CZ300546B6 - Fyziologicky aktivní konjugát, prostredek a zpusob prípravy - Google Patents
Fyziologicky aktivní konjugát, prostredek a zpusob prípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ300546B6 CZ300546B6 CZ20012654A CZ20012654A CZ300546B6 CZ 300546 B6 CZ300546 B6 CZ 300546B6 CZ 20012654 A CZ20012654 A CZ 20012654A CZ 20012654 A CZ20012654 A CZ 20012654A CZ 300546 B6 CZ300546 B6 CZ 300546B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- peg
- conjugate
- gcsf
- conjugates
- day
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 117
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 103
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 81
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 81
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 30
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 28
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 23
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 21
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 21
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 claims description 20
- 229940029345 neupogen Drugs 0.000 claims description 20
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 13
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 11
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 11
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 10
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 7
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 7
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 6
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 claims description 4
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 claims description 3
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 claims description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 2
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims 11
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims 11
- 210000002568 pbsc Anatomy 0.000 claims 3
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 claims 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims 1
- GARPFVCKMNXRTQ-UHFFFAOYSA-N ethyl n-sulfanylcarbamate Chemical compound CCOC(=O)NS GARPFVCKMNXRTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 8
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 5
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- DCESWPKOLYIMNH-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)N1C(=O)CCC1=O DCESWPKOLYIMNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 101100114967 Homo sapiens CSF3 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 3
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- -1 respectively Chemical compound 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FFZJHQODAYHGPO-KZVJFYERSA-N Ala-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N FFZJHQODAYHGPO-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N Arg-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(O)=O IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- YFXFOZPXVFPBDH-VZFHVOOUSA-N Cys-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CS)C(O)=O YFXFOZPXVFPBDH-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102100035861 Cytosolic 5'-nucleotidase 1A Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- BHPQOIPBLYJNAW-NGZCFLSTSA-N Gly-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN BHPQOIPBLYJNAW-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 1
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- TXLQHACKRLWYCM-DCAQKATOSA-N His-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O TXLQHACKRLWYCM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PZAJPILZRFPYJJ-SRVKXCTJSA-N His-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PZAJPILZRFPYJJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101000802744 Homo sapiens Cytosolic 5'-nucleotidase 1A Proteins 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- QCSFMCFHVGTLFF-NHCYSSNCSA-N Leu-Asp-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QCSFMCFHVGTLFF-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- HVJVUYQWFYMGJS-GVXVVHGQSA-N Leu-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HVJVUYQWFYMGJS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QPXBPQUGXHURGP-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Met Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N QPXBPQUGXHURGP-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- OYQUOLRTJHWVSQ-SRVKXCTJSA-N Leu-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OYQUOLRTJHWVSQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N Leu-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- PINHPJWGVBKQII-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PINHPJWGVBKQII-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GPAHWYRSHCKICP-GUBZILKMSA-N Met-Glu-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GPAHWYRSHCKICP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101001076414 Mus musculus Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000716728 Mus musculus Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N Phe-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUGYQLFEJYZOKQ-NGTWOADLSA-N Thr-Ile-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N XUGYQLFEJYZOKQ-NGTWOADLSA-N 0.000 description 1
- RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- VZBWRZGNEPBRDE-HZUKXOBISA-N Trp-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N VZBWRZGNEPBRDE-HZUKXOBISA-N 0.000 description 1
- PAPWZOJOLKZEFR-AVGNSLFASA-N Val-Arg-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PAPWZOJOLKZEFR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000005309 bone marrow development Effects 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000009096 combination chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013230 female C57BL/6J mice Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010072405 glycyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066198 glycyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 description 1
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 150000003673 urethanes Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polyethers (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
V predloženém rešení jsou popsány fyziologicky aktivní konjugáty PEG-GCSF obecného vzorce I a rovnež prostredky, které obsahují smes konjugátu, u nichž m a n mohou být ruzná celá císla pro jednotlivé konjugáty ve smesi.
Description
Oblast techniky
Faktor stimulující kolonie granulocytů (GCSF) je farmaceuticky aktivní protein, který reguluje množení, diferenciaci a funkční aktivaci neutrofílních granulocytů (Metcalf, Blood67: 257 (1986); Van a kol., Blood 84(3): 795-799 (1994); Bensinger a kol., Blood 81(1): 3158-3163 (1993); Roberts a kok, Exptl. Hematology 22: 1 156-1 163 (1994); Neben a kol., Blood 81(7): 1960-1967 (1993)). GCSF může mobilizovat kmenové buňky a prekurzorové buňky kostní dřeně a je používán pro léčení pacientů, jejichž granulocyty byly vyčerpány chemoterapií, nebo jako příprava před transplantací kostní dřeně .
Dosavadní stav techniky
Patent US 5 214 132 popisuje mutovanou formu lidského GCSF, která se tiší od přirozeného hGCSF na pozicích 1, 3, 4, 5 a 17, kde namísto přirozených GCSF aminokyselin má mutovaná forma Ala, Thr, Tyr, Arg, respektive Ser. (Viz také Kuga a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 103-111 (1989)). M. Okabe a kol., (Blood 75(9): 1 788-1 793 (1. květen 1990)) popisuje derivát rhGCSF, v němž byly zaměněny aminokyseliny na pěti pozicích v N-koncové oblasti rhGCSF, který vykazoval ve dvou testech na myších a/nebo lidských buňkách kostní dřeně vyšší specifickou aktivitu než původní rhGCSF. Patent US 5 218 092 popisuje mutovanou formu lidského GCSF, která se liší od přirozeného hGCSF na pozicích 1, 3, 4, 5, 17, 145 a 147, kde namísto přirozených GCSF aminokyselin má mutovaná forma Ala, Thr, Tyr, Arg, Ser, Asn, respektive Ser. Obsahy patentů US 5 214 132 a US 5 218 092 jsou zde zahrnuty jako odkaz.
Biologická dostupnost proteinových léčiv, jako je GCSF, je často omezena jejich krátkým poločasem v plazmě a citlivostí k degradaci proteázou, což zabraňuje maximálně využít jejich klinické možnosti. Studie jiných terapeutických proteinů ukázaly, že takové potíže mohou být překonány konjugací proteinu k polymeru, jako je polyethylenglykol (PEG), typicky například pomocí složky kovalentně vázané jak k proteinu, tak k PEG.
U takovýchto biologických molekul konjugovaných s PEG bylo ukázáno, že mají užitečné klinické vlastnosti (Inada a kol., J. Bioact. and Compatible polymers, 5: 343 (1990); Delgado a kol., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9: 249 (1992); a Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10: 91 (1993)). Jde například o lepší fyzikální a tepelnou stabilitu, ochrana proti citlivosti k enzymatické degradaci, zvýšená rozpustnost, delší invivo poločas cirkulace a snížené vylučování, snížená imunogenita a antigenicita a snížená toxicita.
Konjugáty PEG-GCSF, které mají jinou strukturu než konjugáty, kteréjsou předmětem tohoto vynálezu, jsou popsány v publikaci evropského patentu EP 0 335 423; v publikaci evropského patentu EP 0 401 384; R. W. Niven a kok, J. Controlled Release 32: 177-189 (1994); a SatakeIshikawa a kol., Cell Structure and Function 17: 157-160 (1992)).
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je nová třída PEG derivátů GCSF. Konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má amidový linker a je zobrazen dále.
Ve srovnání s nemodifikovaným GCSF (tj. GCSF bez připojeného PEG), má konjugát zvýšený poločas cirkulace a doby výskytu v plazmě, snížené vylučování a zvýšenou aktivitu tvoření granulocytů in vivo. Dále ve srovnání s PEG-GCSF konjugáty, konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má vynikající vlastnosti, pokud se týká podpory tvoření granulocytů. Jiné PEG-GCSF
- 1 CZ 300546 B6 konjugáty jsou popsány v publikaci evropského patentu EPO 335 423; v publikaci evropského patentu EP 0 401 384; a v Niven a kok, J. Controlled Release 32: 177-189 (1994). Avšak konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má odlišnou strukturu od těchto konjugátů a má vynikající vlastnosti, zvláště vykazuje dlouhodobou, vysokou aktivitu podpory tvoření granulocytů in vivo při nízké dávce.
Výhodný GCSF, který je předmětem tohoto vynálezu, je mutovaná forma GCSF, která má vlastnosti rovnocenné nebo lepší, než přirozený GCSF a má stejné způsoby použití jako GCSF. Mutovaná forma má stejnou aminokyselinovou sekvenci jako GCSF, kromě pozic 1, 3,4, 5 a 17, kde namísto přirozených aminokyselin má mutovaná forma Ala, Thr, Tyr, Arg, respektive Ser (mutovaná forma GCSF) (viz obrázek 1). Tato mutovaná forma je popsána v patentu US 5 214 132, který je zde zahrnut jako odkaz.
Fyziologicky aktivní PEG-GCSF konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má obecný vzorec I
RO(CH2CH2O)nCH2CH2-C-NH (l)
Součástí tohoto vynálezu jsou také prostředky připravené z nárokovaných konjugátů, kde man mohou být různá celá čísla pro konjugáty v prostředku.
Konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má stejné použití jako GCSF. Konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, je zvláště užitečný pro léčení těch pacientů, jejichž granulocyty byly vyčerpány chemoterapií, nebo jako příprava před transplantací kostní dřeně stejným způsobem jako je GCSF používán pro léčení stejných stavů. Avšak konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má vylepšené vlastnosti včetnč vynikající stability, vyšší rozpustnosti, zvýšeného poločasu cirkulace a prodloužené doby výskytu v plazmě.
Nárokovaným vynálezem je fyziologicky aktivní konjugát PEG-GCSF, který má obecný vzorec I
O
RO(CH2CH2O)nCH2CH2-C-NH-m (i) kde G je faktor stimulující kolonie granulocytů, bez těch jeho aminových skupin, které se účastní amidové vazby se strukturou PEG, jak je uvedeno v obecném vzorci I, R je nižší alkyl, n je celé číslo od 420 do 550 a m je celé číslo od 1 do 5.
Čísla n a m jsou vybrána tak, že výsledný konjugát obecného vzorce I má fyziologickou aktivitu srovnatelnou s nemodifikovaným GCSF, tato aktivita může být stejná, větší nebo představovat část odpovídající aktivity nemodifikovaného GCSF. n představuje počet ethylenoxidových zbytků v jednotce PEG. Jedna podjednotka PEG tj. OCH2CH2 má molekulovou hmotnost asi 44 daltonů. m představuje počet jednotek PEG připojených k molekule GCSF. Konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, může mít jednu, dvě, tři, čtyři, pět nebo šest jednotek PEG na molekulu GCSF. Molekulová hmotnost konjugátu (mimo molekulové hmotnosti GCSF) tedy závisí na číslech n a m.
-2CZ 300546 B6 n může mít hodnotu 420 až 550, a vytváří tak konjugát v němž každá jednotka PEG má průměrnou molekulovou hmotnost od asi 18 000 daltonů do asi 25 000 daltonů na jednu jednotku PEG. Je výhodné, když n má hodnotu 450 až 490, a vytváří tak konjugát v němž každá jednotka PEG má průměrnou molekulovou hmotnost asi 20 000 daltonů. m může mít hodnotu 1, 2, 3, 4 nebo 5.
Výhodné m je 1 až 4 a zvláště výhodné m je 2. Rozsah molekulové hmotnosti PEG části konjugátů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je asi od 18 000 daltonů (n=420; m=l) do asi 125 000 daltonů (n=550; m=5). Když n je 420 až 550 a m je celé číslo 1 až 4, rozsah molekulové hmotnosti PEG části konjugátů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je asi od 18 000 daltonů (n=420; m=l )do asi 97 000 daltonů (n=550; m=4). Molekulová hmotnost „asi“ určité číslo znalo mená, že molekulová hmotnost je v přiměřené blízkosti tohoto čísla, při zjišťování běžnými analytickými technikami.
Ve výhodném provedení konjugátu je n 450 až 490 amje 1 až 4, a v tomto případě je rozsah molekulové hmotnosti PEG části konjugátů od asi 20 000 daltonů (n-450; m=l)do asi
86 000 daltonů (n=490; m=4). V jiném výhodném konjugátu je n 420 až 550 a m je 2, v tomto případě je rozsah molekulové hmotnosti PEG části konjugátů asi od 37 000 daltonů (n=420) do asi 48 000 daltonů (n=550). Ve zvláště výhodném konjugátu je n 450 až 490 a m je 2, v tomto případě je rozsah molekulové hmotnosti PEG části konjugátů asi od 40 000 daltonů (n=450) do asi 43 000 daltonů (n=490).
R může být jakýkoli nižší alkyl, čímž je míněna alkylová skupina, která má od jednoho do šesti uhlíkových atomů, jako jsou methyl, ethyl, isopropyl atd. Jsou zahrnuty i rozvětvené alkyly. Výhodným alkylem je methyl.
Zkratkou GCSF je míněn přirozený nebo rekombinantní protein, s výhodou lidský, který je získán z jakéhokoli běžného zdroje, jako jsou tkáně, syntéza proteinů, buněčná kultura přirozených nebo rekombinantních buněk. Je sem zahrnut jakýkoli protein, který má aktivitu GCSF, jako jsou muteiny nebo jinak modifikované proteiny. Získání a izolace GCSF z přírodních nebo rekombinantních zdrojů jsou dobře známy (viz například patent US 4 810 643 a patent US 5 532 341, jejichž obsahy jsou zde zahrnuty jako odkaz). Výhodný GCSF konjugát je konjugát s GCSF Muteinem, jak je popsáno v patentu US 5 214 132.
Fyziologicky aktivní konjugát obecného vzorce I má GCSF aktivitu, čímž je míněna jakákoli část nebo násobek jakékoli známé GCSF aktivity, jak je určováno různými testy, známými v oboru.
Zvláště platí, že konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má GCSF aktivitu, která se projevuje schopností zvyšovat počet PMN. Toto je známá aktivita GCSF. Tento druh aktivity konjugátu může být určen testy, které jsou v oboru dobře známé, například testy, které jsou popsány dále (viz také: Asano a kol., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2 767-2 773; Yamasaki a kol., J. Biochem. (1994) 115: 814-819; a Neben a kol., Blood (1993) 81: 1960).
Konjugát obecného vzorce I vzniká kovalentní vazbou GCSF s reakčním činidlem, kyselinou sukcinimidylpropionovou (SPA), která má obecný vzorec: II
Reakční činidlo obecného vzorce II může být získáno běžnými metodami, podle známých postupů (viz patent US 5 672 662, jehož obsah je zde zahrnut odkazem), n je stejné jako v obecném vzorci 1 výše, a je vybráno tak, aby byl vytvořen konjugát požadované molekulové hmotnosti. Jsou výhodné takové reagencie, v nichž je n od 450 do 490 (molekulová hmotnost =
-3CZ 300546 B6
000 daltonů). Jiné molekulové hmotnosti mohou být získány pomocí běžných metod změnami n u výchozího materiálu PEG-alkohol pro reakční činidlo obecného vzorce II. Reakční činidlo SPA obecného vzorce II s molekulovou hmotností 5, 10, 15 a 20 000 může být získáno od Shearwater PolymersPolymers, lne., (Huntswille, Alabama).
Reakční činidlo obecného vzorce II může být konjugováno kGCSF pomocí běžných metod. Vazba se uskutečňuje pomocí amidové vazby. Přesněji řečeno, reakční činidlo obecného vzorce II primárně reaguje s jednou nebo více primárními aminovými skupinami (například N-konec a postranní řetězce lysinu) GCSF a vytváří amidovou vazbu mezi GCSF a polymerovou kostrou PEG. NH uvedené v obecném vzorci I je odvozeno z této primární aminové skupiny (skupin) GCSF, která reaguje s reakčním činidlem obecného vzorce II a vytváří amidovou vazbu. V menším rozsahu může reakční činidlo obecného vzorce II také reagovat s hydroxylovou skupinou šeřinu na pozici 66 v GCSF a vytvořit esterovou vazbu mezi GCSF a polymerovou kostrou PEG. Podmínky reakce jsou běžně známé osobám se zkušeností v oboru a jsou detailně popsány dále.
Připojení reakčního činidla k GCSF může být provedeno běžnými metodami. V tomto vynálezu může být použit PEG o jakékoli vybrané molekulové hmotnosti (n). Například reakce může být provedena v roztoku při pH od 5 do 10, při teplotě od 4 °C do teploty místnosti, po dobu od 30 minut do 20 hodin, za použití molámího poměru reakčního činidla k proteinu od 4:1 do 30:1. Reakční podmínky mohou být vybrány tak, aby reakce směřovala k vytváření převážně požadovaného stupně substituce. Obecně platí, že nízká teplota, nízké pH (např. pH 5) a krátká doba reakce mají tendenci snižovat počet připojených PEG (nízké m). Vysoká teplota, neutrální až vysoké pH (např. pH >7) a delší doba reakce zvyšují počet připojených PEG (vyšší m). Například v případě reakčního činidla obecného vzorce II s molekulovou hmotností 5000 daltonů, při pH 7,3 a molámím poměru reakčního činidla k proteinu 30:1, teplotě 4 °C a reakční době 30 minut, vzniká převážně konjugát s jedním PEG (mono—PEG); při teplotě 4 °C a reakční době 4 hodiny vzniká převážně konjugát se dvěma PEG (di-PEG); a při teplotě místnosti a reakční době 4 hodiny vzniká převážně konjugát se třemi PEG (tri-PEG). Reakce je ukončena okyselením reakční směsi a zmražením na —20 °C. Obecně je dávána přednost pH od 7 do 7,5 a molárnímu poměru reakčního činidla k proteinu od 4:1 do 6:1.
Purifikační metody, které účinně oddělují konjugáty podle jejich rozdílných molekulových hmotností, jako je kationtová výměnná chromatografie, mohou být použity pro oddělení konjugátů podle rozdílů v náboji. Například sloupec pro výměnu kationtů může být navrstven a potom promyt ~20 mM octanem sodným, pH ~4, a potom vymýván lineárním gradientem (0 M až 0,5 M) NaCI, pufro váným při pH od 3 do 5,5, s výhodou při pH -4,5. Obsah frakcí, získaných kat iontovou výměnnou chromatografií může být určován podle molekulové hmotnosti pomocí běžných metod, například hmotnostní spektroskopií, SDS—PAGE nebo jinými známými metodami pro oddělování molekul látek podle molekulové hmotnosti. Podle toho jsou určeny frakce obsahující konjugát obecného vzorce I, který má požadovaný počet (m) připojených PEG, vyčištěny od nemodifikovaného GCSF a od konjugátů, které mají připojený jiný počet PEG.
Součástí tohoto vynálezu je prostředek z konjugátů, kde jsou zastoupeny ve specifických poměrech konjugáty, které mají různé hodnoty m. Výhodným prostředkem tohoto vynálezu je směs konjugátů, kde m-l. 2, 3 a 4. Procento konjugátů, kde m=l, je 18 až 25 %, procento konjugátů, kde m=2, je 50 až 66 %, procento konjugátů, kde m=3, je 12 až 16 % a procento konjugátů, kde iTrM. je až 5 %. Takový prostředek je připravován reakcí pegylačního reakčního činidla s GCSF v molámím poměru od 4:1 do 6:1 (nadbytek reakčního činidla). Reakce je ponechána probíhat při 4 až 8 °C po dobu 20 hodin při pH blízko 7,5. Na konci reakce je přidána kyselina octová. Konjugát je potom purifikován od zbytkového nemodifikovaného proteinu, nadbytku pegylačního reakčního činidla, ostatních nečistot a složek pufru, přítomných v průběhu reakce. Spolu s pegylovaným· proteinem, vznikají jako vedlejší reakční produkty N-hydroxysukcinimid a polyethylenglykolkarboxylová kyselina.
-4CZ 300546 B6
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1: Primární struktura GCSF Muteinu
Uvedený GCSF Mutein se liší od standardního typu lidského GCSF na pozicích 1,3, 4, 5 a 17, kde namísto přirozených aminokyselin má mutein Ala, Thr, Tyr, Arg, respektive Ser.
Obrázek 2: Reagencie pro pegylaci.
Obrázek 3: Vzájemné oddělení 20 kDa GCSF Muteinu, modifikovaného pomocí PEG od formy nemodifikované PEG. Typický eluční profil pro PEG reakční směs.
Sloupec: 1 až 2 ml Fractogel® EMD SO3 650S.
Ekvilibrační pufr: 10 mM octan amonný, pH 4,5 Eluční pufry: 1. 0,15 M NaCl v ekvilibraěním pufru
2. 0,5 M NaCl v ekvilibraěním pufru
Obrázek 4: Aktivita PEG-GCSF Muteinu 5. den po jedné injekci
Samice myšího kmene C57BL/6J dostaly podkožně injekci obsahující 25,2 pg pegylovaných konjugátů GCSF Muteinu; 5. den po podání injekce byly odebrány vzorky žilní krve z dutiny za očnicí. Byly provedeny hematologické a leukocytové diferenciální analýzy; výsledné počty neutrofilů byly standardizovány k nosičové kontrole, prováděné v každém pokuse. Uvedené údaje představují průměr ± standardní odchylku (S.E.) ze čtyř myší ve skupině.
Obrázek 5: Zvýšení počtů PMN jako funkce hmotnosti PEG (kDa) v amidem a močovinou vázaných konjugátech PEG-GCSF Muteinu. Pro konjugáty připravené pomocí reakěního činidla SPA PMN=0,277*molekulámí hmotnost+3,95. Pro konjugáty připravené pomocí močoviny PMN=0,152* molekulární hmotnost+2,74.
Obrázek 6: Aktivita PEG-GCSF Muteinu 7. den pojedná injekci
Samice myšího kmene C57BU6J dostaly podkožně injekci obsahující 25,2 pg pegylovaných konjugátů GCSF Muteinu; 7. den po podání injekce byly odebrány vzorky žilní krve z dutiny za očnicí. Byly provedeny hematologické a leukocytové diferenciální analýzy; výsledné počty neutrofilů byly standardizovány k nosičové kontrole, prováděné v každém pokuse. Uvedené údaje představují průměr ± standardní odchylku (S.E.) ze čtyř myší ve skupině.
Obrázek 7: Test mobilizace kolonií myších PBSC
Obrázek 8: Test mobilizace kolonií myších PBSC
Obrázek 9: Test mobilizace kolonií myších PBSC
Obrázek 10: Test mobilizace kolonií myších PBSC
Obrázek 11: Test mobilizace kolonií myších PBSC
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady jsou podány pro ilustraci zde popsaného vynálezu a žádným způsobem jej neomezují. V těchto příkladech je použit GCSF Mutein. Jiné druhy GCSF mohou být také pomocí uvedených metod konjugovány s PEG.
Příklad 1: Pegy lační reakční činidla: l.GABA amidový línker (P-6GA-1, P-12Ga-l)
Reakční činidlo GABA amidového linkeru obsahuje 2 řetězce PEG, každý s molekulovou hmotností 6000 nebo 12 000 daltonů. Struktury viz na obrázku 2-A.
-5CZ 300546 B6
2. Amidový linker (P-5 am-1, P-10am-l)
Byly připraveny amidové linkery s molekulovou hmotností 5000 a 10 000 daltonů. Strukturu viz na obrázku 2-B.
3. Amidový linker
Tímto reakčním činidlem byla komerčně dostupná kyselina sukcinimidylpropionová (SPA), připravená s PEG o molekulové hmotnosti 5, 10, 15 a 20 000 daltonů ajejich obecná struktura je zobrazena na obrázku 2-C.
4. Linker odvozený od močoviny
Toto reakční činidlo bylo připraveno s molekulami PEG 5, 10 a 25 000 daltonů a obecná struktura je zobrazena na obrázku 2-D.
5. Uretanový linker
Byly připraveny uretanové linkery o molekulové hmotnosti 10 a 20 000 daltonů a struktura je zobrazena na obrázku 2-E.
6. Uretanový linker
Jak ukazuje struktura tohoto komerčně připraveného reakěního činidla PEG o molekulové hmotnosti 36 000 daltonů, zobrazeného na obrázku 2-G, jeden konec reakěního činidla je zakončen tbutylovou skupinou. Toto reakční činidlo bylo PEG o nejvyšší molekulové hmotnosti, použitý v tomto příkladě.
7. Sulfanyluretanový linker
Strukturu tohoto pegylačního reakěního činidla je možno vidět na obrázku 2-F. Molekulová hmotnost PEG použitého v tomto reakčním činidle byla 20 000 daltonů.
Následující reakční činidla byla poskytnuta Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tokyo, Japonsko): 1)G-CSF mutein označený GCSF Mutein, GCSF Mutein konjugovaný s reakčním činidlem meth oxy polyethylenglykolem s větveným řetězcem (m-PEG), obsahujícím 2 řetězce m-PEG o molekulové hmotnosti buď 6000 nebo 12 000 daltonů (PEG-GABA-NHS, viz obrázek 2A) GCSF Mutein konjugovaný s lineárním reakčním činidlem ester/amid m-PEG (viz obrázek 2B) s molekulovou hmotností 5000 a 10 000 daltonů. Reakční činidla m-PEG-sukcinimidylpropionová kyselina-NHS (PEG-SPA) o molekulových hmotnostech 5000, 10 000, 15 000 a 20 000 daltonů byla zakoupena od Shearwater Polymers (Huntsville, Alabama, viz obrázek 2C). Následující reakční činidla pro pegy láci proteinů byla připravena v Hoffmann-La Roche, lne: 1) linker m-PEG-močovina (5000, 10 000 a 25 000 daltonů, viz obrázek 2D), 2) linker m—PEGuretan (5000, 10 000 a 25 000 daltonů, viz obrázek 2E), m-PEG-sulfanyluretanový linker (10 000 a 20 000 daltonů, viz obrázek 2F) a t-butyl-m-PEG-uretanový linker s průměrnou molekulovou hmotností 36 000 daltonů byl získán od DDI Pharmaceuticals, lne. (Mountaínvíew, CA, viz obrázek 2G).
Pegy lační reakce
Faktory, které ovlivňují pegylační reakce jsou 1) pH, 2) teplota, 3) doba reakce, 4) molární poměr proteinu k reakčnímu činidlu PEG, a 5) koncentrace proteinu. Kontrolou jednoho nebo více z těchto faktorů je možno reakci řídit směrem k produkci mono-, di-, tri-, atd. PEG konjugátů. Například reakční podmínky pro reakční činidlo Shearwater Polymers SPA-PEG 5000 (N-hydroxysukcinimid) byly: 1) pH 7,3, 2) teplota 4 °C pro mono-PEG a di-PEG, a teplota místnosti pro tri PEG. 3) doba reakce 30 minut pro mono-PEG; 4 hodiny pro di-PEG a tri-PEG; a 4) molární poměr proteinu k reakčnímu činidlu 1:30. Pro všechna reakční činidla byly optimální reakční podmínky pro přípravu požadovaného druhu PEG individuálně určeny. Jsou uvedeny v tabulce 1. Reakce je ukončena okyselením reakce a zmražením na -20 °C.
Oddělení modifikovaného a volného GCSF Muteinu z reakční směsi (výměna kationtů na sulfopropylové skupině (SP))
Reakční směs obsahující přibližně 5 mg proteinu byla zředěna 10 až 20x vodou a pH bylo upraveno ledovou kyselinou octovou na 4,5. Zředěné vzorky potom byly na předem navrstvený 1 až 2 ml sloupec Fractogel EMD SO3 - 650S (EM Separations, Gibbstown, New Jersey), kteiý byl
-6 CZ 300546 B6 v rovnováze s 10 mM octanem amonným, pH 4,5. Neadsorbované reakční činidlo a vedlejší produkty reakce byly odstraněny při průtoku. Modifikovaný GCSF Mutein byl vymyt pomocí stupňovitého gradientu, za použití 0,15 M NaCI v rovnovážném pufru. Nemodifikovaný GCSF Mutein, zbývající na sloupci byl eluován pomocí 0,5 M NaCI v rovnovážném pufru. Rozdělená směs PEG konj ugátu GCSF Muteinu byla sterilována filtrací pomocí 0,2 pm filtru a uložena zmražena při -20 °C.
Charakterizace PEG konjugátů GCSF Muteinu
Určování proteinu.
Koncentrace proteinu v purifikovaných PEG konjugátech GCSF Muteinu byly zjišťovány pomocí hodnoty A280, která se rovná 0,86 u roztoku s koncentrací 1 mg/ml. Analýza pomocí SDSPAGE
Tato analýza byla provedena za použití 12 a 15% polyakrylamidových gelů nebo 8 až 16% polyakrylamidových gradientových gelů za redukčních podmínek podle Laemmliho, Nátuře 227: 680-685, 1970.
Určení procentuálního složení v prostředku
Procentuální zastoupení každého druhu (mono-, di-, tri-, atd.) v různých reakčních směsích PEG konjugátů GCSF Muteinu bylo určováno pomocí denzitometrických měření SDS-PAGE gelů, obarvených modří Coomassie (viz tabulka 2).
Určení hmotnosti PEG v PEG konjugátech GCSF Muteinu
Celková hmotnost PEG, substituovaného v různých přípravcích byla určována podle průměrné molekulové hmotnosti PEG, určení jednotlivých PEG konjugátů (mono, di, atd.) na základě elektroforetické pohyblivosti, počtu připojených molekul PEG a na procentuálním zastoupení, určeném na základě denzitometrických měření SDS-PAGE gelů, obarvených modří Coomassie. Celková hmotnost PEG v určitém přípravku je součtem hmotností jeho jednotlivých PEG. Hmotnost jednotlivých PEG je spočítána z následující rovnice:
hmotnost PEG= molekulová hmotnost PEG x počet molekul PEG x % obsahu kde molekulová hmotnost PEG - 5000, 10 000, 20 000 daltonů počet molekul PEG = 1,2, 3 pro mono, di, respektive tri.
Hmotová spektrometrie (MALDI-TOF) byla také používána při určování celkové hmotnosti PEG. V takovém případě hmotnostní spektrum umožňovalo určení molekulové hmotnosti jednotlivých konjugátů PEG. Molekulová hmotnost PEG připojeného ke každému PEG konjugátu je sumou molekulových hmotností jednotlivých PEG konjugátů mínus molekulová hmotnost GCSF Muteinu (18 900 daltonů). Tyto hodnoty násobeny procentuálním zastoupením dávají jednotlivé hmotnosti PEG; jejich součtem je celková hmotnost PEG.
Obě metody byly použity pro určování hmotností PEG v různých přípravcích.
Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 2.
Určování hladin endotoxinů
Hladiny endotoxinů byly určovány pomocí metody LAL, podle návodu výrobce (Associates of Cápe Cod. Inc., Woods Hople, Massachusetts).
-7CZ 300546 B6
Biologické aktivity
Biologický test in vitro na buňkách M-NFS-60 a in vivo test na samici myšího kmene C57BL/6J byly provedeny tak, jak bylo dříve popsáno. (Viz Asano a kol., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2767-2773).
Výsledky a diskuse
Pegylační reakce
Výsledky obecně ukazují, že méně reaktivní reakční činidla, jako je linker odvozený od močoviny, vyžadují vyšší pH, teplotu a molámí poměr protein:reakční činidlo, a rovněž delší dobu reakce, aby bylo dosaženo požadovaného rozsahu konjugace (viz tabulky 1 a 2).
Oddělení modifikovaného a volného GCSF Muteinu z reakční směsí
Typický eluční profil je ukázán na obrázku 4. Vedle kat iontové výměnné chromatografie mohou být vyžadovány další kroky, jako je chromatografie na základě prostupování gelem, aby byly odstraněny stopy kontaminujících látek a endotoxinu, a provedena výměna pufru u konečného produktu pro uložení. Byly vypracovány účinné separační metody pomocí kationtové výměny pro rozsah 30 mg konjugátu, buď SPA (amidového) s molekulovou hmotností 20 000 daltonů a uretanového s molekulovou hmotností 20 000 daltonů. Tímto postupem jsou získány téměř kvantitativní výtěžky.
Procentuální složení a hmotnost PEG
Výsledky zjišťování procentuálního složení a hmotnosti PEG jsou souhrnně uvedeny v tabulce 2. Podle našich zkušeností, v případě konjugátů s vysokou molekulovou hmotností (např. 20 000 daltonů SPA diPEG a 12 000 daltonů GABA), určování procenta druhů PEG v reakční směsi, založené na elektroforetické pohyblivosti, není příliš spolehlivé. Pro zjištění hmotnosti PEG a určení vysoké molekulové hmotnosti a vysoce substituovaných PEG konjugátů jsou zapotřebí kombinace analýz SDS-PAGE, SP-HPLC a MALDI-TOF MS. Avšak monopegylované konjugáty a konjugáty PEG, odvozené od reakčních PEG činidel s nízkou molekulovou hmotností (např. 5000 daltonů), mohou být určeny docela přesně podle jejich SDS-PAGE profilů. Hladiny endotoxinu
Pomocí metody LAL bylo detekováno <1 EU/mg endotoxinu ve všech PEG konjugátech, kromě jednoho, odvozeného pomocí uretanového reakčního činidla. V tomto PEG konjugátu byl endotoxin detekován pouze po zředění. Bylo potvrzeno, že toto není způsobeno kontaminací během ředění a proto nějaký neznámý materiál v tomto vzorku mohl, při vyšší koncentraci proteinu, způsobovat inhibici v LAL testu. Po zředění vzorku a tím i zředění inhibujícího materiálu, byl pozorován pozitivní výsledek na endotoxin.
Biologická aktivita
In vitro a in vivo biologické aktivity všech PEG konjugátů GCSF Muteinu jsou uvedeny v Tabulce 2. Obecně byl pozorován inverzní vztah mezi in vitro aktivitou a stupněm substituce, a rovněž molekulovou hmotností PEG. Na rozdíl od tohoto je se zvyšující se molekulovou hmotností substituovaného PEG pozorováno zvýšení in vivo aktivity. Tento jev je také pozorován jinými autory (Satako-Ishikawa, a kol., Cell Struct. Funct. 17(3): 157—60, 1992). Je vysloven předpoklad, že chemické připojení molekul PEG k polypeptidové kostře GCSF Muteinu způsobuje nějaké konformaění změny, které záporně ovlivňují interakce receptorlligand, a tím snižují vazebnou afinitu. Dále relativně krátká doba inkubace při in vitro testu pravděpodobně nedostačuje k dosažení vrcholu aktivity. Na druhé straně in vivo test na myších je mnohem delší (dny) a
- 8 CZ 300546 B6 je ukončen několik dní po injekci léku. Tato delší inkubační doba, spojená s prodlouženým poločasem přetrvání PEG-GCSF Muteinu v krevním oběhu, kompenzují jakoukoli ztrátu vazebné aktivity, způsobenou pegylací. Konečným výsledkem je dosažení maxima biologické aktivity in vivo. Jinou hypotézou je, že PEG-GCSF Mutein působí, když je podán injekČně myši, jako prekurzor léku. Za takové situace je PEG složka PEG-GCSF Muteinu nějakým způsobem odštěpována, což má za následek trvalé uvolňování malých množství volného GCSF Muteinu, čímž se vysvětluje udržování a zvyšování in vivo aktivity. Avšak hypotéza lékového prekurzoru nevysvětluje základní úroveň aktivity in vivo, 7 dní po podání původní dávky. Mechanizmus lékového prekurzoru je nepravděpodobný, protože amidová vazba mezi proteinem a PEG je stabilní a není io možné ji snadno rozštěpit.
Mezi 15 studovanými PEG konjugáty GCSF Muteinu, byly in vivo aktivity P-12GA-1, SPA s molekulovou hmotností 20 000 daltonů, uretanového s molekulovou hmotností 20 000 daltonů a uretanového s molekulovou hmotností 36 000 daltonů výrazně vyšší než u zbývajících prepa15 rátů (viz obrázek 4 a tabulka 2).
Obecně je možno říci, že je pozorován přímý vztah mezi molekulovou hmotností molekuly PEG a zvýšenou aktivitou in vivo. Toto je zobrazeno na obrázku 5, kde je zvýšení počtů PMN vyjádřeno jako funkce celkové hmotnosti PEG konjugátů, vázaných pomocí amidu (SPA) a PEG kon20 jugátů vázaných pomocí linkeru odvozeného od močoviny.
Výběr a charakteristiky PEG konjugátů GCSF Muteinu
Po pečlivém zhodnocení chemického principu konjugace, biologických vlastností a léčivých vlastností u 15 PEG konjugátů, byly tři z nich vybrány pro další hodnocení, a to: 1) P-12GA-1,
2) SPA s molekulovou hmotností 20 000 daltonů a 3) uretanový s molekulovou hmotností 20 000 daltonů. Pomocí SPA odvozené mono, di a triPEG konjugáty s molekulovou hmotností 20 000 daltonů, přítomné v SP-purifi kované reakční směsi, byly hodnoceny vzájemným porovnáním a ukázalo se, že všechny tři udržovaly vysokou aktivitu granulocytů u samic myšího kmene C57BL/6J po dobu 5 dnů po jedné dávce 25,2 pg (tabulka 3 a obrázek 4). Naopak, pro udržení podobné aktivity byly nutné každodenní dávky nemodifikovaného GCSF Muteinu (údaje nejsou ukázány). Ve všech případech kromě dvou (SPA s molekulovou hmotností 20 000 daltonů a P—12GA-1), se invivo aktivita navrátila na normální úroveň sedmý den po počáteční dávce podané myši (obrázek 6). Jak SPA konjugát s molekulovou hmotností 20 000 daltonů, tak konju35 gát P-12GA-1 vykazovaly zvýšenou aktivitu při nižším dávkování 8,4 pg a navrátily se na normální úroveň sedmý den po počáteční dávce (viz tabulka 3). Údaje o procentovém složení (tabulka 3) ukazují, že přípravky jak SPA konjugátu s molekulovou hmotností 20 000 daltonů, tak konjugátu P-12GA-1 obsahují přibližně 50% dimerů a zbývajících 50 % je rozděleno mezi monomer a trimer. Uretanové reakční činidlo s molekulovou hmotností 20 000 daltonů produkuje za použitých reakčních podmínek (viz tabulka 3) převážně mono-PEG deriváty. In vitro aktivita všech hodnocených PEG konjugátů, včetně převládajícího monomemího uretanového derivátu, sleduje obecnou nepřímou úměrnost ke stupni substituce a tedy rovněž k molekulové hmotnosti PEG. In vivo biologická aktivita hodnocených PEG konjugátů vykazovala přímou úměrnost k molekulové hmotnosti PEG v celém hodnoceném rozsahu molekulových hmotností (obrá45 zek 5).
Závěry
Mezi zkoušenými 15 PEG konjugáty GCSF Muteinu vykazovaly dobré profily in vivo aktivity P50 12GA-1, SPA s molekulovou hmotností 20 000 daltonů a uretanový s molekulovou hmotností
000 daltonů. Nej lepší všeobecné vlastnosti, včetně hospodárnosti produkce, vykazoval PEGGCSF Mutein s molekulovou hmotností 20 000 daltonů.
-9CZ 300546 B6
Tabulka 1
Reakční podmínky použité pro přípravu různých PEG konfugátů
| Molekulová hmotnost | chemický typ | Reakční podmínky | |||
| PH | Teplota | Doba | Poměr | ||
| 5000 | močovina | 10 | teplota místnosti | 1 hodina | 1:100 |
| 5000 | amid | 7,3 | teplota místnosti | 4 hodiny | 1:30 |
| 10 000 | močovina | 10 | teplota místnosti | 1 hodina | 1:100 |
| 10 000 | amid | 7,3 | teplota místnosti | 4 hodiny | 1:30 |
| 10 000 | uretan | 10 | 4 CC | 1 hodina | 1:30 |
| 15 000 | amid | 7,3 | teplota místnosti | 4 hodiny | 1:30 |
| 20 000 | amid | 7,3 | teplota místnosti | 4 hodiny | 1:30 |
| 20 000 | sutfanyluretan | 8 | teplota místnosti | 17 hodin | 1:30 |
| 20 000 | uretan | 10 | 4 °C | 1 hodina | 1:30 |
| 25 000 | močovina | 10 | teplota místnosti | 1 hodina | 1:100 |
| 36 000 | uretan | 8 | 4 °C | 6 hodin | 1:3 |
- 10CZ 300546 B6
Tabulka 2 □
c
Σ3
S
LL
CO
O
O ó
LU
Q_
-□
CD □
čf
MD
-SC ra o
ío o
Φ ra1
Ό o
ra
O
LU
Cl
I ε
x:
ra o
co
| Aktivity i | PMN (% kontroly) | 536+40 | 539+23 | CN «0 + CN rt CO | Ol + o N- | Γ 751+115 | 977+120 | r- CN + Ν' IO CN | 364+50 | 716+87 | 412+88 | CN IO + CO to co | CN rt T- + 00 00 00 | 494+71 | | 598+117 I | | 886+120 | | |||||||||
| & 5 | co Ν' CN CN | 18,65 | 20,48 | 20,13 | 8 co CN | 29,23 | 12,78 | I 14,4 I | CN | oi 03 | ! 7% 1 25,83 1 | í 25,05 I | 21,85 | Oi CN | | 30,03 | | ||||||||||
| M-NFS-60 | £ σ» | £ ιθ | %> I | £ CD | to | o Ν’ | £ CN Ν' | £ CD | £ O | | 15% i | £ o CN | S v- | £ rt | ||||||||||||
| * Hmotnost přidaného PEG | b co CN | 20 000 | | * * 8 r- cŇ | o o LO O) CN | 31 710 | | * o o 8 | ! 11 350 | | O O OO CN CN | | 63 775 I | 29 050 | | * « o o 00 co CN | 54 000 | | | 28 440 | | L O T— 00 | $ | ||||||||||
| oligo | aí | 8 τ- | o | CO CN | o | o | rt CN | rt CN | Γ- ΟΟ T- | IO rt | O | o | o | O | o | ||||||||||
| ožení tri | 51,3 | Ο | 27,2 | 53 | to CN | 22,9 | 23 | 23 | 41,6 | 36,5 | CN Ν' T” | o | co K | co CN | r- T~ | ||||||||||
| tn 4t | 22,3 | O | 63 | - | CN Τ- Ο | 49,5 | σι | 03 | 15.4 | 12,6 | Ν' | 50 | CN | 54,3 | 47 | ||||||||||
| mono | 17,3 | o | co o | o | t 137 | co !< CN | G> CN | 29 | 24,7 | 15,8 | CO r— CO | 50 | I 70,8 | Γ 43,4 | [ 36 | ||||||||||
| Typ linkeru | Ό Έ < | |(b)5000 1 | | (a) 5000 I | 8 O o S | o 8 O | o o o to | | (c) 20 000 | | | Močovina i | | (a) 5000 | | | (a) 10 000 | | |(b)25 000 | | | Uretan | | o o o o T X? | | (c) 20 000 Π | | (a) 36 000 I | c £ 3 > C £ tfí | i (b) 20 000 | | | GABA | | |(b)5000 | | CN S |
% složení a hmotnost přidaného PEG jsou vypočteny na základě denzitometrických měření SDS-PAGE gelů, barvených modří Coomassie (*), nebo pomocí MALDI-TOF hmotnostní analýzy (**) (a), (b), (c): každý představuje samostatný biologický test; jsou uvedeny údaje o PMN z pátého dne
Tabulka 3 i
Φ o
ε c
>
x:
»o ta '<D σ>
o o
JQ o
φ ňT
O o
co ω
«
E *0 c
ta >
o >.
cn φ
CL
Ο ιη □_ to ο
C ο
Ε χζ φ
’8
W
| Aktivity I | PMN (% kontroly) | φ Ό l< | 100 76 906 | Dávka I | σι 2. CN m CN | s LO | r- Ν' Ν' | 119 | ||||||
| σ 2. Ν’ CO' | 140 i | CO O | I frí | |||||||||||
| 5. den | 100 86 1182 | cn η. CN LO CN | Ν' CO O t— | oo r- σ> | cn n! | |||||||||
| σ =1 'Ν' co' | τ- Ο r- | co ín | 222 | | |||||||||||
| WBC | 7. den | 8,97 I 6,1 24,58 | 08 2 CN in CN | 24,1 | | to n· lo“ | I 7,93 I | ||||||||
| σ Ξ1 Ν' CO* | 107 | | lO | s to | |||||||||||
| 5. den | to tn tn CO 00 CN | CT 2 CN LO CN | | 30,03 I | co co CN | I 17,43 | | |||||||||
| ra 2 Ν' co' | 22,75 | | 00 LO co' | 8,35 | | |||||||||||
| M-NFS- 60 | Nosič (kontrola) ND 28: jedna injekce 25,2 pg ND 28: injekce 25,2 pg denně | co | LO | r- | ||||||||||
| ** Hmotnost PEG (daftonů) | 46,5 | | T- co co | 26,8 | | |||||||||||
| *% složení mono di tri oligo | 36,0 47,0 17,0 0,0 | o o cn CN CN LO cn Ν’ CO Γ-.* CN | 81,8 4,0 14,2 0,0 l | |||||||||||
| Molekula PEG | 12 000 GABA | 20 000 SPA | 20 000 uretan |
Samicím myšího kmene C57BL/6J bylo podáváno 8,4 nebo 25,2 pg buď ND-28 denně„nebo jedna dávka PEG konjugátu. Pátý a sedmý den po počáteční dávce byly odebrány vzorky žiiní krve a byla provedena diferenciální analýza leukocytů.
* Na základě denzitometrických měření SDS-PAGE barvené modří Coomassie.
** Určováno pomocí MALDlTOF MS
- 12 CZ 300546 B6
Příklad 2: Příprava PEG o molekulové hmotnosti 20 000 daltonů konjugovaného s rhGCSF Muteinem
Modifikace G-CSF muteinu pomocí methoxy-PEG sukcinimidylpropionové kyseliny (SPA) byla provedena následujícím způsobem. Reakční činidlo PEG bylo rozpuštěno v destilované vodě na koncentraci -200 mg/ml a přidáno k roztoku G-CSF muteinu (-5 mg/ml) v molámím poměru od 4:1 až 6:1 (nadbytek reakčního činidla). Reakce byla ponechána probíhat při 4 až 8 °C po dobu 20 hodin při pH -7,5. Na konci reakce byla přidána ledová kyselina octová, která reakci ukončila. Pegylovaný GCSF Mutein (také označovaný jako PEGG) byl potom vyčištěn od zbytkového io nemodifikovaného muteinu, nadbytku reakčního činidla PEG a jiných nečistot a složek pufru, přítomných v průběhu modifikace. Spolu s pegylo váným proteinem jako vedlejší produkty vznikají N—hydroxy suke i nimi d a polyethylenglykolkarboxylová kyselina.
PEGG byl vyčištěn pomocí kationtové výměnné chromatografie, po níž následovala ultrafíItrace.
Sloupec pro katíontovou výměnnou chromatografii byl navrstven a promýt v 20 mM octanu sodném, pH 4,0. Eluce pomocí lineárního gradientu chloridu sodného oddělila PEGG od všech jiných složek v reakční směsi. Následně byla použita ultrafíltrace/diafiItrace pro zkoncentrování PEGG na koncentraci -4,0 mg/ml a výměnu pufru za 20 mM octan sodný, 50 mM chlorid sodný, pH 6,0.
Pět pegylačních a purifikačních cyklů, provedených za podmínek uvedených výše, bylo analyzováno pomocí kationtové výměnné chromatografie a ukázalo se, že pegylační reakce GCSF muteinu je reprodukovatelná. Bylo ukázáno, že pegylační reakce je reprodukovatelná až do množství 2,5 g na reakcí (konečný výtěžek PEGG), za následujících optimálních podmí25 nek:poměr SPA-PEG s molekulovou hmotností 20 000 daltonů:muteinu 4 až 6:1; pH -7,5, 4°C, 20 hodin. Bylo zjištěno, že průměrné procentuální složení směsi PEGG bylo 21,7% monoPEGG (%RSD=16,6), 60,3 % di-PEGG (%RSD=6,6), 15,1 % tri-PEGG (%RSD=4,0), a 2,9% tetra-PEGG (%RSD=26,1), jak je ukázáno v tabulce 4.
Tabulka 4
Relativní procentuální složení mono, di, tri a tetra-PEGG v pěti PEGG syntézách a purifikačních cyklech, zjišťované analýzou pomocí výměny kationtů
| Číslo syntézy | Mono-PEGG (%RSD, pět měření) | Di-PEGG (%RSD, pět měření) | Tri-PEGG (%RSD, pět měření) | Tetra-PEGG (%RSD, pět měřen í) |
| 1 | 21,9% (8,0) | 60,3 % (2,2) | 15,1% (2,2) | 2,7 % (4,7) |
| 2 | 27,5 % (2,3) | 54,4% (1,0) | 15,7% (0,8) | 2,4% (1,2) |
| 3 | 18,2% (7,1) | 65,5 % (0,6) | 14,3% (6,6) | 2,0 % (9,3) |
| 4 | 21,7% (2,7) | 60,1 % (1,0) | 14,8% (0,5) | 3,5 % (0,9) |
| 5 | 19,2% (1,8) | 61,3% (0,9) | 15,7% (3,7) | 3,8 % (4,5) |
| Průměrné složení | 21,7% (16,6) | 60,3 % (6,6) | 15,1 % (4,0) | 2,9% (26,1) |
Příklad 3: Mobilizace kmenových buněk periferní krve 40
Byly vyvinuty techniky jak mobilizovat jak primitivní kmenové buňky, tak aktivní prekurzory z kostní dřeně, a zvýšit počet cirkulujících zárodečných buněk v periferní krvi. Tyto stimulované
-13 CZ 300546 B6 buňky mohou být schopny zprostředkovat časné i trvalé ujmutí se štěpu po smrtelném ozáření a transplantátů kostní dřeně nebo kmenových buněk. Neben, S. Marcus, K. a Mauch P.: Mobilizace subpopulací krevních kmenových a zárodečných buněk kostní dřeně do krve po cyklofosfamidu a/nebo faktoru stimulujícím kolonie granulocytů. Blood 81: 1960 (1993). Doplňování kmenových buněk periferní krve (PBSC) může pomoci zkrátit zotavení krvetvorby u pacientů, u kterých bylo chemoterapií způsobeno nedostatečné vyvinutí kostní dřeně nebo u těch pacientů, u kteří prodělali jiný typ odstranění kostní dřeně. Roberts, A. W. a Metcalf, D.: Faktor stimulující kolonie granulocytů indukuje selektivní zvýšení počtu zárodečných buněk v periferní krvi myší. Experimental Hematology 22: 1 156 (1994). Pro stimulování mobilizace byly použity jak růstové faktory, tak chemoterapeutické léky. Bodine, D.: Mobilizace kmenových buněk periferní krve: tam kde je dým, je i oheň. Experimental Hematology 23: 293 (1995). Po stimulování PBSC byly mobilizované buňky odebrány oddělením leukocytů od krve a uchovány ve zmraženém stavu do doby, kdy budou potřeba. Nynější klinické protokoly požadují opakované odběry koncentrátů PBSC oddělením leukocytů od krve, po standardní chemoterapii vysokými dávkami (CHT) a opakované denní dávkování nebo kontinuální ínfuzi s růstovými faktory, někdy trvající dva týdny nebo déle. Brugger, W., Bross, K., Frisch, J., Dem, P., Mertelmann, R. a Kanz, L.: Mobilizace zárodečných buněk periferní krve opakovaným podáváním interleukinu-3 a faktoru stimulujícího kolonie granulocytů-makrofágů po polychemoterapii etoposidem, ifosfamidem a cis-platinou. Blood 79: 1 193 (1992). Studie popsané dále byly provedeny se dvěma myšími modely mobilizace PBSC, první model jsou normální myši a jako druhý byl použit myší chemoterapeutický model. Pokusy ukázaly, ve shodě s tímto vynálezem (PEGG), zvýšenou účinnost pegylovaného G-CSF Muteinu ve srovnání s NEUPOGENEM (G-CSF), při ovlivňování mobilizace kmenových buněk. Bylo rovněž potvrzena přednost pegylovaného muteinu vtom, že je významně snížené a mnohem účinnější dávkování.
Tyto studie hodnotily zvýšenou schopnost mobilizovaných nezralých myších PBSC, stimulovaných in vitro pomocí mnoha růstových faktorů, sedmidenním testem kolonií na agaru. Dále, vedle schopnosti vytvářet kolonie, byl zjišťován v krvi všech myší kompletní hematologický profil a byly hodnoceny absolutní počty neutrofilů (ANC). Rovněž byly určovány hladiny GCSF v séru. Po optimalizaci testu bylo provedeno několik časových pokusů, kdy byly hodnoceny vysoké a nízké dávky G-CSF. Pokusné modely zahrnovaly G^CSF a cyklofosfamidem Cytoxanem-indukovanou mobilizaci, a rovněž kombinaci léčení za pomoci jak CHT, tak cytokinu. Materiál a metody: Ve všech těchto pokusech byly použity samice myšího kmene C57BL/6J staré 6 až 10 týdnů, zakoupené od The Jackson Laboratoiy. Myším bylo v den -1 intraperitoneálně podáno buď 200 mg/kg Cytoxanu nebo samotný nosič, tj. fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok (PBS). V den 0 bylo zvířatům podáno podkožně 0,1 ml buď NEUPOGENU (GCSF), PEGG (pomocí SPA s molekulovou hmotností 20 000 daltonů pegylovaný mutein, šarže #P20W3), nebo nosič PBS, obsahující 1 % normální myší sérum. Myši, kterým byl podán Neupogen, dostávaly denně injekce se stejnou dávkou, zatímco všechny ostatní myši dostávaly nosič. V den utracení byla myši za anestézie odebrána žilní krev z dutiny za očnicí do zkumavek obsahujících EDTA. U každé skupiny byl malý objem spojené celé krve přidán ke třem paralelním, 35 mm2 tkáňovým miskám, obsahujícím 1000 U/ml rekombinantního myšího (rm) interleukinu-3, 100 ng/ml rekombinantního myšího faktoru kmenových buněk a 1000 U/ml rekombinantního myšího interleukinu-6 v celkovém objemu 1 ml média RPMI 1640, doplněného 15 % fetálního hovězího séra a 0,35 % agaru Difco. Kultury na tuhém agaru byly inkubovány po dobu 1 týdne při 37 °C ve vlhké atmosféře vzduchu s 5% CO2. Kolonie byly počítány pomocí pitevního stereomikroskopu.
Výsledky: v první uvedené studii dostávaly normální myši denně injekce 25 pg/myš NEUPOGENU ve dnech 0 až 5, nebo 1 injekci 25 pg/myš PEGG v den 0. Myši byly utraceny ve dnech 3 až 7. Jak je vidět na obrázku 7, mobilizace představovaná vytvářením kolonií byla zřetelně zvýšena ve dnech 3 a 4 u myší, kterým byl injekěně podáván NEUPOGEN, ale začala se
5. den postupně vracet na původní úroveň (přes injekci NEUPOGENU 5. den). Na druhé straně myši, kterým byl podán PEGG, vykázaly mnohem vyšší počet kolonií, a na této hladině se udržely v průběhu 7. dne.
- 14CZ 300546 B6
U chemoterapeutického modelu byl získán podobný typ výsledku. Myši v CHT skupinách dostaly injekci Cytoxanu v den -1. Některé z myší potom dostávaly v následujících dnech pouze nosič, zatímco jiné dostávaly kombinované léčení buď denní injekce NEUPOGENU ve dnech 0 až 5, nebo jednu injekci PEGG v den 0. Obrázek 8 ukazuje, že vrcholné hodnoty bylo u myší léčených Cytoxanem dosaženo ve 4. dnu a poté v následujících dnech nastal postupný návrat na základní úroveň. Jak skupina s NEUPOGENEM, tak skupina s PEGG dosáhly vrcholné hodnoty v 5. den, a vykazovaly velice zvýšené počty kolonií. Avšak úroveň u skupiny Cytoxan + PEGG zůstala v průběhu 6. a 7. dne velmi významně zvýšená ve srovnání s úrovní skupiny Cytoxan + NEUPOGEN. Obrázek 9 ukazuje synergický účinek kombinovaného léčení ve srovnání s léčením pomocí samotného Cytoxanu nebo G-CSF.
Druhá studie je ukázána na obrázcích 10 a 11. Normální myši, dostávající denní injekce nižší dávky NEUPOGENU (3 pg/myš) po dobu 10 po sobě následujících dní, vykazovaly pouze relativně nízkou hladinu mobilizace během testovaného časového období. Zvířata, kterým byla injekčně podána jedna dávka PEGG (3 pg/myš), vykazovala 4. den přibližně 5x vyšší počet mobilizovaných zárodečných buněk v periferním oběhu, třebaže výsledkem bylo jednorázové zvýšení, které v podstatě během šesti dnů pominulo.
U myší, kterým byl injekčně podáván Cytoxan, jedna dávka PEGG (3 pg/myš) indukovala zhruba odpovídající množství mobilizovaných PBSC jako NEUPOGEN (30 pg/myš), podávaný injekčně v 10 denních dávkách 3 pg/den (obrázek 11). Obě skupiny vykazovaly nejvyšší mobilizaci zárodečných buněk pátý den a velikost vrcholných hodnot byla totožná. Jediný rozdíl se zdál být ve trochu déle doznívajícím účinku NEUPOGENU. Počty kolonií u CTH myšího modelu byly 4 až lOx vyšší, než jejich počty u normálního myšího modelu.
Tyto pokusy ukazují dvě různé potenciální výhody pegylovaného muteinu před NEUPOGENEM. Zaprvé je zřejmá vyšší účinnost PEGG ve srovnání s NEUPOGENEM ve schopnosti indukovat mobilizaci PBSC, a to jak u normálních, tak u léčených myší chemoterapií. Zadruhé bylo ukázáno, že pegylovaný mutein je u myší účinnější než NEUPOGEN, a je možno použít účinnější dávkovači režim se sníženými dávkami, než jaké jsou dosud běžně u klinických produktů používány.
SEZNAM SEKVENCÍ <110> Hoffman-La Roche, Inc. <120> Konjugáty GCSF <130> 01017/36785 <140>US 09/487,133 <141> 2000-01-19 <150> US 60/117,917 <151> 1999-01-29 <160> 1 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> DISULFID <222> (36)..(42) <220>
<221> DISULFID <222> (64)..(74) <400> 1
- 15CZ 300546 B6
Ala Pro Thr Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys 15 10 15
Ser Leu Glu Gin Val Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin 20 25 30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60
Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser 65 70 75 80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125
Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140
Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe 145 150 155 160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170
Claims (2)
- PATENTOVÉ NÁROKY io 1. Fyziologicky aktivní konjugát obecného vzorce IRO(CH2CH2O)nCH2CH2-C-NH (l)- 16CZ 300546 B6 ve kterém G je faktor stimulující kolonie granulocytů bez své aminové skupiny nebo skupin, které vytvářejí amidovou vazbu s polyethylenglykolovou složkou v konjugátu; R je alkyl C, 6: n je celé číslo od 420 do 550; a m je celé číslo od 1 do 5.5 2. Konjugát podle nároku 1 vzorce I, ve kterém R je methyl.3. Konjugát podle nároku 2 vzorce I, ve kterém n je 450 až 490.4. Konjugát podle nároku 2 vzorce I, ve kterém m je celé číslo od 1 do 4. io5. Konjugát podle nároku 2 vzorce I, ve kterém m je 2.6. Konjugát podle nároku 1 vzorce I, ve kterém faktorem stimulujícím kolonie granulocytů je GCSF Mutein, který má sekvenci uvedenou na obrázku 1.7. Konjugát podle nároku 1 vzorce I, ve kterém n je 450 až 490.8. Konjugát podle nároku 1 vzorce I, ve kterém m je celé číslo od 1 do 4.20 9. Konjugát podle nároku 8 vzorce I, ve kterém m je 2.10. Konjugát podle nároku 1, který má delší poločas cirkulování v krevním oběhu a vyšší in vivo aktivitu stimulování granulocytů než odpovídající nekonjugovaný faktor stimulující kolonie granulocytů.11. Konjugát podle nároku 10, ve kterém faktorem stimulujícím kolonie granulocytů je GCSF Mutein, který má sekvenci uvedenou na obrázku 1.12. Konjugát podle nároku 6 vzorce I, ve kterém R je methyl; n je celé číslo od 450 do 490 a m30 je13. Prostředek obsahující fyziologicky aktivní konjugáty podle nároku 1 obecného vzorce I, vyznačující se tím, že m je nezávisle celé číslo od 1 do 4 a procento konjugátů, kde m je 1, je od 18 do 25 procent; procento konjugátů, kde m je 2 je od 50 do 66 procent, procento35 konjugátů, kde m je 3 je od 12 do 16 procent a procento konjugátů, kde m je 4 je až 5 procent.14. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že R je v každém z konjugátů methyl.40 15. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že na R jsou v každém z konjugátů stejné.16. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím,ženje 450 až 490.45 17. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že v každém z konjugátů je faktorem stimulujícím kolonie granulocytů GCSF Mutein, který má sekvenci uvedenou na obrázku 1.18. Prostředek podle nároku 13, kde n je v každém z konjugátů stejné a je to celé číslo od 45050 do 490; G je GCSF Mutein, který má sekvenci uvedenou na obrázku 1.19. Způsob přípravy konjugátu podle nároku 1, vyznačující se tím, že reaguje sloučenina vzorce II- 17 CZ 300546 B6OIIRO(CH2CH20)nCH2CH2-0 (ll)S GCSF za vzniku uvedeného konjugátu.5 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že GCSF je GCSF Mutein, který má sekvenci uvedenou na obrázku 1.io11 výkresů- 18 CZ 300546 B6Η 00 C - <£X2íAXiXKX$(iXvJÍXlX5tvXtXL^ 170 10010_________o-NH*Ťff tX>X>jBHOOX>AOX)jO
rhQ-CSP G-CSF MUTEIN Thr1 Ala1 Leu3 -► Thr3 Oly4 -► Tyr4 Pro® -> Are® Cya17 •ar17 Obrázek 1: Primární struktura GCSF Muteinu- 19CZ 300546 B6Obrázek 2: Reakční činidla pro pegylaciA.GABA, Amid CH3O(CH3CH30)nCH30,CH3O(CH2CH2O)nCH2ON 2-*ra(CH,)mC0NΛΝ ra = 2-6B.oAmidCH3CXCHjCH,O)nCH,OCCH,CONc.Amid (spa)O ° ληCH3O(CH3CHO)nCH3CHTOND.MočovinaH,C oCH3O(CH3CHjO) ,, ^CHjCH^ÍT^O^^^NE.UretanCH3O(CH3CH3O)xCH3CH3OF.oSulfanyluretanG.CH,Uretan CH3^COCHjCH,(OCH,CH,)nOCH,CH,OCON.....l·-1-20CZ 300546 B6Obrázek 3: Oddělení GCSF Muteinu modifikovaného PEG s molekulovou hmotností 20 000 daltonů od nemodifikovaného Typický eluční profil pro PEG reakční směs.Sloupec: 1 až 2 ml Fractogel ® EMD SO3 650S.Ekvilibrační puír: 10 mM oetan amonný, pH 4,5Eluční pufry 1.0,15 M NaCI v ekvilibračním pufru - 2.0,5 M NaCI v ekvilibračním pufru-21 CZ 300546 B6Obrázek 4: Aktivita PEG-GCSF Muteinu pátý den po jedné injekciSamice myšího kmene C57BL/6J dostaly podkožně injekci obsahující 25,2 pg pegylovaných konjugátů mutované formy GCSF; 5. den po podání injekce byly odebrány vzorky žilní krve z dutiny za očnicí. Byly provedeny hematologické a leukocytové diferenciální analýzy; výsledné počty neutrofiíů byly standardizovány k nosičové kontrole, prováděné v každém pokuse. Uvedené údaje představují průměr ± standardní odchylku (S E.) ze čtyř myší ve skupině.-22CZ 300546 B620 PMN (χΐθ’/mm3)- * * 1 I . .0 10 20 30 40 50 60 70Vypočtené molekulové hmotnosti PEG (kDa)SPA. PWNsO 2’7MW»3 35 Rceň« PMN=0.l52MW-2.74Obrázek 5: Zvýšení počtů PMN jako funkce hmotnosti PEG (kDa) v amidem a močovinou vázaných konjugátech PEG-GCSF Muteinu,-23 CZ 300546 B6300 % kontrolyObrázek 6: Aktivita PEG-GCSF Muteinu 7. den po jedné injekciSamice myšího kmene C57BL/6J dostaly podkožně injekci obsahující 25,2 pg pegylovaných konjugátů GCSF Muteinu; 7. den po podáni injekce byly odebrány vzorky žilní krve z dutiny za očnicí. Byly provedeny heraatologické a leukocytové diferenciální analýzy; výsledné počty neutrofilů byly standardizovány k nosičové kontrole, prováděné v každém pokuse. Uvedené údaje představují průměr ± standardní odchylku (S E.) ze čtyř myší ve skupině.-24CZ 300546 B6Obrázek 7Test mobilizace kolonií myších PBSC tDen injekceNosičN«upof«a -♦“PEGONeupogen (25 gg/myš) podaný injekčně ve dnech 0 až 5 PEGG (25 gg/myš) podaný injekčně v den 0-25CZ 300546 B6Obrázek 8Test mobilizace kolonií myších PBSCPočet koionií/jamkuDen injekce (Cytoxan = den -1)Nosič -^»Cyttauu —ft—Cyunua*H«upof« ->-Cytox»*P£GGNeupogen (25 gg/myš) podaný injekčně ve dnech 0 až 5 PEGG (25 gg/myš) podaný injekčně v den 0-26CZ 300546 B6Obrázek 9Počet koloníi/jamkuNosič -«-Nwpotia -»-PEGG-*-Cytoxm*Nfupof« -W-Cywua-PEGGNeupogen (25 pg/myš) podaný injekčně ve dnech 0 až 5 PEGG (25 pg/myš) podaný injekčně v den 0-27CZ 300546 B6Obrázek 10Počet koloniiZjamkuNosič •Nrapegm řEGONeupogen (3 pg/myš) podaný injckčnč ve dnech 0 až 9 PEGG (3 pg/myš) podaný injekčně v den 0-28CZ 300546 B6Obrázek 11Test mobilizace kolonií myších PBSC -----Počet kolonií/jamku “**- Nosič -e-Cytoxan ~*-CywJun*N«upof«n -^>Cytoun*PEGGNeupogen (3 pg/myš) podaný injekčné ve dnech 0 až 9 PEGO (3 pg/myš) podaný injekčné v den 0Konec dokumentu
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11791799P | 1999-01-29 | 1999-01-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20012654A3 CZ20012654A3 (cs) | 2002-05-15 |
| CZ300546B6 true CZ300546B6 (cs) | 2009-06-10 |
Family
ID=22375505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20012654A CZ300546B6 (cs) | 1999-01-29 | 2000-01-19 | Fyziologicky aktivní konjugát, prostredek a zpusob prípravy |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US20030130193A1 (cs) |
| EP (1) | EP1157037B1 (cs) |
| JP (1) | JP2002540065A (cs) |
| KR (1) | KR100689212B1 (cs) |
| CN (1) | CN1376164A (cs) |
| AT (1) | ATE246202T1 (cs) |
| AU (1) | AU2618500A (cs) |
| BG (1) | BG65213B1 (cs) |
| BR (1) | BR0007781A (cs) |
| CA (1) | CA2361766C (cs) |
| CZ (1) | CZ300546B6 (cs) |
| DE (1) | DE60004172T2 (cs) |
| DK (1) | DK1157037T3 (cs) |
| EA (2) | EA004685B1 (cs) |
| ES (1) | ES2204509T3 (cs) |
| HK (1) | HK1049673A1 (cs) |
| HU (1) | HU228488B1 (cs) |
| IL (1) | IL144361A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA01007609A (cs) |
| NO (1) | NO331787B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ513113A (cs) |
| PT (1) | PT1157037E (cs) |
| RS (1) | RS50928B (cs) |
| SK (1) | SK286898B6 (cs) |
| WO (1) | WO2000044785A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA200105932B (cs) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE246202T1 (de) * | 1999-01-29 | 2003-08-15 | Hoffmann La Roche | Gcsf konjugate |
| US6646110B2 (en) | 2000-01-10 | 2003-11-11 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF polypeptides and conjugates |
| US6831158B2 (en) | 2000-01-10 | 2004-12-14 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
| US6555660B2 (en) | 2000-01-10 | 2003-04-29 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
| ATE421535T1 (de) | 2000-10-16 | 2009-02-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Peg-modifiziertes erythropoietin |
| MXPA04000231A (es) | 2001-07-11 | 2004-05-04 | Maxygen Holdings Ltd | Conjugados del factor de estimulacion de colonias de granulocitos. |
| US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
| CA2462930C (en) * | 2001-10-10 | 2012-07-10 | Shawn De Frees | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
| WO2004099231A2 (en) | 2003-04-09 | 2004-11-18 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| MXPA04004809A (es) * | 2001-11-20 | 2004-08-11 | Pharmacia Corp | Conjugados de hormona de crecimiento humana modificada quimicamente. |
| CN100337689C (zh) | 2002-07-24 | 2007-09-19 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 聚亚烷基二醇酸加合物 |
| US7695723B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-04-13 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
| US7785601B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-08-31 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
| WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
| EP1667706A4 (en) * | 2003-08-22 | 2009-06-24 | Queensland Inst Med Res | G-CSF DERIVATIVE FOR INDUCING IMMUNOLOGICAL TOLERANCE |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| CA2585758C (en) | 2004-10-29 | 2017-08-01 | Neose Technologies, Inc. | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
| NZ556436A (en) | 2005-01-10 | 2010-11-26 | Biogenerix Ag | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| US20060174362A1 (en) * | 2005-02-01 | 2006-08-03 | Origen Therapeutics, Inc. | Long-term culture of avian primordial germ cells (PGCs) |
| WO2006121569A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-16 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| US7381805B2 (en) | 2005-06-01 | 2008-06-03 | Maxygen Holdings, Ltd. | Compositions comprising mixtures of positional PEG isomers of PEGylated G-CSF |
| WO2006138572A2 (en) | 2005-06-16 | 2006-12-28 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates having a degradable linkage and polymeric reagents useful in preparing such conjugates |
| CA2617064A1 (en) * | 2005-08-04 | 2007-02-15 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of a g-csf moiety and a polymer |
| US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| JP2007112924A (ja) * | 2005-10-21 | 2007-05-10 | National Institute For Materials Science | 高分子架橋剤及びこの架橋剤を用いたリポソーム又は細胞の架橋体 |
| WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
| CN101002943B (zh) * | 2006-01-17 | 2012-02-01 | 中国科学院过程工程研究所 | 支链peg-gcsf和peg-gmcsf结合物及其制备方法 |
| CN101516388B (zh) | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
| ITMI20061624A1 (it) | 2006-08-11 | 2008-02-12 | Bioker Srl | Mono-coniugati sito-specifici di g-csf |
| US8969532B2 (en) | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
| US20100316631A1 (en) * | 2006-10-19 | 2010-12-16 | The Uab Research Foundation | Water Soluble Curcumin-Based Compounds |
| KR101079993B1 (ko) * | 2006-11-17 | 2011-11-04 | 동아제약주식회사 | 폴리에틸렌글리콜 과립구 콜로니 자극인자 접합체 |
| JP2008125952A (ja) * | 2006-11-24 | 2008-06-05 | National Institute For Materials Science | 複合架橋体 |
| CN101245109B (zh) * | 2007-02-12 | 2011-12-14 | 杭州九源基因工程有限公司 | 一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体及其制备方法 |
| NZ580030A (en) | 2007-04-03 | 2012-06-29 | Biogenerix Ag | Methods of treatment using glycopegylated g-csf |
| WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
| AR067537A1 (es) | 2007-07-17 | 2009-10-14 | Hoffmann La Roche | Purificacion de polipeptidos pegilados |
| AR067536A1 (es) | 2007-07-17 | 2009-10-14 | Hoffmann La Roche | Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea |
| CN101352573B (zh) * | 2007-07-27 | 2011-02-09 | 杭州九源基因工程有限公司 | 聚乙二醇单修饰的重组人集落细胞刺激因子赖氨酸缺陷体 |
| WO2009103199A1 (zh) | 2008-02-18 | 2009-08-27 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 水溶性聚合物修饰的g-csf偶联物 |
| EP2626079A3 (en) | 2008-02-27 | 2014-03-05 | Novo Nordisk A/S | Conjungated factor VIII molecules |
| RU2409669C9 (ru) | 2008-08-18 | 2012-05-27 | ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management", "SFM") | Способ иммобилизации биологически активного вещества (бав) на носитель (варианты) и конъюгат бав-носитель, полученный данными способами |
| JP5632376B2 (ja) | 2008-09-23 | 2014-11-26 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | エリスロポエチンの精製 |
| KR101485646B1 (ko) | 2010-02-11 | 2015-01-22 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | Ｉｇｆ―ⅰ 폴리(에틸렌 글리콜) 컨쥬게이트 |
| WO2012035037A1 (en) | 2010-09-14 | 2012-03-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for purifying pegylated erythropoietin |
| US8889630B2 (en) | 2011-12-23 | 2014-11-18 | Carlos Lopez | Method for hair regrowth using Granulocyte-Colony Stimulating Factor |
| EP3484911B1 (en) | 2016-07-15 | 2020-11-04 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Method for purifying pegylated erythropoietin |
| BR112020007037A2 (pt) | 2017-10-11 | 2020-11-17 | Elanco Us Inc. | variantes de g-csf porcino e seus usos |
| SI3731872T1 (sl) | 2017-12-29 | 2022-04-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Postopek za zagotavljanje sestavka PEGiliranih beljakovin |
| US20200362002A1 (en) | 2017-12-29 | 2020-11-19 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for providing pegylated protein composition |
| US12208142B2 (en) | 2017-12-29 | 2025-01-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for providing PEGylated protein composition |
| JP2024500974A (ja) * | 2020-12-23 | 2024-01-10 | ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド | 電荷遮蔽された融合タンパク質を精製する方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0335423A2 (en) * | 1988-03-31 | 1989-10-04 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified human G-CSF |
| EP0401384A1 (en) * | 1988-12-22 | 1990-12-12 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically modified granulocyte colony stimulating factor |
| EP0721958A2 (en) * | 1994-12-15 | 1996-07-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Immunological assay for quantifying PEG-modified human granulocyte colony stimulating factor |
| EP1157037A1 (en) * | 1999-01-29 | 2001-11-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Gcsf conjugates |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1609546A (en) * | 1925-11-19 | 1926-12-07 | Petroleum Rectifying Co | Process of separating water from emulsions |
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4002531A (en) * | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| DE3380726D1 (en) * | 1982-06-24 | 1989-11-23 | Japan Chem Res | Long-acting composition |
| US4514497B1 (en) * | 1983-12-30 | 1998-02-24 | Novagene Inc | Modified live pseudorabies viruses |
| JPS61227526A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-10-09 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規なコロニー刺激因子 |
| US5532341A (en) * | 1985-03-28 | 1996-07-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor |
| US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| US4791192A (en) * | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
| US4894226A (en) * | 1986-11-14 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation |
| US5362853A (en) * | 1986-12-23 | 1994-11-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US5214132A (en) * | 1986-12-23 | 1993-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US5194592A (en) * | 1986-12-23 | 1993-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. | Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
| US4847325A (en) * | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US5218092A (en) * | 1988-09-29 | 1993-06-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains |
| US5349052A (en) * | 1988-10-20 | 1994-09-20 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| US6166183A (en) * | 1992-11-30 | 2000-12-26 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically-modified G-CSF |
| US5166322A (en) * | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
| US5372808A (en) * | 1990-10-17 | 1994-12-13 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the treatment of diseases with consensus interferon while reducing side effect |
| US5252714A (en) * | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
| US5281698A (en) * | 1991-07-23 | 1994-01-25 | Cetus Oncology Corporation | Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation |
| US5382657A (en) * | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
| US5581476A (en) * | 1993-01-28 | 1996-12-03 | Amgen Inc. | Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5672662A (en) * | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
| KR0176625B1 (ko) * | 1996-11-05 | 1999-04-01 | 삼성전자주식회사 | 적외선 물체검출장치 |
-
2000
- 2000-01-19 AT AT00904422T patent/ATE246202T1/de active
- 2000-01-19 JP JP2000596041A patent/JP2002540065A/ja active Pending
- 2000-01-19 DK DK00904422T patent/DK1157037T3/da active
- 2000-01-19 EP EP00904422A patent/EP1157037B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-19 CN CN00809241A patent/CN1376164A/zh active Pending
- 2000-01-19 HU HU0203652A patent/HU228488B1/hu unknown
- 2000-01-19 KR KR1020017009533A patent/KR100689212B1/ko active IP Right Grant
- 2000-01-19 AU AU26185/00A patent/AU2618500A/en not_active Abandoned
- 2000-01-19 NZ NZ513113A patent/NZ513113A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 SK SK1035-2001A patent/SK286898B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 MX MXPA01007609A patent/MXPA01007609A/es active IP Right Grant
- 2000-01-19 ES ES00904422T patent/ES2204509T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-19 EA EA200100838A patent/EA004685B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 WO PCT/US2000/001264 patent/WO2000044785A1/en active IP Right Grant
- 2000-01-19 CA CA2361766A patent/CA2361766C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-19 DE DE60004172T patent/DE60004172T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-19 BR BR0007781-0A patent/BR0007781A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-01-19 PT PT00904422T patent/PT1157037E/pt unknown
- 2000-01-19 EA EA200400067A patent/EA200400067A1/ru unknown
- 2000-01-19 IL IL14436100A patent/IL144361A0/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 RS YUP-543/01A patent/RS50928B/sr unknown
- 2000-01-19 CZ CZ20012654A patent/CZ300546B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-07-18 ZA ZA200105932A patent/ZA200105932B/en unknown
- 2001-07-27 NO NO20013700A patent/NO331787B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-08-29 BG BG105851A patent/BG65213B1/bg unknown
-
2002
- 2002-12-30 US US10/331,434 patent/US20030130193A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-03-13 HK HK03101820.1A patent/HK1049673A1/zh unknown
-
2005
- 2005-04-26 US US11/114,576 patent/US20050196378A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-03-12 US US11/717,536 patent/US20070219356A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-06-27 US US12/163,283 patent/US20080287659A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0335423A2 (en) * | 1988-03-31 | 1989-10-04 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified human G-CSF |
| EP0401384A1 (en) * | 1988-12-22 | 1990-12-12 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically modified granulocyte colony stimulating factor |
| EP0721958A2 (en) * | 1994-12-15 | 1996-07-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Immunological assay for quantifying PEG-modified human granulocyte colony stimulating factor |
| EP1157037A1 (en) * | 1999-01-29 | 2001-11-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Gcsf conjugates |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ300546B6 (cs) | Fyziologicky aktivní konjugát, prostredek a zpusob prípravy | |
| US6586398B1 (en) | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods | |
| JP2989002B2 (ja) | 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子 | |
| US7893019B2 (en) | G-CSF site-specific mono-conjugates | |
| CZ292775B6 (cs) | Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon alfa, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje | |
| AU2001255256A1 (en) | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods | |
| US20060247422A1 (en) | Chemically modified G-CSF | |
| AU2004233543B2 (en) | GCSF Conjugates | |
| EP1369429A1 (en) | GCSF conjugates | |
| PL203462B1 (pl) | Fizjologicznie aktywne koniugaty czynnika stymuluj acego tworzenie kolonii granulocytów (GCSF), zawieraj ace je kompozycje i sposób wytwarzania koniugatu PEG-GCSF |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20200119 |