KR101636954B1

KR101636954B1 - 재세포화된 바이오 스캐폴드 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101636954B1
Application number: KR1020130133027A
Authority: KR
Inventors: 차상호; 이지현; 송재영; 박용호; 김찬란; 백종호; 우흥명; 박경미
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-11-04
Filing date: 2013-11-04
Publication date: 2016-07-08
Anticipated expiration: 2033-11-04
Also published as: KR20150052413A

Abstract

본 발명은 재세포화된 바이오 스캐폴드 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본발명에 따른 재세포화된 바이오 스캐폴드는 스캐폴드 내의 간암세포의 기능을 유지시키며, 2차원 모델보다 항암제 내성을 갖게 하며, 암세포의 주위 환경을 효과적으로 모사할 수 있어 이를 항암제 스크리닝에 사용할 수 있다.

Description

재세포화된 바이오 스캐폴드 및 이의 제조방법{Recellularized bio scaffold and method for preparing the same}

본 발명은 재세포화된 바이오 스캐폴드 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

간세포암 (HCC;Hepatocellular carcinoma)은 가장 일반적인 악성 간 질환 중 하나이다. 또한, 매년 백만명이 간세포암으로 사망하고 있으며, 암의 종류 중 3번째로 높은 사망률을 보인다. 대부분 간세포암은 50 내지 60 세에 나타나고, 94 %의 사망률을 보인다. 많은 연구자들은 이러한 높은 사망률의 원인으로, 인간 질환 조건을 완벽하게 모사하지 못하는 in vitro 및 in vivo 연구의 제약과 관련이 있다고 생각한다.

한편, 잠재적인 항암제의 효율성을 예측하기 위하여, 2 차원 시스템에서 배양된 인간 암세포를 이용한 in vitro 전임상 연구가 수행된다. 그러나, 이러한 시스템을 이용하는 경우, 임상 3상 결과와 상당한 차이점을 보인다. 이러한 차이점이 생기는 원인으로 in vitro 실험시 사용되는 단층 배양의 경우 2 차원 환경이나 실제로 암이 작용하는 환경은 3차원 환경이기 때문인 것으로 생각된다. 인간 암세포의 3 차원 배양은 다른 항암제의 평가를 위한 모델로 일반적으로 사용된다. 3 차원에서 배양된 암세포는 2 차원 배양된 암세포보다 항암제에 대한 저항성이 일반적으로 높다. 또한, 동물을 이용한 결과는 반드시 인간을 대상으로 임상 결과와 일치하지는 않는다. 따라서, 동물 모델 및 2차원 암세포 배양 모델을 극복할 수 있는 종양의 3차원 환경을 모사할 수 있는 3차원 모델이 요구된다. 따라서, 이러한 in vitro 모델 및 동물모델의 한계를 극복하기 위하여, 간 질환 및 약물의 독성을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 생체 외에서 배양된 간 모델에 대한 요구가 증가되고 있다.

한편, 조직 공학의 한 방법으로서, 탈세포화 (decellularization) 기법을 이용한 바이오 스캐폴드 방법은 1) 세포 구성물이 제거되어 이식시 면역 거부 반응이 최소화되고, 2) 세포 성장과 분화에 관여하는 세포외기질이 보존되고, 3) 혈관 구조가 보존되어 세포 주입 후 산소 및 영양 공급이 가능하고, 원래 장기 그대로의 형태와 구조가 유지되는 장점이 있어, 새로운 3차원 스캐폴드로서의 가능성을 제시하고 있다.

이에 본 발명자들은 항암제의 효능 평가 및 항암제를 스크리닝하기 위한 새로운 모델의 개발을 하던 중, 탈세포화된 간 바이오 스캐폴드에 간암세포를 관류시켜 재세포화 하는 경우, 재세포화된 바이오 스캐폴드 내의 세포는 암세포의 기능을 유지하고, 2차원 모델보다 항암제 내성을 갖고 있음을 확인하여, 상기 바이오 스캐폴드가 암세포의 주위 환경을 모사할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 특허출원번호 1020157029638 대한민국 특허출원번호 1020137028378 대한민국 특허출원번호 1020137008118 대한민국 특허출원번호 1020090018294 대한민국 특허출원번호 1020110032804 대한민국 특허출원번호 1020077017057

본 발명의 목적은 (1) 계면활성제를 동물의 간에 관류시켜 간을 탈세포화 하는 단계; 및

(2) 상기 탈세포화된 간에 간암세포를 관류시켜 간을 재세포화 하는 단계;를 포함하는 재세포화된 바이오 스캐폴드의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의하여 제조된 재세포화된 바이오 스캐폴드를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 스캐폴드에 항암제 후보물질을 투여하는 단계;를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공함에 있다.

본 발명은

(1) 계면활성제를 동물의 간에 관류시켜 간을 탈세포화 하는 단계; 및

(2) 상기 탈세포화된 간에 간암세포를 관류시켜 간을 재세포화 하는 단계;를 포함하는 재세포화된 바이오 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 스캐폴드란, 조직공학 (Tissue engineering)에 사용되는 용어로서, 생체 세포를 안착시켜 세포와 여러 가지 물질들의 조합을 이용한 어떤 구조물을 말하며, 바이오 스캐폴드란 생체 구조물 즉, 생체 장기를 탈세포화 (decellularization)시켜 세포를 제거한 후, 미세구조 및 장기의 윤곽만을 남긴 구조물(주형물)을 말한다.

본 발명의 제 (1)단계는 간을 탈세포화하는 단계로, 상기 계면활성제는 SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase 및 CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propane sulfonate) 등을 포함하며, 바람직하게는 SDS이다. SDS를 이용하는 경우, 0.01 내지 0.5 % (v/v)의 농도를 이용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1 % (v/v)를 이용할 수 있다. 또한, 관류시키는 SDS는 1.0 내지 3 L, 바람직하게는 1.5 내지 2 L일 수 있다.

본 발명에서 계면활성제를 관류시키는 경우, 유속은 1 내지 100 mL/min, 바람직하게는 20 내지 30 mL/min, 더욱 바람직하게는 25 mL/min일 수 있다. 또한 관류 시간은 30 내지 120분, 바람직하게는 60 내지 80분일 수 있다. 또한, 카뉼라를 장기의 혈관에 설치하여 이를 통하여 계면활성제를 관류시킬 수 있다. 또한, 펌프를 이용하여 관류량을 조절할 수 있고, 상기 펌프는 롤러펌프 (roller pump)임이 바람직하다.

본 발명에서 동물은 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 영장류로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 설치류, 더욱 바람직하게는 랫트임이 바람직하다.

또한, 본 발명의 제조 방법에서 (1)단계 전에,

1) 헤파린을 동물에 적용하는 단계;

2) 상기 1)단계의 동물의 문맥을 통하여 헤파린을 포함하는 PBS (phosphate buffered saline)를 동물에 관류시켜 혈액을 제거하는 단계;

3) 상기 2)단계의 동물의 하대 정맥 (inferior vena cava; IVC) 및 상대 정맥 (superior vena cava; SVC)을 절단하고, 상기 문맥을 통하여 동물의 간에 헤파린을 포함하는 PBS를 관류시켜 혈액을 제거하는 단계; 및

4) 상기 3)단계의 동물로부터 간을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 1)단계의 헤파린은 혈액의 응고를 억제하는 작용을 하며, 본 발명에서 헤파린을 처리하는 경우, 100 내지 300 U, 바람직하게는 200 U를 적용할 수 있다.

본 발명에서 적용이란, 침지, 분산, 도포, 코팅, 처리 및 주사하는 것을 포함하는 개념이다.

상기 2)단계 및 3)단계는 혈액을 제거하는 단계로, 문맥을 통하여 10 내지 50 ml의 헤파린을 포함하는 PBS를 동물에 관류시킬 수 있으며, 이 후, 하대정맥 및 상대 정맥을 절단하고, 50 내지 90 mL의 헤파린을 포함하는 PBS를 관류시킬 수 있다. 상기 문맥을 통하여 관류시키는 경우, 카뉼라 (cannula)를 문맥 (portal vein)에 설치하여 이를 이용하여 관류시킬 수 있다.

제 4)단계는 동물로부터 간을 분리하는 단계로, 바이오 스캐폴드의 제조를 위하여 간을 동물로부터 분리한 후, 계면활성제를 관류시켜 탈세포화시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에서 계면 활성제로 간을 (1)단계의 탈세포화시킨 후 (2)단계 전에,

a) PBS를 탈세포화된 간에 관류시켜 계면활성제를 제거하는 단계;

b) 상기 a) 단계의 간에 살균제를 관류시켜 간을 살균하는 단계;

c) 상기 b)단계의 살균된 간에 PBS를 관류시켜 잔여 화학물질을 제거하는 단계;를 포함할 수 있다.

a) 단계는 간을 탈세포화 시킨 후, 이용한 계면활성제를 혈관에서 제거하는 단계로 PBS를 문맥을 통하여 관류시켜 이를 제거할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 40분 동안 PBS를 관류시킬 수 있다.

b) 단계는 간을 살균하는 단계로, 살균제를 1 내지 3시간 동안 관류시켜 간을 살균시킬 수 있으며, 상기 살균제를 에탄올 및 과아세트산(peracetic acid)을 포함하며, 바람직하게는 0.01 내지 0.2 % (v/v)의 과아세트산이다.

c) 단계는 간 스캐폴드에 잔여 화학물질을 제거하는 단계로, PBS를 10분 내지 40분 동안 문맥을 통하여 관류시킬 수 있다.

본 발명의 제 (2)단계는 상기 제 (1)단계에서 탈세포화된 바이오 스캐폴드에 간암세포를 관류시켜 재세포화시키는 단계이다. 상기 (2)단계는 (2-1) 세포 배양액을 간문맥을 통하여 관류시키는 단계;

(2-2) 간세포를 간문맥을 통하여 관류시키는 단계; 및

(2-3) 세포 배양액을 간문맥을 통하여 관류시키는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 (2-1) 단계는 세포를 재세포화시키기 전에 간 스캐폴드에 세포 배양이 가능한 환경을 조성하는 단계로서, 세포 배양액을 1 내지 10 ml/min, 바람직하게는 3 ml/min의 유속으로 간문맥을 통하여 배양액을 10 내지 100분, 바람직하게는 30분동안 관류시킬 수 있다.

상기 (2-2)단계는 간암세포를 간문맥을 통하여 바이오 스캐폴드에 재세포화 시키는 단계로, 50 × 10⁴내지 50 × 10⁸ 바람직하게는50 × 10⁶ 의 간암세포를10 내지 30분, 바람직하게는, 15분 간격으로 1 내지 10번 관류시킬 수 있다. 상기 간암세포는 인간의 간암세포가 바람직하고, 보다 바람직하게는 HepG25 세포일 수 있다.

상기 (2-3) 단계는 간암세포를 재세포화 시킨 후, 세포를 배양하기 위한 세포 배양액을 추가적으로 관류시키는 단계로, 0.1 내지 10 mL/min, 바람직하게는 1 ml/min의 유속으로 재관류 시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 재세포화된 바이오 스캐폴드를 제공한다.

본 발명에서 제조된 바이오 스캐폴드의 세포부착 효율은 88 ± 7% 임을 확인하였고, 재세포화된 세포는 큰 혈관 주위의 실질 부위 (parenchymal regions)에 넓게 퍼져있음을 확인하였으며 (도 3의 B), 재세포화된 세포에서 Ki-67 항체에 대한 양성 세포 숫자가 증가하였고, 알부민의 발현도 높아졌음을 확인하였다 (도 3의 C 및 도 4의 A).

또한, 본 발명의 재세포화된 바이오 스캐폴드 내의 세포의 대사 및 합성 기능을 수행하는 유전자의 발현은, 단층에서 세포 배양한 경우보다 유의적으로 높음을 확인하였고, 종양 특성과 관련된 유전자의 발현이, 단층에서 세포배양을 한 경우보다 유의적으로 높음을 확인하였다(도 4의 B 및 C).

또한, 재세포화된 바이오 스캐폴드 내의 세포의 항암제 내성이 단층에서 세포 배양한 경우보다 높음을 확인하였다 (도 4의 D)

따라서, 본 발명에 따른 재세포화된 바이오 스캐폴드는 스캐폴드 내의 간암세포의 기능을 유지시키며, 2차원 모델보다 항암제 내성을 갖게 하며, 암세포의 주위 환경을 효과적으로 모사할 수 있어 이를 항암제 스크리닝에 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 바이오 스캐폴드에 항암제 후보물질을 투여하는 단계;를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 항암제 후보물질을 바이오 스캐폴드에 투여 후, 바이오 스캐폴드 내의 암세포의 성장을 측정하여 항암제 후보물질의 치료 효능을 결정할 수 있다.

상기 "항암제 후보물질"이란 종양세포 (암세포)의 성장 또는 전이에 대하여 억제 활성을 가지는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 화학물질, 펩타이드, 단백질, 항체 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 후보물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 후보물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입가능하다. 후보물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

상기 항암제 후보물질의 치료 효능의 결정은, 종양의 종류에 따라 관련 유전자의 발현 정도 또는 미세혈관 밀도를 측정하여 항암제 후보물질의 치료 효능을 분석할 수 있다. 상기 관련 유전자는 당업계에 널리 공지되어 있다. 종양세포의 성장 또는 전이는 육안으로 관찰할 수 있고 또는 캘리퍼스와 같은 도구를 이용하여 측정할 수 있다. 종양세포의 추가적인 성장 또는 전이가 억제되는 경우 분석대상의 항암제 후보물질은 항암제로서 효능을 갖는다고 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 재세포화된 바이오 스캐폴드는 스캐폴드 내의 간암세포의 기능을 유지시키며, 2차원 모델보다 항암제 내성을 갖게 하며, 암세포의 주위 환경을 효과적으로 모사할 수 있어 이를 항암제 스크리닝에 사용할 수 있다.

도 1은 탈세포화된 바이오 스캐폴드의 물리적 특성을 나타낸 도이다 (도 1의 A의 (a): 탈세포화 전의 랫트 간; A의 (b): 탈세포화시키는 과정 중의 랫트 간; A의 (c): 탈세포화된 랫트 간; A (d): 탈세포화 전의 랫트 간을 H&E 염색; A의 (e) 탈세포화시키는 과정 중의 랫트 간을 H&E 염색; A의 (f): 탈세포화된 랫트 간의 H&E 염색; B의 (a): 탈세포화 전의 랫트 간의 SEM 이미지; B의 (b):탈세화된 랫트 간의 SEM 이미지; C의 (a): 형광으로 표지된 덱스트란 관류; C의 (b): 트리판 블루 염료 관류)
도 2는 탈세포화된 바이오 스캐폴드의 화학적 특성을 나타낸 도이다 (A: DNA 함량; B: 콜라겐, GAG 및 엘라스틴 함량)
도 3은 본 발명의 재세포화된 바이오 스캐폴드의 세포의 부착, 증식 및 기능유지 확인한 결과이다 (A: 본 발명의 재세포화를 위한 관류 시스템의 모식도; B: 재세포화된 바이오 스캐폴드의 조직 검사; C: 재세포화된 바이오 스캐폴드의 면역 염색 결과; 항-Ki 67 항체 (적색); 항-알부민 항체 (녹색); DAPI (청색)).
도 4는 본 발명의 재세포화된 바이오 스캐폴드의 특성을 평가한 도이다 (A: 재세포화된 바이오 스캐폴드의 알부민 생산능 확인; B 및 C: 대사 및 종양관련 유전자 발현양 확인; D: MTX (methotrexate)의 처리에 따른 재세포화된 바이오 스캐폴드의 저항성 확인)

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 탈세포화된 랫트 간 스캐폴드의 제조 및 특성 확인

1. 탈세화된 랫트 간 스캐폴드의 제조

탈세포화된 간 스캐폴드를 제조하기 위하여, 웅성 Sprague Dawley 랫트 (170 내지 250 g, Samtako Bio Korea Co., Korea)를 사용하였다. 상기 랫트를 음식물 및 물에 자유롭게 접근가능한 조건화된 환경 조건에서 사육하였으며, 모든 동물 실험 절차는 IACUC (Institutional Animal Care and Use Commitee; Kangwon National University, Korea)에 승인을 받은 지침서에 따라 수행하였다. 먼저 상기 랫트를 안락사시킨 후, 200 U의 헤파린 (Chungwae Pharma Co., Korea)을 전신투여 처리하였다. 이 후, 상기 랫트의 문맥에 24 또는 26 게이지 카뉼라를 설치하였다. 이 후, 30 mL의 헤파린이 포함된 PBS로 기관의 혈액을 제거하였다. 하대 정맥 (inferior vena cava) 및 상대 정맥 (superior vena cava)을 절단하고, 간을 70 mL의 헤파린이 포함된 PBS로 남아있는 혈액을 제거하였다. 이 후, 상기 랫트에서 간을 추출하고, 0.1 %의 SDS (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 용액 1.5 내지 2 L를 롤러펌프 (roller pump)를 이용하여 25 ml/min 유속으로 60분 내지 80분을 관류시켰다. 이 후, 상기 간을 PBS로 20분 동안 관류시켜 SDS 용액을 제거하였다. 이 후, 살균을 위하여, 0.1 %의 과아세트 산 (peracetic acid)을 2시간 동안 관류시켰다. 마지막으로, 간 스캐폴드를 PBS로 120분 동안 관류시켜 화학적 잔해물을 제거하여 탈세포화된 랫트 간 스캐폴드를 제조하였다.

2. 탈세포화된 랫트 간 스캐폴드의 특성확인

(1)조직학적 특성평가

탈세포화 전, 탈세포화 과정 중 및 탈세포화 시킨 후의 간 스캐폴드를 10% 완충된 포르말린에 고정시켜 H&E 염색을 수행하였다.

(2) SEM ( Scanning electron microscopy ) 수행

탈세포화된 간 및 신선한 간을 증류수로 세척하고, 차가운 2.5 % 의 글루타르알데하이드로 2시간동안 4 ℃에서 고정한 다음, PBS로 세척하고, 상온에서 에탄올 농도를 점차적으로 높여 탈수시켰다 (30 % 에탄올, 50 % 에탄올, 70 % 에탄올, 90 % 에탄올, 100 % 에탄올; 각각의 농도당 20 내지 30분씩). 상기 시료를 Critical-Point Dryer에 옮겨 CO₂로 건조시켰다. 이 후, 시료를 JSM-5400 스캐닝 전자 현미경 (Jeol, Tokyo, Japan)에 올려놓고, 관찰하였다

(3) 맥관 및 표면 캡슐의 상태 평가

맥관 및 표면 캡슐 (surface capsule)의 완전한 상태 (integrity)를 평가하기 위하여, 100 mg/mL의 형광물질이 결합된 250 kDa 덱스트란 (Sigma-Aldrich, USA)을 문맥을 통하여 주입하고, 형광 광학 현미경으로 이미지를 관찰하였다.

또한, 맥관의 미세구조를 확인하기 위하여, 희석된 트리판 블루 염료를 간으로 관류시켰다.

(4) 결과

상기의 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 0.1 %의 SDS를 이용하여 60분 내지 80분 동안 랫트 간을 관류시킨 경우, 신선한 간의 형태 및 구조를 유지하면서 투명한 하얀색이 나타나는 것을 확인하였다 (도 1 의 A (a) 내지 A (c)). 또한, H&E 염색을 하는 경우, 신선한 간과 비교하여 핵 또는 세포질 잔유물이 제거되었음을 확인하였다 (도 1의 A (d) 내지 A (f)).

또한, 신선한 간 및 탈세포화된 간에 SEM (Scanning electron microscopy) 분석을 수행한 결과, 탈세포화된 간은 세포 물질이 포함하지 않은 우븐 콜라겐 섬유 (woven collagen fibers)의 다공성 망 및 큰 혈관이 보존됨을 확인하였다 (도 1의 B (a) 내지 도 1의 B (b)).

또한, 형광으로 표지된 덱스트란 입자를 형광현미경을 통하여 관찰한 결과, 수많은 가지를 친 맥관 트리를 확인하였고 (도 1의 C (a)), 트리판 블루 염료 (dye)를 문맥을 통해 관류시킨 경우, 표면 캡슐로부터 어떠한 누출 (leakage)도 발견할 수 없었고, 염료는 큰 혈관으로부터 작은 모세혈관으로 흐르는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 혈관 네트워크가 탈세포화 후에도 유지됨을 나타낸다 (도 1의 C (b)).

상기의 결과를 종합하면, 랫트 간을 탈세포화시킨 경우, 신선한 간과 동일한 형태 및 삼차원 구조, 혈관 등을 유지하나, 핵 또는 세포질 잔유물이 제거되어 스캐폴드로 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

3. 탈세포화된 간의 ECM 에 대한 생화학적 분석

ECM (세포외 기질)에 대해 생화학적 분석을 하기 위하여, 탈세포화 전 및 본 발명의 탈세포화 후 스캐폴드의 DNA, GAG(glycoaminoglycan), 콜라겐 및 엘라스틴 함량을 측정하였다. 제조사의 메뉴얼에 따라 DNeasy Blood and Tissue Kit (Quiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였고, NanoDrop2000c (Thermo Scientific)으로 측정하였다.

DNA 잔해물의 크기를 측정하기 위하여, 동등한 양의 추출된 DNA를 0.5 %의 에티디움 브로마이드를 포함하는 1 %의 아가로오즈 젤로 분리하였고, 100 bp의 기준 래더를 이용하여 자외선투과시켜 시각화하였다.

또한, 제조사의 메뉴얼에 따라 Blyscan dimethylmethylene blue dye-binding assay kit 및 Sircol collagen dye-binding assays kits (Biocolor, Carrickfergus, UK) 및 Fastin assay kit를 이용하여 GAG, 콜라겐 및 엘라스틴 양을 측정하였다.

이의 결과를 도 2의 A 내지 B에 나타내었다 (A: DNA 함량; B: GAG, 콜라겐 함량, 엘라스틴 함량).

도 2의 A에 나타난 바와 같이, 신선한 간과 비교하여 본 발명의 탈세포화된 랫트 간은 대략 1 % 미만의 DNA 잔유물이 남아 있음을 확인하였다 (신선한 간: 6616.6 ± 27.83 ng/mg 건조 무게; 탈세포화된 간: 34.51 ± 13.56 ng/mg 건조 무게).

도 2의 B에 나타난 바와 같이, 본 발명의 탈세포화된 간에서는 건조 무게의 5.77 ± 0.69 μg/mg의 GAG를 포함하고 있지만, 신선한 간에서는 건조 무게의 3.99 ± 0.13 μg/mg의 GAG를 포함하고 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 탈세포화된 간에서는 건조 무게의 19.34 % ± 1.33 μg/mg의 콜라겐을 포함하고 있고, 신선한 간에서는 건조 무게의 16.56 ± 0.83 μg/mg를 포함하고 있어 탈세포화된 간이 콜라겐을 높은 함량으로 포함하고 있음을 확인하였다.

이에 반해, 본 발명의 탈세포화된 간에서는 건조 무게의 205.24 ± 19.36 μg/mg의 엘라스틴을 포함하고 있고, 신선한 간에서는 건조 무게의 381.94 ± 16.42 μg/mg의 엘라스틴을 포함하고 있어 탈세포화된 간이 엘라스틴을 낮은 함량으로 포함하고 있음을 확인하였다.

상기의 결과는 본 발명의 탈세포화된 간의 경우, 세포질 단백질의 제거 효율이 높음을 나타내는 결과이며, GAG 및 콜라겐은 스캐폴드의 대생물 작용 (bioactivity)을 반영할 수 있음을 나타낸다.

실시예 2. HepG2 세포를 탈세포화된 간에 재세포화

1. HepG2 세포 배양

인간의 HepG2 세포를 1 %(w/v)의 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 10 % (w/v)의 FBS (fetal calf serum)가 포함된 DMEM (Dulbecco`s modified Eagle`s medium; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. 상기 세포를 5 %의 CO₂가 포함된 37 ℃의 배양기에서 배양하였고, 매 7 내지 10일마다 계대배양하였다. 트립신/EDTA 용액을 이용하여 콘플루엔트 (cofluent) 배양 접시로부터 세포 부유물을 수득하였다. 이 후, 혈구계수기 (hematocytometer)를 이용하여 세포 농도를 결정하였다.

2. 생체반응기 설계 ( Bioreactor design ) 및 재세포화

우선, 500 mL의 유리병을 여성 루어 쓰레드-스타일 패널 (female Luer thread-style panel)에 알맞은 뚜껑을 덮었다. 상기 뚜껑에 간문맥을 위한 카뉼라, 공기 여과 및 배양액의 순환을 위한 세개의 구멍을 만들었다 (도 3의 a 참조). 연동성 펌프를 이용하여 3 ml/min의 유속으로 유리병에 매달린 스캐폴드의 간문맥을 통하여 배양액을 순환 및 관류시켰다. 배양액을 30분 동안 관류시킨 후, 50 × 10⁶ 의 HepG2 세포를 15분 간격으로 3 번 순환시켰다. 25 ℃에서 세포 배양액을 1 ml/min의 유속으로 재순환시켰다. 60분 후, 관류액을 수집하고, 간에 재세포화되지 않은 세포의 숫자를 혈구계수기를 통하여 결정하였다. 세포를 재세포화한 후, 탈세포화된 간에 존재하는 총 세포숫자를 초기 접종된 세포 및 관류액에서 발견된 세포의 숫자의 차이를 비교하여 계산하였다. 이 후, 생체반응기를 세포가 탈세포화된 간에 부착되도록 한시간동안 배양기에 보관하였다. 한시간 후, 3-4 mL/min의 유속으로 배양액을 스캐폴드에 순환시켰다. 생체반응기를 배양기에 10일 동안 보관하였다. 이 후, 간 매트릭스를 관류시스템에서 제거하여, 재세포화된 간 바이오 스캐폴드를 제조하였다.

실시예 3. 간암세포로 재세포화된 바이오 스캐폴드의 특성 확인

1. 재세포화된 바이오 스캐폴드에서 세포의 부착, 증식 및 기능유지 확인

실시예 2의 재세포화된 바이오 스캐폴드에서 세포의 바이오 스캐폴드에 대한 부착효율을 확인하였고, 또한, in vitro 관류 10일 후에 재세포화된 바이오 스캐폴드에 대한 조직검사를 수행하였다. 또한, 항-Ki 67 항체 (적색), 항-알부민 항체(녹색) 및 DAPI (청색)으로 면역형광화학법 (도 3의 C)을 수행하였다.

이의 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 세포부착 효율은 88 ± 7% 임을 확인하였다.

또한, 재세포화된 세포는 큰 혈관 주위의 실질 부위 (parenchymal regions)에 넓게 퍼져있음을 확인하였다 (도 3의 B).

또한, 재세포화된 세포에서 Ki-67 항체에 대한 양성 세포 숫자가 증가하였고, 알부민의 발현도 높아졌음을 확인하였다 (도 3의 C).

간암세포 관류시간에 따라 DNA 함량을 조사한 결과, 관류시간이 높을수록 DNA 함량은 점차적으로 높아지고, 탈세포화된 스캐폴드와 비교하여 관류 10일 후에는 14배가 되었다.

2. 재세포화된 바이오 스캐폴드의 알부민 생성 확인

재세포화된 바이오 스캐폴드에서 배양된 HepG2 세포의 대사활성을 확인하기 위하여, 배양 시간에 따른 알부민의 생산을 확인하였다. 보다 구체적으로 Bethyl Laboratories, Inc.에 기술된 효소-결합 immunosorbent assay kit를 이용하여 분비된 알부민을 확인하였고, 알부민의 함량을 재세포화된 바이오 스캐폴드 및 HepG2 세포 (단층 (monolayer)에서 배양한 세포)에서 추출한 총 DNA 추출물에 대하여 표준화시켰다.

이의 결과를 도 4의 A에 나타내었다.

도 4의 A에 나타난 바와 같이, 재세포화된 스캐폴드 (3차원 세포 배양)에서는 알부민 생산량이 5.212 ± 0.27 μg/106 cell/day 이나, 배양접시에서 배양 (2차원 세포 배양)하는 경우, 4.13 ± 0.19 μg/106 cell/day임을 확인하였다. 따라서, 2차원 세포 배양하는 경우보다 본 발명의 스캐폴드를 통한 3차원 세포 배양의 경우, 높은 알부민을 생산함을 알 수 있다.

3. PCR 분석을 통한 스캐폴드에서 배양된 HepG2 세포의 기능성 및 종양형 성능 확인

단층에서 세포배양한 HepG2 세포, 재세포화된 바이오 스캐폴드 및 탈세포화된 바이오 스캐폴드의 cDNA의 mRNA 발현을 농도 계측 (Densitometric) 분석을 수행하였다. 보다 구체적으로, 제조사 메뉴얼에 따라 총 RNA를 TRIzol 용액을 이용하여 RNA를 추출 후, 랜덤 프라이머 및 GoScript 역전사 효소를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 이 후, 50 ng의 DNA에 대하여 Tprofessional standard 96 gradient machine (Biometra)을 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 알부민, GPX1 (glutathione peroxidase 1), α-FP (alpha feto protein), catalase, CYP2E1 (cytochrome P450 2E1), ASGR2 (aialoglycoprotein receptor 2), LDLR (low-density lipoprotein receptor), HMGCR (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase), c-MYC, c-Jun, c-Fos, 및 RAB3B의 프라이머를 이용하였다. PCR 조건으로 94 ℃에서 3분 반응 후, 94 ℃에서 30초, 각각 프라이머에 맞는 어닐링 온도에서 30초 및 72 ℃에서 45초로 34 주기를 수행하였다. 이 후 72 ℃에서 10분동안 반응시켰다. 이 후 PCR 산물을 1.5 % 의 에티디움 브로마이드로 염색한 아가로오스 젤에서 전기영동한 후, image J software을 이용하여 발현양을 결정하였고, GAPDH를 내부 대조군으로 사용하였다. 이의 결과를 도 4의 B 및 C에 나타내었다.

도 4의 B 및 C에 나타난 바와 같이, 대사 및 합성 기능을 하는 유전자의 발현은, 단층에서 세포배양을 한 경우보다 재세포화된 간 스캐폴드에서 유의적으로 높음을 확인하였다. 보다 구체적으로, 알부민은 1.8 ± 0.37 배, GPX1 (glutathione peroxidase 1)은 3.35 ± 0.23 배, α-FP (alpha feto protein)은 4 ± 0.93 배, catalase는 4.16 ± 0.30 배, CYP2E1 (cytochrome P450 2E1)은 5.65 ± 0.78 배, ASGR2 (aialoglycoprotein receptor 2)는 1.99 ± 0.12 배, LDLR (low-density lipoprotein receptor)는 2.61 ± 0.55 배, HMGCR (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase)는 2.43 ± 0.31 배가 높음을 확인하였다.

또한, 종양 특성과 관련된 유전자의 발현은, 단층에서 세포배양을 한 경우보다 재세포화된 간 스캐폴드에서 유의적으로 높음을 확인하였다. 구체적으로 c-MYC는 2.6 ± 0.25 배, c-Jun은 1.84 ± 0.12 배, c-Fos는 1.91 ± 0.13 배, RAB3B는 2.55 ± 0.2 배 높음을 확인하였다.

실시예 4. 본 발명의 재세포화된 스캐폴드를 이용한 항암제에 대한 반응 확인

본 발명의 재세포화된 바이오 스캐폴드의 간암세포 환자를 위한 항암제 스크리닝 모델로 사용하기에 적합한지 확인하기 위하여, HepG2 세포로 재세포화된 간 스캐폴드의 일반적으로 간암에 사용되는 항암제에 대한 내성을 확인하였다.

보다 구체적으로, 8 Mm, 31Mm 및 125Mm의 MTX (Methotrexate)의 농도로 관류 7일 째에 관류시스템의 배양배지에 첨가하였다. 이 후, 관류 8일 및 10일에 관류물을 수거하여 알부민 양을 확인하였다. 또한, 같은 농도를 단층 배양하는 경우의 HepG2 세포에 처리하였다. 이의 결과를 도 4의 D에 나타내었다.

도 4의 D에 나타난 바와 같이, HepG2 세포의 2차원 배양 시, 8 mM의 MTX를 처리하는 경우, 알부민 분비가 현저하게 감소함을 확인하였다. 반면에, 스캐폴드에서 배양된 세포에서 상기 낮은 농도 (8 mM)에서 알부민 분비는 알부민을 처리하지 않은 경우와 차이가 없음을 확인하였다.

또한, 높은 농도의 MTX 존재 하에, 2 차원 및 3 차원 시스템에서 배양한 경우 모두에서 알부민 생산이 현저하게 감소함을 확인하였다. 상기 결과는 세포의 기능이 MTX 처리 후, 농도 의존적으로 손상되는 것을 확인하였다. 그러나, 본 발명의 3 차원 시스템은 2 차원 시스템보다 항암제에 대한 저항성을 갖고 있어, 2 차원 시스템보다 in vivo 환경과 유사함을 확인하였다.

Claims

(1) 계면활성제를 인간을 제외한 동물의 간에 관류시켜 간을 탈세포화 하는 단계; 및
(2) 상기 탈세포화된 간에 간암세포를 관류시켜 간을 재세포화 하는 단계;를 포함하는 재세포화된 바이오 스캐폴드의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 계면활성제는 SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase 및 CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propane sulfonate)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 재세포화된 바이오 스캐폴드의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 계면활성제가 SDS인 경우, 0.01 내지 0.5 % (v/v)의 SDS를 장기에 관류시키는 것을 특징으로 하는, 재세포화된 바이오 스캐폴드의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 관류는 계면활성제를 1 내지 100 mL/분의 유속으로 관류시키는 것을 특징으로 하는, 재세포화된 바이오 스캐폴드의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 동물은 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 인간을 제외한 영장류로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 재세포화된 바이오 스캐폴드의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (1) 탈세포화 단계 전에,
1) 헤파린을 인간을 제외한 동물에 적용하는 단계;
2) 상기 1)단계의 동물의 문맥을 통하여 헤파린을 포함하는 PBS (phosphate buffered saline)를 동물에 관류시켜 혈액을 제거하는 단계;
3) 상기 2)단계의 동물의 하대 정맥 (inferior vena cava; IVC) 및 상대 정맥 (superior vena cava; SVC)을 절단하고, 상기 문맥을 통하여 동물의 간에 헤파린을 포함하는 PBS를 관류시켜 혈액을 제거하는 단계; 및
4) 상기 3)단계의 동물로부터 간을 분리하는 단계를 포함하는, 재세포화된 바이오 스캐폴드의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (1)단계 후 (2)단계 전에,
a) PBS를 탈세포화된 간에 관류시켜 계면활성제를 제거하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 간에 살균제를 관류시켜 간을 살균하는 단계;
c) 상기 b)단계의 살균된 간에 PBS를 관류시켜 잔여 화학물질을 제거하는 단계;를 포함하는, 재세포화된 바이오 스캐폴드의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (2)단계의 재세포화하는 단계는,
(2-1) 세포 배양액을 인간을 제외한 동물의 간문맥을 통하여 관류시키는 단계;
(2-2) 간세포를 간문맥을 통하여 관류시키는 단계; 및
(2-3) 세포 배양액을 간문맥을 통하여 관류시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재세포화된 바이오 스캐폴드의 제조방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 재세포화된 바이오 스캐폴드.
제 9항의 재세포화된 바이오 스캐폴드에 항암제 후보물질을 투여하는 단계;를 포함하는 재세포화된 바이오 스캐폴드를 이용한 항암제의 스크리닝 방법.