[go: up one dir, main page]

HU228488B1 - Gcsf conjugates - Google Patents

Gcsf conjugates Download PDF

Info

Publication number
HU228488B1
HU228488B1 HU0203652A HUP0203652A HU228488B1 HU 228488 B1 HU228488 B1 HU 228488B1 HU 0203652 A HU0203652 A HU 0203652A HU P0203652 A HUP0203652 A HU P0203652A HU 228488 B1 HU228488 B1 HU 228488B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
conjugate
conjugates
gcsf
peg
integer
Prior art date
Application number
HU0203652A
Other languages
English (en)
Inventor
Pascal Sebastian Bailon
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of HUP0203652A2 publication Critical patent/HUP0203652A2/hu
Publication of HUP0203652A3 publication Critical patent/HUP0203652A3/hu
Publication of HU228488B1 publication Critical patent/HU228488B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

A Granuiocita Koiőnia-Stimuláió Faktor (GCSF) egy győgyászatitíiag aktív fehérje, amely a proiiferáciőt, a differenciácíőt, és neufrofíl granulociták funkcionális aktiválását szabályozna [Metealf, Biood 67, 257, old, (1986)/ Yan és mtsai., Biood 84, 795-799. old, (1994)/ Bensínger és mtsai., Biood 81, 3-158—3163. old. (1993)? Róbert s és mtsai., Expt# 1 Bematclogy 22, 1156-1163.. old. (1994); Neben és mtsai., Biood «1, 1960-1967. old. (1993)]. A GCS.F képes mobilizálni a? őssejteket („stem cells) és prekurzor sejteket a osont velőből, és olyan, betegek kezelésére aikaimatrák, akiknek a granuiocitáit kemoterápia kimerítette, vagy a osontvelő-átültetést megelőző lépesként,
Az 5 214 132, számú amerikai, egyesült államokbeli szabadalmi irat .feltár egy humán GCSF-muteínt (mutáns protein), amely a hGCSF-töl at 1, 3, 4, 5 és 17. aminosavhelyeken különbözik, ahol a natív GCSF amínosavai helyett a mutein sorrendben Alá, Thr, Tyr, Arg és Ser aminosava.kat tartalmaz (lásd még Kuga és mtsai., Bioehem. Siophys. Rés. Commun. 159, 103-111, old. (19891). Oka.be és mtsai. (Slood 75, 1788-1793. old (1990)3 beszámoltak at rhGCSF egy származékáról, amelyben az rhGCSF ^-terminális régiójában 5 helyen helyettesítettek aminosavakst, és amely magasabb specifikus aktivitást mutatott, mint az intakt rhGCSF egér és/vagy ember csontvelő őssejtekben két vizsgálati eijáráAktas zámunk: 95038-4 44 0/FT χν* * * * ** * ** ♦ óéban. Az 5 218 092. számú amerikai egyesüli államokbeli szabadalmi Irat feltár egy hámén GCSF muteint, amely a hGCSF-tőI az 1, 3, 4, 5, 17, 115 és 147. aminosavhelyekan különbözik, ahol a natív GCSF aminosavai helyett a mutein sorrendben Alá, Thr, Tyr, Arg, Ser, Asn és Ser amínosavakat tartalmaz. Az 5 214 132. és 5 218 092. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat tartalma hivatkozás útján
A fehérjetermészetű gyógyászati anyagok, mint például a GCSF biológiai elérhetősége gyakran korlátozott a plazmában való rövid féleletidő és a proteázos: lebontásra való érzékenység miatt, meggátolva a maximális klinikai hatásosságot. Egyéb terápiás fehérjék vizsgálatai kimutatták, hogy az ilyen nehézségeken felül lehet kerekedni a fehérjék polimerhez, mint például polietfléngiikoihoz (PEG) való konjugálásával, általában egy kapcsoló molekulán keresztül, amely kovalensen kötött mind a fehérjéhez, mind a PEG-hez.
Ilyen PEG-gel konjugáit .bíomolekulákről kimutatták, hogy klinikailag hasznos tulajdonságokkal rendelkeznek (Inada és mtsai., J, Bioact. and Compatible Foiymers 5, 343. old. (1990); Delgado és mtsai., Criticai Reviews ín T'herapeutic Drug Carrier Systems 9, 249. old. (1992); és Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10, 91. old. (1993)1. Ezek között van a jobb fizikai és hőmérsékleti stabilitás, enzimes lebomlásra való érzékenység elleni védelem, megnövelt oldhatóság, hosszabb in vivő keringési féléletidő és csökkent kiürülés, csökkent immunogenitás és antigén!tás, és csök ke n fc toxi-citás.
> y y y ♦ ♦ » ** X Φ* * ♦
imtö 1 eltérő szerkezetű
a z EP ö 335 423. számú
401 334. szá; mi európai
(3. Controll· ed Eelease
ake- Ishíkawa és mtsai.
32, 177-189. old (1994)J, és S [Cell Structure and Eunctíon 17, 157-160. old (1992)).
A találmány tárgyát ennek megfelelően GCSF PEG-szármasokainak új osztálya Képezi. A találmány szerinti fconjugátum amid kapcsolómolekulát tartalmaz, mint ahogy as alábbiakban feltárjuk.
A módosítatlan GCSF-hez (azaz PEG'~et nem tartalmazó GCSF-hez) hasonlítva a ko-n jugá tűm megnövekedett keringési féléiétidővei és plazma tartózkodási idővel, csökkent kiürüléssel, és megnövekedett in vívó granulopoietikus aktivitással rendelkezik. Ezenfelül PEG-GCSF konjugátumokkal összehasonlítva a találmány szerinti korjugétumnak kiváló a granulopoietikus aktivitása. Más PEG-GCSF konjugátumokat tár fal az SP 0 335 423. számú európai közzétételi irat, az EP 0 401 334. számú európai közzétételi irat, Miven és mtsai., mint fent. Azonban a találmány szerinti konjugátum szerkezete eltér ezektől a konjugátumoktől, és kiváló tula jdonságokkai rendelkezik, különösen hosszan tartó, magas granulopoietikus aktivitást mutat in vivő alacsony adagolás me1lett.
A találmány szerinti előnyös GCSF GCSF-mutein, amelynek tulajdonságai egyenértékűek, vagy jobbak a natív GCSFhez képest, és azonosak az alkalmazásai. A muteinnék megegyezik az aminosav-szekvenciája a nativ GCSF-fei, kivéve «
φφ« φ* > ·*« ** * * az 1, 3, 4, 5 és 17. aminosavhelyeket, ahol a natív GCS1 aminosavai helyett a műtőin sorrendben Alá, Thr,. Tyr, Arg és Ser aminosavakat tartalmaz (GCSF-mutein, 1. ábra). Ezt a muteínt az 5 214 132, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi írat tárja fel, amely hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
A találmány szerinti fiziológiásán aktív GCSF-konjugátum szerkezetét az I, általános képlettel adjuk meg, 0 ] 2CH2O)nCH2CHrC~NH
-G
A találmány tárgyát képezik az igényelt kenjugátárnokát tartalmazó készítmények is, ahol iá és n értéke különböző egész szám lehet a kész!menyben lévő konju-gátűrne-kban.
A találmány szerinti konjugátum alkalmazásai megegyeznek a GCSF-élvel. A találmány szerinti konjugátum előnyösen alkalmas olyan betegek kezelésére, akiknek a granulocitáit kemoterápia kimerítette, vagy csontvelő-átültetést megelőző lépésként, ugyanolyan módon, mint ahogyan a GCSF-t alkalmazzák ezen állapotok kezelésére. Azonban a találmány szerinti konjugátum javított tulajdonságokkal rendelkezik, köztük kiváló stabilitás, nagyobb oldhatóság, megnövelt keringési féiéletídö és plazmában való tartózkodási idő.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat:
Az 1. ábrán a GCSF-mutein elsődleges szerkezetét mutatjuk be. A bemutatott GCSF-mutein a vad tíousű ember
GCSF-től az 1, 3, és 17. aminosavheiyeken különbözik, * X ahol a natív GCSE aminosavai helyett a mutein sorrendben Alá, Thr# Tyr# Arg és Ser sminosavakat tartalmaz,
A 2, ábrán pegiiáló reagenseket mutatunk be.
A 3, ábrán 20 kDa molekulatömegű PEG-gel módosított és· módosítatlan GCSF-muteín elválasztását mutatjuk be egy tipikus PEG-reakcióelegy elúciös profiljával.
Oszlop: 1-2 ml Fractogei’9 M) 5£A 65£?£
Ekviiibráciős puffér: 10 mM ammőnium-acetát# pH « 4#5
1. elűclós- puffét: 0# 15 M NaCl ekviiibráciős pufferben
2. elűcíós puf.fér: ö,5 M NaCl ekviiibráciős pufferben.
A 4. ábrán PEG-GCSF konjugátum aktivitását mutatjuk be nappal egyetlen injektálás után. Nőstény C57BL/6J egereket szubkután oltottunk 25,2 ug pegilált GCSF-konjugátummal; a beadást követő ötödik napon vénás vérmintát vettünk a retroorbitális· szinuszból, Coulter hematológiai és laukooita differenciális elemzéseket hajtottunk végre; a kapott neutrofi számot standardizáltuk minden kísérletben. Csoportonként 4 egér adatainak átlag z szórását mutatjuk be.
Az 5. ábrán a PMh-szám növekedését mutatjuk be a PEG tömegének (MW# kDa-banj függvényében amid-'és urea-kapcsolt GCSE-mutein-PSG konjugátumokban. SPA reagenssel készített konj'ugátumokra# PMIHO, 277MN+3# 95. Urea reagenssel készített konjugátumokra# ΡΜΝ-Ό,. 152HW+2# 74 .
A 6. ábrán PEG-GCSF korrjugátum aktivitását mutatjuk be 7 nappal egyetlen injektálás után. Nőstény C57BL/6J egereket szubkntán oltottunk 25#2: pg pegilált GCSF-konjugátűmmel; a beadást kővető hetedik napon, vérmintát vettünk a vénás retroorbitális szinuszból. Coulter hematológiai és leu> ** » *kocita differenciális elemzéseket hajtottunk végre; a kapott neutrofil~s.zámot standardizáltuk minden kísérletben.
Csoport ónként 4 < egér adata inak átlag ± szórása
be.
7. ábrán egér P3SC-- kolonía-mobilízáciös
eljárás t mutatunk be,
8< ábrán egér PBSC~ ko r on t a—mobr r rzác r0 s
eljárás t mutatunk be.
A :3. ábrán egér P8SC- kolónia-mobilizációs
& j. j .3 r á s t mutatunk be,
& Zl. .10. ábrán egér RBSC- ko1ön i a x zác χ o s
3 .1 j 3X‘3 3 t mutatunk be.
£ 11. ábrán egér PBSC- kolonía-mobilízáciös
eljárás t mutatunk be.
igényelt ta lálmány fiziológiásán sk:
út. ZS á i .3t konjugátam, amelynek szerkezetét az adjuk meg.
caláno-s képlettel
HC-H2CH2O)nCH2CH.rC-NH ~-G értéke egész szám ahol G jelentése granulocita kolónia-stímuláló faktor mínusz azok az amino-csöportok, amelyek részt vesznek az amid-kötések kialakításában et polietilénglikol-molekulákkal az I. általános képlettel megadott módon, R jelentése kis altii-csoport, n értéke egész szám 420 és 550 között, és m és S között.
φφ φ *
ΦΦ
Αχ η és m számokat úgy választjuk meg, hogy a kapott, 1«. általános képlet szerinti konjugátum fiziológiás aktivitása a módositatlan GCSF-ével összemérhető legyen, amely aktivitás ugyanakkora, több, vagy törtrészét képviselheti a módosítatlan GG5E megfelelő- aktivitásának. n jelentése az etilén-oxid maradékok száma a PEG—egységben. Egyetlen OCHvCrb PEG-alegység molekulatömege körülbelül 44 Daiton. m jelentése a GCSF-molekulához kapcsolt PEG-egységek száma. A találmány szerinti konjugátum egy, kettő, három., négy, öt vagy hat PEG-egységet tartalmazhat GüSF-moleknlénként. Ezáltal a konjugátum molekulatömege (a SCSF molekulatömegén kívül) n és m értékétől függ.
n érteke 420 és S5Ö között lehet, olyan konjugátumot eredményezve, amelyben minden egyes PEG-egység átlagos molekulatömege körülbelül 18 kDa-tóI körülbelül 25 kDa-ig terjedhet. Előnyösen n értéke 450 és 490 között van, olyan konjugátumot eredményezve, amelyben minden egyes PEG-egység átlagos molekulatömege körülbelül 20 kPa. m értéke 1, 2, 3, vagy 5 lehet. Előnyös érték 1-4, és m különösen előnyös értéke 2. A találmány szerinti konjugátűm PEG részének molekulatömeg tartománya körülbelül 18 kDa-tői (n«4.20, m-1) körülbelül 125 kDa-ig (η~550, m-5) terjed. Amikor n értéke
420 és 5 5 0 ks ázott van, és m értéke egész szám 1 és 4 kö-
zött, a talál mány szerinti konjugátűm PEG részének mól e ke
la tömeg tartó mánya körűibe] ..ül 18 kDa-töl !n~42Ü, m::=l) kő-
rüibelü.' ). 97 i kDa-ig (n~5-S0, m-4) terjed. Egy „körűibe iül
adott érték alatt azt értjük, hogy az az adott szám ésszerű *** ♦ * * 5' Λ < 4 * * * * /»>( ** * * tartományán belül van hagyományos analitikai, módszerekkel
van. és m értéke
nek r iolekulatöme
m~li körülbelül
előny ös magva lö-s
zött van, és m é;
s z éne k molekula
(n~42 0j körüibel-
e 1 dny ös konjugáti
érték: e 2, amely <
tömeg tartománya
Sgy előnyös konjugátumban n értéke 450 és 490 között ír értéke 1-4, amely esetben a konjngátum PEG részé;kulatömeg tartománya körülbelül 20 kba-töl (n~4S0, rülbeiül 86 kDa-íg (n-490, m~4j terjed. Egy másik megvalősitási mód szerint n értéke 420 és 550 kő, és m értéke 2, amely esetben a kenjugátum PEG rémolekulatömeg tartománya körülbelül 37 kDa-töl körülbelül 48 kDa-ig (n-550) terjed. Egy különösen konjugátumban n értéke 450 és 490 között van, és m , amely esetben a konjngátum PEG részének molekula.rtománya körülbelül 40: kDa-töl (n-lSO) körülbelül 43 kDa-íg (n-490) terjed.
E jelentése lehet kis alkil-csoport,- ami alatt olyan alki1-esoportot értünk, amely 1-6 szénatomot tartalmaz, mint például, metil, etil, izopropil, stb. Elágazó .alkilcsoportok is ideértendők. Egy előnyös aikii-csoport a metil-csoport.
GCSF alatt a természetes vagy rekombináns fehérjét értjük, előnyösen emberit, amelyet bármilyen hagyományos forrásból, mint például szövetekből, fehérje-szintézisből, természetes vagy rekombináns sejtek sejttenyészetéből nyerünk. Bármilyen GCSF aktivitású fehérje, mint például műtérnek vagy másképpen módosított fehérjék Ideértendők. GCSF kinyerése ás izolálása természetes vagy rekomtoináns forrásból jól ismert (lásd például a 4 810 543. és 5 532 341. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi
A ♦
iratokat./ .aaelyak hivatkozás ttján a kitanitás részét képezik)· . Előnyös GCSF-konjugátum az 5 214 132. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat szerinti GCSFmnteinnei való fcorjugátum.
Az 1. általános képlettel megadott fiziológiásán aktív konjugátumnak van GCSF aktivitása# ami alatt bármilyen ismert GCSF aktivitásnak bármilyen töredékét vagy többszörösét értjük# a szakirodalomban ismert különféle vizsgálati eljárások szerint meghatározva, A találmány szerinti konjagátamnak előnyösen olyan GCSF aktivitása van# amit a PMNszám növelésére való képesség mutat. Ez a GCSF egy ismert aktivitása. A konjugátum ilyen aktivitását a szakirodalomban jól ismert vizsgálati eljárásokkal határozhatjuk meg# például az alább bemutatottakkal flásd még: Asano és mtsai.# Jen. Pharmacol. Ther, 19# 2767-2773. old, (1991); Yamasaki és mtsai., J. Biochem. 115# 814-819. old. (1994); és Neben és mtsai,, Blood 81, 1960. old. (1993)).
Az 1. általános képlettel megadott konjugátumot a GCSF kovalens kapcsolásával készítjük a 11, általános képlettel megadott szukcínimidi1-propíonsav (SPA) reagenssel.
A 11. általános képlettel megadott reagenst hagyományos módszerekkel állíthatjuk elé# ismert eljárásokkal (lásd az 5 672 662, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot, amelynek tartalma hivatkozás útján a. kitanítás részét képezi) , n jelentése ugyanaz, mint ami. az I. általános képletben fent, és a kívánt moleku.lat.ömegű konjugátum készítéséhez megfelelően választjuk meg. Azon reagensek előnyösek, amelyekben n értéke 950 és 490 között van (Mtk::20 kDa), Más molekula tömegek is elérhetők, a II, általános képlettel megadott reagens kiindulási anyagaként alkalmazott FEG-aikohol n értékének hagyományos módszerekkel történő változtatásával. A. II, általános képlettel mega cio’
5FA reagens S, 10, 15 és 20 kDa molekulatömeggel b szerezhető a Shearwatar Folymers Inc,-tői (Hnnts-vílle, Alabama). A II, általános képlettel megadott reagenst hagyományos eljárásokkal konjágálhatjuk GCSF-hez. A kapcsolás amid-kötésen keresztül történik. Közelebbről, a II, általános képlettel megadott reagens elsősorban a GCSF egy vagy több primer amino-csoportjavai {például N-terminális és lizín-oldallánooki reagál, amid-kötést képezve a GCSF és a PEG polimergerince között. Az I, általános képletben szereplő EH-csoporfc a GCSF ezen primer amino-csoportjalnak a származéka, amelyek a II, általános képlettel megadott reagenssel reagálnak amid-csoportot képezve. A II. általános képlettel megadott reagens kisebb mértékben reagálhat a GCSF 66. amino savhelyén. lévő szerin-oldallánc hidroxilcsoportjával is, észter-kötést képezve a GCSF és a FEG polimergerince között. A reakciókörülmények hagyományosak a szakember számára, és az alábbiakban részletesen megadjuk azokat.
A reagens GCSF-hez való kapcsolását hagyományos eljárásokkal valósíthatjuk meg. Bármilyen kiválasztott molekulatömegü, találmány szerinti PSG-et alkalmazhatunk (n) . A reakciót például oldatban hajthatjuk végre# pH 5 és 10 közötti 4°€ és szobahőmérséklet között, 30 perc és 20 óra közötti időtartamban# 4:1 és 30:1 közötti reagens·: fehérje mólarányt alkalmazva.. A reakció·-körülményeket úgy választhatjuk meg# hogy a reakció elsősorban a kívánt mértékű helyettesítést eredményezze. Általában az alacsony hőmérséklet# alacsony pH (például pH 3)# és rövid reakcióidő a kapcsolt FHG-ek számának csökkentésére irányul (kisebb m). Magas hőmérséklet, semleges vagy magas pH (például pHk7j , és hosszabb reakcióidő a kapcsolt PEG-ek számát növeli (nagyobb m) .. Például az 5 kDa-os TI. általános képlettel megadott reagens pH ·- 7# 3-on és 30:1 reagens: fehérje arány mellett# 4ŐG~on és 30 perc reakcióidő alatt elsősorban mnno-PEG konjugátumot eredményezett#* 4'°C-os. hőmérséklet és 4 óra reakcióidő elsősorban di-PE'G konjugátumot eredményezett; és szobahőmérséklet és 4 óra reakcióidő elsősorban tri-PSG konjugátumot eredményezett. A reakciót a reakcióelegy savanyításával és -20*C-ö.n való lefagyasztással állítjuk le, Általában 7 és 7#5 közötti pH és 4:1 és 6:1 közötti mólarány előnyös.
Tisztítási eljárások# mint például kat.ioncserélö kromatográtla alkalmazhatók a fconjugátumok töltéskülönbség szerinti elválasztására# ami hatásosan elválasztja a konjugátumokat különböző molekulatömegük szerint. Például a mintát reivihetjük kationcserélő oszlopra, és azután mosX ♦ Φ J ♦ ♦ φ « # φ. « « * φ φ φ X Φ Φ X- 9 «♦» «-» ·*φ φ hatjuk körülbelül 20 mH nátrium-acefcáttal, pH~4, és azután elvárhatjuk NaCl (0,5 H) lineáris puffereit gradiensével, pH 3,5-5 között., előnyösen pH·--·4, 5-ön. A kát Ioncserélő kxomatográ.fiával kapott frakciók tartalmát molekulatömeg alapján azonosíthatjuk hagyományos eljárások alkalmazásával, mint például tömegspektroszkópiával, SDS-PAGE-val, vagy más, molekulák molekulatömeg szerinti elválasztására ismert eljárásokkal. Ezután megfelelő módon azonosítjuk az I. általános képlettel megadott konjugátumot tartalmazó frakciót a kívánt számú (m) kapcsolt PEG~geI, megtisztítjuk a módosítatlan GCSE-tői és más számú PSG~et tartalmazó konjugátnmok tói .
A találmány tárgyát képezik különböző m értékű konjugátumokat specifikus arányban tartalmazó készítmények is. A találmány szerinti előnyös készítmény konjugátnmok keveréke, ahol m=l., 2, 3 és 4. Azon konjugátumok aránya, ahol m-1, 18-25%, azon. konjugátnmok aránya, ahol m-2, 50-66%, azon konjugátnmok aránya, ahol m-3, 12-16%, és azon konjags túrnők aránya, ahol m-4, 5%-ig terjed. Ilyen készítményt a pegílálö reagens és GCSE 4-6:1 arányú (reagens-felesleg) reagál tatásával készítünk. A reakciót 4-8°C-on 20 órán -át
7,5 körüli pH-η engedjük folyni, A reakció végén ecetsavat adunk a reakcióelegyhez-. Ezután a konjugátumot megtisztítjuk a megmaradt módosítatlan GCSF-tőI, a oegiialó reagens feleslegétől és a reakció alatt jelenlévő egyéb szennyezésektől és pufferkomponensektől. A pegiiált fehérje mellett H-hidroxiszukcinimíd és poiietiiéngiikol-karboxilsav keletkezik melléktermékként,
X χχ « »
Az alábbi példák a feltárt találmány illusztrálását szolgálják, és nem korlátozzák azt semmilyen módon, Etekben a példákban GCSF-muteint alkalmazunk. GCSF más fajtái szintén konjuoálhatök PEG-gél a szemléltetett eljárásokkal.
1. példa
Pegr1ál6 reagensek:
I. GABA amid-kapcsaló-molekula ÍP-6GA-1, P-12GA-1): A GABA-amid-kapcsoló reagensek 2 PEG szálat tartalmaznak, akár 6, akár 12 kPa molekulatömeggel. A szerkezetüket a 2-A ábrán mutatjuk be.
, Aadd-k ap c s ο 1 ó -mo 1 ekuIa (P-Sam-l, P~löam~I ): S és lö kDa-os amid-kapcsoló-molekulákat állítottunk elő. A szerkezetüket a 2-B ábrán mutatjuk be.
3, And d~kapcsoló-molekula: Éten reagens kereskedelmi, forgalomban kapható szukcínimidil-prcpionsav (SPA) 5, 10, 15 és 20 kDa-os PEG~molekülákkai készítve, és az általános szerkezetüket a 2-C ábrán mutatjuk be,
8, Urea-kapcsoló-molekula: Szén reagenst 5, 10 és 25 kDa-os PEG-mo.Iekulákkal készítettük el,és .tipikus, szerkezetüket a 2-D ábrán mutatjuk be.
5. üretán-kapcsoló^molekula: lö és 20 kDa-os uret.ánkapcsoló-molekulát készítettünk, és a szerkezetüket a 2-E ábrán mutatjuk be,
6, d r e tán - kapc s ο 1 ó - mo 1 e ku 1 a ΐ Mint .ahogy a 2-G ábrán bemutatott, 36 kDa-os kereskedelmi forgalomban kapható reagens szerkezete mutatja, a PEG-reagens egyik végén t~buti.l.~ « « «
-*»««* « V fi
X ♦ * « * X ** »·♦.*< *♦« * csoport található. Ezen reagensnek volt a legnagyobb a példában alkalmazott PEG-ek között a molekulatömege.
?. Tlouretán-kapcsoló-molekula: Ezen pegiláiő reagens szerkezetét a 2-E ábrán mutatjuk be. A reagensben alkalmazott PPG molekulatömege 20 kDa volt.
Az alábbi reagenseket a Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd, {Tokyo# Japan) biztosította: G-CSF métáin, GCSE-muteinnek jelölve. A GCSE-mutein elágazó- metoxi-poiíetilénglíkol (mPEGj reagenssel volt konjugálva, amely reagens két# β vagy 12 kDa-os m-PEG láncot tartalmazott (PEG--GABA-NHS, lásd 2-A ábra) . A GCSE-mutein. 5 és 10 kDa-os lineáris# észter/amid. m-.PEG reagenssel volt konjugálva (lásd 2-B ábra}. As m-PEGszukcinímidil-propionsav-NHS (PEG-SPA) reagenst# 5, 10, 15 és 20 kDa molekulatömeggel a Shearwater Po.lymers cégtől {Huntsvilie# Aiabama, lásd 2-C ábra) vásároltuk. Az alábbi pegíiálö reagenseket a Hoffmann-La Roch-e, Inc. cégnél készítették: m-PEG™urea~kap-csoló~moiekula (5, 10 és 25 kDa, lásd 2-D ábra), m-PEG-uretán-kapcsoló-molekula (10 és 20 kDa, lásd 2-E ábra), m-PEG—tíonretán-kapcsold-molekula (10 és 20 kDa, lásd 2-F ábra), A t-butil-m-PEG-uretáu-kapcsoIömolekulát 36 kDa-os átlagos molekulatömeggel a DDI Pharmaceuticals, Inc. cégtől (Mount axnvíew# CA, lásd 2-G ábra} szereztük be.
Pegílálásí reakciók
A pegilá.lási reakciót befolyásoló tényezők az alábbiak: 1} pH, 2} hőmérséklet# 3j reakcióidő, 4} fehérje és PEG mólaránya# és 5) fehérje-koncentráoiö. Egy vagy több tényező szabályozásával irányíthatjuk a reakció kimenetelét tűiφφφ φ « φ * ♦
X Φ « Φ Φ χ «1 » φ φ φ ΦΦ φ β Φ Φ Φ nyomóén mono-, di~# tri- stb. PEG konjugátumok előállítására.·. Például a reakció-körülmények a Shearwatsr Poiymer PEGSGOO-N-hidroxi-szukcinimid reagenssel az alábbiak, voltak: 1) pn-7, 3, 2) 4°ü mono- és dí-PEG-hez, szobahőmérséklet tri-PSG-hez, 3? reakcióidő mono-PEG-hez 30 perc, dl- és tri-PEG-hez 4 óra, és 4} fehérje és reagens möiaránya 1:30. A kívánt PEG~fajtók előállításához optimális reakciókörülményeket egyedileg határoztuk meg minden reagenshez. Ezeket az 1. táblázatban mutatjuk be. A reakciót savanyítással és -20C-on való fagyasztással állítottuk le.
Módosított és szabad. GCSP-mntern elválasztása a reakciőelegyből [Szelfopropil (SP) kationcserlő kromatográfiai
A körülbelül 5 mg fehérjét tartalmazó reakcióelegyet lO-zQ-szorosra hígítottuk vízzel, és a pH-t 4,5-re állítottuk be jégecettel. A hígított mintát ezután előzetesen elkészített 1-2 ml~es Eractogel*' £W 5(¾ 6505 (EM separations, Gibbstown, New Jersey) oszlopra vittük fel, amelyet 10 mM ammőnium-acetát, pH - 4,5 pufferrei ekviiibráltunk. A fel nem használt reagens és a melléktermékeket eltávolítóttnk az átfolyőval. A módosított GCSE-muteínt lépcsős gradienssel eiuáltuk 0,15 M HaCl-dal az ekvilibráciös pufferben. Az oszlopon maradt módosítatlan GCSP-muteint lépcsősen eiuáltuk 0,5 M NaCl-dal az ekvilibráciös pufferben. Az elválasztott GCSE-meteíü-PEG konjugátumot sterilen szűrtük 0,2 pm-es szűrővel, és fagyasztva tároltuk -20°C~on.
Φ Φ
GCSF-mutein~?SG konjugátnmok jellemzése
Fehérje-meghatárosáé
A tisztított G€SF~mutein~PEG fconjugátumok fehérjekoncentrációját 1 mg/mi-es oldatra 0,86 Asso~érték alkalmazásával határoztuk meg.
SDS -PAGE elemzés
Az elemzést 12 és 15%-os poiiakrilamíd gélek/ vagy 816%-cs gradiens gél alkalmazásával végeztük redukáló körülmények között/ Laemelí (Natúré 227, 680-685. old. (1970)1 leírása szerint,
Százalékos összetétel meghatározása
Az egyes fajták (mo.no-, dl, trí~, stb.) százalékos összetételét a különböző GCSP-muteín-PEG konjugátura reakcióé legyekben Coomassie BJue-vai festett SDS-PAGE gélek denzítometriás mérésével határoztuk meg (lásd 2. táblázat) .,
PEG törnegének meghatározása GCSF-muteln-PEG konjugátuw kb an
A beépített PEG totál tömegét a különböző preparátumokban a PEG átlagos molekulatömegéből, az egyes FEG-konjugátumok (mono-/ di-, stb,) elektrofcretikus mobilitáson alapuló azonosításából/ a kapcsolt FEG-molekulák számából, és a Cbo.mass.ie Plue-vai festett SDS-PAGE gélek denzitometriás mérésén alapuló százalékos összetételből határoztuk meg. Egy adott preparátum totál PEG-tömege az egyedi PSGtömegek összege. A egyedi PEG-tomeget az alábbi egyenlet szerint számítottuk:
FEG-tömeg PEG-moiekulatömeg x PEG-moiekulák száma x % Összetétel, ahol
ΦΚν* *« ΑΧ Α »»** « * * * * -- * % ♦ ♦ Α ♦ » »
Α * 9 9 A Α * * ♦ Α Α »* * A * A Α
PEG-molekulatömeg - 5, 10, 2 0 kDa, stb.
PSG-molekulák száma - .1, 2, 3 a mono-, di-, tri-PEGre.
Tömegspektrometriát (MAbDI-TOE) is alkalmaztunk a totál PEG-tömeg meghatározására. Ebben az esetben, a tömegspektrum lehetővé tette a az egyedi PEG-konjugátumok azonosítását, és Molekulatömegük meghatározását. Az egyedi PEGkonjugátumok PEG-mc lekül atömege az egyedi PEG-konjugátum molekulatömege mínusz GCSF-mntein molekulatömege {18,9 kDaí. Ezeket az értékeket megszoroztuk a százalékos összetétellel, ami az egyedi PEG-tömeget eredményezte; ezek összege a totál PEG-tömeg.
Mindkét eljárást alkalmaztuk a különböző PEG-preparátumok PEG-tömegének meghatározásra. As eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze..
Endotoxin színt meghatározása
Az endotoxín szintet a LAL-eljárás alkalmazásával határoztuk meg, a gyártó {Associates of Cape Cod, Inc., Woods Hople, Massaohusetts). utasításai szerint.
Bioaktivitások
Az in vitro biológiai vizsgálati eljárást M-NFS-60 sejteken, és az in vivő vizsgálati eljárást nőstény CS678L/6J egereken végeztük, korábbi leírások szerint {lásd Asano és mtsai., Jpn. Pharmacol. .The.r, 19, 2767-2773. old.
Í1991) | .
Eredmények és diszkusszió
Pegiiálási reakciók Általában az eredmények azt mutatják, hogy a kevésbé reaktív reagensek, mint például aa urea-kapcsoló-molekula, magasabb pH~t, hőmérsékletet, es fehérje: reagens- mólarányt igényeinek a kívánt mértékű konjugálás eléréséhez, valamint hosszabb reakcióidőt (lásd 1. és 2. táblázat).
Módosított és szabad GCSF-mutein elválasztása a reakcióéi egyből
Egy tipikus eluciős profilt mutatunk be a 4. ábrán, A kationcserélő kromatográfián kívül további lépések, mint például gél-permeációs kromatográfia lehetnek szükségesek nyomnyi szennyezések és endotoxinok eltávolításához, és a puffer lecserélésének végrehajtására az végtermék tárolásához, Az erős kationcserélő eljárást felnagyítottuk 30 mg-os szintre a 20 kDa-os SPA (amid) és 20 k'Da-os uretán konjugátárnokhoz. Ezzel az eljárással majdnem kvantitatív kitermelést kaptunk.
Százalékos összetétel és PEG-tömeg
A százalékos összetétel és PEG-tomeg eredményeket a 2, táblázatban foglaljuk össze. Tapasztalataink szerint a nagyobb molekulatömegü PSG-konjugátumofc (például 20 kd.a SPA dí-PEG, és 12 kDa GASA) esetében a reakcióelegy százalékos összetételének meghatározására a PEG-faj-ta azonosítása eiektroforeti.kns mobilitás alapján nem nagyon megbízható. A PSG-tömeg meghatározásához, és a nagyobb molekulatömegü és nagyon helyettesített PEG-konjugátumok azonosítása érdekében SDS-PAGE, SP-HPLC és MALDI-TGF elemzések kombinációjára van. szükség. Azonban a. mouopegíIáit, és kis molekulatömegül PEG-reagensekboI (például 5 kDaí származó PEG-konjugátumokat viszonylag pontosan azonosíthatjuk a megfelelő SPS-PAGS profi lókból.
Endotoxin szint
A LAL-eljárás alkalmazásával I Eö/mg~nái kevesebb endofoxint detektáltunk minden PEG-konjugátumban, kivéve egy uretán reagenssel készítettet. Ezen PEG-kongugatumban csak hígítás után detektáltunk endotoxint. Megerősítettük, hogy ez nem a hígítás során bekövetkező szennyezés következménye, ezáltal az ebben a mintában lévő valamilyen ismeretlen anyag okozhatta a gátlást a LAL vizsgálati eljárásban magasabb fehérje-koncentrációknál. A minta hígításával a gátlő hatású anyagot ís hígítottuk, és pozitív endotoxin eredményt figyeltünk meg.
Bioaktivifcás
Az összes GCBF-mnteín-PEG konjugátum ín vitro és in vívó bíoaktívitását feltüntetjük a 2. táblázatban. Általában fordított összefüggést figyeltünk meg az in vitro aktivitás és a helyettesítés mértéke, valamint a PEG molekulatömege között, Ezzel ellentétben, az ín vívó aktivitás javulását figyeltük meg a helyettesített PEG molekulatömegének növekedésével. Ezt mások ís megfigyelték (Satakoishikawa és mtsai,, Ceil Street, Eunct. 17, 157-lfQ, old. (1992)j. Javaslatunk szerint, a PEG-moiekulák kémiai kapcsolása a GCSF-mutein polípepfcid gerincéhez valamilyen konformációs változást hoz létre, ami hátrányosan érinti a receptor/ lígandum kölcsönhatásokat, ezáltal csökkenti a köré20 sí affinitást. Ezenfelül a viszonylag rövid inkubációs idő az in vitro vizsgálati eljárás során valószínűleg nem elegendő a csúcsaktivitás: eléréséhez. Másrészről, az in vivő vizsgálati eljárás egerekben sokkal hosszabb (napokig tart?,és napokkal a drog beadása után ér véget. Ez a hosszabb inkubációs odó, a GCSF-mutein-PEG megnövekedett keringési féléletidejével kombinálva kompenzál bármilyen, pegiiálás következtében bekövetkező kötési affinitás csökkenést. A végeredmény a maximális in vivő bioaktivítás megvalósulása. Egy másik hipotézis az, hogy a GCSF-mutein-PEG prodrogként viselkedik, amikor az egérbe injektáljuk. Ebben a helyzetben a GCSF-mutein-FEG PEG-molekuiarésze valamilyen módon folyamatosan levágődik, a szabad GCSF-mutein kis mennyiségének fenntartott felszabadulását eredményezve, és ez felelős az in vivő aktivitás fennmaradásáért és javulásáért. Azonban a prodrog-hipotézis nem magyarázza a megfigyelt alapvonal-aktivitást 7 nappal a kezdeti adagolás után. A prodrog-mechanízmos valószínűtlen amiatt, mert az amid-köt és a fehérje és a PEG között stabil és nem egykönnye:: has itható .
A. 15 tanulmányozott GCSF-mutein-EEG közül a P-12GA-1, 20 kDa SPA, 20 kDa uretán és 36 kDa uretán in vivő aktivitása szignifikánsan magasabb volt, mint a többi preparátumé (lásd 4. ábra és 2. táblázat).
Általában, a PSG-molekuia molekulatömege és a megnövelt in vivő aktivitás között egyenes összefüggést figyeltünk meg. Ezt mutatjuk be az 5. ábrán, ahol a PMM-szám nö~ φφ* φ φφ >
vekedését ábrázoljuk a totál FES-tömeg függvényében amid(SFA). és üres-kapcsolt PEG konjugátumoknái.
öC'SF-mufceín-PE'G konjugátumok kiválasztása és jellemzőik
A konjugációs kémia, biológiai tulajdonságok, és drogfejlesztési szempontok gondos értékelése után a 15 konjugáturn közül hármat választottunk ki további, értékelésre. Ezek a 1) P-I2GA-1, 2) 20 kDa SPA, és 3) 20 kDa uretán, A 20 kDa SFA-eredetü, az SP~tiszított reakoióelegyben jelenlevő mono-, di~ és tri-PEG konjugátumokat egymás mellet összehasonlítottuk, nmi azt mutatta, hogy mindhárom, xsagas granuiopoietíküs aktivitást tartott fenn nőstény C57BL/63 egerekben 5 napon át egyetlen 25,2 pg dózissal (3, táblázat és 4. ábra), Eszel ellentétben a módosítatlan GCSF-mutein napi dózisa volt szükséges hasonló aktivitások fenntartására
; eset kivételével (20 kDa SPA és
.tás normál szintre té .a b V.Í'S:S2& /
itása után (6, ábra). Mind a 20
konju gátum megnövelt aktivitást
, 4 μα- os dózisban, és visszatért
'lásd 3, táblázat) , A. százalékos
Lázat) azt mutatják, 1 rogy mind a
összetételi adatok (3. tát 20 kDa SPA, mind a P-12GA-1 preparátum, körülbelül 50% diáért tartalmaz, és a xsaradsk 50% a.®ow®er és trímer között oszlik meg, A 20 kda uretán reagens túlnyomóan monoPEG-et hoz létre a kísérleti körülmények között (lásd 3, táblázat) . Az Összes értékeit PEG-konjugátum un uitro aktivitása, köztük a túlnyomóan monomer uretán-származeke, ál♦ ♦♦ * * * talánosan fordított összefüggést követ a helyettesítés mértékével, valamint a PEG molekulatömegével. Az értékelt PEGkonjugátumok in vivő aktivitása egyenes összefüggést mutatott a PEG molekulatömegével az vizsgáit molekulatömegtar toményban «5. ábra).
Köve fck e ztetés
A 15 vizsgált GCSF-mutein-PEG konjugátum közül a P12GA-1, a 20 kDa SPA és a 20 kDa uretán kapcsolo-moiekulás preparátum jő in vivő aktivitási profilt mutatott. A 20 kDa GCSF-mutein-PEG mutatta a legjobb általános tulajdonságokat, beleértve az termelés gazdaságosságát Is,
1, Táblázat Különböző DSS-kojugátissck alőáliításáhsz alkalmazott raakció-ksrülKaysk
Molekulatömeg i Kémia keakdő-körül? tények
pH .............. .................’..........- i Hőmérséklet V 4 ff •uv Kólará&v
5 kDA .......................................................J m 10 SzofcahöÉrséklet l A,y; i Λ v*U :« 1:100
s m AKID V Szobaböffiérséklet 4 óra j 1:30
10 kDA iSSA 10 Szobah&aérséklet 1 óra 1:100
10 kDA AKID U SzobahŐBérsékiet 4 óra 1:30
IG M •tóN 10 48C 1 óra 1:30
15 MiA AKID ,3 SzobahőEérsékkt 4 óra 1:30
2 0 kDA AKID hl ........................ Szobahőmérséklet 4 óra 1:30
20 ffi TlSJtóS 8 Szobahőmérséklet 13 óra 1:30
20 kDA ISÁK 10 4’C 1 óra 1:30
..............................................................
25 kDA ÜBEA 10 Szobahőmérséklet 1 óra 1:100
30 a URST&i 8 n 6 óra 1:3
í * »* ’ » » Ή
2. Táblázat Különböző GCSfisatsbttSG konisgátaok összetétele, ffifitöRge, és bioattívitása
Aktivitások
Xapcsoló- aolekula fios összetétel* aóao dl tri oligo Hozzáadott ® tősége* MF5-60 SiBC w (sejtek fia!
Mid
íb! δ tta iy 22,3 51,3 3,1 12600** 95 22,63 536+60
fai 5 tta ö 0 0 ISO 20030 58 16,65 530+23
íb! 10 tta 9,5 63 27,2 0 2!79öH m 20,68 ! 632+82
(a) lö tta 10 11 53 26 29550 fi 20,13 701+92
íb! 15 kba 13,2 61,2 25,1 0 31710 fi 25,53 751+115
íci 20 tta 2?,6 63,5 22,3 ö 33100** 5¾ 23,23 y) λ
Üres
ta! 5 tta 20 13 23 23 11350 12,73 ! 256+27
{a! lö tta 23 19 23 23 22800 í 623 13,6 366+50
íb} 25 tta X,1 .157 él, 5 18,7 63775 í 61 27,78 71677
Krétán
» * »♦
ί) is m 15,8 1.2,· 6 36,5 35 ’j 0 ·Μ· ” íl J ν ν V 131 13,9 fi W ΊΧώ :Jv
(ε; 23 kSa 81,8 4 14,2 3 25533’* 74 7 £ o; <‘,.y 0 j 653152
ja) 36 Öa 53 v'U Λ V 3 54333 i i ISI 25,35 838+132
fioaretás ! 1
(bi 23 kDa » l íÖ,§ : 12 ν η <·\ Λ V (23443 234 Zi, 00 494+7.1
jsm » t
1 í ) ί /( ·, ·λ* : i (bs s c. :ί ί CM sy ; 3 '·· t ** V 13133** ! Π * A 3 k 598+117
i (ci 12 kDa 36 4? A ) Λ V i46533** í..................... í Π7 ί -,!·!ί ................................. 883+120
1 5-ss összetételt es a fe ozzaadott ?SG tőségét Cöfflassie Slae-val festett SBS-PAGE
zitcffietriás mesével ’ Μί’.ητ-?Γ íF ffiS előzéssel (**i száaltottuk >
(aí,(bi, íci: Éndegi fik kalös V ,. 7/ > .X YfV' >?/\ b * Λ ; Wv&\? λΛλV. Lsgiai vizsgálatot jelent; '5, napi l ?HN adatokat ®-
» ΧΗ » » ί » » « ( * ♦♦ί ί ♦ > X «»« « X ♦» <
# ί X ♦ ♦ ♦
X» <
» >
3. Táblázat A hárois alapsűlekula összetétele, PEG-t&ege, pegilált helyei és bioaktivitásé
tEG-soleknia , 1-cs összetétel’ PEG- Aktivitások
mono di tri olígo tőség Pl- PISI {kontroll 1-ai
USai »S- 88 5. asp 7, nap 5. nap ?. nap
Hordozóeszköz íteatröli) 5,73 8,37 150 1C8
KB-28: Egyetlen injekció, 25,2 tg §,Ö5 5,1 85 78
©-28: Bapi injekció, 25,2 pg 28,5 24,58 1132 336
Magolás
8,4 25,2 8,4 25,2 1,4 25,2 8,4 25,2
pg w ug yg y ’43 tg tg
12 W G8B& 38/7 47,0 17,0 0,0 «,5 31 22,75 30,03 10,7 24,1 701 1854 148 555
y 20 kis S?A 12?, 6 43,5 22,S 0,0 38,1 51 13,58 21,83 7,5 15,45 513 378 103 44?
í
20 kDa uretán ..... SM y 14,2 8,0 25,8 71 3,35 17,43 5,78 7,33 222 72.3 74 119
X *» 4 4 í «
4 «X <
* v 4 4 m
« » xt X 4 í 1 4 «
í.,:.
»X 4 4 X »4 kw.
# * <· * * A* » «« « » * « * * * * ♦
Nőstény C57BL/6J egereknek 8,4 pg vagy 25,2 pg ND-28at adtunk he naponta, vagy PFG~koujogátüm.ot egyetlen dózisban ,
Az 5. és 7, napon a kezdeti adagolás után vénás vérmintákat vettünk, és differenciális Xeukocíta-eiemzést végeztünk, * Gocmassie Biue-val festett SDS-PAGE denzitometriás nérésén. alapul.
** MALDI-TOF MS-sel határoztuk meg.
2. példa kDa-os PSG-gel konjugált rhG-CSff-Kiufcein előállítása
A GGSF-mateín módosítását 20 kDa-os metoxi-PEG-szukcinimidil-propionsav (SPA) reagenssel az alábbiak szerint hajtottuk végre. A PSG-reagensf desztillált vízben, feloldottuk körülbelül 200 mg/ml koncentrációban, és GCSF-mutein. oldathoz (körülbelül 5 mg/ml) adtak, 4:1 és 6:1 mólarány között (reagensfelesleg), A reakciót 4 és 8®C között 20 órán keresztül pH - 7,5-ön engedtük folyni. A reakció végén jégecetet adtunk a reakció: leállítására. A pegiiált GCSFmuteint (másik jelölése PEGG) megtisztítottuk a maradék módosítatlan műteintő1, felesleg PEG-reagenstől, és a reakció alatt jelenlévő egyéb szennyezésektől és pufférkomponensektői. A pegllalt fehérje mellett N-hidrox.iszukcini.mid és poiietiléngií kο 1 - ka rbox1. I s av ke l étkezik melléktermékként.
A PEGG-efc kátioncserélő kromatográfiával tisztítottuk, melyet uitrafíItrálás követett. A mintát felvittük a kationcserélő oszlopot, és 20 rdü nátrium-acetáttal, pH - 4,0 ♦ ♦V a * A * x » ν * ·: «· * a>« ·:· .♦#*» <** * mostuk. Az elúciö nátri/um-kloríd lineáris gradiensé választotta a FEGG~et a reakcióelegy minden más komponensétől . Ezt követően ultrafíltrálást/diafiltráiást alkalmaztunk a PEGG körülbelül 0,4 mg/ml-re· való koncentrálására, és a puffer 20 mM nátrium-acetát, 50 mM nátrium-klorid, pH :::: 6,0 pufferre való cseréléséhez.
Öt, a fenti körülmények között végrehajtott pegilálási és tisztítási menetet elemeztünk kationcseréiő kromatográfiával, és eszel demonstráltuk a GCSF-mutein pegilálási reakciójának reprodukálhatóságát. A pegilálási reakció reprodukálhatőnak bizonyult 2,5 g (végső FEGG hozam) mennyiségig az alábbi optimális körülmények között; 20 kDa-S'PAPEGrmuteln mólarany 4-·β; 1; pH -7,5, 4°C 20 óra. A FEGGelegy átlagos százalékos összetétele az alábbi volt: 21,7%· mono-FEGG (%RSD-6,6%), 60,3%. di-EEGG (1RSD-6, 6%} , 15,1% tri-PEGG (%FSD::::4, 0%), és 2,9% tetra-ESGG (%RSD-2S, 1%) , mint ahogy a 4. táblázatban bemutatjuk.
***·» ·** % ft * » S <
.*<♦· -» -4· ·* <5 * > * * * Λ «*λ *λ φ<Ζ'Φ Αβ>^ -:·
Táblázat Mono-, di, tri- és tetra-PSGG relatív százaié>s összetételének, kationcserélő elemzése öt szintézis és tisztítási menetben
Perifériás vér őssejtek mobilizálása
Számos módszert fejlesztettek ki mind primitív őssejtek („stem teli), mind elkötelezett prekurzorok mobilizálására csontvelőből, és keringő előfejtek („progenitor coll) szaporítására perifériás vérben. Szén stimulált sejtek képesek lehetnek korai és fenntartott beépülés közvetítésére# letális besugárzást és csontvelő- vagy őssejtátültetést követően (Neben és mtsai,, Blood 81, 1960, old.
(1993)] . A perifériás vér őssejtek („peripheral blood stem •célis# PBSC) összetoborzás-a segítheti a hemopoíatikus felgyógyulás megrövidítését kemoterápiával kiváltott csontvelő hipopl'ázíás' betegekben# vagy azokban, amelyek egyéb mieloabiativ kezelésen mennek keresztül {Róberts és Hetcalf, Sxperímental Hem.atology 22# 1156. old, (1994)1, Mind növekedési faktorokat# mind kemoterápiás drogokat alkalmaztak a mobilizálás stimulá.'lására [Bodíne, Sxperimental Hematoiogy 23# 2.93. old. (1995) } , A PBSC stimulálását követően a mobilizált sejteket ienkaferézissel összegyűjtik# és fagyasztva tárolják# amíg szükség nem lesz rájuk, A. jelenlegi klinikai eljárások PBSC·koncentrátumok leukaferézissei való ismételt összegyűjtését írják elő szokásos nagy dőzisú kemoterápiát (CHT) követően# és növekedési faktorok ismételt napi dózisát vagy folyamatos infúziót, néha két hétig is vagy tovább (Brugger és mtsai.# Blood 79# 1193. old. (1992)]. Az alább leírt vizsgálatokat a PBSC mobilizálásának két egérmodeiigében végeztük# az elsőt normál egérben, és a másodikat kemoterápiás modellben. A kísérletek demonstrálják a talál31 -·· ** * mány szerinti pegiláit GCSF-mutein (PEGG) megnövelt hatásosságát őssejtek mobilizálására NEUPOGBN~nsi (G-CSE} összehasonlítva. A pegiláit xautein felsőbbrendűségét szignifikánsan csökkentett és hatásosabb adagolás mellett szintén megalapoztuk.
Ezen vizsgálatok értékelték többféle növekedési faktorral in vit.ro stimulált, ímmobílizált értélén egér PSSC szaporodási képességét hétnapos agarkolőnia vizsgálati eljárásban. A kolónia formáló képesség mellett teljes hematológiai profilt, és az abszolút neutrofil szám (ANC) értékelését végeztük ei az összes egér vérén. A szérum G-CSEszinteket is meghatároztuk. A vizsgálati eljárás optimalizálását követően számos időfüggési kísérletet hajtottunk végre, és megvizsgáltuk G-CSP magas és alacsony dózisát. A kísérleti modellek G-CSE- és ciklofossfamid (Cytoran}indukált immobilizációt, valamint CHT-t és citokint alkalmazó kombinált kezelést tartalmaztak.
Anyagok és eljárások: 6-10 hetes nőstény C57BL/6J egereket (The Jackson Laboratory} alkalmaztunk minden kísérletben. Az egereket IP oltottuk a -1, napon .200 mg/kg Cytoxannal, vagy foszfát puffereit sóoldat (PBS} hordozóval, A 0. napon az. állatokat SC oltottuk 0,1 ml ŐFVPOGENnel (GCSF}, PEGG-gel (20 kDa SPA-kapcsolt mutein, Lót #P2öW3), vagy 1% normái egérszérumot tartalmazó PBS hordozóval. A Meupogent kapott egerek ugyanazon dózis napi injekcióját kapták, míg az összes többi egér hordozót kapott. A feláldozás napján perifériás vért vettünk az elaltatott egerek retroorbitális szinuszából EDTA-t tartalmazó csövekX Λ X ,>· be. Minden csoportból összeöntött teljes vér kis mennyiségét adtuk három, párhuzamosban 35 mnh-es szövet tenyésztő csészékhez, amelyek 1000 U/mi rekomhínáns egér irm) lnterieukin-3-a.t, 100 ng/ml rm. őssejt faktort, és 1000 U/ml rm lnterieakin~6~ot tartalmaztak# 1 ml össztérfogatú REMI iő40-tápközegben, 15% magzati marhassárummal és 0#35S Difco-agarrai kíegáészitve. A megszilárdult agartenyészetekét egy hétig 3'?°C-on inkübáltuk párásított, 5% CCo-ot tartalmazó atmoszférában.. A kolóniákat sztereóm!kroszköp alatt sötétmezős megvilágítással számoltuk meg, eredmények: Az első bemutatott vizsgalatban normális egerek 25 ug/egér NEUPöGEN-t kaptak a 0-5. napon, vagy 25 ug/egér PEGG-et kaptak egyetlen dózisban a 0. napon. Egereket áldoztunk fel a 3-7. napokon. Mint ahogy a 7. ábrából láthatjuk, a kolónia-formálással demonstrált mobilizáció szignifikánsan növekedett a DEUPOGEN-oltott egerekben a 3. és 4. napon, de fokozatosan visszatért az alapszintre az 5. napra (az 5, napig tartó NEÜPÖG'EN injekciók ellenére.) , A PEGG-gel oltott egerek ezzel ellentétben jobban megemelkedett kolómíaszámot mutattak, ami megmaradt telítési szinten 7 napon át.
A kemoterápiás modell paradigmája hasonló volt. A CKlcsoportokban lévő egerek Cytoxan-ínjekeiét kaptak a -1. napon. Néhány egér ezután csak hordozót kapott a következő napokon, míg mások kombinált kezelést kaptak# vagy NEOPOGEN napi injekcióit a 0-5» napokon# vagy egyetlen PEGG-injekciöt a 0. napon. A 8. ábrán láthatjuk, hogy a Gytoxan-kezelt egerekben a 4. napon csúcs van, ami fokozatosan «Φ «ΦΦφ φΑ visszatér az alapszintre a következő napokon. Mind a NEUPCGEN-, mind a FSGG-csoportokban a csúcs az 5, napon volt, nagyon megemelkedett kolőniaszámokkai. Azonban a Cytoxan * PEGG értékek nagyon szignifikánsan. emelkedettek maradtak a 6. és 7, napon, a Cytoxan + MEÜPCGEN csoportok szintje felett. A 9. ábrán a. kombinációs kezelés színergstikus hatását mutatjuk be a. Cytoxan vagy G-CSF kezeléshez képest,
Egy második vizsgálatot mutatunk be a 10. és .11. ábrán. KEUPOGFN alacsonyabb, 3 ug/egér dózisát 10 egymás utáni napon napi injekcióban kapó normális egerek viszonylag alacsony színtű, „többfázisú'1' mobilizációt mutattak a vizsgált időszakon belül, PEGG egyetlen 3 pg/egér dózisával injektált állatok megközelítőleg ötször akkora számú elcsejtet mutattak a. perifériás keringésben a 4. napra, bár ez az
tet mutattak a
Ή uú f- ,s egyszeri.
gett a 6. napra
A Cytoxan-
zisa durván ME
pg/e gér dózis)
(11, ábra) . Min·
non volt csűcso
β g ye klen különb:
el hú zódó hatása
10— s zenese volt
A Cytoxan-oltott egerekben PSGG egyetlen 3 ug/egér dódurván MEÜFOGEN 30 ug/egér dózisával (10, napi 3 jér dózis) egyenértékű PBSC-immobiiizáciöt váltott ki ábra). Mindkét csoport elosejt~mobilizáciöja az 5. na7ölt csúcson, és a csúcsok nagysága is azonos volt. Az :len különbség látszólag a NEUPOGEN kicsit tovább tartó ;ódó hatása volt. A CBl-modellben a kolóniák száma 4serese volt a normál egérmodeliben lévőnek.
Ezen kísérletek demonstrálják a pegiiált autein két elkülönült potenciális előnyét a NEGPOGEN felett.. Először, a PEGG nagyobb hatékonysága PBSC mobilizálására nyilvánvaló a NEUPOGEN-nel összehasonlítva, mind normál, mind kemoterápiásán kezelt egerekben, Másodszor, a pegíiált mutelnr-öl megmutattuk, hogy hatásosabb egerekben, mint a bEUPOGSN, kisebb és hatékonyabb adagolás alkalmazásával, mint a lenlég alkalmazott klinikai termék.
* * * >
**♦ «· Α *« »
S2EXVENCIAL3S7A <Zi2> PRT
Homo saoxens < ,·; ,··: υ >
<222> (36)., (42) )ISULFID
J. .-', ·-· .. / ζ~ Λ \ / V Λ X <ζ.2ζ> tο 4} ,„ ‘, 14?
<400:
Pro Thr Tyr Ara #
Ser Le-ts
Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys
Gin Vei Arg Lys lle· Gin Giy Asp Giy Alá Aia Lee Gin
Glu Lv:;
Tyr Lys Len neu
Leu Gye Ars
Giy His Ser Leu Giy lle Pro Trp
S’ trs tro Gru
Aia Pro Leu Ser Ser Cvs
Se?: Gin .Ara Leu Gin Leu .ere •»w
Leu His Ser
O.y Leu Phe Lse Tyr Gin Oly Leu Lse Gin -Alá Len Giu Giy lie Se?
«0
Giu Leu Giy Pro Thr Leu Asp Thr Len Gin Len
Asp « ** * *♦
Phe Alá Thr Thr 11« Trr> Sin Sir, Met Glu Glu Len Gly Met Alá
Alá Leti Gin Pro Thr Sin Gly Alá. Met Pro Ara Phe Alá Ser AJ
L'3'.θ
Axg Arg ALs Gly Gly Val leu Val Alá Ser Hls leu Gin Ser Phe
ISO .60 neu Hu Var bej /al Leu Arg His
179
165 ♦ ♦ * *
-cRO(CH2GH2O)„CH2C-H?

Claims (1)

1. Az 1. általános képlettel megadott fiziológiásán aktív konjogatóm, ί Ο Ί
-G I m
ahol G jelentése granuloclta kolónia-stimuiáiő faktor azon aibíno-csoportja vagy csoportjai nélkül, amelyek polietíiénglíkol-moiekuiávai amid-kötést alkotnak a konjugátumban; R jelentése kis aikil-csoport? n értéke egész szám 420 és 550 között; és m értéke egész szám 1 és 5 között.
Az. i, igénypont szerinti konjugátum, ahol R je~ len tés-e matti-csoport. 3. A 2. igénypont szerinti kenj ugátum. ahol n ér~ teke 450 és 4:90 között van. 4. A 2. igénypont szerinti konjugátum, ahol m ér-
teke egész szám 1 és 4 között.
5. A 4. igénypont szerinti konjugátum, ahol m ér- teke 2. 6. Az 2. igénypont szerinti konjugátum. amelyben a granuloclta kolónia-stímuláló faktor az 1. ábrán bemutatott
szekvenciája GCSF-mutein,
7. Az 1. i gé n y p on. t s z e n i n t í konjugátum, aho l n ér- téka 450 és 490 ks űzött ran. 8 · Az 1. igénypont szerinti konjugátum, ahol m ér-
teke egész szám 1 és 4 között.
X ♦* φ Φ φ φφ Α
9. Α 8. igénypont szerinti konjugátum, ahol m értéke 2.
10. Az 1. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a granulocita koiónia-stimulálő faktor az 1. ábrán bemutatott szekvenciáid GCSF-mutein,
11. Az 1, igénypont szerinti konjugátum, amelynek hosszabb keringési féléiétideje és nagyobb in vivő granulopíetikus aktivitása van, mint a megfelelő konjugálatlan granuloeíta koionia-stimuláló faktornak.
12. A 11, igénypont szerinti konjugátum, amelyben a granulocita koiénia-stimuiáló faktor az 1, ábrán bemutatott székvénefajú ÖCSF~mu t e i n.
13, Az 1. általános képlettel megadott fiziológiásán aktív konjugátum, í ° 1
1 RO(CH2CHjO!„CH2CH-C-Nh4------G I
L J m ahol R jelentése metii-csoport; n értéke egész szám 440 es 490 között; m értéke 2; és G jelentése az 1. ábrán bemutatott szekvenciája GCSF-mutein azon amino-csoportjai nélkül, amelyek polletilénglikol-molekulával amid-kötést alkotnak a kongugátumban,
14, Az I. általános képlettel megadott fiziológiásán aktív konjugátumokat tartalmazó készítmény,
RO(CH2CH2O)f!GH2CHrC-G ahol G jelentése az összes konjugátumban granulocita > · 4 kolönia~stimnd.álö faktor azon amino-csoportia vagy csoportjai nélkül, amelyek poiietiléngiikol-molekuiával amidkötést alkotnak a konjugátumban; R, jelentése az összes konjugátumban egymástól függetlenül kis alkil-osoport; n értéke az összes konjugátusiban egymástól függetlenül egész szám 420 és 55Q között; és m értéke az összes konjugátumban egymástól függetlenül egész szám. 1 és 4 között; azon konjugátumok aránya, ahol m értéke 1, 18-25%, azon konjugátumok aránya, ahol m értéke 2, 50-66%, azon konjugátumok aránya, ahol m értéke 3, 12-161, és svon konjugátumok aránya, ahol m értéke 4, 5%-ig terjed.
15. A 14, igénypont szerinti készítmény, ahol R jelentése az összes konjugátumban metíl-csoport.
16. A 14. igénypont szerinti. készítmény, ahol n értéke és R jelentése az összes kenjugátumban ugyanaz,
17. A 14, igénypont szerinti, készítmény, ahol n értéke 450 és 490 között van.
18. A 14, igénypont szerinti készítmény, amelyben a granulooita kolónia-sfcímulálö faktor az összes konjugátumbán az 1. ábrán bemutatott szekvencíájű GCSF-mutein.
19. Az 1. általános képlettel megadott fiziológiásán aktív kenjugátumokát tartalmazó készítmény, p 1 20Η2Ο)β0Η2€Η2“Ο~Ηη4-G I m
ahol R jelentése metil-osoport; n értéke az összes konjugátumban ugyanaz, és egész szám 450 és 490 között; G jelentése az 1. ábrán bemutatott szekvenciája GCSF-mutein φ
azon amino-csoportjai néiküi, amelyek poiietílériglikolmoiekuiával amid-kötést alkotnak a konjügátnmban; az összes konjugátnmban m érték» egymástól függetlenül egész szánt I és 4 között; azon konjagátumo-'k. aránya/ ahol m. értéke 1, 1825%/ azon konjngátnxaok aránya, ahol m értéke 2, 50—65%'/ azon konjngátnmok aránya, ahol iá értéke 3# 12-16%, és azon konjugátumok aránya, ahol m értéke 4, 5%~ig terjed.
20. Eljárás a megfelelő kenj. ugálat lan GCSF-nél hosszabb keringési féléletidejü és nagyobb in alvó granulopietikus aktivitású. PEG-GCSF konjugátum. előállítására, azzal jellemezve, hogy II. általános képlettel megadott reagenst kovalensen kapcsolnak a GCSF-hez a kenjugátum előállításakor.
21. Az 2ő igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy GCSF-ként az 1. ábrán bemutatott szekvenciája
GCSF-mnteint .a.1 kalmárunk.
HU0203652A 1999-01-29 2000-01-19 Gcsf conjugates HU228488B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11791799P 1999-01-29 1999-01-29
PCT/US2000/001264 WO2000044785A1 (en) 1999-01-29 2000-01-19 Gcsf conjugates

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0203652A2 HUP0203652A2 (hu) 2003-03-28
HUP0203652A3 HUP0203652A3 (en) 2005-01-28
HU228488B1 true HU228488B1 (en) 2013-03-28

Family

ID=22375505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0203652A HU228488B1 (en) 1999-01-29 2000-01-19 Gcsf conjugates

Country Status (26)

Country Link
US (4) US20030130193A1 (hu)
EP (1) EP1157037B1 (hu)
JP (1) JP2002540065A (hu)
KR (1) KR100689212B1 (hu)
CN (1) CN1376164A (hu)
AT (1) ATE246202T1 (hu)
AU (1) AU2618500A (hu)
BG (1) BG65213B1 (hu)
BR (1) BR0007781A (hu)
CA (1) CA2361766C (hu)
CZ (1) CZ300546B6 (hu)
DE (1) DE60004172T2 (hu)
DK (1) DK1157037T3 (hu)
EA (2) EA004685B1 (hu)
ES (1) ES2204509T3 (hu)
HK (1) HK1049673A1 (hu)
HU (1) HU228488B1 (hu)
IL (1) IL144361A0 (hu)
MX (1) MXPA01007609A (hu)
NO (1) NO331787B1 (hu)
NZ (1) NZ513113A (hu)
PT (1) PT1157037E (hu)
RS (1) RS50928B (hu)
SK (1) SK286898B6 (hu)
WO (1) WO2000044785A1 (hu)
ZA (1) ZA200105932B (hu)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE246202T1 (de) * 1999-01-29 2003-08-15 Hoffmann La Roche Gcsf konjugate
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
US6831158B2 (en) 2000-01-10 2004-12-14 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
ATE421535T1 (de) 2000-10-16 2009-02-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Peg-modifiziertes erythropoietin
MXPA04000231A (es) 2001-07-11 2004-05-04 Maxygen Holdings Ltd Conjugados del factor de estimulacion de colonias de granulocitos.
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
CA2462930C (en) * 2001-10-10 2012-07-10 Shawn De Frees Remodeling and glycoconjugation of peptides
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
MXPA04004809A (es) * 2001-11-20 2004-08-11 Pharmacia Corp Conjugados de hormona de crecimiento humana modificada quimicamente.
CN100337689C (zh) 2002-07-24 2007-09-19 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 聚亚烷基二醇酸加合物
US7695723B2 (en) 2002-12-31 2010-04-13 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
US7785601B2 (en) 2002-12-31 2010-08-31 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
EP1667706A4 (en) * 2003-08-22 2009-06-24 Queensland Inst Med Res G-CSF DERIVATIVE FOR INDUCING IMMUNOLOGICAL TOLERANCE
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
CA2585758C (en) 2004-10-29 2017-08-01 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
NZ556436A (en) 2005-01-10 2010-11-26 Biogenerix Ag Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20060174362A1 (en) * 2005-02-01 2006-08-03 Origen Therapeutics, Inc. Long-term culture of avian primordial germ cells (PGCs)
WO2006121569A2 (en) 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7381805B2 (en) 2005-06-01 2008-06-03 Maxygen Holdings, Ltd. Compositions comprising mixtures of positional PEG isomers of PEGylated G-CSF
WO2006138572A2 (en) 2005-06-16 2006-12-28 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates having a degradable linkage and polymeric reagents useful in preparing such conjugates
CA2617064A1 (en) * 2005-08-04 2007-02-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of a g-csf moiety and a polymer
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
JP2007112924A (ja) * 2005-10-21 2007-05-10 National Institute For Materials Science 高分子架橋剤及びこの架橋剤を用いたリポソーム又は細胞の架橋体
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
CN101002943B (zh) * 2006-01-17 2012-02-01 中国科学院过程工程研究所 支链peg-gcsf和peg-gmcsf结合物及其制备方法
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
ITMI20061624A1 (it) 2006-08-11 2008-02-12 Bioker Srl Mono-coniugati sito-specifici di g-csf
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
US20100316631A1 (en) * 2006-10-19 2010-12-16 The Uab Research Foundation Water Soluble Curcumin-Based Compounds
KR101079993B1 (ko) * 2006-11-17 2011-11-04 동아제약주식회사 폴리에틸렌글리콜 과립구 콜로니 자극인자 접합체
JP2008125952A (ja) * 2006-11-24 2008-06-05 National Institute For Materials Science 複合架橋体
CN101245109B (zh) * 2007-02-12 2011-12-14 杭州九源基因工程有限公司 一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体及其制备方法
NZ580030A (en) 2007-04-03 2012-06-29 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
AR067537A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Purificacion de polipeptidos pegilados
AR067536A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
CN101352573B (zh) * 2007-07-27 2011-02-09 杭州九源基因工程有限公司 聚乙二醇单修饰的重组人集落细胞刺激因子赖氨酸缺陷体
WO2009103199A1 (zh) 2008-02-18 2009-08-27 江苏恒瑞医药股份有限公司 水溶性聚合物修饰的g-csf偶联物
EP2626079A3 (en) 2008-02-27 2014-03-05 Novo Nordisk A/S Conjungated factor VIII molecules
RU2409669C9 (ru) 2008-08-18 2012-05-27 ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management", "SFM") Способ иммобилизации биологически активного вещества (бав) на носитель (варианты) и конъюгат бав-носитель, полученный данными способами
JP5632376B2 (ja) 2008-09-23 2014-11-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ エリスロポエチンの精製
KR101485646B1 (ko) 2010-02-11 2015-01-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｉｇｆ―ⅰ 폴리(에틸렌 글리콜) 컨쥬게이트
WO2012035037A1 (en) 2010-09-14 2012-03-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for purifying pegylated erythropoietin
US8889630B2 (en) 2011-12-23 2014-11-18 Carlos Lopez Method for hair regrowth using Granulocyte-Colony Stimulating Factor
EP3484911B1 (en) 2016-07-15 2020-11-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Method for purifying pegylated erythropoietin
BR112020007037A2 (pt) 2017-10-11 2020-11-17 Elanco Us Inc. variantes de g-csf porcino e seus usos
SI3731872T1 (sl) 2017-12-29 2022-04-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek za zagotavljanje sestavka PEGiliranih beljakovin
US20200362002A1 (en) 2017-12-29 2020-11-19 Hoffmann-La Roche Inc. Process for providing pegylated protein composition
US12208142B2 (en) 2017-12-29 2025-01-28 Hoffmann-La Roche Inc. Process for providing PEGylated protein composition
JP2024500974A (ja) * 2020-12-23 2024-01-10 ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド 電荷遮蔽された融合タンパク質を精製する方法

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1609546A (en) * 1925-11-19 1926-12-07 Petroleum Rectifying Co Process of separating water from emulsions
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
DE3380726D1 (en) * 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
US4514497B1 (en) * 1983-12-30 1998-02-24 Novagene Inc Modified live pseudorabies viruses
JPS61227526A (ja) * 1984-07-25 1986-10-09 Chugai Pharmaceut Co Ltd 新規なコロニー刺激因子
US5532341A (en) * 1985-03-28 1996-07-02 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5214132A (en) * 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5194592A (en) * 1986-12-23 1993-03-16 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
CA1340810C (en) * 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
US5349052A (en) * 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
JP2989002B2 (ja) * 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
US6166183A (en) * 1992-11-30 2000-12-26 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5372808A (en) * 1990-10-17 1994-12-13 Amgen Inc. Methods and compositions for the treatment of diseases with consensus interferon while reducing side effect
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
JP3708151B2 (ja) * 1994-12-15 2005-10-19 協和醗酵工業株式会社 Ｐｅｇ化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
KR0176625B1 (ko) * 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
ATE246202T1 (de) * 1999-01-29 2003-08-15 Hoffmann La Roche Gcsf konjugate

Also Published As

Publication number Publication date
HK1049673A1 (zh) 2003-05-23
YU54301A (sh) 2003-10-31
DE60004172T2 (de) 2004-04-22
PT1157037E (pt) 2003-12-31
MXPA01007609A (es) 2003-06-24
NO331787B1 (no) 2012-04-02
CA2361766C (en) 2011-12-06
DE60004172D1 (de) 2003-09-04
CN1376164A (zh) 2002-10-23
NO20013700L (no) 2001-09-25
US20050196378A1 (en) 2005-09-08
HUP0203652A3 (en) 2005-01-28
RS50928B (sr) 2010-08-31
PL363117A1 (en) 2004-11-15
US20080287659A1 (en) 2008-11-20
EA004685B1 (ru) 2004-06-24
US20070219356A1 (en) 2007-09-20
ES2204509T3 (es) 2004-05-01
KR100689212B1 (ko) 2007-03-09
EP1157037A1 (en) 2001-11-28
KR20020007296A (ko) 2002-01-26
BR0007781A (pt) 2002-02-05
ATE246202T1 (de) 2003-08-15
CA2361766A1 (en) 2000-08-03
CZ20012654A3 (cs) 2002-05-15
JP2002540065A (ja) 2002-11-26
BG105851A (en) 2002-06-28
WO2000044785A1 (en) 2000-08-03
SK286898B6 (sk) 2009-07-06
NO20013700D0 (no) 2001-07-27
SK10352001A3 (sk) 2002-06-04
IL144361A0 (en) 2002-05-23
EA200100838A1 (ru) 2002-04-25
HUP0203652A2 (hu) 2003-03-28
NZ513113A (en) 2004-03-26
ZA200105932B (en) 2002-10-18
EP1157037B1 (en) 2003-07-30
CZ300546B6 (cs) 2009-06-10
US20030130193A1 (en) 2003-07-10
AU2618500A (en) 2000-08-18
DK1157037T3 (da) 2003-11-24
EA200400067A1 (ru) 2004-04-29
BG65213B1 (bg) 2007-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228488B1 (en) Gcsf conjugates
JP2980569B2 (ja) インターフェロン複合体
JP5334347B2 (ja) 化学的に修飾した新規なエリスロポエチン刺激タンパク質組成物および方法
CA2978330C (en) Conjugates of an il-7 moiety and a polymer
WO1990006952A1 (en) Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US20060029573A1 (en) Pegylated interferon alpha-1b
US8088899B2 (en) Human granulocyte-colony stimulating factor isoforms
JP2003511357A (ja) ポリマー安定化神経ペプチド
JPH04164098A (ja) 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子誘導体
US8629104B2 (en) G-CSF and water-soluble polymer conjugate
EP2196477B1 (en) Modified recombinant human endostatin and its application
KR101025352B1 (ko) 생리활성 복합체
EP1369429A1 (en) GCSF conjugates
CN116212040A (zh) 一种作为Treg靶向调节剂的PEG修饰IL-2的组合物及其制备方法和用途
CN112175089A (zh) 一种粒细胞集落刺激因子重组蛋白、缀合物及其应用
AU2004233543A1 (en) GCSF Conjugates
KR20180135245A (ko) 안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법
PL203462B1 (pl) Fizjologicznie aktywne koniugaty czynnika stymuluj acego tworzenie kolonii granulocytów (GCSF), zawieraj ace je kompozycje i sposób wytwarzania koniugatu PEG-GCSF
MXPA97004012A (en) Conjugados de interfe