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KR101485646B1 - Ｉｇｆ―ⅰ 폴리(에틸렌 글리콜) 컨쥬게이트 - Google Patents

Ｉｇｆ―ⅰ 폴리(에틸렌 글리콜) 컨쥬게이트 Download PDF

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KR101485646B1
KR101485646B1 KR1020127023645A KR20127023645A KR101485646B1 KR 101485646 B1 KR101485646 B1 KR 101485646B1 KR 1020127023645 A KR1020127023645 A KR 1020127023645A KR 20127023645 A KR20127023645 A KR 20127023645A KR 101485646 B1 KR101485646 B1 KR 101485646B1
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Abstract

본 명세서에서는, a) 5'에서 3' 방향으로 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 및 서열번호 01의 트립신 부위를 코드화하는 핵산을 포함하는, 발현 구조체를 코드화하는 핵산을 제공하는 단계; b) 상기 a) 단계의 핵산을 세포 내에서 발현시키고, 세포 및/또는 배양 배지로부터 발현 구조체를 회수하는 단계; c) C-말단 라이신 잔기에서 폴리(에틸렌 글리콜)과 공유결합에 의해 컨쥬게이트된 서열번호 02의 아미노산 서열을 갖는 표적 펩티드를 제공하는 단계; d) 상기 발현 구조체 및 표적 펩티드를 트립신 변이체 D189K, K60E, N143H, E151H와 인큐베이션시키는 단계; 및 e) 하나의 폴리(에틸렌 글리콜)과 컨쥬게이트된 폴리펩티드를 인큐베이션 혼합물로부터 회수하여 제조하는 단계를 포함하는, 하나의 폴리(에틸렌 글리콜)과 컨쥬게이트된 폴리펩티드의 제조 방법이 개시된다.

Description

ＩＧＦ―Ⅰ 폴리(에틸렌 글리콜) 컨쥬게이트{IGF-Ⅰ poly (ethylene glycol) conjugates}
본 명세서에서는 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 효소에 의한 선택적 C-말단 컨쥬게이션 방법, 즉 효소적 페길화 (PEGylation) 방법이 개시된다.
지난 수십년에 걸쳐 단백질 치료제의 중요성은 이러한 부류의 약물이 이전에 치료불가능했던 질환을 표적화함에 따라 크게 증가하였다. 단백질 약물의 제제화는, 종래의 저분자량 물질과는 분자 크기가 매우 다르기 때문에 까다롭다. 또한, 단백질들은 적절한 기능성을 위해 필수적인 2차 및 3차 구조와 같은 여러 다른 특성들을 갖는다. 이들은 다양한 종류의 분해 또는 변형에 민감하며, 그의 제제화는 안정성을 보장해야 하고, 유효하고 안전한 목적 투여량 범위 내에서 유지되어야 한다.
약제학적 화합물로서 단백질과 관련된 다른 문제점들은 환자 내에서 야기되는 것들로서, 예를 들면, 면역생성 반응, 감소된 반감기를 초래하는 신체로부터의 신속한 제거 및 약물이 작용을 수행하기 전에 파괴시키는 단백질 분해성 절단 등이다(문헌[Brown, L.R., Expert Opinion Drug Deliv. 2 (2005) 29-42] 참조).
이 문제점들을 해결하기 위한 하나의 접근 방법은, 단백질 분자 내에 화학적 변화를 포함시키는 것, 예를 들면, 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 단백질 약물에 공유 결합시키는 것이다. 이 방법을 페길화라고 부른다. 페길화의 이점은 얻어지는 컨쥬게이트의 분자량 및 수력학적 크기(hydrodynamic size)의 증가이다. 상기 신규한 컨쥬게이트는, 단백질 분해성 효소 및 중화 항체 또는 면역 세포들에 의한 접근이 보다 덜 용이하다. 그 결과로서, 페길화는 약물을 원치 않은 절단으로부터 방지할 수 있으며, 알러지성 부작용의 가능성을 감소시킨다. 증가된 크기는 또한, 단백질-PEG 컨쥬게이트가 신장 한외여과에 의해 제거되기에는 지나치게 크기 때문에, 신체로부터의 제거에도 영향을 미친다(문헌[Veronese, F.M. and Pasut, G., Drug Discovery Today 10 (2005) 1451-1458; Brown, L.R., Expert Opinion Drug Deliv. 2 (2005) 29-42] 참조). 폴리(에틸렌 글리콜) 자체는 신규한 약물의 성질을 크게 개선시킨다. 또한, PEG의 무독성은 주요 이점이다. 또한, 페길화는 단백질 약제의 혈액 순환 수명을 증가시키는 잘 알려진 방법이다(문헌[Kozlowski, A. and Harris, M.J., Journal of Controlled Release 72 (2001) 217-224] 참조). 다양한 페길화된 단백질 약물들이 상업적으로 이용가능하며, 예를 들면, 쉐링 푸라우(Schering Plough)에서 시판하는 PEG-Intron®, 화이자(Pfizer)에서 시판하는 Somavert® 및 로슈 파마슈티칼즈(Roche Pharmaceuticals)에서 시판하는 Pegasys®가 있다(문헌[Pasut, G., et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents 14 (2004) 859-894] 참조).
온화한 조건, 높은 화학적- 및 부위-특이성 및 적절한 제품 수율을 갖는, 효소적 부위-특이적 변형에 대해 큰 관심이 존재한다. 이 분야에서 여러 시도들이 있었다. 마오(Mao) 등(문헌[Mao, H., et al., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2670-2671])은 C-말단 변형을 위한, 소르타제(sortase) 매개 단백질 라이게이션(ligation) 방법을 개발하였다. 사토(Sato)(문헌[Sato, H., Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 487-504] 참조)는 트랜스글루타미나제에 대한 특별한 기질 서열을 갖는 온전한(intact) 키메라 단백질 내에 부위 특이적으로 폴리(에틸렌 글리콜)을 도입시키기 위해, 트랜스글루타미나제를 사용하는 시스템을 정립하였다. 비변성 단백질의 N-말단을 변형시키기 위해, 면역글로불린 A 프로테아제(IgA 프로테아제)가 르윈스카(Lewinska) 등에 의해 사용되었다(문헌[Lewinska, M., et al. Bioconjugate Chemistry 15 (2004) 231-234] 참조). 돌연변이된 트립신 효소가 호에스(Hoess) 등에 의해 개발되었다(WO 2006/015879).
본 명세서에서는 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) 분자(들)와 폴리펩티드의 선택적 C-말단 공유결합 컨쥬게이트 방법이 개시된다. 상기 방법에서, 폴리(에틸렌 글리콜)과 공유결합에 의해 컨쥬게이트된 저분자 펩티드(small peptide)가 페길화될 대상 폴리펩티드로 효소적으로 전달된다. 트립신 절단 부위에서 Strep-태그 C 말단의 존재는 C-말단 부위 특이적 변형을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
본 명세서에 개시된 제1 양태는,
a) i) 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 및
ii) 서열번호 01의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산을
5'에서 3' 방향으로 포함하는, 융합 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 제공하는 단계,
b) 단계 a)의 핵산을 세포 내에서 발현시키고, 세포 및/또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
c) C-말단 라이신 잔기에서 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 공유결합에 의해 컨쥬게이트된, 서열번호 02의 아미노산 서열을 갖는 표적 펩티드를 제공하는 단계,
d) 상기 융합 폴리펩티드 및 표적 펩티드를, 트립신 변이체 D189K, K60E, N143H, E151H와 인큐베이션시키는 단계, 및
e) 인큐베이션 혼합물로부터 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드를 회수하여 제조하는 단계를 포함하는, 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드의 제조 방법이다.
일 구현예에서, 상기 인큐베이션은
i) 융합 폴리펩티드 및 표적 펩티드를, 완충 용액 중 구아니디늄 하이드로클로라이드와 인큐베이션시키는 단계,
ii) 트립신 변이체 D189K, K60E, N143H, E151H와 Zn(II) 염을 인큐베이션시키는 단계, 및
iii) 상기 단계 i) 및 ii)의 인큐베이션 혼합물을 혼합하고, 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법의 일 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 페길화될 폴리펩티드, 트립신-4x-변이체 절단 부위 및 Strep-태그를 포함한다. 또다른 구현예에서, 융합 폴리펩티드를 코드화하는 핵산은 5'에서 3' 방향으로, i) 페길화될 폴리펩티드를 코드화하는 핵산, ii) 서열번호 01의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 및 iii) 서열번호 13 또는 27의 Strep-태그를 코드화하는 핵산을 포함한다.
또다른 구현예에서, 상기 인큐베이션은 총 150분 내지 180분 동안 수행된다. 추가적인 구현예에서, 융합 폴리펩티드를 코드화하는 핵산은 추가적으로, iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 인간 IGF-I이다.
일 구현예에서, 인큐베이션은 HEPES 완충 용액 중에서 수행된다. 추가적인 구현예에서, HEPES 완충 용액에서의 인큐베이션은 20시간 이상 동안 수행된다. 또다른 구현예에서, 상기 인큐베이션은 20시간 내지 54시간 동안 수행된다. 또다른 구현예에서, 인큐베이션은 20 ℃에서 수행된다.
일 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 추가적인 구현예에서, 융합 폴리펩티드를 코드화하는 핵산은, 서열번호 10 또는 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산이다.
또한, 본 명세서에 개시된 일 양태는 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, C-말단 라이신 잔기에서 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드이다.
본 명세서에 개시된 일 양태는, 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, C-말단 라이신 잔기에서 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드, 또는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 수득된 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 명세서에 개시된 추가적인 양태는, 알츠하이머 병 치료용 의약의 제조를 위한, 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, C-말단 라이신 잔기에서 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드, 또는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 수득된 폴리펩티드의 용도이다.
본 명세서에 개시된 또다른 양태는, 의약으로서 사용하기 위한, 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, C-말단 라이신 잔기에서 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드, 또는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 수득된 폴리펩티드이다.
본 명세서에 개시된 일 양태는, 알츠하이머 병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, C-말단 라이신 잔기에서 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드, 또는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 수득된 폴리펩티드이다.
본 명세서에 개시된 또다른 양태는, 치료를 필요로 하는 개체에게 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, C-말단 라이신 잔기에서 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드, 또는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 수득된 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법이다.
본 명세서에 개시된 또다른 양태는, 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, C-말단 라이신 잔기에서 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드이다.
본 명세서에 개시된 추가적인 양태는, 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, C-말단 라이신 잔기에서 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물이다. 본 명세서에 개시된 또다른 양태는, 신경퇴행성 질환의 치료를 위한, 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, C-말단 라이신 잔기에서 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드이다. 일 구현예에서 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 병이다.
도 1 상이한 구조체들의 개략도.
도 2 RHAK-6CF 검량선(A) 및 생산 RHAK-6CF 표지화(B)
A: pH 8의 100 mM Tris, 150 mM NaCl에서 제조된, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 100 ㎍/ml의 농도를 갖는 연속 희석물을 SEC를 사용하여 분석하였다. 514 nm에서 RHAK-6CF 방출의 피크 면적을 결정하고, 농도에 대하여 플롯팅하였다. 결정 상수(R2) 및 적용된 추세선에 대한 방정식이 표시되어 있다. 각각의 데이터 지점은 3회 반복 실험의 결과이며, ±표준 오차를 표시하였다.
B: RHAK-6CF 표지화를 위한 4.3.8에 따라 표지화 반응물들을 준비하였다. 샘플들을 SEC에 의해 분석하였다. (좌측): wt-hIGF - tryp 부위 - strep 태그, (중간): wt-hIGF - tryp 부위, (우측): mut-hIGF (K27R, K65R) - tryp 부위.
도 3 RHAK-6CF 또는 RHAK-MCa-PEG20000을 사용한 부위-특이적 변형에서의 수율 비교. (좌측): RHAK-6CF, (우측): RHAK-MCa-PEG20000.
도 4 최적화된 조건 하에서 C-말단 변형된 IGF-I의 시간 의존적 증가(친핵체: RHAK-MCa-PEG20000).
본 명세서에서는 하나(또는 그 이상의) 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기(들)와, 폴리펩티드의 선택적인 C-말단 공유결합 컨쥬게이트화 방법을 개시한다. 이 방법에서는, 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 공유결합에 의해 컨쥬게이트된 저분자 펩티드가 효소에 의해, 페길화될 폴리펩티드로 전달된다.
본 명세서에 개시된 효소적 방법은 종래의, 특별한 기질을 필요로 하는 화학적 방법에 대한 대안을 제공한다. 본 방법을 적용함으로써, 단일한, 부위 특이적 변형체만이 얻어지므로 이형체(isoform)의 분리는 더이상 필요하지 않다. 또한, 온화한 반응 조건은 단백질 변성을 방지하며, 따라서, 생성물 손실을 감소시킨다. 또한, 천연 폴리펩티드를 부위 특이적으로 모노페길화할 수 있어, 조작된 변이체들을 불필요하게 만든다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산(amino acid)"은 카르복시 α-아미노산의 군을 지칭하며, 직접 또는 전구체 형태로 핵산에 의해 코드화될 수 있다. 개별적 아미노산들은, 소위 코돈 또는 염기-트리플렛(base-triplet)으로 지칭되는, 3개의 뉴클레오티드로 구성된 핵산에 의해 코드화된다. 각 아미노산은 적어도 하나의 코돈에 의해 코드화된다. 이는 "유전자 코드의 축퇴(degeneration of the genetic code)"로 알려져 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는, 천연 카르복시 α-아미노산을 지칭한다.
본 발명을 실시하는데 유용한 당업자에게 공지된 방법 및 기술이 예를 들어, 문헌[Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 개시되어 있다.
본 명세서에 사용되는 "약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 생리학적 상용성을 갖는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균 제제, 등장제 및 흡수/재흡수 지연제 등을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 담체는 주사 및 주입에 적합하다. 약제학적으로 허용가능한 담체로는 멸균 수용액 또는 분산물 및 멸균 주사용액 또는 분산물의 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약제학적 활성 물질을 위한 그와 같은 매질 및 제제들의 사용은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 물 외에, 담체는 예를 들면, 등장성 완충 염 용액일 수 있다.
용어 "폴리(에틸렌 글리콜) 잔기(poly(ethylene glycol) residue)" 또는 "PEG" 또는 "PEG 분자"는 주요 분획 또는 부분으로서 폴리(에틸렌 글리콜)을 함유하는 분자 또는 잔기를 지칭한다. 그와 같은 폴리(에틸렌 글리콜)은 분자의 화학적 합성과 관련된, 결합 반응에 필요하거나 또는 분자의 부분들 간 최적 거리를 위한 스페이서인, 하나 이상의 추가적인 화학적 기(들)를 포함할 수 있다. 이 추가적인 화학적 기들은 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량 계산에는 사용되지 않는다. 또한, 그와 같은 폴리(에틸렌 글리콜)은 함께 연결되어 있는, 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜)-사슬을 포함할 수 있다. 둘 이상의 폴리(에틸렌 글리콜)-사슬을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)은 다중팔(multiarmed) 또는 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)로 지칭된다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 예를 들면, 폴리에틸렌 옥사이드를 글리세롤, 펜타에리트리올 및 소르비톨을 포함한, 다양한 폴리올에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 예를 들면, EP　0　473　084 및 US 5,932,462에 보고되어 있다. 일 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기는 20 내지 35 kDa의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기이며, 직쇄형 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기이다. 또다른 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기는 35 kDa 초과, 특히 40 kDa의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기이고, 분지형 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기이다. 추가적인 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기는 40 kDa의 분자량을 가지며, 이중팔 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기이다.
용어 "페길화(PEGylation)"는 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 내부 라이신 잔기에서의 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 공유결합 연결을 의미한다. 폴리펩티드의 페길화는 당해 기술분야에 널리 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417]에 개시되어 있다. PEG 분자는 상이한 작용기 및 상이한 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자, 직쇄형 및 분지형 PEG 및 상이한 연결기들을 사용하여 폴리펩티드와 결합될 수 있다(문헌[Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304] 참조). 폴리펩티드의 페길화는, 예를 들어 WO　00/44785에 기재된 페길화 시약을 사용하여, 일 구현예에서는, 5 kDa 내지 40 kDa의 분자량을 갖는 NHS-활성화된 직쇄형 또는 분지형 PEG 분자를 사용하여 수용액 중에서 수행될 수 있다. 페길화는 또한, 문헌[Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229]에 따라, 고체상에서 수행될 수 있다. 무작위적이지 않게, N-말단 페길화 폴리펩티드는 WO　94/01451에 따라서도 제조될 수 있다.
"폴리펩티드(polypeptide)"는 천연적으로 또는 합성으로 생성된, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기로 이루어진 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드는 "펩티드(peptide)"로 지칭될 수 있으며, 2개 이상의 폴리펩티드로 구성되거나, 100개 초과의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 분자는 "단백질"로 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 탄수화물 기, 금속 이온 또는 카르복실산 에스테르와 같은 비-아미노산 성분을 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은, 상기 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 첨가될 수 있고, 세포 종류에 따라 다양할 수 있다. 폴리펩티드는 본 명세서에서, 그의 아미노산 골격 구조 또는 그를 코드화하는 핵산으로서 정의된다. 탄수화물 기와 같은 성분의 첨가는 일반적으로 명시되지 않으나, 그럼에도 존재할 수 있다.
호에스(Hoess) 등은, 가수분해에 대한 트립신의 우세한 친화성을 극복할 수 있는, 트립신 변이체 D189K, K60E, N143H, E151H (트립신-4x-변이체)를 제조하였다. 또한, 이 변이체는 라이신 및 아르기닌의 C-말단에서 유의한 단백질분해를 나타내지 않는다. 트립신-4x-변이체는 특이적 모티프인, 티로신-아르기닌-히스티딘(YRH) 서열을 인식한다. 트립신-4x-변이체는 히스티딘 잔기들 사이에 Zn2+ 이온을 포함하는 킬레이트 착체를 형성시킴으로써, 상기 인식 부위와 특이적으로 상호작용할 수 있다. 이 인식 서열은 인간 폴리펩티드에 나타날 가능성이 매우 적다. 따라서, 다중 부위-특이적 변형 및/또는 원치 않은 절단은 상당히 발생하기 어렵다. 트립신-4x-변이체에 의한 가장 우수한 인식을 보장하기 위한 이 서열의 추가적 변형은 특이적 태그, 아미노산 서열 티로신-아르기닌-히스티딘-알라닌-알라닌-글리신(YRHAAG) (서열번호 01)로 이루어진, 변형된 "트립신 부위"의 개발을 야기하였다. 이 펩티드는 폴리펩티드의 C-말단에 융합됨으로써, 트립신-4x-변이체에 대한 기질을 형성할 수 있다. 또한, 표적 펩티드는 부위-특이적인 페길화를 가능하게 할 필요가 있다. 이 펩티드는 "트립신 부위"와 중첩되어야 하며, 아미노산 서열 아르기닌-히스티딘-알라닌-라이신(RHAK)(서열번호 02)으로 구성된다. 이 표적 펩티드는 효소에 의해 다양한 분자로 전달될 수 있다. 트립신-4x-변이체는 티로신과 히스티딘 잔기 간의 펩티드 결합을 절단시킴으로써, "트립신 부위"(RHAAG)(서열번호 03)의 일부를 제거한다. 짧은 비천연 아미노산 서열(YRHAK)(서열번호 04)이 단백질 및 부착된 친핵체 사이에 남는다. 그러나, 이 짧은 신장은 부착된 친핵체, 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기에 의해 상당히 은폐되고, 따라서, 이 펩티드의 면역원성 활성은 매우 존재하기 어렵다.
트립신-4x-변이체 내의 변형은 가수분해 부반응을 절대적으로 제거할 수는 없다. 따라서, 최대 수율은, 본 명세서에 개시된 방법의 일 구현예에서와 같이, 착체 Zn2+ 이온에 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 첨가함으로써 반응을 정확한 시간에 중단시키거나, 또는 pH를 본 명세서에 개시된 방법의 또다른 구현예에서와 같은 산성 수준으로 조정하여 적절한 효소 기능성에 필요한 pH 범위 내로 유지시킴으로써 달성될 수 있다.
일부 재조합 단백질은 예를 들면, 후속적인 정제 단계를 용이하게 하거나, 또는 너무 작아서 숙주 세포 내에서의 적절한 생산을 보장하기 어려운 구조체의 발현을 가능하게 하기 위한, 특별한 융합 태그를 함유한다. 일부 잘 정립된 태그들로는 헥사히스티딘-태그(His-태그) 또는 Strep-태그가 있다. His-태그는 금속-친화성 크로마토그래피를 통해 융합 단백질을 정제하는데 사용될 수 있으며, Strep-태그는 스트렙타비딘 컬럼(문헌[Terpe, K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 (2003) 523-533])을 사용한 융합 단백질의 정제 목적으로 적용된다. 일부 상황에서, 예를 들어, 약제용으로 이 태그들을 절단하거나, 또는 필요한 경우, 단순히 적절한 리폴딩(refolding)을 보장할 필요가 있다. 정해진 인식 부위를 갖는 프로테아제를 사용한 효소적 절단은 가장 바람직한 접근 방법이다. 본 명세서에 개시된 방법들의 일 구현예에서, 임균(Neisseria gonorrhoeae)으로부터 유래한 면역글로불린 A 프로테아제(IgA 프로테아제)가 사용된다. IgA 프로테아제의 인식 부위는 Yaa Pro ↓ Xaa Pro (Yaa는 Pro, 또는 드물게는 Ala, Gly 또는 Thr과 조합된 Pro: Pro Ala, Pro Gly, 또는 Pro Thr을 나타내고; Xaa는 Thr, Ser 또는 Ala를 나타낸다)로 보고되어 있다. 임균으로부터 유래한 IgA 프로테아제를 위한 합성 펩티드 기질은 공지된 자가단백질분해(autoproteolytic) 부위이다(예를 들면, 문헌[Wood and Burton, Infection and Immunity 59 (1991) 1818-1822] 참조). IgA 프로테아제에 대해 공지된 인식 부위들로는 하기 서열들이 포함되며, "↓"는 절단된 결합의 위치를 의미한다:
Pro-Ala-Pro ↓ Ser-Pro (서열번호 05),
Pro-Pro ↓ Ser-Pro (서열번호 06),
Pro-Pro ↓ Ala-Pro (서열번호 07),
Pro-Pro ↓ Thr-Pro (서열번호 08),
Pro-Pro ↓ Gly-Pro (서열번호 09),
Ala-Pro ↓ Arg-Pro (서열번호 14),
Pro-Ala-Pro ↓ Arg-Pro (서열번호 15),
Pro-Ala-Pro ↓ Gly-Pro (서열번호 16),
Pro-Pro-Thr-Pro　↓ Ser-Pro (서열번호 17),
Pro-Arg-Pro-Pro　↓ Thr-Pro (서열번호 18),
Pro-Arg-Pro-Pro　↓ Ser-Pro (서열번호 19),
Pro-Arg-Pro-Pro　↓ Ala-Pro (서열번호 20),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Gly-Pro (서열번호 21),
Lys-Pro-Ala-Pro　↓ Ser-Pro (서열번호 22),
Ser-Thr-Pro-Pro　↓ Thr-Pro (서열번호 23),
Val-Ala-Pro-Pro　↓ Ser-Pro (서열번호 24),
Ala-Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Gly-Pro (서열번호 25),
Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Gly-Pro (서열번호 26),
여기서, 처음 3가지 서열들이 가장 빈번하게 선택된다.
따라서, 일 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로, His-태그, 스페이서, IgA 프로테아제 절단 부위(IgA-부위), 대상 폴리펩티드, 트립신-4x-변이체 절단 부위(tryp-부위) 및 선택적으로, 스트렙타비딘-태그(strep-태그)를 포함한다.
트립신-4x-변이체를 사용한 부위-특이적 변형의 효소적 기술은, 이러한 종류의 변형에 필수적인 부속물들을 운반하는 특별한 구조체를 제조하는 것이 필요하도록 만든다.
따라서, 본 명세서에 개시된 방법의 일 구현예에서, 상기 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 페길화될 폴리펩티드, 트립신-4x-변이체 절단 부위 및 Strep-태그를 포함한다. 또다른 구현예에서, 융합 폴리펩티드를 코드화하는 핵산은 5'에서 3' 방향으로 i) 페길화될 폴리펩티드를 코드화하는 핵산, ii) 서열번호 01의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 및 iii) 서열번호 13 또는 27의 Strep-태그를 코드화하는 핵산을 포함한다.
따라서, 본 명세서에 개시된 일 양태는,
a) 5'에서 3' 방향으로, i) 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 및 ii) 서열번호 01의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산을 포함하는 핵산에 의해 코드화되는 융합 폴리펩티드 및 서열번호 02의 아미노산 서열을 가지며 C-말단 라이신 잔기에서 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 공유 결합에 의해 컨쥬게이트된 표적 폴리펩티드와 트립신 변이체 D189K, K60E, N143H, E151H를 인큐베이션시키는 단계, 및
b) 인큐베이션 혼합물로부터 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드를 회수하여 제조하는 단계
를 포함하는, 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드의 제조 방법이다.
일 양태에서, 융합 폴리펩티드는 5'에서 3' 방향으로 i) 페길화될 폴리펩티드를 코드화하는 핵산, ii) 서열번호 01의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산, 및 iii) 서열번호 13 또는 27의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산을 포함하는 핵산에 의해 코드화된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 첫 단계로서:
a-1) 5'에서 3' 방향으로,
i) 페길화될 폴리펩티드를 코드화하는 핵산,
ii) 서열번호 01의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산, 및
iii) 서열번호 13 또는 27의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산을 포함하는, 융합 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 인큐베이션은,
i) 완충 용액 중의 구아니디늄 하이드로클로라이드와 함께, 융합 폴리펩티드 및 표적 펩티드를 인큐베이션시키는 단계,
ii) 트립신 변이체 D189K, K60E, N143H, E151H를 Zn(II) 염과 함께 인큐베이션시키는 단계,
iii) 상기 단계 i) 및 ii)의 인큐베이션 혼합물을 혼합하고, 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 하기에서, 본 발명이 이루어진 당시에 본 발명자들의 실험실에서 충분한 양으로 이용가능했던 IGF-I 단백질을 사용하여 예시되어 있다. 이는 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 본 발명은 대부분의 임의의 폴리펩티드를 사용하여 실시될 수 있기 때문에, 단지 일례로서 제공된다. 본 발명의 진정한 범위는 첨부될 청구항에서 제시된다.
예시적인 구조체는 His-태그, 스페이서 및 IGF-I 폴리펩티드(일부)의 IgA 프로테아제 절단 부위(IgA-부위) N-말단 및 트립신 절단 부위(tryp-부위) 및 선택적으로, IGF-I-폴리펩티드(일부)의 스트렙타비딘-태그(strep-태그) C-말단을 운반했다(도 1 참조):
His-태그 - 스페이서 - IgA-부위 - wt-hIGF - tryp-부위 - strep-태그 (서열번호 10)
His-태그 - 스페이서 - IgA-부위 - wt-hIGF - tryp-부위 (서열번호 11)
His-태그 - 스페이서 - IgA-부위 - hIGF (K27R, K65R) - tryp-부위 (서열번호 12)
트립신-4x-변이체에 의해 촉매되는 에스테르 교환반응의 동력학을 결정하기 위한 실험은, 400 ㎕의 작은 최종 부피에서 수행될 수 있다.
부위-특이적으로 변형될 융합 폴리펩티드를 포함하는 IGF-I을, 효소 반응에 앞서, 2 M 트리스(하이드록시메탄)아미노메탄(TRIS) 완충액(최종 농도 0.2 M), pH 8.0, 친핵체(RHAK-6CF(서열번호 02) 또는 RHAK-MCa-PEG20000 (서열번호 02)), 및 구아니디늄 하이드로클로라이드(Gdm-HCl)와 함께 인큐베이션시킬 수 있다. 이론에 구속되지 않으면서, 이러한 방법으로 IGF 구조체의 용해성이 유지될 수 있었으며, 낮은 농도의 구아니디늄 하이드로클로라이드가 부분적 변성을 유도하였고, 따라서, 효소 반응 동안 "트립신 부위"를 갖는 C-말단의 보다 우수한 접근성을 제공하였다. 트립신-4x-변이체를, Zn2 + 이온의 존재 하에 예비-인큐베이션시킬 수 있다. 융합 폴리펩티드를 포함하는 IGF-I을 포함하는 혼합물 A 및 트립신-4x-변이체를 포함하는 혼합물 B를 사용하여 두 반응 혼합물 A와 B를 조합함으로써, 우수한 효소 활성이 달성될 수 있다. 반응 혼합물은 pH 8.0의 pH값을 가질 수 있다. 총 반응 혼합물을 부드럽게 진탕하면서, 30 ℃에서 인큐베이션시킬 수 있다. 180분의 총 반응시간이 적용될 수 있고, 매 30분마다 샘플을 취할 수 있다. 상기 효소 반응은 Zn2+ 이온을 EDTA와 착화시킴으로써 중단시킬 수 있다. 최종적으로, 최종 희석률 1:2까지, 완충 용액(100 mM TRIS, 150 mM NaCl을 포함하는 pH 8.0의 완충액 S)을 첨가하여 부피를 조정할 수 있다. 샘플들을 SEC에 의해 분석할 수 있다. 사용된 표지에 따라, 상이한 SEC 컬럼이 적용될 수 있다. 예를 들면, RHAK-6CF의 경우, 100 내지 7000 Da의 분리 범위를 갖는 Superdex™ 펩티드 컬럼이 사용될 수 있고, RHAK-MCa-PEG20000의 경우, 3000 내지 70000 Da의 분리 범위를 갖는 Superdex™ 75 컬럼이 사용될 수 있다(GE 헬스케어(GE Healthcare)).
RHAK-6CF를 사용한 부위 특이적 변형의 수율은 다음과 같이 측정될 수 있다. 유리 RHAK-6CF의 연속적 농도 희석액(0.5, 1, 5, 10, 25, 50 및 100 ㎍/ml)을 제조할 수 있다. RHAK-6CF 형광은 pH에 민감하므로, 완충액 S를 용매로서 사용할 수 있다. 검량 샘플을 SEC에 의해 분석할 수 있다. 514 nm에서의 발광으로 얻어진 피크들을 포함하는, RHAK-6CF의 피크 면적을 서로 다른 농도에 대해 측정하고, 플롯팅함으로써, 검량선을 제공할 수 있다. 검량 샘플들과 동일한 방법으로 SEC에 의해 반응 샘플들을 분석하고, 형광 생성물의 피크 면적을 측정할 수 있다. 생성된 RHAK-6CF의 양 및 그에 따른 이 친핵체를 사용한 부위-특이적 변형의 수율을, 검량선을 사용하여 측정할 수 있다.
모든 구조체에 대해, 수율은 시간에 따라 증가하였다. 약 150분 후, 최대 수율이 얻어졌다. wt-hIGF-트립신 부위-strep 태그 구조체가 150분 후 17.5%의 수율로, 가장 우수한 결과를 제공하였다. 대조적으로, wt-hIGF-트립신 부위 및 mut-hIGF (K27R, K65R)는 각각 150분 후 11.9% 및 180분 후 13.0%의, 더 작은 및 비교적 동등한 최대 결과를 제공하였다. RHAK-6CF를 사용한 부위-특이적 변형 동안 시간에 따른 수율 증가가 도 2B에 제시되어 있다.
친핵체로서 RHAK-MCa-PEG20000이 사용된 경우, 유리된, 비컨쥬게이트된 RHAK-MCa-PEG20000 및 RHAK-MCa-PEG20000-표지된 IGF-I의 분리에 있어서의 문제가 발생하였다. 이는 친핵체와 컨쥬게이트화 생성물의 유사한 크기에 기인한 것일 수 있다. 따라서, 이러한 경우 생성물의 증가를 통한 부위-특이적 변형에 대한 수율을 측정하는 것은 불가능했으며, 다른 접근방법이 필요했다. 오직 하나의 부위-특이적 변형만이 일어나기 때문에, 비변형 IGF-I(유리체)의 감소는 컨쥬게이트화 생성물의 증가와 동등할 수 있다. 비변형 IGF-I의 감소를, 226 nm에서의 흡광도로부터 얻어지는 HPLC 크로마토그램 피크 면적을 통해 추산하였다. RHAK-6CF를 사용한 변형에 대해서, RHAK-MCa-PEG20000을 사용한 변형의 수율은 시간에 따라 증가하였다(도 3 및 4). wt-hIGF-tryp　부위-strep　태그 구조체를 사용한 경우, 놀랍게도 180분 후 23.1%의 최대 수율이 얻어질 수 있었다. mut-IGF (K27R, K65R)-tryp 부위(180분 후 20.6 %) 및 wt-hIGF-tryp　부위(180분 후 19.9 %)에 대해서도 거의 동일한 결과가 얻어졌다.
Figure 112012072905178-pct00001
상이한 융합 폴리펩티드의 RHAK-6CF 또는 RHAK-MCa-PEG20000를 사용한 부위-특이적 변형의 비교를 표 1에 나타내었다. 일반적으로, RHAK-MCa-PEG20000을 사용한 변형이 RHAK-6CF를 사용한 변형에 비해 더 높은 수율을 나타냈다. 그러나, 페길화될 폴리펩티드 또한 수율에 영향을 미쳤다. wt-hIGF-tryp　부위-strep　태그 구조체를 사용한 경우, 표적 폴리펩티드(또는 친핵체)와 독립적으로 최고 수율이 얻어질 수 있다. wt-hIGF-tryp 부위 및 mut-hIGF-tryp　부위 구조체는 거의 동등한 결과를 야기했다. 따라서, Strep 태그의 존재가 C-말단 부위-특이적 효소적 변형을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
모노- 및 C-말단 부위-특이적 변형을 입증하기 위해, 표지화된 IGF-I 구조체를 질량 분광분석에 의해 분석할 수 있다. 이 목적으로, 각각의 구조체의 RHAK-6CF를 사용한 부위-특이적 변형에 대한 400 ㎕의 반응물이 사용될 수 있다. 반응물을 30 ℃에서 150분 동안 인큐베이션시키고, 후속적으로 200 ㎕의 10 mM EDTA 용액을 첨가하여 중단시킬 수 있다. 그 후, 반응 용액을 200 ㎕의 완충액 S를 첨가하여 1:2로 희석시킬 수 있다. 전체 표지화 반응물을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. IGF-I 융합 폴리펩티드를 포함하는 RHAK-6CF를 수집하고, 농축시킬 수 있다. 뒤이어, 정제된, 부위-특이적으로 변형된 IGF-I 구조체를 총 분자량에 대해 질량 분광분석 기법에 의해 분석할 수 있다. 소화(digest)(Asp-N-소화)로부터 얻어진 절편들의 분자량은 모든 구조체에 대해, RHAK-6CF로 단일의 C-말단 부위-특이적 변형이 이루어졌음을 입증해주었다.
따라서, "트립신 부위"를 운반하는 조작된 폴리펩티드, 예를 들면, IGF-I를 변형시키기 위해 트립신-4x-변이체를 사용한, C-말단 부위-특이적 변형을 위한 신규한 효소적 방법이 발견되었다. 이 신규한 기술을 사용하여, 불균일한 활성-감소 변형을 얻을 위험 없이도, 폴리펩티드, 예를 들어 야생형 인간 IGF-I을 부위-특이적으로 변형시킬 수 있었다. 과거에, 이러한 원치 않는 부생성물은 페길화의 적용을 종종 제한했다. 이 신규한 효소적 접근법은 페길화된 단백질성 약제의 제조에 용이하게 사용될 수 있다. 표적 폴리펩티드를 포함하는 PEG 대신, 형광성 염료, 바이오틴, 당류 등을 포함하거나, 그와 컨쥬게이트된 표적 폴리펩티드와 같은, 다른 잠재적인 친핵체들이 사용될 수 있다. 저분자 펩티드 RHAK(서열번호 02)의 단순 첨가가, 이들을 트립신-4x-변이체 시스템을 사용한 전달에 사용가능하도록 만들 수 있다.
wt-hIGF-tryp 부위-strep 태그 구조체의 효소적 페길화를 위한 반응 조건은 표지(RHAK-MCa-PEG20000)의 양 및 트립신-4x-변이체의 양을 감소시키고, TRIS 완충액을 HEPES 완충액으로 대체하는 것에 의해 최적화될 수 있었다.
하기 실시예, 서열 목록 및 도면들은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 제시되어 있다. 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 개시된 방법들에 대한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
서열 목록의 설명
서열번호 01 변형된 트립신 부위(tryp-부위)
서열번호 02 부위 특이적 페길화에 필요한 표적 펩티드
서열번호 03 트립신 부위의 제거 부분
서열번호 04 남아있는 펩티드 서열
서열번호 05 내지 09 및 14 내지 26 IgA-프로테아제 절단 부위
서열번호 10 His-태그 - 스페이서 - IgA-부위 - wt-hIGF - tryp-부위 - strep-태그
서열번호 11 His-태그 - 스페이서 - IgA-부위 - wt-hIGF - tryp-부위
서열번호 12 His-태그 - 스페이서 - IgA 부위 - hIGF (K27R, K65R) - tryp-부위
서열번호 13 및 27 Strep-태그
서열번호 28 N-말단 his-태그 및 IgA 프로테아제 절단 부위를 포함하는, 모노-페길화된 인간 IGF-I의 아미노산 서열
서열번호 29 모노-페길화된 인간 IGF-I의 아미노산 서열
약어
"트립신 부위" 아미노산 서열 YRHAAG
6-CF 카르복시 플루오레세인
Gdm-HCl 구아니디늄 하이드로클로라이드
His-tag 폴리 히스티딘 태그
MCa 메틸 쿠마린
PEG 폴리(에틸렌 글리콜)
Strep 스트렙타비딘
TRIS 2-아미노-1-하이드록시메틸-1,3-프로판 디올
Tryp "트립신 부위"
IGF-I 인슐린 유사 성장 인자 1
트립신-4x-변이체 변이 트립신 D189K, K60E, N143H, E151H
재료 및 방법:
분석적 크기 배제 크로마토그래피
완충액: 0.5 M TRIS, 0.15 M NaCl, pH 7.5
컬럼: Superdex™ 펩티드 10/300 GL
시스템: Dionex
방법: 0.5 ml/분의 유량으로 등용매 용리(isocratic elution)를 수행하였다. 총 사이클 시간은 70분이었다. 50 ㎕의 샘플을 주입하였다. 220 nm 및 280 nm에서의 흡광 신호에 따라 분리 과정을 추적하였다.
표지화 중의 크기 배제 크로마토그래피
완충액: 100 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 8.0
컬럼: Superdex™ 펩티드 10/300 GL (RHAK-6CF 표지화)
Superdex™ 75 10/300 GL (RHAK-MCa-PEG20000 표지화)
시스템: Gynkotek (RHAK-6CF 표지화)
Dionex (RHAK-MCa-PEG20000 표지화, 표 8 참조)
RHAK-6CF 표지화 방법: 0.5 ml/분의 유량으로 등용매 용리를 수행하였다. 총 사이클 시간은 60분이었다.
RHAK-MCa-PEG20000 표지화 방법: 0.75 ml/분의 유량으로 등용매 용리를 수행하였다. 총 사이클 시간은 45분이었다.
50 ㎕의 샘플(예비적 목적으로 250 ㎕)을 주입하였다. 220 nm, 280 nm, 320 nm(RHAK-MCa-PEG20000 표지화)에서의 흡광 신호 및 형광 신호(소멸 = 490 nm, 방출 = 514 nm)(RHAK-6CF 표지화)에 따라 분리 과정을 추적하였다.
실시예 1
부위 특이적 변형
RHAK-6CF 및 RHAK-MCa-PEG20000을 사용하여, IGF-I 구조체의 부위-특이적 표지화를 달성하였다.
Figure 112012072905178-pct00002
Figure 112012072905178-pct00003
각각의 구조체를 RHAK-6CF 또는 RHAK-MCa-PEG20000로 표지하였다. 또한, 표 2에 따른 대조예를 실시하였다.
표 4에 최종 표지화 반응물 내의, 상이한 화합물들의 농도를 기재하였다. 모든 반응을 650 ㎕의 실리콘화된 관에서 수행하였다. 단백질을 2 M의 트리스 완충액 중에서 희석시켰다. 뒤이어, 표지된 펩티드 및 구아니디늄 하이드로클로라이드를 첨가하였다. 이 혼합물(A)을 30 ℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 트립신 4x 변이체, ZnCl2 및 완충액 S(100 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 8.0)으로 이루어진 혼합물 B를 혼합물 A와 동일한 조건에서 인큐베이션시켰다. 표지화 반응물의 경우 400 ㎕ 및 대조군의 경우 250 ㎕의 총 반응 부피를 제공하기 위한, 완충액 S의 필요 부피를 선택하였다. 혼합물 A와 B를 혼합하고, 약하게 진탕하면서 30 ℃에서 인큐베이션시켰다.
효소적 반응을 중단시키기 위해, 반응 혼합물과, 그의 절반 부피의 10 mM EDTA(완충액 S 중에서 제조됨) 및 1:2의 희석률을 위해 그와 동일한 부피의 완충액 S를 혼합하였다. 180 분의 총 반응 시간을 적용하였다.
Figure 112012072905178-pct00004
실시예 2
부위 특이적 변형의 최적화
실온에서 1000 ㎕의 부피로 반응을 수행하였다. 트립신-4x-변이체를 ZnCl2 및 PEG 표지의 존재 하에, 30 ℃에서 10분 동안 예비-인큐베이션시켰다. 그 후, 구아니디늄 HCl 및 wt-hIGF-tryp 부위-strep 부위를 첨가하여, 하기 제시된 최종 농도를 달성하였다. 반응 혼합물을, 20 ℃에서 최대 54시간 동안 인큐베이션시켰다. 24시간 후 25% 초과의 생성물 수율을 달성하였으며, 52시간 후 최대 32.6%에 도달하였다(도 4 참조).
반응 조건:
100 μM wt hIGF-I 트립신 부위 Strep 태그
2 μM 트립신 4x 변이체
500 μM RHAK-MCa-PEG20000
10 μM ZnCl2
100 mM HEPES
150 mM NaCl
1 mM CaCl2
200 mM Gdm HCl
실시예 3
재조합 wt 및 돌연변이 IGF -I 변이체 및 모노페길화된 IGF -I에 의한 시험관내 IGF-IR 인산화
상이한 IGF-I 변이체들에 의한 IGF-IR의 활성화를 정량하기 위해 포스포-IGF-IR 특이적 ELISA를 사용하였다. 하룻밤에 걸친 혈청 절식(starvation) 후, 세포 단계에서 IGF-IR의 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해, 인간 IGF-IR을 발현시키는 재조합 NIH-3T3 세포들을 상이한 농도의 IGF-I 변이체들과 함께 인큐베이션시켰다. 자극 후에, 인산화 상태를 보존하기 위해 차가운 용해 완충액(25 mM MES, pH 6.5, 150 mM NaCl,　2% Triton-X100, 60 mM β-옥틸글리코시드, 2 mM Na3VO4, Complete™ 프로테아제 억제제)을 사용하여 세포들을 용해시켰다. 총 IGF-IR을 스트렙타비딘 코팅된 마이크로플레이트의 표면에 포획시키기 위해, 인간 IGF-IR 알파 사슬에 대한 바이오틴화된 단일클론 항체(MAK<hu　IGF-IRα>hu-1a-IgG-Bi, 로슈 디아그노스틱스 게임베하(Roche Diagnostics GmbH))를 사용하였으며, 활성화된 IGF-IR 비율을 결정하기 위해 IGF-IR 키나아제 도메인(셀 시그널링 #3024L) 내의 인산화된 Tyr1135/1136에 대한 단일클론 항체를 사용하였다. 최대치 대조군으로서 10 nM의 인간 IGF-I로 자극시킨 세포들을, 최소치 대조군으로서 자극받지 않은 세포들을 사용하였다. IGF-IR의 활성화 백분율을 (결과치-최소치)/(최대치-최소치)로서 계산하였다. 그래프패드 프리즘 4.0 소프트웨어(GraphPad Prism 4.0 software)를 사용하여 곡선 맞춤(curve fitting)에 의해 IC50/EC50 값을 결정하였다.
Figure 112012072905178-pct00005
첨부된 서열목록 참조
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> IGF-I poly (ethylene glycol) conjugates <130> 26585 WO <140> PCT/EP2011/051631 <141> 2011-02-04 <150> EP10153275.2 <151> 2010-02-11 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified trypsine site <400> 1 Tyr Arg His Ala Ala Gly 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> target peptide <400> 2 Arg His Ala Lys 1 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> displaced part of the tryp site <400> 3 Arg His Ala Ala Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> remaining peptide <400> 4 Tyr Arg His Ala Lys 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 1 <400> 5 Pro Ala Pro Ser Pro 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 2 <400> 6 Pro Pro Ser Pro 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 3 <400> 7 Pro Pro Ala Pro 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 4 <400> 8 Pro Pro Thr Pro 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 5 <400> 9 Pro Pro Gly Pro 1 <210> 10 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-I polypeptide 1 <400> 10 Met His His His His His His Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His Pro 1 5 10 15 Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala 20 25 30 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr 35 40 45 Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp 50 55 60 Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 65 70 75 80 Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala Tyr Arg His Ala Ala Gly Trp 85 90 95 Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 100 <210> 11 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-I polypeptide 2 <400> 11 Met His His His His His His Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His Pro 1 5 10 15 Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala 20 25 30 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr 35 40 45 Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp 50 55 60 Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 65 70 75 80 Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala Tyr Arg His Ala Ala Gly 85 90 95 <210> 12 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-I polypeptide 3 <400> 12 Met His His His His His His Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His Pro 1 5 10 15 Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala 20 25 30 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr 35 40 45 Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp 50 55 60 Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 65 70 75 80 Ala Pro Leu Arg Pro Ala Lys Ser Ala Tyr Arg His Ala Ala Gly 85 90 95 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep-tag <400> 13 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 6 <400> 14 Ala Pro Arg Pro 1 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 7 <400> 15 Pro Ala Pro Arg Pro 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 8 <400> 16 Pro Ala Pro Gly Pro 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 9 <400> 17 Pro Pro Thr Pro Ser Pro 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 10 <400> 18 Pro Arg Pro Pro Thr Pro 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 11 <400> 19 Pro Arg Pro Pro Ser Pro 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 12 <400> 20 Pro Arg Pro Pro Ala Pro 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 13 <400> 21 Pro Pro Arg Pro Pro Gly Pro 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 14 <400> 22 Lys Pro Ala Pro Ser Pro 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 15 <400> 23 Ser Thr Pro Pro Thr Pro 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 16 <400> 24 Val Ala Pro Pro Ser Pro 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 17 <400> 25 Ala Pro Arg Pro Pro Gly Pro 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site 18 <400> 26 Pro Ala Pro Arg Pro Pro Gly Pro 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep-tag 1 <400> 27 Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly 1 5 <210> 28 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mono-PEGylated human IGF-I <400> 28 Met His His His His His His Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His Pro 1 5 10 15 Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala 20 25 30 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr 35 40 45 Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp 50 55 60 Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 65 70 75 80 Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala Tyr Arg His Ala Lys 85 90 <210> 29 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tag cleavaed mono-PEGylated IGF-I <400> 29 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ser Ala Tyr Arg His Ala Lys 65 70 75

Claims (15)

  1. a) i) 폴리펩티드를 코드화하는 핵산, ii) 서열번호 01의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산, 및 iii) Strep-태그를 코드화하는 핵산을 5'에서 3' 방향으로 포함하는 핵산에 의해 코드화되는 융합 폴리펩티드, 및 서열번호 02의 아미노산 서열을 포함하고, C-말단 라이신 잔기에서 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 공유 결합에 의해 컨쥬게이트된 표적 폴리펩티드를
    트립신 변이체 D189K, K60E, N143H, E151H와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및
    b) 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 컨쥬게이트된 폴리펩티드를 회수하여 제조하는 단계를 포함하는,
    폴리(에틸렌 글리콜)과 컨쥬게이트된 폴리펩티드의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인큐베이션 단계가
    i) 융합 폴리펩티드 및 표적 펩티드를, 완충 용액 중 구아니디늄 하이드로클로라이드와 인큐베이션시키는 단계,
    ii) 트립신 변이체 D189K, K60E, N143H, E151H와 Zn(II) 염을 인큐베이션시키는 단계, 및
    iii) 상기 단계 i)과 ii)의 인큐베이션 혼합물을 혼합하고, 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩티드가 5'에서 3' 방향으로,
    i) 폴리펩티드를 코드화하는 핵산,
    ii) 서열번호 01의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산, 및
    iii) 서열번호 13 또는 서열번호 27의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산
    으로 이루어진 핵산에 의해 코드화되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 인큐베이션이 150분 내지 180분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 a)에서의 핵산이
    iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 인큐베이션이 HEPES 완충 용액 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 인간 IGF-I인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    융합 폴리펩티드가 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    융합 폴리펩티드를 코드화하는 핵산이 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산인 것을 특징으로 하는, 방법.
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