性水溶性基、例えばカルボキシ、スルホン酸、硫酸基を有している。両性界面活性剤の例については、１９７５年１２月３０日付で発行されたLaughlinらのＵＳ特許第３，９２９，６７８号明細書の第１９欄１８〜３５行目参照。
本組成物中に含有されるとき、本発明の洗剤組成物は典型的には０．２〜約１５重量％、好ましくは約１〜約１０％のこのような両性界面活性剤を含む。
【０１４４】
双極性界面活性剤も洗剤組成物で使用に適している。これらの界面活性剤は、二級および三級アミンの誘導体、ヘテロ環式二級および三級アミンの誘導体、あるいは四級アンモニウム、四級ホスホニウムまたは三級スルホニウム化合物の誘導体として広く記載することができる。双極性界面活性剤の例については、１９７５年１２月３０日付で発行されたLaughlinらのＵＳ特許第３，９２９，６７８号明細書の第１９欄３８行目〜第２２欄４８行目参照。
本組成物中に含有されるとき、本発明の洗剤組成物は典型的には０．２〜約１５重量％、好ましくは約１〜約１０％のこのような双極性界面活性剤を含む。
【０１４５】
半極性ノニオン性界面活性剤は、炭素原子約１０〜約１８の１つのアルキル部分、炭素原子約１〜約３のアルキル基およびヒドロキシアルキル基からなる群より選択される２つの部分を有した水溶性アミンオキシド；炭素原子約１０〜約１８の１つのアルキル部分、炭素原子約１〜約３のアルキル基およびヒドロキシアルキル基からなる群より選択される２つの部分を有した水溶性ホスフィンオキシド；炭素原子約１０〜約１８の１つのアルキル部分、炭素原子約１〜約３のアルキルおよびヒドロキシアルキル部分からなる群より選択される部分を有した水溶性スルホキシドを含めた、特定カテゴリーのノニオン性界面活性剤である。
【０１４６】
半極性ノニオン性洗剤界面活性剤には、下記式を有したアミンオキシド界面活性剤がある：
【化８】

上記式中Ｒ^３は約８〜約２２の炭素原子を有するアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキルフェニル基またはそれらの混合物である；Ｒ^４は約２〜約３の炭素原子を有するアルキレン、ヒドロキシアルキレン基またはそれらの混合物である；ｘは０〜約３である；各Ｒ^５は約１〜約３の炭素原子を有するアルキルまたはヒドロキシアルキル基、あるいは約１〜約３のエチレンオキシド基を有するポリエチレンオキシド基である。Ｒ^５基は、例えば酸素または窒素原子を介して互いに結合されて、環構造を形成していてもよい。
これらのアミンオキシド界面活性剤には、特にＣ₁₀‐Ｃ₁₈アルキルジメチルアミンオキシドおよびＣ_８‐Ｃ₁₂アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドがある。
本組成物中に含有されるとき、本発明のクリーニング組成物は典型的には０．２〜約１５重量％、好ましくは約１〜約１０％のこのような半極性ノニオン性界面活性剤を含む。
【０１４７】
本発明の洗剤組成物は、一級または三級アミンの群から選択される共界面活性剤(cosurfactant)を更に含んでもよい。
本発明で使用に適した一級アミンには、式Ｒ_１ＮＨ_２によるアミンがあり、ここでＲ_１はＣ_６‐Ｃ₁₂、好ましくはＣ_６‐Ｃ₁₀アルキル鎖、またはＲ_４Ｘ（ＣＨ_２）_ｎであり、Ｘは‐Ｏ‐、‐Ｃ（Ｏ）ＮＨ‐または‐ＮＨ‐であり、Ｒ_４はＣ_６‐Ｃ₁₂アルキル鎖であり、ｎは１〜５、好ましくは３である。Ｒ_１アルキル鎖は直鎖でもまたは分岐鎖でもよく、１２以下、好ましくは５未満のエチレンオキシド部分を介在させてもよい。
上記式による好ましいアミンはｎ‐アルキルアミンである。本発明で使用に適したアミンは、１‐ヘキシルアミン、１‐オクチルアミン、１‐デシルアミンおよびラウリルアミンから選択される。他の好ましい一級アミンには、Ｃ_８‐Ｃ₁₀オキシプロピルアミン、オクチルオキシプロピルアミン、２‐エチルヘキシルオキシプロピルアミン、ラウリルアミドプロピルアミンおよびアミドプロピルアミンがある。
【０１４８】
本発明で使用に適した三級アミンには式Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｎを有する三級アミンがあり、ここでＲ_１およびＲ_２はＣ_１‐Ｃ_８アルキル鎖または
【化９】

であり、Ｒ_３はＣ_６‐Ｃ₁₂、好ましくはＣ_６‐Ｃ₁₀アルキル鎖であるか、またはＲ_３はＲ_４Ｘ（ＣＨ_２）_ｎ（Ｘは‐Ｏ‐、‐Ｃ（Ｏ）ＮＨ‐または‐ＮＨ‐である）であり、Ｒ_４はＣ_４‐Ｃ₁₂であり、ｎは１〜５、好ましくは２〜３である。Ｒ_５はＨまたはＣ_１‐Ｃ_２アルキルであり、ｘは１〜６である。Ｒ_３およびＲ_４は直鎖でもまたは分岐鎖でもよく、Ｒ_３アルキル鎖は１２以下、好ましくは５未満のエチレンオキシド部分を介在させてもよい。
【０１４９】
好ましい三級アミンは、Ｒ_１がＣ_６‐Ｃ₁₂アルキル鎖で、Ｒ_２およびＲ_３がＣ_１‐Ｃ_３アルキルまたは
【化１０】

（上記式中Ｒ_５はＨまたはＣＨ_３であり、ｘ＝１〜２である）である、Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｎである。
下記式のアミドアミンも好ましい：
【化１１】

上記式中Ｒ_１はＣ_６‐Ｃ₁₂アルキルであり、ｎは２〜４、好ましくはｎは３であり、Ｒ_２およびＲ_３はＣ_１‐Ｃ_４である。
【０１５０】
本発明の最も好ましいアミンには、１‐オクチルアミン、１‐ヘキシルアミン、１‐デシルアミン、１‐ドデシルアミン、Ｃ_8-10オキシプロピルアミン、Ｎ‐ココ‐１，３‐ジアミノプロパン、ココナツアルキルジメチルアミン、ラウリルジメチルアミン、ラウリルビス（ヒドロキシエチル）アミン、ココビス（ヒドロキシエチル）アミン、２モルプロポキシル化ラウリルアミン、２モルプロポキシル化オクチルアミン、ラウリルアミドプロピルジメチルアミン、Ｃ_8-10アミドプロピルジメチルアミンおよびＣ₁₀アミドプロピルジメチルアミンがある。
本組成物で使用上最も好ましいアミンは、１‐ヘキシルアミン、１‐オクチルアミン、１‐デシルアミン、１‐ドデシルアミンである。特に望ましいのは、ｎ‐ドデシルジメチルアミン、ビスヒドロキシエチルココナツアルキルアミン、７回エトキシル化オレイルアミン、ラウリルアミドプロピルアミンおよびココアミドプロピルアミンである。
【０１５１】
慣用的な洗剤酵素
洗剤組成物は、マンナナーゼおよびプロテアーゼ酵素に加えて、クリーニング性能、布帛ケアおよび／または衛生処理効果を発揮する１種以上の酵素を更に含むことができる。
上記酵素には、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラタナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β‐グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼまたはそれらの混合物から選択される酵素がある。
好ましい組合せは、１種以上の植物細胞壁分解酵素と一緒にした、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼおよび／またはセルラーゼのような常用酵素のカクテルを有した、洗剤組成物である。
【０１５２】
本発明で使えるセルラーゼには、細菌または真菌双方のセルラーゼを含む。好ましくは、それらは５〜１２の至適ｐＨおよび５０CEVU(Cellulose Viscosity Unit)／mg以上の比活性を有する。適切なセルラーゼはBarbesgoard らのＵＳ特許第４，４３５，３０７号明細書、Ｊ６１０７８３８４およびＷＯ９６／０２６５３で開示されており、そこではHumicola insolens 、Trichoderma 、Thielavia およびSporotrichumから各々産生される真菌セルラーゼについて開示している。ＥＰ７３９９８２は新規なBacillus種から単離されたセルラーゼを記載している。適切なセルラーゼはＧＢ‐Ａ‐２，０７５，０２８、ＧＢ‐Ａ‐２，０９５，２７５、ＤＥ‐ＯＳ‐２，２４７，８３２およびＷＯ９５／２６３９８でも開示されている。
【０１５３】
このようなセルラーゼの例は、Humicola insolens の株（Humicola grisea var.thermoidea）、特にHumicola株ＤＳＭ１８００により産生されるセルラーゼである。他の適切なセルラーゼは、約５０ｋＤａの分子量、５．５の等電点を有して、４１５のアミノ酸を含んだ、Humicola insolens 由来のセルラーゼ；セルラーゼ活性を示す、Humicola insolens,ＤＳＭ１８００に由来した〜４３ｋＤエンドグルカナーゼであり、好ましいエンドグルカナーゼ成分は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１７２４３で開示されたアミノ酸配列を有している。１９９４年９月２９日付で公開されたGenencorのＷＯ９４／２１８０１で記載されたTrichoderma longibrachiatum 由来のＥＧIII セルラーゼも適切なセルラーゼである。特に適切なセルラーゼはカラーケア効果を有するセルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、１９９１年１１月６日付で出願された欧州特許出願第９１２０２８７９．２号（Novo）明細書で記載されたセルラーゼである。CarezymeおよびCelluzyme （Novo Nordisk A/S）が特に有用である。ＷＯ９１／１７２４４およびＷＯ９１／２１８０１も参照。布帛ケアおよび／またはクリーニング性に適した他のセルラーゼは、ＷＯ９６／３４０９２、ＷＯ９６／１７９９４およびＷＯ９５／２４４７１で記載されている。
上記のセルラーゼは、洗剤組成物の０．０００１〜２重量％の純粋酵素レベルで、洗剤組成物中に通常配合される。
【０１５４】
ペルオキシダーゼ酵素は、酸素源、例えばペルカーボネート、ペルボレート、ペルサルフェート、過酸化水素など、およびブリーチ増強分子としてフェノール性基質と組合せて用いられる。それらは、“溶液漂白”のために、即ち洗浄操作中に基材から落ちた染料または顔料が洗浄液中で他の基材に移動することを防ぐために用いられる。ペルオキシダーゼ酵素は当業界で知られており、それには例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、リグニナーゼ、クロロおよびブロモペルオキシダーゼのようなハロペルオキシダーゼがある。ペルオキシダーゼ含有洗剤組成物は、例えばＰＣＴ国際出願ＷＯ８９／０９９８１３、ＷＯ８９／０９８１３、および１９９１年１１月６日付で出願された欧州特許出願ＥＰ９１２０２８８２．６および１９９６年２月２０日付で出願されたＥＰ９６８７００１３．８で開示されている。ラッカーゼ酵素も適切である。
【０１５５】
エンハンサーは全組成物の０．１〜５重量％のレベルで通常含まれる。好ましいエンハンサーは置換フェノチアジンおよびフェノキサジン類の１０‐フェノチアジンプロピオン酸（ＰＰＴ）、１０‐エチルフェノチアジン‐４‐カルボン酸（ＥＰＣ）、１０‐フェノキサジンプロピオン酸（ＰＯＰ）および１０‐メチルフェノキサジン（ＷＯ９４／１２６２１で記載）、および置換シリンゲート類 （Ｃ３‐Ｃ５置換アルキルシリンゲート類）およびフェノール類である。ナトリウムペルカーボネートまたはペルボレートが好ましい過酸化水素源である。
上記ペルオキシダーゼは、洗剤組成物の０．０００１〜２重量％の純粋酵素レベルで洗剤組成物に通常配合される。
【０１５６】
本発明の洗剤組成物中に含有させうる他の好ましい酵素にはリパーゼがある。洗剤用に適したリパーゼ酵素には、英国特許第１，３７２，０３４号明細書で開示された Pseudomonas stutzeri ＡＴＣＣ１９．１５４のようなPseudomonas 属の微生物により産生されるものがある。適切なリパーゼには、リパーゼの抗体と陽性の免疫交差反応を示して、微生物Pseudomonas fluorescent ＩＡＭ１０５７により産生されるものがある。このリパーゼは商品名 Lipase Ｐ "Amano"として日本、名古屋のAmano Pharmaceutical Co.Ltd.から市販されており、以下"Amano-P" と称される。他の適切な市販リパーゼには、Amano-CES 、Chromobacter viscosum 、例えば日本、田方の東洋醸造社からのChromobacter viscosum var.lipolyticum NRRLB 3673由来のリパーゼ；ＵＳＡのU.S.Biochemical Corp. およびオランダのDisoynth Co.からのChromobacter viscosum リパーゼ；Pseudomonas gladioli由来のリパーゼがある。特に適切なリパーゼはＭ１Lipase^R および Lipomax^R (Gist-Brocades) 並びにLipolase^R およびLipolase Ultra^R （Novo）のようなリパーゼであり、これらは本発明の組成物と併用されたとき非常に有効であることがわかった。Novo NordiskのＥＰ２５８０６８、ＷＯ９２／０５２４９およびＷＯ９５／２２６１５、UnileverのＷＯ９４／０３５７８、ＷＯ９５／３５３８１およびＷＯ９６／００２９２で記載された脂肪分解酵素も適切である。
【０１５７】
特別種のリパーゼ、即ち界面活性を要しないリパーゼと考えられるクチナーゼ〔ＥＣ3.1.1.50〕も適切である。洗剤組成物へのクチナーゼの添加は、例えばＷＯ‐Ａ‐８８／０９３６７（Genencor）、ＷＯ９０／０９４４６（Plant Genetic System）、ＷＯ９４／１４９６３およびＷＯ９４／１４９６４（Unilever）で記載されている。
リパーゼおよび／またはクチナーゼは、洗剤組成物の０．０００１〜２重量％の純粋酵素レベルで、洗剤組成物中に通常配合される。
【０１５８】
アミラーゼ（αおよび／またはβ）は、炭水化物ベース汚れの除去のために含有させることができる。１９９４年２月３日付で公開されたNovo Nordisk A/SのＷＯ９４／０２５９７では、変異アミラーゼを配合した洗剤組成物について記載している。１９９５年４月２０日付で公開されたNovo Nordisk A/SのＷＯ９５／１０６０３も参照。洗剤組成物向けに知られた他のアミラーゼには、α‐およびβ‐アミラーゼの双方がある。α‐アミラーゼは当業界で公知であり、ＵＳ特許５，００３，２５７、ＥＰ２５２，６６６、ＷＯ９１／００３５３、ＦＲ２，６７６，４５６、ＥＰ２８５，１２３、ＥＰ５２５，６１０、ＥＰ３６８，３４１および英国特許明細書第１，２９６，８３９号（Novo）で開示されたものがある。他の適切なアミラーゼは、１９９４年８月１８日付で公開されたＷＯ９４／１８３１４、１９９６年２月２２日付で公開されたGenencorのＷＯ９６／０５２９５で記載された安定性向上アミラーゼ、および９５年４月に公開されたＷＯ９５／１０６０３で開示された、Novo Nordisk A/S市販の直親に追加修飾を有したアミラーゼ変種である。ＥＰ２７７２１６、ＷＯ９５／２６３９７およびＷＯ９６／２３８７３（すべてNovo Nordisk）で記載されたアミラーゼも適切である。
【０１５９】
市販α‐アミラーゼ製品の例は、GenencorのPurafect Ox Am^R 、すべてNovo Nordisk A/S Denmarkから市販されているTermamyl^R 、 Ban^R 、Fungamyl^R および Duramyl^R である。ＷＯ９５／２６３９７は、他の適切なアミラーゼ：Phadebas^R α‐アミラーゼ活性アッセイで測定すると、２５〜５５℃の温度範囲および８〜１０範囲のｐＨ値で、Termamyl^R の比活性より少くとも２５％高い比活性を有することで特徴づけられるα‐アミラーゼについて記載している。ＷＯ９６／２３８７３（Novo Nordisk）で記載された上記酵素の変種が適切である。活性レベルと、熱安定性および高い活性レベルの組合せとの面で、改善された性質を有する他のデンプン分解酵素は、ＷＯ９５／３５３８２で記載されている。
【０１６０】
デンプン分解酵素は、組成物の０．０００１〜２重量％、好ましくは０．０００１８〜０．０６％、更に好ましくは０．０００２４〜０．０４８％の純粋酵素レベルで、本発明の洗剤組成物中に配合される。
【０１６１】
上記酵素は、植物、動物、細菌、真菌および酵母起源のように、いかなる適切な起源であってもよい。起源は更に中温性でもまたは好極限性（好冷性、好栄養性、好熱性、好圧性、好アルカリ性、好酸性、好塩性など）でもよい。精製または非精製形のこれら酵素も用いてよい。現在では、本発明の洗剤組成物で性能効力を最大にさせるため、タンパク質／遺伝子工学技術により野生型酵素を修飾することが慣例的である。例えば、変種はこのような組成物の常用成分に対する酵素の適合性が増すようにデザインされる。一方、酵素変種の至適ｐＨ、ブリーチまたはキラント安定性、触媒活性などが特定のクリーニング用途と合うように調整されるよう、変種をデザインしてもよい。
【０１６２】
特に、ブリーチ安定性の面では酸化されやすいアミノ酸について、および界面活性剤適合性の面では表面電荷について、注意が払われるべきである。このような酵素の等電点は一部の荷電アミノ酸の置換により修正してもよく、例えば等電点の増加はアニオン性界面活性剤との適合性を改善する上で役立つ。酵素の安定性は、例えば追加の塩橋を形成させ、カルシウム結合部位を補強してキラント安定性を増すことにより、更に高められる。ほとんどのセルラーゼは別々な結合ドメイン（ＣＢＤ）を有していることから、特別な注意がセルラーゼに払われるべきである。このような酵素の性質は、これらドメインの修飾により変えることができる。
【０１６３】
上記酵素は、洗剤組成物の０．０００１〜２重量％の純粋酵素レベルで、洗剤組成物中に通常配合される。酵素は、別々な単独成分（１種の酵素を含有した小球、顆粒、安定化液体など）として、または２種以上の酵素の混合物（例えば、共顆粒）として加えることができる。
【０１６４】
添加できる他の適切な洗剤成分は酵素酸化スカベンジャーであって、これは１９９２年１月３１日付で出願された同時係属欧州特許出願第９２８７００１８．６号明細書で記載されている。このような酵素酸化スカベンジャーの例は、エトキシル化テトラエチレンポリアミンである。
【０１６５】
様々な酵素物質および合成洗剤組成物中へのそれらの配合手段も、Genencor InternationalのＷＯ９３０７２６３ＡおよびＷＯ９３０７２６０Ａ、NovoのＷＯ８９０８６９４Ａ、および１９７１年１月５日付McCarty らのＵＳ３，５５３，１３９で開示されている。酵素は、１９７８年７月１８日付Place らのＵＳ４，１０１，４５７および１９８５年３月２６日付HughesのＵＳ４，５０７，２１９でも更に開示されている。液体洗剤処方物で有用な酵素物質およびこのような処方物中へのそれらの配合は、１９８１年４月１４日付HoraらのＵＳ４，２６１，８６８で開示されている。洗剤で有用な酵素は様々な技術で安定化させることができる。酵素安定化技術は、１９７１年８月１７日付Gedge らのＵＳ３，６００，３１９、１９８６年１０月２９日付Venegas のＥＰ１９９，４０５およびＥＰ２００，５８６で開示および例示されている。酵素安定化系も、例えばＵＳ３，５１９，５７０で記載されている。プロテアーゼ、キシラナーゼおよびセルラーゼを与える有用なBacillus sp.ＡＣ１３は、NovoのＷＯ９４０１５３２Ａで記載されている。
【０１６６】
カラーケアおよび布帛ケア効果
カラーケア効果のタイプを発揮するテクノロジーも含めることができる。これらテクノロジーの例は、カラー維持のための金属触媒である。このような金属触媒は、同時係属欧州特許出願第９２８７０１８１．２号明細書で記載されている。染料定着剤、シワ防止および水吸収性改善用のポリオレフィン分散剤、香料、カラーケア処理および香料持続用のアミノ官能基ポリマー（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１６５４６）は、カラーケア／布帛ケアテクノロジーの別な例であり、１９９６年１１月７日付で出願された同時係属特許出願第９６８７０１４０．９号明細書で記載されている。
【０１６７】
布帛柔軟剤も本発明による洗剤組成物中に配合できる。これらの剤はタイプが無機でもまたは有機でもよい。無機柔軟剤はＧＢ‐Ａ‐１，４００，８９８およびＵＳＰ５，０１９，２９２で開示されたスメクタイトクレーにより例示される。有機布帛柔軟剤には、ＧＢ‐Ａ１，５１４，２７６およびＥＰ‐Ｂ０，０１１，３４０で開示されたような非水溶性三級アミン、ＥＰ‐Ｂ‐０，０２６，５２７およびＥＰ‐Ｂ‐０，０２６，５２８で開示されたモノＣ₁₂‐Ｃ₁₄四級アンモニウム塩とそれらとの組合せ、およびＥＰ‐Ｂ‐０，２４２，９１９で開示されたようなジ長鎖アミドがある。布帛柔軟化系の他の有用な有機成分には、ＥＰ‐Ａ‐０，２９９，５７５および０，３１３，１４６で開示されたような高分子量ポリエチレンオキシド物質がある。
【０１６８】
スメクタイトクレーのレベルは通常２〜２０重量％、更に好ましくは５〜１５％の範囲であり、その物質は処方物の残部にドライミックス成分として加えられる。非水溶性三級アミンまたはジ長鎖アミド物質のような有機布帛柔軟剤は０．５〜５重量％、通常１〜３重量％のレベルで配合され、高分子量ポリエチレンオキシド物質および水溶性カチオン性物質は０．１〜２重量％、通常０．１５〜１．５％のレベルで加えられる。これらの物質は組成物のスプレードライ部分に通常加えられるが、一部の場合には、それらをドライミックス粒子として加えるか、または組成物の他の固形成分上にそれらを溶融液体としてスプレーした方が便利である。
【０１６９】
キレート化剤
本発明の洗剤組成物は、１種以上の鉄および／またはマンガンキレート化剤も場合により含有してよい。このようなキレート化剤は、すべて以下で記載されているようなアミノカルボキシレート、アミノホスホネート、多官能性置換芳香族キレート化剤およびそれらの混合物からなる群より選択できる。理論に拘束されることなく、これら物質の効果は、可溶性キレートの形成により洗浄液から鉄およびマンガンイオンを除去しうる、それらの例外的な能力に一部起因していると考えられる。
【０１７０】
任意のキレート化剤として有用なアミノカルボキシレートには、エチレンジアミン四酢酸、Ｎ‐ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四プロピオン酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸およびエタノールジグリシン、それらのアルカリ金属、アンモニウムおよび置換アンモニウム塩、およびそれらの混合物がある。
アミノホスホネートも、少くとも低レベルの全リンが洗剤組成物で許容されるときに本発明の組成物でキレート化剤として使用に適しており、それにはDEQUEST のようなエチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホネート）がある。好ましくは、これらのアミノホスホネートは炭素原子約７以上のアルキルまたはアルケニル基を含まない。
多官能性置換芳香族キレート化剤も本組成物で有用である。１９７４年５月２１日付で発行されたConnorらのＵＳ特許第３，８１２，０４４号明細書参照。このタイプの好ましい化合物は、酸形の場合、１，２‐ジヒドロキシ‐３，５‐ジスルホベンゼンのようなジヒドロキシジスルホベンゼンである。
【０１７１】
本発明で使用上好ましい生分解性キレーターは、１９８７年１１月３日付 HartmanおよびPerkins のＵＳ特許第４，７０４，２３３号明細書で記載されたようなエチレンジアミン二コハク酸（“ＥＤＤＳ”）、特に〔Ｓ，Ｓ〕異性体である。
本組成物は、例えばゼオライト、積層シリケートなどのような不溶性ビルダーと一緒にすると有用なコビルダー、またはキラントとして、水溶性メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）塩（または酸形）も含有してよい。
【０１７２】
利用されるならば、これらのキレート化剤は本洗剤組成物の通常約０．１〜約１５重量％である。更に好ましくは、利用されるならば、キレート化剤はこのような組成物の約０．１〜約３．０重量％である。
【０１７３】
起泡抑制剤
もう１つの任意成分は、シリコーンおよびシリカ‐シリコーン混合物により例示される起泡抑制剤である。シリコーンはアルキル化ポリシロキサン物質で通常代表され、シリカはシリカエーロゲル、キセロゲルおよび様々なタイプの疎水性シリカにより例示される微細形態で通常用いられる。これらの物質は粒子として配合することができ、起泡抑制剤は水溶性または水分散性で実質上非界面活性の洗剤不透過性キャリア中で放出しうるように配合されることが有利である。一方、起泡抑制剤は液体キャリアに溶解または分散させて、１種以上の他成分にスプレーすることで適用してもよい。
【０１７４】
好ましいシリコーン起泡抑制剤は、BartollotaらのＵＳ特許第３，９３３，６７２号明細書で開示されている。他の特に有用な起泡抑制剤は自己乳化シリコーン起泡抑制剤であり、１９７７年４月２８日付で公開されたドイツ特許出願ＤＴＯＳ第２，６４６，１２６号明細書で記載されている。このような化合物の例はDow Corning から市販されているＤＣ‐５４４であって、これはシロキサン‐グリコールコポリマーである。特に好ましい起泡抑制剤は、シリコーン油および２‐アルキル‐アルカノールの混合物からなる起泡抑制剤系である。適切な２‐アルキル‐アルカノールは、商品名Isofol１２Ｒで市販されている２‐ブチルオクタノールである。
このような起泡抑制剤系は、１９９２年１１月１０日付で出願された同時係属欧州特許出願第Ｎ９２８７０１７４．７号明細書で記載されている。
特に好ましいシリコーン起泡抑制剤は、同時係属欧州特許出願第Ｎ゜９２２０１６４９．８号明細書で記載されている。上記組成物は Aerosil^R のような溶融無孔質シリカと組み合せたシリコーン／シリカ混合物を含むことができる。
【０１７５】
上記された起泡抑制剤は、組成物の０．００１〜２重量％、好ましくは０．０１〜１重量％のレベルで通常用いられる。
【０１７６】
その他
洗剤組成物で用いられる他の成分、例えば汚れ懸濁剤、汚れ放出剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇り抑制剤、着色剤および／または封入または非封入香料も用いてよい。
【０１７７】
特に適切な封入物質は、ＧＢ１，４６４，６１６で記載されたような多糖およびポリヒドロキシ化合物のマトリックスからなる水溶性カプセルである。他の適切な水溶性封入物質は、ＵＳ３，４５５，８３８で記載されたような、置換ジカルボン酸の非ゼラチン化デンプン酸エステルから誘導されたデキストリンからなる。これらの酸エステルデキストリンは、好ましくは、ワキシーメイズ、ワキシーモロコシ、サゴ、タピオカおよびポテトのようなデンプンから製造される。上記封入物質の適切な例には、National Starch 製のＮ‐Ｌｏｋがある。Ｎ‐Ｌｏｋ封入物質は改質メイズスターチおよびグルコースからなる。デンプンは無水オクテニルコハク酸のような一官能性置換基を加えることにより改質される。
【０１７８】
本発明に適した再付着防止および汚れ懸濁剤には、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロースのようなセルロース誘導体、およびホモもしくはコポリマーポリカルボン酸またはそれらの塩がある。このタイプのポリマーには、ビルダーとして既に記載されたポリアクリレートおよび無水マレイン酸‐アクリル酸コポリマー、並びに無水マレイン酸とエチレン、メチルビニルエーテルまたはメタクリル酸とのコポリマーがあり、無水マレイン酸はコポリマーの少くとも２０モル％を占めている。これらの物質は、通常組成物の０．５〜１０重量％、更に好ましくは０．７５〜８重量％、最も好ましくは１〜６重量％のレベルで用いられる。
【０１７９】
好ましい蛍光増白剤は性質上アニオン性であり、その例は４，４′‐ビス（２‐ジエタノールアミノ‐４‐アニリノ‐ｓ‐トリアジン‐６‐イルアミノ）スチルベン‐２，２′‐ジスルホン酸二ナトリウム、４，４′‐ビス（２‐モルホリノ‐４‐アニリノ‐ｓ‐トリアジン‐６‐イルアミノ）スチルベン‐２，２′‐ジスルホン酸二ナトリウム、４，４′‐ビス（２，４‐ジアニリノ‐ｓ‐トリアジン‐６‐イルアミノ）スチルベン‐２，２′‐ジスルホン酸二ナトリウム、４′，４″‐ビス（２，４‐ジアニリノ‐ｓ‐トリアジン‐６‐イルアミノ）スチルベン‐２‐スルホン酸一ナトリウム、４，４′‐ビス〔２‐アニリノ‐４‐（Ｎ‐メチル‐Ｎ‐２‐ヒドロキシエチルアミノ）‐ｓ‐トリアジン‐６‐イルアミノ〕スチルベン‐２，２′‐ジスルホン酸二ナトリウム、４，４′‐ビス（４‐フェニル‐２，１，３‐トリアゾール‐２‐イル）スチルベン‐２，２′‐ジスルホン酸二ナトリウム、４，４′‐ビス〔２‐アニリノ‐４‐（１‐メチル‐２‐ヒドロキシエチルアミノ）‐ｓ‐トリアジン‐６‐イルアミノ〕スチルベン‐２，２′‐ジスルホン酸二ナトリウム、２‐スチルビル‐４″‐（ナフト‐１′，２′，４，５）‐１，２，３‐トリアゾール‐２″‐スルホン酸ナトリウムおよび４，４′‐ビス（２‐スルホスチリル）ビフェニルである。高度に好ましい増白剤は、ＥＰ７５３５６７で開示された特定の増白剤である。
【０１８０】
他の有用なポリマー物質はポリエチレングリコール、特に分子量１０００〜１００００、更に具体的には２０００〜８０００、最も好ましくは約４０００のものである。これらは０．２０〜５重量％、更に好ましくは０．２５〜２．５％のレベルで用いられる。これらのポリマー、および既に記載されたホモまたはコポリマーポリカルボキシレート塩は、白さ維持、布帛アッシュ付着性(fabric ash deposition) 、および遷移金属不純物の存在下で土、タンパク質および酸化性汚れに対するクリーニング性能を改善する上で有益である。
【０１８１】
本発明の組成物で有用な汚れ放出剤は、慣用的に、様々な配置をとるテレフタル酸とエチレングリコールおよび／またはプロピレングリコール単位とのコポリマーまたはターポリマーである。このようなポリマーの例は、一般譲渡されたＵＳ特許第４１１６８８５号および第４７１１７３０号、および欧州公開特許出願第０，２７２，０３３号明細書で開示されている。ＥＰ‐Ａ‐０，２７２，０３３による特に好ましいポリマーは下記式を有している：
（ＣＨ_３（ＰＥＧ）₄₃）_0.75（ＰＯＨ）_0.25〔（Ｔ‐ＰＯ）_2.8
（Ｔ‐ＰＥＧ）_0.4 〕Ｔ（ＰＯＨ）_0.25（（ＰＥＧ）₄₃ＣＨ_３）_0.75
上記式中ＰＥＧは‐（ＯＣ_２Ｈ_４）Ｏ‐、ＰＯは（ＯＣ_３Ｈ_６Ｏ）、およびＴは（ｐｃＯＣ_６Ｈ_４ＣＯ）である。
【０１８２】
ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコールおよび１，２‐プロパンジオールのランダムコポリマーとして修飾ポリエステルも非常に有用であり、末端基は主にスルホベンゾエート、および二次的にエチレングリコールおよび／またはプロパンジオールのモノエステルからなる。目的はスルホベンゾエート基により両末端でキャップ化されたポリマーを得ることであり、本関係においては“主に”上記コポリマーのほとんどがスルホベンゾエート基で末端キャップ化されている。しかしながら、一部のコポリマーは完全にはキャップ化されておらず、したがってそれらの末端基はエチレングリコールおよび／またはプロパン‐１，２‐ジオールのモノエステルからなっていてもよく、“二次的に”このような種からなる。
本発明で選択されるポリエステルは約４６重量％のジメチルテレフタル酸、約１６重量％のプロパン‐１，２‐ジオール、約１０重量％のエチレングリコール、約１３重量％のジメチルスルホ安息香酸および約１５重量％のスルホイソフタル酸を含んでおり、約３０００の分子量を有する。ポリエステルおよびそれらの製造方法は、ＥＰＡ３１１，３４２で詳細に記載されている。
【０１８３】
水道水中の遊離塩素が洗剤組成物中に含まれた酵素を急速に不活化することは、当業界で周知である。したがって、処方物中に全組成物の０．１重量％以上のレベルでペルボレート、硫酸アンモニウム、亜硫酸ナトリウムまたはポリエチレンイミンのような塩素スカベンジャーを用いたときには、洗剤酵素の改善されたスルー・ザ・ウォッシュ（throuth the wash）安定性を発揮する。塩素スカベンジャーを含む組成物は、１９９２年１月３１日付で出願された欧州特許出願第９２８７００１８．６号明細書で記載されている。
【０１８４】
ポリアクリレートから製造されたようなアルコキシル化ポリカルボキシレートは、追加の脂肪除去性能を発揮させるために本発明では有用である。このような物質は、参考のため本明細書に組み込まれるＷＯ９１／０８２８１およびＰＣＴ９０／０１８１５の第４頁以降で記載されている。化学的に、これらの物質は７〜８つのアクリレート単位毎に１つのエトキシ側鎖を有したポリアクリレートからなる。側鎖は式‐（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３からなり、ここでｍは２〜３、ｎは６〜１２である。側鎖はポリアクリレート“主鎖”にエステル結合されて、“コーム”(comb)ポリマータイプ構造を形成している。分子量は様々であるが、典型的には約２０００〜約５０，０００の範囲内である。このようなアルコキシル化ポリカルボキシレートは、本組成物の約０．０５〜約１０重量％である。
【０１８５】
分散剤
本発明の洗剤組成物は分散剤も含有することができる。適切な水溶性有機塩はホモまたはコポリマー酸、またはそれらの塩であり、そのポリカルボン酸は２以下の炭素原子で互いに離された少くとも２つのカルボキシル基を有している。このタイプのポリマーはＧＢ‐Ａ‐１，５９６，７５６で開示されている。このような塩の例はＭＷ２０００〜５０００のポリアクリレート、およびそれらと無水マレイン酸とのコポリマーであり、このようなコポリマーは１０００〜１００，０００の分子量を有している。
特に、４０００の分子量を有する４８０Ｎのようなアクリレートおよびメチルアクリレートのコポリマーは、組成物の０．５〜２０重量％のレベルで、本発明の洗剤組成物中に加えることができる。
【０１８６】
本発明の組成物はライムソープペプタイザー化合物を含有してもよく、これは８以下、好ましくは７以下、最も好ましくは６以下の下記のようなライムソープ分散力（ＬＳＤＰ）を有していることが好ましい。ライムソープペプタイザー化合物は、好ましくは０〜２０重量％のレベルで存在する。
【０１８７】
ライムソープペプタイザーの有効性の数値尺度はライムソープ分散力（ＬＳＤＰ）により示され、H.C.Borghetty and C.A.Bergman,J.Am.Oil.Chem.Soc.,volume 27,pages 88-90 (1950) の論文で記載されたようなライムソープ分散試験を用いて測定される。このライムソープ分散試験法は当業者に広く用いられており、例えば下記レビュー文献：W.N.Linfield,Surfactant Science Series,Volume 7,p.3 ；W.N.Linfield,Tenside Surf.det.,volume 27,pages 159-161 (1990) ；M.K.Nagarajan,W.F.Masler,Cosmetics and Toiletries,volume 104,pages 71-73(1989) で記載されている。ＬＳＤＰとは、３３３ｐｐｍ ＣａＣｏ_３（Ｃａ：Ｍｇ＝３：２）相当硬度の水３０ｍｌ中でオレイン酸ナトリウム０．０２５ｇにより形成されたライムソープ沈降物を分散させる上で必要な、分散剤対オレイン酸ナトリウムの％重量比のことである。
【０１８８】
良好なライムソープペプタイザー能力を有する界面活性剤には、あるアミンオキシド、ベタイン、スルホベタイン、アルキルエトキシサルフェートおよびエトキシル化アルコールがある。
本発明による使用向けに８以下のＬＳＤＰを有する例示の界面活性剤には、Ｃ₁₆‐Ｃ₁₈ジメチルアミンオキシド、平均エトキシル化度１〜５のＣ₁₂‐Ｃ₁₈アルキルエトキシサルフェート、特にエトキシル化度３のＣ₁₂‐Ｃ₁₅アルキルエトキシサルフェート界面活性剤（ＬＳＤＰ＝４）、およびＢＡＳＦ GmbH から商品名Lutensol A012 およびLutensol A030 で各々販売されている、平均エトキシル化度１２（ＬＳＤＰ＝６）または３０のＣ₁₄‐Ｃ₁₅エトキシル化アルコールがある。
【０１８９】
本発明で使用に適したポリマーライムソープペプタイザーは、Cosmetics and Toiletries,volume 104,pages 71-73 (1989)でみられる、M.K.Nagarajan,W.F.Maslerによる論文で記載されている。
４‐（Ｎ‐オクタノイル‐６‐アミノヘキサノイル）ベンゼンスルホネート、４‐（Ｎ‐ノナノイル‐６‐アミノヘキサノイル）ベンゼンスルホネート、４‐（Ｎ‐デカノイル‐６‐アミノヘキサノイル）ベンゼンスルホネートおよびそれらの混合物のような疎水性ブリーチ；親水性／疎水性ブリーチ処方物と一緒にしたノナノイルオキシベンゼンスルホネートも、ライムソープペプタイザー化合物として使用できる。
【０１９０】
転染阻止
本発明の洗剤組成物は、着色布帛を伴った布帛洗濯操作中に出会う、溶解および懸濁された染料のある布帛から他への転染を阻止するための化合物も含有することができる。
【０１９１】
ポリマー転染阻止剤
本発明による洗剤組成物は、０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜２％、更に好ましくは０．０５〜１％のポリマー転染阻止剤も含む。上記ポリマー転染阻止剤は、着色布帛から洗浄された布帛上への染料の移動を阻止するために、洗剤組成物中に通常配合される。これらのポリマーは、染料が洗浄液中で他の物体と付着するようになる機会をもつ前に、着色布帛から洗い落ちた遊離染料と複合化するかまたはそれを吸着する能力を有している。
特に適切なポリマー転染阻止剤は、ポリアミンＮ‐オキシドポリマー、Ｎ‐ビニルピロリドンおよびＮ‐ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾール、またはそれらの混合物である。
このようなポリマーの添加は、本発明による酵素の性能も高める。
【０１９２】
ａ）ポリアミンＮ‐オキシドポリマー
使用に適したポリアミンＮ‐オキシドポリマーは、下記構造式を有する単位を含んでいる：
【化１２】

上記式中Ｐは重合性単位であり、それにはＲ‐Ｎ‐Ｏ基が結合できるか、またはＲ‐Ｎ‐Ｏ基は重合性単位の一部を形成しているか、または双方の組合せである；
ＡはＮＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｃ＝Ｏ、‐Ｏ‐、‐Ｓ‐、‐Ｎ‐であり、ｘは０または１である；
Ｒは脂肪族、エトキシル化脂肪族、芳香族、ヘテロ環式、脂環式基またはそれらの組合せであり、それにはＮ‐Ｏ基の窒素が結合できるか、またはＮ‐Ｏ基の窒素はこれらの基の一部である。
【０１９３】
Ｎ‐Ｏ基は下記一般構造で表すことができる：
【化１３】

上記式中Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は脂肪族基、芳香族、ヘテロ環式、脂環式基またはそれらの組合せであり、ｘまたは／およびｙまたは／およびｚは０または１であり、そこではＮ‐Ｏ基の窒素が結合しているか、またはＮ‐Ｏ基の窒素がこれらの基の一部を形成している。
【０１９４】
Ｎ‐Ｏ基は重合性単位（Ｐ）の一部でも、ポリマー主鎖に結合しても、または双方の組合せであってもよい。
Ｎ‐Ｏ基が重合性単位の一部を形成している適切なポリアミンＮ‐オキシドには、Ｒが脂肪族、芳香族、脂環式またはヘテロ環式基から選択されるポリアミンＮ‐オキシドがある。
上記ポリアミンＮ‐オキシドの１クラスは、Ｎ‐Ｏ基の窒素がＲ基の一部を形成しているポリアミンＮ‐オキシドのグル−プからなる。好ましいポリアミンＮ‐オキシドは、Ｒがピリジン、ピロール、イミダゾール、ピロリジン、ピペリジン、キノリン、アクリジンおよびそれらの誘導体のようなヘテロ環式基である場合である。
上記ポリアミンＮ‐オキシドのもう１つのクラスは、Ｎ‐Ｏ基の窒素がＲ基に結合されたポリアミンＮ‐オキシドのグル−プからなる。
【０１９５】
他の適切なポリアミンＮ‐オキシドは、Ｎ‐Ｏ基が重合性単位に結合されたポリアミンオキシドである。これらポリアミンＮ‐オキシドの好ましいクラスは、Ｒが芳香族、ヘテロ環式または脂環式基であって、Ｎ‐Ｏ官能基の窒素が上記Ｒ基の一部である、一般式（Ｉ）を有したポリアミンＮ‐オキシドである。これらクラスの例は、Ｒがピリジン、ピロール、イミダゾールおよびそれらの誘導体のようなヘテロ環式化合物である、ポリアミンオキシドである。ポリアミンＮ‐オキシドのもう１つの好ましいクラスは、Ｒが芳香族、ヘテロ環式または脂環式基であって、Ｎ‐Ｏ官能基の窒素が上記Ｒ基に結合されている、一般式（Ｉ）を有したポリアミンオキシドである。これらクラスの例は、Ｒ基がフェニルのような芳香族である、ポリアミンオキシドである。
【０１９６】
いかなるポリマー主鎖も、形成されるアミンオキシドポリマーが水溶性であって、転染阻止性を有しているかぎり、用いてよい。適切なポリマー主鎖の例は、ポリビニル、ポリアルキレン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアミド、ポリイミド、ポリアクリレートおよびそれらの混合物である。
【０１９７】
本発明のアミンＮ‐オキシドポリマーは、典型的には１０：１〜１：１００００００のアミン対アミンＮ‐オキシドの比率を有している。しかしながら、ポリアミンオキシドポリマー中に存在するアミンオキシド基の量は、適切な共重合によるか、または適度のＮ‐オキシド化によって変えることができる。好ましくは、アミン対アミンＮ‐オキシドの比率は２：３〜１：１００００００、更に好ましくは１：４〜１：１００００００、最も好ましくは１：７〜１：１００００００である。本発明のポリマーには、１つのモノマータイプがアミンＮ‐オキシドであって、他のモノマータイプがアミンＮ‐オキシドであるかまたはそうでない、ランダムまたはブロックコポリマーを現実には含んでいる。ポリアミンＮ‐オキシドのアミンオキシド単位はｐＫａ＜１０、好ましくはｐＫａ＜７、更に好ましくはｐＫａ＜６を有する。
ポリアミンオキシドはほぼあらゆる重合度で得ることができる。重合度は、物質が望ましい水溶性および染料懸濁力を有していれば、重要でない。
典型的には、平均分子量は５００〜１，０００，０００、好ましくは１０００〜５０，０００、更に好ましくは２０００〜３０，０００、最も好ましくは３０００〜２０，０００の範囲内である。
【０１９８】
ｂ）Ｎ‐ビニルピロリドンおよびＮ‐ビニルイミダゾールのコポリマー
本発明で用いられるＮ‐ビニルイミダゾール Ｎ‐ビニルピロリドンポリマーは、５０００〜１，０００，０００、好ましくは５０００〜２００，０００の平均分子量範囲を有する。
本発明による洗剤組成物で使用上高度に好ましいポリマーは、Ｎ‐ビニルイミダゾール Ｎ‐ビニルピロリドンコポリマーから選択されるポリマーであり、そのポリマーは５０００〜５０，０００、更に好ましくは８０００〜３０，０００、最も好ましくは１０，０００〜２０，０００の平均分子量範囲を有する。平均分子量範囲は、Barth H.G.and Mays J.W.,Chemical Analysis,Vol.113,"Modern Methods of Polymer Characterization"で記載されているような光散乱により調べた。高度に好ましいＮ‐ビニルイミダゾール Ｎ‐ビニルピロリドンコポリマーは５０００〜５０，０００、更に好ましくは８０００〜３０，０００、最も好ましくは１０，０００〜２０，０００の平均分子量範囲を有する。
【０１９９】
上記の平均分子量範囲を有することで特徴づけられるＮ‐ビニルイミダゾール Ｎ‐ビニルピロリドンコポリマーは優れた転染阻止性を発揮しながら、それで処方された洗剤組成物のクリーニング性能に悪影響を与えない。
本発明のＮ‐ビニルイミダゾール Ｎ‐ビニルピロリドンコポリマーは、１：０．２、更に好ましくは０．８：０．３、最も好ましくは０．６：０．４のＮ‐ビニルイミダゾール対Ｎ‐ビニルピロリドンのモル比を有している。
【０２００】
ｃ）ポリビニルピロリドン
本発明の洗剤組成物では、約２５００〜約４００，０００、好ましくは約５０００〜約２００，０００、更に好ましくは約５０００〜約５０，０００、最も好ましくは約５０００〜約１５，０００の平均分子量を有するポリビニルピロリドン（“ＰＶＰ”）も利用してよい。適切なポリビニルピロリドンは、製品名ＰＶＰ Ｋ‐１５（１０，０００の粘度分子量）、ＰＶＰ Ｋ‐３０（４０，０００の平均分子量）、ＰＶＰ Ｋ‐６０（１６０，０００の平均分子量）およびＰＶＰ Ｋ‐９０（３６０，０００の平均分子量）として、ＩＳＰ Corporation,New York,NY and Montreal,Canadaから市販されている。ＢＡＳＦ Cooperationから市販されている他の適切なポリビニルピロリドンには、Sokalan ＨＰ１６５およびSokalan ＨＰ１２；洗剤業者に知られているポリビニルピロリドン（例えばＥＰ‐Ａ‐２６２，８９７およびＥＰ‐Ａ‐２５６，６９６参照）がある。
【０２０１】
ｄ）ポリビニルオキサゾリドン
本発明の洗剤組成物では、ポリマー転染阻止剤としてポリビニルオキサゾリドンも利用してよい。上記のポリビニルオキサゾリドンは、約２５００〜約４００，０００、好ましくは約５０００〜約２００，０００、更に好ましくは約５０００〜約５０，０００、最も好ましくは約５０００〜約１５，０００の平均分子量を有している。
【０２０２】
ｅ）ポリビニルイミダゾール
本発明の洗剤組成物では、ポリマー転染阻止剤としてポリビニルイミダゾールも利用してよい。上記のポリビニルイミダゾールは、約２５００〜約４００，０００、好ましくは約５０００〜約２００，０００、更に好ましくは約５０００〜約５０，０００、最も好ましくは約５０００〜約１５，０００の平均分子量を有している。
【０２０３】
ｆ）架橋ポリマー
架橋ポリマーは主鎖がある程度まで連結されたポリマーであり、これらのリンクは化学的でもまたは物理的性質であってもよく、可能性として活性基は主鎖上でもまたは側鎖上でもよく、架橋ポリマーはJournal of Polymer Science,volume 22,pages 1035-1039で記載されている。一態様において、架橋ポリマーは三次元硬質構造を形成するように作られ、三次元構造により形成された孔に染料を捕捉しうる。もう１つの態様では、架橋ポリマーは膨潤により染料を捕捉する。このような架橋ポリマーは同時係属特許出願第９４８７０２１３．９号明細書で記載されている。
【０２０４】
洗浄方法
本発明の組成物は、浸漬法、前処理法、別のすすぎ補助組成物を加えてもよいすすぎステップを伴う方法を含めて、本質的にいかなる洗浄またはクリーニング方法で用いてもよい。
本明細書で記載されたプロセスは常法で布帛、食器またはいずれか他の硬質表面をクリーニング液と接触させることからなり、以下で例示されている。
本発明のプロセスは、便宜上クリーニングプロセスの過程で行われる。クリーニングの方法は、好ましくは５〜９５℃、特に１０〜６０℃で行われる。処理溶液のｐＨは、好ましくは７〜１２である。
【０２０５】
好ましい機械皿洗い法は、有効量の機械皿洗いまたはすすぎ組成物を溶解または分散させた水性液体で、汚れた物体を処理することからなる。機械皿洗い組成物の慣用的な有効量とは、３〜１０Ｌの洗浄容量中に溶解または分散される製品８〜６０ｇを意味する。手による皿洗い法によると、汚れた皿は典型的には０．５〜２０ｇ（皿２５枚の処理当たり）の有効量の皿洗い組成物と接触させる。好ましい手による皿洗い法には、皿の表面への濃縮液の適用、または洗剤組成物の多量の希釈液への浸漬がある。
【０２０６】
下記例は本発明の組成物を例示するための意味であり、必ずしも本発明の範囲を制限したりまたは限定するような意味ではない。
【０２０７】
洗剤組成物において、酵素のレベルは全組成物の重量により純粋酵素で表示されており、別記されないかぎり、洗剤成分は全組成物の重量で表示されている。
略記された成分表示は下記意味を有している：

【０２０８】

【０２０９】

【０２１０】

【０２１１】

【０２１２】

【０２１３】

【０２１４】

【０２１５】

【０２１６】

【０２１７】

水およびその他
【０２１８】

水およびその他
【０２１９】

水およびその他
【０２２０】

水およびその他
【０２２１】

【０２２２】

【０２２３】

【０２２４】

【０２２５】

【０２２６】

【０２２７】

【０２２８】

^＊Ｎａ４エチレンジアミン二酢酸
^**ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル
【０２２９】

Claims (9)

1. 界面活性剤、漂白剤、ビルダーおよびそれらの混合物からなる群より選択される洗剤成分、全組成物の０．００１〜２重量％のプロテアーゼ酵素、および、下記の（ｉ）〜（ix）からなる群より選択される全組成物の０．０００１〜２重量％のマンナナーゼ酵素を含んでなる洗剤組成物：
   （ｉ）Bacillus agaradherens ＮＣＩＭＢ４０４８２により産生されるポリペプチド ；
   （ii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の３２‐３４２位で示されたようなアミノ酸配列を含 んだポリペプチド；
   （iii)マンナナーゼ活性を有して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド９７‐ヌ クレオチド１０２９で示されたようなヌクレオチドの配列を含んだポリペプチ ドについてコードしているポリヌクレオチド分子；
   （iv）（iii）の種ホモログ；
   （ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２でアミノ酸残基３２‐アミノ酸残基３４３のアミノ酸 配列と少くとも７０％同一である、マンナナーゼ活性を有したポリペプチドに ついてコードしているポリヌクレオチド分子；
   （vi）Bacillus subtilisis 株１６８由来のマンナナーゼであり、そのマンナナーゼ は
   ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されたＤＮＡ配列のコード部分またはその配 列のアナログによりコードされている；または
   ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されたようなアミノ酸配列を含んだポリペプ チドである；
   （vii)マンナナーゼ活性を有して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されたようなヌクレ オチドの配列を含んだポリペプチドについてコードしているポリヌクレオチド 分子；
   （viii)（Vii）の種ホモログ；および
   （ix）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列と少くとも７０％同一である、マンナ ナーゼ活性を有したポリペプチドについてコードしているポリヌクレオチド分 子。
2. マンナナーゼがBacillus agaradherens由来である、請求項１に記載の洗剤組成物。
3. プロテアーゼが、ＩＵＰＡＣ分類ＥＣ3.4.からのプロテアーゼである、請求項１に記載の洗剤組成物。
4. プロテアーゼが、ＩＵＰＡＣ分類ＥＣ3.4.21.からのエンド‐セリンプロテアーゼである、請求項３に記載の洗剤組成物。
5. プロテアーゼが、ＩＵＰＡＣ分類ＥＣ3.4.21.62 からのズブチリシンプロテアーゼ、およびその変種である、請求項４に記載の洗剤組成物。
6. 洗剤成分が、アニオン性、ノニオン性、カチオン性界面活性剤およびそれらの混合物からなる群より選択される界面活性剤である、請求項１に記載の洗剤組成物。
7. 洗剤成分が、漂白剤である、請求項１に記載の洗剤組成物。
8. 洗剤成分が、ビルダーである、請求項１に記載の洗剤組成物。
9. ビルダーが、ゼオライト、ナトリウム積層シリケート、トリポリリン酸ナトリウムおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項８に記載の洗剤組成物。