CN107998453B

CN107998453B - 一种表面改性的脱细胞基质及其改性方法

Info

Publication number: CN107998453B
Application number: CN201711321409.3A
Authority: CN
Inventors: 沈靖南; 尹军强; 武征; 林熙
Original assignee: Jinan University; First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: Jinan University; First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN107998453A

Abstract

本发明属于组织工程领域，具体涉及一种脱细胞基质的表面改性方法。所述改性方法包括以下过程：(1)对脱细胞基质进行羧基活化；(2)对苯丙氨酸或苯丙氨酸衍生物进行羧基保护，将经过了羧基保护的苯丙氨酸或苯丙氨酸的衍生物通过其氨基与脱细胞基质的羧基进行接枝改性；(3)将接枝改性后的脱细胞基质进行后期处理，即得到表面改性的脱细胞基质。所述改性的脱细胞基质具有抗肿瘤细胞和炎性细胞浸润、抗感染、抗基质金属蛋白酶和乳酸降解并改善炎症环境的功能，可以用于肿瘤治疗的术后组织修复。

Description

一种表面改性的脱细胞基质及其改性方法

技术领域

本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种表面改性的脱细胞基质及其改性方法。

背景技术

脱细胞基质材料作为一种天然的生物可降解材料，具有丰富的生物活性成分、天然的三维网络结构、较低的免疫原性，在组织工程领域已有广泛的应用。在肿瘤治疗方面，脱细胞基质材料已用于解决咽喉肿瘤切除术后粘黏膜损伤修复的问题，（张庆泉,孙岩,王强,等.异种(牛)脱细胞真皮基质修复咽喉肿瘤切除术后黏膜缺损的效果评估[J].中国组织工程研究, 2008, 12(06):1081-1084.），目前亟需用于解决恶性肿瘤术后修复问题的脱细胞基质材料制备技术。

恶性肿瘤术后特殊的生理环境对植入脱细胞基质的性能有如下要求：

1.肿瘤细胞具有转移性和潜伏性，部分肿瘤细胞转移到血管和周边组织中，并以正常细胞的形态潜伏。肿瘤治疗时会按照规定扩大范围，最终杀死了治疗范围内的肿瘤细胞，但治疗范围外潜伏的肿瘤细胞依然存在；一些肿瘤生长在重要脏器或者大血管、神经周围，不能一并切除。这些因素导致术后存在肿瘤原位复发的可能。肿瘤在其他部位复发时，会给病人带来巨大的痛苦，但依然可以采取二次治疗；但如果肿瘤在未完全修复的原位复发，不仅加大手术的难度，而且增加了痊愈的难度，甚至可能直接危及生命。因此。如果植入的脱细胞基质材料具有预防肿瘤复发的功能，将会扩大其应用范围，提高临床治疗效果。

2.肿瘤细胞高表达基质金属蛋白酶（一种锌依赖中性肽链内切酶，参与炎症反应、基质降解、肿瘤转移），可以降解和重构细胞外基质，这也是肿瘤细胞具有转移性的基础，而脱细胞基质材料主要成分即为细胞外基质。理想的脱细胞基质植入材料应具有抗肿瘤细胞浸润和重构细胞外基质的功能。

3.肿瘤细胞主要通过糖酵解方式获得能量，代谢会产生大量乳酸，使周边的环境呈弱酸性，因此，会加快脱细胞基质的降解。一旦肿瘤在原位复发，植入的脱细胞基质材料如果具有抗乳酸降解的功能，不仅可以延长自身的降解时间，还可以减少肿瘤细胞对正常组织的浸润。

4. 肿瘤部位治疗后呈现高炎症状态，周边大量炎性细胞会迁入受损部位。如果植入的脱细胞基质具有抗炎性细胞浸润的能力，可以减缓自身的降解，同时改善受损部位的炎症环境。

因此，相比于其他创伤修复，恶性肿瘤术后修复面临更加严峻的促降解环境，而同时植入的脱细胞基质材料的抗降解能力在组织的修复和减少肿瘤细胞对正常组织的浸润方面具有更重要的意义。获得用于恶性肿瘤术后组织修复的脱细胞基质材料，需要解决脱细胞基质材料在肿瘤细胞、炎性细胞、乳酸作用下抗降解的问题。如果改性后的脱细胞基质材料具有预防肿瘤复发的功能，将会具有更大应用价值。

目前，针对脱细胞基质材料的抗降解问题，现有的改性方法包括化学法、物理法、生物法。（1）化学法是使用化学交联剂对脱细胞基质进行内部交联。最早使用化学交联剂包括戊二醛、甲醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、环氧化物、二酰二胺、二异氰酸酯、聚乙二醇等。但改性后脱细胞基质材料在降解过程会释放出这些交联剂，影响正常的生理功能。天然生物交联剂逐渐用于脱细胞基质的交联改性。专利（201110165428.8和201610284706.4）则使用花青素、核黄素、核糖和京尼平等天然生物交联剂对脱细胞基质进行交联；专利（201410459064.8）设计了角膜专用交联剂（10～20％(w/v) 右旋糖苷溶液，0.1～0.2％(w/v) 核黄素）解决脱细胞角膜基质的交联问题。（2）物理法是使用辐照、热、溶液环境等物理因素，活化脱细胞基质中的基团，实现脱细胞基质的自交联。例如：专利（201611209243.1）提出提高脱细胞基质进行冻干和热处理，实现脱细胞基质的热交联。专利（201110199312.6）借助聚天门冬氨酸钠和水溶性壳聚糖改变胶原的动电电位，实现调节胶原束结构和形貌，修复胶原的天然结构。（3）生物法是指使用转谷氨酰胺酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、赖氨酰氧化酶等催化脱细胞基质发生自交联。上述这些改性方法提高了脱细胞基质内部胶原的连接，延长了脱细胞基质材料的降解时间，但并不能避免肿瘤细胞的基质金属蛋白酶、乳酸和炎性细胞的浸润作用。

此外，针对损伤部位的炎症和易感染特点，研究者通过负载炎症或者抗菌药物的方式对脱细胞基质材料进行改性。专利（200810017603.7）在脱细胞基质表面涂覆负载青霉素的凝胶，用于炎症、溃疡、烧创伤、医源性等原因造成的皮肤缺损的治疗。专利（200910200933.4）在脱细胞基质表面交联抗菌剂的纳米微粒，赋予其抗感染的能力。专利（201610395479.2）在丝素蛋白、聚乙交酯丙交酯或聚己内酯等纤维表面涂覆脱细胞基质碎片与阿司匹林、酮洛芬、舒体安通或非那雄胺等制备的凝胶，实现了炎症药物的缓释。使用类似的改性方法，即使添加肿瘤药物，只能减少肿瘤细胞和炎性细胞的直接作用，不能屏蔽基质金属蛋白酶和乳酸对材料的降解作用。而且这些负载药物的方法，也不能避免肿瘤药物对正常细胞的损伤。

氨基酸作为构成蛋白质的基本单元，本身具有羧基和氨基，可以作为交联剂对脱细胞基质进行改性。专利（200910048157.0）向脱细胞真皮基质内加入游离的氨基酸促进脱细胞基质的血管化，所用的氨基酸包括所色氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、和精氨酸等。Lai报道了分别使用甘氨酸（中性）、赖氨酸（碱性）、谷氨酸（酸性）改性脱细胞羊膜，具有良好的细胞浸润性，用于角膜移植（Lai JY.Carbodiimide cross-linking of amniotic membranes in the presence of aminoacid bridges. Mat SciEng C-Mater. 2015;51:28-36.）。专利（201610040990.0 ）使用酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸）和碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、脯氨酸）对脱细胞角膜进行改性，所用氨基酸的锁水能力提高了脱细胞角膜的含水率，有利于细胞的长入，可以加快角膜功能的修复。然而，上述的氨基酸交联方法的目的均是为了促进细胞长入脱细胞基质，而且为了更好促进细胞长入，专利（200910048157.0）要求所使用的氨基酸为游离的氨基酸。如果将上述氨基酸交联改性方法得到的脱细胞基质植入肿瘤切除部位，反而为肿瘤细胞提供更好的营养和生存环境。

总之，现有的脱细胞基质材料改性方法解决了许多临床应用的问题，但面临恶性肿瘤术后的生理环境，需要解决脱细胞基质材料在肿瘤细胞、炎性细胞、乳酸作用下抗降解的问题，因此需要设计新的脱细胞基质改性方法。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种脱细胞基质的表面改性方法，实现了脱细胞基质的表面功能化，可以用于制备满足恶性肿瘤术后修复需求的脱细胞基质材料。

实现上述目的的具体技术方案如下。

一种脱细胞基质的表面改性方法，包括以下步骤：

（1）对脱细胞基质进行羧基活化；

（2）对苯丙氨酸或苯丙氨酸衍生物进行羧基保护，将经过了羧基保护的苯丙氨酸或苯丙氨酸的衍生物通过其氨基与脱细胞基质的羧基进行接枝改性；

（3）将接枝改性后的脱细胞基质去羧基保护；

（4）洗脱羧基保护基团；

（5）将洗脱羧基保护基团后的脱细胞基质的羧基转化为酰卤，即得到表面改性的脱细胞基质。

本发明的脱细胞基质的表面改性方法，经过发明人长期对脱细胞基质的研究和实验，为满足性肿瘤术后修复需求，巧妙地使用了苯丙氨酸或其衍生物对脱细胞基质进行表面改性。首先对脱细胞基质的羧基进行活化，然后对苯丙氨酸及其衍生物的羧基进行保护，再使用羧基保护后的衍生物的氨基与脱细胞基质活化羧基进行接枝，之后，去除羧基保护，将脱细胞基质的羧基转化为酰氯，从最后接枝抗肿瘤药物、抗菌药物、抗炎症药物，从而得到真正适用于临床的表面改性脱细胞基质材料。得到的表面改性后的脱细胞基质能实现借助苯丙氨酸的羧基，负载抗肿瘤药物、抗菌药物、抗炎症药物，并实现药物缓释，延长对肿瘤细胞和炎性细胞的抑制作用；借助肿瘤细胞对苯丙氨酸生理需求，提高药物的靶向性；借助苯丙氨酸苯环的疏水作用，抑制细胞浸润，抗基质金属蛋白酶和乳酸降解，提高药物缓释效果。

步骤（1）对脱细胞基质羧基活化的目的在于，提高其与苯丙氨酸的衍生物的氨基反应的产率。

步骤（1）中所述的脱细胞基质包含脱细胞处理后的基质或交联改性后的脱细胞基质。

在其中一个实施例中，步骤（1）所述的羧基活化所用的活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和/或N-羟基琥珀酰亚胺。将脱细胞角膜基质进行羧基活化时的pH为4-8。

步骤（2）对苯丙氨酸羧基保护的目的在于，避免苯丙氨酸的羧基与脱细胞基质的氨基反应，为最终的接枝药物保留反应位点；使苯丙氨酸的衍生物的氨基与脱细胞基质的羧基接枝。

在其中一个实施例中，步骤（2）中，步骤（2）中所述的苯丙氨酸的羧基保护使用酯化法、酰胺或酰肼法，或使用带有羧基保护基团的氨基酸衍生物，得到苯丙氨酸的衍生物。

所述步骤（3）的去羧基保护的目的在于将苯丙氨酸的羧基暴露出来，用于后续的药物接枝。

所述步骤（3）中的羧基去保护处理方法包括酯、酰胺、酰肼在酸或碱的催化下水解或热解、温和条件下酸解，以及苄酯的氢解。

在其中一个实施中，所述的苄酯的氢解的用到的试剂包括H₂/Pd-C/乙醇、H₂/Pd(OH)₂-C/乙醇、β-巯基乙醇/BF₃/乙醚、HBr/冰醋酸/二氯乙酸、三甲基碘硅烷/四氯化碳的一组或一组以上。

所述步骤（4）洗脱羧基保护基团的目的在于洗去羧基保护基团。

所述步骤（4）中的洗脱羧基保护基团的方法包括萃取、透析。所述步骤（5）将接枝改性后的脱细胞基质的羧基的-OH转化为卤素的目的在于，将羧基转化为酰氯，提高与药物接枝的速度和产率。

在其中一个实施中，所述步骤（5）中所述的将接枝改性后的脱细胞基质的羧基的-OH转化为卤素，优选氯元素，制备方法为脱细胞基质与三氯化磷、五氯化磷、氯化亚砜、亚硫酰氯、或草酰氯反应。

本发明的另一目的在于提供一种表面改性的脱细胞基质材料及其应用。

一种表面改性的脱细胞基质材料，由上述方法制备得到。

上述表面改性的脱细胞基质材料，可以用于制备负载抗肿瘤药物、抗菌药物、和/或抗炎症药物的制剂。

本发明所述脱细胞基质材料负载有肿瘤药物并可以长时间缓释，有望减少肿瘤的复发率；材料表面具有抗肿瘤细胞和炎性细胞浸润的能力，并可以抵抗乳酸等的长期侵蚀，并具有抗感染、改善炎症环境的作用。

本发明的技术原理如下：

1.苯丙氨酸对肿瘤细胞的生长具有十分重要的作用，苯丙氨酸负载肿瘤药物，可以提高肿瘤药物进入肿瘤细胞的概率，并减少对正常细胞的影响。

2.苯丙氨酸带有的苯环具有很强的疏水作用力，蛋白质中含有的苯丙氨酸对维持蛋白质三维和四维结构具有重要的意义。疏水键作用力范围可以达到100 nm以上，而氢键、范德华力、离子键和共价键等的范围在5 nm以内，改性后脱细胞基质表面含有的苯丙氨酸具有较大的作用范围。

3. 对苯丙氨酸使用酯化法、酰胺或酰肼法进行羧基保护，避免改性过程中苯丙氨酸的羧基与脱细胞基质中的氨基反应，降低最终的载药效果。改性结束后，通过对苯丙氨酸形成的酯、酰胺、酰肼在酸或碱的催化下水解或热解、温和条件下酸解，以及苄酯的氢解，恢复羧基。

4.常用肿瘤药物（如顺铂、阿霉素等）、抗炎药物（如糖皮质激素等）、抑菌药物（万古霉素等）均具有氨基或者羟基，改性后的脱细胞基质表面的羧基、酰氯通过离子吸附、共价键合（形成酰胺键或酯键）的作用吸附上述药物。

5.酰氯与氨基的反应活性高于羧基，将羧基的-OH使用卤素取代，可以提高药物接枝的速度和数量，方便临床使用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1.肿瘤细胞和正常细胞对苯丙氨酸的不同需求，可以使得肿瘤药物高效的进入肿瘤细胞同时减少对正常细胞的伤害。由于苯丙氨酸也是人体必需氨基酸，改性的脱细胞基质降解后对周边组织无不良影响。

2. 本发明所述的改性后的脱细胞基质表面疏水性可以减少周边肿瘤细胞和炎性细胞的浸润。

3.本发明所述的改性后的脱细胞基质表面疏水作用力避免基质金属蛋白酶、乳酸等物质进入脱细胞基质内部，同时也避免脱细胞基质内部水溶性生物分子的流出，减缓脱细胞基质的降解。

4.常规的肿瘤药物、抗炎药物、抗菌药物多为脂溶性物质，苯丙氨酸的疏水性有利于结合和负载这些药物；苯丙氨酸的离子键或共价键可以与药物形成稳定的结合，实现药物缓释，避免暴释并延长药效。

5.周围水环境与改性后的脱细胞基质表面疏水键相互作用，形成“笼状水合物”，锁住肿瘤药物，加强药物的缓释效果。

6.改性后的脱细胞基质表面的羧基转化为酰氯后，提高与药物接枝的效率，可以在使用前半小时内载药，方便临床使用。

7.改性后的脱细胞基质表面可以负载不同的药物，用于抑制肿瘤细胞、防止细菌感染、改善炎症环境。

附图说明

图1为实施例1中的脱细胞心包膜改性前后的傅里叶变换衰减全反射红外谱图；

图2为实施例1中的脱细胞心包膜基质改性后顺铂的释放曲线；

图3为实施例1中的脱细胞心包膜基质改性后胶原含量变化。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

本发明所述改性方法中，为提高所述反应的效率，包括使用相转变催化剂、光催化、微波、超声波、辐照等的一种或一种以上。调节超声的功率、频率；微波的功率；辐照剂量、时间等参数，提高改性效果。

所述相转移催化剂包括聚醚（如链状聚乙二醇、链状聚乙二醇二烷基醚）、环状冠醚类（如环糊精）、季铵盐（如四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵）、叔胺（如三丁胺）、季铵碱、季磷盐。

所述超声波的功率优选为100~600 W，频率优选为30-80 kHz。

所述微波的功率优选为80-120 W。

所述辐照剂量优选为10-30 KyG、时间优选为2-10 min。

实施例1

本实施例的改性脱细胞心包膜由以下方法制备得到：

（1）脱细胞心包膜的羧基活化

取10 cm×5 cm脱细胞心包膜（DPP），浸入8 mL2-(N-吗啡啉)乙磺（MES）溶液（pH=6.5）中，依次加入0.85 g EDC，0.51 g NHS，搅拌12 h，对脱细胞心包膜表面的羧基进行活化。超纯水中透析（透析袋截留分子量500 Da）24 h，去除活化剂，备用。

（2）脱细胞心包膜的表面改性

向10 mL MES溶液（pH=6.5）加入0.3 g含有羧基保护基团的L-苯丙氨酸苄酯盐酸盐，0.57 g四丁基溴化铵，完全溶解后加入羧基活化后的脱细胞心包膜，搅拌48 h，使苯丙氨酸的氨基与脱细胞基质表面的羧基接枝反应。使用透析袋（截留分子量500 Da）透析3天。获得到改性后的脱细胞心包膜（M-DPP）。

（3）改性后的脱细胞心包膜的去羧基保护

取出M-DPP，浸入5 mL二氯乙酸溶液中，冰浴，加入5倍体积的33%的HBr/冰醋酸溶液，避光反应3 h，对苯丙氨酸去羧基保护，暴露出羧基。

（4）羧基保护基团的洗脱

取出脱细胞基质在超纯水中避光透析（透析袋截留分子量500 Da）3天，洗脱羧基保护基团，冻干。

（5）改性后的脱细胞心包膜的羧基的-OH转化为氯元素

取冻干的M-DPP，加入2 mL二氯甲烷（使用前悬蒸，去除水分）中，缓慢滴加0.5 mL草酰氯，室温搅拌1 h，将M-DPP表面羧基的-OH转化为氯元素。冷冻干燥去除草酰氯和二氯甲烷。

（6）抗肿瘤药物的负载

得到的产物称重后浸入5 mL 3 mg/mL顺铂溶液中，搅拌15 min，获得负载抗肿瘤药物的M-DPP。

将本实施例制备得到的改性脱细胞心包膜进行如下性能测试：

1.化学结构分析

使用傅立叶变换红外光谱仪（EQUINOX-70, Bruker, 德国）检测脱细胞心包膜改性前后的化学结构，结果如附图1所示。图中可见，相比于DPP，M-DPP的1631 cm^-1处的酰胺键C＝O伸缩振动峰增强，3284 cm^-1处仲酰胺NH伸缩振动峰强增加，表明苯丙氨酸已接入脱细胞心包膜表面。

2.表面亲疏水性检测

分别取改性前后的脱细胞心包膜材料，置于洁净的载玻片上。使用接触角测试仪（Kruss DSA100）检测材料表面静态接触角。测试温度28℃，湿度80%，每组随机选取10个点测试。结果表明DPP接触角为93±3.21°，M-DPP接触角为126.1±1.37°，表明改性后的脱细胞心包膜具有较强的疏水性。

3.改性脱细胞心包膜载药量检测

设置顺铂浓度梯度溶液，并收集浸入改性脱细胞心包膜后的顺铂溶液，紫外分光光度计检测301 nm吸收波长，计算载药量。结果表明M-DPP的载药量为74.9±11 μg/mg。

4.改性脱细胞心包膜药物释放检测

取5 mg负载顺铂的M-DPP，移入透析袋（截留分子量500 Da）中，加入40 mLPBS溶液中。在 37℃、100 rad/min 的鼓风摇床中进行药物释放，1周、2周、3周、4周取出1mL释放液，同时加入等体积的PBS溶液。浓度检测方法同前，结果如图2所示。图2中可见，1周内M-DPP负载的顺铂有较快的释放速度，2周后进入平台期，4周累计释放百分率为71±1.19%。

5.改性脱细胞基质抗乳酸降解检测

使用超纯水溶解MRS培养基（青岛海博生物），充分溶解后，调整pH=6.2，使用120℃下高压灭菌20 min。分别使用未改性的脱细胞心包膜和改性后脱细胞心包膜包裹培养基，手术线缝合。向内部注射乳酸菌菌种，平铺在培养皿（直径10 cm），周边加入3 mL培养基，37℃恒温平板摇床培养。观察心包膜周边一周、两周后的菌落形成情况，检测心包膜的质量变化。结果表明，在未改性脱细胞心包膜周边有菌落形成，而在改性脱细胞心包膜周边无此现象，二者质量无显著性差异，以上结果说明乳酸可以从未改性的心包膜中渗出并改变细胞膜内部的致密结构，而苯丙氨酸改性后可以减少乳酸的渗透，并减少乳酸的破坏作用。

6.改性脱细胞基质抗基质金属蛋白酶降解检测

配置500 mg/L的基质金属蛋白酶（MMP-1，Sigma，货号SRP3117）溶液（pH=7.4，含有10 mmol/L的CaCl₂）。取3mg未改性的脱细胞心包膜和改性后脱细胞心包膜，加入5 mL基质金属蛋白酶溶液中，37℃下孵育。每30 min取出100μL溶液检测溶液中胶原含量变化（试剂盒：Sirius Red Total Collagen Detection Kit，货号：9062）。结果如图3所示，改性后脱细胞基质在金属蛋白酶的作用下释放的胶原含量远低于未改性的脱细胞基质。

实施例2

本实施例的改性脱细胞羊膜由以下方法制备得到：

（1）脱细胞羊膜的羧基活化

取5 cm×5 cm脱细胞羊膜，浸入10 mL 2-(N-吗啡啉)乙磺（MES）溶液（pH=6.5）中，加入0.57 g EDC，搅拌12 h，活化表面羧基，备用。

（2）脱细胞羊膜的表面改性

使用酯化法对苯丙氨酸的羧基进行保护，制备方法参考文献（曾广翔, 陆惠邦,孙胜玲,等. 山梨酸苯丙氨酸乙酯的合成及抑菌活性[J]. 食品工业科技, 2013, 34(24):321-325.），得到L-苯丙氨酸乙酯。

向步骤1的溶液10mL中加入0.5 g L-苯丙氨酸乙酯，冰浴搅拌12 h，使苯丙氨酸的氨基与脱细胞羊膜表面的羧基进行反应。PBS中透析（截留分子量3000 Da）3天。

（3）改性后的脱细胞羊膜的去羧基保护

取出改性后的脱细胞羊膜，加入5 mL PBS中，加入30 mg NaOH，超声4 h（37 Hz，580 W），实现苯丙氨酸的羧基去保护。

（4）羧基保护基团的洗脱

取出改性后脱细胞羊膜，PBS冲洗后，在超纯水中透析（透析袋截留分子量500 Da）3天，洗脱下苯丙氨酸的羧基保护基团，冷冻干燥。

（5）改性后脱细胞羊膜羧基的-OH转化为氯元素

将脱细胞羊膜加入3 mL二氯甲烷中，滴加0.8 mL氯化亚砜，滴加200 μL二甲基甲酰胺（DMF），冰浴搅拌48 h，将改性后的脱细胞羊膜表面的羧基的-OH转化为氯元素。悬蒸去除二氯甲烷、氯化亚砜、二甲基甲酰胺。

（6）肿瘤药物的负载

得到产物浸入5 mL 1 mg/mL阿霉素溶液中，搅拌5 min，获得负载抗肿瘤药物的改性脱细胞羊膜。

将本实施例制备得到的改性脱细胞羊膜进行如下性能测试：

1.表面亲疏水性检测

测试方法同前，结果表明脱细胞羊膜接触角为73±1.01°，改性后的脱细胞羊膜接触角为116.3±4.87°，表明改性后脱细胞羊膜的疏水性增强。

2.改性脱细胞羊膜载药量检测

测试方法同前，检测波长为253 nm。结果表明脱细胞羊膜的载药量为100.6±4.2μg/mg。

3.苯丙氨酸负载肿瘤药物靶向性效果评价

向10 mL 1 mg/mL阿霉素溶液中3 mg苯丙氨酸，室温反应24 h后，使用截留分子量为600 Da透析袋去除苯丙氨酸和阿霉素小分子，得到阿霉素与苯丙氨酸的共聚物，冷冻干燥后称重8.3 mg。取出4 mg共聚物加入MES溶液（pH=6.8）中，加入1.31 mg EDC。充分溶解后，避光加入0.7 mg的异硫氰酸荧光素酯（CAS：3326-32-7）标记共聚物，同样的方式标记阿霉素，避光冻干，并称重。取前列腺肿瘤DU145细胞种植在6孔板上（每组3个孔），待长满培养皿80%后，分别加入荧光标记的阿霉素和阿霉素与苯丙氨酸的共聚物，37℃ 5%CO₂培养箱中避光培养6 h（凋亡未完全激活），在避光条件下使用PBS反复清洗细胞3次，使用流式细胞仪检测荧光标记的数量。结果表明，阿霉素与苯丙氨酸聚合物组带有荧光标记的细胞数量是阿霉素组的3.1±0.02倍。

实施例3

本实施例的改性脱细胞腹膜由以下方法制备得到：

（1）脱细胞腹膜羧基活化

取10 cm×10 cm脱细胞腹膜，浸入8 mL 2-(N-吗啡啉)乙磺（MES）溶液（pH=5.8）中，加入1.51 g NHS，搅拌12 h，实现脱细胞腹膜的羧基活化。超纯水中透析（透析袋截留分子量500 Da）6 h后，备用。

（2）脱细胞腹膜的表面改性

向20 mL 70%二氯甲烷的MES溶液（pH=6.5）加入0.8 g含有羧基保护基团的L-苯丙氨酸苄酯盐酸盐，1 g四丁基溴化铵，完全溶解后加入羧基活化后的脱细胞腹膜，超声2 h（37 Hz，580 W），使苯丙氨酸的氨基与脱细胞腹膜表面的羧基反应。使用透析袋（截留分子量500 Da）透析3天。

（3）改性后的脱细胞腹膜去羧基保护

对L-苯丙氨酸苄酯氢解：取出改性后的脱细胞腹膜，浸入8 mL乙醇中，加入2 gPd-C，使用氢气枕通入氢气（压力，1 MPa），反应3 h，实现苯丙氨酸的去羧基保护。

（4）羧基保护基团的洗脱

取出改性后的脱细胞腹膜，PBS冲洗后，使用氯仿萃取甲苯，去除羧基保护基团，再使用PBS反复冲洗，冻干。

（5）改性后的脱细胞腹膜羧基的-OH转化为溴元素

冻干的改性后的脱细胞腹膜加入2.5 mL二氯甲烷中，滴加1 mL POBr₃，室温搅拌48 h，将改性后的脱细胞腹膜羧基的-OH转化为溴元素。悬蒸去除二氯甲烷和POBr₃。

（6）负载抗菌和抗肿瘤药物

浸入10 mL 5 mg/mL万古霉素溶液中，搅拌30 min，取出后浸入5 mL 3 mg/mL甲氨蝶吟溶液中，搅拌20 min，获得负载抗菌/抗肿瘤药物的改性脱细胞腹膜。

将本实施例制备得到的改性脱细胞腹膜进行如下性能测试：

1.表面亲疏水性检测

测试方法同前，结果表明脱细胞腹膜接触角为87±1.29°，改性后的脱细胞腹膜接触角为119.3±2.47°，表明改性后脱细胞腹膜的疏水性增强。

2.改性脱细胞腹膜载药量检测

测试方法同前，万古霉素检测波长为236 nm，甲氨蝶吟为302 nm。结果表明脱细胞腹膜万古霉素和甲氨蝶吟载药量分别为57±2.8 μg/mg，31±0.7 μg/mg。

实施例4

本实施例的改性脱细胞角膜由以下方法制备得到：

（1）脱细胞角膜羧基活化

取1 cm×1 cm交联后脱细胞角膜（改性方法见专利201610040990.0），浸入3 mL2-(N-吗啡啉)乙磺（MES）溶液（pH=6.8）中，依次加入0.47 g EDC，搅拌2 h，实现脱细胞角膜的羧基活化。

（2）脱细胞角膜的表面改性

对苯丙氨酸进行羧基保护基团，合成方法见（章文军, 梁莉, 李慧. L-苯丙氨酸手性固定相的制备[J]. 精细化工, 2012, 29(3):69-72），得到苯丙氨酸甲酯。

向上述溶液中加入100 mg L-苯丙氨酸甲酯，在微波条件下（100 W，60℃）反应4h，使苯丙氨酸的氨基与脱细胞心包膜的羧基反应。使用透析袋（截留分子量8000 Da）透析3天。

（3）改性后的脱细胞角膜去羧基保护

取出改性后的脱细胞角膜，加入5 mL MES溶液（pH=5.6），滴加200 μL浓盐酸，40℃反应3 h，使苯丙氨酸甲酯酸解，实现苯丙氨酸的去羧基保护。

（4）羧基保护基团的洗脱

取出改性后的脱细胞角膜，PBS冲洗后，在超纯水中透析（透析袋截留分子量500Da）3天，洗脱羧基保护基团，冻干。

（5）改性后的脱细胞角膜羧基的-OH转化为氯元素

改性后的脱细胞角膜加入2.5 mL二氯甲烷中，滴加1 mL 三氯化磷，室温搅拌48h，将改性后的脱细胞角膜羧基的-OH转化为氯元素。悬蒸去除二氯甲烷和三氯化磷。

（6）抗炎药物的负载

浸入3 mL 10 mg/mL地塞米松溶液中，搅拌2 h，获得负载抗炎药物的脱细胞角膜基质。

将本实施例制备得到的改性脱细胞角膜进行如下性能测试：

1.表面亲疏水性检测

测试方法同前，结果表明脱细胞角膜接触角为67±1.29°，改性后的脱细胞腹膜接触角为99.3±2.47°，表明改性后脱细胞角膜的疏水性增强。

2.改性脱细胞角膜载药量检测

测试方法同前，检测波长为240 nm。结果表明脱细胞角膜的载药量为118±4.8 μg/mg。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种脱细胞基质的表面改性方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对脱细胞基质进行羧基活化；

（3）将接枝改性后的脱细胞基质去羧基保护；

（4）洗脱羧基保护基团；

2.根据权利要求1所述的脱细胞基质的表面改性方法，其特征在于，所述脱细胞基质包含脱细胞处理后的基质或交联改性后的脱细胞基质；步骤（1）所述的羧基活化所用的活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和/或N-羟基琥珀酰亚胺。

3.根据权利要求1所述的脱细胞基质的表面改性方法，其特征在于，步骤（2）中所述的苯丙氨酸的羧基保护使用酯化法、酰胺或酰肼法，或使用带有羧基保护基团的氨基酸衍生物，得到苯丙氨酸的衍生物。

4.根据权利要求1所述的脱细胞基质的表面改性方法，其特征在于，所述

经过了羧基保护的苯丙氨酸或苯丙氨酸的衍生物为L-苯丙氨酸苄酯盐酸盐或L-苯丙氨酸乙酯或苯丙氨酸甲酯。

5.根据权利要求1所述的脱细胞基质的表面改性方法，其特征在于，

所述步骤（3）中的羧基去保护的处理方法包括酯、酰胺、酰肼在酸或碱的催化下水解或热解、温和条件下酸解，以及苄酯的氢解中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的脱细胞基质的表面改性方法，其特征在于，所述的苄酯的氢解的用到的试剂包括H₂/Pd-C/乙醇、H₂/Pd(OH)₂-C/乙醇、β-巯基乙醇/BF₃/乙醚、HBr/冰醋酸/二氯乙酸、三甲基碘硅烷/四氯化碳中的一组以上。

7.根据权利要求1所述的脱细胞基质的表面改性方法，其特征在于，所述步骤（4）中的洗脱羧基保护基团的方法包括萃取、透析。

8.根据权利要求1-6任一所述的脱细胞基质的表面改性方法，其特征在于，所述步骤（5）中羧基转酰卤包括：将所述脱细胞基质与三氯化磷、五氯化磷、氯化亚砜、亚硫酰氯或草酰氯进行反应。

9.根据权利要求1-8任一项所述表面改性方法制备得到的表面改性的脱细胞基质。

10.权利要求9所述的表面改性的脱细胞基质在制备负载抗肿瘤药物、抗菌药物或抗炎症药物制剂中的应用。