JP2008525057A - 移植可能なバイオマテリアルおよび同生成する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は移植可能なバイオマテリアルおよび同一物作製方法に関する。特に、本発明は、（ａ）バイオマテリアルをアルコール含有溶液に少なくとも２４時間曝露するステップを有する移植可能なバイオマテリアル作製方法に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、移植可能なバイオマテリアルと、同一物を作製する方法に関する。特に本発明は、移植可能なデバイスの上でもしくはとともに用いることができ、同一物を作製する方法に用いることのできるものであり、バイオマテリアルの石灰化を低減および緩和の両方、またはいずれか一方を行うとともに、その長寿命性を改善するための、コラーゲン含有バイオマテリアルの処置方法に関する。

生物組織のコラーゲン基質を化学的に変化させることおよび固定することの両方、またはいずれか一方を行い、これらの組織を生きている哺乳類の身体に移植できるようにするための方法には多くの方法がある。変化させられた、もしくは固定された移植可能な生物組織の例としては、心臓弁、血管、心膜、皮膚、硬膜、腱、および靱帯がある。

これらの生物組織は、主として、コラーゲンおよびエラスチンからなる。ほとんどの生物の組織の剛性／弾性は、当該組織に含まれるコラーゲンとエラスチンの相対的な含有量および結合組織フレームワークの物理的配置の両方、またはどちらか一方によって大方は決まってしまう。

各々のコラーゲン分子は、３つのポリペプチド鎖で構成され、これらは絡み合ってコイル状三重らせんを形成している。生物の組織保存用化学薬剤は、一般に、隣り合ったコラーゲン分子間（分子間）はもちろんのこと、コラーゲン分子内（分子内）のポリペプチド鎖にあるアミノ基間にも架橋を形成する。

コラーゲンベースのバイオマテリアルは、異なるレシピエント種に移植可能なデバイスとして用いられる場合、超急性の拒絶反応を起こしやすい。この超急性の拒絶反応は、当然な免疫反応であって、このコラーゲンベースのバイオマテリアルの構造に存在する抗原が引き金となって起こる。超急性の拒絶反応は、急速な退行性のプロセスであって、このような移植可能なデバイスの機能と耐久性に影響を及ぼす。

コラーゲンベースのバイオマテリアルの抗原性は、当該コラーゲンの物理的ないしは化学的架橋により抑制することが可能である。紫外線照射や加熱脱水といった物理的な架橋法は、結果的に低密度の架橋をもたらす。このため、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、酸化でんぷん、およびある種のポリエポキシ化合物といった化学薬剤が、コラーゲンベースのバイオマテリアルの化学的架橋剤として用いられてきた。

コラーゲンの架橋は、異なるポリペプチド鎖上のリジン残基もしくはヒドロキシリジン残基のアミン基での架橋剤の反応によって生じる。別の公知のコラーゲン架橋法には、グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基のカルボキシル基をポリペプチド鎖で活性化させ、別のポリペプチド鎖のアミノ基で反応させ、アミド結合を形成する方法がある。

架橋はまた、隣り合ったポリペプチド鎖のアミン基をジイソシアン酸エステル類で架橋することで遂行することもできる。この方法は、ほとんどのジイソシアン酸エステル類の毒性および定溶解性のため、あまり一般的ではない。

近年では、グルタルアルデヒドが架橋剤として選ばれるようになってきた。グルタルアルデヒドは、炭素５個の脂肪族鎖の両端に存在するアルデヒドがあるために、二官能性となっている。組織を固定することとは別に、グルタルアルデヒドは、移植用の生物組織準備用として優れた滅菌剤でもある。

特に、グルタルアルデヒドで固定された恒久的移植可能バイオマテリアルには、ブタの生体心臓弁、ウシの心膜弁、およびウシの心膜パッチがある。

化学薬品で架橋された生物由来材料の移植に関連する問題は、これらの材料、特にその材料中にコラーゲンおよびエラスチンがあるものは、石灰化する傾向があるという点である。これらの材料の石灰化は、結果として硬化を招き、硬化すると、当該材料の分解および破損という結果を招来する。外因性および内因性石灰化の両者が、架橋バイオマテリアルの石灰化の原因となっている。

残念なことではあるが、グルタルアルデヒドはバイオマテリアルの石灰化を促進することが知られている。バイオマテリアル中のアルデヒドと１級アミン類の反応は、不安定なイミン類（シッフ塩基）を形成し、このイミン類は、続いて当該バイオマテリアルからグルタルアルデヒドを遊離する。組織内に存在する非結合アルデヒド類は、移植後に、炎症反応などの激しい組織刺激作用を引き起こすことがある。このようであるから、グルタルアルデヒドなどの架橋剤の石灰化促進効果を除去ないし不活性化する必要がある。

架橋バイオマテリアルの石灰化の機序は、いまだ完全に理解されるところまでは至っていない。臨床データは、患者の年齢、感染症、宿主組織の化学的性質、脱水症、歪、食事要因、および不適切な最初の抗凝固療法といった要因が、移植されたバイオマテリアルの石灰化を促進し得ることを示している。

架橋バイオマテリアルの石灰化を緩和する方法を見つけ出すためにこれまで多くの試みがなされてきた。バイオマテリアルの石灰化緩和に関する研究は、主として、架橋バイオマテリアルの処置に焦点を当ててきており、下記の特許および文献に記載されているが、これらに限定されたものではない。すなわち、米国特許番号第４，５５３，９７４号公報（デワンジーその他）、米国特許番号第４，１２０，６４９号公報（シェヒター）、米国特許番号第４，６４８，８８１号公報（ナシェフその他）および、米国特許番号第４，９７６，７３３号公報（ジラルド）と、１９９７年発行の雑誌Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ掲載のヴヤヴァーレその他による論文９５巻４７９〜４８８頁、および２００７年発行の雑誌Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ．掲載のパサックその他の論文６９Ａ巻１４０頁〜１４４頁に記載されている。これらの刊行物は、一般に、移植前に、固定した組織をアルコールで処置する方法を述べている。言い換えると、当該組織は、アルコールに曝露する前に既に架橋されているのである。組織が、アルコール存在中で事前培養される事例にあってさえ、曝露時間は、短すぎて使いものにならないことがよくあり、さもなければ、緩衝剤またはその他の薬剤が、架橋の安定性に悪影響を及ぼす（たとえば上記のヴヤヴァーレその他による１９９７年の論文参照）。非グルタルアルデヒド試薬によりバイオマテリアルを固定するための別のプロセスも発表されていて、それらには、以下のものが含まれるが、これらがすべてというわけではない。すなわち、ポリグリシダルエーテル類（１９８８年発行の雑誌Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ掲載の今村その他による論文１７巻１１０１頁〜１１０３頁）、光酸化剤（１９９４年発行の雑誌Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．掲載のムーアその他による論文２８巻６１１頁〜６１８頁）である。

架橋バイオマテリアルをアミノ二リン酸塩と界面活性剤で処置することは、移植後のこれらバイオマテリアルの石灰化を低減させることを実証してきた。しかしながら、これらの薬剤は、移植後に、当該バイオマテリアルから洗い流される傾向にあり、単に石灰化を遅らせるだけに過ぎない。

バイオマテリアルの処置にアルコールを用いることはよく知られているが、その使用は、溶剤および滅菌剤の両方またはどちらか一方として用いることことに限定されている。たとえば、病的石灰化に対抗するバイオマテリアルの処置にアルコールを用いることは、前もって架橋コラーゲンバイオマテリアルに使用することに限られていて、米国特許番号第５，７４６，７７５号公報（Ｌｅｖｙ、その他）および国際特許番号第ＷＯ８４／０１８９４号公報に記載されている。

このような事情で、長期にわたって石灰化に対する抵抗力を持ったバイオマテリアルの作製方法に対するニーズが依然として存在する。
米国特許番号第４，５５３，９７４号公報 米国特許番号第４，１２０，６４９号公報 米国特許番号第４，６４８，８８１号公報 米国特許番号第５，７４６，７７５号公報 国際特許番号第ＷＯ８４／０１８９４号公報 ヴヤヴァーレその他著、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９７年、９５巻４７９頁〜４８８頁 パサックその他著、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ．、２００７年、６９Ａ巻：１４０頁〜１４４頁 今村その他著、Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ、１９８８年、１７巻：１１０１頁〜１１０３頁 ムーアその他著、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１９９４年、２８巻：６１１頁〜６１８頁

本願発明者らは、コラーゲンを含有した移植可能なバイオマテリアルの石灰化の問題を克服する、もしくは少なくとも軽減する方法を開発した。

そして、第一の態様において本発明は、
移植可能なバイオマテリアルを作製する方法であって、
（ａ）このバイオマテリアルをアルコール含有溶液に少なくとも２４時間曝露するステップを有する方法を提供する。

第二の態様において本発明は、
抗石灰化バイオマテリアルを作製するためのコラーゲンを含むバイオマテリアルを処置する方法であって、
（ａ）このバイオマテリアルをアルコール含有溶液に少なくとも２４時間曝露するステップ
を有する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、該第一および第二の態様の方法はさらに、
（ｂ）ステップ（ａ）において該バイオマテリアルを架橋剤に曝露するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において該バイオマテリアルを酸性溶液に曝露するステップと、
を有し、ステップ（ｂ）と（ｃ）は、ステップ（ａ）の後に順次行うものである。

他方、ステップ（ａ）は少なくとも２４時間にわたって行うことが望ましく、さらに望ましくは少なくとも３６時間にわたって行い、最も望ましくは少なくとも４８時間にわたって行うものであり、また、ある状況下ではステップ（ａ）がより短い時間だけ実行してもよいことは当業者には理解されよう。

そして、第三の態様において本発明は、
移植可能なバイオマテリアルを作製する方法であって、
（ａ）このバイオマテリアルをアルコール含有溶液に曝露するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）においてこのバイオマテリアルを架橋剤に曝露するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）においてこのバイオマテリアルを酸性溶液に曝露するステップと、
を有し、ステップ（ｂ）と（ｃ）は、ステップ（ａ）の後に順次行うという方法を値供するものである。

第四の態様において本発明は、
抗石灰化バイオマテリアルを作製するための、コラーゲン含有バイオマテリアルを処置する方法であって、
（ａ）このバイオマテリアルをアルコール含有溶液に曝露するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）においてこのバイオマテリアルを架橋剤に曝露するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）においてこのバイオマテリアルを酸性溶液に曝露するステップと、
を有し、ステップ（ｂ）と（ｃ）は、ステップ（ａ）の後に順次行う方法を提供するものである。

いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間、およびステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間の両方、もしくはどちらか一方の間で、該バイオマテリアルもしくはコラーゲン含有バイオマテリアルが、残留アルコールおよび残留架橋剤の両方もしくはどちらか一方を除去するために洗い流される。望ましくは、該バイオマテリアルもしくはコラーゲン含有バイオマテリアルはさらに、ステップ（ｃ）の後で、残留酸性溶液を除去するために洗い流される。

ここに開示された方法が、どのようなバイオマテリアルの処置にも有用であることは当業者には理解されよう。望ましくは、該バイオマテリアルはコラーゲンを有する。

いくつかの実施形態では、該バイオマテリアルは、培養組織、もしくは動物から得られた細胞外基質を含むプロテーゼ、もしくは再生組織（例、コラーゲン基質）、もしくは類似物である。

該バイオマテリアルが、天然組織基質に一般に見られるものを含む合成ポリマー、もしくは生体ポリマー、もしくはその両方から形成される合成類似物を有し得ることは理解されよう。適切なポリマーとしては、たとえば、ポリアミド類およびポリスルホン類がある。生体ポリマーは、たとえば発酵などにより試験管内で自然発生もしくは作製することができる。

いくつかの実施形態では、該バイオマテリアルは、自然発生的であり、動物から摘出されてきた。該バイオマテリアルは、レシピエントと同一種からであろうと、レシピエントとは異なる種の動物からであろうと、任意の動物から摘出することが可能である。望ましくは、該動物は、哺乳類目すなわち哺乳類目、偶蹄目、ウサギ目、齧歯目、奇蹄目、食肉目および有袋目の一つである。さらに望ましいのは、該動物がヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、有袋類およびヒトからなるグループから選択されることである。

該バイオマテリアルは、どのような種類の細胞組織であってもよい。望ましくは、この細胞組織は、心血管組織、心臓組織、心臓弁、大動脈根、大動脈壁、大動脈尖、心膜組織、結合組織、硬膜、皮膚組織、血管組織、軟骨、心膜、靱帯、腱、血管、臍組織、骨組織、筋膜、および粘膜下組織と皮膚から選択される。

いくつかの実施形態では、該バイオマテリアルは、自然発生的なコラーゲン含有組織というよりは、離散すなわち分離されたコラーゲンであるとともにそれを有する、またはどちらか一方である。離散コラーゲンは、分離した状態で用いることもできるし、当該技術分野では公知のように医用デバイスもしくは医用品を形成することもできる。

ステップ（ａ）で用いられるバイオマテリアルは、これまで架橋されてこなかった。

ステップ（ａ）で用いられるアルコール含有溶液は、望ましくは液体であり、しかも水ベースのものであり、体積割合として、アルコールが約５０％よりも多い水溶液であり、より望ましくは、アルコールが６０％から８０％のものである。緩衝化アルコール含有溶液または非緩衝化アルコール含有溶液のいずれも用いることができる。しかしながら、緩衝化アルコール含有溶液が、続く架橋工程にて黄変バイオマテリアルを作製するという悪影響を及ぼすことが明らかにされてきたので、非緩衝化アルコール含有溶液を用いることが望ましい。

本発明の方法は、アルコール含有溶液についての技術分野において公知の任意のアルコールを用いることができる。望ましくは、このアルコールは、緩衝剤非含有溶液のＣ_１‐Ｃ_６低級アルコールである。より望ましくは、このアルコールは、メタノール、エタノール、シクロヘキサノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、イソブタノール、２‐ブタノールおよび第三ブタノールからなるグループの中から選ばれる。

いくつかの実施形態では、このアルコール含有溶液は、２種類以上のアルコールの混合体を有し、この混合体の合計体積は５０％を超える。たとえば、エタノールが約７０％で、イソブタノールが約１０％の混合体が有効である。

ステップ（ａ）における該バイオマテリアルを、このバイオマテリアルが生体内病原性石灰化に対して抵抗力を持てるようにするのに十分長い時間だけ、このアルコール含有溶液に曝露させることができる。望ましくは、このバイオマテリアルは、このバイオマテリアル中にアルコールが拡散し、浸透するのに十分な時間だけ、このアルコール含有溶液と接触したままにする。より望ましくは、このバイオマテリアルは、このアルコール含有溶液に少なくとも２４時間にわたって、さらにより望ましくは少なくとも３６時間にわたって、また最も望ましくは少なくとも４８時間にわたって曝露される。

たとえば、このバイオマテリアルが該アルコール含有溶液にも２４時間よりも長時間にわたって曝露されたというような実施形態においては、このバイオマテリアルは以下で開示される本発明の処置方法ではそのまま使用してもよい。

いくつかの実施形態では、該バイオマテリアルは、このアルコール含有溶液の曝露後、溶液が除去され、１種類以上の架橋剤に曝露される。当該技術分野では公知の任意のタイプの架橋剤もしくはその組み合わせが、コラーゲンを架橋するのに十分な時間用いられる。架橋剤には以下のものがあるが、これらに限定されたものではないことは理解いただけよう。すなわち、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ポリエチレングリコールジビニルスルホン（ＶＳ‐ＰＥＧ‐ＶＳ）、メタクリル酸ヒドロキシエチルジビニルスルホン（ＨＥＭＡ‐ＤＩＳ‐ＨＥＭＡ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アルデヒド類、イソシアネート類、ハロゲン化アルキル類とハロゲン化アリール類、イミドエステル類、Ｎ置換マレイミド類、アシル化化合物、カルボジイミド、塩化物、Ｎヒドロキシサクシニイミド、光（例、青色光線および紫外線）、ｐＨ、温度、およびこれらの組合せである。望ましくは、この架橋剤は、カルボジイミド、ポリエポキシエーテル、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ポリアルデヒドおよびジフェニルホソホリルアジド（ＤＰＰＡ）からなるグループから選択された化学的架橋剤である。

いくつかの実施形態では、このポリアルデヒドは、バイアルデヒド、またはトライアルデヒド、またはジアルデヒドである。グルタルアルデヒドが特に好ましい。

いくつかの実施形態では、架橋ステップ（ｂ）の後にステップ（ｃ）が続くが、洗い流しステップが介在する場合と介在しない場合がある。ステップ（ｃ）で用いられる酸性溶液は、ステップ（ｂ）の後のバイオマテリアルに存在する架橋剤成分のうちで固定されたものと固定されていないものの両方、あるいはどちらか一方を、不活性化および改変の両方、あるいはどちらか一方を行って得られるカルシウム結合部位を除去ないし削減する何らかの酸を含んでいる。別の方法では、あるいはそれに付け加えて、ステップ（ｃ）で用いられる酸性溶液は、活性カルボキシル基をコラーゲン上の活性アミノ基にさらに架橋してアミド結合を形成することのできる何らかの酸を含んでいる。望ましくは、酸性溶液中の酸はアミノカルボン酸である。望ましくは、このアミノカルボン酸は少なくとも１個のアミノ基と少なくとも１個のカルボン酸置換基を有する。より望ましくは、このアミノカルボン酸は、Ｌ‐アルギニン、Ｌ‐リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ‐グルタミン酸、ないしはＬ‐アスパラギン酸からなるグループから選択される。

いくつかの実施形態では、開示された方法のステップ（ｃ）は、該バイオマテリアルに存在するエラスチン分子上のメタロプロテイナーゼの形成を抑制する方法で持って置換もしくは補完される。特に、大動脈組織といった組織では、他の組織よりも高い割合のエラスチンが存在する。これらエラスチン分子は、メタロプロテイナーゼの形成用の部位を提供することができ、これらの部位は、低減ないしは除去ないしは不活性化する必要がある。下記の例１に示すように、第二鉄塩類およびアルミニウム塩類といった多価陽イオンを含んでいる緩衝剤非含有溶液は、メタロプロテイナーゼの形成を低減するのに用いることができる。

バイオマテリアルを洗い流すステップは、無りんの０．９％生理食塩水を使って実施される。

一つの望ましい実施形態においては、ステップ（ｃ）後の該バイオマテリアルはさらに滅菌される。さらに望ましくは、該バイオマテリアルは洗い流しの後に滅菌される。

本発明の各ステップが実行される温度が重要な意味を持つものではないことは、当該業者には理解されるところであるが、望ましくは、温度は２℃から４０℃の間の温度であり、より望ましくは４℃から３０℃の間であり、最も望ましいのは５℃から２５℃の間であるということも理解されよう。

ある一つの実施形態では、アルコール、架橋剤と酸性溶液、リンス溶液、および滅菌溶液は、すべて緩衝剤非含有である。

本願明細書にて開示されている方法が、生体内移植後２００日よりも長期間にわたって組織１ｍｇ当たり約５０μｇ未満のカルシウムを保つ抗石灰化バイオマテリアルを作製できることは、当業者には理解いただけよう。言い換えれば、本発明の抗石灰化バイオマテリアルは、バイオマテリアルが組織のカルシウム含有量を５０μｇ／ｍｇ超まで増加することのない、２００日よりも長期間にわたって移植が可能である。

従って、第５の態様において、本発明は、架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルであって、前記バイオマテリアル１ｍｇ当たり約５０μｇ未満のカルシウムを含有し、さらに前記バイオマテリアル１ｍｇあたりのカルシウム含有量を５０μｇ超まで増加させることなしに、少なくとも２００日間は移植が可能なバイオマテリアルを提供するものである。

任意の理論ないしは仮定に制約を受けることを望まなければ、本願明細書にて開示されているように、観察された抗石灰化バイオマテリアルは、部分的には該バイオマテリアルの作製法によってもたらされたコラーゲン中の合成ポリマーの存在によってもたらされるものである。

従って、第６の態様において、本発明は、移植可能な生体デバイスであって、架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルを有し、前記コラーゲンが合成ポリマーを有する生体デバイスを提供するものである。

いくつかの実施形態では、該抗石灰化バイオマテリアルは、医用デバイスの表面上にコーティングされる。さらに別の実施形態では、このデバイスは、少なくとも第二のコーティングを有する。

少なくとも第二のコーティングが、抗菌薬または抗ウイルス薬または抗真菌薬または増殖因子または抗脱水薬または消毒薬などの薬剤を有することは、当業者には理解されよう。

望ましくは、この抗菌薬は、イソニアジド、エタンブトール、ピラジナミド、ストレプトマイシン、クロファジミン、リファブチン、フルオロキノロン類、オフロキサシン、スパルフロキサシン、リファンピン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ダプソーン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アンピシリン、アムホテリシンＢ、ケトコナゾール、フルコナゾール、ピリメタミン、スルファジアジン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ペンタミジン、アトバクオン、パロモマイシン、ジクラザリル、アシクロビル、トリフルオロウリジン、ホスカルネット、ペニシリン、ゲンタマイシン、ガンシクロビル、イアトロコナゾール、ミコナゾール、ジンクピリチオン、金と白金と銀と亜鉛と銅とを含むがこれらには限定されない重金属、および塩化物と臭化物とヨウ化物と過ヨウ素酸塩などの塩類、および担体付き複合体を含む以上のものの複合形態のもの、およびその他の形態から成るグループから選択されたものである。

望ましくは、該増殖因子薬は、ヒドロキシアパタイト、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１および２（ＩＧＦ‐１およびＩＧＦ‐２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ（ＴＧＦ‐αおよびＴＧＦ‐β）インターロイキン‐８（ＩＬ‐８）つまり顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）つまりインターロイキン類、およびインターフェロン類からなるグループから選択されたものである。

いくつかの実施形態では、本発明の該デバイスはさらに生体吸収性材料を有し、この生体吸収性材料は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸‐‐ポリグリコール酸共重合体、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリペプチド類, 、ポリカーボネート類、ポリヒドロキシ酪酸塩、ポリ（アルキレンシュウ酸塩）、酢酸ビニル類の不飽和カルボン酸類との共重合体、水溶性もしくは水分散性セルロース誘導体類、エチレンオキシド重合体類、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ゼラチン、ポリ（オルトエステル）、アミノ酸ポリアミド類、ポリビニルアルコール、ポリビニル・ピロリドン、ポリエーテルエーテルケトン、リン酸三カルシウム、およびこれらの混合物から成るグループから選択される。

本発明の該デバイスは、抗石灰化が望ましい任意のデバイスであってもよいことは理解されよう。望ましくは、該デバイスは、人工心臓、心外心臓補助装置、内蔵型または外置型心臓補助装置、心臓弁プロテーゼ、弁形成リング、皮膚移植片、血管移植片、血管ステント、構造用ステント、血管短絡、心血管短絡、硬膜移植片、軟骨移植片、軟骨移植、心膜片、靱帯プロテーゼ、腱プロテーゼ、膀胱プロテーゼ、綿球、縫合糸、永久体内留置型経皮装置、手術用パッチ、心血管ステント、被覆ステント、および被覆カテーテルから成るグループから選択されたものである。

いくつかの実施形態では、該デバイスはさらに、動物から採取された組織片もしくは合成類似組織を有するものである。

望ましくは、該組織片は複数の細胞を含み、手術部位における移植で、この複数細胞が増殖して、周囲組織と一体化する。

第７の態様において、本発明は生体適合性移植片を提供するものであり、この生体適合性移植片は、架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルを有する生体適合性骨格を有しており、前記バイオマテリアルは、バイオマテリアル１ｍｇ当たり約５０μｇ未満のカルシウム含有量を有し、かつ前記バイオマテリアルは、そのカルシウム含有量をバイオマテリアル１ｍｇ当たり約５０μｇ超まで増加させることがなく、少なくとも２００日間は移植可能である。

第８の態様において、本発明は生体適合性移植片を提供するものであり、この生体適合性移植片は、架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルを有する生体適合性骨格を有しており、前記コラーゲンは、合成ポリマーを有する。

望ましくは、本発明の該移植片はさらに、合成ポリマー、天然ポリマー、注射可能ゲル、セラミック材料、自己生成組織、同種異系組織、異種組織、およびそれらの組み合わせを有する。

第９の態様において、本発明は、組織傷害の修復キットを提供するものであり、このキットは、
（ａ）架橋コラーゲンを有する１つ以上の抗石灰化バイオマテリアルであって、前記コラーゲンが合成ポリマーを有するバイオマテリアルを収めた滅菌容器と、
（ｂ）傷害対象についての説明書と、
を有する。

第１０の態様において、本発明は、生きている組織の処置方法を提供するものであり、この処置方法は、
（ａ）架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルであって、前記コラーゲンが合成ポリマーを有するバイオマテリアルを提供するステップと、
（ｂ）処置が必要な患者に前記バイオマテリアルを移植するステップと、
を含む。

この組織処置方法は、予防上の処置および治療上の処置を含め、任意の処置で有り得る。
望ましくは、この組織処置方法は、組織修復、深部組織保護、組織膨化、美容整形術、治療上の処置、組織増強、および組織封着からなるグループから選ばれる。

第１１の態様において、本発明は、創傷被覆材を提供するものであり、この創傷被覆材は、架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルを有する創傷被覆材であり、前記コラーゲンは合成ポリマーを有するものである。

該バイオマテリアルのコラーゲンは、ヒツジコラーゲン、ウシコラーゲン、ヤギコラーゲン、ウマコラーゲン、ブタコラーゲン、有袋類コラーゲンおよびヒトコラーゲンからなるグループの中から選ばれる。

いくつかの実施形態においては、該創傷被覆材はさらに、硫酸化多糖類を有し、この硫酸化多糖類は、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘキスロニルヘキソサミノグリカン硫酸、イノシトールヘキササルフェート、およびスクロースオクタサルフェートからなるグループの中から選ばれる。望ましくは、該創傷被覆材はさらに、抗菌薬、抗ウイルス薬、増殖因子、抗脱水薬、または消毒薬を有する。

望ましくは、該バイオマテリアルは少なくとも５０％のコラーゲンを、より望ましくは７０％のコラーゲンを有し、最も望ましくは本質的にはコラーゲンからなる。

本発明を詳細に説明する前に、本発明が、特に例示された作成方法に限定されるものではなく、当然のことながら変わり得るものであることを理解しておくべきである。また、本願明細書にて用いられる用語が、本発明の特別な実施形態を説明するためだけに用いられるものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることに対して、さらに限定を加えることを意図したものではないということも理解すべきである。

上記もしくは下記の本願明細書にて引用されている刊行物、特許、および特許出願はすべて、そっくりそのまま援用される。しかしながら、本願明細書にて言及される刊行物は、当該刊行物にて報告されていて、本発明に関連して用いられることがあり得る手順と試薬とを説明し開示するために引用されるものである。本願明細書記載の何物も、先願発明があるために、本発明にはこれらの開示に先行する資格がないということを認めていると、解釈されるべきではない。

さらに、本発明の実施には、特に断らない限り、当該技術分野内における従来の免疫技法、化学、および薬理学を用いるものである。このような技法は、当業者には公知のものであり、文献で十分に説明されている。これらには、たとえば、コリガン、ダン、プローエ、スパイチャおよびウィングフィールド著「タンパク科学の現代手順」１９９０年、第I巻および第II巻（ジョンウィリーアンドサンズ）と、Ｊ．Ｅ．ベイリーおよびＤ．Ｆ．オーリス著「生化学技術の基礎」マグローヒルブックカンパニ、ニューヨーク、１９８６年と、「細胞および分子生物学における免疫化学的方法」（メイヤおよびウォーカ編、アカデミックプレス、ロンドン、１９８７年）と、「実験免疫学ハンドブック」第I巻〜IV巻（Ｄ．Ｍ．ウィアおよびＣ．Ｃ．ブラックウェル編、１９８６年）がある。

本願明細書および添付の特許請求の範囲に用いられているように、単数形であっても、文脈上明瞭な指定がない場合は、複数の参照も含むことに留意されたい。たとえば、「架橋剤」の参照は、複数のこの種の薬剤を含み、「アルコール」の参照は、１種類以上のアルコールの参照を示し、以下同様である。定めのない限り、本願明細書にて用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する普通の当業者には普通に理解されるのと同一の意味を持っている。本願明細書にて記述されている材料や方法に類似もしくは等価な任意の材料および方法を用いて、本発明を実施し試験することは可能であるが、望ましい材料および方法についてここでは説明をする。

最も広範な態様の一つにおいて、本発明は、移植可能なバイオマテリアルの作製方法に関する。

本願明細書にて用いられているように、「バイオマテリアル」なる用語は、生体利用の可能性を有する任意の材料を指すものであり、ここでこの材料はある種のコラーゲンを有する。このコラーゲンは任意のものに由来する任意の種類のコラーゲンであってよく、単独で存在しても、他の材料と組み合わさった状態であってもよい。そして、このコラーゲンは、該バイオマテリアル全重量に対する重量割合が、わずか１％であってもよく、丸々１００％であってもよい。

「コラーゲン」なる用語は、堅固な三重らせん構造という特徴を持つ繊維性タンパクの細胞外ファミリーを指すものとして本願明細書では用いられている。３つのコラーゲンポリペプチド鎖（「α鎖」）が相互に巻きついていて、このらせん分子を形成している。この用語はまた、様々な種類のコラーゲンを包含するものとして用いられる。

コラーゲンのらせん部分の主要部は、哺乳類間では少ししか変化しない。実際、多数のコラーゲンタイプは、高度のヌクレオチドおよびアミノ酸配列相同性を有している。たとえば、コラーゲンアルファIタイプIIのヌクレオチド配列相同性は、ヒトとウマとネズミ科動物のそれを比較すると、少なくとも８８％ある。ヒトとウマの間では、ヌクレオチドレベルでは、９３％の配列相同性を持ち、他方、ネズミとウマとでは９３％の配列相同性を持つ。ヒトとネズミのヌクレオチド配列相同性は、８８％である（全米バイオテクノロジー情報センター受入れ番号Ｕ６２５２８（ウマ）、ＮＭ０３３１５０（ヒト）、およびＮＭ０３１１６３（ネズミ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。他のタイプのコラーゲンでも同様のレベルのアミノ酸相同性を有する。たとえば、豚のコラーゲンアルファIタイプIとヒツジのコラーゲンアルファIタイプIとの間のヌクレオチド配列相同性は、９０％である（（全米バイオテクノロジー情報センター受入れ番号ＡＦ２９２８７（ヒツジ）とＡＦ２０１７２３（ブタ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。

多くの上述した動物の共通の祖先と、牛、羊、鼠および豚などの多くの種にわたるコラーゲンについての高度のアミノ酸およびヌクレオチド配列相同性があるという生物学上のレベルに鑑みて、当業者は、本願明細書にて開示されるようなバイオマテリアルの作製方法が、すべての哺乳類動物から分離されたコラーゲン材料に対して適用可能であることを理解されよう。

従って、いくつかの実施態様では、該バイオマテリアルは、一つの哺乳類目、すなわち、偶蹄目、ウサギ目、齧歯目、奇蹄目、食肉目、および有袋目の動物から分離されたあるいは採取されたものである。該動物は、望ましくは、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、有袋類もしくはヒトである。このバイオマテリアルは、望ましくは、レシピエントと同一の動物種から分離されたものである一方で、このバイオマテリアルは、レシピエントとは異種の動物から分離されたものでありことも予想される。

別のいくつかの実施形態では、このバイオマテリアルは、培養組織もしくは再構成組織もしくは類似のものを有する。

このバイオマテリアルは、任意の種類の細胞組織であってよい。たとえばこの細胞組織は、心血管組織、骨盤底組織、心臓組織、心臓弁、大動脈根、大動脈壁、大動脈尖、心膜組織、結合組織、軟質臓器基質または固形臓器基質、硬膜、皮膚組織、血管組織、硬膜、軟骨、心膜、靱帯、腱、血管、臍組織、骨組織、筋膜、および、粘膜下組織もしくは皮膚である。

該バイオマテリアルが、天然組織基質に普通に見られるようなものを含んでいて、合成ポリマーから形成された合成類似物、もしくは精製された生体ポリマー、もしくはその両方を有し得ることは理解されよう。適切な合成ポリマーとしては、たとえば、ポリアミド類およびポリスルホン類がある。生体ポリマーは、たとえば発酵などにより試験管内で自然発生もしくは作製することができる。

精製された生体ポリマーは、織り、編み、鋳込み、モールディング、押出成型、細胞整列、および磁気整列といった技法により基質内に適切に形成することができる。適切な生体ポリマーには、コラーゲン、エラスチン、シルクアミノ酸、ケラチン、ゼラチン、ポリアミノ酸類、多糖類（例、セルロースやでんぷん）、および、これらのいずれかの共重合体があるが、これらに限定されたものではない。たとえば、コラーゲンポリマーとエラスチンポリマーは、たとえば織りとモールディングというように、上記の技法の任意のものを使って合成移植可能材料を形成することができる。合成組織類似物は、天然組織基質を模倣する。もう一つの方法として、合成基質は、組織類似物を形成するのに、単独でもしくは自然発生基質とともに用いることができ、この自然発生基質は、ポリプロピレン、ポリ乳酸、ナイロン、シリコンおよび同類のものがあるが、これらに限定されたものではない。

本願明細書にて開示された方法は、前もって架橋したバイオマテリアルにも何がしかの効果を有するものではあるが、本願明細書にて開示された方法は、架橋していない、すなわち、「天然の」もしくは「未処理の」材料に用いられることを目的とするものである。

ひとたびバイオマテリアルが入手できたなら、このバイオマテリアルは移植にむけ準備が進められる。「移植」、「移植可能」、および「移植する」という用語は、本願明細書では、互いに置き換え可能なように用いられ、これらは皆、本発明の該バイオマテリアル、デバイス、その他が、動物の生きている組織の中ないしは上に拒絶反応や感染症もしくは毒性問題を導くことなく配置される能力を指す言葉である。「移植可能」という用語には、バイオマテリアルもしくはデバイスの一部を含めることができ、さらに、コンタクトレンズなどといった部分的に移植されるデバイスなども含めることができることを理解すべきである。

本発明の方法の最初のステップにおいて、バイオマテリアルは、アルコール含有溶液に曝露される。本願明細書にて用いられているように、「曝露される」ないしは「曝露する」という用語は、バイオマテリアルないしはコラーゲン含有材料を、今述べたように、あるいは以下に述べるようにアルコール含有溶液に接触させ、続けてバイオマテリアルに架橋剤もしくは酸性溶液もしくは他の材料に所望の結果がもたらされるのに十分な時間接触させる積極的なステップを指す。たとえばアルコール含有溶液に、バイオマテリアルを曝露する方法は、当業者には公知である。たとえば、一般に、バイオマテリアルは、噴霧により、あるいはアルコールを有する溶液中への浸漬で、アルコールに「曝露する」ことが可能である。

本願明細書で用いられる「アルコール」という用語は、当業者には公知の任意のアルコールを指し、こられアルコールは、トリグリセロイド類を除去ないしその量を削減するとともに、コラーゲン上に見られるカルボキシル基を部分的にエステル化する。望ましくは、このアルコールは水溶性アルコールである。より望ましくは、このアルコールは緩衝剤非含有溶液中のＣ_１−Ｃ_６低級アルコールである。さらにより望ましくは、このアルコールはメタノール、エタノール、シクロヘキサノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、イソブタノール、２‐ブタノールおよび第三ブタノールからなるグループの中から選択される。

何らかの特定の理論もしくは仮説によって制約されることを望まなければ、発明者らは、アルコール含有溶液が、コラーゲンの三重らせんを解きほどく支援をし、これにより、疎水性部位を曝露することを支援すると考えている（軽部および西田著、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．、１９７９年、２３；５８１（１）巻、１０６頁〜１１３頁参照）。発明者らはさらに、コラーゲンに見られるカルボキシル基とアミン基は、アルコール含有溶液の存在でエステル化されて、後のステップで架橋が可能なようになると考えている。このような次第で、望ましいアルコール溶液は、緩衝剤非含有水溶液に対して、体積割合で少なくとも約５０％ｖ／ｖ、より望ましくは少なくとも体積割合で約７０％ｖ／ｖ、もっとも望ましくは少なくとも体積割合で約８０％ｖ／ｖのアルコールを有するものである。ある一つの実施形態においては、アルコール溶液は、０．９％生理食塩水０．５ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルを含有）中に、体積割合で７０％ｖ／ｖのエタノールとなっている。

ある実施形態においては、本発明の方法は、移植可能なバイオマテリアルを作製する方法を提供し、この方法は、該バイオマテリアルを１００％未満のアルコールを有するアルコール含有緩衝剤非含有溶液に少なくとも２４時間にわたって曝露する。

いくつかの実施形態では、アルデヒドを含む架橋剤は、固定化中に緩衝剤と反応して、このアルデヒドの十号を引き起こすことが仮定されているので、他の溶液や試薬と同じように、アルコール含有溶液は「緩衝剤非含有」である。

該バイオマテリアルをアルコール含有溶液に曝露するステップは、このバイオマテリアルが生体内病原性石灰化に対して抵抗力を持てるようにし、コラーゲンに見られる大多数（すなわち高い割合）のカルボキシル基とアミン基がエステル化されるのに十分長い時間にわたるものであれば、任意の時間実行すればよい。望ましくは、このバイオマテリアルは、このバイオマテリアル中にアルコールが拡散し、浸透するのに十分な時間このアルコール含有溶液と接触したままにする。より望ましくは、このバイオマテリアルは、このアルコール含有溶液に少なくとも２４時間、さらにより望ましくは少なくとも３６時間、また最も望ましくは少なくとも４８時間にわたって曝露される。

いったんこのバイオマテリアルをアルコールに曝露させたら、アルコールは除去される。いくつかの実施形態では、このバイオマテリアルはアルコール曝露後、無りんの０．９％生理食塩水を有する洗浄液で洗い流される。そうではあるが、洗浄液としては、緩衝化されていない生理的に受け入れることができる任意の溶液を用いてもよい。この洗浄液の目的は、過剰なアルコールを除去することなので、このことはそれほどクリチカルなものではない。

このバイオマテリアルないしはコラーゲン含有材料が、アルコールに２４時間よりも長い時間曝露された後、すぐに移植に用いることができる。アルコール事前固定化が用いられてきたが、一方で、コラーゲン上に見られるカルボキシル基とアミン基もエステル化というよりはむしろ組織を滅菌するということが伝統的に用いられてきた。そのようなことで、これまではアミン基に曝露する時間は相対的に短く、すなわち２４時間未満であり、アルコールが組織に完全に浸透するには不十分なものであった。この結果、本発明以前には、抗石灰化バイオマテリアル（定義については下記参照）が、より長い時間すなわち２４時間よりも長い時間バイオマテリアルをアルコール含有溶液に曝露することにより作製できるということについての正しい認識はなかった。このことは、このバイオマテリアルが、２４時間よりも長い時間アルコール含有溶液に曝露後、すぐに（以下で説明）抗石灰化バイオマテリアルとして移植しえることを意味している。然るに、抗石灰化バイオマテリアルの優れた形態は、ステップ（ａ）後の該バイオマテリアルの架橋によって作製することができるということは、当業者には理解されよう。

従って、本発明のいくつかの実施形態では、アルコール曝露後のバイオマテリアルないしはコラーゲン含有材料は、それから１種類以上の二官能性架橋剤に曝露される。本願明細書で用いられる「二官能性」とは、５個の炭素鎖の両端に存在する二つの機能的アルデヒド基を指している。架橋は、当該技術分野では公知の任意の技法により、コラーゲンを架橋することが可能なものであればどのような種類の架橋剤を用いて行うことができる。架橋剤には以下のものがあるが、これらに限定されたものではない。すなわち、アシル化化合物、塩化物、アルデヒド類、ハロゲン化アルキル類とハロゲン化アリール類、バイシミデート、カルボジイミド、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、ヘキサメチレンジイソシアン酸、水酸化塩化物、メタクリル酸ヒドロキシエチルジビニルスルホン（ＨＥＭＡ‐ＤＩＳ‐ＨＥＭＡ）、イソシアネート類、イミドエステル類、光（例、青色光線および紫外線）、Ｎヒドロキシサクシニイミド、Ｎ置換マレイミド類、ｐＨ、ポリアルデヒド、ジフェニルホソホリルアジド（ＤＰＰＡ）、１７〜２５の炭素と４〜５のエポキシ基という重要要素を有するポリエポキシ化合物、ポリエポキシエ−テル類、ポリエチレングリコールジビニルスルホン（ＶＳ‐ＰＥＧ‐ＶＳ）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、温度、およびこれらの組合せである。

いくつかの実施形態では、この架橋剤は、カルボジイミド、ポリエポキシエーテル、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ゲニピン、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、およびジフェニルホソホリルアジド（ＤＰＰＡ）といった化学的架橋剤である。

１７〜２５の炭素と４〜５のエポキシ基というバックボーンを有するポリエポキシ化合物が、コラーゲンの架橋に高い性能を示すということがこれまでに実証されてきた（たとえば、米国特許出願番号第２００４００５９４３０（Ｓ／Ｎ １０／６１８，４４７）参照）。ポリエポキシ化合物の毒性が、グルタルアルデヒドの毒性よりも低いことと、抗原性ないしは免疫応答誘導が、コラーゲンのようならせんペプチド分子に反応する場合に、反応時間に比例して低減することとが示されてきた。当然ながら、このポリエポキシ化合物は、相対的に良好な生体適合性を示す（たとえば、ローレその他著、１９９２年、Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ、１６巻６３０頁〜６３３頁、ならびに、植松その他著、１９９８年、Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ、２２巻９０９頁〜９１３頁参照）。結論として、上述のポリエポキシ化合物は、望ましい架橋剤の一つである。

いくつかの実施形態では、架橋剤は約１％のグルタルアルデヒドを有し、曝露時間の長さは、少なくとも２４時間である。バイオマテリアルを架橋剤に曝露する時間長は、用いられる薬剤と、濃度と、温度とに依存することは理解されよう。標準的には、曝露時間は、２４時間から２８日の間である。バイオマテリアルを架橋剤に曝露する正確な量は、当業者が十分に対応できる範囲内で決定できる。

再び、何がしかの特定の理論ないしは仮説によって制約されることを望まなければ、発明者らは、アルコールに曝露済みのバイオマテリアルを架橋剤に曝露することにより、該バイオマテリアルに存在するコラーゲン上のエステル化されたカルボキシル基とアミン基が架橋されると考えている。

本発明の各ステップが実行される温度が、重要な意味を持つものではないことは、当該業者には理解されるところであるが、望ましくは、温度は２℃から４０℃の間の温度であり、より望ましくは４℃から３０℃の間であり、最も望ましいのは５℃から２５℃の間であるということも理解されよう。

架橋の後に、今一度該バイオマテリアルは望ましくは、アルコール曝露ステップ（ａ）の後で用いられるような洗浄液で洗い流される。然るに、洗い流しステップは単により望ましいことであるというに過ぎないことも理解されよう。

架橋ステップに続いて、もしくは、架橋後に洗い流しステップを活用する場合はその洗い流しに続いて、該バイオマテリアルは、得られるカルシウム結合部位を除去ないし削減するために、任意の酸を含む酸性溶液に曝露されるが、この酸は、ステップ（ｂ）の後のバイオマテリアルに存在する架橋剤成分のうちで固定されたものと固定されていないものの両方、あるいはどちらか一方を、不活性化および改変の両方、あるいはどちらか一方を行い得るものである。これとは別の方法、ないしはこれに付け加えて、ステップ（ｃ）で用いられる酸性溶液は、さらに活性カルボキシル基をコラーゲンの活性アミン基に架橋してアミド結合を形成することのできる任意の酸を含む。

望ましくは、この酸性溶液は、少なくとも１つのアミノカルボン酸を有する。本願明細書に用いられているように「アミノカルボン酸」という用語は、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも一つのカルボン酸置換基を有する任意の酸である。本発明に有用なアミノカルボン酸の代表的な例としては、Ｌ‐グルタミン酸、Ｌ‐アスパラギン酸、Ｌ‐リジン、Ｌ‐アルギニン、Ｌ‐ヒスチジンがあるが、これらに限定されたものではない。酸性溶液を使う目的には二つの要素がある。第１は、固定された架橋剤と固定されない架橋剤の不活性化および改変の両方、またはどちらか一方を支援することである。第２の要素は、活性カルボキシル基をコラーゲンの活性アミン基に架橋して、アミド結合を形成することである。

アミノカルボン酸の濃度は、用いられる実際の酸と、用いられるバイオマテリアルの全質量などといった他のパラメータとに依存する。さらに、バイオマテリアルに対するアミノカルボン酸の湿重量比は、約１：４である。酸性溶液の最も重要な側面は、ｐＨである。ｐＨは、ｐＨ７よりも低くなければならず、望ましくはｐＨ６よりも低く、より望ましくはｐＨ５よりも低く、最も望ましくは約ｐＨ４．６よりも低い。

ある実施形態では、この酸性溶液は、脱イオン水１ミリリットル当たりアミノカルボン酸８ｍｇであり、この酸性溶液は無りんでかつｐＨは約４となる。

該バイオマテリアルは、アミノカルボン酸に少なくとも６時間、より望ましくは少なくとも２４時間、さらにより望ましくは４８時間よりも長時間曝露される。培養温度はクリチカルではないが、望ましくは５℃から５５℃の間、より望ましくは１０℃から４５℃の間、最も望ましくは約４５℃である。

いくつかの実施形態では、開示された方法のステップ（ｃ）は、該バイオマテリアルに存在するエラスチン分子上にメタロプロテイナーゼを形成することを抑制する方法により置換もしくは補完される。特に、大動脈組織といった組織内には、他の組織よりは高い割合のエラスチンが存在する。これらのエラスチン分子は、メタロプロテイナーゼの形成のための部位を提供することができ、これらの部位は削減もしくは除去もしくは不活性化されなければならないほどである。以下の実施例１に示すように、マグネシウム、第二鉄塩、およびアルミニウム塩といった多価陽イオンを含む緩衝剤非含有溶液は、メタロプロテイナーゼ形成を削減するのに用いることができる。

該バイオマテリアルないしはコラーゲン含有材料を酸性溶液および多価陽イオンを含む緩衝剤非含有溶液の両方、またはどちらか一方に曝露させた後、該バイオマテリアルは、望ましくは、もう一度洗浄液で洗い流される。いくつかの実施形態では、該バイオマテリアルはさらに滅菌される。

該バイオマテリアルの滅菌ステップは、コラーゲン含有材料用として当該技術分野では公知である任意の滅菌方法による。たとえば、該バイオマテリアルは、滅菌剤（例、重量比０．２‐２．０％のグルタルアルデヒド溶液などの液体滅菌剤）に曝してもよい。０．６２５％のグルタルアルデヒド溶液は、熱（すなわち、室温よりは高い温度ではあるが、該バイオマテリアルに損傷を与える温度よりは低い）と組み合わせて、滅菌剤として用いることもできる。別の方法では、適当な滅菌剤溶液は、浸透圧平衡水溶液だけ、もしくは非接触滅菌減（例、放射線、電子ビーム、紫外線、もしくはその他の同様の目的にかなったもの）との組み合わせを有するものでもよいし、さもなければ、リン酸緩衝生理食塩水と組み合わせたグルタルアルデヒド水溶液を含んだものでもよい。０．６２５％のグルタルアルデヒド溶液が滅菌剤として用いられる例では、滅菌期間は、３７℃で１から６日間、もしくは、５０℃で１から２日間であってよい。この最終滅菌ステップは、該バイオマテリアルをその最終容器に詰めた後で行ってもよく、そうすることによって、移植のときまでにこれに続けて行う該バイオマテリアルの何がしかの処理の必要がなくなる。

ある望ましい実施形態では、カリウムリン酸二水素緩衝剤を９．０７g／ｌ含む脱イオン水中の０．２５％のグルタルアルデヒドに該バイオマテリアルを曝露することにより、該バイオマテリアルは滅菌される。

滅菌ステップは、任意の時間にわたって実行してもよく、また、保存を含んでもよい。滅菌温度は、望ましくは４０〜５０℃の間で６０分間より長時間実行される。

該バイオマテリアルは、本願明細書にて開示された方法で処置された後は、石灰化に対して高い抵抗力を有する、すなわち「抗石灰化バイオマテリアル」である。本願明細書で用いられているように「石灰化」という用語は、従来方法で作製された結合組織タンパク（すなわちコラーゲンおよびエラスチン）を有するバイオマテリアルに関連した主な病理学的問題の一つを指す。これらの材料が身体内への移植の後に石灰化することがある、ということがこれまで示されてきた。このような石灰化は、該バイオマテリアルの望ましくない硬化ないしは分解という結果を招く可能性がある。このような石灰化が起こる正確な機構は未知であるが、石灰化には２種類のもの、すなわち固定されたコラーゲンバイオマテリアルに、内因性および外因性の石灰化が起こることが知られている。内因性石灰化は、コラーゲン基質やレムナント細胞を含む、固定された生物義装具組織内で、カルシウムイオンとリン酸イオンが沈殿するという特徴がある。外内因性石灰化は、該バイオマテリアルに付着した細胞（例、血小板）と、該バイオマテリアル上のカルシウムリン酸含有表面プラークの成長を含み、付着した血栓内でカルシウムイオンとリン酸イオンが沈殿するという特徴がある。

このため、「石灰化に対する高度の抵抗力」ないしは「抗石灰化」という語句が本発明のバイオマテリアルに用いられる場合は、該バイオマテリアルが、生体内に移植されてから少なくとも２００日後に、それを除去した後に乾燥させた組織の１ｍｇ当たりのカルシウムの量が、５０μｇ未満であり、望ましくは２０μｇ未満であり、より望ましくは１０μｇ未満であるということを意味している。

望ましくは、本発明のバイオマテリアルは、酵素分解に対しても抵抗力を有するものである。本願明細書で用いられているように「酵素分解に対する抵抗力」という用語は、本発明のバイオマテリアルが、従来方法で固定された組織と比較しえるレベルまで酵素分解に耐える能力を指す。

ひとたび該バイオマテリアルが形成されれば、本発明の移植可能なバイオマテリアルもしくはコラーゲン含有材料は、幾多の病気および疾患の両方、またはいずれか一方を処置するのに用いることができる。

ここで、「処置する」、「処置」などの用語は、本願明細書では、個人または動物に作用して、その組織ないしは細胞が、薬理効果および生理的効果の両方、またはどちらか一方を得ることを指す。効果は、病気および疾患の両方、またはいずれか一方の部分的もしくは完全な治癒という点から見ると、特に治療上のものである。本願明細書で用いられているように「処置する」は、脊椎動物、哺乳動物、特にヒトの病気および疾患の両方、またはいずれか一方の任意の処置を対象とし、以下を含むものである。（ａ）病気および疾患の両方、またはいずれか一方を抑制すること、すなわち、その進行を阻止すること。もしくは、（ｂ）病気および疾患の両方、またはいずれか一方の症状を取り除くこともしくは改善すること、すなわち、酵素分解／病気および疾患の両方、またはいずれか一方の症状の原因退化である。

「病気」および「疾患」の両方、またはいずれか一方は、本願明細書では、互いに置き換え可能なものとして用いられ、ヒトを含む動物に作用する異常な状態を指し、本発明のバイオマテリアルを使って処置することができるものである。従って、外傷、病変、組織の変性、微生物感染、火傷、潰瘍、皮膚病の処置が本発明には含まれる。さらに、心臓弁、大動脈根、大動脈壁、大動脈尖、心膜組織、結合組織、硬膜、皮膚組織、血管組織、軟骨、心膜、靱帯、腱、血管、臍組織、骨組織、筋膜および粘膜下組織の交換が包含される。

本発明の抗石灰化バイオマテリアルはまた、医用デバイスの多種多様な接触する面の任意のものに適用することが可能である。この接触する面には、特にヒトを含む動物の血液、細胞もしくは他の体液ないしは組織に接触することを目的とする面が含まれるが、これに限定されたものではない。適切な接触面は、血液もしくは他の組織に接触することを目的にした医用デバイスの一つ以上の面を含む。この医用デバイスには、動脈瘤コイル、人工血管、人工心臓、人口弁、人工腎臓、人工腱と人工靱帯、血液バッグ、血液酵素付加装置、骨および心血管代用品、骨プロテーゼ、骨ろう、心血管移植片、軟骨代用デバイス、カテーテル、コンタクトレンズ、細胞と組織の培養および再生用の容器、塞栓粒子、フィルタシステム、移植片、案内チャネル、留置カテーテル、実験室用器具、マイクロビーズ、神経成長ガイド、眼科用移植片、整形外科用移植片、ペースメーカリード線、プローブ、義肢、シャント、ステント、ペプチド用支持、外科手術用器具、縫合糸、注射器、尿路代用品、創傷被覆剤、創傷被覆材、創傷治癒デバイス、および当該技術分野では公知のその他の医用デバイスがある。

本発明を適用することにより恩恵を受ける医用デバイスの他の例は、外科手術および医療処置の当業者には明らかなものであり、本発明の意図するところのものでもある。接触面には、メッシュ、コイル、ワイヤ、膨張式バルーン、もしくはその他の任意の構造をとることができ、それらは、血管内 の部位、管腔内の部位、固形組織内の部位などを含む目標部位に移植することができるものである。これらのデバイスは、血管内カテーテルおよび他の医療用カテーテルにより搬送されるか、もしくはこれらのカテーテルに組み込まれている。

このようなデバイスの表面コーティング処理は、国際特許出願番号ＷＯ９６／２４３９２号に記載されているように、プラズマコーティング法により実施することができる。

一つの最良の実施形態では、本発明のバイオマテリアルは、創傷被覆材として直接用いられる。たとえば、上述したように、このバイオマテリアルは、乾燥してから創傷被覆材として直接用いことができる。

本発明の創傷被覆材は、当該技術分野では公知の創傷被覆材同様に、望ましくは連続シート形状という形状になっている。しかしながら、本発明は、他の特定の形態をもとり得るものである。たとえば、本発明の創傷被覆材は、上述のバイオマテリアルの在庫シートから所望のデザインパターンを切り出すことによって作製してもよい。また、たとえば、バイオマテリアルの在庫シートから金型裁断してもよい。

本発明の創傷被覆材は、その使用に当たっては、望ましくは、創傷床に直接接触するか、創傷床のできるだけ近傍にセットされる一次被覆材として用いられる。この被覆材は、包装材料としても役立たせてもよく、必要なら、任意の適当な二次創傷被覆材もしくは、ラップ、テープ、ガーゼ、パッド、縫合糸、もしくはクリップなどの用具により位置を固定してもよい。この被覆材は、暫定的であっても恒久的であってもよいので、治癒組織内に永久的に組み込んでしまってもよい。必要な場合には、創傷被覆材は、最初に被覆材上部材料を除去し、次に被覆材を除去して蓄積された壊死組織および浸出液を取り除いて、創傷被覆材を変更する。本発明の暫定的な創傷被覆材は、未使用の被覆材もしくはその他の適当な創傷被覆剤で置き換えることができる。

この被覆材は、そっくりそのまま創傷内に置くこともできる。本発明の被覆材は、切断、成形、および修正を施して、数多くの用途と応用に合わせることができる。

本発明のバイオマテリアルのさらなる用途は、前述した応用の任意のものの中に含ませた治療効果薬の搬送にある。この治療効果薬は、創傷治癒過程に参加し、それを改善することができるものであり、抗菌薬を含んでもよく、この抗菌薬としては、抗真菌薬、抗細菌薬、抗ウイルス薬と抗寄生虫薬、増殖因子、血管新生因子、抗炎症薬、抗血栓薬、麻酔薬、ムコ多糖類、金属類、およびその他創傷治癒薬があるが、これらに限定されたものではない。

本発明に用いることのできる抗菌薬の例としては、イソニアジド、エタンブトール、ピラジナミド、ストレプトマイシン、クロファジミン、リファブチン、フルオロキノロン類、オフロキサシン、スパルフロキサシン、リファンピシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ダプソーン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アンピシリン、アムホテリシンＢ、ケトコナゾール、フルコナゾール、ピリメタミン、スルファジアジン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ペンタミジン、アトバクオン、パロモマイシン、ジクラザリル、アシクロビル、トリフルオロウリジン、ホスカルネット、ペニシリン、ゲンタマイシン、ガンシクロビル、イアトロコナゾール、ミコナゾール、ジンクピリチオン、金と白金と銀と亜鉛と銅とを含むがこれらには限定されない重金属、および塩化物と臭化物とヨウ化物と過ヨウ素酸塩などの塩類と担体付き複合体とを含む以上のものの複合形態のもの、およびその他の形態のものがあるが、これらに限定されたものではない。

本発明の創傷被覆デバイスに組み込まれる増殖因子剤には、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１および２（ＩＧＦ‐１およびＩＧＦ‐２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ（ＴＧＦ‐αおよびＴＧＦ‐β）インターロイキン‐８（ＩＬ‐８）、そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、さらにインターロイキン類、およびインターフェロン類があるが、これらに限定されたものではない。

本発明の創傷被覆材の中に組み入れられるそのほかの薬剤には、酸性ムコ多糖類があり、この酸性ムコ多糖類には、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパリノイド類、デルマタン硫酸、ペントサンポリサルフェート、セルロース、アガロース、キチン、デキストラン、カラゲニン、リノール酸、およびアラントインが含まれるが、これらに限定されたものではない。

抗炎症薬および抗血栓薬には、エンドメジシン、ヘパリン、インドメタシン、イブプロフェン、アスピリン、サリチル酸コリン、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸マグネシウムコリン、サルサラート、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、ナプロシン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ジクロフェナクナトリウム、ジクロフェナクミソプロストール、エトドラク、インドシド、ケトロラック、ナツメトン、スリンダク、トルメチン、スルフィンピラゾン、ジピリダモール、チクロピジン、バルデコキシブ、ロフェコキシブ、ピロキシカム、メロキシカム、メクロフェナム酸ナトリウム、メフェナム酸、シクロホスファミド、シクロスポリンミクロマルジョン、クロラムブシル、アナグレリド、クロピドグレル、およびシロスタゾールがある。また、抗血栓薬は、ヘパリン、アルデパリン、エノキサパリン、チンザパリン、ダナパロイド、エルピルデン、およびヒルジンからなるグループから選択してもよい。

治療効果薬剤は、物理的にまたは化学的にいずれかで、当該技術分野では公知の方法により、本発明のバイオマテリアルに結合することができる。

ここで、「有する」という語は、「有する」に先行するものが何であれ含むことを意味する。従って、「有する」という用語を使うということは、記載された要素が必須であることを示しているが、他の要素は任意的であって、存在してもしなくてもよいということを示している。また、「からなる」という言葉遣いは、「からなる」という言葉遣いに先行するものが何であれ含み、それに限定されていることを意味する。従って、「からなる」という言葉遣いは、記載された要素が必須であることを示していて、他の要素は存在することができないということを示している。また「本質的に〜からなる」という言葉遣いは、「〜」として記載された任意の要素を含み、他の要素としては、当該記載要素の開示において特定された活動ないしは振る舞いを妨害することのない、もしくは寄与することのない要素に限定されていることを意味する。従って、「本質的に〜からなる」という言葉遣いは、記載された要素が必須であることを示しているが、他の要素は任意的であって、当該記載要素の活動ないしは振る舞いに影響を及ぼすか否かによって存在の可否が決定されるということを示している。

本発明を、下記の非限定的な実施例のみを参照して以下でさらに詳しく説明する。しかしながら、以下で示す実施例は、説明のためだけのものであることを理解すべきであり、上述した本発明の一般性を限定するものだと決して受取ってはならない。特に、本発明は、ウシ、ブタ、および有袋類源からの心膜、大動脈根、弁尖、および大動脈壁の処置について、詳細に説明するが、本願の発見事項は、これらの特定の組織もしくは動物源に限定されるものではないことを明瞭に理解すべきである。
［実施例１］

バイオマテリアルの基本的処理

大人のクロカンガルーの心臓が、プロのカンガルー狩猟者により西オートトラリアで採取され、死後４〜６週間以内に氷詰めにされて研究所に運ばれた。この心臓は、氷のように冷たい０．９％の生理食塩水で二度にわたって洗浄された。心膜は、粘着性の脂肪および緩い結合組織から取り出され注意深く洗浄された。大動脈根は大動脈弁とともに、心臓から解体され、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を０．５ｍＭ含む氷のように冷たい０．９％の生理食塩水の中に置かれた。この心膜は、ＰＭＳＦを０．５ｍＭ含む４℃という氷のように冷たい０．９％の生理食塩水の中に一晩保存され、また、この弁付き大動脈根は、ＰＭＳＦを含む０．９％の生理食塩水の中で２０分間洗浄された。

アルコールエタノールの体積濃度が６０〜８０％ｖ／ｖの水溶性アルコール含有溶液が用意された。該心膜は、４℃で一晩保存した後このアルコール溶液に浸された。該弁付き大動脈根は、約５℃のアルコール溶液中に最低でも２４時間にわたり入れたままにされた。

該心膜と、該弁付き大動脈根とは、アルコール溶液から取り出され、０．９％の生理食塩水で約１０分間洗い流された。洗い流し期間中、洗い流し液の温度は約１０℃に保たれた。

該心膜と、該弁付き大動脈根とは、無菌脱イオン水にリン酸二水素緩衝剤を９．０７ｇ／ｌ含む０．６２５％のグルタルアルデヒドの溶液に浸された。このグルタルアルデヒド溶液のｐＨは、水酸化ナトリウムにより７．４に調整された。該心膜と、該弁付き大動脈根とは、この１〜５℃のグルタルアルデヒド溶液中で最低でも２４時間にわたって固定され、この組織のコラーゲンに存在するタンパクが架橋された。

該心膜と、該弁付き大動脈根とは、該グルタルアルデヒド溶液から取り出され、無菌の０．９％の塩化ナトリウムで約１５分間洗い流された。この洗い流し期間中は、該洗い流し液は、約１０℃に保たれていた。

該心膜と、該弁付き大動脈根とは、その後、二つの選択肢がある手順により処置された。第一の手順では、該心膜と、該弁付き大動脈根とは、脱イオン水１ミリリットル当たり８ｍｇのジカルボン酸を含む緩衝剤非含有溶液に浸された。この溶液のｐＨは、希塩酸の量でｐＨ４．５に調整された。該心膜と、該弁付き大動脈根とは、約４５℃のこの溶液に約４８時間浸された。

第二の手順では、該心膜と、該弁付き大動脈根とは、脱イオン水に溶解されたマグネシウムや第二鉄塩やアルミニウム塩といった多価陽イオンを含む緩衝剤非含有溶液で、ｐＨ３．５となっている溶液に約６０分間浸された。

該バイオマテリアルは、その後、組織を、無菌脱イオン水に９．０７ｇ／ｌのリン酸二水素カリウム緩衝剤を含むグルタルアルデヒド０．２５％溶液に浸すか下記の方法のいずれかで滅菌された。このアルデヒド溶液のｐＨは、水酸化ナトリウムにより７．４％に調整された。この滅菌プロセスは、約４５℃の温度で約１２０分間行われた。

もう一つ別の滅菌方法として、該バイオマテリアルは、重量比で２０％のエチルアルコールと結合した２％のエポキシプロパンを有する３７℃の水溶液中で２４時間滅菌された。滅菌された組織は、その後、緩衝化した０．２％のグルタルアルデヒド、プラス１５％のイソプロパノールに保存された。
［実施例２］

バイオマテリアルへの温度の影響

変性温度は、架橋安定性の重要な測度であり、この温度は、材料の強度、耐久性、および完全性を反映している。

ウシの心膜が、西オーストラリアの地域食肉処理場で得られ、氷漬けにされて輸送された。この心膜は、実施例１で述べたように洗浄された。

実施例１で述べた方法に従って準備されたウシの心膜の架橋の程度が、０．６２５％の緩衝化したグルタルアルデヒドで固定されたウシの心膜（対照心膜）のそれと比較された。

各グループを代表する心膜試料条片（５×１０ｍｍ）が等力変換器（オーストラリアのメーカであるＡＤインストルメンツ製ＭＬＴ０５００）に取り付けられ、パワーラブ（ＰｏｗｅｒＬａｂ）データ収集システムおよびデスクトップパソコンにインタフェースされた。試料は、９０±５ｇの荷重で常時伸長されたままにされ、０．９％の生理食塩水で満たされていて温度が管理されている開放型水槽に浸された。この水槽の温度は、約１．５℃／ｍｉｎの速度で、２５℃から９５℃まで徐々に上げられた。収縮温度は、コラーゲン材料が変性したときの常時伸張からの急激な偏位点で示された。結果（摂氏温度表示の収縮温度）の要約が、表１に示されている。

［実施例３］

バイオマテリアルの酵素分解

実施例１で述べた方法に従って準備されたウシの心膜（処置心膜）の対酵素分解抵抗力のレベルが、０．６２５％の緩衝化したグルタルアルデヒドで固定されたウシの心膜（対照心膜）のそれと比較された。

プロナーゼ溶液として、１００ｍｇのプロナーゼ（ストレプトマイセスグリセウス）と１００ｍｇのカルシウム塩を、０．１Ｍのグリシンを含む２００ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させたものが用意された。固定された組織試料は、脱イオン水で３分間洗い流しされ、拭き取られ、７０℃で一晩乾燥され、それから計量された。これらの試料は、５０℃の該プロナーゼ溶液中で２４時間培養された。残っている組織試料は、脱イオン水で洗い流され、７０℃で一晩乾燥され、それから計量された。対プロナーゼ消化抵抗力は、残っている組織の質量によって決定され、消化前組織質量の割合で表わした。結果の要約が、表２に示されている。

［実施例４］

バイオマテリアルの引っ張り強さ

引っ張り強さは材料強度の重要な測度であり、架橋した組織の耐久性を反映している。

実施例１で述べた方法に従って用意されたウシの心膜（処置心膜）の引っ張り強さが、０．６２５％の緩衝化したグルタルアルデヒドで固定されたウシの心膜（対照心膜）のそれと比較された。

両グループの組織の典型的な心膜条片（８×８０ｍｍ）の引っ張り強さが、５０ｍｍ／ｍｉｎという一定の伸張速度で１０ｋニュートンのロードセルが設置された水力式のツヴィックローエル（Ｚｗｉｃｋ／Ｒｏｅｌｌ）製引っ張り試験機（モデル２０１０）で測定された。破断点での引っ張り強さと伸びが、記録された荷重／伸び曲線から求められた。結果の要約が、表３に示されている。

［実施例５］

バイオマテリアルの石灰化特性

処置したコラーゲン含有バイオマテリアル石灰化を軽減する上述のプロセス有効性を評価するために、小動物モデルおよび大動物モデルの実証実験が実施された。最初の動物実験では、０．６２５％の緩衝化したグルタルアルデヒドのみで固定したカンガルーの弁尖組織およびカンガルーの大動脈壁組織（非処置組織）が、実施例１で述べた方法に従って処置したカンガルーの弁尖組織およびカンガルーの大動脈壁組織（処置組織）と比較された。

両グループの大動脈壁組織試料（大きさが１０×５ｍｍ）および大動脈弁尖が０．９％の生理食塩水で５分間洗い流された。洗い流された組織は、成長中（生後６週間）のオスのウィスター系ラットの背側壁中央部に形成された皮下ポケットに外科的に移植された（ラット１匹に付き１試料）。６０日後、この外植された組織は、周囲の宿主組織から解体され、９０℃のバイオサーム培養器（西オーストラリア州パース所在のセルビーサイエンテフィック製）内にて４８時間乾燥された。乾燥組織は計量され、その含有カルシウムが、７５℃の６窒素超高純度塩酸（西オーストラリア州パース所在のマーク製）５．０ｍｌで２４時間にわたって抽出された。その後、抽出可能なカルシウム含有量が原子吸光分光光度計（バリアン製ＡＡ１２７５）を使って測定され、組織１ｍｇ（乾燥重量）当たりのカルシウムをμｇで表わした。これらのデータの要約が、表４に示されている。

石灰化軽減に対する新しいプロセスの有効性は、表４で容易に明らかなところである。処置した組織のカルシウムのレベルは、非固定組織に通常存在するレベルに比肩し得るものであったのであり、それゆえ、標準的なグルタルアルデヒド固定化のみの場合に比較してこの新しいプロセスが優れていることを例証するものである。
［実施例６］

羊についての追加石灰化実験

追加の動物実験においては、実施例１で述べたように０．６２５％の緩衝化したグルタルアルデヒドで固定したカンガルーの弁付き大動脈導管（処置組織）が、実施例１で述べたように抽出した弁大動脈根（非処置組織）と比較された。この大動脈根は、０．９％の生理食塩水で５分間洗い流され、その後幼い（生後４ヵ月）メリノドーセット交雑種羊の肺動脈の位置に外科的に移植された。これらの弁付き移植片は、２００日後に取り外され、弁尖組織および大動脈壁組織のカルシウム含有量が、上述したように原子吸光分光光度計で測定された。

結果（乾燥組織１ｍｇ当たりのμｇ単位のカルシウム）の要約が、表５に示されている。

［実施例８］

豚由来組織のさらなる石灰化実験

さらなる動物実験として、０．６２５％の緩衝化したグルタルアルデヒドで固定した非処置のブタの弁付き大動脈導管（非処置組織）が、実施例１で述べた方法に従って処理されたブタの弁付き大動脈導管（処置組織）と比較された。ブタの弁付き大動脈導管は、０．９％の生理食塩水で５分間洗い流され、その後幼い（生後４ヵ月）メリノドーセット交雑種羊の肺動脈の位置に外科的に移植された。これらの弁付き移植片は、２００日後に取り外され、弁尖組織および大動脈壁組織のカルシウム含有量が、上述したように原子吸光分光光度計で測定された。

結果（乾燥組織１ｍｇ当たりのμｇ単位のカルシウム）の要約が、表６に示されている。

［実施例８］

ウシの心膜の石灰化

さらなる動物実験として、０．６２５％の緩衝化したグルタルアルデヒドで固定したウシの心膜（対照心膜）の石灰化可能性が、実施例１で述べた方法に従って処理されたウシの心膜（処置心膜）の石灰化可能性と比較された。各グループの典型的な試料は、１×１ｃｍの大きさにカットされ、０．９％の生理食塩水で５分間洗い流された。これらの試料は、大人（生後６週間）のウィスター系ラットの背側壁中央部に形成された皮下ポケットに外科的に移植された。これらの組織は、６０日後に取り外され、宿主組織が除去され、それからカルシウム含有量が、上述したように原子吸光分光光度計で測定された。結果（乾燥組織１ｍｇ当たりのμｇ単位のカルシウム）の要約が表７に示されている。

［実施例１０］

非細胞化カンガルー心膜の石灰化

別の動物実験として、０．６２５％の緩衝化したグルタルアルデヒドで固定したカンガルーの心膜（対照心膜）の石灰化可能性が、実施例１で述べた方法に従って非細胞化され処理されたカンガルーの心膜（処置心膜）の石灰化可能性と比較された。

各グループの代表試料は、１×１ｃｍの大きさにカットされ、０．９％の生理食塩水で５分間洗い流された。これらの試料は、大人（生後６週間）のウィスター系ラットの背側壁中央部に形成された皮下ポケットに外科的に移植された。これらの組織は、６０日後に取り外され、宿主組織が除去され、それからカルシウム含有量が、上述したように原子吸光分光光度計で測定された。結果（乾燥組織１ｍｇ当たりのμｇ単位のカルシウム）の要約が、表８に示されている。

［実施例１１］

非細胞化カンガルー心膜の再細胞化

６番目の動物実験では、０．６２５％の緩衝化したグルタルアルデヒドで固定したカンガルーの非細胞化心膜（対照心膜）の再細胞化可能性が、実施例１で述べた方法に従って処理されたカンガルーの非細胞化心膜（処置心膜）の再細胞化可能性と比較された。カンガルーの心膜は、０．２５％のトリトンＸ１００および０．２５％のドデシル硫酸ナトリウム中で、室温にて２４時間にわたって非細胞化された。各グループの心膜の供試試料（ｎ＝５）は、２×２ｃｍの大きさにカットされ、０．９％の生理食塩水で５分間洗い流された。これらの試料には、３．０×１０^５／ｃｍ^２のヒト線維芽細胞が無菌下で播種された。播種された心膜は、標準的な静止細胞培養状態で３７℃にて２１日間培養された。細胞成長は、７日毎に顕微鏡により評価され、次に示す目視基準に従って分類された。１）基質表面には成長している線維芽細胞が存在しない。２）基質表面の５０％未満が線維芽細胞で覆われている（＋）。３）基質表面の５０％超が線維芽細胞で覆われている（＋＋）。４）基質表面全体が線維芽細胞の複数の層で覆われている（＋＋＋）。

迅速比色分析法として、ＭＴＴ（３‐［４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐ｙｌ］−２，５‐ジフェニルテルトラゾリウム臭化物）試験が２１日目に行われ、対照心膜には成長線維芽細胞が存在しないこと、および処置心膜には成長線維芽細胞が存在することが確認された（ＭＴＴ法については、たとえば、ズントその他著Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ．１９９９年、１５（４）、５１９頁〜５２４頁参照）。結果の要約が、表９に示されている。

［実施例１２］

カンガルー組織の架橋安定性

２種類のカンガルーの組織、大動脈壁組織およびカンガルーの心膜が、実施例１に概要を示した手順に従ってステップ（ｂ）に至るまでステップ（ｂ）を含め処置された、すなわち、アルコール溶液前処理後に、グルタルアルデヒド架橋を行った。これらの処置組織は、グルタルアルデヒドで固定した組織、すなわち、アルコール前処理をしていない組織ならびに「そのままの新鮮な」組織と比較された。図１および図２は、心膜の架橋安定性（図１）と、大動脈壁組織の架橋安定性（図２）を示す。図から、エタノールの前処理が、〜８５℃ないし８６℃と架橋安定性に大幅な作用を及ぼしていることが見て取れる。これらのデータは、表１０でも見ることができる。

［実施例１３］

皮下ラットモデルにおける架橋安定性と石灰化の挙動

本実験は、ブタの組織（カスプと壁）の架橋安定性と石灰化の挙動について、実施例１に開示された方法で処置した場合と、グルタルアルデヒドで固定した対照組織と、市販のフリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標））生物義装具組織と、市販のプリマプラス（ＰｒｉｍａＰｌｕｓ（登録商標））生物義装具組織とが比較された。

新鮮なブタの弁付き大動脈根が採取され、４℃のリン酸緩衝剤入生理食塩水（ＰＢＳ、０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中にて運ばれた。代表する大動脈弁カスプ（ｎ＝３０）および大動脈壁試料（ｎ＝３０、１０ｍｍ×１５ｍｍ）が大動脈根から取り出され、２グループに分けられた。グループIは、代表弁カスプ（ｎ＝１５）および代表大動脈壁試料（ｎ＝１５、１０ｍｍ×１５ｍｍ）を含み、０．２５％の緩衝化したグルタルアルデヒド中で保存された。グループIIは、代表弁カスプ（ｎ＝１５）および代表大動脈壁試料（ｎ＝１５、１０ｍｍ×１５ｍｍ）を含み、実施例１に開示された方法で曝露され、０．２５％の緩衝化したグルタルアルデヒド中で保存された。比較のため、グループIIIを、フリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標））生物義装具組織の弁カスプ（ｎ＝１５）および大動脈壁試料（ｎ＝１５、１０ｍｍ×１５ｍｍ）と、プリマプラス（ＰｒｉｍａＰｌｕｓ（登録商標））生物義装具組織の弁カスプ（ｎ＝１５）および大動脈壁試料（ｎ＝１５、１０ｍｍ×１５ｍｍ）とで構成した。

組織のコラーゲン架橋安定性を評価するために収縮温度測定法が用いられた（レビその他著、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９８６年、１２２巻、７１〜８２ページ）。各グループのカスプと大動脈壁試料組織条片（５×１０ｍｍ、ｎ＝１０）が、等力変換器（オーストラリア所在ＡＤインストルメンツ製ＭＬＴ０５００）に取り付けられ、パワーラブ（ＰｏｗｅｒＬａｂ）データ収集システムおよびデスクトップパソコンにインタフェースされた。

試料は、９０±５ｇの荷重で常時伸長されたままにされ、０．９％の生理食塩水で満たされ、温度が管理されている開放型水槽に浸された。水槽の温度は、約１．５℃／ｍｉｎの速度で、２５℃から９５℃まで徐々に上げられた。収縮温度は、コラーゲン材料が変性したときの常時伸張からの急激な偏位点で示された。

カスプおよび大動脈壁の収縮温度は、表１に記載されている。対照と、実施例１の試験手順（「試験」）と、フリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標））と、プリマプラス（ＰｒｉｍａＰｌｕｓ（登録商標））それぞれのカスプ間には有意差は認められなかった。試験手順で処置した大動脈壁組織は、対照、フリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標））、およびプリマプラス（ＰｒｉｍａＰｌｕｓ（登録商標））それぞれの大動脈壁組織に比して、大幅に高い（ｐ＜０．０５）収縮温度を示した。
弁カスプおよび大動脈壁組織の収縮温度（℃）

（１グループに付きｎ＝１０）
値は平均値±標準誤差
^＊ｐ＜０．０５（試験対対照、フリースタイル、プリマプラス）

対タンパク酵素消化抵抗力は、ジラルドとジラルドの方法に基づくものである（Ｊ．Ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅ Ｄｉｓ．、１９９６年、１２２巻７１頁〜８２頁）。１０ｍｇのプロナーゼＥ（ストレプトミセスグリゼウスのタイプＸＩＶ、シグマ製）および１００ｍｇの塩化カルシウムを、グリシンを０．１Ｍ含む２００ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝化溶液（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させたプロナーゼ溶液が用意された。固定した組織試料は、脱イオン水で３分間洗い流され、拭き取られ、７０℃で一晩乾燥され、それから計量された。これらの試料は、５０℃のプロナーゼ溶液中で２４時間培養された。残っている組織試料は、脱イオン水で洗い流され、７０℃で一晩乾燥され、それから計量された。対プロナーゼ消化抵抗力は、残っている組織の質量によって決定され、消化前組織質量との割合で表わされた。

対酵素分解抵抗力を図３に示す。試験手順、フリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標））、およびプリマプラス（ＰｒｉｍａＰｌｕｓ（登録商標））それぞれのカスプ組織は、対タンパク分解抵抗力においては、対照に比して大幅に（ｐ＜０．０００１）上昇した（図３Ａ）。試験手順、フリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標））、およびプリマプラス（ＰｒｉｍａＰｌｕｓ（登録商標））それぞれのカスプ組織間には、有意差は見られない。

試験手順で処置した大動脈壁組織は、対照組織と同程度の対タンパク分解抵抗力（ｐ＝ＮＳ）を示し、フリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標））、およびプリマプラス（ＰｒｉｍａＰｌｕｓ（登録商標））それぞれの壁組織に比して大幅に高い（ｐ＜０．０１）抵抗力を示した（図３Ｂ）。

若いオスのウィスター系ラット（体重１５０〜２００ｇ）が２グループに分けられた。第１グループ（ｎ＝１０）にはカスプが移植され、第２グループ（ｎ＝１０）には大動脈壁が移植された。動物１匹につき、各４グループの組織のうちの１個の試料が移植され、合計８０の移植が行われた。

ラットはペントバルビタール（ネムブタル（Ｎｅｍｂｕｔａｌ（登録商標））、４５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔された。背部の筋領域の毛が剃られ、１５％の希グルコン酸クロルヘキシジン（西オーストラリアパース所在ＩＣＩ薬剤製)とエタノール（西オーストラリアパース所在メルク化学製）で消毒された。

移植片は、脱イオン水で２分間徹底的に洗い流されて、固着性のものが除去され、その後、２．５ｃｍの切開部を通して背中の筋肉壁の皮下袋に移植された。切開部は、５‐０プロレーン縫合糸で閉じた。

ラットは、８週間後、バルビツール酸（ユーセナーゼ（Ｅｕｔｈｅｎａｓｅ（登録商標）））の過量投与により死亡し、皮下移植片を含む背部筋肉壁が取り出されて、定量的および定性的組織カルシウム分析に供せられた。回収された各試料は、解剖学的に対称な２分の１ずつに分割された。片方の２分の１には原子吸光分光分析法が適用され、他方の２分の１は、１０％の緩衝化ホルムアルデヒドで固定され組織学用に処理された。

固定した試料は、パラフィンワックスに埋め込まれ、３μｍ間隔で区切られ、それからフォンコッサカルシウム検出法により定量的なカルシウム分析が行われた。組織学的な検査が、オリンパス製ＢＨＳ光学光学顕微鏡を用いて実施された。

全グループの外植試料が、周囲の宿主組織から切除分離され、９０℃のバイオサーム培養器（西オーストラリア州パース所在セルビーサイエンテフィック製）内で４８時間乾燥された。乾燥試料は軽量され、その含有カルシウムが、７５℃の６Ｎ超高純度塩酸（西オーストラリア州パース所在のマーク製）５．０ｍｌで２４時間にわたって抽出された。抽出可能なカルシウム含有量が原子吸光分光光度計（バリアン製ＡＡ１２７５）を使って測定され、組織１ｍｇ（乾燥重量）当たりのカルシウムをμｇで表わされた。

組織学的な検査は、外植された対照試料に激しい内因性の石灰化が存在していることを示していた（データは示さず）。ＡＤＡＰＴ、フリースタイル、ないしはプリマプラスの弁カスプには、目視可能な石灰化は認められなかった（データは示さず）。

外植した大動脈壁組織は、対照試料では、媒体にいくつか石灰化した箇所があった（データは示さず）。外植した試験大動脈壁組織には、目視可能な石灰化は認められなかった（データは示さず）。外植したフリースタイル大動脈壁組織および外植したプリマプラス大動脈壁組織では、媒体の穏やかな石灰化が認められた（それぞれのデータは示さず）。

外植したカスプの定量的な組織カルシウムレベルを図４Ａに示す。グルタルアルデヒドのみで固定された対照試料は、このモデルでは、最も高いレベルのカルシウムを示した（９２．３７±７．９μｇ／ｍｇ）。実施例１の方法により処置された組織のカルシウムレベルは、組織１ｍｇ当たり２．０９±０．２２μｇ／ｍｇであったが、フリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標））は２．０３±０．２９μｇ／ｍｇ、プリマプラス（ＰｒｉｍａＰｌｕｓ（登録商標））は１．５４±０．１７μｇ／ｍｇであった。このことは、処置組織は、対照試料に比し大幅にカルシウムレベルを低減（ｐ＜０．００１）したことを意味している。実施例１とフリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標））とプリマプラス（ＰｒｉｍａＰｌｕｓ（登録商標））の組織カルシウムレベル間には有意差が見られない。

外植した大動脈壁試料の定量的な組織カルシウムレベルを図４Ｂに示す。実施例１の方法により処置された大動脈壁試料のカルシウム含有量（組織１ｍｇ当たり４．８６±０．１２μｇ／ｍｇ）は、対照試料のそれ（組織１ｍｇ当たり１２０．１１±７．４８μｇ／ｍｇ）よりも大幅（ｐ＜０．００１）に低い（９５．９％も低い）。フリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標））とプリマプラス（ＰｒｉｍａＰｌｕｓ（登録商標））の大動脈壁試料は、それぞれ石灰化が４７．８％および５１．９５％も低減していることを示した。

これらのデータは、実施例１で開示された方法が、皮下ラットモデルにおいては、ブタのカプスおよび壁組織双方の石灰化を低減するのに効果があることを示唆している。また、これらのデータは、促進された架橋が、大動脈壁の石灰化を最小限に抑える上で重要な役割を果たしていることを示唆している。

カンガルーの心膜組織を示す図で、アルコールで前処理後グルタルアルデヒド固定化組織を、アルコールで前処理なしのグルタルアルデヒド固定化組織と、『新鮮』組織と比較して示す。 カンガルーの大動脈組織を示す図で、アルコールで前処理後グルタルアルデヒド固定化組織を、アルコールでの前処理なしのグルタルアルデヒド固定化組織と、『新鮮』組織と比較して示す。 図（Ａ）はブタの弁尖組織の酵素分解耐性を、図（Ｂ）は、ブタの大動脈壁組織のそれを示す。 ラットモデルの皮下における８週間後の外殖されたブタの弁尖組織の定量的なカルシウムレベルを（Ａ）に、ブタの大動脈壁組織のそれを（Ｂ）に示す

Claims (80)

1. 移植可能なバイオマテリアルを作製する方法であって、
   （ａ）バイオマテリアルをアルコール含有溶液に少なくとも２４時間曝露するステップ
   を有する方法。
2. 抗石灰化バイオマテリアルを作製するためのコラーゲンを含むバイオマテリアルを処置する方法であって、
   （ａ）バイオマテリアルをアルコール含有溶液に少なくとも２４時間曝露するステップ
   を有する方法。
3. 前記方法がさらに、
   （ｂ）ステップ（ａ）において前記バイオマテリアルを架橋剤に曝露するステップと、
   （ｃ）ステップ（ｂ）において前記バイオマテリアルを酸性溶液に曝露するステップと、
   を有し、ステップ（ｂ）と（ｃ）を、ステップ（ａ）の後に順次行う請求項１または２に記載の方法。
4. 移植可能なバイオマテリアルを作製する方法であって、
   （ａ）バイオマテリアルをアルコール含有溶液に曝露するステップと、
   （ｂ）ステップ（ａ）において前記バイオマテリアルを架橋剤に曝露するステップと、
   （ｃ）ステップ（ｂ）において前記バイオマテリアルを酸性溶液に曝露するステップと、
   を有し、ステップ（ｂ）と（ｃ）を、ステップ（ａ）の後に順次行う方法。
5. 抗石灰化バイオマテリアルを作製するためにコラーゲンを含むバイオマテリアルを処置する方法であって、
   （ａ）バイオマテリアルを、アルコール含有溶液に曝露するステップと、
   （ｂ）ステップ（ａ）において前記バイオマテリアルを架橋剤に曝露するステップと、
   （ｃ）ステップ（ｂ）において前記バイオマテリアルを酸性溶液に曝露するステップと、
   を有し、ステップ（ｂ）と（ｃ）は、ステップ（ａ）の後に順次行う方法。
6. さらに、ステップ（ａ）と（ｂ）との間、およびステップ（ｂ）と（ｃ）との間の両方、またはいずれか一方で洗い流すステップを有する請求項３ないし５のいずれかに記載の方法。
7. さらに、ステップ（ｃ）の後に洗い流すステップを有する請求項３ないし５のいずれかに記載の方法
8. 前記バイオマテリアルを洗い流すステップが、無りんの０．９％生理食塩水を使って実施される請求項７に記載の方法
9. 前記バイオマテリアルがコラーゲンを有する請求項１ないし８のいずれかに記載の方法
10. 前記バイオマテリアルが動物から摘出されたものである請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
11. 前記動物が、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタおよびヒトからなるグループから選択されたものである請求項１０に記載の方法。
12. 前記バイオマテリアルが培養組織であり、動物または再生組織から得られた細胞外基質を含むプロテーゼである請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
13. 前記バイオマテリアルが、心血管組織、骨盤底組織、心臓組織、心臓弁、大動脈根、大動脈壁、大動脈尖、心膜組織、結合組織、軟質臓器基質または固形臓器基質、硬膜、皮膚組織、血管組織、硬膜軟骨、心膜、靱帯、腱、血管、臍組織、骨組織、筋膜、および、粘膜下組織もしくは皮膚からなるグループから選択された細胞組織である請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。
14. ステップ（ａ）で用いられる前記アルコール含有溶液が、１種類以上の水溶性アルコールを有するものである請求項１ないし１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記水溶性アルコールがC₁-C₆低級アルコールである請求項１４に記載の方法。
16. 前記C₁-C₆低級アルコールが、メタノール、エタノール、シクロヘキサノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、イソブタノール、２‐ブタノールおよび第三ブタノールあるいはこれらの組み合わせからなるグループから選択されたものである請求項１５に記載の方法。
17. 前記アルコール含有溶液が、非緩衝化水性溶媒中に１００％未満のアルコールを有するものである請求項１ないし１６のいずれかに記載の方法。
18. ステップ（ａ）が少なくとも２４時間にわたって実行される請求項３ないし１７のいずれかに記載の方法。
19. ステップ（ａ）が少なくとも３６時間にわたって実行される請求項１ないし１７のいずれかに記載の方法。
20. ステップ（ａ）が少なくとも４８時間にわたって実行される請求項１ないし１７のいずれかに記載の方法。
21. 前記架橋剤が、カルボジイミド、ポリエポキシエーテル、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ゲニピン、ポリアルデヒド、およびジフェニルホソホリルアジド（ＤＰＰＡ）、またはこれらの組み合わせからなるグループから選択されたものである請求項３ないし２０のいずれかに記載の方法。
22. 前記ポリアルデヒドがグルタルアルデヒドである請求項２１に記載の方法。
23. さらに、ステップ（ｃ）の後に、滅菌のステップを有する請求項３ないし２２のいずれかに記載の方法。
24. 前記各ステップが、２℃から４０℃の間の温度で実行される請求項１ないし２３のいずれかに記載の方法。
25. 前記温度が４℃から３０℃の間にある請求項２４に記載の方法。
26. 前記温度が５℃から２５℃の間にある請求項２４に記載の方法。
27. 前記酸性溶液が、ステップ（ｂ）の後の前記バイオマテリアルに存在する固定された架橋剤成分および固定されていない架橋剤成分の両方、またはいずれか一方の不活性化および変更の両方、またはどちらか一方を行い得る酸を含む請求項３ないし２６のいずれかに記載の方法。
28. 前記酸性溶液が、コラーゲン上の活性化カルボキシル基およびアミン基を架橋結合しアミド結合を形成することが可能な酸を含む請求項３ないし２６のいずれかに記載の方法。
29. ステップ（ｃ）で用いられる前記酸性溶液が、アミノカルボン酸を含むものである請求項３ないし２６のいずれかに記載の方法。
30. 前記アミノカルボン酸が、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ‐アルギニン、Ｌ‐リジン、Ｌ‐グルタミン酸およびＬ‐アスパラギン酸からなるグループから選択されたものである請求項２９に記載の方法。
31. 前記アルコール含有溶液、前記架橋剤、および前記酸性溶液にはすべて緩衝剤非含有である請求項１ないし３０のいずれかに記載の方法。
32. ステップ（ｃ）がステップ（ｄ）により交換されるか、またはステップ（ｄ）により補完され、前記ステップ（ｄ）が、前記ステップ（ｂ）において前記材料を一つ以上の多価カチオンを含む緩衝剤非含有溶液に曝露することを有するものである請求項３ないし３１のいずれかに記載の方法。
33. 前記多価カチオンが、マグネシウム、第二鉄塩およびアルミニウム塩からなるグループから選択される請求項３２に記載の方法。
34. 請求項１ないし３３のいずれかに記載の方法により作製される抗石灰化バイオマテリアル。
35. 架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルであって、前記バイオマテリアル１ｍｇ当たり約５０μｇ未満のカルシウムを含有し、さらに前記バイオマテリアル１ｍｇあたりのカルシウム含有量を５０μｇよりも増加させることのない少なくとも２００日間は移植が可能であるバイオマテリアル。
36. 移植前の前記バイオマテリアルが、バイオマテリアル１ｍｇ当たり約２０μｇ未満のカルシウムを有する請求項３５に記載の抗石灰化バイオマテリアル。
37. 移植前の前記バイオマテリアルが、バイオマテリアル１ｍｇ当たり約１０μｇ未満のカルシウムを有する請求項３５に記載の抗石灰化バイオマテリアル。
38. 請求項３４ないし３７のいずれかに記載の抗石灰化バイオマテリアルを有する移植可能な生体デバイス。
39. 前記バイオマテリアルが前記デバイスの表面上にコーティングされた請求項３８に記載の生体デバイス。
40. さらに少なくとも第二のコーティングを有する請求項３８または３９に記載の生体デバイス。
41. 前記の少なくとも第二のコーティングが、抗菌薬または抗ウイルス薬または抗真菌薬または増殖因子または抗脱水薬または消毒薬を有するものである請求項４０に記載の生体デバイス。
42. 前記抗菌薬が、イソニアジド、エタンブトール、ピラジナミド、ストレプトマイシン、クロファジミン、リファブチン、フルオロキノロン類、オフロキサシン、スパルフロキサシン、リファンピシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ダプソーン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アンピシリン、アムホテリシンＢ、ケトコナゾール、フルコナゾール、ピリメタミン、スルファジアジン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ペンタミジン、アトバクオン、パロモマイシン、ジクラザリル、アシクロビル、トリフルオロウリジン、ホスカルネット、ペニシリン、ゲンタマイシン、ガンシクロビル、イアトロコナゾール、ミコナゾール、ジンクピリチオン、金と白金と銀と亜鉛と銅とを含むがこれらには限定されない重金属、および塩化物と臭化物とヨウ化物と過ヨウ素酸塩などの塩類、および担体付き複合体を含む以上のものの複合形態のもの、およびその他の形態から成るグループから選択される請求項４１に記載の生体デバイス。
43. 前記増殖因子薬が、ヒドロキシアパタイト、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１および２（ＩＧＦ‐１およびＩＧＦ‐２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、トランスフォーミング増殖因αおよびβ（ＴＧＦ‐αおよびＴＧＦ‐β）インターロイキン‐８（ＩＬ‐８）、そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、さらにインターロイキン類、およびインターフェロン類から成るグループから選択される請求項４１に記載の生体デバイス。
44. 前記の少なくとも第二のコーティングがさらに、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸‐−ポリグリコール酸共重合体、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリペプチド類, 、ポリカーボネート類、ポリヒドロキシ酪酸塩、ポリ（アルキレンシュウ酸塩）、酢酸ビニル類の不飽和カルボン酸類との共重合体、水溶性もしくは水分散性セルロース誘導体類、エチレンオキシド重合体類、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ゼラチン、ポリ（オルトエステル）、アミノ酸ポリアミド類、ポリビニルアルコール、ポリビニル・ピロリドン、ポリエーテルエーテルケトン、リン酸三カルシウム、およびこれらの混合物から成るグループから選択された生体吸収性材料を有する請求項４０に記載の生体デバイス。
45. 前記生体デバイスが、人工心臓、内蔵型または外置型心臓補助装置、心臓弁プロテーゼ、弁形成リング、皮膚移植片、血管移植片、血管ステント、構造用ステント、血管短絡、心血管短絡、硬膜移植片、軟骨移植片、軟骨移植、心膜移植片、靱帯プロテーゼ、腱プロテーゼ、膀胱プロテーゼ、綿球、縫合糸、永久体内留置型経皮装置、手術用パッチ、心血管ステント、被覆ステント、および被覆カテーテルから成るグループから選択された生体デバイスである請求項３８ないし４４のいずれかに記載の生体デバイス。
46. 前記生体デバイスが、心臓弁プロテーゼである請求項４５に記載の生体デバイス。
47. 前記生体デバイスがさらに組織断片を有する請求項３８ないし４６のいずれかに記載の生体デバイス。
48. 前記組織断片が動物から採取されたものである請求項４７に記載の生体デバイス。
49. 前記動物が、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、シカおよびカンガルーからなるグループから選択されたものである請求項４８に記載の生体デバイス。
50. 前記生体デバイスがさらに組織の合成類似体を有する請求項３８ないし４９のいずれかに記載の生体デバイス。
51. 前記組織断片が複数の細胞を有し、手術部位における移植で、前記複数の細胞の少なくとも一部が、前記組織断片から移動し、増殖して、移植部位における周囲組織と一体化する請求項４８ないし５０のいずれかに記載のデバイス。
52. 生体適合性移植片であって、架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルを有する生体適合性骨格を有し、前記バイオマテリアルが、バイオマテリアル１ｍｇ当たり約５０μｇ未満のカルシウム含有量を有し、かつ前記バイオマテリアルが、そのカルシウム含有量をバイオマテリアル１ｍｇ当たり約５０μｇ超まで増加させることのない、少なくとも２００日間は移植可能である生体適合性移植片。
53. 移植前の前記バイオマテリアルが、バイオマテリアル１ｍｇ当たり約２０μｇ未満のカルシウム含有量を有する請求項５２に記載の生体適合性移植片。
54. 移植前の前記バイオマテリアルが、バイオマテリアル１ｍｇ当たり約１０μｇ未満のカルシウム含有量を有する請求項５２に記載の生体適合性移植片。
55. 生体適合性移植片であって、架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルを有する生体適合性骨格を有し、前記コラーゲンが合成ポリマーを有する生体適合性移植片。
56. 前記骨格がさらに、合成ポリマー、天然ポリマー、注射可能ゲル、セラミック材料、自己生成組織、同種異系組織、異種組織、およびそれらの組み合わせを有する請求項５５に記載の生体適合性移植片。
57. 組織傷害修復用キットであって、
    （ａ）請求項３８ないし５１のいずれかに記載の一つ以上の生体デバイスもしくは請求項５２ないし５６のいずれかに記載の一つの移植片を収めた滅菌容器と、
    （ｂ）傷害対象についての説明書と、
    を有する組織傷害修復用キット。
58. 前記キットがさらに、
    （ｃ）傷害対象からの少なくとも一つの生存組織試料を収集するための採取用具と、
    を有する請求項５７に記載のキット。
59. 前記キットがさらに、前記の少なくとも一つの組織試料の生存能を維持するための少なくとも一つの試薬を有する請求項５８に記載のキット。
60. 前記採取用具がさらに、無菌状態で、前記の組織試料から少なくとも一個の組織断片を分割するための処理用具を有する請求項５８に記載のキット。
61. 生きている組織の処置方法であって、
    （ａ）請求項３４に記載の抗石灰化バイオマテリアルを提供するステップと、
    （ｂ）処置が必要な患者に前記バイオマテリアルを移植するステップと、
    を有する処置方法。
62. 前記抗石灰化バイオマテリアルが、医用デバイスの中または上に組み込まれている請求項６１に記載の方法。
63. さらに、処置される患者の体内の所望の位置に前記抗石灰化バイオマテリアルを取り付けるステップを有する請求項６１または６２に記載の方法。
64. 前記の組織処置法が、組織修復、組織膨化、美容整形術、処置上の処置、組織増強、および組織封着からなるグループから選択された組織処置技法である請求項６１ないし６３のいずれかに記載の方法。
65. 架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルを有する創傷被覆材であって、前記コラーゲンが合成ポリマーを有する創傷被覆材。
66. 前記抗石灰化バイオマテリアルが架橋前にアルコールに曝露されたものである請求項６５に記載の創傷被覆材。
67. 前記アルコールが、C₁-C₆低級アルコールである請求項６６に記載の創傷被覆材。
68. 前記C₁-C₆低級アルコールが、メタノール、エタノール、シクロヘキサノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、イソブタノール、２‐ブタノールおよび第三ブタノールからなるグループから選択されたものである請求項６７に記載の創傷被覆材。
69. 前記架橋剤が、カルボジイミド、ポリエポキシエ−テル、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ゲニピン、ポリアルデヒド、およびジフェニルホソホリルアジド（ＤＰＰＡ）からなるグループから選択されたものである請求項６５ないし６８のいずれかに記載の創傷被覆材。
70. 前記ポリアルデヒドがグルタルアルデヒドである請求項６９に記載の創傷被覆材。
71. 前記バイオマテリアルが、ヒツジコラーゲン、ウシコラーゲン、ヤギコラーゲン、ウマコラーゲン、ブタコラーゲン、有袋類コラーゲンおよびヒトコラーゲンからなるグループから選択されたものである請求項６５ないし７０のいずれかに記載の創傷被覆材。
72. 前記創傷被覆材がさらに、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘキスロニルヘキソサミノグリカン硫酸、イノシトールヘキササルフェート、およびスクロースオクタサルフェートからなるグループから選択された硫酸化多糖類を有する請求項７１に記載の創傷被覆材。
73. 前記創傷被覆材がさらに、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、増殖因子、抗脱水薬、もしくは消毒薬を有する請求項６５ないし７２のいずれかに記載の創傷被覆材。
74. 前記抗菌薬が、イソニアジド、エタンブトール、ピラジナミド、ストレプトマイシン、クロファジミン、リファブチン、フルオロキノロン類、オフロキサシン、スパルフロキサシン、リファンピシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ダプソーン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アンピシリン、アムホテリシンＢ、ケトコナゾール、フルコナゾール、ピリメタミン、スルファジアジン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ペンタミジン、アトバクオン、パロモマイシン、ジクラザリル、アシクロビル、トリフルオロウリジン、ホスカルネット、ペニシリン、ゲンタマイシン、ガンシクロビル、イアトロコナゾール、ミコナゾール、ジンクピリチオン、金と白金と銀と亜鉛と銅を含むがこられには限定されない重金属、および塩化物、臭化物、ヨウ化物、および過ヨウ素酸塩などの塩類と、担体付き複合体とを含む以上のものの複合形態のもの、および他の形態のものからなるグループから選択されたものである請求項７３に記載の創傷被覆材。
75. 前記増殖因子薬が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１および２（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、インターロイキン‐８（ＩＬ−８）、そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、さらにインターロイキン類、およびインターフェロン類からなるグループから選択されたものである請求項７３に記載の創傷被覆材。
76. 架橋コラーゲンを有する抗石灰化バイオマテリアルであって、前記架橋コラーゲンが合成ポリマーを有する抗石灰化バイオマテリアル。
77. 前記バイオマテリアルが少なくとも５０％のコラーゲンを有するものである請求項７６に記載の抗石灰化バイオマテリアル。
78. 前記バイオマテリアルが少なくとも７０％のコラーゲンを有するものである請求項７７に記載の抗石灰化バイオマテリアル。
79. 前記バイオマテリアルが少なくとも９０％のコラーゲンを有するものである請求項７８に記載の抗石灰化バイオマテリアル。
80. 前記バイオマテリアルが本質的にはコラーゲンからなる請求項７９に記載の抗石灰化バイオマテリアル。

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