CN103031334B

CN103031334B - 抑制STAT3 和AFP 基因表达的双靶标siRNA 真核表达质粒及其用途

Info

Publication number: CN103031334B
Application number: CN201210488901.0A
Authority: CN
Inventors: 马效恩; 郑燕; 汪运山; 石晓红; 王婧男; 胡瑞; 孔毅
Original assignee: 汪运山
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2032-11-27
Also published as: CN103031334A

Abstract

本发明涉及抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒及其用途。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对肿瘤中异常高表达的AFP和STAT3基因的靶序列，构建了能在真核细胞中同时表达STAT3和AFP siRNA的质粒pGenesil1.5-STAT3-AFP。本发明能高效、特异性地抑制肿瘤细胞的STAT3和AFP基因表达，可用于制备治疗表达STAT3的AFP阳性肿瘤的基因药物。

Description

抑制STAT3 和AFP 基因表达的双靶标siRNA 真核表达质粒及其用途

技术领域

本发明涉及抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒及其用途，属于生物医药技术领域。

背景技术

甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是胚胎期由肝脏、卵黄囊产生的一种糖蛋白，出生后急剧降低。当发生肝脏肿瘤、某些胃肠道肿瘤和某些生殖系统肿瘤时，血清AFP水平又复升高。目前AFP作为一种公认的肿瘤标志物在肿瘤的诊断中具有重要作用。大约有80%的肝癌患者血清AFP升高，是诊断原发性肝癌的常用检查项目之一。有约50%的生殖细胞肿瘤出现AFP阳性，在其它肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出现不同程度的升高。其中AFP阳性胃癌发病率占胃癌的5.1%-15%，这种肿瘤恶性程度高，具有细胞形态学像肝癌，易发生肝转移和早期淋巴道转移，侵袭性强，预后差的特点。

近年来研究发现AFP在肿瘤的发生发展中具有重要作用：（1）免疫调节活性：AFP能抑制NK细胞活性及T淋巴细胞依赖的抗原反应，诱导抑制性T细胞的产生，下调单核细胞表面的MHC-II类分子，及抑制肿瘤坏死因子对肿瘤细胞的细胞毒性作用；AFP还能降低肝癌细胞死亡受体的表达，使之逃避淋巴细胞的攻击。（2）促进肿瘤细胞增殖：实验证明，AFP对人肝癌HepG2细胞、H22细胞和Ehrlich腹水癌细胞及宫颈癌HeLa细胞有直接促增殖作用，用AFP（20mg/L）刺激人肝癌细胞Bel 7402发现c-fos,c-jun和N-ras的mRNA量升高，说明AFP能刺激一些与细胞增殖和分化有关的癌基因表达，从而促进肿瘤细胞增殖。提示AFP可能是重要的内源性促肿瘤细胞增殖的自分泌性蛋白质。（3）参与肿瘤细胞凋亡过程：有研究报道AFP通过与AFP受体结合从而阻止肿瘤细胞凋亡。另有研究认为AFP在肿瘤细胞中能通过活化caspase3诱导凋亡。

AFP作为一种胚胎时期或病理状态合成的蛋白质，它伴随着胚胎发育和细胞分裂旺盛过程，在肿瘤发生发展过程中不仅是一种伴随现象，而且是促进肿瘤细胞生长的内源性物质。这一作用可以被AFP单克隆抗体阻断。抑制AFP基因表达的药物和方法将会影响肿瘤细胞的增殖，从而达到抗肿瘤治疗的目的。因此，阻断AFP基因的表达及其生物学活性同时结合其他的治疗手段有可能是一个治疗与AFP相关肿瘤的一个新的策略。

本发明人在AFP阳性胃癌中的研究证实，利用RNAi技术抑制AFP表达对AFP阳性胃癌细胞FU97具有增殖抑制及凋亡诱导作用，同时可能通过下调VEGF表达抑制肿瘤血管生成在肝癌中，研究报道AFP的小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）可诱导人肝癌细胞系Huh7的生长阻滞(参见Yang X,Zhang Y,Zhang L,Zhang L,Mao J.Silencingalpha-fetoprotein expression induces growth arrest and apoptosis in humanhepatocellular cancer cell.Cancer Lett.2008 Nov 28;271(2):281-93.Epub 2008 Jul26.)。本发明课题组的研究也发现AFP-siRNA可抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖(参见WangYS,Ma XL,Qi TG,Liu XD,Meng YS,Guan GJ.Downregulation of alpha-fetoprotein siRNAinhibits proliferation of SMMC-7721 cells.World J Gastroenterol.2005 Oct14;11(38):6053-5.）。

信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的双功能蛋白。STAT3在多种肿瘤细胞中被激活，并持续处于高活性状态。它具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用，参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演进，已被公认为一种肿瘤相关基因。大量研究发现，利用反义核酸、STAT3的显性负性异构体以及RNAi技术阻断STAT3的活性及表达可使肿瘤细胞生长受到抑制。

RNA干扰((RNA interference,RNAi)是近年来发现和发展起来的在转录水平上的基因阻断技术，是一种双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程。RNAi技术具有高效性、特异性、操作相对简便、效果稳定、一次可研究多个基因等多方面的优势。目前，在某些病毒性疾病的治疗研究中已取得了一定的进展，在基因功能研究和基因治疗方面也已显示出巨大的应用前景。

双靶标RNAi是将2个shRNA装入同一质粒的不同RNA聚合酶III启动子（H1+U6）-终止信号结构单元。每个shRNA独立有效转录。不同的启动子避免使用单一启动子因序列相同可能引发的重组，2个shRNA分别作用于不同目标基因，增强对靶细胞的作用效果。

目前尚无关于利用RNAi技术将干扰STAT3和AFP基因的高效siRNA串联在一个shRNA表达质粒上、达到同时高效抑制二种在肿瘤中异常高表达的基因的双靶标siRNA真核表达质粒及其应用的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒及其用途。

发明概述：本发明以利用RNA干涉技术为主，针对STAT3和AFP基因的有效靶序列，构建了能在哺乳动物细胞中同时表达STAT3和AFPsiRNA的表达质粒pGenesil1.5-STAT3-AFP，以下简称pG1.5-SA。其示意图谱见图1，能高效、特异性地抑制AFP和STAT3基因表达，可用于制备治疗高表达STAT3基因的AFP阳性肿瘤的基因药物。

术语说明：

STAT3：英文signal transducer and activator of transcription 3的简写，信号转导与转录激活因子3。

AFP，英文alpha-fetoprotein的简写，甲胎蛋白。

siRNA:英文small interference RNA的简写，小干扰RNA

shRNA:英文short hairpin RNA的缩写，短发夹RNA。

shRNA包括两个短的反向重复序列（一个是正向序列，另一个是反向互补序列，两者可以结合成为双链，其中的正向序列为干涉靶序列），中间由一茎环（loop）序列分隔，组成发夹结构。所谓反向重复序列是指在同一多核苷酸链内下游存在着与上游某一段序列的互补序列反向的序列。

RT-PCR:英文reverse transcription Polymerase Chain Reaction的缩写，反转录聚合酶链式反应。

western blotting：western蛋白印迹法。

mRNA:英文messenger RNA的缩写，信使核糖核酸。

cDNA:英文complementary DNA的缩写，互补脱氧核糖核酸。

DEPC：英文diethypyrocarbonate的缩写，焦碳酸二乙酯，是一种RNA酶抑制剂。

MTT：英文3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide的缩写，四甲基偶氮唑盐，常用做比色法测定细胞活力的试剂。

本发明的技术方案如下：

抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒，其特征是，以pGenesil1.5为载体，利用双靶标siRNA技术，在一个shRNA表达质粒上引入针对STAT3和AFP基因有效的shRNA序列，每个序列有各自的启动子及终止信号且各自独立表达，在高表达的STAT3基因的AFP阳性肿瘤中发挥干扰作用,是用于表达STAT3基因的AFP阳性肿瘤的治疗性物质；

所述的shRNA序列的两个反向重复序列分别是STAT3或AFP基因的干涉靶序列及其反向互补序列；

所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列分别为：①5'-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3'，起始于956位；②5'-CAGGGAGACATTCATGAAC-3'，起始于508位；

所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列分别为：

5'-CCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3'，5'-GTTCATGAATGTCTCCCTG-3'；

STAT3、AFP基因shRNA表达框的loop序列分别为：5'-GGCCGGCGCGC-3'，5'-CGCGCGCGGGCC-3'；

由以下方法制得：

（1）STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框的构建

a.第一轮PCR：以包含H1和U6启动子的质粒XM-2P为模板，设计PCR引物，在3’引入PCR模板质粒XM-2P的部分序列，用于扩增H1和U6启动子序列，并在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列及loop序列；

上游引物：P1-FW:5’-GGCCGGCGCGC CCAATGCAGGCAATCTGTTGC GGGAAAGAGTGATC-3’，

下游引物：P1-RV:5’-CGCGCGCGGGCC GTTCATGAATGTCTCCCTG GGTGTTTCGTCCTTTC-3’；

b.第二轮PCR：以第一轮PCR为模板，设计PCR引物，在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列、RNA聚合酶III终止序列“AAAAA”及限制性内切酶HindIII（AAGCTT）、BamHI（GGATCC），为了便于酶切，在两个内切酶5’端添加了保护性碱基分别为“AGT”和“AT”：

上游引物：P2-FW:5’-AGTAAGCTTAAAAA GCAACAGATTGCCTGCATTGG GGCCGGCGCGC CC-3’，

下游引物：P2-RV:5’-ATGGATCCAAAAA CAGGGAGACATTCATGAAC CGCGCGCGGGCC GT-3’；

c.经过以上两轮PCR，得到STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框，产物结构为：HindIII- -shRNA1-H1启动子-U6启动子-shRNA2-BamHI。

（2）将步骤（1）所构建的STAT3和AFP基因shRNA表达框和siRNA表达载体pGenesil1.5同时用HindIII、BamHI双酶切，分别产生插入片段和载体片段，然后进行连接，最后转化到DH5α大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养，用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；得到抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒pGenesil1.5-STAT3-AFP；

（3）质粒的鉴定：将步骤（2）提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用限制性内切酶HindIII、BamHI做酶切鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定STAT3和AFP基因shRNA表达框是否正确插入pGenesil1.5质粒中。

本发明的抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒在制备治疗表达STAT3的AFP阳性肿瘤的基因药物中的应用。

为了对STAT3、AFP双siRNA表达质粒对STAT3和AFP基因的抑制效果及对AFP阳性肿瘤细胞的作用进行鉴定，脂质体转染细胞，提取总核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），反转录-聚合酶链式反应（reverse transcription Polymerase Chain Reaction，RT－PCR）法测定对STAT3和AFP信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）表达水平的抑制作用，蛋白印迹法（western blotting）测定对STAT3和AFP蛋白表达水平的影响。四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）、细胞免疫化学法检测Ki67分析转染STAT3、AFP双siRNA表达质粒后对AFP阳性肿瘤细胞生长增殖的影响。

本发明的针对STAT3和AFP基因构建的双siRNA表达质粒是可用于高表达STAT3的AFP阳性肿瘤治疗物质，其在体外培养的AFP阳性肿瘤细胞内可有效抑制STAT3和AFP基因的表达，对肿瘤细胞的增殖有显著的抑制作用，可进一步在实验动物体内进行基因治疗研究。

本发明的抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒的制备方法和生物学活性鉴定主要包括如下内容：

一、质粒的制备，包括双RNA聚合酶III启动子（H1+U6）的引入，双基因shRNA表达框的设计与构建，将上述构建的双shRNA表达框定向克隆入载体pGenesil1.5，转化宿主菌、扩增及质粒DNA的提取，质粒的鉴定。

二、质粒生物学活性的鉴定，包括质粒的转染、脂质体转染效率的计算、RT－PCR检测STAT3和AFP基因的表达、western blotting测定STAT3和AFP蛋白表达水平的影响。ＭＴＴ、细胞免疫化学法检测Ki67分析转染STAT3、AFP双siRNA表达质粒后对AFP阳性肿瘤细胞生长增殖的影响。

下面详细说明本发明制备方法中各步骤的具体操作方法：

1、RNA干涉靶序列的选择及双RNA聚合酶III（H1+U6）启动子的引入：选用经筛选、验证有效的STAT3及AFP基因的RNAi靶序列，分别为：

①5'-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3'

②5'-CAGGGAGACATTCATGAAC-3'

设计PCR引物，以包含H1和U6启动子的质粒XM-2P为模板，扩增H1和U6启动子序列，并在上下游引物中分别引入STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列及loop序列：上游引物：P1-FW:5’-GGCCGGCGCGCCCAATGCAGGCAATCTGTTGCGGGAAAGAGTGATC-3’下游引物：P1-RV:5’-CGCGCGCGGGCCGTTCATGAATGTCTCCCTGGGTGTTTCGTCCTTTC-3’PCR反应体系：

2．STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框的构建

以1中所得PCR产物为模板，设计PCR引物，在上下游引物中分别引入STAT3和AFP基因的干涉靶序列及HindIII、BamHI、RNA聚合酶III终止序列“AAAAA”：上游引物：P2-FW:5’-AGTAAGCTTAAAAA GCAACAGATTGCCTGCATTGG GGCCGGCGCGCCC-3’下游引物：P2-RV:5’-ATGGATCCAAAAA CAGGGAGACATTCATGAAC CGCGCGCGGGCCGT-3’反应体系：

经过两轮PCR，最终得到STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框，产物结构为：HindIII-shRNA1-H1启动子—U6启动子-shRNA2-BamHI。

3、STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框定向克隆入载体质粒pGenesil1.5

将所构建的STAT3和AFP基因shRNA表达框和siRNA表达载体pGenesil1.5同时用HindIII、BamHI双酶切，分别产生插入片段和载体片段，然后进行连接，最后转化到DH5α大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养，用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；

连接反应体系：

4、质粒的鉴定

将提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用限制性内切酶HindIII+BamHI做酶切鉴定；紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序。

上述方法所构建的质粒生物学活性鉴定方法如下：

1．肝癌细胞培养及质粒的转染 SMMC-7721细胞培养在含10％新生牛血清的RPMI-1640中，置于37℃，5％CO₂培养箱中。转染前24小时，将肿瘤细胞接种在6孔培养板上，每孔约5×10⁵个细胞，使每孔细胞饱和度在转染前达到90％以上，铺板时不使用含抗生素的培养液。种板后24小时，取质粒5μg加入250μlopti-MEM培养液，轻轻混匀，按Lipofectamine^TM 2000转染试剂说明书方法进行瞬时转染。剂量配比在其建议范围内选择设计，按照脂质体与质粒配比分五组，分别为空白对照组，4μl：2μg组,6μl：2μg组,8μl：4μg组,10μl:4μg组，分别制备脂质体/质粒转染复合物6孔板中加入500μl转染复合物，来回移动培养板，使转染复合物与细胞充分接触。于37℃培养6h后，补加新鲜的含10％新生牛血清的DMEM，继续孵育。在转染后48h于荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。

2.总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的半定量RT-PCR检测

（1）提取总RNA 取转染后的肝癌细胞SMMC-7721，用PBS漂洗2次，按10⁶－10⁷个细胞加1ml总RNA抽提试剂Trizol裂解细胞，裂解液转至1.5ml大小无RNA酶的Ep管，加入200μl氯仿，剧烈振荡30秒，12000转/分4℃离心5分钟，小心取上清移至1.5ml大小无RNA酶的Ep管,加入与上清等体积的异丙醇，室温放置5分钟后12000转/分4℃离心5分钟，小心弃上清，70％乙醇（焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）水配制）洗涤沉淀2次，室温下自然晾干，用双蒸水(含1％DEPC)溶解，下续反应。

（2）互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）的合成和PCR反应使用Takara公司的RT-PCR试剂盒，先按50℃ 30分钟，99℃ 5分钟,5℃ 5分钟的步骤分别合成cDNA，反应总体系为10μl，包括MgCI₂ 2μl，10X反转录缓冲液1μl，dNTPs混合物1μl，RNA酶抑制剂0.25μl，AMV反转录酶0.5μl，Oligo dT-引物0.5μl，RNA 4.8μl；然后取cDNA1μl在PCR仪中进行扩增，反应条件为94℃ 2分钟一个循环，94℃ 30秒，56℃ 30秒,72℃1分钟共30个循环，反应总体系为20μl，包括5X PCR缓冲液5μl，灭菌蒸馏水9.875μl，TaKaRa Ex Taq HS酶0.125μl，各对上、下游引物各1μl，内参β-actin上、下游引物各1μl，cDNA 1μl。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列下表。

目的基因PCR引物序列及扩增片段长度

3.Western blot验证STAT3、AFP蛋白表达的变化

（1）培养细胞蛋白提取步骤：取出培养细胞，弃去旧培养液，冰预冷PBS洗1次。加1×SDS上样缓冲液裂解细胞，用细胞刮子将细胞刮下来，并转移至Ep管中，保持在冰上。剪切DNA 10-15秒，降低样本粘滞度。95～100℃加热10分钟，冰上冷却，离心11000转/分钟4℃4分钟。吸取上清至0.5m lEp管中，-80℃保存。

（2）蛋白样品电泳步骤：先灌入约4ml的分离胶，凝固约30分钟；接着灌入约1ml的浓缩胶，凝固约20分钟。将胶板放入电泳槽中，加满电泳液。将蛋白样品加入到孔里，4℃90v电压电泳1.5～2小时。

（3）转膜步骤：PVDF膜处理：甲醇浸泡10秒，去离子水浸泡5分钟，1×转移缓冲液浸泡15分钟。（剪膜时戴手套，防止手上沾染的蛋白污染膜）。由负极到正极，按照三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸的顺序放好。（膜的大小≥滤纸的大小>胶的大小；各层之间不能出现气泡），4℃稳流50毫安转移12～14小时。

（4）抗体孵育步骤：转膜后用25ml TBS洗膜，室温5分钟。室温用封闭缓冲液孵育膜1h（摇床上摇）。25ml TBST洗膜3次×5分钟/次。一抗稀释液孵育膜轻微振荡4℃过夜。TBST洗膜3次×5分钟/次。HRP-标记的二抗稀释液（用封闭液稀释）室温孵育膜1h。TBST洗膜3次×5分钟/次。将滤膜放在瓶皿中，加入适量的新鲜配置的DAB底物溶液，5-15分钟即可显色，用水冲洗终止反应并照相。

4.细胞的增殖活性变化

（1）四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法测定细胞活力：

MTT可透过细胞膜，活细胞内的线粒体脱氢酶能将其转变为不溶于水的甲臜颗粒，用DMSO溶解此颗粒，检测吸光度，由于结晶形成的量与细胞数量及代谢活性成比例，吸光度的高低可反映活细胞的数量及活性。实验过程如下：用PBS配制5mg/ml的MTT溶液，过滤除菌，待用。按照1.5ｘ10⁴/孔，接种SMMC-7721细胞于96孔板中，每孔200μl培养液，置于37℃，5% CO₂培养箱培养24h；脂质体方法进行质粒DNA转染，转染方法如前所述。转染后放于培养箱继续培养，每实验组各设5个复孔，分别于24、48、72小时后进行MTT检测：加入20μl(5g/L)的MTT溶液，置于细胞培养箱继续孵育4小时；轻轻吸取并弃掉上层培养液，再在每孔中加入150μl的二甲基亚枫（DMSO）,室温下避光振荡15分钟；酶联免疫检测仪测定492nm的吸光度。

(2)ki-67细胞免疫化学法测定细胞增殖：

Ki-67是典型的与细胞周期相关的核蛋白，能有效地反映细胞增殖状态，被视为能较可靠地全面反映细胞群体增殖活性的客观指标。将对数生长期SMMC-7721细胞按照5×10⁵个/ml的细胞密度接种在已经铺有无菌盖玻片的六孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中各培养24、48和72小时后用镊子小心取出盖玻片，在室温下，采用ki-67细胞免疫化学法进行实验。

所构建质粒及生物活性的鉴定结果如下：

1．质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图2示，与Marker的条带比较可见质粒DNA位于4000-7000bp之间，已知构建好的质粒大小约为5.4kb。

2．质粒DNA酶切鉴定结果如图3示，质粒用HindIII+BamHI做酶切后，产物685bp和4.7kb的两条片段。

3.测序结果通过测序（图4）验证了插入序列与所构建的STAT3和AFP基因双shRNA表达框完全符合，说明成功构建了pGenesil1.5-STAT3-AFP。

4．转染率计算结果在转染后48h荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果显示以脂质体/质粒体比例为2：1时转染效果最好，且脂质体对细胞的毒性较小，为质粒和转染试剂的合适比例。

5．RT-PCR结果转染后48小时，RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示,各组均可见STAT3、AFP基因的特异性条带和内参β-actin条带,与空载体对照的条带比较可发现pG1.5-SA转染组STAT3、AFP基因条带亮度都有所减弱，抑制率分别为51.29%、26.71%，说明该质粒能够有效抑制肝癌细胞中STAT3、AFP基因的表达。

6．Western bloting检测pG1.5-SA质粒对STAT3、AFP蛋白表达水平的影响转染后48小时，提取各实验组细胞总蛋白，Western bloting检测，结果显示,与空载体对照的条带比较可发现pG1.5-SA转染组STAT3、AFP基因条带灰度值都有所减弱，抑制率分别为59.67%、40.98%，说明该质粒能够有效抑制肝癌细胞中STAT3、AFP蛋白的表达（见图6）。

7.细胞的增殖活性变化检测结果

（1）MTT法检测结果：转染后分别在24、48、72小时测定各孔A₄₉₂，5个复孔取平均值，计算抑制率，抑制率=（1-实验组A值平均值/对照组A值平均值）×100%，以时间为横轴，抑制率为纵轴绘制曲线（图7）。可见STAT3、AFP双靶标siRNA表达质粒（pG1.5-SA）转染组对SMMC-7721细胞增殖的抑制率显著高于单个基因的siRNA表达质粒（pGPU6-STAT3、pDonor Vector AFP）转染组。

（2）Ki-67细胞免疫化学法检测结果：转染pG1.5-SA组在24、48h ki-67荧光染色阳性细胞明显低于对照组（图8）。提示STAT3、AFP双靶标siRNA表达质粒转染能够显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖活性。这可能与双靶标siRNA能够同时干扰SMMC-7721的STAT3、AFP基因表达，该两个基因均有促进肿瘤细胞增殖的作用，因而产生叠加或协同作用，导致对SMMC-7721细胞增殖活性的抑制作用明显高于单基因RNA干扰组。

本发明的优良效果如下：

本发明针对恶性肿瘤中常见的两个异常高表达基因STAT3和AFP，选用经筛选、验证有效的RNAi靶序列，利用RNA干扰技术结合基因重组技术成功构建了由两个RNA聚合酶III启动子驱动的双靶标siRNA表达质粒，2个验证有效的RNAi序列干扰相应的目标基因，对肿瘤细胞产生了协同作用。通过在AFP阳性的肝癌细胞株SMMC-7721中表达，特异性地抑制了STAT3及AFP基因的表达，与单独抑制一种基因的shRNA表达质粒比较，以达到更加有效治疗AFP阳性肿瘤的目的。

1.本发明构建的STAT3和AFP基因双靶标siRNA真核表达质粒可同时有效抑制STAT3和AFP基因的表达。主要有如下优点：①本质粒可在大肠杆菌DH5α中大量扩增，即可不断获得表达siRNAs的质粒；②选用了经本实验室筛选并证实的，对STAT3和AFP基因抑制效率较高的靶位点；③安全性高，无插入突变危险，亦无免疫毒性反应。

2.本发明构建的特异性双靶标siRNA表达质粒针对STAT3和AFP基因，分别由独立的RNA聚合酶III启动子启动shRNA的表达，可避免互相干扰，以保证两基因的siRNA有效表达，对两基因的表达起到较显著的抑制效果。

3.本发明实现了将STAT3和AFP基因siRNA同时在一个质粒中表达，转染细胞后，可达到与单独转染单一基因的siRNA质粒相比较更为显著的抑制细胞增殖的作用。另一方面，为了达到同时干扰两个基因表达，双siRNA表达质粒比两个单一siRNA表达质粒共转染对细胞的毒性会更小，两基因表达的互相干扰会更小，可操作性更强。

本发明针对STAT3和AFP基因的双靶标siRNA表达质粒是可用于高表达STAT3的AFP阳性肿瘤的治疗物质，能显著抑制肿瘤细胞增殖。

附图说明

图1是pGenesil1.5-STAT3-AFP质粒物理图谱。

图2是质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图：①Marker(DL10000)；②pGenesil1.5-Stat3-AFP质粒

图3是酶切鉴定图：①Marker(DL2000)；②pGenesil1.5-Stat3-AFP HindIII/BamHI③pGenesil1.5-Stat3-AFP；④Marker(DL10000)。

图4是pGenesil1.5-Stat3-AFP质粒的插入片段基因测序图：A：STAT3-shRNA表达框测序图；B：AFP-shRNA表达框测序图。

图5是RT-PCR检测转染pGenesil1.5-Stat3-AFP 48小时后对SMMC-7721细胞Stat3、AFPmRNA表达的抑制作用，①空载体对照组；②pGenesil1.5-Stat3-AFP转染组。

图6是Western bloting检测转染pGenesil1.5-Stat3-AFP 48小时后对SMMC-7721细胞Stat3、AFP蛋白表达的抑制作用，①空载体对照组；②pGenesil1.5-Stat3-AFP转染组。

图7是MTT法测定转染不同质粒后对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用。

图8是ki-67细胞免疫化学法测定转染不同质粒后对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用。由左往右依次是：pGPU6-STAT3转染组、pDonor Vector AFP转染组、pGenesil1.5-Stat3-AFP转染组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不仅限于此。

一、主要试剂

1.载体pGenesil1.5购自武汉淅玛公司；

2.工程菌DH5α购自promega公司；

3.T4连接酶购于NEW ENGLAND公司；质粒的提取和纯化试剂盒（QIAprep Spin MiniprepKit）购自QIAGEN公司

4.PCR引物合成和DNA序列测定(南京金斯瑞生物科技有限公司)

5.转染试剂Lipofectamine 2000、TRizol Reagent购自Invitrogen公司

6.RT-PCR试剂盒RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0，限制性内切酶HindIII、BamHI,DNA Marker购自Takara公司

7.预染蛋白marker购于Fermentas公司；

8.MTT试剂购自sigma公司；

9.兔抗Ki-67抗体、FITC标记的山羊抗兔IgG抗体购自epitomics公司。

二、主要仪器

1．紫外分光光度计（GeneQuant Pro）：Amersham Biosciences；

2．凝胶成像系统（ChemilmagerTM 4400）：Alpha Innotech；

3．生物安全柜（Hfsafe1200）：上海力申科学仪器公司；

4．二氧化碳培养箱（HF90）：上海力申科学仪器公司；

5．荧光显微镜（ECLIPSE TE 2000-S）：Nikon；

6．CCD（penguin150CL）：美国pixera公司；

7．台式冷冻离心机（TGL-16G）：上海安亭科学仪器厂；

8．PCR仪（PE7300）：ABI公司；

9.全自动酶标仪（Model 680）：Bio-Rad公司。

三、质粒的制备方法及其生物学活性鉴定

①5'-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3'

②5'-CAGGGAGACATTCATGAAC-3'

所述的STAT3和AFP基因的RNAi靶序列的反向互补序列分别为：

5'-CCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3'和5'-GTTCATGAATGTCTCCCTG-3'；

STAT3、AFP基因shRNA表达框的loop序列分别为5'-GGCCGGCGCGC-3'和5'-CGCGCGCGGGCC-3'；

设计PCR引物，以包含H1和U6启动子的质粒XM-2P为模板，扩增H1和U6启动子序列，并在上下游引物中分别引入STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列及loop序列：

上游引物：P1-FW:5’-GGCCGGCGCGCCCAATGCAGGCAATCTGTTGCGGGAAAGAGTGATC-3’

下游引物：P1-RV:5’-CGCGCGCGGGCCGTTCATGAATGTCTCCCTGGGTGTTTCGTCCTTTC-3’

PCR反应体系：

2．STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框的构建

以上述步骤1中所得PCR产物为模板，设计PCR引物，在上下游引物中分别引入STAT3和AFP基因的干涉靶序列及HindIII、BamHI、RNA聚合酶III终止序列“AAAAA”：上游引物：P2-FW:5’-AGTAAGCTTAAAAA GCAACAGATTGCCTGCATTGG GGCCGGCGCGCCC-3’，下游引物：P2-RV:5’-ATGGATCCAAAAA CAGGGAGACATTCATGAAC CGCGCGCGGGCCGT-3’，反应体系：

经过两轮PCR，最终得到STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框，产物结构为：HindIII--shRNA1-H1启动子-U6启动子-shRNA2-BamHI。

将所构建的STAT3和AFP基因shRNA表达框和siRNA表达载体pGenesil1.5同时用HindIII、BamHI双酶切,分别产生插入片段和载体片段,然后进行连接,最后转化到DH5α大肠杆菌,经卡那霉素筛选,挑选单个菌落大量培养,用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；

连接反应体系：

4、转化

①取感受态细胞DH5α，冰上融化10分钟.

②加入连接产物5μl混匀，冰上放置30分钟,每隔5分钟轻轻摇动EP管。

③42℃水浴中放置30秒，勿晃动。迅速取出置于冰中，静置2分钟。

④加入250μl的37℃预热的LB培养基，37℃振摇（约225转）1小时左右。

⑤取不同体积菌液（50μl-200μl）涂布于含有卡那霉素（终浓度为30μg/ml）的LB平板上，37℃培养12-16小时。

5、阳性重组子小量扩增与分离纯化

①挑选上述含卡那霉素的LB平板中的单克隆菌落5个，各自接种在4ml含卡那霉素的LB培养液中，37℃振摇（约170转/分钟）14-16小时。

②每管取1ml菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司进行插入片段测序。另用甘油保存余下菌液，置-80℃保存备用。

③取出测序正确的菌种，划线接种在含卡那霉素的LB平板上，37℃孵育14-16小时。挑单个菌落接种在4ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇（约170转/分钟）14-16小时。

④质粒的小量提取：取3ml菌液按QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)说明书提取质粒。

a收集菌液与离心管中，室温下10000转/分钟离心5分钟;收集菌体，重悬于250μl的细胞悬浮液P1；

b加入250μl碱裂解液P2,盖紧管口,颠倒旋转离心管4-6次以混匀,室温静置5分钟;

c加入350μl缓冲液N3,立即温和颠倒离心管5-10次,室温下13000转/分钟离心10分钟;

d将上清液小心移入吸附柱，室温下10000转/分钟离心1分钟，倒掉收集管的液体，将吸附柱放于同一收集管中；

e在吸附柱中加入750μl洗涤液PE，室温10000转/分钟离心1分钟，倒掉收集管中液体，重复洗涤一遍；

f倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中。室温10000转/分钟离心1分钟，去除残留洗液；

g将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl洗脱液EB，静置1分钟，室温离心1分钟；

h质粒保存在－70℃

6、质粒DNA的鉴定

①琼脂凝胶电泳分析：配制1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭），取2μl质粒DNA进行电泳，检测提取的质粒DNA。

②应用限制性内切酶HindIII+BamHI做酶切鉴定。酶切体系如下：

37℃酶切2小时。

③紫外分光光度计分析：取1μl质粒DNA用69μl超纯水稀释，在自动紫外分光光度计下检测A260nm和A280nm处的吸光值，以测定质粒DNA的浓度和纯度。

7、肝癌细胞培养及质粒的转染 SMMC-7721细胞培养在含10％新生牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃，5％CO₂培养箱中。转染前24小时，将肿瘤细胞接种在6孔培养板上，每孔约5×10⁵个细胞，使每孔细胞饱和度在转染前达到90％以上，铺板时不使用含抗生素的培养液。种板后24小时，取质粒5μg加入250μlopti-MEM培养基，轻轻混匀，按Lipofectamine^TM 2000转染试剂（Invitrogen）说明书方法进行瞬时转染。剂量配比在其建议范围内选择设计，按照脂质体与质粒配比分五组，分别为空白对照组，4μl：2μg组,6μl：2μg组,8μl：4μg组,10μl:4μg组，分别制备脂质体/质粒转染复合物6孔板中加入500μl转染复合物，来回移动培养板，使转染复合物与细胞充分接触。于37℃培养6h后，补加新鲜的含10％新生牛血清的DMEM培养液，继续孵育。在转染后48小时于荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。

8、总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的半定量RT-PCR检测

（1）提取总RNA 取转染后的肝癌细胞SMMC-7721，用PBS漂洗2次，按10⁶－10⁷个细胞加1ml Trizol(Invitrogen)裂解细胞，裂解液转至1.5ml大小RNase-free(无RNA酶)的Ep管，加入200μl氯仿，剧烈振荡30秒，12000转/分4℃离心5分钟，小心取上清移至1.5ml大小RNase-free的Ep管,加入与上清等体积的异丙醇，室温放置5分钟后12000转/分4℃离心5分钟，小心弃上清，70％乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀2次，室温下自然晾干，用双蒸水(含1％DEPC)溶解，下续反应。

（2）cDNA的合成和PCR反应使用Takara公司的RT-PCR试剂盒，先按50℃ 30分钟，99℃5分钟,5℃ 5分钟的步骤分别合成cDNA，反应总体系为10μl，包括MgCl₂ 2μl，10X反转录缓冲液1μl，dNTPs混合物1μl，RNA酶抑制剂0.25μl，AMV反转录酶0.5μl，Oligo dT引物0.5μl，RNA 4.8μl；然后取cDNA 1μl在PCR仪（PE7300）中进行扩增，反应条件为94℃ 2分钟一个循环，94℃ 30秒，56℃ 30秒,72℃ 1分钟共30个循环，反应总体系为20μl，包括5X PCR缓冲液5μl，灭菌蒸馏水9.875μl，TaKaRa Ex Taq HS酶0.125μl，上、下游引物各1μl，内参β-actin上、下游引物各1μl，cDNA 1μl。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列下表。

目的基因PCR引物序列及扩增片段长度

9、Western bloting验证STAT3、AFP蛋白表达的变化

（1）培养细胞蛋白提取步骤：取出培养细胞，弃去旧培养液，冰预冷PBS洗1次。加1×SDS上样缓冲液裂解细胞，用细胞刮子将细胞刮下来，并转移至Ep管中，保持在冰上。剪切DNA 10-15秒，降低样本粘滞度。95～100℃加热10分钟，冰上冷却，4℃离心11000转/分钟，4分钟。吸取上清至0.5毫升Ep管中，-80℃保存。

（3）转膜步骤：PVDF膜处理：甲醇浸泡10秒，去离子水浸泡5分钟，1×转移缓冲液浸泡15分钟。剪膜时戴手套，防止手上沾染的蛋白污染膜。由负极到正极，按照三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸的顺序放好。膜的大小≥滤纸的大小>胶的大小；各层之间不能出现气泡，4℃稳流50毫安转移12～14小时。

（4）抗体孵育步骤：转膜后用25ml TBS洗膜，室温5分钟。室温用封闭缓冲液孵育膜1小时（摇床上摇）。25ml TBST洗液洗膜3次×5分钟/次。一抗稀释液孵育膜轻微振荡4℃过夜。TBST洗膜3次×5min/次。HRP-标记的二抗稀释液（用封闭液稀释）室温孵育膜1h。TBST洗膜3次×5min/次。将滤膜放在瓶皿中，加入适量的新鲜配置的DAB底物溶液，5-15分钟即可显色，用水冲洗终止反应并照相。

10、细胞的增殖活性变化检测

（1）MTT比色法测定细胞活力：

1)PBS配成5mg/ml的MTT溶液，0.22μl滤器过滤除菌。接种于培养瓶中的SMMC-7721细胞用含有10%新生牛血清的DMEM培养基，37℃，5%CO₂培养，隔日换液，待细胞长到80-90%时，PBS冲洗细胞两遍，再用胰蛋白酶消化细胞，按照1.5ｘ10⁴/孔，接种于96孔板中，每孔200μl，培养液中含有10%的新生牛血清，置于37℃，5% CO₂培养箱培养24小时；

2）次日，在96孔板中按照pGPU6-STAT3转染组、pDonor Vector AFP转染组、pGenesil1.5-Stat3-AFP转染组和pGenesil1.5空载组添加相应转染试剂混合物进行转染，转染方法如前所述。转染后放于培养箱继续培养，每实验组各设5个复孔，分别于转染后24、48、72小时后进行MTT检测；

3）各实验组按设计时间加入20μl的MTT溶液,置于细胞培养箱继续孵育4小时；

4）轻轻吸取并弃掉上层培养液，再在每孔中加入150μl的DMSO,室温下避光振荡15分钟；

5）酶联免疫检测仪上测定波长492nm光的吸光度（A)，计算各组增值率；

6）以上实验重复三次，取平均值。

（2）ki-67细胞免疫化学法

将SMMC-7721于对数生长期按照5×10⁵个/ml的细胞密度接种在已经铺有无菌盖玻片的六孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中各培养24、48和72小时后用镊子小心取出盖玻片，在室温下，采用ki-67细胞免疫化学法进行实验。步骤如下：

1）将盖玻片用镊子小心取出后，用TBST轻轻冲洗盖玻片两次，避免用力冲洗将细胞脱片；

2）将20%多聚甲醛滴于盖玻片上完全覆盖细胞以固定细胞20分钟；

3）用1ｘPBST小心冲洗细胞表面3次；

4）0.1%Triton-X100通透细胞5分钟；

5）用1ｘPBST洗液冲洗细胞两次。

6）将链接抗体用抗体稀释液稀释到合适浓度；

7）将抗体滴加到盖玻片的细胞上，室温避光孵育1小时；

8）用PBST洗液冲洗3次；

9）用DAPI荧光染料室温避光染色5分钟；

10）PBST冲洗细胞3次；

11）用中性树胶封片，避光保存。

四、结果

2．质粒DNA酶切鉴定结果如图3示，质粒用HindIII+BamHI酶切后，得到产物685bp和4.7kb的两条片段。

3.测序结果通过测序（图4）验证了插入序列与我们构建的STAT3和AFP基因双shRNA表达框完全符合，说明成功构建了pGenesil1.5-STAT3-AFP。

4．转染率计算结果在转染后48小时在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果显示以脂质体/质粒比例为2：1时转染效果最好，且脂质体对细胞的毒性较小，为质粒和转染试剂的合适比例（图略）。

7.细胞的增殖活性变化检测结果

Claims

1.抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒，其特征是，以pGenesil1.5为载体，利用双靶标siRNA技术，在一个shRNA表达质粒上引入针对STAT3和AFP基因有效的shRNA序列，每个序列有各自的启动子及终止信号且各自独立表达，在高表达的STAT3基因的AFP阳性肿瘤中发挥干扰作用,是用于表达STAT3基因的AFP阳性肿瘤的治疗性物质；

所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列分别为：①5'-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3' ，起始于956位；②5'-CAGGGAGACATTCATGAAC-3'，起始于508位；

所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列分别为：5'-CCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3'，5'-GTTCATGAATGTCTCCCTG-3'；

由以下方法制得：

（1） STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框的构建

上游引物：P1-FW: 5’-GGCCGGCGCGC CCAATGCAGGCAATCTGTTGC GGGAAAGAGTGATC-3’，

下游引物：P1-RV: 5’-CGCGCGCGGGCC GTTCATGAATGTCTCCCTG GGTGTTTCGTCCTTTC-3’；

b.第二轮PCR：以第一轮PCR为模板，设计PCR引物，在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列、RNA聚合酶III终止序列“AAAAA”及限制性内切酶HindIII 的酶切位点AAGCTT、BamHI的酶切位点GGATCC，为了便于酶切，在两个内切酶5’端添加了保护性碱基分别为“AGT”和“AT”：

上游引物：P2-FW: 5’- AGTAAGCTTAAAAA GCAACAGATTGCCTGCATTGG GGCCGGCGCGC CC -3’，

下游引物：P2-RV: 5’- ATGGATCCAAAAA CAGGGAGACATTCATGAAC CGCGCGCGGGCC GT -3’；

c.经过以上两轮PCR，得到STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框，产物结构为：HindIII- -shRNA1- H1启动子—U6启动子-shRNA2- BamHI；

（3）质粒的鉴定：将步骤（2）提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用限制性内切酶HindIII、BamHI做酶切鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片段测序，以确定STAT3和AFP基因shRNA表达框是否正确插入pGenesil1.5质粒中。

2.权利要求1的抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒在制备治疗表达STAT3的AFP阳性肿瘤的基因药物中的应用。