CN110025403B - 一种通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，该方法先将经过预处理的生物瓣膜材料放入含醛溶液中进行化学交联反应，所述含醛溶液中带有醛基的溶质的浓度为0.1％‑2％(w/w)，反应时间为0.5小时～2周；然后将所述生物瓣膜材料浸润到氨基硅油乳液中，所述氨基硅油乳液的氨值范围在0.2～0.6mmol/g之间，粘度在500‑5000mPa.s之间，浸润时间为0.2小时～1周，温度不超过60度。该方法通过将生物瓣叶材料引入一层光滑、柔软的有机材料涂层，增加了瓣叶的柔软性和表面光滑性，减少了摩擦，降低了钙化风险从而延长了使用寿命。

Description

一种通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法。

背景技术

人工生物瓣膜主要分为两大类，即同种异体生物组织瓣(有主动脉瓣、硬脑膜瓣与阔筋膜瓣等)及异种生物组织瓣(有猪主动脉瓣和牛心包瓣等)。与机械瓣膜相比，生物瓣膜有较好的血流动力学功能，不需终生抗凝，具有较低的血栓栓塞发生率，并可避免抗凝所致的致命性出血等优越性。临床应用的生物瓣多是采用戊二醛处理的异种生物瓣，其原理是通过戊二醛中的醛基官能团与胶原中的氨基官能团发生了化学交联反应。通过戊二醛的交联处理，将具有潜在免疫原性的物质(如核酸、蛋白、多糖、脂质和其他小分子物质等)抗原表位进行隐藏从而并降低异种组织的抗原性。

然而，病理学引起的瓣膜退化会大大削弱瓣膜的功能性。生物瓣膜在体内植入后，随着时间的延长，瓣叶表面的内皮细胞几乎完成脱落，暴露出下面的纤维结构，造成血小板、纤维素等黏附，血细胞、血浆成分的渗入，从而引起组织衰败。

钙化是导致生物瓣膜衰坏的主要因素。生物瓣组织主要由胶原纤维、弹性纤维及基质构成。正常情况下，胶原纤维及基质中存在丰富的黏多糖和糖蛋白等物质，封闭和阻断了与钙磷相结合的部位，从而阻断了钙化的发生。经戊二醛处理的生物瓣膜虽使胶原交联来增加组织稳定性，却因可溶性蛋白的丢失，使胶原自身的羧基、羟基等离子基团暴露出来，与胞内钙离子 (Ca²⁺)结合，经过一系列的生化反应生成羟基磷灰石沉淀，导致了钙化的发生，同时瓣叶表面也会变得粗糙。又因瓣叶钙化变硬，进一步导致了瓣叶撕裂和破损，最终影响了瓣膜正常生物功能和使用寿命。

理想的人工生物瓣膜应满足如下条件：符合生理使用寿命、良好的生物相容性，无抗原性，不引起血液成分沉积；充分交联，具有良好的机械特性与血流动力学特性和足够的耐久性；抗压、抗张力和跨瓣压差满足人体生理要求，不易发生感染，血栓栓塞率低。因此如何防止或延缓生物瓣膜的病理性退化是亟待解决的课题。

临床研究表明，瓣膜植入早期，血液中的蛋白会沉积在瓣叶表面，形成一层生物膜，厚度大约10微米，蛋白生物膜的存在使得瓣叶表面变得更光滑，不但提高了瓣膜的生物相容性，同时可以作为一个保护屏障，防止血液成分和细胞渗入瓣叶。因此建议在瓣膜生产加工过程中在瓣叶表面覆盖一层人工涂层，作为屏障，阻止血液成分或组织液成分渗入、钙盐沉积，预防瓣膜的变性和钙化，延长其耐久性。

同时，通过关注Edwards牛心包瓣膜发现：该品牌的瓣膜在设计时，三个瓣叶在关闭静止状态下中心留有一个小孔，而不是与其他瓣那样呈紧密关闭状态，这种设计下计算出的静态泄漏量为8.4ml/s，远高于其他的牛心包瓣(0.7-3.9％ml/s)，但却可以避免瓣叶因紧密接触，长期反复摩擦而影响瓣叶的寿命。同时也减免了牛心包瓣在压力负荷下，有可能引起瓣叶过度关闭而导致瓣叶褶皱，瓣膜受损。

因此，如何在人工瓣叶的加工过程中引入一种憎水性涂层作为屏障，阻止血液/组织液的渗入、屏蔽水溶性钙离子的汇集，同时降低瓣叶彼此的摩擦，且增加瓣叶的柔软度，最大程度减轻瓣叶撕裂和破损的可能性是需重点解决的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，该方法通过化学交联氨基硅油的方式，让生物瓣膜起到抗钙化的效果。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，该方法先将经过预处理的生物瓣膜材料放入含醛溶液中进行化学交联反应，所述含醛溶液中带有醛基的溶质的浓度为0.1％-2％ (w/w)，反应完成后将所述生物瓣膜材料浸润到氨基硅油乳液中。

本发明的目的还可以通过以下技术方案来进一步实现的：

在一个实施方式中，所述生物瓣膜材料可为牛心包、猪心包、鱼鳔。

在一个实施方式中，所述带有醛基的溶质至少含有两个醛基，所述两个醛基能与所述生物瓣膜材料中的氨基发生化学反应，形成共价键。

在一个优选的实施方式中，所述带有醛基的溶质为戊二醛、乙二醛、己二醛中的一种或多种的组合。

在一个实施方式中，所述氨基硅油乳液中含有侧链或端基带有氨基的聚硅氧烷，氨基为伯胺、仲胺、叔胺或季胺。

在一个实施方式中，所述聚硅氧烷为聚二甲基硅氧烷。

在一个实施方式中，所述氨基硅油乳液的氨值范围在0.2-0.6mmol/g之间，粘度在500-5000mPa.s之间。

在一个实施方式中，所述生物瓣膜材料在所述氨基硅油乳液中浸润时间为0.2小时～1周，温度不超过60度。

在一个实施方式中，所述预处理包括将获取的新鲜的生物瓣膜材料进行表面残留物清除和用等渗溶液进行清洗。

在一个实施方式中，所述化学交联反应的反应时间为0.5小时～2周。

同现有技术相比本发明使用含醛溶液和氨基硅油进行生物瓣膜改性的优点如下：

1、含醛的溶液中的溶质由于具有双醛基官能团，能连接2个氨基胶原分子，在常温水溶液中短时间内就能形成有效的交联，增强生物组织的稳定性。但生物瓣膜(例如心包)内部的戊二醛残留，同样也是引起钙化反应的风险因素之一。由于氨基硅油同样具有氨基，可与残留的戊二醛发生氨基化反应，因此，本发明提供的方法可以清除残留的戊二醛，降低了免疫原反应和细胞毒性，较少钙化发生风险。

2、氨基硅油中的氨基由于极性很强，氨基硅油中的氨基可以与胶原纤维中游离的羧基、羟基形成氢键，屏蔽掉羧基端的钙结合位点，消除钙化反应发生的潜在风险。

3、氨基硅油可以在心包表面形成光滑的涂层。生物瓣膜材料薄，纤维呈波浪式排列，氨基硅油作为改性剂很容易渗透、驻留，与胶原内部的纤维形成氢键，使得氨基硅油涂层稳定性更好，持久性更高；并且光滑的涂层减少了瓣叶之间摩擦的风险，降低了瓣叶因彼此摩擦导致的破损，延长了使用寿命。

4、本发明提供的方法可以利用氨基硅油来隔绝生物瓣膜内外水溶性钙离子聚集，抑制羟基磷灰石晶核等形式的钙盐在受损的心包内外沉积、钙化，有效的抑制钙化反应的发生。

5、氨基硅油还可以起到软化心包的作用，本发明提供的方法利用氨基硅油作为改性剂渗透到心包内部，容易吸附到胶原/弹性纤维表面，降低生物瓣膜内部纤维的表面张力，使得纤维间的摩擦系数降低，有利于纤维之间的滑动，使得处理后的生物瓣膜柔软度更好。

附图说明：

图1和图2是新鲜的生物瓣膜材料和采用本发明所述方法制备的生物瓣膜材料分别植入小动物后，取出，经HE染色、切片后的效果图，其中图1是对照样品，图2是实验样品。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举实施例，对本发明进一步详细说明。

本实施例提供了一种通过氨基硅油涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：获取新鲜的生物瓣膜材料；

步骤2：将生物瓣膜材料进行预处理；

步骤3：在等渗溶液中清洗；

步骤4：将清洗后的生物瓣膜材料浸泡于含醛溶液中进行化学交联反应；

步骤5：将完成反应的生物瓣膜材料进行清洗；

步骤6：将完成清洗的生物瓣膜材料浸泡于氨基硅油乳液中；

步骤7：将完成上述处理的生物瓣膜材料再次清洗；

步骤8：使用保存溶液暂存，进一步加工成瓣膜材料。

根据本发明的通过涂层方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，在步骤1中：所述生物瓣膜材料为新鲜材料，诸如牛心包、猪心包或鱼鳔等，取出后，于2-10度条件下低温冷藏。

在步骤2中：将新鲜的生物瓣膜材料进行预处理，清除表面残留的脂肪、血管、血渍等等。

在步骤3中：在等渗溶液中清洗生物瓣膜材料，等渗溶液可为：生理盐水、Hank’s溶液等平衡盐溶液。

在步骤4中：将完成预处理的生物瓣膜材料浸泡在浓度0.1％-2％(w/w)的含醛溶液中，进行化学交联反应；反应时间0.5小时-2周。醛与心包组织中胶原蛋白的交联反应机理如下：

含醛溶液中，由于溶质含有至少两个醛基官能团，可连接至少2个氨基胶原分子，在常温水溶液中短时间内就能形成有效的交联，增强生物组织的稳定性。

在该步骤中，可以根据试验的需求，在浸泡前进行或者不进行脱细胞处理，常用的脱细胞剂诸如：SDS、Trixton x-100、CHAPS等离子型、非离子型、两性离子去污剂等，方法不限于化学方法或者物理方法(液氮、压力等)。

在步骤5中：将完成上述处理的生物瓣膜材料在溶液中清洗，清洗溶液可为：生理盐水、 Hank’s溶液等平衡盐溶液；清洗温度2-10度，清洗时间0.5小时-6个小时。

在步骤6中：将完成上述处理的生物瓣膜材料浸泡于氨值0.2-0.6mmol/g之间的氨基硅油乳液中，处理时间0.2小时～1周，处理温度不超过60度。

氨基硅油乳液的制备可按如下方法进行：

取一定量的去离子水加入250ml三口烧瓶中，将非离子型乳化剂烷基酚聚氧乙烯醚TX-10 与脂肪醇聚氧乙烯醚AEO，按照复配比例1/2至2/3滴加，搅拌后混合均匀，然后加入适量的助乳化剂，继续乳化直至澄清，将相当于2倍复配乳化剂剂量的市售氨基硅油原料慢慢滴入，并在高速搅拌下使其充分乳化，搅拌2小时后加入一定量的醋酸，缓慢升温至30度下均匀混合，缓缓加入一定量的水至乳化液粘度减小，调节PH值至6-7，继续搅拌60分钟静置得到半透明的微乳液。所得氨基硅油乳液的氨值范围在0.2～0.6mmol/g之内，粘度500-5000mPa.s。其中：氨值是氨基含量的表征，即中和1克氨基硅油所消耗浓度为1摩尔每升盐酸的物质的量，单位为mmol/g，氨值的高低影响心包的柔软度和表面的光滑程度，乳液的粘度影响在心包表面的成膜性能；此外，还可根据额外需求，在氨基硅油乳液中添加适当的抗菌剂，使得处理后的心包具有一定的抗菌效果。

戊二醛与氨基硅油反应的机理如下：

生物瓣膜(例如心包)内部的戊二醛残留，同样也是引起钙化反应的风险因素之一。由于氨基硅油同样具有氨基，可与残留的戊二醛发生氨基化反应，因此，本发明提供的方法可以清除残留的戊二醛，降低了免疫原反应和细胞毒性，较少钙化发生风险。氨基硅油中的氨基由于极性很强，本发明提供的方法可以与胶原纤维中游离的羧基、羟基形成氢键，屏蔽掉羧基端的钙结合位点，消除钙化反应发生的潜在风险。氨基硅油可以在心包表面形成光滑的涂层。生物瓣膜材料薄，纤维呈波浪式排列，氨基硅油作为改性剂很容易渗透、驻留，与胶原内部的纤维形成氢键，使得氨基硅油涂层稳定性更好，持久性更高；并且光滑的涂层减少了瓣叶之间摩擦的风险，降低了瓣叶因彼此摩擦导致的破损，延长了使用寿命。氨基硅油可以隔绝生物瓣膜内外水溶性钙离子聚集，抑制羟基磷灰石晶核等形式的钙盐在受损的心包内外沉积、钙化，有效的抑制钙化反应的发生。氨基硅油还可以起到软化心包的作用，本发明提供的方法利用氨基硅油作为改性剂渗透到心包内部，容易吸附到胶原/弹性纤维表面，降低生物瓣膜内部纤维的表面张力，使得纤维间的摩擦系数降低，有利于纤维之间的滑动，使得处理后的生物瓣膜柔软度更好。氨基硅油作为生物瓣膜材料改性剂，可有效解决现有技术存在的问题：引入憎水性涂层作为屏障，阻止血液/组织液的渗入、屏蔽水溶性钙离子的汇集，同时降低瓣叶彼此的摩擦，且增加瓣叶的柔软度，最大程度减轻瓣叶撕裂和破损的可能性。

在步骤7中：将完成上述处理的心包在溶液中清洗，清洗溶液可为：生理盐水、Hank’s 溶液等平衡盐溶液；清洗温度2-10度，清洗时间0.5小时-6个小时。

在步骤8中：可将完成上述处理的生物瓣膜材料使用保存溶液暂存，进一步加工成所需要的形状。所述保存溶液包括：生理盐水、Hank’s溶液等的等渗平衡盐溶液。

实施例一

本实施例提供了通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：从牛场获取新鲜的牛心包材料；

步骤2：将牛心包材料进行预处理，清除表面残留的脂肪；

步骤3：将牛心包材料在Hank’s溶液中清洗6个小时，温度8度；

步骤4：将清洗后的心包材料浸泡于1％浓度的戊二醛溶液中反应24小时；

步骤5：将完成反应的心包材料用生理盐水进行清洗；

步骤6：将完成清洗的心包材料浸泡于氨值0.3mmol/g，粘度1000mpa.s氨基硅油乳液中；浸泡3个小时，温度常温；

步骤7：将完成上述处理的心包再次使用生理盐水清洗4个小时，温度5度；

步骤8：使用保存溶液暂存，进一步加工成瓣膜材料。

将未经本发明的方法处理的生物瓣膜和经本发明的方法处理的生物瓣膜植入小动物体内进行钙化试验、抗张强度测试、柔软度测试。

(1)小动物体内钙化测试指的是将试验品和对照品分别植入到小鼠背部皮下两侧。试验安排10只wistar雄性幼鼠用于该实验。8周后安乐死动物取出移植物。样品取出后，经恒温烘箱80℃干燥48小时至恒重。进一步分析样品所含钙含量变化。表1为不同植入期小动物体内钙化定性结构(钙含量检测结果)：

其中，所述的试验样品是指采用实施一所述方法制备的生物瓣膜，所述的对照样品是指未经处理的新鲜的生物瓣膜。

如图1所示，经HE染色、切片8周后，其病理分析结果显示对照样品出现较多的钙化灶(蓝色区域)，纤维排列紊乱，间质肿胀输送，并伴有坏死细胞及炎性细胞浸润。如图2所示，试验样品钙化点明显较少，纤维排列比较整齐，保留原有的纤维形态，部分区域出现少量炎性细胞，钙化程度较轻。

(2)对处理前后的牛心包分别测试其抗张强度和柔软度，结果见表2，牛心包处理后抗张强度增加了21％左右；使用挺度设备分别测试其柔软度，测试间距15mm，测试速度300 度/min，牛心包处理前后柔软度降低了33.2％。

表2是采用实施例一所述方法制备的牛心包处理前后的抗张强度和柔软度测试结果

实施例二

本发明所述的一种通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，包括如下步骤：

步骤1：获取新鲜的猪心包；

步骤2：对猪心包进行预处理，清除掉表面多余的脂肪、血管；

步骤3：将理完的猪心包使用生理盐水进行清洗，温度4度，清洗时间4个小时；

步骤4：将猪心包浸泡于0.5％浓度的乙二醛溶液中浸泡，浸泡时间48h，浸泡温度8度；

步骤5：将完成固定的猪心包使用Hank’s溶液进行清洗，时间0.5小时，清洗温度室温；

步骤6：将猪心包浸泡于氨值为0.2mmol/g的聚硅氧烷乳液中，粘度为2000mPa.s，浸泡 3天，浸泡温度37度；

步骤7：将完成上述处理的猪心包进一步清洗，用生理盐水清洗，清洗时间1小时，清洗温度4度；

步骤8：将完成所有工序的猪心包在生理盐水中暂存，进一步加工成所需的形状。

实施例三

本发明所述的一种通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，包括如下步骤：

步骤1：获取新鲜的鱼鳔；

步骤2：对猪心包进行预处理，清除掉表面多余的血渍或脂肪；

步骤3：将理完的鱼鳔使用生理盐水进行，温度2度，清洗时间1小时；

步骤4：将猪心包浸泡于0.1％浓度的己二醛溶液中浸泡，浸泡时间2周，浸泡温度常温；

步骤5：将完成固定的鱼鳔使用生理盐水进行清洗，时间0.5小时，清洗温度室温；

步骤6：将猪心包浸泡于氨值为0.5mmol/g、粘度为500mPa.s的聚二甲基硅氧烷乳液中，浸泡0.2小时，浸泡温度55度；

步骤7：将完成上述处理的鱼鳔进一步清洗，清洗溶液生理盐水，清洗时间1小时，清洗温度10度；

步骤8：将完成所有工序的鱼鳔Hank’s溶液中暂存，进一步加工成所需的形状。

实施例四

本发明所述的一种通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，包括如下步骤：

步骤1：获取新鲜的猪心包；

步骤2：对猪心包进行预处理，清除掉表面多余的脂肪、血管；

步骤3：将理完的猪心包使用生理盐水进行清洗，温度10度，清洗时间0.5小时；

步骤4：将猪心包浸泡于2％浓度的戊二醛溶液中浸泡，浸泡时间0.5小时，浸泡温度8 度；

步骤5：将完成固定的猪心包使用Hank’s溶液进行清洗，时间6小时，清洗温度室温；

步骤6：将猪心包浸泡于氨值为0.6mmol/g的氨基硅油乳液中，粘度为5000mPa.s，浸泡一周，浸泡温度37度；

步骤7：将完成上述处理的猪心包进一步清洗，使用Hank’s溶液清洗，清洗时间6小时，清洗温度2度；

步骤8：将完成所有工序的猪心包在Hank’s平衡盐溶液中暂存，进一步加工成所需的形状。

最后应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，其特征在于，先将经过预处理的生物瓣膜材料放入含醛溶液中进行化学交联反应，所述含醛溶液中带有醛基的溶质的浓度为0.1％-2％(w/w)，反应完成后将所述生物瓣膜材料浸润到氨基硅油乳液中，在所述氨基硅油乳液中，氨基硅油的添加量是复配乳化剂剂量的2倍，所述氨基硅油乳液的氨值范围在0.2-0.6mmol/g之间，粘度在500-5000mPa.s之间。

2.根据权利要求1所述的通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，其特征在于，所述生物瓣膜材料为牛心包、猪心包、鱼鳔。

3.根据权利要求1所述的通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，其特征在于，所述带有醛基的溶质至少含有两个醛基，所述两个醛基能与所述生物瓣膜材料中的氨基发生化学反应，形成共价键。

4.根据权利要求3所述的通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，其特征在于，所述带有醛基的溶质为戊二醛、乙二醛、己二醛。

5.根据权利要求1所述的通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，其特征在于，所述氨基硅油乳液中含有侧链或端基带有氨基的聚硅氧烷，氨基为伯胺、仲胺、叔胺或季胺。

6.根据权利要求5所述的通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，其特征在于，所述聚硅氧烷为聚二甲基硅氧烷。

7.根据权利要求1所述的通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，其特征在于，所述生物瓣膜材料在所述氨基硅油乳液中浸润时间为0.2小时～1周，温度不超过60度。

8.根据权利要求1所述的通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，其特征在于，所述预处理包括将获取的新鲜的生物瓣膜材料进行表面残留物清除和用等渗溶液进行清洗。

9.根据权利要求1所述的通过涂层的方式改善人工生物瓣膜钙化的方法，其特征在于，所述化学交联反应的反应时间为0.5小时～2周。

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