CZ2000506A3

CZ2000506A3 - Prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky a způsob čištění látek

Info

Publication number: CZ2000506A3
Application number: CZ2000506A
Authority: CZ
Inventors: Jean-Luc Philippe Bettiol
Original assignee: The Procter & Gamble Company
Priority date: 1997-08-14
Filing date: 1998-06-10
Publication date: 2001-03-14
Also published as: BR9811189A; AU8064298A; MXPA00001617A; CN1276005A; MXPA00001610A; BR9811196A; JP4090689B2; EP1009796A1; HUP0003670A2; WO1999009131A1; JP2001515126A; DE69835214D1; ATE230013T1; DE69826294D1; ES2227845T3; ATE332958T1; CA2301156A1; CZ2000502A3; EP1009794A1; JP2001515132A

Description

Prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky a způsob čištění látek

Oblast techniky

Předložený vynález se týká prací detergentního prostředku a/nebo prostředku péče o látky, který obsahuje mannanasu a hlinku. Předložený vynález se týká také způsobu čištění látek, který používá uvedený prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky.

Dosavadní stav techniky

Provedení detergentního výrobku je posuzovány četnými faktory, mezi něž patří schopnost odstraňovat ušpinění a schopnost bránit opětovnému ukládání ušpinění nebo rozpadlých produktů ušpinění na výrobky, které se perou. Detergentní prostředky proto dnes obsahují složitou kombinaci účinných složek, které splňují jisté specifické potřeby. Současné detergentní prostředky obvykle zahrnují povrchově aktivní činidla a detergentní enzymy, které poskytují čištění látek a pečují o látky. Navíc potřeba takových detergentních prostředků, které nejenže vykazují dobré čistící vlastnosti, ale mají také avivážní vlastnosti a další vlastnosti péče o látky, je z oblasti techniky dobře známa.

V současných detergentních prostředcích a prostředcích péče o látky se obvykle používají avivážní hlinky, které poskytují pocit hebkosti. V evropské patentové přihlášce A177 165 je popsáno použití avivážní hlinky spolu s celulasou v detergentních prostředcích. Evropská patentová přihláška A 495 258 popisuje detergentní prostředky, které obsahují povrchově aktivní činidlo, systém stavebních složek a avivážní hlinku a celulasu.

Skvmy/ušpinění od potravin a od kosmetiky představují hlavní část skvm/ušpinění týkajících se zákazníka a často obsahují potravinové přísady, jako jsou zahušťovací činidla/stabilizační činidla. Jako potravinové přísady jsou často používány hy• · i·*·· ·· · ··· • · · ··· · ··· ·· drokoloidní gumy a emulgační činidla. Pojem guma znamená skupinu průmyslově užitečných polysacharidů (polymer s dlouhým řetězcem) nebo jejich derivátů, které hydratují v teplé nebo studené vodě za vzniku viskozních roztoků, disperzí nebo gelů. Gumy jsou klasifikovány jako přírodní a modifikované. Mezi přírodní gumy patří extrakty z mořských semen, produkty, které rostliny vylučují, pryskyřice ze semen nebo kořenů a pryskyřice získané mikrobiální fermentací. Mezi modifikované (semisyntetické) pryskyřice patří deriváty celulosy a škrobu a některé syntetické gumy, jako je málo methoxylovaný pektin, alginát propylenglykolu a karboxymethylová a hydroxypropylová guarová pryskyřice (Gums v Encyclopedia Chemical Technology, 4. vydání, 12, strana 842 až 862, J. Baird, Kelco division of Merck). Viz také Carbohydrate Chemistry for Food Scientists (Eagan Press, 1997) od R.L. Whistlera a J.N. BeMillera, kap. 4, str. 63 až 89, a Direct Food Additives in Fruit Processing od P. Laszlo, Bioprinciples and Applications 1, kap. II, str. 313 až 325 (1996), Technomie publishing. Některé z těchto gum, jako je guarová guma (E412), chlebovník (E410), jsou široce používány samotné nebo v kombinacích v mnoha potravinových aplikacích (Gums v Encyclopedia Chemical Technology, 4. vydání, 12, strana 842 až 862, J. Baird, Kelco division of Merck).

Guarová guma používaná v těchto potravinových a kosmetických barvivech se získává ze semen endosperma motýlokvěté rostliny Cyamopsis tetragonoloba. Guarová guma (nazývaná také guaran) extrahovaná z dvojděložního semene sestává z 1-4,b-D-mannopyranosylové jednotky základního řetězce a používá se jako zahušťovací činidlo při ochucování a u mražených výrobků a v kosmetických přípravcích (H.-D. Belitz Food Chemistry, str. 243, anglická verse druhého vydání, Springer-verlag, 1987, ISBN 0-387-15043-9 (USA)) {Carbohydrate Chemistry for Food Scientists, R.L. Wistler, Eagan Press, 1997, ISBN 0-913250-92-9) a {Industriai Gum, druhé vydání, R. L. Whistler, str. 308, Academie Press, 1973, ISBN, 0-12-74-6252-x). Chlebovníková guma (nazývaná také rohovníková guma nebo chléb svátého Jana) se používá také v potravinářském průmyslu a extrahuje se ze semen stále zelené rostliny pěstované v oblasti Středomoří. Chlebovníková guma se pravděpodobně liší od struktury guarové gumy pouze malým počtem D-galaktosylových postranních • 9 • 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • · 999 ·· 9 řetězců a má stejný 1-4,b-D-mannopyranosylový základní řetězec. U semen luštěnin je ve vodě rozpustný galaktomannan hlavním skladovým sacharidem, který v některých případech představuje až 20 % hmotn. z celkové suché hmotnosti. Galaktomannan má α-galaktosu napojenou na 0-6 mannosového zbytku a může být také acetylován do různého stupně na 0-2 a 0-3 mannosových zbytcích.

Hlinka však není slučitelná s některými hydrokoloidními gumami obsaženými v těchto potravinových a kosmetických barvivech. V oblasti techniky se uvádí, že guarová guma indukuje srážení hlinky díky jejímu potenciálu koagulovat částice kalu nebo hlinky (viz Industrial Gum, druhé vydání, R.L. Whistler, str. 307, Academie Press, 1973, ISBN, 0-12-74-6252-x).

Předmětem předloženého vynálezu je tedy získat prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky, které vykazují optimální provedení aviváže a poskytují optimální odstraňování skvr a provedení čistění, zvláště kosmetických a potravinových skvr.

Shora uvedeným předmětům vyhovuje takové sestavení pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky, které obsahuje mannanasový enzym a hlinku jako avivážní činidlo.

Dále bylo zjištěno, že provedení detergentních prostředků podle předložného vynálezu se zvýší přidáním pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky vybraných ze stavební složky, celulasy a/nebo kationtového povrchově aktivního činidla.

Mannanasy byly identifikovány v několika Bacillus organismech. Například Talbot a spol.: Appl. Environ. Microbiol. 1990, 56(11), 3505 až 3510, popisují β-mannanasu odvozenou od Bacillus stearothermophilus v dimeru s molekulovou hmotností 162 000 a optimem pH 5,5 až 7,5. Mendoza a spol.: World J. Microbiol. Biotech. 1994, 10(5), 551 až 555, popisuje β-mannanasu odvozenou od Bacillus Subtilis s

molekulovou hmotností 38 000, optimem aktivity pň pH 5,0/55 °C a pl 4,8. Japonský patent 0304706 popisuje β-mannanasu odvozenou od Bacíllus sp. s molekulovou hmotností 37 000 ± 3000 měřenou gelovou filtrací, optimem pH 8 až 10 a pl 5,3 až

5,4. Japonský patent 63056289 popisuje výrobu alkalické, termostabilní β-mannanasy, která hydrolyzuje β-1,4-D-mannopyranosidové vazby např. mannanů a poskytuje manno:oligo:sacharidy. Japonský patent 63036774 se týká Bacíllus mikroorganismu FERM P-8856, který produkuje β-mannanasu a β-mannosidasu při alkalickém pH. Vyčištěná mannanasa z Bacíllus amyloliguefaciens a způsob její výroby, která je užitečná při bělení buničiny a papíru, je popsána ve spisu WO 97/11164. Spis WO 91/18974 popisuje hemicelulasu, jako je glukanasa, xylanasa nebo mannanasa, aktivní pň extrémním pH a teplotě, a jejich výrobu. Spis WO 94/25576 popisuje enzym vykazující mannanasovou aktivitu odvozený od Aspergillus aculeatus CBS 101.43, který může být používán pro různé účely, u nichž je požadována degradace nebo modifikace materiálu stěn buněk rostlin nebo řas. Spis WO 93/24622 popisuje mannanasu isolovanou z Tríchoderma reesie pro bělení lignocelulosové buničiny.

Avšak až dosud nikdy dříve nebyla popsána synergická kombinace mannanasy a hlinky pro optimální provedení aviváže a pro optimální provedení odstraňování skvrn a čištění, zvláště kosmetických a potravinových skvrn v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky obsahujících mannanasu a hlinku pro dosažení optimálního provedení aviváže a pro dosažení optimálního odstraňování skvrn a provedení čistění, zvláště kosmetických a potravinových skvrn.

V oblasti techniky je známo, že hlinka není slučitelná s některými hydrokoloidními gumami obsaženými například v potravinových a kosmetických skvrnách. Bylo uvedeno, že guarová guma indukuje srážení hlinky díky svému potenciálu • · ···· « · · · · ·· · · ·· ·· ·· ·· koagulovat částice kalu nebo hlinky (viz Industrial Gum, druhé vydání, R.L. Whistler, str. 307, Academie Press, 1973, ISBN, 0-12-74-6252-x).

Bez ohledu na teorii bylo zjištěno, že takto vyvločkovaná hlinka má snížený avivážní účinek. Navíc bylo pozorováno, že hlinka a ušpinění z prací náplně se opětovně ukládají na zbytcích guarové gumy a způsobují ušpinění skvrnami. Překvapivě bylo zjištěno, že mannanasový enzym hydrolyzuje hydrokoloidní gumy, zvláště guarové gumy. Tato enzymová hydrolýza vede k nepřítomnosti guarové gumy při praní. Nedochází tedy k žádnému vločkování hlinky a hlinka si zachovává svůj plný potenciál péče o látky. Navíc nezbývají na látce žádné zbytky guarové gumy a tedy nedochází k žádnému opětovnému ukládání hlinky a ušpinění pň následující náplni praní a tedy k žádnému zabarvení skvrnami.

Mannnasový enzym: Podstatným prvkem pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky podle předloženého vynálezu je mannanasový enzym.

V předloženém vynálezu jsou zahrnuty následující tři enzymy degradující mannany: EC 3.2.1.25: β-mannosidasa, EC 3.2.1.78: endo-1,4-B-mannosidasa, označovaná zde dále jako mannanasa, a EC 3.2.1.100: 1,4B-mannobiosidasa (IUPAC Clasification - Enzyme Nomenclature, 1992 ISBN 0-12-227165-3, Academie Press).

Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu výhodněji obsahují β-1,4-mannosidasu (E.C. 3.2.1.78) označovanou jako mannanasa. Pojem mannanasa nebo galaktomannanasa označuje mannanasový enzym definovaný podle oblasti techniky s oficielním názvem mannan endo-1,4-beta-mannosidasa a s alternativními názvy beta-mannanasa a endo-1,4-mannanasa a katalyzují tuto reakci: náhodná hydrolýza 1,4-beta-D-mannosidových vazeb v mannanech, galakotomannanech, glukomannanech a galaktoglukamannanech.

Konkrétně mannanasy (EC 3.2.1.78) představují skupinu polysacharas, které degradují mannany a znamená enzymy, které jsou schopny štěpit polyosové řetězce obsahující mannosové jednotky, tj. jsou schopny štěpit glykosidické vazby v mannanech, glukomannanech, galakotmannanech a galaktoglukomannanech. Mannany jsou polysacharidy, které mají základní skelet, který je složen z β-1,4-navázané mannosy, glukomannany jsou polysacharidy, které mají základní skelet, který je složen z více či méně pravidelně se opakující β-1,4-navázané mannosy a glukosy, galaktomannany a galaktogklukomannany jsou mannany a glukomannany s a-1,6-navázanými galaktosovými vedlejšími větvemi. Tyto sloučeniny mohou být acetylovány.

Degradace galaktomannanů a galaktoglukomannanů je usnadněna plným nebo částečným odstraněním galaktosových vedlejších řetězců. Dále pak degradace acetylovaných mannanů, glukomannanů, galaktomannanů a galaktoglukomannanů je usnadněna plnou nebo částečnou deacetylací. Acetylové skupiny mohu být odstraněny alkalickými nebo mannanovými acetylesterasami. Oligomery, které jsou uvolňovány z mannanas nebo kombinací mannanas a α-galaktosidasy a/nebo mannan-acetyl-esteras, mohou být dále degradovány za uvolnění volné maltosy β-mannosidasou a/nebo β-glukosidasou.

Mannanasy byly identifikovány v několika Bacillus organismech. Například Talbot a spol.: Appl. Environ. Microbiol. 1990, 56(77), 3505 až 3510, popisuje β-mannanasu odvozenou od Bacillus steaiOthermophilus v dimeru s molekulovou hmotností 162 000 a optimem pH 5,5 až 7,5. Mendoza a spol.: World J. Microbiol. Biotech. 1994, 10(5), 551 až 555, popisuje β-mannanasu odvozenou od Bacillus subtilis s molekulovou hmotností 38 000, optimem aktivity při pH 5,0/55 °C a pl 4,8. Japonský patent 0304706 popisuje β-mannanasu odvozenou od Bacillus sp. s molekulovou hmotností 370 000 měřenou gelovou filtrací, optimem pH 8 až 10 a pl 5,3 až 5,4. Japonský patent 63056289 popisuje výrobu alkalické, termostabilní β-mannanasy, která hydrolyzuje β-1,4-D-mannopyranosidové vazby např. mannanů a poskytuje manno-oligo-sacharidy. Japonský patent 63036774 se týká Bacillus tt ·· · · · · · · · · ·· • 9 · · · · · · · · · ···· ·· · ···* • ·· · · · · ··· * · · ···· ···· · · * · ·· ·« ·· ·· 99 99 mikroorganismu FERM P-8856, který produkuje β-mannanasu a β-mannosidasu při alkalickém pH. Japonský patent 08051975 popisuje alkalické beta-mannanasy z alkalofiního Bacillus sp. AM-001. Vyčištěná mannanasa z Bacillus amyloliguefaciens užitečná při bělení buničiny a papíru a způsob její výroby je popsán ve spisu WO 97/11164. Spis WO 91/18974 popisuje hemicelulasu, jako je glukanasa, xylanasa nebo mannanasa, aktivní při extrémním pH a teplotě. Spis WO 94/25576 popisuje enzym z Aspergillus aculeatus CBS 101.43, který vykazuje mannanasovou aktivitu a který může být používán pro degradaci nebo modifikaci materiálu stěn buněk rostlin nebo řas. Spis WO 93/24622 popisuje mannanasu isolovanou z Trichoderma reseei, užitečnou pro bělení lignocelulosové buničiny. Hemicelulasa, která je schopna degradovat hemicelulosu obsahující mannan, je popsána ve spisu WO 91/18974. Vyčištěná mannanasa z Bacillus amyloliquefaciens je popsána ve spisu WO97/11164.

Mannanasovým enzymem bude zvláště alkalická mannanasa, jak je definována níže, nejvýhodněji mannanasa pocházející z bakteriálního zdroje. Zvláště prací detergentní prostředek podle předloženého vynálezu bud obsahovat alkalickou mannanasu vybranou z mannanas z kmene Bacillus agaradherens a/nebo Bacillus subtilisis kmene 168, gen yght.

Pojem alkalický mannanasový enzym je míněn tak, že zahrnuje enzym, který má enzymatickou aktivitu alespoň 10, s výhodou alespoň 25, výhodněji alespoň 40 % své maximální akvitiy při daném pH v rozmezí od 7 do 12, s výhodou od 7,5 do 10,5.

Nejvýhodněji prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu budou obsahovat alkalickou mannanasu z Bacillus agaradherens. Uvedená mannanasa znamená

i) polypeptid produkovaný Bacillus agaradherens, NCIMB 40482, nebo ii) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedena v polohách až 343 sekv. id. č. 2

9 4 4 4 4

4 4 4

4 4 ·

4 4 4 4

9 9 9 4 4

9 99 99

9 « · 4 4 4

4 4 4 4 4

MKKKLSQIYHLIICTLIISVGIMGITTSPSAASTGFYVDGNTLYDANGQPFVMRGIN

HGHAWYKDTASTAIPAIAEQGANTIRIVLSDGGQWEKDDIDTIREVIELAEQNKM

VAWEVHDATGRDSRSDLNRAVDYWÍEMKDALIGKEDTVIINIANEWYGSWDGS

AlVADGYlDVIPKLRDAGLTHTLMVDAAGWGQYPQSIHDYGQDVFNADPLKNTM

FSIHMYEYAGGDANTVRSNIDRVIDQDLALVIGEFGHRHTDGDVDEDTILSYSEE

T3TGWLAWSWKGNSTEWDYLDLSE9WAGQHLTDWGNRIVHGADGLQETSKP

3TVFTDDNGGHPEPPTATTLYDFEGSTQGWHGSNVTGGPWSVTEWGASGNY

8L.KADVNLTSNSSHELYSEQSRNLHGYSQLNATVRHANWGNPGNGMNARLYV

KVGSDYTWHSGPFTRINSSNSGTTLSFDLNNIENSHHVREIGVQFSAADNSSGQ

TALYVDNVTLR (sekv. id. č. 2) nebo iii) analog polypeptidu definovaný v i) nebo ii), který je alespoň ze 70 % homologní s uvedeným polypeptidem nebo který je odvozen od uvedeného polypeptidu substitucí, delecí nebo adicí jedné nebo několika aminokyselin nebo který je imunologicky reaktivní s polyklonální protilátkou proti uvedenému polypeptidu ve vyčištěné formě.

Předložený vynález zahrnuje také isolovaný polypeptid, který má mannanasovou aktivitu vybranou ze skupinu sestávající z

a) polynukleotidových molekul kódující polypeptid, který má mannanasovou aktivitu a který obsahuje sekvenci nukleotidů, jak je uvedena v sekv. id. č. 1

ATGAAAAAAAAGTTATCACAGATTTATCATTTAATTATTTGCACACTTATAATA

AGTGTGGGAATAATGGGGATTACAACGTCCCCATCAGCAGCAAGTACAGGC

TTTTATGTTGATGGCAATACGTTATATGACGCAAATGGGCAGCCATTTGTCAT

GAGAGGTATTAACCATGGACATGCTTGGTATAAAGACACCGCTTCAACAGCT

ATTCCTGCCATTGCAGAGCAAGGCGCCAACACGATTCGTATTGTTTTATCAG

A YGGCGGTCAATGGGAAAAAGACGACATTGACACCATTCGTGAAGTCATTG

AGCTTGCGGAGCAAAATAAAATGGTGGCTGTCGTTGAAGTTCATGATGCCA

CGGGTCGCGATTCGCGCAGTGATT! AAATCGAGCCGTTGATTATTGGATAG

A/áATGAAAGATGCGCTTATCGGTAAaGAAGATACGGTTATTATTAACATTGCA • 9 · · 9 9 · · · · · • · ·· ·· · 9 9 9 *

99 999 9 999 99 9

9999 9 9 · 9 9999

99 99 99 99 99

AACGAGTGGTATGGGAGTTGGGATGGCTCAGCTTGGGCCGATGGCTATATT

GATGTCATTCCGAAGCTTCGCGATGCCGGCTTAACACACACCTTAATGGTTG

ArGCAGCAGGATGGGGGCAATATCCGCAATCTATTCATGATTACGGACAAG

ATGTGTTTAATGCAGATCCGTTAAAAAATACGATGTTCTCCATCCATATGTAT

GAGTATGCTGGTGGTGATGCTAACACTGTTAGAICAAATATTGATAGAGTCA

TčGATCAAGACCTTGCTCTCGTAATAGGTGAATTCGGTCATAGACATACTGA

TGGTGATGTTGATGAAGATACAATCCTTAGTTATTCTGAAGAAACTGGCACA

GGGTGGCTCGCTTGGTCTTGGAAAGGCAACAGTACCGAATGGGACTATTTA

GACCTTTCAGAAGACTGGGCTGGTCAACATTTAACTGATTGGGGGAATAGAA

TTGTCCACGGGGCCGATGGCTTACAGGAAACCTCCAAACCATCCACCGTAT rrACAGATGATAACGGTGGTCACCCTGAACCGCCAACTGCTACTACCTTGTA

TGACTTTGAAGGAAGCACACAAGGGTGGCATGGAAGCAACGTGACCGGTG

GCCCTTGGTCCGTAACAGAATGGGGTGCTTCAGGTAACTACTCTTTAAAAGC

C GATGTAAATTTAACCTC AAATTCTí CACATGAACTGTATAGTGAACAAAGTC gtaatctacacggatactctcagctcaacgcaaccgttcGccatgccaattg

GGGAAATCCCGGTAATGGCATGAATGCAAGACTTTACGTGAAAACGGGCTC

TGATTATACATGGCATAGCGGTCCTTTTACACGTATCAATAGCTCCAACTCA

GGAACAACGTTATCTTTTGATTTAAACAACATCGAAAATAGTCATCATGTTAG

GGAAATAGGCGTGCAATTTTCAGCGGCAGATAATAGCAGTGGTCAAACTGC

TOTATACGTTGATAACGTTACTTTAAGATAG (sekv. id. č. 1) od nukleotidu 97 do nukleotidu 1029,

b) molekuly homologní s ad a),

c) polynukleotidové molekuly, které kódují polypeptid, který má mannanasovou aktivitu a který je alespoň ze 70 % identický s aminokyselinovou sekvencí sekv. id. 6. 2 od aminokyselinového zbytku 32 k aminokyselinovému zbytku 343,

d) molekul doplňkových k ad a), b) nebo c) a

e) degenerovaných nukleotidových sekvencí a), b), c) nebo d).

Plasmid pSJ1678, který obsahuje polynukleotidovou molekulu (DNA sekvence) kódující mannanasu podle předloženého vynálezu, byl transformován do kmene ·· · · ·· · · · · ·· 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 9· 99

Escherichia coli, který byl uložen vynálezci podle Budapešťské dohody o mezinárodním rozpoznávání uložených mikroorgamismů pro účely patentových postupů v Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, SRN, 18. května 1998, pod číslem uložení DSM 12180.

Druhým nejvýhodnějším enzymem je mannanasa z Bacillus subtilisis kmene 168, která

i) je kódována kódující částí DNA sekvence uvedenou v sekv. id. č. 5

AAT TGG CGC ATA CTG TGT CGC CTG TGA ATC CTA ATG CCC AGC AGA CAA CAA AAA CAG TGA TGA ACT GGC TTG CGC ACC TGC CGA ACC GAA CGG AAA ACA GAG TCC TTT CCG GAG CGT TCG GAG GTT ACA GCC ATG ACA CAT TTT CTA TGG CTG AGG CTG ATA GAA TCC GAA GCG CCA CCG GGC AAT CGC CTG CTA TTT ATG GCT GCG ATT ATG CCA GAG GAT GGC TTG AAA CAG CAA ATA TTG AAG ATT CAA TAG ATG TAA GCT GCA ACG GCG ATT TAA TGT CGT ATT GGA AAA ATG GCG GAA TTC CGC AAA TCA GTT TGC ACC TGG CGA ACC CTG CTT TTC AGT CAG GGC ATT TTA AAA CAC CGA TTA CAA ATG ATC AGT ATA AAA ACA TAT TAG ATT CAG CAA CAG CGG AAG GGA AGC GGC TAA ATG CCA TGC TCA GCA AAA TTG CTG ACG GAC TTC AAG AGT TGG AGA ACC AAG GTG TGC CTG TTC TGT TCA GGC CGC TGC ATG AAA TGA ACG GCG AAT GGT TTT GGT GGG GAC TCA CAT CAT ATA ACC AAA AGG ATA ATG AAA GAA TCT CTC TAT ATA AAC AGC TCT ACA AGA AAA TCT ATC ATT ATA TGA CCG ACA CAA GAG GíAC TTG ATC ATT TGA TTT GGG TTT ACT CTC CCG ACG CCA ACC GAG ATT TTA AAA CTG ATT TTT ACC CGG GCG CGT CTT ACG TGG ATA TTG TCG GAT TAG ATG CGT ATT TTC AAG ATG CCT ACT CGA TCA ATG GAT ACG ATC AGC TAA CAG CGC TTA ATA AAC CAT TTG CTT TTA CAG AAG TCG GCC CGC AAA CAG CAA ACG GCA GCT TCG ATT ACA GCC TGT TCA TCA ATG CAA TAA AAC AAA AAT ATC CTA AAA CCA TTT ACT TTC TGG CAT GGA ATG ATG AAT GGA GCG CAG CAG TAA ACA AGG GTG CTT CAG G'!T TAT ATC ATG ACA GCT GGA CAC TCA ACA AGG GAG AAA TAT GGA ATG GTG ATT CTT TAA CGC CAA TCG TTG AGT GAA TCC GGG ATC 3' (sekv. id. č. 5) ·· ·· • · « · · · · ···· • · ·· * · « • ·· ··· · ··· ·· 9 • · · · · · · 9 · ·· · ·* ·· »« ·· ** ·· nebo analogem uvedené sekvence a/nebo ii) znamená polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedena v sekv. id. č. 6 ______ ____________ ydhT 1

L.l^:KKHTISLLIIFLLASAVLAKPIEAHTVSPVNPNAQQTTKTVMNWLAHL 50 ydhT 51

PNRTENRVLSGAFGGYSHDTFSMAEADRIRSATGQSPAIYGCDYARGWLE 100 ydhT 101

TANIEDSIDVSCNGDLMSYWKNGGIPQISLHLANPAFQSGHFKTPITNDQ 150 ydhT 151

YKNILDSATAEGKRLNAMLSKIADGLQELENQGVPVLFRPLHEMNGEWFW 200 ydhT 201

WGLTSYNQKDNERISLYKQLYKKIYHYMTDTRGLDHLIWVYSPDANRDFK250 ydhT 251

TDFYPGASYVDIVGLDAYFQDAYSINGYDQLTALNKPFAFTEVGPQTANG 300 ydhT 301

SFDYSLFINAIKQKYPKTIYFLAWNDEV7SAAVNKGASALYHDSWTLNKGE 350 ydhT 351

IWNGDSLTPIVE*. 363 (sekv. id. č. 6) nebo iii) znamená analog polypeptidu definovaný v ad ii), který je alespoň ze 70 % homologní s uvedeným polypeptidem nebo který je odvozen od uvedeného polypeptidu substitucí, delecí nebo adicí jedné nebo několika aminokyselin, nebo který je imunologicky reaktivní s polyklonální protilátkou proti uvedenému polypeptidu ve vyčištěné formě.

Předložený vynález zahrnuje také isolovaný polypeptid, který má mannanasovou aktivitu, vybraný ze skupinu sestávající z ·* ·· ·* ··«· 99 99 • » · * 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 99

a) polynukleotidových molekul kódujících polypeptid, který má mannanasovou aktivitu a který obsahuje sekvenci nukleotidů, jak je uvedena v sekv. id. č. 5,

b) molekuly homologní s ad a),

c) polynukleotidové molekuly, které kódují polypeptid, který má mannanasovou aktivitu a který je alespoň ze 70 % identický s aminokyselinovou sekvencí sekv. id. č. 6,

d) molekul doplňkových k ad a), b) nebo c) a

e) degenerovaných nukleotidových sekvencí a), b), c) nebo d).

V následující části spisu budou, před další podrobnější diskusí tohoto vynálezu, uvedeny definice některých pojmů.

Pojem ortholog (nebo druhový homolog) znamená polypeptid nebo protein získaný z jednoho druhu, který je homologní s analogickým polypeptidem nebo proteinem z různých druhů.

Pojem paralog označuje polypeptid nebo protein získaný z daných druhů, který je homologní s jiným polypeptidem nebo proteinem ze stejných druhů.

Pojem expresní vektor znamená takovou DNA molekulu, lineární nebo cirkulámí, která obsahuje segment kódující polypeptid, o který s jedná, odštěpitelně napojený na další segmenty, které zajišťují jeho transkripci. Tyto další segmenty mohou zahrnovat promotorovou a terminační sekvenci a mohou popřípadě obsahovat jeden nebo více počátků replikace, jeden nebo více selektovatelných markérů, zesilovač, polyadenylační signál a podobné. Expresní vektory jsou obecně odvozeny od plasmidové nebo virové DNA nebo mohou obsahovat prvky obou. Expresní vektor podle vynálezu může znamenat jakýkoliv expresní vektor, který je vhodně podroben postupům rekombinace DNA. Výběr vektoru bude často záviset na hostitelské buňce, do které se má vektor zavést. Vektor může tedy znamenat autonomně se replikující vektor, tj. takový vektor, který existuje jako mimochromosomová částice, jehož replikace je nezávislá na replikaci chromosomu, např. plasmid. Vektor může znamenat také

9« 9 9 «99« · 9 9 9

9 9 9 9 9 • 9 »9 • 9*9 99 · «9 9 9 • * * 9 9 9 9

9 9 9 9 *

99 99 •9 9*99

9 9 9 99 takový vektor, který, jestliže se zavede do hostitelské buňky, se integruje do genomu hostitelské buňky a replikuje se společně s chromosomem (chromosomy), do něhož (nichž) je integrován.

Pojem rekombinant exprimovaný nebo rekombinantně exprimován, jak se zde používá v souvislosti s expresí polypeptidu nebo proteinu, je definován podle standardní definice v oblasti techniky. Rekombinantní exprese proteinu se obvykle provádí použitím shora bezprostředně popsaného expresního vektoru.

Pojem isolovaný, jestliže se aplikuje na polynukleotidovou molekulu, označuje, že polynukleotid byl odstraněn ze svého přírodního genetického prostředí a je tedy zbaven jiných vnějších nebo nechtěných kódujících sekvencí a je ve formě vhodné pro použití v genetickém inženýrství sestavených systémech produkce proteinů. Tyto isolované molekuly jsou takové molekuly, které jsou odděleny od jejich přírodního prostředí a zahrnují cDNA a genomové klony. Isolované DNA molekuly podle předloženého vynálezu neobsahují jiné geny, se kterými jsou obvykle asociovány, ale mohou obsahovat přirozeně se vyskytují 5' a 3' nepřekládané oblasti, jako jsou promotory a terminátory. Identifikace asociovaných oblastí bude zřejmá zručnému odborníkovi z oblasti techniky (viz například Dynan a Tijan: Nátuře 1985, 376, 774 až 778).

Pojem isolovaný polynukleotid může být také nazýván klonovaný polynukleotid. Jestliže se aplikuje na protein/polypeptid, pojem isolovaný znamená, že protein se nachází v jiném stavu než je jeho přírodní prostředí. Ve výhodné formě existuje isolovaný protein v podstatě bez jiných proteinů, zvláště bez jiných homologních proteinů (tj. homologních nečistot (viz níže)). Je výhodné získat protein ve více než 40% čisté formě, výhodněji více než 60% čisté formě. Ještě výhodnější je získat protein, který je ve vysoce čisté formě, tj. větší než 80%, výhodněji větší než 95% a ještě výhodněji větší než 99% (hmotn.) čisté formě, jak se stanoví podle SDS-PAGE.

• · · ·· · 4 4 4 4

44 4 4 · 4 4 4 4

4 4 4 4 4 444 44 4 •4 4 4 44 4 4 44 4

44 44 44 44

Pojem isolovaný protein/polypeptid může být alternativně označen také jako vyčištěný protein/polypeptid.

Pojem homologní nečistoty znamená jakoukoliv nečistotu (např. jiný polypeptid než polypeptid podle vynálezu), který pochází z homologní buňky, z níž byl polypeptid podle vynálezu původně získán. Pojem získaný z, jak je zde používán v souvislosti se specifickým mikrobiálním zdrojem, znamená polynukleotid a/nebo polypeptid produkovaný specifickým zdrojem nebo buňkou, do níž byl vložen gen z tohoto zdroje.

Pojem odštěpitelně napojený, jestliže se týká DNA segmentů, označuje skutečnost, že segmenty jsou uspořádány tak, že fungují v souladu s jejich zamýšlenými účely, např. transkripce začíná v promotoru a pokračuje kódujícím segmentem do terminátoru.

Pojem nukleotid označuje jedno- nebo dvou-vláknový polymer deoxyribonukleotidových nebo ribonukleotidových nukleotidů čtený od 5' ke 3' konci. Mezi polynukleotidy patří RNA a DNA. Tyto polynukleotidy mohou být isolovány z přírodních zdrojů, být syntetizovány in vitro nebo se mohou připravovat kombinací přírodních a syntetických molekul.

Pojem doplňky polynukleotiodvých molekul označují polynukleotidové molekuly, které mají doplňkovou sekvenci polynukleotidů a obrácenou orientaci při srovnání s referenční sekvencí. Například sekvence 5' ATGCACGGG 3' je doplňková k sekvenci 5' CCCGTGCAT 3'.

Pojem degenerovaná nukleotidová sekvence označuje takovou sekvenci nukleotidů, která zahrnuje jeden nebo více degenerovaných kodonů (při srovnání s referenční polynukleotidovou molekulou, která kóduje polypeptid). Degenerované kodony obsahují různé triplety nukleotidů, ale kódují stejné aminokyselinové zbytky (tj. oba GAU a GAC triplety kódují Asp).

• · ·· 99 99 99 99

Pojem promotor označuje část genu obsahující DNA sekvence, které zajišťují navázání RNA polymerasy a iniciaci transkripce. Promotorové sekvence se obvykle, ale ne vždy, nalézají v 5' nekódujících oblastech genů.

Pojem sekreční signální sekvence označuje DNA sekvenci, která kóduje polypeptid (sekreční peptid), který, jako složka většího polypeptidu, směřuje větší polypeptid sekreční cestou buňky, v níže je syntetizován. Větší polypeptid je obvykle štěpen, aby se odstranil sekreční peptid během přenosu sekreční cestou.

Jak používat sekvenci podle vynálezu pro získání jiných příbuzných sekvencí: Informace o popsaných sekvencích podle vynálezu, které se týkají polynukleotidové sekvence kódující mannanasu podle vynálezu, se mohou používat jako nástroj pro identifikování jiných homologních mannanas. Například polymerasová řetězová reakce (PCR) se může používat pro amplifikování sekvencí kódujících jiné homologní mannanasy z různých mikrobiálních zdrojů, zvláště různých druhů Bacillus.

Test aktivity: Polypeptid podle vynálezu, který má mannanasovou aktivitu, může být testován na mannanasovou aktivitu podle standamdích testovacích postupů známých v oblasti techniky, jako je aplikování roztoku, který má být testován, na dírky o průměru 4 mm vyražené do agarových desek obsahujících 0,2% (hmotn.) AZCL galaktomannan (carob), tj. substrát pro testování endo-1,4-beta-D-mannanasy dostupný jako kat č. I-AZGMA od společnosti Megazyme při ceně US $ 110,00 za 3 gramy (internetová adresa firmy Megazyme: http:/www.megazyme.com/Purchase/index.html).

Polynukleotidy: Isolovaný polynukleotid podle vynálezu bude hybridizovat s oblastmi sekv. id. č. 1 podobných velikostí nebo se sekvencí k němu doplňkové za alespoň mírných selektivních podmínek.

• ·

99 9

Polynukleotidy podle vynálezu budou zvláště hybridizovat s denaturovanou sondou dvojvláknové DNA obsahující buď plnou sekvenci uvedenou mezi polohami 97 a 1029 shora uvedené sekv. id. č. 1 nebo jakoukoliv sondou obsahující podsekvence sekv. id. č. 1 s délkou alespoň 100 párů nukleotidů za alespoň mírných selektivních podmínek, ale s výhodou za podmínek vysoké selektivity, jak je podrobně popsáno níže. Vhodné experimentální podmínky pro stanovení hybridizace za mírné nebo vysoké selektivity mezi nukleotidovou sondou a homologní DNA nebo RNA sekvencí zahrnují předběžné namočení filtru obsahujícího DNA fragmenty nebo RNA pro hybridizaci v 5 x SSC (chlorid sodný/citrát sodný, Sambrook a spol. 1989) po dobu 10 minut a předhybridizaci filtru v roztoku 5 x SSC, 5 x Denhardtově roztoku (Sambrook a spol. 1989), 0,5% (hmotn.) SDS a 100 pg/ml denaturované sonikované lososové spermální DNA (Sambrook a spol. 1989), následovuje hybridizace ve stejném roztoku obsahujícím koncentraci 10 ng/ml náhodného primeru (Freiberg A.P. a Vogelstein B.: Anal. Biochem. 1983, 132, 6 až 13.), 32P-dCTP-označené (specifická aktivita vyšší než 1.109 impulsů za minutu/pg) sondy po dobu 12 hodin při 45 °C. Filtr se pak promývá dvakrát 30 minut ve 2 x SSC, 0,5% SDS při alespoň 60 °C (mírná selektivita), ještě výhodněji při alespoň 65 °C (mímá/vysoká selektivita), ještě výhodněji při alespoň 70 °C (vysoká selektivita) a ještě výhodněji při alespoň 75 °C (velmi vysoká selektivita).

Molekuly, se kterými za těchto podmínek se oligonukleotidová sonda hybridizuje, se detekují na rentgenový film.

Jak bylo shora uvedeno, isolované polynukleotidy podle předloženého vynálezu zahrnují DNA a RNA. Způsoby isolování DNA a RNA jsou dobře známy v oblasti techniky. DNA a RNA kódující geny, o které se jedná, lze klonovat v genových bankách nebo DNA knihovnách způsoby známými v oblasti techniky.

Polynukleotidy kódující polypeptidy, které mají mannanasovou aktivitu podle vynálezu, se potom identifikují a isolují, například hybridizaci nebo PCR. Předložený vynález dále poskytuje protějšek polypeptidů a polynukleotidů z různých bakteriálních

kmenů (orthology nebo paralogy). Zvláště zajímavé jsou mannanasové polypeptidy z grampositivních alkalofilnich kmenů, včetně druhů Bacíllus.

Druhové homology polypeptidu s mannanasovou aktivitou podle vynálezu mohou být klonovány použitím informací a prostředků získaných podle tohoto vynálezu v kombinaci s konvenčními technikami klonování. Například DNA sekvence podle předloženého vynálezu mohou být klonovány použitím chromosomové DNA získané z takového typu buněk, který exprimuje protein. Vhodné zdroje DNA mohou být identifikovány sondováním Northemových blotů sondami, které jsou navrženy podle sekvencí popsaných v tomto vynálezu. Z chromosomové DNA positivní buněčné linie se pak připraví knihovna. DNA sekvence podle vynálezu kódující polypeptid, který má mannanasovou aktivitu, lze pak isolovat rozmanitými způsoby, jako je sondování sondami navrženými podle sekvencí popsaných v předloženém spisu a nárocích nebo jednou nebo více řadami degenerovaných sond založených na popsaných sekvencích. DNA sekvence podle vynálezu může být také klonován pomocí polymerasové řetězové reakce nebo PCR (Mullis: USA patent 4 683 202) použitím primerů navržených podle sekvencí popsaných v tomto vynálezu. Mezi dalšími způsoby se může používat DNA knihovna pro tranformování nebo transfektování hostitelských buněk a exprese DNA, o kterou se jedná, může být detekována protilátkou (monoklonální nebo polyklonální) proti mannanase klonované z B. agaradherens, NCIMB 40482, exprimována a vyčištěna tak, jako je popsáno v části pojednávající o materiálech a způsobech a v příkladu 1, nebo testem aktivity týkajícím se polypeptidu, který má mannanasovou aktivitu.

Mannanasu kódující část DNA sekvence klonovaná do plasmidu pSJ1678 přítomné v Escheríchia coli DSM 12180 a/nebo analogická DNA sekvence podle vynálezu může být klonována z kmene bakteriálních druhů Bacíllus agaradherens, s výhodou kmene NCIMB 40482, produkující enzym s aktivitou degradující mannan, nebo jiného nebo příbuzného organismu, jak je zde popsáno.

···· ·· ·· ♦ · ··

Analogická sekvence může být zkonstruována také na bázi DNA sekvence získatelné z plasmidu přítomného v Escherichia coli DSM 12180 (o kterém se předpokládá, že je identický s napojenou sekv. id. č. 1), např. jako jeho subsekevnce, a/nebo zavedením nukleotidových substitucí, které nepůsobí proti jiné aminokyselinové sekvenci mannanasy kódované DNA sekvencí, ale která odpovídá kodonu hostitelského organismu, který je uvažován pro produkci enzymu, nebo zavedením substituce nukleotidů, která může poskytnou odlišnou aminokyselinovou sekvenci (tj. variantu enzymu degradujícího mannan podle vynálezu).

Polypeptidy; Sekvence aminokyselin č. 32 až 343 sekv. id. č. 2 je maturovaná mannanasová sekvence.

Předložený vynález poskytuje také mannanasové polypeptidy, které jsou v podstatě homologní s polypeptidem sekv. id. č. 2 a jeho druhovými homology (paralogy nebo orthology). Pojem v podstatě homologní je zde používán k označení polypeptidů, které mají 70%, s výhodou alespoň 80%, výhodněji alespoň 85% a ještě výhodněji alespoň 90% identitiu sekvence se sekvencí uvedenou v aminokyselinách 32 až 343 sekv. id. č. 2 nebo jejich orthologů nebo paralogů. Tyto polypeptidy budou výhodněji identické z alespoň 95 % a nejvýhodněji identické z 98 nebo více % se sekvencí uvedenou v aminokyselinách 32 až 343 sekv. id. č. 2 nebo s jeho orthology nebo paralogy. Procento identity sekvence se stanoví konvenčními způsoby, pomocí počítačových programů známých v oblasti techniky jako GAP, které se získají v programovém balíku GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, verse 8, srpen 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) jak popisují Needleman S.B. a Wunsch C.D.: Journal of Molecular Biology 1970, 48, 443 až 453, která je zde celá zahrnuta jako odkaz. GAP je používán s následujícími nastaveními pro srovnání polypeptidové sekvence: GAP creation penalty 3,0 a GAP extension penalty 0,1.

> · · ( ► · · 4 • · ··

Identita sekvence polynukleotidových molekul se stanovuje podobnými způsoby použitím GAP s následujícími nastaveními pro srovnání DNA sekvence: GAP creation penalty 5,0 a GAP extension penalty 0,3.

Enzymový přípravek podle vynálezu je s výhodou odvozen od mikroorganismu, s výhodou bakterie nebo hub, zvláště bakterie, jako je bakterie patřící do rodu Bacillus, s výhodou alkalofilní Bacillus kmen, který může být vybrán ze skupiny sestávající z druhů Bacillus agaradherens a velice příbuzných druhů Bacillus, při čemž všechny druhy jsou s výhodou alespoň z 95 %, dokonce výhodněji z alespoň 98 % homologní s Bacillus agaradherens podle seřazených 16S rDNA sekvencí.

V podstatě homologní proteiny a polypeptidy se vyznačují tím, že mají jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí. Tyto změny jsou s výhodou minoritní povahy, to znamená jde o konzervativní aminokyselinové substituce (viz tabulka 2) a další substituce, které významně neovlivňují skládání nebo aktivitu proteinu nebo polypeptidu, malé delece, typicky jedna až asi 30 aminokyselin, a malá prodloužení na aminovém nebo karboxylovém konci, jako je methioninový zbytek na aminovém konci, malý vazebný peptid až do kolem 20 až 25 zbytků nebo malá prodloužení, která usnadňují čištění (afinitní značka), jako je polyhistidinový úsek, protein A (Nilsson a spol.: EMBO J. 1985, 4, 1075; Nilsson a spol.: Methods Enzymol. 1991, 198, 3. Obecně viz Ford a spol.: Protein Expression and Purifícation 1991, 2, 95 až 107, které jsou zde zahrnuty jako odkazy. DNA, které kódují afinitní značku, jsou dostupné od komerčních dodavatelů (např. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ.; New England Biolabs, Beverly, Ma.). I když změny shora popsané jako výhodné minoritní povahy, tyto změny mohou být také větší povahy, jako je napojení větších polypeptidů s až 300 aminokyselinami nebo více jak jako rozšíření na aminovém tak na karboxylovém konci na mannanasový polypeptid podle vynálezu.

• 4 4444 • 4 44

4 · 4 4 • 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4

4 44

Tabulka 1

Konzervativní aminokyselinové substituce

bazické:	arginin, lysin, histidin
kyselé:	kyselina glutamová, kyselina asparagová
polární:	glutamin, asparagin
hydrofobní:	leucin, isoleucin, valin
aromatické:	fenylalanin, tryptofan, tyrosin
malé:	glycin, alanin, serin, threonin, methionin

Vedle 20 standardních aminokyselin mohou být za aminokyselinové zbytky polypeptidu podle tohoto vynálezu substituovány nestandardní aminokyseliny (jako je 4-hydroxyprolin, 6-N-methylysin, 2-aminoisomáselná kyselina, isovalin a a-methylserin). Za aminokyselinové zbytky může být substituován omezený počet nekonzervativních aminokyselin, aminokyselin, které nejsou kódovány genetickým kódem, a nepřirozených aminokyselin. Nepřirozené aminokyseliny byly modifikovány také po proteinové syntéze a/nebo mají chemickou strukturu jejich postranního řetězce (postranních řetězců) odlišnou od struktury standardních aminokyselin. Nepřirozené aminokyseliny mohou být chemicky syntetizovány nebo s výhodou jsou dostupné komerčně a patří mezi ně kyselina pipekolová, thiazolidinkarboxylová kyselina, dehydroprolin, 3- a 4-methylprolin a 3,3-dimethylprolin.

Esenciální aminokyseliny v mannanasových polypeptidech podle předloženého vynálezu mohou být identifikovány podle postupů známých v oblasti techniky, jako je místně řízená mutageneze nebo alaninem sledovaná mutageneze (Cunningham a Wells: Science 1989, 244, 1081 až 1085.). Podle posledního způsobu se jednotlivé alaninové mutace zavádějí na každý zbytek v molekule a výsledné mutované molekuly jsou testovány na biologickou aktivitu (tj. mannanasovou aktivitu) pro identifikování aminokyselinových zbytků, které jsou rozhodující pro aktivitu molekuly. Viz také Hilton a spol.: J. Biol. Chem. 1996, 271, 4699 až 4708.

9

99 9

9 • ·

Aktivní místo enzymu nebo jiné biologické interakce lze stanovit také fyzikální analýzou struktury, jako je stanovení takovými způsoby, jako je nukleární magnetická resonance, krystalografie, elektronová difrakce nebo fotoafinitní označování, společně s mutací domnělého kontaktního místa aminokyselin. Viz například de Vos a spol.: Science, 1992, 255, 306 až 312; Smith a spol.: J. Mol. Biol. 1992, 224, 899 až 904; Wlodaver a spol.: FEBS Lett. 1999, 309, 59 až 64. Na identity esenciálních aminokyselin lze usuzovat také z analýzy homologií s polypeptidy, které jsou příbuzné s polypeptidy podle tohoto vynálezu.

Mohou se provádět také násobné substituce aminokyselin a ty mohou být testovány známými způsoby mutageneze, rekombinace a/nebo přeházení s následujícím vyhodnocovacím postupem, jako jsou ty, které jsou popsány Reidhaar-Olsonem a Sauerem (Science 1988, 241, 53 až 57.), Bowiem a Sauerem (Proč. Natí. Acad. Sci. USA 1989, 86, 2152 až 2156.), ve spisu WO 95/17413 nebo WO 95/22625. Ve stručnosti - tito autoři popisují způsoby současné náhodné změny dvou nebo více poloh v polypeptidu nebo nebo rekombinace/přeházení různých mutací (spis WO 95/17413, WO 95/22625), následovaných výběrem funkčního polypeptidu a potom sekvenováním mutagenizovaných polypeptidů pro stanovení spektra dostupných substitucí v každé poloze. Mezi další způsoby, které se mohou používat, patří fágové zobrazení (např. Lowman a spol.: Biochem. 1991, 30,10832 až 10837; Ladner a spol.: USA patent č. 5 223 409; Huse: WIPO spis WO 92/06204) a oblastí řízená mutageneze (Derbyshire a spol.: Gene 1986, 46,145; Ner a spol.: DNA 1988, 7,127).

Způsoby mutageneze/přeházení, jak jsou shora popsány, mohou být kombinovány s vysokovýkonnými, automatickými vyhodnocovacími způsoby pro detekování aktivity klonovaných, mutagenisovaných polypeptidů v hostitelských buňkách. Mutagenisované DNA molekuly, které kódují aktivní polypeptidy, mohou být isolovány z hostitelských buněk a rychle sekvenovány použitím moderního zařízení. Tyto způsoby umožňují rychlé stanovení důležitosti jednotlivých aminokyselinových zbytků v polypeptidu, o který se jedná, a mohou být aplikovány na polypeptidy • · · · • ·· 9 ·· 99

9 9 9

9 9 9 neznámé struktury. Použitím shora uvedených způsobů může zručný odborník z oblasti techniky identifikovat a/nebo připravit rozmanité polypeptidy, které jsou v podstatě homologní se zbytky 32 až 343 sekv. id. č. 2 a které si zachovávají mannanasovou aktivitu přírodního proteinu.

Výroba proteinu: Proteiny a polypeptidy podle předloženého vynálezu, včetně proteinů plné délky, jejich fragmentů a napojených proteinů, se mohou vyrábět genetickým inženýrstvím sestavenými hostitelskými buňkami podle konvenčních způsobů. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou takové typy buněk, které mohou být transformovány nebo transfektovány exogenní DNA a mohou růst v kultuře. Zahrnují bakterie, buňky hub a kultivované vyšší eukaryotické buňky. Výhodné jsou bakteriální buňky, zvláště kultivované buňky grampositivních organismů. Zvláště výhodné jsou grampositivní buňky z rodu Bacillus, jako jsou buňky ze skupiny sestávající z Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuríngíensis, Bacillus licheniformis a Bacillus agaradherens, zvláště pak Bacillus agaradherens.

Techniky manipulování klonovaných DNA molekul a zavedení exogenní DNA do rozmanitých hostitelských buněk jsou popsány Sambrookem a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989, Ausubel a spol (red.), v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, lne., NY, 1987, a v Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim a spol., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C., které jsou zde zahrnuty jako citace.

Obecně je DNA sekvence kódující mannanasu podle předloženého vynálezu odštěpitelně napojena na jiné genetické prvky vyžadované pro její expresi, obecně zahrnující promotor a terminátor transkripce v expresním vektoru. Tento vektor bude obvykle také obsahovat jeden nebo více selektovatelných markérů a jeden nebo více počátků replikace, i když zruční odborníci z oblasti techniky si uvědomí, že některé ·♦»· • 9 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

99 • » · » • · · * · • · ·· · • » · · · · • · · · 9

9f systémy selektovatelných markérů mohou být získány na oddělených vektorech a replikace exogenní DNA lze dosáhnout integrací do genomu hostitelské buňky. Výběr promotorů, terminátorů, selektovatelných markérů, vektorů a dalších prvků je v rámci schopností zručného odborníka z oblasti techniky. Mnoho těchto prvků je popsáno v literatuře a je dostupno od komerčních dodavatelů.

Pro směrování polypeptidů do sekreční cesty hostitelské buňky se v expresním vektoru získá sekreční signální sekvence známá také jako leader sekvence, prepro sekvence nebo pre sekvence. Sekreční signální sekvence může znamenat polypeptid nebo může být odvozena od jiného sekretovaného proteinu nebo syntetizována de novo. V oblasti techniky jsou známy četné vhodné sekreční signální sekvence. Pro další popis vhodných sekrečních signálních sekvencí, zvláště pro sekreci v hostitelské buňce Bacillus lze odkázat na Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonnensheim a spol., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C., a Cutting S.M. (red.): Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley and Sons, 1990. Sekreční signální sekvence je napojena na DNA sekvenci ve správné čtecí fázi. Sekreční signální sekvence je obvykle umístěna 5' k DNA sekvenci kódující polypeptid, o který se jedná, i když některé signální sekvence mohou být umístěny jinde v DNA sekvenci, o kterou se jedná (viz např. Welch a spol.: USA patent č. 5 037 743, Holland a spol.: USA patent č. 5 143 830).

Transformované nebo transfektované buňky se kultivují konvenčními způsoby v kultivačním mediu, které obsahuje živné látky a další složky vyžadované pro růst vybraných hostitelských buněk. V oblasti techniky jsou známa rozmanitá vhodná media, mezi něž patří definovaná media a komplexní media, která obecně obsahují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, esenciální aminokyseliny, vitaminy a minerály. Media mohou obsahovat také takové složky, jako jsou růstové faktory nebo sérum, jak je potřeba. Růstové medium bude obecně vybráno z buněk obsahujících exogenně přidanou DNA, například výběrem léčiva nebo deficitem na esenciální výživu, která je doplněna selektovatelným markérem neseným na expresním vektoru nebo kotransfektovaným do hostitelské buňky.

• 444

4 ·· • · * 4 • 4 44 • 4 4 4

4 4 4

44 • 4 «4 4 • 4 φ

4 4

Isolace proteinů: Když je exprimovaný rekombinantní polypeptid sekretován, může být vyčištěn od růstového media. Expresní hostitelské buňky se s výhodou z media odstraní dříve, než se polypeptid čistí (např. odstřeďováním).

Jestliže exprimovaný rekombinantní polypeptid není sekretován z hostitelské buňky, hostitelská buňka se s výhodou rozbije a polypeptid se uvolní do vodného extraktu, což je první stupeň tohoto způsobu čištění. S výhodou se expresní hostitelské buňky isolují z media před tím, než se tyto buňky rozbijí (např. odstřeďováním).

Rozbití buněk se může provádět konvenčními způsoby, jako je štěpení lysozymu nebo podrobením buněk účinku vysokého tlaku. Pro další popis způsobů rozbíjení buněk viz Robert K.: Scobes, Protein Purífícation, druhé vydání, Springer-Verlag.

Ať jsou nebo nejsou exprimované rekombinantní polypeptídy (nebo chimemí polypeptídy) sekretovány, lze je vyčistit frakcionací a/nebo konvenčními způsoby čistění.

Pro frakcionací vzorků se může použít srážení síranem amonným a kyselá nebo chaotropní extrakce. Mezi příklady čistících stupňů lze zahrnout hydroxyapatit, chromatografií podle velikosti, FPLC a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii na obrácených fázích. Mezi vhodná anexová media patří derivatizované dextrany, agarosa, celulosa, polyakrylamid, křemičitany a podobné. Výhodné jsou PEI, DEAE, QAE a Q deriváty s tím, že DEAE rychletekoucí sepharosa (Pharmacia, Piscataway, NJ.) je zvláště výhodná. Mezi příklady chromatografických medií patří media derivatizovaná fenylovou, butylovou nebo oktylovou skupinou, jako je Phenyl-Sepharosa FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Mongomeryville, Pa.), Octyl-Sepharose (Pharmacia) a podobné, nebo polyakrylové pryskyřice, jako je Amberchrom CG 71 (Toso Haas) a podobné. Mezi vhodné pevné nosiče patří • 9 99 99 9999 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9 9 9

99 999 9 999 99 9 •999 9999 9999 ·· ·· 99 ·· 99 99 skleněné perličky, pryskyřice na bázi oxidu křemičitého, celulosové pryskyřice, agarosové perličky, zesíťované agarosové perličky, polystyrénové perličky, zesilované polyakrylamidové pryskyřice a podobné, které nejsou rozpustné za podmínek, za kterých se používají. Tyto nosiče mohou být modifikovány reaktivními skupinami, které umožňují připojení proteinů aminovými skupinami, karboxylovými skupinami, merkaptanovými skupinami, hydroxylovými skupinami a/nebo sacharidovými skupinami. Mezi příklady kondenzačních chemií patří aktivace bromkyanem, aktivace N-hydroxysukcinimidem, epoxidová aktivace, merkaptanová aktivace, hydrazidová aktivace a karboxylové a aminové deriváty pro karbodiimidové kondenzační chemie. Tato a další media jsou dobře známa, jsou široce používána v oblasti techniky a jsou dostupná od komerčních dodavatelů.

Výběr příslušného způsobu je věcí rutiny a je částečně dán vlastnostmi zvoleného nosiče. Viz například Affínity ChrOmatography: Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Švédsko, 1988.

Polypeptidy podle vynálezu nebo jejich fragmenty se mohou připravovat také chemickými syntézami. Polypeptidy podle vynálezu mohou znamenat monomery nebo multimery, mohou být glykosylovány nebo neglykosylovány, pegylovány nebo nepegylovány a mohou nebo nemusí obsahovat počáteční methionový aminokyselinový zbytek.

Na základě informací o sekvencích, které zde byly popsány, může být klonována plná délka DNA sekvence kódující mannanasu podle vynálezu a obsahující DNA sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 1, alespoň DNA sekvenci od polohy 97 do polohy 1029.

Klonování se provádí standardními postupy známými v oblasti techniky, jako je:

- příprava genomové knihovny z kmene Bacillus, zvláště kmene B. agaradherens, NCIMB 40482,

44 • 4 4 • · 44 • 4 4 • 4 4

44

44' 4444 44 44 ·* 4 4 · 4 4 • · 4 4 4 4 4

4 444 44 4

44 4 4 4 4 4 «· ·· 44 44

- vysetí této knihovny na vhodné desky se substrátem,

- identifikování klonu obsahujícího polynukleotidovou sekvenci podle vynálezu standardními hybridizačními způsoby používajícími sondu na základě sekv. id. č. 1 nebo

- identifikování kolonu z uvedené Bacillus agaradherens NCIMB 40482 genomové knihovny strategií inversní PCR použitím primerů na základě informací ze sekvence sekv. id. č. 1. Odkaz na M.J. McPhersona a spol. (PCR A practical approach, Information ress Ltd., Oxford, Anglie) je zde uveden pro další podrobnosti týkající se inversní PCR.

Na základě informací o sekvencích zde popsaných (sekv. id. č. 1 a sekv. id. č. 2) je pro zručného odborníka z oblasti techniky rutiní prací isolovat homologní polynukleotidové sekvence kódující homologní mannanasu podle vynálezu podobnou strategií používající genomové knihovny z příbuzných mikrobiálních organismů, zvláště z genomových knihoven z jiných kmenů rodu Bacillus, jako jsou alkalofilní druhy Bacillus.

DNA kódující mannan nebo galaktomannan-degradující enzym podle vynálezu se může připravovat také dobře známými způsoby, vhodně je možno ji klonovat z vhodného zdroje, jako je jakýkoliv ze shora uvedených organismů, použitím syntetických oligonukleotidových sond připravených na bázi DNA sekvence získatelné z plasmidu přítomného v Escherichia coli DSM 12180.

Polynukleotidové molekula podle tohoto vynálezu může být tedy isolována z Escherichia coli, DSM 12180, v níž je plasmid získaný kfonováním, jak je shora popsáno, uložen. Předložený vynález se týká také isolované, v podstatě čisté biologické kultury kmene Escherichia coli, DSM 12180.

V předložené souvislosti pojem příprava enzymu je míněn tak, že znamená buď konvenční enzymatický fermentační produkt, možná isolovaný a vyčištěný, z jediného druhu mikroorganismu, tento přípravek obvykle obsahuje četné různé ·* ··♦· ·· ·*

9 9

9 99

9 9

99

9 9

9 9 9 • 9 9 9

99

99 • · 9 · • 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

99 enzymatické aktivity, nebo znamená směs jednosložkových enzymů, s výhodou enzymů odvozených od bakteriálních nebo houbových druhů použitím konvenčních rekombinantních technik, pň čemž tyto enzymy byly fermentovány a možná isolovány a vyčištěny odděleně a mohou pocházet od různých druhů, s výhodou od houbových nebo bakteriálních druhů, nebo znamená fermentační produkt mikroorganismu, který působí jako hostitelská buňka pro expresi rekombinantní mannanasy, ale při tom tento mikroorganismu současně produkuje jiné enzymy, např. enzymy degradující pektin, proteasy nebo celulasy, a jde o přirozeně se vyskytující fermentační produkty mikroorganismu, tj. enzymový komplex konvenčně vyráběný odpovídajícím přirozeně se vyskytujícím mikroorganismem.

Způsob výroby enzymového preparátu podle vynálezu, způsob zahrnující kultivaci mikroorganismu, např. divokého kmene, schopného produkovat mannanasu za podmínek umožňujících produkci enzymu, a isolování enzymu z kultury. Kultivování se může provádět použitím konvenčních technik fermentace, např. kultivováním v kultivační baňce nebo ve fermentorech s mícháním se zajistí dostatečné provzdušnění růstového media, což indukuje produkci mannanasnového enzymu. Růstové medium může obsahovat konvenční zdroj dusíku, jako je pepton, kvasinkový extrakt nebo kasaminové kyseliny, snížené množství konvenčního zdroje uhlíku, jako je dextrosa nebo sacharosa, a indukční činidlo, jako je guarová guma nebo chlebovníková guma. Isolace se může provádět konvenčními způsoby, např. oddělením biomasy a supematantu odstřeďováním nebo filtrací, isolováním supemantantu nebo rozbitých buněk, jestliže enzym, o který se jedná, je intracelulámí, s možným následujícícm dalším čištěním, jak je to popsáno v evropském patentu 0406 314, nebo krystalizací, jak je to popsáno ve spisu WO 97/15660.

Immunologická zkřížená reaktivita: Polyklonální protilátky, které se používají pro stanovení imunologické zkřížené reaktivity, se mohou připravovat použitím vyčištěného mannanasového enzymu. Podrobněji - antiserum proti mannanase podle vynálezu může být získáno immunizováním králíků (nebo jiných hlodavců) postupem φφ φ ΦΦΦ φ · • · φ φ φ φ φφ φ · φ φ ♦ φ φ · φφ φφ φφ φφ • · Φ V φ · φ φ • φ φ φ • · · 9

ΦΦ ΦΦ podle Ν. Axelsena a spol. v: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, kapitola 23, nebo A. Johnstona a R. Thorpeho: Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (podrobněji str. 27 až 31). Vyčištěné imunoglobuliny mohou být získány z antisera, například srážením solí (síranem amonným) s následující dialýzou a chromatografii na ionexu, např. na DEAE-sephadexu. Immunochemická charakterizace proteinů může být provedena bud Ouchterlonyho dvojdifuzní analýzou (O. Ouchterlony v: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, red.), Blackwell Scientific Publications, 1967, str. 655 až 706) zkříženou imunoelektroforesou (N. Axelsen a spol.: viz shora, kapitola 3 a 4) nebo raketovou immunoelektroforesou (N. Axelsen a spol.: kapitola 2).

Příklady užitečných bakterií produkujících enzym nebo enzymový preparát podle vynálezu jsou grampositivní bakterie, s výhodou z pododdělení Baciilus/Lactobacillus, s výhodou kmen rodu Bacillus, výhodněji kmen Bacillus agaradherens, zvláště kmen Bacillus agaradherens, NCIMB 40482.

Předložený vynález zahrnuje isolovanou mannanasu, která má shora popsané vlastnosti, neobsahuje homologní nečistoty a je produkována konvenčními rekombinantními způsoby.

Stanovení katalytické aktivity (ManU) mannanasy: Kolorimetrický test: Substrát: 0,2 % (hmotn.) AZCL-galaktomannanu (Megazyme, Austrálie) z rohovníku v 0,1M glycinovém pufru, pH 10,0. Test se provádí v 1,5ml Eppendorfově mikrozkumavce na termomixeru za míchání a regulace teploty na 40 °C. Inkubace, 20 minut 0,750 ml substrátu s 0,05 ml enzymu, byla zastavena odstřeďováním při 15 000 otáčkách za minutu po dobu 4 minut. Barva supematantu se měří při 600 nm v 1cm kyvetě. Jedna ManU (mannanasová jednotka) poskytuje 0,24 abs v 1 cm.

Získání Bacillus agaradherens mannanasy NCIMB 40482: Kmeny: Bacillus agaradherens NCIMB 40482 obsahuje mannanasový enzym kódující DNA sekvenci.

99

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

9 99

9· • 9 9 9 • 9 99 • 9 · 9 ·

9 · · • 9 9· »·»· • 9 9 • 9 9

9 9 • 9 9 ·

99

£. coli kmen: Byly připraveny buňky E. coli SJ2 (Diderichsen B., Wedsted U., Hedegaard L., Jensen B.R., Sjoholm C.: Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactatdecarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol. 172, 4315 až 4321) a byly transformovány elektroporací použitím elektroporačního zařízení Gene Pulser™ electroporator od BIO-RAD podle postupu popsaného dodavatelem.

6. subtilis PL2306: Tento kmen je B. subtilis DN1885 s přerušenými apr a npr geny (Diderichsen B., Wedsted U., Hedegaard L., Jensen B.R., Sjoholm C.: Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactat-deckarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol. 1990, 172, 4315 až 4321.) rozbitými v transkripční jednotce známého Bacillus subtilis celulasového genu, což vede k celulasovým negativním buňkám. Rozbití se provede v podstatě tak, jak je popsáno v literatuře (A.L.Sonenshein, J.A.Hoch a Richard Losick (red.): Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society for Microbiology, str. 618.).

Příslušné buňky byly připraveny a transformovány tak, jak popisuje Yasbin R.E., Wilson G.A. a Young F.E.: Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol. 1975,121,296 až 304.

Plasmidy: Plasmid pSJ1678 (jak je podrobně popsán ve spisu WO 94/19454, který je zde celý zahrnut jako odkaz).

pMOL.944: Tento plasmid je pUB110 derivát, který v podstatě obsahuje prvky způsobující, že plasmid je množitelný v Bacillus subtilis, gen kanamycinové resistence a silný promotor a signální peptid klonovaný z amylL genu B. licheniformis ATCC 14580. Signální peptid obsahuje Sacll místo, což způsobuje, že je vhodné klonovat DNA kódující maturovanou část proteinu v napojení se signálním peptidem. To vede k expresi pre-proteinu, který směřuje ven z buňky.

•Φ «ΦΦΦ • · φφφφ φφ φ φφφφ • ΦΦΦ φφ φ φφφφ φ φφ ΦΦΦ φ ΦΦΦ φφ φ

ΦΦΦ· · φ φ · φφφφ

ΦΦΦ· φφ φφ φφφφ

Plasmid byl zkonstruován konvenčními způsoby genetického inženýrství, které jsou stručně popsány následujícím způsobem.

Konstrukce pMOL944: Plasmid pUB110 (McKenzie T. a spol.: Plasmid, 1968,

15, 93 až 103.) byl rozštěpen jedinečným restrikčním enyzmem Ncil. PCR fragment amplifikovný z amyL promotoru kódovaného na plasmidu pDN1981 (P.J.Jorgensen a spol.: Gene 1990, 96, 37 až 41.) byl rozštěpen působením Ncil a vložen do pl)B110 rozšetěpeného Ncil za vzniku plasmidu pSJ2624.

Dva použité primery měly následující sekvence:

# LWN5494

5'-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'a # LWN5495

5'-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGG

CAGCAAGAAGAT-3'.

Primer# LWN5494 vkládá do plasmidu místo Notl.

Plasmid pSJ2624 byl pak rozštěpen působením Sací a Notl a nový PCR fragment amplifikovaný na amyL protomor kódovaný na pDN1981 byl rozštěpen působením Sací a Notl. Tento DNA fragment byl vložen do Sacl-Notl rozštěpeného pSJ2624 za vzniku plasmidu pSJ2670.

Toto klonování nahrazuje první amyL protor klonující se stejným promtorem, ale v opačném směru. Tyto dva primery použité pro PCR amplifikaci mají následující sekvence:

# LWN5938

5'-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCA GCAAGAAGAT-3' a

4 4 4*4 *· • 4 · · · · • · 44 4 4 4

4 4 4 4 4 4

44 44 44

4 4

4 « *4 4 # LWN5939

5'-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'.

Plasmid pSJ2670 byl rozštěpen restrikčními enzymy Pstl a Bell a PCR fragment amplifikovaný z klonované DNA sekvence kódující alkalickou amylasu SP722 (popsanou v mezinárodní patentové přihlášce publikované jako spis WO 95/26397, který je zde celý zahrnut jako odkaz) byl rozštěpen Pstl a Bell a vložen, takže se získá plasmid pMOL944. Tyto dva primery použité pro PCR amplifikaci měly následující sekvencí:

# LWN7864

5'-AACAGCTGATCACGACTGATCTmAGCTTGGCAC-3'a # LWN7901

5'-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACATGGG-3'.

Primer# LWN7901 vkládá do plasmidu místo Sacll.

Klonování mannanasového genu z Bacillus agaradherens'. Příprava genomové DNA: Kmen Bacillus agaradherens NCIMB 40482 byl množen v kapalném mediu tak, jak je popsáno ve spisu WO 94/01532. Po 16 hodinách inkubace při 30 °C a 300 otáčkách za minutu byly buňky isolovány. Genomová DNA byla isolována způsobem popsaným Pitcherem a spol. (Pitcher D.G., Saunders N.A., Owen R.J.: Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letí. Appl. Microbiol. 1989, 8,151 až 156.).

Konstrukce genomové knihovny: Genomová DNA byla částečně rozštěpena restikčním enzymem Sau3A a rozdělena podle velikosti elektroforesou na 0,7% (hmotn.) agarosovém gelu. Fragmenty s molekulovou hmotností mezi 2000 a 7000 byly isolovány elektroforesou na DEAE-celulosovém papíru (Dretzen G., Bellard M., Sassone-Corsi P., Chambon P.: A reliable method for the recovery of DNA fragemnts from agarose and aerylamíde gels. Anal. Biochem. 1981, 112,295 až 298.).

9» 9999

99 • 9 ·· • 9 9 9

9 99

9 · 9

9 9 9

99 • 9 9

9 9

9 9 • 9 9 9

C 9 99

9 9

9 9 « 9

9 9

Isolované DNA fragmenty byly navázány na BamHI rozštěpenou pSJ1678 plasmidovou DNA. Tato ligační směs byla použita pro transformování E. coli SJ2.

Identifikace positivních klonů: DNA knihovna v E. coli, zkonstruovaná jak shora popsáno, byla testována na LB agarových deskách obsahujících 0,2 % (hmotn.) AZCL-galaktomannanu (Megazyme) a 9 gg/ml chloramfenikolu a inkubována přes noc při 37 °C. Klony exprimující mannanasovou aktivitu se objevily s modrou difusní aureolou. Plasmidová DNA z jednoho z těchto klonů byla isolována Qiagenovým plasmidovým spinovým přípravkem na 1 ml přes noc v živné kultuře (buňky byly inkubovány při 37 °C v TY s 9 μg/ml chloramfenikolu a třepány rychlostí 250 otáček za minutu).

Tento klon (MB525) byl dále charakterizován DNA sekvenováním klonovaného Sau3A DNA fragmentu. DNA sekvenování bylo prováděno pomocí primeru použitím sekvenační sestavy Taq deoxy-terminačního cyklu (Perkin-Elmer, USA), fluorescenčně označených terminátorů a příslušných oligonukleotidů jako primerů.

Analýza sekvenačních dat byla prováděna podle Devereuxe a spol.: Nucleic Acids Res. 1984, 12, 387 až 395. Sekvence kódující mannanasu je uvedena ve shora uvedené sekv. id. č. 1. Odvozená proteinová sekvence je uvedena ve shora uvedené sekv. id. č. 2.

Subklonování a exprese mannanasy v B. subtilis: Mannanasu kódující DNA sekvence podle vynálezu byla PCR amplifikována použitím PCR příměrové řady sestávající ze dvou oligonukleotidů:

mannanasa. hom í. Sací I

5-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCA AGT ACA GGC TTT TAT GTT GAT GG-3' a mannanasa.dolní.Notl

5'-GAC GAC GTA CAA GCG GCC GCG CTA TTT CCC TAA CAT GAT GAT ATT TTC G-3'.

• · 0 ·

0 00 • · s t • · 0 0 ··

0 0

0·

0 0 ·

0 C 0

00 ·

I 0 0 » 0 0 » 0 0

00

Restrikční místa SacII a Notll jsou podtržena.

Chromosomová DNA, isolovaná z B. agaradherens NCIMB 40482 jak je shora popsáno, byla použita jako templát v PCR reakci použitím Amplitaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) podle pokynů výrobce. PCR reakce byla nasazena v PCR pufru (10mM Tris-HCl, pH 8,3, 50mM KCI, 1,5mM MgCI₂, 0,01% (hmotn. k obj. dílům) želatina) obsahujícím 200 μΜ každého dNTP, 2,5 jednotky AmpliTaq polymerasy (Perkin-Elmer, Cetus, USA) a 100 pmolů každého primeru.

PCR reakce byla prováděna použitím zařízení DNA thermal cycler (Landgraf, Německo). Po jedné inkubaci při 94 °C po dobu 1 minuty následovalo třicet cyklů PCR provedených použitím cyklačního profilu denaturace 30 sekund při 94 °C, anelování 1 minutu při 60 °C a prodloužení 2 minuty při 72 °C. Podíly amplifikovaného produktu po 5 mikrolitrech byly analyzovány elektroforesou v 0,7% (hmotn.) agarosových gelech (NuSieve, FMC). Objevení se DNA fragmentu o molekulové hmotnosti 1400 indikuje příslušnou amplifikaci genového segmentu.

Subklonování PCR fragmentu: Podíly (po 45 μΙ) PCR produktů, získané jak shora popsáno, byly vyčištěny použitím čistící sestavy QIAquick PCR (Qiagen, USA) podle pokynů výrobce. Vyčištěná DNA byla eluována v 50 μΙ 10mM Tris-HCl, pH 8,5.

pg pMOL944 a 25 μΙ vyčištěného PCR fragmenu bylo rozštěpeno působením SacII a Notl, elektroforezováno v 0,8% (hmotn.) agarosových gelech želujících za nízké teploty (SeaPlaque GTG, FMC), příslušné fragmenty byly z gelu vyříznuty a vyčištěny extrakční sestavou QIAquick Gel (Qiagen, USA) podle pokynů výrobce. Isolovaný PCR DNA fragment byl pak ligován s vyčištěným pMOL944, který byl před tím rozštěpen působením Sacll-Notl. Ligace byla prováděna přes noc při 16 °C použitím 0,5 pg každého DNA fragmentu, 1 jednotky T4 DNA ligasy a T4 ligasového pufru (Boehringer Mannheim, Německo).

Ligační směs byla použita pro transformování příslušného B. subtilis PL2306. Transformované buňky byly vysety na LBPG-10 μg/ml kanamycinové desky. Po 18 hodinách inkubace při 37 °C byly na deskách vidět kolonie. Několik kolonů bylo analyzováno isolováním plasmidové DNA z kultivačního prostředí přes noc.

Jeden z těchto positivních klonů byl přeproužkován několikrát na agarových deskách, jak shora uvedeno. Tento klon byl nazván MB594. Klon MB594 byl nechán růst přes noc v TY-10 μg/r^nl kanamycinu při 37 °C. Další den byl 1 ml buněk použit pro isolování plasmidu z buněk použitím sestavy Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit # 27106 podle doporučení výrobce pro přípravu B. subtilis plasmidových přípravků. Tato DNA byla sekvenováno. Bylo zjištěno, že DNA sekvence odpovídající maturované části mannanasy je část od polohy 94 do 1404 připojené sekvence id. č. 3.

ATGAAAAAAAAGTTATCACAGATTTATCATTTAATTATTTGCACACTTATAATA

AGTGTGGGAATAATGGGGATTACAACGTCCCCATCAGCAGCAAGTACAGGC ttttatgttgatggcAatacgttat/\tgacgcaaatgggcagccatttgtcat

GAGÁGGTATTAACCATGGACATGCTTGGTATAAAGACACCGCTTCAACAGCT

ATTCCTGCCATTGCAGAGCAAGGCGCCAACACGATTCGTATTGTTTTATCAG

ATGGCGGTCAATGGGAAAAAGACGACATTGACACCATTCGTGAAGTCATTG

AGČŤŤGCGGAGCAAAAIA^ÁATrGGŤGGCTGTCGTTGAAGTTCATCAŤGCCA''

CGGGTCGCGATTCGCGCAGTGATTTAAATCGAGCCGTTGATTATTGGATAG

AftATGAAAGATGCGCTTATCGGTAAAGAAGATACGGTTATTArrAACATTGCA /\ACGAGTGGTATGGGAGTTGGGATGGCTCAGCTTGGGCCGATGGCTATATT

GATGTCATTCCGAAGCTTCGCGATGCCGGCTTAACACACACCTTAATGGTTG

ATGCAGCAGGATGGGGGCAATATCCGCAATCTATTCATGATTACGGACAAG

ATGTGTTTAATGCAGATCCGTTAAA/u\ATACGATGTTCTCCATCCATATGTAT

GÁGTATGCTGGTGGTGATGCTAACAGTGTTAGATCAAATATTGATAGAGTCA

TAGATCAAGACCTTGCTCTCGTAATAGGTGAATTCGGTCATAGACATACTGA

TGGTGATGTTGATGAAGATACAATCCTTAGTTATTCTGAAGAAACTGGCACA

GGGTGGCTCGCTTGGTCTTGGAAAGGCAACAGTACCGAATGGGACTATTTA

GACCTTTCAGAAGACTGGGCTGGTCAACATTTAACTGATTGGGGGAATAGAA

7GTCCACGGGGCCGATGGCTTACAGGAAACCTCCAAACCATCCACCGTAT r/ACAGATGATAACGGTGGTCACCCTGAACCGCCAACTGCTACTACCTTGTA • ·

7GACTTTGAAGGAAGCACACAAGGGTGGCATGGAAGCAACGTGACCGGTG

GCCCTTGGTCCGTAACAGAATGGGGTGCTTCAGGTAACTACTCTTTAAAAGC

CGATGTAAATTTAACCTCAAATTCTTCACATGAACTGTATAGTGAACAAAGTC

GTAATCTACACGGATACTCTCAGCTCAACGCAACCGTTCGCCATGCCAATTG

GGGAAATCCCGGTAATGGCATGAATGCAAGACTTTACGTGAAAACGGGCTC

TGATTATACATGGCATAGCGGTCCTjTTACACGTATCAATAGCTCCAACTCA

GGAACAACGTTATCTTTTGATTTAAAv:AACATCGAAAATATCATCATGTTAGG

G;\AATAG (sekv. id. č. 3)

Odvozený maturovaný protein je uveden v sekv. id. č. 4

MHKKLSQlYHLIICTLlISVGIMGITrŠPSAASTGFYVDGNTLYDANGQPFVMRGIN

HGHAWYKDTASTAIPAIAEQGANTIRIVLSDGGQWEKDDIDTIREVIELAEQNKM , vawevhdatgrdsrsdlnravdywiemkdáíjgkedtviíňíaňěwýgsvvďgs AWADGYIDVIPKLRDAGLTHTLMVDAAGWGQYPQSIHDYGQDVFNADPLKNTM FSIHMYEYAGGDANTVRSNIDRVIDCiDLALVIGEFGHRHTDGDVDEDTILSYSEE TSTGWLAWSWKGNSTEWDYLDLSEÚWAGQHLTDWGNRIVHGADGLQETSKP STVFTDDNGGHPEPPTATTLYDFEGSTQGWHGSNVTGGPWSVTEWGASGNY SLKADVNLTSNSSHELYSEQSRNLHGYSQLNATVRHANWGNPGNGMNARLYV KTGSDYTWHSGPFTRINSSNSGTTLSFDLNNIENIIMLGK (sekv. id. č. 4)

Bylo zjištěno, že 3' konec mannanasy kódované sekvencí sekv. id. č. 1 byl změněn na konec uvedený v sekv. id. č. 3 díky návrhu dolního primeru použitého při PCR. Výsledná sekvence aminokyselin je uvedena v sekv. id. č. 4. Je zřejmé, že uhlíkový konec sekv. id. č. 2 (SHHVREIGVQFSAADNSSGQTALYVDNVTLR) je změněn na C konec sekv. id. č. 4 (IIMLGK).

Media: TY (jak je popsáno Ausubelem F.M. a spol. (red.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1995).

• · • · · · • ·· · · · · · · · ·· · ···· ···· · · · · • · · · ·· · · · · · ·

LB agar (jak je popsáno Ausubelem F.M. a spol. (red.) Current protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1995).

LBPG je LB agar (viz shora) doplněný 0,5 % (hmotn.) glukosy a 0,05 M fosforenčnanu draselného, pH 7,0.

BPX medium je popsáno v evropském patentu 0 506 780 (spis WO 91/09129).

Exprese, čištění a charakterizace mannanasy z Bacillus agaradherens: Klon MB 594, získaný jak shora popsáno, byl kultivován v 25 x 200 ml BPX mediu s 10 pg/ml kanamycinu ve dvou 500ml třepacích baňkách 5 dnů při 37 °C a při 300 otáčkách za minutu.

Z třepacích baněk bylo isolováno 6500 ml kultivační kapaliny klonu MB 594 (dávka # 9813) a pH bylo upraveno na 5,5. Během míchání bylo kvůli vločkování přidáno 146 ml katexu (C521) a 292 ml anexu (A1390). Vyvločkovaný materiál byl oddělen odstřeďováním použitím odstředivky Sorval RC 3B při 9000 otáčkách za minutu během 20 minut při 6 °C. Supematant byl vyčeřen Whatmanovými skleněnými filtry GF/D a C a nakonec zahuštěn na filtronu s oddělením velikosti 10 000 hmotn. jednotek.

Hodnota pH 750 ml tohoto koncentrátu byla upravena hydroxidem sodným na

7,5. Čirý roztok byl nanesen na anexovou chromatografii s kolonou 900 ml Q-sepharosy ekvilibrované 50mM Tris, pH 7,5. Navázaná mannanasová aktivita byla eluována použitím gradientu chloridu sodného.

Čistý enzym poskytl jediný pás v SDS-PAGE s molekulovoou hmotností 38 000. Aminokyselinová sekvence mannanasového enzymu, tj. přeložená DNA sekvence, je uvedena ve shora popsané sekv. id. č. 2.

• ·

9

Stanovení kinetických konstant: Substrát: Rohovníková guma a redukující cukerná analýza (PHBAH). Rohovníková guma od Sigmy (G-0753).

Kinetická stanoveni použitím různých koncentraci rohovníková gumy a inkubace 20 minut při 40 °C a pH 10 poskytly Kkat: 467 za sek.

Κ„: 0,08 gramů na litr molekulová hmotnost: 38 000 pl (isoelektrický bod): 4,2.

Bylo zjištěno, že optimální teplota mannanasy je 60 °C.

pH aktivita profilu vykazovala maximální aktivitu mezi pH 8 a 10.

DSC diferenční vyhodnocovací kalometrie poskytla 77 °C jako teplotu tání při pH 7,5 v Tris pufru, což ukazuje na to, že tento enzym je tepelně velice stabilní.

Detergentní slučitelnost použitím 0,2 % (hmotn.) AZCL-galaktomannanu z rohovníku jako substrátu a inkubace jak shora uvedeno při 40 °C ukazuje vynikající slučitlenost s konvenčními kapalnými detergenty a dobrou slučitelnost s konvenčními práškovými detergenty.

Získání Bacillus subtilisis mannanasy 168: Bacillus subtilisis β-mannanasa byla charakterizována a vyčištěna následujícím způsobem. Bacillus subtilis genom byl zkoumán na homologii se známou Bacillus sp. β-mannanasovou genovou sekvencí (Mendoza a spol.: Biochemica et Biophysica Acta 1995, 1243, 552 až 554.). Kódující oblast ydhT, jejíž produkt není znám, vykazovala 58% podobnost se známou Bacillus β-mannanasou. Byly navrženy následující oligonukleotidy, aby se amplífikovaly sekvence kódující maturovanou část domnělé β-mannanasy: 5-GCT CAA TTG GCG CAT ACT GTG TCG CCT GTG-3' a 5'-GAC GGA TCC CGG ATT CAC TCA ACG ATT GGC G-3'. Celková genomová DNA z Bacillus subtilis kmene 1A95 byla použita

jako teplat pro amplikování ydhT maturované oblasti použitím shora uvedených primerů. PCR byla provedena použitím sestavy GENE-AMP PCR kit s AMPLITAQ DNA polymerasou (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Foster City, Ka., USA). Po počáteční době tání 5 minut při 95 °C následovalo 25 cyklů s následujícím programem: tání při 95 °C 1 minuta, anelace při 55 °C 2 minuty a prodloužení při 72 °C dvě minuty. Po posledním cyklu byla reakce udržována 10 minut na 72 °C, aby se zkompletovalo rozšíření. PCR produkty byly vyčištěny použitím sestavy pro čištění QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Chatsworth, Ka., USA).

ydhT maturovaná oblast amplikovaná z Bacillus subtilis kmene 1A95 byla vložena do expresního vektoru pPG1524 (shora popsaného) následujícím postupem. Amplifikovaný fragment o 1028 párech nukoeotidů byl rozštěpen působením Mfel a BamHl. Expresní vektor pPG1527 byl rozštěpen působením EcoRI a BamHl. Restrikční produkty byly vyčištěny použitím sestavy pro čištění QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Chatsworth, Ka., USA). Tyto dva fragmenty byly ligovány použitím T4 DNA ligasy (13 hodin, 16 °C) a použity pro transformování příslušného E coli kmenen DH5-a. Kolonie resistentní na ampicilin byly kultivovány pro přípravu DNA. DNA byla charakterizována restrikční analýzou. Plasmid pPG3200 obsahuje maturovanou oblast genu ydhT. Plasmid pPG3200 byl pak použit pro transformování příslušného Bacillus subtilis kmene PG 632 (Saunders a spol. 1992).

Sedm Bacillus substilis klonů resistentních na kanamycin a jeden PG 632 kontrolní klon byly sebrány a nechány růst ve 20 ml media 20/20/5 (20 g/l tryptonu, 20 g/l kvasinkového extraktu, 5 g/l NaCl) doplněného 1 ml 25% maltiny, 120 μΙ 10mM MnCI₂ a 20 μΙ 50 mg/ml kanamycinu. Klony byly nechány růst přes noc ve 250ml baňkách za třepání s 250 ot/min při 37 °C pro expresi proteinu. Buňky byly pak odstřeďovány 15 minut při 14 000 otáčkách za minutu. Jeden mikrolitr každého supematantu byl zředěn v 99 μΙ 50mM octanu sodného (pH 6,0). Jeden μΙ tohoto ředění byl vyhodnocen použitím endo-1,4-B-mannanasového Beta-Mannazyme Tabs (Megazyme, Irsko) podle pokynů výrobce. Absorbance byla vyhodnocena při 590 nm • · ··4 ·

na spektrofotometru Beckman DU640. Klon 7 vykazoval nejvyšší absorbanci 1,67. Kontrolní PG632 nevykazoval žádnou absorbanci při 590 nm.

Supernatant byl analyzován SDS-PAGE na 10 až 20% (hmotn) Tris-Glycine gelu (Novex, San Diego, Ka., USA), aby se potvrdila očekávaná velikost proteinu 38 000 hmotn. jednotek. Vzorky byly připraveny následujícím způsobem. 500μΙ vzorek ydhT klonu 7 a PG 632 supernatanty byly vysráženy 55,5 μΙ 100% (hmotn.) trichloroctové kyseliny (Sigma), promyty 100 μΙ 5% (hmotn.) trichloroctové kyseliny, resupendovány v 50 μΙ Tris-glycinovém SDS vzorku pufru (Novex) a vařeny pět minut. Jeden μΙ každého vzorku byl podroben elektroforese na gelu při 30 mA po dobu 90 minut. Byl pozorován velký pás proteinu o molekulové hmotnosti 38 000 odpovídající ydhT klonu 7.

I fermentace Bacillus subtilis ydhT klonu 7 bylo získáno v B. Braunově Biostat C fermentoru. Podmínky fermentace byly následující. Buňky byly nechány růst 18 hodin v bohatém mediu podobném mediu 20/20/5 při 37 °C. Na konci průběhu fermentace byly buňky odstraněny a supernatant byl zahuštěn na 1 litr tangenciálním průtokovým filtračním systémem. Konečný výtěžek β-mannanasy v koncentrovaném supernatantu byl stanoven jako 3 g/l.

Vyčištění β-mannanasy z fermentačního supernatantu bylo provedeno následujícinm způsobem: 500 ml supernatantu bylo odstřeďováno 10 minut při 10 000 ot/min a při 4 °C. Odstřeďovaný supernatant byl pak dialyzován při 4 °C ve dvou 4I výměnách 10mM fosforečnanu draselného (pH 7,2) přes membránu Spectrapor s oddělením molekulové hmotnosti 12 000 až 14 000 (Speetrum). Dialyzovaný supernatant byl odstřeďován 10 minut při 10 000 ot/min při 4 °C. 200ml kolona anexu rychletekoucí Q sepharosy (Pharmacia) byla ekvilibrována 1 litrem 10mM fosforečnanu draselného (pH 7,2) při 20 °C. Na kolonu bylo naneseno 300 ml supernatantu. Byly isolovány dvě vyteklé frakce o velikosti 210 ml (vzorek A) a 175 ml (vzorek B). Tyto dvě frakce byly analyzovány jak shora uvedeno až na to, že vzorky byly zředěny 199 μΙ 50mM octanu sodného (pH 6,0) a vykazovaly absorbanci 0,38, • * · · · · • · · · · · · · · · · • · *· · · · · · · · • ·· · · · · ··· · · · ···· · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· ·· respektive 0,52. Dva mikrolitry každého vzorku byly přidány k 8 μΙ pufru vzorku Tris-glycin SDS (Novex, Ka., USA) a vařeny 5 minut. Výsledné vzorky byly podrobeny elektroforese na 10 až 20% Tris-glycinovém gelu (Novex, Ka., USA) 90 minut při 30 mA. V každém vzorku byl přítomen hlavní pás odpovídající molekulové hmotnosti 38 000. Tento pás obsahoval více než 95 % hmotn. veškerého proteinu. BCA proteinová analýza (Pierce) byla provedena u obou vzorků podle pokynů výrobce použitím hovězího sérového albuminu jako standardu. Vzorky A a B obsahovaly 1,3, respektive 1,6 mg/ml B-mannanasy. Identita proteinu byla potvrzena hmotnostní spektrometrií s iontovým sprejem a sekvenční analýzou aminokyselin z aminového konce.

Vyčištěné vzorky β-mannanasy byly použity pro charakterizování aktivity enyzmů následujícím způsobem. Všechny testy používaly endo-1,4-B-mannanasový Beta-Mannazyme Tabs (Megazyme, Irsko), jak shora popsáno. Aktivita v rozmezí pH od 3,0 do 9,0 byla stanovována v 50mM citrátfosforečnanovém pufru, pro stanovení aktivity při pH 9,5 byl použit 50mM CAPSO (Sigma) a pro pH od 10,0 do 11,0 50mM CAPS pufr. Optimální pH pro Bacillus substilis B-mannanasu bylo zjištěno jako 6,0 až

6,5. Profil tepelné aktivity byl zjišťován v 50mM citrátofosforečnanovém pufru (pH 6,5). Enzym vykazoval optimální aktivitu při 40 až 45 °C. Bacillus subtilis B-mannanasa si zachovávala významnou aktivitu při méně než 15 °C a více než 80 °C. Specifická aktivita na B-1,4-galaktomannan byla stanovena jako 160 000 pmol/min.mg B-mannanasy použitím endo-1,4-B-mannanasy Beta-Mannazyme Tabs (Megazyme, Irsko) podle pokynů výrobce. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence Bacillus subtilisis B-mannanasy jsou uvedeny v sekv. id. č. 5 a id. č. 6.

Mannanasa se zahrnuje do prostředků podle vynálezu s výhodou v množství od 0,0001 do 2, výhodněji od 0,0005 do 0,1, nejvýhodněji od 0,001 do 0,02 % hmotn. čistého enzymu z hmotnosti prostředku.

Enzym podle vynálezu, vedle enzymového jádra obsahujícího katalytickou doménu, obsahuje také celulosovou vazebnou doménu (CBD), obě jsou spolu

4 4 4 4 4 • · • · • 44 4 4 • 4 ·· ··

4 4 4

44 odštěpitelně spojeny. Celulosová vazebná doména (CBD) může existovat jako integrální část kódovaného enzymu nebo CBD jiného původu může být zavedena do enzymu, takže se vytvoří enzymový hybrid. V této souvislosti pojem celulosová vazebná doména je zamýšlen tak, jak ho definují Peter Tomme a spol.: Celulose-Binding Domains: Classification and Properties v Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, John N. Saddler a Michael H. Penner (red.), ACS Symposium Series, č. 618, 1996. Tato definice klasifikuje více než 120 celulosových vazebných domén do 10 skupin (I až X) a ukazuje, že CBD se nalézají v různých enzymech, jako jsou celulasy, xylanasy, mannanasy, arabinofuranosidasy, acetylesterasy a chitinasy. CBD se také nalézají v řasách, např. v červené řase Porhyra purpurea, jako nehydrolytický polysacharid vázající protein, viz Tomme a spol. (jak shora uvedeno). Většina CBD jsou však celulasy a xylanasy. Bylo zjištěno, že CBD jsou na N nebo C koncích proteinů nebo jsou vnitřní. Enzymové hybridy jsou známy v oblasti techniky, viz např. spis WO 90/00609 a spis WO 95/16782, a mohou se připravovat transformováním do hostitelské buňky DNA konstrukce obsahující alespoň fragment DNA kódující celulosovou vazebnou doménu navázanou, s nebo bez linkeru, na DNA sekvenci kódující mannanasový enzym a rostoucí hostitelskou buňku, takže se exprimuje napojený gen. Enzymové hybridy lze popsat následujícím obecným vzorcem

CBD-MR-X, v němž CBD znamená N- koncovou nebo C-koncovou oblast aminokyselinové sekvence odpovídající alespoň celulosové vazbné doméně, MR znamená střední oblast (linker) a může znamenat vazbu nebo krátkou vazebnou skupinu s výhodou se 2 až 100 atomy uhlíku, výhodněji se 2 až 40 atomy uhlíku, nebo s výhodou se 2 až 100, výhodněji se 2 až 40 aminokyselinami, a X znamená N-koncovou nebo C-koncovou oblast enzymu podle tohoto vynálezu.

Shora uvedené enzymy mohou být jakéhokoliv vhodného původu, jako je rostlinný, živočišný, bakteriální, houbový a kvasinkový původ. Původ může být dále

4 44 44 4444 44 44 • 444 4 · 4 4444

44 44 4 4444

44 444 4 444 44 4

44 4 4 44 4 4 44 4

4· 44 44 44 44 44 mesofilní nebo extremofilní (psychrofilní, psychrotropní, termofilní, barofilní, alkalofilní, acidofilní, halofilní atd.). Mohou se používat vyčištěné nebo nevyčištěné formy těchto enzymů. Nyní je obvyklou praxí modifikovat přírodní enzymy technikami proteinového/genetického inženýrství, aby se optimalizovalo jejich provedení účinnosti v čistících prostředcích podle vynálezu. Například mohou být navrženy takové varianty, aby slučitelnost enzymu se složkami, se kterými se obvykle setkáváme v těchto prostředcích, byla zvýšena. Mohou být navrženay také jiné varianty tak, aby optimální pH, stabilita vůči bělícím a chelatačním činidlům, katalytická aktivita a podobné vlastnosti varianty enzymy byly upraveny tak, aby se hodily pro příslušnou čistící aplikaci.

Pozornost by měla být zvláště zaměřena na aminokyseliny citlivé vůči oxidaci v případě bělící stability a na povrchové náboje u slučitelnosti s povrchově aktivním činidlem. Isolelektrický bod takových enzymů může být modifikován substitucí některých nabitých aminokyselin, např. zvýšení isoelektrického bodu může napomoci zlepšit slučitelnost s aniontovými povrchově aktivními činidly. Stabilita těchto enzymů může být dále zvýšena vytvořením např. adičních můstků solí a zesílením vazebných míst kovů, aby se zvýšila stabilita vůči chelatačním činidlům.

Avivážní hlinka: Druhou podstatnou složkou předložených pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky je avivážní hlinka. Podle předloženého vynálezu se může používat jakákoliv hlinka, která se používá v oblasti techniky, nebo její směsi. Výhodné příklady jsou popsány v britském patentovém spisu 1 400 898 nebo v USA patentu 5 019 292.

Mezi těmito hlinkami jsou zahrnuty rozmanité teplem ošetřené kaoliny a různé vícevrstvé smektity nebo bentonity, také nazývané montmorilonit. Jak je známo z oblasti techniky, výhodné smektitové hlinky vykazují katexovou kapacitu alespoň 50 miliekv. na 100 gramů hlinky, což odpovídá náboji vrstvy 0,2 až 0,6. Dalšími výhodnými hlinkami jsou ty, které mají velikosti částic v rozmezí od 5 do 50 mikrometrů.

• · ·· · * ·»·· · · ·· ···· ·· · · · · · • φ ·Φ · · · «··· φ ·· · · φ · φ · φ φ · φ «••Φ · · · · · · · φ ·· ·· φ · ·· · φ ··

Dalšími výhodnými smektitovými hlinkami jsou hektoritové hlinky obecného vzorce [(Mg₃._xLi_x)Si₄.yMe^lllyOw(OH₂._zF_z)r^(x+y<(x+^IVIⁿ⁺, kde y znamená 0 nebo jestliže y znamená 0, Me¹¹¹ znamená atom hliníku, železa nebo boru, Mⁿ⁺ znamená jednomocný (n=1) nebo dvojmocný (n=2) ion kovu, například vybraný ze sodíku, draslíku, hořčíku, vápníku a stroncia. Hodnota (x+y) je náboj vrstvy hektoritové hlinky. Hektoritové hlinky vhodné pro detergentní prostředky podle předloženého vynálezu mají distribuci náboje vrstvy takovou, že alespoň 50 % je v rozmezí od 0,23 do 0,31.

Výhodné jsou hektoritové hlinky přírodního původu, které mají distribuci náboje vrstvy takovou, že alespoň 65 % je v rozmezí od 0,23 do 0,31.

Specifické neomezující příklady smektitových hlinkových minerálů pro změkčování látek jsou:

montmorilonit sodný: Borck^(R), Volclay BC^(R), Gelwhite GP^(R>, Thixo-Jel^(R),

Ben-A-Gel^(R), hektorit sodný: Veegum F^(R) a Laponite SP^(R), saponit sodný: Barasym NAS 100^(R), montmorilonit vápenatý; Soft Clark^(R), Gelwhite L^w, Imvite K^(R), CSM-Clay^(R) od

Kimolous a hektorit lithný: Barasym LIH 200^(R).

Množství avivážní hlinky, které se používá podle předloženého vynálezu, závisí na formě pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky. Obecně může být v rozmezí od dolních mezí 0,1, 3 nebo 4 až do horních mezí 50, 25 nebo 15 % hmotn.

»0 ·«··

I*

0 0 0 0 « » 00 · • 0 0 · 0 · • · · 0 · ·· • · 0 « · 0 • · · · · · • · · · 0 0 0 « · 0 · · · 0 •0 00 00

Detergentní složky: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle vynálezu musí obsahovat alespoň jednu další detergetní složku. Přesná povaha této další složky a množství, která jsou zde zahrnuta, budou záviset na fyzikální formě prostředku a na povaze čistící operace, pro kterou se používají.

Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu s výhodou dále obsahují prací detergentní činidlo a/nebo složku péče o látky vybrané z celulasy, stavební složku vybranou ze zeolitu, trifosforečnanu sodného a/nebo vrstveného křemičitanu, kationtové povrchově aktivní činidlo a/nebo jejich směsi.

Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle vynálezu mohou existovat jako kapalina, pasta, gely, tyčinky, tablety, sprej, pěna, prášek nebo ve formě granulí. Granulované prostředky mohou existovat také v kompaktní formě a kapalné prostředky mohou existovat také v koncentrované formě.

Prostředky podle vynálezu mohou být připravovány například jako detergentní prostředky pro ruční praní a pro praní v automatické pračce včetně pracích aditivních prostředků a prostředků vhodných pro použití při namáčení a/nebo předběžném ošetření látek se skvrnami a jako máchací avivážní prostředky.

Jestliže se připravují jako prostředky vhodné pro použití při praní v automatické pračce, prostředky podle vynálezu s výhodou obsahují jak povrchově aktivní systém, který může obsahovat aniontové, kationtové, neiontové nebo obojetné povrchově aktivní činidlo nebo jejich směs, tak stavební systém, který může obsahovat fosforečnanovou stavební složku, nefosforečnanový anorganický zeolit, vrstvený křmeičitan, organickou stavební složku, jako je citrát a dále jednu nebo více detergentních složek, které jsou s výhodou vybrány z organických polymemích sloučenin, bělících činidel, dalších enzymů, potlačovatelů pěnění, dispergačních činidel, dispergačních činidel typu vápenných mýdel, činidel suspendujících ušpinění, činidel působích proti zpětnému ukládání ušpinění a inhibitorů koroze. Prací prostředky ♦ φ ···* <ι· <· < · v * · ·· • · · · * • * · ·

94

4 9

9 4

9 9

9 9 9

94

99 • 4 9 9

9 4 · • · Φ 4 • » t ·

9 4 mohou jako další detergentní složky obsahovat také avivážní činidla jiná než je anorganická hlinka nárokovaná v předloženém vynálezu. Prostředky, které obsahují mannanasu a hlinku, mohou poskytovat čištění látek, odstraňování sklvm, mohou mít avivážní účinek a zajišťují vzhled barvy, jestliže se připravují jako prací detergentní prostředky.

Prostředky podle vynálezu se mohou používat také jako detergentní aditivní výrobky v pevné nebo kapalné formě. Tyto aditivní výrobky jsou myšleny jako doplněk nebo jako činidlo, které zlepšuje provedení konvenčních detergentních prostředků a mohou se přidávat v jakémkoliv stupni procesu čištění.

Jestliže je to potřeba, prací detergentní prostředky podle vynálezu mají hustotu v rozmezí od 400 do 1200 g/litr, s výhodou od 500 do 950 g/litr prostředku měřeno při 20 °C.

Kompaktní forma prostředků podle vynálezu je nejlépe vyjádřena hustotou a v pojmech prostředku množstvím anorganické plnící soli. Anorganické plnící soli jsou konvenční přísady detergentních prostředků v práškované formě. V konvenčních detergentních prostředcích jsou plnící soli přítomny v podstatných množstvích, typicky v množství 17 až 35 % hmotn. z hmotnosti celého prostředku. V kompaktních prostředcích je plnící sůl přítomna v množstvích nepřevyšujících 15 % z celého prostředku, s výhodou nepřevyšujích 10 a nejvýhodněji nepřevyšující 5 % hmotn. z hmotnosti prostředku. Anorganické plnící soli, jako jsou míněny v předložených prostředcích, jsou vybrány ze síranů a chloridů alkalických kovů a kovů alkalických zemin. Výhodnou plnící solí je síran sodný.

Kapalné detergentní prostředky podle předloženého vynálezu mohou existovat také v koncentrované formě. V takovém případě kapalné detergentní prostředky podle předloženého vynálezu budou obsahovat menší množství vody, při srovnání s konvenčními kapalnými detergenty. Obsah vody koncentrovaného kapalného detergentů je typicky s výhodou menší než 40, výhodněji menší než 30 a nejvýhodněji menší než 20 % hmotn. z hmotnosti detergentního prostředku.

Vhodné detergentní sloučneiny pro použití podle vynálezu jsou vybrány ze skupiny sestávající z níže popsaných sloučenin.

Povrchově aktivní systém: Prací detergentních prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu mohou dále obsahovat povrchově aktivní systém, v němž je povrchově aktivní činidlo vybráno z neiontových a/nebo aniontových a/nebo kationtových a/nebo amfolytických a/nebo obojetných a/nebo semipolámích povrchově aktivních činidel. Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu budou s výhodou dále obsahovat kationtové povrchově aktivní činidlo. Překvapivě bylo zjištěno, že uvedené prostředky dále obsahující kationtové povrchově aktivní činidlo poskytují zlepšení provedení čištění a zlepšenou aviváž.

Další povrchově aktivní čindilo je typicky přítomno v množství od 0,1 do 60 % hmotn. Výhodnějším množstvím je 1 až 35 %, nejvýhodněji 1 až 30 % hmotn. z hmotnosti pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky podle vynálezu.

Povrchově aktivní činidlo se s výhodou připravuje tak, aby bylo slučitelné s enzymovými složkami přítomnými v prostředku. V kapalných nebo gelových prostředcích je povrchově aktivní činidlo nejvýhodněji formulováno tak, že podporuje nebo alespoň nedegraduje stabilitu jakéhokoliv enzymu v těchto prostředcích.

Polyethylen-, polypropylen- a polybutylen-oxidové kondenzáty alkylfenolů jsou vhodné pro použití jako neiontové povrchově aktivní činidlo povrchově aktivních systémů podle předloženého vynálezu, při čemž polyethylenoxidové kondenzáty jsou výhodné. Mezi tyto sloučeniny patří kondenzační produkty alkylfenolů s alkylovou skupinou se 6 až 14 atomy uhlíku, s výhodou s 8 až 14 atomy uhlíku bud v konfiguraci s přímým nebo rozvětveným řetězcem a s alkylenoxidem. Ve výhodném provedení je ethyienoxid přítomen v množství 2 až 25 molů, výhodněji 3 až 15 molů ethylenoxidu na mol alkylfenolu. Mezi komerčně dostupná neiontová povrchově aktivní činidla tohoto typu patří Igepal™ CO-630, vyráběná firmou GAF Corporation, a Triton™ X-45, X-114, X-100 a X-102, všechny vyráběné firmou Rohm & Haas Company. Tato povrchově aktivní činidla jsou obvykle označována jako alkylfenolalkoxyláty (např. alkylfenolethoxyláty).

Kondenzační produkty primárních a sekundárních alifatických alkoholů s 1 až 25 moly ethylenoxidu jsou vhodné pro použití jako neiontové povrchově aktivní činidlo neiontového povrchově aktivního systému podle předloženého vynálezu. Alkylový řetězec alifatického alkoholu může být buď přímý nebo větvený, primární nebo sekundární a obvykle obsahuje 8 až 22 atomů uhlíku. Výhodné jsou kondenzační produkty alkoholů s alkylovou skupinou s 8 až 20 atomy uhlíku, výhodněji od 10 do 18 atomů uhlíku, se 2 až 10 moly ethylenoxidu na mol alkoholu. V uvedených kondenzačních produktech jsou přítomny 2 až 7 molů ethylenoxidu a nejvýhodněji 2 až 5 molů ethylenoxoidu na mol alkoholu. Mezi příklady komerčně dostupných neiontových povrchově aktivních činidel tohoto typu patří Tergitol™ 15-S-9 (kondenzační produkt lineárního alkoholu s 11 až 15 atomy uhlíku s 9 moly ethylenoxidu), Tergitol™ 24-L-6 NMW (kondenzační produkt primárního alkoholu s 12 až 14 atomy uhlíku se 6 moly ethylenoxidu s úzkou distribucí molekulových hmotností), oba prodávané firmou Union Carbide Corporation, Neodol™ 45-9 (kondenzační produkt lineárního alkoholu se 14 až 15 atomy uhlíku s 9 moly ethylenoxidu), Neodol™ 23-3 (kondenzační produkt lineárního alkoholu s 12 až 13 atomy uhlíku se 3 moly ethylenoxidu), NEODOL™ 45-7 (kondenzační produkt lineárního alkoholu se 14 až 15 atomy uhlíku se 7 moly ethylenoxidu), Neodol™ 45-5 (kondenzační produkt lineárního alkoholu se 14 až 15 atomy uhlíku s 5 moly ethylenoxidu), vyráběné firmou Shell Chemical Company, Kyro™ EOB (kondenzační produkt alkoholu s 13 až 15 atomy uhlíku s 9 moly ethylenoxidu), vyráběný The Procter and Gamble Company, a Genapol LA 030 nebo 050 (kondenzační produkt alkoholu s 12 až 14 atomy uhlíku φ φ se 3 nebo 5 moly ethylenoxidu), vyráběný firmou Hoechst. Výhodným rozmezím HLB v těchto produktech je 8 až 11 a nejvýhodněji od 8 do 10.

V prostředcích podle vynálezu jsou užitečnými neiontovými povrchově aktivními činidly povrchově aktivního systému podle předloženého vynálezu také alkylpolysacharidy, jako jsou ty, které jsou popsány v USA patentu 4 565 647 Llenada, vydaném 21. ledna 1986, které mají hydrofóbní skupinu se 6 až 30, s výhodou s 10 až 16 atomy uhlíku, a polysacharid, např. polyglykosid, hydrofilní skupina obsahuje od 1,3 do 10, s výhodou od 1,3 do 3, nejvýhodněji od 1,3 do 2,7 sacharidových jednotek. Může se použít jakýkoliv redukující sacharid s 5 nebo 6 atomy uhlíku, např. glukosa, galaktosa a galaktosylové skupiny mohou být substituovány glukosylovými skupinami (popřípadě hydrofóbní skupina je připojena v poloze 2-, 3-, 4- atd., čímž poskytnou glukosu nebo galaktosu jako opak glukosidu nebo galaktosidu). Vazby mezi cukry mohou být např. mezi jednou polohou dalších sacharidových jednotek a polohami 2-, 3-, 4- a/nebo 6- předcházejících sacharidových jednotek.

Výhodné alkylpolyglykosidy jsou sloučeniny obecného vzorce

R²O(C_nH_2nO)t(glykosyl)_x, v němž R₂ je vybrána ze skupiny sestávající z alkylu, alkylfenylu, hydroxyalkylu, hydroxyalkylfenylu a jejich směsí, v nichž alkylové skupiny obsahují od 10 do 18, s výhodou od 12 do 14 atomů uhlíku, n znamená číslo 2 nebo 3, s výhodou 2, t znamená číslo od 0 do 10, s výhodou 0, a x znamená číslo od 1,3 do 10, s výhodou od 1,3 do 3, nejvýhodněji od 1,3 do 2,7. Glykosyl je s výhodou odvozen od glukosy. Při přípravě těchto sloučenin se nejdříve vytvoří alkohol nebo alkylpolyethoxyalkohol a ten potom zreaguje s glukosou nebo se zdrojem glukosy za vzniku glukosidu (připojeného v poloze 1). Další glykosylové jednotky mohou být potom připojeny mezi jejich polohou 1 a polohami 2, 3, 4 a/nebo 6 předcházejících glykosylových jednotek, s výhodou převážně v poloze 2.

«

Kondenzační produkty ethylenoxidu s hydrofobní bází vytvořené kondenzací propylenoxidu s propylenglykolem jsou také vhodné pro použití jako další neiontové povrchově aktivní systémy podle předloženého vynálezu. Hydrofobní část těchto sloučenin bude mít s výhodou molekulovou hmotnost od 1500 do 1800 a bude nerozpustná ve vodě. Přidání polyoxyethylenových skupin k této hydrofobní části má tendenci zvýšit rozpustnost molekuly jako celku ve vodě a tento kapalný charakter produktu se zachovává až do bodu, kdy obsah polyoxyethylenu je 50 % hmotn. z celkové hmotnosti kondenzačního produktu, což odpovídá kondenzaci s až 40 moly ethylenoxidu. Mezi příklady sloučenin tohoto typu patří některá komerčně dostupná povrchově aktivní činidla Plurafac™ LF404 a Pluronic™ vyráběná BASF.

Pro použití jako neiontové povrchově aktivní činidlo neiontového povrchově aktivního systému podle předloženého vynálezu jsou vhodné také kondenzační produkty ethylenoxidu s produkty reakce propylenoxidu s ethylendiaminem. Hydrofobní část těchto produktů sestává z produktů reakce ethylendiaminu s nadbytkem propylenoxidu a obecně má molekulovou hmotnost od 2500 do 3000. Tato hydrofobní část se zkondenzuje s ethylenoxidem v takovém rozsahu, aby kondenzační produkt obsahoval od 40 do 80 % hmotn. polyoxyethylenu a měl molekulovou hmotnost od 5000 do 11 000. Mezi příklady tohoto typu neiontového povrchově aktivního činidla patří některé komerčně dostupné sloučeniny Tetronic™ vyráběné firmou BASF.

Pro použití jako neiontová povrchově aktivní činidla povrchově aktivních systémů podle předloženého vynálezu jsou výhodnými polyethylenoxidové kondenzáty alkylfenolů, kondenzační produkty primárních a sekundárních alifatických alkoholů s 1 až 25 moly ethylenoxidu, alkylpolysacharidy a jejich směsi. Nejvýhodnější jsou alkyl(s 8 až 14 atomy uhlíku)fenolethoxyláty se 3 až 15 ethoxyskupinami a alkohol(s 8 až 18 atomy uhlíku)ethoxyláty (s výhodou průměrně s 10 atomy uhlíku), které mají 2 až 10 ethoxyskupin, a jejich směsi.

Vysoce výhodnými neiontovými povrchově aktivními činidly jsou povrchově aktivní činidla typu amidů mastných polyhydroxykyselin obecného vzorce • · » « » « • · r²-c-n-z ¹¹ >1 O R¹ v němž R¹ znamená atom vodíku nebo uhlovodíkovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, 2-hydroxyethyl, 2-hydroxypropyl nebo jejich směsi, R² znamená uhlovodíkovou skupinu s 5 až 31 atomy uhlíku a Z znamená polyhydroxyuhlovodíkovou skupinu s lineárním uhlovodíkovým řetězcem s alespoň třemi hydroxylovými skupinami přímo napojenými na řetězec nebo její alkoxylovaný derivát. S výhodou R¹ znamená methyl, R²znamená přímý alkyl s 11 až 15 atomy uhlíku nebo alkylový nebo alkenylový řetězec se 16 až 18 atomy uhlíku, jako je kokosový alkyl nebo jejich směsi, a Z je s výhodou odvozena od redukujícího cukru, jako je glukosa, fruktosa, maltosa a laktosa, v reduktivní aminační reakci.

Mezi vhodná aniontová povrchově aktivní činidla, která se zde používají, patří lineární alkylbenzensulfonátová, alkylestersulfonátová povrchově aktivní činidla zahrnující lineární estery karboxylových kyselin s 8 až 20 atomy uhlíku (tj. mastné kyseliny), které jsou sulfonovány plynným oxidem siřičitým podle The Journal of the American Oil Chemists Society 1975, 52, 323 až 329. Mezi vhodné výchozí materiály by patřily přírodní mastné látky, jako jsou ty, které jsou odvozeny od loje, palmového oleje atd.

Výhodná alkylestersulfonátová povrchově aktivní činidla, zvláště pro prací aplikace, zahrnují alkylestersulfonátová povrchově aktivní činidla obecného vzorce

O , H „

R³-CH-C-OR^r ,

I so₃m v němž R³ znamená uhlodíkovou skupinu s 8 až 20 atomy uhlíku, s výhodou alkyl nebo jejich kombinaci, R⁴ znamená uhlovodíkovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, s • · výhodou alkyl nebo jejich kombinaci, a M znamená kation, který tvoří ve vodě rozpustnou sůl s alkylestersulfonátem. Mezi vhodné kationty tvořící soli patří takové kovy, jako je sodík, draslík a lithium, a substituované nebo nesubstituované amoniové kationty, jako je monoethanolamin, diethanolamin a triethanolamin. R₃ s výhodou znamená alkyl s 10 až 16 atomy uhlíku a R₄ znamená methyl, ethyl nebo isopropyl. Zvláště výhodné jsou methylestersulfonáty, v nichž R³ znamená alkyl s 10 až 16 atomy uhlíku.

Mezi další vhodná aniontová povrchově aktivní činidla patří alkytsutfátová povrchově aktivní činidla, kterými jsou ve vodě rozpustné soli nebo kyseliny obecného vzorce ROSO₃M, v němž R s výhodou znamená uhlovodíkovou skupinu s 10 až 24 atomy uhlíku, s výhodou alkyl nebo hydroxyalkyl s alkylovou složkou s 10 až 20 atomy uhlíku, výhodněji alkyl nebo hydroxyalkyl s 12 až 18 atomy uhlíku, a M znamená atom vodíku nebo kation, např. kation alkalického kovu (např. sodík, draslík, lithium) nebo amonium nebo substituované amonium (např. methyl-, dimethyl- a trimethyl-amoniové kationty a kvartemí amoniové kationty, jako je tetramethyí-amoniový a dimethyl-piperidiniový kation, a kvartemí amoniové kationty odvozené od alkylaminů, jako je ethylamin, diethylamin, triethylamin a jejich směsi, a podobné). Typicky jsou pro nižší teploty praní výhodné alkylové řetězce s 12 až 16 atomy uhlíku (např. pro teplotu pod 50 °C) a alkylové řetězce se 16 až 18 atomy uhlíku pro vyšší teploty praní (např. nad 50 °C).

Pro čistící účely mohou být v čistících prostředcích podle předloženého vynálezu zahrnuta další aniontová povrchově aktivní činidla. Mezi ně patří soli (včetně například sodných, draselných, amoniových a substituovaných amoniových solí, jako jsou mono-, di- a tri-ethanolaminové soli) mýdel, primární nebo sekundární alkansulfonáty s 8 až 22 atomy uhlíku, ofefinsulfonáty s 8 až 24 atomy uhlíku, sulfonované polykarboxylové kyseliny připravené sulfonaci pyrotyzovaného produktu citrátů kovů alkalických zemin, např. jak je popsáno v britském patentovém spisu č. 1 082179, atkyl(s 8 až 24 atomy uhlíku)polyglykolethersulfáty (s až 10 moty ethylenoxidu), atkytgtycerolsulfonáty, mastné acytglycerolsuífonáty, mastné oíeyfglycerofsulfáty, alkyl• · • · >♦·· ·· , • · · · • · · · • · · · · • · · · ·· ·♦ · fenolethylenoxidetherové sulfáty, parafinové sulfonáty, alkylfosfáty, isethionáty, jako jsou acylisethionáty, N-acyltauráty, alkylsukcinamáty a sulfosukcináty, monoestery sulfosukcinátů (zvláště nasycené a nenasycené monoestery s 12 až 18 atomy uhlíku) a diestery sulfosukcinátů (zvláště nasycené a nenasycené diestery s 6 až 12 atomy uhlíku), acylsarkosináty, sulfáty alkylpolysacharidů, jako jsou sulfáty atkylpotyglukosidu (neiontové nesulfatované sloučeniny popsané níže), primární alkytsulfáty z rozvětveným řetězcem a alkylpolyethoxykarboxyláty, jako jsou sloučeniny obecného vzorce

RO(CH₂CH₂O)_k-CH₂COO‘M⁺, v němž R znamená alkyl s 8 až 22 atomy uhlíku, k znamená číslo od 1 do 10 a M znamená kation tvořící rozpustnou sůl. Vhodné jsou také pryskyřičné kyseliny a hydrogenované pryskyřičné kyseliny, jako je kalafuna, hydrogenovaná kalafuna a prykyřičné kyseliny a hydrogenované pryskyřičné kyseliny přítomné v nebo odvozené od talového oleje.

Další příklady jsou popsány v Surface Active Agents and Detergents (díl I a tt, Schwartz, Perry a Berch). Taková rozmanitá povrchově aktivní činidla jsou obecně popsána také v USA patentu 3 929678 Laughlina a spol., vydaném 30. prosince 1975, ve sloupci 23, řádek 58, až sloupci 29, řádek 23 (zde zahrnuto jako odkaz).

Jestliže jsou zde obsažena, potom prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu typicky obsahují od 1 do 40, s výhodou od 3 do 20 % hmotn. těchto aniontových povrchově aktivních činidel.

Mezi vysoce výhodná aniontová povrchově aktivní činidla patří povrchově aktivního činidla typu alkylalkoxylovaného sulfátu. Tato povrchově aktivní činidla jsou ve vodě rozpustné soli nebo kyseliny obecného vzorce RO(A)_mSO₃M, v němž R znamená nesubstituovanou alkylovou skupinu s 10 až 24 atomy uhlíku nebo hydroxyalkylovou skupinu s alkylovou složkou s 10 až 24 atomy uhlíku, s výhodou ·

• · • · alkylovou nebo hydroxylakylovou skupinu s 12 až 20 atomy uhlíku, výhodněji alkylovou nebo hydroxyalkylovou skupinu s 12 až 18 atomy uhlíku, A znamená ethoxynebo propoxy-jednotku, m znamená číslo větší než 0, typicky mezi 0,5 a 6, výhodněji mezi 0,5 a 3, a M znamená atom vodíku nebo kation, který může znamenat například kation kovu (např. sodíku, draslíku, lithia, vápníku, hořčíku atd.), amoniový nebo substituovaný amoniový kation. Patří sem alkyl-ethoxylované sulfáty stejně jako alkyl-propoxylované sulfáty. Mezi specifické příklady substituovaných amoniových kationtů patří methyl-, dimethyl- a trimethyl-amoniové kationty a kvartemí amoniové kationty, jako jsou tetramethylamoniové a dimethylpiperidinové kationty a kationty odvozené od alkylaminů, jako je ethylamin, diethylamin, triethylamin, a jejich směsí a podobné. Příklady povrchově aktivních činidel jsou sulfát alkyl(s 12 až 18 atomy uhlíku)polyethoxylátu (1,0) (Ci₂-Ci₈E(1 .0)M), sulfát alkyl(s 12 až 18 atomy uhlíku)polyethoxylátu (2,25) (Ci₂-Ci₈E(2.25)M), sulfát alkyl(s 12 až 18 atomy uhlíku)polyethoxylátu (3,0) (Ci2-Ci₈E(3.0)M) a sulfát alkyl(s 12 až 18 atomy uhlíku)polyethoxylátu (4,0) (Ci2-Ci₈E(4.0)M), při čemž M je vhodně vybrán ze sodíku a draslíku.

Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu mohou obsahovat také amfolytická, obojetná a semipolámí povrchově aktivní činidla, stejně jako neiontová a/nebo aniontová povrchově aktivní činidla jiná než ta, která již zde byla popsána.

Pro použití v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky podle předloženého vynálezu jsou vhodná také amfolytická povrchově aktivní činidla. Tato povrchově aktivní činidla mohou být obšírně popsána jako alifatické deriváty sekundárních nebo terciárních aminů nebo alifatické deriváty heterocyklických sekundárních a terciárních aminů, v nichž alifatická skupina může mít přímý nebo větvený řetězec. Jeden z alifatických substituentů obsahuje alespoň 8 atomů uhlíku, typicky od 8 do 18 atomů uhlíku, a alespoň jeden obsahuje aniontovou ve vodě solubilizující skupinu, např. karboxyskupinu, sulfonát a sulfát. Viz USA patent č. 3 929 678 Laughlina a spol., vydaný 30. prosince 1975, ve sloupci 19, řádky 18 až 35, pro příklady amfolytických činidel.

44 • · ♦ 4

4 4 4 • 4 4 4 • ·4 4 •4 44

Jestliže jsou v nich obsaženy, potom prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu typicky obsahují od 0,2 do 15, s výhodou od 1 do 10 % hmotn. těchto amfolytických povrchově aktivních činidel.

Pro použití v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky jsou vhodná také obojetná povrchově aktivní činidla. Tato povrchově aktivní činidla mohou být obšírně popsána jako deriváty sekundárních a terciárních aminů, deriváty heterocyklických sekundárních a terciárních aminů nebo deriváty kvartemích amoniových, kvartemích fosfoniových nebo terciárních sulfoniových sloučenin. Pro příklady obojetných povrchově aktivních činidel viz např. USA patent č. 3 929 678 Laughlina a spol., vydaný 30. prosince 1975, sloupec 19, řádek 18, až sloupec 22, řádek 48.

Jestliže jsou v nich obsaženy, potom prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu typicky obsahují od 0,2 do 15, s výhodou od 1 do 10 % hmotn. těchto obojetných povrchově aktivních činidel.

Semipolámí neiontová povrchově aktivní činidla jsou specielní kategorií neiontových povrchově aktivních činidel, mezi která patří aminoxidy rozpustné ve vodě obsahující alkylovou skupinu s 10 až 18 atomy uhlíku a dvě skupiny vybrané ze skupiny sestávající z alkylových skupin a hydroxyalkylových skupin s 1 až 3 atomy uhlíku, ve vodě rozpustné fosfinoxidy obsahující alkylovou skupinu s 10 až 18 atomy uhlíku a 2 skupiny vybrané ze skupiny sestávající z alkylových skupin a hydroxyalkylových skupin s 1 až 3 atomy uhlíku, a ve vodě rozpustné sulfoxidy obsahující alkylovou skupinu s 10 až 18 atomy uhlíku a skupinu vybranou ze skupiny sestávající z alkylové a hydroxyalkylové skupiny s 1 až 3 atomy uhlíku.

Mezi semipolámí neiontová detergentní povrchově aktivní činidla patří aminoxidová povrchově aktivní činidla obecného vzorce

9* ·99 9

O t

R³(OR⁴)xN(R⁵)₂ , v němž R³ znamená alkylovou, hydroxyalkylovou nebo alkylfenylovou skupinu nebo jejich směsi s 8 až 22 atomy uhlíku, R⁴ znamená alkylenovou nebo hydroxyalkylenovou skupinu se 2 až 3 atomy uhlíku nebo jejich směsi, x znamená číslo od 0 do 3, a každá R⁵ znamená alkylovou nebo hydroxyalkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku nebo polyethylenoxidovou skupinu s 1 až 3 ethylenoxidovými skupinami. Skupiny R⁵mohou být připojeny k sobě navzájem, např. atomem kyslíku nebo dusíku, takže tvoří kruhovou strukturu.

Tato aminoxidová povrchově aktivní činidla zvláště zahrnují alkyl(s 10 až 18 atomy uhlíku)dimethylaminoxidy a alkoxy(s 8 až 12 atomy uhlíku)ethyldihydroxyethylaminoxidy.

Jestliže jsou v nich obsaženy, potom čistící prostředky podle předloženého vynálezu typicky obsahují od 0,2 do 15, s výhodou od 1 do 10 % hmotn. těchto semipoiámíeh neiontových povrchové aktivních činidel.

Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu mohou dále obsahovat další povrchově aktivní činidla, která jsou vybrána ze skupiny primárních nebo terciárních aminů.

Mezi vhodné primární aminy pro použití podle vynálezu patří aminy obecného vzorce RiNH₂, v němž R-ι znamená alkylový řetězec se 6 až 12, s výhodou se 6 až 10 atomy uhlíku nebo skupinu R4X(CH₂)_n, X znamená skupinu -0-, -C(O)NH- nebo -NH-, R₄ znamená alkylový řetězec se 6 až 12 atomy uhlíku a n znamená číslo mezi 1 a 5, s výhodou 3. Alkylové řetězce Ri mohou být přímé nebo rozvětvené a mohou být přerušeny až 12, s výhodou méně než 5 ethylenoxidovými skupinami. Výhodné aminy podle shora uvedeného vzorce jsou alkylaminy. Vhodné aminy pro použití podle vynálezu mohou být vybrány z 1-hexylaminu, 1-oktylaminu, 1-decylaminu a lau44 ··

4 · » • 4 4 4 • 4 4 4 4 ♦ · 4 4

0· rylaminu. Mezi další výhodné primární aminy patří oxypropylamin, oktyloxypropylamin, 2-ethylhexyloxypropylamin, lurylamidopropylamin a amidopropylamin s 8 až 10 atomy uhlíku.

Mezi vhodné terciární aminy pro použití podle vynálezu patří terciární aminy obecného vzorce R1R2R3H, v němž R1 a R₂ znamenají alkylové řetězce s 1 až 8 atomy uhlíku nebo skupinu obecného vzorce

R₅

-(CH₂-CH-O)_xH ,

R₃ znamená buď alkylový řetězec se 6 až 12 atomy uhlíku, s výhodou se 6 až 10 atomy uhlíku, nebo R₃ znamená skupinu obecného vzorce R4X(CH₂)_n, v němž X znamená skupinu -0-, -C(O)NH- nebo -NH-, R₄ znamená skupinu se 4 až 12 atomy uhlíku a n znamená číslo mezi 1 a 5, s výhodou 2 až 3. R₅ znamená atom vodíku nebo alkyl s 1 až 2 atomy uhlíku a x znamená číslo mezi 1 až 6. R₃ a R₄ mohou být lineární nebo větvené a alkylové řetězce R₃ mohou být přerušeny až 12, s výhodou méně než 5 ethylenoxidovými skupinami.

Výhodnými terciárními aminy jsou aminy obecného vzorce RiR₂R₃N, v němž R1 znamená alkylový řetězec se 6 až 12 atomy uhlíku, R₂ a R₃ znamenají alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku nebo skupinu obecného vzorce

R₅

-(CH₂-CH-O)_xH , v němž R₅ znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu a x znamená číslo 1 až 2.

Výhodné jsou také amidoaminy obecného vzorce

RrC(O)-NH-(CH₂)n-N-(R₂)₂ • * φ ·· ·* φφ • φ φ · φ • · φφ φ • * · * · φ • · φ φ φ ·· ·♦ φφ v němž Ri znamená alkyl se 6 až 12 atomy uhlíku, n znamená číslo 2 až 4, s výhodou n znamená číslo 3, a R₂ a R₃ znamenají skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku.

Mezi nejvýhodnější aminy podle předloženého vynálezu patří 1-oktylamin, 1-hexylamin, 1-decylamin, 1-dodecylamin, oxypropylamin s 8 až 10 atomy uhlíku, N-kokosový 1,3-diaminopropan, kokosový alkyldimethylamin, lauryldimethylamin, laurylbis(hydroxyethyl)amin, kokosový bis(hydroxyethyl)amin, laurylamin propoxylovaný 2 moly, oktylamin propoxylovaný 2 moly, laurylamidopropylmethylamin, amidopropyldimethylamin s 8 až 10 atomy uhlíku a amidopropyldimethylamin s 10 atomy uhlílku.

Nejvýhodnější aminy pro použití v prostředcích podle vynálezu jsou 1-hexylamin, 1-oktylamin, 1-decylamin a 1-dodecylamin. Zvláště žádanými jsou dodecyldimethylamin, bishydroxyethyl(kokosový alkyl)amin, sedmkrát ethoxylovaný oleylamin, laurylamidopropylamin a kokosový amidopropylamin.

Bělící činidla: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky mohou dále obsahovat bělící činidla, jako je peroxid vodíku, PB1, PB4 a peruhličitan, která mají velikost částic 400 až 800 pm. Tyto složky bělících činidel mohou obsahovat jedno nebo více kyslíkatých bělících činidel a, podle zvoleného bělícího činidla, jeden nebo více bělících aktivátorů. Jestliže jsou kyslíkaté bělící sloučeniny přítomny, pak jsou typicky přítomny v množstvích od 1 do 25 % hmotn.

Složka bělícího činidla pro použití podle vynálezu může znamenat jakákoliv bělící činidla užitečná pro prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky obsahující kyslíkatá bělící činidla stejně jako jiná činidla známá z oblasti techniky. Bělící činidlo vhodné pro předložený vynález může znamenat aktivované nebo neaktivované bělící činidlo.

• w · »· · • · · • · · • » · • · · · ·* ·» • * · » · · • ♦ · • ·» • * * · ··

Jedna kategorie kyslíkatých bělících činidel, která se může používat, zahrnuje bělící činidla typu perkarboxylových kyselin a jejich solí. Mezi vhodné příklady této skupiny činidel patří hexahydrát monoperftalátu hořečnatého, hořečnatá sůl m-chlorperbenzoové kyseliny, 4-nonylamino-4-oxopermáselná kyselina a diperdodekandiová kyselina. Tato bělící činidla jsou popsána v USA patentu 4 483 781, USA patentové přihlášce 740 446, evropské patentové přihlášce 0 133 354 a USA patentu 4 412 934. Mezi vysoce výhodná bělící činidla patří také 6-nonylamino-6-oxoperkaprová kyselina, jak je popsána v USA patentu 4 634 551.

Jiná kategorie bělících činidel, která se může používat, zahrnuje halogenovaná bělící činidla. Příklady halogenanových bělících Činidel zahrnují například trichlorisokyanurovou kyselinu, dichlorisokyanurát sodný a draselný a N-chlor- a N-brom-alkansulfonamidy. Tyto materiály se normálně přidávají v množství 0,5 až 10 % hmotn. z hmotnosti konečného produktu, s výhodou v množství 1 až 5 % hmotn.

Činidla uvolňující peroxid vodíku se mohou používat v kombinaci s bělícími aktivátory, jako je tetraacetylethylendiamin (TAED), nonanoyloxybenzensulfonát (NOBS, popsný v USA patentu 4 412 934), 3,5-trimethylhexanoloxybenzensulfonát (ISONOBS, popsaný v evropském patentu 120 591) nebo pentaacetylglukosa (PAG) nebo fenolsulfonátový ester N-nonanoyl-6-aminokaprové kyseliny (NACA-OBS, popsaný ve spisu WO 94/28106), který se perhydrolyzuje za vzniku perkyseliny jako aktivních bělících částic, což vede ke zlepšení bělícího účinku. Vhodné aktivátory jsou také acylované citrátové estery, jako jsou sloučeniny popsané v doprovázející evropské patentové přihlášce č. 91870207.7 a nesymetrický acyklický imidový bělící aktivátor následujícího obecného vzorce popsaného v doprovázející USA patentové přihlášce č. 60/022 786 (Procter & Gamble, podané 30. července 1996) a č. 60/028 122 (podané 15. října 1996)

R₃

Ο « φ φ ♦ e φ« • · · • Φ • ♦ Φ • · ·

ΦΦ • φ • Φ • ·

ΦΦ • · Φ • ♦ » • · Φ • * φ φ ·· ΦΦ * · · • φ φ « * · • φ φ φφ v němž R1 znamená nasycenou nebo nenasycenou alkylovou skupinu s lineárním nebo rozvětveným řetězcem se 7 až 13 atomy uhlíku, R₂ znamená nasycenou nebo nenasycenou alkylovou skupinu s lineárním nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 8 atomy uhlíku a R₃ znamená nasycenou nebo nenasycenou alkylovou skupinu s lineárním nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 4 atomy uhlíku.

Užitečná bělící činidla, zahrnující perkyseliny a bělící systémy obsahující bělící aktivátory a perkyslíkaté bělící sloučeniny, pro použití v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky podle vynálezu jsou popsána v našich doprovázejících přihláškách USA č. 08/136 626, PCT/US95/07823, WO 95/27772, WO 95/27773, WO 95/27774 a WO 95/27775.

Peroxid vodíku může být přítomen také tak, že se přidá enzymatický systém (tj. enzym a subrát pro něj), který je schopen generovat peroxid vodíku na počátku nebo během procesu praní a/nebo máchání. Takové enzymatické systémy jsou popsány v evropské patentové přihlášce 91202655.6, podané 6. října 1991.

Mezi katalyzátory obsahující kov pro použití v bělících prostředcích patří katalyzátory obsahující kobalt, jako jsou pentaaminacetátkobaltité soli a katalyzátory obsahující mangan, jako jsou ty, které jsou popsány v evropských patentových přihláškách 549271, 549 272, 458 397, 458 398 a v USA patentech 5 246 621, 5194416 a 5114611. Bělící prostředek, obsahující perslouóenínu a bělící katalyzátor obsahující mangan a chelatační činidlo, je popsán v patentové přihlášce č. 94870206.3

Jiná bělící činidla než jsou kyslíkatá bělící činidla jsou v oblasti techniky také známa a mohou se zde používat. Mezi jeden typ nekyslíkatého bělícího činidla zvláštního zájmu patří fotoaktivovaná bělící činidla, jako jsou suífonované ftalocyaníny zinku a/nebo hliníku. Tyto materiály se mohou ukládat na substrát během procesu praní. Po ozáření světlem v přítomnosti kyslíku, jako je pověšení šatů pro usušení na denním světle, se sulfonovaný ftalocyanín zinku aktivuje a substrát se tak vybělí. Vý···· · · · · · · · • · ·· · 9 9 · · · «

99 999 9 999 99 9 • · · 9 · · · · 9 99 9 hodný ftalocyanin zinku a fotoaktivovaný bělící proces jsou popsány v USA patentu 4 033 718. Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky budou typicky obsahovat 0,025 až 1,25 % hmotn. sulfonovaného ftalocyaninu zinku.

Systém stavebních složek: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu mohou dále obsahovat stavební složku. Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu budou s výhodou dále obsahovat stavební složku vybranou ze zeolitu, trifosforečnanu sodného a/nebo vrstveného křemičítanu. Překvapivě bylo zjištěno, že uvedené prostředky, které dále obsahují stavební složku vybranou ze zeolitu, trifosforečnanu sodného a/nebo vrstveného křemičítanu, poskytují zlepšené provedení čištění a avíváže.

Pro použití podle vynálezu je vhodný jakýkoliv konvenční stavební systém, který zahrnuje hlinítokřemičitanové materiály, křemičitany, polykarboxyláty, alkylnebo alkenyl-jantarovou kyselinu a mastné kyseliny, takové materiály, jako je ethylendiamintetraacetát, diethylentriaminpentamethylenacetát, vychytávače iontů kovů, jako jsou aminopolyfosfonáty, zvláště ethyiendiamitetramethylenfosfonová kyselina a díethylentriaminpentamethylenfosfonová kyselina. Mohou se zde používat také fosfátové stavební složky.

Vhodnými stavebními Činidly mohou být anorganické íonexové materiály, obvykle anorganický hydratovaný hlinitokřemičítanový materiál, zvláště hydratovaný syntetický zeolit, jako je hydratovaný zeolit A, X, B, HS nebo MAP.

Jiným vhodným anorganickým stavebním materiálem je vrstvený křemičitan, např. SKS-6 (Hoechst). SKS-6 je krystalický vrstvený křemičitan sestávající z křemičítanu sodného (Na₂SÍ2O₅).

Mezi vhodné polykarboxyláty obsahující jednu karboxylovou skupinu patří kyselina mléčná, kyselina glykolová a jejich etherové deriváty, jak jsou popsány v • · · · » · · · • · · · · belgických patentech č. 831 368, 821 369 a 821 370. Mezi polykarboxyláty obsahující dvě karboxylové skupiny patří ve vodě rozpustné soli kyseliny jantarové, kyseliny malonové, (ethylendioxy)díoctové kyseliny, kyseliny maleinové, kyseliny diglykolové, kyseliny vinné, kyseliny tartronové a kyseliny fumarové, stejně jako etherkarboxyláty popsané v SRN vykládacím spisu 2446686 a 2 446 687 a v USA patentu č. 3 935 257 a sulfinylkarboxyláty popsané v belgickém patentu č. 640 623. Mezi polykarboxyláty obsahující tň karboxylové skupiny zvláště patří ve vodě rozpustné citráty, akonitáty a citrakonáty stejně jako sukcinátové deriváty, jako jsou karboxymethyloxysukcináty popsané v britském patentovém spisu č. 1 379 241, laktoxysukcináty popsané v holandské patentové přihlášce 7 205 873 a oxypolykarboxylátové materiály, jako jsou 2-oxa-l, 1,3-propan-tríkarboxyláty popsané v britském patentovém spisu 1 387 447.

Mezi polykarboxyláty, které obsahuji čtyři karboxylové skupiny, patří oxydisukcináty popsané v britském patentovém spisu č. 1 261 829, 1,1,2,2-ethan-tetrakarboxyláty, 1,1,3,3-propantetrakarboxyláty a 1,1,2,3-propantetrakarboxyláty. Mezi polykarboxyláty obsahující sulfosubstituenty patří sulfosukcínátové deriváty popsané v britských patentových spisech ó. 1 398 421 a 1 398 422 a v USA patentu č. 3 936 448 a sulfonované pyrolyzované citráty popsané v britském patentu č. 1 082 179, při čemž polykarboxyláty obsahující fosfonové substituenty jsou popsány v britském patentovém spisu č. 1 439 000.

Mezi alícyklické a heterocyklické polykarboxyláty patří cyklopentan-cís,cis,cis-tetrakarboxyláty, cykíopentadienpentakarboxyláty, 2,3,4,5-tetrahydrofuran-cÍs,cis,cÍs-tetrakarboxyláty, 2,5-tetrahydrofuran-cis-dikarboxyláty, 2,2,5,5-tetrahydrofurantetrakarboxyláty, 1,2,3,4,5,6-hexan-hexakarboxyláty a karboxymethylové deriváty polyhydroxyalkoholů, jako je sorbitol, mannitol a xylitol. Mezi aromatické polykarboxyláty patří kyselina meilítová, pyromeílitová a deriváty kyseliny ftalové popsané v britském patentovém spisu 1 425 343.

9 • 9 • · • ••9 99 9 · · · ·

9999 99 9 9 · 9 · • 99 999 9 999 99 9 · · 9 9 99 9 9 99 9

99 99 99 · · 9«

Ze shora uvedených jsou výhodnými polykarboxyláty hydroxykarboxyláty obsahující až tři karboxylové skupiny v molekule, zvláště citráty.

Mezi výhodné stavební systémy pro použití v předložených prostředcích patří směs ve vodě nerozpustného hlinitokřemičitanového stavebního činidla, jako je zeolit A nebo vrstvený křemičitan (SKS-6), a ve vodě rozpustného karboxylátového chelatačního činidla, jako je kyselina citrónová. Mezi další výhodné systémy stavebních složek patří směs ve vodě nerozpustné hlinitokřemičitanové stavební složky, jako je zeolit A, a ve vodě rozpustného karboxylátového chelatačního činidla, jako je kyselina citrónová. Výhodnými stavebními systémy pro kapalné prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu jsou mýdla a polykarboxyláty.

Mezi další stavební materiály, které mohou tvořit část stavebního systému pro použití v granulovaných prostředcích, patří anorganické materiály, jako jsou uhličitany, hydrogenuhličitany a křemičitany alkalického kovu, a organické materiály, jako jsou organické fosfonáty, aminopolyalkylenfosfonáty a aminopolykarboxyláty. Dalšími vhodnými ve vodě rozpustnými organickými solemi jsou homo- nebo ko-polymemí kyseliny nebo jejich soli, v nichž polykarboxylová kyselina obsahuje alespoň dvě karboxylové skupiny oddělené od sebe ne více než dvěma atomy uhlíku. Polymery tohoto typu jsou popsány v britském patentovém spisu 1 596 756. Příklady těchto solí jsou polyakryláty o molekulové hmotnosti 2000 až 5000 a jejich kopolymery s anhydridem kyseliny maleinové, jako jsou kopolymery s molekulovou hmotností od 20 000 do 70 000, zvláště kolem 40 000.

Soli detergentních stavebních složek jsou obvykle v prostředku obsaženy v množstvích od 5 do 80, s výhodou od 10 do 70 a nejobvykleji od 30 do 60 % hmotn. z hmotnosti prostředku.

Konvenční detergentní enzymy: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky mohou vedle mannanasového enzymu dále obsahovat jeden • · • · • · · ·

nebo více enzymů, které poskytují čistící provedení, poskytují péči o látky a/nebo mají dezinfekční účinky. Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu budou s výhodou dále obsahovat celulasu. Překvapivě bylo zjištěno, že uvedené prostředky dále poskytující celulasu poskytují zlepšené čištění a zlepšené provedení aviváže.

Mezi uvedené enzymy patří enzymy, které jsou vybrány z celulas, hemicelulas, peroxidas, proteas, glukoamylas, amylas, xylanas, lipas, fosfolipas, esteras, kutinas, pektinas, keratanas, reduktas, oxidas, fenoloxidas, lipoxygenas, ligninas, pullulanas, tannas, pentosanas, mallanas, β-glukanas, arabinosidas, hyaluronidas, chondroitinas, lakas nebo jejich směsí.

Vhodnou kombinací jsou prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky, které obsahují směs konvenčně použitelných enzymů, jako je proteasa, amylasa, lipasa, kutinasa a/nebo celulasa, společně s jedním nebo více enzymy degradujícími stěny rostlinných buněk.

Vhodnými proteasami jsou subtilisiny, které se získávají z příslušných kmenů B. subtilis a B. licheniformis (subtilisin BPN a BPN'). Jedna vhodná proteáza se získává z kmene Bacillus, má maximální aktivitu v rozmezí pH 8 až 12, byla vyvinuta a je prodávána jako Esperase^(R) firmou Novo Industries A/S z Dánska, která je zde dále uváděna jako Novo. Příprava tohoto enzymu a analogických enzymů je popsána v britském patentovém spisu 1 243 784 (Novo). Mezi další vhodné proteázy patří Alcalase^(R), Durazym^(R> a Savinase^(R) od Novo a Maxatase^(R), Maxacal^(R), Properase^(R)a Maxapem^(R) (proteinovým inženýrstvím sestavený Maxacal) od Gist-Brocads. Proteolytické enzymy zahrnují také modifikované bakteriální serinové proteasy, jako jsou ty, které jsou popsány v evropské patentové přihlášce č. 87 303761.8, podané 28. dubna 1987 (zvláště strany 17, 24 a 98) a která je zde nazývána protesasa B, a v evropské patentové přihlášce 199 404 Venegase, publikované 29. října 1986, která odkazuje na modifikovaný bakteriální serinový proteolytický enzym, která je zde nazývána protesas A. Vhodnou je proteasa nazývaná zde proteasa C, která je ·· «· • · · · · · · · · · · · variantou alkalické serinové proteasy z Bacillus, v níž lysin nahradil arginin v poloze 27, tyrosin nahradil valin v poloze 104, serin nahradil asparagin v poloze 123 a alanin nahradil threonin v poloze 274. Proteasa C je popsána v evropském patentu 90915958:4, který odpovídá spisu WO 91/06637, publikovanému 16. května 1991. Zahrnuty jsou zde také geneticky modifikované varianty, zvláště proteasa C.

Výhodná proteasa, označovaná jako proteasa D, je varianta karbonylové hydrolasy s aminokyselinovou sekvencí, která se v přírodě nevyskytuje, která je odvozena od prekursorové karbonylové hydrolasy substituováním různými aminokyselinami mnoha aminokyselinových zbytků v poloze uvedené karbonylové hydrolasy, která je ekvivalentní poloze +76, s výhodou také v kombinaci s jednou nebo více polohami aminokyselinových zbytků ekvivalentními s těmi, které jsou vybrány ze skupiny sestávající z +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a/nebo +274 podle číslování Bacillus amyloliquefaciens subtilisinu, jak je popsáno ve spisu WO 95/10591 a v patentové přihlášce C. Ghose a spol.:Bleaching Compositions Comprising Protease Enzymes, USA patentová přihláška č. 08/322 677, podaná 13. října 1994. Vhodná je také varianta karbonylové hydrolasy proteasy popsaná ve spisu WO 95/10591, která má aminokyselinovou sekvenci odvozenu nahražením více aminokyselinových zbytků v prekursoru enzymu, který odpovídá poloze +210 v kombinaci s jedním nebo více následujícími zbytky: +33, +62, +67, +76, +101, +103, +104, +107, +128, +129, +130, +132, +135, +156, +158, +164, +166, +167, +170, +209, +215, +217, +218 a +222, kde číslování poloh odpovídá přirozeně se vyskytujícímu Bacillus amyloliquefaciens subtilisinu nebo ekvivalentním aminokyselinovým zbytkům v jiných karbonylových hydrolasách nebo subtilisinech, jako je Bacillus lentus subtilisin (doprovázející patentová přihláška USA 60/048 550, podaná 4. června 1997).

Podle předloženého vynálezu jsou vhodnými také proteasy popsané v evropské patentové přihlášce 251 446 a ve spisu WO 91/06637, proteasa BLAP^(R)popsaná ve spisu WO 91/02792 a jejich varianty popsané ve spisu WO 95/23221.

• · • · · · · ·

Viz také proteasu s vysokým pH z Bacillus sp. NCIMB 40338 popsanou ve spisu WO 93/18140 A (Novo). Enzymatické detergenty obsahující proteasu, jeden nebo více jiných enzymů a inhibitor reversibilní proteasy jsou popsány ve spisu WO 92/03529 A (Novo). Jestliže je to žádoucí, je dostupná proteasa se sníženou adsorpci a zvýšenou hydrolýzou, jak je popsáno ve spisu WO 95/07791 (Procter & Gamble). Rekombinantní, trypsinu podobná proteasa pro detergentní činidla vhodná podle vynálezu je popsána ve spisu WO 94/25583 (Novo). Další vhodné proteasy jsou popsány v evropském patentu 516 200 (Unilever).

Proteolytické enzymy jsou v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky podle předloženého vynálezu obsaženy v množství od 0,0001 do 2, s výhodou od 0,001 do 0,2, výhodněji od 0,005 do 0,1 % hmotn. čistého enzymu z hmotnosti prostředku.

Mezi celulasy, které jsou užitečné v předloženém vynálezu, patří jak celulasy bakteriálního tak houbového typu, s výhodou ty, které mají optimum pH mezi 5 a 12 a specifickou aktivitu kolem 50 CEVU/mg (CÉVU znamená celulosovou viskozitní jednotku). Vhodné celulasy jsou popsány v USA patentu 4 435 307 Barbesgoarda a spol., japonském patentu 61078384 a spisu WO 96/02653, který popisuje houbovou celulasu z Humicola insolens, Trichoderma, Thielavia a Sporotrichum. Evropský patent 739 682 popisuje celulasy isolované z nových druhů Bacillus. Vhodné celulasy jsou popsány v britské patentové přihlášce 2 075 028 a 2 095 275, v SRN spisu OS 2 247 832 a ve spisu WO 95/26398.

Příklady těchto celulas jsou celulasy produkované kmenem Humicola insolens (Humicola grisea var. thermoidea), zvláště Humicola kmenem DSM 1800.

Jiné vhodné celulasy jsou celulasy pocházející z Humicola insolens s molekulovou hmotností 50 000, isolelektrickým bodem 5,5 a obsahující 415 aminokyselin, a endoglukanasa s molekulovou hmotností kolem 43 000 pocházející z Humicola ·· ·· insolens, DSM 1800, vykazující celulasovou aktivitu; výhodná endoglukanasová složka má aminokyselinovou sekvenci popsanou v PCT patentové přihlášce č. WO 91/17243. Vhodnými celulasami jsou také EDIII celulasy z Trichoderma longibrachiatum, popsaná ve spisu WO 94/21801, Genencor, publikovaném 29. září 1994. Zvláště vhodné celulasy jsou celulasy, které mají vlastnost péče o barvy. Příklady těchto celulas jsou celulasy popsané v evropské patentové přihlášce č. 9120287.9.2, podané 6. listopadu 1991 (Novo). Zvláště užitečné jsou Carezyme a Celluzyme (Novo Nordisk A/AS). Viz také spis WO 91/17244 a WO 91/21801. Další vhodné celulasy s vlastnostmi týkajícími se péče o látky a/nebo s čistícími vlastnostmi jsou popsány ve spisu WO 96/34092, WO 96/17994 a WO 95/24471.

Uvedené celulasy jsou v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky obvykle obsaženy v množstvích od 0,0001 do 2 % hmotn. čistého enzymu z hmotnosti pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky.

Peroxidázové enzymy se používají v kombinaci s kyslíkovými zdroji, např. peruhličitanem, perboritanem, persíranem, peroxidem vodíku atd. s fenolickým substrátem jako molekulovou zvyšující schopnost bělení. Používají se pro bělící roztok, tj. pro zabránění přenosu barviv nebo pigmentů, odstraněných ze substrátů během praní, na jiné substráty, které jsou přítomny v pracím roztoku. Mezi peroxidasové enzymy známé z oblasti techniky patří například křenová peroxidasa, ligninasa a halogenperoxidasa, jako je chlor- a brom-peroxidasa. Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky obsahující peroxidázu jsou popsány například v PCT mezinárodní přihlášce WO 89/099813, WO 89/09813, v evropské patentové přihlášce č. 91202882.6, podané 6. listopadu 1991, a v evropském patentu 96870013.8, podaném 20. února 1996. Vhodný je také lakasový enzym.

Zesilovače jsou obvykle obsaženy v množství od 0,1 do 5 % hmotn. z hmotnosti celého prostředku. Výhodnými zesilovači jsou substituovaný fenthiazin a fenoxazin 10-fenothiazinpropionová kyselina (PPT), 10-ethylfenothioazin-4-karbo4 44 44

4 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 • · · • · • 4

44 xylová kyselina (EPC), 10-fenoxazinpropionová kyselina (POP) a 10-methylfenoxazin (popsaný ve spisu WO 94/12621) a substituované syringáty (alkylovou skupinou se 3 až 5 atomy uhlíku substituované syringáty) a fenoly. Výhodnými zdroji peroxidu vodíku jsou péruhličitan nebo perboritan sodný.

Uvedené peroxidasy jsou v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky obvykle obsaženy v množstvích od 0,0001 do 2 % hmotn. čistého enzymu z hmotnosti pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky.

Další vhodné enzymy, které mohou být zahrnuty v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky podle předloženého vynálezu jsou lipasy. Mezi vhodné lipásové enzymy pro použití v detergentech patří ty, které jsou produkovány mikroorganismy skupiny Pseudomonas, jako je Pseudomonas stutzeri ATCC 19154, jak je popsáno v britském patentovém spisu 1 372 304. Mezi vhodné lipasy patří ty lipasy, které vykazují positivní imunologickou zkříženou reakci s protilátkou lipasy, produkované mikroorganismem Pseudomonas fíuorescent IAM 1057. Tato lipasa je dostupná od Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Nagoya, Japonsko, pod obchodním označením Lipase P Amano, zde dále označovaná také jako Amano-P. Mezi další komerční lipasy patří Amano-CES, lipasy z Chromobacter viscosum, např. Chromobacter viscosum var. lipolyticum NRRLB 3673 od Toyo Jozo Co., Tagata, Japonsko; Chromobacter viscosum lipasy od U.S. Biochemical Corp., USA, a Diosynth Co., Nizozemí, a lipasy z Pseudomonas gladioli. Zvláště vhodnými lipasami jsou lipasy jako M1 Lipase^(R) a Lipomax^(R) (Gist-Brocades) a Lipolase^(R) a Lipolase Ultra^(R) (Novo), o nichž bylo zjištěno, že jsou velmi účinné, jestliže se kombinují s prostředky podle předloženého vynálezu. Vhodné jsou také lipolytické enzymy popsané v evropském patentu 258 068, ve spisu WO 92/05249 a WO 95/22615 (Novo Nordisk) a ve spisu WO 94/03578, WO 95/35381 a WO 96/00292 (Unilever).

• · 99··

Vhodné jsou také kutinasy [EC 3.1.1.50], které lze považovat za specielní druh lipasy, konkrétně lipas, které nevyžadují interfaciální aktivaci. Podání kutinas k detergentním prostředkům bylo popsáno např. ve spisu WO A 88/09367 (Genencor), WO 90/09446 (Plant Genetic System) a WO 94/14963 a WO 94/14964 (Unilever).

Lipasy a/nebo kutinasy jsou normálně v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky zahrnuty v množství od 0,0001 do 2% hmotn. čistého enyzmu z hmotnosti pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky.

V prostřecích mohou být kvůli odstraňování skvrn na bázi sacharidů zahrnuty amylasy (a a/nebo β). Spis WO 94/02597, Novo Nordisk A/S, publikovaný 3. února 1994, popisuje detergentní prostředky, které zahrnují mutované amylasy. Viz také spis WO 95/10603, Novo Nordisk A/S, publikovaný 20. dubna 1995. Mezi další amylasy známé pro použití v detergentních prostředcích patří jak a- tak β-amylasy. α-Amylasy jsou známy v oblasti techniky a zahrnují ty amylasy, které jsou popsány v USA patentu č. 5 003 257, evropském patentu 252 666, spisu WO 91/00353, francouzském patentu 2 676 456, evropském patentu 285123, evropském patentu 525 610, evropském patentu 368 341 a v britském patentovém spisu č. 1 296 839 (Novo). Dalšími vhodnými amylasami jsou amylasy se zvýšenou stabilitou, popsané ve spisu WO 94/18314, publikovaném 18. srpna 1994, a spisu WO 96/05295, Genencor, publikovaném 22. února 1996, a amylasové varianty s další modifikací v bezprostředním předchůdci, dostupné od Novo Nordisk A/S, popsané ve spisu WO 95/10603, publikovaném v dubnu 1995. Vhodné amylasy jsou také popsány v evropském patentu 277 216 a ve spisech WO 95/26397 a WO 96/23873 (všechny Novo Nordisk).

Příklady komerčních α-amylasových produktů jsou Purafect Ox Am^(R> od Genencor a Termamyl^CR), Ban^(R), Fungamyl^(R) a Duramyl^(R), všechny dostupné od Novo Nordisk A/S, Dánsko. Spis WO 95/26397 popisuje další vhodné amylasy: a-amylasy, které se vyznačují specifickou aktivitou alespoň o 25 % vyšší než je

99

9 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

99 ♦ » 9 99 9

9 9 9 9 9 ♦ 9 99 9 ·

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 99 specifická aktivita Termamylu^(R) pň teplotě v rozmezí od 25 do 55 °C a pH v rozmezí od 8 do 10, měřeno testem α-amylasové aktivity Phadebas^(R). Vhodné jsou varianty shora uvedených enzymů, popsané ve spisu WO 96/23873 (Novo Nordisk). Další amylolytické enzymy se zlepšenými vlastnostmi, pokud jde o hladinu aktivity a kombinaci termostability a vyšší hladiny aktivity jsou popsány ve spisu WO 95/35382.

Amylolytické enzymy jsou zahrnuty v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky podle předloženého vynálezu v množství od 0,0001 do 2, s výhodou od 0,00018 do 0,06, výhodněji od 0,00024 do 0,08 % hmotn. čistého enzymu z hmotnosti prostředku.

Shora uvedené enzymy mohou být vhodného původu, jako je rostlinný, živočišný, bakteriální, houbový a kvasinkový původ. Původ může být dále mesofilní nebo extremofilní (psychrofilní, psychrotropní, termofilní, barofilní, alkalofilní, acidofilní, halofilní atd.). Mohou se používat vyčištěné nebo nevyčištěné formy těchto enzymů. Nyní je obvyklou praxí modifikovat přírodní enzymy technikami proteinového/genetického inženýrství, aby se optimalizovalo jejich provedení účinnosti v detergentních prostředcích podle vynálezu. Například mohou být navrženy takové varianty, že slučitelnost enzymu se složkami, se kterými se obvykle setkáváme v těchto prostředcích, je zvýšena. Mohou být navrženy také jiné varianty tak, aby optimální pH, stabilita vůči bělícím nebo chelatačním činidlům, katalytická aktivita a podobné vlastnosti varianty enzymy byly upraveny tak, aby se hodily pro příslušnou čistící aplikaci.

Pozornost by měla být zvláště zaměřena na aminokyseliny citlivé vůči oxidaci v případě bělící stability a na povrchové náboje u slučitelnosti s povrchově aktivním činidlem. Isolelektrický bod takových enzymů může být modifikován substitucí některých nabitých aminokyselin, např. zvýšení isoelektrického bodu může napomoci zlepšit slučitelnost s aniontovými povrchově aktivními činidly. Stabilita těchto enzymů může být dále zvýšena vytvořením např. adičních můstků solí a zesílením vazebných míst vápníku, aby se zvýšila stabilita vůči chelatačním činidlům. Zvláštní pozornost

99··

99

9 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

99 • 9 99 • 999 9 ·

9 99 9 9

9 9 9 · 9 9 • · · · 9 9

99 99 musí být věnována celulasám, protože většina celulas má oddělené vazbené domény (CBD). Vlastnosti takových enzymů lze změnit modifikacemi v těchto doménách.

Uvedené enzymy jsou normálně v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky obsaženy v množstvích od 0,0001 do 2 % hmotn. čistého enzymu z hmotnosti pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky. Enzymy se mohou přidávat jako oddělené jednotlivé složky (kousky, granule, stabilizované kapaliny atd. obsahující jeden enzym) nebo jako směsi dvou či více enzymů (např. kogranuláty).

Dalšími vhodnými detergentními přísadami, které se mohou přidávat, jsou vychytávače oxidace enzymů, které jsou popsány v doprovázející evropské patentové přihlášce 92870018.6, podané 31. ledna 1992. Jejich příklady jsou ethoxylované tetraethylenpolyaminy.

Mnoho enzymových materiálů a prostředků pro jejich zavedení do syntetických detergentních prostředků je popsáno také ve spisu WO 93/07263 A a WO 93/07260 A (Genencor International), WO 89/08694 A (Novo) a USA patentu 3 553139, 5. ledna 1971, McCarty a spol. Enzymy jsou dále popsány v USA patentu číslo 4 101 457 Placeho a spol., 18. července 1978, a USA patentu č. 4 507 219 Hughese,

26. března 1985. Enzymové materiály užitečné pro kapalné detergentní prostředky a jejich zahrnutí do těchto prostředků jsou popsány v USA patentu č. 4 261 868 Hory a spol., 14. dubna 1981. Enzymy pro použití v detergentních prostředcích mohou být stabilizovány různými způsoby. Způsoby stabilizování enzymů jsou popsány a jejich příklady jsou uvedeny v USA patentu 3 600 319 Gedgeho a spol., 17. srpna 1971, v evropském patentu 199405 a v evropském patentu 200 586 Venegase, 29. října 1986. Enzymové stabilizační systémy jsou popsány také například v USA patentu 3 519 570. Užitečný Bacillus, sp. AC13, poskytující proteasy, xylanasy a celulasy, je popsán ve spisu WO 94/01532 A (Novo).

·»··

4 4 4

4 44

4 4 4

4 4

4 4 4

4 44

44

4 4 4

4 4 4 4

4 4 4

44

Účinek péče o barvy a péče o látky: Patří sem rovněž technologie, které zajišťují běči o barvy. Příklady těchto technologií jsou kovové katalyzátory pro zachování barvy. Tyto kovové katalzyátory jsou popsány v doprovázející evropské patentové přihlášce č. 92870181.2. Činidla fixující barviva, polyolefinová disperze proti tvoření vrásek a zlepšenou absorbovatelnost vody, parfém a polymer s aminovou funkcí (PCT/US 97/16546) pro ošetření barev a pro dojem parfému jsou dalšími příklady technologií pečujících o barvy/látky a jsou popsány v doprovázející evropské patentové přihlášce č. 96870140.9, podané 7. listopadu 1996.

Avivážní činidla látek mohou být rovněž zahrnuta v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky podle předloženého vynálezu. Tato činidla mohou být anorganická nebo organická. Mezi organická avivážní činidla patří ve vodě nerozpustné terciární aminy, jak jsou popsány v britském patentovém spisu A 1 514 276 a v evropském patentu B 0 011 340. Jejich kombinace s mono(s 12 až 14 atomy uhlíku)kvartemími amoniovými solemi jsou popsány v evropském patentu B 0 026 527 a B 0 026 528 a amidy se dvěma dlouhými řetězci jsou popsány v evropském patentu B 0 242 919. Mezi další užitečné organické složky avivážních systémů pro látky patří polyethylenoxidové materiály s vysokou molekulovou hmotností, jak jsou popsány v evropské patentové přihlášce A 0 299 575 a 0 313146.

Organická avivážní činidla látek, jako jsou ve vodě nerozpustné terciární aminy nebo amidové materiály s dvěma dlouhými řetězci, jsou v prostředcích obsaženy v množstvích od 0,5 do 5, normálně od 1 do 3 % hmotn., zatímco polyethylenoxidové materiály s vysokou molekulovou hmotností a ve vodě rozpustné kationtové materiály se přidávají v množstvích od 0,1 do 2, normálně od 0,15 do 1,5 % hmotn. Tyto materiály se normálně přidávají ke rozprášením vysušené části prostředku, i když v některých případech může být vhodnější přidávat je jako suchou sypkou směs nebo je postříkat jako roztavenou kapalinu na další pevné složky prostředku.

Chelatační činidla: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle vynálezu mohou obsahovat popřípadě také jedno nebo více chelatačních »♦ 999· ·· ·· ♦ · 1 • · « » · · 1

I 9 9 « ·« ·♦ činidel železa a/nebo manganu. Tato chelatační činidla mohou být vybrána ze skupiny sestávající z aminokarboxylátů, aminofosfonátů, polyfunkčně substituovaných aromatických chelatačních činidel a jejich směsí, všech, jak jsou popsány níže. Bez ohledu na teorii se předpokládá, že příznivé účinky těchto materiálů spočívají zčásti v jejich výjimečné schopnosti odstraňovat ionty železa a manganu z pracích roztoků tvorbou rozpustných chelátů.

Mezi aminokarboxyláty, užitečné jako případná chelatační činidla, patří ethylendiamintetraacetáty, N-hydroxyethylethylendiamintriacetáty, nitriltriacetáty, ethylendiamintetrapropionáty, triethylentetraminhexaacetáty, diethylentriaminpentaacetáty a ethanoldiglyciny, jejich soli s alkalickým kovem, amoniakem a jejich substituované amoniové soli a jejich směsi.

Pro použití v prostředcích podle vynálezu jako chelatační činidla jsou vhodné také aminofosfonáty, jestliže jsou dovolena alespoň nízká množství celkového fosforu v detergentních prostředcích. Tato činidla zahrnují ethylediamintetrakis(methylenfosfonáty), jako je Dequest. Tyto aminofosfonáty s výhodou neobsahují alkylovou nebo alkenylovou skupinu s více než 6 atomy uhlíku.

V prostředcích podle vynálezu jsou užitečná také polyfunkčně substituovaná aromatická chelatační činidla. Viz USA patent 3 812 044 Connora a spol., vydaný 21. května 1974. Výhodnými sloučeninami tohoto typu v kyselé formě jsou dihydroxydisulfobenzeny, jako je 1,2-dihydroxy-3,5-disulfobenzen.

Výhodným zde používaným biodegradovatelným chelatačním činidlem je ethylendiamin-disukcinát (EDDS), zvláště [S,S]-isomer, jak je popsán v USA patentu 4 704 233 Hartmana a Perkinse, 3. listopadu 1987.

Prostředky podle vynálezu mohou obsahovat také ve vodě rozpustné soli (nebo kyselou formu) methylglycindioctové kyseliny (MGDA) jako chelatační činidlo ♦0 0000

00

0 0 0 t 0 0 *

0 0 0

00 nebo současně používanou stavební složku užitečné například s nerozpustnými stavebními složkami, jako jsou zeolity, vrstvené křemičitany a podobné.

Jestliže se používají, pak tato chelatační činidla budou v pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky podle vynálezu obvykle obsažena v množstvích od 0,1 do 15 % hmotn. z hmotnosti prostředků podle vynálezu. Výhodněji, jestliže se používají, tato chelatační činidla budou v prostředcích obsažena v množstvích od 0,1 do 3,0 % hmotn. z hmotnosti prostředků.

Potlačovatelé pěnění: Jinou případnou složkou je potlačovatel pěnění, jehož příkladem jsou silikony a směsi oxid křemičitý-silikon. Silikony mohou být obecně representovány alkylovanými polysiloxanovými materiály, zatímco oxid křemičitý se normálně používá v jemně práškované formě, jehož příklady jsou aerogely a xerogely oxidu křemičitého a hydrofobní oxidy křemičté různých typů. Tyto materiály mohou být v prostředcích zahrnuty jako částice, v nichž je potlačovatel pěnění s výhodou uvolnitelně zahrnut ve ve vodě rozpustném nebo ve vodě dispergovatelném nosiči, který je v podstatě nepropustný pro povrchově neaktivní detergent. Potlačovatel pěnění může být také rozpuštěn nebo dispergován v kapalném nosiči a aplikován nastříkáním na do jedné či více jiných složek. Výhodné silikonové činidlo regulující pěnění je popsáno Bartollotem a spol.: USA patent 3 933 672. Dalšími zvláště užitečnými potlačovateli pěnění jsou samoemulgující silikonové potlačovatele pěnění popsané v SRN patentové přihlášce DTOS 2 646 126, publikované 28. dubna 1977. Příkladem takové sloučeniny je DC-544, komerčně dostupný od Dow Corning, což je kopolymer siloxan/glykol. Zvláště výhodným činidlem regulujícím pěnění je systém potlačující pěnění, který obsahuje směs silikonových olejů a 2-alkyl-alkanolů. Vhodnými 2-alkylalkanoly je 2-butyloktanol, který je komerčně dostupný pod obchodním názvem Isofol 12 R.

Tento systém potlačovatelů pěnění je popsán v doprovázející evropské patentové přihlášce N 92870174.7, podané 10. listopadu 1992.

4* 4444

44

4 4 4 · 4 *

4 4 4

44

4 4 4 4 4

4 44 44

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

44 4·

Zvláště výhodná silikonová činidla regulující pěnění jsou popsána v doprovázející evropské patentové přihlášce č. 92201649.8. Uvedené prostředky mohou obsahovat směs silikon/oxid křemičitý v kombinaci s prachovým neporézním oxidem křemičitým, jako je Aerosil^(R).

Potlačovatelé pěnění, jak shora popsáno, se obvykle používají v množstvích od 0,001 do 2, s výhodou od 0,01 do 1 % hmotn. z hmotnosti prostředku.

Další složky: V pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky se mohou používat další složky, jako jsou činidla suspendující ušpinění, činidla uvolňující ušpinění, optická zjasňující činidla, abraziva, baktericidy, inhibitory ztrácení lesku, barvící činidla a/nebo parfémy uzavřené nebo neuzavřené v tobolkách.

Zvláště vhodným materiálem pro uzavření do tobolek jsou ve vodě rozpustné tobolky, které sestávají z matrice polysacharidu a polyhydroxysloučenin, jak jsou popsány v britském patentovém spisu 1 464 616. Další vhodné ve vodě rozpustné materiály pro uzavření do tobolek obsahují dextriny odvozené od neželatinizujících škrobových esterů substituovaných dikarboxylových kyselin, jak jsou popsány v USA patentu č. 3455 838. Tyto estery dextrinu s kyselinami se s výhodou připravují z takových škrobů, které pocházejí z voskové kukuřice, voskového ciroku, sága, tapoiky a brambor. Mezi vhodné příklady materiálů pro uzavírání do tobolek patří N-Lok vyráběný National Starch. Materiál N-Lok pro uzavírání do tobolek sestává z modifikovaného kukuřičného škrobu a z glukosy. Tento škrob je modifikován přidáním monofunkčních substituovaných skupin, jako je anhydrid oktenyljantarové kyseliny.

Mezi činidla působící proti zpětnému ukládání ušpinění a způsobující suspendování ušpinění, která jsou vhodná podle vynálezu, patří celulózové deriváty, jako je methylcelulóza, karboxymethylcelulóza a hydroxyethylcelulóza, a homo- nebo ko-polymemí polykarboxylové kyseliny nebo jejich soli. Mezi polymery tohoto typu patří polyakryláty a kopolymery anhydridu kyseliny maleinové a kyseliny akrylové, shora zmíněné jako stavební složky, stejně jako kopolymery anhydridu kyseliny φφ φφ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ • φ · φ φ φ φ φ « « φφ φ · φ φ φφ φ φ maleinové s ethylenem, methylvinyletherem nebo methakrylovou kyselinou, anhydrid kyseliny maleinové představuje alespoň 20 molámích procent kopolymeru. Tyto materiály se normálně používají v množstvích od 0,5 do 10 % hmotn., výhodněji od 0,75 do 8, nejvýhodněji od 1 do 6 % hmotn.

Výhodné optické zjasňující prostředky mají aniontový charakter. Jejich příklady jsou dvojsodná sůl 4,4'-bis-(2-diethanolamino-4-anilino-1,3,5-triazin-6-ylamino)stilben-2:2'-disulfonátu, dvojsodná sůl 4,4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-1,3,5-triazin-6-ylamino)-stilben-2:2'-disulfonátu, dvojsodná sůl 4,4'-bis-(2,4-dianilino-1,3,5-triazin-6-ylamino)stilben-2:2'-dísulfonátu, monosodná sůl 4',4-bis-(2,4-dianilino-1,3,5-triazin-6-ylamino)-stilben-2-sulfonátu, dvojsodná sůl 4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-methyl-N-2-hydroxyethylamino)-1,3,5-triazin-6-ylamino)stilben-2:2'-disulfonátu, dvojsodná sůl 4,4'-bis-(4-fenyl-Ž.I.S-triazol-ž-yQstilben-ž^-disulfonátu, dvojsodná sůl 4,4'-bis-(2-anilino-4-(1-methyl-2-hydroxyethylamino)-1,3,5-triazin-6-ylamino)-stilben-2:2'-disulfonátu, sodná sůl 2(stilbyl-4-(nafto-T,2':4,5)-1,2,3-triazol-2''-sulfonátu a 4',4-bis-(2-sulfostyryl)bifenyl. Vysoce výhodná zjasňující činidla jsou specifická zjasňující činidla popsaná v evropském patentu 753 567.

Dalšími užitečnými polymemími materiály jsou polyethylenglykoly, zvlášty s molekulovou hmotností 1000 až 10 000, zvláště 2000 až 8000 a nejvýhodněji 4000. Používají se v množstvích od 0,20 do 5, výhodněji od 0,25 do 2,5 % hmotn. Tyto polymery a dříve zmíněné homo- a ko-polymemí polykarboxylátové soli jsou cenné pro zlepšení uchovávání bělosti, ukládání popelu na látky a provedení čištění hlinek, proteinových a oxidovatelných ušpinění v přítomnosti nečistot transitního kovu.

Činidla uvolňující ušpinění užitečná v prostředcích podle předloženého vynálezu znamenají konvenčně kopolymery nebo terpolymery tereftalové kyseliny s ethylenglykolovými a/nebo propylenglykolovými jednotkami v různých uspořádáních. Příklady těchto polymerů jsou popsány v USA patentech číslo 4116 885 a 4 711 730 a v evropské publikované patentové přihlášce č. 0 272 033. Zvláště výhodný polymer podle evropské patentové přihlášky 0 272 033 je sloučenina obecného vzorce * · ·» ·· 9 999 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 » 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 · · · *

99 99 9 9 99 9 9 (CH₃(PEG)43)o,7₅(POH)o,₂₅F-PO)2.₈r-PEG)o,4]T(PO-H)o,₂₅((PEG)4₃CH₃)o.7₅, v němž PEG znamená skupinu -(OC₂H₄)O-, PO znamená skupinu (OC₃H₆O) a T znamená skupinu (pcOC₅H₄CO).

Velmi užitečné jsou také modifikované polyestery, jako jsou náhodné kopolymery dimethyltereftalátu, dimethylsulfoisoftalátu, ethylenglykolu a 1,2-propandiolu, koncové skupiny sestávají primárně ze sulfobenzoátu a sekundárně z monoesterů ethylenglykolu a/nebo propandiolu. Cílem je získat polymer na obou koncích ukončený sulfobenzoátovými skupinami, primárně v předložené souvislosti většina kopolymerů podle vynálezu bude na konci uzavřena sulfobenzoátovými skupinami. Některé kopolymery však budou méně než plně uzavřeny a jejich koncové skupiny tedy mohou sestávat z monoesteru ethylenglykolu a/nebo propan-1,2-diolu, které sekundárně sestávají z těchto částí.

Vybrané polyestery podle vynálezu obsahují 46 % hmotn. dimethyltereftalové kyseliny, 16 % hmotn. propan-1,2-diolu, 10 % hmotn. ethylenglykolu, 13 % hmotn. dimethylsulfobenzoové kyseliny a 15 % hmotn. sulfoisoftalové kyseliny a mají molekulovou hmotnost kolem 3000. Polyestery a způsob jejich výroby jsou popsány podrobně v evropské patentové přihlášce 311 342.

V oblasti techniky je velmi dobře známo, že volný chlor ve vodě z vodovodu rychle deaktivuje enzymy obsažené v detergentních prostředcích. Použití vychytávače chloru, jako je perboritan, síran amonný, siřičitan sodný nebo polyethylenimin, v množství nad 0,1 % hmotn. z hmotnosti celého prostředku zlepšuje stabilitu detergentních enzymů při praní. Prostředky obsahující vychytávač chloru jsou popsány v evropské patentové přihlášce 92870018.6, podané 31. ledna 1992.

Alkoxylované polykarboxyláty, jako jsou ty, které jsou připraveny z polyakrylátů, jsou užitečné podle vynálezu pro dosažení dalšího odstraňování mastnosty.

9 999

99

9 9 · • · « ·

9 9 9

Μ 99

9 · • ·· • · 9

Tyto materiály jsou popsány ve spisu WO 91/08281 a v PCT 90/01815 na str. 4 a na následujících stranách; oba spisy jsou zde zahrnuty jako odkazy. Chemicky tyto materiály obsahují polyakryláty, které mají jednu ethoxyskupinu na každých 7 až 8 akrylátových jednotek v postranním řetězci. Postranní řetězce mají obecný vzorec -(CH₂CH₂O)_m(CH₂)nCH₃, v němž m znamená číslo 2 až 3 a n znamená číslo 6 až 12. Postranní řetězce jsou esterovou vazbou navázány na polyakrylátový základní skelet, takže poskytují polymemí strukturu typu hřebenu. Molekulová hmotnost se může měnit, typicky je však v rozmezí od 2000 do 50000. Tyto alkoxylované polykarboxyláty mohou být v prostředcích obsaženy v množství od 0,05 do 10 % hmotn.

Dispergační činidla: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu mohou obsahovat také dispergační činidla. Vhodnými ve vodě rozpustnými organickými solemi jsou homo- nebo ko-polymemí kyseliny nebo jejich soli, v nichž polykarboxylová kyselina obsahuje alespoň dvě karboxylové skupiny, které jsou od sebe odděleny ne více než dvěma atomy uhlíku. Polymery tohoto typu jsou popsány v britském patentovém spisu číslo A 1 596 756. Příklady těchto solí jsou polyakryláty o molekulové hmotnosti 2000 až 5000 a jejich kopolymery s anhydridem kyseliny maleinové, jako jsou kopolymery s molekulovou hmotností od 1000 do 100 000.

Do pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky podle předloženého vynálezu se mohou přidávat zvláště kopolymery akrylátů a methakrylátů, jako je 480N, který má molekulovou hmotnost 4000, v množství od 0,5 % do 20 % hmotnostních z hmotnosti prostředku.

Prostředky podle vynálezu mohou obsahovat peptizační sloučeninu vápenného mýdla, která ma schopnost dispergovat vápenné mýdlo (LSDP), jak je zde dále definováno ne více než 8, s výhodou ne více než 7, nejvýhodněji ne více než 6. Peptizační sloučenina vápenného mýdla je přítomna s výhodou v množství od 0 % do 20 % hmotn.

V9 ···« ·· ··

Μ · · « • · · · • · · · • · · ·

Φ· • · * « • · ·« • · · · · • · · · ·· *· • · · • · · • · 9 · • · · · ·· 99

Číselná míra účinnosti peptizační sloučeniny vápenného mýdla je dána dispergační hodnotou vápenného mýdla (LSDP), která se měří použitím testu dispergace vápenného mýdla, jak je popsán v článku H. C. Borghettyho a C. A. Bergmana: J. Am. Oil. Chem. Soc. 1950, 27, 88 až 90. Tento test dispergování vápenného mléka je široce používán v praxi této oblasti techniky, a je na něj odkazováno například v následujících přehledných článcích: W. N. Linfield: Surfactant Science Senes 7, 3, W. N. Linfield: Tenside Surf. Det. 1990, 27, 159 až 163, a Μ. K. Nagarajan, W. F. Masler Cosmetics and Toiletries 1989, 104, 71 až 73. LSDP znamená poměr % hmotnostních dispegačního činidla k oleátu sodnému, kterého je zapotřebí pro dispergování usazenin vápenného mýdla vytvořených působením 0,025 g oleátu sodného ve 30 ml vody s ekvivalentem tvrdosti 333 ppm CaCO₃ (poměr Ca: Mg = 3:2).

Povrchové aktivní Činidla, která mají dobrou schopnost peptizační sloučeniny vápenného mýdla, zahrnují některé aminoxidy, betainy, sulfobetainy, alkylethoxysulfáty a ethoxylované alkoholy.

Mezi příklady povrchově aktivních činidel, která mají LSDP ne vyšší než 8, pro použití podle předloženého vynálezu patří dimethylaminoxid se 16 až 18 atomy uhlíku, alkyl(s 12 až 18 atomy uhlíku)ethoxysulfáty s průměrným stupněm ethoxylace od 1 do 5, zvláště alkyl(s 12 až 15 atomy uhlíku)ethoxysulfátové povrchově aktivní činidlo se stupněm ethoxylace 3 (LSDP = 4) a ethoxylované alkoholy se 14 až 15 atomy uhlíku s průměrným stupněm ethoxylace buď 12 (LSDP = 6) nebo 30, prodávaná pod obchodními názvy Lutensol A012 a Lutensol A030 firmou BASF GmbH.

Polymerní peptizační vápenná mléka vhodná pro použití podle vynálezu jsou popsána v článku Μ. K. Nagarajana a W. F. Maslera: Cosmetics and Toiletries 1989, 104, 71 až 73.

• · • · · · 9 9 · · · · · • · ·· 9 9 · · · · · • 9 9 · 9 · 9 999 99 9

Jako peptizační sloučeniny vápenného mléka se mohou použít také hydrofóbní bělící činidla, jako je 4-[N-oktanoyl-6-aminohexanoyl]benzensulfonát, 4-[N-nonanoyl-6-aminohexanoyl]benzensulfonát, 4-[N-dekanoyl-6-aminohexanoyl]benzensulfonát a jejich směsi a nonanoylbenzensulfonát spolu s hydrofilními/hydrofóbními bělícími činidly.

Inhibice přenosu barviv: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu obsahují také sloučeniny pro inhibování přenosu z jedné látky na druhou těch barviv, která jsou solubilizována a suspendována a se kterými se látka setkává během procesů praní, při kterém se perou barevné látky.

Polymemí činidla inhibující přenos barviv: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu obsahují také od 0,001 do 10 %, s výhodou od 0,01 do 2, výhodněji od 0,05 do 1 % z hmotnosti polymemích činidel inhibujících přenos barviv. Tato polymemí činidla inhibující přenos barviv jsou normálně zahrnuta do pracích detergentních prostředků a/nebo prostředků péče o látky proto, aby inhibovala přenos barviv z barevných látek na látky, které se s nimi perou. Tyto polymery mají schopnost tvořit komplex nebo absorbovat těkavá barviva vymytá z obarvených látek před tím, než tato barviva mají příležitost ulpět na jiných předmětech při praní.

Zvláště výhodnými polymemími činidly inhibujícími přenos barviv jsou polyaminové N-oxidové polymery, kopolymery N-vínylpyrrolidonu a N-vinylimidazolu, polyvinylpyrrolidonové polymery, polyvinyloxazolidony a polyvinylimidazoly nebo jejich směsi.

Přidání těchto polymerů také zvyšuje účinnost enzymů podle vynálezu.

a) Polyamin-N-oxidové polymery: Polyamin-N-oxidové polymery výhodné pro použití podle vynálezu obsahují jednotky následujícího obecného vzorce I • · · · • 4 ·· • ’ · · · · · · 4 4 · ·

4 44 4 4 · ···· • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 · • · · · 4··· 4444

44 44 4 4 44 44

P

R v němž P znamená polymerovatelnou jednotku, na kterou může být připojena skupina R-N-0 nebo kde skupina R-N-0 může tvořit část polymerovatelné jednotky nebo znamená obojí.

A znamená jednu z následujících struktur: -NC(O)-, -C(O)O-, -CO-, -S-, -0-, -N-, x znamená číslo 0 nebo 1 a R znamená alifatickou, ethoxylovanou alifatickou, aromatickou, herocyklickou nebo alicyklickou skupinu nebo jakoukoliv jejich kombinaci, na kterou může být připojen atom dusíku skupiny N-0 nebo jejichž část může tvořit atom dusíku skupiny N-O.

Skupina N-0 může znamenat skupinu následujících obecných vzorců

O O

I I (Ri)x-N-(R₂)_y nebo =N-(R₁)_X ,

I (R₃)_z v nichž Ri, R₂ a R₃ znamenají alifatickou, aromatickou, heterocyklickou nebo alicyklickou skupinu nebo jejich kombinace, x nebo/a y nebo/a z znamenají číslo 0 nebo 1 a atom dusíku skupiny N-0 může být připojen na nebo může tvořit část těchto skupin.

Skupina N-0 může znamenat část polymerovatelné jednotky (P) nebo může být připojena na polymerní základní skelet nebo může jít o kombinaci obojího.

Vhodné polyamin-N-oxidy, v nichž skupina N-0 tvoří část polymerovatelné jednotky, zahrnují polyamin-N-oxidy, v nichž R je vybrána z alifatické, aromatické, alicyklické nebo heterocyklické skupiny.

• · · · · · ·· ··

Jedna skupina uvedených polyamin-N-oxidů zahrnuje skupinu polyamin-N-oxidú, v nichž atom dusíku skupiny N-0 tvoří část této R-skupiny. Výhodnými polyamin-N-oxidy jsou ty sloučeniny, v nichž R znamená heterocyklickou skupinu, jako je pyridin, pyrrol, imidazol, pyrrolidin, piperidin, chinolin, akridin a jejich deriváty.

Jiná skupina uvedených polyamin-N-oxidů zahrnuje skupinu polyamin-N-oxidů, v nichž je atom dusíku skupiny N-0 připojen na skupinu R.

Jinými vhodnými polyamin-N-oxidy jsou ty polyaminoxidy, v nichž je skupina N-0 připojena na polymerovatelnou jednotku.

Výhodnou skupinou těchto polyamin-N-oxidů jsou polyamin-N-oxidy obecného vzorce I, v němž R znamená aromatickou, heterocyklickou nebo alicyklickou skupinu, v nichž atom dusíku funkční skupiny N-0 znamená část uvedené skupiny R.

Příklady těchto skupin jsou polyaminoxidy, v nichž R znamená heterocyklickou sloučeninu, jako je pyridin, pyrrol, imidazol a jejich deriváty.

Jinou výhodnou skupinou polyamin-N-oxidů jsou polyaminoxidy obecného vzorce I, v nichž R znamená aromatickou, heterocyklickou nebo alicyklickou skupinu, v nichž je atom dusíku funkční skupiny N-0 napojen na uvedené skupiny R.

Příklady těchto skupin jsou polyaminoxidy, v nichž skupiny R mohou znamenat aromatickou skupinu, jako je fenylová skupina.

Může se použít jakýkoliv polymemí základní skelet, pokud vytvořený aminoxidový polymer je rozpustný ve vodě a pokud má vlastnosti inhibující přenos barviv. Mezi příklady vhodných polymemích základních skeletů patří polyvinyly, polyalkyleny, polyestery, polyethery, polyamidy, polyimidy, polyakryláty a jejich směsi.

• φ φ φ φφφφ • « φ φ «« φ φφφφ • ΦΦΦ « φ · · φ φ · φ φφ φφφ « φφφ φφ · φ φφ · φ · · φ φ φφ φ φφ φφ φφ φφ «· ··

Amin-N-oxidové polymery podle předloženého vynálezu typicky mají poměr aminu k amin-N-oxidu 10:1 až 1:1 000 000. Počet aminoxidových skupin přítomných v polyaminoxidovém polymeru se však může měnit podle příslušné kopolymerace nebo příslušného stupně N-oxidace. Poměr aminu k amin-N-oxidu je s výhodou od 2:3 do 1:1 000 000, výhodněji od 1:4 do 1:1 000 000, nejvýhodněji od 1:7 do 1:1 000 000. Polymery podle předloženého vynálezu skutečně zahrnují náhodné nebo blokové kopolymery, kde jeden typ monomeru znamená amin-N-oxid a druhý typ monomeru znamená buď amin-N-oxid nebo ho neznamená. Aminoxidová jednotka polyamin-N-oxidů má PKa < 10, s výhodou PKa < 7, výhodněji PKa < 6.

Polyaminoxidy se mohou získávat s téměř jakýmkoliv stupněm polymerace. Stupeň polymerace není rozhodující za předpokladu, že materiál má žádanou rozpustnost ve vodě a žádanou aktivitu suspendovat barvivo.

Průměrná molekulová hmotnost je typicky v rozmezí od 500 do 1 000 000, s výhodou od 1000 do 50 000, výhodněji od 2000 do 30 000 a nejvýhodněji od 3000 do 20 000.

b) Kopolymery N-vinylpyrrolidonu a N-vinylimidazolu: Polymery N-vinylpyrrolidonu a N-vinylimidazolu použité v předloženém vynálezu mají průměrnou molekulovou hmotnost v rozmezí od 5000 do 1 000 000, výhodněji od 5000 do 200 000.

Vysoce výhodné polymery pro použití v detergentních prostředcích podle předloženého vynálezu obsahují polymer vybraný z N-vinylimidazol/N-vinylpyrrolidonových kopolymerů, při čemž uvedený polymer má průměrnou molekulovou hmotnost v rozmezí od 5000 do 50 000, výhodněji od 8000 do 30 000, nejvýhodněji od 10 000 do 20 000.

Rozmezí průměrné molekulové hmotnosti bylo stanovováno rozptylem světla, jak je popsáno Barthem H.G. a Maysem J.W.: Chemical Analyses 113, Modem Methods of Polymer Characterization.

• · • · · ·

Vysoce výhodné N-vinylimidazol/N-vinylpyrrolidonové kopolymery mají průměrnou molekulovou hmotnost v rozmezí od 5000 do 50 000, výhodněji od 8000 do 30 000 a nejvýhodněji od 10 000 do 20 000.

N-Vinylimidazol/N-vinylpyrrolidonové kopolymery se vyznačují tím, že uvedené rozmezí průměrné molekulové hmotnosti poskytuje vynikající vlastnosti spočívající v inhibici přenosu barviv, při čemž neovlivňují nepříznivě čistící provedení zde připravených detergentních prostředků.

N-Vinylimidazol/N-vinylpyrrolidonový kopolymer podle předloženého vynálezu mají molární poměr N-vinylimidazolu k N-vinylpyrrolidonu od 1 do 0,2, výhodněji od 0,8 do 0,3, nejvýhodněji od 0,6 do 0,4.

c) Polyvinylpyrrolidon: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu mohou také používat polyvinylpyrrolidon (PVP) s průměrnou molekulovou hmotností od 2500 do 400 000, s výhodou od 5000 do 200 000, výhodněji od 5000 do 50 000 a nejvýhodněji od 5000 do 15 000. Vhodné polyvinylpyrrolidony jsou komerčně dostupné od ISP Corporation, New York, N.Y., a Montreal, Kanada, pod názvy výrobku PVP K-15 (molekulová hmotnost podle viskozity 10 000), PVP K-30 (průměrná molekulová hmotnost 40 000), PVP K-60 (průměrná molekulová hmotnost 160 000) a PVP K-90 (průměrná molekulová hmotnost 360 000). Mezi další vhodné polyvinylpyrrolidony, které jsou komerčně dostupné od BASF Cooperation, patří Sokalan HP 165 a Sokalan HP 12, polyvinylpyrrolidony známé odborníkům z oblasti techniky detergentů (viz například evropské patentové přihlášky 262 897 a 256 696).

d) Polinyloxazolidon: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu mohou jako polymemí činidlo inhibující přenos barviv používat také polyvinyloxazolidon. Uvedené polyvinyloxazolidony mají • ·

průměrnou molekulovou hmotnost od 2500 do 400 000, s výhodou od 5000 do 200 000, výhodněji od 5000 do 50 000 a nejvýhodněji od 5000 do 15 000.

e) Polyvinylimidazol: Prací detergentní prostředky a/nebo prostředky péče o látky podle předloženého vynálezu mohou jako polymemí činidlo inhibující přenos barviv používat také polyvinylimidazol. Uvedené polyvinylimidazoly mají průměrnou molekulovou hmotnost od 2500 do 400 000, s výhodou od 5000 do 200 000, výhodněji od 5000 do 50 000 a nejvýhodněji od 5000 do 15 000.

f) Zesíťované polymery: Zesíťované polymery jsou takové polymery, jejichž základní skelet je do jistého stupně vzájemně propojen. Tyto vazby mohou být chemické nebo fyzikální povahy, možná s aktivní skupinami na základním skeletu nebo na větvích. Zesíťované polymery byly popsány v Journal of Polymer Science 22, 1035 až 1039. V jednom provedení se zesíťované polymery vyrábějí tak, že tvoří trojrozměrnou rigidní strukturu, která může zachycovat barviva v pórech tvořených trojrozměrnou strukturou. V jiném provedení zesíťované polymery zachycují tato barviva bobtnáním. Tyto zesíťované polymery jsou popsány v doprovázející patentové přihlášce 94870213.9.

Způsob praní: Prostředky podle vynálezu mohou být použity v podstatě při jakémkoliv způsobu praní nebo čištění, včetně způsobů namáčení, předběžného ošetření a způsobů se stupněm má-chání, při němž se může přidávat oddělený pomocný prostředek pro máchání.

Zde popsaný způsob zahrnuje uvedení látek do kontaktu s pracím roztokem obvyklým způsobem a tak, jak je zde dále uvedeno na příkladech. Způsob podle vynálezu se s výhodou provádí během procesu praní. Způsob čištění se s výhodou provádí při 5 až 95 °C, zvláště mezi 10 a 60 °C. Hodnota pH ošetřovacího roztoku je s výhodou od 7 do 12.

• 9 ··

9 9·9 ·

9

9 • 9 99 99 99 99 99

Následující příklady jsou míněny jako příklady prostředků podle předloženého vynálezu, ale nejsou nutně míněny tak, že omezují nebo jinak definují rozsah tohoto vynálezu. V pracích detergentních prostředcích a/nebo prostředcích péče o látky se množství enzymu vyjadřují jako hmotnost čistého enzymu z hmotnosti celého prostředku a, pokud není jinak uvedeno, detergentní přísady jsou vyjádřeny jako hmotnost z celkové hmotnosti prostředků. Zkrácené identifikace složek v tomto spisu mají následující významy:

LAS: lineární alkyl(s 11 až 13 atomy uhlíku)benzensulfonát sodný

TAS: lojový alkylsulfát sodný

CxyAS: alkyl(s 1 x až 1 y atomy uhlíku)sulfát sodný

CxySAS: sekundární (2,3) alky l(s 1 x až 1 y atomy uhlíku)sulfát sodný

CxyEz: převážně lineární primární alkohol s 1x až 1y atomy uhlíku kondenzovaný s průměrně z moly ethylenoxidu CxyEzS: alkylsulfát sodný s 1x až 1y atomy uhlíku kondenzovaný s průměrně z moly ethylenoxidu

QAS: R₂.N⁺(CH₃)2(C₂H4OH) s R₂ znamenající skupinu s 12 až 14 atomy uhlíku

QAS 1: R₂.N⁺(CH₃)2(C₂H₄OH) s R₂ znamenající skupinu s 8 až 11 atomy uhlíku

APA: amido(s 8 až 10 atomy uhlíku)propyldimethylamin mýdlo: lineární alkylkarboxylát sodný odvozený od směsi (80/20) lojového a kokosového oleje neiontový: směsný ethoxylovaný/propoxylovaný mastný alkohol se 13 až 15 atomy)uhlíku s průměrným stupněm ethoxylace 3,8 a průměrným stupněm propoxylace 4,5

Neodol45-13: lineární primární alkohol(se 14 až 15 atomy uhlíku)ethoxylát prodávaný firmou Shell Chemical Co.

STS: toluensulfonát sodný

CFAA: alkyl(s 12 až 14 atomy uhlíku)N-methyl-glukamid

TFAA: alkyl(se 16 až 18 atomy uhlíku)N-methyl-glukamid

TPKFA: mastné kyseliny s 12 až 14 atomy uhlíku křemičitan: amorfní křemičitan sodný (poměr SiO₂:Na₂O je 1,6 až 3,2) ·· » «

9· •9 ·999 metakřemičitan: zeolit A:

NASKS-6:

citrát:

kyselina citrónová:

boritan:

uhličitan:

hydrogenuhličitan:

síran:

síran hořečnatý: STPP:

TSPP:

MA/AA:

MA/AA 1:

AA:

PA30:

480N:

polygel/carbopol:

PB1:

PB4:

metakřemičitan sodný (poměr SiO₂:Na₂O = 1,0) hydratovaný hlinitokřemičitan sodný vzorce Na₁₂(AIO₂SiO₂)i₂.27 H₂O s primární velikostí částic v rozmezí od 0,1 do 10 pm (hmotnost vyjádřena na bezvodém základu) krystalický vrstvený křemičitan vzorce 6-Na₂Si₂O₅ dihydrát citrátu sodného o aktivitě 86,4 % s distribucí velikostí částic mezi 425 pm a 850 pm bezvodá kyselina citrónová boritan sodný bezvodý uhličitan sodný s částicemi o velikosti mezi 200 pm a 900 pm bezvodý hydrogenuhličitan sodný s velikostí částic mezi 400 pm a 1200 pm bezvodý síran sodný bezvodý síran hořečnatý bezvodý trifosforečnan sodný difosforečnan sodný náhodný kopolymer kyseliny maleinové/akrylové v poměru 1:4 s průměrnou molekulovou hmotností 70 000 až 80 000 náhodný kopolymer kyseliny maleinové/akrylové v poměru 6:4 s průměrnou molekulovou hmotností 10 000 polymer polyakrylátu sodného s průměrnou molekulovou hmotností 4500 kyselina polyakrylová s průměrnou molekulovou hmotností 4500 až 8000 náhodný kopolymer kyseliny akrylové/methakrylové v poměru 7:3, průměrná molekulová hmotnost kolem 3500 zesíťované polyakryláty s vysokou molekulovou hmotností bezvodý monohydrát perboritanu sodného vzorce NaBO₂.H₂O₂tetrahydrát bezvodého perboritanu sodného vzorce NaBO₂.3 H₂O.H₂O₂

0 0 0 · * 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 · · 0·· • 0 00 0· · 00· • 00 Φ·0 0 0 · 0 00 • 00 0 0 00 0 0 00 • 0 00 00 00 00 00

	87
peruhličitan: NaDCC:	bezvodý peruhličitan sodný vzorce 2 Na₂CO₃.3 H₂O₂ dichlorisokyanurát sodný
TAED:	tetraacetylethylendiamin
NOBS:	nonanoyloxybenzensulfonát ve formě sodné soli
NACA-OBS:	(6-nonamidokaproyl)oxybenzensulfonát
DTPA:	diethylentriaminpentaoctová kyselina
HEDP:	1,1 -hydroxyethandifosfonová kyselina
DETPMP:	diethylentriaminpenta(methylen)fosfonová kyselina prodávaná firmou Monsanto pod obchodním názvem Dequest 2060
EDDS:	ethylendiamin-N,N'-dijantarová kyselina, (S,S)-isomer ve formě její sodné soli
MnTACN:	1,4,7-trimethyl-1,4,7-triazacyklononan manganu

fotoaktivované bělící činidlo: sulfonovaný ftalocyanin zinku uzavřený v tobolce z rozpustného polymeru dextrinu fotoaktivované bělící činidlo 1: sulfonovaný ftalocyanin hliníku uzavřený v tobolce

	z rozpustného polymeru dextrinu
PAAC:	sůl pentaaminacetátu kobaltitého
parafin:	parafinový olej prodávaný pod obchodním označením Winog 70 firmou Wintershall
NaBz:	benzoát sodný
BzP:	benzoylperoxid
mannanasa:	mannanasa z Bacillus agaradherens, NCIMB 40482
proteasa:	proteolytický enzym prodávaný pod obchodním názvem Savinase, Alcalase a Durazym firmou Novo Nordisk A/S, Maxacal a
amylasa:	Maxapem, prodávané Gist-Brocades, a proteasy popsané v patentech WO 91/06637 a/nebo WO 95/10591 a/nebo v evropském patentu 251 446 amylolytický enzym prodávaný pod obchodním názvem Purafact Ox Am^R, popsaný ve spisu WO 94/18314 a ve spisu WO 96/05295, prodávaný firmou Genencor, Termamyl^(R), Funga-

44

4444 44 4 4 4 4 · «4 44 4 4444

94 444 4 444 44 4

4444 4444 4444

44 44 44 44 44

lipasa:	myl^(R) a Duramyl^(R), všechny dostupné do Novo Nordisk A/S, a ty, které jsou popsány ve spisu WO 95/26397 lipolytický enzym prodávaný pod obchodním označením
celulasa:	Lipolase a Lipolase Ultra firmou Novo Nordisk A/S a Lipomax firmy Gist-Brocades celulytický enzym prodávaný pod obchodním názvem Care-
hlinka:	zyme, Celluzyme a/nebo Endolase firmou Novo Nordisk A/S smektitová hlinka nebo bentonitová hlinka
CMC:	sodná sůl karboxymethylcelulosy
PVP:	polyvinylový polymer s průměrnou molekulovou hmotností
PVNO:	60 000 poly(4-vinylpyridin)-N-oxid s průměrnou molekulovou hmotností
PVPVI:	50 000 kopolymer vinylimidazolu a vinylpyrrolidonu s průměrnou
zjasňující činidlo 1:	molekulovou hmotností 20 000 dvojsodná sůl 4,4'-bis(2-sulfostyryl)bifenylu
zjasňující činidlo 2:	dvojsodná sůl 4,4'-bis(4-anilino-6-morfolino-1,3,5-triazin-2-yl)stil-
ben-2:2'-disulfonátu silikonové protipěnící činidlo: polydimethylsiloxanový regulátor pěnění se siloxan-
-oxyalkylenovým kopolymerem jako dispergačním činidlem s poměrem prvního ke druhému od 10:1 do 100:1 granulovaný potlačovatel pěnění: 12 % hmotn. silikonu/oxidu křemičitého, 18 %
zakalující činidlo:	hmotn. stearylalkoholu, 70 % hmotn. škrobu v granulované formě monostyrenlatexová směs na bázi vody, prodávaná
SRP1:	BASF Aktiengesellschaft pod obchodním názvem Lytron 621 aniontovou skupinou za konci uzavřené polyestery
SRP2:	diethoxylovaný poly(1,2-propylentereftalátový) krátký blokový
QEA:	polymer bis((C₂H₅O)(C₂H4O)_n)(CH₃)-N⁺-C6Hi2-N⁺-(CH3)

44

4 4 4

44 ··♦· • · 4·

4*44 44

4 44 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4 · 4 4 4

44 44 44

ΡΕΙ:

SCS:

HMWPEO:

PEGx:

PEO:

TEPAE:

bis((C2H₅O)-(C₂H4O))n v němž n znamená číslo od 20 do 30 polyethylenimin s průměrnou molekulovou hmotností 1800 a průměrným stupněm ethoxylace 7 ethylenoxyskupin na atom dusíku kumensulfonát sodný polyethylenoxid s vysokou molekulovou hmotností polyethylenglykol s molekulovou hmotností x polyethylenoxid s průměrnou molekulovou hmotností 5000 tetraethylenpentaminethoxylát

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Podle předloženého vynálezu byly připraveny následující detergentní prostředky.

I	II	III
Foukaný prášek
zeolit A	13,0	13,0	15,0
síran	-	3,0	-
LAS	3,0	3,0	3,0
QAS	-	1,5	1,5
DETPMP	0,4	0,2	0,4
EDDS	-	0,4	0,2
CMC	0,4	0,4	0,4
MA/AA	4,0	2,0	2,0

9999 ·· • · · * • · ·· » · · · • · · 9

99

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

99 99

Aglomerát
LAS	5,0	5,0	5,0
TAS	2,0	1,0	1,0
křemičitan	3,0	2,0	4,0
zeolit A	8,0	8,0	8,0
uhličitan	7,0	4,0	4,0
Rozprašovací prostředek
parfém	0,3	0,3	0,3
C45E7	2,0	2,0	2,0
C25E3	2,0	-	-
Suché přísady
citrát	3,0	-	2,0
hydrogenuhličitan	-	3,0	-
uhličitan	8,0	15,0	10,0
TAED	6,0	2,0	5,0
PB1	9,0	7,0	10,0
PEO	-	-	0,2
bentonitová hlinka	10,0	10,0	10,0
mannanasa	0,001	0,001	0,02
proteasa	0,03	0,03	0,03
lipasa	0,008	0,008	0,008
celulalsa	0,001	0,001	0,001
amylasa	0,01	0,01	0,01
silikonové protipěnivé činidlo	5,0	5,0	5,0
síran	-	3,0	-
hustota (g/litr) různé a minoritní složky	850	850 doplnit do 100 %	850

φφ φφ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φφ φφ φφ φφ • φ φ · φ ΦΦΦ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφφφ φ · φ

ΦΦΦ φ φ φ φ φ φ φ φφ φ·

Příklad 2

Podle předloženého vynálezu byly připraveny následující kapalné detergentní prostředky (množství jsou uvedena v hmotnostních dílech, enzym znamená čistý enzym).

1	II	III	IV
LAS	25,0	-	-	-
C25AS	-	13,0	16,0	13,0
C25E3S	-	2,0	2,0	4,0
C25E7	-	-	4,0	4,0
TFAA	-	6,0	6,0	6,0
APA	3,0	1,0	2,0	-
TPKFA	-	14,0	11,0	11,0
kyselina citrónová	1,0	1,0	1,0	1,0
dodecenyl/tetradecenyl-
jantarová kyselina	15,0	-	-	-
řepková mastná kyselina	1,0	-	3,5	-
ethanol	7,0	2,0	3,0	2,0
1,2-propandiol	6,0	8,0	10,0	13,0
monoethanolamin	-	-	9,0	9,0
TEPAE	-	-	0,4	0,3
DETPMP	2,0	1,2	1,0	-
mannanasa	0,001	0,002	0,02	0,001
proteasa	0,08	0,02	0,01	0,02
lipasa	-	-	0,003	0,003
amylasa	0,004	0,01	0,01	0,01
celulasa	-	-	0,004	0,003
SRP 2	-	-	0,2	0,1

φφ ·Φ φ φ φ φ • · φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφφφ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φ»

kyselina boritá	1,0	1,5	2,5	2,5
bentonitová hlinka	4,0	5,0	4,0	4,0
zjasňující činidlo 1	0,1	0,2	0,3	-
potlačovatel pěnění	0,4	-	-	-
zakalující činidlo	0,8	0,7	-	-
NaOH až do pH	8,0	7,5	8,0	8,2

různé a minoritní složky

Příklad 3

Podle předloženého vynálezu byly připraveny následující granulované detergentní prostředky pro látky, které mají schopnost avivážního účinku při praní.

II

C45AS LAS	7,6	10,0
C68AS	1,3	-
C45E7	4,0	-
C25E3	-	5,0
kokosový alkyl-dimethyl-hydroxyethylamoniumchlorid	1,4	1,0
citrát	5,0	3,0
Na-SKS-6	-	11,0
Zeolit A	15,0	15,0
MA/AA	4,0	4,0
DETPMP	0,4	0,4
PB1	15,0	-
peruhličitan	-	15,0
TAED	5,0	5,0

44

4 4 4

44

4 4

4

4 4

4444

4

4 4

4

4 4

4· 44

smektitová hlinka	10,0	10,0
HMWPEO	-	0,1
mannanasa	0,001	0,02
proteasa	0,02	0,01
lipasa	0,02	0,01
amylasa	0,03	0,005
celulasa	0,001	-
křemičitan	3,0	5,0
uhličitan	10,0	10,0
potlačovatel pěnění	1,0	4,0
CMC	0,2	0,1
různé a minoritní složky	do 100%

Příklad 4

Podle předloženého vynálezu byly připraveny následující prací kostkové detergentní prostředky (množství jsou uváděna ve hmotnostních dílech, enzymy jsou vyjádřeny jako čistý enzym).

	I	II	III	IV
LAS	-	-	19,0	15,0
C28AS	26,0	13,5	-	-
laurát sodný	2,5	9,0	-	-
zeolit A	2,0	1,25	-	-
uhličitan	20,0	3,0	13,0	8,0
uhličitan vápenatý	27,5	39,0	31,0	-
síran	5,0	5,0	3,0	5,0
TSPP	5,0	-	-	-
STPP	5,0	15,0	10,0	-

99

9·· ··

999« · ·

9 9 9 9 9 * · 9 9 9 9 •9 99 99

9« 9999 • 9 99

9 9 9 9

9 9 ··

9 9 ·· 9 • 9 9 9 9

99 99

bentonitová hlinka	4,0	10,0	4,0	4,0
DETPMP	-	0,7	0,6	-
CMC	-	1,0	1,0	1,0
talek	-	-	10,0	11,0
křemičitan	-	-	4,0	5,0
PVNO	0,02	0,03	-	0,01
MA/AA	0,4	1,0	-	-
SRP 1	0,3	0,3	0,3	0,3
mannanasa	0,001	0,001	0,02	0,001
amylasa	-	-	0,01	-
proteasa	-	0,004	-	0,003
lipasa	-	0,002	-	0,002
celulasa	-	0,003	-	-
PEO	-	0,2	-	0,2
parfém	1,0	0,5	0,3	0,2
síran hořečnatý	-	-	3,0	3,0
zjasňující činidlo	0,15	0,1	0,15	-
fotoaktivované bělící
činidlo (ppm)	-	15,0	15,0	15,0

	V	III	VI	V
LAS	21,0	6,75	8,8	-
C28AS	-	15,75	11,2	22,5
laurát sodný	-	-	-	-
zeolit A	-	1,25	1,25	1,25
uhličitan	10,0	15,0	13,0	8,0
uhličitan vápenatý	-	36,0	-	36,0
síran	3,0	-	-	5,0

99

9 9 9

9 9 · ·· » • · · • · ·· • · · * · ·· 99

9 V

9 9

9 9 9

99 ··*· *· 99

TSPP	-	5,0	2,5	-
STPP	-	7,0	8,0	10,0
bentonitová hlinka	5,0	4,0	4,0	4,0
DETPMP	0,6	0,7	0,7	0,7
CMC	1,0	-	-	1,0
talek	10,0	-	-	-
křemičitan	3,0	-	-	-
PVNO	-	0,02	-	-
MA/AA	0,2	0,4	0,5	0,4
SRP1	0,3	0,3	0,3	0,3
mannanasa	0,02	0,03	0,01	0,001
amylasa	-	-	0,002	-
proteasa	0,003	-	-	0,003
lipasa	-	-	-	-
celulasa	0,0003	0,002	-	-
PEO	0,3	-	-	0,3
parfém	0,4	-	-	0,4
síran hořečnatý	3,0	-	-	-
zjasňující činidlo	-	-	-	0,1
fotoaktivované bělící
činidlo (ppm)	15,0	-	-	15,0

99

9 9 9

99 • 9 • 9 9

9

9 9

9 •

9«r ···»

9 9

9 9 9

99

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

Přihlašovatel jméno: The Procter & Gamble Company ulice: One Procter & Gamble Plaza město: Cincinnati, Ohio země: USA poštovní směrovací číslo: 45202

Název vynálezu: Prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky a způsob čištění látek

Počet sekvencí: 6

Počítačová čtecí forma:

typ media: disketa počítač: IBM PC compatible operační systém: PC-DOS/MS-DOS počítačový program (software): Patentln Release #1.0, verse #1.25 (EPO)

Sekv. id. č. 1:

Vlastnosti sekvence: délka: 1407 párů nukleotidů typ: nukleová kyselina typ vlákna: jednovláknová topologie: lineární

Typ molekuly: genomová DNA Původní zdroj:

Znaky:

název/klíč: CDS umístění: 1 až 1482

Popis sekvence: sekvence id. č. 1:

ATGAAAAAAAAGTTATCACAGATTTATCATTTAATTATTTGCACACTTATAATA

AGTGTGGGAATAATGGGGATTACAACGTCCCCATCAGCAGCAAGTACAGGC

ITTTATGTTGATGGCAATACGTTATATGACGCAAATGGGCAGCCATTTGTCAT

GAGAGGTATTAACCATGGACATGCTTGGTATAAAGACACCGCTTCAACAGCT

AÍTCCTGCCATTGCAGAGCAAGGCGCCAACACGATTCGTATTGTTTTATCAG

ATGGCGGTCAATGGGAAAAAGACGACATTGACACCATTCGTGAAGTCATTG

AGCTTGCGGAGCAAAATAAAATGGTGGCTGTCGTTGAAGTTCATGATGCCA

CGGGTCGCGATTCGCGCAGTGATTl AAATCGAGCCGTTGATTATTGGATAG

AAATGAAAGATGCGCTTATCGGTAAAGAAGATACGGTTATTATTAACATTGCA

AACGAGTGGTATGGGAGTTGGGATGGCTCAGCTTGGGCCGATGGCTATATT

GATGTCATTCCGAAGCTTCGCGATGCCGGCTTAACACACACCTTAATGGTTG

ATGCAGCAGGATGGGGGCAATATCCGCAATCTATTCATGATTACGGACAAG

ATGTGTTTAATGCAGATCCGTTAAAAATACGATGTTCTCCATCCATATGTAT

GAGTATGCTGGTGGTGATGCTAACACTGTTAGATCAAATATTGATAGAGTCA

TAGATCAAGACCTTGCTCTCGTAATAGGTGAATTCGGTCATAGACATACTGA

TGGTGATGTTGATGAAGATACAATCCTTAGTTATTCTGAAGAAACTGGCACA

GGGTGGCTCGCTTGGTCTTGGAAAGGCAACAGTACCGAATGGGACTATTTA

GACCTTTCAGAAGACTGGGCTGGTCAACATTTAACTGATTGGGGGAATAGAA

TrGTCCACGGGGCCGATGGCTTACAGGAAACCTCCAAACCATCCACCGTAT

TTACAGATGATAACGGTGGTCACCC-TGAACCGCCAACTGCTACTACCTTGTA

TGACTTTGAAGGAAGCACACAAGGGTGGCATGGAAGCAACGTGACCGGTG

GCCCTTGGTCCGTAACAGAATGGGGTGCTTCAGGTAACTACTCTTTAAAAGC

C GATGTAAATTTAACCTCAAATTCTl CACATGAACTGTATAGTGAACAAAGTC • · ·· · · · · · · · · gggaaatcccggtaatggcatgaatgcaagactttacgtgaaaacgggctc TGATTATACATGGCATAGCGGTCCTÍTTACACGTATCAATAGCTCCAACTCA GGAACAACGTTATCTTTTGATTTAAACAACATCGAAAATAGTCATCATGTTAG GGAAATAGGCGTGCAATTTTCAGCG GCAGATAATAGC AGTGGTCAAACTGC TGTATACGTTGATAACGTTACTTTAAGATAG

Sekv. id. č. 2:

Vlastnosti sekvence:

délka: 493 aminokyselin typ: aminokyselina topologie: lineární

Typ molekuly: protein

Popis sekvence: sekvence id. č. 2:

MKKKLSQIYHLIICTLIISVGIMGITTSPSAASTGFYVDGNTLYDANGQPFVMRGIN

HGHAWYKDTASTAIPAIAEQGANTIRIVLSDGGQWEKDDIDTIREVIELAEQNKM

VAWEVHDATGRDSRSDLNRAVDYWIEMKDALIGKEDTVIINIANEWYGSWDGS

AWADGYIDVIPKLRDAGLTHTLMVDAAGWGQYPQSIHDYGQDVFNADPLKNTM

FSIHMYEYAGGDANTVRSNIDRVIDQDLALVIGEFGHRHTDGDVDEDTILSYSEE

TGTGWLAWSWKGNSTEWDYLDLSEDWAGQHLTDWGNRIVHGADGLQETSKP

STVFTDDNGGHPEPPTATTLYDFEGSTQGWHGSNVTGGPWSVTEWGASGNY

SLKADVNLTSNSSHELYSEQSRNLHGYSQLNATVRHANWGNPGNGMNARLYV

KTGSDYTWHSGPFTRINSSNSGTTLSFDLNNIENSHHVREIGVQFSAADNSSGQ

TALYVDNVTLR

Sekv. id. č. 3:

Vlastnosti sekvence: délka: 1407 párů nukleotidů typ: nukleová kyselina ·♦·· ·· · · · · · • · · · · · · ···· • ·· ··· · ··· · · · typ vlákna: jednovláknová topologie: lineární

Typ molekuly: genomová DNA

Popis sekvence: sekvence id. č. 3:

ATGAAAAAAAAGTTATCACAGATTTATCATTTAATTATTTGCACACTTATAATA

AGTGTGGGAATAATGGGGATTACAACGTCCCCATCAGCAGCAAGTACAGGC

TTTTATGTTGATGGCAATACGTTATATGACGCAAATGGGCAGCCATTTGTCAT

GAGÁGGTATTAACCATGGACATGCTTGGTATAAAGACACCGCTTCAACAGCT

ATTCCTGCCATTGCAGAGCAAGGCGCCAACACGATTCGTATTGTTTTATCAG

ATGGCGGTCAATGGGAAAAAGACGACATTGACACCATTCGTGAAGTCATTG

AGCTTGCGGAGCAAAATAAAATGGTGGCTGTCGTTGAAGTTCATGÁTGCCA

GGGGTCGCGATTCGCGCAGTGATTl· AAATCGAGCCGTTGATTATTGGATAG

AAATGAAAGATGCGCTTATCGGTAAáGAAGATACGGTTATTATTAACATTGCA

AACGAGTGGTATGGGAGTTGGGATG GCTCAGCTTGGGCCGATGGCTATATT

GATGTCATTCCGAAGCTTCGCGATGCCGGCTTAACACACACCTTAATGGTTG

ÁTGCAGCAGGATGGGGGCAATATCCGCAATCTATTCATGATTACGGACAAG

ÁTGTGTTTAATGCAGATCCGTTAAAAAATACGATGTTCTCCATCCATATGTAT

GAGTATGCTGGTGGTGATGCTAACACTGTTAGATCAAATATTGATAGAGTCA

TAGATCAAGACCTTGCTCTCGTAATAGGTGAATTCGGTCATAGACATACTGA

TGGTGATGTTGATGAAGATACAATCCTTAGTTATTCTGAAGAAACTGGCACA

GGGTGGCTCGCTTGGTCTTGGAAAGGCAACAGTACCGAATGGGACTATTTA

GACCTTTCAGAAGACTGGGCTGGTCAACATTTAACTGATTGGGGGAATAGAA

7TGTCCACGGGGCCGATGGCTTACAGGAAACCTCCAAACCATCCACCGTAT

TTACAGATGATAACGGTGGTCACCCTGAACCGCCAACTGCTACTACCTTGTA

TGACTTTGAAGGAAGCACACAAGGGTGGCATGGAAGCAACGTGACCGGTG

GGCCTTGGTCCGTAACAGAATGGGGTGCTTCAGGTAACTACTCTTTAAAAGC

CGATGTAAATTTAACCTCAAATTCTTGACATGAACTGTATAGTGAACAAAGTC

GTAATCTACACGGATACTCTCAGCTCAACGCAACCGTTCGCCATGCCAATTG

GGGAAATCCCGGTAATGGCATGAATGCAAGACTTTACGTGAAAACGGGCTC

TGATTATACATGGCATAGCGGTCCTTTTACACGTATCAATAGCTCCAACTCA

GGAACAACGTTATCTTTTGATTTAAACAACATCGAAAATATCATCATGTTAGG

G)\AATAG • · • · · · • · · · • · ·· ·· · · · · • * · 9 · · · ·«· ·9

100

Sekv. id. č. 4:

Vlastnosti sekvence: délka: 468 aminokyselin typ: aminokyselina topologie: lineární

Typ molekuly: protein

Popis sekvence: sekvence id. č. 4:

vawevhdatgrdsrsdlnravdyviemkdalígkedtviinianewygswdgs AWADGYIDVIPKLRDAGLTHTLMVDAAGWGQYPQSIHDYGQDVFNADPLKNTM FSIHMYEYAGGDANTVRSNIDRVIDQDLALVIGEFGHRHTDGDVDEDTILSYSEE TGTGWLAWSWKGNSTEWDYLDLSEDWAGQHLTDWGNRIVHGADGLQETSKP SWFTDDNGGHPEPPTATTLYDFEGSTQGWHGSNVTGGPWSVTEWGASGNY SLKADVNLTSNSSHELYSEQSRNLHGYSQLNATVRHANWGNPGNGMNARLYV KTGSDYTWHSGPFTRINSSNSGTTL':f-DLNNIENHMLGK

MKKKLSQIYHLIICTLNSVGIMGITTSPSAASTGFYVDGNTLYDANGQPFVMRGIN

HGHAWYKDTASTAIPAIAEQGANTIRIVLSDGGQWEKDDIDTIREVIELAEQNKM

Sekv. id. č. 5:

Vlastnosti sekvence: délka: 1029 párů nukleotidů typ: nukleová kyselina typ vlákna: jednovláknová topologie: lineární

Typ molekuly: genomová DNA * ·

101

Popis sekvence: sekvence id. č. 5:

5' AAT TGG CGC ATA CTG TGT CGC CTG TGA ATC CTA ATG CCC AGC AGA CAA CAA AAA CAG TGA TGA ACT GGC TTG CGC ACC TGC CGA ACC

G.AA CGG AAA ACA GAG TCC TTT CCG GAG CGT TCG GAG GTT ACA GCC ATG ACA CAT TTT CTA TGG CTG AGG CTG ATA GAA TCC GAA GCG CCA CCG GGC AAT CGC CTG CTA TTT ATG GCT GCG ATT ATG CCA GAG GAT GGC TTG AAA CAG CAA ATA TTG AAG ATT CAA TAG ATG TAA GCT GCA ACG GCG ATT TAA TGT CGT ATT GGA AAA ATG GCG GAA TTC CGC AAA TCA GTT TGC ACC TGG CGA ACC CTG CTT TTC AGT CAG GGC ATT TTA AAA CAC CGA TTA CAA ATG ATC AGT ATA AAA ACA TAT TAG ATT CAG CAA CAG CGG AAG GGA AGC GGC TAÁ ATG CCA TGC TCA GCA AAA TTG CTG ACG GAC TTC AAG AGT TGG AGA ACC AAG GTG TGC CTG TTC TGT TCA GGC QGC TGC ATG AAA TGA ACG GCG AAT GGT TTT GGT GGG GAC TCA CAT CAT ATA ACC AAA AGG ATA ATG AAA GAA TCT CTC TAT ATA AAC AGC TCT ACA AGA AAA TCT ATC ATT ATA TGA CCG ACA CAA GAG GAC TTG ATC ATT TGA TTT GGG TTT ACT CTC CCG ACG CCA ACC GAG ΑΠ TTA AAA CTG ÁTT TTTACC CGG GCG CGT CTT ACGTGGATATTG TCG GAT TAG ATG CGT ATT TTC AAG ATG CCT ACT CGA TCA ATG GAT ACG ATC AGC TAA CAG CGC TTA ATA AAC CAT TTG CTT TTA CAG AAG TCG GCC CGC AAA CAG CAA ACG GCA GCT TCG ATT ACA GCC TGT TCA TCA ATG CAA TAA AAC AAA AAT ATC CTA AAA CCA TTT ACT TTC TGG CAT GGA ATG ATG AAT GGA GCG CAG CAG TAA ACA AGG GTG CTT CAG CIT TAT ATC ATG ACA GCT GGA CAC TCA ACA AGG GAG AAA TAT GGA ATG GTG ATT CTT TAA CGC CAA TCG TTG AGT GAA TCC GGG ATC 3’

Sekv. id. č. 6:

Vlastnosti sekvence: délka: 363 aminokyselin typ: aminokyselina topologie: lineární

102

Typ molekuly: protein

Popis sekvence: sekvence id. č. 6:

yéhT 1

LFKKHTISLLIIFLLASAVLAKPIEAHTVSPVNPNAQQTTKTVMNWLAHL50 ydhT 51

PNRTENRVLSGAFGGYSHDTFSMAEADRIRSATGQSPAIYGCDYARGWLE 100 ydhT 101

TANIEDSIDVSCNGDLMSYWKNGGIPQISLHLANPAFQSGHFKTPITNDQ 150 ydhT 151

YKNILDSATAEGKRLNAMLSKIADGLOELENQGVPVLFRPLHEMNGEWFW 200 y:íhT 201

WGLTSYNQKDNERISLYKQLYKKlYFiYMTDTRGLDHLIWVYSPDANRDFK 250 ydhT 251

TDFYPGASYVDIVGLDAYFQDAYSINGYDQLTALNKPFAFTEVGPQTANG 300 ydhT 301

SFDYSLFINAIKQKYPKTIYFLAWNDEWSAAVNKGASALYHDSWTLNKGE 350 ydhT 351 tWNGDSLTPIVE*. 363

Claims

1. Prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky, vyznačující se t í m, že obsahuje prací detergentní složku a/nebo složku péče o látky, enzym mannanasu a hlinku.

2. Prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky podle nároku 1, vyznačující se tím, že mannanasa je přítomna v množství od 0,0001 do 2, s výhodou od 0,0005 do 0,5, výhodněji od 0,001 do 0,02 % hmotn. čistého enzymu z hmotnosti celého prostředku.

3. Prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky podle nároků 1 až

2, vyznačující se tím, že obsahuje hlinku v množství od 0,1 do 50, s výhodou od 3 do 25, výhodněji od 4 do 15 % hmotn. z celkové hmotnosti prostředku.

4. Prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky podle nároků 1 až

3, vyznačující se t í m, že se jako hlinka používá smektitová hlinka, s výhodou montmorilonitová nebo hektoritová hlinka, s katexovou kapacitou alespoň 50 mekv./100 g.

5. Prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky podle nároků 1 až

4, v y z n a č u j í c í se t í m, že dále obsahuje stavební složku vybranou ze zeolitu, trifosforečnanu sodného, vrstvenného křemičitanu a/nebo jejich směsí.

6. Prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 5, vyznačující se t í m, že dále obsahuje celulasu.

7. Prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 6, v y z n a č u j í c í se t í m, že dále • · ~/oc>o -S~qc>

9 9 9 99 9 · · 99

9909 99 9 · 9 9 ·

99 99 99 9 9999

9 99 999 9 999 99 9 9 99 9 9 99 9 9 99 9

104 obsahuje kationtové povrchově aktivní činidlo, s výhodou povrchově aktivní činidlo obsahující dva dlouhé alkylové řetězce.

8. Způsob čištění látek, vyznačující se tím, že používá prací detergentní prostředek a/nebo prostředek péče o látky podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 7.