JP2008125952A - 複合架橋体 - Google Patents
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Abstract
【課題】
動物細胞の一般的な培養法として広く用いられている単層培養法は、生体内で有していた細胞本来の機能を維持することが困難であり、急速に機能を消失するという問題点がある。
【解決手段】
一分子内に疎水性及び親水性部をもつ高分子架橋剤を合成し、脂質集合体である細胞、又は細胞とリポソームの混合体を物理的に架橋して、細胞機能の向上した細胞架橋体及び細胞とリポソームから構成される複合架橋体を得る。
【選択図】図１
動物細胞の一般的な培養法として広く用いられている単層培養法は、生体内で有していた細胞本来の機能を維持することが困難であり、急速に機能を消失するという問題点がある。
【解決手段】
一分子内に疎水性及び親水性部をもつ高分子架橋剤を合成し、脂質集合体である細胞、又は細胞とリポソームの混合体を物理的に架橋して、細胞機能の向上した細胞架橋体及び細胞とリポソームから構成される複合架橋体を得る。
【選択図】図１
Description
本発明は、細胞同士又は細胞とリポソームを高分子架橋剤にて架橋した複合架橋体に関する。
動物細胞の一般的な培養法として広く用いられている単層培養法は、生体内で有していた細胞本来の機能を維持することが困難であり、急速に機能を消失することがよく知られている（例えば、非特許文献１〜２）。
このため、細胞の生着、増殖を促進させ、細胞機能を維持、向上させ、細胞形態を生体内に近い形態に保持できるような方法として、コラーゲンゲルを利用した３次元培養方法などの培養方法が種々開発されている（例えば、特許文献１〜２）。骨や軟骨は、細胞外マトリックスを含む組織であるため、生体高分子架橋体が組織再生には有効である。一方、肝臓や膵臓などの実質臓器は、細胞外マトリックスはほとんど含まれていないため、組織再生が行われていない。また、細胞を凝集化させるための技術として、擬似微小重力培養、疎水性と親水性のパターン化表面、Ｕ字型マルチプレートなどが報告されている（例えば、非特許文献３〜５）。
本発明は、細胞の機能を高度に発現させることができる高分子架橋剤及びこの高分子架橋剤を用いて作製される細胞機能の向上した細胞架橋体及び細胞とリポソームから構成される複合架橋体を提供することを目的とする。
上記課題を達成するために、発明１の複合架橋体は、高分子架橋剤が、細胞表面に存在する脂質の疎水性部位に対してアンカリングする高分子架橋剤であって、下記［化１］に示す構造を持つ高分子で、Ａが疎水性分子、Ｂが親水性分子、Ｃが非生分解性分子又は生分解性分子であり、かつ、かつ、前記架橋剤の生分解性分子を分解するまで培地にて培養することにより得られたことを特徴とする。
［化１］
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ａ
［化１］
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ａ
発明２の複合架橋体は、発明１に記載の複合架橋体において、前記高分子架橋剤の前記疎水性分子Ａが、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合された脂質、アルキル基、コレステロール基であることを特徴とする。
発明３の複合架橋体は、発明１又は２に記載の複合架橋体において、前記高分子架橋剤の前記親水性分子Ｂが、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合されたポリエチレングリコールであることを特徴とする。
発明４の複合架橋体は、発明１から３のいずれかに記載の複合架橋体において、前記高分子架橋剤の前記非生分解性分子又は生分解性分子Ｃが、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合されたアルキル鎖又はマトリックスメタロプロテアーゼ分解ペプチド、酵素分解性ペプチド、ポリ又はオリゴエステル、ポリ又はオリゴエーテルの１種又はそれ以上の組み合わせであることを特徴とする。
発明５の複合架橋体は、発明１から４のいずれかに記載の複合架橋体において、前記細胞が、間葉系幹細胞、肝細胞、膵細胞、膵β細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、赤血球、ＥＳ細胞の１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする。
発明６の複合架橋体は、発明１から５のいずれかに記載の複合架橋体において、前記培地が血清添加培地であることを特徴とする。
細胞は、凝集化することによりＥ−カドヘリンなどの細胞−細胞間結合を介して細胞１個あたりの機能性が向上する。細胞を凝集化させることにより機能が向上し、架橋剤以外の細胞−細胞間の結合が形成された後には、架橋剤が細胞機能あるいは増殖に影響を与えないように分解する必要がある。そのため、細胞の産生する酵素によって分解する部位を架橋剤に組み込むことが必要になる。
本発明の複合架橋体は、良好な凝集を行って細胞機能を向上させた後は、リポソーム又は細胞を物理的に架橋して、生分解性分子（Ｃ）を分解することで架橋剤は消滅することになる。
本発明の複合架橋体は、良好な凝集を行って細胞機能を向上させた後は、リポソーム又は細胞を物理的に架橋して、生分解性分子（Ｃ）を分解することで架橋剤は消滅することになる。
疎水性部Ａは、架橋反応時に細胞膜表面の脂質膜と疎水的な相互作用を可能にするために、水に不溶な分子、例えば、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合された脂質、アルキル基、コレステロール基であることが好ましい。このように、細胞膜表面の脂質膜と疎水的な相互作用を可能にすることによって、細胞表面に存在するタンパク質の構造および活性を壊すことがなく、細胞へのダメージを減らすことができる。
親水性部Ｂは、架橋体の細胞に対する生体親和性の観点から、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合されたポリエチレングリコールであることが好ましい。ここで親水性とは、架橋剤を水溶液として反応に用いるために必要な性質であり、水に溶解する平均分子量を持ち、かつポリエチレングリコール以外の親水性部、例えば、ポリプロピレングリコール鎖単独あるいはポリエチレングリコールとの共重合鎖などの組成を有することにより水に溶解する性質をいうものである。
非生分解性部又は生分解性部Ｃは、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合されたアルキル鎖又はマトリックスメタロプロテアーゼ分解ペプチド、酵素分解性ペプチド、ポリ又はオリゴエステル、ポリ又はオリゴエーテルの１種又はそれ以上の組み合わせであることが好ましい。ここで生分解性とは、酵素的又は非酵素的加水分解のことである。
なお、リポソームは、細胞の凝集塊に適度な空間を持たせることができることに利点がある。細胞凝集塊中では内部に酸素や栄養分が透過しにくいため、内部の細胞はネクローシス（壊死）を起こすことが知られている。
この場合、リポソームの存在により、細胞凝集塊の奥にまで、酸素や栄養分を透過させることができ、ネクローシスが生じなくなる。
この場合、リポソームの存在により、細胞凝集塊の奥にまで、酸素や栄養分を透過させることができ、ネクローシスが生じなくなる。
本発明は、下記［化１］に示す構造を持つ高分子で、Ａが疎水性部、Ｂが親水性部、Ｃが非生分解性部又は生分解性部である細胞機能を向上させる高分子架橋剤である。
［化１］
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ａ
［化１］
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ａ
疎水性部Ａは、架橋反応時に細胞膜表面の脂質膜と疎水的な相互作用を可能にするために、水に不溶な分子、例えば、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合された脂質、アルキル基、コレステロール基であることが好ましい。このように、細胞膜表面の脂質膜と疎水的な相互作用を可能にすることによって、細胞表面に存在するタンパク質の構造および活性を壊すことがなく、細胞へのダメージを減らすことができる。
親水性部Ｂは、架橋体の細胞に対する生体親和性の観点から、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合されたポリエチレングリコールであることが好ましい。ここで親水性とは、架橋剤を水溶液として反応に用いるために必要な性質であり、水に溶解する平均分子量を持ち、かつポリエチレングリコール以外の親水性部、例えば、ポリプロピレングリコール鎖単独あるいはポリエチレングリコールとの共重合鎖などの組成を有することにより水に溶解する性質をいうものである。
非生分解性部又は生分解性部Ｃは、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合されたアルキル鎖又はマトリックスメタロプロテアーゼ分解ペプチド、酵素分解性ペプチド、ポリ又はオリゴエステル、ポリ又はオリゴエーテルの１種又はそれ以上の組み合わせであることが好ましい。ここで生分解性とは、酵素的又は非酵素的加水分解のことである。
細胞は、凝集化することによりＥ−カドヘリンなどの細胞−細胞間結合を介して細胞１個あたりの機能性が向上する。細胞を凝集化させることにより機能が向上し、架橋剤以外の細胞−細胞間の結合が形成された後には、架橋剤が細胞機能あるいは増殖に影響を与えないように分解する必要がある。そのため、細胞の産生する酵素によって分解する部位を架橋剤に組み込むことが必要になる。
非生分解性部又は生分解性部は、架橋剤の分子鎖長を変化させる、あるいは分子間の相互作用を強める役割をする。非生分解性部又は生分解性部の長い分子で形成された架橋体は、細胞あるいはリポソーム間の距離が長くなるため架橋密度が低くなる。非生分解性部は、分子鎖の延長および分子間相互作用（例えば＋と−のチャージを持つもの）のみを強めることが可能になる。一方、生分解性部を用いると、分子鎖の延長および分子間相互作用（例えば＋と−のチャージを持つもの）に加え、酵素分解性ペプチドを持っているため、細胞を一時的に凝集させ（このときに細胞−細胞間相互作用により架橋剤以外の結合が形成する）、その後細胞の産生する酵素によって分解することが可能になる。
前記酵素分解性ペプチドは、マトリックスメタロプロテアーゼ分解ペプチドであるＬＧＰＡ又は、ＰＱＧＩＷＧＱの１種又は２種以上の組み合わせを含むペプチドであることが好ましい。
前記ポリ又はオリゴエステルを構成する分子は、乳酸、グリコール酸、カプロラクトンの１種又は２種以上の組み合わせであることが好ましい。また、前記ポリ又はオリゴエーテルを構成する分子が、エチレングリコール、プロピレングリコールの１種又は２種以上の組み合わせであることが好ましい。
高分子架橋剤は、活性化エステルで活性化する、又は縮合剤を用いて溶媒中反応させ、疎水性部Ａ、親水性部Ｂ、非生分解性部又は生分解性部Ｃをエステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかの結合を形成させることで合成する。リポソーム又は細胞の懸濁溶液と高分子架橋剤の溶液とを混合することにより架橋が起こり、細胞架橋体、及び細胞とリポソームから構成される複合架橋体が得られる。
本発明は、前記の細胞機能を向上させる高分子架橋剤と細胞又はリポソームの分散水溶液によって得られる細胞架橋体、又は細胞とリポソームから構成される複合架橋体である。ここで、架橋とは、前記の高分子架橋剤の疎水性部とリポソーム又は細胞の脂質膜との疎水的な相互作用による物理的な架橋である。すなわち、本明細書において、物理的な架橋は、細胞表面に存在する脂質の疎水性部位に対するアンカリングを意味している。図３の模式図に示すように、リポソーム又は細胞膜を構成する脂質の疎水性部分に対して、高分子架橋剤の疎水性部分が疎水的な相互作用によりアンカリングする。
また、前記リポソームは脂質の１種又は２種以上の組み合わせであることが挙げられる。また、前記細胞は間葉系幹細胞、肝細胞、膵細胞、膵β細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、赤血球、ＥＳ細胞の１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。
以下、実施例及び試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
細胞機能を向上させる高分子架橋体の一例として、末端に疎水性部としてオレイル基を持ち、親水性部としてポリエチレングリコール（分子量８０００）を持つ分子と非生分解性部のエチレンジアミンの両末端をジメチルホルムアミド溶媒中、室温で反応させ、アミド結合を形成させることにより、一分子内に疎水性部、親水性部及び非生分解性部をもつ高分子架橋剤を合成した。
さらに、培養容器としてＵ底９６ウェルプレート（住友ベークライト製）を用い、ラット膵島β細胞（ＲＩＮ）（１ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培地０．１ ｍＬ、無血清）に高分子架橋剤（０-２５ ｍｇ／ｍＬ水溶液、０．１ ｍＬ）を添加し、１０％血清培地で培養（３７℃， ５％ ＣＯ２）することにより細胞架橋体を調製した。
膵β細胞の機能の一つとして、インスリンの生産がある。図１には、得られた細胞架橋体のインスリン分泌量をＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定）により測定した結果を示している。得られた細胞架橋体を２ ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む無血清培地中で１時間インキュベート（３７℃， ５％ ＣＯ２）したときのインスリン量をレビス(R)インスリンキット（株式会社シバヤギ製）を用いて測定した。また、ＤＮＡの定量により求めた細胞数から、１細胞当たりのインスリン分泌量に換算してある。
架橋剤の存在により、１細胞当たりのインスリン分泌能が向上したことを示している。
さらに、細胞接着因子であるＥ−カドヘリンの遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量についてリアルタイムＰＣＲ法により定量した。図２には、その結果を示してある。内在性コントロールとしてＲａｔ−１８Ｓを使用し、これを１００として換算してある。
図２から明らかなように、高分子架橋剤存在下で作製された細胞架橋体はＥ−カドヘリンの遺伝子発現量に増加が認められた。Ｅ−カドヘリンなどの細胞接着因子を介した細胞凝集塊（スフェロイド）を形成することによりインスリン産生などの細胞機能が上昇していることが示唆される。
合成実験
原料のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体： 親水性部としてのポリエチレングリコール鎖の片末端に疎水性部としてオレイル基を持ち、もう片末端は反応基として活性エステル基（アミノ基と反応してアミド結合を形成する）を持つ分子（分子量８５００）
得られた架橋剤： 分子量１８０００
ＰＥＧ誘導体をジアミンの両末端に１段階で導入して、架橋剤を合成した。
原料のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体： 親水性部としてのポリエチレングリコール鎖の片末端に疎水性部としてオレイル基を持ち、もう片末端は反応基として活性エステル基（アミノ基と反応してアミド結合を形成する）を持つ分子（分子量８５００）
得られた架橋剤： 分子量１８０００
ＰＥＧ誘導体をジアミンの両末端に１段階で導入して、架橋剤を合成した。
操作
１．ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中、エチレンジアミン（２μＬ、１．０当量）とＰＥＧ誘導体（５６１ｍｇ、２．２当量）を室温にて一晩撹拌
２．透析（分画分子量１２０００−１４０００）により精製
３．凍結乾燥
１．ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中、エチレンジアミン（２μＬ、１．０当量）とＰＥＧ誘導体（５６１ｍｇ、２．２当量）を室温にて一晩撹拌
２．透析（分画分子量１２０００−１４０００）により精製
３．凍結乾燥
細胞培養実験
条件
使用細胞：ラット膵島β細胞 ＲＩＮ
使用培地：ＲＰＭＩ−１６４０ （Ｓｉｇｍａ）
２％ ペニシリン−ストレプトマイシン含有
１０％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）有または無
使用容器：Ｕ底９６ウェルプレート
（スミロンセルタイト(R)スフェロイド，住友ベークライト）
播種細胞数：１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（培地０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌ）
架橋剤添加濃度：０，０．２５，２．５，２５ （ｍｇ／ｍＬ）（添加量０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌ）
架橋剤を１５分ＵＶ照射して滅菌後、ＰＢＳ溶液に溶解
培地交換：１日目および４日目（３日毎に交換）
培養日数：７日
条件
使用細胞：ラット膵島β細胞 ＲＩＮ
使用培地：ＲＰＭＩ−１６４０ （Ｓｉｇｍａ）
２％ ペニシリン−ストレプトマイシン含有
１０％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）有または無
使用容器：Ｕ底９６ウェルプレート
（スミロンセルタイト(R)スフェロイド，住友ベークライト）
播種細胞数：１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（培地０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌ）
架橋剤添加濃度：０，０．２５，２．５，２５ （ｍｇ／ｍＬ）（添加量０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌ）
架橋剤を１５分ＵＶ照射して滅菌後、ＰＢＳ溶液に溶解
培地交換：１日目および４日目（３日毎に交換）
培養日数：７日
操作
１．細胞播種（細胞懸濁液 ０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌ、無血清培地使用）
２．架橋剤添加（ＰＢＳ溶液 ０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌ）
３．インキュベーション（３７ ℃，５％ ＣＯ２）
培地交換（培地０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌを抜き取り、血清培地０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌを添加）
無血清培地で架橋剤を添加し、血清培地で培養
１．細胞播種（細胞懸濁液 ０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌ、無血清培地使用）
２．架橋剤添加（ＰＢＳ溶液 ０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌ）
３．インキュベーション（３７ ℃，５％ ＣＯ２）
培地交換（培地０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌを抜き取り、血清培地０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌを添加）
無血清培地で架橋剤を添加し、血清培地で培養
インスリン測定
操作（サンプリング）
１．マイクロピペットで培地を抜き取る。
２．グルコースの添加： 培地（グルコース濃度２ ｇ／Ｌ ，ＦＢＳなし，２％ ペニシリン−ストレプトマイシン含有）を０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加する。
３．インキュベーション（３７℃， １ ｈ）
４．上澄み回収： 遠心（１２００ ｒｐｍ， ５ ｍｉｎ）した後、マイクロピペットで培地を６０ μＬ／ｗｅｌｌずつ回収し、測定するまでディープフリーザー（−８０ °Ｃ）にて保存。
結果を表１に示す。
操作（サンプリング）
１．マイクロピペットで培地を抜き取る。
２．グルコースの添加： 培地（グルコース濃度２ ｇ／Ｌ ，ＦＢＳなし，２％ ペニシリン−ストレプトマイシン含有）を０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加する。
３．インキュベーション（３７℃， １ ｈ）
４．上澄み回収： 遠心（１２００ ｒｐｍ， ５ ｍｉｎ）した後、マイクロピペットで培地を６０ μＬ／ｗｅｌｌずつ回収し、測定するまでディープフリーザー（−８０ °Ｃ）にて保存。
結果を表１に示す。
１細胞当たりのインスリン分泌量は、ＤＮＡの定量により求めた細胞数から換算した。
操作（測定）
レビス(R)インスリンキット（株式会社シバヤギ製）（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いたモノクロナル抗体を使用するサンドイッチ手法によるインスリン測定用キット）を用いて、取扱説明書に従って測定（下記）。
１．抗体固相化プレートを洗浄液で、４回洗浄する。
２．ビオチン結合抗インスリン抗体を１００μＬずつ各ウェルに分注する。
３．撹拌後、検体又は標準インスリン溶液を１０μＬずつ分注する。
４．撹拌後、静置し室温で２時間反応させる。
５．プレートを洗浄液にて、４回洗浄する。
６．ペルオキシダーゼ−アビジン結合物を１００μＬずつ各ウェルに分注する。
７．撹拌後、静置し室温で３０分間反応させる。
８．プレートを洗浄液にて、４回洗浄する。
９．発色液を１００μＬずつ各ウェルに分注する。
１０．撹拌後、静置３０分間反応させる。
１１．反応停止液を１００μＬずつ各ウェルに分注する。
１２．撹拌後、プレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定する。
ＤＮＡの定量
操作（サンプリング）
１．インスリン測定用サンプルを採取した後、遠心（１２００ ｒｐｍ， ５ ｍｉｎ）し、マイクロピペットで培地を４０ μＬ／ｗｅｌｌずつ抜き取る。
２．凍結乾燥し、測定するまでデシケーターにて保存。
操作（サンプリング）
１．インスリン測定用サンプルを採取した後、遠心（１２００ ｒｐｍ， ５ ｍｉｎ）し、マイクロピペットで培地を４０ μＬ／ｗｅｌｌずつ抜き取る。
２．凍結乾燥し、測定するまでデシケーターにて保存。
操作（測定）
１．パパイン消化： パパイン溶液（１２５ μｇ／ｍＬ）を０．１５ ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加後、プレートシールにて密封し、インキュベーション（６０ °Ｃ， ２４ ｈ）。
２．蛍光測定（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８染色）： 遠心（１８００ ｒｐｍ， １０ ｍｉｎ）した後、検体を平底９６ウェルプレートに分注（０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌ）。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（１ μｇ／ｍＬ）を０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、撹拌した後、プレートリーダーにて測定（ｅｘ． ３６０ ｎｍ， ｅｍ． ４６５ ｎｍ）。
検量線は、細胞懸濁液とＤＮＡ溶液で作成し、換算した。
その結果を表２に示す。
１．パパイン消化： パパイン溶液（１２５ μｇ／ｍＬ）を０．１５ ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加後、プレートシールにて密封し、インキュベーション（６０ °Ｃ， ２４ ｈ）。
２．蛍光測定（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８染色）： 遠心（１８００ ｒｐｍ， １０ ｍｉｎ）した後、検体を平底９６ウェルプレートに分注（０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌ）。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（１ μｇ／ｍＬ）を０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、撹拌した後、プレートリーダーにて測定（ｅｘ． ３６０ ｎｍ， ｅｍ． ４６５ ｎｍ）。
検量線は、細胞懸濁液とＤＮＡ溶液で作成し、換算した。
その結果を表２に示す。
遺伝子解析（リアルタイムＰＣＲ）
操作（サンプリング）
１．１５ ｍＬ遠心管に細胞を集めて、遠心（１２００ ｒｐｍ， ５ ｍｉｎ）した後、培地を抜き取る。
２．ＰＢＳ洗浄（２回）： 冷ＰＢＳ（２ ｍＬ）で懸濁後、遠心（１２００ ｒｐｍ， ５ ｍｉｎ）して、抜き取る。
もう一度繰り返す。
３．測定するまでディープフリーザー（−８０℃）にて保存。
操作（サンプリング）
１．１５ ｍＬ遠心管に細胞を集めて、遠心（１２００ ｒｐｍ， ５ ｍｉｎ）した後、培地を抜き取る。
２．ＰＢＳ洗浄（２回）： 冷ＰＢＳ（２ ｍＬ）で懸濁後、遠心（１２００ ｒｐｍ， ５ ｍｉｎ）して、抜き取る。
もう一度繰り返す。
３．測定するまでディープフリーザー（−８０℃）にて保存。
操作（測定）
１．ｔｏｔａｌ ＲＮＡ 抽出 （ＱＩＡＧＥＮ、ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ使用）
２．ＯＤ測定する（この結果より、４ｕｇ相当のＲＮＡ量を計算）
３．ｃＤＮＡ合成 （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ使用）
４．リアルタイムＰＣＲ （日本ジーン、ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ＳＹＢＲ(R) Ｇｒｅｅｎ Ｉ
その結果を表３に示す
１．ｔｏｔａｌ ＲＮＡ 抽出 （ＱＩＡＧＥＮ、ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ使用）
２．ＯＤ測定する（この結果より、４ｕｇ相当のＲＮＡ量を計算）
３．ｃＤＮＡ合成 （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ使用）
４．リアルタイムＰＣＲ （日本ジーン、ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ＳＹＢＲ(R) Ｇｒｅｅｎ Ｉ
その結果を表３に示す
（使用）
リアルタイムＰＣＲ条件
１０ｍｉｎ ９５℃
１５ｓｅｃ ９５℃ ４０ｃｙｃｌｅｓ
１ｍｉｎ ６０℃
内在性コントロールとして、Ｒａｔ−１８Ｓ等を使用
リアルタイムＰＣＲ条件
１０ｍｉｎ ９５℃
１５ｓｅｃ ９５℃ ４０ｃｙｃｌｅｓ
１ｍｉｎ ６０℃
内在性コントロールとして、Ｒａｔ−１８Ｓ等を使用
本発明によると、高分子架橋剤を用いて細胞の機能を高度に発現できる細胞架橋体及びリポソームと細胞から構成される複合架橋体を作製することが可能であり、医用生体材料として有用である。
Claims (6)
- 細胞同士又は細胞とリポソームを高分子架橋剤にて架橋した複合架橋体であって、前記高分子架橋剤が、細胞表面に存在する脂質の疎水性部位に対してアンカリングする高分子架橋剤であって、下記［化１］に示す構造を持つ高分子で、Ａが疎水性分子、Ｂが親水性分子、Ｃが非生分解性分子又は生分解性分子であり、培地にて培養してすることにより得られたことを特徴とする複合架橋体。
［化１］
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ａ - 請求項１に記載の複合架橋体において、前記高分子架橋剤の前記疎水性分子Ａが、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合された脂質、アルキル基、コレステロール基であることを特徴とする複合架橋体。
- 請求項１又は２に記載の複合架橋体において、前記高分子架橋剤の前記親水性分子Ｂが、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合されたポリエチレングリコールであることを特徴とする複合架橋体。
- 請求項１から３のいずれかに記載の複合架橋体において、前記高分子架橋剤の前記非生分解性分子又は生分解性分子Ｃが、エステル、アミド、ジスルフィド、シッフ塩基結合のいずれかで結合されたアルキル鎖又はマトリックスメタロプロテアーゼ分解ペプチド、酵素分解性ペプチド、ポリ又はオリゴエステル、ポリ又はオリゴエーテルの１種又はそれ以上の組み合わせであることを特徴とする複合架橋体。
- 請求項１から４のいずれかに記載の複合架橋体において、前記細胞が、間葉系幹細胞、肝細胞、膵細胞、膵β細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、赤血球、ＥＳ細胞の１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする複合架橋体。
- 請求項１から５のいずれかに記載の複合架橋体において、前記培地が血清添加培地であることを特徴とする複合架橋体。
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| JP2002540065A (ja) * | 1999-01-29 | 2002-11-26 | アムジェン インコーポレーテッド | Ｇｃｓｆコンジュゲート |
| JP2007112924A (ja) * | 2005-10-21 | 2007-05-10 | National Institute For Materials Science | 高分子架橋剤及びこの架橋剤を用いたリポソーム又は細胞の架橋体 |
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2006
- 2006-11-24 JP JP2006316806A patent/JP2008125952A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019088258A1 (ja) * | 2017-11-06 | 2019-05-09 | 国立大学法人 東京大学 | 光分解性細胞固定化剤 |
| JPWO2019088258A1 (ja) * | 2017-11-06 | 2020-11-26 | 国立大学法人 東京大学 | 光分解性細胞固定化剤 |
| JP7205910B2 (ja) | 2017-11-06 | 2023-01-17 | 国立大学法人 東京大学 | 光分解性細胞固定化剤 |
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