CN103255173A - 双启动子双表达特异性shRNA慢病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

一种双启动子双表达特异性shRNA慢病毒载体，包含核苷酸序列为SEQ ID NO:1的U6启动子和核苷酸序列为SEQ ID NO:2的H1启动子。经实验证实，该慢病毒载体能够同时表达出两种shRNA，可抑制vpr基因表达和/或下调tat基因的表达水平，可用于研制防治HIV感染药物。

Description

双启动子双表达特异性shRNA慢病毒载体及其应用

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种使用双启动子同时表达两种shRNA的重组慢病毒载体和穿梭质粒。本发明还涉及所述载体和穿梭质粒在制备防治HIV感染药物中的应用。

背景技术：

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

RNA干扰可以通用用化学合成的成熟的小的干扰RNA（small interfering RNAs，siRNA）去瞬时转染细胞，或者是通过将能够表达短发卡RNA（shRNA）的载体整合进入细胞，进行稳定表达。表达出来的shRNA包含两个短的反向重复序列（其中一个与目的基因互补），中间由一个loop序列分割，组成发夹结构，在体内shRNA可以在Dicer酶的作用下加工成为成熟siRNA，其干扰效果等同于siRNA。体外合成和质粒介导的RNA干扰持续时间较短，不适用于长期抑制基因表达。使用病毒载体来介导shRNA的表达可以达到长期稳定地抑制基因的表达。

慢病毒载体是一种新型基因转移载体，具有独特的特点，可高效地感染非分裂期的细胞，特别是造血系统来源细胞，具有稳定整合染色体并能够长期稳定表达、细胞毒性低、免疫反应小等特点，在基因治疗研究中展现出良好的应用的前景。

现如今，常规商品化的病毒载体只能单独表达出一种shRNA。单独的shRNA不足以完全干扰目的基因的表达。如果靶向的基因是RNA病毒基因，由于病毒基因容易发生变异，RNA干扰是序列高度特异性的，即使靶向基因中有一个碱基发生突变，就会严重影响siRNA的干扰效果。譬如，在RNA干扰技术应用于HIV的基因治疗中，由于HIV基因组具有很高的突变率，突变产生的病毒逃逸就成为siRNA治疗的一个潜在问题。

因此，如果能够同时表达出两个或者多个siRNA，针对于病毒基因的同一个基因或者不同的基因，将两个siRNA的干扰效果联合作用，不仅可以更加高效的干扰病毒基因和肿瘤癌基因的表达水平，而且可以降低病毒产生病毒逃逸株的出现，就可以解决上述问题。

发明内容：

本发明的目的是构建一种慢病毒载体，达到在同一载体中用两种启动子，可同时表达出两种shRNA，更加高效抑制靶向基因的表达，且能够同时靶向于两个不同的基因。

本发明选择的两种启动子是U6和H1启动子，它们都是RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达大小约21ntRNA和50ntRNA茎环结构（stem loop），且没有物种特异性，在所有的哺乳细胞中都能够启动高效表达。采用两种不同的启动子不仅可以同时高效地表达出两种shRNA，还可以有效地避免在载体整合进入到细胞过程中相同的启动子因为同源匹配引起的丢失交换等，更加稳定和安全。

本发明以plvx-shRNA2为骨架构建出同时表达出两种shRNA的慢病毒载体。

在构建shRNA双表达系统时，在多克隆位点引入含有BamHI、EcoRI、XbaI、XhoI四个限制性酶切位点的linker序列（图1），在限制性酶切位点EcoRI和XbaI之间插入H1启动子，形成PU6-BamHI-EcoRI-PH1-XbaI-XhoI（SEQ NO：3）。

在BamHI和EcoRI酶切位点可以插入一种表达shRNA的双链DNA寡核苷酸，（设计要求如oligo1，经过退火后可以形成两端带有BamHI和EcoRI粘性末端的双链寡核苷酸），通过U6启动子进行启动。在XbaI和XhoI酶切位点可以引入表达另外一种shRNA的双链寡核苷酸（设计要求见oligo2，经过退火后可以形成两端带有XbaI和XhoI粘性末端的双链寡核苷酸），由H1启动子进行启动。

Oligo1(+)：5’-gatcccc(siRNA序列)ttcaagaga(siRNA序列的反向互补序列)tttttg-3’

Oligo1(-)：5'-aattcaaaaa（siRNA序列）tctcttgaa（siRNA序列的反向互补序列）ggg-3'

Oligos2(+)：5’-ctagacc(siRNA序列)ttcaagaga(siRNA序列的反向互补序列)tttttc-3’

Oligos2(-)：5'-tcgagaaaaa（siRNA序列）tctcttgaa（siRNA序列的反向互补序列）ggt-3'

其中下划线_____部分为限制性酶切位点，可以形成粘性末端，+链中ttcaagaga和-链tctcttgaa为loop序列。

表1

本发明效果

本发明构建了能够同时表达出两种shRNA的慢病毒载体，在同一个载体中采用两种不同的启动子同时表达出两种shRNA，分别用U6启动子（P_U6，见序列1)和H1启动子（P_H1，，见序列2）驱动shRNA的表达，能够同时高效地表达出两种shRNA。两种shRNA可以针对于同一个基因，联合干扰该基因的表达，增强对该靶向基因的干扰效果，又可以同时靶向于两种基因，同时下调两种基因的表达水平。

本发明构建了能够稳定高效的双启动子表达双shRNA的慢病毒穿梭质粒，其特征是包含慢病毒载体包装信号Ψ、整合进入染色体所必须的元件LTR和利于细胞观察和筛选的荧光蛋白基因zsgreen，并且含有U6和H1两种不同的启动子。

在慢病毒穿梭质粒的基础上，构建了含有靶向于HIV-vpr基因和tat基因的两种shRNA的重组慢病毒穿梭质粒plvx-vpr-tatshRNA，U6启动子启动靶向于vpr基因的shRNA的表达，H1启动子启动靶向于tat基因的shRNA的表达。与能够表达出靶向基因的重组质粒共转染，realtime PCR结果显示，plvx-vpr-tatshRNA能够高效的表达出靶向于vpr基因的shRNA，对vpr基因的抑制率可以达到89.2%，而且能够高效表达出靶向于tat基因的shRNA，对tat基因的抑制率达到62%，对两种靶基因的抑制效果与单个表达shRNA的重组质粒对靶基因的抑制效率相当，证明了该表达系统通过U6启动子可以高效地启动一种shRNA的表达，通过H1启动子可以高效地表达出另外一种shRNA，且两种启动子之间没有存在相互抑制的情况，而且能够成功地包装成重组慢病毒。在HIV病毒包装质粒pNL4-3病毒包装时，plvx-vpr-tatshRNA较单独表达一种shRNA的重组质粒更好地抑制病毒包装的效率，证明双shRNA的表达的联合作用具有更好的干扰效果。

所述质粒由U6和H1启动子启动两种不同的shRNA的表达，引入两种shRNA，且能够包装成重组慢病毒，可用于制备防治HIV感染药物，感染靶向细胞，能够在细胞内长期稳定的表达，从而干扰同一基因或者是两个不同基因的表达。

两种不同启动子启动两种shRNA的表达与两个相同的启动子启动两种shRNA相比，可以有效地避免了在载体整合进入细胞染色体的过程中相同的启动子因为同源匹配引起的丢失交换等，更加稳定和安全。

附图说明：

图1为设计的linker序列示意图,其中

为BamHI的酶切后粘性末端，

可以同EcoRI的酶切粘性末端连接。

图2为plvxshRNA2质粒图谱

图3为质粒图谱示意图，其中A为构建的plvx-linker；B为plvx-DS；C为plvx-vprshRNA、plvx-tatshRNA；D为plvx-vpr-tatshRNA结构示意图

图4共转染实验shRNA对靶向基因的抑制效果A为不同表达质粒对vpr基因表达的抑制效率；B为不同质粒对tat基因表达的抑制效率

图5慢病毒感染293T细胞后荧光照片

具体实施方式:

以下所用的实验材料来源如下：

实施例1双启动子双表达shRNA慢病毒载体的构建

1.linker设计和合成

设计和合成了接头序列linker，正链linker(+)和负链linker(-)。正链linker(+)和负链linker(-)用双蒸水溶解成100mM的浓度，分别取2μL在50μL的反应体系中加热到90℃，常温下自然冷却退火。形成双链的寡核苷酸oligos，序列中含有BamHI、EcoRI、XbaI和XhoI四个酶切位点，并且顺序如下BamHI-EcoRI-XbaI-XhoI如（图1）

2.慢病毒载体plvx-shRNA2分析及处理

本发明中涉及到的重组慢病毒载体为plvx-shRNA2（图2）。序列分析表明，该载体内存在大量的酶切位点，其中包括XbaI和XhoI两个限制性酶切位点。设计的Linker中也存在XbaI和XhoI两个位点。需要对该载体中XbaI和XhoI进行敲除，采用定点突变试剂盒对该位点进行定点突变，去除掉XbaI和XhoI位点，经过测序鉴定，筛选到突变正确的克隆。且该载体中含有U6启动子，且其后具有BamHI和EcoRI限制性酶切位点。

3.plvx-linker慢病毒载体的构建

将退火成功的双链寡核苷酸与经过BamHI和EcoRI酶切过的线形的plvx-shRNA2在T4DNA连接酶的作用下16℃连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，酶切和测序鉴定成功地获得plvx-linker(图3)克隆，该载体中U6启动子后面的多克隆位点为BamHI-EcoRI-XbaI-XhoI。

4.plvx-dual shRNA双表达shRNA载体的构建

根据NCBI上H1启动子序列，合成出相应的单链DNA。以该单链DNA为模板，采用引物P_H1-F、P_H1-R扩增出两端带有EcoRI和XbaI的酶切位点的H1启动子，经过EcoRI和XbaI双酶切，与经过EcoRI和XbaI酶切处理的线形plvx-linker进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑去克隆，经过测序验证成功地获得plvx-dual shRNA(简写plvx-DS，见图3)。该载体具有PU6-BamHI-EcoRI-PH1-XbaI-XhoI结构（SEQ NO:3）。该载体中含有U6启动子和H1启动子，并且含有BamHI、EcoRI、XbaI和XhoI唯一限制性酶切位点，可以在BamHI和EcoRI插入一种shRNA，由U6启动子启动，在XbaI和XhoI两位点间插入另外一种shRNA，通过H1启动子进行启动，可以同时启动两种shRNA的表达。

实施例2靶向于HIV-1vpr和tat基因的双shRNA慢病毒载体的构建及对靶向基因的抑制研究

1.plvx-vpr-tatshRNA质粒构建

针对HIV-1NL4-3本实验室筛选到针对于vpr及tat的siRNA序列，设计出相对应的shRNA，vprshRNA和tatshRNA。分别与线性化的plvx-shRNA2连接形成能够单独表达一个shRNA的重组载体plvx-vprshRNA，plvx-tatshRNA。将vprshRNA插入到plvx-DS中BamHI和EcoRI位点，tatshRNA插入到XbaI和XhoI位点之间，形成plvx-vpr-tatshRNA（图3）。

2.共转染实验检测shRNA抑制效率

293T细胞按3×10⁵个细胞/孔接入6孔细胞培养板，待细胞密度达到80～85%，将plvx-vprshRNA、plvx-vpr-tatshRNA（1μg）与含有靶基因的重组质粒pEGFP-vpr（1μg），plvx-tatshRNA、plvx-vpr-tatshRNA（1μg）与含有tat靶基因的重组质粒pDsRed-tat（1μg），用FuGene HD共转染293T细胞。

定量PCR检测vpr及tat基因的表达丰度：Trizol提取细胞总RNA，逆转录成cDNA。SYBR green荧光定量PCR技术检测分别检测出vpr及tat的表达丰度，vpr和tat及内参基因18s引物见序列表。PCR反应条件：95℃2min；60℃30s，40个循环，反应完成后，得出Ct值，根据内参基因，计算出vpr及tat基因的表达情况，从而计算出慢病毒载体表达出来的shRNA对靶向基因的抑制效率。

结果表明（见图4），plvx-vprshRNA在共转染时对靶基因vpr可以达到88.8%的抑制率，plvx-tatshRNA对tat的抑制率可以达到60.6%,同时表达靶向于vpr及tat的shRNA的plvx-vpr-tatshRNA对vpr的抑制率可以达到89.2%，对tat可以达到62.0%，表明重组载体不仅能够高效地表达出靶向于vpr的shRNA，而且能够高效地表达出靶向于tat的shRNA，能够高效地抑制vpr基因的表达，也能够抑制tat基因的表达，对靶基因的抑制效果与单个表达shRNA的重组质粒对靶基因的抑制效率相当。

将plvx-tatshRNA、plvx-vprshRNA及plvx-vpr-tatshRNA与HIV毒株NL4-3的包装质粒pNL4-3共转染293T细胞后，P24定量试剂盒对上清中的病毒HIV NL4-3进行定量分析结果如图。结果分析表明，vprshRNA、tatshRNA对NL4-3病毒的包装分别可以达到98.51%和48.83%,同时含有vprshRNA和tatshRNA的重组慢病毒对病毒的包装抑制率可以达到99.05%，比单个shRNA的抑制效率都要高。说明两种shRNA的联合作用可以更加高效地抑制HIV病毒包装。

3.plvx-vpr-tatshRNA重组慢病毒包装

提取高质量无内毒素的plvx-vpr-tatshRNA7μg与包装骨架质粒18μg用FuGeneHD共转染293T-X细胞，6hours后换液，72h收集细胞上清。用P24定量试剂盒对上清液中的慢病毒载体滴度进行测定。以MOI为10去感染293T细胞，荧光显微镜观察细胞内荧光表达情况。

结果：在上清中病毒滴度可以达到2×10⁶，这表明采用双启动子表达双shRNA能够包装出慢病毒，对慢病毒载体的包装没有影响。293T细胞经过慢病毒感染24h后荧光照片（图5）。

Claims (8)

1.一种能够同时表达出两种shRNA的慢病毒载体，其特征为包含核苷酸序列为SEQID NO:1的U6启动子和核苷酸序列为SEQ ID NO:2的H1启动子。

2.权利要求1所述的慢病毒载体，其特征为包含SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的双启动子区。

3.权利要求1或2所述的慢病毒载体，其特征为：

1）U6启动子启动的shRNA引入酶切位点为BamHI和EcoRI，分别位于SEQ ID NO:3中253-258位和262-267位；

2）H1启动子启动的shRNA引入酶切位点为XbaI和XhoI，分别位于SEQ ID NO:3中483-488位和SEQ ID NO:3中492-497位。

4.权利要求3所述的慢病毒载体，其特征为：

1）在BamHI和EcoRI酶切位点插入了表达shRNA的双链DNA寡核苷酸，其正向序列和反向序列如oligo1(+)和oligo1(-)所示，退火后两段形成BamHI和EcoRI酶切粘性末端，通过U6启动子进行启动；

2）在XbaI和XhoI酶切位点插入了表达另外一种shRNA的双链寡核苷酸，其正向序列和反向序列如oligo2(+)和oligo2(-)所示，退火后两段形成XbaI和XhoI酶切粘性末端，由H1启动子进行启动；

所述Oligo1(+)序列是5’-gatcccc—N¹—ttcaagaga—M¹—tttttg-3’，其中N¹是长度为19～22bp的siRNA序列，M¹是N¹的反向互补序列；

所述Oligo1(-)5'-aattcaaaaa—N²—tctcttgaa—M²—ggg-3'，其中N²是长度为19～22bp的siRNA序列，M²是N²的反向互补序列；

所述Oligo2(+)5’-ctagacc—N³—ttcaagaga—M³—tttttc-3’，其中N³是长度为19～22bp的siRNA序列，M³是N³的反向互补序列；

所述Oligo2(-)5'-tcgagaaaaa—N⁴—tctcttgaa—M⁴—ggt-3'，其中N⁴是长度为19～22bp的siRNA序列，M⁴是N⁴的反向互补序列。

5.一种同时表达靶向HIV病毒中vpr基因和tat基因的慢病毒载体，其特征是包含SEQID NO:4～SEQ ID NO:7所示的shRNA。

6.权利要求1或5所述慢病毒载体在研制防治HIV感染药物中的应用。

7.权利要求6所述的应用，所述防治HIV感染药物是抑制vpr基因表达和/或下调tat基因的表达水平的药物。

8.一种构建shRNA双表达慢病毒表达质粒的方法，在多克隆位点引入含有BamHI-EcoRI-XbaI-XhoI的寡核苷酸序列；且在限制性酶切位点EcoRI和XbaI之间插入SEQ ID NO:2所示序列的H1启动子，形成SEQ ID NO：3所示序列的双启动子区；

所述BamHI、EcoRI、XbaI和XhoI如权利要求3所示；

所述BamHI-EcoRI-XbaI-XhoI的序列为5’-GGATTC GAATTC TCTAGA CTCGAG-3’。

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