JPH04507083A

JPH04507083A - 規定された構造の短い治療用ｄｓＲＮＡ

Info

Publication number: JPH04507083A
Application number: JP1503637A
Authority: JP
Inventors: ギレスピー、デイビッド・エイチ; カーター、ウイリアム・エー
Original assignee: ヘム・リサーチ・インコーポレーテッド
Priority date: 1989-05-19
Filing date: 1989-05-19
Publication date: 1992-12-10
Also published as: DK188991D0; EP0473576A1; NO914529D0; EP0473576A4; WO1990014090A1; NO914529L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般に、治療用組成物、該組成物の製造方法、およびヒトを含む生物体に該組成物を投与するための方法に関する。

ある種の長い二本鎖ＲＮＡ　（ｄ　５ＲＮＡ）　、特にポリ（Ｉ）；ポリ（Ｃ）およびポ’Ｊ（Ｉ）：ボ＋Ｊ　（Ｃ１２，Ｕ）　（７：／フリケン（Ａｍｐｌｉｇｅｎ）　：登録商標）は、抗癌および抗エイズ剤である（１）。これらｄ　５ＲＮＡは、インターフェロンを誘起し、種々の細胞酵素を活性化させる（２）。

これらｄｓＲＮＡは、リボヌクレオシドジホスフェートを基質として、およびポリヌクレオチドホスホリラーゼを酵素として用いて、高分子量核酸ポリマー（ｍ＞３００）として酵素合成される。

アンブリケンは、その親化合物ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）が毒性であるので創り出された（３）。１９６０年代に、カーター　（Ｃａ＋［ｅｒ）およびツォ（Ｔｓ ’Ｏ）博士は、代謝的に不安定の長いｄｓＲＮＡ誘導体は、血液から迅速にクリアーされ、それ故最小の毒性を示すに違いないと推論した。彼らは、ＲＮアーゼ感受性ミス対合を有する長いｄｓＲＮＡ分子としてアンブリケン（登録商標）を創り出し、この分子は、生物効能を保持しているが非毒性であることが証明された。一般的使用におけるポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）またはポリ（１）：ポリ（Ｃ１２，Ｕ）　ノサイズを指摘するために、本発明者らは、１９８７０１９８８における臨床試験におけるアンブリケンの明細は、１，０００，０００を越える分子量および１５０　（−）を越える塩基対数に対応するＳ　２０．１０−１５のＷという要件を含んでいることを指摘しておく。

新しい考えは、本発明者らをして、ｄｓＲＮＡを同時に特徴付ける生物活性および毒性の欠如に対する新たな異なる機構説明に到達させ、本発明者らは、治療効果のある新しいクラスのｄｓＲＮＡを創り出すに至った。従来技術の教示とは対照的に、本発明者らは、アンブリケンの毒性の欠如は、ウラシル残基によって導入された螺旋状インターラブシコン（すなわち、螺旋ストレッチの短さ）に由来し、ＲＮアーゼに由来するのではないと結論し７た。すなわち、本発明の要点は、次の通りである。まず、ある種の短いｄ　５ＲＮＡは、それらがＲＮＡアーゼ感受性ミス対合を含むかどうかにかかわらず、非毒性であり、生物活性がある。

適切なヌクレオチド配列を白′するそのような短いｄｓＲＮＡは、それらの生物活性故に治療的である。従来技術は、毒性を伴うことなく生物活性を保持するためには、長い生物分解性ｄｓＲＮＡが必要であると教示することによって、本発明を教示するものでない。

規定された配列の短いｄｓＲＮＡは、ＰＮＰＮ−アーゼ法っては合成できない。

第一に、ＰＮＰアーゼは、それがターミナルトランスフェラーゼであり、鋳型複製酵素ではないので、規定された配列の核酸を合成できない。第二に、ホモポリマー：ホモポリマータイプのｄ　５ＲＮＡの螺旋含有率は、「スリッペイジ」反応により常に変化する。スリッペイジとは、ｄｓＲＮＡ分子の２つの鎖か、互いに対して２つの鎖の位置を固定するための相捕的ヌクレオチド１ノシスターが存在しないので、互いに対して相対的に動くことを意味する。本発明は、規定された配列の安定で短いｄｓＲＮＡを合成するための手段を提供する。

図面の簡単な説明第１図は、規定された配列の短いｄｓＲＮＡの２つのタイプを説明する図である。第１Ａ図に、末端「ロック」を有するｄｓＲＮＡが示され、第１Ｂ図に、中央の「ヒンジ」を有するｄ　５ＲＮＡが示されている。第１図のｄ　５ＲＮＡは、Ａ−Ｕ塩基対によって示されている「内部レジスター」をも含有する。

第２図は、末端ロックおよび内部レジスターを有する規定された配列の短いｄｓＲＮＡを製造するための方法を説明する図である。

第３図は、中央または近中央ヒンジを有する規定された配列の短いｄｓＲＮＡを製造するための方法を説明する図である。

第４図は、末端ロックおよび中央または近中央ヒンジの双方を有する規定された配列の短いｄ　５ＲＮＡを製造するための方法の説明図である。

使用に関連する本発明の組成物及び方法は、一般に、蛋白質誘導及び／又は酵素活性ｄｓＲＮＡ複合体の、生存する動物細胞に対する毒性を減らすような前記複合体の化学修飾に関するいくつかの実施例に依存する。ここで開示されている化学的に修飾された複合体は、未修飾の複合体の生物活性を保持し、同時に現在不知の機構により毒性が減少している。

本発明の対象であるｄｓＲＮＡ複合体は前記ｄＳＲＮＡを短縮し、同時に相互に対して空間的に二本鎖を固定することにより修飾できる。図１はこの適用において企図される２つの型のｄｓＲＮＡを示している。Ａ型のｄ　５ＲＮＡは「ロックされたｄ　５ＲＮＡＪと呼ばれる。これはｄｓＲＮＡレジスタを固定するために各末端に相補的領域（「ロック」）を有する。このモデルの変形例は末端部よりむしろ、或いはこれに加えて、次端部を有し、或いは唯一のロックを有し得る。ロックは１ヌクレオチドとほぼ等しい長さであり得る。更に図１及び２のＡ　 −Ｕ塩基対のような内部レジスタも増加された安定性のために付加できる。Ｂ型のｃ３ｓＲＮＡは［ヒンジされたＪｄｓＲＮＡと呼ばれる。ヒンジされたｄ　５ＲＮＡは内部の自己に相補的なストレッチを有し、これは制限された方法でおりたたまれ、残りのｄｓＲＮＡヌクレオチドを整列させる（ヒンジされたｄｓＲＮＡの例として図３及び４も参照）。この応用の目的に対して「ロック」、「ヒンジ」、および「内部レジスタ」はｄｓＲＮＡのホモポリマーストレッチと異なる相補的なヌクレオチド対である。前記ロック、ヒンジ、および内部レジスタはこの応用においてヘテロポリマー領域と呼ばれる。一方の末端にｄ　５ＲＮＡレジスタを固定するための１つのヘテロポリマーヌクレオチド対があり、他方の末端に、完全にヘテロポリマーの短いｄ　５ＲＮＡがある。ロックされた及びヒンジされたｄｓＲＮＡの両者は末端に又は内部に１本鎖領域を何し得る（図２）。

２）規定された配列の短いｄｓＲＮＡの合成規定された長さ及び規定された配列のロックされたＲＮＡ分子は、対象の配列付近に設置された規定された配列のプロモーターを存するプラスミドＤＮＡベクターから合成できる。

ベクター、酵素及び基質は、種々の商業的給源から入手できる。例えば図２の構造［７コとして示されているロックされたｄｓＲＮＡは次のように作製できる。

図２の最上部（構造［１］）に示された２つのデオキシオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドシンセサイザーにより合成できる。これらを（構造［２コ）に示したようアニーリングし、１本鎖末端を残す。市販のベクターであるｐＧＥＭ４をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ　Ｉ　１を用いて開環後この１本鎖末端を組み込み、クローン化することができ、構造［３］が得られる。図２に記述したようなこのプラスミドの転写は分離した２つの１本鎖ＲＮＡ　（構造［４］及び［５］）を生じ、これは図２における構造［６］に示されたｄｓＲＮＡを生成するためにアニーリングする（例えばＩＭ　ＮａＰＯ４、ｐＨ７で６５″において）ことができる。このロックされたｄ　５ＲＮＡは、図２における構造［７］に示されているｄｓＲＮＡを生成させるためにＲＮアーセ゛を用いて除去し、用いることができる。

規定された長さ及び規定された配列のヒンジされたＲＮＡ分子は、関連する配列付近に設置された規定された配列のプロモーターを有するプラスミドＤＮＡベクターから合成できる。例えば図３における構造［８］に示されたヒンジされたＲＮＡは次のように作製できる。図３の最上部（構造［１］）に示された２つのデオキシオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドシンセサイザーにより合成し、構造〔２コを生成するためにアニーリングし、前もってＥ　ｃ　ｏＲＩ及びＳｍａ　Ｉを用いて切断されたｐＧＥＭ４に組み込み、クローン化することができ、構造〔３］が得られる。図３に記述したようなこのプラスミドの転写は１つのＲＮＡ　（構造［５コに示されたｄｓＲＮＡを生じるために自己アニーリングすることができる構造［４］）を生じる。このヒンジされたｄｓＲＮＡは、図３、構造（［６］　’Ｉに示されているｄｓＲＮＡを生成するためにＲＮアーゼを用いて除去し、用いることができる。ロック及びヒンジの両方を有する規定された長さ及び配列のｄｓＲＮＡ分子は、この上記手順をＳｍａ　！の代わりにＨｉｒ＋ｄＩＩを用い、図４に描写された僅かに異なるデオキシオリゴオチドを用いるという僅かな変形を行うことにより合成することができる。

他のベクター及び他の制限エンドヌクレアーゼ部位を用いても同様の結果を得られることは当業者において明らかである。また、［（Ｉ　）Ａコ／［（Ｃ１ｏ）Ｕ］の３と異なる反Ｏ温度も使用でき、（１）／（Ｃ）、（１）　／［（Ｃ，）；Ω　ｎｎＵ］　、ＣＡ）　／（Ｕ）　等の他のポリプリン／ポリビリｎ　ｍ　ｍミジン領域も、毒性を回避するのに十分ならせん領域が短く維持され、かつ生物活性を保持するのに十分な長さが維持される限り用いることかできることも明らかである。

また、本発明を特定する、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを側部に有する挿入部を構成するオリゴヌクレオチドは、ベクターに挿入することなく直接合成し、アニーリングし、かつ転写することができることが当業者において明らかである。また、短いｄ　５ＲＮＡは、化学的に合成できることも当業者において明らかである。本発明の本質はｄ　５ＲＮＡ自身の構造及び特性にある。この例は、当業者が、規定された配列の短い治療用ｄｓＲＮＡを調製できるように与えられている。

ｄ　５ＲＮＡの生物活性は、当該分野において慣用されているいくつかの実験システムにおいて評価される。ｄ　ｓ　ＲＮＡの抗ウイルス特性は、ｄ　５ＲＮＡ処理した細胞に水胞性０炎ウィルス（Ｖ　Ｓ　Ｖ）を作用させることおよび、（５）に記載されているようにウィルス収率の減少をＩ測定することによって測ることができる。同様の方法が、ＶＳＶおよびその他のウィルスの抑制によって報告された。ｄ　５ＲＮＡの抗腫瘍特性は、組織培養に腫瘍セルを曝すこと、および（６）に述べられているように成長速度の減少を測定することによって、評価することができる。ｄｓＲＮＡの抗腫瘍特性はまた、腫瘍をもっているヌードマウスにｄ　５ＲＮＡを注射すること、および腫瘍成長速度を測定すること（７）によっても評価することができる。天然キラー細胞またはマクロファージ破壊活性を高めるためのｄｓＤＮＡの能力は、（８）で述へられているように決定される。これら全ての方法は、当該分野において慣用されているものであり、先のセクションで述へたように、当業者をして、合成されたｄｓＲＮＡの生物活性を測定することを可能にするために引用される。これらの方法の引用は、限定的なものと考えるべきでない。ｄ　５ＲＮＡの存在の生物活性を測定するためのその他の方法が存在し、それらもまた、当業者によく知られている。

ｄ　５ＲＮＡの毒性またはその欠如は、長い間、起こり得る治療法の種々の試験のための慣用された手順であって、長い間、起こり得る治療法の種々の試験のための慣用された手順であって、およびｄ　５ＲＮＡに同様に長い量適用されてきたところの方法によって決定できる。マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルおよびヒト等の適した試験動物は、ｄ　５ＲＮＡの異なる量を定期的に注射され、適した間隔の後、前記動物は、発熱の有無、体重の減少、肝機能の低下、血小板減少、白血病、骨髄抑圧等について検査される。検査官は、そのような研究がｄｓＲＮＡに関してなされた例について、特に引用（９）に注意が向けられる。

Ｆ）Ｉ／）Ｆ工Ｇ、２ｅｕｔ　ｗｉｔｈ　Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ　（、）　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｉｅｒｉｂｅ　ｗｉｔｈＴ７　ｐＯｌｙｍｅｒａｇｅ　ｐｌｕｓ　ＮＩ’Ｐ”ＵＣＩＡＡ［（Ｃ）１゜Ｕ］３ＣＵＵＡＡＩＩＩＣＣＡ工Ａｌｌｌ５’　（＋）　ＲＮＡＩＡＡＵＡＣＡＡＩＣＵＵ［（１）、。Ａ］ＩＡＡＵＵ３”　（−）ＲＨＡ酊ｍｅａｌ　（Ｑ　釘−（−）賜ＲＮａｓｓ　Ｔ２ｘ７嵩悪Ｅ”’；：”シ＝ＮＴＰ会　＝　ＡＴＰ、　υＴＰ、ＣＴＰ　ｐｌｕｇ　ＸτＰＦ工Ｇ、３ｍａｋｅ　ｄ＠ｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ＠ｅ　ＧＧＧ（Ｇ）１２ＡＡＴＧＡＴｒ（Ｃ）１５（：　ａｎｄαＸ：　（Ｃ）ｚ２ＴｌｒＡＣＴＡＡ（Ｇ）ｘ５ｃｒｒｌＡＩＡｃｃｌａｎｓ　ａｎｎｅａｌｅｄ　ｏｌｉｇｏｓ　１ｎｔｏ　ｐＧ団４　ｃｕｔ　ｗｉｔｈ　ＥａｏＲｌ　ａｎｄ　５ｍｍ１ｃｕｔ　ｗｉｔｈ　Ｓｗａｍ　（、）　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｉｃｒｉｂｅ　ｗｉｔｈ　Ｔ７　ｐｏｌｙｍｅｒａｇｅ　ｐｌｕｓ　Ｎ’ｒＰ”（Ｃ）１５ＵＵＡＣＵＡＡ　（Ｘ　）１５　ＣＵＵＡＡＩ　ＩＣＣＡｘＡＩ　Ｘ　Ｘ５　’５ｅｌｆ　ａｎｎｅａｌＵＡＡ（５）、Ｃ１ｊＵＡＡＩＩＣＡ藷１１１５＾υυ（ＲＮａｓｅ　Ａ３１２６　ｗａ　ＡＴＰ、ｔ７Ｔｌ’、ＣＴＰ　ｐｉｕｓ　ＸＴ’ｌ’国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的活性を有し、かつ有意の毒性が欠如する、所定の構造を有する短いｄｓＲＮＡ。２．相補的ヘテロポリマーの「ロック」、「ヒンジ」および／または「内部レジスター」領域によって安定化される請求の範囲第１項記載のｄｓＲＮＡ。３．下記−般構造５′ロック−（Ｉ）ｎ−ロック３′ ３′ロック−（Ｃ）ｍ−ロック５′ を有する請求の範囲第２項記載のｄｓＲＮＡであって、「ｍ」および「ｎ」は１００未満かつ５より大きく、一方の鎖のロックは他方の鎖のロックと相補的であり、かつ「Ｉ」および「Ｃ」はそれぞれイノシン−リン酸およびシチジン−リン酸であるｄｓＲＮＡ。４．一般構造５′（Ｉ）ｎ−ヒンジ−（Ｃ）ｍ３′を有する請求の範囲第２項記載のｄｓＲＮＡであって、「ｍ」および「ｎ」は１０Ｇ未満かつ５より大きく、ヒンジは自己相補性を示すヘテロポリマー領域であり、かつ［Ｉ」および「Ｃ」はそれぞれイノシン−リン酸およびシチジン−リン酸であるｄｓＲＮＡ。５．下記一般構造５′ロック−［（Ｉ）ｎＡ］ｊ−ロック３′３′ロック−［（Ｃ）ｍＵ］ｋ−ロック３′を有する請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡであって、「ｍ」および「ｎ」は２５未満かつ５より大きく、「ｊ」および「ｋ」は１０未満かつ０より大きく、「Ｉ」および「Ｃ」はそれぞれイノシン− リン酸およびシチジン−リン酸であり、「Ａ」はＩではないヌクレオチドであり、および「Ｕ」はＡと塩基対を形成するヌクレオチドであるｄｓＲＮＡ。７．一方の鎖に置換が生じ、該置換が他方の鎖のヌクレオチドとは相補的ではない請求の範囲第１項記載のｄｓＲＮＡ。８．前記ｄｓＲＮＡが一本鎖の尾部を有する請求の範囲第７項記載のｄｓＲＮＡ。９．ｄｓＲＮＡ依存性酵素の治療学的な活性化、またはインターフェロンの誘導を、そのような治療を必要とするヒト体内で行なう方法であって、請求の範囲第１項に記載の所定の構造を有する短いｄｓＲＮＡの治療上有効な量をヒトに投与することを含む方法。１０．ｄｓＲＮＡ依存性酵素の治療学的な活性化、またはインターフェロンの誘導を、そのような治療を必要とするヒト体内で行なう方法であって、請求の範囲第２項に記載の所定の構造を有する短いｄｓＲＮＡの治療上有効な量をヒトに投与することを含む方法。１１．ｄｓＲＮＡ依存性酵素の治療学的な活性化、またはインターフェロンの誘導を、そのような治療を必要とするヒト体内で行なう方法であって、請求の範囲第３項に記載の所定の構造を有する短いｄｓＲＮＡの治療上有効な量をヒトに投与することを含む方法。１２．ｄｓＲＮＡ依存性酵素の治療学的な活性化、またはインターフェロンの誘導を、そのような治療を必要とするヒト体内で行なう方法であって、請求の範囲第４項に記載の所定の構造を有する短いｄｓＲＮＡの治療上有効な量をヒトに投与することを含む方法。１３．ｄｓＲＮＡ依存性酵素の治療学的な活性化、またはインターフェロンの誘導を、そのような治療を必要とするヒト体内で行なう方法であって、請求の範囲第５項に記載の所定の構造を有する短いｄｓＲＮＡの治療上有効な量をヒトに投与することを含む方法。１４．ｄｓＲＮＡ依存性酵素の治療学的な活性化、またはインターフェロンの誘導を、そのような治療を必要とするヒト体内で行なう方法であって、請求の範囲第６項に記載の所定の構造を有する短いｄｓＲＮＡの治療上有効な量をヒトに投与することを含む方法。１５．ｄｓＲＮＡ依存性酵素の治療学的な活性化、またはインターフェロンの誘導を、そのような治療を必要とするヒト体内で行なう方法であって、請求の範囲第７項に記載の所定の構造を有する短いｄｓＲＮＡの治療上有効な量をヒトに投与することを含む方法。１６．ｄｓＲＮＡ依存性酵素の治療学的な活性化、またはインターフェロンの誘導を、そのような治療を必要とするヒト体内で行なう方法であって、請求の範囲第８項に記載の所定の構造を有する短いｄｓＲＮＡの治療上有効な量をヒトに投与することを含む方法。