NO331787B1 - Fysiologisk aktive PEG-GCSF-konjugater, sammensetning omfattende konjugatene og fremgangsmate for fremstilling av konjugatene - Google Patents
Fysiologisk aktive PEG-GCSF-konjugater, sammensetning omfattende konjugatene og fremgangsmate for fremstilling av konjugatene Download PDFInfo
- Publication number
- NO331787B1 NO331787B1 NO20013700A NO20013700A NO331787B1 NO 331787 B1 NO331787 B1 NO 331787B1 NO 20013700 A NO20013700 A NO 20013700A NO 20013700 A NO20013700 A NO 20013700A NO 331787 B1 NO331787 B1 NO 331787B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- conjugates
- peg
- gcsf
- conjugate
- mutein
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 116
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 92
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 82
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 82
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 49
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000000788 granulopoietic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims description 4
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims 8
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 229940029345 neupogen Drugs 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 13
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000013230 female C57BL/6J mice Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 101100114967 Homo sapiens CSF3 gene Proteins 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 3
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- DCESWPKOLYIMNH-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)N1C(=O)CCC1=O DCESWPKOLYIMNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000002568 pbsc Anatomy 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- -1 sulfopropyl Chemical group 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 150000003673 urethanes Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polyethers (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Fysiologisk aktive PEG-GCSF-konjugater med formel (I) beskrives, så vel som sammensetninger som inneholder en blanding av konjugater i hvilke m og n kan være forskjellige heltall for konjugatene i sammensetningen.
Description
Oppfinnelsens bakgrunn
Granulocyttkolonistimulerende faktor (GCSF) er et farmasøytisk aktivt protein som regulerer proliferasjon, diffe-rensiering og funksjonell aktivering av nøytrofile granulocytter (Metcalf, Blood, 67:257 (1986); Yan et al., Blood, 84(3) :795-799
(1994); Bensinger et al., Blood, 81(11):3158-3163 (1993); Roberts et al., Expt'1 Hematology, 22:1156-1163 (1994); Neben et al., Blood, 81(7) :1960-1967 (1993)). GCSF kan mobilisere stamceller og forløperceller fra benmarg og anvendes for behandling av pasienter hvis granulocytter er blitt redusert ved kjemoterapi, eller som en forbehandling ved benmargstransplantasjoner.
US patentskrift nr. 5 214 132 beskriver et mutein av human GCSF som avviker fra nativ hGCSF i posisjonene 1, 3, 4, 5 og 17, hvor muteinet i stedet for de native GCSF-aminosyrer har Ala, Thr, Tyr, Arg henholdsvis Ser (se også Kuga et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159:103-111 (1989)). M. Okabe et al. (Blood, 75(9) :1788-1793 (1. mai 1990) rapporterte et derivat av rhGCSF i hvilket aminosyrer var erstattet i fem posisjoner i den N-terminale del av rhGCSF, som viste høyere spesifikk aktivitet enn intakt rhGCSF benmargforløperceller fra mus og/eller menneske i to analysesystemer. US patentskrift nr. 5 218 092 beskriver et mutein av human GCSF som avviker fra nativ hGCSF i posisjonene 1, 3, 4, 5, 17, 145 og 147, hvor muteinet i stedet for de native GCSF-aminosyrer har Ala, Thr, Tyr, Arg, Ser, Asn og henholdsvis Ser.
Biotilgjengeligheten av terapeutiske proteiner som GCSF begrenses ofte av en kort halveringstid i plasma og følsomhet overfor proteasedegradering, noe som forhindrer maksimal klinisk aktivitet. Undersøkelser av andre terapeutiske proteiner har vist at slike vanskeligheter kan overvinnes ved å konjugere proteinet til en polymer som polyetylenglykol (PEG), typisk via en sammenkoblende gruppe som er kovalent bundet til både proteinet og PEG.
Slike PEG-konjugerte biomolekyler er blitt vist å besitte klinisk anvendbare egenskaper (Inada et al., J. Bioact. and Compatible Polymers, 5:343 (1990); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9:249 (1992); Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10:91 (1993) og US patentskrift nr. 5 281 698). Blant disse er bedre fysisk stabilitet og varmestabilitet, beskyttelse mot følsomhet for enzymatisk degradering, økt løselighet, lengre halveringstid in vivo i sirkulasjonen og redusert clearance, redusert immuno-genisitet og antigenisitet, og redusert toksisitet.
PEG-GCSF-konjugater med andre strukturer enn konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse beskrives i europeisk patentskrift nr. EP 0 335 423; europeisk patentskrift nr. 0 401 384; R.W. Niven et al., J. Controlled Release, 32:177-189 (1994); og Satake-Ishikawa et al., Cell Structure and Function, 17:157-160
(1992)).
Oppsummering av oppfinnelsen
Oppfinnelsen er følgelig en ny klasse av PEG-derivater av GCSF. Konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse har en amidlinker, som vist nedenfor.
Sammenlignet med umodifisert GCSF (det vil si GCSF uten tilkoblet PEG) har konjugatet en forlenget halveringstid i sirkulasjonen og oppholdstid i plasma, redusert clearance og forhøyet granulopoietisk aktivitet in vivo. Sammenlignet med PEG-GCSF-konjugater har konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse i tillegg overlegne granulopoietiske egenskaper. Andre PEG-GCSF-konjugater beskrives i europeisk patentskrift nr.
EP 0 335 423; europeisk patentskrift nr. EP 0 401 384; og Niven et al., ibid. Konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse har imidlertid en annen struktur enn disse konjugatene og har overlegne egenskaper, særlig ved at det viser langvarig, høy granulopoietisk aktivitet in vivo i en lav dose.
En foretrukket GCSF ifølge foreliggende oppfinnelse er et GCSF-mutein som har egenskaper som tilsvarer eller er bedre enn nativ GCSF, og som har de samme anvendelser som GCSF. Muteinet har den samme aminosyresekvens som GCSF, bortsett fra i posisjonene 1, 3, 4, 5 og 17, hvor muteinet i stedet for de native GCSF-aminosyrer har Ala, Thr, Tyr, Arg henholdsvis Ser (GCSF-mutein) (se figur 1). Dette mutein er beskrevet i US patentskrift nr. 5 214 132.
Det fysiologisk aktive PEG-GCSF-konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse har formelen
Også del av foreliggende oppfinnelse er sammensetninger inneholdende konjugatene ifølge kravene, hvor m og n kan være forskjellige heltall for konjugatene i sammensetningen.
Konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse har de samme anvendelser som GCSF. Nærmere bestemt er konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse anvendbart for behandling av pasienter hvis granulocytter er blitt redusert ved kjemoterapi eller som en forbehandling for benmargstransplantater, på samme måte som GCSF anvendes for behandling av disse tilstander. Konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse har imidlertid forbedrede egenskaper, innbefattet overlegen stabilitet, høyere løselighet, forlenget halveringstid i sirkulasjonen og forlenget oppholdstid i plasma.
Beskrivelse av figurene
Figur 1: Primærstrukturen til GCSF-mutein. Det viste GCSF-mutein avviker fra villtype-human-GCSF i posisjonene 1, 3, 4, 5 og 17, hvor muteinet i stedet for de native GCSF-aminosyrer har Ala, Thr, Tyr, Arg henholdsvis Ser.
Figur 2: Pegyleringsreagenser.
Figur 3: Separasjon av PEG-modifisert GCSF-mutein på 20 kDa og umodifisert GCSF-mutein. En typisk elueringsprofil for en PEG-reaksjonsblanding. Kolonne: 1-2 ml "Fractogel" EMD SO3650S. Ekvilibreringsbuffer: 10 mM ammoniumacetat, pH 4,5. Elueringsbuffere: 1. 0,15 M NaCl i ekvilibreringsbuffer.
2. 0,5 M NaCl i ekvilibreringsbuffer.
Figur 4: PEG-GCSF-muteinaktivitet på dag 5 etter en enkelt injeksjon. C57BL/6J-hunnmus ble injisert subkutant med 25,2^g av de pegylerte GCSF-muteinkonjugatene, og på den femte dag etter tilførselen ble veneblodprøver oppsamlet fra retroorbitalvenen. Hematologisk differensialanalyse og leukocytt-differensialanalyse ble utført med en Coulter-teller, og de resulterende nøytrofiltall ble standardisert mot en kontroll med bærerstoff for hvert eksperiment. De viste resultater representerer middelverdi + standardfeil med 4 mus i hver gruppe. Figur 5: Økt PMN-tall som funksjon av PEG-masse (kDa) i amid- og urealinkede GCSF-mutein-PEG-konjugater. For konjugater fremstilt med SPA-reagens er PMN = 0,277 MW + 3,95. For konjugater fremstilt med ureareagens er PMN = 0,152 MW + 2,74. Figur 6: PEG-GCSF-muteinaktivitet på dag 7 etter en enkelt injeksjon. C57BL/6J-hunnmus ble injisert subkutant med 25,2^g av de pegylerte GCSF-muteinkonjugatene, og på den sjuende dag etter tilførselen ble veneblodprøver oppsamlet fra retroorbitalvenen. Hematologisk differensialanalyse og leuko-cyttdifferensialanalyse ble utført med en Coulter-teller, og de resulterende nøytrofiltall ble standardisert mot en kontroll med bærerstoff for hvert eksperiment. De viste resultater representerer middelverdi ± standardfeil med 4 mus i hver gruppe. Figur 7: Kolonianalyse for muse-PBSC-mobilisering. Figur 8: Kolonianalyse for muse-PBSC-mobilisering. Figur 9: Kolonianalyse for muse-PBSC-mobilisering. Figur 10: Kolonianalyse for muse-PBSC-mobilisering. Figur 11: Kolonianalyse for muse-PBSC-mobilisering.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
En utførelsesform av oppfinnelsen er ifølge krav 1 et fysiologisk aktivt PEG-GCSF-konjugat med formelen
hvor G er en granulocyttkolonistimulerende faktor minus aminogruppen eller -gruppene som danner en amidbinding med en polyetylenglykolgruppe i konjugatet; R er Ci-C6-alkyl; n er et heltall fra 420 til 550, og m er et heltall fra 1 til 5.
I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen en sammensetning hvori sammensetningen omfatter fysiologisk aktive konjugater med formelen
hvor G i hvert konjugat er en granulocyttkolonistimulerende faktor minus aminogruppen eller -gruppene som danner en amidbinding med en polyetylenglykolgruppe i konjugatene; R i hvert konjugat er uavhengig av hverandre Ci-C6-alkyl; n i hvert konjugat er uavhengig av de andre et heltall fra 420 til 550; m i hvert konjugat er uavhengig av de andre et heltall fra 1 til 4; prosentandelen av konjugater hvor m er 1, er 18-25 %; prosentandelen av konjugater hvor m = 2, er 50-66 %; prosentandelen av konjugater hvor m = 3, er 12-16 %; og prosentandelen av konjugater hvor m = 4, er opptil 5 %. I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et PEG-GCSF-konjugat ifølge krav 1, med lengre halveringstid i sirkulasjonen og høyere granulopoietisk aktivitet in vivo enn den tilsvarende ukonjugerte GCSF, hvori fremgangsmåten består av å omdanne et reagens med formelen
med GCSF for fremstilling av konjugatet.
Tallene n og m utvelges slik at det resulterende konjugat med formel I har en fysiologisk aktivitet som kan sammen-lignes med aktiviteten til umodifisert GCSF, hvis aktivitet kan representere den samme aktivitet, en høyere aktivitet eller en fraksjon av den tilsvarende aktivitet av umodifisert GCSF. n står for antall etylenoksidrester i PEG-enheten. En enkelt PEG-subenhet, OCH2CH2, har en molekylvekt på ca. 44 dalton. m står for antall PEG-enheter koblet til GCSF-molekylet. Et konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 PEG-enheter pr. molekyl GCSF. Molekylvekten til konjugatet
(bortsett fra molekylvekten til GCSF) avhenger således av tallene n og m.
n kan ha en verdi fra 420 til 550, noe som gir et konjugat i hvilket hver PEG-enhet har en gjennomsnittsmolekylvekt på fra ca. 18 kilodalton til ca. 25 kilodalton pr. PEG-enhet. n har fortrinnsvis en verdi på mellom 450 og 490, noe som gir et konjugat i hvilket hver PEG-enhet har en gjennomsnittsmolekylvekt på ca. 20 kilodalton. m kan ha en verdi på 1, 2, 3, 4 eller 5. En foretrukket m er 1-4, og en spesielt foretrukket m er 2. Molekylvektområdet for PEG-delen av konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse er på fra ca. 18 kilodalton (n = 420, m = 1) til ca. 125 kilodalton (n = 550, m = 5). Dersom n er fra 420 til 550 og m er et heltall fra 1 til 4, er molekylvektområdet for PEG-delen av konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse på fra ca. 18 kilodalton (n = 420, m = 1) til ca. 97 kilodalton (n = 550, m = 4). En molekylvekt på "ca." et gitt nummer betyr at den ligger innenfor et rimelig område rundt dette nummer, bestemt ved konvensjonelle analytiske teknikker.
I et foretrukket konjugat er n 450 til 490, og m er 1-4, slik at molekylvektområdet for PEG-delen av konjugatene er fra ca. 20 kilodalton (n = 450, m = 1) til ca. 86 kilodalton (n = 490, m = 4). I et annet foretrukket konjugat er n fra 420 til 550, og m er 2, slik at molekylvektområdet for PEG-delen av konjugatene er fra ca. 37 kilodalton (n = 420) til ca. 48 kilodalton (n = 550). I et spesielt foretrukket konjugat er n fra 450 til 490, og m er 2, slik at molekylvektområdet for PEG-delen av konjugatene er fra ca. 40 kilodalton (n = 450) til ca.
43 kilodalton (n = 490).
R er et Ci-C6~alkyl, med hvilket menes en alkylgruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, f.eks. metyl, etyl, isopropyl osv. Forgrenede alkyler omfattes. Et foretrukket alkyl er metyl.
Med GCSF menes det naturlige eller rekombinante protein, fortrinnsvis fra menneske, som erholdt fra enhver konvensjonell kilde, f.eks. vev, proteinsyntese eller celle-dyrking av naturlige eller rekombinante celler. Ethvert protein med GCSF-aktivitet, f.eks. muteiner og på annet vis modifiserte proteiner, omfattes. Erholdelse og isolering av GCSF fra naturlige eller rekombinante kilder er vel kjent (se f.eks.
US patentskrifter nr. 4 810 643 og 5 532 341). Et foretrukket
GCSF-konjugat er et konjugat med GCSF-mutein, som beskrevet i US patentskrift nr. 5 214 132.
Det fysiologisk aktive konjugat med formel I har GCSF-aktivitet, med hvilket menes enhver fraksjon eller ethvert multiplum av enhver kjent GCSF-aktivitet, bestemt ved forskjellige analyser som er kjent innen faget. Nærmere bestemt har konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse GCSF-aktivitet, vist ved evnen til å øke PMN-tallet. Dette er en kjent GCSF-aktivitet. En slik aktivitet i et konjugat kan bestemmes ved analyser som er vel kjent innen faget, f.eks. analysene beskrevet nedenfor (se også: Asano et al., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991), 19:2767-2773; Yamasaki et al., J. Biochem. (1994), 115:814-819; og Neben et al., Blood (1993), 81:1960.
Konjugatet med formel I fremstilles ved kovalent binding til GCSF av et suksinimidylpropionsyre(SPA)reagens med formelen
Reagenset med formel II kan erholdes ved konvensjonelle metoder ifølge kjente fremgangsmåter (se US patentskrift nr. 5 672 662). n er den samme som i formel I ovenfor og velges slik at det dannes et konjugat med ønsket molekylvekt. Slike reagenser i hvilke n er fra 450 til 490 (molekylvekt = 20 kDa) foretrekkes. Andre molekylvekter kan erholdes ved å variere n for PEG-alkoholutgangsmaterialene for reagenset med formel II ved konvensjonelle fremgangsmåter. SPA-reagenset med formel II og med molekylvekter 5, 10, 15 og 20 kDa kan erholdes fra Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama).
Reagenset med formel II kan konjugeres til GCSF ved konvensjonelle fremgangsmåter. Tilkoblingen er via en amidbinding. Nærmere bestemt reagerer reagenset med formel II hovedsakelig med én eller flere av de primære aminogruppene (f.eks. N-enden og lysinsidekjedene) i GCSF, slik at det dannes en amidbinding mellom GCSF og polymerryggraden i PEG. NH-gruppen vist i formel I er avledet fra én eller flere av disse primære aminogruppene i GCSF som reagerer med reagenset med formel II, slik at det dannes en amidbinding. I mindre grad kan reagenset med formel II også reagere med hydroksylgruppen i serin i posisjon 66 i GCSF, slik at det dannes en esterbinding mellom GCSF og polymerryggraden i PEG. Reaksjonsbetingelsene er konvensjonelle for fagfolk og gis i detalj nedenfor.
Tilkobling av reagensene til GCSF kan oppnås ved konvensjonelle fremgangsmåter. PEG med enhver utvalgt molekylvekt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes (n). Reaksjonen kan f.eks. utføres i løsning ved en pH fra 5 til 10, ved en temperatur fra 4 °C til romtemperatur, i fra 30 minutter til 20 timer, ved anvendelse av et molart forhold mellom reagens og protein på fra 4:1 til 30:1. Reaksjonsbetingelsene kan velges slik at reaksjonen styres mot hovedsakelig fremstilling av en ønsket substitusjonsgrad. Generelt bidrar lav temperatur, lav pH (f.eks. pH 5) og kort reaksjonstid til å redusere antall tilkoblede PEG (lavere m). Høy temperatur, nøytral til høy pH (f.eks. pH > 7) og lengre reaksjonstid bidrar til å øke antall tilkoblede PEG (høyere m). For f.eks. 5 kDa-reagenset med formel II ved pH 7,3 og et molart forhold mellom reagens og protein på
30:1, en temperatur på 4 °C og en reaksjonstid på 30 minutter ble hovedsakelig mono-PEG-konjugatet dannet; en temperatur på 4 °C og en reaksjonstid på 4 timer ga hovedsakelig di-PEG-konjugatet, og en temperatur på romtemperatur og en reaksjonstid på 4 timer ga hovedsakelig tri-PEG-konjugatet. Reaksjonen stanses ved surgjør-ing av reaksjonsblandingen og nedfrysning ved -20 °C. Generelt foretrekkes en pH på fra 7 til 7,5 og et molart forhold mellom reagens og protein på fra 4:1 til 6:1.
Rensingsfremgangsmåter som f.eks. kationbytterkromatografi kan anvendes for å separere konjugater ut fra ladnings-forskjeller, noe som effektivt separerer konjugatene i de forskjellige molekylvekter. Blandingen kan f.eks. settes på kationbytterkolonnen, som så vaskes med ca. 20 mM natriumacetat, pH ca. 4, og kolonnen elueres så med en lineær (0 M til 0,5 M) NaCl-gradient bufret ved en pH fra 3 til 5,5, fortrinnsvis ved pH ca. 4,5. Innholdet i fraksjonene som erholdes ved kationbytterkromatografi, kan identifiseres ved molekylvekt ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter, f.eks. massespektro- skopi, SDS-PAGE eller andre kjente fremgangsmåter for separasjon av forskjellige molekyler ut fra molekylvekt. Det identifiseres følgelig en fraksjon som inneholder det konjugat med formel I som har det ønskede antall (m) tilkoblede PEG, renset fritt for umodifisert GCSF og for konjugater med et annet antall PEG tilkoblet .
Også del av foreliggende oppfinnelse er en sammensetning av konjugater hvor konjugater med forskjellige verdier for m inngår i spesifikke forhold. En foretrukket sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse er en blanding av konjugater hvor m = 1, 2, 3 og 4. Prosentandelen av konjugater hvor m = 1, er 18-25 %; prosentandelen av konjugater hvor m = 2, er 50-66 %; prosentandelen av konjugater hvor m = 3, er 12-16 %; og prosentandelen av konjugater hvor m = 4, er opptil 5 %. En slik sammensetning fremstilles ved å la pegyleringsreagens reagere med GCSF i et molart forhold på fra 4 til 6:1 (overskudd av reagens). Reaksjonen får forløpe ved 4 °C til 8 °C i 20 timer ved en pH nær 7,5. Ved avsluttet reaksjon tilsettes eddiksyre. Konjugatet renses så fra gjenværende umodifisert protein, overskudd av pegyleringsreagens og andre urenheter og bufferbestanddeler som foreligger under reaksjonen. Sammen med pegylert protein dannes N-hydroksysuksinimid og polyetylenglykolkarboksylsyre som side-produkter i reaksjonen.
De påfølgende eksempler gis for å illustrere oppfinnelsen som beskrives heri. GCSF-mutein anvendes i disse eksempler. Andre GCSF-typer kan også konjugeres til PEG ved de eksemplifiserte fremgangsmåter.
Eksempel 1
Pegyleringsreagenser
1. GABA- amidlinker (P-6GA-1, P-12Ga-l)
GABA-amidlinkerreagensene inneholder to PEG-grupper på enten 6 eller 12 kDa. Se figur 2-A for strukturene.
2. Amidlinker (P-5 am-1, P-lOam-1)
Amidlinkere på 5 og 10 kDa ble fremstilt. Se figur 2-B for strukturen.
3. Amidlinker
Dette reagens var en kommersiell suksinimidylpropion-syre (SPA), fremstilt med PEG-molekyler på 5, 10, 15 og 20 kDa, og den generelle struktur er vist i figur 2-C.
4. Urealinker
Dette reagens ble fremstilt med PEG-molekyler på 5, 10 og 25 kDa, og den typiske struktur er vist i figur 2-D.
5. Uretanlinker
Uretanlinkere på 10 og 20 kDa ble fremstilt, og strukturen er vist i figur 2-E.
6. Uretanlinker
Som strukturen til dette kommersielt fremstilte PEG-reagens på 36 kDa viser, vist i figur 2-G, er én ende av PEG-reagenset blokkert med en t-butylgruppe. Dette reagens inneholdt PEG-gruppen med den høyeste molekylvekt som ble anvendt i dette eksempel.
7. Tiouretanlinker
Strukturen til dette pegyleringsreagens kan ses i figur 2-F. Molekylvekten til PEG anvendt i dette reagens var 20 kDa.
Følgende reagenser ble erholdt fra Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan: G-CSF-mutein betegnet GCSF-mutein, GCSF-mutein konjugert til et forgrenet metoksypolyetylenglykol-(m-PEG)-reagens bestående av 2 m-PEG-kjeder på enten 6 eller 12 kDa (PEG-GABA-NHS, se figur 2A), GCSF-mutein konjugert til lineært ester-/amid-m-PEG reagens på 5 og 10 kDa (se figur 2B). m-PEG-suksinimidylpropionsyre-NHS(PEG-SPA)reagens med molekylvekter på 5, 10, 15 og 20 kDa ble erholdt fra Shearwater Polymers (Huntsville, Alabama, se figur 2C). Følgende protein-pegyleringsreagenser ble fremstilt hos Hoffmann-La Roche, Inc.: 1) m-PEG-urealinker (5, 10 og 25 kDa, se figur 2D), 2) m-PEG-uretanlinker (10 og 20 kDa, se figur 2E), m-PEG-tiouretanlinker (10 og 20 kDa, se figur 2F) og t-butyl-m-PEG-uretanlinkerreagens med en gjennomsnittsmolekylvekt på 36 kDa ble erholdt fra DDI Pharmaceuticals, Inc. (Mountainview, CA, figur 2G).
Pegyleringsreaksj oner
Faktorene som påvirker pegyleringsreaksjonene er 1) pH, 2) temperatur, 3) reaksjonstid, 4) det molare forhold mellom protein og PEG-reagens og 5) proteinkonsentrasjon. Ved å kontrollere én eller flere av disse faktorer kan man styre reaksjonen mot fremstilling av hovedsakelig mono-, di-, tri-osv. PEG-konjugater. For eksempel var reaksjonsbetingelsene for SPA-PEG 5000(N-hydroksysuksinimid)-reagenset fra Shearwater Polymers 1) pH 7,3, 2) temperatur 4 °C for mono- og di-PEG, og romtemperatur for tri-PEG, 3) reaksjonstiden for mono-PEG var 30 minutter og for di- og tri-PEG 4 timer, og 4) det molare forhold mellom protein og reagens var 1:30. For alle reagenser ble de optimale reaksjonsbetingelser for fremstilling av de ønskede PEG-typer bestemt enkeltvis. Disse betingelsene er vist i tabell 1. Reaksjonen stanses ved surgjøring av reaksjonsblandingen og nedfrysing ved -20 °C.
Separering av modifisert og fritt GCSF- mutein fra reaksjonsblandingen ( sulfopropyl( SP)- kationbytting)
Reaksjonsblandingen, som inneholdt ca. 5 mg protein, ble fortynnet 10-20 ganger med vann, og pH ble justert til 4,5 med iseddik. Den fortynnede prøve ble så påsatt en tidligere pakket 1-2 ml "Fractogel" EMD S03650S-kolonne (EM Separations, Gibbstown, New Jersey) som var ekvilibrert med 10 rtiM ammoniumacetat, pH 4,5. Ikke-adsorbert reagens og biprodukter fra reaksjonen ble fjernet i det ubundne materialet. Det modifiserte GCSF-mutein ble eluert med en trinnvis gradient med 0,15 M NaCl i ekvilibreringsbufferen. Umodifisert GCSF-mutein som fortsatt var bundet til kolonnen, ble trinnvis eluert med 0,5 M NaCl i ekvilibreringsbufferen. Den separerte GCSF-mutein-PEG-konjugat-blanding ble sterilfiltrert med et 0,2 filter og lagret nedfrosset ved -20 °C.
Karakterisering av GCSF- mutein- PEG- konjugater
Proteinbestemmelse
Proteinkonsentrasjonen i de rensede GCSF-mutein-PEG-konjugatene ble bestemt ved å anvende en A28o-verdi på 0,86 for en løsning med 1 mg/ml.
SDS- PAGE- analyse
Denne analysen ble utført ved anvendelse av 12 og 15 % polyakrylamidgeler eller 8-16 % polyakrylamidgradientgeler under reduserende betingelser ifølge Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970.
Bestemmelse av prosentvis sammensetning
Den prosentvise andel av hver molekyltype (mono-, di-, tri- osv.) i de forskjellige GCSF-konjugatreaksjonsblandingene ble bestemt ut fra densitometrisk måling av Coomassie blue-fargede SDS-PAGE-geler (se tabell 2).
Bestemmelse av PEG- masse i GCSF- mutein- PEG- konjugater
Den totale PEG-masse som var substituert i forskjellige preparater, ble bestemt ut fra gjennomsnittsmolekylvekten til PEG, identifisering av de enkelte PEG-konjugater (mono-, di-osv.) basert på elektroforetisk mobilitet, antall tilkoblede PEG-molekyler og prosentandelen basert på densitometrisk måling av Coomassie blue-farget SDS-PAGE. Den totale PEG-masse i et gitt preparat er summen av de enkeltvise PEG-massene. Den enkelte PEG-masse beregnes ut fra følgende ligning:
PEG-masse = PEG M.W. x # PEG-molekyler x %-andel
hvor
PEG M.W.-5, 10, 20 kDa osv.
# PEG-molekyler =1, 2, 3 for mono, di henholdsvis tri.
Massespektrometri (MALDI-TOF) er også blitt anvendt for bestemmelse av den totale PEG-masse. I dette tilfellet tillot massespekteret identifisering og bestemmelse av molekylvekten til de enkelte PEG-konjugater. Molekylvekten til PEG tilkoblet til hvert PEG-konjugat er den totale molekylvekt til de enkelte PEG-konjugater minus molekylvekten til GCSF-mutein (18,19 kDa). Disse verdier multiplisert med den prosentvise andel gir de enkelte PEG-masser, og summen av disse er den totale PEG-masse.
Begge fremgangsmåter er blitt anvendt for å bestemme PEG-massen i forskjellige preparater. Resultatene er oppsummert i tabell 2.
Bestemmelse av endotoksinnivåer
Endotoksinnivåer ble bestemt ved anvendelse av LAL-fremgangsmåten ifølge produsentens instruksjoner (Associates of Cape Cod, Inc, Woods Hople, Massachusetts).
Biologiske aktiviteter
In vitro-bioanalysen på M-NFS-60-celler og in vivo-analysen i C57BL/6J-hunnmus ble utført som beskrevet tidligere (se Asano et al., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991), 19:2767-2773).
Resultater og diskusjon
Pegyleringsreaksj on
Generelt viste resultatene at mindre reaktive reagenser som urealinkeren krever høyere pH, temperatur og molart forhold mellom protein og reagens, så vel som lengre reaksjonstid, for å oppnå den ønskede konjugasjonsmengde (se tabellene 1 og 2).
Separasjon av modifisert og fritt GCSF- mutein fra reaksjonsblandingen
En typisk elueringsprofil er vist i figur 4. I tillegg til kationbytterkromatografi kan det være nødvendig med ytterligere trinn, f.eks. gelpermeasjonskromatografi, for å fjerne sporkontaminanter og endotoksin og for å skifte bufferen i sluttproduktet for lagring. Separasjonsfremgangsmåten med en kraftig kationbytter er blitt oppskalert til 30 mg skala for SPA(amid)-konjugatene på 20 kDa og uretankonjugatene på 20 kDa. Nær sagt kvantitativ gjenvinning oppnås ved denne fremgangsmåten .
Prosentvis sammensetning og PEG- masse
Den prosentvise sammensetning og PEG-masseresultatene er oppsummert i tabell 2. Ut fra vår erfaring er for PEG-konjugater med høy molekylvekt (f.eks. 20 kDa SPA-di-PEG og 12 kDa GABA) identifisering av PEG-typer basert på elektroforetisk mobilitet for å bestemme den prosentvise sammensetning av en reaksjonsblanding ikke svært pålitelig. For å bestemme PEG-massen og identifisere PEG-konjugater med høy molekylvekt og høy substitusjonsgrad er det nødvendig med en kombinasjon av SDS- PAGE, SP-HPLC og MALDI-TOF-MS-analyser. Monopegylerte konjugater og PEG-konjugater avledet fra PEG-reagenser med lav molekylvekt (f.eks. 5 kDa) kunne imidlertid identifiseres temmelig nøyaktig ut fra den angjeldende SDS-PAGE-profil.
Endotoksinnivåer
Ved anvendelse av LAL-fremgangsmåten ble < 1 EU/mg endotoksin påvist i alle PEG-konjugater, bortsett fra konjugatet avledet fra uretanreagens. I dette PEG-konjugat ble endotoksin påvist kun etter fortynning. Det er blitt bekreftet at dette ikke skyldes kontaminering under fortynningen, og et ukjent materiale i denne prøven kan derfor ha gitt en inhibering av LAL-analysen ved høyere proteinkonsentrasjon. Ved fortynning av prøven og medfølgende fortynning av det inhiberende materialet ble et positivt endotoksinresultat erholdt.
Bioaktivitet
Bioaktiviteter in vitro og in vivo for alle GCSF-mutein-PEG-konjugater er oppstilt i tabell 2. Generelt observeres et inverst forhold mellom in vitro-aktivitet og substitusjonsgrad, så vel som PEG-molekylvekten. I motsetning til dette ble en forsterket in vivo-aktivitet observert med økende molekylvekt av den substituerte PEG. Dette er også blitt observert av andre (Satako-Ishikawa et al., Cell Struct. Funct., 17(3) :157-60, 1992). Det postuleres at den kjemiske tilkobling av PEG-molekyler til polypeptidryggraden i GCSF-mutein innfører en slags konformasjonsendring som på uheldig måte påvirker reseptor-/ligandinteraksjonene og således reduserer bindings-affiniteten. I tillegg er den relativt korte inkubasjonstid i in vitro-analysen trolig ikke tilstrekkelig til å nå toppakti-vitet. In vivo-analysen i mus varer derimot mye lenger (dager) og avsluttes flere dager etter injeksjon av medikamentet. Denne lengre inkuberingstid kombinert med forhøyet halveringstid i sirkulasjonen for PEG-GCSF-mutein kompenserer for eventuelt tap av bindingsaffinitet grunnet pegylering. Sluttresultatet er at man oppnår maksimal in vivo-bioaktivitet. En annen hypotese er at PEG-GCSF-mutein fungerer som et promedikament ved injeksjon i mus. I denne situasjonen avkløyves på et eller annet vis PEG-gruppen i PEG-GCSF-mutein kontinuerlig, noe som fører til ved varende frigivelse av små mengder fritt GCSF-mutein, som sørger for opprettholdelse og styrking av in vivo-aktiviteten. Pro-medikamenthypotesen forklarer imidlertid ikke den observerte basale in vivo-aktivitet 7 dager etter innledende dosering. Promedikamentmekanismen er usannsynlig, siden amidbindingen mellom proteinet og PEG er stabil og ikke lett vil kløyves.
Blant de undersøkte 15 GCSF-mutein-PEG-konjugater var in vivo-aktiviteten til P-12GA-1, 20 kDa SPA, 20 kDa uretan og 36 kDa uretan signifikant høyere enn for resten av preparatene (se figur 4 og tabell 2).
Totalt sett observeres et direkte forhold mellom molekylvekten av PEG-molekylet og økt in vivo-aktivitet. Dette illu-streres i figur 5, hvor økningen i PMN-tall uttrykkes som en funksjon av den totale PEG-masse i amid(SPA)- og ureakoblede PEG-konjugater.
Seleksjon av og egenskaper ved GCSF- mutein- PEG- konjugater
Etter nøye evaluering av konjugasjonskjemien, de biologiske egenskaper og medikamentutviklingsspørsmål blant de 15 PEG-konjugatene er de tre som ble utvalgt for videre evaluering: 1) P-12GA-1, 2) 20 kDa SPA og 3) 20 kDa uretan. 20 kDa SPA-avledede mono-, di- og tri-PEG-konjugatene som foreligger i den SP-rensede reaksjonsblanding ble evaluert i en "Head-to-head"-sammenligning som viste at alle tre ga høy granulopoietisk aktivitet i C57BL/6J-hunnmus i 5 dager med en enkelt dose på 25,2^g (tabell 3 og figur 4). I motsetning til dette var det nødvendig med daglige doser av det umodifiserte GCSF-mutein for å oppnå tilsvarende aktivitet (resultater ikke vist). Bortsett fra for to tilfeller (20 kDa SPA og P-12GA-1) vendte in vivo-aktiviteten tilbake til et normalt nivå på dag 7 etter innledende dosering av musene (figur 6). Både 20 kDa SPA-og P-12GA-l-konjugatet viste forhøyet aktivitet i en lavere dose på 8,4^g og returnerte til normalt nivå på dag 7 (se tabell 3). Resultatene for den prosentvise sammensetning (tabell 3) viser at både 20 kDa SPA- og P-12GA-l-preparatet inneholder ca. 50 % dimer, og de gjenværende 50 % er fordelt mellom monomer og tri-mer. Uretanreagenset på 20 kDa gir hovedsakelig mono-PEG under de anvendte eksperimentelle betingelser (se tabell 3). In vitro-aktiviteten til alle de analyserte PEG-konjugatene, innbefattet det hovedsakelig monomere uretanderivat, følger det generelle mønster med et inverst forhold mellom aktivitet og substitusjonsgrad, så vel som molekylvekten til PEG. Den biologiske aktivitet in vivo av de analyserte PEG-konjugater viste et direkte forhold mellom aktivitet og molekylvekt av PEG over det undersøkte molekylvektområdet (figur 5).
Konklusjon
Blant de 15 GCSF-mutein-PEG-konjugatene som ble under-søkt, viste P-12GA-1-, 20 kDa SPA- og 20 kDa uretanlinkerprepa-ratene gode aktivitetsprofiler in vivo. PEG-GCSF-mutein på
20 kDa viste de beste totalegenskaper, innbefattet økonomisk fremstilling. Den prosentvis sammensetning og innførte PEG-masse er beregnet basert på densitometriske målinger av Coomassie blue-farget SDS-PAGE (*) , eller ved MALDI-TOF-masseanalyse (<**>)
(a), (b), (c): hver bokstav representerer en separat bioanalyse, PMN-verdier på dag 5 er angitt
C57BL/6J-hunnmus ble tilført 8,4 eller 25,2 av enten ND-28 daglig eller en enkelt dose med PEG-konjugat.
På dagene 5 og 7 etter innledende dosering ble veneblodprøver uttatt, og differensiell leukocyttanalyse ble utført.<*>Basert på densitometrisk måling av Coomassie-farget SDS-PAGE.
<**>Bestemt ved MALDI-TOF-MS.
Eksempel 2
Fremstilling av PEG på 20 kDa konjugert til rhG- CSF- mutein
Modifisering av G-CSF-mutein med metoksy-PEG-suksin-imidylpropionsyre (SPA) på 20 kDa ble utført som følger: PEG-reagens ble løst i destillert vann ved en konsentrasjon på ca. 200 mg/ml og tilsatt til G-CSF-muteinløsningen (ca. 5 mg/ml) i et molart forhold på fra 4:1 til 6:1 (overskudd av reagens). Reaksjonen fikk forløpe ved 4 °C til 8 °C i 20 timer ved pH ca. 7,5. Ved avsluttet reaksjon ble iseddik tilsatt for å stoppe reaksjonen. Pegylert GCSF-mutein (også betegnet PEGG) ble så renset fra gjenværende umodifisert mutein, overskudd av PEG-reagens og andre urenheter og bufferbestanddeler som foreligger under modifikasjonen. Sammen med pegylert protein dannes N-hydroksysuksinimid og polyetylenglykolkarboksylsyre som side-produkter i reaksjonen.
PEGG ble renset ved anvendelse av kationbytterkromatografi fulgt av ultrafiltrering. Kationbytterkolonnen ble påsatt prøve og vasket med 20 rtiM natriumacetat, pH 4,0. Eluering med en lineær natriumkloridgradient skilte PEGG fra alle andre bestand-deler i reaksjonsblandingen. Deretter ble ultrafiltrering/dia-filtrering anvendt for oppkonsentrering av PEGG til ca.
4,0 mg/ml og for å skifte bufferen til 20 mM natriumacetat,
50 mM natriumklorid, pH 6,0.
Fem pegyleringsreaksjoner og rensinger utført under betingelsene angitt ovenfor ble analysert ved anvendelse av kationbytterkromatografi, og dette har vist reproduserbarheten av G-CSF-muteinpegyleringsreaksjonen. Pegyleringsreaksjonen ble vist å være reproduserbar i reaksjoner opp til 2,5 g (endelig PEGG-utbytte) under følgende optimale betingelser: 20 kDa SPA-PEG:mutein-forhold på 4 til 6:1, pH ca. 7,5, 4 °C, 20 timer. Den gjennomsnittlige prosentvise sammensetning av blandingen av forskjellige PEG-typer ble bestemt å være 21,7 % mono-PEGG (% RSD = 16,6), 60,3 % di-PEGG (% RSD = 6,6), 15,1 % tri-PEGG (% RSD = 4,0) og 2,9 % tetra-PEG (% RSD = 26,1), som vist i tabell 4.
Eksempel 3
Mobilisering av stamceller fra perifert blod
Teknikker er blitt utviklet for å mobilisere både primitive stamceller og forpliktede forløperceller fra benmarg og for ekspansjon av sirkulerende forløperceller i perifert blod. Disse stimulerte cellene kan ha evnen til å formidle tidlig og vedvarende innpoding etter dødelig bestråling og transplantasjon av benmarg eller stamceller. Neben, S., Marcus, K. og Mauch, P., Mobilization of hematopoietic stem and progenitor cell subpopulations from the marrow to the blood of mice following cyclophosphamide and/or granulocyte colony-stimulating factor, Blood, 81:1960 (1993). Rekruttering av stamceller fra perifert blod (PBSC) kan bidra til å forkorte hematopoietisk gjenvinning hos pasienter med benmargshypoplasi indusert ved kjemoterapi eller pasienter som gjennomgår andre myeloablative behandlinger. Roberts, A.W. og Metcalf, D., Granulocyte colony-stimulating factor induces selective elevations of progenitor cells in the peripheral blood of mice, Experimental Hematology, 22:1156 (1994). Både vekstfaktorer og kjemoterapeutiske medika-menter er blitt anvendt for å stimulere mobiliseringen. Bodine, D., Mobilization of peripheral blood "stem" cells: where there is smoke, is there fire? Experimental Hematology, 23:293 (1995). Etter stimulering med PBSC høstes de mobiliserte celler ved leukaferese og oppbevares nedfrosset inntil de skal anvendes. Dagens kliniske fremgangsmåter krever gjentatt oppsamling av PBSC-konsentrater ved leukaferese etter standard kjemoterapi med høye doser (CHT) og gjentatt daglig dosering eller kontinuerlig infusjon av vekstfaktorer, noen ganger over et tidsrom på 2 uker eller mer. Brugger, W., Bross, K., Frisch, J., Dern, P., Weber, B., Mertelsmann, R. og Kanz, L., Mobilization of peripheral blood progenitor cells by sequential administration of Interleukin-3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor following polychemotherapy with etoposide, ifosfamid, and cis-platin, Blood, 79:1193 (1992). Undersøkelsene beskrevet nedenfor ble utført med to musemodeller for PBSC-mobilisering, den første i normale mus og den andre i en kjemoterapimodell. Eksperimen-tene viste økt aktivitet av pegylert G-CSF-mutein ifølge foreliggende oppfinnelse (PEGG) sammenlignet med Neupogen (G-CSF) for å oppnå mobilisering av stamceller. Det pegylerte muteins overlegenhet i et signifikant redusert og mer effektivt doseringsskjema er også tydelig etablert.
Disse undersøkelsene evaluerte ekspansjonsevnen til mobiliserte, umodne PBSC fra mus stimulert in vitro med flere vekstfaktorer i en 7 dagers agarkolonianalyse. I tillegg til kolonidannende evne ble en fullstendig hematologisk profil og en evaluering av det absolutte nøytrofiltall (ANC) utført på blod fra alle mus. G-CSF-nivået i serum ble også bestemt. Etter opti-malisering av analysen ble flere tidsforløpseksperimenter ut-ført, og høye og lave doser av G-CSF ble undersøkt. De eksperimentelle modellene omfattet G-CSF- og syklofosfamid(Cytoxan)-indusert mobilisering, så vel som en kombinasjonsbehandling som benyttet både CHT og cytokinet.
Materialer og fremgangsmåter: 6-10 uker gamle C57BL/6J-hunnmus erholdt fra The Jackson Laboratory ble anvendt i alle eksperimenter. Musene ble injisert intraperitonealt på dag -1 med enten 200 mg/kg Cytoxan eller fosfatbufret saltvann (PBS) som det anvendte løsningsmiddel. På dag 0 ble musene injisert subkutant med 0,1 ml av enten Neupogen (G-CSF), PEGG (20 kD SPA-koblet, pegylert mutein, porsjon nr. P20W3) eller løsningsmidlet PBS tilsatt 1 % normalt museserum. Musene som ble gitt Neupogen, ble gitt daglige injeksjoner med den samme dose, mens alle andre mus ble gitt løsningsmiddel. På avlivningsdagen ble perifert blod oppsamlet fra den retroorbitale vene hos bedøvde mus i EDTA-holdige rør. For hver gruppe ble et lite volum sammenslått helblod tilsatt til 35 mm<2>vevsdyrkningsskåler i triplikat, tilsatt 1000 U/ml rekombinant muse(rm)interleukin-3, 100 ng/ml rm-stamcellefaktor og 1000 U/ml rm-interleukin-6, i totalt 1 ml RPMI 1640-medium tilsatt 15 % føtalt, bovint serum og 0,35 % og 0,35 % Difco-agar. De stivnede agarkulturene ble inkubert i 1 uke ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 5 % CO2i luft. Kolo-niene ble talt ved anvendelse av et stereodisseksjonsmikroskop under mørkefeltbelysning.
Resultater: I den første viste undersøkelse ble normale mus gitt daglige injeksjoner med 25^g/mus Neupogen på dagene 0-5 eller en enkelt injeksjon med 25 fKj/mus PEGG på dag 0. Musene ble avlivet på dagene 3-7. Som vist i figur 7, var mobiliseringen, vist ved kolonidannelse, signifikant forhøyet i Neupogen-injiserte mus på dagene 3 og 4, men vendte gradvis tilbake til basalnivået på dag 5 (trass i Neupogen-injeksjoner frem til dag 5). Musene injisert med PEGG viste derimot et høyere målt antall kolonier som forble på høyt nivå til og med dag 7.
Paradigmet for kjemoterapimodellen lignet dette. Musene i CHT-gruppene ble gitt én injeksjon med Cytoxan på dag -1. Noen mus ble så kun gitt løsningsmiddel de påfølgende dager, mens andre ble gitt en kombinasjonsbehandling med enten daglige injeksjoner av Neupogen på dagene 0-5 eller en enkelt injeksjon av PEGG på dag 0. Figur 8 viser en topp for de Cytoxan-behand-lede mus på dag 4, med en gradvis tilbakevending til basalnivået de påfølgende dager. Både Neupogen-gruppen og PEGG-gruppen nådde en topp på dag 5 og viste et svært forhøyet kolonitall. Cytoxan + PEGG-verdiene forble imidlertid svært signifikant forhøyet over verdiene for Cytoxan + Neupogen-gruppen på dagene 6 og 7. Figur 9 viser den synergistiske virkning av kombinasjonsbehandling fremfor Cytoxan eller G-CSF alene.
En annen undersøkelse er vist i figurene 10 og 11. Normale mus som ble gitt daglige injeksjoner av en lavere dose på 3^g/mus av Neupogen i 10 på hverandre følgende dager viste et relativt lavt nivå av "multifase"-mobilisering gjennom hele det undersøkte tidsrom. Dyr injisert med en enkelt dose på 3^g/mus av PEGG viste ca. fem ganger høyere antall mobiliserte forløperceller i den perifere sirkulasjon på dag 4, selv om virkningen var kortvarig og i det vesentlige var over i løpet av 6 dager.
I Cytoxan-injiserte mus induserte en enkelt dose på
3^g/mus av PEGG grovt sett en ekvivalent mengde PBSC-mobilisering som 30^g/mus av Neupogen injisert i 10 daglige doser på 3^g/dag (figur 11). Begge grupper viste en mobiliseringstopp for forløperceller på dag 5, og størrelsen av toppene var like. Den eneste forskjell så ut til å være en noe lengre vedvarende virkning av Neupogen. Antall kolonier i CHT-modellen var 4-10 ganger høyere enn resultatene for den normale musemodell.
Disse eksperimenter viser to tydelige mulige fordeler ved pegylert mutein fremfor Neupogen. For det første er den høyere virkning av PEG sammenlignet med Neupogen når det gjelder evne til å indusere mobilisering av PBSC åpenbar, både for normale mus og kjemoterapibehandlede mus. For det andre er det pegylerte mutein blitt vist å være mer effektivt enn Neupogen i mus ved anvendelse av et redusert og mer effektivt doseringsskjema enn det som i dag anvendes med det kliniske produkt.
Claims (19)
1. Fysiologisk aktivt konjugat,karakterisert vedat det har formelen
hvor G er en granulocyttkolonistimulerende faktor minus aminogruppen eller -gruppene som danner en amidbinding med en polyetylenglykolgruppe i konjugatet; R er Ci-C6-alkyl; n er et heltall fra 420 til 550; og m er et heltall fra 1 til 5.
2. Konjugat ifølge krav 1,
karakterisert vedat R er metyl.
3. Konjugat ifølge krav 2,
karakterisert vedatner fra 450 til 490.
4. Konjugat ifølge krav 2,
karakterisert vedat m er et heltall fra 1 til 4 .
5. Konjugat ifølge krav 4,
karakterisert vedat m er 2.
6. Konjugat ifølge krav 1,
karakterisert vedat den granulocyttkolonistimulerende faktor er GCSF-mutein med sekvensen vist i figur 1.
7. Konjugat ifølge krav 1,
karakterisert vedatner fra 450 til 490.
8. Konjugat ifølge krav 1,
karakterisert vedat m er et heltall fra 1 til 4 .
9. Konjugat ifølge krav 8,
karakterisert vedat m er 2.
10. Konjugat ifølge krav 1,
karakterisert vedat den granulocyttkolonistimulerende faktor er GCSF-mutein med sekvensen vist i figur 1.
11. Fysiologisk aktivt konjugat ifølge krav 6,karakterisert vedat R er metyl, n er et heltall fra 450 til 490 og m er 2.
12. Sammensetning,
karakterisert vedat den omfatter fysiologisk aktive konjugater med formelen
hvor G i hvert konjugat er en granulocyttkolonistimulerende faktor minus aminogruppen eller -gruppene som danner en amidbinding med en polyetylenglykolgruppe i konjugatene; R i hvert konjugat er uavhengig av hverandre Ci-C6-alkyl; n i hvert konjugat er uavhengig av de andre et heltall fra 420 til 550; m i hvert konjugat er uavhengig av de andre et heltall fra 1 til 4; prosentandelen av konjugater hvor m er 1, er 18-25 %; prosentandelen av konjugater hvor m = 2, er 50-66 %; prosentandelen av konjugater hvor m = 3, er 12-16 %; og prosentandelen av konjugater hvor m = 4, er opptil 5 %.
13. Sammensetning ifølge krav 12,karakterisert vedat R er metyl i alle konjugater .
14. Sammensetning ifølge krav 12,karakterisert vedat n og R er de samme i alle konjugater.
15. Sammensetning ifølge krav 12,karakterisert vedatner fra 450 til 490.
16. Sammensetning ifølge krav 12,karakterisert vedat den granulocyttkolonistimulerende faktor i alle konjugater er GCSF-mutein med sekvensen vist i figur 1.
17. Sammensetning ifølge krav 12,karakterisert vedat n er et heltall fra 450 til 490 og G er GCSF-mutein med sekvensen vist i figur 1.
18. Fremgangsmåte for fremstilling av et PEG-GCSF-konjugat ifølge krav 1, med lengre halveringstid i sirkulasjonen og høyere granulopoietisk aktivitet in vivo enn den tilsvarende ukonjugerte GCSF,
karakterisert vedat den består av å omdanne et reagens med formelen
med GCSF for fremstilling av konjugatet.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat GCSF er GCSF-mutein med sekvensen vist i figur 1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11791799P | 1999-01-29 | 1999-01-29 | |
| PCT/US2000/001264 WO2000044785A1 (en) | 1999-01-29 | 2000-01-19 | Gcsf conjugates |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20013700D0 NO20013700D0 (no) | 2001-07-27 |
| NO20013700L NO20013700L (no) | 2001-09-25 |
| NO331787B1 true NO331787B1 (no) | 2012-04-02 |
Family
ID=22375505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20013700A NO331787B1 (no) | 1999-01-29 | 2001-07-27 | Fysiologisk aktive PEG-GCSF-konjugater, sammensetning omfattende konjugatene og fremgangsmate for fremstilling av konjugatene |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US20030130193A1 (no) |
| EP (1) | EP1157037B1 (no) |
| JP (1) | JP2002540065A (no) |
| KR (1) | KR100689212B1 (no) |
| CN (1) | CN1376164A (no) |
| AT (1) | ATE246202T1 (no) |
| AU (1) | AU2618500A (no) |
| BG (1) | BG65213B1 (no) |
| BR (1) | BR0007781A (no) |
| CA (1) | CA2361766C (no) |
| CZ (1) | CZ300546B6 (no) |
| DE (1) | DE60004172T2 (no) |
| DK (1) | DK1157037T3 (no) |
| EA (2) | EA004685B1 (no) |
| ES (1) | ES2204509T3 (no) |
| HK (1) | HK1049673A1 (no) |
| HU (1) | HU228488B1 (no) |
| IL (1) | IL144361A0 (no) |
| MX (1) | MXPA01007609A (no) |
| NO (1) | NO331787B1 (no) |
| NZ (1) | NZ513113A (no) |
| PT (1) | PT1157037E (no) |
| RS (1) | RS50928B (no) |
| SK (1) | SK286898B6 (no) |
| WO (1) | WO2000044785A1 (no) |
| ZA (1) | ZA200105932B (no) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE246202T1 (de) * | 1999-01-29 | 2003-08-15 | Hoffmann La Roche | Gcsf konjugate |
| US6646110B2 (en) | 2000-01-10 | 2003-11-11 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF polypeptides and conjugates |
| US6831158B2 (en) | 2000-01-10 | 2004-12-14 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
| US6555660B2 (en) | 2000-01-10 | 2003-04-29 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
| ATE421535T1 (de) | 2000-10-16 | 2009-02-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Peg-modifiziertes erythropoietin |
| MXPA04000231A (es) | 2001-07-11 | 2004-05-04 | Maxygen Holdings Ltd | Conjugados del factor de estimulacion de colonias de granulocitos. |
| US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
| CA2462930C (en) * | 2001-10-10 | 2012-07-10 | Shawn De Frees | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
| WO2004099231A2 (en) | 2003-04-09 | 2004-11-18 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| MXPA04004809A (es) * | 2001-11-20 | 2004-08-11 | Pharmacia Corp | Conjugados de hormona de crecimiento humana modificada quimicamente. |
| CN100337689C (zh) | 2002-07-24 | 2007-09-19 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 聚亚烷基二醇酸加合物 |
| US7695723B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-04-13 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
| US7785601B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-08-31 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
| WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
| EP1667706A4 (en) * | 2003-08-22 | 2009-06-24 | Queensland Inst Med Res | G-CSF DERIVATIVE FOR INDUCING IMMUNOLOGICAL TOLERANCE |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| CA2585758C (en) | 2004-10-29 | 2017-08-01 | Neose Technologies, Inc. | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
| NZ556436A (en) | 2005-01-10 | 2010-11-26 | Biogenerix Ag | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| US20060174362A1 (en) * | 2005-02-01 | 2006-08-03 | Origen Therapeutics, Inc. | Long-term culture of avian primordial germ cells (PGCs) |
| WO2006121569A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-16 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| US7381805B2 (en) | 2005-06-01 | 2008-06-03 | Maxygen Holdings, Ltd. | Compositions comprising mixtures of positional PEG isomers of PEGylated G-CSF |
| WO2006138572A2 (en) | 2005-06-16 | 2006-12-28 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates having a degradable linkage and polymeric reagents useful in preparing such conjugates |
| CA2617064A1 (en) * | 2005-08-04 | 2007-02-15 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of a g-csf moiety and a polymer |
| US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| JP2007112924A (ja) * | 2005-10-21 | 2007-05-10 | National Institute For Materials Science | 高分子架橋剤及びこの架橋剤を用いたリポソーム又は細胞の架橋体 |
| WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
| CN101002943B (zh) * | 2006-01-17 | 2012-02-01 | 中国科学院过程工程研究所 | 支链peg-gcsf和peg-gmcsf结合物及其制备方法 |
| CN101516388B (zh) | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
| ITMI20061624A1 (it) | 2006-08-11 | 2008-02-12 | Bioker Srl | Mono-coniugati sito-specifici di g-csf |
| US8969532B2 (en) | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
| US20100316631A1 (en) * | 2006-10-19 | 2010-12-16 | The Uab Research Foundation | Water Soluble Curcumin-Based Compounds |
| KR101079993B1 (ko) * | 2006-11-17 | 2011-11-04 | 동아제약주식회사 | 폴리에틸렌글리콜 과립구 콜로니 자극인자 접합체 |
| JP2008125952A (ja) * | 2006-11-24 | 2008-06-05 | National Institute For Materials Science | 複合架橋体 |
| CN101245109B (zh) * | 2007-02-12 | 2011-12-14 | 杭州九源基因工程有限公司 | 一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体及其制备方法 |
| NZ580030A (en) | 2007-04-03 | 2012-06-29 | Biogenerix Ag | Methods of treatment using glycopegylated g-csf |
| WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
| AR067537A1 (es) | 2007-07-17 | 2009-10-14 | Hoffmann La Roche | Purificacion de polipeptidos pegilados |
| AR067536A1 (es) | 2007-07-17 | 2009-10-14 | Hoffmann La Roche | Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea |
| CN101352573B (zh) * | 2007-07-27 | 2011-02-09 | 杭州九源基因工程有限公司 | 聚乙二醇单修饰的重组人集落细胞刺激因子赖氨酸缺陷体 |
| WO2009103199A1 (zh) | 2008-02-18 | 2009-08-27 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 水溶性聚合物修饰的g-csf偶联物 |
| EP2626079A3 (en) | 2008-02-27 | 2014-03-05 | Novo Nordisk A/S | Conjungated factor VIII molecules |
| RU2409669C9 (ru) | 2008-08-18 | 2012-05-27 | ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management", "SFM") | Способ иммобилизации биологически активного вещества (бав) на носитель (варианты) и конъюгат бав-носитель, полученный данными способами |
| JP5632376B2 (ja) | 2008-09-23 | 2014-11-26 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | エリスロポエチンの精製 |
| KR101485646B1 (ko) | 2010-02-11 | 2015-01-22 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | Ｉｇｆ―ⅰ 폴리(에틸렌 글리콜) 컨쥬게이트 |
| WO2012035037A1 (en) | 2010-09-14 | 2012-03-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for purifying pegylated erythropoietin |
| US8889630B2 (en) | 2011-12-23 | 2014-11-18 | Carlos Lopez | Method for hair regrowth using Granulocyte-Colony Stimulating Factor |
| EP3484911B1 (en) | 2016-07-15 | 2020-11-04 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Method for purifying pegylated erythropoietin |
| BR112020007037A2 (pt) | 2017-10-11 | 2020-11-17 | Elanco Us Inc. | variantes de g-csf porcino e seus usos |
| SI3731872T1 (sl) | 2017-12-29 | 2022-04-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Postopek za zagotavljanje sestavka PEGiliranih beljakovin |
| US20200362002A1 (en) | 2017-12-29 | 2020-11-19 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for providing pegylated protein composition |
| US12208142B2 (en) | 2017-12-29 | 2025-01-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for providing PEGylated protein composition |
| JP2024500974A (ja) * | 2020-12-23 | 2024-01-10 | ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド | 電荷遮蔽された融合タンパク質を精製する方法 |
Family Cites Families (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1609546A (en) * | 1925-11-19 | 1926-12-07 | Petroleum Rectifying Co | Process of separating water from emulsions |
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4002531A (en) * | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| DE3380726D1 (en) * | 1982-06-24 | 1989-11-23 | Japan Chem Res | Long-acting composition |
| US4514497B1 (en) * | 1983-12-30 | 1998-02-24 | Novagene Inc | Modified live pseudorabies viruses |
| JPS61227526A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-10-09 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規なコロニー刺激因子 |
| US5532341A (en) * | 1985-03-28 | 1996-07-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor |
| US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| US4791192A (en) * | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
| US4894226A (en) * | 1986-11-14 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation |
| US5362853A (en) * | 1986-12-23 | 1994-11-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US5214132A (en) * | 1986-12-23 | 1993-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US5194592A (en) * | 1986-12-23 | 1993-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. | Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
| US4847325A (en) * | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| CA1340810C (en) * | 1988-03-31 | 1999-11-02 | Motoo Yamasaki | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US5218092A (en) * | 1988-09-29 | 1993-06-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains |
| US5349052A (en) * | 1988-10-20 | 1994-09-20 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| JP2989002B2 (ja) * | 1988-12-22 | 1999-12-13 | キリン―アムジエン・インコーポレーテツド | 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子 |
| US6166183A (en) * | 1992-11-30 | 2000-12-26 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically-modified G-CSF |
| US5166322A (en) * | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
| US5372808A (en) * | 1990-10-17 | 1994-12-13 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the treatment of diseases with consensus interferon while reducing side effect |
| US5252714A (en) * | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
| US5281698A (en) * | 1991-07-23 | 1994-01-25 | Cetus Oncology Corporation | Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation |
| US5382657A (en) * | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
| US5581476A (en) * | 1993-01-28 | 1996-12-03 | Amgen Inc. | Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| JP3708151B2 (ja) * | 1994-12-15 | 2005-10-19 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｐｅｇ化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法 |
| US5672662A (en) * | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
| KR0176625B1 (ko) * | 1996-11-05 | 1999-04-01 | 삼성전자주식회사 | 적외선 물체검출장치 |
| ATE246202T1 (de) * | 1999-01-29 | 2003-08-15 | Hoffmann La Roche | Gcsf konjugate |
-
2000
- 2000-01-19 AT AT00904422T patent/ATE246202T1/de active
- 2000-01-19 JP JP2000596041A patent/JP2002540065A/ja active Pending
- 2000-01-19 DK DK00904422T patent/DK1157037T3/da active
- 2000-01-19 EP EP00904422A patent/EP1157037B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-19 CN CN00809241A patent/CN1376164A/zh active Pending
- 2000-01-19 HU HU0203652A patent/HU228488B1/hu unknown
- 2000-01-19 KR KR1020017009533A patent/KR100689212B1/ko active IP Right Grant
- 2000-01-19 AU AU26185/00A patent/AU2618500A/en not_active Abandoned
- 2000-01-19 NZ NZ513113A patent/NZ513113A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 SK SK1035-2001A patent/SK286898B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 MX MXPA01007609A patent/MXPA01007609A/es active IP Right Grant
- 2000-01-19 ES ES00904422T patent/ES2204509T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-19 EA EA200100838A patent/EA004685B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 WO PCT/US2000/001264 patent/WO2000044785A1/en active IP Right Grant
- 2000-01-19 CA CA2361766A patent/CA2361766C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-19 DE DE60004172T patent/DE60004172T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-19 BR BR0007781-0A patent/BR0007781A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-01-19 PT PT00904422T patent/PT1157037E/pt unknown
- 2000-01-19 EA EA200400067A patent/EA200400067A1/ru unknown
- 2000-01-19 IL IL14436100A patent/IL144361A0/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 RS YUP-543/01A patent/RS50928B/sr unknown
- 2000-01-19 CZ CZ20012654A patent/CZ300546B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-07-18 ZA ZA200105932A patent/ZA200105932B/en unknown
- 2001-07-27 NO NO20013700A patent/NO331787B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-08-29 BG BG105851A patent/BG65213B1/bg unknown
-
2002
- 2002-12-30 US US10/331,434 patent/US20030130193A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-03-13 HK HK03101820.1A patent/HK1049673A1/zh unknown
-
2005
- 2005-04-26 US US11/114,576 patent/US20050196378A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-03-12 US US11/717,536 patent/US20070219356A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-06-27 US US12/163,283 patent/US20080287659A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1157037B1 (en) | Gcsf conjugates | |
| US6166183A (en) | Chemically-modified G-CSF | |
| JP2989002B2 (ja) | 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子 | |
| US6586398B1 (en) | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods | |
| JP5336372B2 (ja) | Ｇ−ｃｓｆ部位特異的モノコンジュゲート | |
| EP2233504B1 (en) | An erythropoietin mimetic peptide derivatives and its pharmaceutical salt, the preparation and uses thereof | |
| PL202758B1 (pl) | Koniugat zawierający glikoproteinę erytropoetynę, kompozycja zawierająca te koniugaty, środek farmaceutyczny, zastosowanie tych koniugatów i tych kompozycji oraz sposób wytwarzania koniugatów erytropoetyny | |
| US8088899B2 (en) | Human granulocyte-colony stimulating factor isoforms | |
| WO2006094530A1 (en) | Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation | |
| US20060247422A1 (en) | Chemically modified G-CSF | |
| AU2004233543B2 (en) | GCSF Conjugates | |
| EP1369429A1 (en) | GCSF conjugates | |
| PL203462B1 (pl) | Fizjologicznie aktywne koniugaty czynnika stymuluj acego tworzenie kolonii granulocytów (GCSF), zawieraj ace je kompozycje i sposób wytwarzania koniugatu PEG-GCSF | |
| MX2007015893A (en) | Human granulocyte-colony stimulating factor isoforms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |