FI109921B - Menetelmä ja entsyymivalmiste prosessiteollisuuteen - Google Patents

Description

109921

Menetelmä ja entsyymivalmiste prosessiteollisuuteen 5 Esillä olevan keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 johdannon mukainen menetelmä mikrobipolysakkaridien hajottamiseksi.

Keksintö koskee myös patenttivaatimuksen 13 johdannon mukaista menetelmää monosakkaridien tai oligosakkaridien valmistamiseksi.

10

Keksinnön kohteena on lisäksi patenttivaatimuksen 17 johdannon mukainen menetelmä mikrobipolysakkarideja sisältävien limakeräymien käsittelemiseksi.

Keksinnön kohteena on myös entsyymivalmiste käytettäväksi mikrobipolysakkaridien 15 hajottamiseen prosessiteollisuudessa kuten vaatimuksen 33 johdannossa on määriteltyjä entsyymivalmiste käytettäväksi mono- tai oligosakkaridien valmistuksessa patenttivaatimuksen 35 johdannon mukaisesti.

Mikrobien aiheuttamien kerrostumien eli biofilmien muodostuminen erilaisiin pinta- 20 materiaaleihin on yleinen ongelma prosessiteollisuudessa. Bakteerien yleinen taipumus kasvaa biofilmeissä kiinnittyneenä pintoihin johtaa limakerrostumien muodostumiseen , · | · ’ erityisesti paperikoneympäristössä. Paperikoneet tarj oavat erinomaiset kasvuolosuhteet • · · • · ·. mikrobeille, koska biofilmit mahdollistavat mikrobien kasvun siellä tavattavissa vähära- • · : vinteisissanestevirtauksissa.

• · · 25 . : 1. Biofilmit koostuvat yleensä mikrobien sekapopulaatioista, mikrobien tuottamista polymee reistä puukuidun ja epäorgaanisen materiaalin lisäksi. Mikrobipolysakkaridit ovat oleel-•: · · Unen biofilmien rakenneosa. Biofilmien sisältämien mikrobien tuottamat polysakkaridit •' 1 ’: sitovat mikrobisolut pinnoille ja biofilmiin saostuneisiin liukenemattomiin aineksiin ja • · · . 1 · ·, 30 muodostuu mikrobeista, saostuneista aineksista (mm. kuiduista) ja polysakkarideista ....: koostuva matriisi, joka puolestaan suojaa mikrobisoluja, stabiloi biofilmiä, lisää sen • · · · 2 1099 2 Ί viskositeettia ja suojaa biofilmiä kuivumiselta. Kuituhiilihydraatit muodostavat usein biofilmin hiilihydraattien pääfraktion. Kohonneet määrät bakteerien heteropolysakkari-deille tyypillisiä sokereita ilmaisevat bakteeripolysakkaridien läsnäolon limakerrostumissa.

5 Paperikoneympäristöön kulkeutuu jatkuvasti bakteereita raaka-aineiden (vesi, kuidut, erityisesti mekaaninen massa ja kierrätyskuitu) ja paperinvalmistuksessa käytettävien kemikaalien mukana. Paperikoneympäristö on suotuisa mikrobien kasvulle sopivan lämpötilan takia (30-50°C) ja pH:n (4-10) takia ja siksi, että läsnä on ravinteita, jotka virtaavat paperikoneelle massan ja paperikemikaalien mukana. Tämän takia paperikoneilla 10 on aina mikrobeita. Väisäsen et ai. (1998) tutkimusten mukaan paperikoneen märkäpään yleisimpiä mikrobeita olivat Bacillus coagulans ja muut BacillusAapt, Burkholderia cepacia, Ralstonia pickettii. Paperikemikaalit sisälsivät Aureobacterium, B. cereus, B. licheniformis, B. sphaericus, Bordetella, Hydrogenophaga, Klebsiella pneumoniae,

Pantoea agglomerans, Pseudomonas stuzeri, StaphylococcusAajeja. Vaaleanpunaisissa 15 limoissa, jotka akkumuloituivat viiran alueella ja painosektorilla yleisimpiä bakteereita olivat Deinococcus-, Aureobacterium- ja BrevibacteriumAajit. 91 kannan 131 tutkitusta kannasta todettiin hajottavan paperinteon raaka-aineita. Värillisiä limoja muodostivat Deinococcus, Acinetobacter, ja Methylobacterium (vaaleanpunaninen), Aureobacterium, Pantoea ja Ralstonia (kellertävä) ja Microbulbifer-sxxkaiset kannat (ruskea).

·.·. 20 • · '/ Biofilmit aiheuttavat prosessiteollisuudessa monenlaista haittaa mm. virtausnopeuksien • · ·. alenemista, putkistoj en tukkiutumista, korroosiota j a energian kulutuksen lisääntymistä.

• · · . ·. : Paperikoneilla mikrobikasaumat voivat lisäksi aiheuttaa paperin reikiintymistä, ratakatkoja . ·: *. tai heikentää vedenpoistoa. Veden käytön vähentäminen paperinvalmistuksessa on lisännyt .': *. 25 kiertoveden ravinnepitoisuuksia ja näin myös edellytykset biofilmin muodostumiseen ovat lisääntyneet. Biofilmien bakteerit ovat resistentimpiä paperikoneilla yleisesti käytettäville : ‘ · antimikrobisille aineille kuin vapaina elävät solut. Limakerrostumat toimivat jatkuvana • ’": infektiolähteenä, siirtäen kontaminoivia organismeja kiertoveteen ja jopa lopulliseen , ·. ·. tuotteeseen. Lisäksi monet myös biofilmeissä tavattavat mikro-organismit hajottavat . · · ·. 30 paperimateriaaleja kuten selluloosakuituja, tärkkelystä, kaseiinia ja liimahartseja tai ne voivat aiheuttaa tuotteen laadun huonontumista tuottamalla siihen hajuja, makuja, ei-_ 1^ toivottua värjäytymistä ja mikrobiologista kontaminaatiota.

Paperikoneilla Ilmaongelma on yritetty ratkaista käyttämällä erilaisia mikrobeille 109921 3 myrkyllisiä aineita eli biosideja yhdessä dispergointiaineiden kanssa ja etsimällä sopiva biosidiyhdistelmä konekohtaisesti. Monien biosidien käyttöä tullaan kuitenkin lähitulevaisuudessa huomattavasti rajoittamaan niiden toksisuuden takia, joten paperikoneiden lima-ja mikrobiongelmiin pitäisi löytyä jokin vaihtoehtoinen ratkaisu.

5

Biofilmejä hajottavia entsyymejä on ehdotettu korvaamaan tai lisäämään konventionaalisten biosidien vaikutusta. Levanaasientsyymin on joissain tapauksissa todettu toimivan kerrostumien kontrolloimisessa. Sen vaikutus on kuitenkin rajoittunut fruktoosipolymeeri levaaniin, joka on useimmiten hyvin vähäinen komponentti paperikoneiden biofilmeissä.

10

Paperikoneiden Ilmaongelmaa on yritetty ratkaista myös käyttämällä kaupallisesti saatavissa olevia entsyymejä erilaisina yhdistelminä, jotka on optimoitu biofilmikokeilla tapauskohtaisesti. Nykyisin käytössä olevilla entsymaattisilla menetelmillä ei ole kuitenkaan pystytty tyydyttävästi ratkaisemaan paperikoneiden Ilmaongelmaa.

15 Rättö ym (1998) ovat analysoineet paperikoneen limakeräymien hiilihydraattikoostu-muksia ja proteiini- ja tuhkapitoisuuksia. Näytteet sisälsivät mikrobiologisia ja kemiallisia keräymiä, joissa oli mikrobeita ja mikrobipolysakkarideja massan kuitujen ja epäorgaanisten yhdisteiden lisäksi. Puusta peräisin olevat hiilihydraatit, selluloosa ja ksylaani, olivat . 20 keräymien hiilihydraattien pääkomponentit. Kohonneet määrät arabinoosia, galaktoosia, • « ! iI; * mannoosia, ramnoosia tai fruktoosia kuvasivat bakteeripolysakkaridien läsnäoloa ··_ keräymissä.

• * * • · * , ·: ·. Buchert ym (1998) ja Rättö ym (1998) ovat eristäneet näytteitä paperikoneen lima- ♦ 25 keräymistä ja eristäneet niistä runsaasti limaa tuottavia mikrobikantoja. Tällöin on todettu

Klebsiella pneumoniae - lajin olevan yleinen. Klebsiella-lajien todettiin tuottavan hetero-: polysakkarideja, joissa oli erilaisia määriä neutraalisokereita ja uronihappoja, kuten · '. galaktoosi, glukoosi, mannoosi ja galakturonihappo. Eristettyjä bakteeripolysakkarideja , *, *, käytettiin polysakkarideja hajottamaan kykenevien mikrobikantojen löytämiseksi maa- ja • > · . · · . 30 kompostinäytteistä. Erään K. pneumoniae-kannan polysakkaridin avulla rikastetun seka- • · ,', viljelmän kasvuliuos oli aktiivinen joidenkin K. pneumoniae-kantojen tuottamia poly- * » « t * » M sakkarideja vastaan. Biofilmikokeissa soluvapaa entsyymipreparaatti, joka oli valmistettu sekaviljelmän soluista sonikoimalla inhiboi soluaggregaatteja sisältävän matriisin muodostumista teräslevyissä.

4 109921

Edellämainituissa julkaisuissa ei ole kuvattu paperikoneilta eristettyjen mikrobien tuottamien polysakkaridien puhdistusta eikä karakterisointia. Maa-ja kompostinäytteistä eristettyjen mikrobisekaviljelmien tuottaman tai tuottamien entsyymien eristystä ja karak-5 terisointia ei ole myöskään kuvattu em julkaisuissa. Entsyymin tai entsyymien toimintatapaa ei ole kuvattu. Tekniikan tason mukaisissa julkaisuissa ei ole kuvattu hyvin toimivaa ratkaisua paperikoneilla tai muussa prosessiteollisuudessa esiintyvään Ilmaongelmaan eikä kaupallisesti ole saatavissa tuotetta, jota voitaisiin käyttää Ilmaongelman ratkaisemiseen.

10 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa tunnetun tekniikan epäkohdat ja saada aikaan uudenlainen menetelmä hajottaa polysakkarideja. Erityisesti keksinnön tarkoituksena on esitellä entsyymi, jolla on endo-p-l,2-galaktanaasi-aktiivisuutta. Tällaista entsyymiaktiivisuutta ei tietääksemme ole aiemmin kuvattu.

15 Täsmällisemmin sanottuna keksinnön kohteena on menetelmä mikrobipolysakkaridien hajottamiseksi entsyymivalmisteen avulla, jolle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Keksinnön mukaisesti endo-P-l,2-galaktanaasi-entsyymiä sisältävää entsyymivalmistetta 20 voidaan käyttää pilkkomaan polysakkarideja, joissa on kaksi monosakkaridiyksikköä, joiden välissä on p-l,2-sidos, jolloin toinen monosakkarideista on galaktoosi ja toinen on :joko galaktoosi, galakturonihappo, glukuronihappo, mannoosi, glukoosi, arabinoosi, . “ksyloosi tai ramnoosi. Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti entsyymiä : \: käytetään haj ottamaan polysakkaridej a, j ossa β -1,2-sidos on galaktoosin j a galakt- • · · V · 25 uronihapon välillä.

• · · * · * * · »

Keksinnön mukaista entsyymivalmistetta voidaan käyttää erilaisten mono- tai oligo-* : sakkaridien valmistamiseen. Täsmällisemmin ilmaistuna keksintö kohdistuu siten •..' menetelmään mono- tai oligosakkaridien valmistamiseksi patenttivaatimuksen 13 : .· 30 tunnusmerkkiosan mukaisesti. Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaa "' ’: mono- tai oligosakkarideja hydrolysoimalla entsymaattisesti mikrobipolysakkarideja.

. ‘. : Tiettyjä oligosakkarideja voidaan mahdollisesti käyttää esimerkiksi probiootteina.

Erityisen merkittävä sovellus on keksinnön mukaisen entsyymivalmisteen käyttö 5 109921

S

( ! limakeräymien hajottamiseen erilaisissa ympäristöissä. Täsmällisemmin sanottuna keksinnön kohteena on siten menetelmä mikrobipolysakkarideja sisältävien limakeräymien käsittelemiseksi patenttivaatimuksen 17 tunnusmerkkiosan mukaisesti. Εηάο-β-1,2-5 galaktanaasia sisältävän entsyymivalmisteen avulla voidaan hajottaa prosessiteollisuudessa esiintyviä biofilmejä ja muita limakeräymiä. Bakteeripolysakkarideja esiintyy paperikoneympäristöissä, mutta myös muussa prosessiteollisuudessa kuten elintarviketeollisuudessa. Bakteeripolysakkarideja sisältäviä limakeräymiä on myös esimerkiksi puhdasvesi-ja viemäriputkistoissa. Erityisen edullista on endo-P-1,2-10 galaktanaasia sisältävän entsyymivalmisteen käyttö Ilmaongelman ratkaisemiseen paperikoneilla.

Prosessiteollisuudessa käytettävälle entsyymivalmisteelle on tunnusomaista se, mikä on määritelty patenttivaatimuksen 33 tunnusmerkkiosassa ja mono- tai oligosakkaridien 15 valmistuksessa käytettävälle entsyymivalmisteelle on tunnusomaista se, mikä on määritelty patenttivaatimuksen 35 tunnusmerkkiosassa.

Keksinnön mukaista entsyymivalmistetta on edullista käyttää yhdessä muita entsyymi-aktiivisuuksia sisältävien entsyymivalmisteiden kanssa. Tällaisia entsyymiaktiivisuuksia 20 ovat esimerkiksi proteaasi, β-glukanaasi, mannanaasi, kitinääsi, lysotsyymi, hemisellulaasi, . :': pektinaasi, lipaasi ja levanaasi, joita sisältäviä entsyymipreparaatteja on kaupallisesti : * ·': saatavissa. Sopiva entsyymiyhdistelmä valitaan käyttökohteen mukaisesti.

: *.: Keksinnöstä on monessa suhteessa hyötyä etenkin prosessiteollisuudessa. Virtausno- • · » ' · : 25 peuksia voidaan lisätä, putkistojen tukkiutumisriski pienenee, korroosiota ilmenee vähem- • · » v ·* mänja energiankulutusta voidaan pienentää. Paperikoneilla liman vähentäminen vähentää ratakatkoja ja parantaa vedenpoistoa. Paperin pilaantumista reikiintymisen takia tapahtuu " · ‘' · vähemmän ja mikrobien kulkeutuminen lopputuotteen mukana sen loppukäyttäjälle tai ... · kuluttaj alle vähenee.

: 30 "' ” Endo-β-1,2- galaktanaasia voitaisiin käyttää puhdasvesi- ja viemäriputkistojen » · 109921 6 I puhtaanapitämiseen mahdollisesti yhdessä muiden entsyymiaktiivisuuksien ja/ tai i kemikaalien kanssa.

Koska endo-p-galaktanaasientsyymiä ei ole aiemmin kuvattu, keksinnön mukainen endo-5 β-galaktanaasi entsyymin käyttö mono- ja oligosakkaridien valmistuksessa mahdollistaa uuden tavan tiettyjen oligosakkaridien tai sokereiden valmistamiseksi.

Talletustiedot 10 Klebsiella pneumoniae VTT-E-97860 talletettiin 28 syyskuuta, 1999 Budapestin sopimuksen mukaisesti Budapestin sopimuksen mukaiseen talletuslaitokseen DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, osoite: Mascheroderweg 1 b, D-38124 Braunschweig, Saksa ja se sai talletusnumeron DSM 13058.

15 Keksintöä selitetään tarkemmin seuraavan yksityiskohtaisen kuvauksen avulla ja viittaamalla kokeellisiin esimerkkeihin.

Termillä "polysakkaridi" tarkoitetaan monosakkaridimolekyylien muodostamia useiden (yli 20) yksiköiden muodostamia suuria molekyylejä. Oligosakkarideilla tarkoitetaan . . 20 muutaman (2 - 20) sokeriyksikön muodostamia ketjuja. Tämän keksinnön mukaisella • · polysakkaridilla tarkoitetaan erityisesti sellaista polysakkaridia, joka sisältää kaksi < $ · ί·.# monosakkaridia ja niiden välillä P-l,2-sidoksen, jolloin toinen monosakkarideista on • · · . ·, : galaktoosi ja toinen galaktoosi, galakturonihappo, glukuronihappo, mannoosi, glukoosi,

A AA

. : ·. arabinoosi, ksyloosi tai ramnoosi. Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti

• A A

25 polysakkaridilla tarkoitetaan tässä keksinnössä polysakkaridia, joka sisältää P-l,2-sidoksen

A

galaktoosin ja galakturonihapon välillä.

A ·

A AA

• ” ]: Tässä keksinnössä kuvattu entsyymiaktiivisuus on rikastettu maa -ja kompostinäytteistä . y. polysakkaridin avulla, joka koostuu oligosakkaridiyksiköistä, jotka sisältävät galakt- .'' *. 30 uronihapon, kaksi mannoosia ja galaktoosin, sekä sivuketjuna mannoosin, johon on . *. _ sitoutuneena asetaalimuodossa oleva palorypälehappo ja jossa galaktoosin ja galakt-

»AA

, · · ·. uronihapon välillä on β-l ,2-sidos. Polysakkaridin rakenne on siten seuraava:

• A

I 1G9921 j 7 -2)-a-D-GalpA-( 1 ->3)-cc-D-Manp-( 1 ->2)-a-D-Manp-( 1 ->3)-p-D-Galp-( 1 -» / a-D-Manp-(l-»4) 4 6 5 \/ c /\ h3c cooh 10 Polysakkaridi on tuotettu Klebsiella pneumoniae-kannalla VTT-E-97860 joka on talletettu DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen - kantakokoelmaan 28. syyskuuta 1999, talletusnumerolla DSM 13058. Polysakkaridia voidaan tuottaa K. pneumoniae- kannan avulla kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Muutkin Klebsiella pneumoniae-karmat kykenevät tuottamaan vastaavaa polysakkaridia. Esimerkiksi Dutton ja 15 Parolis (1986) ovat kuvanneet rakenteeltaan samanlaisen polysakkaridin Klebsiellan serotyypillä 3.

Keksintö ei kuitenkaan rajoitu edellämainitun Klebsiella pneumonie-karman, tai -Klebsiella pneumoniae-lapn tuottamaan polysakkaridiin ja sen käyttöön endo-β-1,2-galaktanaasia . . 20 tuottavien mikro-organismien rikastamiseen, vaan endo-β-1,2-galaktanaasia tuottavia • ·:: > mikro-organismeja voidaan rikastaa muistakin mikrobeista peräisin olevien polysakkari- • · ·. dien avulla, kunhan polysakkaridien rakenne on sellainen, että niissä on kaksi mono- .·. : sakkaridia ja niiden välillä β-l,2-sidos, jolloin toinen monosakkarideista on galaktoosi ja ;: toinen galaktoosi, galakturonihappo, glukuronihappo, mannoosi, glukoosi, arabinoosi, 25 ksyloosi tai ramnoosi, edullisesti polysakkaridin avulla, jossa β-1,2-sidos on galaktoosin ja galkturonihapon välillä. Vastaavasti keksinnön mukainen entsyymi kykenee hajottamaan • · y. j erilaisissa ympäristöissä olevia polysakkarideja, joissa on mainittu rakenne.

» : Y: Polysakkaridi voidaan keksinnön mukaisesti eristää paperikoneen limakeräymistä eris- : ” ’: 30 tetyistä runsaasti limaa tuottavista bakteerikannoista. Keksinnön edullisen suoritusmuodon , · * ·, mukaisesti polysakkaridi eristetään Klebsiella pneumoniae-kanto']en kasvuliuoksista, koska . · · ·, näiden bakteerien todettiin tässä keksinnössä olevan yleisiä runsaasti limaa tuottavien • » bakteerien joukossa.

109921 8

Keksinnön taustana olevissa tutkimuksissa kantojen kykyä tuottaa polysakkarideja tarkasteltiin maljalevityksin. Tällöin todettiin, että sakkaroosia sisältävällä alustalla, jota käytetään yleisesti limaa tuottavien bakteerien seulomiseen, saatiin eristetyksi pääasiassa fruktoosista koostuvan polymeerin, levaanin tuottajia. Levaanin muodostumisen välttä-5 miseksi jatkossa seulonta-alustan hiilenlähteeksi valittiin glukoosi. Alustavassa seulonnassa valituilla, maljoilla limaisina pesäkkeinä kasvavilla kannoilla tuotettiin edelleen polysakkarideja ravistelukasvatuksin liuosviljelmissä. Polysakkaridin tuottoa liuos-viljelmissä seurattiin mittaamalla alustan viskositeettia tai saostamalla muodostunut polysakkaridi kasvuliuoksesta.

10

Jatkokokeisiin valitut polysakkaridin tuottokannat identifioitiin.Osoittautui, että monet paperikonelimanäytteistä eristetyt polysakkaridintuottajat edustivat aiemmin kuvaa-! mattomia bakteerilajeja. Seulonnassa löytyi useita polysakkarideja tuottavia Klebsiella pneumoniae -kantoja. Kun eri paperikoneilta eristettyjä K. pneumoniae -kantoja verrattiin 15 keskenään niille tehdyn ribotyypityksen perusteella, jokainen tutkittu kanta oli ihotyypiltään erilainen.

Polysakkarideja tuotettiin ravistelukasvatuksissa erilaisilla alustoilla. Varsinkin alustan hiilenlähteellä ja typpipitoisuudella oli vaikutusta polysakkaridien muodostumiseen. Kun 20 hiilenlähteenä käytettiin sakkaroosia, useat tutkitut kannat tuottivat levaania. Muiden kuin * · • # ‘ levanaasientsyymin eristämiseksi tuottoalustaksi valittiin jatkossa typpirajoitteinen glu- « » 1 • · !.. koosialusta, jolla tuotetut polysakkaridit olivat erilaisia heteropolysakkarideja. Polysak- karidit eristettiin kasvuliuoksista etanolisaostuksella. Saostetut polysakkaridit liuotettiin t ·’; · [ veteen ja käsiteltiin proteaasilla (Neutrase, Novo) mahdollisten proteiinijäämien poistami- • · · . ·: ·. 25 seksi ja saostettiin uudelleen. Saostuksen jälkeen osa näytteistä sisälsi runsaasti fosfaatteja. Suolojen poistamiseksi näytteitä dialysoitiin. Lopuksi polysakkaridit kylmäkuivattiin.

• · « · « • · . 1 1 1. Jatkotutkimuksiin valittiin runsaasti limaa tuottava Klebsiella pneumoniae -lajin kanta ,(VTT-E-97860). K. pneumoniaen kasvuliuoksesta eristettiin polysakkaridi konsentroi- t 1 · ’, 30 maila, ultrasuodattamalla ja saostamalla kuten on kuvattu esimerkissä 1. Epäpuhtauksien • · saostamiseksi konsentroitu polysakkaridiliuos lämpökäsiteltiin, jolloin epäpuhtauksia • » · ;,; saostui ja liuoksen viskositeetti laski. Viskositeetin lasku mahdollisti edelleenkonsen- 1 ’ troinnin, jonka jälkeen polysakkaridi saostettiin etanolilla.

! 109921 9

Polysakkaridin rakenne määritettiin NMR-tekniikalla. Entsymaattisesti hydrolysoitujen näytteiden spektrien perusteella polysakkaridin rakenne voitiin selvittää. Kuten yllä on mainittu, rakenteeltaan samanlainen kapselipolysakkaridi on aikaisemmin kuvattu K. pneumoniae serotyypillä K3 (Dutton ja Parolis,1986). Tämän polysakkaridin esiintymistä 5 prosessiteollisuuden biofilmeissä ei ole kuitenkaan aikaisemmin raportoitu eikä tätä polysakkaridia hajottavaa entsyymiä ole eristetty eikä karakterisoitu.

Limapolysakkarideja hajottavien entsyymien löytämiseksi ja eristämiseksi maa-ja kompostinäytteistä sekä puhtaiden kantojen että sekaviljelmien kykyä hajottaa poly-10 sakkarideja tutkittiin entsyymien tuottokokeissa. Entsyymejä tuottavien kantojen seulonnat tehtiin mikrotiitterilevy- tai koeputkikasvatuksina ravintoalustalla, jossa tutkittava polysakkaridi oli ainoana hiilenlähteenä. Seulottavien kantojen kykyä hajottaa polysakkaridia selvitettiin mm. seuraamalla kasvatusliuoksen sameutta ja sen viskositeetissa tapahtuvia muutoksia.

15

Seulontoihin valittiin aluksi hakijan omasta kantakokoelmasta erilaisia paperikonelimoista, paperikoneilta tai tehtailta eristettyjä bakteereita sekä bakteereja, joiden tiedettiin tuottavan erilaisia polysakkarideja hajottavia entsyymejä. Seulonnassa löytyi useita bakteereja, jotka pystyivät käyttämään B. licheniformis ja P. fluorescens -kannoilla sakkaroosialustalla tuo-20 tettuja fruktoosipolymeerejä (levääni) ainoana hiilenlähteenä. Hydrolyysikokeilla varmis- • · • · "), * tettiin, että näiden kantojen kasvuliuokset sisälsivät entsyymiaktiivisuutta, joka hydrolysoi ;,, e.m. levaanipolysakkarideja ja kaupallista levaania tuottaen hydrolyysituotteena fruktoosia.

!* *. Mikään tähän seulontaan valituista bakteereista ei pystynyt hajottamaan K. pneumoniae t/ kantojen VTT-E-84211 ja VTT-E-97860 polysakkaridia.

• » · 25 • · ·

Koska tutkitut kokoelmakannat eivät tuottaneet K7eZwze//a-polysakkarideja hajottavaa , ·. entsyymiä, jatkettiin entsyymiä tuottavien kantojen seulontoja rikastamalla tehdas- ja . * ’ ·. luonnonnäytteistä sekavilj elmiä, j otka pystyivät käyttämään eristettyj ä heteropolysak- karideja ainoana hiilenlähteenä. Viljelmien kykyä hajottaa polysakkaridia seurattiin t » * t..! _ 30 nestemäisellä alustalla viskositeetissa tapahtuvien muutosten perusteella. Tämä seulon tamenetelmä osoittautui toimivaksi.

» | *

• I

’ ‘ * Multa- ja kompostinäytteistä eristettiin heteropolysakkarideja hajottavia sekavilj elmiä.

Näitä viljelmiä ylläpidettiin alustoilla, joissa bakteeripolysakkaridi oli ainoana hiilen- 10 109921 lähteenä, sillä muita hiilihydraatteja sisältävillä alustoilla viljelmät menettivät nopeasti halutun ominaisuutensa tarkemmin tuntemattomasta syystä, mahdollisesti viljelmän lajisuhteiden muuttuessa. Useissa tapauksissa entsyymi ei erittynyt kasvuliuokseen vaan oli kiinnittynyt solun pinnalle, josta se irrotettiin lievällä sonikoinnilla. Entsyymien aktiivisuus 5 määritettiin viskosimetrisellä menetelmällä, ja aktiivisuusyksikkö (AY) määriteltiin entsyymipitoisuudeksi, joka sai aikaan viskositeetin laskun 1 cP/min.

Esillä oleva keksintö liittyy siten myös menetelmään sellaisten entsyymiä tuottavien mikro-organismien eristämiseksi, jotka entsyymit kykenevät hajottamaan valittuja limaa 10 tuottavia polysakkarideja. Menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: - kerätään maa- ja kompostinäytteitä erilaisista ympäristöistä, - suspendoidaan näytteet puskuriliuokseen, kuten fysiologiseen suolaliuokseen, - siirrostetaan liuoksella tai suoraan maa- tai kompostinäytteellä kasvuliuos, joka sisältää valittua polysakkaridia, joka sisältää kahden monosakkaridin välillä p-l,2-sidoksen, jolloin 15 toinen monosakkaridi on galaktoosi j a toinen j oko galaktoosi, galakturonihappo, glukuro- nihappo, mannoosi, glukoosi, arabinoosi, ksyloosi tai ramnoosi, - inkuboidaan alustaa sopivissa olosuhteissa ja mitataan viljelmän suodoksesta viskositeetti, - valitaan jatkokokeisiin viljelmä, jossa viskositeetti on alentunut, valinnaisesti sellainen 20 viljelmä, jonka viskositeetti on alentunut nopeimmin ja eniten, . ·. - erotetaan solut ja kasvatetaan viljelmää sopivissa olosuhteissa uudelleen alustalla, joka . * : ·. sisältää valittua polysakkaridia, - kerätään kasvuliuos tai erotetaan solut kasvuliuoksesta, suspendoidaan ne • · · : \ f puskuriliuokseen tai kasvualustaan, sonikoidaan solut, erotetaan solut ja otetaan suodos • · 25 talteen, : T: - saatetaan kasvuliuos kosketuksiin tutkittavan polysakkaridin kanssa ja todetaan kykeneekö entsyymi hajottamaan valittua polysakkaridia, ’: · ‘: - otetaan viljelmän solut talteen, valinnaisesti sellaisesta viljelmästä, jonka kasvualustan tai '.,, · sonikoinnista saadun liuoksen on todettu kykenevän hajottamaan valittua polysakkaridia ja ; . 30 - kasvatetaan soluja valittua polysakkaridia sisältävällä alustalla.

• · · , · | j Tässä keksinnössä kuvattu eristysmenetelmä on toistettavissa, vaikka lähtökohtana ovat • M » » ....: maa- tai kompostinäytteet. Vaikka maanäytteet olivat erilaisia ja kompostinäytteet olivat peräisin eri raaka-ainetta sisältävistä ja eri vaiheessa olevista kompostinäytteistä, yli 80% 109921 11 näytteistä sisälsi mikrobeita, jotka kykenivät hajottamaan polysakkaridia käytettäessä ko. polysakkaridia niiden alustassa ainoana hiilenlähteenä. Sekaviljelmän kyky polysakkaridin hajotukseen säilyi sukupolvesta toiseen kasvatettaessa viljelmää jatkuvasti alustalla, joka ! sisälsi valittua polysakkaridia ainoana hiilenlähteenä.

! I 5

Keksinnön mukaisesti eristetyn mikrobiviljelmän kasvuliuos tai soluekstrakti, joka on saatu esimerkiksi sonikoimalla soluja ja ottamalla talteen soluvapaa liuos sisältää endo-β- 1,2-galaktanaasi-entsyymiä keksinnön yhteydessä tehtyjen havaintojen perusteella proteiinina laskettuna 0,02-0,03 mg/ml tai entsyymiaktiivisuutena laskettuna 50-200 10 AY/ml. Teollisesti käyttökelpoisen entsyymi valmisteen tekemiseksi kasvuliuosta tai sonikoimalla saatua liuosta on edullista konsentroida ja/tai entsyymi pitää puhdistaa yhden tai useamman proteiininpuhdistusvaiheen kautta, niin että entsyymi valmisteessa on endo-β-1,2-galaktanaasi-entsyymiä proteiinina laskettuna yli 0,1 mg/ml, edullisesti 0,250 mg/ml, edullisimmin 0,5 mg/ml. Entsyymiaktiivisuutena laskettuna entsyymiaktiivisuus on yli 15 200 AY/ml, edullisesti yli 500 AY/ml, edullisimmin yli 1000 AY/ml.

Esillä oleva keksintö ei ole kuitenkaan rajoittunut tässä esitettyyn entsyymin eristys-menetelmään, vaan entsyymi voidaan eristää tai saada aikaan myös muilla menetelmillä. Keksinnön mukainen entsyymi voidaan tuottaa mikro-organismeilla, joihin entsyymiä 20 koodittava geeni on siirretty tai jotka tuottavat entsyymiä luonnostaan, mutta joiden • * ;;; · tuottokykyä on mahdollisesti parannettu mutatoimalla tai geeniteknisin menetelmin.

« « · « « · ;". Mikrobi viljelmästä, joka sisältää yhden tai useamman eri mikrobilajin soluja voidaan • * t • «· !..' eristää endo-β-1,2-galaktanaasia koodittava geeni ja siirtää se sopivaan isäntämikro- • · · t *:. t 25 organismiin mieluiten tehokkaiden säätelyalueiden alaisuuteen.Tuottajaorganismi on * s # • 1 ( edullisesti sellainen, että se kykenee erittämään entsyymin solun ulkopuolelle, min että . \ : kasvuliuosta pystytään käyttämään entsyymipreparaattina jo sellaisenaan tai vain vähäisin . · · ·, toimenpitein muutettuna kuten konsentroimalla, lisäämällä stabiilisuutta lisääviä aineita ja puskureita jne.

• I · 30

Termillä "entsyymivalmiste" tarkoitetaan mitä tahansa valmistetta, joka sisältää vähintään ’; ’ · ’ yhden entsyymin. Entsyymivalmiste voi siten olla kasvuliuos tai soluekstrakti, joka sisältää yhden tai useamman entsyymin, eristetty entsyymi tai yhden tai useamman entsyymin muodostama seos. Entsyymiaktiivisuuden lisäksi entsyymivalmiste sisältää edullisesti 1G9921 12 ! apuaineita, joita yleisesti käytetään entsyymivalmisteissa, jotka on tarkoitettu käyttöalan prosessiteollisuuteen. Tällaisia apuaineita ovat esimerkiksi puskurit ja stabilointiaineet. Paperikonesovelluksessa nämä apuaineet ovat edullisesti aineita, joita käytetään sellu- tai massateollisuuden sovelluksissa. Jos entsyymivalmiste on tarkoitettu muuhun prosessi-5 teollisuuteen tai puhdasvesi- tai viemäriputkistojen käsittelyyn, apuaineet valitaan sopiviksi kyseisessä käyttötarkoituksessa.

K. pneumoniae VTT-E-97860-kannan tuottamaa polysakkaridia hydrolysoivan entsyymin karakterisoimiseksi entsyymi puhdistettiin kromatografisesti kuten on kuvattu esimerkissä 10 2. Puhdistus koostui kahdesta hydrofobisiin vuorovaikutuksiin perustuvasta kromatografia- vaiheesta, joita seurasi anioninvaihtokromatografia ja puhdistuksen viimeisenä vaiheena geelisuodatus.

Puhdistetulla entsyymillä hydrolysoitiin substraattina käytettyä K. pneumoniae VTT-E-15 97860-kannan tuottamaa polysakkaridia ja NMR-menetelmällä määritettiin, minkä sidoksen entsyymi katkaisi polysakkaridista. Entsyymin todettiin katkaisevan galaktoosin ja galakturonihapon välisen p-l,2-sidoksen.

Kun entsyymin toimintatapa tunnetaan, voidaan suunnitella erilaisia entsyymiyhdistelmiä 20 spesi fi sesti eri laisia käyttötarkoituksia varten.

« · •. ‘ 1 · Keksinnön mukainen entsyymi on edullisesti endo-β-1,2-galaktanaasi, jonka molekyyli- I I 1 ·. ·' paino on 110 -130 kDa. Keksinnön mukaisen entsyymin pH-optimi on välillä 5-6.5, * ' : edullisesti pH-optimi on noin 5,5. Entsyymin pH-stabiilisuus on 40 °C:ssa välillä pH 5 - 7, ;,. 25 edullisesti välillä 5,4 - 6,0.

. . Entsyymimäärä, joka tarvitaan hydrolysoitaessa polysakkarideissa esiintyvän galaktoosin • · · • · ♦ *. / ja galakturonihapon välisiä β-1,2-sidoksia tai vastaavia galaktoosin ja galaktoosin, galakt uronihapon, glukuronihapon, mannoosin, glukoosin, arabinoosin, ksyloosin tai ramnoosin • · · 30 välisiä sidoksia, on 50-500 000 AY/g, edullisesti 500 - 50 000 AY/g, edullisimmin 1000 -10 000 AY/g polysakkaridia.

‘ ··1 Polysakkaridien hydrolysointi tehdään 20 - 60 °C:ssa, edullisesti 35 - 55 °C:ssa, edullisimmin 35-50°C:ssa. Hydrolysointiliuoksen pH on 4-8 , edullisesti pH on 5-7, 109921 13 edullisimmin pH on 5,5-6,0. Hydrolysointiaika voi olla 5 min - 10 vrk riippuen käytetystä sovelluksesta ja entsyymimäärästä. Mono- tai oligosakkarideja valmistettaessa hydrolysointiaika on edullisesti alle 1 vrk tai muutamia kymmeniä minuutteja, 5 min - lvrk, edullisesti 20 min - 5 tuntia, edullisimmin 30 min-2 tuntia.

5

Esillä olevan keksinnön mukainen entsyymi soveltuu erilaisissa ympäristöissä esiintyvien biofilmien ja muiden limakeräymien hajottamiseen. Tällöin entsyymivalmiste, joka mahdollisesti sisältää sopivia kyseisessä ympäristössä tarvittavia apuaineita, kuten puskureita, saatetaan kosketuksiin limakeräymän kanssa entsyymin toiminnalle sopivissa olosuhteissa.

10

Keksinnön mukaisessa menetelmässä limamuodostuma saatetaan kosketuksiin endo-β-1,2-galaktanaasia sisältävän entsyymivalmisteen kanssa yksin tai yhdessä muiden entsyymi-aktiivisuuksien kanssa. Käsittelylämpötila on 20 - 60 °C, edullisesti 35 - 55 °C, edullisimmin 35-50 °C . Käsittely tehdään pH:ssa 4-8 , edullisesti pH:ssa 5-7, edullisimmin 15 pH.ssa 5,5-6,0. Entsyymivalmiste lisätään etenkin paperikoneilla kiertoveteen. Sopiva entsyymimäärä on tällöin 5- 10 000 AY/ litra kiertovettä, edullisesti 20 - 50 000 AY/ litra, edullisimmin 200 - 2000 AY/litra kiertovettä. Koska käsittelyä ei selkeästi lopeteta tiettynä ajankohtana, käsittelyaika vaihtelee muutamasta tunnista useisiin vuorokausiin.

20 Endo-β-1,2-galaktanaasikäsittely voidaan tehdä erikseen tai samanaikaisesti muiden • · · : entsyymikäsittelyiden kanssa, tai ennen tällaisia käsittelyjä. On erityisen edullista yhdistää endo- β-1,2-galaktanaasikäsittely proteaasi-, β-glukanaasi, mannanaasi, kitinääsi, leva-1 “. naasi, hemisellulaasi tai lysotsyymikäsittelyn kanssa. Kun endo-β-1,2-galaktanaasia käy- _ 1. / tetään samanaikaisesti edellämainittujen entsyymien kanssa, on edullista käyttää entsyy- • · · .··,·, 25 mivalmistetta, johon on lisätty endo-β-1,2-galaktanaasia tai joka on tuotettu kannalla, joka * t · on geneettisesti muunnettu tuottamaan suuria määriä ko entsyymiä, jotta entsyymivalmis- ;'. # | teessä olisi olennaisen korkea endo-β-1,2-galaktanaasiaktiivisuus.

• · • · , f·. Keksinnön mukainen entsyymikäsittely voidaan liittää myös yhteen tai useampaan kerni- • · · , · · ·. 30 alliseen käsittelyyn. Tällainen voi olla esimerkiksi biosidikäsittely, jolloin biosidi on valittu • · 1 I · 1 · I · • · · 109921 14 joukosta: glutaraldehydi, DBNPA, MBT, kloori-2-metyyli-isotiatsolin-3-oni, metyyli-4-isotiatsolin-3-oni, Bronopol, datsometti, natriumhypokloriitti, peretikkahappo BCDMH ( bromiklooridimetyylihydantoini).

5 Esimerkit Esimerkki 1 Polysakkaridin eristys 10

Limapolysakkarideja tuottavat mikrobikannat olivat peräisin eri kantakokoelmista tai paperikoneen limanäytteistä. Kantojen kykyä tuottaa polysakkarideja tarkasteltiin malja-hajotuksin. Tutkimuksen alkuvaiheessa todettiin, että sakkaroosia sisältävällä alustalla saatiin eristetyksi pääasiassa levaanin tuottajia, joten jatkossa seulonta-alustan hiilen- 15 lähteeksi valittiin glukoosi. Alustavassa seulonnassa valituilla, maljoilla limaisina pesäkkeinä kasvavilla kannoilla tuotettiin edelleen polysakkarideja ravistelukasvatuksin liuos-viljelmissä. Polysakkaridin tuottoa liuosviljelmissä seurattiin mittaamalla alustan viskositeettia tai saostamalla muodostunut polysakkaridi kasvuliuoksesta.

20 Jatkokokeisiin valitut polysakkaridin tuottokannat identifioitiin (API, FAME, ribotyypitys, ';. 16S rDNA-sekvensointi). Osoittautui, että monet paperikonelimanäytteistä eristetyt poly- 1 : '·: sakkaridintuottajat edustivat aiemmin kuvaamattomia bakteerilajeja. Seulonnassa löytyi ." ’: useita polysakkarideja tuottavia Klebsiella pneumoniae -kantoja. Verrattaessa eri paperi- : * ·.: koneilta eristettyj ä K. pneumoniae -kantoj a keskenään niille tehdyn ribotyypityksen perus- : : : 25 teella todettiin, että ne olivat ribotyypiItään erilaisia.

I » ·

Polysakkarideja tuotettiin ravistelukasvatuksissa erilaisilla alustoilla. Varsinkin alustan •. ‘ · i hiilenlähteellä ja typpipitoisuudella oli vaikutusta polysakkaridien muodostumiseen.

'...: Muiden kuin levanaasi-entsyymin eristämiseksi tuottoalustaksi valittiin j atkossa typpi- : :': 30 rajoitteinen glukoosialusta, jolla tuotetut polysakkaridit olivat erilaisia heteropoly-: : sakkarideja. Polysakkaridit eristettiin kasvuliuoksista etanolisaostuksella. Saostetut . ·. ·. polysakkaridit liuotettiin veteen ja käsiteltiin proteaasilla (Neutrase, Novo) mahdollisten ." *. proteiinijäämien poistamiseksi ja saostettiin uudelleen. Saostuksen jälkeen osa näytteistä 109921 15 sisälsi runsaasti fosfaatteja. Suolojen poistamiseksi näytteitä dialysoitiin. Lopuksi polysakkaridit kylmäkuivattiin

Polysakkaridisaannot olivat liuoskasvatuksissa melko alhaisia, useimmiten alle 1 g/1 5 i | Polysakkaridipreparaattien kokonaishiilihydraattipitoisuus määritettiin fenolirikkihap- pomenetelmällä. Polysakkaridien monosakkaridi-ja uronihappokoostumus määritettiin HPLCdlä happohydrolyysin jälkeen. Polysakkarideja hydrolysoitaessa todettiin, että jokaiselle polysakkaridille tulisi selvittää optimaaliset hydrolyysiolosuhteet: sopiva 10 happokonsentraatio ja hydrolyysiaika. Happohydrolyysi tehtiin pääsääntöisesti 0,5N - 2N rikkihapolla 105 °C:ssa. Hydrolyysiaika oli 2-5 h. Fruktoosipitoisuuden määrittämiseksi polysakkarideja hydrolysoitiin 2N TFA:lla 20 °C:ssa 1 h.

Kokeita jatkettiin Klebsiella pneumoniae VTT-E-97860-kannalla, joka tuotti hyvin li-15 maisia pesäkkeitä kasvumaljoilla. Solunulkopuolisten polysakkaridien tuottamiseksi kantaa kasvatettiin nestemäisellä alustalla ravistelupulloissa ja laboratoriofermentorissa. Polysak-karidisaanto ravistelupulloissa (mitattuna kokonaishiilihydraattipitoisuutena kylmäkuivatusta polysakkaridipreparaatista) oli noin 1 g/1 kasvatusalustaa. Polysakkaridi koostui mannoosista, galaktoosista ja galakturonihaposta. Se sisälsi myös jonkin verran glukoosia 20 ja metyyliglukuronihappoa (Taulukko 1).

• · · · ·/” Taulukko 1. Hiilihydraattisaanto ja K. pneumoniae -polysakkaridin sokerikoostumus ravistelupullokasvatuksessa.

·".*·: Saanto Man Gal Glc GalA MeGluA

v: (g r1) (%) (%) (%) (%) (%) ' * 0.95 62.6 23.5 0.9 12.10 0.9 . · · ·. 25 Klebsiella pneumoniae VTT-E-97860-kannan avulla tuotettiin polysakkaridia 5 1 . ‘. Erlenmeyer-pullossa, joka sisälsi 11 kasvatusalustaa. Alusta sisälsi 20 g Γ1 glukoosia, 0.5 g λ! Γ1 hiivaekstraktia (Difco), 0.6 g Γ1 (NH4)2S04 (Riedel-de Haen), 3.18 g Γ1 KH2PO4 (Merck), 5.2 g F1 K2HP04 (Merck), 0.3 g F1 MgS04x7H20 (Merck), 0.05 g l 'CaCl2 ;,; (Merck) ja lml/1 ravintoaineliuosta (0.2 g F1 ZnS04x7H20 (Merck), 0.2 g F1 CuS04x5H20 ‘ * 30 (Merck), 0.2 g F1 MnS04xH20 (Merck), 0.2 g F1 CoC12x6H20 (Merck), 0.2 g F1

FeS04x7H20 (Merck). Viljelmää kasvatettiin 5 päivää ravistelijassa (120 kierrosta min’1) 109921 16 + 30°C:ssa, minkä jälkeen kasvatusalustaan lisättiin NaCl (0.9 %) jotta osittain soluun sitoutunut polysakkaridi olisi helpommin saatu erilleen. Alusta homogenoitiin sekoittajalla (Ystral). Solut erotettiin sentrifugoimalla. Polysakkaridi saostettiin supematantista 3 voi. etanolia +4 °C:ssa yön yli. Polysakkaridi erotettiin sentrifugoimalla ja liuotettiin veteen.

5 Proteiiniepäpuhtauksien poistamiseksi liukoinen polysakkaridi käsiteltiin proteaasilla (Neutrase, Novo) +37°C:ssa 1 tunti. Polysakkaridi saostettiin etanolilla, liuotettiin veteen, dialysoitiin (MWCO 12-14 kDa, Medicell, London, UK) vettä vastaan ja kylmäkuivattiin.

Polysakkaridin tuottamiseksi suuremmassa mittakaavassa, fermentaatioita tehtiin Chemap 10 CF 2000 laboratoriofermentorissa, jonka kasvatustilavuus oli 10 1, sekä pilot-mitan fermentorissa (kasvatustilavuus 1200 1). Fermentointi-olosuhteet olivat: lämpötila 30°C, p02 >10% (Chemap) tai pC>2 >30% (pilot), pC>2 säädetty sekoituksella, pH 7-8,5 (säädetty automaattisella NaOH-lisäyksellä). Kasvualusta sisälsi 30 g/1 glukoosia, 0,5 g/1 hiivauutetta ja samat suolat kuin Erlenmeyer-pullokasvatuksessa. Tuotetun polysakkaridin määrä lasts kettiin mannoosin määrästä, joka oli analysoitu sentrifugoidusta kasvuliemestä HPLC:llä happaman hydrolyysin ( 2 N H2SO4 , 105 °C , 2h) jälkeen. Solut erotettiin sentrifugoimalla, kasvuliemi konsentroitiin ultrasuodatuksella ja polysakkaridi saostettiin super-natantista etanolilla.

20 Geelielektroforeesi •.' ’ · Näytteiden sisältämiä proteiineja karakterisoitiin SDS-elektroforeesilla 10 % polyakryyli- •...: amidigeelillä Laemmlin (1970) mukaisesti käyttäen Ready Gel Cell systeemiä (Bio-Rad

:.' i Laboratories, Hercules, CA, USA) ja seuraten valmistajan ohjeita. Kalibrointiseosta 7707S

‘ 25 (Biolabs, NE, USA) käytettiin standardina.

•

Kemialliset analyysit *; · Proteiinikonsentraatio määritettiin spektrofotometrillä mittaamalla näytteiden adsorptio :; 30 aallonpituudella 280 nm. Konsentraatio saatiin olettaen, että 1 yksikön absorbanssiarvo ‘‘ vastasi 1 mg/ml proteiinikonsentraatiota.

• · · •... · Polysakkaridipreparaattien kokonaishiilihydraattisisältö määritettiin fenoli-rikkihappo- menetelmällä (Dubois et ai. 1956). Monosakkaridi-uronihappokomposition määrittämi- ί 109921 I 17 f j seksi eristetty polysakkaridi hydrolysoitiin 2 N ttSO^lla 105 °C:ssa 2 h. Hydrolysaatti analysoitiin HPLC :llä (Dionex ).

Polysakkaridin rakenne 5

Polysakkaridin rakenneanalyysiä ja hydrolyysikokeita varten polysakkaridi puhdistettiin anioininvaihtohartsilla (DEAE Sepharose FF, Pharmacia-LKB, Uppsala, Ruotsi). Hartsin tasapainotettiin puskurin kanssa, jonka pH oli 7 ja johtavuus 190 pS/cm. Polysakkaridi sekoitettiin hartsin kanssa ja ravisteltiin 1 h + 20 °C:ssa. Hartsi erotettiin sentrifugoimalla.

10

Polysakkaridin rakenne määritettiin 2D NMR:llä entsyymikäsittelyn jälkeen. Polysakkari-dia käsiteltiin puhdistetulla entsyymillä endo-β-1,2-galaktanaasilla 24 h (annos 280 mg/g polysakkaridia), jonka jälkeen seos keitettiin (5 min) ja kylmäkuivattiin. Kylmäkuivattu hydrolysaatti liuotettiin deuteriumoksidiin (D20, 99.8 atom%, Fluka) ja 15 liuos kirkastettiin sentrifugoimalla. Näytteestä mitattiin ID 1H ja 13C NMR-spektrit ja 2D COSY, relayCOSY,TOCSY, HMQCja HSQC-spektrit 50 °C:ssa.

NMR-analyysi osoitti, että polysakkaridi koostui viidestä sokeriyksiköstä, joiden rakenne oli seuraava: 20 . Y: ->2)-a-D-GalpA-( 1 ->3)-a-D-Manp-( 1 ->2)-<x-D-Manp-( 1 ->3)-p-D-Galp-( 1 -> / a-D-Manp-(l->4) :.Y 4 6

Y * 25 W

: c Λ h3c cooh • · t · · • » 109921 18

Esimerkki 2 ί

Entsyymin seulonta ja eristys 5 Maa- ja kompostinäytteistä seulottiin sekaviljelmiä, jotka kykenivät hajottamaan esimer kissä 1 eristettyä polysakkaridia. Polysakkaridia hajottavien viljelmien rikastamiseksi näytteet siirrostettiin kasvualustalle, joka sisälsi 5 g Γ1 K. pneumoniae:n polysakkaridia ja 6.7 g Γ1 Yeast nitrogen base (Difco) 50 mM kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7. 12 päivän inkuboinnin jälkeen +30 °C:ssa sekoittajassa (120 kierrosta min'1) 750 μΐ viljelmiä siirros-10 tettiin uudelleen 15 ml:aan tuoretta alustaa ja inkuboitiin 3vrk. Viljelmän kykyä hajottaa polysakkaridia seurattiin viskositeettimittauksilla (Brookfield DVII).

Seulottaessa polysakkaridia hajottavaa entsyymiaktiivisuutta tuottavia mikrobeita maa-ja kompostinäytteistä inkuboimalla näytteitä alustalla, joka sisälsi K. pneumoniae -polysak-15 karidia ainoana hiileni ahteen ä kuten edellä on kuvattu, havaittiin polysakkaridia hajottava aktiivisuus 6 sekaviljelmässä 7 polysakkaridialustalla kasvatetusta.(Taulukko 3). Maasta eristetty sekaviljelmä numero 3 hajotti polysakkaridia kaikkein tehokkaimmin toisen inkuboinnin aikana. Tämä viljelmä valittiin entsyymintuotantoon.). Sekaviljelmä säilytettiin kasvualustassa + 4 °C:ssa entsyymin tuottamiseen asti.

20 .,· - Taulukko 2.

•.Näyte I Inkub. 5 d I Inkub. 12 d II Inkub. 1 d II Inkub. 3 d '···’ No Alkuperä Viskositeetti (cP)

Kontrolli ^2 63 4Λ 4~6 «tl l"' 1 Komposti, olkia 5.2 2.7 ’ 2 Komposti, paperia 1.2 1.3 3.7 2.5 3 Maa 5.0 1.1 1.7 1.0 !..* 4 Komposti 1.1 1.2 4.1 1.3 '·’ 5 Santa ja lehdet 5.2 1.2 2.1 1.2 6 Maa ja lehdet 5.0 5.3 ·;·’ 7 Komposti ja lehdet 5.2 1.3 2.4 1.2 • * * 109921 19

Vastaavasti havaittiin myös muita kuin edellä kuvattua K. pneumoniaen polysakkaridia käytettäessä, että yleensä multa- tai kompostinäytteistä voitiin eristää tällä menetelmällä kutakin mikrobipolysakkaridia hajottavia viljelmiä.

5 Entsyymin tuottamiseksi sekaviljelmää nro 3 (VTT-E-97916) inkuboitiin ravistelu-pulloissa, jotka sisälsivät 500 ml polysakkaridialustaa +30 °C:ssa 3-5 päivää. Solut erotettiin kasvualustasta sentrifugoimalla +4°C:ssa. Solut suspendoitiin 50 mitään 50 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH 7. Suspensio sonikoitiin soluun sitoutuneen entsyymin vapauttamiseksi nestefaasiin. Solut poistettiin entsyymiliuoksesta.

10

Seuraavat puhdistusvaiheet tehtiin + 4 °C:ssa. Puhdistus aloitettiin hydrofobisella kromatografialla (hydrophobic interaction chromatography, HIC). Entsyymiliuoksen johtavuus säädettiin 106 mS/cm:ksi ja pH 6:ksi. Liuos saatettiin butyylisefaroosi-kolonniin (Butyl Sepharose FF, Pharmacia-LKB, kolonni 16 mm x 80 mm,), joka oli tasapainotettu 15 samaan johtokykyyn (106 mS/cm) ja pH-arvoon (pH 6) 0.8 M ammoniumsulfaatilla 20 mM kaliumfosfaattipuskurissa, pH 6. Näytteen syöttämisen jälkeen kolonni pestiin e.m. tasapainottavalla puskurilla j a sen j älkeen kolonni eluoitiin alenevalla lineaarisella gradientilla ammoniumsulfaattia (80 ml) 0,8 M:sta 0 M:een 20 mM kaliumfosfaattipuskurissa, pH 6. Virtausnopeus oli 1,5 ml min'1 ja koko ajon ajalta kerättiin 9 ml:n 20 fraktiot, joista mitattiin K. pneumoniae VTT-E-97860 polysakkaridia hajottava kyky.

..: : Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja puhdistettiin edelleen toisella HIC-puhdistusvaiheella.

'. * Näytteen johtavuus ja pH säädettiin vastaamaan tasapainotuspuskuria (1.0 M ammo- • · · ‘ · · · * niumsulfaatti 20 mM kaliumfosfaatissa, pH 6). Näyte (93 ml) saatettiin samaan kolonniin, joka aikaisemmin oli tasapainotettu 1.0 M ammoniumsulfaatilla 20 mM kaliumfosfaatissa, ';*/ 25 pH 6. Näytteen syötön j älkeen kolonni pestiin tasapainottavalla puskurilla j a sen j älkeen kolonni eluoitiin alenevalla lineaarisella ammoniumsulfaattigradientilla (80 ml) 1 M:sta 20 . , mM kaliumfosfaattipuskurissa (pH 6) 0 M:een 2 mM kaliumfosfaattipuskurissa (pH 6).

!,, ‘ Entsyymi eluoitui gradientin aikana yhtenä piikkinä ja aktiiviset fraktiot kerättiin yhteen.

'; ;' 30 Saatu entsyymin sisältävä jae (36 ml) puskuroitiin 20 mM:een kaliumfosfaattiin, pH 6,2, •; · geelisuodattamalla (Sephadex G-25 coarse, Pharmacia LKB, 50 x 150 mm). Entsyymi ’ V puhdistettiin edelleen anioninvaihtokromatografialla (AE) (DEAE Sepharose FF,

‘ ‘ Pharmacia-LKB, 10 mm x 110 mm) kolonnissa. Entsyymi sidottiin hartsiin 20 mM

kaliumfosfaatissa, pH 6.2, virtausnopeudella 0,8 ml min'1. Entsyymi eluoitiin kolonnista 109921 20 nousevalla lineaarisella gradientilla natriumkloridia 0:sta 0.15 M:aan, jonka aikana entsyymi eluoitui yhtenä piikkinä. Aktiivisimmat fraktiot (a 3 ml) yhdistettiin (12 ml, AE fraktio I) ja kolme fraktiota jotka eluoituivat ennen ja jälkeen fraktio I keräämisen yhdistettiin toiseksi näytteeksi (18 ml, AE fraktio II). Molemmat e.m. näytteet konsentroitiin 5 ultrasuodatuksella (Amicon, Amicon Diaflo , PM 10 -kalvo, Beverly, MA, USA), AE fraktio I konsentroitiin 8-kertaisesti ja AE fraktio II konsentroitiin 22-kertaisesti.

Viimeinen puhdistusvaihe, geelisuodatus, suoritettiin huoneenlämpötilassa. Fraktio saatettiin Sephracryl S-300 HR-kolonniin (Pharmacia-LKB), joka oli tasapainotettu 0,1 M 10 natriumkloridilla 50 mM kaliumfosfaattipuskurissa, pH 6. Virtausnopeus oli 0.6 ml min'1 ja 2.9 ml:n fraktiot kerättiin. Entsyymi, joka eluoitui DEAE faktio Estä jaettiin kahteen eri fraktioon (G fraktio I ja G fraktio II) ja entsyymi, joka eluoitui DEAE fraktio II:sta yhdistettiin yhdeksi fraktioksi (G fraktio III).

15 Soluvapaan entsyymipreparaatin kokonaisaktiivisuus, joka saatiin 500 mlrsta kasvualustaa kasvatetuista soluista oli 14 874 AU. Ensimmäinen puhdistusvaihe (HIC 1) aikaansai entsyymin spesifisen aktiivisuuden 25 kertaisen nousun saannolla 74%. Entsyymi ei tällöin sitoutunut kunnolla hartsiin eikä eluoituminen ollut näin ollen optimaalista. Aktiiviset fraktiot kerättiin yhteen ja puhdistettiin uudelleen (HIC2). Tällä kerralla etsyymi sitoutui ja 20 eluoitui yhtenä piikkinä, jonka seurauksena noin 50% proteiiniepäpuhtauksia poistui ja V: kokonaisaktiivisuutta menetettiin n. 10%. Aktiiviset fraktiot, jotka eluoituivat !*··: anioninvaihtokromatografiakolonneista jaettiin kahteen fraktioon. Fraktio 1 sisälsi neljä . *' ’: eniten aktiivista fraktiota ja fraktio 2 kolme sellaista fraktiota, jotka olivat eluoituneet : ’ > · ennen ja kolme sellaista fraktiota, jotka olivat eluoituneet aktiivisimpien fraktioiden :: : 25 jälkeen. Ultrasuodatuksella tehdyn konsentroinnin jälkeen puhdistuskertoimet olivat 229 : (fraktio 1) ja 111 (fraktio 2). AE:ssa saatiin talteen 15 % proteiinista ja lähes 50 % kokonaisaktiivisuudesta. SDS-PAGE:ssa molemmat fraktiot tuottivat selkeästi väijäytyvän •. · i vyöhykkeen, mutta lisäksi havaittiin useita merkittävästi heikompia vyöhykkeitä.

• »

Molemmat fraktiot puhdistettiin edelleen geelisuodatuksella. Geelisuodatuksessa jotkin 30 epäpuhtaudet poistettiin mutta samalla menetettiin paljon aktiivisuutta ja puhdistuskerroin :: laski. Fraktio 1 jaettiin kahteen erilliseen fraktioon geelisuodatuksen jälkeen. Fraktio 2:n ; ‘; *; geelisuodatuksen jälkeen aktiiviset fraktiot koottiin yhdeksi fraktioksi. Fraktion : ‘ ”: konsentroinnissa menetettiin aktiivisuutta lisää. SDS-PAGE:ssa havaittiin yksi ohut » I * vyöhyke.

j 109921 21

Taulukko 3. K. pneumoniae VTT-E-97860 polysakkaridia hajottavan entsyymin puhdistus. Puhdistusvaihe Tilav. Kok. proteiini Kok.aktiiv. Spes. aktiivisuus Saanto Puhdistus (ml) (mg) (AU) (AU/ mg prot.) (%) kerroin

Soluvapaa uute 37 444 14874 34 1 HIC 1 95 13 10944 853 74 25 HIC 2 38 6 9302 1466 63 44 AE Fraktioi 12,5 0,65 4200 6462 28 193

Fraktion 18 0,63 1166 1851 8 55

Fraktio I kons. 1,4 0,39 3024 7687 20 229

Fraktio II kons. 0,8 0,38 1402 3720 9 111 GF Fraktioi 16 0,34 307 914 2,1 27

Fraktioi! 11 0,22 111 504 0,7 15

Fraktioin 14 0,31 134 436 0,9 13

Fraktio I kons. 1 0,05 58 1252 0,4 37

Fraktio II kons. 1,05 67 0,5

Fraktio III kons. 1 0,06 41 638 0,3 19

Proteiinin molekyylipaino oli 110-130 kDa määritettynä liikkuvuudesta SDS-PAGE:ssa ja 5 geelisuodatuskolonnissa. MALDI massaspektrofotometrilla määritettynä molekyylipaino oli noin 117-120 kDa.

. . Entsyymin aktiivisuusmääritys • · ·, 10 Entsyymiaktiivisuus mitattiin entsyymin kykynä alentaa K. pneumoniae VTT-E-97860 • »

: polysakkaridin viskositeettia polysakkaridisubstraatin 50 mM kaliumfosfaattipuskuriin, pH

. y. 7, tehdyssä 0,5 %:ssa liuoksessa, + 30 °C:ssa. Määrityksessä 50 μΐ entsyymiä lisättiin 450 : ‘: pl:aan substraattia. Viskositeetin pienenemistä seurattiin viskosimetrillä (Brookfield LVTDV-II CP, MA, USA) 4 min. Viskositeetti mitattiin välillä 60-180 s entsyymi- » · # : *.: 15 lisäyksen jälkeen. Näyte laimennettiin siten, että viskositeeeti laski mittauksen aikana *,..: nopeudella 0.007- 0.0035 cP/s. Aktiivisuusyksikkö (AU) määritettiin siten, että se oli ; V j sellainen määrä entsyymiaktiivisuutta, joka alensi mittausolosuhteissa viskositeettia 1 cP:n 1 minuutissa.

• I t I > » » » • · · i 109921 [ 22 j Entsyymin pH optimin määritys pH optimi määritettiin hydrolysoimalla 0.5 % polysakkaridisubstraattia 100 mM etikka-happo- tai fosfaattipuskurissa pH 3.5-8.4 entsyymillä, joka oli puhdistettu anioininvaihto-5 kromatografialla. 50 μΐ näytettä lisättiin 1 ml:aan substraattia. Vertailuarvojen määrittämiseksi koe tehtiin myös inaktivoidulla entsyymillä. Kaikkia näytteitä inkuboitiin 15 min ja entsymaattinen reaktio lopetettiin keittämällä näytteitä 8 min. Viskositeetti mitattiin Brookfieldin viskometrillä. Aktiviteetti tietyissä pH-arvoissa määritettiin näytteen ja vertailunäytteen välisenä viskositeettierona.

10

Entsyymin pH-optimi oli noin 5.5, ja pH 5:n alapuolella entsyymin aktiivisuus laski nopeasti.

pH ja lämpöstabiilisuus 15

pH ja lämpöstabiilisuus puhdistetusta ja puhdistamattomasta entsyymistä määritettiin pH

välillä 4.0-8.8. Entsyymiliuoksen pH säädettiin 25 % etikkahapon tai 1 M NaOH:n avulla.

Entsyymiä pidettiin 40°C:ssa tai 50 °C:ssa (vain puhdistettu) 1 tunti. 50 μΐ entsyymiä lisättiin 1 ml:aan 0.5 % polysakkaridisubstraattia 200 mM fosfaattipuskurissa, pH 7.

20 Vertailunäyte hydrolysoitiin käsittelemättömällä entsyymillä ja vertailunäytteissä entsyymi .. · i oli korvattu puskurilla. Näytteitä inkuboitiin 25 min. Reaktio lopetettiin keittämällä • · « · •. *': näytteitä 8 min. Aktiivisuusmittaus perustui viskositeetin määrittämiseen kuten edellä on • · * kuvattu.

» « · • · · *; ’ 25 Puhdistamattoman entsyymin pH stabiilisuus (enemmän kuin 80 % aktiivisuudesta jäljellä) oli 40 °C :ssa välillä 5.8 - 7 ja puhdistetun entsyymin välillä 5.4-6.0. Puhdistettu entsyymi . menetti aktiivisuutensa inkuboitaessa 1 tunti 50 °C:ssa.

> · • i ‘ I' Hydrolyysikokeet • · · 30 « · * ; · * Entsyymin hydrolysoiman sidoksen määrittämiseksi 2 ml puhdistettua polysakkaridia, joka •. *. · sisälsi 1,66 mg hiilihydraattia 1 ml:ssa hydrolysoitiin 200 μΐ entsyymiä (280 AU ml'1) 48 '...1 h +30 °C:ssa. Entsyymi saatiin ioninvaihtokromatografialla puhdistetusta preparaatista.

109921 23

Hydrolysaatti kylmäkuivattiin ja muodostuneiden oligomeerien rakenne analysoitiin 2D NMR.

i !

Hydrolysoidusta polysakkaridista tehdyn NMR-analyysin mukaisesti entsyymi katkaisi β-5 D-Galp-(1—>2) sidoksen.

Esimerkki 3

Hydrolyysikokeet 10

Kaupallisten seosentsyymien Econase CE (Primalco) ja Pectinex Ultra SPL (Novo) kykyä hajottaa B. licheniformis STFI-79133 ja B. licheniformis E-91446 kantojen sakkaroosi-alustalla tuotettuja levaani-polysakkarideja ja AT. pneumoniae VTT-E-97860-kannalla tuotettua heteropolysakkaridia selvitettiin hydrolyysikokeilla. Tutkitut entsyymivalmisteet 15 eivät sisältäneet näitä polysakkarideja hydrolysoivaa aktiivisuutta.

Tutkimuksessa selvitettiin myös eri entsyymivalmisteiden (Econase CE, Primalco; Pectinex Ultra SPL, Novo; Neutrase, Novo; Aspergillus foetidus hemisellulaasi ja Rhodotermus β-(1—>3)-glukanaasi) vaikutusta kaupallisiin mikrobipolysakkarideihin (welaani, gellaani, 20 ksantaani, alginaatti, kurdlaani). Kurdlaani, joka on lineaarinen β-(1—>3)-glukaani, hydro- • · ;;: ; lysoitui tehokkaasti Econase CE, Pectinex, Ultra SPL ja β-( 1 ->3)-glukanaasi-entsyy- ; / meillä. Muita tutkittuja mikrobipolysakkarideja hydrolysoivia aktiivisuuksia ei todettu *

t I

‘ *'. käytetyissä entsyymivalmisteissa.

tl· • t t • · • I I I > t !.. 25 Projektissa tuotetun, K. pneumoniaen tuottamaa polysakkaridia hajottavan entsyymin vaikutusta K. pneumoniae-biofilmin muodostumiseen ja kiinnittymiseen tutkittiin , *, j laboratoriomittakaavassa kasvattamalla mikrobeja erilaisissa ravintoliuoksissa. Biofilmin • · , ·· , muodostumista seurattiin sekä perinteisen viljelyn että epifluoresenssimikroskopian avulla.

Kasvuliuokseksi valittiin Klebsiella pneumoniae VTT-E-97860 -kannan kasvua ja :30 ravintoliuoksen pH:n tasoa seuraamalla esikokeissa kaksi erilaista ravintoliuosta: : Y; peptonista ja 0,2 M kaliumfosfaattipuskurista koostuva ravintoliuos ja glukoosista ja 0,2 M :"' · kaliumfosfaattipuskurista koostuva ravintoliuos. Kummallakin ravintoliuoksella tehtiin biofilmikasvatuksia sekä entsyymilisäyksellä (steriilisuodatettua entsyymiliuosta 460 ί ί I 109921 24 j j ΑΥ/200 ml ravintoliuosta) että ilman entsyymin lisäystä. Kahden päivän välein j kasvatuslaitteesta poistettiin 100 ml vanhaa ravintoliuosta ja lisättiin vastaava määrä tuoretta ravintoliuosta sekä 460 AY entsyymiä. Olosuhteita ja biofilmin muodostumista seurattiin viljely-, mikroskopointi-ja pH-määrityksin 2, 4, 6, 8, 10 ja 14 vrk:n ikäisistä 5 Klebsiella /wewmomae-biofilmikasvatuksista.

Viljelytulosten mukaan 10 vuorokauden kasvatusajan jälkeen entsyymi näytti vaikuttavan K. pneumoniae -biofilmin kasvua vähentävästi. Samansuuntainen tulos saatiin aiemmassa, epästeriilillä entsyymillä tehdyssä koesaijassa, vaikkakaan numeeristen mikroskopointi-10 tulosten perusteella ei vastaavaa biofilmiä vähentävää vaikutusta ollut selkeästi havaittavissa. Kuitenkin entsyymipitoisessa ravintoliuoksessa yli 10 vuorokautta kasvatetun biofilmin mikrobit näyttivät mikroskoopilla tarkasteltaessa oleellisesti tasaisemmin levittäytyneiltä kuin entsyymittömässä ravintoliuoksessa kasvaneet solut, jotka muodostivat kasaumia. Erityyppisillä ravintoliuoksilla saatiin samansuuntaisia eroja entsyy-15 mipitoisen ja ilman entsyymiä tehtyjen kasvatusten välille.

Lisäksi tutkittiin entsyymin vaikutusta Klebsiella pneumoniae -biofilmin muodostumiseen pilotmittakaavassa. Pilotkokeet tehtiin koehallissa kasvatuslaitteistolla, jonka kokonaistilavuus on 87 1. Biofilmin muodostumista tutkittiin kasvattamalla Klebsiella pneumoniae -20 mikrobia pelkässä ravintoliuoksessa sekä ravintoliuoksessa, johon lisättiin projektissa V: tuotettua K. pneumoniaen polysakkaridia hajottavaa entsyymiä vastaavalla tavalla kuin ": laboratoriokokeissakin (annostus 2.2 AY/ml).

• · « · * : ’ ·, · Kokeessa kasvatettiin K. pneumoniae VTT-E-97860 -kantaa ravintoliuoksessa, joka sisälsi : T; 25 fosfaattipuskurin (0,16 M, pEl 7), glukoosia (2 %), hiivauutetta (0,05 %) ja suoloja. Kasva- '·/·’· tusliuosta oli referenssiajossa 75 1 ja entsyymi ajossa 37 1. Visuaalisen tarkastelun perus teella voitiin todeta entsyymiä sisältäneen ajon olleen vähälimaisempi kuin referenssiajon.

• * !* i Referenssiajossa säiliön kansi, seinämät nestepinnan yläpuolelta ja näyteritilikkö olivat • i * *.,. · runsaan liman peitossa. Entsyymiajossa seinämille kertynyt limamäärä oli huomattavasti : V: 30 niukempi ja liman koostumus oli erilainen (kuivempi) kuin referenssiajon liman.

• · » * · ' 1 * Laboratoriokokeissa entsyymin vaikutus K. pneumoniae -biofilmin muodostukseen oli i i · ' ; ] · ’ havaittavissa 10 vuorokauden kasvatusaj an j älkeen. V ilj elytulosten mukaan entsyymi

! I

’1 · ‘ vähensi K. pneumoniae -biofilmin kasvua ja mikroskoopilla nähtiin entsyymin käytön hajottavan mikrobikasaumia ja näin muuttavan biofilmin rakennetta.

25 109921

Pilotmittakaavan kokeiden mukaan entsyymilisäys vähensi liman muodostusta ja muutti sen koostumusta.

5 References

Buchert et ai. (1998) Enzymes for the improvement of paper machine runnability. 7th Int. Confe. Biotechnology in the pulp and paper industry, Vancouverin 16-19. June 1998, A225-A228.

10

Dubois, M et ai. (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 28: 350-356.

Dutton GGS, Parolis H (1986) The use ofbacteriphage depolymerization in the structural 15 investigation of the capsular polysaccharide from klebsiella serotype K3. Carbohydr Res I 149:411-423.

Laemmli, UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature (London) 227: 680-685 20

Ratto et ai. (1998) Effect of Enzymes degrading bacterial polysaccharides on biofilm • · ,, 1 · formation. COST Action El, Paper Recyclability. Improvement of recyclability and the I « > · ," · recycling paper industiy of the future. Ed. by A. Blanco et al. Las Palmas de Gran Canaria,

♦ a I

*,,. · 24-26 November 1998. Posteri • · • 1 · • « · • Λ * « · * 1 1 * · » * it1 t t t > t tl» ) 1 $ f · III • · I I ·

• I

* 1 1 * 1 · • ·

It1 • · t » t I · » t f II» t 1 · • 1 I · I 1 < 1 It1

Claims (36)

1. Menetelmä mikrobipolysakkaridien hajottamiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan 5 polysakkaridi kosketuksiin entsyymivalmisteen kanssa, joka sisältää yli 200 AY/ml endo-P-l,2-galaktanaasia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymivalmiste sisältää yli 500 AY/ml endo-β-1,2-galaktanaasia. 10

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridissa esiintyy galaktoosin ja toisen monosakkaridin välillä p-l,2-sidos, jolloin toinen monosakkaridi on joko galaktoosi, galakturonihappo, glukuronihappo, mannoosi, glukoosi, arabinoosi, ksyloosi tai ramnoosi ja että endo-p-l,2-galaktanaasi kykenee hajottamaan 15 tämän sidoksen. ί

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä polysakkaridissa esiintyy p-l,2-sidos galaktoosin ja galakturonihapon välillä ja että endo-P-1,2-galaktanaasi kykenee pilkkomaan tämän sidoksen. 20

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että endo-β- 1,2-galaktanaasi-entsyymin molekyylipaino on 110-130 kDa.

;, · · 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1 -5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että endo-β- •... · 25 1,2-galaktanaasi-entsyymin pH-optimi on alueella 5-6,5.

' ·' ’ 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1 -6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi- • · · *·’ käsittely suoritetaan lämpötilassa 20-60 °C, edullisesti 35 - 55 °C, edullisimmin 35 - 50 °C. • · !;; 30

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1 -7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi- '! ’ käsittely suoritetaan pH:ssa 4-8, edullisesti pH:ssa 5-7 , edullisimmin pHrssa 5,5-6,0.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsitte-:lyaika on 5 min - 10 vrk, edullisesti 20 min - 1 vrk, edullisimmin 30 min - 2 tuntia. 1G9921

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1- 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty entsyymimäärä on 50 - 500 000 AY/g, edullisesti 500 - 50 000 AY/g , edullisimmin 1000 - 10 000 AY/g polysakkaridia. 5

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridi on bakteerin tuottamaa.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 10 polysakkaridi on Klebsiella pneumoniae- bakteerin tuottamaa.

13. Menetelmä monosakkaridien tai oligosakkaridien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan polysakkaridi, joka sisältää p-l,2-sidoksen kahden monosakkaridin välillä, joista toinen on galaktoosi ja toinen joko galaktoosi, galakturonihappo, glukuronihappo, 15 arabinoosi, ksyloosi, mannoosi, glukoosi tai ramnoosi, kosketuksiin entsyymivalmisteen kanssa, joka sisältää endo-β-1,2-galaktanaasia.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi-valmiste sisältää endo-β-1,2-galaktanaasia yli 200, edullisesti yli 500 AY/ml. 20

15. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että endo-β- 1,2-galaktanaasi-entsyymin molekyylipaino on 110-130 kDa.

: : *: 16. Jonkin patenttivaatimuksen 13-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että endo- 25 β-1,2^3ΐ3^3η335ί-εηί8)7ηιΐηρΗ-ορ0ιηΐon välillä5-6,5.

:.' : 17. Menetelmä mikrobipolysakkarideja sisältävien limakeräymien käsittelemiseksi, * * * *. * * tunnettu siitä, että saatetaan limakeräymä kosketuksiin entsyymivalmisteen kanssa, joka sisältää yli 200 AY/ml endo-β-1,2-galaktanaasia. 30

•: * 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymival- ‘ ’ miste sisältää yli 500 AY/ml endo-β-1,2-galaktanaasia.

19. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 109921 28 polysakkaridissa esiintyy galaktoosin ja toisen monosakkaridin välillä p-l,2-sidos, jolloin j toinen monosakkaridi on joko galaktoosi, galakturonihappo, glukuronihappo, arabinoosi, ksyloosi, mannoosi, glukoosi tai ramnoosi ja että endo-β-1,2-galaktanaasi kykenee pilkkomaan tämän sidoksen. 5

20. Jonkin patenttivaatimuksen 17-19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä polysakkaridissa esiintyy p-l,2-sidos galaktoosin ja galakturonihapon välillä ja että endo-P-l,2-galaktanaasi kykenee pilkkomaan tämän sidoksen.

21. Jonkin patenttivaatimuksen 17-20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että endo- β-1,2-galaktanaasi-entsyymin molekyylipaino on 110-130 kDa.

22. Jonkin patenttivaatimuksen 17-21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että endo-β-1,2^ηΐ3^3η338Ϊ-εηί8)7ππη pH-optimi on välillä 5-6,5. 15

23. Jonkin patenttivaatimuksen 17-22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymikäsittely suoritetaan lämpötilassa 20-60 °C, edullisesti 35 - 55 °C, edullisimmin 35 - 50 °C.

24. Jonkin patenttivaatimuksen 17-23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ent syymikäsittely suoritetaan pH:ssa 4-8, edullisesti pH:ssa 5-7 , edullisimmin pH:ssa 5,5 -6.

; ·: : 25. Jonkin patenttivaatimuksen 17-24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että • ·' : käsittelyaika on 5 min -10 vrk, edullisesti 20 min - 1 vrk, edullisimmin 30 min - 2 tuntia. ;··* 25

; '· 26. Jonkin patenttivaatimuksen 17-25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ;,, limakeräymä sisältää Klebsiella pneumoniae- bakteerin tuottamaa polysakkaridia.

27. Jonkin patenttivaatimuksen 17-26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että '!30 limakeräymää käsitellään entsyymivalmisteella ja ennen tai jälkeen tai yhtäaikaisesti vähintään yhdellä seuraavista entsyymeistä: proteaasi, β-glukanaasi, mannanaasi, kitinääsi, levanaasi, hemisellulaasi, pektinaasi, lipaasi tai lysotsyymi.

’ · · ’ 28. Jonkin patenttivaatimuksen 17-27 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 109921 29 I limakeräymää käsitellään entsyymi valmisteella ja ennen tai jälkeen tai yhtäaikaisesti i j vähintään yhdellä biosidilla, joka on valittu joukosta: glutaraldehydi, DBNPA, MBT, kloori-2-metyyli-isotiatsolin-3-oni, metyyli-4-isotiatsolin-3-oni, Bronopol, datsometti, natriumhypokloriitti, peretikkahappo BCDMH (bromiklooridimetyylihydantoini). 5

29. Jonkin patenttivaatimuksen 17-28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmää käytetään limakeräymien hajottamiseen prosessiteollisuudessa.

30. Jonkin patenttivaatimuksen 17-29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 10 menetelmää käytetään limakeräymien hajottamiseen paperikoneilla.

31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi-valmiste annostellaan paperikoneen kiertoveteen.

32. Patenttivaatimuksen 30 tai 31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että annosteltava entsyymimäärä on 5 - 10 000 AY/litra, edullisesti 20- 5 000 AY/litra, edullisimmin 200 -2000 AY/litra kiertovettä.

33. Entsyymivalmiste käytettäväksi mikrobipolysakkareiden hajottamiseen prosessi-20 teollisuudessa, tunnettu siitä, että se sisältää endo-P-l,2-galaktanaasia yli 200 AY/ml, edullisesti yli 500 AY/ml ja että valmiste sisältää lisäksi apuaineita, kuten stabilointiaineita ja valinnaisesti puskureita.

: :': 34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että se on ; ’ ”: 25 tarkoitettu käytettäväksi mikrobipolysakkaridien pilkkomiseen paperikoneympäristössä ja '/•f että se sisältää endo-P-l,2-galaktanaasin lisäksi sellu-ja massateollisuuteen sopivia .: : stabilointiaineita j a valinnaisesti jotain seuraavista: puskureita, yhtä tai useampaa » t ♦ ·.· · kemikaalia, kuten biosidia ja yhtä tai useampaa muuta entsyymiä. ' · ·.’ 30

35. Entsyymivalmiste käytettäväksi mono- tai oligosakkaridien valmistuksessa, tunnet tu siitä, että se sisältää endo-β-1,2-galaktanaasia yli 200 AY/ml, edullisesti yli 500 • ‘ ’ * AY/ml ja että valmiste sisältää lisäksi apuaineita, kuten stabilointiaineita ja valinnaisesti ' ’: puskureita. > « · > I » » k 109921 30

36. Jonkin patenttivaatimuksen 33 - 35 mukainen entsyymivalmisite, tunnettu siitä, että entsyymin molekyylipaino on 110- 130 kDa ja pH-optimi on välillä 5-6,5. 1 109921 31