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JP2005518803A - 短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いる遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害 - Google Patents

短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いる遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害 Download PDF

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JP2005518803A
JP2005518803A JP2003573107A JP2003573107A JP2005518803A JP 2005518803 A JP2005518803 A JP 2005518803A JP 2003573107 A JP2003573107 A JP 2003573107A JP 2003573107 A JP2003573107 A JP 2003573107A JP 2005518803 A JP2005518803 A JP 2005518803A
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sina
sina molecule
nucleotides
molecule
gene
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JP2005518803A5 (ja
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ベージェルマン，レオニド
チョウリラ，バラット
パブコ，パメラ
フォスナフ，キャシー
ジャミソン，シャロン
アスマン，ナシム
トンプソン，ジェームズ
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Original Assignee
Sirna Therapeutics Inc
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Abstract

本発明は，種々の用途，例えば，治療，診断，標的評価およびゲノム発見用途における使用において遺伝子発現を調節するのに有用な方法および試薬に関する。詳細には，本発明は，標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる小核酸分子，例えば，短干渉核酸（ｓｉＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子に関する。小核酸分子は細胞，組織または生物における遺伝子発現の調節に応答する任意の疾病または状態の治療において有用である。

Description

本発明は，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／３５８，５８０（２００２年２月２０日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／３６３，１２４（２００２年３月１１日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／３８６，７８２（２００２年６月６日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ米国特許出願６０／４０６，７８４（２００２年８月２９日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／４０８，３７８（２００２年９月５日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／４０９，２９３（２００２年９月９日出願），およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／４４０，１２９（２００３年１月１５日出願）に基づく優先権を主張する。これらの出願は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
本発明は，種々の用途，例えば，治療，診断，標的評価，および遺伝子発見用途における使用において，遺伝子発現を調節するのに有用な方法および試薬に関する。特に，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる小核酸分子，例えば短干渉核酸（ｓｉＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子に関連する。
以下は，ＲＮＡｉに関係する関連する技術の議論である。この議論は，以下に記載される本発明の理解のためにのみ提供される。この概要は，以下に記載される仕事のいずれかが本発明に対する先行技術であると認めるものではない。本出願人は，本発明において，化学的に修飾された短干渉核酸がｓｉＲＮＡ分子と同じく，ＲＮＡｉを媒介する能力を有し，インビボで改良された安定性および活性を有すると予測されることを示す。したがって，この議論は，ｓｉＲＮＡにのみ限定されることを意味するものではなく，ｓｉＮＡ全体に適用することができる。
ＲＮＡ干渉とは，動物において短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを表す（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物における対応するプロセスは一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと称され，真菌においてはクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは，外来遺伝子の発現を防止するために用いられる進化的に保存された細胞防御メカニズムであると考えられており，異なる叢および門が共通して有している（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。そのような外来遺伝子発現からの防御は，ウイルス感染または宿主ゲノム中へのトランスポゾン要素のランダムインテグレーションから生ずる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して，相同的一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答により進化してきたのであろう。細胞におけるｄｓＲＮＡの存在は，まだ完全には特性決定されていないメカニズムにより，ＲＮＡｉ応答を引き起こす。このメカニズムは，蛋白質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介性活性化の結果リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断が生ずるインターフェロン応答とは異なるようである。
細胞中に長いｄｓＲＮＡが存在すると，ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは，ｄｓＲＮＡをプロセシングして短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる短い断片のｄｓＲＮＡにすることに関与している（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサー活性から生ずる短干渉ＲＮＡは，典型的には約２１−２３ヌクレオチドの長さであり，約１９塩基対のデュープレックスを含む（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。ダイサーはまた，翻訳制御における関与が示唆されている保存された構造の前駆体ＲＮＡから２１および２２ヌクレオチドの小さな一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を切り出すことに関与することが示唆されている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた，一般にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし，これはｓｉＲＮＡデュープレックスのアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は，ｓｉＲＮＡデュープレックスのアンチセンス鎖に相補的な領域の中央部で生ずる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。
ＲＮＡｉは種々の系で研究されてきた。Ｆｉｒｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は，Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓにおいて最初にＲＮＡｉを観察した。ＷｉａｎｎｙおよびＧｏｅｔｚ（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，７０）は，マウス胚においてｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉを記載する。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は，ｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記載する。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）は，培養哺乳動物細胞，例えばヒト胚性腎臓細胞およびＨｅＬａ細胞において，合成の２１ヌクレオチドＲＮＡのデュープレックスを導入することにより誘導されるＲＮＡｉを記載する。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ，２０，６８７７）は，効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ，構造，化学組成，および配列についてのある種の要件を明らかにした。これらの研究は，２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡデュープレックスは３’末端ジヌクレオチドオーバーハングを含む場合に最も活性であることを示した。さらに，一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシ（２’−Ｈ）または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が破壊されるが，３’末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドを２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）で置換することは許容されることが示された。ｓｉＲＮＡデュープレックスの中心における単一のミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を破壊することが示された。さらに，これらの研究はまた，標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなくガイド配列の５’末端により規定されることを示した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究は，ｓｉＲＮＡデュープレックスの標的相補鎖の５’−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり，ｓｉＲＮＡの５’−リン酸成分を維持するためにＡＴＰが用いられることを示した（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。
２ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡデュープレックスの３’末端ヌクレオチドのオーバーハングしているセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置き換えても，ＲＮＡｉ活性に有害な影響を有しないことが示されている。ｓｉＲＮＡの各末端で４個までのヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置き換えることはよく許容されると報告されているが，デオキシリボヌクレオチドで完全に置換するとＲＮＡｉ活性がなくなる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７）。さらに，Ｅｌｂａｓｈｉｒら（上掲）はまた，ｓｉＲＮＡを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換すると，ＲＮＡｉ活性が完全に破壊されたことを報告する。Ｌｉら（国際公開ＷＯ００／４４９１４）およびＢｅａｃｈら（国際公開ＷＯ０１／６８８３６）は，ｓｉＲＮＡがリン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに窒素またはイオウ複素原子の少なくとも１つを含むよう修飾することができることを予備的に示唆する。しかし，いずれの出願も，ｓｉＲＮＡ分子においてそのような修飾がどの程度許容されるかを仮定しておらず，そのような修飾ｓｉＲＮＡのそれ以上の指針または実例を提供していない。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら（カナダ特許出願２，３５９，１８０）もまた，ｄｓＲＮＡコンストラクトにおいて二本鎖ＲＮＡ依存性蛋白質キナーゼＰＫＲの活性化を妨げる目的で用いるためのある種の化学的修飾，特に２’−アミノまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド，および２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドを記載する。しかし，Ｋｒｅｕｔｚｅｒらも同様に，ｓｉＲＮＡ分子においてこれらの修飾がどの程度許容されるかについての実例または指針を提供していない。
Ｐａｒｒｉｓｈら（２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６，１９７７−１０８７）は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて長い（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写産物を用いてｕｎｃ−２２遺伝子を標的とするある種の化学的修飾を試験した。著者らは，Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼによりチオリン酸ヌクレオチド類似体を取り込ませることによりこれらのｓｉＲＮＡ転写産物中にチオリン酸残基を導入すること，および２個のホスホロチオエート修飾塩基を有するＲＮＡもＲＮＡｉとしての有効性を実質的に低下させたことを記載する。さらに，Ｐａｒｒｉｓｈらは，２残基より多いホスホロチオエート修飾は，干渉活性をアッセイすることができないほど大きくインビトロでＲＮＡを不安定化させたことを報告する（同上，１０８１）。著者らはまた，長いｓｉＲＮＡ転写産物中のヌクレオチド糖の２’位におけるある種の修飾を試験して，リボヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置換すると，特にウリジンからチミジンおよび／またはシチジンからデオキシシチジンへの置換の場合に，干渉活性が実質的に減少することを見いだした（同上）。さらに，著者らは，ある種の塩基修飾，例えば，ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖において，ウラシルの代わりに４−チオウラシル，５−ブロモウラシル，５−ヨードウラシル，および３−（アミノアリル）ウラシル，およびグアニンの代わりにイノシンの置換を試験した。４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシル置換は許容されたように見えたが，Ｐａｒｒｉｓｈは，イノシンはいずれの鎖に取り込まれたときにも干渉活性における実質的な減少を生じたことを報告している。Ｐａｒｒｉｓｈはまた，アンチセンス鎖における５−ヨードウラシルおよび３−（アミノアリル）ウラシルの取り込みによっても，ＲＮＡｉ活性が実質的に減少したことを報告している。
より長いｄｓＲＮＡの使用が記載されている。例えば，Ｂｅａｃｈら（国際公開ＷＯ０１／６８８３６）は，内因性ｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を弱めるための特定の方法を記載する。Ｔｕｓｃｈｌら（国際公開ＷＯ０１／７５１６４）は，ショウジョウバエのインビトロＲＮＡｉシステム，およびある種の機能的ゲノム用途およびある種の治療用途に特定のｓｉＲＮＡ分子を用いることを記載する。しかし，Ｔｕｓｃｈｌ（２００１，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，２３９−２４５）は，インターフェロン応答の活性化の危険性のため，遺伝的疾病またはウイルス感染を治癒させるためにＲＮＡｉを用いることができることは疑わしいと述べている。Ｌｉら（国際公開ＷＯ００／４４９１４）は，ある種の標的遺伝子の発現を弱めるために特定のｄｓＲＮＡを用いることを記載する。Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら（国際公開ＷＯ０１／３６６４６）は，ある種のｄｓＲＮＡ分子を用いて哺乳動物細胞において特別の遺伝子の発現を阻害するある種の方法を記載する。Ｆｉｒｅら（国際公開ＷＯ９９／３２６１９）は，遺伝子発現の阻害に用いるためにある種のｄｓＲＮＡ分子を細胞内に導入するための特別の方法を記載する。Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら（国際公開ＷＯ００／０１８４６）は，特定のｄｓＲＮＡ分子を用いて細胞において特別の表現型を与える原因である特定の遺伝子を同定するある種の方法を記載する。Ｍｅｌｌｏら（国際公開ＷＯ０１／２９０５８）は，ｄｓＲＮＡ媒介性ＲＮＡｉに関与する特定の遺伝子の同定を記載する。Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅら（国際公開ＷＯ９９／０７４０９）は，ある種の抗ウイルス剤と組み合わせた特別のｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物を記載する。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（国際公開９９／５３０５０）は，ある種のｄｓＲＮＡを用いて植物細胞における核酸の表現型の発現を減少させるある種の方法を記載する。Ｄｒｉｓｃｏｌｌら（国際公開ＷＯ０１／４９８４４）は，標的生物において遺伝子サイレンシングを促進するのに用いるための特定のＤＮＡコンストラクトを記載する。
他の者は，種々のＲＮＡｉおよび遺伝子サイレンシングシステムを報告している。例えば，Ｐａｒｒｉｓｈら（２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６，１９７７−１０８７）は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｕｎｃ−２２遺伝子を標的とする特定の化学的に修飾されたｓｉＲＮＡコンストラクトを記載する。Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ（国際公開ＷＯ０１／３８５５１）は，植物においてある種のｄｓＲＮＡを用いてポリコーム遺伝子発現を制御するためのある種の方法を記載する。Ｃｈｕｒｉｋｏｖら（国際公開ＷＯ０１／４２４４３）は，ある種のｄｓＲＮＡを用いて生物の遺伝的特性を改変するある種の方法を記載する。Ｃｏｇｏｎｉら（国際公開ＷＯ０１／５３４７５）は，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａのサイレンシング遺伝子を単離するある種の方法およびその用途を記載する。Ｒｅｅｄら（国際公開ＷＯ０１／６８８３６）は，植物における遺伝子サイレンシングのある種の方法を記載する。Ｈｏｎｅｒら（国際公開ＷＯ０１／７０９４４）は，ある種のｄｓＲＮＡを用いてパーキンソン病のモデルとしてトランスジェニック線虫を用いる薬剤スクリーニングのある種の方法を記載する。Ｄｅａｋら（国際公開ＷＯ０１／７２７７４）は，ショウジョウバエにおけるＲＮＡｉに関連するかもしれないある種のショウジョウバエ由来遺伝子産物を記載する。Ａｒｎｄｔら（国際公開ＷＯ０１／９２５１３）は，ＲＮＡｉを増強する因子を用いて遺伝子抑制を媒介するある種の方法を記載する。Ｔｕｓｃｈｌら（国際公開ＷＯ０２／４４３２１）は，ある種の合成ｓｉＲＮＡコンストラクトを記載する。Ｐａｃｈｕｋら（国際公開ＷＯ００／６３３６４）およびＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎら（国際公開ＷＯ０１／０４３１３）は，ある種のｄｓＲＮＡを用いてある種のポリヌクレオチド配列の機能を阻害するためのある種の方法および組成物を記載する。Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉら（国際公開ＷＯ０２／３８８０５）は，ＲＮＡｉにより同定されたある種のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子を記載する。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら（国際公開ＷＯ０２／０５５６９２，ＷＯ０２／０５５６９３，およびＥＰ１１４４６２３Ｂ１）は，ＲＮＡｉを用いて遺伝子発現を阻害するある種の方法を記載する。Ｇｒａｈａｍら（国際公開ＷＯ９９／４９０２９およびＷＯ０１／７０９４９，およびＡＵ４０３７５０１）は，ベクターから発現されるある種のｓｉＲＮＡ分子を記載する。Ｆｉｒｅら（ＵＳ６，５０６，５５９）は，ＲＮＡｉを媒介するある種の長い（２５ヌクレオチドより長い）ｄｓＲＮＡコンストラクトを用いてインビトロで遺伝子発現を阻害するためのある種の方法を記載する。
本発明は，細胞においてＲＮＡ機能および／または遺伝子発現を調節するのに有用な化合物，組成物，および方法に関する。詳細には，本発明は，細胞においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子発現を調節しうる合成小核酸分子，例えば，短干渉核酸（ｓｉＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を特徴とする。本発明のｓｉＲＮＡは，化学的に合成してもよく，ベクターから発現させてもよく，または酵素的に合成してもよい。化学的に修飾されたｓｉＮＡを使用することにより，インビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性が増加し，および／または細胞取り込みが改良されることにより，天然のｓｉＲＮＡ分子の種々の特性を改良することができる。本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子は，種々の治療，診断，農業，標的評価，ゲノム発見，遺伝子工学およびファーマコゲノミクス用途に有用な試薬および方法を提供する。
非限定的例においては，化学的に修飾されたヌクレオチドを核酸分子中に導入することにより，外的にデリバリーされた天然のＲＮＡ分子に内在するインビボ安定性および生物利用性の潜在的な制限を克服する強力な道具が提供される。例えば，化学的に修飾された核酸分子は血清中でより長い半減期を有する傾向にあるため，化学的に修飾された核酸分子を使用することにより，所定の治療効果のための特定の核酸分子の投与量を少なくすることができる。さらに，ある種の化学的修飾は，特定の細胞または組織を標的とすることにより，および／または核酸分子の細胞取り込みを改良することにより，核酸分子の生物利用性を改良することができる。したがって，化学的に修飾された核酸分子の活性が天然の核酸分子と比較して，例えば，全ＲＮＡ核酸分子と比較したときに低下したとしても，分子の改良された安定性および／またはデリバリーのため，修飾された核酸分子の全体の活性は天然の分子より高い可能性がある。天然の未修飾ｓｉＲＮＡとは異なり，化学的に修飾されたｓｉＮＡはまた，ヒトにおいてインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限にすることができる。
本発明のｓｉＲＮＡ分子は，種々のＲＮＡ分子のＲＮＡｉターゲティングにより遺伝子発現を阻害するよう設計することができる。１つの態様においては，本発明のｓｉＲＮＡ分子を用いて，標的遺伝子に対応する種々のＲＮＡを標的とすることができる。そのようなＲＮＡの非限定的例としては，メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ），標的遺伝子の選択的ＲＮＡスプライシング変種，標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ，標的遺伝子のプレｍＲＮＡが挙げられる。選択的スプライシングによって適当なエクソンの使用により区別される転写産物のファミリーが生ずる場合，本発明を用いて，適当なエクソンを通して遺伝子発現を阻害して，遺伝子ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害するか，または区別することができる。例えば，選択的にスプライシングされた貫膜ドメインを含む蛋白質は，膜結合型および分泌型の両方で発現させることができる。本発明を用いて貫膜ドメインを含むエクソンを標的とすることにより，分泌型の蛋白質に対して，膜結合型の蛋白質の医薬品ターゲティングの機能的結論を決定することができる。これらのＲＮＡ分子のターゲティングに関連する本発明の用途の非限定的例には，治療用医薬品用途，医薬品発見用途，分子診断および遺伝子機能用途，および遺伝子マッピング，例えば，本発明のｓｉＲＮＡ分子による一塩基多型のマッピングを用いるものが挙げられる。そのような用途は，既知の遺伝子配列を用いて，または発現配列タグ（ＥＳＴ）から入手可能な部分配列から行うことができる。
別の態様においては，本発明のｓｉＲＮＡ分子を用いて，遺伝子ファミリーに対応する保存配列を標的とすることができる。したがって，ｓｉＲＮＡを用いて，種々の用途において，遺伝子機能の経路を特性決定することができる。例えば，本発明を用いて，経路における標的遺伝子の活性を阻害して，遺伝子機能分析，ｍＲＮＡ機能分析，または翻訳分析により，特性決定されていない遺伝子の機能を決定することができる。本発明を用いて，医薬品開発に向けて，種々の疾病および状態に関与する潜在的標的遺伝子経路を決定することができる。本発明を用いて，発生，例えば，出生前発生，出生後発生および／または加齢に関与する遺伝子発現の経路を理解することができる。
１つの態様においては，本発明は，ＲＮＡ干渉により遺伝子ファミリーの発現をダウンレギュレートする短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。遺伝子ファミリーは，標的遺伝子の２以上のスプライシング変種，標的遺伝子の２以上の転写後修飾ＲＮＡ，またはホモロジーを共有する２以上のＲＮＡ転写産物を含むことができる。１つの態様においては，遺伝子ファミリーは，表皮成長因子（例えば，ＥＧＦＲ，例えばＨＥＲ１，ＨＥＲ２，ＨＥＲ３，および／またはＨＥＲ４）遺伝子，血管内皮成長因子および血管内皮成長因子レセプター（例えば，ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦＲ１，ＶＥＧＦＲ２，またはＶＥＧＦＲ３）遺伝子，または異なるウイルス株に対応するウイルス遺伝子（例えば，ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）を含む。そのような遺伝子ファミリーは，核酸配列（例えば，表ＶのＧｅｎｂａｎｋ受託番号により示される配列）をホモロジーについて分析することにより確立することができる。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は１またはそれ以上の化学的修飾を含み，二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は約２１ヌクレオチドの長さである。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は，内因性哺乳動物標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は，内因性哺乳動物標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部と実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１９−約２３ヌクレオチドを含み，各鎖は他方の鎖のヌクレオチドに相補的な約１９ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は，内因性哺乳動物標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み，ｓｉＮＡはさらにセンス領域を含み，センス領域は内因性哺乳動物標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部と実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，アンチセンス領域およびセンス領域はそれぞれ約１９−約２３ヌクレオチドを含み，アンチセンス領域はセンス領域のヌクレオチドに相補的な約１９ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含み，アンチセンス領域は，内因性哺乳動物標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は２つの別々のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ，一方のフラグメントはｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み，第２のフラグメントはアンチセンス領域を含む。センス領域はポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介してアンチセンス領域と連結されていてもよい。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含み，アンチセンス領域は内因性哺乳動物標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域中のピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド，２’−デオキシヌクレオチド，および／または２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は２つの別々のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ，一方のフラグメントはｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み，第２のフラグメントはアンチセンス領域を含み，センス領域を含むフラグメントは，センス領域を含むフラグメントの５’末端，３’末端，または５’末端および３’末端の両方に末端キャップ成分を含む。別の態様においては，末端キャップ成分は反転デオキシ無塩基成分またはグリセリル成分である。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントのそれぞれは２１ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含み，アンチセンス領域は，内因性哺乳動物標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含み，アンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシ−プリンヌクレオチドである。別の態様においては，アンチセンス領域はアンチセンス領域の３’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の態様においては，アンチセンス領域は，アンチセンス領域の３’末端にグリセリル修飾を含む。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子）の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は２つの別々のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ，一方のフラグメントはｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み，第２のフラグメントはアンチセンス領域を含み，ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの約１９ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補的ヌクレオチドと塩基対形成しており，ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントのヌクレオチドと塩基対形成していない。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの２つの３’末端ヌクレオチドのそれぞれは２’−デオキシ−ピリミジン，例えば２’−デオキシ−チミジンである。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの２１ヌクレオチドすべてが，ｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補的ヌクレオチドと塩基対形成している。別の態様においては，アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドは，内因性哺乳動物標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部と塩基対形成している。別の態様においては，アンチセンス領域の２１ヌクレオチドは，内因性哺乳動物標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部と塩基対形成している。別の態様においては，前記アンチセンス領域を含むフラグメントの５’末端は任意にリン酸基を含んでいてもよい。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的ＲＮＡ配列（例えば，前記標的ＲＮＡ配列はヒト遺伝子によりコードされる）の発現を阻害する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まず，二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約２１ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明は，内因性哺乳動物標的遺伝子（例えばヒト遺伝子，例えば，血管内皮成長因子，血管内皮成長因子レセプター（例えば，ＶＥＧＦＲ１，ＶＥＧＦＲ２，ｏｒＶＥＧＦＲ３），ＢＣＬ２，ＨＥＲ２／ｎｅｕ，ｃ−Ｍｙｃ，ＰＣＮＡ，ＲＥＬ−Ａ，ＰＴＰ１Ｂ，ＢＡＣＥ，ＣＨＫ１，ＰＫＣ−アルファ，またはＥＧＦＲ）の発現を阻害する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は，内因性哺乳動物標的遺伝子の発現の前記阻害のためにｓｉＮＡ分子中にリボヌクレオチドの存在を必要とせず，二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約２１ヌクレオチドの長さである。
１つの態様においては，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子を含む医薬品を特徴とする。
１つの態様においては，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子を含む活性成分を特徴とする。
１つの態様においては，本発明は，二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を用いて内因性哺乳動物標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は，１またはそれ以上の化学的修飾を含み，二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は約２１ヌクレオチドの長さである。
１つの態様においては，本発明のｓｉＲＮＡ分子および／または方法は，表ＶにおいてＧｅｎｂａｎｋ受託番号により参照されるＲＮＡをコードする遺伝子の発現を阻害するために用いられる。別の態様においては，本発明のｓｉＲＮＡ分子および／または方法は，表ＶにおいてＧｅｎｂａｎｋ受託番号により参照されるＲＮＡ配列，または表ＶにおいてＧｅｎｂａｎｋ受託番号により参照される配列をコードする核酸配列を標的とするために用いられる。そのような配列は，表ＶにおけるＧｅｎｂａｎｋ受託番号を用いて容易に入手することができる。
１つの態様においては，本発明は，蛋白質をコードするＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は，蛋白質をコードする配列を有するＲＮＡに相補的な配列，例えば，表Ｖに示されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する配列を含む。
別の態様においては，本発明は，遺伝子に対するＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は，遺伝子，例えば，表Ｖに示されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する配列をコードする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用し，このことにより遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含み，例えば，ｓｉＮＡは，遺伝子のクロマチン構造を調節して遺伝子の転写を防止する細胞プロセスにより遺伝子発現の制御を媒介する。
さらに別の態様においては，本発明は，表Ｖに示されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号により表される配列または前記配列に相補的な配列，例えば，ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。
１つの態様においては，ＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング応答のメディエータとして作用する本発明の核酸分子は，化学的に修飾された二本鎖核酸分子である。その天然の二本鎖ＲＮＡ対応物におけるように，これらのｓｉＮＡ分子は，典型的には，約１９−約２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド間に約１９塩基対を含むデュープレックスから構成される。最も活性なｓｉＲＮＡ分子は，１−３ヌクレオチドのオーバーハング末端を有するデュープレックス，例えば，１９塩基対および２ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する２１ヌクレオチドのデュープレックスを有すると考えられている。これらのオーバーハングしているセグメントは，インビボでエンドヌクレアーゼにより容易に加水分解される。研究によれば，２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡデュープレックスの３’−オーバーハングセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置き換えても，ＲＮＡｉ活性に有害な影響を有しないことが示されている。ｓｉＲＮＡのそれぞれの末端で４ヌクレオチドまでをデオキシリボヌクレオチドで置き換えることはよく許容されると報告されているが，完全にデオキシリボヌクレオチドで置き換えるとＲＮＡｉ活性はなくなる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯＪ．，２０，６８７７）。さらに，Ｅｌｂａｓｈｉｒら（上掲）はまた，ｓｉＲＮＡを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が完全に破壊されたことを報告する。Ｌｉら（国際公開ＷＯ００／４４９１４）およびＢｅａｃｈら（国際公開ＷＯ０１／６８８３６）はいずれも，ｓｉＲＮＡはリン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに窒素またはイオウ複素原子の少なくとも１つを含む修飾を含むことができることを示唆するが，いずれの出願も，ｓｉＲＮＡ分子においてそのような修飾がどの程度許容されるかを教示しておらず，そのような修飾ｓｉＲＮＡの例を提供していない。ＫｒｅｕｔｚｅｒおよびＬｉｍｍｅｒ（カナダ特許出願２，３５９，１８０）もまた，ｄｓＲＮＡコンストラクトにおいて二本鎖ＲＮＡ依存性蛋白質キナーゼＰＫＲの活性化を妨げる目的で用いるためのある種の化学的修飾，特に２’−アミノまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド，および２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドを記載する。しかし，ＫｒｅｕｔｚｅｒおよびＬｉｍｍｅｒも同様に，ｓｉＲＮＡ分子においてこれらの修飾がどの程度許容されるかを示しておらず，そのようなｓｉＲＮＡの例を提供していない。
１つの態様においては，本発明は，細胞において，標的核酸分子（すなわち，本明細書において表ＶのＧｅｎｂａｎｋ受託番号で参照される配列を含むかこれによりコードされる標的核酸分子）に対する特異性を有する化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを特徴とする。そのような化学的修飾の非限定的例としては，限定されないが，ホスホロチオエートヌクレオチド間結合，２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド，２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド，２’−デオキシリボヌクレオチド，“万能塩基”ヌクレオチド，５−Ｃ−メチルヌクレオチド，および反転デオキシ無塩基残基を組み込むことが挙げられる。これらの化学的修飾は，種々のｓｉＮＡコンストラクト中で用いた場合，細胞においてＲＮＡｉ活性を保ち，同時に，これらの化合物の血清安定性を劇的に増加させることが示されている。さらに，Ｐａｒｒｉｓｈら（上掲）により公表されたデータに反して，本発明においては，多数（２以上）のホスホロチオエート置換が充分に許容され，修飾ｓｉＮＡコンストラクトの血清安定性を実質的に増加させることが示される。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら，修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドを用いて，インビトロまたはインビボでの特性，例えば安定性，活性，および／または生物利用性を改良することができる。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数のパーセンテージとして修飾ヌクレオチドを含むことができる。すなわち，本発明のｓｉＮＡ分子は，一般に，ヌクレオチド位置の約５％−約１００％（例えば，ヌクレオチド位置の５％，１０％，１５％，２０％，２５％，３０％，３５％，４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％または１００％）の修飾ヌクレオチドを含むことができる。所定のｓｉＮＡ分子中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは，ｓｉＮＡ中に存在するヌクレオチドの総数によって異なる。ｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合，修飾のパーセントは一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。同様に，ｓｉＮＡ分子が二本鎖である場合，修飾のパーセントは，センス鎖，アンチセンス鎖，またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。さらに，所与のｓｉＮＡ分子中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは，ｓｉＮＡ中に存在するプリンおよびピリミジンヌクレオチドの総数，例えば，ｓｉＮＡ分子中に存在するすべてのピリミジンヌクレオチドおよび／またはすべてのプリンヌクレオチドが修飾されているかにも依存する。
本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は，前記アンチセンス領域の３’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。アンチセンス領域は，前記アンチセンス領域の５’末端に約１−約５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドオーバーハングは，核酸の糖，塩基，または骨格で化学的に修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。３’末端ヌクレオチドオーバーハングは，１またはそれ以上の万能塩基リボヌクレオチドを含むことができる。３’末端ヌクレオチドオーバーハングは，１またはそれ以上の非環状ヌクレオチドを含むことができる。
本発明の１つの態様は，本発明の少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を，核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを提供する。本発明の別の態様は，そのような発現ベクターを含む哺乳動物細胞を提供する。哺乳動物細胞はヒト細胞であってもよい。発現ベクターのｓｉＮＡ分子は，センス領域およびアンチセンス領域を含むことができる。アンチセンス領域は蛋白質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列に相補的な配列を含むことができ，センス領域はアンチセンス領域に相補的な配列を含むことができる。ｓｉＮＡ分子は，相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する２つの別々の鎖を含むことができる。ｓｉＮＡ分子は，相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する一本の鎖を含むことができる。
１つの態様においては，本発明は，細胞の内部でまたは再構成されたインビトロ系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，化学的修飾は，式Ｉ：
Figure 2005518803
 ［式中，
各Ｒ１およびＲ２は，独立して，任意のヌクレオチド，非ヌクレオチド，またはポリヌクレオチドであり，これは天然に生ずるものであっても化学的に修飾されたものでもよく，各ＸおよびＹは，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｎ，アルキル，または置換アルキルであり，各ＺおよびＷは，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｎ，アルキル，置換アルキル，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，アルカリール，またはアラルキルであり，Ｗ，Ｘ，Ｙ，およびＺは任意に全てＯでなくてもよい］
を有する骨格修飾ヌクレオチド間結合を含む，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。
例えば任意のＺ，Ｗ，Ｘ，および／またはＹが独立してイオウ原子を含む式Ｉを有する化学的に修飾されたヌクレオチド間結合は，ｓｉＮＡデュープレックスの一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に，例えば，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の式Ｉを有する化学的に修飾されたヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の５’末端に，約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の式Ｉを有する化学的に修飾されたヌクレオチド間結合を含むことができる。別の非限定的例においては，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に式Ｉを有する化学的に修飾されたヌクレオチド間結合を有する１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のピリミジンヌクレオチドを含むことができる。さらに別の非限定的例においては，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に，式Ｉを有する化学的に修飾されたヌクレオチド間結合を有する１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のプリンヌクレオチドを含むことができる。別の態様においては，式Ｉのヌクレオチド間結合を有する本発明のｓｉＮＡ分子はまた，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有する化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞の内部でまたは再構成されたインビトロ系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，化学的修飾は，式ＩＩ：
Figure 2005518803
 ［式中，
各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１およびＲ１２は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリールまたはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ２，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，または式１を有する基であり；Ｒ９は，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり，Ｂは，ヌクレオシド塩基，例えば，アデニン，グアニン，ウラシル，シトシン，チミン，２−アミノアデノシン，５−メチルシトシン，２，６−ジアミノプリン，または標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい他の任意の天然に生じない塩基，または非ヌクレオシド塩基，例えば，フェニル，ナフチル，３−ニトロピロール，５−ニトロインドール，ネブラリン，ピリドン，ピリジノン，または標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい他の任意の天然に生じない万能塩基である］
を有する１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。
式ＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドは，ｓｉＮＡデュープレックスの一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖，例えば，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は，１またはそれ以上の式ＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に含むことができる。例えば，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の式ＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の５’末端に含むことができる。別の非限定的例においては，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の式ＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端に含むことができる。
１つの態様においては，本発明は，細胞の内部でまたは再構成されたインビトロ系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，化学的修飾は，式ＩＩＩ：
Figure 2005518803
 ［式中，
各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１およびＲ１２は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリールまたはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ２，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，または式１を有する基であり；Ｒ９は，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり，Ｂは，ヌクレオシド塩基，例えば，アデニン，グアニン，ウラシル，シトシン，チミン，２−アミノアデノシン，５−メチルシトシン，２，６−ジアミノプリン，または標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよいように用いることができる他の任意の天然に生じない塩基，または非ヌクレオシド塩基，例えば，フェニル，ナフチル，３−ニトロピロール，５−ニトロインドール，ネブラリン，ピリドン，ピリジノン，または標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい他の任意の天然に生じない万能塩基である］
を有する１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。
式ＩＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドは，ｓｉＮＡデュープレックスの一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に，例えば，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に，１またはそれ以上の式ＩＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができる。例えば，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の５’末端に，約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の式ＩＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができる。別の非限定的例においては，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端に，約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の式ＩＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができる。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，式ＩＩまたはＩＩＩを有するヌクレオチドを含み，ここで，式ＩＩまたはＩＩＩを有するヌクレオチドは反転のコンフィギュレーションである。例えば，式ＩＩまたはＩＩＩを有するヌクレオチドは，ｓｉＮＡコンストラクトに３’−３’，３’−２’，２’−３’，または５’−５’コンフィギュレーションで，例えば，ｓｉＮＡ鎖の一方または両方の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に結合させることができる。
１つの態様においては，本発明は，細胞の内部でまたは再構成されたインビトロ系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，化学的修飾は，式ＩＶ：
Figure 2005518803
 ［式中，
各ＸおよびＹは，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｎ，アルキル，置換アルキル，またはアルキルハロであり；各ＺおよびＷは，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｎ，アルキル，置換アルキル，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，アルカリール，アラルキル，またはアルキルハロであり；Ｗ，Ｘ，ＹおよびＺはすべてＯではない］
を有する５’末端リン酸基を含む。
１つの態様においては，本発明は，標的−相補的鎖，例えば，標的ＲＮＡに相補的な鎖に式ＩＶを有する５’末端リン酸基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡ分子は，全ＲＮＡ ｓｉＮＡ分子を含む。別の態様においては，本発明は，標的−相補的鎖に式ＩＶを有する５’末端リン酸基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡ分子はまた，一方または両方の鎖の３’末端に約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）のデオキシリボヌクレオチドを有する，約１−約３（例えば，約１，２，または３）ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む。別の態様においては，式ＩＶを有する５’末端リン酸基は，本発明のｓｉＮＡ分子，例えば式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有する化学的修飾を有するｓｉＮＡ分子の標的−相補的鎖に存在する。
１つの態様においては，本発明は，細胞の内部でまたは再構成されたインビトロ系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，化学的修飾は１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。例えば，非限定的例においては，本発明は，一方のｓｉＮＡ鎖に約１，２，３，４，５，６，７，８個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。さらに別の態様においては，本発明は，両方のｓｉＮＡ鎖に独立して約１，２，３，４，５，６，７，８個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は，ｓｉＮＡデュープレックスのオリゴヌクレオチド鎖の一方または両方に，例えば，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の５’末端に，約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，個またはそれ以上）の連続するホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。別の非限定的例においては，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。さらに別の非限定的例においては，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。
１つの態様においては，本発明は，センス鎖が１またはそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，および／または約１またはそれ以上の（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含み；かつ，アンチセンス鎖が約１−約１０個またはそれ以上，特に約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にアンチセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては，センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１またはそれ以上の，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチルおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており，同じまたは異なる鎖に存在する，１またはそれ以上の，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を有していても有していなくてもよい。
別の態様においては，本発明は，センス鎖が約１−約５個，特に約１，２，３，４，または５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含み；かつ，アンチセンス鎖が約１−約５個またはそれ以上，特に約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にアンチセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては，センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１またはそれ以上，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチルおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており，同じまたは異なる鎖に存在する，約１−約５個またはそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を有していても有してなくてもよい。
１つの態様においては，本発明は，アンチセンス鎖が１またはそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または約１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含み；かつ，アンチセンス鎖が約１−約１０個またはそれ以上，特に約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にアンチセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては，センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１またはそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチルおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており，同じまたは異なる鎖に存在する１またはそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を有していても有していなくてもよい。
別の態様においては，本発明は，アンチセンス鎖が約１−約５個またはそれ以上，特に約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含み；かつ，アンチセンス鎖が約１−約５個またはそれ以上，特に約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にアンチセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含む，ｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては，センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１またはそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチルおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており，同じ鎖または異なる鎖に存在する約１−約５個，例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または，３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を有していても有していなくてもよい。
１つの態様においては，本発明は，ｓｉＮＡ分子の各鎖に約１−約５個，特に約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する，化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，２’−５’ヌクレオチド間結合を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。２’−５’ヌクレオチド間結合は，ｓｉＮＡ配列鎖の一方または両方の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在することができる。さらに，２’−５’ヌクレオチド間結合は，ｓｉＮＡ配列鎖の一方または両方の種々の他の位置に存在することができ，例えば，ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖のピリミジンヌクレオチドの約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上，例えばすべてのヌクレオチド間結合は，２’−５’ヌクレオチド間結合を含むことができ，またはｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖のプリンヌクレオチドの約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上，例えばすべてのヌクレオチド間結合は，２’−５’ヌクレオチド間結合を含むことができる。
別の態様においては，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子は，２つの鎖を有するデュープレックスを含み，この一方または両方を化学的に修飾することができ，各鎖は約１８−約２７（例えば，約１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，または２７）ヌクレオチドの長さであり，デュープレックスは約１８−約２３（例えば，約１８，１９，２０，２１，２２，または２３）塩基対を有し，化学的修飾は，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有する構造を含む。例えば，本発明の化学的に修飾された例示的なｓｉＮＡ分子は２つの鎖を有するデュープレックスを含み，この一方または両方は式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有する化学的修飾で化学的に修飾されていてもよく，各鎖は約２１ヌクレオチドからなり，それぞれは２−ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有し，デュープレックスは約１９塩基対を有する。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖ヘアピン構造を有し，ここで，ｓｉＮＡは約３６−約７０（例えば，約３６，４０，４５，５０，５５，６０，６５，または７０）ヌクレオチドの長さであり，約１８−約２３（例えば，約１８，１９，２０，２１，２２，または２３）塩基対を有し，ｓｉＮＡは式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有する構造を含む化学的修飾を含むことができる。例えば，本発明の化学的に修飾された例示的なｓｉＮＡ分子は，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有する化学的修飾で化学的に修飾された，約４２−約５０（例えば，約４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，または５０）ヌクレオチドを有する直鎖状オリゴヌクレオチドを含み，ここで，直鎖状オリゴヌクレオチドは約１９塩基対および２−ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有するヘアピン構造を形成する。別の態様においては，本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子はステムループモチーフを含み，ここで，ｓｉＮＡ分子のループ部分は生物分解性である。例えば，本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解により３’末端オーバーハング，例えば約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成されうるように設計される。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は環状核酸分子を含み，ここで，ｓｉＮＡは約３８−約７０（例えば，約３８，４０，４５，５０，５５，６０，６５，または７０）ヌクレオチドの長さであり，約１８−約２３（例えば，約１８，１９，２０，２１，２２，または２３）塩基対を有し，ｓｉＮＡは化学的修飾を含むことができ，これは式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有する構造を含む。例えば，本発明の化学的に修飾された例示的なｓｉＮＡ分子は，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有する化学的修飾で化学的に修飾された約４２−約５０（例えば，約４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，または５０）ヌクレオチドを有する環状オリゴヌクレオチドを含み，環状オリゴヌクレオチドは約１９塩基対および２個のループを有するダンベル形状の構造を形成する。
別の態様においては，本発明の環状ｓｉＮＡ分子は，２つのループモチーフを含み，ここで，ｓｉＮＡ分子のループ部分の一方または両方は生物分解性である。例えば，本発明の環状ｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解により，３’末端オーバーハング，例えば約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成することができるように設計される。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，少なくとも１つ（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の無塩基成分，例えば，式Ｖ：
Figure 2005518803
 ［式中，
各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，およびＲ１３は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリールまたはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ２，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，または式１を有する基であり；Ｒ９は，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，またはＣＦ２である］
を有する化合物を含む。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，少なくとも１つ（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の反転無塩基成分，例えば，式ＶＩ：
Figure 2005518803
 ［式中，
各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，およびＲ１３は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリールまたはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ２，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，または式Ｉを有する基であり；Ｒ９は，０，Ｓ，ＣＨ２，Ｓ＝０，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ８またはＲ１３のいずれかは，本発明のｓｉＮＡ分子への結合の点として働く］
を有する化合物を含む。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，少なくとも１つ（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，またはそれ以上）の置換ポリアルキル成分，例えば，式ＶＩＩ：
Figure 2005518803
 ［式中，各ｎは，独立して，１−１２の整数であり，各Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリールまたはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ２，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，または式Ｉを有する基であり，Ｒ１，Ｒ２またはＲ３は，本発明のｓｉＮＡ分子への結合の点として働く］
を有する化合物を含む。
別の態様においては，本発明は，Ｒ１およびＲ２はヒドロキシル（ＯＨ）基であり，ｎは１であり，Ｒ３はＯを含み，かつ本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方への，または本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子への結合の点である，式ＶＩＩを有する化合物を特徴とする。この修飾は，本明細書において"グリセリル"と称される（例えば，図２２の修飾６を参照）。
別の態様においては，式Ｖ，ＶＩまたはＶＩＩのいずれかを有する本発明の成分は，本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在する。例えば，式Ｖ，ＶＩまたはＶＩＩを有する成分は，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖，センス鎖，またはアンチセンス鎖およびセンス鎖の両方の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在することができる。さらに，式ＶＩＩを有する成分は，本明細書に記載されるように，ヘアピンｓｉＮＡ分子の３’末端または５’末端に存在することができる。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，式ＶまたはＶＩを有する無塩基残基を含み，ここで，式ＶＩまたはＶＩを有する無塩基残基は，３’−３’，３’−２’，２’−３’，または５’−５’コンフィギュレーションで，例えば，一方または両方のｓｉＮＡ鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方でｓｉＮＡコンストラクトに結合している。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，例えば，ｓｉＮＡ分子の５’末端，３’末端，５’末端および３’末端の両方，またはそれらの任意の組み合わせにおいて，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，例えば，ｓｉＮＡ分子の５’末端，３’末端，５’末端および３’末端の両方，またはそれらの任意の組み合わせにおいて，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の非環状ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されたｓｉＮＡがセンス領域を含む，本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，センス領域中に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上，またはすべての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），かつ，センス領域中に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上，またはすべての）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されたｓｉＮＡがセンス領域を含む，本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，センス領域中に存在する任意の（例えば１またはそれ以上，またはすべての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），かつ，センス領域中に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上，またはすべての）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである），ここで，前記センス領域中に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されたｓｉＮＡがアンチセンス領域を含む，本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上，またはすべての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），かつ，アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上，またはすべての）プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されたｓｉＮＡがアンチセンス領域を含む，本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上，またはすべての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），かつ，アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上，またはすべての）プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである），ここで，前記アンチセンス領域中に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されたｓｉＮＡがアンチセンス領域を含む本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上，またはすべての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），かつ，アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上，またはすべての）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては，本発明は，細胞の内部または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる，本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，化学的に修飾されたｓｉＮＡはセンス領域およびアンチセンス領域を含む。センス領域は，１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），および１またはそれ以上の２’−デオキシプリンヌクレオチド（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）を含む。センス領域の３’末端，５’末端，または３’末端，および５’末端の両方に反転デオキシ無塩基修飾が存在していてもよい。センス領域はさらに約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の２’−デオキシリボヌクレオチドを有する３’末端オーバーハングを含んでいてもよい。アンチセンス領域中は，１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），および１またはそれ以上の２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）を含む。末端キャップ修飾，例えば，本明細書に記載されるかまたは図２２に示されるいずれかの修飾が，アンチセンス配列の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在してもよい。アンチセンス領域はさらに任意に，約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の２’−デオキシヌクレオチドを有する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよく，ここでオーバーハングヌクレオチドはさらに１またはそれ以上（例えば，１，２，３，または４個）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡの非限定的例は図１８および１９および本明細書の表ＩＶに示される。
１つの態様においては，本発明は，細胞の内部でまたは再構築されたインビトロ系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ｓｉＮＡは，センス領域およびアンチセンス領域を含み，センス領域は１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは，複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），および１またはそれ以上のプリンリボヌクレオチド（例えば，すべてのプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであるか，あるいは，複数のプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドである）を含み，アンチセンス領域は１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは，複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），および１またはそれ以上の２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか，あるいは，複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）を含む。センス領域の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に反転デオキシ無塩基修飾が存在していてもよい。センス領域はさらに任意に，約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の２’−デオキシリボヌクレオチドを有する３’末端オーバーハングを含む。末端キャップ修飾，例えば，本明細書に記載されるか図２２に示されるいずれかの修飾が，アンチセンス配列の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に任意に存在していてもよい。アンチセンス領域はさらに任意に，約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の２’−デオキシヌクレオチドを有する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよく，オーバーハングヌクレオチドはさらに，１またはそれ以上（例えば，１，２，３，または４個）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡの非限定的例は，図１８および１９および本明細書の表ＩＶに示される。
１つの態様においては，本発明は，細胞内または再構築されたインビトロ系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，化学的に修飾されたｓｉＮＡは，センス領域およびアンチセンス領域を含み，センス領域は１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドを含み（例えばすべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），および２’−デオキシヌクレオチド，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される１またはそれ以上のプリンヌクレオチドを含み（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが，２’−デオキシヌクレオチド，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択されるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが，２’−デオキシヌクレオチド，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される），アンチセンス領域は１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドを含み（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），および２’−デオキシヌクレオチド，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される１またはそれ以上のプリンヌクレオチドを含む（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが，２’−デオキシヌクレオチド，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択されるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが，２’−デオキシヌクレオチド，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される）。任意にセンス領域の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に反転デオキシ無塩基修飾が存在してもよい。センス領域は，任意に約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の２’−デオキシリボヌクレオチドを有する３’末端オーバーハングをさらに含んでいてもよい。末端キャップ修飾，例えば，本明細書に記載されるかまたは図２２に示される任意の修飾が，アンチセンス配列の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の２’−デオキシヌクレオチドを有する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよく，ここで，オーバーハングヌクレオチドはさらに，１またはそれ以上（例えば，１，２，３，または４個）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子中に存在する任意の修飾ヌクレオチドは，好ましくは，本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に存在するが，また任意に，センスおよび／またはアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に存在していてもよく，これは，天然に生ずるリボヌクレオチドと類似する特性または特徴を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば，本発明は，ノザンコンフォメーション（例えば，ノザン偽回転サイクル，例えば，Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ．，１９８４を参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。このように，本発明のｓｉＮＡ分子中に存在する化学的に修飾されたヌクレオチドは，好ましくは，本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に存在するが，また任意にセンスおよび／またはアンチセンス鎖およびセンス鎖の両方に存在してもよく，これはヌクレアーゼ分解に対して耐性であると同時にＲＮＡｉを媒介する能力を維持する。ノザンコンフィギュレーションを有するヌクレオチドの非限定的例としては，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば，２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド，２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド，２’−アジドヌクレオチド，および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。
１つの態様においては，本発明は，細胞の内部でまたは再構成されたインビトロ系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる化学的に修飾された短干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を特徴とし，ここで，化学的修飾は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に共有結合したコンジュゲートを含む。別の態様においては，コンジュゲートは化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に生物分解性リンカーを介して共有結合している。１つの態様においては，コンジュゲート分子は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端に結合している。別の態様においては，コンジュゲート分子は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の５’末端に結合している。さらに別の態様においては，コンジュゲート分子は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端および５’末端の両方，またはそれらの任意の組み合わせに結合している。１つの態様においては，本発明のコンジュゲート分子は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子の生物学的システム（例えば細胞）へのデリバリーを促進する分子を含む。別の態様においては，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に結合したコンジュゲート分子は，ポリエチレングリコール，ヒト血清アルブミン，または細胞取り込みを媒介することができる細胞レセプターのリガンドである。化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に結合させることができる，本発明により企図される特定のコンジュゲート分子の例は，Ｖａｒｇｅｅｓｅら（米国特許出願１０／２０１，３９４，本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。用いられるコンジュゲートのタイプおよび本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲーションの程度は，同時にｓｉＮＡがＲＮＡｉ活性を媒介する能力を維持しながら，ｓｉＮＡコンストラクトの改良された薬物動態学プロファイル，生物利用性，および／または安定性について評価することができる。このように，当業者は，例えば，当該技術分野において一般的に知られる動物モデルにおいて，種々のコンジュゲートで修飾されたｓｉＮＡコンストラクトをスクリーニングして，ｓｉＮＡコンジュゲート複合体がＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら改良された特性を有するかを判定することができる。
１つの態様においては，本発明は，ｓｉＮＡがさらにｓｉＮＡのセンス領域とｓｉＮＡのアンチセンス領域とを連結させるヌクレオチド，非ヌクレオチド，または混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含む本発明の短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの態様においては，本発明のヌクレオチドリンカーは，２ヌクレオチド以上の長さ，例えば，３，４，５，６，７，８，９，または１０ヌクレオチドの長さのリンカーでありうる。別の態様においては，ヌクレオチドリンカーは，核酸アプタマーであってもよい。本明細書において用いる場合，"アプタマー"または"核酸アプタマー"とは，標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し，ここで，核酸分子は，その天然の設定において標的分子により認識される配列を含む配列を有する。あるいは，アプタマーは天然には核酸に結合しない標的分子に結合する核酸分子であってもよい。標的分子は目的とする任意の分子でありうる。例えば，アプタマーを用いて蛋白質のリガンド結合ドメインに結合させ，このことにより，天然に生ずるリガンドと蛋白質との相互作用を妨害することができる。これは非限定的例であり，当業者は当該技術分野において一般に知られる手法を用いて他の態様を容易に生成しうることを認識するであろう（例えば，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；およびＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照）。
さらに別の態様においては，本発明の非ヌクレオチドリンカーには，無塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質，ポリ炭化水素，または他のポリマー性化合物（例えば，ポリエチレングリコール，例えば２−１００個のエチレングリコール単位を有するもの）が含まれる。特定の例としては，Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，７５：６３５３およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７，７５：３１１３；Ｃｌｏａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１７３：６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，７７３：５１０９；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２７：２５８５およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，７５：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９１，１０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９３，３４：３０１；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１９１０およびＦｅｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，７７３：４０００（すべて本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが挙げられる。"非ヌクレオチド"はさらに，１またはそれ以上のヌクレオチドユニットの代わりに糖および／またはリン酸置換のいずれかにより核酸鎖中に取り込むことができ，残りの塩基がその酵素活性を発揮することを可能とする任意の基または化合物を意味する。基または化合物は，般に認識されているヌクレオチド塩基，例えばアデノシン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを，例えば糖のＣ１位に含まない場合，無塩基でありうる。
１つの態様においては，本発明は，細胞の内部または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てられたｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖はリボヌクレオチドを含まない。例えば，ｓｉＮＡ分子は，単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられていてもよく，ここで，ｓｉＮＡのセンス領域およびアンチセンス領域は，オリゴヌクレオチド中に存在するリボヌクレオチド（例えば，２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を有しない別々のオリゴヌクレオチドを含む。別の例においては，ｓｉＮＡ分子は，単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられていてもよく，ここで，ｓｉＮＡのセンス領域およびアンチセンス領域は，本明細書に記載されるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーにより連結されているかまたは環化されており，オリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチド中に存在するリボヌクレオチド（例えば，２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を有しない。本出願人は，驚くべきことに，ＲＮＡｉ活性を支持するためには，ｓｉＮＡ分子中におけるリボヌクレオチド（例えば，２’−ヒドロキシル基を有するヌクレオチド）の存在が必要または必須ではないことを見いだした。したがって，１つの態様においては，ｓｉＮＡ中のすべての位置は，ｓｉＮＡ分子が細胞においてＲＮＡｉ活性を支持する能力が維持される程度に，化学的に修飾されたヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド，例えば，式Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ，またはＶＩＩを有するヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドまたはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，細胞または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であり，ここで，ｓｉＮＡ分子は，標的核酸配列に対して相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含む。別の態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，５’末端リン酸基を含む。別の態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は５’末端リン酸基および３’末端リン酸基（例えば，２’，３’−環状リン酸）を含む。別の態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，約１９−約２９ヌクレオチドを含む。さらに別の態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，本明細書に記載される１またはそれ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。例えば，細胞中においてｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を支持する能力が維持される程度に，ｓｉＮＡ分子中のすべての位置で，化学的に修飾されたヌクレオチド，例えば式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，細胞または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であり，ここで，ｓｉＮＡ分子は，標的核酸配列に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡ中に存在する１またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），アンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである），および末端キャップ修飾，例えば本明細書に記載されるかまたは図２２に示される任意の修飾を含み，これは任意にアンチセンス配列の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在してもよく，ｓｉＮＡはさらに任意に，ｓｉＮＡ分子の３’末端に約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の末端２’−デオキシヌクレオチドを含んでいてもよく，ここで，末端ヌクレオチドはさらに１またはそれ以上（例えば，１，２，３，または４個）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができ，ｓｉＮＡはさらに任意に末端リン酸基，例えば５’末端リン酸基を含むことができる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，細胞または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であり，ここで，ｓｉＮＡ分子は，標的核酸配列に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡ中に存在する１またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），およびアンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるかあるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである），および末端キャップ修飾，例えば，本明細書に記載されるかまたは図２２に示される任意の修飾を含み，これは任意にアンチセンス配列の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在してもよく，ｓｉＮＡはさらに任意にｓｉＮＡ分子の３’末端に約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の末端２’−デオキシヌクレオチドを含んでいてもよく，ここで末端ヌクレオチドはさらに１またはそれ以上（例えば，１，２，３，または４個）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができ，ｓｉＮＡはさらに任意に，末端リン酸基，例えば５’末端リン酸基を含むことができる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，細胞または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であり，ここで，ｓｉＮＡ分子は，標的核酸配列に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡ中に存在する１またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），アンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドはロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであり（例えば，すべてのプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドであるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドである），および末端キャップ修飾，例えば，本明細書に記載されるかまたは図２２に示される任意の修飾を含み，これは任意にアンチセンス配列の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在していてもよく，ｓｉＮＡはさらに任意に，ｓｉＮＡ分子の３’末端に約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の末端２’−デオキシヌクレオチドを含んでいてもよく，ここで末端ヌクレオチドはさらに１またはそれ以上（例えば，１，２，３，または４個）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができ，ｓｉＮＡはさらに任意に，末端リン酸基，例えば５’末端リン酸基を含むことができる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，細胞または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であり，ここで，ｓｉＮＡ分子は，標的核酸配列に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡ中に存在する１またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば，すべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），およびアンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドであり（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドであるか，あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである），および末端キャップ修飾，例えば，本明細書に記載されるかまたは図２２に示される任意の修飾を含み，これは任意にアンチセンス配列の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在していてもよく，ｓｉＮＡはさらに任意に，ｓｉＮＡ分子の３’末端に約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の末端２’−デオキシヌクレオチドを含んでいてもよく，ここで末端ヌクレオチドはさらに１またはそれ以上（例えば，１，２，３，または４個）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができ，ｓｉＮＡはさらに任意に，末端リン酸基，例えば５’末端リン酸基を含むことができる。
別の態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在する任意の修飾ヌクレオチドは，天然に生ずるリボヌクレオチドと類似する特性または特徴を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば，本発明は，ノザンコンフォメーション（例えば，ノザン偽回転（ｐｓｅｕｄｏｒｏｔａｔｉｏｎ）サイクル（例えば，Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ．，１９８４を参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。このように，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在する化学的に修飾されたヌクレオチドは，好ましくは，ヌクレアーゼ分解に耐性であり，同時にＲＮＡｉを媒介する能力を維持する。
１つの態様においては，本発明は，細胞中において遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；そして（ｂ）細胞における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入する，ことを含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞中において遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み，ｓｉＮＡのセンス鎖配列は標的ＲＮＡの配列と実質的に類似する配列を含み；そして（ｂ）細胞中における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入する，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，細胞中において２以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；そして（ｂ）細胞における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入する，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，細胞中において２以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み，ｓｉＮＡのセンス鎖配列は，標的ＲＮＡの配列と実質的に類似する配列を含み；そして（ｂ）細胞における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入する，ことを含む。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，エクスビボ用途において試薬として用いられる。例えば，ｓｉＮＡ試薬を組織または細胞内に導入し，これを被験者に移植して治療効果を得る。細胞および／または組織は，後に外植片を移植される生物または被験者に由来するものであってもよく，あるいは，移植前に別の生物または被験者に由来するものであってもよい。ｓｉＮＡ分子を用いて，細胞または組織が所望の表現型を獲得するように，またはインビボで移植されたときに機能を発揮することができるように，細胞または組織において１またはそれ以上の遺伝子の発現を調節することができる。１つの態様においては，ある種の標的細胞を患者から抽出する。これらの抽出された細胞を，これらの細胞によるｓｉＮＡの取り込みに適した条件下で（例えば，デリバリー試薬，例えば，カチオン性脂質，リポソーム等を用いて，またはエレクトロポレーション等の手法を用いてｓｉＮＡの細胞内へのデリバリーを容易にすることにより），細胞中の特定のヌクレオチド配列を標的とするｓｉＮＡと接触させる。次に，細胞を同じ患者に再導入するか，または他の患者に導入する。エクスビボ用途の非限定的例としては，臓器／組織移植，組織移植，または肺疾病（例えば再狭窄）の治療または血管移植片における新脈管内膜過形成およびアテローム性動脈硬化症の予防における使用が挙げられる。そのようなエクスビボ用途はまた，心臓および末梢バイパス移植不全に伴う状態を治療するためにも用いることができる。例えば，そのような方法を末梢血管バイパス移植手術および心臓動脈バイパス移植手術と組み合わせて用いることができる。さらに別の用途としては，ＣＮＳ病巣または傷害を治療するための移植，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病，てんかん，痴呆，ハンチントン病，または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性性状態の治療における使用が挙げられる。
１つの態様においては，本発明は，組織外植片における遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；そして（ｂ）組織外植片における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入する，ことを含む。別の態様においては，この方法はさらに，その生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，組織外植片をその組織が由来する生物に戻すかまたは別の生物に導入することを含む。
１つの態様においては，本発明は，組織外植片において遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み，ｓｉＮＡのセンス鎖配列は標的ＲＮＡの配列と実質的に類似する配列を含み；そして（ｂ）組織外植片における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入する，ことを含む。別の態様においては，この方法はさらに，その生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，組織外植片をその組織が由来する生物に戻すかまたは別の生物に導入することを含む。
別の態様においては，本発明は，組織外植片において２以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；そして（ｂ）組織外植片における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入する，ことを含む。別の態様においては，この方法はさらに，その生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，組織外植片をその組織が由来する生物に戻すかまたは別の生物に導入することを含む。
１つの態様においては，本発明は，生物において遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；そして（ｂ）生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を生物に導入する，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，生物において２以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；そして（ｂ）生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を生物に導入する，ことを含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞内において遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡは遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）細胞における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入する，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，細胞内において２以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡは遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）細胞における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，ｓｉＮＡ分子をインビトロまたはインビボで細胞と接触させる，ことを含む。
１つの態様においては，本発明は，組織外植片において遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡは遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）組織外植片における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞と接触させる，ことを含む。別の態様においては，この方法はさらに，その生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，組織外植片をその組織が由来する生物に戻すかまたは別の生物に導入することを含む。
別の態様においては，本発明は，組織外植片において２以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡは遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）組織外植片における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入する，ことを含む。別の態様においては，この方法はさらに，その生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，組織外植片をその組織が由来する生物に戻すかまたは別の生物に導入することを含む。
１つの態様においては，本発明は，生物において遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡは遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を生物に導入する，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，生物において２以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡは遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を生物に導入する，ことを含む。
１つの態様においては，本発明は，生物において遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。
別の態様においては，本発明は，生物において２以上の遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，該方法は，生物における遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，生物を１またはそれ以上の本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。
本発明のｓｉＮＡ分子は，種々のＲＮＡ分子を標的とするＲＮＡｉにより標的遺伝子の発現が阻害されるよう設計することができる。１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子に対応する種々のＲＮＡを標的とするよう用いられる。そのようなＲＮＡの非限定的例には，メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ），標的遺伝子の選択的ＲＮＡスプライシング変種，標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ，標的遺伝子のプレ−ｍＲＮＡ，および／またはＲＮＡテンプレートが含まれる。選択的スプライシングにより，適当なエクソンの使用により区別される転写産物のファミリーが生ずる場合には，本発明は，適当なエクソンにより遺伝子発現を阻害して，遺伝子ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害するかまたはその間を区別するために用いることができる。例えば，選択的スプライシングされた貫膜ドメインを含む蛋白質を，膜結合型および分泌型の両方の形で発現させることができる。本発明を用いて貫膜ドメインを含むエクソンを標的とすることにより，分泌型の蛋白質に対して，膜結合型の薬学的ターゲティングの機能的重要性を判定することができる。これらのＲＮＡ分子を標的とすることに関連する本発明の用途の非限定的例には，治療的医薬用途，医薬の発見用途，分子診断および遺伝子機能用途，および遺伝子マッピング，例えば本発明のｓｉＮＡ分子を用いる単一ヌクレオチド多型のマッピングが含まれる。そのような用途は，既知の遺伝子配列を用いて，または発現配列タグ（ＥＳＴ）から入手可能な部分配列から実行することができる。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，遺伝子ファミリーに対応する保存配列を標的とするために用いられる。そのように，多くの遺伝子標的を標的とするｓｉＮＡ分子は，増加した治療効果を提供することができる。さらに，ｓｉＮＡは，種々の応用法において遺伝子機能の経路を特性決定するために用いることができる。例えば，本発明を用いて，経路における標的遺伝子の活性を阻害して，遺伝子機能分析，ｍＲＮＡ機能分析，または翻訳分析において，特性決定されていない遺伝子の機能を決定することができる。本発明は，医薬開発に向けて，種々の疾病および健康状態に関与する可能性のある標的遺伝子経路を決定するために用いることができる。本発明は，例えば，発生，例えば出生前発生および出生後発生に関与する遺伝子発現の経路，および／または癌，感染性疾病，自己免疫，炎症，内分泌疾患，腎臓疾病，肺疾病，心臓血管疾病，生殖不全，加齢，遺伝子発現に関連する他の任意の疾病または病気の進行および／または維持を理解するために用いることができる。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）予め決定された複雑性を有するｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生成し，そして（ｂ）標的ＲＮＡ配列中のＲＮＡｉ標的部位を決定するのに適した条件下で，上述の（ａ）のｓｉＮＡコンストラクトをアッセイする，ことを含む方法を特徴とする。別の態様においては，（ａ）のｓｉＮＡ分子は，固定された長さ，例えば，約２３ヌクレオチドの長さの鎖を含む。さらに別の態様においては，（ａ）のｓｉＮＡ分子は，異なる長さのものであり，例えば，約１９−約２５（例えば，約１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）ヌクレオチドの長さの鎖を有する。１つの態様においては，アッセイは，本明細書に記載されるような再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。別の態様においては，アッセイは，標的ＲＮＡが発現されている細胞培養系を含むことができる。別の態様においては，標的ＲＮＡのフラグメントを，例えば，ゲル電気泳動，ノザンブロット分析，またはＲＮＡｓｅ保護アッセイにより検出可能なレベルの切断について分析して，標的ＲＮＡ配列中の最も適当な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は，当該技術分野において知られるように，例えば，クローニングおよび／またはインビトロ系については転写，インビボ系においては細胞発現により，得ることができる。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）予め決定された複雑性，例えば４N（Ｎは，ｓｉＮＡコンストラクトの鎖のそれぞれにおいて塩基対形成したヌクレオチドの数を示し，例えば，１９塩基対を有する２１ヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を有するｓｉＮＡコンストラクトについては，複雑性は４19となる）を有するランダム化されたｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生成し；そして（ｂ）標的ＲＮＡ配列中のＲＮＡｉ標的部位を決定するのに適した条件下で，上述の（ａ）のｓｉＮＡコンストラクトをアッセイする，の各工程を含む方法を特徴とする。別の態様においては，（ａ）のｓｉＮＡ分子は，固定された長さ，例えば約２３ヌクレオチドの長さの鎖を含む。さらに別の態様においては，（ａ）のｓｉＮＡ分子は異なる長さのものであり，例えば，約１９−約２５（例えば，約１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）ヌクレオチドの長さの鎖を有する。１つの態様においては，アッセイは，本明細書の実施例７に記載されるような，再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。別の態様においては，アッセイは，標的ＲＮＡが発現されている細胞培養系を含むことができる。別の態様においては，標的ＲＮＡのフラグメントを，例えば，ゲル電気泳動，ノザンブロット分析，またはＲＮＡｓｅ保護アッセイにより検出可能なレベルの切断について分析して，標的ＲＮＡ配列中の最も適当な標的部位を決定する。別の態様においては，標的ＲＮＡ配列は，当該技術分野において知られるように，例えば，クローニングおよび／またはインビトロ系については転写により，インビボ系においては細胞発現により，得ることができる。
別の態様においては，本発明は，：（ａ）標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ標的の配列を分析し；（ｂ）（ａ）のＲＮＡの１またはそれ以上の領域に相補的な配列を有する１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子の組を合成し；そして（ｃ）標的ＲＮＡ配列中のＲＮＡｉ標的を決定するのに適した条件下で（ｂ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，の各工程を含む方法を特徴とする。１つの態様においては，（ｂ）のｓｉＮＡ分子は，固定された長さ，例えば約２３ヌクレオチドの長さの鎖を有する。別の態様においては，（ｂ）のｓｉＮＡ分子は，異なる長さ，例えば，約１９−約２５（例えば，約１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）ヌクレオチドの長さの鎖を有する。１つの態様においては，アッセイは，本明細書に記載されるような再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含んでいてもよい。別の態様においては，アッセイは，標的ＲＮＡが発現されている細胞培養系を含むことができる。標的ＲＮＡのフラグメントを，検出可能なレベルの切断について，例えばゲル電気泳動，ノザンブロット分析，またはＲＮＡｓｅ保護アッセイにより分析して，標的ＲＮＡ配列中の最も適当な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は，当該技術分野において知られるようにして，例えば，クローニングおよび／またはインビトロ系については転写により，インビボ系においては発現により，得ることができる。
"標的部位"とは，アンチセンス領域中に標的配列に相補的な配列を含むｓｉＮＡコンストラクトにより媒介される切断の"標的とされる"，標的ＲＮＡ中の配列を意味する。
"検出可能なレベルの切断"とは，標的ＲＮＡのランダム分解から生成するＲＮＡのバックグラウンドから切断産物を識別するのに十分な程度の標的ＲＮＡの切断（および切断産物ＲＮＡの形成）を意味する。ほとんどの検出方法について，標的ＲＮＡの１−５％から切断産物が生成すれば，バックグラウンドから検出するのに充分である。
１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む組成物を特徴とする。別の態様においては，本発明は，１またはそれ以上の遺伝子を標的とし，化学的に修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む医薬組成物を特徴とする。別の態様においては，本発明は，被験者において疾病または健康状態を治療または予防する方法を特徴とし，該方法は，被験者における疾病または健康状態の治療または予防に適した条件下で，被験者に本発明の組成物を単独でまたは１またはそれ以上の他の治療用化合物と併用して投与することを含む。さらに別の態様においては，本発明は，被験者において組織拒絶を低減または予防する方法を特徴とし，該方法は，被験者における組織拒絶の低減または予防に適した条件下で被験者に本発明の組成物を投与することを含む。
別の態様においては，本発明は，遺伝子標的を評価する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾してもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；（ｂ）細胞，組織，または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，ｓｉＮＡ分子を細胞，組織，または生物に導入し；そして（ｃ）細胞，組織，または生物における表現型変化をアッセイすることにより，遺伝子の機能を決定する，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，標的遺伝子を評価する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾されていてもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；（ｂ）生物学的システムにおける標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，ｓｉＮＡ分子を生物学的システムに導入し；そして（ｃ）生物学的システムにおける表現型の変化をアッセイすることにより，遺伝子の機能を決定する，ことを含む。
"生物学的システム"とは，生物起源，例えば，限定されないが，ヒト，動物，植物，昆虫，細菌，ウイルスまたは他の起源からの，精製されたまたは精製されていない形の物質を意味し，ここで，システムはＲＮＡｉ活性に必要な成分を含む。"生物学的システム"との用語には，例えば，細胞，組織，または生物，またはそれらの抽出物が含まれる。生物学的システムとの用語にはまた，インビトロの設定で用いることができる再構成されたＲＮＡｉ系が含まれる。
"表現型変化"とは，本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ）との接触または処理に応答して生ずる任意の検出可能な細胞の変化を意味する。そのような検出可能な変化には，限定されないが，形状，サイズ，増殖，運動性，蛋白質発現またはＲＮＡ発現，または当該技術分野において知られる方法によりアッセイすることができる他の物理学的または化学的変化が含まれる。検出可能な変化にはまた，グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等のレポーター遺伝子／分子，または発現された蛋白質を同定するために用いられる種々のタグ，またはアッセイすることができる任意の他の細胞成分の発現が含まれる。
１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子を含有するキットを特徴とし，これは細胞，組織，または生物における標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。別の態様においては，本発明は，化学的に修飾されていてもよい２以上の本発明のｓｉＮＡ分子を含有するキットを特徴とし，これは細胞，組織，または生物において２以上の標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。
１つの態様においては，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子を含むキットを特徴とし，これは化学的に修飾されていてもよく，これは生物学的システムにおいて標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。別の態様においては，本発明は，本発明の２以上のｓｉＮＡ分子を含むキットを特徴とし，これは化学的に修飾されていてもよく，これは生物学的システムにおいて２以上の標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。
１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されていてもよい本発明の１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子を含有する細胞を特徴とする。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子を含有する細胞は哺乳動物細胞である。さらに別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子を含有する細胞はヒト細胞である。
１つの態様においては，化学的に修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子の合成は，（ａ）ｓｉＮＡ分子の２つの相補的鎖を合成し；（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を得るのに適した条件下で２つの相補的鎖を一緒にアニーリングさせる，ことを含む。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子の２つの相補的鎖の合成は，固相オリゴヌクレオチド合成により行う。さらに別の態様においては，ｓｉＮＡ分子の２つの相補的鎖の合成は，固相タンデムオリゴヌクレオチド合成により行う。
１つの態様においては，本発明は，ｓｉＮＡデュープレックス分子を合成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡ分子の第１のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成し，ここで，第１のオリゴヌクレオチド配列鎖はｓｉＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の合成の足場として用いることができる切断可能なリンカー分子を含み；（ｂ）第１のオリゴヌクレオチド配列鎖の足場上でｓｉＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成し，ここで，第２のオリゴヌクレオチド配列鎖はさらに，ｓｉＮＡデュープレックスを精製するために用いることができる化学成分を含み；（ｃ）２つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズして安定なデュープレックスを形成するのに適した条件下で（ａ）のリンカー分子を切断し；そして（ｄ）第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学成分を利用してｓｉＮＡデュープレックスを精製する，の各工程を含む。１つの態様においては，上述の（ｃ）におけるリンカー分子の切断は，オリゴヌクレオチドの脱保護の間に，例えば，メチルアミン等のアルキルアミン塩基を用いて加水分解条件下で行う。１つの態様においては，合成の方法は，調整多孔ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン等の固体支持体上での固相合成を含み，ここで，（ａ）の第１の配列は，固体支持体を足場として用いてスクシニルリンカー等の切断可能なリンカー上で合成される。（ａ）において第２の鎖を合成するための足場として用いられる切断可能なリンカーは，固体支持体誘導化リンカーと（ａ）の切断可能なリンカーの切断が同時に行われるように，固体支持体誘導化リンカーと同様の反応性を有することができる。別の態様においては，結合したオリゴヌクレオチド配列の単離に用いることができる（ｂ）の化学成分は，ジメトキシトリチル基等のトリチル基を含み，これは本明細書に記載されるトリチルオン合成戦略において利用することができる。さらに別の態様においては，ジメトキシトリチル基等の化学成分は，精製の間に，例えば酸性条件を用いて除去する。
さらに別の態様においては，ｓｉＮＡ合成の方法は溶液相合成またはハイブリッド相合成であり，ここでは，第１の配列に結合され，第２の配列の合成の足場として作用する切断可能なリンカーを用いて，ｓｉＮＡデュープレックスの両方の鎖をタンデムで合成する。別々のｓｉＮＡ配列鎖がハイブリダイズするのに適した条件下でリンカーを切断することにより，二本鎖ｓｉＮＡ分子が形成される。
別の態様においては，本発明は，ｓｉＮＡデュープレックス分子を合成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡ分子の一方のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成し，ここで，配列は他方のオリゴヌクレオチド配列の合成の足場として用いることができる切断可能なリンカー分子を含み；（ｂ）第１の配列鎖に対して相補性を有する第２のオリゴヌクレオチド配列を（ａ）の足場上で合成し，ここで，第２の配列は二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖を含み，かつ，第２の配列はさらに，結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するために用いることができる化学成分を含み；（ｃ）第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学成分を利用して，切断可能なリンカーにより接続された両方のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖を含む全長配列を単離するのに適した条件下で，かつ，２つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズして安定なデュープレックスを形成するのに適した条件下で，（ｂ）の生成物を精製する，の各工程を含む。１つの態様においては，上述の（ｃ）におけるリンカー分子の切断は，オリゴヌクレオチドの脱保護の間に，例えば加水分解条件下で行う。別の態様においては，上述の（ｃ）におけるリンカー分子の切断は，オリゴヌクレオチドの脱保護の後に行う。別の態様においては，合成の方法は，調整多孔ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン等の固体支持体上での固相合成を含み，ここで，（ａ）の第１の配列は，スクシニルリンカー等の切断可能なリンカー上で，固体支持体を足場として用いて合成する。（ａ）において第２の鎖を合成するための足場として用いられる切断可能なリンカーは，固体支持体誘導化リンカーおよび（ａ）の切断可能なリンカーが同時にまたは別々に切断されるように，固体支持体誘導化リンカーと同様の反応性または異なる反応性を有することができる。１つの態様においては，結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するために用いることができる（ｂ）の化学成分は，トリチル基，例えばジメトキシトリチル基を含む。
別の態様においては，本発明は，１回の合成プロセスで二本鎖ｓｉＮＡ分子を作製する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）第１の配列および第２の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し，ここで，第１の配列は第２の配列に相補的であり，第１のオリゴヌクレオチド配列は切断可能なリンカーを介して第２の配列に連結されており，かつ，第２の配列を有するオリゴヌクレオチドには末端５’−保護基，例えば，５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基（５’−Ｏ−ＤＭＴ）が残存しており；（ｂ）オリゴヌクレオチドを脱保護し，このことにより脱保護によって２つのオリゴヌクレオチド配列を結合しているリンカーが切断され；そして（ｃ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で，例えば本明細書に記載されるトリチル−オン合成戦略を用いて，（ｂ）の生成物を精製する，の工程を含む。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子の合成の方法は，Ｓｃａｒｉｎｇｅらの米国特許５，８８９，１３６；６，００８，４００；および６，１１１，０８６（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）の教示を含む。
１つの態様においては，本発明は細胞または再構成されたシステムにおいてＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし，ｓｉＮＡコンストラクトは，ｓｉＮＡコンストラクトのヌクレアーゼ耐性を増加させる１またはそれ以上の化学的修飾，例えば，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有する１またはそれ以上の化学的修飾を含む。
別の態様においては，本発明は，ヌクレアーゼ耐性が増加しているｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）ヌクレアーゼ耐性が増加しているｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
１つの態様においては，本発明は標的遺伝子に対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし，ｓｉＮＡコンストラクトは，ｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和性を調節する，１またはそれ以上の本明細書に記載される化学的修飾を含む。
別の態様においては，本発明は，ｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）ｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞または再構成されたシステムにおいてＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし，ｓｉＮＡコンストラクトは，ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス鎖と細胞中の相補的標的ＲＮＡ配列との間の結合親和性を調節する本明細書に記載される１またはそれ以上の化学的修飾を含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞または再構成されたシステムにおいてＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし，ｓｉＮＡコンストラクトは，ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス鎖と細胞中の相補的標的ＤＮＡ配列との間の結合親和性を調節する本明細書に記載される１またはそれ以上の化学的修飾を含む。
別の態様においては，本発明は，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＲＮＡ配列との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＲＮＡ配列との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を同定するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＤＮＡ配列との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＤＮＡ配列との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で，工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞または再構成されたシステムにおいてＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし，ｓｉＮＡコンストラクトは，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトに対する配列ホモロジーを有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成しうる細胞性ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を調節する，本明細書に記載される１またはそれ以上の化学的修飾を含む。
別の態様においては，本発明は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に対して配列ホモロジーを有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成しうる細胞性ポリメラーゼのポリメラーゼ活性の増加を媒介することができるｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に対して配列ホモロジーを有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成しうる細胞性ポリメラーゼのポリメラーゼ活性の増加を媒介することができるｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で，工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞または再構成されたシステムにおいてＲＮＡｉを媒介する化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし，ここで，化学的修飾は，そのようなｓｉＮＡコンストラクトにより媒介されるＲＮＡｉの効率を低下させるような様式で，ｓｉＮＡと標的ＲＮＡ分子，ＤＮＡ分子および／または蛋白質またはＲＮＡｉに必須の他の因子との相互作用に有意に影響を与えない。
別の態様においては，本発明は，改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で，工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
さらに別の態様においては，本発明は，標的ＲＮＡに対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）標的ＲＮＡに対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で，工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
さらに別の態様においては，本発明は，ＤＮＡ標的に対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）ＤＮＡ標的，例えば，遺伝子，染色体またはこれらの一部に対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で，工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞または再構成されたシステムにおいてＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし，ここで，ｓｉＮＡコンストラクトは，ｓｉＮＡコンストラクトの細胞取り込みを調節する本明細書に記載される１またはそれ以上の化学的修飾を含む。
別の態様においては，本発明は，改良された細胞取り込みを有する，標的遺伝子に対するｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）改良された細胞取り込みを有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で，工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
１つの態様においては，本発明は，標的遺伝子に対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし，ここで，ｓｉＮＡコンストラクトは，例えば，ｓｉＮＡコンストラクトの薬物動態学を改良するポリエチレングリコールまたは同等のコンジュゲート等のポリマー性コンジュゲートを結合させることにより，またはインビボで特定の組織のタイプまたは細胞のタイプにターゲティングするコンジュゲートを結合させることにより，ｓｉＮＡコンストラクトの生物利用性を増加させる，本明細書に記載される１またはそれ以上の化学的修飾を含む。そのようなコンジュゲートの非限定的例は，Ｖａｒｇｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願１０／２０１，３９４（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
１つの態様においては，本発明は，改良された生物利用性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）コンジュゲートをｓｉＮＡ分子の構造中に導入し，そして（ｂ）改良された生物利用性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で，工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。そのようなコンジュゲートには，細胞レセプターのリガンド，例えば，天然に生ずる蛋白質リガンドに由来するペプチド；蛋白質局在化配列，例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他の補因子，例えば葉酸およびＮ−アセチルガラクトースアミン；ポリマー，例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；ポリアミン，例えばスペルミンまたはスペルミジン；および他のものが含まれる。
別の態様においては，本発明は，改良された生物利用性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）賦形剤処方をｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）改良された生物利用性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で，工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。そのような賦形剤には，ポリマー，例えばシクロデキストリン，脂質，カチオン性脂質，ポリアミン，リン脂質，およびその他のものが含まれる。
別の態様においては，本発明は，改良された生物利用性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）改良された生物利用性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ化合物にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有結合的に結合させることができる。結合したＰＥＧは，任意の分子量のものであってよく，好ましくは約２，０００−約５０，０００ダルトン（Ｄａ）である。
本発明は，単独で，またはインビトロまたはインビボでＲＮＡを試験サンプルおよび／または被験者に導入するのに必要な試薬の少なくとも１つを有するキットの成分として，用いることができる。例えば，キットの好ましい成分には，本発明のｓｉＮＡ分子，および本明細書に記載されるような，目的とする細胞内へのｓｉＮＡの導入を促進するベヒクルが含まれる（例えば，脂質および当該技術分野において知られる他のトランスフェクション法を用いる。例えば，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ，米国特許６，３９５，７１３を参照）。キットは，標的評価のために，例えば，遺伝子機能および／または活性を決定するために，または薬剤最適化において，および薬剤の発見において用いることができる（例えば，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願６０／４０２，９９６を参照）。そのようなキットはまた，キットのユーザが本発明を実施できるようにするための指針を含んでいてもよい。
本明細書において用いる場合，"短干渉核酸"，"ｓｉＮＡ"，"短干渉ＲＮＡ"，"ｓｉＲＮＡ"，"短干渉核酸分子"，"短干渉オリゴヌクレオチド分子"，または"化学的に修飾された短干渉核酸分子"との用語は，例えば，配列特異的様式でＲＮＡ干渉（"ＲＮＡｉ"）または遺伝子サイレンシングを媒介することにより，遺伝子発現またはウイルス複製をダウンレギュレートしうる任意の核酸分子を表す（例えば，Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ０１／３６６４６；Ｆｉｒｅ，国際公開ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／０１８４６；Ｍｅｌｌｏ ａｎｄ Ｆｉｒｅ，国際公開ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際公開ＷＯ９９／０７４０９；およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／４４９１４；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；およびＲｅｉｎｈａｒｔ＆Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照）。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的例は，図４−６および本明細書の表ＩＩ，ＩＩＩおよびＩＶに示される。例えば，ｓｉＮＡは，自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってもよく，ここで，アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ，ここで一方の鎖はセンス鎖であり，他方はアンチセンス鎖であり，アンチセンス鎖およびセンス鎖は自己相補的であり（すなわち，各鎖は，他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，例えば，アンチセンス鎖とセンス鎖とがデュープレックスまたは二本鎖構造を形成し，例えば，二本鎖領域は約１９塩基対である）；アンチセンス鎖は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。あるいは，ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立ててもよく，ここで，ｓｉＮＡの自己相補的センス領域およびアンチセンス領域は，核酸系または非核酸系のリンカーにより連結されている。ｓｉＮＡは，自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよく，ここで，アンチセンス領域は別の標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は，標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは２またはそれ以上のループ構造および自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく，ここで，アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し，環状ポリヌクレオチドは，インビボまたはインビトロでプロセシングされて，ＲＮＡｉを媒介しうる活性なｓｉＮＡ分子を生ずることができる。ｓｉＮＡはまた，標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでいてもよく（例えば，そのようなｓｉＮＡ分子がｓｉＮＡ分子中に標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない場合），ここで，一本鎖ポリヌクレオチドはさらに末端リン酸基，例えば５’−リン酸（例えば，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚ ｅｔａ ｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照），または５’，３’−二リン酸を含んでいてもよい。ある態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含んでいてもよく，ここで，センス領域およびアンチセンス領域は，当該技術分野において知られるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合により結合しているか，あるいは，イオン相互作用，水素結合，ファンデルワールス相互作用，疎水的相互作用，および／またはスタッキング相互作用により非共有結合的に結合している。ある態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子の発現の阻害が引き起こされるように，標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書において用いる場合，ｓｉＮＡ分子はＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく，化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも包含する。ある態様においては，本発明の短干渉核酸分子は２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠失している。本出願人は，ある態様において，ＲＮＡｉを媒介するために２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としない短干渉核酸を記載する。すなわち，本発明の短干渉核酸分子は，任意にリボヌクレオチド（例えば，２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし，ＲＮＡｉを支持するためにｓｉＮＡ分子中にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなｓｉＮＡ分子は，２’−ＯＨ基を有する１またはそれ以上のヌクレオチドを含む，結合したリンカーまたは他の結合しているかまたは会合している基，成分，または鎖を有することができる。任意に，ｓｉＮＡ分子は，ヌクレオチド位置の約５，１０，２０，３０，４０，または５０％にリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の修飾短干渉核酸分子はまた，短干渉修飾オリゴヌクレオチド"ｓｉＭＯＮ"と称される。本明細書において用いる場合，ｓｉＮＡとの用語は，配列特異的ＲＮＡｉを媒介しうる核酸分子を記述するために用いられる他の用語，例えば，短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ），短干渉オリゴヌクレオチド，短干渉核酸，短干渉修飾オリゴヌクレオチド，化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ，転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ），および他のものと同等であることを意味する。さらに，本明細書において用いる場合，ＲＮＡｉとの用語は，配列特異的ＲＮＡ干渉を記述する他の用語，例えば転写後遺伝子サイレンシング，または後成遺伝学（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）と同等であることを意味する。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子を用いて，転写後レベルまたは転写前レベルの両方で後成的に遺伝子をサイレンシングさせることができる。非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的制御は，クロマチン構造のｓｉＮＡ媒介性修飾により生じて遺伝子発現を変化させることができる（例えば，Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。
"調節する"とは，遺伝子の発現，または１またはそれ以上の蛋白質または蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡ分子または同等のＲＮＡ分子のレベル，または蛋白質または蛋白質サブユニットの１またはそれ以上の活性が，発現，レベル，または活性が，調節剤の非存在下で観察されるより高いかまたは低いように，アップレギュレートまたはダウンレギュレートされることを意味する。例えば，"調節する"との用語は，"阻害する"ことを意味しうるが，"調節する"との用語の使用はこの定義には限定されない。
"阻害する"とは，遺伝子発現産物の活性または１またはそれ以上の遺伝子産物をコードするＲＮＡまたは同等のＲＮＡのレベルが，本発明の核酸分子の非存在下において観察されるレベルより減少することを意味する。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子による阻害は，好ましくは，ＲＮＡｉ応答を媒介することができない不活性または減弱化分子の存在下で観察されるレベルより低い。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の阻害は，ｓｉＮＡ分子の存在下において，存在しない場合よりも大きい。
“阻害する”，"ダウンレギュレートする"，または“減少させる”とは，遺伝子の発現，または１またはそれ以上の蛋白質または蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡ分子または同等のＲＮＡ分子のレベル，または１またはそれ以上の蛋白質または蛋白質サブユニットの活性が，本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ）の非存在下において観察されるより低く低下していることを意味する。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子による阻害，ダウンレギュレーションまたは低下は，不活性または減弱化分子の存在下で観察されるレベルより低い。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子による阻害，ダウンレギュレーション，または低下は，例えば，スクランブル化配列を有するかミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより低い。別の態様においては，本発明の核酸分子による遺伝子発現の阻害，ダウンレギュレーション，または低下は，核酸分子の存在下においてその非存在下におけるより大きい。
"遺伝子"または"標的遺伝子"とは，ＲＮＡをコードする核酸を意味し，例えば，限定されないが，ポリペプチドをコードする構造遺伝子などの核酸配列が含まれる。標的遺伝子は，細胞に由来する遺伝子，内因性遺伝子，トランスジン，または外来遺伝子，例えば，病原体（例えばウイルス）の感染後に細胞中に存在する病原体の遺伝子でありうる。標的遺伝子を含有する細胞は，任意の生物，例えば，植物，動物，原生動物，ウイルス，細菌または真菌に由来するかその中に含まれうる。植物の非限定的例には，単子葉植物，双子葉植物，または裸子植物が含まれる。動物の非限定的例には脊椎動物または無脊椎動物が含まれる。真菌の非限定的例には糸状菌または酵母が含まれる。
“内因性”または“細胞性”遺伝子とは，通常は細胞中でゲノムにおけるその天然の位置に見いだされる遺伝子を意味する。例えば，ＨＥＲ−２，ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｒ，ＥＧＦＲ，ＢＣＬ−２，ｃ−ＭＹＣ，ＲＡＳ等は内因性遺伝子であると考えられる。細胞において，プラスミド，ウイルスベクターまたは他のベクターから，またはウイルス，細菌，真菌において発現される遺伝子は，“外来”または"異種"遺伝子であると考えられる。このような遺伝子は，通常は宿主細胞において見いだされないが，標準的な遺伝子輸送手法により，またはウイルス，細菌または他の感染性病原体による感染の結果として導入される。
“遺伝子ファミリー”とは，少なくとも１つの共通の性質，例えば配列ホモロジー，標的特異性，作用モード，二次構造，または生物学的システムにおいて１または２以上のプロセスを調節する能力を共有する２以上の核酸分子の群を意味する。遺伝子ファミリーは，ウイルス起源のものであっても細胞起源のものであってもよい。遺伝子ファミリーは，例えば，サイトカイン，レセプター，成長因子，アダプター蛋白質，構造蛋白質，および他の蛋白質エピトープの群をコードすることができる。
“蛋白質ファミリー”とは，少なくとも１つの共通の性質，例えば，配列ホモロジー，標的特異性，作用モード，二次構造，または生物学的システムにおいて１または２以上のプロセスを調節する能力を共有する２以上の蛋白質，ペプチド，またはポリペプチドの群を意味する。蛋白質ファミリーは，ウイルス起源のものであっても細胞起源のものであってもよい。蛋白質ファミリーは，例えば，サイトカイン，レセプター，成長因子，アダプター蛋白質，構造蛋白質，および他の蛋白質エピトープの群をコードすることができる。
"高度に保存された配列領域"とは，標的遺伝子中の１またはそれ以上の領域のヌクレオチド配列が，１つの世代と他の世代とで，または１つの生物学的システムと他の生物学的システムとで有意に相違しないことを意味する。
“癌”とは，異常な細胞の制御されない成長および広がりにより特徴づけられる一群の疾病を意味する。
"センス領域"とは，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対する相補性を有する，ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに，ｓｉＮＡ分子のセンス領域は，標的核酸配列とホモロジーを有する核酸配列を含むことができる。
"アンチセンス領域"とは，標的核酸配列に対する相補性を有する，ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は，ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対する相補性を有する核酸配列を任意に含むことができる。
"標的核酸"とは，その発現または活性が調節されるべき任意の核酸配列を意味する。標的核酸はＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。
"相補性"とは，核酸が，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタイプのいずれかにより，別の核酸配列と水素結合を形成しうることを意味する。本発明の核酸分子に関して，核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは，核酸の適切な機能，例えば，ＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分なものである。核酸分子についての結合自由エネルギーの決定は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照）。相補性のパーセンテージは，核酸分子中の，第２の核酸配列と水素結合（例えば，ワトソン−クリック塩基対形成）を形成しうる連続する残基のパーセンテージを示す（例えば，１０塩基中の５，６，７．８，９，１０塩基は，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，および１００％の相補性である）。"完全な相補性"とは，核酸配列の連続する残基がすべて第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。
本発明のｓｉＮＡ分子は，広いスペクトルの疾病および状態，例えば，癌または癌性疾病，感染性疾病，心臓血管疾病，神経学的疾病，プリオン疾病，炎症性疾病，自己免疫疾患，肺疾病，腎臓疾病，肝臓疾病，ミトコンドリア疾病，内分泌疾病，生殖関連疾病および状態，および細胞または生物中で発現される遺伝子産物のレベルに応答することができる他の任意の適応症の新規な治療方法である。
本発明の１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子の各配列は，独立して，約１８−約２４ヌクレオチドの長さであり，特定の態様においては，約１８，１９，２０，２１，２２，２３，または２４ヌクレオチドの長さである。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡデュープレックスは，独立して，約１７−約２３（例えば，約１７，１８，１９，２０，２１，２２または２３）塩基対を含む。さらに別の態様においては，ヘアピンまたは環状構造を含む本発明のｓｉＮＡ分子は，約３５−約５５（例えば，約３５，４０，４５，５０または５５）ヌクレオチドの長さであるか，または約３８−約４４（例えば，３８，３９，４０，４１，４２，４３または４４）ヌクレオチドの長さであり，約１６−約２２（例えば，約１６，１７，１８，１９，２０，２１または２２）塩基対を含む。本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，表ＩＩに示される。本発明の例示的合成ｓｉＮＡ分子は，表Ｉおよび／または図１８−１９に示される。
本明細書において用いる場合，"細胞"は，その通常の生物学的意味で用いられ，多細胞生物全体を指さず，特にヒトを指さない。細胞は生物中で，例えば，鳥類，植物および哺乳動物，例えばヒト，ウシ，ヤギ，無尾サル，有尾サル，ブタ，イヌおよびネコ中で存在することができる。細胞は，原核生物または真核生物（例えば哺乳動物または植物細胞）であってもよい。細胞は体細胞起源でも生殖細胞系起源でもよく，全能細胞でも多能性細胞でもよく，分裂していても分裂していなくてもよい。細胞はまた，配偶子または胚，幹細胞，または完全に分化した細胞に由来するか，またはこれらを含むものであってもよい。
本発明のｓｉＮＡ分子は，直接加えてもよく，またはカチオン性脂質と複合体化して，リポソーム中に封入して，または他の方法により，標的細胞または組織にデリバリーすることができる。核酸または核酸複合体は，関連する組織にエクスビボで，または注射，注入ポンプまたはステントを用いてインビボで，バイオポリマー中に取り込ませてまたは取り込ませずに，局所的に投与することができる。特定の態様においては，本発明の核酸分子は表Ｉ−ＩＩおよび／または図１８−１９に示される配列を含む。そのような核酸分子の例は，これらの表および図面において規定される配列から本質的になる。さらに，表ＩＶに記載される化学的に修飾されたコンストラクトを本発明の任意のｓｉＮＡ配列に適用することができる。
別の観点においては，本発明は本発明の１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供する。１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子は，独立して，同じまたは異なる部位を標的とすることができる。
"ＲＮＡ"とは，少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。"リボヌクレオチド"とは，β−Ｄ−リボフラノース成分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は，二本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＲＮＡ，単離されたＲＮＡ，例えば部分的に生成されたＲＮＡ，本質的に純粋なＲＮＡ，合成ＲＮＡ，組換え的に製造されたＲＮＡ，ならびに１またはそれ以上のヌクレオチドの付加，欠失，置換および／または変更により天然に生ずるＲＮＡと異なるように変更されたＲＮＡを含む。そのような変更は，非ヌクレオチド物質の付加，例えば，ｓｉＮＡの末端または内部（例えばＲＮＡの少なくとも１またはそれ以上のヌクレオチド）への付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた，標準的ではないヌクレオチド，例えば，天然に生じないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含むことができる。これらの変更されたＲＮＡは，類似体または天然に生ずるＲＮＡの類似体と称することができる。
"被験者"とは，外植された細胞のドナーまたはレシピエントである生物または細胞それ自体を意味する。"被験者"とはまた，本発明の核酸分子を投与することができる生物を表す。１つの態様においては，被験者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。別の態様においては，被験者はヒトまたはヒト細胞である。
本明細書において用いる場合，"ホスホロチオエート"との用語は，式Ｉ（式中，Ｚおよび／またはＷはイオウ原子を含む）を有するヌクレオチド間結合を表す。したがって，ホスホロチオエートとの用語は，ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートヌクレオチド間結合の両方を表す。
本明細書において用いる場合，"万能塩基"との用語は，天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと，これらをほとんど区別せずに塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を表す。万能塩基の非限定的例としては，当該技術分野において知られるように（例えば，Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照），Ｃ−フェニル，Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体，イノシン，アゾールカルボキサミド，およびニトロアゾール誘導体，例えば，３−ニトロピロール，４−ニトロインドール，５−ニトロインドール，および６−ニトロインドールが挙げられる。
本明細書において用いる場合，"非環状ヌクレオチド"との用語は，非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチド，例えば，リボース炭素（Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４，またはＣ５）のいずれかが，独立してまたは組み合わせてヌクレオチド中に存在しないヌクレオチドを表す。
本発明の核酸分子は，個別に，または他の薬剤と組み合わせてまたは一緒に，本明細書に記載される疾病または健康状態を治療するために用いることができる。例えば，特定の疾病または健康状態を治療するために，治療に適した条件下で，ｓｉＮＡ分子を個別にまたは１またはそれ以上の薬剤と組み合わせて被験者に投与することができ，または当業者には明らかな他の適当な細胞に投与することができる。
さらに別の態様においては，ｓｉＮＡ分子を他の既知の治療法と組み合わせて用いて，上述の健康状態または疾病を治療することができる。例えば，本明細書に記載される分子を１またはそれ以上の既知の治療剤と組み合わせて用いて，疾病または健康状態を治療することができる。本発明のｓｉＮＡ分子と容易に組み合わせることができる他の治療剤の非限定的例は，酵素的核酸分子，アロステリック核酸分子，アンチセンス，デコイ，またはアプタマー核酸分子，抗体，例えばモノクローナル抗体，小分子，および他の有機および／または無機化合物，例えば金属，塩およびイオンである。
１つの態様においては，本発明は，本発明の少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を，そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とするように含む発現ベクターを特徴とする。例えば，ベクターは，デュープレックスを含むｓｉＮＡ分子の両方の鎖をコードする配列を含むことができる。ベクターはまた，自己相補的でありしたがってｓｉＮＡ分子を形成する１つの核酸分子をコードする配列を含むことができる。そのような発現ベクターの非限定的例は，Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；およびＮｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。
別の態様においては，本発明は，本発明の発現ベクターを含む哺乳動物細胞，例えば，ヒト細胞を特徴とする。
さらに別の態様においては，本発明の発現ベクターは，表ＩＩＩにおいてＧｅｎｂａｎｋ受託番号により参照されるＲＮＡ分子に相補性を有するｓｉＲＮＡ分子の配列を含む。
さらに別の態様においては，本発明の発現ベクターは，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号，例えば表Ｉに示されるＧｅｎｂａｎｋ受託番号で表されるＲＮＡ分子に対する相補性を有するｓｉＮＡ分子の配列を含む。
１つの態様においては，本発明の発現ベクターは，２またはそれ以上のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含み，これらは同じであっても異なっていてもよい。
本発明の別の観点においては，標的ＲＮＡ分子と相互作用して，標的ＲＮＡ分子（例えば，表ＩＩＩにおいてＧｅｎｂａｎｋ受託番号で表される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子をダウンレギュレートするｓｉＲＮＡ分子は，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベクターは，ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターでありうる。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターは，本明細書に記載されるようにデリバリーされ，標的細胞中に残留する。あるいは，ｓｉＮＡ分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，ｓｉＮＡ分子は結合してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子機能または発現をダウンレギュレートする。ｓｉＮＡを発現するベクターのデリバリーは，全身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），被験者から外植された標的細胞に投与した後，被験者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる。
"ベクター"とは，所望の核酸をデリバリーするために用いられる，任意の核酸および／またはウイルスに基づく手法を意味する。
本発明の他の特徴および利点は，以下の本発明の好ましい態様の説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
図面の簡単な説明
図１は，ｓｉＮＡ分子を合成するスキームの非限定的例を示す。相補的ｓｉＮＡ配列鎖である鎖１および鎖２をタンデムで合成し，切断可能な結合，例えばヌクレオチドスクシネートまたは無塩基スクシネートで結合させる。これは，固体支持体上の固相合成において用いられる切断可能なリンカーと同じであっても異なっていていてもよい。合成は固相でも液相でもよく，示される例においては合成は固相合成である。合成は，タンデムオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチド上にジメトキシトリチル基等の保護基が残るように実施する。オリゴヌクレオチドを切断および脱保護すると，２つのｓｉＮＡ鎖は自発的にハイブリダイズしてｓｉＮＡデュープレックスを形成するため，末端保護基の性質を利用してデュープレックスを精製することができる。これは，例えば，末端保護基を有するデュープレックス／オリゴヌクレオチドのみが単離されるトリチルオン精製法を適用することにより行うことができる。
図２は，本発明の方法により合成された精製ｓｉＮＡデュープレックスのＭＡＬＤＩ−ＴＯＶ質量分析を示す。示される２つのピークは，別々のｓｉＮＡ配列鎖の推定質量に対応する。この結果は，タンデム合成から生成されたｓｉＮＡデュープレックスを，単純なトリチルオン精製方法論を用いて単一物質として精製しうることを示す。
図３は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの血清安定性を３’−ＴＴ末端を有する全ＲＮＡからなるｓｉＮＡ対照と比較して測定するために用いられた安定性アッセイの結果を示す。デュープレックス安定性についてのＴ１／２値が示される。
図４は，ルシフェラーゼレポーター系を用いるホスホロチオエート修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。
図５は，ルシフェラーゼレポーター系を用いるホスホロチオエートおよび万能塩基修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。
図６は，ルシフェラーゼレポーター系を用いる２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。
図７は，ルシフェラーゼレポーター系を用いる２’−Ｏ−メチルおよび２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。
図８は，ルシフェラーゼレポーター系を用いるホスホロチオエート修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。
図９は，タンデム合成により生成した反転デオキシ無塩基修飾ｓｉＮＡコンストラクトの，ルシフェラーゼレポーター系を用いるＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。
図１０は，３’−グリセリル修飾ｓｉＮＡコンストラクト等の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの，ルシフェラーゼレポーター系を用いるＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を，全ＲＮＡ対照ｓｉＮＡコンストラクトと比較して示す。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡを，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは，“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖はＲＰＩ番号により示される（センス鎖／アンチセンス鎖）。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。
図１１は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。スクリーニングにより，センス鎖の化学的修飾およびアンチセンス鎖の化学的修飾の種々の組み合わせを比較した。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡｓを，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは，“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖はＲＰＩ番号により示される（センス鎖／アンチセンス鎖）。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。
図１２は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。スクリーニングにより，センス鎖の化学的修飾およびアンチセンス鎖の化学的修飾の種々の組み合わせを比較した。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡｓを，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖はＲＰＩ番号により示される（センス鎖／アンチセンス鎖）。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。さらに，アンチセンス鎖のみ（ＲＰＩ３０４３０）および反転対照（ＲＰＩ３０２２７／３０２２９；ＲＰＩ３００６３／３０２２４とマッチする化学を有する）を上述のｓｉＮＡデュープレックスと比較した。
図１３は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。スクリーニングにより，センス鎖の化学的修飾およびアンチセンス鎖の化学的修飾の種々の組み合わせを比較した。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡを，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖は，ＲＰＩ番号により示される（センス鎖／アンチセンス鎖）。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。さらに，反転対照（ＲＰＩ３０２２６／３０２２９；ＲＰＩ３０２２２／３０２２４とマッチした化学を有する）を上述のｓｉＮＡデュープレックスと比較した。
図１４は，種々の３’末端修飾ｓｉＮＡコンストラクト等の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを全ＲＮＡ対照ｓｉＮＡコンストラクトと比較した，ルシフェラーゼレポーター系を用いるＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡｓを，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは，“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖はＲＰＩ番号により示される（センス鎖／アンチセンス鎖）。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。
図１５は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。スクリーニングにより，固定されたアンチセンス鎖化学と比較して，センス鎖化学の種々の組み合わせを比較した。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡｓは，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖はＲＰＩ番号により示される（センス鎖／アンチセンス鎖）。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。
図１６は，ルシフェラーゼレポーター系を用いて，ホスホロチオエート修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性を，２つの末端チミジン残基を除きすべてリボヌクレオチドから構成されるｓｉＮＡコンストラクトと比較するｓｉＮＡ滴定実験の結果を示す。
図１７は，ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の提唱されるメカニズムの非限定的例を示す図である。外来一本鎖ＲＮＡ，例えばウイルス，トランスポゾン，または他の外因性ＲＮＡからＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が，ダイサー（ＤＩＣＥＲ）酵素を活性化し，次にこれはｓｉＮＡデュープレックスを生成する。あるいは，合成されたまたは発現されたｓｉＮＡを適当な手段により細胞内に直接導入することができる。活性なｓｉＮＡ複合体が形成され，これは標的ＲＮＡを認識し，その結果，ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体により標的ＲＮＡが分解されるか，またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により追加のＲＮＡが合成され，これはダイサーを活性化して追加のｓｉＮＡ分子が生じ，このことによりＲＮＡｉ応答が増幅される。
図１８Ａ−Ｆは，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの非限定的例を示す。図中，Ｎは任意のヌクレオチド（アデノシン，グアニン，シトシン，ウリジン，または任意にチミジン）を表し，例えば，括弧（ＮＮ）により表されるオーバーハング領域においてチミジンで置換されていてもよい。ｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖について種々の修飾が示されている。
図１８Ａ：センス鎖は，４個のホスホロチオエート５’−および３’末端ヌクレオチド間結合を有する２１ヌクレオチドを含み，ここで，２つの末端３’−ヌクレオチドは任意に塩基対形成してもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，これはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み，任意に３’末端グリセリル成分を有していてもよく，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは任意に標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく，１個の３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合および４個の５’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有していてもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，これはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。
図１８Ｂ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは，任意に塩基対形成してもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，これはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み，任意に３’末端グリセリル成分を有していてもよく，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは，任意に標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，これはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。
図１８Ｃ：センス鎖は５’末端キャップ成分および３’末端キャップ成分を有する２１ヌクレオチドを含み，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは任意に塩基対形成していてもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，これはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は，２１ヌクレオチドを含み，任意に３’末端グリセリル成分を有していてもよく，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは任意に標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく，１個の３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有していてもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，これはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。
図１８Ｄ：センス鎖は５’末端キャップ成分および３’末端キャップ成分を有する２１ヌクレオチドを含み，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは任意に塩基対形成してもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，これはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができ，存在しうるすべてのプリンヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み，これは任意に３’末端グリセリル成分を有していてもよく，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは任意に標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく，１個の３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有していてもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，存在しうるすべてのプリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり，これはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。
図１８Ｅ：センス鎖は５’末端キャップ成分および３’末端キャップ成分を有する２１ヌクレオチドを含み，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは任意に塩基対形成してもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，これは，リボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み，任意に３’末端グリセリル成分を有していてもよく，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは任意に標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，存在しうるすべてのプリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり，これは，リボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。
図１８Ｆ：センス鎖は５’末端キャップ成分および３’末端キャップ成分を有する２１ヌクレオチドを含み，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは任意に塩基対形成してもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，これはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み，任意に３’末端グリセリル成分を有していてもよく，ここで，２個の末端３’−ヌクレオチドは任意に標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく，１個の３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有していてもよく，存在しうるすべてのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，存在しうるすべてのプリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ修飾ヌクレオチドであり，これはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。コンストラクトＡ−Ｆのアンチセンス鎖は，本発明の標的ＲＮＡ配列に相補的な配列を含む。
図１９は，本発明の化学的に修飾された特定のｓｉＮＡ配列の非限定的例を示す。Ａ−Ｆは，図１８Ａ−Ｆに示される化学的修飾をＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）を標的とする代表的ｓｉＮＡ配列に適用したものである。
図２０は，本発明の種々のｓｉＮＡコンストラクトの非限定的例を示す。示される例（コンストラクト１，２，および３）は典型的な１９塩基対を有するが，本発明の異なる態様には本明細書に記載される任意の数の塩基対が含まれる。括弧内の領域は，例えば約１，２，３，または４ヌクレオチドの長さ，好ましくは約２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングを表す。コンストラクト１および２は，ＲＮＡｉ活性用に独立して用いることができる。コンストラクト２は，ポリヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを含むことができ，これは，任意に，生物分解性リンカーとして設計することができる。１つの態様においては，コンストラクト２に示されるループ構造は生物分解性リンカーを含むことができ，このことにより，インビボおよび／またはインビトロでコンストラクト１が形成される。別の例においては，同じ原理でコンストラクト２を生成するためにコンストラクト３を用いることができ，ここで，リンカーはインビボおよび／またはインビトロで活性なｓｉＮＡコンストラクト２を生成するために用いられ，これは任意に別の生物分解性リンカーを用いてインビボおよび／またはインビトロで活性なｓｉＮＡコンストラクト１を生成することができる。そのように，ｓｉＮＡコンストラクトの安定性および／または活性は，インビボまたはインビトロで，および／またはインビトロにおいて用いるためのｓｉＮＡコンストラクトの設計に基づいて調節することができる。
図２１は，特定の標的核酸配列，例えばメッセンジャーＲＮＡ中のｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉの標的部位を決定するために用いられる方法の概略図である。（Ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域が標的核酸配列の全域で標的部位に対する相補性を有し，センス領域がｓｉＮＡのアンチセンス領域に相補的な配列を含むよう，ｓｉＮＡオリゴヌクレオチドのプールを合成する。（Ｂ）配列を細胞にトランスフェクトする。（Ｃ）標的核酸配列の調節に伴う表現型の変化に基づいて細胞を選択する。（Ｄ）選択された細胞からｓｉＮＡを単離し，シークエンスして，標的核酸配列中の有効な標的部位を同定する。
図２２は，例えば，本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために用いることができる，種々の安定化化学（１−１０）の非限定的例を示す：（１）［３−３’］−反転デオキシリボース；（２）デオキシリボヌクレオチド；（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド；（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；（６）３’−グリセリル；（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド；（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド；および（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチド。図面に示されている修飾および非修飾の骨格化学に加えて，これらの化学を本明細書に記載されるような別の骨格修飾，例えば，式Ｉを有する骨格修飾と組み合わせることができる。さらに，示される末端修飾の５’側に示される２’−デオキシヌクレオチドは，本明細書に記載される別の修飾または非修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド，例えば，式Ｉ−ＶＩＩまたはそれらの任意の組み合わせを有する修飾であってもよい。
図２３は，血管新生のラット角膜モデルを用いるＶＥＧＦ−誘導性血管新生のｓｉＮＡ媒介性阻害の非限定的例を示す。ＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡの部位２３４０を標的とするｓｉＮＡ（ＲＰＩ番号，センス鎖／アンチセンス鎖で示される）を，３種類の異なる濃度で，反転対照（ＲＰＩ番号，センス鎖／アンチセンス鎖で示される）と比較し，さらにｓｉＮＡを投与しないＶＥＧＦ対照と比較した。
図２４は，ヌクレアーゼに耐性であるがＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保持している本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを同定するために用いられる戦略の非限定的例を示す。経験に基づく設計パラメータ（例えば，２’−修飾，塩基修飾，骨格修飾，末端キャップ修飾等の導入）に基づいてｓｉＮＡコンストラクトに化学修飾を導入する。修飾されたコンストラクトを適当な系（例えば，示されるようにヌクレアーゼ耐性についてはヒト血清，またはＰＫ／デリバリーパラメータについては動物モデル）で試験する。平行して，例えば，細胞培養系において，例えばルシフェラーゼレポーターアッセイにより，ＲＮＡｉ活性についてｓｉＮＡコンストラクトを試験する。次に，特定の特徴を有するがＲＮＡｉ活性を保持しているリードｓｉＮＡコンストラクトを同定し，これをさらに修飾し，再びアッセイする。この同じ方法を用いて，改良された薬物動態学的プロファイル，デリバリー，およびＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ−コンジュゲート分子を同定することができる。
図２５は，ＨＥＲ２ ｍＲＮＡの部位２３４４および３７０６を標的とするＲＮＡ系のおよび化学的に修飾されたｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＨＥＲ２ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。Ａ５４９細胞を，部位２３４４については３’末端ジチミジンキャップを有する２５ｎＭの未修飾ｓｉＮＡ（ＲＰＩ＃２８２６６／２８２６７）または対応する反転対照（ＲＰＩ＃２８２６８／２８２６９）と，および部位３７０６については（ＲＰＩ＃２８２６２／２８２６３）および対応する反転対照（ＲＰＩ２８２６４／２８２６５）と複合体化した４μｇ／ｍｌの脂質でトランスフェクトした。さらに，Ａ５４９細胞を，部位２３４４については２５ｎＭの修飾ｓｉＮＡ（ＲＰＩ＃３０４４２／３０４４３）および対応するマッチした対照（ＲＰＩ＃３０４４４／３０４４５）と，および部位３７０６については（ＲＰＩ＃３０４３８／３０４３９）および対応するマッチした対照（ＲＰＩ３０４４０／３０４４１）と複合体化した４μｇ／ｍｌの脂質でトランスフェクトした。図に示されるように，部位２３４４および３７０６を標的とする修飾されたコンストラクトおよび修飾されていないコンストラクトはすべて，ＨＥＲ２ ＲＮＡ発現の有意な阻害を示す。
図２６は，ＰＫＣ−アルファｍＲＮＡを標的とする化学的に修飾されたｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＰＫＣ−アルファｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。Ａ５４９細胞を２５ｎＭのｓｉＮＡと複合体化した０．２５μｇ／ウエルの脂質でトランスフェクトした。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含む一連のｓｉＮＡコンストラクトを，未処理細胞，スクランブル化ｓｉＮＡ対照コンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）と比較した。図に示されるように，すべてのｓｉＮＡコンストラクトは，ＰＫＣ−アルファＲＮＡ発現の有意な減少を示す。
図２７は，ｃ−Ｍｙｃ ｍＲＮＡを標的とする化学的に修飾されたｓｉＮＡにより媒介される，２９３Ｔ細胞におけるＭｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ）ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。２９３Ｔ細胞を２５ｎＭのｓｉＮＡと複合体化した０．２５μｇ／ウエルの脂質でトランスフェクトした。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含む一連のｓｉＮＡコンストラクトを，未処理細胞，スクランブル化ｓｉＮＡ対照コンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）と比較した。図に示されるように，３つのｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ３０９９３／３１０６９；ＲＰＩ３０９９５／３１０７１；およびＲＰＩ３０９９６／３１０７２）は，ｃ−Ｍｙｃ ＲＮＡ発現の有意な減少を示す。
図２８は，ＢＣＬ２ ｍＲＮＡを標的とする化学的に修飾されたｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＢＣＬ２ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。Ａ５４９細胞を２５ｎＭのｓｉＮＡと複合体化した０．２５μｇ／ウエルの脂質でトランスフェクトした。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３０９９８／３１０７４）を，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３６８／３１３６９）とともに試験した。また，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３７０／３１３７１），および２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンおよび２’−デオキシ−２’−フルオロプリンヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖が５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３７２／３１３７３）とも比較した。これはまた，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３７４／３１３７５）と比較した。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトはまた，未処理細胞，脂質でトランスフェクトした細胞，およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２）および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。図に示されるように，ｓｉＮＡコンストラクトはスクランブル化，未処理，およびトランスフェクション対照と比較して，ＢＣＬ２ ＲＮＡ発現の有意な減少を示す。
図２９は，ＣＨＫ−１ ｍＲＮＡを標的とする化学的に修飾されたｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＣＨＫ−１ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。Ａ５４９細胞を２５ｎＭのｓｉＮＡと複合体化した０．２５μｇ／ウエルの脂質でトランスフェクトした。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１００３／３１０７９），および２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３０２／３１３０３）を，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３１４／３１３２５）と比較した。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトは，未処理細胞，脂質およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２）でトランスフェクトした細胞，および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。図に示されるように，いずれのｓｉＮＡコンストラクトも適当な対照と比較してＣＨＫ−１ ＲＮＡ発現の有意な減少を示す。
図３０は，ＢＡＣＥ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＢＡＣＥ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。Ａ５４９細胞を２５ｎＭのｓｉＮＡと複合体化した０．２５μｇ／ウエルの脂質でトランスフェクトした。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含む一連のｓｉＮＡコンストラクトを，未処理細胞，スクランブル化ｓｉＮＡ対照コンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）と比較した。図に示されるように，すべてのｓｉＮＡコンストラクトは，ＢＡＣＥ ＲＮＡ発現の有意な減少を示す。
図３１は，サイクリンＤ１ ｍＲＮＡを標的とする化学的に修飾されたｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるサイクリンＤ１ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。Ａ５４９細胞を２５ｎＭのｓｉＮＡと複合体化した０．２５μｇ／ウエルの脂質でトランスフェクトした。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１００９／３１０８５）を，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３０４／３１３０５）と比較した。また，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３１６／３１３１７）とも比較した。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトはまた，未処理細胞，脂質でトランスフェクトした細胞およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。図に示されるように，いずれのｓｉＮＡコンストラクトもサイクリンＤ１ ＲＮＡ発現の有意な減少を示す。
図３２は，ＰＴＰ−１Ｂ ｍＲＮＡを標的とする化学的に修飾されたｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＰＴＰ−１Ｂ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。Ａ５４９細胞を２５ｎＭのｓｉＮＡと複合体化した０．２５μｇ／ウエルの脂質でトランスフェクトした。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１０１８／３１３０７）を，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３０６／３１３０７）と比較した。また，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３１８／３１３１９）と比較した。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトはまた，未処理細胞，脂質でトランスフェクトした細胞およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。図に示されるように，いずれのｓｉＮＡコンストラクトも，ＰＴＰ−１Ｂ ＲＮＡ発現の有意な減少を示す。
図３３は，ＥＲＧ２ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡにより媒介される，ＤＬＤ１細胞におけるＥＲＧ２ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。ＤＬＤ１細胞を２５ｎＭのｓｉＮＡと複合体化した０．２５μｇ／ウエルの脂質でトランスフェクトした。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含む一連のｓｉＮＡコンストラクトを，未処理細胞，スクランブル化ｓｉＮＡ対照コンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）と比較した。図に示されるように，すべてのｓｉＮＡコンストラクトはＥＲＧ２ ＲＮＡ発現の有意な減少を示す。
図３４は，ＰＣＮＡ ｍＲＮＡを標的とする化学的に修飾されたｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＰＣＮＡ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。Ａ５４９細胞を２５ｎＭのｓｉＮＡと複合体化した０．２５μｇ／ウエルの脂質でトランスフェクトした。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１０３５／３１１１１）を，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３１０／３１３１１）と比較した。また，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３２２／３１３２３）と比較した。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトはまた，未処理細胞，脂質でトランスフェクトした細胞およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。図に示されるように，いずれのｓｉＮＡコンストラクトもＰＣＮＡ ＲＮＡ発現の有意な減少を示す。
発明の詳細な説明
本発明の核酸分子の作用のメカニズム
以下の議論は，現在知られている短干渉ＲＮＡにより媒介されるＲＮＡ干渉の提唱されるメカニズムを記載するが，限定を意味するものではなく，先行技術であると認めるものではない。本出願人は，本明細書において，化学的に修飾された短干渉核酸がｓｉＲＮＡ分子と類似のまたは改良されたＲＮＡｉ媒介能力を有し，インビボで改良された安定性および活性を有すると予測されることを示す。したがって，この議論は，ｓｉＲＮＡのみに限定されることを意味するものではなく，ｓｉＮＡ全体に適用することができる。"ＲＮＡｉを媒介する改良された能力"または"改良されたＲＮＡｉ活性"とは，インビトロおよび／またはインビボで測定されたＲＮＡｉ活性を含むことを意味し，ここで，ＲＮＡｉ活性はｓｉＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力と本発明のｓｉＮＡの安定性との両方を反映する。本発明においては，これらの活性の積を，全ＲＮＡ ｓｉＲＮＡまたは複数のリボヌクレオチドを含むｓｉＮＡと比較して，インビトロおよび／またはインビボで増加させることができる。場合によっては，ｓｉＮＡ分子の活性または安定性は低下するかもしれないが（すなわち，１０分の１以下），ｓｉＮＡ分子の全体的活性はインビトロおよび／またはインビボで増強される。
ＲＮＡ干渉とは，動物において短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを表す（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物における対応するプロセスは一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと称され，真菌においてはクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは，外来遺伝子の発現を防止するために用いられる進化的に保存された細胞防御メカニズムであると考えられており，異なる叢および門が共通して有している（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。そのような外来遺伝子発現からの防御は，ウイルス感染または宿主ゲノム中へのトランスポゾン要素のランダムインテグレーションから生ずる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して，相同的一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答により進化してきたのであろう。細胞におけるｄｓＲＮＡの存在は，まだ完全には特性決定されていないメカニズムにより，ＲＮＡｉ応答を引き起こす。このメカニズムは，蛋白質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介性活性化の結果，リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断が生ずるインターフェロン応答とは異なるようである。
細胞中に長いｄｓＲＮＡが存在すると，ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは，ｄｓＲＮＡをプロセシングして短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる短い断片のｄｓＲＮＡとすることに関与している（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサー活性から生ずる短干渉ＲＮＡは，典型的には約２１−２３ヌクレオチドの長さであり，約１９塩基対のデュープレックスを含む。ダイサーはまた，翻訳制御における関与が示唆されている保存された構造の前駆体ＲＮＡから２１および２２ヌクレオチドの小さな一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を切り出すことに関与することが示唆されている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた，一般にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される，ｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし，これはｓｉＲＮＡと相同な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は，ｓｉＲＮＡデュープレックスのガイド配列に相補的な領域の中央部で生ずる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。さらに，ＲＮＡ干渉には，小さいＲＮＡ（例えば，マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）に媒介される遺伝子サイレンシングが関与する場合もある。これはおそらくは，クロマチン構造を制御する細胞性メカニズムによるものであり，このことにより標的遺伝子配列の転写が妨害される（例えば，Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。このように，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡ転写産物との相互作用を介して，あるいは特定の遺伝子配列との相互作用により，遺伝子サイレンシングを媒介するために用いることができ，そのような相互作用により転写レベルまたは転写後レベルのいずれかで遺伝子サイレンシングが生ずる。
ＲＮＡｉは種々の系で研究されてきた。Ｆｉｒｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は，Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓにおいて最初にＲＮＡｉを観察した。ＷｉａｎｎｙおよびＧｏｅｔｚ（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，７０）は，マウス胚においてｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉを記載する。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は，ｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記載する。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）は，培養哺乳動物細胞，例えばヒト胚性腎臓細胞およびＨｅＬａ細胞において，合成の２１ヌクレオチドＲＮＡのデュープレックスを導入することにより誘導されるＲＮＡｉを記載する。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究は，効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ，構造，化学組成，および配列についてのある種の要件を明らかにした。これらの研究は，２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡデュープレックスは２つの２−ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む場合に最も活性であることを示した。さらに，一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が破壊されるが，３’末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置換することは許容されることが示された。ｓｉＲＮＡデュープレックスの中心におけるミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を破壊することが示された。さらに，これらの研究はまた，標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなくガイド配列の５’末端により規定されることを示した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７）。別の研究により，ｓｉＲＮＡ活性にはｓｉＲＮＡデュープレックスの標的相補的鎖上に５’−リン酸が必要であること，およびｓｉＲＮＡ上の５’−リン酸成分を維持するためにＡＴＰが用いられていることが示されている（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）；しかし，５’−リン酸を欠失したｓｉＲＮＡ分子は外的に導入したときに活性であり，このことは，インビボでｓｉＲＮＡコンストラクトの５’−リン酸化が生じているかもしれないことを示唆する。
核酸分子の合成
１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難であり，そのような分子の治療コストは非常に高くなる。本発明においては，好ましくは，小さい核酸モチーフ（"小さい"とは，１００ヌクレオチド以下の長さ，好ましくは８０ヌクレオチド以下の長さ，最も好ましくは５０ヌクレオチド以下の長さの核酸モチーフ，例えば，別々のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列またはタンデムで合成されたｓｉＮＡ配列を表す）が外的デリバリーに用いられる。これらの分子は構造が簡単であるため，核酸が蛋白質および／またはＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。本発明の例示的分子は化学的に合成するが，他の分子も同様に合成することができる。
オリゴヌクレオチド（例えば，ある種の修飾オリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを欠失しているオリゴヌクレオチドの一部）は，例えば，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９９／５４４５９，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許６，００１，３１１に記載されるような，当該技術分野において知られるプロトコルを用いて合成する（これらの文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する）。オリゴヌクレオチドの合成は，一般の核酸保護基およびカップリング基，例えば５’末端にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを用いて行う。非限定的例においては，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で，０．２μｍｏｌスケールのプロトコルで，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程，および２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドについては４５秒間のカップリング工程で，小スケールの合成を行う。表ＩＩは，合成サイクルで用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトおよび１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。デオキシ残基の各カップリングサイクルにおいては，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して２２倍過剰（４０μＬの０．１１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイトおよび７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（４０μＬの０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，典型的には９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，ＴＨＦ中１６．９ｍＭ Ｉ2，４９ｍＭピリジン，９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは，ホスホロチオエート結合の導入のためには，ボーケージ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
ＤＮＡ系オリゴヌクレオチドの脱保護は以下のように行う：ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から取り出す。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得る。
本発明のある種のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡについて用いられる合成方法は，Ｕｓｍａｎら（１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅら（１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃｏｔｔら（１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４），Ｗｉｎｃｏｔｔら（１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９）に記載の方法にしたがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例えば，５’末端にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを用いて行う。非限定的例においては，小スケールの合成は，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で，改変した０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて，アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．５分間のカップリング工程を，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程を行う。表ＩＩは，合成サイクルにおいて用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトおよび７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。リボ残基の各カップリングサイクルにおいては，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して６６倍過剰（１２０μＬの０．１１Ｍ＝１３．２μｕｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホルアミダイトおよび１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬの０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，典型的には９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，ＴＨＦ中１６．９ｍＭ Ｉ2，４９ｍＭピリジン，９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは，ホスホロチオエート結合の導入のためには，ボーケージ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
ＲＮＡの脱保護は，２ポットプロトコルまたは１ポットプロトコルのいずれかを用いて行う。２ポットプロトコルについては，ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から取り出す。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得る。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン，７５０μＬ ＴＥＡおよび１．０ｍＬ ＴＥＡ・３ＨＦの溶液３００μＬ，ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し，６５℃に加熱する。１．５時間後，オリゴマーを１．５Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3で反応を停止させる。
あるいは，１ポットプロトコルのためには，ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，３３％エタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液中で，６５℃で１５分間懸濁する。バイアルを室温にする。ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を加え，バイアルを６５℃で１５分間加熱する。試料を−２０℃に冷却し，次に１．５Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3で反応を停止させる。
トリチルオンオリゴマーの精製のためには，停止したＮＨ4ＨＣＯ3溶液を，アセトニトリル，続いて５０ｍＭ ＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８含有カートリッジに負荷する。負荷したカートリッジを水で洗浄した後，ＲＮＡを０．５％ＴＦＡで１３分間脱トリチル化する。次にカートリッジを水で再び洗浄し，１Ｍ ＮａＣｌで塩交換し，再び水で洗浄する。次に，３０％アセトニトリルでオリゴヌクレオチドを溶出する。
平均段階カップリング収率は，典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。当業者は，合成のスケールは，上述の例より大きくまたは小さく，例えば，限定されないが，９６ウエルのフォーマットに適合させることができること認識するであろう。
あるいは，本発明の核酸分子は，別々に合成して，合成後に例えばライゲーションにより（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８，２０４），または合成および／または脱保護の後にハイブリダイゼーションにより，一緒につなげてもよい。
本発明のｓｉＮＡ分子はまた，本明細書の実施例１に記載されるようにタンデム合成法により合成することができる。この方法では，両方のｓｉＮＡ鎖を，切断可能なリンカーにより分離された単一の連続するオリゴヌクレオチドフラグメントまたは鎖として合成し，次にこれを切断して別々のｓｉＮＡフラグメントまたは鎖を生成し，これはハイブリダイズしてｓｉＮＡデュープレックスの精製を可能とする。リンカーはポリヌクレオチドリンカーであっても非ヌクレオチドリンカーであってもよい。本明細書に記載されるｓｉＮＡのタンデム合成は，マルチウエル／マルチプレート合成プラットフォーム，例えば９６ウエルまたは同様のより大きなマルチウエルプラットフォームのいずれにも容易に適合させることができる。本明細書に記載されるｓｉＮＡのタンデム合成はまた，バッチリアクター，合成カラムなどを用いる大規模合成プラットフォームにも容易に適合させることができる。
ｓｉＮＡ分子はまた，一方のフラグメントがＲＮＡ分子のセンス領域を含み，第２のフラグメントがアンチセンス領域を含む２つの別々の核酸鎖またはフラグメントから組み立ててもよい。
本発明の核酸分子は，広範囲に修飾して，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｈによる修飾により安定性を高めることができる（概説として，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。ｓｉＮＡコンストラクトは，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）により精製し，水に再懸濁する。
本発明の別の観点においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベクターは，ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターでありうる。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルスまたはアルファウイルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターを本明細書に記載されるようにデリバリーし，標的細胞中に残留させることができる。あるいは，ｓｉＮＡ分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いてもよい。
本発明の核酸分子の活性の最適化
修飾（塩基，糖および／またはリン酸）を有する化学的に合成した核酸分子は，血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ，このことによりその抗力を高めることができる（例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ６，３００，０７４およびＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照（これらはすべて本明細書の一部としてここに引用する）。上述の参考文献はすべて，本明細書に記載される核酸分子の塩基，リン酸および／または糖成分になしうる種々の化学修飾を記載する。細胞中におけるその抗力を増強するよう修飾し，およびオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するために核酸分子から塩基を除去することが望ましい。
当該技術分野には，そのヌクレアーゼ安定性および効力を有意に増強することができる，核酸分子中に導入することができる糖，塩基およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。例えば，オリゴヌクレオチドは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２'−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，２'−Ｈ等のヌクレオチド塩基修飾で修飾することにより，安定性を高め，および／または生物学的活性を増強するために修飾される（総説については，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ ＴＩＴＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ３５，１４０９０を参照）。核酸分子の糖修飾は，当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，７１６，８２４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２７，０５３；Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９８／１３５２６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願６０／０８２，４０４（１９９８年４月２０日出願）；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５；Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４；およびＢｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０を参照，これらの参考文献はすべて，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。これらの刊行物は，触媒活性を変更することなく，糖，塩基および／またはリン酸修飾等を核酸分子中に組み込む位置を決定する一般的方法および戦略を記載しており，本明細書の一部としてここに引用する。このような教示の観点から，ｓｉＮＡが細胞においてＲＮＡｉを促進する能力が有意に阻害されない限り，本明細書に記載されるように，同様の修飾を用いて本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。
ホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，および／または５’−メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を改良するが，過剰な修飾はある種の毒性または活性の低下を引き起こしうる。したがって，核酸分子を設計する場合，これらのヌクレオチド間結合の量は最小にすべきである。これらの結合の濃度を減少させると，毒性が低下し，これらの分子の効力が増加し特異性が高くなるはずである。
活性を維持または増強する化学的修飾を有する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子が提供される。そのような核酸はまた，一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対する耐性が高い。したがって，インビトロおよび／またはインビボで活性は顕著に低下しないはずである。調節が目的である場合には，外的にデリバリーされる治療用核酸分子は，最適には，望ましくない蛋白質のレベルが低下するのに充分長い時間標的ＲＮＡの翻訳が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。この時間は，疾病の状態により数時間から数日まで様々である。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成における進歩（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｌａｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９（本明細書の一部としてここに引用する））により，上述のようにヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることにより，核酸分子を改変する可能性が拡大した。
１つの態様においては，本発明の核酸分子は，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のＧクランプヌクレオチドを含む。Ｇクランプヌクレオチドは，修飾シトシン類似体であり，ここで，修飾は，デュープレックス中の相補的グアニンのワトソン・クリックおよびフーグスティーン面の両方の水素結合の能力を与える。例えば，Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，８５３１−８５３２を参照。オリゴヌクレオチド中の単一のＧクランプ類似体置換により，相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときのらせん熱安定性およびミスマッチ識別性を実質的に増強することができる。そのようなヌクレオチドを本発明の核酸分子中に取り込ませることにより，核酸標的の相補的配列またはテンプレート鎖に対する親和性および特異性の両方が増強される。別の態様においては，本発明の核酸分子は１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のＬＮＡ"ロック核酸"ヌクレオチド，例えば，２’，４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを含む（例えば，Ｗｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／６６６０４およびＷＯ９９／１４２２６を参照）。
別の態様においては，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲートおよび／または複合体を特徴とする。そのようなコンジュゲートおよび／または複合体は，生物学的システム，例えば細胞へのｓｉＮＡ分子のデリバリーを容易にするために用いることができる。本発明により提供されるコンジュゲートおよび複合体は，治療用化合物を細胞膜を超えて輸送し，薬物動態学を変更し，および／または本発明の核酸分子の局在化を調節することにより，治療的活性を付与することができる。本発明は，分子，例えば，限定されないが，小分子，脂質，リン脂質，ヌクレオシド，ヌクレオチド，核酸，抗体，トキシン，負に荷電したポリマーおよび他のポリマー，例えば，蛋白質，ペプチド，ホルモン，炭水化物，ポリエチレングリコール，またはポリアミンを，細胞膜を横切ってデリバリーするための，新規コンジュゲートおよび複合体の設計および合成を包含する。一般に，記載されるトランスポーターは，個々にまたは多成分系の一部として，分解性リンカー付きでまたはなしで用いるよう設計される。これらの化合物は，血清の存在下または非存在下で，本発明の核酸分子を異なる組織に由来する多数の細胞タイプにデリバリーおよび／または局在化することを改良すると予測される（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，米国特許５，８５４，０３８を参照）。本明細書に記載される分子のコンジュゲートは，生物分解性のリンカー，例えば生物分解性核酸リンカー分子を介して，生物学的に活性な分子に結合させることができる。
本明細書において用いる場合，"生物分解性リンカー"との用語は，１つの分子を別の分子に，例えば，生物学的に活性な分子を本発明のｓｉＮＡ分子に，または本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖とを接続するための生物分解性リンカーとして設計される核酸または非核酸リンカー分子を表す。生物分解性リンカーは，特定の目的，例えば特定の組織または細胞タイプへのデリバリーのためにその安定性を調節することができるように設計する。核酸に基づく生物分解性リンカー分子の安定性は，リボヌクレオチド，デオキシリボヌクレオチド，および化学的に修飾されたヌクレオチド，例えば，２’−Ｏ−メチル，２’−フルオロ，２’−アミノ，２’−Ｏ−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−Ｏ−アリル，および他の２’−修飾または塩基修飾ヌクレオチドの種々の組み合わせを用いることにより調節することができる。生物分解性核酸リンカー分子は，ダイマー，トリマー，テトラマー，またはより長い核酸分子，例えば，約２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，または２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであることができ，またはリン酸に基づく結合，例えば，ホスホルアミデートまたはホスホジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含むことができる。生物分解性核酸リンカー分子はまた，核酸骨格，核酸糖，または核酸塩基修飾を含むことができる。
本明細書において用いる場合，"生物分解性"との用語は，生物学的システムにおける分解，例えば酵素的分解または化学的分解を表す。
本明細書において用いる場合，"生物学的に活性な分子"との用語は，システムにおいて生物学的応答を導き出すかまたは調節することができる化合物または分子を表す。本発明により単独または他の分子との組み合わせで企図される生物学的に活性なｓｉＮＡ分子の非限定的例としては，治療上活性な分子，例えば，抗体，ホルモン，抗ウイルス剤，ペプチド，蛋白質，化学療法剤，小分子，ビタミン，補因子，ヌクレオシド，ヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アンチセンス核酸，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，２，５−Ａキメラ，ｓｉＮＡ，ｄｓＲＮＡ，アロザイム，アプタマー，デコイおよびこれらの類似体が含まれる。本発明の生物学的に活性な分子には，他の生物学的に活性な分子の薬物動態学および／または薬力学を調節することができる分子，例えば，脂質およびポリマー，例えば，ポリアミン，ポリアミド，ポリエチレングリコールおよび他のポリエーテルも含まれる。
本明細書において用いる場合，"リン脂質"との用語は，少なくとも１つのリン酸基を含む疎水性分子を表す。例えば，リン脂質は，リン酸含有基および飽和または不飽和アルキル基を含むことができ，これは，ＯＨ，ＣＯＯＨ，オキソ，アミン，または置換もしくは未置換アリール基で任意に置換されていてもよい。
外的にデリバリーされた治療用核酸分子（例えば，ｓｉＮＡ分子）は，最適には，ＲＮＡ転写産物のレベルが低下するのに充分長い時間ＲＮＡの逆転写が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。核酸分子は，有効な細胞内治療用薬剤として機能するためには，ヌクレアーゼに耐性である。本明細書におよび当該技術分野において記載される核酸分子の化学合成の改良により，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を増強させることにより，核酸分子を修飾する可能性が拡大した。
さらに別の態様においては，ＲＮＡｉに関与する蛋白質の酵素活性を維持するかまたは増強させる化学的修飾を有するｓｉＮＡ分子が提供される。そのような核酸はまた，一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対してより耐性が高い。したがって，インビトロおよび／またはインビボで，活性は顕著に低下しないであろう。
本発明の核酸系分子の使用は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数のｓｉＮＡ分子，既知の小分子阻害剤とカップリングさせた核酸分子，または分子（異なる酵素的核酸分子モチーフを含む）および／または他の化学的または生物学的分子の組み合わせによる間欠的治療）。ｓｉＮＡ分子を用いる被験者の治療にはまた，異なる種類の核酸分子，例えば，酵素的核酸分子（リボザイム），アロザイム，アンチセンス，２，５−Ａオリゴアデニレート，デコイ，およびアプタマーの組み合わせが含まれる。
別の観点においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，１またはそれ以上の５’および／または３’−キャップ構造を，例えばセンスｓｉＮＡ鎖のみに，アンチセンスｓｉＮＡ鎖のみに，または両方のｓｉＮＡ鎖に含む。
"キャップ構造"とは，オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれている化学的修飾を意味する（例えば，Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，９９８，２０３（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。これらの末端修飾は，核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し，デリバリーおよび／または細胞中の局在化を助けるであろう。キャップは５’末端（５’−キャップ）に存在してもよく，または３’末端（３’−キャップ）に存在してもよく，両方の末端に存在してもよい。非限定的例においては，５’−キャップは，グリセリル，反転デオキシ無塩基残基（成分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３’−３’−反転ヌクレオチド成分；３’−３’−反転無塩基成分；３’−２’−反転ヌクレオチド成分；３’−２’−反転無塩基成分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋メチルホスホネート成分からなる群より選択される。
非限定的例においては，３’−キャップは，例えば，グリセリル，反転デオキシ無塩基残基（成分），４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５’−５’−反転ヌクレオチド成分；５’−５’−反転無塩基成分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト成分からなる群より選択される（より詳細には，Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１９２５（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。
"非ヌクレオチド"との用語は，１またはそれ以上のヌクレオチドユニットの代わりに核酸鎖中に導入することができ，糖および／またはリン酸置換のいずれかを含み，残りの塩基がその酵素的活性を発揮することを可能とする任意の基または化合物を意味する。基または化合物は，一般に認識されているヌクレオチド塩基，例えば，アデノシン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まず，したがって１’位に塩基を欠失している場合，無塩基である。
"アルキル"基とは，飽和脂肪族炭化水素を表し，直鎖，分枝鎖，および環状アルキル基が含まれる。好ましくは，アルキル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素を有する低級アルキルである。アルキルは置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2，アミノ，またはＳＨである。この用語は，また，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基を含み，直鎖，分枝鎖，および環状基を含む。好ましくは，アルケニル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素原子，より好ましくは１−４個の炭素原子の低級アルケニルである。アルケニル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2，ハロゲン，Ｎ（ＣＨ3）2，アミノ，またはＳＨから選択される。"アルキル"との用語はまた，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む不飽和の炭化水素基を有するアルキニル基を含み，直鎖，分枝鎖，および環状基を含む。好ましくは，アルキニル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素を有する低級アルキニルである。アルキニル基は，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2，アミノまたはＳＨである。
そのようなアルキル基はまた，アリール，アルキルアリール，炭素環式アリール，複素環アリール，アミドおよびエステル基を含むことができる。"アリール"基とは，共役したパイ電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基を表し，炭素環式アリール，複素環アリールおよび二アリール基が含まれる。これらはすべて任意に置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換基は，ハロゲン，トリハロメチル，ヒドロキシル，ＳＨ，ＯＨ，シアノ，アルコキシ，アルキル，アルケニル，アルキニル，およびアミノ基である。"アルキルアリール"基は，アリール基（上述）に共有結合したアルキル基（上述）を表す。炭素環式アリール基は，芳香族環の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は任意に置換されていてもよい。複素環アリール基は，芳香族環中の環原子として１−３個の複素原子を有し，環原子の残りが炭素原子である基である。適当な複素原子には，酸素，イオウ，および窒素が含まれ，例えば，フラニル，チエニル，ピリジル，ピロリル，Ｎ−低級アルキルピロロ，ピリミジル，ピラジニル，イミダゾリル等が挙げられる。これらはすべて任意に置換されていてもよい。"アミド"とは，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。"エステル"とは，−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。
本明細書において用いる場合，"ヌクレオチド"は，当該技術分野においては，天然塩基（標準的），および当該技術分野においてよく知られる修飾塩基を含むと認識されている。そのような塩基は，一般にヌクレオチド糖成分の１’位に位置する。ヌクレオチドは一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは，糖，リン酸および／または塩基成分において修飾されていてもされていなくてもよい（互換的に，ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，非標準的ヌクレオチド等とも称される。例えば，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲）（すべて本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。当該技術分野において知られる修飾核酸塩基のいくつかの例があり，Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸中に導入することができる塩基修飾のいくつかの非限定的例としては，例えば，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニル，５−アルキルシチジン（例えば５−メチルシチジン），５−アルキルウリジン（例えばリボチミジン），５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン），プロピンおよびその他のものが挙げられる（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，上掲）。この観点において，"修飾塩基"とは，１’位におけるアデニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはそれらの同等物を意味する。
１つの態様においては，本発明はリン酸骨格修飾を有する修飾されたｓｉＮＡ分子を特徴とし，これは１またはそれ以上のホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，メチルホスホネート，ホスホトリエステル，モルホリノ，アミデート，カルバメート，カルボキシメチル，アセトアミデート，ポリアミド，スルホネート，スルホンアミド，スルファメート，ホルムアセタール，チオホルムアセタール，および／またはアルキルシリル置換を含む。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については，Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照されたい。
"無塩基"とは，１’位において塩基を欠失しているか，または塩基の代わりに他の化学基を有する糖成分を意味する（例えば，Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，９９８，２０３を参照）。
"非修飾ヌクレオシド"とは，β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合した塩基，アデニン，シトシン，グアニン，チミンまたはウラシルのいずれかの塩基を意味する。
"修飾ヌクレオシド"とは，非修飾ヌクレオチドの塩基，糖および／またはリン酸の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの非限定的例は式Ｉ−ＶＩＩに示されるか，および／または本明細書に記載される他の修飾である。
本発明において記載される２’−修飾ヌクレオチドに関して，"アミノ"とは，２’−ＮＨ2または２’−Ｏ−ＮＨ2を意味し，これは修飾されていてもされていなくてもよい。そのような修飾基は，例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６７２，６９５およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許６，２４８，８７８（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
核酸ｓｉＮＡ構造に対する種々の修飾を作成して，これらの分子の有用性を高めることができる。例えば，このような修飾は，製品寿命，インビトロの半減期，安定性，およびそのようなオリゴヌクレオチドを標的部位に導入する容易さを高め，例えば，細胞膜の透過性を高め，標的とする細胞を認識し結合する能力を付与するであろう。
核酸分子の投与
本発明のｓｉＮＡ分子は，単独でまたは他の療法と組み合わせて，任意の疾病，感染または遺伝子発現に関連する状態，および細胞または組織における遺伝子産物のレベルに応答しうる他の適応症の治療に用いるために適合させることができる。例えば，ｓｉＮＡ分子は，被験者に投与するためのリポソーム等のデリバリーベヒクル，担体および希釈剤，およびそれらの塩を含むことができ，および／または薬学的に許容しうる処方中に存在することができる。核酸分子のデリバリーの方法は，Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５；Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２；およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．．２０００，ＡＣＳＳｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許６，３９５，７１３およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５は，さらに，核酸分子をデリバリーするための一般的な方法を記載する。これらのプロトコルを用いて，事実上いかなる核酸分子もデリバリーすることができる。核酸分子は当業者に知られる種々の方法によって細胞に投与することができ，これには，限定されないが，リポソームへの封入，イオントホレシス，または他のベヒクル，例えば，ヒドロゲル，シクロデキストリン（例えば，Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４を参照），生分解性ナノカプセル，および生体接着性小球体への組み込み，または蛋白質性ベクター（Ｏ’Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎｄ，国際公開ＷＯ００／５３７２２）によるものが含まれる。あるいは，核酸／ベヒクルの組み合わせを，直接注入により，または注入ポンプを用いることにより局所的にデリバリーする。本発明の核酸分子の直接注入は，標準的な針とシリンジの方法論を用いて，または例えばＣｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｌｉｖａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５，２３３０−２３３７およびＢａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／３１２６２に記載される無針手法により，皮下，筋肉内，または皮膚内に行うことができる。当該技術分野における多くの例が，浸透圧ポンプ（Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２５７，１３５−１３８，Ｄ’Ａｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５，１５１−１６４，Ｄｒｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１５７，１６９−１７５，Ｇｈｉｒｎｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４７，２１−２４を参照）または直接注入（Ｂｒｏａｄｄｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｆｏｃｕｓ，３，ａｒｔｉｃｌｅ ４）によるオリゴヌクレオチドのＣＮＳデリバリー法を記載する。デリバリーの他の経路には，限定されないが，経口（錠剤または丸薬の形）および／または髄腔内デリバリー（Ｇｏｌｄ，１９９７，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７６，１１５３−１１５８）が含まれる。核酸のデリバリーおよび投与のより詳細な記述は，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲），Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９９／０５０９４，およびＫｌｉｍｕｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９９／０４８１９に提供される（これらはすべて本明細書の一部としてここに引用する）。本発明の分子は医薬品として用いることができる。医薬品は，被験者における疾病状態を予防し，発症を調節しまたは治療する（症状をある程度，好ましくは症状をすべて軽減する）。
さらに，本発明は，本発明の核酸分子を造血細胞，例えば単球およびリンパ球にデリバリーする方法を使用することを特徴とする。これらの方法は，Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８５（２），９２０−９２８；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ，９１（３），８５２−８６２；Ｆｉｌｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３２９（２），３４５−３５６；Ｍａ ａｎｄ Ｗｅｉ，１９９６，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２０（１１／１２），９２５−９３０；およびＢｏｎｇａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２），４６８１−８により詳細に記載されている。このような方法には，上述したように，造血細胞をオリゴヌクレオチドでトランスフェクションするための，遊離オリゴヌクレオチド，カチオン性脂質処方，ｐＨ感受性リポソームおよびイムノリポソーム等のリポソーム処方，および融合誘導性ペプチドとコンジュゲートさせたオリゴヌクレオチド等のバイオコンジュゲートが含まれる。
すなわち，本発明は，本発明の１またはそれ以上の核酸を，許容しうる担体，例えば安定剤，緩衝液等に含む医薬組成物を特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは，安定剤，緩衝液等を用いてまたは用いずに医薬組成物を形成することにより，任意の標準的な手段により，投与（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡまたは蛋白質）し，被験者に導入することができる。リポソームデリバリーメカニズムを利用することが望ましい場合には，リポソームを形成する標準的なプロトコルにしたがうことができる。本発明の組成物はまた，経口投与用には錠剤，カプセルまたはエリキシルとして；直腸投与用には座剤として；滅菌溶液として；注入投与の用には懸濁液として，および当該技術分野において知られる他の組成物として，処方し使用することができる。
本発明はまた，記載される化合物の薬学的に許容しうる処方を含む。これらの処方には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。
医薬組成物または処方は，細胞または被験者（例えばヒト）への投与（例えば全身投与）に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は，部分的には，使用する投与経路（例えば経口，経皮，または注射）に依存する。そのような形態は，組成物または処方が標的細胞（すなわち，負に荷電した核酸がデリバリーされることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例えば，血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は当該技術分野において知られており，例えば，毒性，および組成物または処方がその効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
"全身投与"とは，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には，限定されないが，静脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれる。これらの投与経路のそれぞれは，本発明のｓｉＮＡ分子をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，分子量またはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソームまたは他の薬剤担体を使用することにより，薬剤を，例えば，あるタイプの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることが可能である。薬剤と細胞（例えば白血球およびマクロファージ）の表面との会合を容易にすることができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は，マクロファージおよび白血球による異常な細胞（例えば過剰のＭＤＲを産生する細胞）の免疫認識の特異性を利用することにより，薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。
"薬学的に許容しうる処方"とは，本発明の核酸分子をその所望の活性に最も適した物理学的位置に有効に分布させることができる組成物または処方を意味する。本発明の核酸分子とともに処方するのに適した薬剤の非限定的例には以下のものが含まれる：ＣＮＳ中への薬剤の侵入を促進することができるＰ−糖蛋白質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５等）（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ ａｎｄ Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ，１９９９，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３，１６−２６）；大脳内移植後の徐放輸送用の生分解性ポリマー，例えばポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）微小球（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）；および薬剤を脳血管関門を越えて輸送することができ，神経の取り込みメカニズムを変更しうる，例えばポリブチルシアノアクリレートから作成される充填されたナノ粒子（Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）。本発明の核酸分子のデリバリー戦略の他の非限定的例には，Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６；およびＴｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載される物質が含まれる。
本発明はまた，ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾，または長期間循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む表面修飾リポソームを含む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は，標的組織における薬剤の蓄積を増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は，単核食細胞システム（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり，したがって，封入された薬剤の血流循環時間を長くし，組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは，おそらくは脈管新生標的組織における溢出および捕獲のため，腫瘍中に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期間循環リポソームは，特に，ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べて，ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態学および薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９２）。長期間循環リポソームはまた，代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織，例えば肝臓および脾臓における蓄積を回避するその能力に基づいて，カチオン性リポソームと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護するようである。
本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を用いることができる。これらには，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤および懸濁剤を用いてもよい。
薬学的に有効な用量とは，疾患状態の予防，発症の阻害，または治療（症状をある程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学的に有効な用量は，疾患の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時に投与される薬剤，および医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，負に荷電したポリマーの効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分を投与する。
本発明の核酸分子およびその処方は，慣用的な無毒性の薬学的に許容しうる担体，アジュバントおよびベヒクルを含む用量単位処方中で，経口的に，局所的に，非経口的に，吸入またはスプレーにより，または直腸に投与することができる。本明細書において用いる場合，非経口的との用語には，経皮，皮下，血管内（例えば，静脈内），筋肉内，または髄腔内注射または注入の手法等が含まれる。さらに，本発明の核酸分子および薬学的に許容しうる担体を含む医薬処方が提供される。１またはそれ以上の本発明の核酸分子は，１またはそれ以上の無毒性の薬学的に許容しうる担体および／または希釈剤，および／またはアジュバント，および所望の場合には他の活性成分とともに存在することができる。本発明の核酸分子を含有する医薬組成物は，経口使用に適した形，例えば，錠剤，トローチ剤，菱形剤，水性または油性懸濁液，分散可能な粉体または顆粒，乳剤，硬カプセルまたは軟カプセル，またはシロップまたはエリキシル剤の形であることができる。
経口で使用することが意図される組成物は，医薬組成物の製造について当該技術分野において知られる任意の方法にしたがって製造することができ，そのような組成物は，薬学的に洗練された口に合う製品を提供するために，１またはそれ以上のそのような甘味剤，芳香剤，着色剤または保存剤を含んでいてもよい。錠剤は，錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容しうる賦形剤との混合物として活性成分を含む。これらの賦形剤は，例えば，不活性希釈剤，例えば，炭酸カルシウム，炭酸ナトリウム，ラクトース，リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；顆粒化剤および崩壊剤，例えば，コーンスターチ，またはアルギン酸；結合剤，例えば，デンプン，ゼラチンまたはアラビアゴム，および潤滑剤，例えば，ステアリン酸マグネシウム，ステアリン酸またはタルクでありうる。錠剤は被覆しなくてもよく，既知の手法により被覆してもよい。場合によっては，既知の手法によりそのような被覆を調製して，胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ，このことによりより長い期間の持続的な作用を与えることができる。例えば，遅延用材料，例えばグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを用いることができる。
経口使用のための処方は，活性成分が不活性固体希釈剤，例えば，炭酸カルシウム，リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル，または活性成分が水または油状媒体，例えば，ピーナッツ油，液体パラフィンまたはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルであってもよい。
水性懸濁液は，水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含む。そのような賦形剤は，懸濁剤，例えば，カルボキシメチルセルロースナトリウム，メチルセルロース，ヒドロプロピル−メチルセルロース，アルギン酸ナトリウム，ポリビニルピロリドン，トララガントガムおよびアラビアゴムである。分散剤または湿潤剤は，天然に生ずるホフファチド，例えば，レシチン，またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物，例えば，ステアリン酸ポリオキシエチレン，またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物，例えば，ヘプタデカエチレンオキシセタノール，またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物，例えば，ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート，またはエチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物，例えば，ポリエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。水性懸濁液はまた，１またはそれ以上の保存剤，例えば，エチル−，またはｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート，１またはそれ以上の着色剤，１またはそれ以上の芳香剤，および１またはそれ以上の甘味剤，例えばショ糖またはサッカリンを含んでいてもよい。
油性懸濁液は，活性成分を植物油，例えば，アラキス油，オリーブ油，ゴマ油またはココナッツ油，または無機油，例えば液体パラフィン中に懸濁させることにより処方することができる。油性懸濁液は，増粘剤，例えば，密ロウ，硬パラフィンまたはセチルアルコールを含むことができる。甘味剤および芳香剤を加えて，口に合う経口製品を得ることができる。これらの組成物は，抗酸化剤，例えばアスコルビン酸を加えることにより保存することができる。
水を加えることにより水性懸濁液を製造するのに適した分散可能な粉体および顆粒は，活性成分を，分散剤または湿潤剤，懸濁剤および１またはそれ以上の保存剤との混合物中で与える。適当な分散剤または湿潤剤または懸濁剤は，上で例示したとおりである。さらに別の賦形剤，例えば，甘味剤，芳香剤および着色剤が存在していてもよい。
本発明の医薬組成物はまた，水中油エマルジョンの形であってもよい。油相は，植物油またはミネラルオイルまたはこれらの混合物であってもよい。適当な乳化剤としては，天然に生ずるガム，例えば，アラビアゴムまたはトラガガントゴム，天然に生ずるホスファチド類，例えば，大豆，レクチン，および脂肪酸とヘキシトールから誘導されるエステルまたは部分エステル，無水物，例えば，ソルビタンモノオレエート，および前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物，例えば，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。エマルジョンは，甘味料および芳香剤を含んでいてもよい。
シロップおよびエリキシルは，甘味剤，例えば，グリセロール，プロピレングリコール，ソルビトール，グルコースまたはショ糖を用いて処方することができる。このような処方はまた，粘滑剤，保存剤および甘味料および着色料を含んでいてもよい。医薬組成物は，滅菌した注射可能な水性または油性の懸濁液の形であってもよい。この懸濁液は，上述した適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて，当該技術分野において知られるように処方することができる。滅菌した注射可能な製品はまた，無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌した注射可能な溶液または懸濁液，例えば，１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることのできる許容可能なベヒクルおよび溶媒の例は，水，リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに，滅菌し固定した油を溶媒または懸濁媒体として便利に用いることができる。この目的のためには，任意の非刺激性の固定した油，例えば，合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを用いることができる。さらに，脂肪酸，例えば，オレイン酸を注射可能な薬剤の製造において用いることができる。
本発明の核酸分子はまた，例えば，薬剤の直腸投与用に，座剤の形で投与することができる。これらの組成物は，薬剤を，通常の温度では固体であるが直腸温度では液体であり，したがって直腸中で溶融して薬剤を放出する適当な非刺激性賦形剤と混合することにより製造することができる。そのような材料としては，カカオバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
本発明の核酸分子は，滅菌媒体中で非経口的に投与することができる。薬剤は，使用するベヒクルおよび濃度に応じて，ベヒクル中に懸濁されていてもよく，溶解されていてもよい。アジュバント，例えば局所麻酔剤，保存剤および緩衝剤をベヒクル中に溶解することも有利である。
上述した健康状態の治療には，体重１キログラムあたり１日あたり約０．１ｍｇ−約１４０ｍｇのオーダーの投与量レベルが有用である（被験者あたり１日あたり約０．５ｍｇ−約７ｇ）。担体物質と組み合わせて１回投与量形を生成することができる活性成分の量は，治療される宿主および投与の特定のモードに依存して様々である。投与量単位形は，一般に，約１ｍｇ−約５００ｍｇの活性成分を含む。
特定の被験者についての特定の投与量レベルは，種々の因子，例えば，用いる特定の化合物の活性，年齢，体重，一般的健康状態，性別，食事，投与時間，投与経路，および排出速度，薬剤の組み合わせ，および治療をしている特定の疾病の重篤性に依存することが理解されるであろう。
ヒト以外の動物に投与するためには，組成物を動物飼料または飲料水に加えてもよい。動物が治療上適当な量の組成物を飼料とともに接種できるよう，動物飼料および飲用水組成物を処方することが便利であろう。飼料または飲料水に加えるように組成物をプレミックスとして製造することも便利であろう。
本発明の核酸分子はまた，他の治療用化合物と組み合わせて被験者に投与して，全体的治療効果を高めることができる。ある適応症の治療に複数の化合物を用いることにより，副作用の存在を低下させながら有益な効果を高めることができる。
１つの態様においては，本発明は，特定の細胞タイプに本発明の核酸分子を投与するのに適した組成物を含む。例えば，アシアロ糖蛋白質レセプター（ＡＳＧＰｒ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２）は，肝細胞に独特であり，分枝鎖ガラクトース末端糖蛋白質，例えばアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）に結合する。別の例においては，多くの癌細胞中で葉酸レセプターが過剰発現されている。そのような糖蛋白質，合成グリココンジュゲート，または葉酸のレセプターへの結合は，オリゴサッカライド鎖の分枝の程度に強く依存する親和性で生ずる。例えば，三触角構造は，二触角または一触角鎖より高い親和性で結合する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２，６１１−６２０；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，９３９−９４５）。Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ（１９８７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，４，３１７−３２８）は，ガラクトースと比較してレセプターに対してより高い親和性を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンを炭水化物成分として用いることによりこの高い特異性を得た。この"クラスタリング効果"はまた，マンノシル末端糖蛋白質またはグリココンジュゲートの結合および取込についても記載されている（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｌｉｅｎｔ．，２４，１３８８−１３９５）。ガラクトース，ガラクトースアミンまたは葉酸に基づくコンジュゲートを使用して外来性化合物を細胞膜を超えて輸送することにより，例えば，肝疾患，肝臓の癌，または他の癌の治療に標的化デリバリー法を提供することができる。また，バイオコンジュゲートの使用により，治療に必要な治療用化合物の必要用量を低下させることができる。さらに，本発明の核酸バイオコンジュゲートを使用することにより，治療薬の生物利用性，薬力学，および薬物動態学的パラメータを調節することができる。そのようなバイオコンジュゲートの非限定的例は，Ｖａｒｇｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願１０／２０１，３９４，（２００１年８月１３日出願）；およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ，米国特許出願６０／３６２，０１６（２００２年３月６日出願）に記載されている。
あるいは，本発明のある種のｓｉＮＡ分子は，細胞中で真核生物プロモーターから発現させることができる（例えば，Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５）。当業者は，真核生物細胞中で任意の核酸を適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを認識するであろう。そのような核酸の活性は，酵素的核酸によりそれらを一次転写産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６）。
本発明の別の観点においては，本発明のＲＮＡ分子は，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現させることができる（例えばＣｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。組換えベクターは，ＤＮＡプラスミドであってもウイルスベクターであってもよい。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができる。別の態様においては，ｐｏｌＩＩＩに基づくコンストラクトを用いて，本発明の核酸分子を発現させる（例えば，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，米国特許５，９０２，８８０および６，１４６，８８６を参照）。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターは，上述のようにデリバリーされ，標的細胞中に残留することができる。あるいは，核酸分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，ｓｉＮＡ分子は標的ｍＲＮＡと相互作用して，ＲＮＡｉ応答を生ずる。ｓｉＮＡ分子を発現するベクターの輸送は，全身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与した後，被験者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により，行うことができる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。
１つの観点においては，本発明は，少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは，ｓｉＮＡデュープレックスの一方または両方の鎖，または自己ハイブリダイズしてｓｉＮＡデュープレックスを生ずる１本の自己相補的鎖をコードすることができる。本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列は，そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とする様式で動作可能なように連結することができる（例えば，Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；およびＮｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５を参照）。
別の観点においては，本発明は，以下を含む発現ベクターを特徴とする：ａ）転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核生物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの終止領域）；およびｃ）本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を含み，前記配列は，ｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。ベクターは，任意に，本発明のｓｉＮＡをコードする配列の５'側または３’側に動作可能なように連結された蛋白質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／またはイントロン（介在配列）を含んでいてもよい。
ｓｉＮＡ分子配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ），ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ），またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターにより推進させることができる。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからの転写産物は，すべての細胞において高いレベルで発現される。あるタイプの細胞におけるあるｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイレンサー等）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で発現される限り，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ １９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒｅｔ．ａｌ．，１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。何人かの研究者が，そのようなプロモーターから発現した核酸分子が哺乳動物細胞中で機能しうることを示している（例えば，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，９０，６３４０−４；Ｌ'Ｈｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より詳細には，転写ユニット，例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものは，細胞中において高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えばｓｉＮＡ）を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，１６２４，８０３；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１８７３６）。上述のｓｉＮＡ転写ユニットは，哺乳動物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むことができる。ベクターとしては，限定されないが，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター），またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）。
別の観点においては，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を，そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを特徴とする。１つの態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；およびｃ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み；この配列は，ｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域および終止領域に動作可能なように連結されている。
別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）オープンリーディングフレーム；およびｄ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み，この配列は，オープンリーディングフレームの３'−末端に動作可能なように連結されており，配列は，ｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域，オープンリーディングフレームおよび終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；およびｄ）少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含み；この配列は，核酸分子の発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域，イントロンおよび終止領域に動作可能なように連結されている。
別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；およびｅ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み，この配列は，オープンリーディングフレームの３'−末端に動作可能なように連結されており，配列は，ｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域，イントロン，オープンリーディングフレームおよび終止領域に動作可能なように連結されている。
以下は本発明の核酸の選択，単離，合成および活性を示す非限定的例である。
実施例１：ｓｉＮＡコンストラクトのタンデム合成
本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，切断可能なリンカー，例えば，スクシニル系リンカーを用いて，タンデムで合成する。本明細書に記載されるタンデム合成の後に，１段階精製プロセスを行って，ＲＮＡｉ分子を高収率で得る。この方法はハイスループットＲＮＡｉスクリーニングを支えるｓｉＮＡ合成に非常に適しており，マルチカラムまたはマルチウエルの合成プラットフォームに容易に適合させることができる。
５’末端ジメトキシトリチル（５’−Ｏ−ＤＭＴ）基がそのまま残るｓｉＮＡオリゴおよびその相補鎖のタンデム合成（トリチルオン合成）が完了した後，オリゴヌクレオチドを上述のようにして脱保護する。脱保護の後，ｓｉＮＡ配列鎖を自発的にハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションにより，一方の鎖が５’−Ｏ−ＤＭＴ基を保持し，相補鎖が末端５’−ヒドロキシルを含むデュープレックスが得られる。新たに形成されたデュープレックスは，１つの分子のみがジメトキシトリチル基を有するにもかかわらず，日常的な固相抽出精製（トリチルオン精製）の間，単一の分子として振る舞う。これらの鎖は安定なデュープレックスを形成するため，オリゴの対を例えばＣ１８カートリッジを用いて精製するためには，このジメトキシトリチル基（または同等の基，例えば他のトリチル基または他の疎水性成分）のみが必要である。
タンデムリンカー，例えば反転デオキシ無塩基スクシネートまたはグリセリルスクシネートリンカー（図１を参照）または同等の切断可能なリンカーを導入する時点までは，標準的なホスホルアミダイト合成化学を用いる。用いることができるリンカー結合条件の非限定的例には，活性化剤，例えばブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢｒＯＰ）の存在下で，妨害塩基，例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＡ）および／またはＤＭＡＰを使用することが含まれる。リンカーを結合させた後，標準的な合成化学を用いて第２の配列の合成を完了し，末端の５’−Ｏ−ＤＭＴはそのまま残す。合成後，得られたオリゴヌクレオチドを本明細書に記載される方法にしたがって脱保護し，適当な緩衝液，例えば，５０ｍＭ ＮａＯＡｃまたは１．５Ｍ ＮＨ4Ｈ2ＣＯ3で反応を停止させる。
ｓｉＮＡデュープレックスの精製は，固相抽出，例えば，１カラム容量（ＣＶ）のアセトニトリル，２ＣＶのＨ2Ｏ，および２ＣＶの５０ｍＭ ＮａＯＡｃで調整したＷａｔｅｒｓ Ｃ１８ ＳｅｐＰａｋ ｌｇカートリッジを用いて，容易に行うことができる。サンプルを負荷し，１ＣＶのＨ2Ｏまたは５０ｍＭ ＮａＯＡｃで洗浄する。失敗配列は１ＣＶの１４％ＡＣＮ（水性；５０ｍＭ ＮａＯＡｃおよび５０ｍＭＮａＣｌを含む）で溶出する。次にカラムを１ＣＶのＨ2Ｏ等で洗浄し，例えば，１ＣＶの１％水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をカラムに通し，次にさらに１ＣＶの１％水性ＴＦＡをカラムに加えて約１０分間放置することにより，カラム上で脱トリチル化を行う。残りのＴＦＡ溶液を除去し，カラムをＨ2Ｏで，次に１ＣＶの１ＭＮａＣｌおよび再度のＨ2Ｏで洗浄する。次に，ｓｉＮＡデュープレックス生成物を，例えば，１ＣＶの２０％水性ＣＡＮを用いて溶出する。
図２は，精製したｓｉＮＡコンストラクトのＭＡＬＤＩ−ＴＯＶ質量分析の例を示し，ここで，各ピークはｓｉＮＡデュープレックスの個々のｓｉＮＡ鎖の計算質量に対応する。同じ精製ｓｉＮＡは，キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）で分析したときに３つのピークを与える。１つのピークはおそらくはデュープレックスｓｉＮＡに対応し，２つのピークはおそらく個々のｓｉＮＡ配列鎖に対応する。同じｓｉＮＡコンストラクトのイオン交換ＨＰＬＣ分析では単一のピークしか示されない。以下に記載されるルシフェラーゼレポーターアッセイを用いる精製ｓｉＮＡコンストラクトの試験は，別々に合成したオリゴヌクレオチド配列鎖から生成したｓｉＮＡコンストラクトと比較して，ＲＮＡｉ活性が同じであることを示した。
実施例２：化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの血清安定性
ｓｉＮＡコンストラクト中に化学的修飾を導入して，ヒト血清中におけるこれらのコンストラクトの安定性を，天然のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド（２つのチミジンヌクレオチドオーバーハングを含む）と比較して測定した。ＲＮＡデュープレックスの血清安定性の実験は，２つのチミジンヌクレオチドオーバーハングを含む全ＲＮＡヌクレオチドからなるｓｉＮＡコンストラクトは１５秒間の血清中半減期を有し，一方，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトは，修飾の程度により，血清中で１−３日間安定なままであったことを明らかにした。ＲＮＡｉ安定性試験は，ｓｉＮＡの一方の鎖（鎖１）を内部標識し，１．５倍濃度の相補的ｓｉＮＡ鎖（鎖２）（すべての標識された物質がデュープレックス型であったことを確実にするため）とともにデュープレックスを形成させることにより行った。次に，デュープレックスを形成したｓｉＮＡコンストラクトを，２μＭｓｉＮＡ（鎖２濃度）の最終濃度で，９０％マウスまたはヒト血清中で，３０秒，１分，５分，３０分，９０分，４時間１０分，１６時間２４分，および４９時間の各時間インキュベートすることにより，安定性について試験した。各時点のサンプルを１５％変性ポリアクリルアミドゲルに流し，ホスホイメージャーで分析した。
内部標識は，ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）および32Ｐ−γ−ＡＴＰを用いるキナーゼ反応により行い，鎖２の３’側から数えてヌクレオチド１３に放射性標識リン酸を付加した。残りの８−ｍｅｒフラグメントをＴ４ＲＮＡリガーゼでライゲーションさせて，全長の２１−ｍｅｒの鎖２を得た。ＲＮＡｉのデュープレックス化は，適当な濃度のｓｉＮＡオリゴヌクレオチドを加えて９５℃で５分間加熱し，次に室温までゆっくり冷却することにより行った。反応は，１００％血清をｓｉＮＡデュープレックスに加え，３７℃でインキュベートし，次に所望の時点でアリコートを取り出すことにより行った。この実験の結果は図３にまとめられている。図３に示されるように，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子（例えば，配列番号９２５／９２７，９２５／９２８，９２５／９２９，９２５／９３０，および９２５／９３１）は，３’末端ジチミジン（ＴＴ）修飾を除き全リボヌクレオチドを有するｓｉＮＡコンストラクト（例えば，配列番号９２５／９２６）と比較して血清安定性が有意に増加している。
実施例３：任意のＲＮＡ配列中の潜在的ｓｉＮＡ標的部位の同定
目的とするＲＮＡ標的，例えばウイルスまたはヒトｍＲＮＡ転写産物の配列を，例えばコンピュータフォールディングアルゴリズムを用いることにより，標的部位についてスクリーニングする。非限定的例においては，Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースから得られる遺伝子またはＲＮＡ遺伝子転写産物の配列を用いて，標的に対して相補性を有するｓｉＮＡ標的を生成する。そのような配列は，データベースから得ることができるか，または当該技術分野において知られるように実験的に決定することができる。既知の標的部位，例えば，リボザイムまたはアンチセンス等の他の核酸分子を用いた研究に基づいて有効な標的部位であると決定されている標的部位，または疾病または健康状態と関連していることが知られている標的，例えば変異または欠失を含む部位を用いて，これらの部位を標的とするｓｉＮＡ分子を設計することができる。種々のパラメータを用いて，標的ＲＮＡ配列中でいずれの部位が最も適当な標的部位であるかを判定することができる。これらのパラメータには，限定されないが，二次または三次ＲＮＡ構造，標的配列のヌクレオチド塩基組成，標的配列の種々の領域間のホモロジーの程度，またはＲＮＡ転写産物中の標的配列の相対的位置が含まれる。これらの判定に基づいて，ＲＮＡ転写産物中の任意の数の標的部位を選択して，例えば，インビトロＲＮＡ切断アッセイ，培養細胞，または動物モデルを用いることにより，効力についてｓｉＮＡ分子をスクリーニングすることができる。非限定的例においては，用いるべきｓｉＮＡコンストラクトのサイズに基づいて，転写産物中のいずれかの位置の１−１０００個の標的部位を選択する。当該技術分野において知られる方法，例えば標的遺伝子発現の有効な減少を判定するマルチウエルまたはマルチプレートアッセイまたはコンビナトリアル／ｓｉＲＮＡスクリーニングアッセイを用いて，ｓｉＮＡ分子をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発することができる。
実施例４：ＲＮＡ中のｓｉＮＡ分子標的部位の選択
以下の非限定的工程を用いて，所定の遺伝子配列または転写産物を標的とするｓｉＮＡの選択を行うことができる。
標的配列をインシリコで解析して，標的配列中に含まれる特定の長さのすべてのフラグメントまたはサブ配列，例えば２３ヌクレオチドフラグメントのリストを作成する。この工程は，典型的にはあつらえのＰｅｒｌスクリプトを用いて行うが，市販の配列分析プログラム，例えば，Ｏｌｉｇｏ，ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，またはｔｈｅ ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅも同様に用いることができる。
場合によっては，ｓｉＮＡは２以上の標的配列に対応する。これは，例えば，同じ遺伝子の異なる転写産物を標的とする場合，２以上の遺伝子の異なる転写産物を標的とする場合，またはヒト遺伝子と動物ホモログとの両方を標的とする場合に生じうる。この場合には，それぞれの標的について特定の長さのサブ配列のリストを生成し，次にリストを比較して，各リスト中でマッチング配列を見いだす。次に，サブ配列を，所定のサブ配列を含む標的配列の数にしたがってランク付けする。この目的は，標的配列のほとんどまたはすべてに存在するサブ配列を見いだすことである。あるいは，ランク付けにより，標的配列にユニークなサブ配列，例えば変異体標的配列を同定することができる。このような方法により，変異体配列を特異的に標的とし，正常な配列の発現に影響を及ぼさないｓｉＮＡの使用が可能となるであろう。
場合によっては，ｓｉＮＡのサブ配列は，１またはそれ以上の配列中には存在しないが，所望の標的配列中に存在する。これは，ｓｉＮＡが標的とされないままでいるべきパラロガスファミリーのメンバーを有する遺伝子を標的とする場合に生じうる。上述のケース２におけるように，それぞれの標的について特定の長さのサブ配列のリストを生成し，次にリストを比較して，標的遺伝子中に存在するが標的ではないパラログ中には存在しない配列を見いだす。
ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，ＧＣ含量にしたがってランク付けすることができる。３０−７０％のＧＣを含有する部位が好ましく，４０−６０％のＧＣを含有する部位がさらに好ましい。
ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，自己フォールディングおよび内部ヘアピンにしたがってランク付けすることができる。内部フォールディングがより弱いことが好ましい。強いヘアピン構造は回避すべきである。
ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，配列中にＧＧＧまたはＣＣＣの連続を有するか否かにしたがってランク付けすることができる。いずれかの鎖にＧＧＧ（またはさらに多いＧ）が存在すると，オリゴヌクレオチド合成に問題が生じることがあり，ＲＮＡｉ活性を妨害する可能性がある。したがって，他の適当な配列が利用可能である限り，これは回避する。ＣＣＣはアンチセンス鎖にＧＧＧを配置するため，標的鎖中で検索する。
ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，配列の３’末端にジヌクレオチドＵＵ（ウリジンジヌクレオチド）を，および／または配列の５’末端にＡＡ（アンチセンス配列に３’ＵＵを生ずる）を有するか否かにしたがってランク付けする。これらの配列により，末端ＴＴチミジンジヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子を設計することが可能となる。
上述のようにランク付けされたサブ配列のリストから４個または５個の標的部位を選択する。次に，例えば，２３ヌクレオチドを有するサブ配列において，それぞれの選択された２３−ｍｅｒサブ配列の右側２１ヌクレオチドをｓｉＮＡデュープレックスの上側（センス）鎖用に設計し合成し，一方，それぞれの選択された２３−ｍｅｒサブ配列の左側２１ヌクレオチドの逆相補鎖をｓｉＮＡデュープレックスの下側（アンチセンス）鎖用に設計し合成する（表ＩＩを参照）。末端ＴＴ残基が配列にとって望ましい場合には（パラグラフ７に記載されるように），オリゴを合成する前にセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の２つの３’末端ヌクレオチドをＴＴで置き換える。
ｓｉＮＡ分子をインビトロ，培養細胞または動物モデル系においてスクリーニングして，最も活性なｓｉＮＡ分子，または標的ＲＮＡ配列中の最も好ましい標的部位を同定する。
別の方法においては，標的配列に特異的なｓｉＮＡコンストラクトのプールを用いて，標的ＲＮＡを発現する細胞，例えばヒトＨｅＬａ細胞において，標的部位についてスクリーニングする。この方法に用いる一般的戦略は図２１に示される。このようなプールの非限定的例は，標的ＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス配列およびアンチセンス配列に相補的なセンス配列を有する配列を含むプールである。標的遺伝子を発現する細胞（例えばＨｅＬａ細胞）をｓｉＮＡコンストラクトのプールでトランスフェクションし，遺伝子サイレンシングに伴う表現型を示す細胞を分類する。ｓｉＮＡコンストラクトのプールは，本明細書に記載されるように化学的に修飾してもよく，例えば，ハイスループットの様式で合成してもよい。ポジティブの表現型の変化（例えば，標的ｍＲＮＡレベルまたは標的蛋白質発現の減少）を示す細胞からのｓｉＮＡを，例えばアッセイ中のポジショナル分析により同定し，これを用いて，アッセイにおいて同定された対応するｓｉＮＡアンチセンス鎖に相補的な配列に基づいて，標的ＲＮＡ配列中の最も適した標的部位を決定する。
実施例５：化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性
短干渉核酸（ｓｉＮＡ）は，遺伝子制御の強力なツールであることが明らかになりつつある。全リボースｓｉＮＡデュープレックスはＲＮＡｉ経路を活性化するが，上述の実施例２に示されるように，ヌクレアーゼ感受性および短い血清中の半減期のために，治療用化合物としてのその用途は限定されている。インビボ用途のためのヌクレアーゼ耐性ｓｉＮＡコンストラクトを開発するために，ルシフェラーゼｍＲＮＡを標的とし，安定化化学的修飾を含むｓｉＮＡの活性をＨｅＬａ細胞において調べた。この実験に用いたｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列の配列は表Ｉに示される。修飾には，一方または両方のｓｉＮＡ鎖におけるホスホロチオエート結合（Ｐ＝Ｓ），２’−Ｏ−メチルヌクレオチド，または２’−フルオロ（Ｆ）ヌクレオチドおよび種々の３’末端安定化化学，例えば，３’−グリセリル，３’−反転無塩基，３’−反転チミジン，および／またはチミジンが含まれていた。安定化修飾，例えば本明細書に記載される修飾を含む活性なｓｉＮＡは，インビボ用途に有用であることが明らかとなるはずである。
ルシフェラーゼレポーター系を利用して，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性を２チミジンヌクレオチドオーバーハングを含む全ＲＮＡヌクレオチドからなるｓｉＮＡコンストラクトと比較して試験した。緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．４，２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で９０℃で１分間，次に３７℃で１時間インキュベートすることにより，センスおよびアンチセンスｓｉＮＡ鎖（各２０ｕＭ）をアニーリングさせた。蛍ルシフェラーゼ（ｐＧＬ２）およびウミシイタケルシフェラーゼ（ｐＲＬＳＶ４０）をコードするプラスミドはＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。
ＨｅＬａＳ３細胞を５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで３７℃で成長させ，トランスフェクションの２４時間前に９６ウエルプレートのウエルあたり１００μｌの培地中に１５，３００個の細胞を播種した。トランスフェクションのためには，４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を９６μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに加え，ボルテックスし，室温で５分間インキュベートした。次に１００μｌの希釈脂質を，５μｌのｐＧＬ２（２００ｎｇ／μｌ），５μｌのｐＲＬＳＶ４０（８ｎｇ／μｌ），６μｌのｓｉＮＡ（最終濃度２５ｎＭまたは１０ｎＭ），および８４μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを含むマイクロタイターチューブに加え，軽くボルテックスし，室温で２０分間インキュベートした。次にトランスフェクション混合物を軽く混合し，１００μｌの培地中にＨｅＬａＳ３細胞を含む３つのウエルのそれぞれに５０μｌを加えた。細胞はトランスフェクション後２０時間インキュベートし，デュアルルシフェラーゼアッセイを用いて，製造元の指針にしたがって（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ），ルシフェラーゼ発現について分析した。この実験の結果を図４−１６にまとめる。この実験において用いたｓｉＮＡ鎖の配列は表Ｉに示され，図中ＲＰＩ番号で参照される。標準化したルシフェラーゼ活性は，同じサンプルの蛍ルシフェラーゼ活性対ウミシイタケルシフェラーゼ活性の比で表す。誤差バーは三重に行ったトランスフェクションの標準偏差を表す。図４−１６に示されるように，化学的に修飾されたコンストラクトのＲＮＡｉ活性は，２つのチミジンヌクレオチドオーバーハングを含む３’末端を除きすべての位置で全リボヌクレオチドからなる対照ｓｉＮＡコンストラクトと匹敵するものである。場合によっては，化学的に修飾されたコンストラクトのＲＮＡｉ活性は，２つのチミジンヌクレオチドオーバーハングを含み，３’末端を除くすべての位置について全リボヌクレオチドからなるｓｉＮＡコンストラクトより高い。例えば，図４は，ホスホロチオエート修飾ｓｉＮＡコンストラクトを用いるスクリーニングから得られた結果を示す。ＲＰＩ２７６５４／２７６５９コンストラクトは両方の配列のすべてのピリミジンヌクレオチドにホスホロチオエート置換を含み，ＲＰＩ２７６５７／２７６６２コンストラクトは各鎖に５末端３’−ホスホロチオエート置換を含み，ＲＰＩ２７６４９／２７６５８コンストラクトはアンチセンス鎖のみに全ホスホロチオエート置換を含み，一方，ＲＰＩ２７６４９／２７６６０およびＲＰＩ２７６４９／２７６６１コンストラクトは，未修飾センス鎖およびアンチセンス鎖に種々の程度のホスホロチオエート置換を有する。これらのコンストラクトはすべて，スクランブル化ｓｉＮＡと比較したときに有意なＲＮＡｉ活性を示す。
図５は，ホスホロチオエート（ＲＰＩ２８２５３／２８２５５およびＲＰＩ２８２５４／２８２５６）および万能塩基置換（ＲＰＩ２８２５７／２８２５９およびＲＰＩ２８２５８／２８２６０）を用いるスクリーニングから，上述と同じ対照と比較して得られた結果を示す。図に示されるように，これらの修飾は，対照ｓｉＮＡコンストラクトと比較したときに，同等またはより高いＲＮＡｉ活性を示す。
図６は，センス鎖が１０個（ＲＰＩ２８２４４／２７６５０）または５個（ＲＰＩ２８２４５／２７６５０）の２’−Ｏ−メチル置換を含む２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＮＡコンストラクトを用いるスクリーニングから得られた結果を示し，いずれも対照ｓｉＮＡコンストラクトと匹敵する活性を有する。
図７は，２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ｓｉＮＡコンストラクトを用いて，２つのチミジンヌクレオチドオーバーハングを含み，３’末端を除くすべての位置について全リボヌクレオチドからなる対照コンストラクトと比較したスクリーニングの結果を示す。
図８は，各鎖に６個のホスホロチオエート置換を含み，５個のホスホロチオエートは３’末端に存在し，１個のホスホロチオエートは各鎖の５’末端に存在するｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ２８４６０／２８４６１）を比較したものである。このモチーフは，２チミジンヌクレオチドオーバーハングを含む３’末端を除くすべての位置の全リボヌクレオチドからなる対照ｓｉＮＡコンストラクトと非常に類似する活性を示す。
図９は，実施例１に記載される本発明の方法により合成されたｓｉＮＡコンストラクトの比較を示す。反転デオキシ無塩基スクシネートリンカーを用いて，ｓｉＮＡのアンチセンス鎖に３’−反転デオキシ無塩基キャップを有するｓｉＮＡを生成した。このコンストラクトは，２つのチミジンヌクレオチドオーバーハングを含む３’末端を除きすべての位置で全リボヌクレオチドからなる対照ｓｉＮＡ（ｓｉＧＬ２）コンストラクトと比較して，改良された活性を示す。
図１０は，ルシフェラーゼレポーター系を用いて，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト，例えば３’−グリセリル修飾ｓｉＮＡコンストラクトを，全ＲＮＡ対照ｓｉＮＡコンストラクトと比較したＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡを，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは，“細胞”の列で示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖はＲＰＩ番号（センス鎖／アンチセンス鎖）により示される。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。図に示されるように，３’末端修飾ｓｉＮＡコンストラクトは，対照ｓｉＮＡ（ｓｉＧＬ２）コンストラクトと比較して有意なＲＮＡｉ活性を保持している。
図１１は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性のスクリーニングの結果を示す。このスクリーニングは，センス鎖の化学的修飾およびアンチセンス鎖の化学的修飾の種々の組み合わせを比較した。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡを，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，本明細書において記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて，３’末端ジチミジン（ＴＴ）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）と比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは，“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖は，ＲＰＩ番号（センス鎖／アンチセンス鎖）で示される。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。図に示されるように，化学的に修飾されたＲＰＩ３００６３／３０４３０，ＲＰＩ３０４３３／３０４３０，およびＲＰＩ３００６３／３０２２４コンストラクトは，対照ｓｉＮＡコンストラクトと比較して，有意なＲＮＡｉ活性を保持している。インビボで対照ｓｉＧＬ２コンストラクトと比較したときに有意なＲＮＡｉ活性を保持しているＲＰＩ３０４３３／３０４３０は，リボヌクレオチドを含まないｓｉＮＡコンストラクトであることに注目すべきである。したがって，このコンストラクトは，インビボでリボヌクレオチドを有するｓｉＮＡコンストラクトと同様のＲＮＡｉ活性および改良された安定性を有すると予測される。
図１２は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。スクリーニングは，センス鎖の化学的修飾およびアンチセンス鎖の化学的修飾の種々の組み合わせを比較した。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡを，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖はＲＰＩ番号（センス鎖／アンチセンス鎖）で示される。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。図に示されるように，化学的に修飾されたＲＰＩ３００６３／３０２２４およびＲＰＩ３００６３／３０４３０コンストラクトは，対照ｓｉＮＡ（ｓｉＧＬ２）コンストラクトと比較して，有意なＲＮＡｉ活性を保持している。さらに，アンチセンス鎖のみ（ＲＰＩ３０４３０）および反転対照（ＲＰＩ３０２２７／３０２２９，ＲＰＩ３００６３／３０２２４とマッチした化学を有する）を上述のｓｉＮＡデュープレックスと比較した。アンチセンス鎖（ＲＰＩ３０４３０）のみは，この配列を用いるｓｉＮＡデュープレックスと比較してはるかに低い阻害を与えた。
図１３は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性のスクリーニングの結果を示す。スクリーニングは，センス鎖の化学的修飾およびアンチセンス鎖の化学的修飾の種々の組み合わせを比較した。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡを，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは，“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖は，ＲＰＩ番号（センス鎖／アンチセンス鎖）により示される。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。さらに，反転対照（ＲＰＩ３０２２６／３０２２９，ＲＰＩ３０２２２／３０２２４とマッチした化学を有する）を上述のｓｉＮＡデュープレックスと比較した。図に示されるように，化学的に修飾されたＲＰＩ２８２５１／３０４３０，ＲＰＩ２８２５１／３０２２４，およびＲＰＩ３０２２２／３０２２４コンストラクトは，対照ｓｉＮＡコンストラクトと比較して有意なＲＮＡｉ活性を保持しており，化学的に修飾されたＲＰＩ２８２５１／３０４３０コンストラクトは，対照ｓｉＮＡ（ｓｉＧＬ２）コンストラクトと比較して改良された活性を示す。
図１４は，ルシフェラーゼレポーター系を用いて，種々の３’末端修飾ｓｉＮＡコンストラクトを含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを，全ＲＮＡ対照ｓｉＮＡコンストラクトと比較したＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡを，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖はＲＰＩ番号（センス鎖／アンチセンス鎖）で示される。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。図に示されるように，化学的に修飾されたＲＰＩ３０２２２／３０５４６，３０２２２／３０２２４，３０２２２／３０５５１，３０２２２／３０５５７および３０２２２／３０５５８コンストラクトは，対照ｓｉＮＡコンストラクトと比較して有意なＲＮＡｉ活性を保持する。
図１５は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性のスクリーニングの結果を示す。このスクリーニングは，固定されたアンチセンス鎖化学と比較して，センス鎖化学の種々の組み合わせを比較した。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡｓは，１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度で，本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにおいて，３’末端ジチミジン（ＴＴ）を有する全ＲＮＡｓｉＮＡ対照（ｓｉＧＬ２）およびその対応する反転対照（Ｉｎｖ ｓｉＧＬ２）を用いて比較した。ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルは，“細胞”の列に示される。化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖はＲＰＩ番号（センス鎖／アンチセンス鎖）により示される。これらのＲＰＩ番号に対応する配列は表Ｉに示される。図に示されるように，化学的に修飾されたＲＰＩ３００６３／３０４３０，３０４３４／３０４３０，および３０４３５／３０４３０コンストラクトはすべて，対照ｓｉＮＡ（ｓｉＧＬ２）コンストラクトと比較してより高い活性を示す。
実施例６：ＲＮＡｉ活性の滴定
滴定アッセイを行って，全ＲＮＡヌクレオチドからなり，２つのチミジンヌクレオチドオーバーハングを含む対照ｓｉＮＡコンストラクト，およびセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの両方について，ＲＮＡｉ活性に必要なｓｉＮＡ濃度の下限範囲を決定した。アッセイは上述のように行ったが，ただし，ｓｉＮＡコンストラクトは２．５ｎＭ−０．０２５ｎＭの最終濃度に希釈した。結果は図１６に示される。図１６に示されるように，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトは，反転ｓｉＮＡ配列対照と比較したとき，対照ｓｉＮＡコンストラクトと非常に類似する濃度依存的ＲＮＡｉ活性プロファイルを示した。
実施例７：ｓｉＮＡの設計
ｓｉＮＡの標的部位は，実施例４に記載されるｓｉＮＡ分子のライブラリを用いて，あるいは本明細書の実施例９に記載されるようなインビトロｓｉＮＡシステムを用いて，標的ＲＮＡの配列を分析し，任意にフォールディング（ｓｉＮＡの標的へのアクセス可能性を判定するために分析される任意の所与の配列の構造）に基づいて標的部位に優先順位を付けることにより，選択した。ｓｉＮＡ分子は，それぞれの標的に結合することができるように設計し，任意に個々にコンピュータフォールディングにより分析して，ｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用しうるか否かを評価した。種々の長さのｓｉＮＡ分子を選択して，活性を最適化することができる。一般に，標的ＲＮＡと結合するかさもなくばこれと相互作用する十分な数の相補的ヌクレオチド塩基が選択されるが，種々の長さまたは塩基組成のｓｉＮＡデュープレックスに適応させるように，相補性の程度を調節することができる。そのような方法論を用いることにより，ｓｉＮＡ分子は，任意の既知のＲＮＡ配列，例えば，任意の遺伝子転写産物に対応するＲＮＡ配列中の部位を標的とするよう設計することができる。
化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを設計して，ＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保存しながら，インビボでの全身投与のためのヌクレアーゼ安定性および／または改良された薬物動態学，局在化，およびデリバリー特性を提供することができる。本明細書に記載される合成方法および一般に当該技術分野において知られる合成方法を用いて，本明細書に記載される化学修飾を合成的に導入する。次に，血清および／または細胞／組織抽出物（例えば肝臓抽出物）中で，合成ｓｉＮＡコンストラクトをヌクレアーゼ安定性についてアッセイする。合成ｓｉＮＡコンストラクトはまた，適当なアッセイ，例えば本明細書に記載されるルシフェラーゼレポーターアッセイまたはＲＮＡｉ活性を定量しうる他の適当なアッセイを用いて，ＲＮＡｉ活性についても平行して試験する。ヌクレアーゼ安定性およびＲＮＡｉ活性の両方を有する合成ｓｉＮＡコンストラクトは，さらに改変して，安定性および活性のアッセイにおいて再評価することができる。次に，任意の選択されたＲＮＡを標的とするいずれかのｓｉＮＡ配列に安定化活性ｓｉＮＡコンストラクトの化学的修飾を適用して，例えば，標的スクリーニングアッセイにおいて用いて，治療薬を開発するためのｓｉＮＡ化合物のリードを拾い上げることができる（例えば，図２４を参照）。
実施例８：ｓｉＮＡの化学合成および精製
ｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡメッセージ中の種々の部位，例えば，本明細書に記載されるＲＮＡ配列中の標的配列と相互作用するよう設計することができる。ｓｉＮＡ分子の一方の鎖の配列は，上述した標的部位配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は，本明細書に記載される方法を用いて化学的に合成することができる。対照配列として用いられる不活性ｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子の配列を標的配列に相補的ではないようにスクランブル化することにより，合成することができる。一般に，ｓｉＮＡコンストラクトは，本明細書に記載されるように，固相オリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成することができる（例えば，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８０４，６８３；５，８３１，０７１；５，９９８，２０３；６，１１７，６５７；６，３５３，０９８；６，３６２，３２３；６，４３７，１１７；６，４６９，１５８；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許６，１１１，０８６；６，００８，４００；６，１１１，０８６を参照（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
非限定的例においては，ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，当該技術分野において知られるように，ホスホルアミダイト化学を用いて段階的様式で合成する。標準的なホスホルアミダイト化学においては，５’−Ｏ−ジメトキシトリチル，２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル，３’−Ｏ−２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト基，および環外アミン保護基（例えば，Ｎ６−ベンゾイルアデノシン，Ｎ４−アセチルシチジン，およびＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオシドを使用する。あるいは，Ｓｃａｒｉｎｇｅ（上掲）により記載されるように，ＲＮＡの合成において２’−Ｏ−シリルエーテルを酸不安定性２’−Ｏ−オルトエステル保護基と組み合わせて用いてもよい。異なる２’化学は異なる保護基を必要とし，例えば，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６３１，３６０（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるように，２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドにはＮ−フタロイル保護を用いることができる。
固相合成の間に，各ヌクレオチドを順番に（３’−から５’−方向に）固体支持体結合オリゴヌクレオチドに付加する。鎖の３’末端の最初のヌクレオシドを種々のリンカーを用いて固体支持体（例えば，調整多孔ガラスまたはポリスチレン）に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体，リボヌクレオシドホスホルアミダイト，および活性化剤を混合して，第１のヌクレオシドの５’末端上に第２のヌクレオシドホスホルアミダイトをカップリングさせる。次に支持体を洗浄し，未反応５’−ヒドロキシル基を無水酢酸等のキャッピング試薬を用いてキャッピングして，不活性な５’−アセチル成分を得る。次に３価リン結合を酸化してより安定なリン酸結合とする。ヌクレオチド付加サイクルの最後に，適当な条件下で（例えば，トリチル系の基については酸性条件，シリル系の基についてはフッ化物を用いて），５’−Ｏ−保護基を切断する。それぞれの次のヌクレオチドについてこのサイクルを繰り返す。
合成条件を改変して，例えば，合成すべきｓｉＮＡの特定の化学組成に応じて，異なるカップリング時間，異なる試薬／ホスホルアミダイト濃度，異なる接触時間，異なる固体支持体および固体支持体リンカー化学を用いることにより，カップリング効率を最適化することができる。ｓｉＮＡの脱保護および精製は，一般に記載されているようにして行うことができる（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８３１，０７１，米国特許６，３５３，０９８，米国特許６，４３７，１１７，およびＢｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許６，０５４，５７６，米国特許６，１６２，９０９，米国特許６，３０３，７７３（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）またはＳｃａｒｉｎｇｅ（上掲））。さらに，脱保護条件を改変して，可能な限り最高の収量および純度のｓｉＮＡコンストラクトを得る。例えば，本出願人は，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは不適切な脱保護条件下で分解しうることを見いだした。そのようなオリゴヌクレオチドは，水性メチルアミンを用いて約３５℃で３０分間脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドをも含む場合には，水性メチルアミンで約３５℃で３０分間脱保護した後，ＴＥＡ−ＨＦを加え，反応液をさらに１５分間約６５℃に維持する。
実施例９：ｓｉＮＡ活性を評価するためのＲＮＡｉインビトロアッセイ
ＲＮＡｉを無細胞システムにおいて再現するインビトロアッセイを用いて，標的ＲＮＡに特異的なｓｉＮＡコンストラクトを評価する。アッセイは，Ｔｕｓｃｈｌら（１９９９，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７）およびＺａｍｏｒｅら（２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３）に記載され，標的ＲＮＡ用に適合させた系を含む。シンシチウム胚盤葉に由来するショウジョウバエ抽出物を用いてインビトロでＲＮＡｉ活性を再構築する。標的ＲＮＡは，適当なプラスミドからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写することにより，または本明細書に記載されるように化学合成により作製する。センスおよびアンチセンスｓｉＮＡ鎖（例えば各２０μＭ）は，緩衝液（例えば，１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．４，２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で９０℃で１分間，次に３７℃で１時間インキュベートすることによりアニーリングさせ，次に溶解緩衝液（例えば１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４），２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈する。アニーリングは，アガロースゲルを用いてＴＢＥ緩衝液でゲル電気泳動し，臭化エチジウムで染色することによりモニターすることができる。ショウジョウバエの溶解物は，ＯｒｅｇｏｎＲハエからの０−２時間齢の胚を用いて調製し，酵母糖蜜寒天上に回収し，絨毛膜を除去し溶解する。溶解物を遠心分離し，上清を単離する。アッセイは，５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］，ＲＮＡ（１０−５０ｐＭの最終濃度），およびｓｉＮＡ（１０ｎＭの最終濃度）を含む１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物はまた，１０ｍＭのクレアチンリン酸，１０μｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ，１００μＭのＧＴＰ，１００μＭのＵＴＰ，１００μＭのＣＴＰ，５００μＭのＡＴＰ，５ｍＭのＤＴＴ，０．１Ｕ／μＬのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ），および１００μＭの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度は１００ｍＭに調節する。反応は氷上で予め組立て，２５℃で１０分間プレインキュベートした後にＲＮＡを加え，２５℃でさらに６０分間インキュベートする。４倍容量の１．２５ｘ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で反応を停止させる。標的ＲＮＡの切断は，ＲＴ−ＰＣＲ分析または当該技術分野において知られる他の方法によりアッセイし，反応からｓｉＮＡが省略されている対照反応と比較する。
あるいは，アッセイ用の内部標識した標的ＲＮＡを［アルファ−32Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し，さらに精製することなく標的ＲＮＡとして用いる。任意に，標的ＲＮＡはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて５’−32Ｐ末端標識してもよい。アッセイは上述のようにして行い，標的ＲＮＡおよびＲＮＡｉにより生成する特異的ＲＮＡ切断産物をゲルのオートラジオグラフィーで可視化する。切断のパーセントは，無傷の対照ＲＮＡまたはｓｉＮＡなしの対照反応からのＲＮＡ，およびアッセイにより生成する切断産物を表すバンドをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（登録商標）で定量することにより決定する。
１つの態様においては，このアッセイを用いて，ｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉ切断のためのＲＮＡ標的の標的部位を決定する。すなわち，例えば，標識した標的ＲＮＡの電気泳動によりアッセイ反応を分析することにより，またはノザンブロットにより，ならびに当該技術分野において知られる他の方法論により，複数のｓｉＮＡコンストラクトをＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介性切断についてスクリーニングする。
実施例１０：標的ＲＮＡのインビボでの核酸阻害
上述したようにして，標的ＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子を設計し，合成する。これらの核酸分子は，例えば以下の方法を用いることにより，インビボで切断活性について試験することができる。
特定の遺伝子転写産物を標的とするの有効性を試験するために，２つのフォーマットが用いられる。第１に，標的を発現する細胞（例えばＨｅＬａ）で試薬を試験して，ＲＮＡおよび蛋白質阻害の程度を決定する。ＲＮＡ標的に対するｓｉＮＡ試薬を選択する。これらの試薬を適当なトランスフェクション試薬により細胞にデリバリーした後，ＲＮＡ阻害を測定する。増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング（例えば，ＡＢＩ７７００ Ｔａｑｍａｎ（登録商標））を用いて，アクチンに対する標的ＲＮＡの相対量を測定する。無関係標的に対して，または同じ全体の長さおよび化学を有するがそれぞれの位置でランダムに置換されているランダム化ｓｉＮＡ対照に対して作製したオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して，比較を行う。標的に対して一次および二次のリード試薬を選択し，最適化を行う。最適なトランスフェクション試薬濃度を選択した後，リードｓｉＮＡ分子を用いてＲＮＡの阻害の経時変化を測定する。さらに，細胞播種フォーマットを用いて，ＲＮＡ阻害を判定することができる。
ｓｉＮＡの細胞へのデリバリー
細胞（例えばＨｅＬａ）は，トランスフェクションの前日に，例えば，ＥＧＭ−２（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１ｘ１０5細胞／ウエルで６−ウエルディッシュに播種する。ｓｉＮＡ（例えば最終濃度２０ｎＭ）およびカチオン性脂質（例えば最終濃度２μｇ／ｍｌ）を，ポリスチレン管でＥＧＭ基礎培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で，３７℃で３０分間複合体化させる。ボルテックスした後，複合体化したｓｉＮＡを各ウエルに加え，示される時間インキュベートする。最初の最適化実験のためには，細胞を例えば，１ｘ１０3で９６ウエルプレートに播種し，記載されるようにしてｓｉＮＡ複合体を加える。ｓｉＮＡの細胞へのデリバリーの効率は，脂質と複合体化した蛍光ｓｉＮＡを用いて決定する。６ウエルディッシュ中の細胞をｓｉＮＡとともに２４時間インキュベートし，ＰＢＳですすぎ，２％パラホルムアルデヒド中で室温で１５分間固定する。ｓｉＮＡの取り込みは蛍光顕微鏡を用いて可視化する。
Ｔａｑｍａｎおよび光サイクラーによるｍＲＮＡの定量
ｓｉＮＡのデリバリーの後，例えば，６ウエル用にはＱｉａｇｅｎＲＮＡ精製キットを，または９６ウエルアッセイ用にはＲｎｅａｓｙ抽出キットを用いて，細胞から総ＲＮＡを調製する。Ｔａｑｍａｎ分析のためには，５’末端に共有結合させたレポーター染料（ＦＡＭまたはＪＯＥ）および３’末端にコンジュゲート化したクエンチャー染料ＴＡＭＲＡを有する二重標識プローブを合成する。１段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅は，例えば，ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒで，１０μｌの総ＲＮＡ，１００ｎＭのフォワードプライマー，９００ｎＭのリバースプライマー，１００ｎＭのプローブ，１ＸＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），５．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，３００μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，およびｄＴＴＰ，１０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ），１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ＵのＭ−ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から構成される５０μｌの反応液を用いて行う。熱サイクリング条件は，４８℃で３０分間，９５℃で１０分間，次に９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクルからなるものでありうる。ｍＲＮＡレベルの定量は，段階的に希釈した総細胞ＲＮＡ（３００，１００，３３，１１ｎｇ／ｒｘｎ）から生成した標準に対して行い，平行してＴａｑＭａｎ反応で測定したβ−アクチンまたはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して標準化する。目的とする各遺伝子について，上側プライマーおよび下側プライマー，および蛍光標識したプローブを設計する。特定のＰＣＲ産物中へのＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ染料のリアルタイム取り込みは，ガラスキャピラリー管で光サイクラーを用いて測定することができる。対照ｃＲＮＡを用いて，各プライマー対について標準曲線を作成する。値は，各サンプルにおいてＧＡＰＤＨに対する相対的発現として表す。
ウエスタンブロッティング
核抽出物は，標準的なマイクロ調製手法（例えば，Ａｎｄｒｅｗｓ ａｎｄ Ｆａｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，２４９９を参照）を用いて調製することができる。例えばＴＣＡ沈殿を用いて，上清からの蛋白質抽出物を調製する。等量の２０％ＴＣＡを細胞上清に加え，氷上で１時間インキュベートし，５分間の遠心分離によりペレット化する。ペレットをアセトンで洗浄し，乾燥し，水に再懸濁する。細胞蛋白質抽出物を１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅ（核抽出物）または４−１２％Ｔｒｉｓ−グリシン（上清抽出物）ポリアクリルアミドゲルに流し，ニトロセルロース膜に移す。非特異的結合は，例えば，５％無脂乳とともに１時間インキュベートすることによりブロッキングすることができ，次に一次抗体で４℃で１６時間反応させる。洗浄した後，二次抗体，例えば（１：１０，０００希釈）を室温で１時間適用し，ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）でシグナルを検出する。
実施例１１：動物モデル
当該技術分野において知られるように，種々の動物モデル，例えば，他の核酸技術，例えば酵素的核酸分子（リボザイム）および／またはアンチセンスを評価するために用いられる動物モデルを用いて，ｓｉＮＡコンストラクトをインビボでスクリーニングすることができる。このような動物モデルを用いて，本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の効力を試験する。非限定的例においては，抗血管新生剤として設計されるｓｉＮＡ分子を動物モデルにおいてスクリーニングすることができる。血管新生および／または転移に関係する遺伝子，例えば，ＶＥＧＦＲ（例えば，ＶＥＧＦＲ１，ＶＥＧＦＲ２，およびＶＥＧＦＲ３）遺伝子に対する本発明の核酸（例えばｓｉＮＡ）の抗血管新生効果を試験することができるいくつかの動物モデルが存在する。典型的には，ラットおよびウサギにおける血管新生の研究には角膜モデルが用いられてきた。この通常は無血管である組織においては，血管の補充を容易に追跡することができるためである（Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：５６７−５６９）。これらのモデルにおいては，血管新生因子（例えば，ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦ）で前処理した小さいテフロンまたはハイドロン（Ｈｙｄｒｏｎ）のディスクを角膜中に外科的に形成したポケット中に挿入する。血管新生は，３から５日後にモニターする。ＶＥＧＦＲ ｍＲＮＡに対するｓｉＮＡ分子を，同様にディスク中で輸送するか，または実験の経過期間にわたって眼に滴下する。他の眼のモデルにおいては，低酸素症がＶＥＧＦの増加した発現および網膜における血管新生の両方を引き起こすことが示されている（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ．９２：９０５−９０９；Ｓｈｗｅｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２３５−２２４３）。
抗血管新生剤のスクリーニングのためのいくつかの動物モデルが存在する。これらには，角膜創傷後の角膜血管形成（Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８５ Ｃｏｒｎｅａ ４：３５−４１；Ｌｅｐｒｉ， ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０：２７３−２８０；Ｏｒｍｅｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３７：１２４３−１２５２）または角膜内成長因子移植（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３６：２８２−２９１；Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９５（上掲）；Ｚｉｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６７：７１１−７１５），成長因子を含むマトリゲルマトリクス内への血管の成長（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上掲）），ホルモン操作後の雌生殖器新生血管形成（Ｓｈｗｅｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２３５−２２４３），高度に脈管化した固形腫瘍における腫瘍成長の阻害を含むいくつかのモデル（Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８；Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓ．Ｒｅｖ．１２：３０３−３２４；Ｔａｋａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：４２３３−４２３７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３（上掲）），およびマウス網膜における過渡的低酸素症誘導性新生血管形成（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ．９２：９０５−９０９）が含まれる。
Ｐａｎｄｅｙら（上掲）により記載された角膜モデルは，最も一般的かつよく特徴づけられた抗血管新生剤の効力スクリーニングモデルである。このモデルは無血管組織を含み，刺激剤（成長因子，熱またはアルカリ火傷，エンドトキシン）によりこの組織内に血管が補充される。角膜モデルはＶＥＧＦ−ハイドロン溶液に浸漬したテフロンペレットの間質内角膜移植を利用して，ペレットに向けて血管を補充させ，これを標準的な顕微鏡および画像分析技術により定量することができる。その抗血管新生効力を評価するために，リボザイムを眼に局所的に適用するか，またはテフロンペレットそれ自体の上のハイドロン中に結合させる。この無血管角膜ならびにマトリゲルモデルは，低いバックグラウンドのアッセイを提供する。角膜モデルはウサギで広範に実施されてきたが，ラットでの研究も行われてきた。
マウスモデル（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，（上掲））は，マトリゲル，すなわち基底膜の抽出物（Ｋｌｅｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）またはミリポア（登録商標）フィルターディスクを用いる非組織モデルであり，これを注入前に液体形態の成長因子および抗血管新生剤に浸漬することができる。体温で皮下投与すると，マトリゲルまたはミリポア（登録商標）フィルターディスクは固体移植片を形成する。マトリゲルまたはミリポア（登録商標）フィルターディスク内に埋め込まれたＶＥＧＦを用いて，マトリゲルまたはミリポア（登録商標）フィルターディスクのマトリクス中で血管を補充させ，これを内皮細胞特異的ｖＷＦ（第ＶＩＩＩ因子抗原）について組織学的に，免疫組織化学的に，トリクローム−マッソン染色で，またはヘモグロビン含量について処理する。角膜と同様に，マトリゲルまたはミリポア（登録商標）フィルターディスクは無血管であるが，これは組織ではない。マトリゲルまたはミリポア（登録商標）フィルターディスクモデルにおいては，ｓｉＮＡ分子をマトリゲルまたはミリポア（登録商標）フィルターディスクのマトリクス内に投与して，その抗血管新生効力を試験する。すなわち，このモデルにおけるデリバリーの問題は，ラット角膜モデルにおけるハイドロン被覆テフロンペレットへのｓｉＮＡ分子のデリバリーの問題と同様に，それぞれのマトリクス中にｓｉＮＡ分子が均一に存在するため，より問題が少ないであろう。
ルイス肺癌腫およびＢ−１６ネズミ悪性腫瘍モデルは，原発性および転移癌のよく認められているモデルであり，抗癌剤の初期スクリーニングに用いられている。これらのネズミモデルは，免疫不全マウスの使用に依存せず，比較的安価であり，飼育場所の問題が少ない。ルイス肺およびＢ−１６悪性腫瘍のモデルは両方とも，活発に転移する腫瘍細胞株（ルイス肺株３ＬＬまたはＤ１２２，ＬＬｃ−ＬＮ７；Ｂ−１６−ＢＬ６悪性腫瘍）からの約１０6個の腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス中に皮下移植することを含む。あるいは，ルイス肺モデルは，腫瘍範囲（直径約０．８ｍｍ）の外科的移植により生成することができる。転移はまた，腫瘍細胞を直接静脈内に注射することによりモデル化することができる。ルイス肺モデルにおいては，移植の約１４日後に微視的な転移を認めることができ，２１−２５日以内に定量化しうる巨視的な転移腫瘍が発達する。Ｂ−１６悪性腫瘍は，同様な時間経過を示し，腫瘍新生血管形成は移植の４日後に始まる。これらのモデルにおいては，２１−２５日後には，同じ動物中に原発性および転移性腫瘍の両方が存在するため，効力の指標として多くの測定値をとることができる。原発性腫瘍体積および成長潜伏期間，ならびに微視的および巨視的転移肺病巣の数，または転移を示す動物の数を定量化することができる。また，寿命の増加のパーセンテージも測定することができる。すなわち，これらのモデルは，全身投与されたｓｉＮＡ分子およびｓｉＮＡ処方のスクリーニングのための，適当な一次効力アッセイを提供する。
ルイス肺およびＢ−１６悪性腫瘍モデルにおいては，広範な種類の薬剤を用いる全身薬物療法を，通常は腫瘍移植／播種の１−７日後に連続または多数回投与計画により始める。同時薬物動態学の研究を行って，薬力学的効果を期待するのに十分なｓｉＮＡの組織内レベルが達成されるか否かを決定することができる。さらに，原発性腫瘍および二次的肺転移を除去して，種々のインビトロ研究に供することができる（すなわち標的ＲＮＡの減少）。
ｓｉＮＡ活性を評価するこれらのモデルを用いて，ＶＥＧＦＲ１，ＶＥＧＦＲ２，および／またはＶＥＧＦＲ３の蛋白質レベルを，ＦＡＣＳ分析により臨床的にまたは実験的に測定することができる。ＶＥＧＦＲ１，ＶＥＧＦＲ２，および／またはＶＥＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡのレベルは，ノザン分析，ＲＮａｓｅ保護，プライマー伸長分析および／または定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価する。このようにして，ＶＥＧＦＲ１，ＶＥＧＦＲ２，および／またはＶＥＧＦＲ３蛋白質をコードするｍＲＮＡを妨害し，したがって，インビトロでＶＥＧＦＲ１，ＶＥＧＦＲ２，および／またはＶＥＧＦＲ３活性のレベルを２０％以上減少させるｓｉＮＡ分子を同定することができる。
実施例１２：インビボにおける血管新生のｓｉＮＡ媒介性阻害
この実験の目的は，ＶＥＧＦ誘導性血管新生のラット角膜モデルにおいて（上述を参照），ＶＥＧＦＲ１を標的とするｓｉＮＡの抗血管新生活性を評価することであった。これらのｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡ標的と相互作用することができないために不活性であるマッチした反転対照を有する。フィルターディスク法を用いてｓｉＮＡ分子およびＶＥＧＦを共デリバリーした：Ｐａｎｄｅｙら（上記）が記載するように，直径０．０５７のニトロセルロースフィルターディスク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を適当な溶液に浸漬し，ラット角膜に外科的に移植した。
この研究における血管新生の刺激は，フィルターディスクを３０μＭのＶＥＧＦで処理し，これを角膜の支質内に移植して行った。この用量で，移植後５日間の用量−応答試験において，ディスクへの角膜周囲の血管叢からディスクへと成長する再現性のある新生血管形成が起こる。ＶＥＧＦのベヒクルのみで処理したフィルターディスクは血管新生応答を示さない。２つの異なるｓｉＮＡ濃度で，ディスク上にｓｉＮＡをＶＥＧＦと共投与した。同時投与に関する一つの懸念は，ＶＥＧＦレセプターが刺激されうるためにｓｉＮＡが血管新生を阻害できないことである。しかしながら，低用量のＶＥＧＦでは，新生血管形成応答が正常へと逆行することが観察され，このことはＶＥＧＦ刺激が血管新生応答を維持するのに必須であることを示唆している。抗ＶＥＧＦ−Ｒ ｍＲＮＡ ｓｉＮＡの同時投与を用いたＶＥＧＦレセプターの生成の阻害によって，ＶＥＧＦで処理したフィルターディスクによって誘導される正常な新生血管形成が低下されうる。
材料および方法：
試験化合物および対照
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＶＥＧＦ，無担体，８２ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．９）中７５μＭ
ｓｉＮＡ，１．６７μｇ／μＬ，部位２３４０（配列番号２；配列番号６）センス／アンチセンス
ｓｉＮＡ，１．６７μｇ／μＬ，部位２３４０の反転対照（配列番号１９；配列番号２０）センス／アンチセンス
ｓｉＮＡ１．６７μｇ／μＬ，部位２３４０（配列番号４１９；配列番号４２０）センス／アンチセンス
動物
ハーラン・スプラグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット，約２２５−２５０ｇ
４５匹の雄，１群につき５匹
管理
ラットを２つの群で収容する。飼料，水，温度，および湿度は，１９９６年実験動物の管理と使用の指針（ＮＲＣ）に基づく薬学試験施設標準作業手順書（ＳＯＰ）にしたがって決定する。ラットは実験前の少なくとも７日間，施設に馴化される。この期間中，ラットは全体の健康について観察し，基礎血清学のために採血する。
実験群
各溶液（ＶＥＧＦおよびｓｉＮＡ）を表ＩＩＩに記載されている実験群に示された最終濃度に対する１倍溶液として調製した。
ｓｉＮＡアニーリング条件
ｓｉＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を１．６７ｍｇ／ｍＬ／鎖でＨ2Ｏ中で１分間アニーリングした後，３７℃で１時間インキュベートして，３．３４ｍｇ／ｍＬのデュープレックスｓｉＮＡを生成する。２０μｇ／眼の処理のために，３．３４ｍｇ／ｍＬのデュープレックス６μＬを眼に注入する（下記参照）。次に，用量反応アッセイのために，３．３４ｍｇ／ｍＬのデュープレックスｓｉＮＡを連続希釈することができる。
ＶＥＧＦフィルターディスクの調製
角膜移植のために，孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルター膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から調製した０．５７ｍｍ径のニトロセルロースディスクを，氷上でカバーされたペトリ皿で，８２ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．９）中の７５μＭ ＶＥＧＦ １μｌ中に３０分間浸漬した。ＶＥＧＦのベヒクル（８３ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ６．９）のみで浸漬したフィルターディスクは，血管新生応答を誘導しない。
角膜の外科処置
この実験において用いられたラット角膜モデルは，Ｋｏｃｈら（上掲），およびＰａｎｄｅｙら（上掲）から改変した。簡単には，０．５％ポビドンヨード溶液で角膜を洗浄した後，生理食塩水および２％リドカイン２滴を投与した。解剖顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＭＺ−６）下で，間質ポケットを作成し，予め浸漬したフィルターディスク（上記参照）を，その端が角膜輪部から１ｍｍであるようにポケットに挿入した。
試験溶液の結膜内注射
ディスク挿入直後，４０〜５０μｍＯＤの注射器（当実験室で構成）の先端を，ＶＥＧＦを浸漬したフィルターディスクに直接隣接した角膜輪部の端から１ｍｍ離れた結膜組織内に挿入した。６００ナノリットルの試験溶液（ｓｉＮＡ，反転対照または滅菌水ベヒクル）を，シリンジポンプ（Ｋｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１．２μＬ／分の速度で施与した。次いで，注射器を取出し，７０％エタノールで，次に滅菌水中で洗浄し，各注射の間には滅菌水に浸けた。試験溶液を注射した後，動物が全体の運動活動を回復するまで毛細血管瘤クリップを用いて瞼の閉鎖を維持した。処置後，３７℃の加熱パッド上で動物を保温した。
血管新生反応の定量化
ディスク移植の５日後に動物を安楽死させた後，０．４ｍｇ／ｋｇアトロピンをｉｍ投与し，角膜をデジタル画像化した。コンピュータ制御形態計測機（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ，Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ｖ２．０）を用いて，血液充填角膜管から新血管表面積（ＮＳＡ，ピクセルで表示）を死後計測した。フィルターディスクと輪部との間の最大新生血管形成領域の同一サイズの３つの部分から個々の平均ＮＳＡを３重の実験で測定した。これらの領域中の血液充填角膜管に対応するピクセル数を合計し，ＮＳＡ指数を得た。次いで，群平均ＮＳＡを計算した。各処置群からのデータをＶＥＧＦ／ｓｉＮＡベヒクル処理対照ＮＳＡに対して標準化し，最後にＶＥＧＦ誘導性血管新生の阻害率として表した。
統計
処置群平均の正規性を判定した後，ＶＥＧＦ−誘導性血管新生の群平均阻害率について分散の一元分析を行った。その後に，有意性について，アルファ＝０．０５でデュネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）（ＶＥＧＦ対照との比較）およびターキー・クレーマー（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ）（すべての他の群平均の比較）を含む２つの事後検定を行った。統計学的分析はＪＭＰｖ．３．１．６（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて行った。
結果は図２３のグラフに示される。図２３に示されるように，ＶＥＧＦＲ１部位４２２９活性ｓｉＮＡは，３種類の濃度で，反転ｓｉＮＡ対照およびＶＥＧＦ対照と比較して，血管新生の阻害に有効であった。２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンおよびリボプリンを有し，５’および３’末端反転デオキシ無塩基残基を有するセンス鎖（配列番号４１９），および２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンおよびリボプリンを有し，末端３’−ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖（配列番号４２０）を含む，化学的に修飾されたＶＥＧＦＲ１部位４２２９活性ｓｉＮＡは，同様の阻害を示した。この結果は，種々の化学的に修飾された組成を有する本発明のｓｉＮＡ分子が，インビボで有意に血管新生を阻害しうることを示す。
実施例１３：ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）ＲＮＡ発現のＲＮＡｉ媒介性阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表Ｉ）を，Ａ５４９細胞において，ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）ＲＮＡ発現を低下させる効力について試験した。Ａ５４９細胞を，トランスフェクションの時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように，トランスフェクションの約２４時間前に，９６ウエルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウエル，１００μｌ／ウエルで播種した。トランスフェクションのためには，アニーリングしたｓｉＮＡを５０μｌ／ウエルの容量でトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し，室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，１５０μｌの容量中最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとした。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３回のｓｉＮＡ処理用に３つのウエルに加えた。細胞をｓｉＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間において，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを調製した。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し，次に細胞を溶解し，各ウエルからＲＮＡを調製した。処理後の標的遺伝子の発現を，標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲにより評価した。３回の実験のデータを平均し，各処理について標準偏差を求めた。標準化したデータをグラフに表し，活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少のパーセントをそれぞれの反転対照ｓｉＮＡと比較して判定した。
この実験の結果は図２５に示される。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３０９８８／３１０６４）を，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖が５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖が３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３００／３１３０１）と比較し，これはまたマッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３１２／３１３１３）とも比較した。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトはまた，未処理細胞，脂質でトランスフェクトした細胞およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。
図に示されるように，いずれのｓｉＮＡコンストラクトもＥＧＦＲ ＲＮＡ発現を有意に減少させる。表ＩＶに記載される追加の安定化化学も活性について同様にアッセイする。
実施例１４：ＰＫＣ−アルファＲＮＡ発現のＲＮＡｉ媒介性阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表Ｉ）を，例えばＡ５４９細胞において，ＰＫＣ−アルファＲＮＡ発現を低下させる効力について試験する。トランスフェクションの時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように，トランスフェクションの約２４時間前に，９６ウエルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウエル，１００μｌ／ウエルで細胞を播種する。トランスフェクションのためには，アニーリングしたｓｉＮＡを５０μｌ／ウエルの容量でトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し，室温で２０分間インキュベートする。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，１５０μｌの容量中最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとする。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３回のｓｉＮＡ処理用に３つのウエルに加える。細胞をｓｉＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間において，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを調製する。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し，次に細胞を溶解し，各ウエルからＲＮＡを調製する。処理後の標的遺伝子の発現を，標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲにより評価する。３回の実験のデータを平均し，各処理について標準偏差を求める。標準化したデータをグラフに表し，活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少のパーセントをそれぞれの反転対照ｓｉＮＡと比較して判定する。
非限定的例においては，ｓｉＮＡコンストラクトを活性についてスクリーニングし（図２６を参照），未処理細胞，スクランブル化ｓｉＮＡ対照コンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）と比較する。図２６に示されるように，ｓｉＮＡコンストラクトは，ＰＫＣ−アルファＲＮＡの発現を有意に低下させる。そのようなスクリーニングから得られたリードを，次にさらにアッセイする。非限定的例においては，リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト，ならびに，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖が５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖が３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトをアッセイする。表ＩＶに記載されるさらに別の安定化化学も同様に活性についてアッセイする。これらのｓｉＮＡコンストラクトを，適当なマッチした化学の反転対照と比較する。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトはまた，未処理細胞，脂質およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクトでトランスフェクトした細胞，および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較する。
実施例１５：Ｍｙｃ ＲＮＡ発現のＲＮＡｉ媒介性阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表Ｉ）を，２９３Ｔ細胞において，Ｍｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ）ＲＮＡ発現を低下させる効力について試験した。２９３Ｔ細胞を，トランスフェクションの時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように，トランスフェクションの約２４時間前に，９６ウエルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウエル，１００μｌ／ウエルで播種した。トランスフェクションのためには，アニーリングしたｓｉＮＡを５０μｌ／ウエルの容量でトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し，室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，１５０μｌの容量中最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとした。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３回のｓｉＮＡ処理用に３つのウエルに加えた。細胞をｓｉＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間において，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを調製した。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し，次に細胞を溶解し，各ウエルからＲＮＡを調製した。処理後の標的遺伝子の発現を，標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲにより評価した。３回の実験のデータを平均し，各処理について標準偏差を求めた。標準化したデータをグラフに表し，活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少のパーセントをそれぞれの反転対照ｓｉＮＡと比較して判定した。
この実験の結果は図２７に示される。一連のｓｉＮＡコンストラクトを，未処理細胞，スクランブル化ｓｉＮＡ対照コンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）と比較した。図に示されるように，ｓｉＮＡコンストラクトのうち３つ（ＲＰＩ３０９９３／３１０６９；ＲＰＩ３０９９５／３１０７１；およびＲＰＩ３０９９６／３１０７２）は，ｃ−Ｍｙｃ ＲＮＡ発現を有意に低下させる。表ＩＶに記載される追加の安定化化学も活性について同様にアッセイする。
実施例１６：ＢＣＬ２ ＲＮＡ発現のＲＮＡｉ媒介性阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表Ｉ）を，例えばＡ５４９細胞において，ＢＣＬ２ ＲＮＡ発現を低下させる効力について試験する。トランスフェクションの時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように，トランスフェクションの約２４時間前に，９６ウエルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウエル，１００μｌ／ウエルで細胞を播種する。トランスフェクションのためには，アニーリングしたｓｉＮＡを５０μｌ／ウエルの容量でトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し，室温で２０分間インキュベートする。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，１５０μｌの容量中最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとする。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３回のｓｉＮＡ処理用に３つのウエルに加える。細胞をｓｉＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間において，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを調製する。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し，次に細胞を溶解し，各ウエルからＲＮＡを調製する。処理後の標的遺伝子の発現を，標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲにより評価する。３回の実験のデータを平均し，各処理について標準偏差を求める。標準化したデータをグラフに表し，活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少のパーセントをそれぞれの反転対照ｓｉＮＡと比較して判定する。
非限定的例においては，Ａ５４９細胞を２５ｎＭのｓｉＮＡと複合体化した０．２５μｇ／ウエルの脂質でトランスフェクションする。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３０９９８／３１０７４）を，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３６８／３１３６９）とともに試験した。さらにこれを，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３７０／３１３７１）および，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンおよび２’−デオキシ−２’−フルオロプリンヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３７２／３１３７３）とも比較した。また，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３７４／３１３７５）とも比較した。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトはまた，未処理細胞，脂質でトランスフェクトした細胞およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。図２８に示されるように，ｓｉＮＡコンストラクトは，スクランブル化，未処理，およびトランスフェクション対照と比較して，ＢＣＬ２ ＲＮＡ発現を有意に低下させる。表ＩＶに記載される追加の安定化化学も活性について同様にアッセイする。
実施例１７：ＣＨＫ−１ ＲＮＡ発現のＲＮＡｉ媒介性阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表Ｉ）を，Ａ５４９細胞において，ＣＨＫ−１ ＲＮＡ発現を低下させる効力について試験した。Ａ５４９細胞を，トランスフェクションの時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように，トランスフェクションの約２４時間前に，９６ウエルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウエル，１００μｌ／ウエルで播種した。トランスフェクションのためには，アニーリングしたｓｉＮＡを５０μｌ／ウエルの容量でトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し，室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，１５０μｌの容量中最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとした。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３回のｓｉＮＡ処理用に３つのウエルに加えた。細胞をｓｉＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間において，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを調製した。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し，次に細胞を溶解し，各ウエルからＲＮＡを調製した。処理後の標的遺伝子の発現を，標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲにより評価した。３回の実験のデータを平均し，各処理について標準偏差を求めた。標準化したデータをグラフに表し，活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少のパーセントをそれぞれの反転対照ｓｉＮＡと比較して判定した。
この実験の結果を図２９に示す。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１００３／３１０７９），および２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３０２／３１３０３）を，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３１４／３１３２５）と比較した。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトはまた，未処理細胞，脂質でトランスフェクトした細胞およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。図に示されるように，いずれのｓｉＮＡコンストラクトも，適当な対照と比較して，ＣＨＫ−１ ＲＮＡ発現を有意に低下させる。表ＩＶに記載される追加の安定化化学も活性について同様にアッセイする。
実施例１８：ＢＡＣＥ ＲＮＡ発現のＲＮＡｉ媒介性阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表Ｉ）を，例えばＡ５４９細胞において，ＢＡＣＥ ＲＮＡ発現を低下させる効力について試験する。トランスフェクションの時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように，トランスフェクションの約２４時間前に，９６ウエルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウエル，１００μｌ／ウエルで細胞を播種する。トランスフェクションのためには，アニーリングしたｓｉＮＡを５０μｌ／ウエルの容量でトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し，室温で２０分間インキュベートする。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，１５０μｌの容量中最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとする。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３回のｓｉＮＡ処理用に３つのウエルに加える。細胞をｓｉＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間において，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを調製する。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し，次に細胞を溶解し，各ウエルからＲＮＡを調製する。処理後の標的遺伝子の発現を，標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲにより評価する。３回の実験のデータを平均し，各処理について標準偏差を求める。標準化したデータをグラフに表し，活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少のパーセントをそれぞれの反転対照ｓｉＮＡと比較して判定する。
非限定的例においては，ｓｉＮＡコンストラクトを活性についてスクリーニングし（図３０を参照），未処理細胞，スクランブル化ｓｉＮＡ対照コンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）と比較する。図３０に示されるように，ｓｉＮＡコンストラクトは，ＢＡＣＥ ＲＮＡの発現を有意に低下させる。そのようなスクリーニングから得られたリードを，次にさらにアッセイする。非限定的例においては，リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト，ならびに，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖が５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖が３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトをアッセイする。表ＩＶに記載されるさらに別の安定化化学も同様に活性についてアッセイする。これらのｓｉＮＡコンストラクトを，適当なマッチした化学の反転対照と比較する。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトはまた，未処理細胞，脂質およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクトでトランスフェクトした細胞，および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較する。
実施例１９：サイクリンＤ１ ＲＮＡ発現のＲＮＡｉ媒介性阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表Ｉ）を，Ａ５４９細胞において，サイクリンＤ１ ＲＮＡ発現を低下させる効力について試験した。Ａ５４９細胞を，トランスフェクションの時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように，トランスフェクションの約２４時間前に，９６ウエルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウエル，１００μｌ／ウエルで播種した。トランスフェクションのためには，アニーリングしたｓｉＮＡを５０μｌ／ウエルの容量でトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し，室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，１５０μｌの容量中最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとした。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３回のｓｉＮＡ処理用に３つのウエルに加えた。細胞をｓｉＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間において，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを調製した。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し，次に細胞を溶解し，各ウエルからＲＮＡを調製した。処理後の標的遺伝子の発現を，標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲにより評価した。３回の実験のデータを平均し，各処理について標準偏差を求めた。標準化したデータをグラフに表し，活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少のパーセントをそれぞれの反転対照ｓｉＮＡと比較して判定した。
この実験の結果は図３１に示される。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３０９８８／３１０６４）を，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３００／３１３０）とともにアッセイした。これはまた，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３１２／３１３１３）とも比較した。さらにｓｉＮＡコンストラクトは，未処理細胞，脂質でトランスフェクトした細胞およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。図に示されるように，いずれのｓｉＮＡコンストラクトも，サイクリンＤ１ＲＮＡ発現を有意に低下させる。表ＩＶに記載される追加の安定化化学も活性について同様にアッセイする。
実施例２０：ＰＴＰ−１Ｂ ＲＮＡ発現のＲＮＡｉ媒介性阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表Ｉ）を，Ａ５４９細胞において，ＰＴＰ−１Ｂ ＲＮＡ発現を低下させる効力について試験した。Ａ５４９細胞を，トランスフェクションの時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように，トランスフェクションの約２４時間前に，９６ウエルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウエル，１００μｌ／ウエルで播種した。トランスフェクションのためには，アニーリングしたｓｉＮＡを５０μｌ／ウエルの容量でトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し，室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，１５０μｌの容量中最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとした。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３回のｓｉＮＡ処理用に３つのウエルに加えた。細胞をｓｉＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間において，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを調製した。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し，次に細胞を溶解し，各ウエルからＲＮＡを調製した。処理後の標的遺伝子の発現を，標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲにより評価した。３回の実験のデータを平均し，各処理について標準偏差を求めた。標準化したデータをグラフに表し，活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少のパーセントをそれぞれの反転対照ｓｉＮＡと比較して判定した。
この実験の結果は図３２に示される。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１０１８／３１０９４）を，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３０６／３１３０７）とともにアッセイした。これはまた，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３１８／３１３１９）とも比較した。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトは，未処理細胞，脂質でトランスフェクトした細胞およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。図に示されるように，いずれのｓｉＮＡコンストラクトもＰＴＰ−１Ｂ ＲＮＡ発現を有意に低下させる。表ＩＶに記載される追加の安定化化学も活性について同様にアッセイする。
実施例２１：ＥＲＧ２ ＲＮＡ発現のＲＮＡｉ媒介性阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表Ｉ）を，例えばＤＬＤ１細胞において，ＥＲＧ２ ＲＮＡ発現を低下させる効力について試験する。トランスフェクションの時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように，トランスフェクションの約２４時間前に，９６ウエルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウエル，１００μｌ／ウエルで細胞を播種する。トランスフェクションのためには，アニーリングしたｓｉＮＡを５０μｌ／ウエルの容量でトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し，室温で２０分間インキュベートする。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，１５０μｌの容量中最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとする。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３回のｓｉＮＡ処理用に３つのウエルに加える。細胞をｓｉＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間において，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを調製する。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し，次に細胞を溶解し，各ウエルからＲＮＡを調製する。処理後の標的遺伝子の発現を，標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲにより評価する。３回の実験のデータを平均し，各処理について標準偏差を求める。標準化したデータをグラフに表し，活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少のパーセントをそれぞれの反転対照ｓｉＮＡと比較して判定する。
非限定的例においては，ｓｉＮＡコンストラクトを活性についてスクリーニングし（図３３を参照），未処理細胞，スクランブル化ｓｉＮＡ対照コンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）と比較する。図３３に示されるように，ｓｉＮＡコンストラクトは，ＥＲＧ２ ＲＮＡの発現を有意に低下させる。そのようなスクリーニングから得られたリードを，次にさらにアッセイする。非限定的例においては，リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト，ならびに，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖が５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖が３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトをアッセイする。表ＩＶに記載されるさらに別の安定化化学も同様に活性についてアッセイする。これらのｓｉＮＡコンストラクトを，適当なマッチした化学の反転対照と比較する。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトはまた，未処理細胞，脂質およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクトでトランスフェクトした細胞，および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較する。表ＩＶに記載される追加の安定化化学も活性について同様にアッセイする。
実施例２２：ＰＣＮＡ ＲＮＡ発現のＲＮＡｉ媒介性阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表Ｉ）を，Ａ５４９細胞において，ＰＣＮＡ ＲＮＡ発現を低下させる効力について試験した。Ａ５４９細胞を，トランスフェクションの時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように，トランスフェクションの約２４時間前に，９６ウエルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウエル，１００μｌ／ウエルで播種した。トランスフェクションのためには，アニーリングしたｓｉＮＡを５０μｌ／ウエルの容量でトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し，室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，１５０μｌの容量中最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとした。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３回のｓｉＮＡ処理用に３つのウエルに加えた。細胞をｓｉＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間において，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを調製した。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し，次に細胞を溶解し，各ウエルからＲＮＡを調製した。処理後の標的遺伝子の発現を，標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲにより評価した。３回の実験のデータを平均し，各処理について標準偏差を求めた。標準化したデータをグラフに表し，活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少のパーセントをそれぞれの反転対照ｓｉＮＡと比較して判定した。
この実験の結果は図３４に示される。リボヌクレオチドおよび３’末端ジチミジンキャップを含むｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１０３５／３１１１１）を，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡのセンス鎖は５’および３’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており，アンチセンス鎖は３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（ＲＰＩ＃３１３１０／３１３１１）とともにアッセイした。これはまた，マッチした化学の反転対照（ＲＰＩ＃３１３２２／３１３２３）とも比較した。さらに，ｓｉＮＡコンストラクトは，未処理細胞，脂質でトランスフェクトした細胞およびスクランブル化ｓｉＮＡコンストラクト（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２），および脂質のみでトランスフェクトした細胞（トランスフェクション対照）とも比較した。図に示されるように，いずれのｓｉＮＡコンストラクトもＰＣＮＡ ＲＮＡ発現を有意に低下させる。表ＩＶに記載される追加の安定化化学も活性について同様にアッセイする。
実施例２３：適応症
本発明のｓｉＮＡ分子は，遺伝子発現を調節することにより種々の疾病および状態を治療するために用いることができる。本明細書に記載される方法を用いて，任意の数の標的遺伝子，例えば，限定されないが，癌，代謝性疾病，感染性疾病（例えば，ウイルス，細菌または真菌感染），神経学的疾病，筋骨格疾病，免疫系の疾病，シグナリング経路および細胞メッセンジャーに関連する疾病，およびトランスポートシステム，例えば分子ポンプおよびチャネルに関連する疾病に関連する遺伝子の発現を調節するよう，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子を設計することができる。
本発明のｓｉＲＮＡ分子を用いて標的とすることができる種々のウイルス遺伝子の非限定的例としては，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ，例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｄ１１１６８，Ｄ５０４８３．１，Ｌ３８３１８およびＳ８２２２７），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１００３０８．１），ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５１１８８），ヒト免疫不全ウイルスタイプ２（ＨＩＶ−２，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６０６６７），西ナイル熱ウイルス（ＷＮＶ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１５６３），サイトメガロウイルス（ＣＭＶ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１３４７），ＲＳウイルス（ＲＳＶ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１７８１），インフルエンザウイルス（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３７４１２，ライノウイルス（例えば，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ００２３９，Ｘ０２３１６，Ｘ０１０８７，Ｌ２４９１７，Ｍ１６２４８，Ｋ０２１２１，Ｘ０１０８７），パピローマウイルス（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１３５３），ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１３４５），および他のウイルス，例えば，ＨＴＬＶ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ４３０４５８）が挙げられる。多くのウイルスゲノムの高い配列変動性のため，広範な治療用途のためのｓｉＲＮＡ分子の選択は，おそらくウイルスゲノムの保存領域を含むであろう。ウイルスゲノムの保存領域の非限定的例には，限定されないが，５’−非コーディング領域（ＮＣＲ），３’−非コーディング領域（ＮＣＲ）および／または内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）が挙げられる。種々のウイルスゲノムの保存領域に対して設計されたｓｉＲＮＡ分子は，種々の患者集団においてウイルス複製の有効な阻害を可能とし，ウイルスゲノムの非保存領域における変異のために進化するウイルス偽種に対するｓｉＲＮＡ分子の有効性を確実にするであろう。
本明細書に記載される方法を用いて，本発明のｓｉＲＮＡ分子を用いて標的とすることができるヒト遺伝子の非限定的例には，任意のヒトＲＮＡ配列，例えば，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号により一般に参照される配列が含まれる。これらのＲＮＡ配列を用いて，遺伝子発現を阻害し，したがってこれらの遺伝子の発現に関連する疾病，病気，または感染を排除するｓｉＲＮＡ分子を設計することができる。ｓｉＲＮＡ分子を用いて標的とすることができるそのようなヒト遺伝子の非限定的例としては，ＶＥＧＦｒ（ＶＥＧＦｒ−１，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０６７７２３，ＶＥＧＦｒ−２，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６３６５８），ＨＥＲ１，ＨＥＲ２，ＨＥＲ３，およびＨＥＲ４（例えば，それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８，ＮＭ＿００４４４８，ＮＭ＿００１９８２，およびＮＭ＿００５２３５），テロメラーゼ（ＴＥＲＴ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２１９），テロメラーゼＲＮＡ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８６０４６），ＮＦカッパＢ，Ｒｅｌ−Ａ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８），ＮＯＧＯ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２０６９３），ＮＯＧＯｒ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０１５６２０），ＲＡＳ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４２８３），ＲＡＦ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０３３８８４），ＣＤ２０（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０７２０３），ＭＥＴＡＰ２（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２１９），ＣＬＣＡ１（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２８５），ホスホランバン（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２６６７），ＰＴＰ１Ｂ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３１７２４）およびその他のもの，例えば，表ＩＩＩに示されるものが含まれる。
本発明のｓｉＮＡ分子はまた，ｓｉＮＡを用いる植物における内因性または外的遺伝子発現の調節が関与する種々の農業用途において，例えば，殺虫剤，抗ウイルス剤，および抗菌剤としても用いることができ，または植物の特性，例えば，油およびデンプンのプロファイルおよびストレス耐性を調節するために用いることができる。
実施例２４：診断用途
本発明のｓｉＮＡ分子は，種々の応用において，例えば，臨床，工業，環境，農業および／または研究の設定において，種々の診断用途，例えば分子標的（例えばＲＮＡ）の同定に用いることができる。そのようなｓｉＮＡ分子の診断における使用は，再構成されたＲＮＡｉ系，例えば，細胞溶解物または部分的に精製された細胞溶解物を利用することを含む。本発明のｓｉＮＡ分子を診断手段として使用し，疾病に罹患した細胞内の遺伝的浮動および変異を検査するか，または細胞において内因性のまたは外来の（例えばウイルス）ＲＮＡの存在を検出することができる。ｓｉＮＡ活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により，分子のいずれの領域においても，標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載されるｓｉＮＡ分子を複数使用することにより，インビトロならびに細胞および組織におけるＲＮＡの構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。ｓｉＮＡ分子による標的ＲＮＡの切断を使用して，遺伝子の発現を阻害し，疾病または感染の進行における特定の遺伝子産物の役割を明らかにすることができる。このようにして，他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにすることができる。これらの実験は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数のｓｉＮＡ分子，既知の小分子阻害剤と組み合わせたｓｉＮＡ分子，ｓｉＮＡ分子および／または他の化学的または生物学的分子と組み合わせた間欠的治療）。本発明のｓｉＮＡ分子の他のインビトロにおける使用は当該技術分野においてよく知られており，これには，疾病，感染または関連する健康状態に伴うｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡは，ｓｉＮＡ分子で処理した後，標準的な方法論，例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して切断産物の存在を判定することにより検出する。
特定の例においては，標的ＲＮＡの野生型または変異型のみしか切断できないｓｉＮＡ分子をアッセイに使用する。第１のｓｉＮＡ分子（すなわち，野生型の標的ＲＮＡのみを切断するもの）を用いて試料中の野生型ＲＮＡの存在を同定し，第２のｓｉＮＡ分子（すなわち，変異型の標的ＲＮＡのみを切断するもの）を用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定する。反応対照として，野生型および変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方のｓｉＮＡ分子で切断し，反応におけるｓｉＮＡ分子の相対効率および"非標的"ＲＮＡ種を切断しないことを明らかにする。合成基質からの切断産物は，試料集団中の野生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。したがって，それぞれの分析は２つのｓｉＮＡ分子，２つの基質，および１つの未知の試料を必要とし，これらを組み合わせて６つの反応を行う。切断産物の存在をＲＮａｓｅ保護アッセイを用いて確認し，各ＲＮＡの完全長および切断フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるようにする。標的細胞における変異体ＲＮＡの発現および所望の表現型の変化の推定されるリスクへの洞察を得るために，必ずしも結果を定量する必要はない。その蛋白質産物が表現型（すなわち，疾病に関連するかまたは感染に関連する）の発生に関与することが示唆されるｍＲＮＡの発現はリスクを確立するのに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば，ＲＮＡレベルの定性的比較で十分であり，初期の診断のコストが低減する。ＲＮＡレベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても，より高い変異型と野生型の比率はより高いリスクと相関関係があるであろう。
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用されるすべての参考文献は，それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される方法および組成物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。すなわち，そのような追加の態様は，本発明および特許請求の範囲の範囲内である。本発明は，ＲＮＡｉ活性を媒介する改良された活性を有する核酸コンストラクトを得るために本明細書に記載される化学的修飾の種々の組み合わせおよび／または置換を試験することを当業者に教示する。そのような改良された活性は，改良された安定性，改良された生物利用性，および／またはＲＮＡｉを媒介する細胞応答の改良された活性化を含むことができる。したがって，本明細書に記載される特定の態様は限定ではなく，当業者は，改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を同定するために，過度の実験なしに本明細書に記載される修飾の特定の組み合わせを試験しうることを容易に理解することができる。
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的になる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループまたは他の代替グループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
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図１は，ｓｉＮＡ分子を合成するスキームの非限定的例を示す。 図２は，本発明の方法により合成された精製ｓｉＮＡデュープレックスのＭＡＬＤＩ−ＴＯＶ質量分析を示す。 図３は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの血清安定性を測定するために用いられた安定性アッセイの結果を示す。 図４は，ホスホロチオエート修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図５は，ホスホロチオエートおよび万能塩基修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図６は，ルシフェラーゼレポーター系を用いる２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図７は，２’−Ｏ−メチルおよび２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図８は，ホスホロチオエート修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図９は，タンデム合成により生成した反転デオキシ無塩基修飾ｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図１０は，３’−グリセリル修飾ｓｉＮＡコンストラクト等の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図１１は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図１２は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図１３は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図１４は，種々の３’末端修飾ｓｉＮＡコンストラクト等の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図１５は，化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトのＲＮＡｉ活性スクリーニングの結果を示す。 図１６は，ｓｉＮＡ滴定実験の結果を示す。 図１７は，ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の提唱されるメカニズムの非限定的例を示す図である。 図１８は，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの非限定的例を示す。 図１９は，本発明の化学的に修飾された特定のｓｉＮＡ配列の非限定的例を示す。 図２０は，本発明の種々のｓｉＮＡコンストラクトの非限定的例を示す。 図２１は，特定の標的核酸配列中のｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉの標的部位を決定するために用いられる方法の概略図である。 図２２は，本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために用いることができる，種々の安定化化学の非限定的例を示す。 図２３は，血管新生のラット角膜モデルを用いるＶＥＧＦ−誘導性血管新生のｓｉＮＡ媒介性阻害の非限定的例を示す。 図２４は，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを同定するために用いられる戦略の非限定的例を示す。 図２５は，本発明のｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＨＥＲ２ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。 図２６は，本発明のｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＰＫＣ−アルファｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。 図２７は，本発明のｓｉＮＡにより媒介される，２９３Ｔ細胞におけるＭｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ）ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。 図２８は，本発明のｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＢＣＬ２ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。 図２９は，本発明のｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＣＨＫ−１ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。 図３０は，本発明のｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＢＡＣＥ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。 図３１は，本発明のｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるサイクリンＤ１ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。 図３２は，本発明のｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＰＴＰ−１Ｂ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。 図３３は，本発明のｓｉＮＡにより媒介される，ＤＬＤ１細胞におけるＥＲＧ２ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。 図３４は，本発明のｓｉＮＡにより媒介される，Ａ５４９細胞におけるＰＣＮＡ ｍＲＮＡの減少の非限定的例を示す。

Claims (54)

  1. 内因性哺乳動物標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって，前記ｓｉＮＡ分子は１またはそれ以上の化学的修飾を含み，前記二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は約２１ヌクレオチドを含むことを特徴とするｓｉＮＡ分子。
  2. 前記ｓｉＮＡ分子がリボヌクレオチドを含まない，請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
  3. 前記ｓｉＮＡ分子がリボヌクレオチドを含む，請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
  4. 前記二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は内因性哺乳動物標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，前記二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は内因性哺乳動物標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む，請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
  5. ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１９−約２３ヌクレオチドを含み，各鎖は他方の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１９ヌクレオチドを含む，請求項４記載のｓｉＮＡ分子。
  6. 前記ｓｉＮＡ分子は内因性哺乳動物標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み，前記ｓｉＮＡはさらにセンス領域を含み，前記センス領域は前記内因性哺乳動物標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部と実質的に類似するヌクレオチド配列を含む，請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
  7. 前記アンチセンス領域および前記センス領域はそれぞれ約１９−約２３ヌクレオチドを含み，前記アンチセンス領域はセンス領域のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１９ヌクレオチドを含む，請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
  8. 前記ｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含み，前記アンチセンス領域は内因性哺乳動物標的遺伝子にコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，および前記センス領域は前記アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含む，請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
  9. 前記ｓｉＮＡ分子が２つの別々のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ，ここで，一方のフラグメントは前記ｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み，第２のフラグメントは前記ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む，請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
  10. 前記センス領域が，リンカー分子を介してアンチセンス領域に連結されている，請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
  11. 前記リンカー分子がポリヌクレオチドリンカーである，請求項１０記載のｓｉＮＡ分子。
  12. 前記リンカー分子が非ヌクレオチドリンカーである，請求項１０記載のｓｉＮＡ分子。
  13. センス領域中のピリミジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである，請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
  14. センス領域中のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである，請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
  15. センス領域中に存在するピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである，請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
  16. 前記センス領域を含むフラグメントが，前記センス領域を含むフラグメントの５’末端，３’末端，または５’末端および３’末端の両方に末端キャップ成分を含む，請求項９記載のｓｉＮＡ分子。
  17. 前記末端キャップ成分が反転デオキシ無塩基成分である，請求項１６記載のｓｉＮＡ分子。
  18. 前記アンチセンス領域のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである，請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
  19. 前記アンチセンス領域のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである，請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
  20. 前記アンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチドが２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む，請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
  21. 前記アンチセンス領域が，前記アンチセンス領域の３’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む，請求項１８記載のｓｉＮＡ分子。
  22. 前記アンチセンス領域が，前記アンチセンス領域の３’末端にグリセリル修飾を含む，請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
  23. 前記ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントのそれぞれが２１ヌクレオチドを含む，請求項９記載のｓｉＮＡ分子。
  24. ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの約１９ヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補的ヌクレオチドと塩基対形成しており，ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントのヌクレオチドと塩基対形成していない，請求項２３記載のｓｉＮＡ分子。
  25. ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの２つの３’末端ヌクレオチドのそれぞれが２’−デオキシ−ピリミジンである，請求項２４記載のｓｉＮＡ分子。
  26. 前記２’−デオキシ−ピリミジンが２’−デオキシ−チミジンである，請求項２５記載のｓｉＮＡ分子。
  27. ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの２１ヌクレオチドすべてがｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補的ヌクレオチドと塩基対形成している，請求項２３記載のｓｉＮＡ分子。
  28. アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドは，内因性哺乳動物標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部と塩基対形成している，請求項２３記載のｓｉＮＡ分子。
  29. アンチセンス領域の２１ヌクレオチドは，内因性哺乳動物標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部と塩基対形成している，請求項２３記載のｓｉＮＡ分子。
  30. 前記アンチセンス領域を含むフラグメントの５’末端が任意にリン酸基を含む，請求項９記載のｓｉＮＡ分子。
  31. 前記哺乳動物遺伝子がヒト遺伝子である，請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
  32. 内因性哺乳動物標的ＲＮＡ配列の発現を阻害する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって，前記二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約２１ヌクレオチドを含み，および前記ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まないことを特徴とするｓｉＮＡ分子。
  33. 前記標的ＲＮＡ配列がヒト遺伝子によりコードされる，請求項３２記載のｓｉＮＡ分子。
  34. 内因性哺乳動物標的遺伝子の発現を阻害する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって，前記二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約２１ヌクレオチドを含み，前記ｓｉＮＡ分子は，内因性哺乳動物標的遺伝子の発現の阻害のためにｓｉＮＡ分子中にリボヌクレオチドの存在を必要としないことを特徴とするｓｉＮＡ分子。
  35. 前記哺乳動物標的遺伝子がヒト遺伝子である，請求項３４記載のｓｉＮＡ分子。
  36. 前記ヒト遺伝子が血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  37. 前記ヒト遺伝子がＶＥＧＦのレセプターである，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  38. 前記レセプターがＶＥＧＦＲ１である，請求項３７記載のｓｉＮＡ。
  39. 前記レセプターがＶＥＧＦＲ２である，請求項３７記載のｓｉＮＡ。
  40. 前記レセプターがＶＥＧＦＲ３である，請求項３７記載のｓｉＮＡ。
  41. 前記ヒト遺伝子がＢＣＬ２である，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  42. 前記ヒト遺伝子がＨＥＲ２／ｎｅｕである，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  43. 前記ヒト遺伝子がｃ−Ｍｙｃである，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  44. 前記ヒト遺伝子がＰＣＮＡである，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  45. 前記ヒト遺伝子がＲＥＬ−Ａである，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  46. 前記ヒト遺伝子がＰＴＰ１Ｂである，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  47. 前記ヒト遺伝子がＢＡＣＥである，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  48. 前記ヒト遺伝子がＣＨＫ１である，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  49. 前記ヒト遺伝子がＰＫＣ−アルファである，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  50. 前記ヒト遺伝子がＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）である，請求項３１または３５記載のｓｉＮＡ分子。
  51. 許容しうる担体または希釈剤中に請求項１記載のｓｉＮＡ分子を含む，医薬組成物。
  52. 請求項１記載のｓｉＮＡ分子を含む医薬品。
  53. 請求項１記載のｓｉＮＡ分子を含む活性成分。
  54. 内因性哺乳動物標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするための二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用であって，前記ｓｉＮＡ分子は１またはそれ以上の化学的修飾を含み，かつ前記二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は約２１ヌクレオチドを含むことを特徴とする使用。
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