CN111617317B - 一种生物组织的交联固定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物组织的交联固定方法。该方法的具体过程为：使交联剂中的活性基团与生物组织进行交联反应，然后再通过交联剂中的硅烷基团相互之间进行水解缩合，完成对生物组织的交联固定。本发明通过交联剂中的活性基团与在生物组织反应引入交联剂分子，然后交联剂分子中的硅烷基团发生水解缩合形成硅氧网络，从而交联生物组织。由此交联后的生物组织，具有良好的细胞外基质的稳定性，热收缩温度明显提高。
Description
技术领域
本发明属于生物组织处理技术领域，具体涉及一种生物组织的交联固定方 法。
背景技术
异种生物组织具有和人体组织相似的物理化学性质，因此被广泛用作一种 天然生物材料植入人体来替代或者修复损坏的人体组织或者器官，例如人造血 管、人工瓣膜、人工补片等。异种组织直接植入后由于免疫排斥作用，会迅速 降解，失去原有功能，因此需要化学固定处理才能长期稳定在体内存在并发挥 功能。
目前的异种生物组织一般通过戊二醛交联固定，但是戊二醛交联的生物组 织已知在用作血管补片和心脏瓣膜中暴露出钙化问题。虽然利用氨基油酸、乙 醇处理、表面活性剂等措施已知可以减少戊二醛交联生物组织的钙化，但是戊 二醛交联存在固有的交联不稳定和生物相容性不佳等问题。氰基硼氢化钠还原 可以减少戊二醛的毒性，但对组织其他性能的影响目前尚不明确。
为了克服戊二醛交联的缺点，一些替代的交联方法被相继报道，包括1-乙 基-3(-3二甲基氨基丙基)盐酸卡二亚胺(EDC)、环氧化合物、多酚等用来交联生 物组织。已有报道研究采用1-乙基-3(-3二甲基氨基丙基)盐酸卡二亚胺(EDC)作 为交联剂对生物组织进行交联，EDC交联同时利用了蛋白中的羧基和氨基基团 交联，交联程度升高，但是EDC只交联邻近的蛋白分子，属于短程交联，可能 导致交联的灵活性下降和硬度的升高。
有研究利用环氧化合物具有和多个活性基团反应的能力交联生物组织，环 氧交联的瓣膜具有较好的生物相容性、胶原稳定性和一定的抗钙化性能，但是 环氧基团在水中易发生水解，交联效率不如戊二醛高，并且交联后产生新的羟 基，增加了瓣膜的吸水性和厚度，导致力学强度降低。多酚和戊二醛联用可以 同时稳定组织中的胶原蛋白和弹性蛋白，并且显示出了抗钙化的能力，但是由 于多酚的交联机理是通过非共价键作用，无法长期稳定生物组分，因此不适合 用作长期植入物。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种生物组织的交联固定方法， 本发明的一个目的提供一种具有细胞外基质稳定性、对体内病理性钙化有抵抗 性并且生物力学性能良好的用于体内移植替换的生物材料。
本发明的另一个目的是提供一种具有长期细胞外基质稳定性、对体内病理 性钙化有长期抵抗性并且生物力学性能良好的用于体内移植替换的生物材料。
本发明的再一个目的是提供一种具有长期细胞外基质稳定性、对体内病理 性钙化有长期抵抗性并且生物力学性能良好，且无任何毒副作用的用于体内移 植替换的生物材料。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种生物组织的交联固定方法，交联剂中的活性基团与生物组织交联反应， 然后交联剂之间再通过其中含有的硅烷基团进行水解缩合，完成对生物组织的 交联固定。
交联过程如下所示：
进一步地，活性基团通过环氧开环、酰胺偶联、席夫碱反应、迈克尔加成 反应与生物组织中的氨基、羧基、羟基或巯基反应，从而连接到生物组织上的 基团。
进一步地，活性基团为环氧基、羧基、氨基、异氰酸酯基、乙烯基或醛基。
进一步地，硅烷基团为甲氧基硅烷、乙氧基硅烷、氯硅烷、硅酸、甲硅烷 或乙硅烷。
进一步地，生物组织为异种生物组织。
进一步地，异种生物组织为牛心包膜、猪心包膜、猪心脏瓣膜小叶、隐静 脉旁路移植物、主动脉同种移植物或硬脑膜等。
进一步地，还包括在与生物组织交联之前或交联之后添加常规交联剂。
进一步地，常规交联剂包括但不限于戊二醛，碳化二亚胺，槲皮素，鞣酸， 原花青素，聚环氧化合物等。
进一步地，包括以下步骤：
(1)将异种生物组织用去离子水清洗干净，用聚丙烯材质的塑料框展平撑 开，加入PBS溶液，每片膜约50-100mL；
(2)将生物组织溶液的温度控制在0-80℃，优选温度为4-50℃；
(3)向生物组织溶液中加入GPTMS，配制成特定浓度的溶液，优选GPTMS 的终浓度为1％-5％；
(4)将生物组织溶液置于恒温摇床上，37℃，120r/min，反应3-7d；
(5)取出生物组织用去离子水超声清洗彻底。
其交联机理如下：
其中，
R表示生物组织。
一种用于对生物组织进行交联固定的交联剂，该交联剂的化学结构式如下：
其中，R1为环氧基、羧基、氨基、异氰酸酯基、乙烯基或醛基；R2为甲氧 基硅烷、乙氧基硅烷、氯硅烷、硅酸、甲硅烷或乙硅烷，且相互独立。
进一步地，交联剂为GPTMS。
本发明的有益效果为：
1、本发明通过交联剂中的活性基团与在生物组织反应引入交联剂分子，然 后交联剂分子中的硅烷基团发生水解缩合形成硅氧网络，从而交联生物组织。 由此交联后的生物组织，具有良好的细胞外基质的稳定性，热收缩温度明显提 高。
2、本发明交联后的生物组织具有良好的力学性能，拉伸强度高，抗撕裂性 能优异，抗钙化性能良好，且无细胞毒性。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理 解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的 普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精 神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保 护之列。
实施例1
一种采用GPTMS对猪心包进行交联的方法，具体过程为：
将新鲜猪心包去脂肪并用去离子水清洗干净，用聚丙烯材质的5cm*5cm塑 料框展平撑开，然后加入50-100mL的PBS溶液，再向溶液中加入GPTMS，使 GPTMS的最终浓度为分别为0.25％，然后将其置于恒温摇床上，于37℃， 120r/min，反应7d，最后用去离子水超声清洗交联后猪心包，并保存在25％异 丙醇溶液中即可。
实施例2
一种采用GPTMS对猪心包进行交联的方法，具体过程为：
将新鲜猪心包去脂肪并用去离子水清洗干净，用聚丙烯材质的5cm*5cm塑 料框展平撑开，然后加入50-100mL的PBS溶液，再向溶液中加入GPTMS，使 GPTMS的最终浓度为分别为1％，然后将其置于恒温摇床上，于37℃，120r/min， 反应7d，最后用去离子水超声清洗交联后猪心包，并保存在25％异丙醇溶液中 即可。
实施例3
一种采用GPTMS对猪心包进行交联的方法，具体过程为：
将新鲜猪心包去脂肪并用去离子水清洗干净，用聚丙烯材质的5cm*5cm塑 料框展平撑开，然后加入50-100mL的PBS溶液，再向溶液中加入GPTMS，使 GPTMS的最终浓度为分别为2％，然后将其置于恒温摇床上，于37℃，120r/min， 反应7d，最后用去离子水超声清洗交联后猪心包，并保存在25％异丙醇溶液中 即可。
实施例4
一种采用GPTMS对猪心包进行交联的方法，具体过程为：
将新鲜猪心包去脂肪并用去离子水清洗干净，用聚丙烯材质的5cm*5cm塑 料框展平撑开，然后加入50-100mL的PBS溶液，再向溶液中加入GPTMS，使 GPTMS的最终浓度为分别为4％，然后将其置于恒温摇床上，于37℃，120r/min， 反应7d，最后用去离子水超声清洗交联后猪心包，并保存在25％异丙醇溶液中 即可。
对比例
采用戊二醛按常规方法对猪心包进行交联处理。
实验例1 GPTMS交联猪心包的稳定性表征
按照实例1的步骤制备GPTMS交联的猪心包膜，采用差示扫描量热法(DSC)测定其热收缩温度，具体测试数据见表1。
表1猪心包膜稳定性
如表1数据所示，本申请实施例制备得到的猪心包膜的热收缩温度随交联 剂的用量增加而升高，当交联剂的浓度超过1.0％时，其热收缩温度就几乎与对 照组的相同，当浓度超过2.0％时，其热收缩温度就高于对照组温度。
实验例2 GPTMS交联猪心包的细胞毒性
根据ISO 10993-5中描述的提取方法来评估实施例1～4和对照组(戊二醛) 交联组织的细胞毒性。
实验结果表示，不同浓度GPTMS(浓度分别为1％、2％、4％)交联猪心包 浸提液的L929细胞存活率均大于90％，而戊二醛交联猪心包浸提液的细胞存活 率小于20％。
实验例3 GPTMS交联猪心包的机械性能
采用拉伸试验机测定实施例2～4和对比例交联后的猪心包的断裂拉伸强度、 断裂伸长率及撕裂强度，其结果见表2。
表2猪心包机械性能
由表2所示，本发明实施例2～4交联后的猪心包的撕裂强度均优于戊二醛 对照组和空白组，实施例2的断裂拉伸强度也明显优于戊二醛对照组和空白组， 表明采用本申请交联方法对猪心包进行处理后，可明显提升其撕裂强度和断裂 拉伸强度。
实验例4 GPTMS交联猪心包的体内钙化性能
将实施例2～4和对比例交联后的猪心包材料裁剪成1平方厘米的片材，分 别植入SD大鼠皮下30天后取出，ICP-OES测定其钙元素含量。具体结果见表 3。
表3猪心包体内钙化性能
| 样品编号 | GPTMS浓度(％) | 钙元素含量(μg/mg) |
| 实施例2 | 1.0 | 2.1±0.7 |
| 实施例3 | 2.0 | 3.8±1.0 |
| 实施例4 | 4.0 | 2.5±0.8 |
| 戊二醛交联对照组 | - | 107±9.3 |
如表3所示，植入实施例2～4交联后制备得到的猪心包的大鼠体内钙元素 含量远远低于戊二醛对照组，表明本申请设计的交联方法和交联剂能够有效的 提升猪心包的抗钙化性能。
Claims (9)
1.一种生物组织的交联固定方法，其特征在于，交联剂中的活性基团与生物组织进行交联反应，然后交联剂之间再通过其中含有的硅烷基团进行水解缩合，完成对生物组织的交联固定；
所述交联剂的化学结构式如下：
其中，R1为环氧基、羧基、异氰酸酯基或醛基；R2为甲氧基硅烷、乙氧基硅烷、氯硅烷、硅酸、甲硅烷或乙硅烷，且R1、R2相互独立。
2.根据权利要求1所述的生物组织的交联固定方法，其特征在于，所述活性基团为能够与生物组织中的氨基、羧基、羟基或巯基反应，从而连接到生物组织上的基团。
3.根据权利要求2所述的生物组织的交联固定方法，其特征在于，所述活性基团为环氧基、羧基、异氰酸酯基或醛基。
4.根据权利要求1所述的生物组织的交联固定方法，其特征在于，所述硅烷基团为甲氧基硅烷、乙氧基硅烷、氯硅烷、硅酸、甲硅烷和乙硅烷中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的生物组织的交联固定方法，其特征在于，所述生物组织为牛心包膜、猪心包膜、猪心脏瓣膜小叶、隐静脉旁路移植物、主动脉同种移植物或硬脑膜。
6.根据权利要求1所述的生物组织的交联固定方法，其特征在于，还包括在与生物组织交联之前或交联之后添加常规交联剂。
7.根据权利要求1所述的生物组织的交联固定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将清洗后的生物组织展平撑开，加入溶液，并控制其温度为4～80℃；
(2)向生物组织溶液中加入交联剂，形成交联剂终浓度为1％-5％的溶液，于30～40℃，100～150r/min培育3～7天后即可。
8.根据权利要求7所述的生物组织的交联固定方法，其特征在于，所述生物组织溶液的温度为4～50℃。
9.根据权利要求7所述的生物组织的交联固定方法，其特征在于，所述溶液为去离子水或PBS溶液。
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