CN101787366B

CN101787366B - 一种特异抑制Rab27B基因表达的DNA片段及其应用

Info

Publication number: CN101787366B
Application number: CN 201010118556
Authority: CN
Inventors: 姜颖; 贺福初; 齐菲菲; 孙薇; 魏汉东
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2010-03-04
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2030-03-04
Also published as: CN101787366A

Abstract

本发明公开了一种特异抑制Rab27B基因表达的DNA片段及其应用。本发明提供的小干扰RNA是序列表中序列4和5所示的核苷酸序列组成的双链RNA。本发明提供的DNA片段，如式I所示，其中，SEQ_正向的核苷酸序列如序列表中序列2所示；SEQ_反向与所述SEQ_正向反向互补；X是内含子。实验证明：本发明提供的DNA片段导入肝细胞癌细胞中，Rab27B蛋白表达量显著下调，并且敲低Rab27B后，HCC97H细胞体外增殖能力、体外黏附能力、体外迁移能力和体外侵袭能力都显著下降。SEQ_正向-X-SEQ_反向(I)。

Description

一种特异抑制Rab27B基因表达的DNA片段及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种特异抑制Rab27B基因表达的DNA片段及其应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的、致死率极高的恶性肿瘤，每年约650,000人死于HCC，且其发病率有增高的趋势。该病多发于东南亚和非洲，其中约有50％以上发生于中国，位居我国癌症死亡率的第二位。HCC早期诊断较难，病情进展快，预后水平低。手术切除一直被认为是HCC获得根治的最佳手段，但是仅有10-20％的病人适合通过手术来干预；除此之外，即使是根治性切除，5年内仍有60-70％的病人会出现转移复发而危及生命，而局部治疗的转移复发率则更高。HCC的转移是影响治疗效果和预后的最大障碍，是导致其高死亡率的主要原因。

近年来，针对HCC的转移进行了大量研究并找到了许多重要的分子，如：黏附分子、细胞骨架及调节蛋白、基质降解酶、癌基因及抑癌基因、血管生成的调控因子、肿瘤免疫相关分子等。也即HCC的转移过程与肿瘤细胞的黏附运动、细胞增殖、细胞外基质、机体免疫、肿瘤血管生成等多因素有关。尽管对HCC转移进行了大量研究，但目前HCC转移的分子机制仍不明确，尚未发现预测HCC复发转移的分子标志物和有效的治疗靶标。

Rab27B是Rab家族中Rab27亚族成员，Rab家族在细胞内发挥着非常广泛的生物学功能，包括细胞的分泌、胞吞、信号转导及发育。Rab GTPase是机体内一组与内膜运输相关的调节蛋白。Rab家族在肿瘤的生长和转移过程中发挥了重要的作用，如：Rab20在胰腺癌中高表达，在肿瘤的生长过程中发挥了重要的作用；Rab23和Rab5a在肝细胞癌中高表达，在HCC的生长和增殖过程中，发挥了重要的作用，其中Rab5a在EGF信号通路中起了重要作用；Rab25介导的信号通路在卵巢癌的细胞增殖和凋亡的调控中发挥了重要的作用；Rab25可以通过指引整合素循环囊泡的定位以及增强肿瘤细胞侵袭胞外基质的能力来加速肿瘤的生长。

Rab27亚族包括两个成员：Rab27A和Rab27B。Rab27A与Griscelli Disease有关，在溶酶体样细胞器中起了重要的作用。研究发现Rab27A和Rab27B在序列和结构上有高度的保守性。两者在功能上也有一定的相似性。乳腺癌中Rab27a的过表达，增强了肿瘤的侵袭能力和转移潜能，与胰岛素样生长因子2的分泌相关。目前为止尚未见到其与肿瘤的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小干扰RNA。

本发明提供的小干扰RNA是序列表中序列4和5所示的核苷酸序列组成的双链RNA。

编码上述的小干扰RNA的DNA片段也属于本发明的保护范围之内。

上述的DNA片段，如式I所示：

SEQ_正向-X-SEQ_反向

(I)

其中，SEQ_正向的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

SEQ_反向与所述SEQ_正向反向互补；

X是SEQ_正向与SEQ_反向之间的间隔序列，X与所述SEQ_正向或者X与SEQ_反向均不互补。

上述X是内含子，所述内含子的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

含有上述DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体是将上述的DNA片段插入GCsilencer^TMU6/Neo/GFP载体的多克隆位点构建成的重组表达载体。

上述小干扰RNA、上述DNA片段或者上述的重组载体在制备抑制Rab27B基因表达产品中的应用也属于本发明的保护范围之内。

上述Rab27B基因是如下1)或2)：

1)核苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第112-768位所示；

2)核苷酸序列如序列表中序列1所示。

上述小干扰RNA、上述DNA片段或者上述的重组载体在制备治疗肝细胞癌细胞转移的抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围之内。

上述小干扰RNA、上述DNA片段或者上述的重组载体在制备肝细胞癌细胞转移的药物中的应用也属于本发明的保护范围之内。

上述肝细胞癌细胞具体可为HCC97H。

实验证明：本发明提供的DNA片段导入肝细胞癌细胞中，Rab27B蛋白表达量显著下调，并且敲低Rab27B后，HCC97H细胞体外增殖能力、体外黏附能力、体外迁移能力和体外侵袭能力都显著下降。

附图说明

图1半定量RT-PCR检测三株细胞中Rab27B mRNA水平的差异。

图2Western blot检测三株细胞中Rab27B蛋白水平的差异。

图3Rab27B在HCC97H细胞中的荧光定位(400×)。

图4Western blot检测shRab27B质粒载体敲低效果。

图5敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外增殖能力的影响。

图6敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外黏附能力的影响。

图7敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外迁移能力的影响(划痕愈合模型)。

图8敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外迁移能力的影响(Transwell)。

图9敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外侵袭能力的影响(Transwell)。

其中图4-图9中的HCC97H是指HCC97H组细胞的实验结果，Mock是指阴性对照(也即是指将一段不发挥作用的DNA片段(核苷酸序列是GGCAGATAAAGCACTAGCATTCAAGAGA TGCTAGTGCTTTATCTGCC)转染HCC97H细胞得到的重组细胞)的结果，shRab27B是97H-shRab27B组细胞实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、比较不同转移能力肝细胞癌细胞株中Rab27B的mRNA和蛋白表达水平，及Rab27B的细胞内定位

1、收集细胞，提取RNA和蛋白质

肝细胞癌细胞株HCC97L、HCC97H和HCCLM6购自复旦大学肝癌研究所，其转移能力依次增强，将三株细胞在37℃、5％CO₂下培养于添加10％胎牛血清(FBS，澳大利亚PAA公司)的DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)中，待细胞生长至80％汇合度时，收集细胞。

提取三株细胞的总RNA，反转录合成其cDNA。用细胞裂解液(20mM Tris[pH7.5]，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM PMSF，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％去氧胆酸钠)裂解所收集的细胞，然后用4℃离心机10000g离心15min，收集裂解液上清，即为细胞总蛋白。

2、半定量RT-PCR和Western blot检测Rab27B含量的变化(图1和图2)

将步骤1中所合成的cDNA为模板，在引物Rab27B-F(上游引物)：5’-ATGACCGATGGAGACTATGATTATC-3’和Rab27B-R(下游引物)：5’-CTAGCAGATACATTTCTTCTCTGGTGTG-3’的引导下，PCR扩增三株细胞中Rab27B蛋白的基因(657bp)，同时以GAPDH(452bp)为内参对照，上下游引物分别为：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和5’-TCCACCACCCTGTTGCT GTA-3’。将PCR产物进行1％琼脂糖电泳，结果如图1所示，随着转移能力的增强，Rab27B的mRNA水平在三株细胞中逐渐增高，说明Rab27B可能参与了HCC的转移过程。

将细胞总蛋白在100℃下煮10min后进行12％SDS-PAGE分离蛋白样品，并转移至硝酸纤维素膜上，然后分别用Rab27B的多克隆抗体(Santa Cruz公司)和beta-actin单克隆抗体(Proteintech公司)进行Western blot检测，结果如图2所示，在三株细胞中Rab27B的含量依次增高，表明Rab27B与HCC的转移相关。

3、Rab27B的细胞内定位(图3)

将已消毒的18mm盖玻片置于六孔培养板中，按1×10⁵/ml的细胞密度将HCC97H细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，第二天后进行免疫荧光染色鉴定；4％多聚甲醛固定10min；封闭血清孵育(5％正常二抗血清PBS液)30min；一抗孵育(Rab27B羊多抗，Santa Cruz公司，PBS配，滴度1∶100)37℃2h，阴性对照为羊血清，空白对照用PBS液；PBS清洗标本3次各5min；滴加1∶1000FITC标记的兔抗羊二抗，室温孵育30min，PBS洗涤三遍以后，滴加染核试剂Hochest(PBS 1∶5000稀释)，室温孵育30min，PBS洗涤三遍以后，80％甘油封片、镜检、拍照。结果如图3所示，Rab27B主要分布于细胞的胞质中，这与其相应的参与细胞的分泌及运输功能相一致。

实施例2、稳定敲低Rab27B的细胞株的构建及其表型检测

一、稳定敲低Rab27B的细胞株的构建

1、重组表达载体的构建

1)化学合成片段ABC

片段ABC是片段A、片段B和片段C依次连接而成，其中片段A的核苷酸序列如序列表中序列2所示，片段B的核苷酸序列如序列表中序列3所示，片段C的核苷酸序列与片段A反向互补。在片段ABC的两端加上酶切位点EcoR I和BamH I。

2)将片段ABC插入pGCsilencer^TMU6/Neo/GFP载体(购自上海吉凯基因技术有限公司，货号20106)的酶切位点EcoR I和BamH I之间，构成重组表达载体pGCsilencer^TMU6/Neo/GFP/RNAi。

2、转染

将步骤1获得的重组表达载体用LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)转染HCC97H细胞(可购自上海中山医院)，再将转染细胞在37℃、5％CO₂下培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养基中，然后加入0.4mg/ml G418进行筛选，待细胞形成克隆后，挑取带有荧光的单克隆进行培养，从得到稳定敲低Rab27B表达水平的细胞株，命名为97H-shRab27B。

3、敲低效果检测

用细胞裂解液裂解步骤2中所收集的单克隆稳定细胞株，然后用4℃离心机10000g离心15min，收集裂解液上清，即为细胞总蛋白。将细胞总蛋白在100℃下煮10min后进行12％SDS-PAGE分离蛋白样品，并转移至硝酸纤维素膜上，然后分别用Rab27B的多克隆抗体(购自Santa Cruz公司，货号sc-22993)和beta-actin单克隆抗体(购自Protein-tech公司，货号60008-1-Ig)进行Western blot检测，结果如图4显示，与阴性对照mock及正常HCC97H细胞相比，转染后的shRab27B组细胞的Rab27B的表达水平下调约70％。

二、表型检测

培养基配方：

无血清DMEM高糖培养基(购自Hyclone公司)

有血清DMEM高糖培养基(胎牛血清购自PAA公司，含10％血清)

含BSA的DMEM高糖培养基(BSA购自Merck公司，含5％BSA)

1、稳定敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外贴壁增殖的影响(MTT比色分析)(图5)

分别取对数生长期(70％-80％汇合度)的HCC97H、97H-shRab27B和mock组细胞，0.25％胰酶(Hyclone公司)消化成细胞悬液，以1.0×10⁵个/ml接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml，12h后完全贴壁，经无血清DMEM高糖培养基同步培养24h后，换有血清DMEM高糖培养基继续培养24h，每组细胞设5个平行复孔实验；每孔加入20μl 0.5％噻唑篮(Sigma公司)(MTT)，继续培养4h；终止培养，吸出孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜(Sigma公司)(DMSO)，置摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解；在酶标仪OD₄₉₀nm处测量各孔的吸光值。结果如图5，97H-shRab27B组细胞的体外贴壁增殖能力与HCC97H组细胞相比有显著的下降，而mock组的细胞则与HCC97H组细胞无显著差异，说明降低Rab27B的表达后HCC97H细胞的增殖能力显著下降，即Rab27B参与HCC97H的增殖过程。

2、稳定敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外黏附的影响(平板黏附实验)(图6)

96孔培养板分别均匀包被DMEM高糖培养基(FBS10％)10μl，4℃过夜，超净工作台风干，紫外线照射消毒；分别取对数生长期(70％-80％汇合度)的HCC97H、97H-shRab27B和mock细胞，0.25％trypsin消化成细胞悬液，离心弃上清后，用无血清DMEM高糖培养基把细胞制成悬液(0.4×10⁶个/ml)，各取细胞悬液100μl加入培养板中，每组细胞设3个平行复孔实验，继续常规培养；培养60min后，37℃PBS洗去未黏附的细胞，进行MTT比色，测各孔490nm波长光吸收值(A值)，用A值大小表达黏附活细胞数的相对多少。结果如图6，shRab27B组细胞的黏附能力与HCC97H组细胞相比有显著的下降，而mock组的细胞则与HCC97H组细胞无显著差异，说明降低Rab27B的表达后HCC97H细胞的黏附能力显著下降，即Rab27B参与HCC97H的黏附过程。

3、稳定敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外迁移能力的影响(划痕愈合模型)(图7)

首先用记号笔在六孔培养板后沿直尺划平行线，每条线之间间隔1cm；HCC97H、97H-shRab27B和mock细胞分别以2×10⁵个/ml接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于培养箱培养；待细胞生长至60-70％汇合度后，用200μl枪头沿直线做划痕，划痕与记号笔所画直线垂直，一般做三道，然后用PBS清洗细胞三次，再加入培养基继续培养；分别在划痕后0h、12h、24h和48h拍照。测量细胞划痕宽度。结果如图7所示，shRab27B组细胞的划痕愈合速率与HCC97H组细胞相比有显著的下降，而mock组的细胞则与HCC97H组细胞无显著差异，说明降低Rab27B的表达后HCC97H细胞的迁移能力显著下降，即Rab27B参与HCC97H的迁移过程，进而影响了HCC97H细胞的转移过程。

4、稳定敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外迁移能力的影响(Transwell实验)(图8)

制备细胞悬液前先让细胞无血清饥饿24h；分别取对数生长期(70-80％汇合度)的HCC97H、97H-shRab27B、mock三组细胞，消化后，离心弃去培养基，用PBS(pH＝7.4)清洗，用含BSA的无血清DMEM高糖培养基(5％BSA)重悬，调整细胞密度为10×10⁵/ml；在24孔板下室加入500μl含10％FBS的DMEM培养基，用无菌镊将Transwell小室放入有培养基的孔内，必须确认膜下没有气泡，并避免小室在液体中形成角度。取三组细胞悬液100μl加入Transwell小室中，每组细胞设3个平行复孔实验。置于培养箱中常规培养24h；24h后从培养箱中取出Transwell小室，用棉签蘸无血清的DMEM培养基擦拭除去Transwell小室上层的细胞；将Transwell小室置于甲醇中固定10min，PBS清洗5min×3次；将Traswell小室移入0.1％结晶紫中，染色30min，PBS清洗5min×3次；取出Transwell小室，底面朝上，置于光镜下，膜上滴一滴水，上置盖玻片；每个滤膜随即选取5个视野，计数穿膜细胞数，以穿膜细胞的数目表示细胞的相对侵袭能力。结果如图8所示，97H-shRab27B组细胞的穿膜细胞数与HCC97H组细胞相比有显著的下降，而mock组的细胞则与HCC97H组细胞无显著差异，说明降低Rab27B的表达后HCC97H细胞的迁移能力显著下降，即Rab27B参与HCC97H的迁移过程，进而影响了HCC97H细胞的转移过程。

5、稳定敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外侵袭能力的影响(Transwell实验)(图9)

把24孔板Transwell小室置于冰上遇冷，将Matrigel胶(BD公司)(50μg/ml)从-20℃中取出，置于4℃过夜溶解，把Matrigel胶和无血清DMEM培养基按1∶3混合，按每孔20μl包被Traswell小室底部膜的上室面，4℃风干；制备细胞悬液前先让细胞无血清饥饿24h；分别取对数生长期(70-80％汇合度)的HCC97H、97H-shRab27B、mock三组细胞，消化后，离心弃去培养基，用PBS(pH＝7.4)清洗，用含BSA的无血清DMEM高糖培养基(5％BSA)重悬，调整细胞密度为10×10⁵/ml；在24孔板下室加入500μl含10％FBS的DMEM培养基，用无菌镊将Transwell小室放入有培养基的孔内，必须确认膜下没有气泡，并避免小室在液体中形成角度。取三组细胞悬液100μl加入Transwell小室中，每组细胞设3个平行复孔实验。置于培养箱中常规培养24h；24h后从培养箱中取出Transwell小室，用棉签蘸无血清的DMEM培养基擦拭出去Transwell小室上层的Matrigel胶及其表面的细胞；将Transwell小室置于甲醇中固定10min，PBS清洗5min×3次；将Traswell小室移入0.1％结晶紫中，染色30min，PBS清洗5min×3次；取出Transwell小室，底面朝上，置于光镜下，膜上滴一滴水，上置盖玻片；每个滤膜随即选取5个视野，计数穿膜细胞数，以穿膜细胞的数目表示细胞的相对侵袭能力。结果如图9所示，97H-shRab27B组细胞的穿膜细胞数与HCC97H组细胞相比有显著的下降，而mock组的细胞则与HCC97H组细胞无显著差异，说明降低Rab27B的表达后HCC97H细胞的侵袭能力显著下降，即Rab27B参与HCC97H的侵袭过程，进而影响了HCC97H细胞的转移过程。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

<120>一种特异抑制Rab27B基因表达的DNA片段及其应用

<130>CGGNARL102129

<160>5

<210>1

<211>1365

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

gtggagcccg ggagttccag ggcttgggaa ggggaaggaa acctctctga aatctgacac 60

ctgctctccc ggcaaggaaa cttcgcaggc tgaccgacca agaccatcac tatgaccgat 120

ggagactatg attatctgat caaactcctg gccctcgggg attcaggggt ggggaagaca 180

acatttcttt atagatacac agataataaa ttcaatccca aattcatcac tacagtagga 240

atagactttc gggaaaaacg tgtggtttat aatgcacaag gaccgaatgg atcttcaggg 300

aaagcattta aagtgcatct tcagctttgg gacactgcgg gacaagagcg gttccggagt 360

ctcaccactg catttttcag agacgccatg ggcttcttat taatgtttga cctcaccagt 420

caacagagct tcttaaatgt cagaaactgg atgagccaac tgcaagcaaa tgcttattgt 480

gaaaatccag atatagtatt aattggcaac aaggcagacc taccagatca gagggaagtc 540

aatgaacggc aagctcggga actggctgac aaatatggca taccatattt tgaaacaagt 600

gcagcaactg gacagaatgt ggagaaagct gtagaaaccc ttttggactt aatcatgaag 660

cgaatggaac agtgtgtgga gaagacacaa atccctgata ctgtcaatgg tggaaattct 720

ggaaacttgg atggggaaaa gccaccagag aagaaatgta tctgctagac tctacataga 780

aactgaacat caagaacccc accaaaatat tacttttaaa aacaatgaca aaccacacaa 840

ttgttgttga gtaaaccacg cacaatggca tgtctttctt tttctgccag aaaatctatt 900

ttaagaaacc agaatagtca acagtgttca aaagaattga ctagttatcc ctgaggccct 960

ttcaaacatg atcaaagatt tcccaatgtg atctcatcat catggatact caatttgttt 1020

tttcttatag agaaaatgag tatataagac aatatacaag aagaaatatc agtgagtttt 1080

aaatcagaac aagttacctg tcacattgaa gaaaagggta ggcactaaag ggagaacaca 1140

gaaagaagaa tttctaaaat attggattta cttcttatat tgagtcagat gcatactttt 1200

agatttgcat tggggaaaat gtactagcta aaaatggata cacaatgaag aattctattt 1260

ggctaattaa gaatgatata ctatgtacac ccaataagct gtactagaat gaataaatta 1320

ctgataaggt tccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1365

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

aagccaccag agaagaaatg t 21

<210>3

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ttcaagaga 9

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

acauuucuuc ucugguggcu u 21

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

aagccaccag agaagaaaug u 21

Claims

1.一种小干扰RNA，是序列表中序列4和5所示的核苷酸序列组成的双链RNA。

2.编码权利要求1所述的小干扰RNA的DNA片段。

3.如权利要求2所述的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段是式I所示的片段：

SEQ_正向-X-SEQ_反向

(I)

其中，SEQ_正向的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

SEQ_反向与所述SEQ_正向反向互补；

4.根据权利要求3所述的DNA片段，其特征在于：所述X是内含子，所述内含子的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

5.含有权利要求2-4中任一所述DNA片段的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将权利要求4所述的DNA片段插入GCsilencer^TMU6/Neo/GFP载体的多克隆位点构建成的重组表达载体。

7.权利要求1所述小干扰RNA、权利要求2-4中任一所述DNA片段或者权利要求5或6所述的重组载体在制备抑制Rab27B基因表达产品中的应用；所述Rab27B基因是如下1)或2)：

1)核苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第112-768位所示；

2)核苷酸序列如序列表中序列1所示。

8.权利要求1所述小干扰RNA、权利要求2-4中任一所述DNA片段或者权利要求5或6所述的重组载体在制备治疗肝细胞癌细胞转移的抑制剂中的应用。

9.权利要求1所述小干扰RNA、权利要求2-4中任一所述DNA片段或者权利要求5或6所述的重组载体在制备抑制肝细胞癌细胞转移的药物中的应用。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述肝细胞癌细胞为HCC97H细胞。